特表 2024-529496 アルツハイマー病を処置するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-06

(54)【発明の名称】アルツハイマー病を処置するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20240730BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240730BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240730BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240730BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00 ZNA

A61K48/00

A61K31/713

A61K31/7105

A61K31/7088

A61K35/76

A61K9/08

A61K9/10

A61K9/06

A61K9/20

A61K9/48

A61P25/28

A61P43/00 105

C12N15/113 Z

C12N15/86 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024505419

(86)(22)【出願日】2022-07-27

(85)【翻訳文提出日】2024-03-29

(86)【国際出願番号】 CN2022108136

(87)【国際公開番号】W WO2023005959

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】63/226,165

(32)【優先日】2021-07-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ

(71)【出願人】

【識別番号】598082547

【氏名又は名称】ザ・ホンコン・ユニバーシティー・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

(71)【出願人】

【識別番号】524163579

【氏名又は名称】ホンコン センター フォー ニュロウディジェナラティヴ ディジージズ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】イップ、ナンシー ユク ユイ

(72)【発明者】

【氏名】フー、キット ユイ

(72)【発明者】

【氏名】イップ、ファニー チョイ ファン

(72)【発明者】

【氏名】チアン、ユアンピン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ、シアオプー

(72)【発明者】

【氏名】オウヤン、リー

(72)【発明者】

【氏名】ワン、ヒウ イー

(72)【発明者】

【氏名】トアン、ヤンヤン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA11

4C076AA22

4C076AA36

4C076AA53

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB25

4C076CC01

4C076CC26

4C084AA13

4C084AA17

4C084MA17

4C084MA23

4C084MA28

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA43

4C084MA52

4C084MA59

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA161

4C084ZB212

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA17

4C086MA23

4C086MA28

4C086MA35

4C086MA37

4C086MA43

4C086MA52

4C086MA59

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA16

4C086ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA17

4C087MA23

4C087MA28

4C087MA35

4C087MA37

4C087MA43

4C087MA52

4C087MA59

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA16

4C087ZB21

(57)【要約】

ｒｓ１９２１６２２及び／又は他の５７４個のｓＳＴ２関連ゲノム部位及び／又はｓＳＴ２遺伝子／転写物の３’－ＵＴＲを含むＩＬ１ＬＲ１遺伝子のゲノム座位を破壊することによる、アルツハイマー病の治療、予防、及び潜在的治癒に有用な新しい組成物及び方法が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アルツハイマー病（ＡＤ）の治療又はＡＤのリスクの低減を必要とする個人においてＡＤを治療するため又はＡＤのリスクを低減するための方法であって、ｒｓ１９２１６２２、並びに／又は表４及び表５に列挙されたそれ以外の５７４個のｓＳＴ２関連遺伝子バリアントのいずれか１個若しくは複数、並びに／又はｓＳＴ２遺伝子／転写物の３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）を包含するゲノム配列を破壊する有効量の組成物を前記個人へと投与する工程を含む、方法。

【請求項2】

前記投与する工程の前に、前記個人のゲノムの少なくとも一部をシーケンシングすることを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記個人が、ＡＰＯＥ－ε４キャリア又は非ＡＰＯＥ－ε４キャリアである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記個人が、女性又は男性である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記個人が、ｒｓ１９２１６２２にＡアレル若しくはＧアレルを有するか、又は前記個人が、表４若しくは表５に示される特定の遺伝子座に少なくとも１つのアレルを有する、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記個人が、ＡＤと診断されているか、又は前記個人が、まだＡＤと診断されていないが、ＡＤの既知のリスク因子を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）を包含する前記ゲノム配列が、ｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）の上流側及び下流側に約３００塩基対、好ましくはｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）の上流側及び下流側に約２５０塩基対、２００塩基対、１５０塩基対、１００塩基対、５０塩基対、３０塩基対、又は２０塩基対の配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記組成物が、ｒｓ１９２１６２２又は前記ｓＳＴ２遺伝子の前記３’－ＵＴＲを包含する前記ゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミニＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記組成物が、スモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼ及びｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）を包含する前記ゲノム配列内の２つの位置を標的とする２つのｓｇＲＮＡをコードする１又は複数のベクターを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記組成物が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び２つのｓｇＲＮＡをコードする１つのベクターを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記１又は複数のベクターが、１又は複数のウイルスベクターである、請求項９又は請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記組成物が、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射によって投与されるか、又は経口投与若しくは経鼻投与によって投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記組成物が、溶液、懸濁液、粉末、ペースト、錠剤、又はカプセルの形態で投与される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

アルツハイマー病（ＡＤ）の治療又はＡＤのリスクの低減を必要とする個人においてＡＤを治療するため又はＡＤのリスクを低減するためのキットであって、ｒｓ１９２１６２２（若しくは表４若しくは表５の別の遺伝子座）又はｓＳＴ２遺伝子の３’－ＵＴＲを包含するゲノム配列を破壊する組成物を含有する容器を含む、キット。

【請求項15】

前記組成物が、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射のために製剤化されているか、又は経口投与若しくは経鼻投与のために製剤化されている、請求項１４に記載のキット。

【請求項16】

前記組成物が、ｒｓ１９２１６２２又は前記ｓＳＴ２遺伝子の前記３’－ＵＴＲを包含する前記ゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミニＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のキット。

【請求項17】

前記組成物が、スモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼ及びｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）を包含する前記ゲノム配列内の２つの位置を標的とする２つのｓｇＲＮＡをコードする１又は複数のベクターを含む、請求項１４に記載のキット。

【請求項18】

前記組成物が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び２つのｓｇＲＮＡをコードする１つのベクターを含む、請求項１７に記載のキット。

【請求項19】

前記個人のゲノムの少なくとも一部をシーケンシングするための薬剤を含有する第２の容器を更に含む、請求項１４に記載のキット。

【請求項20】

前記組成物の投与のための取扱説明を更に含む、請求項１４に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年７月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／２２６，１６５号の優先権の利益を主張し、その内容は、全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

神経変性疾患及び神経炎症性障害などの脳疾患は、集団の大きなサブセットに影響を及ぼす破壊的な状態である。そのような疾患の多くは、不治であり、非常に消耗性であり、しばしば経時的に脳の構造及び機能の進行性の低下をもたらす。高齢者はこれらの状態を発症するリスクが高いので、世界中で高齢化人口が増加していることに起因して、疾患の有病率もまた急速に増加している。現在、多くの神経変性疾患及び神経炎症性障害は、これらの疾患の病態生理学の理解が限られていることに起因して、診断が困難である。一方で、現在の処置は効果がなく、かつ市場の需要を満たさず、人口の高齢化の進行に起因して、需要が毎年大幅に増加している。例えば、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）は、学習及び記憶の漸進的であるが進行性である低下、並びに高齢者の死亡の主な原因によって特徴付けられる。ＡＤの有病率の増加は、より良好かつ早期の診断の必要性及び要求を推進している。Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによると、この疾患は現在、世界中で４６８０万人が罹患しているが、今後３０年間で症例数は３倍になると予測されている。高齢者の人口増加が最も速い国の１つは中国である。人口予測に基づくと、２０３０年までに、４人に１人が６０歳を超えると予測され、その大部分にＡＤを発症するリスクがあろう。実際、中国でのＡＤ症例数は１９９０～２０１０年に３７０万例～９２０万例に倍増し、２０５０年までに２２５０万例になると予測されている。香港の人口もまた急速に高齢化している。６５歳以上の高齢者は、２０２５年までに人口の２４％を占め、２０５０年までに人口の３９．３％を占めるものと推定される。ＡＤ症例数は２０３９年までに３３２，６８８症例までに増加すると予測されている。そのため、この破壊的な状態に罹患しているＡＤ患者を効果的に処置するための新しい方法を開発する緊急の必要性が存在する。本発明は、疾患の効果的な処置に有用であり、かつ潜在的に治癒を提供する新規な組成物及び方法を開示することによって、この必要性及び他の関連する必要性を満たす。

【発明の概要】

【0003】

本出願は、遺伝子操作によるアルツハイマー病の治療的介入の標的として、破壊されると可溶性ＳＴ２（ｓｏｌｕｂｌｅ ＳＴ２：ｓＳＴ２）タンパク質の発現低下をもたらす、ｒｓ１９２１６２２及び／若しくは他の５７４個のｓＳＴ２関連遺伝子バリアント、並びに／又はｓＳＴ２の３’末端（３’）非翻訳領域を含む、遺伝子座位を初めて開示する。したがって、ｒｓ１９２１６２２、他の５７４個のｓＳＴ２関連遺伝子バリアント、又はｓＳＴ２の３’末端（３’）非翻訳領域を包含するゲノム配列の効果の抑制又は排除によってアルツハイマー病を処置するための新しい組成物及び方法が、この発見から考案される。

【0004】

そのため、第１の態様では、本発明は、個人におけるアルツハイマー病を処置する方法、又は個人が後日（later）アルツハイマー病を発症するリスクを低減する方法を提供する。特許請求される方法は、（ｉ）ｒｓ１９２１６２２、並びに／又は（ｉｉ）表４及び表５に列挙されたそれ以外の５７４個のｓＳＴ２関連遺伝子バリアントのいずれか１個若しくは複数、並びに／又は（ｉｉｉ）ｓＳＴ２遺伝子コード配列若しくは転写物の３’－非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲ）を包含するゲノム配列を破壊する、有効量の組成物を個人へと投与する工程を含む。

【0005】

いくつかの実施形態では、特許請求される方法は、投与する工程の前に、個人のゲノムの少なくとも一部をシーケンシングすることを含む。いくつかの実施形態では、個人は、ヘテロ接合体キャリア又はホモ接合体キャリアのいずれかのＡＰＯＥ－ε４キャリアと見なされる。他の場合では、個人は、非ＡＰＯＥ－ε４キャリアである。いくつかの場合では、個人は、女性である。いくつかの場合では、個人は、男性である。いくつかの実施形態では、個人は、ｒｓ１９２１６２２にＡアレルを有する。いくつかの実施形態では、個人は、表４に示される特定の遺伝子座に少なくとも１つのアレルを有する。いくつかの実施形態では、個人は、ＡＤと診断されている。いくつかの実施形態では、個人はまだＡＤと診断されていないが、ＡＤの家族歴などのＡＤの既知のリスク因子を有するか、又はＡＤリスクを増加させることが知られている１若しくは複数の遺伝的アレル（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｌｅｌｅ）を、例えば女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアとして保有している。いくつかの実施形態では、ｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５で命名された別の遺伝子座）を包含するゲノム配列は、ｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）の上流側及び下流側約３００塩基対、好ましくはｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）の上流側及び下流側約２５０塩基対、２００塩基対、１５０塩基対、１００塩基対、５０塩基対、３０塩基対、又は２０塩基対の配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｒｓ１９２１６２２（若しくは表４若しくは表５の別の遺伝子座）又はｓＳＴ２遺伝子の３’－ＵＴＲを包含するゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミニＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、スモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼ及びｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５に列挙した別の遺伝子座）又はｓＳＴ２遺伝子の３’－ＵＴＲを包含するゲノム配列内の２つの位置を標的とする２つのｓｇＲＮＡをコードする１又は複数のベクターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び２つのｓｇＲＮＡをコードする１つのベクターを含む。いくつかの実施形態では、１又は複数のベクターは、１又は複数のウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射によって投与されるか、又は経口投与若しくは経鼻投与によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、溶液、懸濁液、粉末、ペースト、錠剤、又はカプセルの形態で投与される。

【0006】

第２の態様では、本発明は、（ｉ）ｒｓ１９２１６２２、並びに／又は（ｉｉ）表４及び表５に列挙されたそれ以外の５７４個のｓＳＴ２関連遺伝子バリアントのいずれか１個若しくは複数、並びに／又は（ｉｉｉ）ｓＳＴ２遺伝子コード配列若しくは転写物の３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）と、くわえて１若しくは複数の生理学的に許容される添加剤（excipient）とを包含するゲノム配列を破壊する、有効量の１又は複数の薬剤を含む組成物を提供する。

【0007】

いくつかの実施形態では、ｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５で命名された別の遺伝子座）を包含するゲノム配列は、ｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）の上流側及び下流側約３００ｂｐｓ、好ましくはｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）の上流側及び下流側約２５０ｂｐｓ、２００ｂｐｓ、１５０ｂｐｓ、１００ｂｐｓ、５０ｂｐｓ、３０ｂｐｓ、又は２０ｂｐｓの配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｒｓ１９２１６２２（若しくは表４若しくは表５の別の遺伝子座）又はｓＳＴ２遺伝子の３’－ＵＴＲを包含するゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミニＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、スモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼ及びｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５に列挙した別の遺伝子座）又はｓＳＴ２遺伝子の３’－ＵＴＲを包含するゲノム配列内の２つの位置を標的とする２つのｓｇＲＮＡをコードする１又は複数のベクターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び２つのｓｇＲＮＡをコードする１つのベクターを含む。いくつかの実施形態では、１又は複数のベクターは、１又は複数のウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射によって投与されるか、又は経口投与若しくは経鼻投与によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、溶液、懸濁液、粉末、ペースト、錠剤、又はカプセルの形態で投与される。

【0008】

第３の態様では、本発明は、個人におけるアルツハイマー病を処置するキット、又は後にアルツハイマー病を発症する個人のリスクを低減するキットを提供する。キットは、ｒｓ１９２１６２２（若しくは表４若しくは表５の別の遺伝子座）又はｓＳＴ２遺伝子の３’－ＵＴＲを包含するゲノム配列を破壊する組成物を含有する、第１の容器を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、組成物は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射のために製剤化されているか、又は経口投与若しくは経鼻投与のために製剤化されている。いくつかの実施形態では、組成物は、ｒｓ１９２１６２２（若しくは表４若しくは表５の別の遺伝子座）又はｓＳＴ２遺伝子の３’－ＵＴＲを包含するゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミニＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（１）スモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼ及び（２）ｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）又はｓＳＴ２遺伝子の３’－ＵＴＲを包含するゲノム配列内の２つの位置を標的とする２つのｓｇＲＮＡをコードする１又は複数のベクターを含む。いくつかの実施形態では、キットは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び２つのｓｇＲＮＡをコードする１つのベクターを含む組成物を含有する。いくつかの実施形態では、キットは、個人のゲノム（例えば、ＡＰＯＥ－ε４遺伝子）の少なくとも一部をシーケンシングするための薬剤を含有する第２の容器を更に含む。所望により、キットはまた、組成物の投与のための取扱説明を更に含む。

【0010】

本発明のこの態様に関連して、（１）アルツハイマー病を処置するための医薬品；及び／又は（２）アルツハイマー病を処置するための医薬品を含有するキットを製造するための、ｒｓ１９２１６２２、及び／又は他の５７４個のｓＳＴ２関連遺伝子バリアント、及び／又はｓＳＴ２の３’－非翻訳領域を包含するゲノム配列を破壊する１又は複数の薬剤の使用が、本明細書の開示に従って更に提供される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達を図示する図。（ａ）可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）転写物及び全長ＳＴ２（ＳＴ２Ｌ）転写物を示す概略図。（ｂ）ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達経路。ＩＬ－３３、インターロイキン３３。

【図2】循環ｓＳＴ２レベルは、アルツハイマー病及びその病理学的変化に関連する。（ａ）疾患表現型（ｎ＝３３６の健常対照［ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ：ＨＣ］、ｎ＝２７７の中国人＿コホート＿１からのＡＤ患者；線形回帰試験、Ｔ＝３．２４１、＊＊Ｐ＜０．０１）に従って層別化された個々の血漿可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）レベル。データは、最大値、７５パーセンタイル、中央値、２５パーセンタイル、及び最小値を含む箱ひげ図として提示される。プラス記号（＋）は、対応する平均値を表す。（ｂ）血漿ｓＳＴ２レベルと頭蓋内体積（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｖｏｌｕｍｅ：ＩＣＶ）－正規化灰白質体積との相関（ｎ＝１９２の参加者、中国人＿コホート＿１から）；ｒ、ピアソンの相関係数。（ｃ）血漿ｓＳＴ２とＰ－ｔａｕ１８１レベルとの相関（ｎ＝２７１の参加者、中国人＿コホート＿１から）。（ｄ）血漿ｓＳＴ２とＮｆＬ（神経フィラメント光ポリペプチド）レベルとの相関（ｎ＝２５１の参加者、中国人＿コホート＿１から）。（ｅ）脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ：ＣＳＦ）とｓＳＴ２の血漿レベルとの相関（ｎ＝１０７の参加者、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ［ＡＤＲＣ］コホートから）。（ｆ）疾患表現型（ｎ＝１１のＨＣ、ｎ＝７５のＵＫＢＢＮコホートからのＡＤ患者；線形回帰試験、Ｔ＝３．３５５、＊＊Ｐ＜０．０１）に従って層別化された個々のＣＳＦ ｓＳＴ２レベル。（ｇ、ｈ）ＡＤ患者における死後の前頭皮質におけるアミロイドベータ（Ａβ）染色とＣＳＦ ｓＳＴ２レベルとの相関関係（ｎ＝５１、ＵＫＢＢＮコホートからの参加者）。参加者を、ＣＳＦ ｓＳＴ２レベル：低、≦３．６ｎｇ／ｍＬ；高、＞３．６ｎｇ／ｍＬに従って２群に層別化した。（ｈ）の垂直の破線は、ＣＳＦ ｓＳＴ２レベル（３．６ｎｇ／ｍＬ）を指し示し、ＡＤ患者とＨＣ識別するための最も大きいヨーデン指標（Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ）値を有する。ＣＳＦ ｓＳＴ２レベルが低いＡＤ患者及び高いＡＤ患者におけるＡβ染色の代表的な画像（ｇ）及び相関分析の結果（ｈ）。スケールバー、１００μｍ。

