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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-06
(54)【発明の名称】固定床バイオリアクタ用の均一細胞培養基材
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20240730BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024505342
(86)(22)【出願日】2022-07-21
(85)【翻訳文提出日】2024-03-26
(86)【国際出願番号】 US2022037798
(87)【国際公開番号】W WO2023009373
(87)【国際公開日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】63/227,693
(32)【優先日】2021-07-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】397068274
【氏名又は名称】コーニング インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100073184
【弁理士】
【氏名又は名称】柳田 征史
(74)【代理人】
【識別番号】100175042
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 秀明
(74)【代理人】
【識別番号】100224775
【弁理士】
【氏名又は名称】南 毅
(72)【発明者】
【氏名】スゥン，ユィジエン
(72)【発明者】
【氏名】ジョウ，ユエ
【テーマコード（参考）】
4B029
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029AA21
4B029BB11
4B029CC10
4B029CC11
4B029DA06
4B029DA08
4B029DG06
(57)【要約】
細胞を培養するための充填床バイオリアクタシステムが提供される。該システムは、少なくとも１つの内部リザーバ、該リザーバに流体接続された入口、及びリザーバに流体接続された出口を有する細胞培養容器と、リザーバ内に配置され、固定床として構成された細胞培養マトリクスとを含む。細胞培養マトリクスは、細胞が接着するように構成された基材を含む。細胞培養マトリクスは、該細胞培養マトリクス全体にわたってリザーバ内の均一な流れを維持する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞培養用の充填床バイオリアクタシステムであって、少なくとも１つの内部リザーバ、前記リザーバに流体接続された入口、及び前記リザーバに流体接続された出口を備えた細胞培養容器、並びに
前記リザーバ内に配置され、固定床として構成された細胞培養マトリクスであって、細胞が接着するように構成された基材を含む、細胞培養マトリクス
を備えており、
前記細胞培養マトリクスが、該細胞培養マトリクス全体にわたって前記リザーバ内の均一な流れを維持するように構成されており、かつ
前記細胞培養マトリクスが多層基材を含み、該多層基材の各層が実質的に規則的かつ均一な物理的構造及び多孔率を含む、
充填床バイオリアクタシステム。
【請求項2】
前記細胞培養マトリクスが実質的に均一な多孔率を含む、請求項１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項3】
前記均一な流れが層流を含む、請求項１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項4】
前記リザーバが長さ及び幅によって規定され、前記長さが前記入口に隣接した前記リザーバの第１の端から前記出口に隣接した前記リザーバの第２の端まで延び、前記細胞培養マトリクスが前記リザーバの実質的に幅全体にわたって延びる幅を有する、請求項１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項5】
前記多層基材が、前記リザーバ内にスタックされた複数の基材ディスクを含む、請求項１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項6】
前記複数の基材ディスクの前記スタックが、前記複数の基材ディスクの各々の幅全体にわたって実質的に均一な流体流れを示すように構成される、請求項５に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項7】
多層基材が前記多孔率を規定する複数の開口部を含み、前記複数の開口部が前記複数の基材ディスクの各ディスク内に規則的なパターン又は均一なパターンで配列される、請求項５に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項8】
前記多層基材が、成形ポリマー格子、３Ｄ印刷された格子、及び織布基材のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項9】
前記細胞培養マトリクスが複数の織布基材を含み、各織布基材が、第１の側と、該第１の側とは反対側にあり、前記織布基材の厚さによって前記第１の側から分離されている第２の側とを有する、請求項８に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項10】
前記複数の基材の少なくとも一部が、スペーサ材料若しくは障壁によって分離されていない、又は互いに物理的に接触している、請求項９に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項11】
前記細胞培養マトリクスが、該細胞培養マトリクスの表面積の少なくとも９０％にわたって均一な流体流れを示す、請求項１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項12】
前記細胞培養マトリクスが、流体の流れの方向に前記細胞培養マトリクスの長さにわたってプラグ流れを示す、請求項１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項13】
前記細胞培養マトリクスが３．４×１０－１０ｍ２を超える透過度を示す、請求項１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【請求項14】
前記固定床が、約５０μｍから約１０００μｍの充填厚さ、
約４０％から約６５％の多孔率、及び
約６ｍｌ／ｇ未満の充填密度
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、その内容が依拠され、その全体がここに参照することによって本願に援用される、２０２１年７月３０日出願の米国仮特許出願第６３／２２７，６９３号の米国法典第３５編特許法１１９条に基づく優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【0002】
本開示は、概して、細胞を培養するための基材及びそのような基材を組み込んだ固定床バイオリアクタ、並びに細胞を培養するためのシステム及び方法に関する。特に、本開示は、改善された流体流動特性を有する細胞培養基材に関する。
【背景技術】
【0003】
バイオプロセス産業では、ホルモン、酵素、抗体、ワクチン、及び細胞療法の生産を目的として、細胞の大規模培養が行われる。細胞療法及び遺伝子治療の市場は急速に成長しており、有望な治療法は臨床試験へと移行し、急速に商業化に向けて進んでいる。しかしながら、細胞療法の１回の投与には、数十億の細胞又は数兆のウイルスが必要となる場合がある。したがって、臨床の成功には、短期間で大量の細胞産物を提供できることが重要である。
【0004】
バイオプロセスで用いられる細胞のかなりの部分は足場依存性であり、これは、細胞が増殖し機能するために接着する表面を必要とすることを意味する。従来、接着細胞の培養は、Ｔフラスコ、ペトリ皿、細胞工場、セルスタック容器、ローラボトル、及びＨＹＰＥＲスタック（登録商標）容器など、多数の容器形式のうちの１つに組み込まれた二次元（２Ｄ）細胞接着表面上で行われる。これらの手法には、治療薬又は細胞の大規模生産を可能にするのに十分に高い細胞密度を達成することが困難であることを含む、重大な欠点を有する可能性がある。
【0005】
培養細胞の体積密度を増加させるための代替方法が提案されている。これらには、撹拌タンク内で行われるマイクロキャリア培養が含まれる。この手法では、マイクロキャリアの表面に接着した細胞は一定のせん断応力にさらされ、その結果、増殖及び培養性能に重大な影響を及ぼす。高密度細胞培養システムの別の例は、中空繊維バイオリアクタであり、細胞は、繊維間空間で増殖するときに大きい三次元凝集体を形成しうる。しかしながら、栄養素が不足すると、細胞の増殖及び性能は著しく阻害される。この問題を軽減するために、これらのバイオリアクタは小型に作られており、大規模製造には適していない。
【0006】
足場依存性細胞の高密度培養システムの別の例は、充填床バイオリアクタシステムである。このタイプのバイオリアクタでは、接着細胞の接着のための表面を提供するために細胞基材が用いられる。培地は表面に沿って、又は半多孔性基材を通して灌流され、細胞の増殖に必要な栄養素と酸素を供給する。例えば、細胞を捕捉するための支持体又はマトリクスシステムの充填床を含む充填床バイオリアクタシステムは、以前に特許文献１～３に開示されている。充填床マトリクスは通常、基材としての多孔質粒子又はポリマーの不織布マイクロファイバで作られる。このようなバイオリアクタは、再循環フロースルーバイオリアクタとして機能する。このようなバイオリアクタに関する重大な問題の１つは、充填床内の細胞分布が不均一であることである。例えば、充填床は、デプスフィルタとして機能し、主に入口領域で細胞が捕捉され、その結果、接種ステップ中に細胞分布の勾配が生じる。加えて、繊維がランダムに充填されていることにより、充填床の断面の流動抵抗及び細胞捕捉効率は均一ではない。例えば、培地は、細胞充填密度が低い領域では速く流れ、抵抗が高い領域では、捕捉された細胞の数が多いため、ゆっくりと流れる。これにより、体積細胞密度が低い領域には栄養素及び酸素がより効率的に供給され、細胞密度が高い領域では次善の培養条件で維持される、チャネリング効果が生じる。
【0007】
従来技術に開示されている充填床システムの別の重大な欠点は、培養プロセスの最後にインタクトな生細胞を効率的に回収することができないことである。最終生成物が細胞である場合、又はバイオリアクタが、細胞集団を１つの容器で増殖させ、その後細胞集団をさらに増殖させるために別の容器に移す「シードトレイン」の一部として用いられる場合、細胞の回収は重要である。特許文献４には、細胞回収ステップでの充填床からの細胞回収効率を向上させるためのバイオリアクタの設計が開示されている。これは、充填床マトリクスを疎にし、充填床粒子を撹拌して、多孔性マトリクスを衝突させ、それによって細胞を分離することに基づいている。しかしながら、この手法は手間がかかり、重大な細胞損傷を引き起こす可能性があるため、全体的な細胞生存率が低下する。
【0008】
現在市販されている充填床バイオリアクタの一例は、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製造のｉＣｅｌｌｉｓ（登録商標）である。「ｉＣｅｌｌｉｓ」は、不織布構成でランダムに配向した繊維からなる細胞基材材料の小さいストリップを使用する。これらのストリップを容器に充填して、充填床を生成する。しかしながら、市販されている同様の解決策と同様に、このタイプの充填床基材にも欠点がある。具体的には、基材ストリップの不均一な充填により、充填床内に目に見えるチャネルが生成し、充填床全体にわたる優先的かつ不均一な培地の流れ及び栄養素の分布が生じる。「ｉＣｅｌｌｉｓ」の研究では、「固定床の上から下に向かって数が増加する、細胞のシステム的な不均一な分布」、並びに「細胞の増殖及び産生の制限につながる…栄養勾配」が指摘されており、これらはすべて「トランスフェクション効率を損なう可能性のある、細胞の不均等な分布」につながる。（非特許文献１）。研究では、充填床を撹拌すると分散が改善さうるが、他の欠点を有するであろうことが指摘されている（すなわち、「接種及びトランスフェクション中に分散を良くするために必要な撹拌は、せん断応力の増加を引き起こし、ひいては細胞生存率の低下につながる。（necessary agitation for better dispersion during inoculation and transfection would induce increased shear stress, in turn leading to reduced cell viability.）」同じく、非特許文献１）。「ｉＣｅｌｌｉｓ」に関する別の研究では、細胞が不均一に分布しているため、バイオマスセンサを使用した細胞集団のモニタリングが困難であることが指摘されている（「…細胞が不均一に分布している場合、上部キャリア上の細胞からのバイオマス信号はバイオリアクタ全体の全体像を示さない可能性がある。（…if the cells are unevenly distributed, the biomass signal from the cells on the top carriers may not show the general view of the entire bioreactor.）」非特許文献２）。
【0009】
加えて、基材ストリップ内の繊維のランダムな配置と、「ｉＣｅｌｌｉｓ」のある充填床と別の充填床との間でのストリップの充填のばらつきにより、基材は培養ごとに異なるため、ユーザが細胞培養性能を予測することが困難になりうる。さらには、「ｉＣｅｌｌｉｓ」の充填された基材は、細胞が充填床に閉じ込められていると考えられことから、効率的な細胞の回収を非常に困難に又は不可能にする。
【0010】
早期臨床治験用のウイルスベクターの製造は既存のプラットフォームでも可能であるが、後期の商業生産規模に到達するためには、高品質の製品をより多く生産することができるプラットフォームが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】米国特許第４，８３３，０８３号明細書
【特許文献2】米国特許第５，５０１，９７１号明細書
【特許文献3】米国特許第５，５１０，２６２号明細書
【特許文献4】米国特許第９，２７３，２７８号明細書
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Rational plasmid design and bioprocess optimization to enhance recombinant adeno-associated virus (AAV) productivity in mammalian cells.Biotechnol.J. 2016, 11, 290-297
【非特許文献2】Process Development of Adenoviral Vector Production in Fixed Bed Bioreactor: From Bench to Commercial Scale. Human Gene Therapy, Vol. 26, No. 8, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
