特表 2024-529494 抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質ならびにその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-06

(54)【発明の名称】抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質ならびにその応用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240730BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240730BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240730BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20240730BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240730BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20240730BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20240730BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

C07K19/00

C07K14/54

C07K14/52

C12N15/13

C12N15/24

C12N15/62 Z

A61K39/395 N

A61K39/395 D

A61K38/17 100

A61P35/00

A61P31/00

A61P37/02

A61K38/20

C12P21/08

C12P21/02 C

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024505401

(86)(22)【出願日】2022-07-29

(85)【翻訳文提出日】2024-03-29

(86)【国際出願番号】 CN2022109039

(87)【国際公開番号】W WO2023006082

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】202110868857.5

(32)【優先日】2021-07-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521501093

【氏名又は名称】クレ バイオテクノロジ （シャンハイ） カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000578

【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】チー シャンドン

(72)【発明者】

【氏名】パン チン

【テーマコード（参考）】

4B064

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA02

4C084BA22

4C084BA41

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA12

4C084DA39

4C084DA46

4C084NA14

4C084ZB07

4C084ZB26

4C084ZB31

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085BB41

4C085BB42

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045DA02

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

ＣＤ１６Ａに特異的に結合するＣＤ１６Ａ結合領域、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合するＴＡＡ結合領域、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとの結合によって形成されるＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体、ならびにＦｃドメインを含む、抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質が開示される。設計された腫瘍標的化自然免疫細胞活性化分子は、抗ＴＡＡ、抗ＣＤ１６ＡおよびサイトカインＩＬ１５の三機能性融合タンパク質であり、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａとに同時に結合することにより、ＮＫ細胞を腫瘍に標的とし、ＮＫ細胞は、パーフォリンおよびグランザイムを放出し、アポトーシスを引き起こし、腫瘍細胞死を引き起こす。サイトカインＩＬ１５は、ＮＫ細胞の機能を拡張および維持し、免疫細胞の増殖を刺激し、腫瘍の免疫微小環境を変化させる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質であって、
前記抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含み、前記三機能性融合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに特異的に結合するＣＤ１６Ａ結合領域、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合するＴＡＡ結合領域、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとの結合によって形成されるＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体、ならびにＦｃドメインを含むことを特徴とする、前記抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項2】

前記ＣＤ１６Ａ結合領域は、抗ＣＤ１６Ａ抗体またはその抗原結合断片を含み、好ましくは、前記ＣＤ１６Ａ結合領域は、ＣＤ１６Ａを標的とするＦａｂ断片またはＦｖ断片であることを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項3】

前記ＴＡＡ結合領域は、抗ＴＡＡ抗体またはその抗原結合断片を含み、好ましくは、前記ＴＡＡ結合領域は、ＴＡＡを標的とするＦａｂ断片またはＦｖ断片であることを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項4】

前記融合タンパク質は、連結断片をさらに含み、前記連結断片のアミノ酸配列は、若干のＧＳリピート配列であることが好ましいことを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項5】

前記融合タンパク質は、若干のペプチド鎖を含み、前記ＩＬ－１５および前記ＩＬ－１５Ｒαは、それぞれ異なるペプチド鎖上に位置することを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項6】

前記融合タンパク質は、第１の単量体および第２の単量体を含み、
前記第１の単量体は、前記ＴＡＡ結合領域および第１のＦｃ鎖を含み、前記第２の単量体は、前記ＣＤ１６Ａ結合領域、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体および第２のＦｃ鎖を含み、
前記第１のＦｃ鎖および前記第２のＦｃ鎖は、重合して前記Ｆｃドメインを形成することを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項7】

前記ＴＡＡ結合領域は、ＴＡＡを標的とするＦａｂ断片であり、前記ＣＤ１６Ａ結合領域は、ＣＤ１６Ａを標的とするＦｖ断片であることを特徴とする
請求項６に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項8】

前記融合タンパク質は、第１の単量体および第２の単量体を含み、
前記第１の単量体は、前記ＣＤ１６Ａ結合領域および第１のＦｃ鎖を含み、前記第２の単量体は、前記ＴＡＡ結合領域、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体および第２のＦｃ鎖を含み、
前記第１のＦｃ鎖および前記第２のＦｃ鎖は、重合して前記Ｆｃドメインを形成することを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項9】

前記ＣＤ１６Ａ結合領域は、ＣＤ１６Ａを標的とするＦａｂ断片であり、前記ＴＡＡ結合領域は、ＴＡＡを標的とするＦｖ断片であることを特徴とする
請求項８に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項10】

前記第１の単量体は、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖を含み、前記第２の単量体は、第３のペプチド鎖および第４のペプチド鎖を含み、
前記第１のペプチド鎖は、ＶＬドメインとＣＬドメインとの融合によって形成される軽鎖を含み、
前記第２のペプチド鎖は、ＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと第１のＦｃ鎖との融合によって形成される重鎖を含み、
前記第３のペプチド鎖は、抗体可変領域、サイトカインおよび第２のＦｃ鎖を含み、
前記第４のペプチド鎖は、抗体可変領域およびサイトカインを含み、
前記第１のペプチド鎖のＶＬドメイン、ＣＬドメイン、および前記第２のペプチド鎖のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメインは、対になってＦａｂ断片を形成し、
前記第３のペプチド鎖の抗体可変領域および前記第４のペプチド鎖の抗体可変領域は、対になってＦｖ断片を形成し、
前記第３のペプチド鎖のサイトカインと前記第４のペプチド鎖のサイトカインが結合して、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体を形成し、
ここで、
前記Ｆａｂ断片は、ＴＡＡを標的とし、前記Ｆｖ断片は、ＣＤ１６Ａを標的とするか、または、前記Ｆａｂ断片は、ＣＤ１６Ａを標的とし、前記Ｆｖ断片は、ＴＡＡを標的とすることを特徴とする
請求項６または８に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項11】

対になって前記Ｆｖ断片を形成する抗体可変領域は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインから選択され、前記サイトカインは、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαから選択されることを特徴とする
請求項１０に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項12】

対になって前記Ｆｖ断片を形成するＶＨドメインとＶＬドメインとの間には、１対または複数対のジスルフィド結合があり、次の突然変異の組み合わせの形態のいずれかの１種以上を含み、ＥＵに従ってカウントされることを特徴とする
請求項１１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【表1】

【請求項13】

ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記第３のペプチド鎖の融合順序は、抗体可変領域～サイトカイン～第２のＦｃ鎖であるか、またはサイトカイン～抗体可変領域～第２のＦｃ鎖であり、
ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記第４のペプチド鎖の融合順序は、抗体可変領域～サイトカインであるか、またはサイトカイン～抗体可変領域であり、「～」は、連結断片を表わすことを特徴とする
請求項１０に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項14】

前記ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５、ならびにそのＩＬ－１５Ｒａに結合できる突然変異、切断および様々な誘導体を含み、前記ＩＬ－１５Ｒａは、ＩＬ－１５Ｒａ、ならびにそのＩＬ－１５に結合できる突然変異、切断および様々な誘導体を含み、好ましくは、前記ＩＬ－１５は、次の突然変異の組み合わせのいずれかを含むがこれらに限定されず、計数方法は、ＩＬ－１５のアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいて第１位としてカウントされ、

【表2】

または、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体は、次の突然変異の組み合わせのいずれかを含むがこれらに限定されず、計数方法は、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒａのアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいて第１位としてカウントされることを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【表3】

【請求項15】

前記ＴＡＡは、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ｓｌａｍｆ７、ＧＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ１３３、ＣＤ２１７、ＣＤ２３９、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、Ｔｒｏｐ２、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ｆｏｌｒ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、Ｃ－ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＥｐｈＡ２、ＡＤＡＭ１７、１７－Ａ１、ＮＫＧ２Ｄリガンド（ｌｉｇａｎｄｓ）、ＭＣＳＰ、ＬＧＲ５、ＳＳＥＡ３、ＳＬＣ３４Ａ２、ＢＣＭＡ、ＧＰＮＭＢ、ＣＣＲ４、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ６、インテグリンα４、ＰＤＧＦＲα、ＮｅｕＧｃＧＭ３、インテグリンαＶβ３、ＣＤ５１、ＣＴＡＡ１６．８８、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＳＰＧ４、ＳＳ１またはＩＧＦＲ１から選択されることを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項16】

前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、好ましくは、ＩｇＧ１ Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃヘテロ二量体の形態であり、好ましくは、前記Ｆｃヘテロ二量体は、次の突然変異の組み合わせを含むがこれらに限定されず、次の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされることを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【表4】

【請求項17】

前記Ｆｃドメインは、免疫エフェクター機能を除去するように選択され、好ましくは、次の突然変異形態のいずれかを含み、次の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされることを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【表5】

【請求項18】

前記第１のＦｃ鎖は、プロテインＡに結合せず、好ましくは突然変異Ｈ４３５ＲまたはＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆを含み、ＥＵに従ってカウントされ、前記第２のＦｃ鎖は、プロテインＡに結合することができることを特徴とする
請求項１０に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項19】

前記ＣＤ１６Ａ結合領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるようなＶＨドメインおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるようなＶＬドメインを含むか、または、前記ＩＬ－１５の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６または４７に示されたとおりであるか、または、前記ＩＬ－１５Ｒａの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８～５４のいずれかに示されたとおりであり、好ましくは、前記ＣＤ１６Ａ結合領域のＶＨとＶＬとの間、および／または前記ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒａとの間には、少なくとも１対以上のジスルフィド結合があることを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項20】

（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０２、０３、０４；
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０５、０３、０６；
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、０８、０９、１０；
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０２、１１、１２；
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０２、１３、１４；
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０５、１１、１５；
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０５、１３、１６の任意のセットの配列に示されるか、またはそれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸断片と融合することによって得られることを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項21】

前記抗原は、感染性疾患関連抗原、病原体、免疫機能関連抗原をさらに含むことを特徴とする
請求項１に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質。

【請求項22】

核酸分子であって、
請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質をコードすることを特徴とする、前記核酸分子。

【請求項23】

医薬組成物であって、
請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質、ならびに薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。

【請求項24】

癌、感染および免疫調節性疾患を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質の応用。

【請求項25】

前記癌は、前立腺がん、肺がん、結腸がん、直腸がん、膀胱がん、黒色腫、腎臓がん、口腔がん、咽頭がん、膵臓がん、子宮がん、甲状腺がん、皮膚がん、頭頚部がん、子宮頸がん、卵巣がんまたは血液系がんを含むことを特徴とする
請求項２４に記載の応用。

【請求項26】

タンパク質の複合ユニットであって、
前記複合ユニットは、請求項１０に記載の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質における第３のペプチド鎖の抗体可変領域およびサイトカイン、第４のペプチド鎖の抗体可変領域およびサイトカイン、ならびに若干の連結断片を含み、
前記第３のペプチド鎖の抗体可変領域は、連結断片を介して、前記第３のペプチド鎖のサイトカインに融合され、前記第４のペプチド鎖の抗体可変領域は、連結断片を介して、前記第４のペプチド鎖のサイトカインに融合され、
前記第３のペプチド鎖の抗体可変領域および前記第４のペプチド鎖の抗体可変領域は、ＣＤ１６Ａを標的とするＶＨドメインまたはＶＬドメインから選択され、対になってＦｖ断片を形成し、
前記第３のペプチド鎖のサイトカインおよび前記第４のペプチド鎖のサイトカインは、ＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒαから選択され、結合してＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒ複合体を形成し、
好ましくは、前記対になってＦｖ断片を形成するＶＨドメインとＶＬドメインとの間、および／または前記ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間には、１対以上のジスルフィド結合があることを特徴とする、前記タンパク質の複合ユニット。

【請求項27】

核酸分子であって、
請求項２６に記載のタンパク質の複合ユニットをコードすることを特徴とする、前記核酸分子。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［技術分野］
本発明は、生物医学技術の分野に関し、具体的には、抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質ならびにその応用に関する。