【図3】血漿ｓＳＴ２レベルは、中国人＿コホート＿１において心血管疾患の病歴のないアルツハイマー病患者において上昇した。（ａ）心血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＶＤ）表現型によって層別化された個々の血漿可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）レベル（それぞれ、ｎ＝９７のＣＶＤの病歴がない認知機能が正常な（cognitively normal）参加者［非ＣＶＤ］、ｎ＝３０の心疾患を有する認知機能正常参加者［ＨＤ］、ｎ＝２０１の高血圧を有する認知機能正常参加者［ＨＴ］、ｎ＝７２の真性糖尿病を有する認知機能正常参加者［ＤＭ］、ｎ＝９８の中国人＿コホート＿１からの高脂血症を有する認知機能正常参加者［ＨＬ］；線形回帰試験、心臓疾患、高血圧、真性糖尿病、及び高脂血症に関する試験については、それぞれ、Ｔ＝２．２０６、０．２９６、－１．４９３、及び－０．４６１；＊Ｐ＜０．０５）。データは、最大値、７５パーセンタイル、中央値、２５パーセンタイル、及び最小値を含む箱ひげ図として提示される。プラス記号（＋）は、対応する平均値を表す。（ｂ～ｅ）血漿ｓＳＴ２レベルは、アルツハイマー病（ＡＤ）及び関連するエンドフェノタイプと関連する。（ｂ）疾患表現型によって層別化された個々の血漿ｓＳＴ２レベル（それぞれ、ｎ＝９７の健常対照［ＨＣ］、ｎ＝７０のＣＶＤの病歴のない中国人＿コホート＿１からのＡＤ患者［非ＣＶＤコホート］；線形回帰試験、Ｔ＝３．１５１、＊＊Ｐ＜０．０１）。（ｃ～ｅ）ＡＤ患者における血漿ｓＳＴ２レベルとエンドフェノタイプとの相関。（ｃ）頭蓋内体積（ＩＣＶ）に対して正規化された灰白質体積（ｎ＝４８の参加者、非ＣＶＤコホートから）。（ｄ）血漿Ｐ－ｔａｕ１８１レベル（ｎ＝７７の参加者、非ＣＶＤコホートから）。（ｅ）血漿ＮｆＬ（神経フィラメント光ポリペプチド）レベル（ｎ＝６０の参加者、非ＣＶＤコホートから）。ｒ、ピアソンの相関係数。

【図4】脳ｓＳＴ２レベルの上昇は、Ａβ蓄積を増悪させ、かつミクログリアＡβクリアランス能力を損なう。（ａ）３月齢の５ＸＦＡＤマウスへの可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）送達の概略図。（ｂ～ｅ）対照としてのｓＳＴ２－Ｆｃ又はＦｃのｉ．ｃ．ｖ．送達後の４月齢の５ＸＦＡＤマウスの皮質におけるアミロイドベータ（Ａβ）沈着。（ｂ、ｃ）ＡβのＤＡＢ染色。（ｂ）代表画像；スケールバー、１ｍｍ。（ｃ）Ａβプラークの定量化（総皮質面積の％）（対照：ｎ＝６のマウス、ｓＳＴ２：ｎ＝７のマウス；独立スチューデントｔ検定、Ｔ＝２．７５８、＊Ｐ＜０．０５）。棒グラフのデータは平均＋ＳＥＭである。（ｄ）Ｘ－３４染色Ａβ沈着物（青色）及び４Ｇ８標識Ａβ（赤色）の共焦点像。繊維状（白塗りの矢印）のＡβプラーク及びコンパクトな（黒塗りの矢印）Ａβプラークを標識する。スケールバー、１００μｍ。（ｅ）繊維状Ａβプラーク、コンパクトなＡβプラーク、及び不活性Ａβプラークの定量化（対照：ｎ＝６のマウス、ｓＳＴ２：ｎ＝７のマウス；独立スチューデントｔ検定、それぞれ、Ｔ＝３．３２５、２．２７４、及び－０．７７０；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。（ｆ、ｇ）対照としてのｓＳＴ２－Ｆｃ又はＦｃのｉ．ｃ．ｖ．送達後の４月齢の５ＸＦＡＤマウスの皮質におけるミクログリア及びＡβプラークの共局在。（ｆ）直交するＸ－Ｚ視像及びＹ－Ｚ視像を有する合併共焦点Ｚスタック画像を用いた４Ｇ８標識Ａβプラーク（白色）及びＩｂａ－１^＋ミクログリア（緑色；赤色の矢印はミクログリア細胞体を指し示す）の共染色を示す、代表的な画像。スケールバー、１０μｍ。（ｇ）Ａβプラークのミクログリア被覆率の定量化（対照：ｎ＝６のマウス、ｓＳＴ２：ｎ＝７のマウス；独立スチューデントｔ検定、Ｔ＝－２．２９８；＊Ｐ＜０．０５）。（ｈ、ｉ）対照としてのｓＳＴ２－Ｆｃ又はＦｃのｉ．ｃ．ｖ．送達後の４月齢の５ＸＦＡＤマウスの皮質におけるミクログリアＡβ取込活性。代表的な散布図（ｈ）及び定量化（ｉ）は、メトキシ－Ｘ０４標識Ａβ（対照：ｎ＝７のマウス、ｓＳＴ２：ｎ＝７のマウス；独立スチューデントｔ検定、Ｔ＝－３．６２０、＊＊Ｐ＜０．０１）を含有するＣＤ１１ｂ^＋細胞のパーセンテージを示す。（ｈ）の野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ：ＷＴ）マウスの散布図を使用して、メトキシ－Ｘ０４^＋ミクログリア（すなわち、ＭｅＸ０４^＋ＣＤ１１ｂ^＋細胞）をゲーティングした。

【図5】５ＸＦＡＤマウスにおける繊維状Ａβプラーク、コンパクトなＡβプラーク、及び不活性Ａβプラークの代表的な画像。４月齢の５ＸＦＡＤマウスの皮質におけるＸ－３４染色アミロイドベータ（Ａβ）沈着物（青色）及び４Ｇ８標識Ａβ（赤色）の共焦点像。スケールバー、１０μｍ。

【図6】脳ｓＳＴ２の上昇は、５ＸＦＡＤマウスにおけるミクログリア数の増加をもたらす。（ａ、ｂ）脳可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）は、５ＸＦＡＤマウスのミクログリア数を増加させる。対照としてのｓＳＴ２－Ｆｃ又はＦｃの脳室内送達後の４月齢の５ＸＦＡＤマウスの皮質におけるＩｂａ－１^＋ミクログリアの代表的な画像（ａ）及び定量化（ｂ）（対照：ｎ＝６のマウス、ｓＳＴ２：ｎ＝７のマウス；独立スチューデントｔ検定、Ｔ＝４．４９１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。スケールバー、５０μｍ。棒グラフのデータは平均＋ＳＥＭである。（ｃ）小さい（すなわち、半径≦８μｍ）及び大きい（すなわち、半径＞８μｍ）アミロイドベータ（Ａβ）プラーク（それぞれ、対照：ｎ＝６のマウス、ｓＳＴ２：ｎ＝７のマウス；独立スチューデントｔ検定、それぞれＴ＝２．６６１及び２．５５１、＊Ｐ＜０．０５）の周囲のミクログリアの定量化。

【図7】アミロイドベータ（Ａβ）^＋ミクログリアのゲーティング戦略。細胞を前方（ＦＳＣ＝サイズ）及び側方散乱（ＳＳＣ＝内部構造）でゲートした。本発明者らは、ＦＳＣ及びトリガーパルス幅を使用して、単一細胞を、細胞のダブレット（doublets）又は凝集物から区別した。本発明者らは、非染色対照を使用してＣＤ１１ｂ^＋細胞集団を同定した。本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス由来の試料を使用して、メトキシ－Ｘ０４^＋細胞集団を同定した。

【図8】ｓＳＴ２レベルに対する性別及び年齢の影響。（ａ）性別及び疾患表現型によって層別化された個々の血漿可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）レベル（それぞれ、ｎ＝１３２の男性健常対照［ＨＣ］、ｎ＝８４のアルツハイマー病の男性患者［ＡＤ］、ｎ＝２０４の女性ＨＣ、ｎ＝１９３の中国人＿コホート＿１からの女性ＡＤ患者；線形回帰試験、性別の影響についての試験：それぞれ、ＨＣ及びＡＤ患者におけるＴ＝－４．９１８及び－２．４０７、^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃＃Ｐ＜０．００１；ＡＤの効果の試験：男性及び女性で、それぞれ、Ｔ＝１．５３４及び３．００８、＊＊Ｐ＜０．０１）。データは、最大値、７５パーセンタイル、中央値、２５パーセンタイル、及び最小値を含む箱ひげ図として提示される。プラス記号（＋）は、対応する平均値を表す。（ｂ）男性及び女性における血漿ｓＳＴ２レベルと年齢との相関（ｎ＝２１６及び３９７：それぞれ、中国人＿コホート＿１の男性及び女性；男性：ピアソンのｒ^２＝０．００１０、Ｐ＝０．６４１０；女性：ピアソンのｒ^２＝０．０３６６、Ｐ＜０．０００１）。（ｃ）ＩＮＴＥＲＶＡＬ及びＬｏｎＧｅｎｉｔｙコホート^２０からの男性及び女性における血漿ｓＳＴ２レベルと年齢との相関（それぞれ、ＩＮＴＥＲＶＡＬコホートからのｎ＝１，６８５及び１，６１６の男性及び女性、ＬｏｎＧｅｎｉｔｙコホートからのｎ＝４３２及び５３０の男性及び女性；ＩＮＴＥＲＶＡＬコホート［年齢１８～７６歳］における相関試験、男性：ピアソンのｒ^２＝０．０１６９、Ｐ＜０．０００１；女性：ピアソンのｒ^２＝０．０００１、Ｐ＝０．７７１５；ＬｏｎＧｅｎｉｔｙコホート［年齢６５～９４歳］における相関試験、男性：ピアソンのｒ^２＝０．０１００、Ｐ＝０．００９３；女性：ピアソンのｒ^２＝０．０１９６、Ｐ＝０．０００１）。（ｄ）日本人コホートからの男性及び女性における脳脊髄液（ＣＳＦ）ｓＳＴ２レベルと年齢との相関（それぞれ、ｎ＝６８及び６５男性及び女性；男性：ピアソンのｒ^２＝０．０４４１、Ｐ＝０．０８１２；女性：ピアソンのｒ^２＝０．１５２１、Ｐ＝０．００１４）。（ｅ、ｆ）ｓＳＴ２レベルの分散に対する年齢及び性別の寄与。数字は、それぞれ、中国人＿コホート＿１及び日本人コホートにおける年齢、性別、及び他の要因によって説明される血漿ｓＳＴ２（ｅ）及びＣＳＦ ｓＳＴ２（ｆ）分散の割合を表す。

【図9】ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、より低い循環ｓＳＴ２レベルと関連する。（ａ）中国人＿コホート＿１における血漿ｓＳＴ２レベルのゲノムワイド関連研究によって同定された、血漿可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）レベルと関連する、ＩＬ１ＲＬ１座位での遺伝子バリアントを示すマンハッタンプロット。水平線は、示唆的閾値（Ｐ＝１Ｅ－５、青色）及びゲノムワイドな閾値（Ｐ＝５Ｅ－８、赤色）を指し示す。（ｂ）ＩＬ１ＲＬ１座位及び血漿ｓＳＴ２レベルでの遺伝子バリアントの領域的関連プロット。紫色の菱形は、センチネルバリアントｒｓ１９２１６２２を指し示す。カラースケールは、ｒｓ１９２１６２２とその隣接バリアントとの連鎖不平衡（ｒ^２として測定）を指し示す。（ｃ、ｄ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化された個体における血漿（ｃ）及び脳脊髄液（ＣＳＦ）（ｄ）ｓＳＴ２レベル（血漿ｓＳＴ２レベル：それぞれ、ｎ＝１０７、２０６、及び１１４のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア、中国人＿コホート＿１から；線形回帰検定、Ｔ＝－１１．２０７、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＣＳＦ ｓＳＴ２レベル：それぞれ、ｎ＝２０、４４、及び２２のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア、ＵＫＢＢＮコホートから；線形回帰試験、Ｔ＝－２．６１５、＊Ｐ＜０．０５）。箱ひげ図のデータは、最大値、７５パーセンタイル、中央値、２５パーセンタイル、及び最小値を含む；プラス記号（＋）は対応する平均値を表す。

【図10】ＩＬ１ＲＬ１遺伝子におけるｓＳＴ２関連遺伝子バリアントのファインマッピング分析。（ａ）ゲノムワイド関連研究結果のｐ値分布を示す、分位数－分位数（Ｑｕａｎｔｉｌｅ－ｑｕａｎｔｉｌｅ：Ｑ－Ｑ）プロット。ゲノムインフレーション係数（λ）が示される。（ｂ）ｒｓ１９２１６２２に関連する７９の遺伝子バリアントのハプロタイプ分析（ｒ^２＞０．７）。番号が付けられた各カラムは、７９個のバリアントのうち１つを表す；赤色及び青色は、それぞれ、マイナーアレル及びメジャーアレルを指し示す。各行は、ハプロタイプブロック中のメジャーアレルとマイナー次的アレルの特定の組合せによって定義される特定のハプロタイプを表し、ここではハプロタイプ頻度を右側に指し示し、遺伝子座位（±１０ｋｂｐ）を上部に指し示す。三角形はｒｓ１９２１６２２の位置を指し示す。（ｃ）ＩＬ１ＲＬ１遺伝子のバリアントと血漿可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）レベルとの関連を示す、ファインマッピングプロット。ドットの色彩強度は、血漿ｓＳＴ２レベルに対する個々のバリアントの効果量を指し示し、ドットのサイズは、バリアントがその因果効果を発揮する確率を指し示す。

【図11】ｒｓ１９２１６２２遺伝子座位における標的欠失は、脳内皮細胞におけるｓＳＴ２発現及び分泌を減少させる。（ａ）ＧＴＥｘデータセットからのヒト組織における、可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）（ＥＮＳＴ０００００３１１７３４．２）の転写レベルに対するｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの影響。ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの効果量及び各組織の９５％信頼区間（詳細については表１を参照）を、それぞれ、ボックス及び線で指し示す。赤色及び青色は、ｒｓ１９２１６２２遺伝子型とｓＳＴ２転写物レベルとの有意な関連（Ｐ＜０．０５）及び有意でない関連（Ｐ≧０．０５）をそれぞれ指し示す。（ｂ～ｄ）単一核ＲＮＡシーケンシング分析は、ヒト脳の内皮細胞におけるｒｓ１９２１６２２とｓＳＴ２転写物レベルとの関連を明らかにした。（ｂ）ヒト前頭皮質（ＵＫＢＢＮコホートからの２１人の参加者からのｎ＝１６９，４９６の細胞）における細胞型を示す、均一多様体近似及び投影（Ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ：ＵＭＡＰ）プロット。興奮、興奮性ニューロン；抑制、抑制性ニューロン；アストロ、アストロサイト；ミクロ、ミクログリア；エンド、内皮細胞；オリゴ、オリゴデンドロサイト；ＯＰＣ、オリゴデンドロサイト前駆細胞。（ｃ）ヒト前頭皮質におけるｓＳＴ２転写物（上部）及びＣＬＤＮ５転写物（下部）の発現プロファイル。（ｄ）ヒト前頭皮質からの内皮細胞におけるｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化された、ｓＳＴ２（上部）及びＣＬＤＮ５（下部）の発現レベルを示すドットプロット。正規化実験、正規化された発現。（ｅ～ｈ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集により、ｒｓ１９２１６２２座位がｓＳＴ２発現に重要であることが明らかになった。（ｅ）ｒｓ１９２１６２２座位を保持する領域（赤色）を標的とする２つのｓｇＲＮＡ対（すなわち、６７ｂｐ欠失［Δ６７ｂｐ］についてｓｇＲＮＡ－１及びｓｇＲＮＡ－４；３８ｂｐ欠失［Δ３８ｂｐ］についてのｓｇＲＮＡ－２及びｓｇＲＮＡ－３）の位置を示す図。（ｆ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における２４時間のＩＬ－３３投与後のｒｓ１９２１６２２座位でのＨ３Ｋ２７ａｃ変化のＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ分析（群あたりｎ＝３；独立スチューデントｔ検定、Ｔ＝４．５９３、＊Ｐ＜０．０５）。棒グラフのデータは平均＋ＳＥＭである。（ｇ、ｈ）ｒｓ１９２１６２２座位の欠失は、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞におけるｓＳＴ２の転写レベル及びタンパク質分泌を減少させる。（ｇ）ｓＳＴ２転写レベル（それぞれ、ｎ＝６、８、及び１０の同質遺伝子コントロールクローン、３８ｂｐ欠失を有するクローン、並びに６７ｂｐ欠失を有するクローン；独立スチューデントｔ検定、Δ３８ｂｐ対対照及びΔ６７ｂｐ対対照について、それぞれ、Ｔ＝－５．４４４及び－７．６１２、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（ｈ）馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ：ＣＭ）における分泌されたｓＳＴ２タンパク質レベル（それぞれ、ｎ＝３、３、及び４の同質遺伝子的コントロール系統、３８ｂｐ欠失を有する系統、及び６７ｂｐ欠失を有する系統；独立スチューデントｔ検定、Δ３８ｂｐ対対照及びΔ６７ｂｐ対対照について、それぞれ、Ｔ＝－１３．４５０及び－１６．０３０、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【図12】ＩＬ－３３は、脳内皮細胞におけるｓＳＴ２の発現及び分泌を誘導する。（ａ、ｂ）ＩＬ－３３の投与は、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）の発現（群あたりｎ＝４）（ａ）及び分泌（群あたりｎ＝３）（ｂ）を増強する（独立スチューデントｔ検定、ｓＳＴ２転写物及びタンパク質レベルについて、それぞれ、Ｔ＝６．４８４及び２８．８９、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。棒グラフのデータは平均＋ＳＥＭである。ＣＭ、馴化培地；対照、対照群。（ｃ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における２４時間のＩＬ－３３投与後のｓＳＴ２プロモータ領域におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３変化のＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ分析（群あたりｎ＝３；独立スチューデントｔ検定、Ｔ＝２９．６９、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【図13】ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞におけるｒｓ１９２１６２２含有領域でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの標的欠失の検証。（ａ）ｒｓ１９２１６２２含有領域（赤色）を標的とする２つのｓｇＲＮＡ対（すなわち、６７ｂｐ欠失［Δ６７ｂｐ］ではｓｇＲＮＡ－１及びｓｇＲＮＡ－４、及び３８ｂｐ欠失［Δ３８ｂｐ］ではｓｇＲＮＡ－２及びｓｇＲＮＡ－３）の位置を示す図。（ｂ）同質遺伝子的対照系統（対照）、３８ｂｐ欠失系統（Δ３８ｂｐ）、及び６７ｂｐ欠失系統（Δ６７ｂｐ）の単一クローンのゲル画像。Ｌ、ＤＮＡラダー。（ｃ）単一クローンのサンガー検証。