細胞培養基材及び／又はマトリクス、バイオリアクタ、システム、並びに均一な細胞分布を有する高密度形式での細胞の培養を可能にし、容易に達成でき、収穫量を増加させる方法が必要とされている。特に、改善された流体流動特性を有する、固定床バイオリアクタ用の細胞培養基材が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本開示の一実施形態によれば、細胞培養用の充填定床バイオリアクタシステムが提供される。該システムは、少なくとも１つの内部リザーバ、該リザーバに流体接続された入口、及びリザーバに流体接続された出口を備えた細胞培養容器；並びに、リザーバ内に配置された充填床細胞培養マトリクスを含む。細胞培養マトリクスは、細胞を接着させるための複数の構造的に規定された基材層を含み、該基材層の各々は、規則的かつ均一な物理的構造及び多孔率を有する。実施形態の幾つかの態様は、均一な多孔率を有する充填床細胞培養マトリクス、及び／又は均一な流体が流れるように構成された充填床細胞培養マトリクスを含む。追加の態様として、複数の構造的に規定された基材は、リザーバ内に配置された基材ディスクのスタックを含む。さらなる態様では、構造的に規定された基材は多孔率を規定する複数の開口部を含み、該複数の開口部は各基材ディスク内に規則的なパターン又は均一なパターンで配列される。
【0015】
本開示の一実施形態によれば、細胞培養マトリクスが提供される。細胞培養マトリクスは、第１の側、該第１の側とは反対側の第２の側、第１の側と第２の側とを分離する厚さ、及び基材内に形成され、基材の厚さを貫通する複数の開口部を有する基材を含む。複数の開口部は、細胞培養培地、細胞、又は細胞生成物のうちの少なくとも１つが基材の厚さを通って流れることを可能にするように構成される。基材は、成形ポリマー格子シート、３Ｄ印刷された格子シート、及び織布メッシュシートのうちの少なくとも１つでありうる。基材は、規則的な秩序構造を有しており、細胞の接着、増殖、及び最終的な細胞の放出のための表面を提供する。
【0016】
本開示の一実施形態によれば、細胞培養用のバイオリアクタシステムが提供され、該システムは、少なくとも１つのリザーバを有する細胞培養容器と、該少なくとも１つのリザーバ内に配置された細胞培養マトリクスとを含み、該細胞培養マトリクスは、細胞が接着するように構成された表面を備えた複数の織り合わされた繊維を有する織布基材を含む。
【0017】
１つ以上の実施形態によれば、細胞培養システムが提供され、該システムは、バイオリアクタ容器と、バイオリアクタ容器内に配置され、細胞を培養するように構成された細胞培養マトリクスとを含む。細胞培養マトリクスは、第１の側、該第１の側とは反対側の第２の側、第１の側と第２の側とを分離する厚さ、及び基材内に形成され、基材の厚さを貫通する複数の開口部を備えた基材を含み、該複数の開口部は、細胞培養培地、細胞、又は細胞生成物のうちの少なくとも１つが基材の厚さを通って流れることを可能にするように構成される。
【0018】
１つ以上の実施形態によれば、細胞を培養するためのバイオリアクタシステムが提供される。該システムは、第１の端、第２の端、及び第１の端と第２の端との間の少なくとも１つのリザーバを有する細胞培養容器と、少なくとも１つのリザーバ内に配置された細胞培養マトリクスとを含む。細胞培養マトリクスは、各々が、細胞が接着するように構成された表面を有する複数の織り合わされた繊維を含む、複数の織布基材を有する。バイオリアクタシステムは、材料を、第１の端から第２の端へと流れ方向に少なくとも１つのリザーバを通して流すように構成されており、複数の織布基材の基材は、各織布基材が他の織布基材の各々に対して実質的に平行になり、かつ流れ方向に対して実質的に垂直になるようにスタックされる。
【0019】
１つ以上の実施形態によれば、細胞を培養するためのバイオリアクタシステムが提供される。該システムは、第１の端、第２の端、及び第１の端と第２の端との間の少なくとも１つのリザーバを有する細胞培養容器と、少なくとも１つのリザーバ内に配置された細胞培養マトリクスとを含み、該細胞培養マトリクスは、各々が細胞が接着するように構成された表面を備えた複数の織り合わされた繊維を有する複数の織布基材を含む。バイオリアクタシステムは、材料を、第１の端から第２の端へと流れ方向に少なくとも１つのリザーバを通して流すように構成されており、複数の織布基材の基材は、各織布基材が他の織布基材の各々に対して実質的に平行になり、かつ流れ方向に対して実質的に平行になるようにスタックされる。
【0020】
１つ以上の実施形態によれば、細胞を培養するためのバイオリアクタシステムが提供される。該システムは、第１の端、第２の端、及び第１の端と第２の端との間の少なくとも１つのリザーバを有する細胞培養容器と、少なくとも１つのリザーバ内に配置された細胞培養マトリクスとを含む。細胞培養マトリクスは、細胞が接着するように構成された表面を有する複数の織り合わされた繊維を含む織布基材を含み、該織布基材は、少なくとも１つのリザーバ内に巻かれた構成で配置され、織布基材の表面が円筒状細胞培養マトリクスの縦軸に平行な織布基材の表面を有する円筒状細胞培養マトリクスを提供する。
【0021】
別の実施形態によれば、バイオリアクタ内で細胞を培養する方法が提供される。該方法は、バイオリアクタ容器内に細胞培養チャンバを有するバイオリアクタ容器と、細胞培養チャンバ内に配置された細胞培養マトリクスとを提供するステップを含む。細胞培養マトリクスは、その上で細胞を培養するために提供される。細胞培養マトリクスは、第１の側、該第１の側とは反対側の第２の側、第１の側と第２の側とを分離する厚さ、及び基材内に形成され、基材の厚さを貫通する複数の開口部を有する基材を含む。該方法は、細胞培養マトリクス上に細胞を播種するステップ；細胞培養マトリクス上で細胞を培養するステップ；及び、細胞の培養産物を回収するステップをさらに含む。基材の複数の開口部は、細胞培養培地、細胞、又は細胞生成物のうちの少なくとも１つが基材の厚さを通って流れることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1A】本開示の１つ以上の実施形態による、細胞培養基材の三次元モデルの斜視図
【図2A】幾つかの実施形態による細胞培養基材の一例を示す図
【図2B】幾つかの実施形態による細胞培養基材の一例を示す図
【図2C】幾つかの実施形態による細胞培養基材の一例を示す図
【図3A】１つ以上の実施形態による多層細胞培養基材の斜視図
【図3B】１つ以上の実施形態による多層細胞培養基材の平面図
【図6】１つ以上の実施形態による、細胞培養システムの概略図
【図7】１つ以上の実施形態による、細胞培養システムの概略図
【図8】１つ以上の実施形態による、細胞培養システムの概略図
【図9A】ＨＹＰＥＲフラスコと比較した、本開示の実施形態による２つの例について回収した総細胞数の実験結果を示すグラフ
【図9B】ＨＹＰＥＲフラスコと比較した、本開示の実施形態による２つの例についての容器あたりの総ゲノムコピーの実験結果を示すグラフ
【図9C】ＨＹＰＥＲフラスコと比較した、本開示の実施形態による２つの例についての表面積あたりのゲノムコピーの実験結果を示すグラフ
【図10A】本開示の１つ以上の実施形態による、密に充填された構成でのモデル化された多層織布メッシュ細胞培養基材の平面図
【図11A】本開示の１つ以上の実施形態による、疎に充填された構成でのモデル化された多層織布メッシュ細胞培養基材の平面図
【図13A】本開示の１つ以上の実施形態による、表５のメッシュ試料Ａに従ったメッシュ試料の写真
【図13B】本開示の１つ以上の実施形態による、表５のメッシュ試料Ｂに従ったメッシュ試料の写真
【図13C】本開示の１つ以上の実施形態による、表５のメッシュ試料Ｃに従ったメッシュ試料の写真
【図13D】本開示の１つ以上の実施形態による、表５のメッシュ試料Ｄに従ったメッシュ試料の写真
【図13E】本開示の１つ以上の実施形態による、表５のメッシュ試料Ｅに従ったメッシュ試料の写真
【図13F】本開示の１つ以上の実施形態による、表５のメッシュ試料Ｆに従ったメッシュ試料の写真
【図16A】本開示の１つ以上の実施形態による、織布メッシュ基材を有するバイオリアクタの流れ均一性モデルを示す図
【図17A】不織布基材の透過性を測定するための実験装置の概略図
【図17B】ランダムに充填された不織布基材の透過性を測定するための実験装置の概略図
【図17C】本開示の１つ以上の実施形態による、開放織布メッシュ基材の透過性を測定するための実験装置の概略図
【図18】織布及び不織布細胞培養基材の透過性測定値の棒グラフ
【図19A】流れ方向に対して９０°に整列された不織布メッシュ基材片の周りのシミュレートされた流速を示す図
【図19B】流れ方向に対して４５°に整列された不織布メッシュ基材片の周りのシミュレートされた流速を示す図
【図20A】すべての隣り合うものの間に１ｍｍの間隙を有する不織布メッシュ基材片の周囲のシミュレーションされた流速を示す図
【図20B】すべての隣り合うものの間に１ｍｍの間隙を有する開放織布メッシュの周囲のシミュレーションされた流速を示す図
【図21】異なる細胞培養基材試料の滞留時間分布を測定するための実験セットアップの概略図
【図22】織布及び不織布細胞培養基材の滞留時間分布の測定中の染料濃度の変化と時間の関係を示すグラフ
【図23】本開示の実施形態による織布基材を有するバイオリアクタ、及び他の市販の不織布細胞培養基材を有するバイオリアクタを通過する正規化された流量に対する染料濃度の変化を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【0023】
本開示のさまざまな実施形態は、もしあれば、図面を参照して詳細に説明される。さまざまな実施形態への言及は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。加えて、本明細書に記載された例は限定的ではなく、特許請求された発明の多くの可能な実施形態のうちの幾つかを単に記載するものである。
【0024】
本開示の実施形態は、細胞培養基材、及びそのような基材を組み込んだ細胞培養システム又はバイオリアクタシステム、並びにそのような基材及びバイオリアクタシステムを使用して細胞を培養する方法を対象とする。
【0025】
従来の大規模細胞培養バイオリアクタでは、さまざまなタイプの充填床バイオリアクタが使用されてきた。通常、これらの充填床は、接着細胞又は浮遊細胞を保持し、成長及び増殖を支援するための多孔質マトリクスを含む。充填床マトリクスは体積に対する表面積の比率が高く、他のシステムよりも細胞密度を高くすることができる。しかしながら、充填床は多くの場合、細胞がマトリクスの繊維に物理的に捕捉されるか又は絡み合う、デプスフィルタとして機能する。したがって、充填床を通る細胞接種材料の直線的な流れの理由から、細胞は充填床内で不均一に分布し、充填床の深さ又は幅にわたる細胞密度の変動につながる。例えば、細胞密度は、バイオリアクタの入口領域でより高く、バイオリアクタの出口に近づくほど大幅に低くなる。充填床内の細胞のこの不均一な分布は、バイオプロセス製造におけるこのようなバイオリアクタの拡張性及び予測可能性を著しく妨げ、充填床の単位表面積又は体積あたりの細胞の増殖又はウイルスベクター産生に関する効率の低下につながる可能性さえある。
【0026】
従来技術で開示されている充填床バイオリアクタにおいて遭遇する別の問題は、チャネリング効果である。充填された不織布繊維のランダムな性質に起因して、充填床の任意の断面における局所的な繊維密度は均一ではない。培地は、繊維密度が低い領域（床透過性が高い）では迅速に流れるが、繊維密度が高い（床透過性が低い）領域では非常に遅くなる。充填床全体にわたり結果として生じる不均一な培地灌流がチャネリング効果を生み出し、これは、細胞培養及びバイオリアクタの性能全体に悪影響を与える重大な栄養素及び代謝物の勾配として現れる。培地の灌流が低い領域に位置する細胞は飢餓状態になり、多くの場合、栄養素の不足又は代謝物中毒により死滅する。不織繊維足場が充填されたバイオリアクタを使用する場合、細胞回収はさらに別の問題に遭遇する。充填床はデプスフィルタとして機能することから、細胞培養プロセスの最後に放出される細胞は充填床内に閉じ込められ、細胞回収率は非常に低くなる。これにより、生細胞が製品となるバイオプロセスにおけるこのようなバイオリアクタの利用が大幅に制限される。したがって、不均一性により、流れ及びせん断に曝露される領域が異なり、使用可能な細胞培養領域が事実上減少し、培養が不均一になり、トランスフェクション効率及び細胞放出が妨げられる。
【0027】
既存の細胞培養溶液のこれら及び他の問題に対処するため、本開示の実施形態は、足場依存性細胞の効率的かつ高収量の細胞培養及び細胞産物（例えば、タンパク質、抗体、ウイルス粒子）の産生を可能にする、細胞増殖基材、このような基材のマトリクス、及び／又はこのような基材を使用する充填床システムを提供する。実施形態は、均一な細胞播種及び培地／栄養素の灌流、並びに効率的な細胞回収を可能にする、多孔性基材材料の規則正しい整然とした構成から作られた多孔率細胞培養マトリクスを含む。実施形態はまた、該実施形態の均一な性能を犠牲にすることなく、プロセス開発規模から完全な生産サイズ規模まで細胞を播種及び増殖させ、及び／又は細胞産物を回収することができる、基材及びバイオリアクタを備えた拡張可能な細胞培養ソリューションを可能にする。例えば、幾つかの実施形態では、バイオリアクタは、プロセス開発規模から製品規模まで容易に拡張することができ、生産規模全体にわたって基材の単位表面積あたりのウイルスゲノム（ＶＧ／ｃｍ２）が同等である。本明細書の実施形態の回収可能性及び拡張性により、同じ細胞基材上で複数のスケールで細胞集団を増殖させるための効率的なシードトレインでの使用が可能になる。加えて、本明細書の実施形態は、記載された他の特徴と組み合わせて、高収率の細胞培養ソリューションを可能にする、高表面積を有する細胞培養マトリクスを提供する。幾つかの実施形態では、例えば、本明細書で論じられる細胞培養基材及び／又はバイオリアクタは、バッチあたり１０１６から１０１８のウイルスゲノム（ＶＧ）を生成することができる。
【0028】
一実施形態では、マトリクスには、接着細胞が接着して増殖するための構造的に規定された表面積が設けられており、これは、良好な機械的強度を有し、充填床又は他のバイオリアクタ内でアセンブリされた場合に、非常に均一な多数の相互接続された流体ネットワークを形成する。特定の実施形態では、機械的に安定で非分解性の織布メッシュを基材として使用して、接着細胞の産生を支援することができる。本明細書に開示される細胞培養マトリクスは、高体積密度形式で足場依存性細胞の接着及び増殖を支援する。このようなマトリクスへの均一な細胞播種が達成でき、また、細胞又はバイオリアクタの他の生成物の効率的な回収も達成可能である。加えて、本開示の実施形態は、接種ステップ中に均一な細胞分布を提供し、開示されたマトリクス上に接着細胞のコンフルエントな単層又は多層を達成するための細胞培養を支援し、また、栄養素の拡散が制限され、代謝産物濃度が増加する、大きい及び／又は制御不能な３Ｄ細胞凝集体の形成を回避することができる。したがって、マトリクスはバイオリアクタの動作中の拡散制限を排除する。加えて、マトリクスは、バイオリアクタからの細胞回収を簡単かつ効率的に可能にする。１つ以上の実施形態の構造的に画定されたマトリクスは、完全な細胞回収及びバイオリアクタの充填床からの一貫した細胞回収を可能にする。