【0002】

［背景技術］
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、ウイルス感染または腫瘍形質転換細胞等のストレスを受けた細胞を非常に効果的に破壊できる自然免疫細胞である。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存性細胞毒性、サイトカインの生成および免疫記憶等の機能を有しており、免疫応答系の重要な役割を果たしている。抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって媒介される効果的な細胞毒性メカニズムである。ＣＤ１６ａによるＡＤＣＣ効果は、ＮＫ細胞の抗腫瘍効果の主なメカニズムの一つである。特異的抗体が標的腫瘍細胞の膜に結合すると、免疫細胞は、当該反応を通じて細胞死を誘導する。

【0003】

抗体と免疫細胞との相互作用は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）ファミリーを通じて発生する。ヒトの場合、ＩｇＧのＦｃＲファミリー（ＦｃγＲ）は、ＦｃγＲＩ／ＣＤ６４、ＦｃγＲＩＩａ／ＣＤ３２ａ、ＦｃγＲＩＩｂ／ＣＤ３２ｂ、ＦｃγＲＩＩｃ／ＣＤ３２ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ／ＣＤ１６ａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ／ＣＤ１６ｂの六つの受容体で構成され、ここで、ＣＤ１６ａは、主にＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣを引き起こす。通常の場合、ＡＤＣＣ効果は、主にＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合する抗体を通じてＮＫ細胞を活性化する。ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６ ＢＲＩＧＨＴ細胞およびＣＤ５６ ｄｉｍ細胞の二つの主な亜集団に分けられる。ＣＤ５６ ｂｒｉｇｈｔ ＮＫ細胞は、強力なサイトカイン生成細胞であるが、ＣＤ１６ａを欠いており、ＣＤ５６ ｄｉｍ ＮＫ細胞は、高度の細胞毒性を有し、ＣＤ１６ａを発現する。ＣＤ１６ａを介してＩｇＧオプソニン化されたターゲットポイントを識別する場合、ＮＫ細胞は、様々な細胞毒性分子を放出し、それによって標的細胞の死を引き起こす。このようなメカニズムは、免疫シナプスの形成、およびパーフォリンおよびグランザイムを含む溶解顆粒の脱顆粒に依存する。脱顆粒に加えて、ＮＫ細胞は、標的デスレセプター（例えば、ＤＲ４、ＤＲ５またはＦａｓ）とそのデスレセプターリガンド（例えば、ＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬ）とを結合することによって、標的細胞を除去することもできる。

【0004】

ＣＤ１６ａは、短いＣ－ｔｅｒ細胞質尾部を有し、且つ二つの細胞外Ｉｇ様ドメインを有する、膜貫通受容体である。ＣＤ１６ａとＩｇＧのＣＨ２とは、１：１で相互作用し、ここで、ＣＨ２上のＮ２９７位のＮ－グリカン鎖も、このような相互作用中で重要な役割を果たす。ＣＤ１６ａは、その細細胞質尾部にＩＴＡＭドメインを有さないため、ＣＤ３ζおよびＦｃεＲＩγのＩＴＡＭドメインを含む二つのタンデム細胞内鎖の助けを必要とする。ＣＤ１６ａ結合後、Ｓｒｃファミリーに属するキナーゼＬｃｋは、活性化され、ＣＤ３ζおよび／またはＦｃεＲＩγのＩＴＡＭドメインをリン酸化する。リン酸化されたＩＴＡＭは、ＳｙｋおよびＺＡＰ－７０等のＳｙｋファミリーからのキナーゼの募集およびリン酸化を可能にし、それらは、逆に後続のシグナル伝達に関与する。それらの基質において、ＰＩ３Ｋは、ＰＩＰ２をＰＩＰ３に形質転換し、ＰＩＰ３がＰＬＣ－γによって処理した後にＩＰ３およびＤＡＧを放出するため、高度に関連される。ＤＡＧは、ＰＫＣファミリーを活性化し、これは、脱顆粒の誘発に役立つ。ＩＰ３は、小胞体からのカルシウム放出を誘導し、このようなカルシウム流入は、ＡＤＣＣによって引き起こされる主なシグナルの一つであり、核内でのＮＦＡＴの転座を引き起こし、その標的遺伝子の転写を誘導する。ＥＲＫ２ ＭＡＰＫ経路等のＣＤ１６ａによって活性化される他の経路も、ＡＤＣＣに寄与する。ＣＤ１６ａ依存性ＮＫ細胞殺傷後、ＣＤ１６ａは、急速にダウンレギュレートされる。ＣＤ１６ａ脱落のメカニズムの一つは、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）によって媒介され、後者は、ＮＫ細胞で発現される。ＡＤＡＭ１７によるＣＤ１６ａの切断は、シス構造で起こり、これは、ＡＤＡＭ１７を発現するＮＫ細胞が別のＮＫ細胞でＣＤ１６ａ脱落を誘導できないことを表わす。活性化後のＣＤ１６ａダウンレギュレーションのもう一つのメカニズムは、内部移行であり、これは、ＣＤ１６ａだけでなく、ＣＤ３ζ、ＺＡＰ－７０およびＳｙｋ等の他の細胞内シグナル成分でも発生する。

【0005】

ＮＫ細胞は、自然免疫細胞中のキラー細胞として、病原体および腫瘍細胞を直接殺すことができる。Ｔ細胞と比較して、ＮＫ細胞は、より強力な腫瘍識別能力および殺傷能力だけでなく、より強力な既製の応用への可能性を有する。自然免疫応答をより活性化し、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を増強するように治療性抗体薬物の定常領域（ＦＣ末端）を修飾するかと、ＣＤ１６Ａに特異的に結合できるビス（ポリ）抗体の有効性をどのように評価するかとは、医薬品開発者にとって興味深い問題である。現在、ＡＤＣＣの役割を改善するための策略は、主に次のような態様に焦点を当てている。

【0006】

（１）サイトカイン：ＡＤＣＣ活性を高める簡単な方法は、炎症誘発性サイトカインでＮＫ細胞を刺激することである。ＮＫ細胞移植は、サイトカイン誘導性記憶様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞の注入等により、複数の臨床試験で成功裏に実施され、最も一般的に使用されるサイトカインの組み合わせは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８を含む。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、従来のＮＫ細胞よりも多くのＩＦＮ－γを発現し、白血病細胞および原発性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）母細胞に対して優れた細胞毒性を示す。ＩＬ－１２は、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの生成を増加させ、Ｉ／ＩＩ相臨床試験において、セツキシマブとＩＬ－１２とは、切除不能または再発の頭頚部扁平上皮がん患者に併用される。無増悪生存期間（ＰＦＳ）が１００日未満の患者と比較して、ＰＦＳが１００日を超える患者のＮＫ細胞は、インビトロでより高いＡＤＣＣ活性有する。ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との生存および機能に必要なサイトカインである。Ｎ－８０３は、突然変異型Ｎ７２Ｄ ＩＬ－１５スーパーアゴニストであり、前臨床モデルおよび臨床試験において、増強されたＮＫ細胞のインビトロおよびインビボでの活性を示す。さらに、それは、ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の数も増加した。

【0007】

（２）ＡＤＡＭ１７の阻害：ＡＤＡＭ１７は、活性化後のＣＤ１６ａダウンレギュレーションの主なドライバーである。ＮＫ細胞のＡＤＣＣを改善する一つの策略は、ＡＤＡＭ１７を標的とすることによりＣＤ１６ａの脱落を防ぐことである。研究によると、ＮＫ細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用してＡＤＡＭ１７をノックアウトすると、より優れたＩＦＮ－γ生成、ならびにインビボおよびインビトロでのＡＤＣＣ活性が示されることがわかる。しかしながら、ＡＤＡＭ１７をブロッキングすると、ＮＫ細胞の生存率およびＣＤ１６ａ媒介性連続殺傷が低下され、細胞が標的細胞から分離できなくなり、別の標的細胞に移動することを妨げることも研究で示される。とにかく、ＡＤＡＭ１７阻害の利点は、不明であり、結果についても議論の余地がある。この策略が成功するかどうかは、進行中の臨床試験（ＮＣＴ０４０２３０７１）の結果によって決定され、当該試験では、ＡＭＬおよびＢ細胞リンパ腫における非切断性ＣＤ１６ａを保有するｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の応用を評価する予定である。

【0008】

（３）操作された抗体：抗体のＦｃ部分を操作すると、ＣＤ１６ａに対するＦｃの親和性が増加され、その後ＡＤＣＣが改善される。一部の突然変異は、非常に流行しており、例えば、いわゆるＧＡＳＤＡＬＩＥは、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２ＥのＦｃにおける四つの置換からなる。当該突然変異は、ＣＤ１６ａに対する親和性の大幅な増加を示すが、ＣＤ３２ｂ親和性の増加は、突然変異体１８（Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ）と呼ばれる別の突然変異は、ＡＤＣＣを大幅に増加させる。これらの突然変異は、現在、抗ＨＥＲ２抗体マルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）として臨床に導入され、様々なＨＥＲ２陽性がんのＩ相治療において良好な効果が示される。さらに、抗体Ｆｃ Ｎ－グリカンの糖操作により、ＣＤ１６ａに対する親和性が増加されると予想される。最も研究されている糖修飾は、脱フコシル化修飾等の脱グリコシル化である。このような修飾により、ＣＤ１６ａとの結合が増加し、ＡＤＣＣが改善される。この技術は、抗ＣＤ２０抗体オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）に使用される。

【0009】

（４）ＮＫ細胞エンゲージャー：操作された抗体に加えて、抗体の形態も研究できる。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）策略の成功に基づいて、ＮＫ細胞用に同様の形態、即ち、いわゆる二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）が開発される。ＢｉＫＥは、二つのｓｃＦｖが配列を連結することによって構成され、一つの単鎖抗体は、ＣＤ１６ａを標的とし、もう一つは、腫瘍抗原を標的とする。さらに、二つの腫瘍抗原をＣＤ１６ａと一緒に標的とするか、または３番目の単鎖抗体の代わりにＩＬ－１５を添加する、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴＲｉＫＥ）もある。このような構造の使用により、ＮＫ細胞が腫瘍細胞に再局在することが可能になり、標的細胞に対する強力なＡＤＣＣ効果を引き起こす。ＡＦＭ１３は、ＣＤ１６ａおよびＣＤ３０を標的とする二重特異性抗体であり、現在臨床II相段階にあり、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、形質転換菌状息肉症およびホジキンリンパ腫の治療に使用される。再発性または難治性ホジキンリンパ腫を治療するＩｂ臨床研究において、ＡＦＭ１３とペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）との併用により、客観的奏効率が８８％、全体の奏効率が８３％となる。ＧＴＢ－３５５０は、現在、複数種の白血病を対象とした第Ｉ／ＩＩ相試験で研究されるＣＤ１６／ＣＤ３３／ＩＬ－１５のＴＲｉＫＥ形態である（ＮＣＴ０３２１４６６６）。

【0010】

しかしながら、腸がん、腎臓がん、肝臓がん、乳がんおよび肺がん等を含むほとんどの腫瘍の腫瘍微小環境には、非常に少ない数のＮＫ細胞がみられる。従って、業界では、腫瘍表面抗原に特異的な抗体およびＮＫ細胞ＣＤ１６Ａに特異的な抗体によって形成される二重特異性分子等、ＣＤ１６Ａの活性を使用して癌を治療する免疫治療法の開発を進めており、現在、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＣＤ１６Ａの二重特異性抗体が開発されており、単独のＨＥＲ２抗体よりもより強力な抗腫瘍活性を有し、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ３０に特異的に結合する二重特異性抗体であるＡＦＭ１３は、ＮＫ細胞または単球の表面にあるＣＤ１６分子に結合して、これらの免疫エフェクター細胞がＣＤ３０を発現する腫瘍細胞に標的にして殺傷できるようにし、当該抗体は、ホジキン腫瘍のマウスモデルと患者との療法で腫瘍を除去する効果を示す。しかし、従来のＣＤ１６Ａ抗体または抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質に一定期間曝露すると、ＮＫ細胞の枯渇またはＮＫ細胞毒性の効力低下が生じ、それによってＮＫ細胞の腫瘍殺傷効果に影響を及ぼす。ＣＤ１６Ａ二重抗体を長期間投与することができなくなり、その効果に影響を及ぼす。