【図14】ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいてアルツハイマー病に対する保護効果を発揮する。（ａ、ｂ）６つのアルツハイマー病（ＡＤ）データセットからの全体的なＡＰＯＥ－ε４キャリア（ａ）及び女性ＡＰＯＥ－ε４キャリア（ｂ）におけるｒｓ１９２１６２２ Ａアレルのメタ分析結果を示す、フォレストプロット（Ｎ＝５，４３６の健常対照、Ｎ＝５，５５６のＡＤ患者）。独立したデータセット及びメタ分析から得られた効果量（対数オッズ比）を、それぞれ、長方形及び菱形で表示する。独立したデータセットの場合、水平線は９５％信頼区間を指し示し、長方形のサイズはメタ分析で使用される重みに比例する。ＲＥ２、Ｈａｎ及びＥｓｋｉｎのランダム効果モデル。（ｃ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化されたＡＤを有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおける累積認知症非罹患確率（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）の生存プロット（それぞれ、ｎ＝５８、１０８、及び６６のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア、ＬＯＡＤコホートから）。ＨＲ、ハザード比。（ｄ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化されたＡＤを有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアの個々の認知能力（ミニメンタルステート検査［ＭＭＳＥ］スコアによって決定されるとおり）（それぞれ、ｎ＝８０、９７、及び４１のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ及びＡ／Ａキャリア、中国人＿コホート＿２から；線形回帰試験、Ａ／Ａ対Ｇ／Ｇ及びＡ／Ａ対Ｇ／Ａについて、それぞれ、Ｔ＝２．６４４及び２．２０７、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。箱ひげ図のデータは、最大値、７５パーセンタイル、中央値、２５パーセンタイル、及び最小値を含む。プラス記号（＋）は、対応する平均値を表す。（ｅ）認知障害を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおける脳領域体積に対するｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの効果量（それぞれ、ｎ＝２９、７２及び４６のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア、ＡＤＮＩコホートから）。各脳領域について、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの効果量及び９５％信頼区間を、それぞれボックス及び線で指し示す。赤色及び青色は、ｒｓ１９２１６２２遺伝子型と脳領域体積との有意な関連（＊Ｐ＜０．０５）及び有意でない関連（Ｐ≧０．０５）をそれぞれ指し示す。紡錘形、紡錘状回；中側頭、中側頭回。（ｆ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化されたアミロイドベータ（Ａβ）^＋ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおける個々の認知スコア（ｎ＝１３３のＧキャリア［Ｇ／－］、ｎ＝５７のＡ／Ａキャリア、ＡＩＢＬコホートから；ウィルコクソン順位和検定、ＡＩＢＬＰＡＣＣスコアに対するｒｓ１９２１６２２遺伝子型の影響についての試験、アテンション処理スコア、エピソード想起スコア、及び認識スコア：それぞれ、Ｗ＝４３３６．０、１９７０．５、１６１０．０、及び１５２３．５；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。（ｇ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化されたＡβ^＋ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおける縦方向灰白質体積（それぞれ、ｎ＝２８１、並びにＡＩＢＬコホートからの１２８人のＧキャリア［Ｇ／－］及び５５人のＡ／Ａキャリアからの１１２データポイント；線形混合モデル試験、β＝－０．０４６、Ｆ＝４．８３９、＊Ｐ＜０．０５）。

【図15】アルツハイマー病のリスクは、ＡＰＯＥ－ε４非キャリアにおけるｒｓ１９２１６２２遺伝子型と関連していない。６つのアルツハイマー病データセットからのＡＰＯＥ－ε４非キャリアにおけるｒｓ１９２１６２２のメタ分析を示すフォレストプロット。独立したデータセット及びメタ分析結果から得られた効果量（対数オッズ比）の値を、それぞれ、長方形及び菱形で表示する。独立したデータセットの場合、水平線は９５％信頼区間の範囲を指し示し、長方形のサイズはメタ分析で使用される重みに比例する。ＲＥ２、Ｈａｎ、及びＥｓｋｉｎのランダム効果モデル。

【図16】ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、ＬＯＡＤ及びＡＤＣコホートにおけるアルツハイマー病を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおける認知症の発症年齢の遅延に関連する。（ａ、ｂ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化されたＬＯＡＤコホートからのアルツハイマー病（ＡＤ）群における、全ＡＰＯＥ－ε４キャリア（それぞれ、ｎ＝８２、１６４、及び９９のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及び９９Ａ／Ａキャリア）（ａ）及び、女性ＡＰＯＥ－ε４キャリア（それぞれ、ｎ＝１９７、４７７、及び２７６のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア）（ｂ）での、累積認知症非罹患確率の生存プロット。（ｃ、ｄ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化されたＡＤＣコホートからのＡＤ群における全ＡＰＯＥ－ε４キャリア（ｎ＝４３８，９５９、及びそれぞれ５４３Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア）（ｃ）及び女性ＡＰＯＥ－ε４キャリア（ｎ＝１９７，４７７、及びそれぞれ２７６Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア）における累積認知症非罹患確率の生存プロット。コックス回帰試験。ＨＲ、ハザード比。

【図17】ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、ＡＤＮＩコホートにおいて認知障害を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいて嗅内皮質の萎縮から保護する。（ａ）認知障害を有するＡＰＯＥ－ε４キャリア（ＡＤＮＩコホートからのｎ＝３７４の参加者）における、脳領域体積に対するｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの影響。各脳領域について、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの効果量及び９５％信頼区間を、それぞれ、ボックス及び線で指し示す。（ｂ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化された認知障害を有するＡＰＯＥ－ε４キャリアにおける個々の頭蓋内体積（ＩＣＶ）－正規化された嗅内皮質体積（ｎ＝８０、１８０、及び１１４のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア、ＡＤＮＩコホートから；線形回帰試験、Ｔ＝０．３３０）。箱ひげ図のデータは、最大値、７５パーセンタイル、中央値、２５パーセンタイル、及び最小値を含む。プラス記号（＋）は、対応する平均値を表す。（ｃ）認知障害を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリア（ＡＤＮＩコホートからのｎ＝１４７の参加者）における脳領域体積に対するｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの影響。（ｄ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化された認知障害を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおける個々のＩＣＶ正規化嗅内皮質体積（それぞれ、ｎ＝２９、７２、及び４６のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア、ＡＤＮＩコホートから；線形回帰試験、Ｔ＝２．２８５、＊Ｐ＜０．０５）。紡錘形、紡錘状回；中側頭、中側頭回。

【図18】ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、中国人＿コホート＿１のアルツハイマー病を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいて神経変性から保護する。（ａ、ｂ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化された中国人＿コホート＿１からのアルツハイマー病（ＡＤ）を有するＡＰＯＥ－ε４キャリアにおける、Ｐ－ｔａｕ１８１（それぞれ、ｎ＝１４、３２、及び１１のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア）（ａ）及びＮｆＬ（神経フィラメント光ポリペプチド）（それぞれ、ｎ＝１４、３３、及び１２のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア）（ｂ）の個々の血漿レベル（線形回帰試験、血漿Ｐ－ｔａｕ１８１及びＮｆＬについて、それぞれ、Ｔ＝－０．４１９及び－１．６２２）。箱ひげ図のデータは、最大値、７５パーセンタイル、中央値、２５パーセンタイル、及び最小値を含む。プラス記号（＋）は、対応する平均値を表す。（ｃ、ｄ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化された中国人＿コホート＿１からのＡＤを有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおける、Ｐ－ｔａｕ１８１（それぞれ、ｎ＝１３、２３、及び４のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア）（ｃ）及びＮｆＬ（それぞれ、ｎ＝１３、２３、及び５のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア）の個々の血漿レベル（線形回帰試験、血漿Ｐ－ｔａｕ１８１及びＮｆＬについて、それぞれ、Ｔ＝－２．０６５及び－２．４９８；＊Ｐ＜０．０５）。

【図19】ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、ＡＩＢＬ Ａβ^＋コホートでの女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいて認知低下及び灰白質萎縮から保護する。（ａ、ｂ）ＡＩＢＬコホートにおけるアミロイドベータ（Ａβ）^＋ＡＰＯＥ－ε４キャリアのうちｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化された個々の認知スコア及びベースライン灰白質体積（それぞれ、ｎ＝４５、８８、及び５７のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア；ＡＩＢＬＰＡＣＣスコア、アテンション処理、エピソード想起スコア、及び認識スコアでのｒｓ１９２１６２２（Ａ／Ａ）に対するウィルコクソン順位和検定：それぞれ、Ｗ＝４，３３６、１，９７０．５、１，６１０、及び１，５２３．５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。（ｃ、ｄ）ＡＩＢＬコホートでの女性Ａβ^＋ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおけるｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化された個々の認知スコア及びベースライン灰白質体積（それぞれ、ｎ＝２３、４５、及び３３のＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、及びＡ／Ａキャリア；ウィルコクソン順位和検定、ＡＩＢＬＰＡＣＣスコアでのｒｓ１９２１６２２（Ａ／Ａ）に対する試験、アテンション処理、エピソード想起スコア、認識スコア、及びベースライン灰白質体積に対する検定：それぞれ、Ｗ＝６４１、６９２．５、５８４，５７２、及び８１９；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。データは、最大値、７５パーセンタイル、中央値、２５パーセンタイル、及び最小値を含む箱ひげ図として提示される。プラス記号（＋）は、対応する平均値を表す。

【図20】ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの共保持（Ｃｏ－ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）は、アルツハイマー病を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおけるＡβに対する損なわれたミクログリア活性を回復させる。（ａ、ｂ）ＡＰＯＥ－ε４は、アルツハイマー病（ＡＤ）の女性患者におけるアミロイドベータ（Ａβ）沈着の増加と関連する。（ａ）前頭皮質におけるＡβプラーク染色の代表的な画像。スケールバー、２００μｍ。（ｂ）性別及びＡＰＯＥ－ε４遺伝子型に従って層別化した前頭皮質におけるＡβプラーク負荷の定量化（ｎ＝１４の男性ＡＰＯＥ－ε４非キャリア［非ε４］、ｎ＝２２の男性ＡＰＯＥ－ε４キャリア［ε４］、ｎ＝１９の女性非ＡＰＯＥ－ε４キャリア、ｎ＝２３の女性ＡＰＯＥ－ε４キャリア、ＵＫＢＢＮコホートから；線形回帰試験、性別の影響についての試験：それぞれ、非ＡＰＯＥ－ε４及びＡＰＯＥ－ε４におけるＴ＝２．５０７及び５．０２２、^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃＃Ｐ＜０．００１；ＡＰＯＥ－ε４の効果の試験：それぞれ、男性及び女性でＴ＝－０．８０２及び２．０６２、＊Ｐ＜０．０５）。箱ひげ図のデータは、最大値、７５パーセンタイル、中央値、２５パーセンタイル、及び最小値を含む。プラス記号（＋）は、対応する平均値を表す。（ｃ）ＡＰＯＥ－ε４及びｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化されたＡＤを有する女性患者の前頭皮質におけるＡβプラーク染色の代表的な画像。スケールバー、５ｍｍ。（ｄ、ｅ）ｒｓ１９２１６２２バリアントは、ＡＰＯＥ－ε４キャリアではＡβのミクログリア被覆率の増加と関連するが、非キャリアでは関連しない。（ｄ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化した女性ＡＰＯＥ－ε４非キャリアの前頭皮質におけるＡβプラーク（褐色）及びＩｂａ－１^＋ミクログリア（紫色）の共染色の代表的な画像。スケールバー、１００μｍ。（ｅ）ＡＰＯＥ－ε４遺伝子型及びｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化されたミクログリアと共局在化したＡβプラークの面積の定量化（ＡＰＯＥ－ε４非キャリア［非ε４］のうちそれぞれｎ＝４及び１５のＧ／Ｇキャリア及びＡキャリア［Ａ／－］、ＡＰＯＥ－ε４キャリア［ε４］のうちそれぞれｎ＝５及び１８のＧ／Ｇキャリア及びＡ／－キャリア、ＵＫＢＢＮコホートから；線形回帰試験、ＡＰＯＥ－ε４の効果の試験：Ｇ／Ｇ及びＡ／－でそれぞれＴ＝－２．９９１及び－１．５５３、^＃Ｐ＜０．０５；ｒｓ１９２１６２２の効果の試験：非ε４及びε４でそれぞれＴ＝０．２２９及び２．４０９、＊Ｐ＜０．０５）。

【図21】ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、アルツハイマー病を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアのＡβに対するミクログリア活性を増強する。（ａ、ｂ）ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおけるアミロイドベータ（Ａβ）沈着の減少と関連する（それぞれ、ＡＰＯＥ－ε４非キャリア［非ε４］のうちｎ＝４及び１５のＧ／Ｇキャリア、Ａキャリア［Ａ／－］；ＵＫＢＢＮコホートからのＡＰＯＥ－ε４キャリア［ε４］のうちｎ＝５及び１８のＧ／Ｇキャリア及びＡ／－キャリア）。（ａ）前頭皮質におけるＡβプラーク染色を示す代表的な画像。スケールバー、２００μｍ。（ｂ）ＡＰＯＥ－ε４及びｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化した前頭皮質におけるＡβプラーク面積の定量化（線形回帰試験；ＡＰＯＥ－ε４の効果：Ｇ／Ｇ及びＡ／－キャリアにおいて、それぞれ、Ｔ＝２．９１２及び０．９５６、^＃Ｐ＜０．０５；ｒｓ１９２１６２２の効果：それぞれ、非ＡＰＯＥ－ε４及びＡＰＯＥ－ε４キャリアにおけるＴ＝－０．８３３及び－３．７０６、＊Ｐ＜０．０５）。箱ひげ図のデータは、最大値、７５パーセンタイル、中央値、２５パーセンタイル、及び最小値を含む。プラス記号（＋）は、対応する平均値を表す。（ｃ、ｄ）ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、ＡＤを有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおけるＡβとのミクログリア共局在化の増加と関連する（それぞれ、ＡＰＯＥ－ε４キャリアのうちｎ＝５及び１８のＧ／Ｇ及びＡ／－キャリア、ＵＫＢＢＮコホートから）。（ｃ）前頭皮質におけるＡβプラーク（褐色）及びＩｂａ－１^＋ミクログリア（紫色）の共染色を示す代表的な画像。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化されたＡβプラーク面積とミクログリアとの共局在化の定量化（線形回帰試験、Ｔ＝２．４０９、＊Ｐ＜０．０５）。（ｅ）ＡＤを有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアの前頭皮質における、ｒｓ１９２１６２２遺伝子型と、ミクログリアによって発現される遺伝子との関連性を示すボルケーノプロット（ＵＫＢＢＮコホートからの８人の参加者からのｎ＝２，６３６ミクログリア）。青色及び赤色のドットは、それぞれ、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルと負及び正に関連するミクログリア遺伝子を指し示す。ドットサイズは、偽発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ：ＦＤＲ、ｌｏｇ_１０スケール）に比例する。上位５つの負及び正に関連するミクログリア遺伝子を標識する。（ｆ）ｒｓ１９２１６２２関連ミクログリア遺伝子が濃縮された代表的な遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ：ＧＯ）ターム。ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルキャリアにおけるダウンレギュレートされたミクログリア遺伝子及びアップレギュレートされたミクログリア遺伝子について濃縮されたＧＯタームを、それぞれ、青色及び赤色で指し示す。（ｇ）ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って層別化されたミクログリア活性化遺伝子及び恒常性遺伝子の発現レベルを示すドットプロット。