【0029】
幾つかの実施形態によれば、治療用タンパク質、抗体、ウイルスワクチン、又はウイルスベクターのバイオプロセス生産のためのマトリクスを備えたバイオリアクタを使用する細胞培養方法も提供される。
【0030】
細胞培養バイオリアクタに用いられる既存の細胞培養基材（すなわち、ランダムに構成された繊維の不織布基材）とは対照的に、本開示の実施形態は、画定された規則的な構造を有する細胞培養基材を含む。画定された規則的な構造により、一貫した予測可能な細胞培養結果が得られる。加えて、基材は、細胞の捕捉を防ぎ、充填層を通る均一な流れを可能にする、開放多孔率構造を有する。この構造は、細胞の播種、栄養素の送達、細胞の増殖、及び細胞の回収の向上を可能にする。１つ以上の特定の実施形態によれば、マトリクスは、シートの厚さが基材の第１の側と第２の側の幅及び／又は長さに比べて小さくなるように、比較的薄い厚さで分離された第１の側と第２の側とを有する薄いシート状構造を有する基材材料で形成される。加えて、複数の穴又は開口部が、基材の厚さを貫通して形成される。開口部間の基材材料は、細胞がほぼ二次元（２Ｄ）表面であるかのように基材材料の表面に接着でき、同時に基板材料の周囲及び開口部を通る適切な流体の流れも可能になるサイズ及び幾何学形状のものである。幾つかの実施形態では、基材はポリマーベースの材料であり、成形ポリマーシート；厚さ全体に穿孔された開口部を備えたポリマーシート；メッシュ様の層に融合された多数のフィラメント；３Ｄ印刷された基材；又は、メッシュ層へと織られた複数のフィラメントとして形成することができる。マトリクスの物理的構造は、足場依存性細胞を培養するための高い表面積対体積比を有する。さまざまな実施形態によれば、マトリクスは、均一な細胞播種及び増殖、均一な培地灌流、並びに効率的な細胞回収のために、本明細書で論じられるある特定の方法でバイオリアクタ内に配置又は充填することができる。
【0031】
本開示の実施形態は、バッチあたり約１０１４超のウイルスゲノム、バッチあたり約１０１５超のウイルスゲノム、バッチあたり約１０１６超のウイルスゲノム、バッチあたり約１０１７超のウイルスゲノム、又はバッチあたり最大約１０１６又はそれより多くのウイルスゲノムの規模で、ウイルスゲノムを産生することができる実用的なサイズのウイルスベクタープラットフォームを実現することができる。幾つかの実施形態では、産生は、バッチあたり、約１０１５から約１０１８又はそれより多くのウイルスゲノムである。例えば、幾つかの実施形態では、ウイルスゲノム収量は、バッチあたり約１０１５から約１０１６のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０１６から約１０１９のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０１６～１０１８のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０１７から約１０１９のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０１８から約１０１９のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０１８以上のウイルスゲノムでありうる。
【0032】
加えて、本明細書に開示される実施形態は、細胞培養基材への細胞の接着及び増殖だけでなく、培養細胞の生存可能な回収も可能にする。生細胞を回収できないことは、現在のプラットフォームの重大な欠点であり、生産能力に十分な数の細胞を構築及び維持することが困難になる。本開示の実施形態の一態様によれば、８０％から１００％が生存、又は約８５％から約９９％が生存、又は約９０％から約９９％が生存を含めて、細胞培養基材から生細胞を回収することができる。例えば、回収される細胞のうち、少なくとも８０％が生存、少なくとも８５％が生存、少なくとも９０％が生存、少なくとも９１％が生存、少なくとも９２％が生存、少なくとも９３％が生存、少なくとも９４％が生存、少なくとも９５％が生存、少なくとも９６％が生存、少なくとも９７％が生存、少なくとも９８％が生存、又は少なくとも９９％が生存する。細胞は、例えばトリプシン、ＴｒｙｐＬＥ、又はＡｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞培養基材から放出されうる。
【0033】
図１Ａ及び１Ｂは、それぞれ、本開示の１つ以上の実施形態の一例による、細胞培養基材１００の三次元（３Ｄ）斜視図及び二次元（２Ｄ）平面図を示している。細胞培養基材１００は、第１の方向に延びる第１の複数の繊維１０２と、第２の方向に延びる第２の複数の繊維１０４とからなる織布メッシュ層である。基材１００の織られた繊維は、１つ以上の幅又は直径（例えば、Ｄ１、Ｄ２）によって画定されうる複数の開口部１０６を形成する。開口部のサイズ及び形状は、織りのタイプ（例えば、フィラメントの数、形状、及びサイズ；交差するフィラメント間の角度など）に基づいて変化しうる。織布メッシュは、マクロスケールでは、二次元のシート又は層として特徴付けることができる。しかしながら、織布メッシュを詳しく調べてみると、交差するメッシュの繊維が上下することにより、立体的な構造が明らかになる。したがって、図１Ｃに示されるように、織布メッシュ１００の厚さＴは、単一の繊維の太さ（例えば、ｔ１）より厚くなりうる。本明細書で用いられる場合、厚さＴは、織布メッシュの第１の側１０８と第２の側１１０との間の最大厚さである。理論に束縛されるものではないが、基材１００の三次元構造は、接着細胞を培養するための大きい表面積を提供することから、有利であり、また、メッシュの構造的剛性により、均一な流体の流れを可能にする一貫した予測可能な細胞培養マトリクス構造を提供することができると考えられる。
【0034】
図１Ｂでは、開口部１０６は、対向する繊維１０２間の距離として画定される直径Ｄ１と、対向する繊維１０４間の距離として画定される直径Ｄ２とを有する。Ｄ１とＤ２は、織りの形状に応じて、等しくても、等しくなくてもよい。Ｄ１とＤ２が等しくない場合、大きい方を長径、小さい方を短径と呼ぶ。幾つかの実施形態では、開口部の直径とは、開口部の最も広い部分を指しうる。別段の指定がない限り、本明細書で用いられる開口部の直径は、開口部の対向する側部の平行な繊維間の距離を指す。
【0035】
複数の繊維１０２の所与の繊維は太さｔ１を有し、複数の繊維１０４の所与の繊維は太さｔ２を有する。図１Ａに示されるような円形断面の繊維、又は他の三次元断面の繊維の場合、太さｔ１及びｔ２は、繊維断面の最大直径又は太さである。幾つかの実施形態によれば、複数の繊維１０２はすべて、同じ太さｔ１を有し、複数の繊維１０４はすべて、同じ太さｔ２を有する。さらに、ｔ１とｔ２は等しくてもよい。しかしながら、１つ以上の実施形態では、ｔ１とｔ２は、例えば複数の繊維１０２が複数の繊維１０４とは異なる場合には、等しくない。加えて、複数の繊維１０２及び複数の繊維１０４の各々は、２つ以上の異なる太さ（例えば、ｔ１ａ、ｔ１ｂなど、及びｔ２ａ、ｔ２ｂなど）の繊維を含みうる。実施形態によれば、太さｔ１及びｔ２は、その上で培養される細胞のサイズに比べて大きく、その結果、繊維は細胞の観点から見るとほぼ平坦な表面を提供し、これにより、繊維サイズが小さい（例えば、細胞直径の規模で）他の幾つかの解決策と比較して、より優れた細胞の接着及び増殖が可能となる。図１Ａ～１Ｃに示されるように、織布メッシュの三次元的性質により、細胞の接着及び増殖に利用可能な繊維の２Ｄ表面積は、同等の平面２Ｄ表面における接着のための表面積を超える。
【0036】
１つ以上の実施形態では、繊維は、約５０μｍから約１０００μｍ；約１００μｍから約７５０μｍ；約１２５μｍから約６００μｍ；約１５０μｍから約５００μｍ；約２００μｍから約４００μｍ；約２００μｍから約３００μｍ；又は、約１５０μｍから約３００μｍの範囲の直径を有しうる。マイクロスケールレベルでは、細胞と比較した繊維のスケール（例えば、繊維の直径が細胞よりも大きい）に起因して、モノフィラメント繊維の表面は、接着細胞が接着し、増殖するための２Ｄ表面の近似として表示される。繊維は、約１００μｍ×１００μｍから約１０００μｍ×１０００μｍの範囲の開口部を有するメッシュへと織ることができる。幾つかの実施形態では、開口部は、約５０μｍから約１０００μｍ；約１００μｍから約７５０μｍ；約１２５μｍから約６００μｍ；約１５０μｍから約５００μｍ；約２００μｍから約４００μｍ；又は、約２００μｍから約３００μｍの直径を有しうる。フィラメント直径及び開口部直径のこれらの範囲は、幾つかの実施形態の例であるが、すべての実施形態によるメッシュの可能な特徴部サイズを制限することを意図するものではない。繊維直径と開口部直径との組合せは、例えば、細胞培養マトリクスが多数の隣接するメッシュ層（例えば、個々の層のスタック又は巻かれたメッシュ層）を含む場合に、基材を通る効率的で均一な流体の流れを提供するように選択される。
【0037】
繊維直径、開口部直径、及び織りのタイプ／パターンなどの要因により、細胞の接着及び増殖に利用可能な表面積が決まる。加えて、細胞培養マトリクスがスタック、ロール、又は重なり合う基材の他の構成を含む場合、細胞培養マトリクスの充填密度は充填床マトリクスの表面積に影響を与えるであろう。充填密度は、基材材料の充填厚さ（例えば、基材の層に必要なスペース）によって変化しうる。例えば、細胞培養マトリクスのスタックがある特定の高さを有する場合、スタックの各層は、スタックの全高をスタック内の層の数で割ることによって決定される充填厚さを有すると言うことができる。充填厚さは繊維の直径及び織り方に基づいて異なるが、スタック内の隣接する層の配置によっても変わりうる。例えば、織られた層の三次元的な性質に起因して、隣接する層が互いの位置合わせに基づいて対応することができる、ある程度のインターロッキング又は重なりが存在する。第１の位置合わせでは、隣接する層をしっかりと配置することができるが、第２の位置合わせでは、上層の最下点が下層の最上点と直接接触している場合など、隣接する層の重なりがゼロになることがある。ある特定の用途では、層の充填密度が低い（例えば、より高い透過性が優先される場合）、又は充填密度が高い（例えば、基材表面積を最大化することが優先される場合）、細胞培養マトリクスを提供することが望ましい場合がる。１つ以上の実施形態によれば、充填の厚さは、約５０μｍから約１０００μｍ；約１００μｍから約７５０μｍ；約１２５μｍから約６００μｍ；約１５０μｍから約５００μｍ；約２００μｍから約４００μｍ；約２００μｍから約３００μｍでありうる。
【0038】
上記構造因子により、単層の細胞培養基材であろうと、基材の複数の層を有する細胞培養マトリクスであろうと、細胞培養マトリクスの表面積を決定することができる。例えば、特定の実施形態では、円形で６ｃｍの直径を有する単層の織布メッシュ基材は、約６８ｃｍ２の有効表面積を有することができる。本明細書で用いられる「有効表面積」とは、細胞の接着及び増殖に利用可能な基材材料の一部における繊維の総表面積である。特に明記されていない限り、「表面積」への言及は、この有効表面積を指す。１つ以上の実施形態によれば、直径６ｃｍの単一織布メッシュ基材層は、約５０ｃｍ２から約９０ｃｍ２；約５３ｃｍ２から約８１ｃｍ２；約６８ｃｍ２；約７５ｃｍ２；又は約８１ｃｍ２の有効表面積を有しうる。これらの有効表面積の範囲は、例としてのみ提供されており、幾つかの実施形態は、異なる有効表面積を有しうる。細胞培養マトリクスは、本明細書の実施例で論じられるように、多孔率の観点から特徴付けることもできる。
【0039】
基材メッシュは、例えば、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール類、及びポリプロピレンオキシドを含む、細胞培養用途に適合するポリマー材料のモノフィラメント又はマルチフィラメント繊維から製造することができる。メッシュ基材は、例えば、編み物、経編み物、又は織物（例えば、平織、綾織、オランダ織、五本針織）を含む、異なるパターン又は織りを有することができる。
【0040】
メッシュフィラメントの表面化学は、所望の細胞接着特性を提供するために修飾する必要がある場合がある。このような修飾は、メッシュのポリマー材料の化学処理を通じて、又は細胞接着分子をフィラメント表面にグラフトすることによって行うことができる。あるいは、メッシュは、例えば、コラーゲン又はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を含む、細胞接着特性を実証する生体適合性ヒドロゲルの薄層でコーティングすることができる。あるいは、メッシュのフィラメント繊維の表面は、業界で知られているさまざまなタイプのプラズマ、処理ガス、及び／又は化学薬品を用いた処理プロセスを通じて細胞接着特性を与えることができる。しかしながら、１つ以上の実施形態では、メッシュは、表面処理なしに、効率的な細胞増殖表面を提供することができる。
【0041】
図２Ａ～２Ｃは、本開示の幾つかの企図される実施形態による織布メッシュの異なる例を示している。これらのメッシュの繊維直径と開口部サイズ、並びに同等の２Ｄ表面と比較したそれぞれのメッシュの単層によってもたらされる細胞培養表面積の増加のおおよその規模を、以下の表１にまとめる。表１において、メッシュＡは図２Ａのメッシュを指し、メッシュＢは図２Ｂのメッシュを指し、メッシュＣは図２Ｃのメッシュを指す。表１の３つのメッシュ形状は単なる例であり、本開示の実施形態はこれらの特定の例に限定されない。メッシュＣは表面積が最も大きいため、細胞の接着及び増殖において高密度を達成するのに有利であり、したがって細胞培養に最も効率的な基材を提供することができる。しかしながら、幾つかの実施形態では、例えば、培養チャンバ内で所望の細胞分布又は流れ特性を達成するために、メッシュＡ又はメッシュＢなどのより低い表面積を有するメッシュ、又は異なる表面積のメッシュの組合せを含むことが、細胞培養マトリクスにとって有利でありうる。
【0042】
【表1】
【0043】
上の表に示されるように、メッシュの三次元品質により、同等のサイズの平面２Ｄ表面と比較して、細胞の接着及び増殖のための表面積の増加がもたらされる。この増加した表面積は、本開示の実施形態によって達成されるスケーラブルな性能に役立つ。プロセス開発及びプロセスの検証研究では、試薬のコストを節約し、実験スループットを向上させるために、多くの場合、小規模のバイオリアクタが必要とされる。本開示の実施形態は、このような小規模な研究に適用可能であるが、同様に産業規模又は生産規模にスケールアップすることもできる。例えば、直径２．２ｃｍの円形の形状をした１００層のメッシュＣを、内径２．２ｃｍの円筒状の充填床に充填すると、細胞が接着及び増殖するために利用可能な総表面積は、約９３５ｃｍ２に等しくなる。このようなバイオリアクタを１０倍に拡張するには、７ｃｍの内径と１００層の同じメッシュとを備えた、円筒状の充填床の同様のセットアップを使用することもできる。このような場合、総表面積は９，３５０ｃｍ２になるであろう。幾つかの実施形態では、利用可能な表面積は約９９，０００ｃｍ２／Ｌ以上である。充填床でのプラグ型灌流流により、充填床の断面表面積のｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２で表される同じ流量を、バイオリアクタの小規模バージョン及び大規模バージョンで使用することができる。より大きい表面積により、より高い播種密度及びより高い細胞増殖密度が可能となる。１つ以上の実施形態によれば、本明細書に記載される細胞培養基材は、最大で２２，０００細胞／ｃｍ２以上の細胞播種密度を実証している。参考までに、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（登録商標）の二次元表面上での播種密度は、２０，０００細胞／ｃｍ２程度である。本明細書で用いられる場合、「プラグ型灌流流れ」又は「プラグ流れ」は、本明細書の実施形態による固定床を有するバイオリアクタを通る層流を指し、流れ方向に垂直な固定床の任意の断面を通る流れは、断面全体にわたって同じ速度で進む。