【0011】

インターロイキン－１５（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５、ＩＬ－１５）は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋Ｔ細胞機能に非常に重要な、長さ１４～１５ｋＤａのサイトカインである。ＩＬ－１５は、その受容体ＩＬ－１５Ｒαに結合して、極めて高い生物学的効力を有する複合体ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（ＩＬ－１５ ＳＡ）を生成した後に形質導入されて標的細胞に輸送される。ＩＬ－１５ ＳＡは、発現ＩＬ－１５Ｒに応答する細胞、特にＮＫ細胞／Ｔ細胞を強力に活性化し、それによって抗腫瘍および抗ウイルス機能を促進する。ＩＬ－１５は、広範囲の免疫調節効果を有し、Ｔ細胞、特にＮＫ細胞、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の生存、増殖および機能の調節に関与する。ＩＬ－１５とＩＬ－２との構造は、非常に似ており、スパイラルサイトカインファミリーに属する。ＩＬ－１５のヘテロ三量体受容体は、ＩＬ－２受容体とＩＬ－２Ｒ／ＩＬ－１５ Ｒβ（ＣＤ１２２）および共通のγｃ鎖（ＣＤ１３２）を共有しており、これらの共通の受容体成分および共通のＪＡＫ １／ＪＡＫ ３／ＳＴＡＴ ５シグナル伝達経路により、ＩＬ－１５およびＩＬ－２は、Ｔ細胞増殖の刺激、細胞傷害性Ｔリンパ球の産生、Ｂ細胞の刺激による免疫グロブリンの合成、ならびにＮＫ細胞の産生および持続的生存等を含む、同様の機能を有する。多くの適応性免疫応答において、ＩＬ－２およびＩＬ－１５は、独特で、しばしば競合する役割を果たす。主なポイントは、次のように四つある。１．ＩＬ－２は、Ｔｒｅｇｓ細胞の活性化を調節できるが、ＩＬ－１５は、調節できない。２．ＩＬ－２は、誘導性ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の細胞死を活性化することによってＴ細胞応答を阻害する。３．ＩＬ－１５は、ＮＫ、エフェクター細胞ＣＤ８＋および記憶表現型ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化において重要な役割を果たす。４．前臨床研究によると、ＩＬ－１５の毒性は、ＩＬ－２の毒性とは異なり、ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－１５は、血管毛細管の漏出がほとんどない。これらの要因により、ＩＬ－１５は、腫瘍免疫策略においてより潜在的なサイトカインとなる。現在、複数のＩＬ－１５ターゲットポイント製品がまだ臨床試験段階にあり、その中で最も注目すべきなのは、ＩＬ－１５タンパク質Ｎ７２Ｄの突然変異後にＩＬ－１５ＲａとＩｇＧ１Ｆｃとに結合して共発現する融合タンパク質であるＩＬ－１５スーパーアゴニストＮ－８０３であり、２０２２年５月２３日、ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏは、非筋層浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）の治療薬として、ＢＣＧワクチン（ＢＣＧ）と併用したＩＬ－１５スーパーアゴニストＮ－８０３の販売申請をＦＤＡに提出した。２０２１年に発表された臨床データでは、Ｎ－８０３＋ＢＣＧの併用治療効果が顕著で、ＣＲ率は、７１％（５９／８３）に達し、平均ＣＲ維持時間は、２４．１カ月であることが示される。第１相臨床実験では、転移性非小細胞肺がんの治療においてニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（ＰＤ－１抗体、オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ））とＮ－８０３と併用すると、患者の長期生存を大幅に延長できることが示される。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社は、Ｘｅｎｃｏｒ社と協力してＩＬ－１５サイトカインＸｍＡｂ（登録商標）２４３０６を開発し、現在、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑと併用したＸｍＡｂ（登録商標）２４３０６の臨床研究を実施している。Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．のＳＨＲ－１５０１（ＩＬ－１５融合タンパク質）は、２０１９年５月１４日にＳＨＲ－１５０１臨床試験の実施が承認された。さらに、ＳＨＲ－１３１６（ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体薬物）は、治療が失敗した進行性悪性腫瘍患者に対してＳＨＲ－１５０１と併用する。しかしながら、サイトカインの臨床上使用は、単剤投与の標的化が不十分である欠点があり、高濃度投与でなければ抗腫瘍効果が得られず、高濃度投与では免疫阻害効果および高い毒性が生じる。また、非標的性サイトカインによる免疫系の活性化は、全身的であり、免疫系は、広範囲に活性化され、致命的な副作用がある。さらに、サイトカインは、低分子量のタンパク質に属し、体内で抗体のような循環保護機構を有さないため、単純なサイトカインは、半減期が短いことが多く、短時間で高用量の反復投与が必要となる。現在、臨床研究薬物では、主にＰＥＧ化またはＦｃ融合を使用してサイトカインの半減期を延長し、半減期が延長されたものの、サイトカインの標的化が不十分であるという問題は依然として解決できない。

【0012】

［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明の第１の目的は、背景技術の問題を解決するために、新規抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質を提供することである。

【0013】

［課題を解決するための手段］
本発明によって提供される抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに特異的に結合するＣＤ１６Ａ結合領域、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合するＴＡＡ結合領域、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとの結合によって形成されるＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体、ならびにＦｃドメインを含む。本発明によって提供される三機能性融合タンパク質は、ＣＤ１６ＡおよびＴＡＡを同時に標的とするだけでなく、独特の成分を有し、且つ独特の構造を形成するＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体およびＦｃドメインを融合する。さらに、本発明の三機能性融合タンパク質は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαを使用して、二重特異性抗体の抗体構造の一つにおけるＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインをそれぞれ置き換え、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとの間の超高親和性（ＫＤ約３０～１００ｐＭ）によって形成されるＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα構造は、二重特異性抗体の軽鎖と重鎖との間の正しいペアリングを保証し、それによって二重特異性抗体の軽鎖の不一致の問題を解決する。同時に、三機能性融合タンパク質ＣＤ１６Ａ抗体は、ＮＫ細胞を腫瘍部位に標的化し、腫瘍細胞近くでＮＫ細胞を活性化する。従来のＣＤ１６Ａ抗体または抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質に一定期間曝露すると、ＮＫ細胞の枯渇またはＮＫ細胞毒性の効力低下を引き起こし、ＣＤ１６Ａ抗体を長期間投与できなくなり、腫瘍治療の効果に影響を及ぼすが、損傷したＮＫ細胞の毒性は、本発明の三機能性融合タンパク質構造におけるサイトカインＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαによる刺激を通じて回復することができ、それによりＮＫ細胞の腫瘍細胞殺傷効果がさらに増強され、ＣＤ１６Ａ抗体によるＮＫ細胞の枯渇および腫瘍細胞毒性の弱体化の問題が解決される。ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαは、ＮＫ細胞およびＴ細胞等の免疫エフェクター細胞の増殖および活性化を刺激し、腫瘍に対する身体の免疫阻害活性を大幅に増強する。

【0014】

選択可能で、前記ＣＤ１６Ａ結合領域は、抗ＣＤ１６Ａ抗体またはその抗原結合断片を含む。
選択可能で、前記ＣＤ１６Ａ結合領域は、ＣＤ１６Ａを標的とするＦａｂ断片またはＦｖ断片である。

【0015】

選択可能で、前記ＴＡＡ結合領域は、抗ＴＡＡ抗体またはその抗原結合断片を含む。
選択可能で、前記ＴＡＡ結合領域は、ＴＡＡを標的とするＦａｂ断片またはＦｖ断片である。

【0016】

選択可能で、前記融合タンパク質は、連結断片をさらに含み、前記連結断片のアミノ酸配列は、若干のＧＳリピート配列であることが好ましい。

【0017】

選択可能で、前記融合タンパク質は、若干のペプチド鎖を含み、前記ＩＬ－１５および前記ＩＬ－１５Ｒαは、それぞれ異なるペプチド鎖上に位置する。

【0018】

選択可能で、前記融合タンパク質は、第１の単量体および第２の単量体を含み、前記第１の単量体は、前記ＴＡＡ結合領域および第１のＦｃ鎖を含み、前記第２の単量体は、前記ＣＤ１６Ａ結合領域、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体および第２のＦｃ鎖を含み、前記第１のＦｃ鎖および前記第２のＦｃ鎖は、重合して前記Ｆｃドメインを形成する。

【0019】

選択可能で、前記ＴＡＡ結合領域は、ＴＡＡを標的とするＦａｂ断片であり、前記ＣＤ１６Ａ結合領域は、ＣＤ１６Ａを標的とするＦｖ断片である。

【0020】

選択可能で、前記融合タンパク質は、第１の単量体および第２の単量体を含み、前記第１の単量体は、前記ＣＤ１６Ａ結合領域および第１のＦｃ鎖を含み、前記第２の単量体は、前記ＴＡＡ結合領域、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体および第２のＦｃ鎖を含み、前記第１のＦｃ鎖および前記第２のＦｃ鎖は、重合して前記Ｆｃドメインを形成する。

【0021】

選択可能で、前記ＣＤ１６Ａ結合領域は、ＣＤ１６Ａを標的とするＦａｂ断片であり、前記ＴＡＡ結合領域は、ＴＡＡを標的とするＦｖ断片である。

【0022】

選択可能で、前記第１の単量体は、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖を含み、前記第２の単量体は、第３のペプチド鎖および第４のペプチド鎖を含み、前記第１のペプチド鎖は、ＶＬドメインとＣＬドメインとの融合によって形成される軽鎖を含み、前記第２のペプチド鎖は、ＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと第１のＦｃ鎖との融合によって形成される重鎖を含み、前記第３のペプチド鎖は、抗体可変領域、サイトカインおよび第２のＦｃ鎖を含み、前記第４のペプチド鎖は、抗体可変領域およびサイトカインを含み、前記第１のペプチド鎖のＶＬドメイン、ＣＬドメイン、および前記第２のペプチド鎖のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメインは、対になってＦａｂ断片を形成し、前記第３のペプチド鎖の抗体可変領域および前記第４のペプチド鎖の抗体可変領域は、対になってＦｖ断片を形成し、前記第３のペプチド鎖のサイトカインと前記第４のペプチド鎖のサイトカインが結合して、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体を形成し、ここで、前記Ｆａｂ断片は、ＴＡＡを標的とし、前記Ｆｖ断片は、ＣＤ１６Ａを標的とするか、または、前記Ｆａｂ断片は、ＣＤ１６Ａを標的とし、前記Ｆｖ断片は、ＴＡＡを標的とする。

【0023】

選択可能で、対になって前記Ｆｖ断片を形成する抗体可変領域は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインから選択され、前記サイトカインは、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαから選択される。

【0024】

選択可能で、対になって前記Ｆｖ断片を形成するＶＨドメインとＶＬドメインとの間には、１対または複数対のジスルフィド結合があり、次の突然変異の組み合わせの形態のいずれかの１種以上を含み、ＥＵに従ってカウントされる。

【0025】

【表1】

【0026】

選択可能で、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記第３のペプチド鎖の融合順序は、抗体可変領域～サイトカイン～第２のＦｃ鎖であるか、またはサイトカイン～抗体可変領域～第２のＦｃ鎖であり、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記第４のペプチド鎖の融合順序は、抗体可変領域～サイトカインであるか、またはサイトカイン～抗体可変領域であり、「～」は、連結断片を表わす。

