特表 2024-529493 ヒト腫瘍壊死因子アルファ抗体グルココルチコイドコンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-06

(54)【発明の名称】ヒト腫瘍壊死因子アルファ抗体グルココルチコイドコンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/24 20060101AFI20240730BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240730BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240730BHJP

【ＦＩ】

C07K16/24 ZNA

A61K47/68

A61K31/573

A61K39/395 U

A61K39/395 L

A61P21/00

A61P27/02

A61P1/04

A61P19/00

A61P17/06

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P29/00

A61P37/06

A61P17/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024505396

(86)(22)【出願日】2023-05-05

(85)【翻訳文提出日】2024-01-29

(86)【国際出願番号】 US2023066634

(87)【国際公開番号】W WO2023220549

(87)【国際公開日】2023-11-16

(31)【優先権主張番号】63/341,691

(32)【優先日】2022-05-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100126778

【弁理士】

【氏名又は名称】品川 永敏

(74)【代理人】

【識別番号】100162684

【弁理士】

【氏名又は名称】呉 英燦

(72)【発明者】

【氏名】チャオ，グレイス

(72)【発明者】

【氏名】クレイトン，ジョシュア アール

(72)【発明者】

【氏名】クランプトン，ジョーダン スコット

(72)【発明者】

【氏名】フェン，イーチン

(72)【発明者】

【氏名】レオン，ドンミエンヌ ドエン ムン

(72)【発明者】

【氏名】ナ，ソンチン

(72)【発明者】

【氏名】ニューバーン，クリステン ペイジ

(72)【発明者】

【氏名】ポッター，スコット チャールズ

(72)【発明者】

【氏名】ラマムルティ，バラティ

(72)【発明者】

【氏名】ストーケル，デイビッド ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ワースト，ジャクリーン エム

(72)【発明者】

【氏名】シュー，ジアンホワイ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076EE41

4C076EE59

4C085AA14

4C085AA25

4C085BB17

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA10

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA13

4C086ZA33

4C086ZA68

4C086ZA89

4C086ZA94

4C086ZA96

4C086ZB08

4C086ZB11

4C086ZB15

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA50

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA50

(57)【要約】

本開示は、ヒト腫瘍壊死因子アルファ抗体グルココルチコイド受容体アゴニストコンジュゲート、並びに自己免疫性疾患及び炎症性疾患の治療のためにコンジュゲートを使用する方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式：

【化1】

で示されるコンジュゲートであって、式中、
Ａｂが、ヒトＴＮＦαに結合する抗体であって、Ａｂが、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１又は２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２又は２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３、１３、又は３０を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４、１４、３１、又は４３を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６、１５、３２、又は４４を含み、

【化2】

であり、
ｎが、１～５である、コンジュゲート。

【請求項2】

【化3】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項3】

【化4】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項4】

【化5】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項5】

【化6】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項6】

【化7】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項7】

【化8】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項8】

【化9】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項9】

【化10】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項10】

前記ヒトＴＮＦαに結合する抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項11】

前記ＶＨが、配列番号７を含み、前記ＶＬが、配列番号８を含む、請求項１０に記載のコンジュゲート。

【請求項12】

前記抗体が、重鎖（ＨＣ）と、軽鎖（ＬＣ）とを含み、前記ＨＣが、配列番号９を含み、前記ＬＣが、配列番号１０を含む、請求項１０又は１１に記載のコンジュゲート。

【請求項13】

前記ヒトＴＮＦαに結合する抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１５を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項14】

前記ＶＨが、配列番号１６を含み、前記ＶＬが、配列番号１７を含む、請求項１３に記載のコンジュゲート。

【請求項15】

前記抗体が、重鎖（ＨＣ）と、軽鎖（ＬＣ）とを含み、前記ＨＣが、配列番号１８を含み、前記ＬＣが、配列番号１９を含む、請求項１３又は１４に記載のコンジュゲート。

【請求項16】

前記ヒトＴＮＦαに結合する抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項17】

ヒトＴＮＦαに結合する前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１５を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項18】

ヒトＴＮＦαに結合する前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項19】

前記ヒトＴＮＦαに結合する抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４３を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項20】

ヒトＴＮＦαに結合する前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号４４を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項21】

前記ＶＨが、配列番号２４を含み、前記ＶＬが、配列番号８、１７、又は２７を含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項22】

前記抗体が、重鎖（ＨＣ）と、軽鎖（ＬＣ）とを含み、前記ＨＣが、配列番号２５を含み、前記ＬＣが、配列番号１０、１９、又は２８を含む、請求項１６～２１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項23】

ヒトＴＮＦαに結合する前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３０を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号３１を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号３２を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項24】

前記ＶＨが、配列番号３３を含み、前記ＶＬが、配列番号３４を含む、請求項２３に記載のコンジュゲート。

【請求項25】

前記抗体が、重鎖（ＨＣ）と、軽鎖（ＬＣ）とを含み、前記ＨＣが、配列番号３５を含み、前記ＬＣが、配列番号３６を含む、請求項２３又は２４に記載のコンジュゲート。

【請求項26】

前記抗体が、重鎖と、軽鎖とを含み、前記重鎖が、
アミノ酸残基１２４（ＥＵ番号付け）におけるシステイン、
アミノ酸残基３７８（ＥＵ番号付け）におけるシステイン、又は
アミノ酸残基１２４（ＥＵ番号付け）におけるシステイン及びアミノ酸残基３７８（ＥＵ番号付け）におけるシステインを含む、請求項１～１１、１３又は１４、１６～２１、２３又は２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項27】

前記抗体が、重鎖（ＨＣ）と、軽鎖（ＬＣ）とを含み、前記ＨＣが、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１～１１、１３、１４、１６～２１、２３又は２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項28】

ｎが、２～５である、請求項１～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項29】

ｎが、３～５である、請求項１～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項30】

ｎが、３～４である、請求項１～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項31】

ｎが、約４である、請求項１～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項32】

ｎが、約３である、請求項１～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項33】

ｎが、約２である、請求項１～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項34】

請求項１～３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項35】

治療を必要とする対象における自己免疫性疾患又は炎症性疾患を治療する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項３４に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

【請求項36】

前記自己免疫性疾患又は前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、尋常性乾癬（ＰＳ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）、ブドウ膜炎、非感染性の中間部、後部、汎ブドウ膜炎、ベーチェット病、又はリウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）から選択される、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記有効量の前記コンジュゲートを投与されている前記対象が、他の抗ＴＮＦα治療薬の前治療を受けており、前記対象が、前記他の抗ＴＮＦα治療薬に対する抗薬物抗体を生成している、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

前記他の抗ＴＮＦα治療薬が、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、及びエタネルセプト、又はこれらのコンジュゲートから選択される、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記コンジュゲートが、アダリムマブに対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、または交差反応性を有しない、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

療法における使用のための、請求項１～３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項３４に記載の医薬組成物。

【請求項41】

自己免疫性疾患又は炎症性疾患の治療における使用のための、請求項１～３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項３４に記載の医薬組成物。

【請求項42】

前記自己免疫性疾患又は前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性結腸炎、尋常性乾癬（ＰＳ）、化膿性汗腺炎、ブドウ膜炎、非感染性の中間部、後部、汎ブドウ膜炎、ベーチェット病、又はリウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）から選択される、請求項４１に記載の使用のためのコンジュゲート又は医薬組成物。

【請求項43】

自己免疫性疾患又は炎症性疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１～３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項３４に記載の医薬組成物の使用。

【請求項44】

前記自己免疫性疾患又は前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性結腸炎、尋常性乾癬（ＰＳ）、化膿性汗腺炎、ブドウ膜炎、非感染性の中間部、後部、汎ブドウ膜炎、ベーチェット病、又はリウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）から選択される、請求項４３に記載の使用。

【請求項45】

前記抗体が、ヒトＴＮＦαを中和する、請求項１～３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項46】

前記抗体が、内在化抗体である、請求項１～３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項47】

式：

【化11】

で示される化合物。

【請求項48】

【化12】

で示される、請求項４７に記載の化合物。

【請求項49】

【化13】

で示される、請求項４７に記載の化合物。

【請求項50】

【化14】

で示される、請求項４８に記載の化合物。

【請求項51】

【化15】

で示される、請求項４９に記載の化合物。

【請求項52】

式：

【化16】

で示される、化合物。

【請求項53】

前記コンジュゲートが、

【化17】

で示される、請求項５２に記載の化合物。

【請求項54】

コンジュゲートを生成する方法であって、前記方法が、請求項４７に記載の化合物を抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させることを含む、方法。

【請求項55】

前記コンジュゲートが、請求項１～３３のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記コンジュゲートが、
（ａ）抗ヒトＴＮＦα抗体を還元剤で還元する工程であって、前記抗ヒトＴＮＦα抗体が、１つ以上の操作されたシステイン残基を含む、工程と、
（ｂ）前記抗ヒトＴＮＦα抗体を酸化試薬で酸化させる工程と、
（ｃ）式：

【化18】

で示される化合物を、前記抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させて、前記コンジュゲートを生成する工程とを含む、工程に従って生成される、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

前記還元剤が、ジチオスレイトールであり、前記酸化剤が、デヒドロアスコルビン酸である、請求項５６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ヒト腫瘍壊死因子アルファ抗体グルココルチコイド受容体アゴニストコンジュゲート、関節リウマチ、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、尋常性乾癬、及び強直性脊椎炎などの自己免疫性疾患及び炎症性疾患の治療のためのコンジュゲートを使用する方法、コンジュゲートを調製するための方法、並びにヒトＴＮＦα抗体グルココルチコイドコンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。

【背景技術】

【0002】

関節リウマチ（rheumatoid arthritis、ＲＡ）は、関節、最も一般的には、手、手首、及び膝の関節を攻撃し、通常は一度に多くの関節を攻撃する消耗性の慢性自己免疫性疾患である。ＲＡでは、関節の内層が炎症を起こし、硬直、腫脹、不安定（バランスの欠如）、変形、及び慢性疼痛を引き起こし得る、関節組織への損傷を引き起こす。現在の治療は、例えば、非ステロイド抗炎症薬（non-steroidal anti-inflammatory drug、ＮＳＡＩＤＳ）、コルチコステロイド、疾患修飾性抗リウマチ薬（disease modifying anti-rheumatic drug、ＤＭＡＲＤ）、メトトレキサート、トファシチニブ、エタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、及びセルトリズマブなどの治療薬を使用する。そのような治療の欠点としては、例えば、非標的毒性及び抗薬物抗体の発生が挙げられる。

【0003】

抗薬物抗体は、ＴＮＦαと同時に抗ＴＮＦα抗体治療薬に結合する非中和抗体であり得るか、又はそれらは、血清中の抗ＴＮＦα治療用抗体の有効濃度を低下させ、かつ／若しくは抗原結合部位（パラトープ）についてＴＮＦαと競合し、したがって抗ＴＮＦα治療用抗体の作用機序を阻害する中和抗体であり得る（ｖａｎ Ｓｃｈｉｅ ＫＡ，ｅｔ ａｌ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１５，７４：３１１－３１４）。例えば、研究により、抗ＴＮＦα薬物抗体の９０パーセント超が中和性であり、他の抗ＴＮＦα抗体治療薬と交差反応性であり得ることが示されている（ｖａｎ Ｓｃｈｉｅ ＫＡ，ｅｔ ａｌ，２０１５）。したがって、場合によっては、抗ＴＮＦα抗体に対する抗薬物抗体を生成している患者は、これらの治療薬に対する臨床応答の低下、及び／又は薬物投与後の最初の日の間若しくはその日のうちの発熱、掻痒、気管支痙攣、若しくは心臓血管虚脱などの症状を特徴とする注入関連の反応などの有害事象を有することが報告されている（Ａｔｉｑｉ，Ｓ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０２０，２６（１１）：３１２）。したがって、ＲＡなどの炎症性疾患及び／又は自己免疫性疾患の改善された有効な治療を提供し、現在承認されている治療が有する欠点を最小限に抑えるか又は排除する新しい薬剤が依然として大いに必要とされている。

【0004】

国際公開第２０１７／２１０４７１号は、ある特定のグルココルチコイド受容体アゴニスト（glucocorticoid receptor agonist、ＧＣ）、抗体、及びその免疫コンジュゲートを開示している。国際公開第２０１８／０８９３７３号は、新規ステロイド、そのタンパク質コンジュゲート、並びにステロイド及びコンジュゲートを投与することを含む疾患、障害、及び状態を治療する方法を開示している。現在まで、承認されている疾患の治療のためのヒトＴＮＦα抗体ＧＣコンジュゲートは存在しない。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、抗体がヒトＩＴＮＦαに結合する、ある特定の新規のヒトＴＮＦα抗体ＧＣコンジュゲートを提供する。本開示は、新規の抗ヒトＴＮＦα抗体ＧＣコンジュゲートを含む組成物、並びにそのような抗ヒトＴＮＦα抗体ＧＣコンジュゲート及びその組成物を使用する方法を更に提供する。加えて、本開示は、関節リウマチなどの自己免疫性疾患及び炎症性疾患の治療において有用なある特定の新規の抗ヒトＴＮＦα抗体ＧＣコンジュゲートを提供する。本開示は、他の抗ＴＮＦα治療薬（例えば、アダリムマブ）に対する抗薬物抗体を生成している患者における自己免疫性疾患及び炎症性疾患の治療に有用なある特定の新規の抗ヒトＴＮＦα抗体ＧＣコンジュゲートを更に提供する。本明細書に開示されるある特定の抗ヒトＴＮＦα抗体ＧＣコンジュゲートは、開発、製造、及び製剤化を容易にするための良好な物理化学的特性（例えば、低粘度、又は凝集、良好な熱安定性）などの良好な開発性プロファイルを呈する。したがって、本明細書に開示されるような、ある特定の抗ヒトＴＮＦα抗体ＧＣコンジュゲートは、以下の特性のうちの１つ以上を有する：１）所望の効力でヒトＴＮＦαに結合する、２）ヒト膜ＴＮＦαに結合して、細胞内に取り込まれる、３）所望の効力でアカゲザル及び／若しくはイヌＴＮＦαに結合する、４）可溶性及び膜ヒトＴＮＦα誘導性アポトーシスを阻害する、５）ＴＮＦＲ及びグルココルチコイド受容体媒介性サイトカイン発現の両方をインビトロで調節する（例えば、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦを阻害する、ＩＬ－１０を誘導する）、６）ＴＮＦＲ媒介性サイトカイン発現（例えば、ＣＸＣＬ１）をインビボで阻害する、７）ＡＤＣＣ活性を誘導する、８）他の抗ＴＮＦα治療薬（例えば、アダリムマブ）に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性をインビボ及びインビトロで呈するか、若しくは交差反応性を呈さない、９）組織及び／若しくは多発性関節炎関節の炎症をインビボで有意に阻害する、１０）アダリムマブ不応性マウスにおいて関節炎症をインビボで有意に阻害する、又は１１）良好な開発性プロファイル、例えば、許容可能な粘度、溶解度、及び凝集、良好な安定性、並びに／若しくは開発、製造、及び／若しくは製剤化を容易にするための許容可能な薬物動態プロファイルを有する。

【0006】

したがって、一実施形態では、本開示は、式Ｉ：

【化1】

で示されるコンジュゲートであって、式中、
Ａｂが、ヒト腫瘍壊死因子アルファに結合する抗体（「抗ヒトＴＮＦα抗体」）であって、Ａｂが、重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）と、軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１又は２２を含み、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２又は２３を含み、
ＨＣＤＲ３が、配列番号３、１３、又は３０を含み、
ＬＣＤＲ１が、配列番号４、１４、３１、又は４３を含み、
ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
ＬＣＤＲ３が、配列番号６、１５、３２、又は４４を含み、

【化2】

であり、
ｎが、１～５である、コンジュゲートを提供する。

【0007】

更なる実施形態では、本開示は、式Ｉａ：

【化3】

で示されるコンジュゲートであって、式中、
Ａｂが、ヒトＴＮＦαに結合する抗体であって、Ａｂが、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１又は２２を含み、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２又は２３を含み、
ＨＣＤＲ３が、配列番号３、１３、又は３０を含み、
ＬＣＤＲ１が、配列番号４、１４、３１、又は４３を含み、
ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
ＬＣＤＲ３が、配列番号６、１５、３２、又は４４を含み、

【化4】

であり、
ｎが、１～５である、コンジュゲートを提供する。

【0008】

更なる実施形態では、本開示は、式Ｉｂ：

【化5】

で示されるコンジュゲートであって、式中、
Ａｂが、ヒトＴＮＦαに結合する抗体であって、Ａｂが、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１又は２２を含み、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２又は２３を含み、
ＨＣＤＲ３が、配列番号３、１３、又は３０を含み、
ＬＣＤＲ１が、配列番号４、１４、３１、又は４３を含み、
ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
ＬＣＤＲ３が、配列番号６、１５、３２、又は４４を含み、

【化6】

であり、
ｎが、１～５である、コンジュゲートを提供する。

【0009】

更なる実施形態では、本開示は、式Ｉｃ：

【化7】

で示されるコンジュゲートであって、式中、
Ａｂが、ヒトＴＮＦαに結合する抗体であって、Ａｂが、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１又は２２を含み、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２又は２３を含み、
ＨＣＤＲ３が、配列番号３、１３、又は３０を含み、
ＬＣＤＲ１が、配列番号４、１４、３１、又は４３を含み、
ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
ＬＣＤＲ３が、配列番号６、１５、３２、又は４４を含み、

【化8】

であり、
ｎが、１～５である、コンジュゲートを提供する。

【0010】

更なる実施形態では、本開示は、式Ｉｄ：

【化9】

で示されるコンジュゲートであって、式中、
Ａｂが、ヒトＴＮＦαに結合する抗体であって、Ａｂが、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１又は２２を含み、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２又は２３を含み、
ＨＣＤＲ３が、配列番号３、１３、又は３０を含み、
ＬＣＤＲ１が、配列番号４、１４、３１、又は４３を含み、
ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
ＬＣＤＲ３が、配列番号６、１５、３２、又は４４を含み、

【化10】

であり、
ｎが、１～５である、コンジュゲートを提供する。

【0011】

更なる実施形態では、本開示は、式Ｉｅ：

【化11】

で示されるコンジュゲートであって、式中、
Ａｂが、ヒトＴＮＦαに結合する抗体であって、Ａｂが、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１又は２２を含み、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２又は２３を含み、
ＨＣＤＲ３が、配列番号３、１３、又は３０を含み、
ＬＣＤＲ１が、配列番号４、１４、３１、又は４３を含み、
ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
ＬＣＤＲ３が、配列番号６、１５、３２、又は４４を含み、