【0044】
より高い表面積及び高い細胞播種密度又は増殖密度の別の利点は、本明細書に開示される実施形態のコストが競合する解決策と同じかそれよりも低くなりうることである。具体的には、細胞製品あたり（例えば、細胞あたり、又はウイルスゲノムあたり）のコストを、他の充填床バイオリアクタと同等か又はそれより低くすることができる。
【0045】
十分な剛性を備えた構造的に画定された培養マトリクスを使用することにより、マトリクス又は充填床全体にわたる高い流動抵抗の均一性が達成される。さまざまな実施形態によれば、マトリクスは、単層又は多層フォーマットで配置することができる。この柔軟性により、拡散の制限が排除され、マトリクスに接着した細胞に栄養素と酸素が均一に供給される。加えて、開放マトリクスには充填床構成の細胞捕捉領域が欠けており、培養終了時に高い生存率での完全な細胞回収が可能になる。該マトリクスはまた、充填床の充填の均一性ももたらし、プロセス開発ユニットから大規模な産業用バイオプロセスユニットまでの直接的な拡張を可能にする。充填床から細胞を直接回収する能力は、複雑さが増し、細胞に有害なせん断応力を与えうるであろう、撹拌した又は機械的に振動させた容器内でマトリクスを再懸濁する必要性を排除する。さらに、細胞培養マトリクスの高い充填密度により、産業規模で管理可能な量で高いバイオプロセス生産性が得られる。
【0046】
図３Ａは、多層基材２００を備えたマトリクスの実施形態を示しており、図３Ｂは、同じ多層基材２００の平面図である。多層基材２００は第１のメッシュ基材層２０２と第２のメッシュ基材層２０４とを含む。第１の基材層２０２と第２の基材層２０４とが重なっているにもかかわらず、メッシュの形状（例えば、開口部直径の繊維直径に対する比）は、図３Ｂのフィラメントのない開口部２０６によって示されるように、第１の基材層２０２と第２の基材層２０４の開口部が重なり合い、流体が多層基材２００の全厚を通って流れる経路を提供するようなものである。
【0047】
図４は、図３Ｂの線Ｂ－Ｂにおける多層基材２００の断面図を示している。矢印２０８は、第２の基材層２０４の開口部を通過し、その後、第１の基材層２０２のフィラメントの周囲を通る、可能な流体流路を示している。メッシュ基材層の形状は、一又は複数の基材層を通る効率的かつ均一な流れを可能にするように設計される。さらには、マトリクス２００の構造は、複数の配向でマトリクスを通る流体の流れに適応することができる。例えば、図４に示されるように、バルク流体の流れの方向（矢印２０８で示される）は、第１の基材層２０２及び第２の基材層２０４の主側面に対して垂直である。しかしながら、マトリクスは、基材層の側面がバルクフロー方向と平行になるように、流れに対して配向することもできる。図５は、図４の線Ｃ－Ｃに沿った多層基材２００の断面図を示しており、マトリクス２００の構造は、多層基材２００の流体経路を通る流体の流れ（矢印２１０）を可能にする。流体の流れがメッシュ層の第１の側及び第２の側に対して垂直又は平行であることに加えて、マトリクスは、複数の基材片を中間の角度で配置することができ、あるいは流体の流れに対してランダムに配置することもできる。この配向の柔軟性は、織られた基材の本質的に等方性の流れ挙動によって可能になる。対照的に、既存のバイオリアクタの接着細胞用の基材は、この挙動を示さず、その代わりに充填床が優先的な流路を生成し、異方性透過性を備えた基材材料を有する傾向がある。本開示のマトリクスの柔軟性により、バイオリアクタ容器全体にわたるより良好かつより均一な透過性を可能にしつつ、さまざまな用途及びバイオリアクタ又は容器の設計での使用が可能となる。
【0048】
本明細書で論じられるように、１つ以上の実施形態によれば、細胞培養基材は、バイオリアクタ容器内で使用することができる。例えば、基材は、充填床バイオリアクタ構成で、又は三次元培養チャンバ内の他の構成で使用することができる。しかしながら、実施形態は三次元培養空間に限定されず、基材は二次元培養表面構成とみなされるうるものにおいても使用することができることが企図されており、ここで、基材の１つ以上の層は、平底の培養皿内などに平らに置かれ、細胞の培養基材を提供する。汚染の懸念があることから、容器は使用後に廃棄することができる使い捨て容器とすることができる。
【0049】
１つ以上の実施形態によれば、細胞培養マトリクスがバイオリアクタ容器の培養チャンバ内で用いられる、細胞培養システムが提供される。図６は、バイオリアクタ容器３０２の内部に細胞培養チャンバ３０４を有する、バイオリアクタ容器３０２を含む細胞培養システム３００の一例を示している。細胞培養チャンバ３０４内には、基材層３０８のスタックから作られた細胞培養マトリクス３０６がある。基材層３０８は、第１の面又は第２の面が、隣接する基材層の第１の面又は第２の面に面するようにスタックされる。バイオリアクタ容器３００は、一端に培地、細胞、及び／又は栄養素を培養チャンバ３０４に投入するための入口３１０を有し、反対端に培養チャンバ３０４から培地、細胞、又は細胞産物を除去するための出口３１２を有する。この方法で基材層をスタック可能にすることにより、画定された構造及びスタックされた基材を通る効率的な流体の流れに起因して、細胞の接着及び増殖に悪影響を与えることなく、システムを容易にスケールアップすることができる。容器３００は、概して、入口３１０及び出口３１２を有するものとして説明されるが、幾つかの実施形態では、培地、細胞、又は他の内容物を培養チャンバ３０４に流入及び培養チャンバ３０４から流出させるために、入口３１０及び出口３１２の一方又は両方を使用することができる。例えば、入口３１０は、細胞播種、灌流、又は培養段階中に培地又は細胞を培養チャンバ３０４に流すために使用することができるが、回収段階で入口３１０を通じて培地、細胞、又は細胞産物のうちの１つ以上を取り出すために使用することもできる。したがって、「入口」及び「出口」という用語は、それらの開口部の機能を制限することを意図するものではない。
【0050】
１つ以上の実施形態では、充填床の流れ抵抗及び体積密度は、異なる幾何学形状の基材層を交互に配置することによって制御することができる。特に、メッシュのサイズ及び幾何学形状（例えば、繊維の直径、開口部の直径、及び／又は開口部の幾何学形状）は、充填床形式における流体の流れ抵抗を規定する。異なるサイズ及び幾何学形状のメッシュを間に配置することにより、バイオリアクタの１つ以上の特定の部分において流れ抵抗を制御又は変更することができる。これにより、充填床内の液体灌流の均一性を向上させることができる。例えば、１０層のメッシュＡ（表１）に続いて１０層のメッシュＢ（表１）、さらに１０層のメッシュＣ（表１）を積み重ねて、所望の充填床特性を達成することができる。別の例として、充填床は、１０層のメッシュＢから始まり、次に５０層のメッシュＣ、さらに１０層のメッシュＢが続きうる。このような繰り返しパターンは、バイオリアクタ全体にメッシュが充填されるまで継続させてもよい。これらは単なる例であり、可能な組み合わせを制限することを意図するものではなく、説明の目的で使用されている。実際、異なるサイズのメッシュをさまざまに組み合わせて、細胞増殖表面の体積密度と流れ抵抗の異なるプロファイルを得ることが可能である。例えば、異なる体積細胞密度のゾーン（例えば、低／高／低／高などの密度のパターンを生成する一連のゾーン）を備えた充填床カラムは、異なるサイズのメッシュを交互に配置することによってアセンブリすることができる。
【0051】
図６では、バルク流方向は、入口３１０から出口３１２の方向になり、この例では、基材層３０８の第１及び第２の主面はバルク流方向に対して垂直である。対照的に、図７に示される例は、システム３２０が培養空間３２４内にバイオリアクタ容器３２２と、バルク流方向に平行な第１の側及び第２の側を有する基材３２８のスタックとを含む実施形態であり、バルク流方向は、入口３３０から入り、出口３３２から出る流線によって示される方向に対応する。したがって、本開示の実施形態のマトリクスは、いずれの構成においても採用することができる。システム３００及び３２０の各々において、基材３０８、３２８は、培養チャンバ３０４、３２４によって画定される内部空間を満たすようにサイズ調整及び形状化され、その結果、各容器内の培養空間が細胞増殖表面で満たされて、単位容積当たりの細胞の観点から効率を最大化する。図７は、複数の入口３３０及び複数の出口３３２を示しているが、システム３２０は単一の入口によって供給され、単一の出口を有してもよいことが企図されている。しかしながら、本明細書のさまざまな実施形態によれば、分配プレートは、充填床の断面全体にわたり培地、細胞、又は栄養素を分配するのに役立てるために使用することができ、したがって充填床を通る流体の流れの均一性を向上させることができる。したがって、複数の入口３３０は、より均一な流れを生成するために、分配プレートに充填床の断面にわたって複数の穴をどのように設けることができるかを表している。
【0052】
図８は、１つ以上の実施形態による細胞培養システム４００を示している。システム４００は、本明細書に開示される１つ以上の実施形態の細胞培養マトリクスを収容するバイオリアクタ４０２を含む。バイオリアクタ４０２は、培地調整容器４０４に流体接続することができ、システムは、調整容器４０４内の細胞培養培地４０６をバイオリアクタ４０２に供給することができる。培地調整容器４０４は、懸濁バッチ、流加培養、又は灌流培養のためのバイオプロセス産業で用いられる典型的なバイオリアクタに見られるセンサ及び制御部品を含むことができる。これらには、ＤＯ酸素センサ、ｐＨセンサ、酸素供給器／ガス散布ユニット、温度プローブ、並びに栄養素添加ポート及び塩基添加ポートが含まれるが、これらに限定されない。散布ユニットに供給されるガス混合物は、Ｎ２、Ｏ２、及びＣＯ２ガス用のガス流量コントローラによって制御することができる。培地調整容器４０４はまた、培地を混合するためのインペラも含む。上に挙げたセンサによって測定されるすべての培地パラメータは、培地調整容器４０４と通信する培地調整制御ユニット４１８によって制御することができ、細胞培養培地４０６の状態を測定及び／又は所望のレベルに調整することが可能である。図８に示されるように、培地調整容器４０４は、バイオリアクタ容器４０２とは別個の容器として提供される。これは、細胞が培養される場所とは別に培地を調整し、次いで調整された培地を細胞培養空間に供給することができるという点で利点を有しうる。しかしながら、幾つかの実施形態では、培地調整はバイオリアクタ容器４０２内で行うことができる。
【0053】
培地調整容器４０４からの培地４０６は、細胞を播種して培養を開始するための細胞接種材料の注入ポートも含みうる、入口４０８を介してバイオリアクタ４０２へと送給される。バイオリアクタ容器４０２はまた、そこを通じて細胞培養培地４０６が容器４０２から出る、１つ以上の出口４１０も含みうる。加えて、細胞又は細胞産物は出口４１０を通じて排出されうる。バイオリアクタ４０２からの流出物の内容を分析するために、ラインに１つ以上のセンサ４１２を設けることができる。幾つかの実施形態では、システム４００は、バイオリアクタ４０２への流れを制御するための流量制御ユニット４１４を含む。例えば、流量制御ユニット４１４は、１つ以上のセンサ４１２（例えば、Ｏ２センサ）から信号を受信し、その信号に基づいて、バイオリアクタ４０２への入口４０８の上流にあるポンプ４１６（例えば、蠕動ポンプ）に信号を送信することによって、バイオリアクタ４０２への流れを調整することができる。したがって、センサ４１２によって測定された要因の１つ又は組合せに基づいて、ポンプ４１６は、所望の細胞培養条件を得るために、バイオリアクタ４０２への流れを制御することができる。
【0054】
培地灌流速度は、培地調整容器４０４及び充填床バイオリアクタ出口４１０に位置したセンサからのセンサ信号を収集して比較する、信号処理ユニット４１４によって制御される。充填床バイオリアクタ４０２を通る培地灌流の充填流の性質により、栄養素、ｐＨ、及び酸素の勾配が充填床に沿って発生する。バイオリアクタの灌流流量は、図１１のフローチャートに従って、蠕動ポンプ４１６に動作可能に接続された流量制御ユニット４１４によって自動的に制御することができる。
【0055】
本開示の１つ以上の実施形態は、従来の方法とは異なる細胞接種ステップを提供する。従来の方法では、従来のマトリクスを備えた充填床が培地で満たされ、濃縮された接種材料が培地循環ループに注入される。細胞懸濁液は、従来の充填床マトリクス上での捕捉による細胞播種の不均一性を軽減するために、増加した流量でバイオリアクタを通ってポンピングされる。このような従来の方法では、細胞の大部分が充填床バイオリアクタに捕捉されるまで、高い流量での循環ループ内の細胞のポンピングがおそらく数時間継続される。しかしながら、従来の充填床バイオリアクタの不均一な深層濾過の性質に起因して、細胞は充填床内に不均一に分布しており、バイオリアクタの入口領域では細胞密度が高く、バイオリアクタの出口領域では細胞密度が低くなる。
【0056】
対照的に、本開示の実施形態によれば、バイオリアクタ内の培養チャンバの空隙容積と等しい体積の細胞接種材料が、バイオリアクタ４０２の入口４０８にある細胞接種材料注入ポートを通じて充填床に直接注入される（図８）。次いで、本明細書に記載される細胞培養マトリクス中に存在する均一かつ連続的な流体通路により、細胞懸濁液は充填床内に均一に分布する。播種の初期段階での重力に起因する細胞の沈降を防ぐために、接種材料の注入後すぐに培地の灌流を開始することができる。重力のバランスをとり、充填床バイオリアクタから細胞が洗い流されるのを回避するために、灌流流量は事前にプログラムされた閾値未満に維持される。したがって、初期の細胞接着段階では、細胞は充填床内で穏やかに転がり、均一な細胞の分布と利用可能な基材表面への接着が達成される。
【0057】
細胞培養マトリクスは、所望のシステムに応じて、培養チャンバ内で複数の構成で配置することができる。例えば、１つ以上の実施形態では、システムは、培養チャンバ内の画定された細胞培養空間の幅を横切って延びる幅を有する、基材の１つ以上の層を含む。このように基材の複数の層を所定の高さまでスタックすることができる。上で論じたように、基材の層は、１つ以上の層の第１の側及び第２の側が、培養チャンバ内の画定された培養空間を通る培地のバルク流方向に対して垂直になるように配置することができ、あるいは１つ以上の層の第１の側及び第２の側がバルク流方向に対して平行であってもよい。１つ以上の実施形態では、細胞培養マトリクスは、バルク流に対して第１の配向にある１つ以上の基材層と、第１の配向とは異なる第２の配向にある１つ以上の他の層とを含む。例えば、さまざまな層は、バルク流方向に対して平行又は垂直であるか、あるいはその間の何らかの角度をなす、第１の側及び第２の側を有しうる。
【0058】