【図22】ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルと脳脊髄液ｓＳＴ２レベルとは、アルツハイマー病を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアのミクログリア転写体に対して反対の効果を呈する。アルツハイマー病（ＡＤ）を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアの前頭皮質におけるミクログリア遺伝子発現に対する、脳脊髄液（ＣＳＦ）可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）レベルの正規化効果量（β）と、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルとの相関性を示す、散布図（ＵＫＢＢＮコホートからの８人の個体からのｎ＝２，６３６ミクログリア）。

【図23】ｓＳＴ２の３’－非翻訳領域の欠失は、５ＸＦＡＤマウスにおいて、ｓＳＴ２レベルを低下させ、アミロイド関連病態を軽減する。（ａ、ｂ）ｓＳＴ２の３’－非翻訳領域の欠失は血清ｓＳＴ２レベルを低減させる。（ａ）ｓＳＴ２の３’－非翻訳領域の欠失の概略図。ｓＳＴ２とＳＴ２Ｌはコード配列の大部分を共有しているが、一方で、ｓＳＴ２の３’－非翻訳領域は特異的である。（ｂ）ＥＬＩＳＡによる血清ｓＳＴ２レベルの定量分析。値は平均±ｓ．ｅ．ｍである（＊＊＊Ｐ＜０．００１、独立両側ｔ検定）。（ｅ～ｈ）ｓＳＴ２の３’－非翻訳領域の欠失は、５ＸＦＡＤマウスのアミロイド関連病態を軽減する。（ｃ、ｄ）ＥＬＩＳＡによる可溶性及び不溶性のＡβ_ｘ－４０及びＡβ_ｘ－４２の定量分析。値は平均±ｓ．ｅ．ｍである（＊Ｐ＜０．０５、独立両側ｔ検定）。（ｅ、ｆ）ＡβのＤＡＢ染色。（ｅ）代表的な画像。（ｆ）Ａβプラークの定量化（総皮質面積の％）。値は平均±ｓ．ｅ．ｍである（＊Ｐ＜０．０５、独立両側ｔ検定）。（ｇ、ｈ）Ｘ－３４染色Ａβ沈着物。（ｇ）代表的な画像。（ｈ）Ｘ３４陽性Ａβプラークの定量化（総皮質面積の％）。値は平均±ｓ．ｅ．ｍである（＊Ｐ＜０．０５、独立両側ｔ検定）。

【図24】ｓＳＴ２の３’－非翻訳領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｓＳＴ２レベルを低減させ、アミロイド病態を軽減する。（ａ）ｓＳＴ２の３’－非翻訳領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ＡＳＯ）の概略図。（ｂ、ｃ）マウス線維芽細胞ＮＩＨ－３Ｔ３細胞におけるマウスｓＳＴ２－ＡＳＯの系統的スクリーニング。（ｂ）全てのマウスｓＳＴ２ ＡＳＯにおけるｓＳＴ２転写物レベル（ｃ）上位１３の効率的ＡＳＯにおけるｓＳＴ２転写物レベル。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。（ｄ）ｓＳＴ２－ＡＳＯの全身送達は、インビボで血清ｓＳＴ２レベルを低減させる。値は平均±ｓ．ｅ．ｍである。（ｅ、ｆ）Ｘ－３４染色Ａβ沈着物。（ｅ）代表的な画像。（ｆ）Ｘ３４陽性Ａβプラークの定量化（総皮質面積の％）。

【図25】ｓＳＴ２の３’－非翻訳領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト細胞においてｓＳＴ２タンパク質及び転写レベルを低減させる。（ａ）標的ｓＳＴ２の３’－非翻訳領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の概略図。（ｂ、ｃ）ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）におけるヒトｓＳＴ２－ＡＳＯの系統的スクリーニング。（ｂ）培地中の分泌ｓＳＴ２のレベル。値は、陰性対照ＡＳＯでトランスフェクトしたＨＵＶＥＣにおけるｓＳＴ２レベルを正規化している。（ｃ）上位１５の効率的なＡＳＯにおけるｓＳＴ２転写物レベル。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

表１．ヒト組織におけるｒｓ１９２１６２２ Ａアレルと可溶性ＳＴ２及び全長ＳＴ２転写物レベルとの関連性。年齢、性別、ＲＮＡ完全性、及び集団構造について調整した線形回帰試験。β、効果量；ＳＥ、標準誤差；ｓＳＴ２、可溶性ＳＴ２；ＳＴ２Ｌ、全長ＳＴ２。太字及び赤色の文字は、Ｐ＜０．０５のカットオフでの統計的有意性を指し示す。^ａ発現を呈した個体の５０％超（マッピングされたリード１キロベースあたりのリード［ＲＰＫＭ］＞０）での組織のみが、候補遺伝子の平均発現、及び候補遺伝子レベルとｒｓ１９２１６２２遺伝子型との関連試験を計算するように含まれた。^ｂ各組織における個体のうちの候補遺伝子の平均発現。
表２．中国人＿コホート＿１の人口統計的特徴。ＣＶＤ、心血管疾患；ＩＣＶ、頭蓋内体積；ＭｏＣＡ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ；ＭＲＩ、磁気共鳴画像法；ＮｆＬ、神経フィラメント光ポリペプチド；ＳＤ、標準偏差；ｓＳＴ２、可溶性ＳＴ２；ＷＧＳ、全ゲノムシーケンシング。
表３．ＵＫ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ Ｎｅｔｗｏｒｋコホートの人口統計的特徴。ＳＤ、標準偏差；ＰＭＤ、死後期間；ＣＳＦ、脳脊髄液；ｓＳＴ２、可溶性ＳＴ２。
表４．中国人＿コホート＿１における血漿ｓＳＴ２レベルと関連した候補遺伝子バリアント（Ｐ＜１Ｅ－５）。年齢、性別、ＡＤ診断、及び集団構造について調整した、線形回帰試験。
表５．ファインマッピング後の血漿可溶性ＳＴ２レベルと関連したＩＬ１ＲＬ１遺伝子における候補遺伝子バリアント（原因可能性＞０．００１）。ファインマッピング分析により、年齢、性別、ＡＤ診断、及び集団構造について調整した線形回帰試験。β、効果量；ＳＥ、標準誤差；ＳＮＰ、一塩基多型；ｓＳＴ２、可溶性ＳＴ２。^ａ血漿ｓＳＴ２レベルの推定原因バリアントである確率。
表６．メタ分析のための５つのアルツハイマー病データセットの人口統計的特徴。ＭＭＳＥ、ミニメンタルステート検査；ＳＤ、標準偏差。
表７．６つのアルツハイマー病データセットにおける全参加者、ＡＰＯＥ－ε４キャリア、及びＡＰＯＥ－ε４非キャリアにおけるｒｓ１９２１６２２ Ａアレルのマイナーアレル頻度。ＡＤ、アルツハイマー病；ＨＣ、健常対照；ＯＲ、オッズ比。太字の文字は、Ｐ＜０．０５のカットオフでの統計的有意性を指し示す。
表８．６つのアルツハイマー病データセットにおける男性ＡＰＯＥ－ε４キャリア及び女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアでのｒｓ１９２１６２２ Ａアレルのマイナーアレル頻度。ＡＤ、アルツハイマー病；ＨＣ、健常対照；ＯＲ、オッズ比。太字の文字は、Ｐ＜０．０５のカットオフでの統計的有意性を指し示す。
表９：オリゴヌクレオチド配列。

【0013】

定義
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＤＮＡ）又はリボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＲＮＡ）、及びそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別段示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オーソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列、並びに明示的に指し示された配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１若しくは複数の選択された（若しくは全ての）コドンの第３位が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を産生することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．」第１９巻：第５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、第２６０巻：第２６０５～２６０８頁（１９８５年）；及び、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ」、第８号：第９１～９８頁（１９９４年））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。

【0014】

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。セグメントは、コード領域の前及び後の領域（リーダ及びトレーラ）、並びに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含みうる。

【0015】

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってエンコードされるアミノ酸、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を指し、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。「アミノ酸模倣物」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。

【0016】

非天然アミノ酸誘導体又は類似体を、部位特異的な様式でポリペプチド鎖へと組み込むことを可能にする、様々な公知の方法が当技術分野に存在する（例えば、国際公開第０２／０８６０７５号を参照のこと）。

【0017】

アミノ酸は、一般に知られている３文字の記号、又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字の記号のいずれかによって本明細書で言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般に受け入れられている一文字のコードによって参照され得る。

【0018】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。３つの用語は全て、１又は複数のアミノ酸残基が対応する天然発生アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然発生アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用される場合、この用語は、全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここで、アミノ酸残基は、共有結合性ペプチド結合によって連結されている。

【0019】

本明細書で使用される場合、「ｒｓ１９２１６２２を包含するゲノム配列を破壊する組成物」とは、ゲノム配列の転写又は翻訳を抑制又は排除することが可能な１又は複数の薬剤を含む任意の組成物を指し、これは、ゲノム配列の少なくとも一部の直接欠失又は改変によって（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：ＣＲＩＳＰＲ）システムなどのゲノム編集技術によって）達成され得るか、又は低分子阻害性ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子若しくは他の酵素の作用を介してゲノム配列から転写されたｍＲＮＡの低減又は排除によって達成され得る（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどの低分子阻害性ＲＮＡ、及びリボザイムなど）。本開示で使用され、かつ他の遺伝子座（「表４及び表５に列挙された他のｓＳＴ２関連遺伝子バリアント」など）に関して同様に表現される用語及び語句は、機能的に同一又は同様に定義される。

【0020】

「標的化」という用語は、阻害性オリゴヌクレオチド又は遺伝子編集システムが負に調節するために使用されるゲノム配列に関して、阻害性オリゴヌクレオチド（低分子阻害性ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなど）又はｓｇＲＮＡを説明する文脈で使用される場合、ｓｇＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドとゲノム配列又はそのｍＲＮＡ転写物との特異的ハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチド又はｓｇＲＮＡの少なくとも一部とゲノム配列との充分な配列相補性、例えばワトソン・クリック塩基対合原理に基づくヌクレオチド配列相補性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれを超えるパーセンテージを指し、これはその後、所定の位置でのゲノム配列の切断、又はそのｍＲＮＡ転写物の破壊をもたらす。

【0021】

「組換え」という用語は、例えば細胞、又は核酸、タンパク質、又はベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、異種核酸若しくはタンパク質の導入、又は天然核酸若しくはタンパク質の改変によって修飾されていること、又は細胞がそのように修飾された細胞に由来することを指し示す。このようにして、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内に見られない遺伝子を発現するか、又はそうでなければ異常に発現されるか、低発現されるか、若しくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。

【0022】

「プロモータ」は、ポリヌクレオチド配列の転写を指示する核酸制御配列のアレイとして定義される。本明細書で使用される場合、プロモータは、転写の開始部位付近の必要なポリヌクレオチド配列、例えばポリメラーゼＩＩ型プロモータの場合、ＴＡＴＡエレメントなどを含む。プロモータはまた、所望により、転写の開始部位から数千塩基対も位置し得る遠位のエンハンサーエレメント又はリプレッサーエレメントを含む。「構成的」プロモータは、ほとんどの環境条件下及び発達条件下において活性なプロモータである。「誘導性」プロモータは、環境下又は発生調節下において活性なプロモータである。用語「作動可能に連結された」とは、ポリヌクレオチド発現制御配列（プロモータ、又は転写因子結合部位のアレイなど）と、第２のポリヌクレオチド配列との機能的連結を指し、ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応するポリヌクレオチド配列の転写を指示する。

【0023】

「発現カセット」は、宿主細胞における特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の特定のポリヌクレオチドエレメントを有する、組換え的又は合成的に産生された核酸構築物である。発現カセットは、プラスミド、ウイルスゲノム、又は核酸フラグメントの一部であり得る。典型的には、発現カセットは、転写され、プロモータへ作動可能に連結されるポリヌクレオチドを含む。

【0024】

２つのエレメントの相対位置について記載する文脈で使用される「異種」という用語は、同じ相対位置で天然には見られない、ポリヌクレオチド配列（例えば、プロモータ、及びｍＲＮＡコード配列又はタンパク質／ポリペプチドコード配列）、又はポリペプチド配列（例えば、融合タンパク質内の融合パートナーとしての２つのペプチド）などの、２つのエレメントを指す。このようにして、コード配列の「異種プロモータ」とは、そのコード配列に自然に作動可能に連結されていないプロモータを指す。同様に、特定のタンパク質又はそのコード配列に対する「異種ポリペプチド」又は「異種ポリヌクレオチド」は、その特定のタンパク質とは異なる起源に由来するもの、又は同じ起源に由来するが同じ様式でその特定のタンパク質又はそのコード配列に天然には連結されていない場合のものである。１つのポリペプチド（又はそのコード配列）と異種ポリペプチド（又はポリヌクレオチド配列）との融合は、自然界で見出すことができるより長いポリペプチド又はポリヌクレオチド配列をもたらさない。

【0025】

「特異的にハイブリダイズする」という語句は、ポリヌクレオチド配列が複雑な混合物（例えば、全細胞又はライブラリＤＮＡ又はライブラリＲＮＡ）中に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下におけるワトソン・クリック型ヌクレオチド塩基対合に基づく、１つのポリヌクレオチド配列の別のポリヌクレオチド配列への結合、二重鎖化、又はハイブリダイゼーションを指す。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、核酸（例えば、ポリヌクレオチドプローブ）が、典型的には核酸の複雑な混合物中でその標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、かつ異なる状況では異なるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３年）に見出される。概して、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔ_ｍ）よりも約５～１０℃低いように選択される。Ｔ_ｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態（標的配列が過剰に存在するので、Ｔ_ｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される）で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度の下における）である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０～８．３にて、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１～１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、１０～５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、及び長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃である、条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２倍、好ましくは１０倍である。例示的な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件としては、４２℃でインキュベートした５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、又は６５℃でインキュベートした５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ、並びに６５℃で０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられる。

【0026】

「宿主細胞」とは、発現ベクターを含有し、かつ発現ベクターの複製又は発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞、又は酵母、昆虫、両生類などの真核細胞、又は例えばＣＨＯ、ＨｅＬａなどの哺乳動物細胞、例えば培養細胞、外植片、及びインビボ細胞であり得る。

【0027】

本明細書で使用される「阻害すること（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」又は「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」という用語は、可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）タンパク質の発現、ＡＤ患者の脳中のアミロイドβ（Ａβ）プラークの形成、ＡＤ患者の認知低下、タンパク質リン酸化、細胞シグナル伝達、タンパク質合成、細胞増殖、腫瘍形成性、及び転移能など、阻害剤が標的生物学的プロセスに及ぼす任意の検出可能な負の効果を指す。典型的には、阻害は、阻害剤に曝露されていない対照と比較した場合、標的プロセス（例えば、ｓＳＴ２タンパク質発現又はＡβプラーク蓄積）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％の減少、又は上述の下流パラメータのいずれか１つの減少に反映される。同様に、「増加させること（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」又は「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」という用語は、エンハンサーの非存在下において対照と比較した場合、少なくとも２５％、５０％、７５％、１００％、又は２倍、３倍、４倍、５倍、若しくは最大１０倍若しくは２０倍の正の変化など、増強剤が標的生物学的プロセスに対して有する任意の検出可能な正の効果を説明するために使用される。逆に、「実質的に変化しない」という用語は、正の変化又は負の変化が１０％、５％、２％、１％、又はそれ未満である状態について記載する。

【0028】

本明細書で使用される「有効量」という用語は、物質が投与される意図された効果を生じるのに充分な量を指す。効果は、生物学的プロセス（例えば、ＡＤ患者における、ｓＳＴ２発現の検出可能な減少、Ａβプラーク形成の低減、又は認知低下の遅延）の望ましい変化、並びに疾患／状態及び関連する合併症の症状の進行の任意の検出可能な程度までの予防、補正、又は阻害を含みうる。所望の効果を達成するため「有効」である正確な量は、治療剤の性質、投与様式、及び処置の目的に依存し、かつ公知の技術（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ」（第１～３巻、１９９２年）；Ｌｌｏｙｄ、「Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ」（１９９９年）；及び、Ｐｉｃｋａｒ、「Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ」（１９９９年））を用いて当業者によって確認される。

【0029】

本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患若しくは状態の存在、又は後にそのような疾患若しくは状態を発症するリスクに対処するためにとられる治療的措置及び予防的措置の両方を含む。これは、進行中の症状を軽減する、疾患の進行を阻害若しくは遅延させる、症状の発症を遅延させる、又はそのような疾患若しくは状態によって引き起こされる副作用を排除若しくは低減するための、治療的措置又は予防的措置を包含する。この文脈及びその変形における予防措置は、事象の発生の１００％排除を必要とせず、むしろこれらは、そのような発生の可能性若しくは重症度の抑制若しくは低減、又はそのような発生の遅延を指す。