【化12】

であり、
ｎが、１～５である、コンジュゲートを提供する。

【0012】

更なる実施形態では、本開示は、式Ｉｆ：

【化13】

で示されるコンジュゲートであって、式中、
Ａｂが、ヒトＴＮＦαに結合する抗体であって、Ａｂが、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１又は２２を含み、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２又は２３を含み、
ＨＣＤＲ３が、配列番号３、１３、又は３０を含み、
ＬＣＤＲ１が、配列番号４、１４、３１、又は４３を含み、
ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
ＬＣＤＲ３が、配列番号６、１５、３２、又は４４を含み、

【化14】

であり、
ｎが、１～５である、コンジュゲートを提供する。

【0013】

一部の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、ヒトＴＮＦαに結合する抗体（「antibody、Ａｂ」）が、Ａｂ１であり、Ａｂ１が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号１を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号３を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号４を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、コンジュゲートである。一部の実施形態では、Ａｂ１は、配列番号７を含むＶＨと、配列番号８を含むＶＬとを含む。一部の実施形態では、Ａｂ１は、配列番号９を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１０を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む。

【0014】

一部の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、ヒトＴＮＦαに結合する抗体（「Ａｂ」）が、Ａｂ２であり、Ａｂ２が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号１を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１５を含む、コンジュゲートである。一部の実施形態では、Ａｂ２は、配列番号１６を含むＶＨと、配列番号１７を含むＶＬとを含む。一部の実施形態では、Ａｂ２は、配列番号１８を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１９を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む。

【0015】

一部の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、ヒトＴＮＦαに結合する抗体（「Ａｂ」）が、Ａｂ３であり、Ａｂ３が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号４を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、コンジュゲートである。一部の実施形態では、Ａｂ３は、配列番号２４を含むＶＨと、配列番号８を含むＶＬとを含む。一部の実施形態では、Ａｂ３は、配列番号２５を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１０を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む。

【0016】

一部の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、ヒトＴＮＦαに結合する抗体（「Ａｂ」）が、Ａｂ４であり、Ａｂ４が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１５を含む、コンジュゲートである。一部の実施形態では、Ａｂ４は、配列番号２４を含むＶＨと、配列番号１７を含むＶＬとを含む。一部の実施形態では、Ａｂ４は、配列番号２５を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１９を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む。

【0017】

一部の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、ヒトＴＮＦαに結合する抗体（「Ａｂ」）が、Ａｂ５であり、Ａｂ５が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、コンジュゲートである。一部の実施形態では、Ａｂ５は、配列番号２４を含むＶＨと、配列番号２７を含むＶＬとを含む。一部の実施形態では、Ａｂ５は、配列番号２５を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号２８を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む。

【0018】

一部の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、ヒトＴＮＦαに結合する抗体（「Ａｂ」）が、Ａｂ６であり、Ａｂ６が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号１を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号３０を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号３１を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号３２を含む、コンジュゲートである。一部の実施形態では、Ａｂ６は、配列番号３３を含むＶＨと、配列番号３４を含むＶＬとを含む。一部の実施形態では、Ａｂ６は、配列番号３５を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号３６を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む。

【0019】

一部の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、ヒトＴＮＦαに結合する抗体（「Ａｂ」）が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号４４を含む、コンジュゲートである。一部の実施形態では、配列番号４４は、アミノ酸残基ＱＱＹＤＸａａ_５ＬＰＬＴを含み、配列番号４４のＸａａ_５は、アスパラギン又はリジンである。

【0020】

一部の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、ヒトＴＮＦαに結合する抗体（「Ａｂ」）が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号４３を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号６を含む、コンジュゲートである。一部の実施形態では、配列番号４３は、アミノ酸残基ＱＡＳＱＧＩＸａａ_７ＮＹＬＮを含み、配列番号４３のＸａａ_７は、セリン又はアルギニンである。

【0021】

一部の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、抗ヒトＴＮＦα抗体が、完全ヒト抗体である、式Ｉのコンジュゲートである。更なる実施形態では、抗ヒトＴＮＦα抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する。

【0022】

本開示の一部の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、抗ヒトＴＮＦα抗体が修飾ヒトＩｇＧ１を有する、コンジュゲートである。一部の実施形態では、修飾は、重鎖可変領域（ＶＨ）に存在する。一部の実施形態では、修飾は、軽鎖可変領域（ＶＬ）に存在する。一部の実施形態では、修飾は、ＶＨ及びＶＬに存在する。更なる実施形態では、修飾ヒトＩｇＧ１ ＶＨ及び／又はＶＬは、本開示の抗ヒトＴＮＦα抗体に、望ましい粘度プロファイル及び／又は免疫原性リスクプロファイルを提供する。

【0023】

更なる実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、抗ヒトＴＮＦα抗体が、抗体コンジュゲート（バイオコンジュゲートとも称される）の生成において使用するための操作されたシステイン残基を含む修飾ヒトＩｇＧ１定常ドメインを有する、コンジュゲートである（国際公開第２０１８／２３２０８８（Ａ１）号を参照されたい）。より具体的には、本開示のそのような実施形態では、抗ヒトＴＮＦα抗体は、ＩｇＧ１重鎖中に操作されたシステイン残基を含む。そのような実施形態では、抗ヒトＴＮＦα抗体は、重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）内のアミノ酸残基１２４（ＥＵ番号付け）にシステイン、又は重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）内のアミノ酸残基３７８（ＥＵ番号付け）にシステインを含む。更なる実施形態では、抗ヒトＴＮＦα抗体は、ＣＨ１ドメイン内のアミノ酸残基１２４（ＥＵ番号付け）にシステインを含み、ＣＨ２ドメイン内のアミノ酸残基３７８（ＥＵ番号付け）にシステインを含む。

【0024】

一部の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、抗ヒトＴＮＦα抗体が、他の抗ＴＮＦα治療薬（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はエタネルセプト）又はそのコンジュゲートに対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない、コンジュゲートである。特定の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、抗ヒトＴＮＦα抗体が、アダリムマブに対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない、コンジュゲートである。そのような実施形態では、ある特定の式Ｉのコンジュゲートを使用して、本明細書で定義されるような他の抗ＴＮＦα治療薬（例えば、アダリムマブ）による前治療に対する抗薬物抗体を生成している患者を治療することができる。更なる実施形態では、ある特定の式Ｉのコンジュゲートを使用して、他の抗ＴＮＦα治療薬による前治療からそのような他の抗ＴＮＦα治療薬に対する抗薬物抗体を生成しており、ひいては他の抗ＴＮＦα治療薬に対する臨床応答又は有害反応が低下している患者を治療することができる。そのような実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、抗ヒトＴＮＦα抗体が、それらが他の抗ＴＮＦα治療薬に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しないように、十分に異なるアミノ酸配列及び核酸配列を有する、コンジュゲートである。特定の実施形態では、式Ｉのコンジュゲートであって、本開示の抗ヒトＴＮＦα抗体が、それが他の抗ＴＮＦα治療薬に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しないように、十分に異なるＣＤＲアミノ酸配列を有する、コンジュゲートである。一部の実施形態では、他の抗ＴＮＦα治療薬は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、若しくはエタネルセプト、又はそれらのコンジュゲートである。

【0025】

一部の実施形態では、本開示は、抗ヒトＴＮＦαに結合する新規の抗体のＨＣ若しくはＬＣ、又はＶＨ若しくはＶＬをコードする核酸、又はそのような核酸を含むベクターを提供する。

【0026】

一部の実施形態では、本開示は、配列番号１１、１２、２０、２１、２６、２９、３７、又は３８の配列を含む核酸を提供する。

【0027】

一部の実施形態では、ヒトＴＮＦαに結合する抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸が提供される。一部の実施形態では、配列番号９、１０、１８、１９、２５、２８、３５、又は３６をコードする配列を含む核酸が提供される。一部の実施形態では、配列番号９、１８、２５、又は３５を含む抗体重鎖をコードする配列を含む核酸が提供される。例えば、核酸は、配列番号１１、２０、２６、又は３７の配列を含むことができる。一部の実施形態では、配列番号１０、１９、２８、又は３６を含む抗体軽鎖をコードする配列を含む核酸が提供される。例えば、核酸は、配列番号１２、２１、２９、又は３８の配列を含むことができる。

【0028】

本開示の一部の実施形態では、ヒトＴＮＦαに結合する抗体のＶＨ又はＶＬをコードする核酸が提供される。一部の実施形態では、配列番号７、８、１６、１７、２４、２７、３３、又は３４をコードする配列を含む核酸が提供される。一部の実施形態では、配列番号７、１６、２４、又は３３を含む抗体ＶＨをコードする配列を含む核酸が提供される。一部の実施形態では、配列番号８、１７、２７、又は３４を含む抗体ＶＬをコードする配列を含む核酸が提供される。

【0029】

本開示の一部の実施形態は、抗体重鎖又は軽鎖をコードする核酸配列を含むベクターを提供する。例えば、そのようなベクターは、配列番号９、１８、２５、又は３５をコードする核酸配列を含むことができる。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１０、１９、２８、又は３６をコードする核酸配列を含む。

【0030】

本明細書では、抗体ＶＨ又はＶＬをコードする核酸配列を含むベクターも提供される。例えば、そのようなベクターは、配列番号７、１６、２４、又は３３をコードする核酸配列を含むことができる。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号８、１７、２７、又は３４をコードする核酸配列を含む。

【0031】

抗体重鎖をコードする第１の核酸配列と、抗体軽鎖をコードする第２の核酸配列とを含むベクターも本明細書に提供される。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号９、１８、２５、又は３５をコードする第１の核酸配列と、配列番号１０、１９、２８又は３６をコードする第２の核酸配列とを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号９をコードする第１の核酸配列と、配列番号１０をコードする第２の核酸配列とを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１８をコードする第１の核酸配列と、配列番号１９をコードする第２の核酸配列とを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号２５をコードする第１の核酸配列と、配列番号１０をコードする第２の核酸配列とを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号２５をコードする第１の核酸配列と、配列番号１９をコードする第２の核酸配列とを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号２５をコードする第１の核酸配列と、配列番号２８をコードする第２の核酸配列とを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号３５をコードする第１の核酸配列と、配列番号３６をコードする第２の核酸配列とを含む。

【0032】

また、本明細書では、抗体重鎖をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、抗体軽鎖をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む組成物も提供される。一部の実施形態では、組成物は、配列番号９、１８、２５、又は３５をコードする核酸配列と、配列番号１０、１９、２８、又は３６をコードする第２の核酸配列とを含む第１のベクターを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号９をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号１０をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号１８をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号１９をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２５をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号１０をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２５をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号１９をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２５をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号２８をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号３５をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号３６をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む。

【0033】

また、本明細書では、抗体重鎖をコードする核酸配列と、抗体軽鎖をコードする核酸配列とを含むベクターを含む組成物も提供される。一部の実施形態では、組成物は、配列番号９、１８、２５、又は３５をコードする核酸配列と、配列番号１０、１９、２８、又は３６をコードする第２の核酸配列とを含むベクターを含む。

【0034】

一実施形態では、ｎは、２～５である。

【0035】

一実施形態では、ｎは、３～５である。

【0036】

一実施形態では、ｎは、３～４である。

【0037】

一実施形態では、ｎは、約４である。

【0038】

一実施形態では、ｎは、約３である。

【0039】

一実施形態では、ｎは、約２である。

【0040】

本明細書で使用される場合、式：

【化15】

における「ＧＣ」は、好適なグルココルチコイド受容体アゴニストペイロードを意味し、以下の式ＩＩａ、ＩＩｂ、又はＩＩｃを含む。

【化16】

【0041】

本明細書で使用される場合、式：

【化17】

における「Ｌ」は、ＡｂをＧＣに接続する好適なリンカー基を意味する。当業者に既知の好適なリンカーは、例えば、切断可能なリンカー及び切断不可能なリンカーを含む。より具体的には、好適なリンカー「Ｌ」は、以下の式ＩＩＩａ～ＩＩＩｆを含む。

【化18】

【0042】

一実施形態では、本開示は、式ＩＶ：

【化19】

で示されるグルココルチコイド受容体アゴニストペイロード－リンカーを提供する。

【0043】

一実施形態では、本開示は、式ＩＶａ：

【化20】

で示されるグルココルチコイド受容体アゴニストペイロード－リンカーを提供する。

【0044】

一実施形態では、本開示は、式ＩＶｂ：

【化21】

で示されるグルココルチコイド受容体アゴニストペイロード－リンカーを提供する。

【0045】

一実施形態では、本開示は、式ＩＶｃ：

【化22】

で示されるグルココルチコイド受容体アゴニストペイロード－リンカーを提供する。

【0046】

一実施形態では、本開示は、式ＩＶｄ：

【化23】

で示されるグルココルチコイド受容体アゴニストペイロード－リンカーを提供する。

【0047】

一実施形態では、本開示は、式Ｖ：

【化24】

で示される化合物を提供する。

【0048】

更なる実施形態では、本開示は、式Ｖａ：

【化25】

で示される化合物を提供する。

【0049】

一実施形態では、本開示はまた、治療を必要とする対象における炎症性疾患を治療する方法であって、有効量の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、本開示はまた、治療を必要とする対象における炎症性疾患を治療する方法であって、有効量の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、自己免疫性疾患又は炎症性疾患は、例えば、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎（Psoriatic Arthritis、ＰｓＡ）、クローン病（Crohn’s Disease、ＣＤ）、潰瘍性結腸炎、尋常性乾癬（Plaque Psoriasis、ＰＳ）、強直性脊椎炎（Ankylosing Spondylitis、ＡＳ）、若年性特発性関節炎、化膿性汗腺炎、ブドウ膜炎、非感染性の中間部、後部、汎ブドウ膜炎、ベーチェット病、又はリウマチ性多発筋痛症（Polymyalgia Rheumatica、ＰＭＲ）である。一実施形態では、本開示は、治療を必要とする対象におけるリウマチ性関節炎を治療する方法であって、有効量の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む、方法を更に提供する。一実施形態では、本開示は、治療を必要とする対象における乾癬性関節炎を治療する方法であって、有効量の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む、方法を更に提供する。一実施形態では、本開示は、治療を必要とする対象におけるクローン病を治療する方法であって、有効量の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む、方法を更に提供する。一実施形態では、本開示は、治療を必要とする対象における潰瘍性結腸炎を治療する方法であって、有効量の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む、方法を更に提供する。一実施形態では、本開示は、治療を必要とする対象における尋常性乾癬を治療する方法であって、有効量の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む、方法を更に提供する。一実施形態では、本開示は、治療を必要とする対象における強直性脊椎炎を治療する方法であって、有効量の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む、方法を更に提供する。一部の実施形態では、有効量の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩を投与されている対象は、他の抗ＴＮＦα治療薬による前治療を受けており、対象は、他の抗ＴＮＦα治療薬に対する抗薬物抗体を生成している。そのような実施形態では、他の抗ＴＮＦα治療薬は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される。また更なる実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される他の抗ＴＮＦα治療薬のうちの少なくとも４つ以上に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。また更なる実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される他の抗ＴＮＦα治療薬のうちの少なくとも３つ以上に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。また更なる実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される他の抗ＴＮＦα治療薬のうちの少なくとも２つ以上に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。更に他の実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ又はそのコンジュゲートに対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。

【0050】

一実施形態では、本開示は、療法における使用のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を更に提供する。一実施形態では、本開示は、炎症性疾患の治療における使用のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、本開示は、炎症性疾患の治療における使用のための式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を提供する。ある特定の実施形態では、自己免疫性疾患又は炎症性疾患は、例えば、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性結腸炎、尋常性乾癬（ＰＳ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、若年性特発性関節炎、化膿性汗腺炎、ブドウ膜炎、非感染性の中間部、後部、汎ブドウ膜炎、ベーチェット病、又はリウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）である。一実施形態では、本開示は、リウマチ性関節炎の治療における使用のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、本開示は、乾癬性関節炎の治療における使用のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、本開示は、クローン病の治療における使用のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、本開示は、潰瘍性結腸炎の治療における使用のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、本開示は、尋常性乾癬の治療における使用のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、本開示は、強直性脊椎炎の治療における使用のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を提供する。一部の実施形態では、有効量の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩を投与されている対象は、他の抗ＴＮＦα治療薬による前治療を受けており、対象は、他の抗ＴＮＦα治療薬に対する抗薬物抗体を生成している。そのような実施形態では、他の抗ＴＮＦα治療薬は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される。また更なる実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される他の抗ＴＮＦα治療薬のうちの少なくとも４つ以上に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。また更なる実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される他の抗ＴＮＦα治療薬のうちの少なくとも３つ以上に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。また更なる実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される他の抗ＴＮＦα治療薬のうちの少なくとも２つ以上に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。更に他の実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ又はそのコンジュゲートに対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。

【0051】

一実施形態では、本開示は、自己免疫性疾患の治療のための医薬の製造のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の使用も提供する。一実施形態では、本開示は、炎症性疾患の治療のための医薬の製造のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の使用も提供する。ある特定の実施形態では、自己免疫性疾患又は炎症性疾患は、例えば、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性結腸炎、尋常性乾癬（ＰＳ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、若年性特発性関節炎、化膿性汗腺炎、ブドウ膜炎、非感染性の中間部、後部、汎ブドウ膜炎、ベーチェット病、又はリウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）である。一実施形態では、本開示は、リウマチ性関節炎の治療のための医薬の製造のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。一実施形態では、本開示は、乾癬性関節炎の治療のための医薬の製造のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。一実施形態では、本開示は、クローン病の治療のための医薬の製造のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。一実施形態では、本開示は、潰瘍性結腸炎の治療のための医薬の製造のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。一実施形態では、本開示は、尋常性乾癬の治療のための医薬の製造のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。一実施形態では、本開示は、強直性脊椎炎の治療のための医薬の製造のための、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。一部の実施形態では、有効量の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩を投与されている対象は、他の抗ＴＮＦα治療薬による前治療を受けており、対象は、他の抗ＴＮＦα治療薬に対する抗薬物抗体を生成している。そのような実施形態では、他の抗ＴＮＦα治療薬は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される。また更なる実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される他の抗ＴＮＦα治療薬のうちの少なくとも４つ以上に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。また更なる実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される他の抗ＴＮＦα治療薬のうちの少なくとも３つ以上に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。また更なる実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、又はそれらのコンジュゲートからなる群から選択される他の抗ＴＮＦα治療薬のうちの少なくとも２つ以上に対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。更に他の実施形態では、本明細書に開示されるような、ある特定の式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に受容可能な塩は、アダリムマブ又はそのコンジュゲートに対する抗薬物抗体への低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しない。

【0052】

本開示の核酸は、例えば、核酸が発現制御配列に作動可能に連結された後に、宿主細胞において発現され得る。作動可能に連結される核酸の発現が可能な発現制御配列は、当該技術分野において周知である。発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチドの分泌を促進する１つ以上のシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。目的の核酸（例えば、抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸）を含む発現ベクターは、周知の方法、例えば、安定的又は一過性のトランスフェクション、形質転換、形質導入又は感染によって宿主細胞に移植され得る。追加的に、発現ベクターは、所望の核酸配列で形質転換された宿主細胞の検出を助けるために、例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、及びジヒドロ葉酸レダクターゼ等の１つ以上の選択マーカーを含み得る。