１つ以上の実施形態では、細胞培養システムは、充填床構成の複数の個別の細胞培養基材片を含み、この基材片の長さ及び／又は幅は培養チャンバに比べて小さい。本明細書で用いられる場合、基材片の長さ及び／又は幅が培養空間の長さ及び／又は幅の約５０％以下であるとき、基材片は、培養チャンバに比べて小さい長さ及び／又は幅を有すると見なされる。したがって、細胞培養システムは、所望の配置で培養空間に充填された複数の基材片を含みうる。基材片の配置は、ランダム又はセミランダムであってもよいし、あるいは、基材片が実質的に同様の配向（例えば、水平、垂直、又はバルク流方向に対して０°から９０°の間の角度）で配向されるなど、所定の順序又は構成を有していてもよい。
【0059】
本明細書で用いられる「画定された培養空間」とは、細胞培養マトリクスによって占有され、細胞播種及び／又は培養が行われる、培養チャンバ内の空間を指す。画定された培養空間は、培養チャンバのほぼ全体を満たすことができ、あるいは培養チャンバ内の空間の一部を占有してもよい。本明細書で用いられる場合、「バルク流方向」は、細胞の培養中及び／又は培養チャンバへの培地の流入又は流出中の、細胞培養マトリクスを通るか又は細胞培養マトリクス上の流体又は培地のバルク質量流の方向として定義される。
【0060】
１つ以上の実施形態では、細胞培養マトリクスは、固定機構によって培養チャンバ内に固定される。固定機構は、細胞培養マトリクスの一部を、該マトリクスを取り囲む培養チャンバの壁、又は培養チャンバの一端のチャンバ壁に固定することができる。幾つかの実施形態では、固定機構は、細胞培養マトリクスの一部を、培養チャンバを通る部材、例えば、培養チャンバの長手方向軸に平行に走る部材、又は長手方向軸に垂直に走る部材に接着する。しかしながら、１つ以上の他の実施形態では、細胞培養マトリクスは、チャンバ又はバイオリアクタ容器の壁に固定的に取り付けられることなく、培養チャンバ内に含まれていてもよい。例えば、マトリクスは、該マトリクスがそれらの境界又は構造部材にしっかりと固定されることなく、バイオリアクタ容器の所定の領域内に保持されるように、培養チャンバの境界又はチャンバ内の他の構造部材によって収容されてもよい。
【0061】
幾つかの実施形態の一態様は、ローラボトル構成のバイオリアクタ容器を提供する。培養チャンバは、本開示に記載される１つ以上の実施形態による細胞培養マトリクス及び基材を収容することができる。ローラボトル構成では、バイオリアクタ容器は、該バイオリアクタ容器を容器の中心長手方向軸の周りを移動させるための手段に動作可能に取り付けられうる。例えば、バイオリアクタ容器は、中心長手方向軸の周りを回転することができる。回転は、連続的（例えば、一方向に継続する）であっても、不連続的（例えば、単一方向又は交互方向に断続的に回転する、あるいは前後の回転方向に振動する）であってもよい。動作中、バイオリアクタ容器の回転が、チャンバ内の細胞及び／又は流体を移動させる。この動きは、チャンバの壁に対して相対的であると見なすことができる。例えば、バイオリアクタ容器がその中心長手方向軸の周りを回転すると、重力により、流体、培地、及び／又は未接着細胞がチャンバの下部に向かって残る可能性がある。しかしながら、１つ以上の実施形態では、細胞培養マトリクスは本質的に容器に対して固定されているため、容器とともに回転する。１つ以上の他の実施形態では、細胞培養マトリクスは取り付けられておらず、容器が回転すると、容器に対して所望の程度まで自由に移動することができる。細胞は細胞培養マトリクスに接着することができるが、容器の移動により、細胞は培養チャンバ内の細胞培養培地又は液体、及び酸素又は他のガスの両方に曝露されうる。
【0062】
本開示の実施形態による細胞培養マトリクス、例えば織物又はメッシュ基材を含むマトリクスなどを使用することにより、ローラボトル容器には、接着細胞が接着、増殖、及び機能するために利用可能な表面積の増加がもたらされる。特に、ローラボトル内にモノフィラメントポリマー材料の織布メッシュの基材を使用すると、表面積は、標準的なローラボトルの約２．４から約４．８倍、又は約１０倍増加しうる。本明細書で論じられるように、メッシュ基材の各モノフィラメントストランドは、それ自体が接着細胞が接着するための２Ｄ表面として存在することができる。加えて、多層のメッシュをローラボトルに配置することができ、利用可能な総表面積が標準的なローラボトルの約２から２０倍の範囲に増加する。したがって、細胞播種、培地交換、及び細胞回収を含む既存のローラボトル設備及び処理は、本明細書に開示される改良型細胞培養マトリクスの追加によって、既存の動作インフラストラクチャ及び処理ステップへの影響を最小限に抑えつつ、変更することができる。
【0063】
バイオリアクタ容器は、任意選択的に、入口及び／又は出口手段に取り付けることができる１つ以上の出口を含む。１つ以上の出口を通じて、液体、培地、又は細胞をチャンバに供給したり、チャンバから取り出したりすることができる。容器内の単一のポートが入口と出口の両方として機能してもよく、あるいは専用の入口及び出口として複数のポートが設けられてもよい。
【0064】
１つ以上の実施形態の充填床細胞培養マトリクスは、該細胞培養マトリクス内に配置又は散在した任意の他の形態の細胞培養基材なしに、織られた細胞培養メッシュ基材から構成されうる。すなわち、本開示の実施形態の織られた細胞培養メッシュ基材は、既存のソリューションで用いられる不規則な不織布基材のタイプを必要としない、有効な細胞培養基材である。これにより、流れの均一性、回収可能性などに関連して本明細書で論じられる他の利点を備えた高密度細胞培養基材を提供しつつ、簡素化された設計及び構造の細胞培養システムが可能になる。
【0065】
本明細書で論じられるように、細胞培養基材及びバイオリアクタシステムは、多くの利点を提供した。例えば、本開示の実施形態は、ＡＡＶ（全血清型）及びレンチウイルスなどの多数のウイルスベクターのいずれかの産生を支援することができ、インビボ及びエクスビボの遺伝子治療用途に適用することができる。均一な細胞播種及び分布により、容器あたりのウイルスベクター収量が最大化され、生細胞の回収が可能な設計となっており、同じプラットフォームを使用する複数の増殖期間からなるシードトレインに有用である。加えて、本明細書の実施形態は、プロセス開発規模から生産規模まで拡張可能であり、最終的には開発時間とコストを節約する。本明細書に開示される方法及びシステムはまた、細胞培養プロセスの自動化及び制御を可能にして、ベクター収量を最大化し、再現性を向上させる。最後に、ウイルスベクターの生産レベルの規模（例えば、バッチあたり１０１６から１０１８のＡＡＶ ＶＧ）に達するために必要な容器の数は、他の細胞培養ソリューションと比較して大幅に削減することができる。
【0066】
実施形態は、中心長手方向軸の周りの容器の回転に限定されない。例えば、容器は、該容器に対して中心に位置しない軸の周りを回転してもよい。加えて、回転軸は水平軸でも垂直軸でもよい。
【実施例】
【0067】
本開示の細胞培養マトリクス、細胞培養システム、及び関連方法の有効性を実証するために、以下の実施例に従って、細胞の播種及び培養に関する研究を行った。
【0068】
実施例３
実施例３では、細胞を充填床バイオリアクタシステム内で培養し、バイオリアクタ内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生のためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションを実施した。実施例２と同じバイオリアクタ設定を実施例３でも使用した（例えば、図６を参照）。充填床は、１００枚のＰＥＴメッシュディスク（表１のメッシュＣ）を含んでいた。各ディスクの直径は約２０ｍｍであり、充填床の高さは約２５ｍｍで、細胞の接着及び増殖に利用可能な二次元表面積は合計約７６０ｃｍ２であった。バイオリアクタに接種するために、８ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞懸濁液（２００万細胞／ｍｌ）を充填床に直接注入した。約５０ｍｌの培地を含む培地保存容器をバイオリアクタ容器に流体的に接続した。＋１０％ＦＢＳ及び＋６ｍＭのＬ－グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）ＡＴＣＣ（登録商標）培地で細胞を７２時間培養した。保存容器内の培地のｐＨが７を下回ったら、培地を新しい培地と交換した。バイオリアクタの出口でｐＯ２の５０％以上の飽和及び７以上のｐＨを維持するように、灌流流量を適切に調整した。７２時間後、培養培地を＋１０％ＦＢＳ、＋６ｍＭのＬ－グルタミンを含む５０ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭ（１５－０１８）に交換し、トランスフェクション試薬を、ＡＡＶ２及びＰＥＩｐｒｏが２μｇ／ｍｌの最終濃度となるように１：２の比率で添加した。次の７２時間の間に、保存ボトル内のｐＨが７未満に低下した場合は、培養培地を新しい供給培地に交換した。バイオリアクタの出口でｐＯ２の５０％以上の飽和及び７以上のｐＨを維持するように、灌流流量を適切に調整した。５Ｘ ＴｒｙｐＬＥを使用して細胞を回収した。トランスフェクション効率は蛍光フローサイトメータで分析し、ウイルス粒子及びウイルスゲノム力価はＥＬＩＳＡ及びＰＣＲアッセイによって分析した。細胞培養の結果を表２に示す。ここで、「ＶＰ」はウイルスタンパク質を表し、「ＧＣ」はゲノムコピーを表す。
実施例３では、細胞を充填床バイオリアクタシステム内で培養し、バイオリアクタ内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生のためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションを実施した。実施例２と同じバイオリアクタ設定を実施例３でも使用した（例えば、図６を参照）。充填床は、１００枚のＰＥＴメッシュディスク（表１のメッシュＣ）を含んでいた。各ディスクの直径は約２０ｍｍであり、充填床の高さは約２５ｍｍで、細胞の接着及び増殖に利用可能な二次元表面積は合計約７６０ｃｍ２であった。バイオリアクタに接種するために、８ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞懸濁液（２００万細胞／ｍｌ）を充填床に直接注入した。約５０ｍｌの培地を含む培地保存容器をバイオリアクタ容器に流体的に接続した。＋１０％ＦＢＳ及び＋６ｍＭのＬ－グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）ＡＴＣＣ（登録商標）培地で細胞を７２時間培養した。保存容器内の培地のｐＨが７を下回ったら、培地を新しい培地と交換した。バイオリアクタの出口でｐＯ２の５０％以上の飽和及び７以上のｐＨを維持するように、灌流流量を適切に調整した。７２時間後、培養培地を＋１０％ＦＢＳ、＋６ｍＭのＬ－グルタミンを含む５０ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭ（１５－０１８）に交換し、トランスフェクション試薬を、ＡＡＶ２及びＰＥＩｐｒｏが２μｇ／ｍｌの最終濃度となるように１：２の比率で添加した。次の７２時間の間に、保存ボトル内のｐＨが７未満に低下した場合は、培養培地を新しい供給培地に交換した。バイオリアクタの出口でｐＯ２の５０％以上の飽和及び７以上のｐＨを維持するように、灌流流量を適切に調整した。５Ｘ ＴｒｙｐＬＥを使用して細胞を回収した。トランスフェクション効率は蛍光フローサイトメータで分析し、ウイルス粒子及びウイルスゲノム力価はＥＬＩＳＡ及びＰＣＲアッセイによって分析した。細胞培養の結果を表２に示す。ここで、「ＶＰ」はウイルスタンパク質を表し、「ＧＣ」はゲノムコピーを表す。
【0069】
【表2】
【0070】
下記表４は、異なる直径（２９ｍｍ及び６０ｍｍ）のバイオリアクタ容器を含む複数の実験に関連した上記の結果を示している。データは、より小さい容器（例えば、直径２９ｍｍ、表面積１６００ｃｍ２）とより大きい（例えば、直径６０ｍｍ、表面積６７８０ｃｍ２）容器及び／又は充填床マトリクスとの間で優れたスケーラビリティを示している。
【0071】
【表4】
【0072】
上で論じたように、本開示の実施形態は、比較的小さく実用的な設置面積で高密度の細胞を培養可能な充填床細胞培養マトリクス及び／又はバイオリアクタを提供することができる。例えば、上記表３及び４の実施例の６０ｍｍの細胞培養マトリクスは約６８７０ｃｍ２の表面積を有する。参考までに、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨＹＰＥＲフラスコ（登録商標）は約１７２０ｃｍ２の表面積を有する。表３及び４の直径６０ｍｍの細胞培養マトリクスは、ＨＹＰＥＲフラスコよりも小さいバイオリアクタに収容することができるが、それでもなお、回収時の細胞数が増加し、容器あたりの総ゲノムコピー数（ＧＣ、又はウイルスゲノム（ＶＧ））が増加する。図９Ａ～９Ｃは、表３及び４の直径６０ｍｍの基材を備えた２つのバイオリアクタ容器の数値をＨＹＰＥＲフラスコと比較して示しており、また、ＨＹＰＥＲフラスコよりも低いが、より高い表面積で補われる、ｃｍ２あたりのＧＣも示している。
【0073】
実施例６
本開示の基材の流れ均一性又は透過性をさらに調べるために、モデリングを使用して三次元細胞培養マトリクスの多孔率を理解した。織布ＰＥＴメッシュ基材のシートを、密に充填された構成と疎に充填された構成とでモデル化した。これらは、モデリングされた特定のメッシュシートのための基材スタックの充填密度の上限と下限を表している。特に、図１０Ａは密に充填された構成の平面図を示しており、図１０Ｂは同じスタックの側面断面図を示している。図１１Ａ及び１１Ｂは、それぞれ、疎に充填された構成の平面図及び断面図を示している。モデル化された構成ごとに、試料セル６００、６０２の単位体積当たりの多孔率を分析するために、同じ体積のメッシュ材料を囲む試料セル６００、６０２を規定した。各セル内の開放空間のモデル化された体積が、図１２Ａ（密に充填されたスタックの場合）及び１２Ｂ（疎に充填されたスタックの場合）に示されている。開放空間のパーセンテージで表された多孔率は、疎に充填されたセルでは約４０．８％、密に充填されたセルでは６１．４％であった。図１０Ａ～１１Ｂのモデル化されたスタックは、所与のメッシュ材料の最も密に充填された構成及び最も疎に充填された構成を表しているため、４０．８％及び６１．４％の多孔率が、この特定のメッシュ材料の多孔率の上限及び下限である。このメッシュ材料を使用するときの配置及び実際の充填密度に応じて、多孔率はこれらの極端な値の間に入りうる。しかしながら、細胞培養容器内のメッシュ寸法の変動及び基材の配置により、異なる範囲の多孔率が生じる可能性があることから、本開示の実施形態はこの多孔率範囲に限定されない。
本開示の基材の流れ均一性又は透過性をさらに調べるために、モデリングを使用して三次元細胞培養マトリクスの多孔率を理解した。織布ＰＥＴメッシュ基材のシートを、密に充填された構成と疎に充填された構成とでモデル化した。これらは、モデリングされた特定のメッシュシートのための基材スタックの充填密度の上限と下限を表している。特に、図１０Ａは密に充填された構成の平面図を示しており、図１０Ｂは同じスタックの側面断面図を示している。図１１Ａ及び１１Ｂは、それぞれ、疎に充填された構成の平面図及び断面図を示している。モデル化された構成ごとに、試料セル６００、６０２の単位体積当たりの多孔率を分析するために、同じ体積のメッシュ材料を囲む試料セル６００、６０２を規定した。各セル内の開放空間のモデル化された体積が、図１２Ａ（密に充填されたスタックの場合）及び１２Ｂ（疎に充填されたスタックの場合）に示されている。開放空間のパーセンテージで表された多孔率は、疎に充填されたセルでは約４０．８％、密に充填されたセルでは６１．４％であった。図１０Ａ～１１Ｂのモデル化されたスタックは、所与のメッシュ材料の最も密に充填された構成及び最も疎に充填された構成を表しているため、４０．８％及び６１．４％の多孔率が、この特定のメッシュ材料の多孔率の上限及び下限である。このメッシュ材料を使用するときの配置及び実際の充填密度に応じて、多孔率はこれらの極端な値の間に入りうる。しかしながら、細胞培養容器内のメッシュ寸法の変動及び基材の配置により、異なる範囲の多孔率が生じる可能性があることから、本開示の実施形態はこの多孔率範囲に限定されない。