【0030】

「医薬的に許容される」添加剤又は「薬理学的に許容される」添加剤とは、生物学的に有害でなく又は他の点で望ましくない物質であり、すなわち、添加剤は、いかなる望ましくない生物学的効果をも引き起こさずに生物活性剤と共に個体へと投与され得る。添加剤は、添加剤が含有される組成物の構成成分のいずれとも有害な様式で相互作用しない。

【0031】

「添加剤」という用語は、本発明の組成物の完成剤形中に存在し得る任意の本質的に付属的な物質を指す。例えば、「添加剤」という用語は、ビヒクル、結合剤、崩壊剤、充填剤（希釈剤）、潤滑剤、流動促進剤（流動増強剤）、圧縮助剤、着色剤、甘味料、防腐剤、懸濁剤／分散剤、フィルム形成剤／コーティング剤、香料、及び印刷インクを含む。

【0032】

「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、１つの活性成分又は複数の活性成分含有する組成物を説明する文脈で使用される場合、組成物が、活性成分（複数可）の任意の類似生物学的活性又は関連生物学的活性を所有するか、活性を増強又は抑制することが可能な他の成分を含有せず、一方で、生理学的又は医薬的に許容される添加剤などの１又は複数の不活性成分が組成物中に存在し得るという事実を指す。例えば、対象においてｒｓ１９２１６２２含有ゲノム配列を破壊するために、又はゲノム配列から転写されるｍＲＮＡを抑制するために有効な活性薬剤（複数可）から本質的になる組成物は、同じ標的プロセスに対していずれかの検出可能な正の効果若しくは負の効果を有し得るか、又は対象において疾患の発生又は症状を任意の測定可能な程度まで増加又は減少させ得る、任意の他の薬剤を含有しない組成物である。

【0033】

「約」という用語は、所定の値の＋／－１０％の範囲を表す。例えば、「約１０」は、１０の９０％～１１０％の範囲、すなわち９～１１を設定する。

【0034】

Ｉ．序論
それらの初期の研究において、本発明者らは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳における可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）タンパク質血清レベルの増加とアミロイドβ（Ａβ）プラーク形成の増加との相関、並びに特に一般集団（例えば、女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアのうち）のある特定のセグメント内での血清ｓＳＴ２レベル及びＡβプラーク蓄積の顕著な低減に示されるような、ｒｓ１９２１６２２のＡアレルの抗ＡＤ保護効果を発見した。例えば、国際公開第２０１７／００９７５０号及び国際公開第２０２１／０３７０２７号を参照されたい。本発明者らは、表４及び表５に列挙されるｒｓ１９２１６２２及び／又はその他のｓＳＴ２関連遺伝子バリアントを包含するゲノム配列の破壊が、脳内皮細胞におけるｓＳＴ２タンパク質の発現及び分泌を直接抑制する有効な手段として役立ち得ることを更に発見した。したがって、ｒｓ１９２１６２２遺伝子座のそのような破壊は、アルツハイマー病に罹患している患者の処置における治療上の利益、並びに疾患とまだ診断されていない個体におけるアルツハイマー病の予防又はリスク低減における予防上の利益を提供することが実証される。

【0035】

ＩＩ．一般的な組換え技術
組換え遺伝学の分野における一般的な方法及び技術を開示する基本的な文章としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第３編、２００１年）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９９０年）；及び、Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９４年）が挙げられる。

【0036】

核酸の場合、サイズはキロベース（ｋｉｌｏｂａｓｅ：ｋｂ）又は塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ：ｂｐ）のいずれかで与えられる。これらは、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、シーケンシングされた核酸、又は公開されたＤＮＡ配列に由来する推定値である。タンパク質の場合、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）又はアミノ酸残基番号で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動、シーケンシングされたタンパク質、由来するアミノ酸配列、又は公開されたタンパク質配列から推定される。

【0037】

市販されていないオリゴヌクレオチドは、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」、第１２巻：第６１５９～６１６８頁（１９８４年）に記載されているように、自動合成機を用いて、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．」、第２２巻：第１８５９～１８６２頁（１９８１年）によって最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、任意の当技術分野で認識されている戦略、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＲｅａｎｉｅｒ、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．」、第２５５巻：第１３７～１４９頁（１９８３年）に記載されている天然アクリルアミドゲル電気泳動又はアニオン交換ＨＰＬＣを用いて実施される。

【0038】

目的の遺伝子の配列、目的のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド、及び合成オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、「Ｇｅｎｅ」、第１６巻：第２１～２６頁（１９８１年）の二本鎖鋳型をシーケンシングするための連鎖停止反応法を用いて、クローニング又はサブクローニングの後に検証され得る。

【0039】

ＩＩ．ゲノム配列を破壊する組成物
本発明者らによる以前の研究は、アルツハイマー病の発症におけるｓＳＴ２タンパク質及び遺伝子座ｒｓ１９２１６２２の関与を例示した。彼らの最新の発見は、遺伝子座ｒｓ１９２１６２２並びに表４及び表５に列挙される他のゲノム部位を包含するゲノム配列を破壊することによって、脳におけるｓＳＴ２発現及びＡβプラーク蓄積を低減させることができることを明らかにしている。この発見により、このゲノム配列を破壊する組成物の治療的使用及び予防的使用がもたらされ、これは、ｒｓ１９２１６２２の遺伝子座並びに／若しくは表４及び表５に列挙される他の候補ゲノム部位におけるインタクトなゲノム配列のレベル、若しくはそれらを直ちに取り囲むインタクトなゲノム配列のレベルで作用し得るか、又はゲノム配列から転写されるｍＲＮＡのレベルで作用し得るものであって、既に疾患を有すると診断された患者におけるアルツハイマー病を処置するため、かつ、例えば家族歴又は既知の遺伝的バックグラウンド（例としては、１つ又は２つのＡＰＯＥ ε４アレルのキャリア、２１番染色体上のアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＰＰ）をエンコードするゲノム配列における点突然変異、１４番染色体上のプレセニリン１（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １：ＰＳＥＮ１）をエンコードするゲノム配列における点突然変異、及び１番染色体上のプレセニリン２（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ２：ＰＳＥＮ２）をエンコードするゲノム配列における点突然変異）に起因して、まだ診断を受けていないが疾患のリスクが高い個体におけるアルツハイマー病の後の発症のリスクを予防／低減するためのものである。異なる機構（例えば、ゲノム編集又はｍＲＮＡ抑制によって）を介して作用する様々なカテゴリーの可能な薬剤は、ｒｓ１９２１６２２含有ゲノム配列の破壊のためのそのような組成物を製剤化するのに有用であり、かつ以下に論じられる。

【0040】

Ａ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｓＳＴ２遺伝子、例えば、ｒｓ１９２１６２２又はｓＳＴ２遺伝子の３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）（Ｃｈｒ２：１０２、９５９、８９３～１０２、９６１、１８２）を包含する、ゲノム配列から転写されたＲＮＡのコード鎖（センス鎖）に相補的（又はアンチセンス）である、比較的短い核酸である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的にはＲＮＡベースであるが、また、ＤＮＡベースであってもよい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安定性を増加させるために修飾されることが多い。

【0041】

理論に拘束されるものではないが、ｍＲＮＡへのこれらの比較的短いオリゴヌクレオチドの結合は、内因性リボヌクレアーゼによるメッセージの分解を引き起こす二本鎖ＲＮＡのストレッチを誘導すると考えられている。くわえて、オリゴヌクレオチドは、コード配列のプロモータ付近に結合するように特異的に設計される場合があり、これらの状況下においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳を追加的に妨害し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドが機能する具体的な機構にかかわらず、細胞又は組織へのそれらの投与は、ｓＳＴ２遺伝子、例えばｒｓ１９２１６２２又はｓＳＴ２遺伝子の３’ＵＴＲ（Ｃｈｒ２：１０２、９５９、８９３～１０２、９６１、１８２）を包含するゲノム配列から転写されたＲＮＡの分解を可能にする。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ゲノム配列からのエンコードされた生成の発現及び／又は活性を減少させる。

【0042】

オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はキメラ混合物若しくは誘導体、又はそれらの修飾バージョン、一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、宿主細胞受容体を標的化するため）、又は細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９年、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」、第８６巻：第６５５３～６５５６頁；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７年、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」、第８４巻：第６４８～６５２頁；国際公開第８８／０９８１０号参照）若しくは血液脳関門（例えば、国際公開第８９／１０１３４号参照）を通過する輸送を推進する薬剤、ハイブリダイゼーショントリガー切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８年、「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第６巻：第９５８～９７６頁参照）、又は挿入剤（例えば、Ｚｏｎ、１９８８年、「Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．」、第５巻：第５３９～５４９頁）などの、他の付随基（ａｐｐｅｎｄｅｄ ｇｒｏｕｐ）を含みうる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子へとコンジュゲートさせることができる。

【0043】

本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用によって合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら（１９８８年、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」、第１６巻：第３２０９頁）の方法によって合成されてもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御細孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、１９８８年、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」、第８５巻：第７４４８～７４５１頁）などを使用することによって調製され得る。

【0044】

アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを細胞へと送達するためのいくつかの方法が開発されている：例えば、アンチセンス分子は、標的解剖学的部位へと直接注射することができ、又は所望の細胞（例えば、標的細胞表面上に発現される、受容体又は抗原に特異的に結合するペプチド又は抗体に連結されたアンチセンス）を標的とするように設計された修飾アンチセンス分子を体系的に投与することができる。

【0045】

ある特定の場合において、内因性ｍＲＮＡ上の翻訳を抑制するのに充分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することは困難であり得る。したがって、別のアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌ ＩＩＩプロモータ又はｐｏｌ ＩＩプロモータの制御下に置かれる組換えＤＮＡ構築物を利用する。例えば、ベクターは、細胞によって取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を指示するようにインビボで導入することができる。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生成することができる限り、エピソームのままであり得るか、又は染色体に組み込まれ得る。そのようなベクターは、当技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術方法によって構築することができる。ベクターは、哺乳動物細胞における複製及び発現に使用されるプラスミド、ウイルス、又は当技術分野で公知の他のものであり得る。アンチセンスＲＮＡをエンコードする配列の発現は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において作用することが当技術分野で公知の任意のプロモータによるものであり得る。そのようなプロモータは、誘導性又は構成的であり得る。そのようなプロモータとしては、ＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ、１９８１年、「Ｎａｔｕｒｅ」、第２９０巻：第３０４～３１０頁）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含有されるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０年、「Ｃｅｌｌ」、第２２巻：第７８７～７９７頁）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１年、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」、第７８巻：第１４４１～１４４５頁）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２年、「Ｎａｔｕｒｅ」、第２９６巻：第３９～４２頁）などが挙げられるが、これらに限定されない。任意のタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、又はウイルスベクターを使用して、標的組織部位へと直接導入することができる組換えＤＮＡ構築物を調製することができる。あるいは、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターを使用することができ、その場合、投与は別の経路によって（例えば、体系的に）達成され得る。

【0046】

Ｂ．低分子干渉ＲＮＡ
いくつかの実施形態では、薬剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡｉ構築物は、標的遺伝子の発現を特異的にブロックすることができる二本鎖ＲＮＡを含む。「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が特異的かつ転写後の様式で遺伝子発現をブロックする現象に最初に適用される用語である。ＲＮＡｉは、インビトロ又はインビボで遺伝子発現を阻害する有用な方法を提供する。ＲＮＡｉ構築物は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びインビボで開裂されてｓｉＲＮＡを形成することができる他のＲＮＡ種を含むことができる。本明細書のＲＮＡｉ構築物はまた、細胞内でｄｓＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡを形成する転写物、及び／又はインビボでｓｉＲＮＡを生成することができる転写物を生じさせることが可能な発現ベクター（「ＲＮＡｉ発現ベクター」を含む。

【0047】

ＲＮＡｉ発現ベクターは、構築物が発現される細胞においてｓｉＲＮＡ部分を生成するＲＮＡを発現（転写）する。そのようなベクターは、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する遺伝子エレメント（複数可）（例えば、プロモータ、オペレータ、又はエンハンサーのアセンブリ）と、（２）転写されて二本鎖ＲＮＡ（細胞内でアニーリングしてｓｉＲＮＡを形成する２つのＲＮＡ部分、又はｓｉＲＮＡにプロセシングされ得る単一のヘアピンＲＮＡ）を生成する「コード」配列に作動可能に連結されるものと、（３）適切な転写開始配列及び転写終結配列と、のアセンブリを含む、転写単位を含む。プロモータ及び他の調節エレメントの選択は、概して、意図される宿主細胞に応じて変化する。

【0048】

ＲＮＡｉ構築物は、細胞の生理学的条件下において、阻害される遺伝子（すなわち、ｒｓ１９２１６２２又はｓＳＴ２遺伝子の３’ＵＴＲを包含するゲノム配列から転写されたＲＮＡ）のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部のヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含有する。二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する天然のＲＮＡと充分に類似してさえいればよい。このようにして、本発明は、遺伝子突然変異、株多型、又は進化的分岐に起因して予想され得る配列突然変異を許容することが可能だという利点を有する。標的配列とＲＮＡｉ構築物配列との許容されるヌクレオチドミスマッチの数は、５塩基対中１個以下、又は１０塩基対中１個以下、又は２０塩基対中１個以下、又は５０塩基対中１個以下である。ｓｉＲＮＡ二重鎖の中心におけるミスマッチが最も重要であり、かつ標的ＲＮＡの切断を本質的に消失し得る。対照的に、標的ＲＮＡに相補的なｓｉＲＮＡ鎖の３’末端のヌクレオチドは、標的認識の特異性に有意に寄与しない。

【0049】

ＲＮＡｉ構築物の製造は、化学合成法又は組換え核酸技術によって行うことができる。処置された細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、インビボで転写を媒介し得るか、又はクローニングされたＲＮＡポリメラーゼは、インビトロでの転写に使用され得る。ＲＮＡｉ構築物は、例えば、細胞ヌクレアーゼに対する感受性を低減させ、バイオアベイラビリティを改善し、製剤特徴を改善し、及び／又は他の薬物動態学的特性を変更するために、リン酸－糖骨格又はヌクレオシドのいずれかに対する修飾を含みうる。例えば、天然のＲＮＡのホスホジエステル連結は、窒素又は硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含むように修飾されていてもよい。ＲＮＡ構造の修飾は、ｄｓＲＮＡに対する一般的な応答を回避しながら、特異的な遺伝子阻害を可能にするように合わせられてもよい。同様に、塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性をブロックするように修飾され得る。ＲＮＡｉ構築物は、酵素的に又は部分的／全有機合成によって生成されてもよく、任意の修飾リボヌクレオチドは、インビトロ酵素合成又は有機合成によって導入され得る。

【0050】

ある特定の実施形態では、主題のＲＮＡｉ構築物は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」である。これらの核酸は、およそ１９～３０ヌクレオチド長、更により好ましくは２１～２３ヌクレオチド長であり、例えば、より長い二本鎖ＲＮＡのヌクレアーゼ「ダイシング」によって産生されたフラグメントに対応する長さである。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を動員し、特定の配列と対合することによって複合体を標的ｍＲＮＡへとガイドするものと理解される。その結果、標的ｍＲＮＡは、タンパク質複合体中のヌクレアーゼによって分解される。特定の実施形態では、２１～２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。

【0051】

ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物は、短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡと呼ばれる）の形態である。ｓｈＲＮＡは、外因的に合成され得、又はインビボでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータから転写することによって形成され得る。哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングのためのそのようなヘアピンＲＮＡの作製及び使用の例は、例えば、Ｐａｄｄｉｓｏｎら、「Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ」、２００２年、第１６巻：第９４８～５８頁；ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、「Ｎａｔｕｒｅ」、２００２年、第４１８巻：第３８～９頁；Ｙｕら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」、２００２年、第９９巻：第６０４７～５２頁）に記載されている。多くの場合、そのようなｓｈＲＮＡは、所望の遺伝子の連続的かつ安定な抑制を確実にするために細胞又は動物において操作される。ｓｉＲＮＡは、細胞内でヘアピンＲＮＡをプロセシングすることによって生成され得ることが当技術分野で公知である。

【0052】

プラスミドを使用して、例えば転写産物として二本鎖ＲＮＡを送達し得る。そのような実施形態では、プラスミドは、ＲＮＡｉ構築物のセンス鎖及びアンチセンス鎖の各々に「コード配列」を含むように設計される。コード配列は、同じ配列であってもよく、例えば、逆方向プロモータに隣接し得、又は各々が別個のプロモータの転写制御下にある２つの別個の配列であり得る。コード配列が転写された後、相補的ＲＮＡは、塩基対を転写して二本鎖ＲＮＡを形成する。