【0027】

選択可能で、前記ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５、ならびにそのＩＬ－１５Ｒａに結合できる突然変異、切断および様々な誘導体を含み、前記ＩＬ－１５Ｒａは、ＩＬ－１５Ｒａ、ならびにそのＩＬ－１５に結合できる突然変異、切断および様々な誘導体を含み、好ましくは、前記ＩＬ－１５は、次の突然変異の組み合わせのいずれかを含むがこれらに限定されず、計数方法は、ＩＬ－１５のアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいて第１位としてカウントされ、

【0028】

【表2】

【0029】

または、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体は、次の突然変異の組み合わせのいずれかを含むがこれらに限定されず、計数方法は、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒａのアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいて第１位としてカウントされる。

【0030】

【表3】

【0031】

選択可能で、前記ＴＡＡは、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ｓｌａｍｆ７、ＧＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ１３３、ＣＤ２１７、ＣＤ２３９、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、Ｔｒｏｐ２、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ｆｏｌｒ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、Ｃ－ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＥｐｈＡ２、ＡＤＡＭ１７、１７－Ａ１、ＮＫＧ２Ｄリガンド（ｌｉｇａｎｄｓ）、ＭＣＳＰ、ＬＧＲ５、ＳＳＥＡ３、ＳＬＣ３４Ａ２、ＢＣＭＡ、ＧＰＮＭＢ、ＣＣＲ４、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ６、インテグリンα４、ＰＤＧＦＲα、ＮｅｕＧｃＧＭ３、インテグリンαＶβ３、ＣＤ５１、ＣＴＡＡ１６．８８、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＳＰＧ４、ＳＳ１またはＩＧＦＲ１から選択される。

【0032】

選択可能で、前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、好ましくは、ＩｇＧ１ Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃヘテロ二量体の形態であり、好ましくは、前記Ｆｃヘテロ二量体は、次の突然変異の組み合わせを含むがこれらに限定されず、次の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされる。

【0033】

【表4】

【0034】

選択可能で、前記Ｆｃドメインは、免疫エフェクター機能を除去するように選択され、好ましくは、次の突然変異形態のいずれかを含み、次の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされる。

【0035】

【表5】

【0036】

選択可能で、前記第１のＦｃ鎖は、プロテインＡに結合せず、好ましくは突然変異Ｈ４３５ＲまたはＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆを含み、ＥＵに従ってカウントされ、前記第２のＦｃ鎖は、プロテインＡに結合することができる。

【0037】

選択可能で、前記ＣＤ１６Ａ結合領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるようなＶＨドメインおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるようなＶＬドメインを含むか、または、前記ＩＬ－１５の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６または４７に示されたとおりであるか、または、前記ＩＬ－１５Ｒａの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８～５４のいずれかに示されたとおりであり、好ましくは、前記ＣＤ１６Ａ結合領域のＶＨとＶＬとの間、および／または前記ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒａとの間には、少なくとも１対以上のジスルフィド結合がある。

【0038】

選択可能で、前記抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０２、０３、０４、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０５、０３、０６、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、０８、０９、１０、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０２、１１、１２、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０２、１３、１４、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０５、１１、１５、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、０５、１３、１６の任意のセットの配列に示されるか、またはそれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸断片と融合することによって得られる。

【0039】

選択可能で、前記抗原は、感染性疾患関連抗原、病原体、免疫機能関連抗原をさらに含む。
本発明は、上記の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質をコードする、核酸分子をさらに提供する。

【0040】

本発明は、上記の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質、ならびに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物をさらに提供する。

【0041】

本発明は、癌、感染および免疫調節性疾患を阻害または治療するための薬物の調製における、上記の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質の応用を提供する。

【0042】

前記癌は、前立腺がん、肺がん、結腸がん、直腸がん、膀胱がん、黒色腫、腎臓がん、口腔がん、咽頭がん、膵臓がん、子宮がん、甲状腺がん、皮膚がん、頭頚部がん、子宮頸がん、卵巣がんまたは血液系がんを含む。

【0043】

本発明は、タンパク質の複合ユニットをさらに提供し、前記複合ユニットは、第１の可変領域、第２の可変領域、第１のサイトカイン、第２のサイトカイン、若干の連結断片を含み、前記第１の可変領域は、連結断片を介して前記第１のサイトカインに融合され、前記第２の可変領域は、連結断片を介して前記第２のサイトカインに融合され、前記第１の可変領域および第２の可変領域は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインから選択され、前記第１の可変領域および第２の可変領域は、対になって、ＣＤ１６Ａに特異的に結合するＦＶ断片を形成し、前記第１のサイトカインおよび第２のサイトカインは、ＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒαから選択され、前記ＩＬ－１５および前記ＩＬ－１５Ｒαは、それぞれ異なるペプチド鎖に位置し、前記第１のサイトカインおよび第２のサイトカインは、結合してＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα複合体を形成し、好ましくは、前記ＶＨドメインと前記ＶＬドメインとの間、および／または前記ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間には、１対以上のジスルフィド結合がある。

【0044】

［発明の効果］
本発明の有益な効果は、次のとおりである。
（１）本発明によって提供される三機能性融合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに特異的に結合するＣＤ１６Ａ結合領域、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合するＴＡＡ結合領域、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとの結合によって形成されるＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体、ならびにＦｃドメインを含み、ＣＤ１６ＡとＴＡＡとを同時に標的とするだけでなく、独特の成分を有し、且つ独特の構造を形成するＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体およびＦｃドメインも融合することができる。

【0045】

（２）本発明によって設計されるＴＡＡ／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ１５三機能性融合タンパク質は、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａとに同時に結合することにより、ＮＫ細胞を腫瘍に標的とし、ＮＫ細胞は、パーフォリンおよびグランザイムを放出し、アポトーシスを引き起こし、腫瘍細胞死を引き起こす。サイトカインＩＬ１５は、ＮＫ細胞の機能を拡張および維持し、免疫細胞の増殖を刺激し、腫瘍の免疫微小環境を変化させる。

【0046】

（３）本発明によって構築される抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα活性を有し、サイトカインを腫瘍部位に標的化し、腫瘍部位で免疫エフェクター細胞（ＮＫ細胞およびＴ細胞）を特異的に拡張および活性化して、免疫細胞の数および殺傷性サイトカインの放出を増加させ、免疫応答をより効果的に活性化して腫瘍細胞を殺傷する。

【0047】

（４）ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαは、抗体構造におけるＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインを置き換え、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαの高親和性を利用してＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体を形成し、それによって二重特異性抗体軽鎖の正しいペアリングを実現し、二重特異性抗体軽鎖の不一致の問題を解決する。さらに、アミノ酸配列の突然変異により、ＶＨとＶＬとの間、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとの間に１対または複数対のジスルフィド結合を添加し、軽鎖／重鎖間の結合活性をさらに増強し、二重特異性抗体の重鎖の不一致の問題を解決するためにＦｃヘテロ二量体技術と組み合わせることで、二重特異性抗体の調製プロセスにおける軽鎖および重鎖の不一致、高い副産物、不十分な安定性という課題をより効果的に克服でき、正しくペアリングされた多機能性融合タンパク質が調製されると同時に、多機能性融合タンパク質の開発周期が短縮され、調製コストが削減される。

【0048】

（５）Ｆｃドメインのエフェクター機能を保持したり、または免疫エフェクターを除去させた形態のＦｃドメイン使用したりすることができる。免疫エフェクターを除去させた形態のＦｃドメインを使用すると、Ｆｃは、ＦｃＲγＩＩＩ（ＣＤ１６Ａ）に結合できない。本発明の融合タンパク質がＦｃドメインのエフェクター機能を保持している場合、免疫細胞に対応する活性化効果も観察される。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】それぞれ、本発明の異なる実施例における三機能性融合タンパク質の構造形態の模式図である。

【図2】それぞれ、本発明の異なる実施例における三機能性融合タンパク質の構造形態の模式図である。

【図3】それぞれ、本発明の異なる実施例における三機能性融合タンパク質の構造形態の模式図である。

【図4】それぞれ、本発明の異なる実施例における三機能性融合タンパク質の構造形態の模式図である。

【図5】それぞれ、本発明の異なる実施例における三機能性融合タンパク質の構造形態の模式図である。

【図6】それぞれ、本発明の異なる実施例における三機能性融合タンパク質の構造形態の模式図である。

【図7】それぞれ、本発明の異なる実施例における三機能性融合タンパク質の構造形態の模式図である。

【図8】それぞれ、本発明の異なる実施例における三機能性融合タンパク質の構造形態の模式図である。

【図9】それぞれ、本発明の異なる実施例における三機能性融合タンパク質の構造形態の模式図である。

【図10】ＨＬ６０細胞に結合する三機能性タンパク質のＦＡＣＳ検出の結果図である。

【図11】Ｄａｕｄｉ細胞に結合するＣＤ３８／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質のＦＡＣＳ検出の結果図である。

【図12】ＣＳ１タンパク質に結合する三機能性分子のＥＬＩＳＡ検出の結果図である。

【図13】Ｍｏ７ｅ細胞増殖実験に対するＴＡＡ／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質のＣＣＫ８検出の結果図である。

【図14】Ｍｏ７ｅ細胞増殖実験に対するＴＡＡ／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質のＣＣＫ８検出の結果図である。

【図15】Ｍｏ７ｅ細胞増殖実験に対するＴＡＡ／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質のＣＣＫ８検出の結果図である。

【図16】１０：１のエフェクター：ターゲット比を有するＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質媒介性ＡＤＣＣ効果の結果図である。

【図17】１０：１のエフェクター：ターゲット比を有するＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質媒介性ＡＤＣＣ効果の結果図である。

【図18】２０：１のエフェクター：ターゲット比を有するＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質媒介性ＡＤＣＣ効果の結果図である。

【図19】１０：１のエフェクター：ターゲット比を有するＣＤ３８／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質媒介性ＡＤＣＣ効果の結果図である。

【図20】５：１のエフェクター：ターゲット比を有するＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質媒介性ＡＤＣＰの結果図である。

【図21】ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質媒介性ＡＤＣＰの結果図である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

以下、添付の図面および実施例を参照して、本発明の技術的解決策をさらに説明する。本発明をより理解しやすくするために、特定の技術的用語および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の場所で明確に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的用語および科学的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。

【0051】

用語
「融合」という用語は、ペプチド結合による構成要素直接連結、連結断片を介した構成要素の連結、または分子間相互作用による非共有結合融合、一つまたは複数のジスルフィド結合もしくは化学架橋共有結合による融合を指す。単一のペプチド鎖において、融合とは、ペプチド結合による直接連結、または連結断片を介した連結を指す。「多機能融合タンパク質」とは、二つまたはそれ以上の異なるエピトープ（例えば、二つ、三つまたはそれ以上の異なるエピトープ）に結合できる、二つまたはそれ以上の抗原結合ドメインを含むタンパク質を指し、多機能融合タンパク質は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒａ）等をさらに含むこともできる。「融合位置」とは、ペプチド鎖における機能的領域またはドメインの位置を指し、当該ペプチド鎖上の各機能的断片の連結順序を示す。

【0052】

「ポリペプチド」という用語は、タンパク質およびその断片を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を指す。本発明は、アミノ酸残基の配列としてのポリペプチドを開示する。あれらの配列は、アミノ基末端からカルボキシ基末端への方向に左から右に書かれている。標準命名法に従って、アミノ酸残基配列は、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、シメシン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉ１ｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）のように３文字または１文字のコードで命名される。

【0053】

「ペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合によってアミノ酸に線形的に結合した分子を指す。
「変異体」または「突然変異体」という用語は、含まれたアミノ酸またはヌクレオチドとは異なるが、基本的な特性を保持しているポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。通常、変異体間または変異体と親抗体との間の違いは、限られており、アミノ酸配列は、一般に非常に類似している。本明細書において、変異前の抗体または抗体断片を親抗体と呼び、変異後の抗体または抗体断片を変異体と呼ぶ。変異体は、依然として抗原結合活性を有する。

【0054】

「抗体」（ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂ）という用語は、少なくとも一つの抗原結合部位を含み、且つ抗原に特異的に結合できる免疫グロブリン分子（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ）を指す。