【0074】
モデル化された多孔率の範囲に加えて、ＰＥＴ織布メッシュ基材の実際の充填床を使用して多孔率を測定した。測定は、それぞれ２２．４ｍｍの直径を有する１００枚のディスクを使用して、ランダムな配置で積み重ねて行った。１００枚のディスクのスタックの総重量は５．６５±０．２ｇであった。スタックのＰＥＴ材料の体積は、ＰＥＴ密度を１．３８ｇ／ｃｍ３であると仮定して、次式を使用して計算した：
ＶＰＥＴ＝（スタックの総重量）／（ＰＥＴの密度） 式２
したがって、５．６５ｇのＰＥＴのＰＥＴ体積ＶＰＥＴ（直径２２．４ｍｍのディス１００枚の場合）は、４．１ｍｌであると計算された。次に、ＰＥＴ体積ＶＰＥＴ及びスタック内の開放空間の体積を含む、スタックの総体積Ｖｔｏｔａｌを、次式を使用して計算した：
Ｖｔｏｔａｌ＝π×（０．５×ディスク直径）×（スタックされた床の高さ） 式３
１００枚のディスクのスタックは、２５±１ｍｍスタック高さを有していた。したがって、ディスク直径が２２．４ｍｍの場合、Ｖｔｏｔａｌは９．８５ｍｌであることがわかった。したがって、積層床の多孔率は以下を使用して計算することができる：
多孔率＝（Ｖｔｏｔａｌ－ＶＰＥＴ）／Ｖｔｏｔａｌ 式４
式４及び上記値を使用して、多孔率は５８．４％であると計算され、これは、モデルによって予測された範囲内である。
ＶＰＥＴ＝（スタックの総重量）／（ＰＥＴの密度） 式２
したがって、５．６５ｇのＰＥＴのＰＥＴ体積ＶＰＥＴ（直径２２．４ｍｍのディス１００枚の場合）は、４．１ｍｌであると計算された。次に、ＰＥＴ体積ＶＰＥＴ及びスタック内の開放空間の体積を含む、スタックの総体積Ｖｔｏｔａｌを、次式を使用して計算した：
Ｖｔｏｔａｌ＝π×（０．５×ディスク直径）×（スタックされた床の高さ） 式３
１００枚のディスクのスタックは、２５±１ｍｍスタック高さを有していた。したがって、ディスク直径が２２．４ｍｍの場合、Ｖｔｏｔａｌは９．８５ｍｌであることがわかった。したがって、積層床の多孔率は以下を使用して計算することができる：
多孔率＝（Ｖｔｏｔａｌ－ＶＰＥＴ）／Ｖｔｏｔａｌ 式４
式４及び上記値を使用して、多孔率は５８．４％であると計算され、これは、モデルによって予測された範囲内である。
【0075】
実施例７
実施例７では、さまざまなＰＥＴ織布メッシュ基材材料の透過性を比較した。表５は、この比較で使用したＰＥＴメッシュ試料を示している。
実施例７では、さまざまなＰＥＴ織布メッシュ基材材料の透過性を比較した。表５は、この比較で使用したＰＥＴメッシュ試料を示している。
【0076】
【表5】
【0077】
メッシュ試料Ａ～Ｆの写真が図１３に示されている。各メッシュ試料Ａ～Ｆの透過性の結果が図１４に示されている。図１５は、試料Ａ～Ｃについての圧力損失試験を示しており、試料Ａについては、異なる配置及び充填密度を有するスタックで圧力損失試験を実施した。破線はメッシュ試料Ａの最も密な充填密度と最も疎な充填密度を表しており、試料Ａ１は試料Ａ２よりも疎に充填されたスタックである。センチメートルあたりの圧力変化（Ｐａ）で表した圧力損失をＱ／Ａに対してプロットしている。
【0078】
実施例８
本明細書で論じられるように、本開示の実施形態は、拡張可能であり、かつ細胞集団を徐々に増加させるための細胞シードトレインの提供に使用することができる、細胞培養基材、バイオリアクタシステム、及び細胞又は細胞副生成物を培養する方法を提供する。既存の細胞培養ソリューションにおける問題の１つは、所与のバイオリアクタシステム技法をシードトレインの一部とすることができないことである。代わりに、細胞集団は通常、さまざまな細胞培養基材上でスケールアップされる。細胞はある特定の表面に順応し、異なる種類の表面に移されると効率の低下につながると考えられていることから、これは細胞集団に悪影響を与える可能性がある。したがって、細胞培養基材間又は技術間のこのような移行を最小限に抑えることが望ましいであろう。本開示の実施形態によって可能になるように、シードトレイン全体にわたって同じ細胞培養基材を使用することにより、細胞集団をスケールアップする効率が増加する。例えば、シードトレインは、第１の容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製のＴ１７５フラスコなど）に播種されるスターター細胞のバイアルから始めて、次に第２の容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製のＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（登録商標））に播種し、次に本発明の実施形態によるプロセス開発スケールのバイオリアクタシステム（基材の有効表面積は約２０，０００ｃｍ２）に播種し、次に本発明の実施形態による、より大きいバイオリアクタパイロットシステム（基材の有効表面積は約３００，０００ｃｍ２である）に播種することができる。このシードトレインの最後に、本開示の実施形態に従って、例えば約５，０００，０００ｃｍ２の表面積を有する生産規模のバイオリアクタ容器に細胞を播種することができる。細胞培養が完了したら、次に、回収及び精製のステップを行うことができる。回収は、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００など）を使用したｉｎ ｓｉｔｕでの細胞溶解、又は機械的溶解によって達成することができ、必要に応じて、さらに下流の処理を行うことができる。
本明細書で論じられるように、本開示の実施形態は、拡張可能であり、かつ細胞集団を徐々に増加させるための細胞シードトレインの提供に使用することができる、細胞培養基材、バイオリアクタシステム、及び細胞又は細胞副生成物を培養する方法を提供する。既存の細胞培養ソリューションにおける問題の１つは、所与のバイオリアクタシステム技法をシードトレインの一部とすることができないことである。代わりに、細胞集団は通常、さまざまな細胞培養基材上でスケールアップされる。細胞はある特定の表面に順応し、異なる種類の表面に移されると効率の低下につながると考えられていることから、これは細胞集団に悪影響を与える可能性がある。したがって、細胞培養基材間又は技術間のこのような移行を最小限に抑えることが望ましいであろう。本開示の実施形態によって可能になるように、シードトレイン全体にわたって同じ細胞培養基材を使用することにより、細胞集団をスケールアップする効率が増加する。例えば、シードトレインは、第１の容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製のＴ１７５フラスコなど）に播種されるスターター細胞のバイアルから始めて、次に第２の容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製のＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（登録商標））に播種し、次に本発明の実施形態によるプロセス開発スケールのバイオリアクタシステム（基材の有効表面積は約２０，０００ｃｍ２）に播種し、次に本発明の実施形態による、より大きいバイオリアクタパイロットシステム（基材の有効表面積は約３００，０００ｃｍ２である）に播種することができる。このシードトレインの最後に、本開示の実施形態に従って、例えば約５，０００，０００ｃｍ２の表面積を有する生産規模のバイオリアクタ容器に細胞を播種することができる。細胞培養が完了したら、次に、回収及び精製のステップを行うことができる。回収は、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００など）を使用したｉｎ ｓｉｔｕでの細胞溶解、又は機械的溶解によって達成することができ、必要に応じて、さらに下流の処理を行うことができる。
【0079】
シードトレイン内で（例えば、プロセス開発レベルからパイロットレベルまで、さらには生産レベルまで）同じ細胞培養基材を使用することの利点には、シードトレイン及び生産段階中に細胞が同じ表面に慣れることから得られる効率；シードトレインフェーズ中の手動のオープン操作の数の減少；本明細書に記載されるように、均一な細胞分布及び流体の流れによる充填床のより効率的な使用；並びに、ウイルスベクターの回収中に機械的又は化学的溶解を使用する柔軟性が含まれる。
【0080】
実施例９
本開示の基材の潜在的なウイルス産生収量の増加を理解するために、ＰＥＴ織布メッシュ基材の性能を、「ｉＣｅｌｌｉｓ」で用いられる基材と同様の基材材料の性能と比較した。表６は、簡略化されたバイオリアクタにおいてこれらの基材を使用して生成されるウイルス粒子の総量をまとめたものである。
本開示の基材の潜在的なウイルス産生収量の増加を理解するために、ＰＥＴ織布メッシュ基材の性能を、「ｉＣｅｌｌｉｓ」で用いられる基材と同様の基材材料の性能と比較した。表６は、簡略化されたバイオリアクタにおいてこれらの基材を使用して生成されるウイルス粒子の総量をまとめたものである。
【0081】
【表6】
【0082】
表６の結果から、一定数のウイルス粒子を生成するのに必要な基材材料の体積を計算することが可能である。例えば、表７に示されるように、生産規模のウイルスベクター産生の目標が３．００Ｅ＋１８個のウイルス粒子である場合、必要なＰＥＴ織布メッシュの量は、必要な不織布基材の量の約７分の１である。
【0083】
【表7】
【0084】
実施例１０
本開示の開放メッシュ基材を通る均一な流れを実証するために、充填床バイオリアクタを通る流体の流速をモデル化した。図１６Ａは、直径６ｃｍ、床の高さ１０ｃｍのＰＥＴ織布メッシュディスクの充填床領域６２２を有し、３５７枚のＰＥＴ織布メッシュ基材のディスクからなる容器６２０のモデリング結果を示している。流体速度の大きさが、示されているスケールに従って示されている。流速は入口６２４及び出口６２６付近では速いが、速度は充填床の高さに沿って及び幅全体を含む充填床領域６２２全体にわたって一定である。破線６２８で示される領域が、図１６Ｂに拡大図で示されており、流体が細胞培養マトリクスの均一な開放構造に入ると、速度が比較的一定になることが示されている。この例の充填床は、総表面積約２４，２１４ｃｍ２に相当する。モデルに示されている均一な流れを所与とすると、不均一な流れに曝露されるこの表面積のパーセンテージ（平均速度からの偏差が＞２．５％として定義される）は０％であった。
本開示の開放メッシュ基材を通る均一な流れを実証するために、充填床バイオリアクタを通る流体の流速をモデル化した。図１６Ａは、直径６ｃｍ、床の高さ１０ｃｍのＰＥＴ織布メッシュディスクの充填床領域６２２を有し、３５７枚のＰＥＴ織布メッシュ基材のディスクからなる容器６２０のモデリング結果を示している。流体速度の大きさが、示されているスケールに従って示されている。流速は入口６２４及び出口６２６付近では速いが、速度は充填床の高さに沿って及び幅全体を含む充填床領域６２２全体にわたって一定である。破線６２８で示される領域が、図１６Ｂに拡大図で示されており、流体が細胞培養マトリクスの均一な開放構造に入ると、速度が比較的一定になることが示されている。この例の充填床は、総表面積約２４，２１４ｃｍ２に相当する。モデルに示されている均一な流れを所与とすると、不均一な流れに曝露されるこの表面積のパーセンテージ（平均速度からの偏差が＞２．５％として定義される）は０％であった。
【0085】
容器のサイズがスケールアップされたときにこの均一な流れがどの程度維持されるかを実証するために、より広い充填床を備えた徐々に幅広になっている容器を使用して、図１６Ａと同様の追加のモデリングを行った。これらのより大きい容器についての不均一な流れのパーセンテージが表８に示されている。示されるように、リアクタが直径６０ｃｍまでスケールアップされた場合でも、不均一な流れの量は、基材の表面積の１パーセントの約半分以下のままである。これは、既存の細胞培養基材とは異なり、本明細書に記載の均一な開放織布メッシュ構造が充填床全体にわたって均一な流れを可能にすることを示している。
【0086】
【表8】
【0087】
実施例１１
本開示の織布メッシュ基材と既存市場の不織布の不規則な基材との間の透過性の違いをよりよく理解するために、これらの材料の透過性を測定する実験を行った。特に、ＰＥＴ織布メッシュを、不織布基材材料及び市販されている同様の不織布不規則基材と比較した。スタックされたディスクの充填床の織布メッシュ基材層に対して垂直な流れ、不織布基材のランダム充填床を通る流れ、及び不織布基材材料の固定シートを通る流れについて、透過性測定を行った。不織布メッシュは、繊維直径約２０μｍ、厚さ約０．１８ｍｍ、及び多孔率９１％を有していた。織布メッシュ基材は、直径約１６０μｍ、及び開口部直径２５０μｍを有していた。
本開示の織布メッシュ基材と既存市場の不織布の不規則な基材との間の透過性の違いをよりよく理解するために、これらの材料の透過性を測定する実験を行った。特に、ＰＥＴ織布メッシュを、不織布基材材料及び市販されている同様の不織布不規則基材と比較した。スタックされたディスクの充填床の織布メッシュ基材層に対して垂直な流れ、不織布基材のランダム充填床を通る流れ、及び不織布基材材料の固定シートを通る流れについて、透過性測定を行った。不織布メッシュは、繊維直径約２０μｍ、厚さ約０．１８ｍｍ、及び多孔率９１％を有していた。織布メッシュ基材は、直径約１６０μｍ、及び開口部直径２５０μｍを有していた。
【0088】
透過性を測定するために、細胞培養培地をシミュレートする試験に水を使用した。バイオリアクタ内で基材が通常経験する流れ条件をシミュレートするために、蠕動ポンプを使用して流量を１５～５０ｍｌ／ｃｍ２／分の間に制御した。試験条件下で被った試料の圧力損失が低かったため、モノメーターを使用して試料間の圧力差を測定した。基材の種類及び包装方法が異なるため、基材をわずかに異なる方法で保持した。
【0089】
図１７Ａに示されるように、不織布メッシュを横切る流れを測定するために、不織布基材７００を直径１２ｍｍのディスクへと切断し、Ｏリングでシールされた２つの開放された円筒形チャンバ間に１０レベルの基材を保持した。モノメーター７０２、７０４を開放チャンバに直接接続して、不織布基材全体にわたる流体の圧力損失を測定した。
【0090】
図１７Ｂに示されるように、ランダムに充填された不織布メッシュを通る流れを測定するために、基材を５ｍｍ×２５ｍｍのストリップへと切断し、充填床７１０を形成する直径２９ｍｍの円筒形チャンバに充填した。合計３ｇのメッシュストリップを３０ｍｌの容量に充填し、約４５ｍｍの床高さにした。充填されたストリップの両側で、２枚の開放織布メッシュのディスクを使用して充填床を閉じ込めた。床の両側には厚さ約３ｍｍの開放空間があり、厚さ１０ｍｍの多孔質材料７１６の２つの片を使用して、容器の入口及び出口での流れを再分配した。モノメーター７１２及び７１４で充填床７１０全体の圧力損失を測定した。