【0053】

Ｃ．リボザイム
いくつかの実施形態では、薬剤は、リボザイムである。ｍＲＮＡ転写物を触媒的に開裂するように設計されたリボザイム分子もまた、ｍＲＮＡの下流効果を破壊及び防止するために使用される（例えば、国際公開第９０／１１３６４号参照；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０年、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第２４７巻：第１２２２～１２２５頁、及び米国特許第５，０９３，２４６号）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを開裂するリボザイムを使用して特定のｍＲＮＡを破壊することができるが、一方でハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域によって指示される位置でｍＲＮＡを開裂する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが２つの塩基：５’－ＵＧ－３’の続く配列を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び生成は当技術分野で周知であり、Ｈａｓｅｌｏｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ、１９８８年、「Ｎａｔｕｒｅ」、第３３４巻：第５８５～５９１頁に更に詳細に記載されている。

【0054】

本発明で使用するためのリボザイムはまた、例えば、テトラヒメナ・サーモフィラ（ＩＶＳ、又はＬ－１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られている）において天然に存在するような、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（本明細書では以下「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）を含んでもよく、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈ及び共同研究者（Ｚａｕｇら、１９８４年、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第２２４巻：第５７４～５７８頁；Ｚａｕｇ及びＣｅｃｈ、１９８６年、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第２３１巻：第４７０～４７５頁；Ｚａｕｇら、１９８６年、「Ｎａｔｕｒｅ」、第３２４巻：第４２９～４３３頁；国際公開第８８／０４３００号；Ｂｅｅｎ及びＣｅｃｈ、１９８６年、「Ｃｅｌｌ」、第４７巻：第２０７～２１６頁）によって広く記載されている。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズし、その後標的ＲＮＡの切断が起こる、８塩基対の活性部位を有する。本発明は、８塩基対活性部位配列を標的とするＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。

【0055】

アンチセンスアプローチの場合と同様に、リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、改善された安定性、標的化などのため）から構成され得、かつインビトロ又はインビボで細胞に送達され得る。好ましい送達方法は、トランスフェクトされた細胞が標的ｍＲＮＡを破壊し、かつその効果を阻害するのに充分な分量のリボザイムを生成するように、強力な構成的ｐｏｌ ＩＩＩプロモータ又はｐｏｌ ＩＩプロモータの制御下においてリボザイムのＤＮＡ構築物「エンコーディング」を用いることを含む。リボザイムはアンチセンス分子とは異なり触媒的であるので、効率のためにはより低い細胞内濃度が必要である。

【0056】

現在、２つの塩基性タイプのＤＮＡ酵素が存在し、これらの両方は、Ｓａｎｔｏｒｏ及びＪｏｙｃｅによって同定された（例えば、第６，１１０，４６２号参照）。１０－２３ ＤＮＡ酵素は、２つのアームを連結するループ構造を含む。２つのアームは、特定の標的核酸配列を認識することによって特異性を提供し、一方でループ構造は、生理学的条件下において触媒機能を提供する。

【0057】

簡潔には、標的核酸を特異的に認識及び開裂する理想的なＤＮＡ酵素を設計するために、当業者は、最初に固有の標的配列を同定しなければならない。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて概説したのと同じアプローチを用いて行うことができる。好ましくは、固有又は実質的な配列は、およそ１８～２２ヌクレオチドのＧ／Ｃリッチである。高いＧ／Ｃ含有量は、ＤＮＡ酵素と標的配列とのより強い相互作用を保証するのに役立つ。

【0058】

ＤＮＡ酵素を合成する場合、酵素をメッセージに標的化する特異的アンチセンス認識配列は、それがＤＮＡ酵素の２つのアームを含むように分割され、ＤＮＡ酵素ループは２つの特異的アームの間に配置される。

【0059】

ＤＮＡ酵素を作製及び投与する方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号に見出され得る。同様に、インビトロ又はインビボでＤＮＡリボザイムを送達する方法には、上記で詳細に概説したように、ＲＮＡリボザイムを送達する方法が含まれる。くわえて、当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのように、安定性を改善し、かつ分解に対する耐性を改善するために、ＤＮＡ酵素を所望により修飾することができることを認識するであろう。

【0060】

Ｄ．ゲノム編集
ｓＳＴ２タンパク質発現の阻害は、遺伝子座ｒｓ１９２１６２２、並びに／又は表４及び表５に列挙される他のゲノム部位、又はｓＳＴ２遺伝子／転写物の３’－ＵＴＲを包含する遺伝子配列の破壊によって達成され得る。標的遺伝子切断の１つの有効な手段は、ＣＲＩＳＰＲシステムである。

【0061】

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートの略語である、ＣＲＩＳＰＲという用語は、細菌及び古細菌において最初に見出された短い反復塩基配列を含有する、原核生物ＤＮＡのセグメントに関して最初に作り出された。回文反復では、ヌクレオチドの配列は、両方向で同じである。各反復の後に、外来ＤＮＡ（例えば、ウイルスのＤＮＡ）への以前の曝露からのスペーサＤＮＡの短いセグメントが続く。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子の小さなクラスターは、ＣＲＩＳＰＲ配列の隣に位置する。後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、外来遺伝子エレメント、特にウイルス起源のものに対する耐性を付与し、それによって獲得免疫の形態を提供する、原核生物免疫システムであることが認識された。スペーサ配列を保持するＲＮＡは、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質が外因性ＤＮＡを認識及び切断するのを助ける。他のＲＮＡガイドＣａｓタンパク質は外来ＲＮＡを切断した。ＣＲＩＳＰＲは、シーケンシングされた細菌ゲノムのおよそ５０％、及びシーケンシングされた古細菌のほぼ９０％に見られ、最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、真核細胞における標的遺伝子編集での使用に適合している。例えば、Ｌｅｄｆｏｒｄ（２０１６年）、「Ｎａｔｕｒｅ」、第５３１巻（第７５９３号）：第１５６～９頁を参照のこと。

【0062】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単純なバージョンであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ゲノムを編集するために修飾されている。１又は複数の合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化したＣａｓ９ヌクレアーゼを細胞へと送達することによって、典型的には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（複数可）をエンコードする１又は複数の発現ベクターで細胞をトランスフェクトすることによって、細胞のゲノムを、１又は複数の予め選択された位置で切断し、標的遺伝子（例えば、ｒｓ１９２１６２２を保持するゲノム配列）を除去し、及び／又は新しい配列で置換することを可能にすることができる。

【0063】

この場合、表４及び表５に列挙される部位を含有するｒｓ１９２１６２２包含ゲノム配列及び／又は他のゲノム配列に特異的な１又は複数のｇＲＮＡに対するコード配列を保有する、発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）を、内因性ｒｓ１９２１６２２含有ゲノム配列並びに／又は表４及び表５に列挙される部位を含有する他のゲノム配列が、ノックアウトされる細胞（例えば、内皮細胞又は内皮前駆細胞）へと導入され得る。同じ発現ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又は同等物に対するコード配列も所望により保有する。代替的には、別個の発現ベクターが、標的細胞におけるその発現のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼコード配列を導入するために使用され得る。いくつかの場合では、２以上（例えば、２）の異なるｇＲＮＡを使用して、標的ゲノム配列（例えば、ｒｓ１９２１６２２座位、並びに／又は表４及び表５に列挙される他のゲノム部位を包含するもの）の除去及び／又は置換を確実にする。

【0064】

本発明を実施するために使用することができる追加的な遺伝子編集システムとしては、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、及び塩基編集、並びにホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼ（ＭｅｇＮ）（ＤＮＡ配列を標的化し開裂する）及びプライム編集（遺伝子改変のためのＲＮＡ鋳型を産生する）などの新たに開発された技術が挙げられる。

【0065】

ＩＩＩ．医薬組成物及び投与
本発明はまた、予防的用途及び治療用途の両方における本発明の方法において有用な有効量の１又は複数の薬剤を含む、医薬組成物又は生理学的組成物を提供する。そのような医薬組成物又は生理学的組成物はまた、１又は複数の医薬的又は生理学的に許容される添加剤又はキャリアを含む。例としては、本発明の１つの例示的な組成物は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又は同等物、及び１つ又は２つのｓｇＲＮＡ）をエンコードする１又は複数の発現ベクターと、１又は複数の生理学的に許容される添加剤又はキャリアと、を含むか、又はこれらから本質的になる。本発明の別の例示的な組成物では、１又は複数の阻害性オリゴヌクレオチド（例えば、低分子阻害性ＲＮＡ分子、又はアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド若しくはＲＮＡオリゴヌクレオチド）をエンコードする１又は複数の発現ベクターと、１又は複数の生理学的に許容される添加剤又はキャリアと、を含むか、又はこれらから本質的になる。本発明の医薬組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用に好適である。本発明での使用に好適な製剤は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５年）に見られる。薬物送達のための方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第２４９巻：第１５２７～１５３３頁（１９９０年）を参照されたい。

【0066】

本発明の医薬組成物は、様々な経路、例えば、経口、皮下、経皮、筋肉内、静脈内、又は頭蓋内によって投与され得る。医薬組成物を投与する好ましい経路は、レシピエントにおける標的疾患に対する関連器官又は組織への、所定の１日用量での局所送達である。適切な用量は、１日１回の用量で、又は適切な間隔で提示される分割用量として、例えば１日当たり２回、３回、４回、又はそれ以上の分割用量として投与され得る。

【0067】

本発明の１又は複数の活性薬剤を含有する医薬組成物を調製するために、不活性かつ医薬的に許容されるキャリアもまた使用される。典型的には、医薬的キャリアは、固体又は液体のいずれかであり得る。固形の調製物としては、例えば、散剤、錠剤、分散性顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤、及び坐剤が挙げられる。固体キャリアは、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁化剤、結合剤、又は錠剤、崩壊剤としてもまた作用することができる１又は複数の物質であり得、これはまた、カプセル化材料であり得る。

【0068】

散剤において、キャリアは、概して、微粉化された活性成分と混合された微粉化固体である。錠剤において、活性成分は、必要な結合特性を有するキャリアと好適な割合で混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。

【0069】

坐剤の形態である医薬組成物を調製するために、脂肪酸グリセリドとココアバターとの混合物などの低融点ワックスを最初に溶融し、活性成分を、例えば撹拌することによってその中に分散させる。次いで、溶融した均質な混合物を、便利な大きさの型に注ぎ、冷却して、固化させる。

【0070】

散剤及び錠剤は、好ましくは、約５重量％～約７０重量％の活性成分を含有する。好適なキャリアとしては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラクトース、糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどが挙げられる。

【0071】

医薬組成物は、キャリアがしたがって薬剤（複数可）と会合するように、（他のキャリアの有無にかかわらず）１又は複数の薬剤がキャリアによって囲まれたカプセルを提供するキャリアとしての、カプセル化材料を有する活性薬剤（複数可）の製剤を含みうる。同様に、カシェ剤もまた含まれ得る。錠剤、散剤、カシェ剤、及びカプセル剤は、経口投与に好適な固体剤形として使用され得る。

【0072】

液体医薬組成物としては、例えば、経口投与又は非経口投与に好適な溶液、懸濁液、及び経口投与に好適なエマルジョンが挙げられる。水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、エタノール、又はプロピレングリコールを含む溶媒中における活性成分（複数可）の滅菌水溶液又は活性成分（複数可）の滅菌溶液は、非経口投与に好適な液体組成物の例である。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤、洗剤などの生理学的条件に近似するために必要とされるような、医薬的に許容される補助物質を含有し得る。

【0073】

滅菌溶液は、活性成分（複数可）を所望の溶媒システム中に溶解し、次いで得られた溶液を膜フィルタに通して滅菌することによって、又はあるいは、滅菌条件下において滅菌構成成分（複数可）を予め滅菌した溶媒中に溶解することによって、調製することができる。得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージングされてもよく、又は凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性キャリアと組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には、３～１１、より好ましくは５～９、最も好ましくは７～８である。

【0074】

１又は複数の活性薬剤を含有する医薬組成物は、予防的処置及び／又は治療的処置のために投与され得る。治療用途では、組成物は、既にアルツハイマー病に罹患している患者に、疾患の発症、進行、持続期間、及び重症度などの、疾患及びその合併症の症状を予防、治癒、逆転、又は少なくとも部分的に遅らせる若しくは停止するのに充分な量で投与される。これを達成するのに妥当な量を「治療的有効用量」と定義する。この使用に有効な量は、疾患の重症度、患者の体重及び全身状態、並びに活性薬剤（複数可）の性質に依存する。

【0075】

予防的用途では、１又は複数の活性薬剤を含有する医薬組成物は、症状の発症を遅延又は予防するのに充分な量で、アルツハイマー病にかかりやすい患者、又はそうでなければアルツハイマー病を発症するリスクがある患者に投与される。このような量を「予防的有効用量」と定義する。この使用では、活性薬剤（複数可）の正確な量は、やはり患者の健康状態及び体重、並びに活性薬剤（複数可）の性質に依存する。

【0076】

組成物の単回投与又は複数回投与は、処置医によって選択される用量レベル及びパターンで行われ得る。いずれの場合でも、医薬製剤は、治療的又は予防的のいずれかで、患者のｓＳＴ２タンパク質の血清レベル及びＡβプラーク形成を効果的に抑制するのに充分な分量の薬剤（複数可）を提供すべきである。

【0077】

ＩＶ．核酸を用いた治療用途
コード配列が転写され、ポリペプチド剤又はオリゴヌクレオチド剤が細胞内で生成されるように、ｒｓ１９２１６２２包含ゲノム配列、並びに／又は表４及び表５に列挙される部位を含有する他のゲノム配列を破壊する１又は複数の薬剤をエンコードする核酸を細胞へと導入すること、又はゲノム配列によってエンコードされるｍＲＮＡ（アンチセンス又はｍｉＲＮＡ又はＣａｓ９ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡなど）を阻害することを含む、治療アプローチによって、種々の状態を処置することができる。遺伝性疾患及び後天性疾患の治療に対する遺伝子療法の適用に関する議論については、Ｍｉｌｌｅｒ、「Ｎａｔｕｒｅ」、第３５７巻：第４５５～４６０頁（１９９２年）；及び、Ｍｕｌｌｉｇａｎ、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第２６０巻：第９２６～９３２頁（１９９３年）を参照されたい。

【0078】

Ａ．遺伝子送達用ベクター
細胞又は生物への送達のために、１又は複数の活性薬剤をエンコードするポリヌクレオチドを、ベクターへと組み込むことができる。そのような目的のために使用されるベクターの例としては、標的細胞における核酸の発現を指示することが可能な発現プラスミドが含まれる。他の例では、ベクターは、ポリヌクレオチドが標的細胞をトランスフェクトすることが可能なウイルスゲノムへと組み込まれている、ウイルスベクターシステムである。一実施形態では、エンコードポリヌクレオチドは、所望の標的宿主細胞におけるポリペプチド又はオリゴヌクレオチドの発現を指示することができる発現配列及び制御配列に作動可能に連結され得る。このようにして、標的細胞で適切な条件下において、ポリペプチド阻害剤又はオリゴヌクレオチド阻害剤の発現を達成することができる。

【0079】

Ｂ．遺伝子送達システム
ｒｓ１９２１６２２、並びに／又は表４及び表５に列挙される他のゲノム部位を包含するゲノム配列を破壊するポリペプチド又はオリゴヌクレオチドの発現に有用なウイルスベクター系には、例えば、天然に存在するウイルスベクターシステム又は組換えウイルスベクターシステムが含まれる。特定の用途に応じて、好適なウイルスベクターには、複製コンピテント、複製欠損、及び条件付き複製ウイルスベクターが含まれる。例えば、ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス又はウシアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、マウス微小ウイルス（ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ：ＭＶＭ）、ＨＩＶ、シンドビスウイルス、及びレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスを含むが、これらに限定されない）、及びＭｏＭＬＶのゲノムに由来し得る。典型的には、目的のコード配列（例えば、本発明のポリペプチド活性薬剤又はオリゴヌクレオチド活性薬剤をエンコードするもの）を、そのようなベクターへと挿入して、典型的には付随するウイルスＤＮＡと共に遺伝子構築物をパッケージングし、続いて感受性宿主細胞を感染させ、目的のコード配列を発現させる。

【0080】

本明細書で使用される場合、「遺伝子送達システム」とは、目的のポリヌクレオチド配列を標的細胞へと送達するための任意の手段を指す。本発明のいくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ連結部分（Ｗｕら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、第２６３巻：第１４６２１～１４６２４頁（１９８８年）；国際公開第９２／０６１８０号）などの適切な連結部分を介して、又は超音波－マイクロバブル送達システム（Ｌａｎ ＨＹら、「Ｊ．Ａｍ Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．」、第１４巻：第１５３５～１５４８頁）によって、取り込みの推進（例えば、コーティングピットの陥入及びエンドソームの内部移行）のために、細胞受容体リガンドへとコンジュゲートされる。例えば、核酸は、ポリリジン部分を介して、肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体に対するリガンドであるアシアロ－オロムコシドに連結され得る。