【0055】

「抗原」という用語は、体内で免疫応答を誘導でき、且つ抗体に特異的に結合する物質である。抗原への抗体の結合は、水素結合、ファンデルワールス力、イオン結合、および疎水結合を含む両者間に形成される相互作用によって媒介された。抗原表面上で抗体に結合する領域を「抗原決定基」または「エピトープ」と呼び、一般に、各抗原には、複数の決定基がある。

【0056】

本発明で言及される「抗体」という用語は、最も広い意味で理解され、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、抗体断片、少なくとも二つの異なる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む。抗体は、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、および他に由来する抗体をさらに含む。本発明の抗体は、ヒト、非ヒト霊長類動物、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ニワトリ、ラクダ、アルパカ等の免疫グロブリンを含むがこれらに限定されない、任意の動物に由来することができる。抗体は、非天然アミノ酸、Ｆｃエフェクター機能の突然変異およびグリコシル化部位の突然変異のような別の修飾を含むことができる。抗体は、抗体が所望の生物学的活性を示す限り、翻訳後修飾された抗体、抗体の抗原決定基を含む融合タンパク質、ならびに抗原識別部位に対する任意の他の修飾を含む免疫グロブリン分子をさらに含む。言い換えれば、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性断片、即ち、少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む分子を含む。

【0057】

抗体の基本構造は、２本の完全に同一の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｈ）および２本の完全に同一の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｌ）がジスルフィド結合によって連結されるＹ字型の単量体である。各鎖は、それぞれ２～５個の約１１０個のアミノ酸を含み、配列が類似しているが機能が異なるドメイン（機能領域とも呼ばれる）で構成される。抗体分子において、軽鎖および重鎖がＮ末端に近接するアミノ酸配列は、大きく変化しており、形成されたドメインを可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、Ｖ領域）と呼ばれ、Ｃ末端に近接するアミノ酸配列が相対的に一定な領域は、定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ、Ｃ領域）と呼ばれる。

【0058】

重鎖および軽鎖のＶ領域は、それぞれＶＨおよびＶＬと呼ばれ、ＶＨおよびＶＬは、それぞれ三つの領域のアミノ酸組成を有し、配列順序が非常に変化しやすく、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＨＶＲ）と呼ばれ、当該領域は、抗原エピトープに相補的な空間構造を形成し、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）とも呼ばれる。ＶＨの３个ＣＤＲは、それぞれＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３で表され、ＶＬの三つのＣＤＲは、それぞれＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３で表される。ＶＨおよびＶＬの合計六つのＣＤＲが、一緒に抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を形成する。ＣＤＲ領域のアミノ酸の多様性は、抗体が多数の異なる抗原に特異的に結合する分子基盤である。Ｖ領域のＣＤＲの外側のアミノ酸組成および排列順序は、比較的に変化が少なく、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と呼ばれる。ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で表される四つのフレームワーク領域（フレームワーク領域と呼ばれる）を有する。ＶＨおよびＶＬは、それぞれ三つのＣＤＲおよび四つのＦＲで構成され、アミノ基端からカルボキシ基に向かう配列の順序は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４である。

【0059】

抗体重鎖の定常領域のアミノ酸配列に従って、ヒト免疫グロブリンをＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの五つのカテゴリーに分類できる。それは、異なるサブタイプ（アイソタイプ）に分けることができ、例えば、ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けることができ、ＩｇＡは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けることができる。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥのサブタイプは、発見されていない。軽鎖アミノ酸配列に基づいて、軽鎖をκ鎖およびλ鎖に分類できる。本発明の抗体は、任意の種類（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）またはサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）であり得る。

【0060】

重鎖および軽鎖の定常領域は、それぞれＣＨおよびＣＬと呼ばれる。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤの重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の三つのドメインを有し、ＩｇＭ、ＩｇＥの重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４の四つのドメインを有する。

【0061】

ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）は、ＣＨ１とＣＨ２との間に位置し、豊富なプロリンを含むため、伸ばしたり曲げたりしやすく、Ｙ字型の二つのアーム間の距離を変えることができ、二つのアームを同時に抗原エピトープに結合するのに有利する。

【0062】

「Ｆａｂ断片」という用語は、抗原結合断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ、Ｆａｂ）であり、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインと構成される抗体断片を表わし、単一の抗原エピトープ（一価）に結合する。当業者は、一定条件下で、抗体分子鎖の特定の部分がタンパク質加水分解酵素によって容易に様々な断片に加水分解されることを知っている。パパインは、ヒンジ領域のＮ末端から抗体分子を二つの完全に同一の抗原結合断片（Ｆａｂ）および結晶化可能な断片（Ｆｃ）に加水分解される。

【0063】

「Ｆｖ断片」という用語は、Ｌ鎖およびＨ鎖のＶ領域（ＶＨ＋ＶＬ）からなる一価の低分子であり、抗原に結合する最小の機能的断片である。
「Ｆｃ」、「Ｆｃセグメント」、「Ｆｃ断片」、「Ｆｃドメイン」という用語は、抗原結合活性を有しない結晶化可能な断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）を指し、抗体がエフェクター分子または細胞表面Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に相互作用する部位である。Ｆｃ断片は、表面に対応するＦｃ受容体を有する細胞に結合し、異なる生物学的効果を生み出す。ＡＤＣＣ効果（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性効果、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）において、抗体のＦａｂセグメントは、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞の抗原エピトープに結合し、そのＦｃセグメントは、殺傷細胞（ＮＫ細胞、マクロファージ等）表面のＦｃＲに結合し、殺傷細胞を媒介して標的細胞を直接殺傷する。Ｆｃ断片は、重鎖定常領域ＣＨ１を除く抗体の定常領域ポリペプチド、即ち、ヒト免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ重鎖定常領域のカルボキシ基末端の二つの定常領域ドメインＣＨ２およびＣＨ３、ならびにヒト免疫グロブリンＩｇＥおよびＩｇＭ重鎖定常領域のカルボキシ基末端の三つの定常領域ドメインＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む。Ｆｃ断片は、多くの場合、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、好ましくはＩｇＧ１ Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択される。

【0064】

Ｆｃは、２本の鎖から構成されることができ、本明細書において、Ｆｃ断片の２本の鎖を第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖と記載し、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、それぞれ突然変異されることができ、本発明は、特定に限定されない。Ｆｃ断片は、Ｆｃドメイン内の単一のポリペプチド鎖を指すこともできる。抗体のＦｃセグメントは、免疫エフェクター機能を排除するように選択でき、次のような突然変異の組み合わせ（ＥＵによってカウントされる）を含むが、これらに限定されない。

【0065】

【表6】

【0066】

突然変異によって設計されたＦｃ変異体の間は、空間充填効果、静電ステアリング、水素結合作用、疏水作用等を形成することができる。Ｆｃ変異体間の相互作用は、安定なヘテロ二量体の形成に有利する。好ましい突然変異設計は、「Ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ」形態の突然変異設計である。

【0067】

「連結断片」とは、タンパク質の正確なフォールディングおよびペプチドの安定性を確保するために、免疫グロブリンドメインに挿入され、且つ十分な移動性を提供する一つまたは複数のアミノ酸残基を指す。「連結断片」は、好ましくは（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、０、１、２、３、４、５またはそれ以上であり得る。連結断片配列が短すぎると、二つのタンパク質の高次構造のフォールディングに影響を及ぼし、それによって相互に干渉する可能性があり、連結ペプチド配列が長すぎると、連結ペプチド配列自体が新しい抗原であるため、免疫原性の問題が発生する。

【0068】

腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＡＡ）とは、胚性タンパク質、糖タンパク質抗原、扁平上皮抗原等を含む、腫瘍細胞または正常細胞に存在する抗原分子を指し、臨床腫瘍の診断に一般的に使用される。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の固有のものではなく、正常細胞でも微量合成されることができるが、腫瘍細胞が増殖すると高度に発現するため、「関連抗原」と呼ばれる。腫瘍関連抗原は、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ｓｌａｍｆ７、ＧＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ１３３、ＣＤ２３９、ＣＤ２７６、ＰＤ－１、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、Ｔｒｏｐ２、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ｆｏｌｒ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＰＤＬ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、Ｃ－ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＥｐｈＡ２、ＡＤＡＭ１７、１７－Ａ１、ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ、ＭＣＳＰ、ＬＧＲ５、ＳＳＥＡ３、ＳＬＣ３４Ａ２、ＢＣＭＡ、ＧＰＮＭＢまたはＧｌｙｐｉｃａｎ－３であり得る。

【0069】

「ベクター」という用語は、それが連結している別のポリヌクレオチドを輸送できるポリヌクレオチド分子を指す。ベクターの一つの種類は、「プラスミド」であり、これは、環状の二本鎖ＤＮＡ環を指し、ここで、追加のＤＮＡセグメントに連結されることができる。ベクターの別の種類は、ウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムに連結されることができる。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入された後に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製されることができる。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。通常、組換えＤＮＡ技術で有用である発現ベクターは、通常、プラスミドの形態である。本発明は、三機能性融合タンパク質をコードすることができる核酸断片を含むベクターを提供することができる。

【0070】

「ＩＬ－１５」および「ＩＬ－１５Ｒａ」という用語は、その突然変異体または断片を指してもよい。本発明に記載の「ＩＬ－１５」は、任意のＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαに結合できる突然変異体、例えば、ヒトＩＬ－１５または非ヒト哺乳動物もしくは非哺乳動物のＩＬ－１５であり得る。例示的な非ヒト哺乳動物としては、ブタ、ウサギ、サル、オランウータン、マウス等、例えばニワトリ等の非哺乳動物が挙げられ、好ましくは、ヒトのＩＬ－１５が挙げられる。「ＩＬ－１５Ｒαに結合できる突然変異体」という用語は、ＩＬ－１５とその受容体との間の親和性を増加または減少させる、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞の刺激におけるその活性を増加または減少させる、一つまたは複数のアミノ酸の置換、増加または欠失によって突然変異が得られる突然変異体分子を指す。

【0071】

本発明に記載の「ＩＬ－１５Ｒα」は、任意の種のＩＬ－１５ＲαまたはＩＬ－１５Ｒαに結合できる突然変異体、例えば、ヒトＩＬ－１５Ｒαまたは非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５Ｒαもしくは非哺乳動物ＩＬ－１５Ｒαであり得る。例示的な非ヒト哺乳動物としては、ブタ、ウサギ、サル、オランウータン、マウス等、例えばニワトリ等の非哺乳動物が挙げられる。好ましくは、ヒトのＩＬ－１５Ｒα、より好ましくは、ＩＬ－１５ＲαＥＣＤと呼ばれるヒトＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン断片である（データベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、登録番号Ｑ１３２６１、３１－２０５ａａ）。「ＩＬ－１５Ｒαに結合できる突然変異体」という用語は、ＩＬ－１５Ｒα上の一つまたは複数のアミノ酸欠失、挿入または置換突然変異によって形成され、ＩＬ－１５等のそのリガンド分子に結合する能力を有する機能性突然変異体を指し、好ましくはヒトＩＬ－１５Ｒα分子、より好ましくはヒトＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン断片の短縮型であり、即ち、細胞外ドメイン断片のＣ末端から一つまたは複数のアミノ酸を欠失突然変異により得られる、ヒトＩＬ－１５受容体α活性を有する分子、好ましくは６５～１７８アミノ酸の欠失突然変異形態を保持する分子、例えばＩＬ－１５Ｒαである。ＩＬ－１５タンパク質自体は、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質と複合する場合ほど安定ではない。当技術分野で知られているように、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、「ｓｕｓｈｉドメイン」を含み、それは、ＩＬ－１５結合活性を保持する受容体の最も短い領域、または９０％以上の結合活性を保持できる細胞外領域の一つのドメインである。