【0091】
図１７Ｃに示されるように、開放織布メッシュを通る流れを測定するために、メッシュ基材を直径２９ｍｍのディスクへと切断して、充填床７２０として円筒形チャンバに適合させた。床の高さが４５ｍｍになるまで、合計１７０枚のディスクを一層ずつ充填した。メッシュの各レベルの繊維の方向は互いに整列していなかった。流れはメッシュディスクを横切った（すなわち、ディスク表面に対して垂直）。床の両側に厚さ約３ｍｍの開放空間があり、厚さ１０ｍｍの多孔質材料７２６の２つの片を使用して、入口及び出口での流れを再分配した。モノメーター７２２及び７２４で充填床７２０全体の圧力損失を測定した。
【0092】
次の式（５）を使用して透過度を計算した：
【0093】
【数1】
【0094】
［式中、Ｑ＝流量；Ｋ＝透過度；Ａ＝試料又は充填床の面積；ｄＰ＝試験試料又は充填床全体の圧力損失；μ＝水の粘度；及び、ｄＬ＝試料の総厚又は充填床の高さである］。
【0095】
最終的に計算した透過度を図１８にまとめる。結果は、不織布メッシュは、はるかに低い、約７．５×１０－１２ｍ２の透過度を有しており、開放織布メッシュ全体の透過性の約１／５０であったことを示している。不織布メッシュを小さいストリップへと切断し、ランダムに充填すると、透過性が大幅に増加し、開放織布メッシュと同様になった。この増加した透過性は、上で論じたチャネリング効果に起因して、流れがメッシュストリップの周りをほとんど迂回した結果であると考えられる。
【0096】
測定された透過度に基づいて、不織布メッシュ及び開放織布メッシュを通る流れ及びその周囲の流れをシミュレートした。シミュレーションは、ＡＮＳＹＳ Ｆｌｕｅｎｔ ｖ１９．２ソフトウェアパッケージを使用して実施した。説明の目的で、図１９Ａ及び１９Ｂに示されるように、基材材料の表面が流れの方向に対して（ｉ）９０°及び（ｉｉ）４５°に整列するという２つのシナリオを研究した。どちらの場合も、同じレベルの隣接するメッシュ間の間隔が５ｍｍの場合、流れは大部分がメッシュの周囲にあり、メッシュを通過する流れはわずか約０．０２～０．００５％であった。これにより、メッシュの背後に大幅なデッドゾーンが形成され、充填床を通る不均一な流れが生じるであろう。不織布メッシュ片が流れ方向に対して垂直に完全に整列していない場合、不均一性はより深刻になる。
【0097】
開放織布メッシュの場合、開放構造により、メッシュを容易に通過できるようになり、開放メッシュ層の後ろにデッドゾーンが形成されなかった。織布メッシュの規則的な構造も、各レベルを通る均一な流れ分布に寄与すると考えられる。したがって、これにより、充填床全体を通るより均一な流れが可能になる。この比較は、基材材料の端部付近の流れの拡大図を示している、図２０Ａ（不織布メッシュ片）及び２０Ｂ（開放織布メッシュ基材）に明確に示されている。図２０Ａ及び２０Ｂの場合、６方向すべてにおける隣接するメッシュ片間の間隙が１ｍｍに短縮され、このような１つのメッシュ片の周期ドメインのみがシミュレートされている。図２０Ａは、流れが基材の周りをほとんどバイパスし、基材自体を通る流れがほとんどないため、不織布メッシュは非常に低い透過性を有することを示している。総質量流量の０．１７％のみが不織布メッシュを通過する。対照的に、開放織布メッシュははるかに高い透過性を有するため、図２０Ｂに示されるように、メッシュを通過する流れがより多くなる。２つの事例のカラーバーを比較すると、間隙を通るショートカット流が弱くなる。開放織布メッシュの場合、基材を通過する総質量流量は１０．７％もの高さに達し、これは、間隙が充填されている場合でさえも開放織布メッシュが優れた透過性を有することを示している。
【0098】
本明細書で論じられるように、複数の織布メッシュディスクをランダムに充填し、ディスク間の位置合わせに無数のばらつきを持たせることが可能である。しかしながら、可能な位置合わせの範囲は、充填密度に基づいた２つの理論上の制限（すなわち、最も密な充填と最も疎な充填）にまで縮小することができる。これら２つの理想条件又は境界条件により、大きい充填床を小さい周期領域へと単純化することができる。このモデルを使用して、最も密な充填限界と最も疎な充填限界とでは、基材の透過度がおよそ１０倍異なることが分かった。上記の実験的に測定された透過性データはこの範囲内に十分に収まっており、良好な検証ポイントとして機能する。このモデルは、両方の充填条件において、流れ方向での透過性が横方向での透過性と同様であることも示した。これは、本開示の織布メッシュが、不織布基材で見出されたように流れの方向を変化させる可能性が低く、基材の向きに関係なく、流れをより均一にすることを示唆している。以下の実施例における滞留時間分布（ＲＴＤ）測定によって、本開示の基材の改善された流れ均一性がさらに実証された。
【0099】
実施例１２
滞留時間分布（ＲＴＤ）は、容器内の流れを研究するのに役立つツールである。その理論、測定、及び分析は次のテキストに記載されている：Levenspiel, O. Chemical Reaction Engineering. 3ed. 1999. Wiley. New York。図２１は、ＲＴＤを測定するためのセットアップの概略図を示している。チャンバは直径２９ｍｍの円筒形状であり、３．６ｇの不織布メッシュ又は２００層の開放織布メッシュを含む合計３６ｍｌの充填床体積を容器チャンバに充填した。１：２０００希釈のＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ｇｒｅｅｎ Ｆｏｏｄ Ｃｏｌｏｒを測定用のトレーサとして使用した。Ｆｌｏｗｃｅｌｌを備えたＵＶ－ｖｉｓを使用して、トレーサ濃度の変化を監視した。すべての実験において２２．５ｍｌ／ｍｌの流量を使用した。まず、チャンバを水で満たした。緑色の染料に切り替えた後、ＯＤの変化を記録した。結果が図２２に示されている。
滞留時間分布（ＲＴＤ）は、容器内の流れを研究するのに役立つツールである。その理論、測定、及び分析は次のテキストに記載されている：Levenspiel, O. Chemical Reaction Engineering. 3ed. 1999. Wiley. New York。図２１は、ＲＴＤを測定するためのセットアップの概略図を示している。チャンバは直径２９ｍｍの円筒形状であり、３．６ｇの不織布メッシュ又は２００層の開放織布メッシュを含む合計３６ｍｌの充填床体積を容器チャンバに充填した。１：２０００希釈のＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ｇｒｅｅｎ Ｆｏｏｄ Ｃｏｌｏｒを測定用のトレーサとして使用した。Ｆｌｏｗｃｅｌｌを備えたＵＶ－ｖｉｓを使用して、トレーサ濃度の変化を監視した。すべての実験において２２．５ｍｌ／ｍｌの流量を使用した。まず、チャンバを水で満たした。緑色の染料に切り替えた後、ＯＤの変化を記録した。結果が図２２に示されている。
【0100】
次式を使用して、平均滞留時間ｔ（式（６））と分散σ（式（７））を計算した：
【0101】
【数2】
【0102】
ここで、Ｆは、ステップトレーサー応答における正規化された濃度である。表９は、計算された平均滞留時間と測定値からの分散をまとめたものである。開放織布メッシュは平均滞留時間がより短いことを示しているが、これはおそらく、多孔率の低下とデッドゾーンの減少によって引き起こされたと考えられる。開放織布メッシュの充填床では、多孔率は約６０％であったが、不織布メッシュの多孔率はさらに高い多孔率を有しており、約９３％であった。不織布メッシュの充填床で検出されたはるかに高い正規化分散は、不織布メッシュにおける流れが均一性不十分であったか、又は理想的ではなかったことを示唆している。
【0103】
【表9】
【0104】
上で説明したのと同じセットアップを使用して、他の市販の充填床基材材料のＲＴＤを測定した。供給業者の推奨に基づいて、疎な充填を避けるために、充填密度を計算した。容器を通って流れる水の量による染料濃度の変化が図２３に示されている。前のセクションで説明したように、測定された染料変化を使用して、正規化分散を計算した。計算された分散が表１０に示されている。
【0105】
【表10】
【0106】
上記の透過性及び滞留時間の実験から、現在のバイオリアクタで用いられる種類の不織布の不規則な細胞培養基材は、本開示の基材よりも低い透過性を有することが示される。これらの不織布基材はまた、該不織布基材に対する流れの方向に応じて異なる透過性又は流量を有するのに対し、本開示の基材は本質的に等方性の流れ挙動を示す。不織布基材の不均一な流れ及び短い滞留時間に起因して、栄養分及びトランスフェクション試薬が基材表面上又は基材層の反対側にある細胞へと到達するまでに、本開示の均一な織布メッシュ基材と比較して時間がかかる可能性がある。これに加えて、ランダムに充填された不織布基材は透過性が高く、これは、強力なチャネリング効果、したがって細胞又は栄養素の不均一な送達を示唆している。
【0107】
例示的な実装形態
以下は、開示された主題の実装形態のさまざまな態様の説明である。各態様は、開示された主題のさまざまな特徴、特性、又は利点のうちの１つ以上を含みうる。実装形態は、開示された主題の幾つかの態様を説明することを意図しており、すべての可能な実装形態の包括的又は網羅的な説明と見なされるべきではない。
以下は、開示された主題の実装形態のさまざまな態様の説明である。各態様は、開示された主題のさまざまな特徴、特性、又は利点のうちの１つ以上を含みうる。実装形態は、開示された主題の幾つかの態様を説明することを意図しており、すべての可能な実装形態の包括的又は網羅的な説明と見なされるべきではない。
【0108】
態様１は、細胞を培養するための充填床バイオリアクタシステムに関し、該システムは、少なくとも１つの内部リザーバ、該リザーバに流体接続された入口、及びリザーバに流体接続された出口を備えた細胞培養容器と、リザーバ内に配置され、固定床として構成された細胞培養マトリクスとを含み、該細胞培養マトリクスは細胞が接着するように構成された基材を含み、細胞培養マトリクスは、該細胞培養マトリクス全体にわたりリザーバ内の均一な流れを維持するように構成される。
【0109】
態様２は、細胞培養マトリクスが多層基材を含み、多層基材の各層が実質的に規則的かつ均一な物理的構造及び多孔率を含む、態様１に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0110】
態様３は、細胞培養マトリクスが実質的に均一な多孔率を含む、態様１に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0111】
態様４は、均一な流れが層流を含む、態様１に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0112】
態様５は、リザーバが長さ及び幅によって規定され、長さが入口に隣接したリザーバの第１の端から出口に隣接したリザーバの第２の端まで延び、細胞培養マトリクスが、リザーバの実質的に幅全体にわたって延びる幅を有する、態様１に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0113】
態様６は、多層基材が、リザーバ内にスタックされた複数の基材ディスクを含む、態様２に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0114】
態様７は、複数の基材ディスクのスタックが、複数の基材ディスクの各々の幅全体にわたって実質的に均一な流体流れを示すように構成される、態様６に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0115】
態様８は、多層基材が多孔率を規定する複数の開口部を含み、該複数の開口部が複数の基材ディスクの各ディスク内に規則的なパターン又は均一なパターンで配列される、態様６に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0116】
態様９は、多層基材が成形ポリマー格子、３Ｄ印刷された格子、及び織布基材のうちの少なくとも１つを含む、態様１に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0117】
態様１０は、多層基材が、細胞が接着するように構成された表面を備えた複数の織り合わされた繊維を有する織布基材を含み、該複数の織り合わされた繊維が複数の開口部を画成する、態様９に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0118】
態様１１は、細胞培養マトリクスが複数の織布基材を含み、各織布基材が、第１の側と、該第１の側とは反対側にある、織布基材の厚さによって第１の側から分離された第２の側とを有する、態様１０に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0119】
態様１２は、複数の織布基材が、該基材の第１の側及び第２の側のうちの一方が隣接する基材の第１の側又は第２の側に面するように、積み重ねて配列される、態様１１に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0120】
態様１３は、複数の基材の少なくとも一部が、スペーサ材料若しくは障壁によって分離されない、又は互いに物理的に接触している、態様１１に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0121】
態様１４は、細胞培養マトリクスが、バイオリアクタ容器を通る培地のバルク流れ方向が第１の側及び第２の側に対して垂直になるようにバイオリアクタ容器内に配置される、態様１１に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0122】
態様１５は、細胞培養マトリクスが、該細胞培養マトリクスの表面積の少なくとも９０％にわたって均一な流体流れを示す、態様１に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0123】
態様１６は、細胞培養マトリクスが、流体の流れの方向に細胞培養マトリクスの長さにわたってプラグ流れを示す、態様１に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0124】
態様１７は、細胞培養マトリクスが３．４×１０－１０ｍ２を超える透過度を示す、態様１に記載の充填床バイオリアクタシステムに関する。
【0125】
定義
「全合成」又は「完全合成」とは、完全に合成原料から構成され、動物由来又は動物起源の材料を欠いている、マイクロキャリア又は培養容器の表面などの細胞培養物品を指す。本開示の全合成された細胞培養物品は、異種汚染のリスクを排除する。
「全合成」又は「完全合成」とは、完全に合成原料から構成され、動物由来又は動物起源の材料を欠いている、マイクロキャリア又は培養容器の表面などの細胞培養物品を指す。本開示の全合成された細胞培養物品は、異種汚染のリスクを排除する。
【0126】
「含む（Ｉｎｃｌｕｄｅ，ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、又は同様の用語は、網羅的であるが限定的ではない、すなわち包括的であって排他的ではないことを意味する。
【0127】
「ユーザ」とは、本明細書に開示されているシステム、方法、物品、又はキットを使用する人々を指し、細胞又は細胞産生物を回収するために細胞を培養している人々、又は本明細書の実施形態に従って培養及び／又は回収された細胞又は細胞産生物を使用する人々を含む。