【0081】

同様に、目的の核酸を含む遺伝子構築物をパッケージングするために使用されるウイルスエンベロープは、受容体に特異的な受容体リガンド又は抗体を添加して、受容体媒介エンドサイトーシスを特定の細胞に可能にすることによって修飾することができる（例えば、国際公開第９３／２０２２１号、国際公開第９３／１４１８８号、及び国際公開第９４／０６９２３号を参照されたい）。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物は、エンドサイトーシスを推進するために、アデノウイルス粒子などのウイルスタンパク質に連結される（Ｃｕｒｉｅｌら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」、第８８巻：第８８５０～８８５４頁（１９９１年））。他の実施形態では、本発明の活性薬剤は、微小管阻害剤（ＷＯ／９４０６９２２号）、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（Ｐｌａｎｋら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、第２６９巻：第１２９１８～１２９２４頁（１９９４年））を模倣する合成ペプチド、及びＳＶ４０ Ｔ抗原（ＷＯ９３／１９７６８号）などの核局在化シグナルを含みうる。

【0082】

レトロウイルスベクターはまた、本発明のポリペプチド活性薬剤又はオリゴヌクレオチド活性薬剤のコード配列を、標的細胞又は組織へと導入するためにも有用であり得る。レトロウイルスベクターはレトロウイルスを遺伝子操作することによって生成される。レトロウイルスのウイルスゲノムはＲＮＡである。感染の際、このゲノムＲＮＡは、高度の安定性及び効率で形質導入細胞の染色体ＤＮＡへと組み込まれる、ＤＮＡコピーに逆転写される。組み込まれたＤＮＡコピーはプロウイルスと称され、任意の他の遺伝子と同様に、娘細胞によって継承される。野生型レトロウイルスゲノム及びプロウイルスＤＮＡは、２つの長末端反復（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ：ＬＴＲ）配列に隣接し、３つの遺伝子：ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子を有する。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（ヌクレオカプシド）タンパク質をエンコードする；ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をエンコードする；ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をエンコードする。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写及びポリアデニル化を促進するのに役立つ。５’ＬＴＲに隣り合って、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）及びウイルスＲＮＡの粒子への効率的な封入（Ｐｓｉ部位）に必要な配列がある（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、「Ｉｎ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｉｎｏｕｙｅ（編）、第１５５～１７３頁（１９８３年）；Ｍａｎｎら、「Ｃｅｌｌ」、第３３巻：第１５３～１５９頁（１９８３年）；Ｃｏｎｅ及びＭｕｌｌｉｇａｎ、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．」、第８１巻：第６３４９～６３５３頁（１９８４年）を参照されたい）。

【0083】

レトロウイルスベクターの設計は当業者に周知である。手短に言えば、キャプシド形成（又はレトロウイルスＲＮＡの感染性ビリオンへのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠失している場合、結果は、ゲノムＲＮＡのキャプシド形成を予防するシス作用欠陥である。しかしながら、得られた突然変異体は、依然として全てのビリオンタンパク質の合成を指示することが可能である。これらの配列が欠失されたレトロウイルスゲノム、及び染色体へと安定に組み込まれた突然変異ゲノムを含有する細胞株は、当技術分野で周知であり、レトロウイルスベクターを構築するために使用される。レトロウイルスベクターの調製及びその使用は、例えば、欧州特許出願公開第ＥＰＡ０１７８２２０号；米国特許第４，４０５，７１２号；Ｇｉｌｂｏａ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第４巻：第５０４～５１２頁（１９８６年）；Ｍａｎｎら、「Ｃｅｌｌ」、第３３巻：第１５３～１５９頁（１９８３年）；Ｃｏｎｅ及びＭｕｌｌｉｇａｎ、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第８１巻：第６３４９～６３５３頁（１９８４年）；Ｅｇｌｉｔｉｓら、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第６巻：第６０８～６１４頁（１９８８年）；Ｍｉｌｌｅｒら、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第７巻：第９８１～９９０頁（１９８９年）；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２年）、上記；Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３年）、上記；及び、国際公開第９２／０７９４３号を含む、多くの刊行物に記載されている。

【0084】

レトロウイルスベクター粒子は、所望のヌクレオチド配列をレトロウイルスベクターへと組換え的に挿入し、パッケージング細胞株を使用してレトロウイルスキャプシドタンパク質でベクターをパッケージングすることによって、調製される。得られたレトロウイルスベクター粒子は、宿主細胞内で複製することは不可能であるが、所望のヌクレオチド配列を含有するプロウイルス配列として宿主細胞ゲノムへと組み込むことが可能である。結果として、患者は、例えば、本発明の方法において有用なポリペプチド活性薬剤又はポリヌクレオチド活性薬剤を生成することが可能であり、このようにして、標的細胞（例えば、脳内皮細胞）を正常な表現型に回復させることが可能である。

【0085】

レトロウイルスベクター粒子を調製するために使用されるパッケージング細胞株は、典型的には、パッケージングに必要な必要なウイルス構造タンパク質を生成するが、感染性ビリオンを生成することが不可能である、組換え哺乳動物組織培養細胞株である。一方で、使用される欠陥レトロウイルスベクターは、これらの構造遺伝子を欠くが、パッケージングに必要な残りのタンパク質をエンコードする。パッケージング細胞株を調製するために、パッケージング部位が欠失された所望のレトロウイルスの感染性クローンを構築することができる。この構築物を含む細胞は、全ての構造ウイルスタンパク質を発現するが、導入されたＤＮＡはパッケージングすることが不可能である。あるいは、パッケージング細胞株は、適切なコア及びエンベロープタンパク質をエンコードする１又は複数の発現プラスミドで細胞株を形質転換することによって生成することができる。これらの細胞において、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子は、同じレトロウイルス又は異なるレトロウイルスに由来し得る。

【0086】

本発明に好適ないくつかのパッケージング細胞株もまた、先行技術において利用可能である。これらの細胞株の例としては、Ｃｒｉｐ、ＧＰＥ８６、ＰＡ３１７及びＰＧ１３（Ｍｉｌｌｅｒら、「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」、第６５巻：第２２２０～２２２４頁（１９９１年）参照）が挙げられる。他のパッケージング細胞株の例は、Ｃｏｎｅ及びＭｕｌｌｉｇａｎ、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ」、第８１巻：第６３４９～６３５３頁（１９８４年）；Ｄａｎｏｓ及びＭｕｌｌｉｇａｎ、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ」、第８５巻：第６４６０～６４６４頁（１９８８年）；Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８８年）、上記；及び、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０年）、上記、に記載されている。

【0087】

キメラエンベロープタンパク質を有するレトロウイルスベクター粒子を生成することが可能なパッケージング細胞株を使用してもよい。あるいは、ＰＡ３１７及びＧＰＸパッケージング細胞株によって生成されるものなどの両種指向性又は異種指向性のエンベロープタンパク質を使用して、レトロウイルスベクターをパッケージングしてもよい。

【0088】

Ｃ．医薬製剤
医薬的目的のために使用される場合、ポリペプチド活性薬剤又はオリゴヌクレオチド活性薬剤をエンコードする核酸は、概して、好適な緩衝液中に製剤化され、これは、任意の医薬的に許容される緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水又はリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、及びＧｏｏｄら、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第５巻：第４６７頁（１９６６年）に記載されているものなどの当業者に公知の他の緩衝液などであり得る。

【0089】

組成物は、安定剤、エンハンサー、又は他の医薬的に許容されるキャリア若しくはビヒクルを追加的に含みうる。医薬的に許容されるキャリアは、例えば、本発明の核酸及び任意の関連するベクターを安定化するように作用する、生理学的に許容される化合物を含有し得る。生理学的に許容される化合物は、炭水化物、例えばグルコース、スクロース、若しくはデキストランなど、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸若しくはグルタチオンなど、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定剤若しくは添加剤を含みうる。他の生理学的に許容される化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤、又は防腐剤が含まれ、これらは、微生物の成長又は作用を予防するために特に有用である。様々な防腐剤が周知であり、例えば、フェノール及びアスコルビン酸が含まれる。キャリア、安定剤、又はアジュバントの例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５年）に見出すことができる。

【0090】

Ｄ．製剤の投与
ポリペプチド活性薬剤又はオリゴヌクレオチド活性薬剤をエンコードするポリヌクレオチド配列を含有する製剤は、当業者に公知の任意の送達方法を用いて標的組織又は標的器官へと送達され得る。本発明のいくつかの実施形態では、エンコードするポリヌクレオチド配列は、皮下注射用、筋肉内注射用、静脈内注射用、若しくは腹腔内注射用、又は経口摂取用若しくは局所適用用に製剤化される。

【0091】

目的の核酸を含有する製剤は、典型的には、細胞に直接投与される。細胞は、循環システムの一部としての赤血球などの組織の一部として、又は組織培養などで単離された細胞として提供され得る。細胞は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで提供され得る。

【0092】

製剤は、種々の方法によってインビボ又はエクスビボで目的の組織へと導入することができる。本発明のいくつかの実施形態では、目的の核酸を、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム融合、超音波、エレクトロポレーション、又はバイオリスティックなどの方法によって細胞へと導入される。更なる実施形態では、例えば、標的細胞が脳内皮細胞頭蓋内注射である場合、核酸は、処置されている疾患又は状態に関連する標的組織又は標的器官によって直接取り込まれることが適切である。

【0093】

本発明のいくつかの実施形態では、目的の核酸を、患者から外植された細胞又は組織にエクスビボで投与し、次いで、患者に戻す。治療用遺伝子構築物のエクスビボ投与の例としては、Ｎｏｌｔａら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第９３巻（第６号）：第２４１４～９頁（１９９６年）；Ｋｏｃら、「Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」、第２３巻（第１号）：第４６～６５頁（１９９６年）；Ｒａｐｅｒら、「Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ」、第２２３巻（第２号）：第１１６～２６頁（１９９６年）；Ｄａｌｅｓａｎｄｒｏら、「Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉ．Ｓｕｒｇ．」、第１１巻（第２号）：第４１６～２２頁（１９９６年）；及び、Ｍａｋａｒｏｖら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第９３巻（第１号）：第４０２～６頁（１９９６年）が挙げられる。

【0094】

製剤の有効投与量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、及び投与される他の薬剤を含む、多くの異なる要因に応じて変化する。このようにして、治療投与量は、安全性及び有効性を最適化するために滴定する必要がある。投与されるべきベクターの有効量を決定する際に、医師は、使用される特定の核酸、診断されている疾患状態；患者の年齢、体重、及び全身状態、循環血漿レベル、ベクター毒性、疾患の進行、並びに抗ベクター抗体の生成を評価すべきである。投与のサイズはまた、特定のベクターの投与に伴う、任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定され得る。例えば、１～１０００ｍｇ、１０～２００ｍｇ、又は２０～１００ｍｇの量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、少なくとも１～３ヶ月又はそれより長い期間にわたって、毎週投与、隔週投与、又は毎月投与の頻度で静脈内注射によって患者へと送達され得る。ｓＳＴ２ゲノム領域を標的とするＣＲＩＳＰＲ編集のために、別の例として、各５×１０^５細胞（例えば、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞）は、一対のｓｇＲＮＡと一緒にＣａｓ９をエンコードする遺伝子を保有する０．５μｇ～５０μｇ；１～２０μｇ；又は２～１０μｇのベクターでトランスフェクトされる。ヒト患者におけるｓＳＴ２ゲノム領域を標的とするＣＲＩＳＰＲ編集のために、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを保有する脂質ナノ粒子の用量は、１～４週間にわたって１～３回のｉ．ｖ．注射によって送達される、０．０１～２ｍｇ／ｋｇ体重；０．０２～１．０ｍｇ／ｋｇ体重；０．０５～０．５ｍｇ／ｋｇ体重；又は０．１０～０．３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。

【0095】

Ｖ．キット
本発明はまた、本発明の方法に従って、アルツハイマー病の治療又はアルツハイマー病のリスクの低減を必要とする個人において、アルツハイマー病を治療するため又はアルツハイマー病のリスクを低減するためのキットを提供する。キットは、典型的には、（１）ｒｓ１９２１６２２、及び／若しくは表４及び表５に列挙される他のゲノム部位を包含するゲノム配列を破壊すること、並びに／又はゲノム配列から転写されるｍＲＮＡを抑制することが可能である、有効量の１又は複数の活性薬剤を有する医薬組成物と、（２）治療され得る患者の種類（例えば、アルツハイマー病に罹患しているか、又は疾患のリスクが高いヒト患者）、スケジュール（例えば、用量及び頻度）及び投与経路などの説明を含む、医薬組成物をどのように分注するかについての指示を含む情報材料と、を含有する容器を含む。いくつかの場合では、有効量の少なくとも１つの活性薬剤、例えば、ベクター、又はＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、又は同等物及び１若しくは複数のｓｇＲＮＡ）の構成成分をエンコードするか、若しくはｓＳＴ２遺伝子／転写物の３’－ＵＴＲを含むｒｓ１９２１６２２を包含するゲノム配列を標的とするｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミニＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドをエンコードするベクターなどを各々が含む、複数の医薬組成物を提供するために、キットに２つ以上の容器が含まれる。所望により、キットは、１又は複数の追加的な容器を更に含んでいてもよく、各々が、その個人のゲノムの少なくとも一部、特に遺伝子座ｒｓ１９２１６２２、並びに／又は表４及び表５に列挙される他のゲノム部位を包含するゲノム配列をシーケンシングするのに有用な、少なくとも１つの薬剤を含有する。

【実施例】

【0096】

以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、限定を目的として提供されない。当業者は、本質的に同様の結果をもたらすように変更又は修正することができる、種々の重要でないパラメータを容易に認識するであろう。

【0097】

概要
循環タンパク質のレベルの変化はアルツハイマー病（ＡＤ）と関連するが、一方で、ＡＤにおけるそれらの病原的役割は不明である。ここで、本発明者らは、ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達の可溶性デコイ受容体である可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）が、ＡＤ病因に関与することを報告する。本発明者らは、ｓＳＴ２レベルの上昇が、ＡＤ患者におけるより重篤な神経変性及びＡβ病理学的病変と関連し、かつアミロイド症マウスモデルにおいてＡβ蓄積の増悪及びＡβ－ミクログリア共局在化の低減をもたらし得ることを見出した。本発明者らのゲノムワイド関連研究は、減少したｓＳＴ２レベルと関連するＩＬ１ＲＬ１（ｓＳＴ２をエンコードする遺伝子）における遺伝子バリアントを同定した。典型的には、ＩＬ１ＲＬ１のエンハンサーエレメントに位置するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集によるｒｓ１９２１６２２バリアントの欠失は、脳内皮細胞におけるｓＳＴ２の発現及び分泌を減少させる；そのｓＳＴ２レベルの低下は、女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいて、ＡＤ及びそれほど重篤ではないＡＤ関連エンドフェノタイプを発症するリスクの減少と関連している。ＡＤ脳の免疫組織化学的及び単一核トランスクリプトーム分析は、女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいて、ｒｓ１９２１６２２／より低いｓＳＴ２レベルが、ミクログリアの活性化及びＡβとのそれらの共局在化を増強することによってＡβ蓄積を低減させることによって保護効果を発揮することを更に示唆する。更に、ｓＳＴ２ ３’－ＵＴＲのゲノム領域の欠失、又はｓＳＴ２ ３’－ＵＴＲ標的化アンチセンスオリゴマー（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒ：ＡＳＯ）の投与のいずれかによる、ｓＳＴ２転写物の３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）の破壊もまた、ｓＳＴ２の遺伝子及びタンパク質レベルを減少させ、アミロイド症マウスモデルにおけるＡＤ関連病理学的変化を改良した。まとめると、これらの所見は、ｓＳＴ２がＡＤの新規な疾患原因因子であり、ｓＳＴ２レベルの減少が疾患に対する潜在的な介入戦略であることを実証している。

【0098】

序論
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も一般的な神経変性疾患であり、かつ高齢者の死亡の主な原因であり^１、記憶力低下及び認知障害を特徴とする。その病理学的特徴には、Ａβプラークを形成するアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの細胞外蓄積、及び過剰リン酸化ｔａｕタンパク質（Ｐ－ｔａｕ）から構成される細胞内神経原線維変化が含まれる^２。ＡＤでは、Ａβは、ミクログリアの活性化を引き起こすリスク因子関連分子パターンとして作用し、食作用を介してＡβプラークに向かって遊走し、かつＡβプラークを除去するようにそれらを刺激する^３、４。ＡＤの根底にある病態生理学的機構は不明のままであるが、一方で大規模ゲノムワイド関連研究（ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ：ＧＷＡＳ）により、ミクログリア機能と関連する４０超のＡＤ関連遺伝子が明らかにされており（例えば、ＡＰＯＥ、ＴＲＥＭ２、ＢＩＮ１、及びＣＤ３３）、これは、ミクログリアがＡＤの病因において重要な役割を果たすことが示唆されている^５～７。注目すべきことに、孤発性ＡＤの最も強い既知のリスク因子であるＡＰＯＥ－ε４は^５、ＡＤにおけるＡβ蓄積に主に影響を及ぼすことが示唆されている^８、９。ＡＰＯＥ遺伝子は、異なる細胞機構を介してＡβのクリアランスに寄与する；具体的には、Ａβ周囲のミクログリアのクラスター形成を促進し、その後、Ａβプラークを分解する^{６、１０、１１}。ＡＤ脳の死後の単一細胞／核トランスクリプトーム分析は、ＡＤにおいてＡＰＯＥ発現が増加したミクログリア亜集団を明らかにした^{１２、１３}。更に、アミロイド症マウスモデルでは、ＡＰＯＥは、Ａβプラークと相互作用する特定のミクログリア亜集団を誘導するために必要である^６。このようにして、ミクログリア機能不全は、ＡＤの本質的な原因因子である。