【0072】

ＣＳ１（ＣＤ３１９とも呼ばれ、ＳＬＡＭＦ７）は、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーのメンバー７であり、ＮＫ細胞の免疫機能を調節する表面受容体タンパク質である。ＣＳ１は、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株で高度に発現するが、健康な組織、原発性腫瘍組織または血液がんおよび非血液がん細胞株には見出されないため、当該疾患を治療するための魅力的な標的となっている。

【0073】

ＣＤ３３は、６７ｋＤの１回膜貫通糖タンパク質であり、且つシアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃｓ）ファミリーのメンバーである。その正確な生物学的機能は不明であるが、正常な人では、主に骨髄系分化抗原と考えられており、骨髄前駆細胞、好中球およびマクロファージでは、発現が低く、循環単球および樹状細胞では高度に発現する。重要なことは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の８５％～９０％の芽球および白血病幹細胞でＣＤ３３が検出されていることである。興味深いことに、ＣＤ３３の発現は、造血細胞に限定されているが（Ｐａｕｌ、Ｔａｙｌｏｒ、ＳｔａｎｓｂｕｒｙおよびＭｃＶｉｃａｒ、２０００年、Ｕｌｙａｎｏｖａ、Ｂｌａｓｉｏｌｉ、Ｗｏｏｄｆｏｒｄ－ＴｈｏｍａｓおよびＴｈｏｍａｓ、１９９９年）、正常な造血細胞には存在しない（Ａｎｄｒｅｗｓ、Ｔｏｒｏｋ－ＳｔｏｒｂおよびＢｅｒｎｓｔｅｉｎ、１９８３年、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｌｉｎｃｈ、Ｓａｂｂａｔｈ、ＬａｒｃｏｍおよびＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ、１９８４、Ｊｉｌａｎｉら、２００２年）。これらの発見は、ＣＤ３３がＡＭＬにおける抗体ベースの治療法の適切な標的であることを示唆する。

【0074】

ＣＤ３８抗原は、１９８０年に発見され、大きさが４６ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ３８のリガンドは、ＣＤ３１であり、ＰＥＣＡＭ－１とも呼ばれ、それは、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ３１は、内皮細胞上の発現に加えて、リンパ系細胞（ザカＢ細胞および形質細胞）、肺（肺胞管、肺胞およびリンパ管）および腎臓（糸球体細胞）でも発現する。ＣＤ３８は、リガンドＣＤ３１と相互作用し、細胞遊走、受容体媒介性接着およびシグナル伝達の調節において重要な役割を果たす。さらに、ＣＤ３８タンパク質は、シクラーゼおよび加水分解酵素活性の両方を有する二機能性細胞外酵素でもあり、ヌクレオチド代謝に関与する。ＣＤ３８は、ＮＡＤ＋を基質として使用して環状ＡＤＰリボース（ｃＡＤＰＲ）およびＡＤＰＲを形成し、これらのヌクレオチド代謝産物は、効果的な第２のメッセンジャーであり、細胞質内のカルシウムイオンの動員を調節し、リンパ球の増殖、膵臓Ｂ細胞の分泌によるインスリン等の様々な生物学的プロセスを制御するシグナル伝達経路を活性化する。研究では、ＣＤ３８依存性アデノシン産生は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性免疫阻害において重要な役割を果たしていることが示される。通常、ＣＤ３８は、正常なリンパ系細胞、骨髄系細胞、および非造血細胞では低レベルで発現しているが、造血起源の細胞（コミットされる幹細胞を含む）で広く発現される。ＣＤ３８は、Ｂ細胞で発現され、形質細胞（エフェクターＢ細胞とも呼ばれる）でＣＤ３８の発現レベルが高くなる。ＣＤ３８の発現は、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例えば、漸新世エリテマトーデス）、２型糖尿病、骨粗鬆症および癌を含む様々な疾患に関連する。研究によると、ＣＤ３８は、多くの悪性血液がん、特に多発性骨髄腫等の癌で高度に発言していることが判明され、このため、ＣＤ３８は、多発性骨髄腫に対する治療性抗体薬物の開発のターゲットポイントとなっている。

【0075】

「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互相から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣを含むが、これらに限定されない。「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」とは、細胞媒介性応答を意味し、ここで、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞は、標的細胞上に結合した抗体を識別し、その後標的細胞の溶解を引き起こす。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａの結合に関連しており、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、ＡＤＣＣ活性が増加する。本明細書で議論されるように、本発明の多くの実施例は、ＡＤＣＣ活性を完全に除去する。「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞媒介性食作用とは、細胞媒介性応答を意味し、ここで、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞は、標的細胞上に結合する抗体を識別し、その後標的細胞の食作用を引き起こす。

【0076】

タンパク質配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列を整列させ、且つ必要の場合ギャップを導入した後、配列同一性の一部として保存的置換を考慮せず、特定（親）の配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。いくつかの実施例において、二つまたはそれ以上のアミノ酸配列は、少なくとも８０％、８５％または９０％同一である。いくつかの実施例において、二つまたはそれ以上のアミノ酸配列は、少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％同一である。

【0077】

「第１の」および「第２の」という用語は、説明の目的でのみ使用されており、その重要性の程度を示したり暗示したりするものではない。
本発明の抗原ターゲティング、抗ＣＤ１６Ａおよび免疫エフェクター細胞活性化の三機能性融合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに特異的に結合するＣＤ１６Ａ結合領域、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合するＴＡＡ結合領域、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとの結合によって形成されるＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体、ならびにＦｃドメインを含む。本発明のＴＡＡ／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質は、治療効果を発揮し、主に腫瘍細胞上に発現する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）およびＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａを同時に結合することにより、この二つの細胞を架橋して免疫シナプスを形成し、ＮＫ細胞による腫瘍細胞の殺傷を促進し、同時にＩＬ－１５は、ＮＫ細胞の機能を拡張および維持する。

【0078】

本発明の三機能性融合タンパク質の構造形態は、図１～図９を参照することができる。融合タンパク質は、四つのペプチド鎖が融合して形成され、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は、第１の単量体を形成し（図の左側）、第３のペプチド鎖および第４のペプチド鎖は、第２の単量体を形成する（図の右側）。第１のペプチド鎖は、ＶＬドメインとＣＬドメインとの融合によって形成される軽鎖を含み、第２のペプチド鎖は、ＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと第１のＦｃ鎖との融合によって形成される重鎖を含み、第１のペプチド鎖のＶＬドメインおよびＣＬドメイン、ならびに前記第２のペプチド鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインは、対になってＦａｂ断片を形成する。第３のペプチド鎖は、抗体可変領域、サイトカインおよび第２のＦｃ鎖を含み、第４のペプチド鎖は、抗体可変領域、サイトカインを含む。第３のペプチド鎖の抗体可変領域および前記第４のペプチド鎖の抗体可変領域は、対になってＦｖ断片を形成し、第３のペプチド鎖のサイトカインおよび前記第４のペプチド鎖のサイトカインは、結合して前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体を形成する。

【0079】

図１～図８に示される融合タンパク質において、第１の単量体におけるＦａｂ断片は、ＴＡＡを標的とし、図中のＴＡＡ抗体の機能を実現する。第２の単量体において、対になってＦｖ断片を形成する抗体可変領域は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインから選択され、例えば、第３のペプチド鎖における抗体可変領域は、ＣＤ１６Ａを標的とするＶＨドメインから選択され、第４のペプチド鎖の抗体可変領域は、ＣＤ１６Ａを標的とするＶＬドメインから選択され、ＶＨおよびＶＬは、対になってＣＤ１６Ａを標的とするＦｖ断片を形成し、図中の抗ＣＤ１６Ａ抗体（Ａｎｔｉ－ＣＤ１６Ａ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の機能を実現する。別の実施例において、第３のペプチド鎖における抗体可変領域は、ＣＤ１６Ａを標的とするＶＬドメインであり、第４のペプチド鎖における抗体可変領域は、ＣＤ１６Ａを標的とするＶＨドメインである。図中のＶＨ（Ｌ）は、ＶＨまたはＶＬの選択を表わす。図中の「ＶＨ（Ｌ）１」、「ＶＬ（Ｈ）１」、「ＶＨ２」、「ＶＬ２」の数字は、説明のみを目的としており、異なる抗原を標的とする抗体可変領域を表わす。ＶＨ（Ｌ）１は、ＶＨ１またはＶＬ１を選択できることを表わし、第３のペプチド鎖の抗体可変領域がＶＨ１である場合、第４のペプチド鎖の抗体可変領域は、ＶＬ１である必要があり、それにより対になってＦｖ断片を形成できる。第３のペプチド鎖および第４のペプチド鎖におけるサイトカインは、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαから選択され、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体（ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する。いくつかの実施例において、第３のペプチド鎖におけるサイトカインは、ＩＬ－１５であり、第４のペプチド鎖におけるサイトカインは、ＩＬ－１５Ｒαである。逆に、いくつかの実施例において、第３のペプチド鎖は、ＩＬ－１５Ｒαであり、第４のペプチド鎖は、ＩＬ－１５である。

【0080】

第３のペプチド鎖および第４のペプチド鎖において、抗体可変領域（ＶＨまたはＶＬ）とサイトカインとの融合順序を限定しない。例えば、図１に示される融合タンパク質において、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記第３のペプチド鎖の融合順序は、抗体可変領域～サイトカイン～第２のＦｃ鎖であり、第４のペプチド鎖の融合順序は、抗体可変領域～サイトカインであり、「～」は、連結断片を表わす。図２に示される融合タンパク質と図１との違いは、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、第４のペプチド鎖の融合順序は、サイトカイン～抗体可変領域である。図１～図８における球状および三日月形は、異なるサイトカインを表わし、以下で、球状は、ＩＬ－１５を表わし、三日月形は、ＩＬ－１５Ｒａを表わすものと仮定する。ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、図１～図８に示される融合タンパク質の第３のペプチド鎖および第４のペプチド鎖の可能な組み合わせ形態の例は、次のとおりである。

【0081】

【表7】

【0082】

図９に示される融合タンパク質において、その第１の単量体（図中の左側部分）のＦａｂ断片は、ＣＤ１６Ａを標的とし、図中の抗ＣＤ１６Ａ抗体の機能を実現する。Ｆｖ断片は、ＴＡＡを標的とし、図中の抗ＴＡＡ抗体の機能を実現する。図１～図８に示される融合タンパク質と同様に、図９に示される融合タンパク質も、表１に列挙した第３のペプチド鎖および第４のペプチド鎖の様々な可能な組み合わせ形態を有することができる。

【0083】

本発明によって提供される革新的構造タンパク質の複合ユニットについては、図１に示される融合タンパク質の第２の単量体の上部、即ち、抗ＣＤ１６ＡのＦｖ断片とＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体とが融合した領域を参照することができる。複合ユニットは、二つの抗体可変領域（抗ＣＤ１６ＡのＶＨおよびＶＬ）、二つのサイトカイン（ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒａ）、若干の連結断片を含む。抗体可変領域は、連結断片を介してサイトカインに融合される。二つの抗体可変領域が対になってＦｖ断片を形成し、二つのサイトカインが結合してＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒ複合体を形成する。抗ＣＤ１６ＡのＶＨドメインとＶＬドメインとの間、および／またはＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間には、好ましくは、１対以上のジスルフィド結合を有し、それによってより安定な構造を形成する。ＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合を設定することができ、ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間にジスルフィド結合を設定しないことができ、ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間にジスルフィド結合を設定することができ、ＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合を設定しないことができ、または、ＶＨとＶＬとの間、およびＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間の両方にジスルフィド結合を設定することができる。本発明によって提供される複合ユニットを利用して、当業者は、本発明の実施例に示される融合タンパク質の形態に限定されることなく、他の標的タンパク質を構築することができる。