【0053】

別の態様において、本明細書に記載の核酸、ベクター、又は核酸組成物を含む細胞、例えば宿主細胞が本明細書に提供される。宿主細胞は、本明細書に記載の抗体の全部又は一部分を発現する１つ以上の発現ベクターで安定的に又は一過性にトランスフェクト、形質転換、形質導入又は感染された細胞であり得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、本開示の抗体のＨＣ及びＬＣポリペプチドを発現する発現ベクターで、安定的に又は一過性にトランスフェクト、形質転換、形質導入又は感染され得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載の抗体のＨＣポリペプチドを発現する第１のベクター及びＬＣポリペプチドを発現する第２のベクターで安定的に又は一過性にトランスフェクト、形質転換、形質導入又は感染され得る。そのような宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞は、本明細書に記載されるような抗ヒトＴＮＦαに結合する抗体を発現することができる。抗体を発現することができることが知られている哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、及びＮＳ０細胞が含まれる。

【0054】

一部の実施形態では、細胞、例えば、宿主細胞は、配列番号９、１８、２５、又は３５をコードする第１の核酸配列と、配列番号１０、１９、２８、又は３６をコードする第２の核酸配列とを含む、ベクターを含む。

【0055】

一部の実施形態では、細胞、例えば、宿主細胞は、配列番号９、１８、２５、又は３５をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号１０、１９、２８、又は３６をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む。

【0056】

本開示は、上記の宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞を、抗体が発現するような条件下で培養し、発現した抗体を培養培地から回収することによって、本明細書に記載の抗ヒトＴＮＦαに結合する抗体を生成するための方法を更に提供する。抗体が分泌されている培地は、従来の技術によって精製され得る。タンパク質精製の様々な方法が採用され得、そのような方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：８３－８９（１９９０）、及びＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮＹ（１９９４）に記載される。

【0057】

本開示は、コンジュゲートを生成する方法であって、本開示の化合物を抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させることを含む、方法を提供する。

【0058】

本開示は、コンジュゲートを生成する方法であって、式ＩＶの化合物を抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させることを含む、方法を提供する。本開示は、コンジュゲートを生成する方法であって、式ＩＶａの化合物を抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させることを含む、方法を提供する。本開示は、コンジュゲートを生成する方法であって、式ＩＶｂの化合物を抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させることを含む、方法を提供する。本開示は、コンジュゲートを生成する方法であって、式ＩＶｃの化合物を抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させることを含む、方法を提供する。本開示は、コンジュゲートを生成する方法であって、式ＩＶｄの化合物を抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させることを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、生成されるコンジュゲートは、式Ｉのコンジュゲートである。

【0059】

本開示は、コンジュゲートを生成する方法であって、以下の工程：
（ａ）抗ヒトＴＮＦα抗体を還元剤で還元する工程であって、抗ヒトＴＮＦα抗体が、１つ以上の操作されたシステイン残基を含む、工程と、
（ｂ）抗ヒトＴＮＦα抗体を酸化試薬で酸化させる工程と、
（ｃ）本開示の化合物を抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させて、コンジュゲートを生成する工程とを含む、方法を提供する。

【0060】

本開示は、コンジュゲートを生成する方法であって、以下の工程：
（ａ）抗ヒトＴＮＦα抗体を還元剤で還元する工程であって、抗ヒトＴＮＦα抗体が、１つ以上の操作されたシステイン残基を含む、工程と、
（ｂ）抗ヒトＴＮＦα抗体を酸化試薬で酸化させる工程と、
（ｃ）式：

【化26】

で示される化合物を、抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させて、コンジュゲートを生成する工程とを含む、方法を提供する。

【0061】

一部の実施形態では、還元剤は、ジチオスレイトールである。一部の実施形態では、酸化剤は、デヒドロアスコルビン酸である。一部の実施形態において、還元剤はジチオスレイトールであり、酸化剤はデヒドロアスコルビン酸である。

【0062】

本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される抗体又はその抗原結合断片を更に提供する。

【0063】

一実施形態では、本開示は、式Ｉのコンジュゲート若しくはその薬学的に許容される塩、又は本明細書に記載の抗体、核酸、若しくはベクターを、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と共に含む、医薬組成物を更に提供する。一実施形態では、本開示は、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と共に含む、医薬組成物を更に提供する。一実施形態では、本開示は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と共に、式Ｉのコンジュゲートを含む、医薬組成物を更に提供する。一実施形態では、本開示は、式Ｉのコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を調製するための方法を更に提供する。一実施形態では、本開示はまた、式Ｉのコンジュゲートの合成のための新規中間体及び方法を包含する。

【図面の簡単な説明】

【0064】

【図1】例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのインビトロでのＡＤＣＣ活性を示す。

【図2】例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのインビトロでのＣＤＣ活性を示す。

【図3】例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ６が、アダリムマブで過免疫されたカニクイザルにおいて形成されたアダリムマブに対する抗薬物抗体への有意に低い結合を有することを示す。

【図4】例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ６が、アダリムマブで治療されたヒト患者において形成されたアダリムマブに対する抗薬物抗体への有意に低い結合を有することを示す。

【図5A】ＰＢＳ、ｐＨ７．２（５Ａ）、酢酸塩、ｐＨ５（５Ｂ）、及びヒスチジン、ｐＨ６（５Ｃ）中の例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのＤＳＣサーモグラムを示す。

【図5B】ＰＢＳ、ｐＨ７．２（５Ａ）、酢酸塩、ｐＨ５（５Ｂ）、及びヒスチジン、ｐＨ６（５Ｃ）中の例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのＤＳＣサーモグラムを示す。

【図5C】ＰＢＳ、ｐＨ７．２（５Ａ）、酢酸塩、ｐＨ５（５Ｂ）、及びヒスチジン、ｐＨ６（５Ｃ）中の例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのＤＳＣサーモグラムを示す。

【図6A】接触過敏症のヒト化マウスモデルにおける、１ｍｇ／ｋｇ（６Ａ）、３ｍｇ／ｋｇ（６Ｂ）、及び１０ｍｇ／ｋｇ（６Ｃ）での抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１、及び例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体コンジュゲートの有効性比較を示す。

【図6B】接触過敏症のヒト化マウスモデルにおける、１ｍｇ／ｋｇ（６Ａ）、３ｍｇ／ｋｇ（６Ｂ）、及び１０ｍｇ／ｋｇ（６Ｃ）での抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１、及び例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体コンジュゲートの有効性比較を示す。

【図6C】接触過敏症のヒト化マウスモデルにおける、１ｍｇ／ｋｇ（６Ａ）、３ｍｇ／ｋｇ（６Ｂ）、及び１０ｍｇ／ｋｇ（６Ｃ）での抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１、及び例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体コンジュゲートの有効性比較を示す。

【図7】ヒトＴＮＦαトランスジェニックマウス多発性関節炎モデルにおける抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲートが、アダリムマブナイーブマウス及びアダリムマブ処置マウスの両方において臨床スコアによって測定されたように疾患進行を停止させたことを示し、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲートが有意な抗薬物抗体応答を生成せず、アダリムマブに対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有したか、又は交差反応を有さなかったことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0065】

本明細書で使用される「ＴＮＦα」という用語は、別段の記載がない限り、可溶性及び膜ＴＮＦα、並びに細胞内のＴＮＦα前駆体タンパク質のプロセシングから生じる任意の天然の成熟ＴＮＦαを指す。この用語は、別段の指示がない限り、イヌ、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル又はアカゲザル）、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からのＴＮＦαを含む。この用語には、ＴＮＦαの天然に存在するバリアント、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも含まれる。抗ヒトＴＮＦαの一例のアミノ酸配列は、当該技術分野で知られており、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００５８５（配列番号３９）である。カニクイザルＴＮＦαの一例のアミノ酸配列も、当該技術分野で知られており、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ参照配列Ｐ７９３３７（配列番号４２）である。アカゲザルＴＮＦαの一例のアミノ酸配列も、当該技術分野で知られており、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ参照配列Ｐ４８０９４（配列番号４０）である。イヌＴＮＦα一例のアミノ酸配列も、当該技術分野で知られており、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６４４０３（配列番号４１）である。ヒト「ＴＮＦα」という用語は、全ての既知のヒトＴＮＦαアイソフォーム及び多形形態を集合的に指すために本明細書で使用される。本明細書で使用される配列番号付けは、シグナルペプチドを含まない成熟タンパク質に基づく。

【0066】

本明細書で使用される「ＴＮＦＲ」又は「ＴＮＦ受容体」という用語は、別段の記載がない限り、任意の天然の成熟ＴＮＦＲ、例えば、ＴＮＦＲ１（ｐ５５若しくはｐ６０としても知られる）又はＴＮＦＲ２（ｐ７５若しくはｐ８０としても知られる）を指す。この用語は、別段の指示がない限り、イヌ、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル又はアカゲザル）、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からのＴＮＦＲを含む。この用語には、ＴＮＦＲの天然に存在するバリアント、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも含まれる。ヒトＴＮＦＲ１の一例のアミノ酸配列は、当該技術分野で知られており、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＡ６１２０１（配列番号４５）である。ヒトＴＮＦＲ２の一例のアミノ酸配列は、当該技術分野で知られており、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１０５７（配列番号４６）である。「ＴＮＦＲ」という用語は、全ての既知のヒトＴＮＦＲアイソフォーム及び多形形態を集合的に指すために本明細書で使用される。

【0067】

本明細書で使用される「抗薬物抗体」又は「anti-drug antibody、ＡＤＡ」という用語は、哺乳動物に投与された治療薬に対する免疫応答から、哺乳動物において形成された抗体を指す。本開示の一部の実施形態では、治療薬に対して形成された抗薬物抗体は、その治療薬の効果を中和し得、したがって、治療薬の薬物動態（pharmacokinetic、ＰＫ）及び／又は薬力学的（pharmacodynamic、ＰＤ）特性を変化させ、治療薬の効果に干渉し、並びに／又は有効性を低減し、並びに／又は治療薬に対する臨床応答を低下させる。治療薬に対する抗薬物抗体はまた、患者において有害な免疫反応を導き得、その結果、患者は、その治療薬での更なる治療のための候補でなくなる可能性がある。有害な免疫反応の例としては、これらに限定されないが、薬物投与後１日目の発熱、掻痒、気管支痙攣、又は心臓血管虚脱などの症状を特徴とする注入関連の反応が挙げられる（Ａｔｉｑｉ，Ｓ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０２０，２６（１１）：３１２）。

【0068】

本明細書で使用される、抗薬物抗体への「低い結合又は結合なし」という用語は、他の抗ＴＮＦα治療薬に対する抗薬物抗体への、本開示の抗ヒトＴＮＦα抗体グルココルチコイドコンジュゲート又は抗ヒトＴＮＦα抗体の結合を指し、そのような結合は、結合を測定するために使用されるアッセイのカットオフ点未満であると決定されるか、又はアッセイの所定の変動範囲内である。そのような方法において、カットオフ点は、抗薬物抗体への陽性結合を識別するために使用される所定の閾値である。一部の実施形態では、アッセイの所定の変動性は、アッセイのカットオフ点を約２０％未満上回る。そのような実施形態では、本開示の抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲート又は抗ヒトＴＮＦα抗体の、他の治療薬（例えば、アダリムマブ）に対する抗薬物抗体への結合であって、アッセイのカットオフ点を約２０％未満上回る結合は、低結合とみなされる。一部の実施形態では、本開示の抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲート又は抗ヒトＴＮＦα抗体の、他の治療薬（例えば、アダリムマブ）に対する抗薬物抗体への結合であって、アッセイのカットオフ点以下である結合は、結合なしとみなされる。

【0069】

「他の抗ＴＮＦα治療薬」という用語は、ＴＮＦαに結合し、ＴＮＦ受容体媒介性応答を阻害する薬剤を指し、本明細書に記載のコンジュゲート又は抗ヒトＴＮＦα抗体を含まない。そのような薬剤は、これらに限定されないが、例えばＦｃ領域又はＩｇＧ重鎖定常領域に融合し得る、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｄ断片、又は線状抗体などの、抗原と相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも一部分を含む、抗体又はそのコンジュゲート、抗体断片又は抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、他の抗ＴＮＦα治療薬は、例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、及びセルトリズマブ、並びに／又はそれらのコンジュゲートであってもよい。

【0070】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体の実施形態には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性若しくは多重特異性抗体、又はコンジュゲート抗体が含まれる。抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ）、及び任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）であってもよい。本開示の実施形態はまた、抗体断片又は抗原結合断片を含み、「抗体断片又は抗原結合断片」という用語は、例えばＦｃ領域又はＩｇＧ重鎖定常領域に融合してもよい、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｄ断片及び線状抗体などの、抗原と相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも一部分を含む。

【0071】

例示的な抗体は、４つのポリペプチド鎖：鎖間ジスルフィド結合を介して架橋される２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）から構成された免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体である。４つのポリペプチド鎖の各々のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１２５個以上のアミノ酸の可変領域を含む。４つのポリペプチド鎖の各々のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を含有する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、抗体重鎖のＦｃ領域及びＣＨ１ドメインを含む、抗体の領域を指す。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域から構成される。ＩｇＧアイソタイプは、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に更に分割され得る。定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに基づく。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９９１）。ＥＵインデックス番号付け又はＥＵ番号付けという用語は、本明細書では交換可能に使用される。

【0072】

ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework regions、ＦＲ）と呼称される、より保存されている領域が散在する、相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と呼称される、超可変領域に更に細分され得る。ＣＤＲはタンパク質の表面上に露出しており、抗原結合特異性のための抗体の重要な領域である。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されており、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。本明細書では、重鎖の３つのＣＤＲを「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３」と称し、軽鎖の３つのＣＤＲを「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３」と称する。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。アミノ酸残基のＣＤＲへの割り当ては、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１－９１７（１９８７）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７））、Ｎｏｒｔｈ（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１））、又はＩＭＧＴ（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：２０９－２１２）。ＩＭＧＴとＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義との組み合わせを、本明細書に記載されるような例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体に使用した。

【0073】

本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む抗体の領域を指す。任意選択で、Ｆｃ領域は、抗体重鎖のヒンジ領域の一部分又はヒンジ領域全体を含み得る。エフェクター機能などの生物活性は、抗体のアイソタイプによって異なるＦｃ領域に起因する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞介在性食作用（antibody-dependent cell mediated phagocytosis、ＡＤＣＰ）、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）、食作用、細胞表面受容体の下方制御（例えば、Ｂ細胞受容体）、及びＢ細胞活性化が挙げられる。

【0074】

本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体によって結合される抗原のアミノ酸残基を指す。エピトープは、直鎖状エピトープ、立体構造エピトープ、又はハイブリッドエピトープであり得る。「エピトープ」という用語は、構造的エピトープに関して使用され得る。構造的エピトープは、一部の実施形態によれば、抗体によってカバーされる抗原の領域（例えば、抗原に結合したときの抗体のフットプリント）を説明するために使用され得る。一部の実施形態では、構造的エピトープは、抗体のアミノ酸残基の特定の近接内（例えば、特定のオングストローム数内）にある抗原のアミノ酸残基を説明し得る。「エピトープ」という用語はまた、機能的エピトープに関して使用され得る。機能的エピトープは、一部の実施形態によれば、抗原と抗体との間の結合エネルギーに寄与する様式で抗体のアミノ酸残基と相互作用する抗原のアミノ酸残基を説明するために使用され得る。エピトープは、「エピトープマッピング技術」とも呼ばれる異なる実験技術に従って決定することができる。エピトープの決定は、使用される異なるエピトープマッピング技術に基づいて変動し得、例えば、特定の実験条件によって誘導される抗原の立体構造変化又は切断に起因して、使用される異なる実験条件によっても変動し得ることが理解される。エピトープマッピング技術は、当該技術分野において既知であり（例えば、Ｒｏｃｋｂｅｒｇ ａｎｄ Ｎｉｌｖｅｂｒａｎｔ，Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，３^ｒｄ ｅｄ．２０１８、Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９９８，５３（１）：１６６－１７５）、例えば、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance、ＮＭＲ）分光法、部位特異的変異誘発、種交換変異誘発、アラニンスキャニング変異誘発、立体障害変異誘発、水素－重水素交換（hydrogen-deuterium exchange、ＨＤＸ）、及び交差ブロッキングアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。

【0075】

本明細書で使用される「結合する」という用語は、別段の定めがない限り、化学結合又は別のタンパク質若しくは分子との引力相互作用を形成するタンパク質又は分子の能力を意味することを意図しており、当該技術分野において既知である一般的な方法によって決定されるように、２つのタンパク質又は分子の近接をもたらす。

【0076】

本明細書で使用される「核酸」という用語は、天然ヌクレオチド、改変ヌクレオチド、及び／又はヌクレオチドの類似体を組み込んだＤＮＡ、ｃＤＮＡ、並びにＲＮＡ分子などの一本鎖及び／又は二本鎖ヌクレオチド含有分子を含むヌクレオチドのポリマーを指す。本開示のポリヌクレオチドはまた、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼ又は合成反応によってその中に組み込まれた基質を含んでもよい。

【0077】

本開示の実施形態は、ポリペプチド（例えば、抗ヒトＴＮＦα抗体）が、１つ以上の薬物部分、例えば、２つの薬物部分、３つの薬物部分、４つの薬物部分、５つの薬物部分、又はそれ以上の薬物部分にコンジュゲートされているコンジュゲートを含む。薬物部分は、本明細書中に記載されるように、ポリペプチド中の１つ以上の部位でポリペプチドにコンジュゲートされ得る。ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、２～５、又は３～５、又は３～４の範囲の平均薬物対抗体比（drug-to-antibody ratio、ＤＡＲ）（モル比）を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートは、約３の平均ＤＡＲを有する。ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、約４の平均ＤＡＲを有する。平均とは、算術平均を意味する。

【0078】

本明細書で使用される場合、式Ｉのコンジュゲートは、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、及びＩｆのコンジュゲートを包含することが理解され、本明細書における式Ｉのコンジュゲートへの言及は全て、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、及びＩｆのコンジュゲートを含むものとして読まれるべきである。式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、及びＩｆのコンジュゲートを含む式Ｉのコンジュゲートは、抗ヒトＴＮＦα抗体グルココルチコイドコンジュゲート（「抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲート」）と称され得ることが、当業者によって更に理解される。