【0128】
本開示の実施形態を説明する際に採用される、例えば、組成物中の成分の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、圧力、粘度などの値、及びそれらの範囲、又は構成要素の寸法及び同様の値並びにそれらの範囲を変更する「約」は、例えば、材料、組成物、複合材料、濃縮物、構成部品、製造品、又は使用製剤の調製に使用される一般的な測定及び取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意によるエラーを通じて；方法を実行するために使用される出発材料又は原料の製造、供給源、又は純度の違いを通じて；及び同様の考慮事項を通じて発生する可能性のある数量の変動を指す。「約」という用語は、特定の初期濃度又は混合物を伴う組成物又は製剤の劣化に起因して異なる量、及び特定の初期濃度又は混合物を伴う組成物又は製剤の混合又は加工に起因して異なる量も包含する。
【0129】
「任意選択的な」又は「任意選択的に」とは、その後に記載される事象又状況が発生してもしなくてもよいこと、及び、その記載が、当該事象又状況が発生する場合と発生しない場合を含むことを意味する。
【0130】
本明細書で用いられる不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」及びその対応する定冠詞「ｔｈｅ」は、別段の指定がない限り、少なくとも１つ又は１つ以上を意味する。
【0131】
当業者によく知られている略語が用いられることがある（例えば、時間を「ｈ」又は「ｈｒｓ」、グラムを「ｇ」又は「ｇｍ」、ミリリットルを「ｍＬ」、室温を「ｒｔ」、ナノメートルを「ｎｍ」、及び同様の略語）。
【0132】
成分、原料、添加剤、寸法、条件、及び同様の特徴、並びにそれらの範囲について開示されている特定の好ましい値は、例示のみを目的としており、他の定義された値又は定義された範囲内の他の値を除外しない。本開示のシステム、キット、及び方法は、本明細書に記載されるいずれかの値、特定の値、さらに具体的な値、及び好ましい値のうちの任意の値又は任意の組合せを含みうる。
【0133】
特に明記しない限り、本明細書に記載の任意の方法は、そのステップが特定の順序で実行されることを必要とすると解釈されることは、決して意図していない。したがって、方法クレームがその工程が従うべき順序を実際に列挙していないか、又は工程が特定の順序に限定されるべきであることが特許請求の範囲又は明細書に具体的に述べられていない場合には、いかなる特定の順序も、推測されることは、決して意図していない。
【0134】
開示される実施形態の精神又は範囲から逸脱することなく、さまざまな修正及び変更を加えることができることは、当業者にとって明白であろう。 実施形態の精神及び本質を組み込んだ開示された実施形態の修正、組合せ、部分組合せ、及び変形が当業者に想起されうることから、本開示の実施形態は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内のあらゆるものを含むと解釈されるべきである。
【0135】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【0136】
実施形態１
細胞培養用の充填床バイオリアクタシステムにおいて、該システムが、
少なくとも１つの内部リザーバ、前記リザーバに流体接続された入口、及び前記リザーバに流体接続された出口を備えた細胞培養容器、並びに
前記リザーバ内に配置され、固定床として構成された細胞培養マトリクスであって、細胞が接着するように構成された基材を含む、細胞培養マトリクス
を備えており、
前記細胞培養マトリクスが、該細胞培養マトリクス全体にわたって前記リザーバ内の均一な流れを維持するように構成される、
充填床バイオリアクタシステム。
細胞培養用の充填床バイオリアクタシステムにおいて、該システムが、
少なくとも１つの内部リザーバ、前記リザーバに流体接続された入口、及び前記リザーバに流体接続された出口を備えた細胞培養容器、並びに
前記リザーバ内に配置され、固定床として構成された細胞培養マトリクスであって、細胞が接着するように構成された基材を含む、細胞培養マトリクス
を備えており、
前記細胞培養マトリクスが、該細胞培養マトリクス全体にわたって前記リザーバ内の均一な流れを維持するように構成される、
充填床バイオリアクタシステム。
【0137】
実施形態２
前記細胞培養マトリクスが多層基材を含み、該多層基材の各層が、実質的に規則的かつ均一な物理的構造及び多孔率を含む、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記細胞培養マトリクスが多層基材を含み、該多層基材の各層が、実質的に規則的かつ均一な物理的構造及び多孔率を含む、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0138】
実施形態３
前記細胞培養マトリクスが実質的に均一な多孔率を含む、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記細胞培養マトリクスが実質的に均一な多孔率を含む、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0139】
実施形態４
前記均一な流れが層流を含む、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記均一な流れが層流を含む、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0140】
実施形態５
前記リザーバが長さ及び幅によって規定され、前記長さが前記入口に隣接した前記リザーバの第１の端から前記出口に隣接した前記リザーバの第２の端まで延び、前記細胞培養マトリクスが前記リザーバの実質的に幅全体にわたって延びる幅を有する、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記リザーバが長さ及び幅によって規定され、前記長さが前記入口に隣接した前記リザーバの第１の端から前記出口に隣接した前記リザーバの第２の端まで延び、前記細胞培養マトリクスが前記リザーバの実質的に幅全体にわたって延びる幅を有する、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0141】
実施形態６
前記多層基材が、前記リザーバ内にスタックされた複数の基材ディスクを含む、実施形態２に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記多層基材が、前記リザーバ内にスタックされた複数の基材ディスクを含む、実施形態２に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0142】
実施形態７
前記複数の基材ディスクの前記スタックが、前記複数の基材ディスクの各々の幅全体にわたって実質的に均一な流体流れを示すように構成される、実施形態６に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記複数の基材ディスクの前記スタックが、前記複数の基材ディスクの各々の幅全体にわたって実質的に均一な流体流れを示すように構成される、実施形態６に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0143】
実施形態８
前記多層基材が、前記多孔率を規定する複数の開口部を含み、前記複数の開口部が、前記複数の基材ディスクの各ディスク内に規則的なパターン又は均一なパターンで配列される、実施形態６に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記多層基材が、前記多孔率を規定する複数の開口部を含み、前記複数の開口部が、前記複数の基材ディスクの各ディスク内に規則的なパターン又は均一なパターンで配列される、実施形態６に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0144】
実施形態９
前記多層基材が、成形ポリマー格子、３Ｄ印刷された格子、及び織布基材のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記多層基材が、成形ポリマー格子、３Ｄ印刷された格子、及び織布基材のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0145】
実施形態１０
前記多層基材が、細胞が接着するように構成された表面を備えた複数の織り合わされた繊維を有する前記織布基材を含み、前記複数の織り合わされた繊維が複数の開口部を画成する、実施形態９に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記多層基材が、細胞が接着するように構成された表面を備えた複数の織り合わされた繊維を有する前記織布基材を含み、前記複数の織り合わされた繊維が複数の開口部を画成する、実施形態９に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0146】
実施形態１１
前記細胞培養マトリクスが複数の織布基材を含み、各織布基材が、第１の側と、該第１の側とは反対側にあり、前記織布基材の厚さによって前記第１の側から分離されている第２の側とを有する、実施形態１０に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記細胞培養マトリクスが複数の織布基材を含み、各織布基材が、第１の側と、該第１の側とは反対側にあり、前記織布基材の厚さによって前記第１の側から分離されている第２の側とを有する、実施形態１０に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0147】
実施形態１２
前記複数の織布基材が、該基材の前記第１の側及び第２の側のうちの一方が、隣接する基材の前記第１の側又は第２の側に面するように積み重ねて配列される、実施形態１１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記複数の織布基材が、該基材の前記第１の側及び第２の側のうちの一方が、隣接する基材の前記第１の側又は第２の側に面するように積み重ねて配列される、実施形態１１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0148】
実施形態１３
前記複数の基材の少なくとも一部が、スペーサ材料若しくは障壁によって分離されていない、又は互いに物理的に接触している、実施形態１１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記複数の基材の少なくとも一部が、スペーサ材料若しくは障壁によって分離されていない、又は互いに物理的に接触している、実施形態１１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0149】
実施形態１４
前記細胞培養マトリクスが、前記バイオリアクタ容器を通る培地のバルク流れ方向が前記第１の側及び第２の側に対して垂直になるように、前記バイオリアクタ容器内に配置される、実施形態１１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記細胞培養マトリクスが、前記バイオリアクタ容器を通る培地のバルク流れ方向が前記第１の側及び第２の側に対して垂直になるように、前記バイオリアクタ容器内に配置される、実施形態１１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0150】
実施形態１５
前記細胞培養マトリクスが、該細胞培養マトリクスの表面積の少なくとも９０％にわたって均一な流体流れを示す、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記細胞培養マトリクスが、該細胞培養マトリクスの表面積の少なくとも９０％にわたって均一な流体流れを示す、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0151】
実施形態１６
前記細胞培養マトリクスが、流体の流れの方向に前記細胞培養マトリクスの長さにわたってプラグ流れを示す、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記細胞培養マトリクスが、流体の流れの方向に前記細胞培養マトリクスの長さにわたってプラグ流れを示す、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【0152】
実施形態１７
前記細胞培養マトリクスが３．４×１０－１０ｍ２を超える透過度を示す、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
前記細胞培養マトリクスが３．４×１０－１０ｍ２を超える透過度を示す、実施形態１に記載の充填床バイオリアクタシステム。
【符号の説明】
【0153】
１００ 細胞培養基材／織布メッシュ
１０２ 第１の複数の繊維
１０４ 第２の複数の繊維
１０８ 第１の側
１１０ 第２の側
２００ 多層基材
２０２ 第１のメッシュ基材層
２０４ 第２のメッシュ基材層
２０６ 開口部
３００ 細胞培養システム／バイオリアクタ容器
３０２ バイオリアクタ容器
３０４ 細胞培養チャンバ
３０６ 細胞培養マトリクス
３０８ 基材層
３１０ 入口
３１２ 出口
３２０ システム
３２２ バイオリアクタ容器
３２４ 培養空間／培養チャンバ
３２８ 基材
３３０ 入口
３３２ 出口
４００ 細胞培養システム
４０２ バイオリアクタ
４０４ 培地調整容器
４０６ 細胞培養培地
４０８ 入口
４１０ 出口
４１２ センサ
４１４ 流量制御ユニット
４１６ 蠕動ポンプ
４１８ 培地調整制御ユニット
６２０ 容器
６２２ 充填床領域
６２４ 入口
６２６ 出口
７００ 不織布基材
７０２，７０４ モノメーター
７１０ 充填床
７１２，７１４ モノメーター
７１６ 多孔質材料
７２０ 充填床
７２２，７２４ モノメーター
７２６ 多孔質材料
１０２ 第１の複数の繊維
１０４ 第２の複数の繊維
１０８ 第１の側
１１０ 第２の側
２００ 多層基材
２０２ 第１のメッシュ基材層
２０４ 第２のメッシュ基材層
２０６ 開口部
３００ 細胞培養システム／バイオリアクタ容器
３０２ バイオリアクタ容器
３０４ 細胞培養チャンバ
３０６ 細胞培養マトリクス
３０８ 基材層
３１０ 入口
３１２ 出口
３２０ システム
３２２ バイオリアクタ容器
３２４ 培養空間／培養チャンバ
３２８ 基材
３３０ 入口
３３２ 出口
４００ 細胞培養システム
４０２ バイオリアクタ
４０４ 培地調整容器
４０６ 細胞培養培地
４０８ 入口
４１０ 出口
４１２ センサ
４１４ 流量制御ユニット
４１６ 蠕動ポンプ
４１８ 培地調整制御ユニット
６２０ 容器
６２２ 充填床領域
６２４ 入口
６２６ 出口
７００ 不織布基材
７０２，７０４ モノメーター
７１０ 充填床
７１２，７１４ モノメーター
７１６ 多孔質材料
７２０ 充填床
７２２，７２４ モノメーター
７２６ 多孔質材料
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図21】
【図22】
【図23】
【国際調査報告】