【0084】

サイトカインＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒａとの間には、超高親和性（ＫＤ約３０～１００ｐＭ）を有し、本発明は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒａを使用して、抗体構造の一つにおけるＣＬおよびＣＨ１ドメインをそれぞれ置換して、二重特異性抗体の軽鎖の不一致の問題を解決し、ＦＣヘテロ二量体形態の重鎖の不一致の問題を解決することができる。いくつかの実施例において、Ｆａｂを有するＦＣ末端は、プロテインＡに結合できないように突然変異される。ＦＣ末端に結合するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびＣＨ１ドメインに結合するＣＨ１－ＸＬアフィニティークロマトグラフィーの２段階を通じて、二重特異性ターゲティング抗体を精製する。

【0085】

実施例１：ＴＡＡ／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質の取得、分子クローニング、一過性発現、およびタンパク質の精製
分子クローニング：この実施例では、以下の表に従って複数の融合タンパク質を構築し、ＴＡＡは、それぞれＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＳ１を選択する。タンパク質の発現および配列番号は、以下の表に示されたとおりである。

【0086】

【表8】

【0087】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１の配列は、次のとおりである。

【0088】

【化1】

ここで、点線で示す配列は、抗ＣＤ１６ＡのＶＬであり、波線で示す配列は、ＩＬ－１５である。

【0089】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０２の配列は、次のとおりである。

【0090】

【化2】

ここで、点線で示す配列は、抗ＣＤ１６ＡのＶＨであり、波線で示す配列は、ＩＬ－１５Ｒａであり、二重下線は、Ｆｃ（Ｋｎｏｂ突然変異）である。

【0091】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３の配列は、次のとおりである。

【0092】

【化3】

ここで、下線以外の部分は、抗ＣＤ３３の軽鎖配列であり、点線で示す配列は、ＶＬである。

【0093】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０４の配列は、次のとおりである。

【0094】

【化4】

ここで、下線以外の部分は、抗ＣＤ３３の重鎖配列であり、点線で示す配列は、ＶＨである。

【0095】

次のような配列をさらに提供する。
抗ＣＤ１６Ａ ＶＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８
ＳＹＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＴＩＳＣＧＧＨＮＩＧＳＫＮＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＮＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＮＹＳＶＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
抗ＣＤ１６Ａ ＶＨ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＡＹＹＹＤＦＡＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗ＣＤ３８ ＶＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
抗ＣＤ３８ ＶＨ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＮＳＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＤＫＩＬＷＦＧＥＰＶＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗ＣＳ１ ＶＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
抗ＣＳ１ ＶＨ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤＫＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＰＤＧＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗ＣＤ３３ ＶＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＴＶＳＬＧＥＲＴＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＤＳＳＴＮＫＮＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＬＳＷＡＳＴＲＥＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＤＳＰＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＱＱＳＡＨＦＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
抗ＣＤ３３ ＶＨ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＫＦＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＩＲＮＬＧＧＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＳＷＳＤＧＹＹＶＹＦＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
ＩＬ－１５ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
ＩＬ－１５（Ｌ５２Ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＣＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
ＩＬ－１５Ｒａ ＥＣＤＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＴＶＴＴＡＧＶＴＰＱＰＥＳＬＳＰＳＧＫＥＰＡＡＳＳＰＳＳＮＮＴＡＡＴＴＡＡＩＶＰＧＳＱＬＭＰＳＫＳＰＳＴＧＴＴＥＩＳＳＨＥＳＳＨＧＴＰＳＱＴＴＡＫＮＷＥＬＴＡＳＡＳＨＱＰＰＧＶＹＰＱＧＨＳＤＴＴ
ＩＬ－１５Ｒａ Ｓｕｓｈｉ ６５ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ
ＩＬ－１５Ｒａ Ｓｕｓｈｉ ７３ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲ
ＩＬ－１５Ｒａ Ｓｕｓｈｉ ７７ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ
ＩＬ－１５Ｒａ Ｓｕｓｈｉ ８６ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＴＶＴＴＡＧＶＴ
ＩＬ－１５Ｒａ Ｓｕｓｈｉ １０２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＴＶＴＴＡＧＶＴＰＱＰＥＳＬＳＰＳＧＫＥＰＡＡＳ
ＩＬ－１５Ｒａ－ｓｕｓｈｉ（Ｓ４０Ｃ）： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＣＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ。

【0096】

上記ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒａの配列は、すべて、本発明の融合タンパク質を構築するために使用されることができる。
表３に示されるように、対照抗体抗ＣＤ１６ａ抗体、抗ＣＤ３３抗体、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ＴＡＡ／ＣＤ１６Ａ二重抗体を設計および構築し、特許文献ＵＳ２０２００１４８７３７Ａ１に基づいてＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５対照分子ＧＴＢ－３５５０等の分子を構築する。

【0097】

【表9】

【0098】

標的分子の一過性発現：
ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞をＦｏｒｔｉＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１１４８３０１）に接種し、８ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘをさらに加え、３７℃、１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ_２で培養する。トランスフェクションの前日に、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞密度を３×１０Ｅ６／ｍＬに調整し、シェーカーに入れ、３７℃、１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ_２で培養し、トランスフェクション当日、サンプルを採取し、計数し、細胞密度を６×１０Ｅ６／ｍｌに希釈し、各ボトルは、４０ｍＬであり、１２５ｍｌの振とうフラスコに入れ、２０μｇの同時トランスフェクションした各プラスミドを４．８ｍＬのＯｐｔｉ ＭＥＭと混合し、１２０μｌのＰｏｌｙｐｌｕｓ－ＦｅｃｔｏＰＲＯトランスフェクション試薬を加え、ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬を均一に混合した後、室温で１０分間放置し、混合物を細胞にゆっくりと入れ、均一に混合した後、シェーカーに入れて培養する。培養中に、１、４、６、８日目にそれぞれ２ｍＬのＦｅｅｄ ＰＦＦ０５（ＯＰＭ、Ｆ８１２７９－００１）および１ｍＬの３０％グルコース溶液をボトルに追加する。トランスフェクションの初日、温度を３２℃に冷却し、ＣＯ_２濃度を５％に下げる。１３日目にサンプルを収集し、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を取り、精製する準備をする。

【0099】

融合タンパク質の精製：
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製
平衡溶液をカラムに通し、少なくとも３ＣＶ、実際の体積２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致するように確保し、流速１ｍｌ／ｍｉｎであり、遠心分離後の培養液の上清をカラムに通し、４０ｍｌのサンプルをロードし、流速０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、平衡溶液をカラムに通し、少なくとも３ＣＶ、実際の体積２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致するように確保し、流速０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、溶離液をカラムに通し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに上昇した時点で溶出ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに低下した時点で収集を停止し、流速１ｍｌ／ｍｉｎである。サンプル収集終了後、ｐＨ調節液でＰＡＣ－ＥＰを中性に調整する。

【0100】

ＣＨ１－ＸＬアフィニティークロマトグラフィー
プロテインＡで処理したサンプルを８０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、平衡溶液をカラムに通し、少なくとも３ＣＶ、実際の体積２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致するように確保し、流速１ｍｌ／ｍｉｎであり、遠心分離した上清をサンプルループにかけてカラムに通し、流速０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、平衡溶液をカラムに通し、少なくとも３ＣＶ、実際の体積２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致するように確保し、流速０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、溶離液をカラムに通し、ＵＶ２８０が１０ｍＡＵに上昇した時点で溶出ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１０ｍＡＵに低下した時点で収集を停止し、流速１ｍｌ／ｍｉｎである。サンプル収集終了後、ｐＨ調節液でＣＨ１－ＥＰを中性に調整する。

【0101】

実施例２：ＣＤ３３に天然に発現するＨＬ６０細胞に結合するＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質のＦＡＣＳ検出
実験目的：ヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０細胞は、ＣＤ３３を天然に発現し、本発明は、ＦＡＣＳを使用して、ＣＤ３３を天然に発現するＨＬ６０細胞へのＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質の結合を検出する。

【0102】

実験方法：ＨＬ６０細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養し、トリプシン消化により細胞を収集し、ウェルあたり１０００００個の細胞を９６ウェルプレートに接種し、２％ＦＢＳ／ＰＢＳを用いて氷上で１時間ブロッキングし、異なる濃度の三機能性タンパク質および対照タンパク質をインキュベートし、氷上で１時間保持し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ（１：２００）をインキュベートして希釈し、ＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬのＰＢＳで再懸濁し、ＦＡＣＳによって平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。結果は、図１０に示されたとおりであり、ＣＤ３３抗体ＩｇＧ１ｗｔサブタイプＱＰ４１１５４１１６、ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質ＱＰ７４３７４５（ＦＣ野生型）、ＱＰ４３３９４３４０（ＦＣは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異除去機能を実行する）、ＱＰ４２９１４２８５（ＦＣは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異除去機能を実行する）、ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体ＱＰ４１１５７７７７７８（ＦＣ野生型）、ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体ＱＰ４１１５４３６７４３６８（ＦＣは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異除去機能を実行する）およびＣＤ３３抗体ＩｇＧ１ｗｔサブタイプＱＰ４１１５４１１６は、すべてＣＤ３３を天然に発現するＨＬ６０細胞に結合する。

【0103】

実施例３：ＣＤ３８を天然に発現するＤａｕｄｉ細胞に結合するＣＤ３８／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質のＦＡＣＳ検出
実験目的：ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫細胞Ｄａｕｄｉ細胞は、ＣＤ３８を天然に発現し、本発明は、ＦＡＣＳを使用して、ＣＤ３８を天然に発現するＤａｕｄｉ細胞に結合するＣＤ３８／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質を検出する。

【0104】

実験方法：Ｄａｕｄｉ細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養し、トリプシン消化により細胞を収集し、ウェルあたり１０００００の細胞を９６ウェルプレートに接種し、２％ＦＢＳ／ＰＢＳを用いて氷上で１時間ブロッキングし、異なる濃度の三機能性タンパク質および対照タンパク質をインキュベートし、氷上で１時間保持し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ（１：２００）をインキュベートして希釈し、ＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬのＰＢＳで再懸濁し、ＦＡＣＳによって平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。結果は、図１１に示されたとおりであり、ＣＤ３８抗体ＩｇＧ１ｗｔサブタイプＱＰ３４５０３４５１、ＣＤ３８／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質ＱＰ４３３９４３４１（ＦＣは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異除去機能を実行する）は、ＣＤ３８を天然に発現するＤａｕｄｉ細胞に濃度依存的に結合する。

【0105】

実施例４：ＣＳ１に対するＣＳ１／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質結合活性のＥＬＩＳＡ検出
検出試薬：牛乳（ＢＤ、２３２１００）、ＰＢＳ（Ｓａｎｇｏｎ、Ｂ５４８１１７－０５００）、ＨＲＰ－抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０８８）、ＴＭＢ（Ｌｕｏｙａｎｇ Ｂａｉａｏｔｏｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃ０６０２０１）、Ｅｌｉｓａプレート（ｃｏｓｔａ、９０１８）１×ＰＢＳ緩衝液、８．００ｇのＮａＣｌ、０．２０ｇのＫＣｌ、２．９ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２０、０．２ｇのＫＨ_２ＰＯ_４を秤量して８００ｍＬのｄｄＨ_２Ｏに溶解し、十分に溶解した後に１Ｌに定容し、ｐＨを７．４に調節し、高温で滅菌した後で備蓄する。または市販の１０×、２０×のＰＢＳ溶液を購入して１×ＰＢＳ緩衝液に希釈して使用する。ブロッキング溶液：５ｇの牛乳をＰＢＳに秤量し、ブロッキング溶液を調製してすぐに使用する必要がある。停止溶液（１ｍｏｌ／ＬＨ_２ＳＯ_４）：１０９ｍＬの９８％濃Ｈ_２ＳＯ_４を秤量して２０００ｍＬのｄｄＨ_２Ｏにゆっくりと滴下する。ＴＭＢを３７℃で１０分間発色させ、１００μｌ／ウェルでシェーカー（１２０ｒｐｍ）に入れる。