【0079】

本開示の抗ヒトＴＮＦα抗体ＧＣコンジュゲートは、例えば、静注、又は皮下投与を含む、コンジュゲートを体内に吸収され、利用されるようにする任意の経路によって投与される医薬組成物として製剤化され得る。そのような医薬組成物は、当該技術分野で既知の技法及び方法を使用して調製され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ａｄｅｊａｒｅ，Ｅｄｉｔｏｒ，２３^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０２０，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅを参照されたい）。

【0080】

本明細書で使用される場合、用語「治療すること」、「治療」、又は「治療するため」は、既存の症状若しくは障害の進行若しくは重症度を抑制すること、緩徐化すること、停止すること、制御すること、遅延させること、若しくは逆転させること、又は既存の症状若しくは障害を改善することを含むが、必ずしも既存の症状若しくは障害の完全な排除を示すわけではない。治療は、患者、特にヒトの症状又は障害の治療のためのタンパク質又は核酸又はベクター又は組成物の投与を含む。

【0081】

本明細書で使用される「阻害する」又は「阻害すること」という用語は、例えば、生物学的応答又は活性の低減、低下、減速、減少、停止、破壊、抑止、拮抗、又はブロッキングを指すが、必ずしも生物学的応答の完全な排除を示すわけではない。

【0082】

本明細書で使用される「対象」という用語は、これらに限定されないが、ヒト、チンパンジー、類人猿、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモットなどを含む哺乳動物を指す。好ましくは、対象はヒトである。

【0083】

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、対象に単回又は複数回投与すると、診断中又は治療中の対象に所望の効果を提供する、本開示のコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の量又は投与量を指す。本明細書で使用される「有効量」という用語は、対象の所望の生物学的又は医学的応答を誘発する、例えば、タンパク質の活性の低下又は阻害を誘発する、あるいは症状を改善する、状態を緩和する、疾患の進行を減速若しくは遅延する、又は疾患などを予防する、本開示のコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の量を更に指す。非限定的な実施形態では、「有効量」という用語は、対象に投与されたときに、所望の治療結果を達成するために、状態、又は障害又は疾患を少なくとも部分的に緩和、阻害、予防及び／又は改善するために有効である、コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の必要な量（投与量及び期間及び投与の手段）を指す。有効量は、有益な効果が本開示のコンジュゲート又は本開示のその薬学的に許容される塩の毒作用又は有害作用を上回る量でもある。

【0084】

有効量は、既知の技法の使用により、かつ同様の状況下で得られた結果を観察することにより、当業者によって決定され得る。患者のための有効量を決定する際に、担当医によって、患者の種；そのサイズ、年齢、及び全般的健康状態；関連する特定の疾患又は障害；疾患又は障害の程度又は関与又は重症度；個々の患者の応答、投与される特定のコンジュゲート、投与様式；投与される調製物の生物学的利用能特性；選択された投与レジメン；併用薬の使用；並びに他の関連する状況が挙げられるが、これらに限定されない。

【0085】

本発明の範囲内に含まれるのは、式Ｉのコンジュゲートの薬学的に許容される塩である。式Ｉのコンジュゲートなどの本発明のコンジュゲートの薬学的に許容される塩は、当該技術分野で既知の標準的な条件下で形成することができる。例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９，（１９７７）を参照のこと。

【0086】

表１：略語及び定義

【表1】

【0087】

本開示のコンジュゲート又はその塩は、当業者に既知の様々な手順によって容易に調製され得、そのうちのいくつかが、以下の調製物及び実施例において例解されている。当業者は、本開示のコンジュゲート又はその塩を調製するために、記載される経路の各々に対する特定の合成工程を異なる方式で組み合わせることができるか、又は異なるスキームからの工程と併せることができることを認識している。各工程の生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィ、濾過、粉砕、及び結晶化を含む、当該技術分野で周知の従来の方法によって回収することできる。全ての置換基は、別途指示のない限り、すでに定義されたとおりである。試薬及び出発物質は、当業者であれば容易に入手可能なものである。以下の調製物、実施例、及びアッセイは、本開示を更に例解するが、決して本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。

【0088】

図面の簡単な説明
図１は、例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのインビトロでのＡＤＣＣ活性を示す。
図２は、例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのインビトロでのＣＤＣ活性を示す。
図３は、例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ６が、アダリムマブで過免疫されたカニクイザルにおいて形成されたアダリムマブに対する抗薬物抗体への有意に低い結合を有することを示す。
図４は、例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ６が、アダリムマブで治療されたヒト患者において形成されたアダリムマブに対する抗薬物抗体への有意に低い結合を有することを示す。
図５Ａは、ＰＢＳ、ｐＨ７．２（５Ａ）、酢酸塩、ｐＨ５（５Ｂ）、及びヒスチジン、ｐＨ６（５Ｃ）中の例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのＤＳＣサーモグラムを示す。
図５Ｂは、ＰＢＳ、ｐＨ７．２（５Ａ）、酢酸塩、ｐＨ５（５Ｂ）、及びヒスチジン、ｐＨ６（５Ｃ）中の例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのＤＳＣサーモグラムを示す。
図５Ｃは、ＰＢＳ、ｐＨ７．２（５Ａ）、酢酸塩、ｐＨ５（５Ｂ）、及びヒスチジン、ｐＨ６（５Ｃ）中の例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのＤＳＣサーモグラムを示す。
図６Ａは、接触過敏症のヒト化マウスモデルにおける、１ｍｇ／ｋｇ（６Ａ）、３ｍｇ／ｋｇ（６Ｂ）、及び１０ｍｇ／ｋｇ（６Ｃ）での抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１、及び例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体コンジュゲートの有効性比較を示す。
図６Ｂは、接触過敏症のヒト化マウスモデルにおける、１ｍｇ／ｋｇ（６Ａ）、３ｍｇ／ｋｇ（６Ｂ）、及び１０ｍｇ／ｋｇ（６Ｃ）での抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１、及び例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体コンジュゲートの有効性比較を示す。
図６Ｃは、接触過敏症のヒト化マウスモデルにおける、１ｍｇ／ｋｇ（６Ａ）、３ｍｇ／ｋｇ（６Ｂ）、及び１０ｍｇ／ｋｇ（６Ｃ）での抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１、及び例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体コンジュゲートの有効性比較を示す。
図７は、ヒトＴＮＦαトランスジェニックマウス多発性関節炎モデルにおける抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲートが、アダリムマブナイーブマウス及びアダリムマブ処置マウスの両方において臨床スコアによって測定されたように疾患進行を停止させたことを示し、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲートが有意な抗薬物抗体応答を生成せず、アダリムマブに対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有したか、又は交差反応を有さなかったことを示す。

【実施例】

【0089】

調製物１
６－ブロモ－２－フルオロ－３－メトキシベンズアルデヒド

【化27】

２つの反応を、並行して実施した。ＴＨＦ（１５００ｍＬ）中の４－ブロモ－２－フルオロ－１－メトキシベンゼン（２５０ｇ、１．２ｍｏｌ）の溶液に、ＬＤＡ（２Ｍ、７３０ｍＬ）を－７８℃で３０分かけてゆっくり添加した。更に３０分後、ＤＭＦ（１４０ｍＬ、１．８ｍｏｌ）を－７８℃で３０分かけてゆっくり添加した。１時間後、２つの反応物を合わせ、混合物をクエン酸水溶液（２０００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（１５００ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＣｌ水溶液（１０００ｍＬ）で洗浄し、減圧下で濃縮して、残渣を得た。残渣を、石油エーテル（１０００ｍＬ）で、室温で１２時間にわたって摩砕して、表題化合物（３８２ｇ、６７％の収率）を得た。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ２３３．９（Ｍ＋Ｈ）。

【0090】

調製物２
２－フルオロ－３－メトキシ－６－メチルベンズアルデヒド

【化28】

３つの反応を、並行して実施した。６－ブロモ－２－フルオロ－３－メトキシベンズアルデヒド（１２０ｇ、５．３ｍｏｌ）、メチルボロン酸（４７ｇ、７．９ｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２（１２ｇ、０．０２ｍｏｌ）、及びＣｓ_２ＣＯ_３（３４０ｇ、１．１ｍｏｌ）を、１，４－ジオキサン（６００ｍＬ）及び水（１２０ｍＬ）の混合物に添加した。混合物を、１２０℃で撹拌した。１２時間後、３つの反応物を合わせ、混合物を、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（１０００ｍＬ）で希釈し、ＭＴＢＥ（１５００ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＣｌ水溶液（１０００ｍＬ）で洗浄し、減圧下で濃縮して、残渣を得た。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィによって精製し、４０：１のＰｅｔエーテル：ＥｔＯＡｃで溶出して、表題化合物を得た（１８０ｇ、５９％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ１６９．３（Ｍ＋Ｈ）。

【0091】

調製物３
２－フルオロ－３－ヒドロキシ－６－メチルベンズアルデヒド

【化29】

２－フルオロ－３－メトキシ－６－メチルベンズアルデヒド（１７５ｇ、１．０ｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０５０ｍＬ）中に添加した。ＢＢｒ_３（２００ｍＬ、２．１ｍｏｌ）を、溶液中に、０℃でゆっくり添加した。反応物を、室温で撹拌した。１時間後、混合物を、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１０００ｍＬ）で、ｐＨ＝７～８になるまで希釈し、ＭＴＢＥ（１５００ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＣｌ水溶液（１０００ｍＬ）で洗浄し、減圧下で濃縮して、表題化合物（１１０ｇ、６８％）を得た。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ１５４．９（Ｍ＋Ｈ）。

【0092】

調製物４
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［３－［（２－フルオロ－３－ホルミル－４－メチル－フェノキシ）メチル］フェニル］カルバメート

【化30】

２－フルオロ－３－ヒドロキシ－６－メチルベンズアルデヒド（１３０ｇ、０．８４ｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル（３－（ブロモメチル）フェニル）カルバメート（２００ｇ、０．７０ｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（３５０ｇ、２．５ｍｏｌ）を、アセトニトリル（７８０ｍＬ）に、室温で添加し、次いで、５０℃に加熱した。５時間後、反応物を、水（６００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（８００ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＣｌ水溶液（８００ｍＬ）で洗浄し、減圧下で濃縮して、残渣を得た。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィによって精製し、５０：１のＰｅｔエーテル：ＥｔＯＡｃで溶出して、粗生成物を得た。粗生成物を、ＭＴＢＥ（５００ｍＬ）で、室温で３０分間摩砕して、表題化合物（１０３ｇ、３２％）を得た。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ３８２．１（Ｍ＋Ｎａ）。

【0093】

調製物５
（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（３－（（３－アミノベンジル）オキシ）－２－フルオロ－６－メチルフェニル）－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－４Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－オン

【化31】

過塩素酸（水中の７０％、４．８ｍＬ）を、アセトニトリル（１１０ｍＬ）中の、（８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｓ）－１１，１６，１７－トリヒドロキシ－１７－（２－ヒドロキシアセチル）－１０，１３－ジメチル－７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６－オクタヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オン（４．４ｇ、１２ｍｍｏｌ、「１６アルファ－ヒドロキシプレドニゾロン」とも称される）及びｔｅｒｔ－ブチルＮ－［３－［（２－フルオロ－３－ホルミル－４－メチル－フェノキシ）メチル］フェニル］カルバメート（４．０ｇ、１１ｍｍｏｌ、調製物４）の懸濁液に、－１０℃で添加し、室温に加温した。１時間後、ＤＭＦ（１０ｍＬ）を、懸濁液に、室温で添加した。１８時間後、反応物を、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液でクエンチし、９：１のＤＣＭ：イソプロパノールで抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得た。残渣を、１：１のＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液（１０ｍＭ＋５％ＭｅＯＨ）：ＡＣＮで溶離する逆相クロマトグラフィによって精製して、表題化合物、ピーク１（１．７２ｇ、２５％）を得た。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ６１８．６（Ｍ＋Ｈ）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ｄ_６－ＤＭＳＯ）δ０．９３－０．８７（ｍ，６Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ），１．７１－１．６０（ｍ，１Ｈ），１．８９－１．７６（ｍ，４Ｈ），２．１８－２．１２（ｍ，２Ｈ），２．２９（ｓ，４Ｈ），４．２３－４．１７（ｍ，１Ｈ），４．３２－４．３０（ｍ，１Ｈ），４．５０－４．４３（ｍ，１Ｈ），４．８１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．９８－４．９５（ｍ，３Ｈ），５．１６－５．１０（ｍ，３Ｈ），５．６１（ｓ，１Ｈ），５．９５（ｓ，１Ｈ），６．１８－６．１５（ｍ，１Ｈ），６．５３－６．４８（ｍ，２Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），６．９０－６．８６（ｍ，１Ｈ），６．９９（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１２（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３３－７．３０（ｍ，１Ｈ）。

【0094】

調製物６
（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｓ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（３－（（３－アミノベンジル）オキシ）－２－フルオロ－６－メチルフェニル）－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－４Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－オン（本明細書ではＧＣ１とも称される）

【化32】

調製物５から、残渣を、１：１のＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液（１０ｍＭ＋５％ＭｅＯＨ）：ＡＣＮで溶出する逆相クロマトグラフィによって精製して、表題化合物、ピーク２（１．２４ｇ、１８％）を得た。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ６１８．６（Ｍ＋Ｈ）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ｄ_６－ＤＭＳＯ）ｄ ^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：０．８８（ｓ，３Ｈ），１．２４－１．１２（ｍ，２Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ），１．６９－１．５６（ｍ，１Ｈ），１．９１－１．７６（ｍ，４Ｈ），２．０８－２．０１（ｍ，２Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），２．３９－２．２９（ｍ，１Ｈ），３．１８（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．１２－４．００（ｍ，１Ｈ），４．３７－４．３０（ｍ，２Ｈ），４．７９（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），５．００－４．９３（ｍ，２Ｈ），５．１０－５．０６（ｍ，３Ｈ），５．３１（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｓ，１Ｈ），６．１８（ｄｄ，Ｊ＝１．８，１０．１Ｈｚ，１Ｈ），６．３４（ｓ，１Ｈ），６．５３－６．４８（ｍ，２Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１Ｈ）。

【0095】

調製物７
（３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパノイル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニン

【化33】

ＤＭＦ（２５ｍＬ）中のＮ－スクシンイミジル３－マレイミドプロピオネート（５．０ｇ、１９ｍｍｏｌ）及びＬ－アラニル－Ｌ－アラニン（３．４ｇ、２１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（３．１ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得て、残渣をＥｔＯＡｃ中２％の酢酸で溶出するシリカゲルクロマトグラフィにより精製して、表題化合物（４．０ｇ、６９％）を得た。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ３１２．３（Ｍ＋Ｈ）。

【0096】

調製物８
３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（（２－フルオロ－３－（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｓ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）－４－メチルフェノキシ）メチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）プロパンアミド（本明細書において「ＧＣ－Ｌ」とも称される）

【化34】

（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｓ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（３－（（３－アミノベンジル）オキシ）－２－フルオロ－６－メチルフェニル）－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－４Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－オン（２４ｇ、３９ｍｍｏｌ、調製物６参照）及び３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパノイル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニン（１５ｇ、４７ｍｍｏｌ、調製物７参照）のＤＭＦ（２５０ｍＬ）溶液を０～５℃に冷却し、２，６－ルチジン（１１ｍＬ、９７ｍｍｏｌ）、続いてＨＡＴＵ（１７ｇ、４３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０～５℃で５分間撹拌し、次いで冷却浴を除去し、混合物を２時間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃで希釈した。有機溶液を水で３回、飽和ＮａＣｌ水溶液で１回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ（ＭｅＯＨを添加して溶解性を補助した）、濾過し、蒸発させて、粗生成物を得た。粗生成物を、ＤＣＭ中１～１０％のＭｅＯＨの勾配を使用してシリカゲルクロマトグラフィによって精製して、表題化合物（２４ｇ、６８％）を得た。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ９１１．４（Ｍ＋Ｈ）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：ｄ９．８８（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．６０－７．５８（ｍ，１Ｈ），７．３４－７．２９（ｍ，２Ｈ），７．１４－７．０９（ｍ，２Ｈ），７．００（ｓ，２Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．３４（ｓ，１Ｈ），６．１８（ｄｄ，Ｊ＝１．８，１０．０Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｓ，１Ｈ），５．７６（ｓ，１Ｈ），５．３１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．１３－５．０４（ｍ，３Ｈ），４．７８（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４１－４．３０（ｍ，４Ｈ），４．１０－４．００（ｍ，１Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４２－２．３１（ｍ，３Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），２．１１－２．０１（ｍ，２Ｈ），１．９１－１．７８（ｍ，５Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．１９－１．１１（ｍ，５Ｈ），０．８８（ｓ，３Ｈ）。

【0097】

調製物９
３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（（２－フルオロ－３－（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）－４－メチルフェノキシ）メチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）プロパンアミド

【化35】

調製物８に記載の手順に類似した様式で、調製物９の化合物を、（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（３－（（３－アミノベンジル）オキシ）－２－フルオロ－６－メチルフェニル）－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－４Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－オン（調製物５参照）及び３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパノイル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニン（調製物７参照）から調製した。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ９１１．４（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：ｄ９．８８（ｓ，１Ｈ），８．２３－８．２０（ｍ，１Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３３－７．２８（ｍ，２Ｈ），７．１５－７．０８（ｍ，２Ｈ），７．００（ｓ，２Ｈ），６．９１－６．８９（ｍ，１Ｈ），６．１７（ｄｄ，Ｊ＝１．７，１０．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．６１（ｓ，１Ｈ），５．１６－５．１２（ｍ，３Ｈ），４．９８－４．９６（ｍ，１Ｈ），４．８１（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４９－４．３６（ｍ，６Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３０－２．２９（ｍ，４Ｈ），２．１７－２．１５（ｍ，２Ｈ），１．８８－１．７７（ｍ，４Ｈ），１．６９－１．６１（ｍ，１Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），０．９３－０．８７（ｍ，６Ｈ）。

【0098】

実施例１．抗ヒトＴＮＦα抗体グルココルチコイドコンジュゲート（抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲート）の生成
実施例１ａ：抗ヒトＴＮＦα抗体の生成及び操作
抗体生成：ヒトＴＮＦαに特異的な抗体を生成させるために、ヒト免疫グロブリン可変領域を有するトランスジェニックマウスを、組換えヒトＴＮＦαで免疫化した。ヒトＴＮＦαを用いてスクリーニングを行い、他のＴＮＦα種による交差反応性を試験した。ヒト及びカニクイザルＴＮＦαの両方に交差反応性である抗体をクローニングし、発現させ、標準的な手順によって精製し、ＴＮＦα誘導性細胞傷害性アッセイにおいて中和について試験した。抗体を選択し、そのＣＤＲ、可変ドメインフレームワーク領域、及びＩｇＧアイソタイプを操作して、結合親和性、並びに安定性、溶解性、粘度、疎水性、及び凝集などの開発性特性を改善した。

【0099】

ヒトＴＮＦαのアミノ酸配列は、配列番号３９として提供され、カニクイザルＴＮＦαのアミノ酸配列は、配列番号４２として提供される。

【0100】

抗ヒトＴＮＦα抗体は、周知の方法によって合成及び精製することができる。適切な宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese hamster ovarian cell、ＣＨＯ）に、２つのベクターが使用される場合、所定のＨＣ：ＬＣベクター比を用いる抗体、又は重鎖及び軽鎖の両方をコードする単一ベクター系を用いる抗体を分泌するための発現系を、一過性に又は安定的にトランスフェクトすることができる。抗体が分泌されている清澄化培地は、一般的に使用される技術を使用して精製することができる。

【0101】

粘度を改善するための抗体操作：親ＴＮＦα抗体系統は、濃縮時に高い粘度を有することが見出された。粘度は、例えば、自己注射器による治療用抗体の送達の実現可能性を評価するための重要な開発性基準である。抗体の変異誘発分析は、免疫原性リスクを増加させることなく、生物物理学的特性を改善することと、望ましい親和性及び効力を保持することとのバランスをとることを必要とした。親抗体のインシリコモデリングを使用して、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる表面における電荷不均衡の領域を識別した。変異誘発から生成された抗体をＴＮＦα結合についてスクリーニングし、親ｍＡｂと比較して標的結合を保持又は改善し（ＥＬＩＳＡによって決定される）、かつ望ましい粘度及び他の開発性特性を有するそれらの抗体を、更なる開発のために選択した。

【0102】

免疫原性のリスクを低下させるための抗体操作：抗ヒトＴＮＦα抗体を、ＭＨＣ関連ペプチドプロテオミクス（MHC-associated peptide proteomics、ＭＡＰＰＳ）アッセイにおいて試験して、免疫原性リスクを決定した。簡潔には、主要組織適合性複合体（major histocompatibility complex、ＭＨＣ）結合ペプチドを、特異的ＣＤＲ配列を有する抗体について識別した。免疫原性を低下させる可能性があると識別された変異を有するＣＤＲライブラリを構築し、ＴＮＦα結合についてスクリーニングした。抗体をスクリーニング及び選択して、ＴＮＦαに対する望ましい結合親和性と、他の望ましい開発性特性を維持することとのバランスをとりながら、低い免疫原性リスクについて最適化した。

【0103】

表２ａ、２ｂ、及び３は、ヒトＴＮＦαへの望ましい結合効力を保持しながら、低粘度、許容可能な免疫原性リスク、及び他の望ましい開発性特性について最適化された例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体配列を示す。

【0104】

表２ａ：例示的な抗ヒトＴＮＦα ＡｂのＣＤＲアミノ酸配列

【表2-1】

【0105】

表２ｂ：例示的な抗ヒトＴＮＦα ＡｂのＣＤＲアミノ酸配列

【表2-2】

【0106】

表３：例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂのアミノ酸配列

【表3】

【0107】

実施例１ｂ．抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート（式中、ｎは、４である）の生成

【化36】

（式中、ｎは、４であり、Ａｂは、Ａｂ１である）
例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１（表２ａ、２ｂ、及び表３を参照）を、まず、４０倍モル過剰のジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）の存在下で、３７℃で２時間又は約２１℃で１６時間を超えて還元した。この最初の還元工程を使用して、発現中に重鎖の１２４位及び３７８位で、操作されたシステインに結合する、システイン及びグルタチオンを含む様々なキャッピング基を除去した。還元工程の後、脱塩樹脂を通して試料を精製して、非結合キャップ並びに還元剤を除去した。その後の２時間の酸化工程を、１０倍モル過剰のデヒドロアスコルビン酸（dehydroascorbic acid、ＤＨＡＡ）の存在下で、室温（約２１℃）で行って、軽鎖と重鎖との間の天然の鎖間ジスルフィド並びにヒンジジスルフィドの対を再形成した。２時間の酸化工程後、４～８モル当量のグルココルチコイド受容体アゴニストペイロード－リンカー（「glucocorticoid receptor agonist payload-linker、ＧＣ－Ｌ」）、調製物８で調製した３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（（２－フルオロ－３－（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｓ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）－４－メチルフェノキシ）メチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）プロパンアミドをＤＭＳＯに溶解した１０ｍＭストック溶液を使用して添加した。次いで、試料を室温で３０～６０分間インキュベートして、操作されたシステインへのＧＣ－Ｌの効率的なコンジュゲーションを可能にした。次いで、サイズ排除クロマトグラフィ（Size Exclusion Chromatography、ＳＥＣ）又は接線流濾過（Tangential Flow Filtration、ＴＦＦ）などの後続の仕上げ工程を使用して、試料を適切な製剤緩衝液に緩衝液交換し、ＤＭＳＯ及びあらゆる過剰なリンカー－ペイロードを除去した。

【0108】

薬物対抗体比（Drug to antibody ratio、ＤＡＲ）評価：最終コンジュゲート上に存在するリンカー－ペイロードの平均数を評価するために、１）逆相（Reverse phase、ＲＰ）ＨＰＬＣ及び２）飛行時間（Time of Flight、ＴＯＦ）質量分析の２つの分析方法を使用した。両方の方法は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度約１０ｍＭまで添加し、続いて４２℃で５分間インキュベートすることを含む最初の試料還元工程を必要とした。

【0109】

逆相ＨＰＬＣ法：１０～３０μｇの還元された抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ１ＧＣコンジュゲート試料を、Ｐｈｅｎｙｌ ５ＰＷ、４．６ｍｍ×７．５ｃｍ、１０μＭカラム（Ｔｏｓｈ Ｐａｒｔ＃０００８０４３）上に注入した。Ａ緩衝液は水中の０．１％トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid、ＴＦＡ）から構成され、一方、Ｂ緩衝液はアセトニトリル（acetonitrile、ＡＣＮ）中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から構成された。試料注入前にカラムを２０％Ｂ緩衝液中で平衡化し、続いて約８．５カラム体積にわたって２８％Ｂ～４０％Ｂの勾配をかけた。平均ＤＡＲは、寄与する種ごとのＤＡＲ数を乗じた分画パーセンテージから、各個々のＤＡＲ種からの寄与を計算することによって決定した。この値は、部分的に還元された試料に基づき、分子の半分のみを表すので、次いで、インタクトな抗体ＧＣコンジュゲートを説明するために、その数に２を乗じた。実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのＤＡＲ計算を表４に提供する。

【0110】

表４：部分的に還元された試料からの各ＤＡＲ種についての分画パーセンテージを使用した抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについての平均ＤＡＲの定量化。

【表4】

【0111】

飛行時間型質量分析法：部分的に還元された試料８μｇをＰｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ｓｂ－Ｃ３ ２．１×２．５ｍｍ、５μＭカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐａｒｔ＃８２１０７５－９２４）上に注入した。緩衝液Ａは水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から構成され、一方、緩衝液Ｂはアセトニトリル（ＡＣＮ）中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から構成された。試料注入の前にカラムを０％Ｂ緩衝液中で平衡化し、続いて約２８カラム体積にわたって１０％Ｂ～８０％Ｂの勾配をかけた。平均ＤＡＲは、寄与する種ごとのＤＡＲ数を乗じた分画パーセンテージから、各個々のＤＡＲ種からの寄与を計算することによって決定した。この値は、部分的に還元された試料に基づき、分子の半分のみを表すので、次いで、インタクトな抗体ＧＣコンジュゲートを説明するために、その数に２を乗じた。実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについてのＤＡＲ計算を表５に提供する。

【0112】

表５：飛行時間質量分析からの総イオンカウントに基づく分画パーセンテージを使用した、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについての平均ＤＡＲの定量化。

【表5】

【0113】

実施例１ｃ．抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート（式中、ｎは、３である）の生成

【化37】

（式中、ｎは、３であり、Ａｂは、Ａｂ１である）
実施例１ｃのコンジュゲートを、実施例１ｂに記載の手順と類似の様式で、ＧＣ－Ｌ、３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（（２－フルオロ－３－（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｓ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）－４－メチルフェノキシ）メチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）プロパンアミド対Ａｂ１のより低いモル比を、コンジュゲーション工程中に使用して調製した。例えば、対応するＧＣ－Ｌ：Ａｂ１の３．２：１のモル比の使用は、約３の最終ＤＡＲをもたらした。

【0114】

実施例１ｄ．抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲート（式中、ｎは、４である）の生成

【化38】

（式中、ｎは、４であり、Ａｂは、Ａｂ２である）
実施例１ｄのコンジュゲートを、Ａｂ１の代わりにＡｂ２を使用して、本質的に実施例１ｂに記載の手順と類似の様式で調製した。

【0115】

実施例１ｅ．抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲート（式中、ｎは、３である）の生成

【化39】

（式中、ｎは、３であり、Ａｂは、Ａｂ２である）
実施例１ｅのコンジュゲートを、Ａｂ１の代わりにＡｂ２を使用して、本質的に実施例１ｃに記載の手順と類似の様式で調製した。

【0116】

実施例１ｆ．チオスクシンイミド加水分解：コンジュゲート式Ｉｅ（式中、ｎは、４である）のチオスクシンイミド環を、以下のスキーム２に示すように、当該技術分野で周知の条件下で加水分解して（例えば、国際公開第２０１７／２１０４７１号、段落００１２２６を参照）、式Ｉｆの開環生成物を得ることができる。

【0117】

スキーム２

【化40】

加えて、式Ｉｅのコンジュゲートの上記チオスクシンイミド環は、少なくとも部分的なインビボでの加水分解を、標準的な又は周知の配合条件下で受けて、式Ｉｆの開環生成物をもたらすことができる。

【0118】

実施例２．抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び抗ヒトＴＮＦα抗体の結合効力
実施例２ａ．Ｅｌｉｓａ結合：実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び抗ヒトＴＮＦα抗体の、ヒト、アカゲザル、及び／又はイヌＴＮＦαタンパクに対する結合効力を、抗原ダウンＥＬＩＳＡフォーマットで試験した。簡潔に述べると、３８４ウェル高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ＃７８１０６１）を、炭酸塩緩衝液ｐＨ９．３（０．０１５ＭのＮａ_２ＣＯ_３及び０．０３５ＭのＮａＨＣＯ_３）で希釈した１μｇ／ｍＬのヒトＴＮＦα（Ｓｙｎｇｅｎｅ）、２μｇ／ｍＬのアカゲザルＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１０７０－ＲＭ）、又は２μｇ／ｍＬのイヌＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５０７－ＣＴ／ＣＦ）の１つのウェル当たり２０μＬでコーティングし、４℃で一晩保存した。翌日、プレートを８０μＬのカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３７５２８）で、室温で１時間ブロッキングし、ブロッキング緩衝液を除去し、ＣＨＯ細胞で発現させた２０μＬの滴定抗ヒトＴＮＦα抗体及び抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート（２０μｇ／ｍＬでの開始濃度をカゼインで希釈し、３倍に滴定、８ポイントダウン）をプレートに添加した。プレートを３７℃で９０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。１：１５００希釈の二次抗体試薬ヤギ抗ヒトカッパ－ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０６０－０４）２０μＬをプレートに添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。プレートを上記のように３回洗浄し、分子グレードの水で１：３５に希釈した２０μＬのアルカリホスファターゼ基質溶液を各ウェルに添加した。発色したら（約１５～３０分）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーで、５６０ｎＭ ＯＤでプレートを読み取り、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ４．７ソフトウェアを使用してデータを取得した。データ分析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで行った。

【0119】

表６ａの結果は、実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートが、コンジュゲートされていない抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１に匹敵する所望の効力でヒトＴＮＦαに結合することを示す。

【0120】

表６ｂの代表的な結果は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、及びＡｂ６が、ヒト、アカゲザル、及びイヌＴＮＦαと交差反応することを示す。

【0121】

表６ａ．実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの、ヒトＴＮＦαに対する結合ＥＣ_５０

【表6-1】

【0122】

表６ｂ．例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体の、ヒト、アカゲザル、及びイヌＴＮＦαに対する結合ＥＣ_５０

【表6-2】

【0123】

実施例２ｂ．細胞表面結合：実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの、生きた膜ＴＮＦα発現細胞への結合を評価するために、ＴＮＦα切断の非存在下で、生物活性ＴＮＦαの発現を細胞表面上で可能にすることが以前に実証された（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．１９９９）一連の変異を使用して、ＴＮＦαの既知の切断部位を不活性化した。切断不可能なＴＮＦα構築物を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に安定にトランスフェクトした。これらの細胞は、フローサイトメトリによって示されるように、膜結合ＴＮＦαを発現する。

【0124】

ＴＮＦαトランスフェクトＣＨＯ細胞を、６００ｎＭ～０．０３０４ｎＭの範囲の濃度（３倍希釈）の例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートと共に、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）中、４℃で３０分間インキュベートした。細胞結合を、製造業者のプロトコルに従って、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７（Ｔｈｅｒｍｏ＃Ａ２０１８６）で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２を用いた二次検出によって実証した。例示した抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートと共にインキュベートしたトランスフェクトＣＨＯ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液中、４℃で３０分間、２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２で染色した。染色された細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。染色は二連で行った。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１を陽性対照として使用した。

【0125】

ＦｌｏｗＪｏ（ｖ１０．８．０）を使用してフローサイトメトリデータを分析して、各試験試料についてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７の平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）を得た。ＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９を使用して、プロットされたＭＦＩデータに非線形回帰（４ＰＬ曲線）を当てはめることによって得た。

【0126】

表７の結果は、ＧＣの、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１へのコンジュゲーションが、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの、膜発現ＴＮＦαへの結合に有意に影響を及ぼさないことを示す。

【0127】

表７．実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの、ヒトＴＮＦαに対する結合

【表7】

【0128】

実施例３：抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲートのインビトロでの機能的特徴付け
実施例３ａ．内在化：実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び抗ヒトＴＮＦα抗体が、膜結合ＴＮＦαに結合し、異なる健常ヒトドナーからの樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）に由来するヒトＣＤ１４＋単球に内在化する能力を評価した。ＣＤ１４＋単球を末梢血単核細胞（periphery blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）から単離し、培養し、未成熟樹状細胞に分化させ（ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦを用いて）、全て標準的なプロトコルを使用した。成熟ＤＣを得るために、細胞を１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（リポ多糖）で４時間処理した。

【0129】

例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び抗ヒトＴＮＦα抗体を、完全ＲＰＭＩ培地中で、８μｇ／ｍＬで希釈し、完全ＲＰＭＩ培地中で５．３３μｇ／ｍＬに希釈した検出プローブＦａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７と等体積で混合し、次いで複合体形成のために暗所で、４℃で３０分間インキュベートし、次いで未成熟及び成熟ＤＣ培養物に添加し、ＣＯ_２インキュベーター中で、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を２％ＦＢＳ ＰＢＳで洗浄し、Ｃｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎの生／死色素を含む１００μＬの２％ＦＢＳ ＰＢＳに再懸濁した。ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０でデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。生単一細胞をゲーティングし、ＴＡＭＲＡ蛍光陽性細胞の割合を読み出しとして記録した。異なるドナーから生成されたデータを有する分子の比較を可能にするために、正規化された内在化指数を使用した。内在化シグナルは、次の式を使用して、ＩｇＧ１アイソタイプ（正規化された内在化指数＝０）及び内部陽性対照ＰＣ（正規化された内在化指数＝１００）に対して正規化し、

【数1】

式中、Ｘ_{ＴＡＭＲＡ}、ＩｇＧ１アイソタイプ_{ＴＡＭＲＡ}、及びＰＣ_{ＴＡＭＲＡ}は、それぞれ、試験分子Ｘ、ＩｇＧ１アイソタイプ、及びＰＣのＴＡＭＲＡ陽性集団の割合であった。

【0130】

表８ａの結果は、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートが、コンジュゲートされていない抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１の内在化指数に匹敵する内在化指数で、成熟樹状細胞上に発現したＴＮＦαへの結合の際に、インビトロで樹状細胞に内在化したことを示す。これは、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１へのグルココルチコイドのコンジュゲーションが抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１の内在化機能に影響を与えないことを示す。

【0131】

表８ｂにおける異なるドナーからの代表的な結果は、抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、及びＡｂ６が、細胞表面上のＴＮＦαへの結合の際に、未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞に内在化することを示す。

【0132】

実施例８ａ：実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの、樹状細胞への内在化

【表8-1】

【0133】

表８ｂ：例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体の、樹状細胞への内在化

【表8-2】

【0134】

実施例３ｂ．可溶性及び膜ＴＮＦα誘導性アポトーシスの阻害：実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び抗ヒトＴＮＦα抗体による可溶性及び膜ＴＮＦα誘導性アポトーシスの阻害を、インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいて評価した。

【0135】

可溶性ＴＮＦα誘導性アポトーシスの阻害：例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び抗ヒトＴＮＦα抗体が可溶性ＴＮＦα誘導性Ｌ９２９アポトーシスアッセイを阻害する能力を、インビトロで評価した。Ｌ９２９マウス線維肉腫細胞は、ＴＮＦレセプターを天然に発現する。アクチノマイシン－Ｄと組み合わせた場合、ＴＮＦαは、これらの細胞において古典的なアポトーシスを誘導し、ＴＮＦα中和によってレスキューされ得る反応性酸素中間体の過剰な形成に起因する迅速な細胞死をもたらす。簡潔に述べると、Ｌ９２９をアッセイ培地（１×ＤＭＥＭ培地、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、１％ＭＥＭ必須アミノ酸、１％Ｌ－グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム）中で培養した。アッセイ当日、細胞を１×ＰＢＳ（Ｃａ^＋＋もＭｇ^＋＋も含まない）ですすぎ、０．２５％トリプシン＋ＥＤＴＡを用いて培養フラスコから剥離した。トリプシンをアッセイ培地で不活性化した。Ｌ９２９細胞を室温で５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットをアッセイ培地に再懸濁し、１×１０^４個のＬ９２９細胞（１００μＬ中）を９６ウェルプレートに添加し、組織培養インキュベーター（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ_２）中に一晩置いた。次いで、コンジュゲート／ＴＮＦα／アクチノマイシン－Ｄ混合物（ＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び抗体を３倍希釈で、１５μｇ／ｍＬ～０．０００５μｇ／ｍＬで添加した）を、Ｌ９２９接着細胞を含む９６ウェルプレートに移し、１８時間インキュベートした（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ_２）。

【0136】

生存細胞の数を決定するために、アッセイ培地を除去し、ＭＴＳ－テトラゾリウム基質混合物をウェルに添加した（１００μＬ）（代謝的に活性な細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素が、ＭＴＳ－テトラゾリウムを着色ホルマザン生成物に還元する）。プレートをインキュベーター（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ_２）内に２時間置いた。細胞死は、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ）上で、４９０ｎｍでプレートを読み取ることによって決定した。結果は、例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート又は抗体によってＴＮＦα誘導性細胞傷害性の５０％が阻害される濃度（ＩＣ_５０）で表し、データの４パラメータシグモイドフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を使用して計算した。