【0106】

実験段階：ＣＳ１－ＦＣ融合タンパク質を１μｇ／ｍｌ、４℃で一晩プレーティングし、ＰＢＳで３回洗浄する。２００μＬ／ウェルに従ってブロッキング溶液５％牛乳を加え、３７℃で１時間インキュベートする。ブロッキング終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、サンプルをインキュベートし、２０μｇ／ｍｌで５倍希釈し、合計七つの勾配で希釈し、最後のウェルを１００倍に希釈し、１００μｌ／ウェルで十分に混合した後、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、酵素標識抗体の添加：ＨＲＰ－抗ヒトＦａｂ抗体を１：５０００の希釈比率で１００μｌ／ウェルでインキュベートし、十分に混合した後、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで６回洗浄する。基質発色溶液の添加：基質発色溶液ＴＭＢを１００μＬ／ウェルの用量で加え、シェーカーに入れ、２００ｒｐｍ、３５℃で暗所で１０分間発色させる。終了：発色終了後、１００μＬ／ウェルの用量で停止溶液を速やかに反応を終了させる。検出：マイクロプレートリーダー上でＡ４５０ｎｍでのＯＤ値を測定し、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。結果は、図１２に示されたとおりであり、ＣＳ１／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質ＱＰ７４３４２６２（ＦＣ野生型）、ＱＰ４３３９４３４２（ＦＣは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異除去機能を実行する）は、すべてＣＳ１タンパク質に濃度依存的に結合することを示す。

【0107】

実施例５：Ｍｏ７ｅ細胞増殖実験
Ｍｏ７ｅ（ヒト巨細胞性白血病細胞株）細胞は、ＩＬ－１５Ｒβγを発現し、サイトカイン依存性成長細胞である。研究では、休止期ＮＫおよびナイーブＴ細胞は、中程度の親和性ＩＬ－１５Ｒβγ表現型を発現することが示され、Ｍｏ７ｅ（ＩＬ－１５Ｒβγ）細胞増殖実験におけるサイトカインＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａの結果は、刺激されていないＰＢＭＣでの増殖実験と一致する（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ、１１（６）Ｊｕｎｅ２０１２）。本発明は、Ｍｏ７ｅ細胞増殖実験を利用して、多機能性融合タンパク質ＩＬ－１５活性を評価し、方法および結果は、次のとおりである。

【0108】

実験試薬：Ｍｏ７ｅ細胞（ヒト巨細胞性白血病細胞株）は、中国医学アカデミー基礎医学研究所の細胞リソースセンターから購入され、細胞増殖および毒性検出キット（ＣＣＫ－８）は、ＭｅｉｌｕｎＢｉｏから購入され、製品番号ＭＡ０２１８、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、ｐｅｒｐｒｏｔｅｃｈから購入され、製品番号３００－０３、ヒトＩｇＧは、Ｓｉｇｍａから購入され、製品番号Ｉ４５０６、他の抗体は、内部で調製される。

【0109】

実験方法：Ｍｏ７ｅ細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび８ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地を使用して、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養され、Ｍｏ７ｅ細胞を収集し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、ＧＭ－ＣＳＦを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を２回洗浄し、ＧＭ－ＣＳＦを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を再懸濁し、且つ計数し、２×１０４個の細胞を８０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１時間培養し、試験する各薬用培地を４倍勾配希釈した後、ウェルあたり２０μｌを細胞懸濁液と均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで３日間培養し、試験する９６ウェルプレートにウェルあたり１０μｌのＣＣＫ－８試薬を加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４時間インキュベートし、９６ウェルプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍでの吸光度を検出する。

【0110】

図１３、図１４、図１５の結果は、ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５、ＣＤ３８／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５、ＣＳ１／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質は、すべてＭＯ７Ｅ細胞の増殖を促進することができることを示し、本発明の三機能性融合タンパク質分子形態タンパク質がすべてＩＬ－１５生物活性を有することを証明する。

【0111】

実施例６：ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質媒介性ＡＤＣＣの効果
実験目的：ＡＤＣＣ実験を通じてＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質を検出する。

【0112】

実験材料：ＰＢＭＣは、ＳａｉｌｙＢｉｏから購入され、ＨＬ６０細胞は、中国科学院Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから購入され、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６ 非放射性細胞毒性実験検出キットは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｇ１７８０）から購入される。

【0113】

実験段階：ＰＢＭＣを蘇生させ、翌日使用するために細胞を収集する。標的細胞の準備：ＨＬ６０をトリプシンで１０００ｒｐｍで５分間消化する。ＰＢＳで２回洗浄した後、９６ウェルプレートに２００００細胞／ウェル、５０μｌ／ウェルでプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートする。抗体の準備：抗体を培地（１０％低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）で八つの濃度に勾配希釈する。上記で希釈した各濃度の抗体を各ウェルに５０μｌ加え、３７℃で１５分間インキュベートする。ＰＢＭＣの準備：初日に蘇生したＰＢＭＣを遠心分離し、培地（１０％低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）で再懸濁し、計数する。ＰＢＭＣ：標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）＝２０：１または１０：１に従って、上記のウェルプレートにウェルあたり５０μｌを加え、３７℃で４時間インキュベートする。ＬＤＨ検出：最大放出群および体積補正群の場合、４５分前に１０μｌの溶解溶液を加え、引き続きインキュベーターで培養する。４時間培養した後、５０μｌの上清をマイクロプレートにピペットで移し、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６非放射性細胞毒性実験検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）の指示に従って、５０μｌの試薬を加える。室温暗所で３０分間反応させた後、５０μｌの停止溶液を加える。４９０ｎｍでの吸光度を読み取る（停止溶液を添加完了後に１時間以内に読み取りを完了する）。計算：殺傷率＝（サンプル放出－標的細胞の自然放出－エフェクター細胞の自然放出）／（標的細胞の最大放出－標的細胞の自然放出）×１００。自然放出（抗体の非存在下でエフェクター細胞とインキュベートされる標的細胞に相当する）を０％細胞毒性として定義し、最大放出（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で溶解した標的細胞）を１００％細胞毒性として定義する。

【0114】

図１６、図１７は、エフェクター：ターゲット比が１０：１の場合の結果を示し、図１８は、エフェクター：ターゲット比が２０：１の場合の結果を示す。その結果：ＣＤ３３抗体ＩｇＧ１ｗｔサブタイプＱＰ４１１５４１１６が、ＣＤ３３を天然に発現するＨＬ６０細胞の濃度依存的にＮＫ細胞殺傷を引き起こし、ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質ＱＰ７４３７４５（ＦＣ野生型）、ＱＰ４３３９４３４０（ＦＣは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異除去機能を実行する）、ＱＰ４２９１４２８５（ＦＣは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異除去機能を実行する）、ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体ＱＰ４１１５７７７７７８（ＦＣ野生型）、ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体ＱＰ４１１５４３６７４３６８（ＦＣは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異除去機能を実行する）は、ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質対照分子ＧＴ－３５５０（ＱＰ８７７）およびＣＤ３３抗体ＩｇＧ１ｗｔサブタイプＱＰ４１１５４１１６よりも、ＮＫ細胞によるＨＬ６０細胞の殺傷を高める。ＣＤ１６Ａモノクローナル抗体ＱＰ４３３５４３３６およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ－ＦＣ融合タンパク質ＱＰ３３１２３３１３の両方は、ＡＤＣＣ効果を有さない。

【0115】

実施例７：ＣＤ３８／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質媒介性ＡＤＣＣの効果
実験目的：ＡＤＣＣ実験を通じてＣＤ３８／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質を検出する。

【0116】

実験材料：ＰＢＭＣは、ＳａｉｌｙＢｉｏから購入され、Ｄａｕｄｉ細胞は、中国科学院Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから購入され、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６非放射性細胞毒性実験検出キットは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｇ１７８０）から購入される。

【0117】

実験段階：ＰＢＭＣを蘇生させ、翌日使用するために細胞を収集する。標的細胞の準備：Ｄａｕｄｉ細胞をトリプシンで１０００ｒｐｍで５分間消化する。ＰＢＳで２回洗浄した後、９６ウェルプレートに２００００細胞／ウェル、５０μｌ／ウェルでプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートする。抗体の準備：抗体を培地（１０％低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）で八つの濃度に勾配希釈する。上記で希釈した各濃度の抗体を各ウェルに５０μｌ加え、３７℃で１５分間インキュベートする。ＰＢＭＣの準備：初日に蘇生したＰＢＭＣを遠心分離し、培地（１０％低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）で再懸濁し、計数する。ＰＢＭＣ：標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）＝１０：１または５：１に従って、上記のウェルプレートにウェルあたり５０μｌを加え、３７℃で４時間インキュベートする。ＬＤＨ検出：最大放出群および体積補正群の場合、４５分前に１０μｌの溶解溶液を加え、引き続きインキュベーターで培養する。４時間培養した後、５０μｌの上清をマイクロプレートにピペットで移し、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６非放射性細胞毒性実験検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）の指示に従って、５０μｌの試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）を加える。室温暗所で３０分間反応させた後、５０μｌの停止溶液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加える。４９０ｎｍでの吸光度を読み取る（停止溶液を添加完了後に１時間以内に読み取りを完了する）。計算：殺傷率＝（サンプル放出－標的細胞の自然放出－エフェクター細胞の自然放出）／（標的細胞の最大放出－標的細胞の自然放出）×１００。自然放出（抗体の非存在下でエフェクター細胞とインキュベートされる標的細胞に相当する）を０％細胞毒性として定義し、最大放出（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で溶解した標的細胞）を１００％細胞毒性として定義する。

【0118】

図１９は、エフェクター：ターゲット比が１０：１の場合の結果を示し、図２０は、エフェクター：ターゲット比５：１の場合の結果を示し、図面に示されるように、異なるエフェクター：ターゲット比かで、ＣＤ３８抗体ＩｇＧ１ｗｔサブタイプＱＰ３４５０３４５１は、ＣＤ３８を天然に発現するＤａｕｄｉ細胞の濃度依存的にＮＫ細胞殺傷を引き起こし、ＣＤ３８／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質ＱＰ４３３９４３４１（ＦＣは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異除去機能を実行する）は、ＣＤ３８抗体ＩｇＧ１ｗｔサブタイプＱＰ３４５０３４５１よりもＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ細胞の殺傷を高める。ＣＤ１６Ａモノクローナル抗体ＱＰ４３３５４３３６およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ－ＦＣ融合タンパク質ＱＰ３３１２３３１３の両方は、ＡＤＣＣ効果を有さない。

【0119】

実施例８：ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質媒介性ＡＤＣＰ
健康な人の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単球を分離し、５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＭ－ＣＳＦ（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ－ＣＳＦ）を加え、マクロファージへの分化を誘導する。ＨＬ６０細胞を緑色蛍光ＣＦＳＥで標識し、ＨＬ６０細胞とマクロファージとを２：１の比率で９６ウェルプレートに接種し、異なる濃度の検出対象タンパク質を加える。３７℃で２時間インキュベートした後、反応を停止させ、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体をインキュベートし、ＦＡＣＳによって読み取り、抗体の各濃度下でのＡＰＣ／ＦＩＴＣ二重陽性細胞のパーセント、貪食作用を受けたマクロファージの割合を取得する。

【0120】

結果は、図２１に示されたとおりであり、ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質ＱＰ７４３７４５（ＦＣ野生型）およびＱＰ４３３９４３４０（ＦＣは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異除去機能を実行する）の両方は、マクロファージに濃度依存的にＨＬ６０細胞を貪食させる。ＣＤ３３／ＣＤ１６Ａ／ＩＬ－１５三機能性融合タンパク質対照分子ＧＴ－３５５０（ＱＰ８７７）は、ＡＤＣＰエフェクターを有さない。

【0121】

本発明の内容を上記の好ましい実施形態を通じて詳細に説明したが、本発明は上記の説明に限定されるものでないことを理解されたい。当業者であれば、上記の内容を読めば、本発明に対する様々な修正および変更が明らかとなるであろう。従って、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって限定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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【国際調査報告】