【0137】

膜ＴＮＦα誘導性アポトーシスの阻害：実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び抗ヒトＴＮＦα抗体が膜ＴＮＦα誘導性アポトーシスを阻害する能力を評価するために、切断不可能なＴＮＦα構築物を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に安定にトランスフェクトして、ＣＨＯ細胞を発現する細胞表面（膜）ＴＮＦαを生成した。切断不可能なＴＮＦα構築物は、ＴＮＦα切断の非存在下で、細胞表面上の生物活性ＴＮＦαの発現を可能にするＴＮＦαの切断部位における既知の変異を用いて生成した（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．１９９９）。切断不可能なヒトＴＮＦαを発現するＣＨＯ細胞とのＬ９２９細胞のインキュベーションは、迅速なＬ９２９細胞死をもたらした。例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び抗ヒトＴＮＦα抗体が、観察されたアポトーシスを中和することができるかどうかを決定するために、１５μｇ／ｍＬ～０．０００５μｇ／ｍＬ（３倍希釈）の用量範囲を評価した。各濃度の例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート又は抗ヒトＴＮＦα抗体を、５００個のＣＨＯ ＴＮＦαトランスフェクタント細胞／ウェル＋６．２５μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤを含有するプレートに１００μＬ／ウェルで、２連で添加した。混合物を室温で３０分間インキュベートし、次いでＬ９２９細胞プレートに添加した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。Ｌ９２９細胞死は、本質的に可溶性ＴＮＦα誘導性アポトーシスアッセイについて記載したように決定した。

【0138】

表９ａの結果は、実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートが、用量依存的な様式でＬ９２９の可溶性ヒトＴＮＦα（約０．１０４μｇ／ｍＬのＩＣ_５０）及び膜ヒトＴＮＦα（約０．３０６μｇ／ｍＬのＩＣ_５０）誘導性アポトーシスをインビトロで阻害したことを示し、これは、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１に匹敵する。これは、抗体へのＧＣのコンジュゲーションが抗体の生物学的活性に影響を及ぼさないことを示す。陰性対照ｈＩｇＧ１アイソタイプは、予想どおり、ＴＮＦα誘導性アポトーシスを阻害しなかった。

【0139】

表９ｂの代表的な結果は、例示した抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、及びＡｂ６が、用量依存的な様式でＬ９２９細胞の可溶性及び膜ヒトＴＮＦα誘導性アポトーシスの両方をインビトロで阻害したことを示す。

【0140】

表９ａ．実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートは、Ｌ９２９細胞の可溶性及び膜ヒトＴＮＦα誘導性アポトーシスを阻害する

【表9-1】

【0141】

表９ｂ．例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体は、Ｌ９２９細胞の膜及び可溶性ヒトＴＮＦα誘導性アポトーシスを阻害する

【表9-2】

【0142】

実施例３ｃ．インビトロでのヒトＴ細胞サイトカイン発現アッセイ：疾患関連細胞に対する実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び実施例１ｄの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲートの機能活性を評価するために、ヒト初代Ｔ細胞を、インビトロで刺激し、コンジュゲートで共処理した。米国特許出願公開第２０２０／３３８２０８号からの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲートの活性も評価した。ヒト初代ＣＤ３^＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコル（Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１７９５１）に従って、免疫磁気陰性選択によって新たに精製されたヒトＰＢＭＣから単離した。フローサイトメトリ染色を使用して、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒで細胞純度を評価した。Ｔ細胞は、ＣＤ４（抗ヒトＣＤ４－ｅＦｌｕｏｒ－４５０、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃４８－００３６－４２）及びＣＤ８（抗ヒトＣＤ８ａ－ＦＩＴＣ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３０１００６）Ｔ細胞サブセットについての追加の表現型決定を用いて、ＣＤ３^＋（抗ヒトＣＤ３－ＡＰＣ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃１７－００４７－４２）であることを確認した。２×１０^５個のＣＤ３^＋Ｔ細胞／ウェルを、アッセイ培地（１×ＲＰＭＩ－１６４０培地、１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、及び０．１％β－メルカプトエタノール）中の９６ウェル平底プレートに播種した。細胞を、１×１０^５ヒトＴ－アクチベーター抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃１１１３２Ｄ）で刺激し、例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲート、又は米国特許出願公開第２０２０／３３８２０８号からの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲートの各々で、２００ｎＭ～０．０９１４ｎＭ（３倍希釈）で、１人のドナー当たり２連のプレートで処理した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。対照は、コンジュゲートされていない抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１及び遊離ＧＣを含んだ。次いで、アッセイプレートを７２時間、３７℃で５％ＣＯ_２と共にインキュベートした。細胞培養上清を７２時間で回収し、－８０℃で凍結した。サイトカインレベルは、ヒトＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、及びＧＭ－ＣＳＦに特異的な検出抗体を用いたカスタムＵ－ＰＬＥＸヒトバイオマーカー多重アッセイ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ＃Ｋ１５０６７Ｌ）を使用して、解凍した細胞培養上清から測定した。活性を、サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＧＭ－ＣＳＦの阻害、及びＩＬ－１０の誘導として測定した。各個々のドナーについて、サイトカインの検出レベル（ｐｇ／ｍＬ）を、正規化された「阻害％」又は「誘導％」値に変換した。ＩＬ－６、ＩＬ－１３、及びＧＭ－ＣＳＦについての正規化パラメータは、０％阻害が刺激未処置対照ウェル中のサイトカインの平均濃度に等しく、１００％阻害が非刺激対照ウェル中のサイトカインの平均濃度に等しいと設定した。ＩＬ－１０についての正規化パラメータは、０％誘導が刺激未処理対照ウェル中のサイトカインの平均濃度に等しく、１００％誘導が２００ｎＭ遊離ＧＣ処理群におけるサイトカインの平均濃度に等しいと設定した。正規化されたＩＣ_５０値は、正規化されたデータに非線形回帰（４ＰＬ曲線）を当てはめることによって得た。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９を使用して統計分析を行った。

【0143】

表１０の結果は、実施例１ｂ及び実施例１ｄの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲートがサイトカインＩＬ－１３、ＩＬ－６、及びＧＭ－ＣＳＦを有意に阻害し、サイトカインＩＬ－１０を有意に誘導したことを示す。追加的に、実施例１ｂ及び実施例１ｄの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲートは、このインビトロアッセイにおいて、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１又は米国特許出願公開第２０２０／３３８２０８号に開示されている例示的な抗ＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲートよりも高い割合でサイトカインＩＬ－１３、ＩＬ－６、及びＧＭ－ＣＳＦを阻害し、サイトカインＩＬ－１０を誘導した。特に、結果は、実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び実施例１ｄの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲートが、ＴＮＦα抗体及びグルココルチコイドの両方を介してサイトカイン発現を調節することを示す。

【0144】

表１０．Ｔ細胞サイトカイン放出に対する実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び実施例１ｄの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲートの効果

【表10】

統計：Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、^＊＝アイソタイプと比較したｐ＜０．０５、＾＝Ａｂ１と比較したｐ＜０．０５、†＝米国特許出願公開第２０２０／３３８２０８号からの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂコンジュゲートと比較したｐ＜０．０５。

【0145】

実施例４．例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲートのエフェクター機能活性
実施例４ａ．ヒトＦｃγ受容体結合。実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの、ヒトＦｃγ受容体に対する結合親和性を、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）分析によって評価した。シリーズＳ ＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ Ｐ／Ｎ ＢＲ１００５３０）は、製造者のＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリング法（Ｃｙｔｉｖａ Ｐ／Ｎ ＢＲ１０００５０）を使用して準備した。要約すると、ＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合物を１０μＬ／分で７分間注入することによって、４つ全てのフローセル（flow cell、ＦＣ）の表面を活性化させた。タンパク質Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｐ／Ｎ５３９２０２）を、ｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸緩衝液中で１００μｇ／ｍＬまで希釈し、１０μＬ／分の流速で７分間の注入によって４つ全てのＦＣ上に約４０００ＲＵまで固定化した。未反応部位を、１０μＬ／分で７分間のエタノールアミンの注入によってブロッキングした。ｐＨ１．５の２×１０μＬのグリシン注入を使用して、あらゆる非共有付随タンパク質を除去した。ランニングバッファは１×ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＴＥＫＮＯＶＡ、Ｐ／Ｎ Ｈ８０２２）であった。ＦｃγＲ細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、ＥＣＤ）－ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ＿１３１Ｒ、及びＦｃγＲＩＩＡ＿１３１Ｈ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ＿１５８Ｖ、ＦｃγＲＩＩＩＡ＿１５８Ｆ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）を、安定したＣＨＯ細胞発現から生成し、ＩｇＧセファロース及びサイズ排除クロマトグラフィを使用して精製した。ＦｃγＲＩ結合のために、試験分子（実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を含む）をランニングバッファ中で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、およそ１５０ＲＵの各抗体をＦＣ２～４に捕捉した（ＲＵ捕捉）。ＦＣ１は参照ＦＣであったため、ＦＣ１では抗体が捕捉されなかった。ＦｃγＲＩ ＥＣＤをランニングバッファ中で２００ｎＭまで希釈し、次いで、ランニングバッファ中で２倍連続希釈して０．７８ｎＭにした。各濃度の２連注入は、全てのＦＣに４０μＬ／分で１２０秒間注入し、その後１２００秒の解離フェーズが続いた。再生を、ｐＨ１．５の１０ｍＭのグリシン１５μＬを３０μＬ／分で全てのＦＣに注入することによって実施した。参照減算データをＦＣ２ ＦＣ１、ＦＣ３－ＦＣ１、及びＦＣ４－ＦＣ１として収集し、測定値を２５℃で得た。親和性（Ｋ_Ｄ）を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２ Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いた定常状態平衡分析又はＢＩＡ評価の「１：１（ラングミュア）結合」モデルのいずれかを使用して計算した。ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａの結合では、試験分子をランニングバッファ中で５μｇ／ｍＬに希釈し、およそ５００ＲＵの各抗体をＦＣ２～４で捕捉した）。ＦＣ１は、参照ＦＣであった。Ｆｃγ受容体ＥＣＤをランニングバッファ中で１０μＭに希釈し、次いで、ランニングバッファ中で２倍連続希釈して３９ｎＭにした。各濃度の２連注入は、全てのＦＣに４０μＬ／分で６０秒間注入され、その後１２０秒の解離フェーズが続いた。再生を、ｐＨ１．５の１０ｍＭのグリシン１５μＬを３０μＬ／分で全てのＦＣに注入することによって実施した。参照減算データをＦＣ２－ＦＣ１、ＦＣ３－ＦＣ１、及びＦＣ４－ＦＣ１として収集し、測定値を２５℃で得た。親和性（Ｋ_Ｄ）を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２ Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアを用いた定常状態平衡分析を使用して計算した。各受容体を少なくとも２回アッセイした。

【0146】

表１１の結果は、実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａ受容体ＥＣＤに対する結合親和性（Ｋ_Ｄ）がヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体に匹敵することを示す。

【0147】

表１１．実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの、ヒトＦｃγ受容体に対する結合親和性

【表11】

【0148】

実施例４ｂ．抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）：実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートのインビトロでのＡＤＣＣアッセイを、レポーター遺伝子ベースのＡＤＣＣアッセイで評価した。

【0149】

レポーター遺伝子ベースのＡＤＣＣアッセイのために、膜結合ＴＮＦα及びＣＤ２０を共発現するＣＨＯ細胞株（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）を標的細胞株として使用し、機能的ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）をエフェクター細胞株として発現するＪｕｒｋａｔ細胞を使用した。全ての試験分子及び細胞を、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（non-essential amino acid、ＮＥＡＡ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、５００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン、及び０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡを含むＲＰＭＩ－１６４０（フェノールレッドなし）を含有するアッセイ培地中で希釈した。試験抗体を、まず２０ｎＭの３×濃度に希釈し、次いで１：４の比で７回連続希釈した。５０μＬ／ウェルの各抗体を、白色不透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３９１７）に三連で分注した。ＣＤ２０抗体を陽性対照として使用した。次いで、Ｄａｕｄｉ標的細胞を５０μＬアリコート中５×１０^４細胞／ウェルでプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、Ｊｕｒｋａｔ Ｖ１５８細胞をウェルに５０μＬアリコート中１．５×１０^５個の細胞／ウェルで添加し、３７℃で４時間インキュベートし、続いて１００μＬ／ウェルのＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ８１３０）を添加した。プレートシェーカーを低速で使用してプレートの内容物を混合し、室温で５分間インキュベートし、０．２ｃｐｓの積分を使用してＢｉｏＴｅｋマイクロプレートリーダー（BioTek Instruments）で発光シグナルを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９を使用してデータを分析し、各抗体濃度についての相対発光単位（relative luminescence unit、ＲＬＵ）を、抗体濃度対ＲＬＵの散乱フォーマットでプロットした。結果は、２つの独立した実験の代表であった。

【0150】

図１の結果は、実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートが、陽性対照と比較した場合、適度なＡＤＣＣ活性を有したことを示す。

【0151】

実施例４ｃ．補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）：実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートのインビトロでのＣＤＣアッセイを、膜結合ＴＮＦα及びＣＤ２０を共発現するＣＨＯ細胞株（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）を使用して行った。全ての試験抗体、補体、及び細胞を、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、５００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン、及び０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡを含むＲＰＭＩ－１６４０（フェノールレッドなし）からなるアッセイ培地で希釈した。試験抗体を、まず２００ｎＭの３×濃度に希釈し、次いで１：４の比で７回連続希釈した。５０μＬ／ウェルの各抗体（ＣＤ２０陽性対照抗体を含む）を、白色不透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３９１７）に三連で分注した。Ｄａｕｄｉ標的細胞を５×１０^４細胞／ウェル、５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、３７℃の水浴中で迅速に解凍したヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ、＃Ａ１１３）をアッセイ培地中で１：６に希釈し、５０μＬ／ウェルでアッセイプレートに添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、続いて１００μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７５７１）を添加した。プレートシェーカーを低速で使用してプレートの内容物を混合し、室温で５分間インキュベートし、０．２ｃｐｓの積分を使用してＢｉｏＴｅｋマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で発光シグナルを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９を使用してデータを分析し、各抗体濃度についての相対発光単位（ＲＬＵ）を、抗体濃度対ＲＬＵの散乱フォーマットでプロットした。

【0152】

２つの代表的な独立した実験（そのうちの１つを図２に示す）の結果は、例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートが、陽性対照と比較した場合、ＣＤＣ活性のわずかな誘導を有することを示した。

【0153】

実施例５：アダリムマブに対する抗薬物抗体に結合する例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体の特徴付け
実施例５ａ．アダリムマブに対するカニクイザル抗薬物抗体への結合：アダリムマブで高度免疫したカニクイザルからのアフィニティ精製高度免疫サル血清（affinity purified hyperimmune monkey serum、ＡＰ－ＨＩＭＳ）から得たアダリムマブに対する抗薬物抗体（抗アダリムマブ抗体）への、例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体の結合を評価した。アダリムマブ－ＡｆｆｉＧｅｌ１０を使用して、アダリムマブ高度免疫カニクイザルからの抗アダリムマブ抗体を精製した。抗アダリムマブ抗体は、ＡＣＥ－ＢｒｉｄｇｅアッセイにおいてＡＰ－ＨＩＭＳの滴定を使用して検出した。アッセイは、免疫原性試験に関するＦＤＡガイダンスに従って開発された。簡単に説明すると、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、１５５００）を１×ＴＢＳＴ（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、ＩＢＢ－１８１Ｘ）で洗浄し、室温で１時間、ＴＢＳＴ／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ、Ａ７８８８）中１００μＬ／ウェルで、３０ｎＭのビオチン化アダリムマブで被覆した。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、アフィニティ精製抗アダリムマブ抗体をＴＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ、ＢＰ２４７１－１）で１：１０に希釈し、被覆したプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、捕捉された抗アダリムマブ抗体を、６５μＬ／ウェルの３００ｍＭ酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ３８－５００）を使用して室温で５分間酸溶出した。次いで、ポリプロピレン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３３５９）に、中和緩衝液（０．３７５ＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９）中の各１μｇ／ｍＬのビオチン化アダリムマブ及びルテニウム標識アダリムマブ５０μＬを装填した。次に、５０μＬの酸溶出試料を、中和緩衝液中の混合物及びＡＤＡを含有するポリプロピレンプレートに添加し、室温で１時間、標識抗体に架橋させた。ＭＳＤ Ｇｏｌｄ９６ウェルストレプトアビジンプレート（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ、Ｌ１５ＳＡ－１）を洗浄し、ＴＢＳ＋１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングし、次いで洗浄し、８０μＬの架橋試料をプレートに１時間添加した。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、１５０μＬ／ウェルの２×ＭＳＤ緩衝液（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ、Ｒ９２ＴＣ－２）をプレートに添加した。プレートをＭＳＤ ＳＱ１２０リーダーで読み取って、電気化学発光単位（electro chemiluminescent unit、ＥＣＬＵ）として表されるＴｉｅｒ１シグナルを得た。

【0154】

同じＡＰ－ＨＩＭＳをＡＣＥ－Ｂｒｉｄｇｅアッセイにおいても試験して、アダリムマブについて上で概説したのと本質的に同じ方法に従って、ただしビオチン及びルテニウム標識Ａｂ６を使用して、例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ６に対する抗体を検出した。次いで、得られたＥＣＬＵシグナルを、試験したＡＰ－ＨＩＭＳの濃度の関数としてプロットした。

【0155】

図３の結果は、アダリムマブ自体の抗薬物抗体（最大ＥＣＬＵシグナル４００００）へのアダリムマブの結合と比較した場合、例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ６が、アダリムマブで高度免疫されたカニクイザルからの血清から精製されたアダリムマブに対する抗薬物抗体（最大ＥＣＬＵシグナル４０００）への低い結合を有したか、結合しなかったことを示す。具体的には、結果は、例示した抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ６がカニクイザルによって生成されたアダリムマブに対する抗薬物抗体の約１０％のみを認識することを示し、この結合が、抗体定常領域などのＣＤＲ領域から離れて位置する共有配列に起因する可能性が高いことを示唆した。

【0156】

実施例５ｂ．アダリムマブに対するヒト患者抗薬物抗体への結合：試験ＲＡ－ＢＥＡＭに登録されたアダリムマブ治療患者から得られた２１個の患者血清試料中のアダリムマブに対する抗薬物抗体（抗アダリムマブ抗体）への、例示的抗ヒトＴＮＦα抗体の結合を評価した。２１個の血清試料をベースライン後に収集し、本質的にカニクイザルＡＤＡ評価について記載したような方法を使用することによって、アダリムマブに対して高いＡＤＡ力価を有することを確認した。次いで、２１個の血清試料を、本質的にカニクイザルＡＤＡ評価について記載したような方法を使用して、例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ６への結合について評価した。

【0157】

図４の結果は、例示した抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ６が、試験した２１個の患者試料のうち１６個においてアダリムマブに対する抗薬物抗体への低い結合を有したか、結合しなかったことを示す（ＥＣＬＵシグナルは、アッセイのカットオフ点（１０２ＥＣＬＵ）未満であった）。免疫原性の決定において、カットオフ点は、「推定陽性」又は抗薬物抗体含有試料を識別するために使用される閾値である。図４に示されるように、２１個の試料のうち５個が、カットオフ点を超えるＥＣＬＵシグナルを有したが、全てがカットオフ点を２０％未満超えており、したがって、アッセイの変動性の範囲内であると決定された。アダリムマブで治療されたヒト患者におけるアダリムマブに対する抗薬物抗体への抗ヒトＴＮＦα抗体Ａｂ６の有意に低い結合、又は結合がないことは、Ａｂ６及びアダリムマブ抗体配列が十分に異なり、その結果、アダリムマブ中に存在するエピトープに特異的である、試験されたヒト対象によってアダリムマブに対して生成されたＡＤＡが、Ａｂ６によって共有されず、したがってＡｂ６によってあまり認識されないことを示した。

【0158】

これらの結果は、アダリムマブなどの他のＴＮＦα治療薬に対する抗薬物抗体に対する臨床応答又は有害反応の低下を発生する対象の治療のための、例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体又はコンジュゲートの潜在的な使用を示す。

【0159】

実施例６：免疫原性評価
実施例６ａ．ＭＨＣ関連ペプチドプロテオミクス（ＭＡＰＰ）アッセイ：ＭＡＰＰは、例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体で予め処理したヒト樹状細胞上のＭＨＣ－ＩＩ提示ペプチドをプロファイリングする。ＣＤ１４＋単球を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、培養し、標準的なプロトコルを使用して未成熟樹状細胞（ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦを含む）に分化させた。４日目に例示的な抗体を未成熟樹状細胞に添加し、細胞を成熟樹状細胞に形質転換するための、ＬＰＳを含有する新鮮な培地を５時間のインキュベーション後に交換した。翌日、成熟樹状細胞をプロテアーゼ阻害剤及びＤＮＡｓｅを含むＲＩＰＡ中で溶解した。ＭＨＣ－ＩＩ複合体の免疫沈降を、ストレプトアビジンビーズに結合したビオチン化抗ＭＨＣ－ＩＩ抗体を使用して行った。結合した複合体を溶出させ、濾過した。単離されたＭＨＣ－ＩＩペプチドを、質量分析計によって分析した。ペプチド識別は、データベースに付加された試験配列を含むウシ／ヒトデータベースに対する、酵素検索パラメータを伴わない検索アルゴリズムを使用して、内部プロテオミクスパイプラインによって生成した。例示的な抗体から識別されたペプチドを、親配列に対して整列させた。

【0160】

表１２の結果は、例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体が、ＭＡＰＰによる様々な程度の提示を有したことを示す。Ａｂ１は、試験した１０人のドナーのうち３人において、１つの非生殖系列クラスターを有する最も低いＭＡＰＰ提示を実証した。

【0161】

表１２．例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体のＭＡＰＰ分析

【表12】

【0162】

Ｔ細胞増殖アッセイ：例示的な抗ヒトＴＮＦα抗体ＭＡＰＰ由来ペプチドクラスターが細胞増殖を誘導することによってＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する能力を評価した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０人の健常ドナーからの凍結保存ＰＢＭＣから枯渇させ、１μＭのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester、ＣＦＳＥ）で標識した。ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣを、５％ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ２５９６１０１）を含むＡＩＭ－Ｖ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２０５５－０８３）に４×１０^６個の細胞／ｍＬ／ウェルで播種し、以下の異なる分子を含有する２．０ｍＬで、３連で試験した：ＤＭＳＯ対照、培地対照、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；陽性対照）、ＰＡＤＲＥ－Ｘペプチド（合成ワクチンヘルパーペプチド、陽性ペプチド対照）、又はそれぞれの抗ヒトＴＮＦα抗体ＭＡＰＰ由来ペプチドクラスター（各ペプチド１０μＭ）。細胞を培養し、５％ＣＯ_２と共に３７℃で７日間インキュベートした。７日目に、ハイスループットサンプラー（High Throughput Sampler、ＨＴＳ）を装備したＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）を使用したフローサイトメトリによる生存率検出のために、試料を以下の細胞表面マーカーで染色した：抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１９、及びＤＡＰＩ。ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ、ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用してデータを分析し、細胞分裂指数（Cellular Division Index、ＣＤＩ）を計算した。簡潔に述べると、各ＭＡＰＰ由来ペプチドクラスターについてのＣＤＩは、ペプチド刺激されたウェルからの増殖しているＣＦＳＥ^ｄｉｍＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を、刺激されていないウェルにおける増殖しているＣＦＳＥ^ｄｉｍＣＤ４＋Ｔ細胞の割合で割ることによって計算した。２．５以上のＣＤＩは、陽性応答を表すとみなした。全てのドナーにわたるドナー頻度の割合を評価した。

【0163】

表１３ａ及び１３ｂにおける結果は、Ａｂ２についてのＬＣＤＲ１（表１３ａ）及びＨＣＤＲ３（表１３ｂ）ペプチドが、それぞれ、約２２．０％及び２５％のドナーにおいてＴ細胞応答頻度を誘導したことを示し、陽性対照と比較した場合、Ａｂ２についての有意に低減された免疫原性リスクを示す。ＫＬＨ陽性対照は、ドナーの１００％においてＴ細胞応答を誘導し、ＰＡＤＲＥ－Ｘ（合成ワクチンヘルパーペプチド）陽性対照は、２つの研究においてそれぞれ、ドナーの６７％及び６２．５％においてＴ細胞応答を誘導した。これは、このアッセイの予想範囲内である（４８．１％＋２４．４の陽性ドナー頻度）。

【0164】

表１３ａ．健常ドナーにおけるＭＡＰＰ由来ペプチドによって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答の頻度。

【表13-1】

【0165】

表１３ｂ．健常ドナーにおけるＭＡＰＰ由来ペプチドによって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答の頻度。

【表13-2】

【0166】

実施例７．実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの生物物理学的特性
実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの生物物理学的特性を、開発性について評価した。

【0167】

実施例７ａ．粘度：実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの試料を、ｐＨ６の一般的な製剤緩衝液マトリックス中で約５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ及び１５０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ＶＲＯＣ（登録商標）ｉｎｉｔｉｕｍ（ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ）を使用して、１５℃で、９回の反復測定の平均を使用して、３つ全ての濃度におけるコンジュゲートの粘度を測定した。表１５の結果は、実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートが、５０ｍｇ／ｍＬ（２ｃＰ）、１００ｍｇ／ｍＬ（４．７ｃＰ）、及び１２５ｍｇ／ｍＬ（８．２ｃＰ）で良好な粘度プロファイルを有することを示した。１２５ｍｇ／ｍＬ（８．２ｃＰ）の例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの粘度は、１２５ｍｇ／ｍＬ（８．８ｃＰ）でのコンジュゲートされていない抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１の粘度と同様であり、リンカー－ペイロードを例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１表面上の４つの操作されたシステインにコンジュゲートすることが、粘度に悪影響を及ぼさなかったことを示した。

【0168】

実施例７ｂ．熱安定性：示差走査熱量測定（Differential Scanning Calorimetry、ＤＳＣ）を使用して、熱変性に対する実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの安定性を評価した。ＰＢＳ、ｐＨ７．２緩衝液、ｐＨ５の酢酸塩、及びｐＨ６のヒスチジン中の例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの溶融開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ）及び熱融解温度（ＴＭ１、ＴＭ２、及びＴＭ３）を、データ適合によって得、表１４に列記する。３つの緩衝液組成物のサーモグラムを図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃに示す。各ドメインの熱転移は、十分に分解され、表１４の結果は、実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートが良好な熱安定性を有することを示す。

【0169】

実施例７ｃ．温度ストレス時の凝集：例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの経時的な溶液安定性を、賦形剤を含む一般的な５ｍＭのヒスチジンｐＨ６．０緩衝液中のおよそ１００ｍｇ／ｍＬ及び５０ｍｇ／ｍＬで評価した。試料を５℃及び３５℃で２８週間の期間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィ（size exclusion chromatography、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）を使用して、高分子量（％ＨＭＷ）種のパーセンテージについて分析した。表１５の結果は、実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートが、５℃又は３５℃のいずれかで４週間にわたって許容可能な凝集プロファイルを有することを示す。

【0170】

実施例７ｄ．薬物動態：カニクイザルにおける実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ １ＧＣコンジュゲートのＰＫプロファイルは、許容可能な開発性プロファイルを有することが見出された。

【0171】

表１４．実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの熱安定性（℃）

【表14】

【0172】

表１５：実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートについての粘度及び高濃度温度保持安定性

【表15】

【0173】

実施例８．実施例１ｂ、実施例１ｃ、及び実施例１ｄの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲートのインビボ機能
実施例８ａ．ヒトＴＮＦα誘導性ＣＸＣＬ１サイトカインのインビボ阻害：
実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート及び抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１によるＴＮＦα誘導性ＣＸＣＬ１の中和をインビボで評価した。Ｃ５７／Ｂ６マウスへのヒトＴＮＦαの投与は、マウス血漿ＣＸＣＬ１レベルの急速かつ一過性の増加を誘導する。これにより、インビボでの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１及び抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートの中和能力の調査が可能となる。

【0174】

簡潔に述べると、Ｃ５７／Ｂ６マウス（Ｎ＝８／群）に、０．３ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート又は抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１、及び３ｍｇ／ｋｇの非結合アイソタイプ対照を皮下（subcutaneously、ＳＣ）投与した。投与の２４時間後、マウスを、３μｇ／マウスの用量での腹腔内注射を介してヒトＴＮＦαをチャレンジした。ヒトＴＮＦαチャレンジの２時間後、マウスを屠殺し、血液を収集し、遠心分離によって血漿に清澄化した。血漿を、市販のＭＳＤアッセイ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｐ／Ｎ．番号Ｋ１５２ＱＴＧ－１）を使用して、製造者の使用説明書に従って分析した。

【0175】

表１６の結果は、実施例１ｂの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１及び抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートが、アイソタイプ対照処置マウスと比較して（ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの多重比較検定）、ヒトＴＮＦα誘導性血漿ＣＸＣＬ１生成をインビボで、それぞれ、３ｍｇ／ｋｇで約８０．５及び８１．６％、０．３ｍｇ／ｋｇで約６９．４及び５８．９％、有意に阻害したことを示す。重要なことに、試験した用量では、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートと抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１との間に有意差はなかった。これは、例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１が、インビボでヒトＴＮＦαによって誘導される生物学的効果を中和し、ＧＣへのコンジュゲーションがこの機能に影響を及ぼさないことを示す。

【0176】

表１６：実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートによるヒトＴＮＦα誘導性ＣＸＣＬ１サイトカイン生成のインビボでの阻害

【表16】

通常の一元配置分散分析、Ｔｕｋｅｙ検定、多重比較

【0177】

実施例８ｂ．完全ヒト化マウスモデルのＩＶ型過敏症におけるインビボでの有効性：接触過敏症のヒト化マウスモデルを使用して、実施例１ｂ及び実施例１ｃの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート並びに抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１のインビボ活性を決定した。

【0178】

骨髄系列発生を支持するためにヒトＧＭ－ＣＳＦ及びヒトＩＬ－３を発現する免疫不全ＮＯＧマウス（ｈｕＮＯＧ－ＥＸＬ、Ｔａｃｏｎｉｃ）に、ヒト臍帯血から単離されたヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を６週齢で移植した。幹細胞投与の２０～２４週間後、マウスを十分なヒトＣＤ４５生着（血液中＞２５％）について評価し、オキサゾロン誘導性接触過敏症プロトコルに供した。０日目に、体重によってグループ分けされたマウスに、実施例１ｂの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート（ｎ＝７）、実施例１ｃのＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲート（ｎ＝７）、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１（ｎ＝７）、米国特許出願公開第２０２０／３３８２０８号からの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲート（ｎ＝７）、又は対照ヒトＩｇＧ１抗体（ｎ＝７）のいずれかを１ｍｇ／ｋｇで皮下（ＳＣ）投与した。１日目に、マウスを５％のイソフルランで麻酔し、それらの腹部を剃毛し、エタノール中の３％のオキサゾロン１００μＬを剃毛領域に塗布した。７日目にマウスに１ｍｇ／ｋｇ ＳＣで再び投与し、麻酔し、次いで投与の２４時間後にエタノール中２％オキサゾロンを両耳（１０μＬ／側／耳）にチャレンジした。用量チャレンジパラダイムを毎週繰り返し、試験薬剤の用量を、チャレンジ２については３ｍｇ／ｋｇに、チャレンジ３については１０ｍｇ／ｋｇに増加させた。炎症応答を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ電子キャリパーを使用して、各チャレンジの前及び２４時間後の耳の厚さの差によって決定した。群間のＰ値を、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの事後検定によって計算し、＜０．０５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）であれば有意とみなした。

【0179】

表１７及び図６Ａ～図６Ｃの結果は、実施例１ｂ及び実施例１ｃの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートが、１０ｍｇ／ｋｇのチャレンジ３の用量でのみ耳腫脹を減弱させた抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１、及び米国特許出願公開第２０２０／３３８２０８号からの例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂ ＧＣコンジュゲートの両方と比較して、３つ全てのチャレンジ（１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇ）でハプテン誘導性接触過敏症反応からのインビボでの炎症応答の優れた低減を誘発したことを示す。更に、結果は、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１の、３つ又は４つのＧＣ分子（ＤＡＲ）へのコンジュゲーションが同様の有効性を誘発したことを示す。これらの結果は、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートがグルココルチコイドを炎症組織に効果的に送達し、ヒト化マウスモデルにおけるＩＶ型過敏性反応に関連する生物学的効果を有意に抑止したことを示し、この抗炎症応答がヒト対象において誘発され得ることを示している。

【0180】

表１７：ＩＶ型過敏症ヒト化マウスモデルにおける実施例１ｂ及び実施例１ｃの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ１ ＧＣコンジュゲートのインビボでの有効性

【表17】

^＊ｐ＜０．０５対アイソタイプ；ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ；＾ｐ＜０．０５対Ａｂ１；ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ

【0181】

実施例８ｃ．ヒトＴＮＦαトランスジェニックマウス多発性関節炎モデルにおけるインビボでの有効性：ヒトＴＮＦαトランスジェニックマウス多発性関節炎モデル（Ｔａｃｏｎｉｃ、＃１００６）を使用して、アダリムマブナイーブマウスにおける一次処置として、及びアダリムマブに対する抗薬物抗体を生成しており、アダリムマブに対する減少又は喪失又は応答を有するアダリムマブ処置マウス、すなわちアダリムマブ不応性マウスにおける二次処置として、実施例１ｄの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲート及び抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２の有効性を評価した。このマウスモデルは、ＣＭＶプロモータを介してヒトＴＮＦαを構成的に発現し、これは、主に前足及び後足に現れる進行性関節炎症をもたらす。アダリムマブによる治療は、疾患の進行を数週間弱めるが、しかしながら、有益な効果は、中和抗薬物抗体の発生に起因した。アダリムマブが抗体のヒトＦｃ部分に対する抗薬物抗体を生成し、したがって実施例１ｄの抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲート及び抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２の活性に影響を及ぼす可能性を排除するために、抗体定常ドメインがマウスＩｇＧ２ａ抗体の定常ドメインで置き換えられたキメラ種として全ての分子を生成した。

【0182】

１３週齢で、全てのマウスが１つ以上の足において中程度の炎症を示したら（スコア４～９）、マウスを、８匹／群の６つの臨床スコア適合群に分けた。各群のマウスに、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、ヒト／マウスキメラ抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２（本明細書において「ｈ／ｍＡｂ２」と称される）、ヒト／マウスキメラ抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲート（本明細書において「ｈ／ｍＡｂ２－ＧＣ」と称される）、ヒト／マウスキメラアダリムマブ（本明細書において「ｈ／ｍ－アダリムマブ」と称される）、試験期間の間にｈ／ｍ－アダリムマブを２回の用量、その後ヒト／マウスキメラアダリムマブＧＣコンジュゲート（本明細書において「ｈ／ｍ－アダリムマブ－ＧＣ」と称され、操作されたシステインを用いて調製し、本質的に実施例１ｂ）に記載されるように、ＧＣ－Ｌにコンジュゲートした）への切り替え、及び試験期間の間にｈ／ｍ－アダリムマブを２回の用量、その後ｈ／ｍＡｂ２－ＧＣへの切り替えのいずれかを９週間にわたって３ｍｇ／ｋｇで週１回、皮下（ＳＣ）投与した。各肢の臨床スコアのパラメータは、以下のとおりであった：０＝歪みの証拠なし、１＝軽度の歪み、２＝中程度の歪み、３＝重度の歪み／軽度の膨潤、４＝重度の歪み／重度の腫脹／機能喪失。マウスを週２回採点し、定期的に体重を測定した。１０日目に血液を採取して、抗体曝露レベルを定量化し、抗薬物抗体発生の程度を決定した。実験の終了時に、マウスをイソフルランで麻酔し、血液及び組織を採取した。

【0183】

図７の結果は、ｈ／ｍＡｂ２－ＧＣ及びｈ／ｍＡｂ２が、他の全ての処置と比較した臨床スコアによって測定されるように、処置の開始時に疾患の進行を完全に停止させ、９週間の処置の期間にわたって持続したことを示す。重要なことに、これは、ｈ／ｍＡｂ２－ＧＣ及びｈ／ｍＡｂ２が、有意な抗薬物抗体応答を生成せず、その結果、それがコンジュゲート又は抗体の有効性を中和及び／又は低下させたことを示した。結果はまた、ｈ／ｍ－アダリムマブが疾患の進行を約２週間遅延させることができたことを示したが、しかしながら、有効性は、９週間の治療の約２週目までにｈ／ｍ－アダリムマブに対する抗薬物抗体の出現と同時に失われた。しかしながら、重要なことに、ｈ／ｍ－アダリムマブで２週間処置し、次いでｈ／ｍＡｂ２－ＧＣでの処置に切り替えたマウスは、疾患進行の有意な抑止を維持したが、ｈ／ｍ－アダリムマブで２週間処置し、次いでｈ／ｍ－アダリムマブ－ＧＣでの処置に切り替えたマウスは、ｈ／ｍ－アダリムマブ処置単独群を反映した炎症応答を示した。これらの結果は、抗ヒトＴＮＦα Ａｂ２ ＧＣコンジュゲートが、アダリムマブに対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、交差反応性を有しないことを示す。これらの結果は、アダリムマブなどの他の抗ＴＮＦα治療薬に対する抗薬物抗体を生成し、その治療に対する応答が低下した対象の治療における、例示的な抗ヒトＴＮＦα Ａｂコンジュゲートの潜在的な使用を示す。

【0184】

配列表
Ａｂ１
配列番号１ Ａｂ１、Ａｂ２、及びＡｂ６に対するＨＣＤＲ１
ＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨ
配列番号２ Ａｂ１、Ａｂ２、及びＡｂ６に対するＨＣＤＲ２
ＷＩＮＰＹＴＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号３ Ａｂ１に対するＨＣＤＲ３
ＤＬＹＧＳＳＮＹＧＧＤＶ
配列番号４ Ａｂ１及びＡｂ３に対するＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮ
配列番号５ Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、及びＡｂ６に対するＬＣＤＲ２
ＤＡＳＮＬＥＴ
配列番号６ Ａｂ１、Ａｂ３、及びＡｂ５に対するＬＣＤＲ３
ＱＱＹＤＫＬＰＬＴ
配列番号７ Ａｂ１に対するＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＹＧＳＳＮＹＧＧＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号８ Ａｂ１及びＡｂ３に対するＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＫＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号９ Ａｂ１に対するＨＣ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＹＧＳＳＮＹＧＧＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＣＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＣＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１０ Ａｂ１及びＡｂ３に対するＬＣ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＫＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１１ Ａｂ１に対するＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＣＧＧＴＧＧＣＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＧＴＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡ
配列番号１２ Ａｂ１及びＡｂ３に対するＬＣ ＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＡＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ

【0185】

Ａｂ２
配列番号１ Ａｂ１、Ａｂ２、及びＡｂ６に対するＨＣＤＲ１
ＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨ
配列番号２ Ａｂ１、Ａｂ２、及びＡｂ６に対するＨＣＤＲ２
ＷＩＮＰＹＴＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号１３ Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣＤＲ３
ＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶ
配列番号１４ Ａｂ２、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＧＩＲＮＹＬＮ
配列番号５ Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、及びＡｂ６に対するＬＣＤＲ２
ＤＡＳＮＬＥＴ
配列番号１５ Ａｂ２及びＡｂ４に対するＬＣＤＲ３
ＱＱＹＤＮＬＰＬＴ
配列番号１６ Ａｂ２に対するＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１７ Ａｂ２及びＡｂ４に対するＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＧＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１８ Ａｂ２に対するＨＣ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＣＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＣＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１９ Ａｂ２及びＡｂ４に対するＬＣ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＧＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２０ Ａｂ２に対するＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡ
配列番号２１ Ａｂ２及びＡｂ４に対するＬＣ ＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＣＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ

【0186】

Ａｂ３
配列番号２２ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣＤＲ１
ＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨ
配列番号２３ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣＤＲ２
ＷＩＮＰＹＴＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号１３ Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣＤＲ３
ＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶ
配列番号４ Ａｂ１及びＡｂ３に対するＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮ
配列番号５ Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、及びＡｂ６に対するＬＣＤＲ２
ＤＡＳＮＬＥＴ
配列番号６ Ａｂ１、Ａｂ３、及びＡｂ５に対するＬＣＤＲ３
ＱＱＹＤＫＬＰＬＴ
配列番号２４ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号８ Ａｂ１及びＡｂ３に対するＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＫＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号２５ Ａｂ３、Ａｂ４及びＡｂ５に対するＨＣ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＣＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＣＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１０ Ａｂ１及びＡｂ３に対するＬＣ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＫＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２６ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡ
配列番号１２ Ａｂ１及びＡｂ３に対するＬＣ ＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＡＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ

【0187】

Ａｂ４
配列番号２２ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣＤＲ１
ＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨ
配列番号２３ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣＤＲ２
ＷＩＮＰＹＴＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号１３ Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣＤＲ３
ＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶ
配列番号１４ Ａｂ２、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＧＩＲＮＹＬＮ
配列番号５ Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、及びＡｂ６に対するＬＣＤＲ２
ＤＡＳＮＬＥＴ
配列番号１５ Ａｂ２及びＡｂ４に対するＬＣＤＲ３
ＱＱＹＤＮＬＰＬＴ
配列番号２４ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１７ Ａｂ２及びＡｂ４に対するＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＧＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号２５ Ａｂ３、Ａｂ４及びＡｂ５に対するＨＣ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＣＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＣＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１９ Ａｂ２及びＡｂ４に対するＬＣ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＧＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２６ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡ
配列番号２１ Ａｂ２及びＡｂ４に対するＬＣ ＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＣＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ

【0188】

Ａｂ５
配列番号２２ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣＤＲ１
ＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨ
配列番号２３ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣＤＲ２
ＷＩＮＰＹＴＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号１３ Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣＤＲ３
ＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶ
配列番号１４ Ａｂ２、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＧＩＲＮＹＬＮ
配列番号５ Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、及びＡｂ６に対するＬＣＤＲ２
ＤＡＳＮＬＥＴ
配列番号６ Ａｂ１、Ａｂ３、及びＡｂ５に対するＬＣＤＲ３
ＱＱＹＤＫＬＰＬＴ
配列番号２４ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号２７ Ａｂ５に対するＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＧＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＫＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号２５ Ａｂ３、Ａｂ４及びＡｂ５に対するＨＣ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＹＧＳＳＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＣＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＣＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２８ Ａｂ５に対するＬＣ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＧＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＫＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２６ Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５に対するＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡ
配列番号２９ Ａｂ５に対するＬＣ ＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＣＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＡＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ

【0189】

Ａｂ６
配列番号１ Ａｂ１、Ａｂ２、及びＡｂ６に対するＨＣＤＲ１
ＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨ
配列番号２ Ａｂ１、Ａｂ２、及びＡｂ６に対するＨＣＤＲ２
ＷＩＮＰＹＴＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号３０ Ａｂ６に対するＨＣＤＲ３
ＤＩＹＧＳＳＮＹＧＧＤＶ
配列番号３１ Ａｂ６に対するＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ
配列番号５ Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、及びＡｂ６に対するＬＣＤＲ２
ＤＡＳＮＬＥＴ
配列番号３２ Ａｂ６に対するＬＣＤＲ３
ＱＱＹＤＴＬＰＬＴ
配列番号３３ Ａｂ６に対するＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＩＹＧＳＳＮＹＧＧＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号３４ Ａｂ６に対するＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＴＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３５ Ａｂ６に対するＨＣ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＹＴＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＩＹＧＳＳＮＹＧＧＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３６ Ａｂ６に対するＬＣ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＴＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号３７ Ａｂ６に対するＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＡＴＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＣＧＧＴＧＧＣＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡ
配列番号３８ Ａｂ６に対するＬＣ ＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＣＣＣＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
配列番号３９ ヒトＴＮＦαタンパク質
ＭＳＴＥＳＭＩＲＤＶＥＬＡＥＥＡＬＰＫＫＴＧＧＰＱＧＳＲＲＣＬＦＬＳＬＦＳＦＬＩＶＡＧＡＴＴＬＦＣＬＬＨＦＧＶＩＧＰＱＲＥＥＦＰＲＤＬＳＬＩＳＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号４０ アカゲザルＴＮＦαタンパク質
ＭＳＴＥＳＭＩＲＤＶＥＬＡＥＥＡＬＰＲＫＴＡＧＰＱＧＳＲＲＣＷＦＬＳＬＦＳＦＬＬＶＡＧＡＴＴＬＦＣＬＬＨＦＧＶＩＧＰＱＲＥＥＦＰＫＤＰＳＬＩＳＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＴＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＮＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＬＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号４１ イヌＴＮＦαタンパク質
ＭＳＴＥＳＭＩＲＤＶＥＬＡＥＥＰＬＰＫＫＡＧＧＰＰＧＳＲＲＣＦＣＬＳＬＦＳＦＬＬＶＡＧＡＴＴＬＦＣＬＬＨＦＧＶＩＧＰＱＲＥＥＬＰＮＧＬＱＬＩＳＰＬＡＱＴＶＫＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＥＡＥＧＱＬＱＷＬＳＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＴＤＮＱＬＩＶＰＳＤＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＦＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＴＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＬＰＮＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号４２ カニクイザルＴＮＦαタンパク質
ＭＳＴＥＳＭＩＱＤＶＥＬＡＥＥＡＬＰＲＫＴＡＧＰＱＧＳＲＲＣＷＦＬＳＬＦＳＦＬＬＶＡＧＡＡＴＬＦＣＬＬＨＦＧＶＩＧＰＱＲＥＥＦＰＫＤＰＳＬＩＳＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＶＡＮＧＶＥＬＴＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＮＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＬＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ
配列番号４３ ＬＣＤＲ１コンセンサス配列
ＱＡＳＱＧＩＸａａ_７ＮＹＬＮ
式中、Ｘａａ_７は、セリン又はアルギニンである
配列番号４４ ＬＣＤＲ３コンセンサス配列
ＱＱＹＤＸａａ_５ＬＰＬＴ
式中、Ｘａａ５は、アスパラギン又はリジンである
配列番号４５ ヒトＴＮＦＲ１
ＭＧＬＳＴＶＰＤＬＬＬＰＬＶＬＬＥＬＬＶＧＩＹＰＳＧＶＩＧＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣＴＣＨＡＧＦＦＬＲＥＮＥＣＶＳＣＳＮＣＫＫＳＬＥＣＴＫＬＣＬＰＱＩＥＮＶＫＧＴＥＤＳＧＴＴＶＬＬＰＬＶＩＦＦＧＬＣＬＬＳＬＬＦＩＧＬＭＹＲＹＱＲＷＫＳＫＬＹＳＩＶＣＧＫＳＴＰＥＫＥＧＥＬＥＧＴＴＴＫＰＬＡＰＮＰＳＦＳＰＴＰＧＦＴＰＴＬＧＦＳＰＶＰＳＳＴＦＴＳＳＳＴＹＴＰＧＤＣＰＮＦＡＡＰＲＲＥＶＡＰＰＹＱＧＡＤＰＩＬＡＴＡＬＡＳＤＰＩＰＮＰＬＱＫＷＥＤＳＡＨＫＰＱＳＬＤＴＤＤＰＡＴＬＹＡＶＶＥＮＶＰＰＬＲＷＫＥＦＶＲＲＬＧＬＳＤＨＥＩＤＲＬＥＬＱＮＧＲＣＬＲＥＡＱＹＳＭＬＡＴＷＲＲＲＴＰＲＲＥＡＴＬＥＬＬＧＲＶＬＲＤＭＤＬＬＧＣＬＥＤＩＥＥＡＬＣＧＰＡＡＬＰＰＡＰＳＬＬＲ
配列番号４６ ヒトＴＮＦＲ２
ＭＡＰＶＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＥＬＷＡＡＡＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＦＡＬＰＶＧＬＩＶＧＶＴＡＬＧＬＬＩＩＧＶＶＮＣＶＩＭＴＱＶＫＫＫＰＬＣＬＱＲＥＡＫＶＰＨＬＰＡＤＫＡＲＧＴＱＧＰＥＱＱＨＬＬＩＴＡＰＳＳＳＳＳＳＬＥＳＳＡＳＡＬＤＲＲＡＰＴＲＮＱＰＱＡＰＧＶＥＡＳＧＡＧＥＡＲＡＳＴＧＳＳＤＳＳＰＧＧＨＧＴＱＶＮＶＴＣＩＶＮＶＣＳＳＳＤＨＳＳＱＣＳＳＱＡＳＳＴＭＧＤＴＤＳＳＰＳＥＳＰＫＤＥＱＶＰＦＳＫＥＥＣＡＦＲＳＱＬＥＴＰＥＴＬＬＧＳＴＥＥＫＰＬＰＬＧＶＰＤＡＧＭＫＰＳ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【配列表】

2024529493000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-01-29

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式：

【化1】

で示されるコンジュゲートであって、式中、
Ａｂが、ヒトＴＮＦαに結合する抗体であって、Ａｂが、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１又は２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２又は２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３、１３、又は３０を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４、１４、３１、又は４３を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６、１５、３２、又は４４を含み、

【化2】

であり、
ｎが、１～５である、コンジュゲート。

【請求項2】

【化3】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項3】

【化4】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項4】

【化5】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項5】

【化6】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項6】

【化7】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項7】

【化8】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項8】

【化9】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項9】

【化10】

である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項10】

前記ヒトＴＮＦαに結合する抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項11】

前記ＶＨが、配列番号７を含み、前記ＶＬが、配列番号８を含む、請求項１０に記載のコンジュゲート。

【請求項12】

前記抗体が、重鎖（ＨＣ）と、軽鎖（ＬＣ）とを含み、前記ＨＣが、配列番号９を含み、前記ＬＣが、配列番号１０を含む、請求項１０に記載のコンジュゲート。

【請求項13】

前記ヒトＴＮＦαに結合する抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１５を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項14】

前記ＶＨが、配列番号１６を含み、前記ＶＬが、配列番号１７を含む、請求項１３に記載のコンジュゲート。

【請求項15】

前記抗体が、重鎖（ＨＣ）と、軽鎖（ＬＣ）とを含み、前記ＨＣが、配列番号１８を含み、前記ＬＣが、配列番号１９を含む、請求項１３に記載のコンジュゲート。

【請求項16】

前記ヒトＴＮＦαに結合する抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項17】

ヒトＴＮＦαに結合する前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１５を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項18】

ヒトＴＮＦαに結合する前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項19】

前記ヒトＴＮＦαに結合する抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４３を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項20】

ヒトＴＮＦαに結合する前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２２を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２３を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号４４を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項21】

前記ＶＨが、配列番号２４を含み、前記ＶＬが、配列番号８、１７、又は２７を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項22】

前記抗体が、重鎖（ＨＣ）と、軽鎖（ＬＣ）とを含み、前記ＨＣが、配列番号２５を含み、前記ＬＣが、配列番号１０、１９、又は２８を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項23】

ヒトＴＮＦαに結合する前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３０を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号３１を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号３２を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項24】

前記ＶＨが、配列番号３３を含み、前記ＶＬが、配列番号３４を含む、請求項２３に記載のコンジュゲート。

【請求項25】

前記抗体が、重鎖（ＨＣ）と、軽鎖（ＬＣ）とを含み、前記ＨＣが、配列番号３５を含み、前記ＬＣが、配列番号３６を含む、請求項２３に記載のコンジュゲート。

【請求項26】

前記抗体が、重鎖と、軽鎖とを含み、前記重鎖が、
アミノ酸残基１２４（ＥＵ番号付け）におけるシステイン、
アミノ酸残基３７８（ＥＵ番号付け）におけるシステイン、又は
アミノ酸残基１２４（ＥＵ番号付け）におけるシステイン及びアミノ酸残基３７８（ＥＵ番号付け）におけるシステインを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項27】

前記抗体が、重鎖（ＨＣ）と、軽鎖（ＬＣ）とを含み、前記ＨＣが、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項28】

ｎが、２～５である、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項29】

ｎが、３～５である、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項30】

ｎが、３～４である、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項31】

ｎが、約４である、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項32】

ｎが、約３である、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項33】

ｎが、約２である、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項34】

請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項35】

請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、治療を必要とする対象における自己免疫性疾患又は炎症性疾患を治療するための医薬組成物。

【請求項36】

前記自己免疫性疾患又は前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、尋常性乾癬（ＰＳ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）、ブドウ膜炎、非感染性の中間部、後部、汎ブドウ膜炎、ベーチェット病、又はリウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）から選択される、請求項３５に記載の医薬組成物。

【請求項37】

前記対象が、他の抗ＴＮＦα治療薬の前治療を受けており、前記対象が、前記他の抗ＴＮＦα治療薬に対する抗薬物抗体を生成している、請求項３５に記載の医薬組成物。

【請求項38】

前記他の抗ＴＮＦα治療薬が、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、及びエタネルセプト、又はこれらのコンジュゲートから選択される、請求項３７に記載の医薬組成物。

【請求項39】

前記コンジュゲートが、アダリムマブに対する抗薬物抗体に対して低い交差反応性を有するか、または交差反応性を有しない、請求項３８に記載の医薬組成物。

【請求項40】

療法における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物であって、前記コンジュゲートが、療法を必要とする対象に投与されるように用いられることを特徴とする、医薬組成物。

【請求項41】

自己免疫性疾患又は炎症性疾患の治療における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物であって、前記コンジュゲートが、治療を必要とする対象に投与されるように用いられることを特徴とする、医薬組成物。

【請求項42】

前記自己免疫性疾患又は前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性結腸炎、尋常性乾癬（ＰＳ）、化膿性汗腺炎、ブドウ膜炎、非感染性の中間部、後部、汎ブドウ膜炎、ベーチェット病、又はリウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）から選択される、請求項４１に記載の医薬組成物。

【請求項43】

自己免疫性疾患又は炎症性疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。

【請求項44】

前記自己免疫性疾患又は前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性結腸炎、尋常性乾癬（ＰＳ）、化膿性汗腺炎、ブドウ膜炎、非感染性の中間部、後部、汎ブドウ膜炎、ベーチェット病、又はリウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）から選択される、請求項４３に記載の使用。

【請求項45】

前記抗体が、ヒトＴＮＦαを中和する、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項46】

前記抗体が、内在化抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項47】

式：

【化11】

で示される化合物。

【請求項48】

【化12】

で示される、請求項４７に記載の化合物。

【請求項49】

【化13】

で示される、請求項４７に記載の化合物。

【請求項50】

【化14】

で示される、請求項４８に記載の化合物。

【請求項51】

【化15】

で示される、請求項４９に記載の化合物。

【請求項52】

コンジュゲートを生成する方法であって、前記方法が、請求項４７に記載の化合物を抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させることを含む、方法。

【請求項53】

前記コンジュゲートが、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記コンジュゲートが、
（ａ）抗ヒトＴＮＦα抗体を還元剤で還元する工程であって、前記抗ヒトＴＮＦα抗体が、１つ以上の操作されたシステイン残基を含む、工程と、
（ｂ）前記抗ヒトＴＮＦα抗体を酸化試薬で酸化させる工程と、
（ｃ）式：

【化16】

で示される化合物を、前記抗ヒトＴＮＦα抗体と接触させて、前記コンジュゲートを生成する工程とを含む、工程に従って生成される、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記還元剤が、ジチオスレイトールであり、前記酸化剤が、デヒドロアスコルビン酸である、請求項５４に記載の方法。

【国際調査報告】