【0099】

遺伝的要因に加えて、脳環境及び循環における分泌されたシグナル伝達タンパク質の変化は、ミクログリア活性を破壊し、ＡＤの病因に寄与し得る^{１４、１５}。例えば、細胞外ドメインを含有するミクログリア受容体ＴＲＥＭ２のタンパク質分解性開裂生成物である可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）のレベルは、ＡＤ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中で増加する^{１６～１８}。アミロイドーシスのトランスジェニック・マウス・モデルにおいて、ｓＴＲＥＭ２の注射は、ミクログリアとＡβとの相互作用、それ故にその後のＡβ食作用を増強することによって、Ａβ蓄積を軽減し、記憶欠損を救済する^{１９、２０}。更に、内皮細胞上の全長タンパク質から開裂された可溶性形態のＶＣＡＭ１（血管細胞接着分子１）の発現は、ＡＤ患者の血漿及びＣＳＦにおいて上昇している^{２１、２２}；これは、老化中のミクログリアの海馬神経発生の低減及び炎症誘発性応答を媒介することが示唆される^２３。

【0100】

ＡＤの病因に寄与し得る他の分泌型の可溶性受容体には、デコイ受容体として機能し、かつサイトカイン媒介性シグナル伝達を減弱させる膜結合サイトカイン受容体の外部ドメインを含む、可溶性サイトカイン受容体が含まれる^{２４、２５}。特に、可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）は、代替プロモータ活性化（図１）によって生成されるサイトカインＩＬ－３３（すなわち、ＳＴ２Ｌ［全長ＳＴ２］）の受容体の分泌アイソフォームである^２６。ＳＴ２Ｌは脳のミクログリアによって発現され^２７、ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達の活性化は、アミロイドーシスのトランスジェニック・マウス・モデルにおいて、Ａβ蓄積を減少させ、かつミクログリアのＡβクリアランス能を増加させる^{２８、２９}。一方で、ｓＳＴ２はＩＬ－３３のデコイ受容体として作用し、ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達を効果的に阻害することができる^{３０、３１}。血漿中の変化したｓＳＴ２レベルは、複数の炎症性疾患、がん、及び心疾患で観察され、末梢におけるこれらの疾患の有望なバイオマーカである^{３２～３５}。注目すべきことに、最近のエビデンスはまた、ｓＳＴ２レベルが軽度認知障害又はＡＤ患者の血液中で上昇することを示す^{２８、３６}。それにもかかわらず、ｓＳＴ２の調節不全の根底にある調節機構、及びｓＳＴ２がＡＤにおいて病理学的役割を有するかどうかは不明のままである。

【0101】

したがって、本研究では、本発明者らは、ＡＤ病因におけるｓＳＴ２の役割、並びに遺伝的要因によるｓＳＴ２発現及びＡＤ関連病理学的変化の調節を調査した。本発明者らは、ｓＳＴ２レベルの上昇がミクログリア機能を損ない、かつアミロイドーシスのマウスモデルにおけるＡβ蓄積を増悪させることを示した。更に、本発明者らは、より低い血漿及びＣＳＦ ｓＳＴ２レベルと関連したＩＬ１ＲＬ１（ｓＳＴ２及びＳＴ２Ｌをエンコードする遺伝子）の一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）を同定した。典型的には、遺伝子型－発現関連分析及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのゲノム編集は、ｓＳＴ２関連ＳＮＰのうち１つであるｒｓ１９２１６２２が、ヒト内皮細胞におけるｓＳＴ２の遺伝子発現及び分泌をダウンレギュレートすることと、このバリアントを保持する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアが、ＡＤのリスクが低く、かつＡＤ関連エンドフェノタイプの重症度が低いことと、を実証した。その後の単一核トランスクリプトームプロファイリングは、ｒｓ１９２１６２２の存在及び低減したｓＳＴ２レベルの両方が、ＡＰＯＥ－ε４を保有するＡＤを有する女性患者におけるミクログリア活性化の増強と関連することを明らかにし、このことは、ｓＳＴ２レベルがＡＤにおけるミクログリア活性化状態を調節することを指し示している。一致して、アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）を用いたｓＳＴ２ ３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）の破壊又はゲノム編集による、ｓＳＴ２レベルの減少は、アミロイド症マウスモデルにおけるＡＤ関連病理学的変化を減弱させた。まとめると、本発明者らの所見は、ｓＳＴ２が、ＡＤの病因において疾患を引き起こす役割を果たす脳環境における可溶性因子であり、これが、ＡＤ療法の新規標的となり得ること、及びｓＳＴ２レベルの減少が、疾患に対する潜在的な介入戦略となり得ることを指し示している。

【0102】

結果
ｓＳＴ２のレベルは、アルツハイマー病及びその病理学的変化と関連する
ｓＳＴ２がＡＤの病因にどのように関与するかを調査するために、本発明者らは、ｓＳＴ２レベルと、ＡＤ及びその関連するエンドフェノタイプとの関連を調べた。具体的には、本発明者らは、香港で動員されたＡＤ及びＨＣを有する中国人患者の血漿ｓＳＴ２レベルを測定した（本明細書以下、「中国人＿コホート＿１」；ｎ＝３４５のＨＣ及びｎ＝３４５のＡＤ患者；表２）。その後、本発明者らは、年齢、性別、及び集団構造について調整して、血漿ｓＳＴ２レベルとＡＤとの線形回帰分析を実施した。結果は、血漿ｓＳＴ２レベルが、ＨＣよりもＡＤ患者において有意に高かったことを示す（Ｐ＜０．０１；図２ａ）。更に、ｓＳＴ２が心血管疾患（ＣＶＤ）の周知のバイオマーカであり^{３５、３７}、本発明者らのコホート（Ｐ＜０．０５；図３ａ）では心臓疾患患者で上昇していたことを考慮して、本発明者らは、ＣＶＤの臨床歴のない参加者のサブコホートにてＡＤの血漿ｓＳＴ２レベルの変化を調べた（「非ＣＶＤコホート」と称される）。非ＣＶＤコホート内の全体コホートにおける本発明者らの所見と一致して、ＡＤを有する患者は、やはりＨＣよりも有意に高い血漿ｓＳＴ２レベルを有し（Ｐ＜０．０１；図３ｂ）、ＡＤにおける血漿ｓＳＴ２レベルの増加がＣＶＤ状態とは無関係であることを示唆した。くわえて、血漿ｓＳＴ２レベルは、調べたＡＤ関連エンドフェノタイプ、すなわち灰白質萎縮、並びに全体コホート（図２ｂ～図２ｄ）及び非ＣＶＤコホート（図３ｃ～図３ｅ）における神経変性及びＡＤ（すなわち、Ｐ－ｔａｕ１８１及び［ＮｆＬ］神経フィラメント光ポリペプチド^{３８、３９}）に対応する血漿バイオマーカのレベルと正の相関があった。これらの観察結果は、血漿ｓＳＴ２レベルがＡＤ及び関連するエンドフェノタイプと関連していることを集合的に示唆している。

【0103】

更に、本発明者らは、血漿及びＣＳＦ ｓＳＴ２レベルが同じ個体内で正の相関があることを示した（Ｐ＜０．０００１；ｎ＝ＡＤＲＣコホートからの１０７人の参加者^４０；図２ｅ）。したがって、本発明者らは続いて、ＣＳＦ ｓＳＴ２レベルとＡＤとの関連を調べた。ＡＤにおける血漿ｓＳＴ２レベルの調節と一致して（図２ａ）、ＵＫ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ Ｎｅｔｗｏｒｋコホート（本明細書以下、「ＵＫＢＢＮコホート」；ｎ＝１１のＨＣ及びｎ＝７５のＡＤ患者；表３）では、ＣＳＦ ｓＳＴ２レベルは、ＨＣよりもＡＤ患者で有意に高かった（Ｐ＜０．０１；図２ｅ）。注目すべきことに、ＡＤ患者では、ＣＳＦ ｓＳＴ２レベルは前頭皮質におけるＡβプラーク負荷と正の相関があった（Ｐ＜０．０５；図２ｇ、図２ｈ）。これらの所見は、血液及びＣＳＦの両方における循環ｓＳＴ２レベルが、ＡＤにおいて増加し、かつ疾患進行と関連することを指し示している。

【0104】

脳内のｓＳＴ２レベルの増加は、Ａβ蓄積を増悪させ、かつミクログリアのＡβクリアランス能力を損なう
ｓＳＴ２レベルの増加とＡＤ進行との因果関係を調査するために、本発明者らは、アミロイドーシスのトランスジェニック・マウス・モデルである５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＤ関連病理学的変化に対するｓＳＴ２レベルの増加の影響を調べた。ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達の活性化がＡＤの病理学的特徴、特にＡβ蓄積を減弱させること^{２８、２９}を示す本発明者らの以前の所見と一致して、組換えマウスｓＳＴ２の３月齢の５ＸＦＡＤマウスへの２８日間にわたる連続的な脳室内投与（図４ａ）は、ビヒクル対照で処置したマウスと比較して、皮質領域におけるＡβプラーク負荷を有意に増加させた（Ｐ＜０．０５；図４ｂ～図４ｃ）。特に、Ａβプラークの繊維状形態（すなわち、高密度コアのないＸ－３４^＋拡散フィブリル^４１）及びＡβプラークのコンパクト形態（すなわち、４Ｇ８ハローを有するＸ－３４^＋高密度コア）の両方の分量が、ｓＳＴ２処置マウスにおいて増加した（Ｐ＜０．０５；図４ｄ、図４ｅ、及び図５）。しかしながら、ｓＳＴ２投与は、５ＸＦＡＤマウスにおける毒性の低い不活性Ａβプラーク（すなわち、４Ｇ８標識なしのＸ－３４^＋高密度コア）の負荷に影響を及ぼさなかった。

【0105】

ミクログリアがＡβクリアランスにおいて重要な役割を果たすことを考慮して、本発明者らは続いて、ｓＳＴ２がミクログリアとＡβプラークとの相互作用をどのように調節するかを調べた。５ＸＦＡＤマウスでは、ｓＳＴ２注射は、ミクログリアの総数、及び皮質領域のＡβプラークの周りのミクログリアのクラスター化を増加させた（Ｐ＜０．０５；図６）。しかしながら、皮質領域におけるミクログリアによるＡβプラークの被覆率は、ビヒクル対照注射５ＸＦＡＤマウスよりもｓＳＴ２注射５ＸＦＡＤマウスで低く（図４ｆ、図４ｇ）、これは、ｓＳＴ２がＡβプラーク周囲のミクログリアのバリア形成を減少させることを示唆した。更に、フローサイトメトリー分析は、Ａβ^＋ミクログリアのパーセンテージの減少によって指し示されるように、ｓＳＴ２投与が５ＸＦＡＤマウスにおけるミクログリアのＡβ食作用能を減少させることを示した（すなわち、ｓＳＴ２処置群における２３．５７％のＣＤ１１ｂ^＋及びメトキシ－Ｘ０４^＋細胞対対照群における３２．７９％；Ｐ＜０．０１；図４ｈ、図４Ｉ、及び図７）。このようにして、これらの所見は、脳内のｓＳＴ２レベルの増加がＡβ蓄積を増悪させ、かつミクログリアＡβクリアランス能力を損なうことを集合的に示唆する。

【0106】

ｓＳＴ２のレベルは、ＩＬ１ＲＬ１の遺伝子バリアントと関連する
ＡＤの発症中にｓＳＴ２がどのように調節されるかを理解するために、本発明者らは、様々な要因がｓＳＴ２レベルの変化にどのように寄与するかを調べた。以前の研究と一致して、本発明者らは、血漿ｓＳＴ２レベルが、中国人の集団及びヨーロッパ人家系の集団において年齢及び性別の両方と有意に関連することを見出した^４２；これは、男性よりも女性で有意に低く（中国人＿コホート＿１、ＩＮＴＥＲＶＡＬコホート、及びＬｏｎＧｅｎｉｔｙコホートにおいてＰ＜０．００１ ^４２）、かつ年齢と共に有意に増加した（両方のコホートにおいてＰ＜０．００１；図８ａ～図８ｃ）。更に、ＣＳＦ ｓＳＴ２レベルはまた、日本人コホート（両方Ｐ＜０．０１；図８ｄ）において年齢と性別の両方と関連していた^４３。しかしながら、本発明者らがｓＳＴ２レベルの分散に対する年齢、性別、及び他の要因の寄与を調べたとき、年齢と性別とを合わせると、における中国人＿コホート＿１における血漿ｓＳＴ２レベル及び日本人コホートにおけるＣＳＦ ｓＳＴ２レベルでの分散のそれぞれ６．９２％及び１３．０１％しか占めず（図８ｅ、図８ｆ）、これは、他の要因がこのような変化を調節することを示唆している。

【0107】

ヨーロッパ人家系の集団における関連研究により、血漿ｓＳＴ２レベルと関連するＩＬ１ＲＬ１遺伝子の様々な遺伝子バリアントが同定され^４４、これは、遺伝的要因がｓＳＴ２レベルの調節に寄与することを示唆する。それにもかかわらず、これらの同定されたＳＮＰがこの遺伝子領域においてハプロタイプ構造を形成し得ること^４５を考慮すると、これらのＳＮＰは、単に原因バリアントと一緒に遺伝され得る。したがって、ｓＳＴ２の重要な遺伝子調節因子（複数可）を同定するために、本発明者らは、血漿ｓＳＴ２レベルのＧＷＡＳについて、中国人＿コホート＿１の本発明者らの全ゲノムシーケンシングデータセット^４６を利用した。したがって、本発明者らは、血漿ｓＳＴ２レベル（Ｐ＜１Ｅ－５）と有意に関連した５７５の遺伝子バリアントを同定し、かつこれらのバリアントが、そのバリアントの５４．８６％を占めることを見出した（図９ａ、図１０ａ、及び表４）。具体的には、これらの５７５のバリアントのうち、ハプロタイプを形成するＩＬ１ＲＬ１内又はＩＬ１ＲＬ１付近の７９の遺伝子バリアントは、ｓＳＴ２レベルと最も強く関連していた（図９ｂ及び図１０ｂ）。ＣＡＶＩＡＲによるその後のファインマッピング分析^４７では、センチネルバリアントｒｓ１９２１６２２（Ｇ／Ａ）が、血漿ｓＳＴ２レベルを調節する推定因果バリアント（確率９９．９％）として同定された（図１０ｃ及び表５）。中国人＿コホート＿１では、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、アレル用量依存的様式での血漿ｓＳＴ２レベルの２０％の減少と関連した（Ｐ＜０．００１；図９ｃ）。更に、ＣＳＦ ｓＳＴ２レベルは、ＵＫＢＢＮコホートの非キャリアよりもｒｓ１９２１６２２ Ａアレルのキャリアで一貫して低かった（Ｐ＜０．０５；図９ｄ）。注目すべきことに、ｒｓ１９２１６２２単独は、それぞれ血漿及びＣＳＦ ｓＳＴ２レベルの分散の１８．０４％及び１８．２９％を占め、これは、年齢及び性別の寄与よりもはるかに大きい。したがって、全ゲノムシーケンシングデータを用いた本発明者らのファインマッピング分析は、ｓＳＴ２の血漿及びＣＳＦレベルを調節する重要な遺伝的因子としてｒｓ１９２１６２２を同定した。

【0108】

ｒｓ１９２１６２２座位は、ヒト脳内皮細胞におけるｓＳＴ２発現を調節する
ｒｓ１９２１６２２は、ｓＳＴ２をエンコードする領域の下流にあるＳＴ２Ｌのイントロン領域に位置する非コードバリアントであるので、本発明者らは、それがｓＳＴ２転写物及びＳＴ２Ｌ転写物の発現を調節するかどうかを調べた。遺伝子型－組織発現（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＧＴＥｘ）データセットを用いた遺伝子型－発現関連分析^{４８、４９}は、非キャリアと比較して、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルを保有する個体が、複数の脳領域においてＳＴ２ＬではなくｓＳＴ２の有意に低い転写レベルを呈したことを示した（例えば、側座核、扁桃体、海馬、及び前頭皮質；Ｐ＜０．０５；図１１ａ及び表１）。更に、ＵＫＢＢＮコホートの本発明者らの以前に公開されたヒト前頭皮質単一核ＲＮＡシーケンシング（ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ）データセットの分析^５０は、ｓＳＴ２が前頭皮質（図１１ｂ、図１１ｃ）において内皮細胞（すなわち、ＣＬＤＮ５発現細胞）によって排他的に発現されることを明らかにした。くわえて、細胞型特異的遺伝子型－発現関連分析は、主要なアレルを保有する個体と比較して、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルを保有する個体が、アレルの用量依存的様式にてより低い内皮細胞ｓＳＴ２転写物レベル（Ｐ＜０．０１）及びより少ないｓＳＴ２発現内皮細胞を有することを示した（Ｐ＜０．０５；図１１ｄ）。これらの結果は、ｒｓ１９２１６２２バリアントが、ヒトの脳内皮細胞におけるｓＳＴ２発現の減少と関連することを集合的に指し示している。

【0109】

内皮細胞における減少したｓＳＴ２発現におけるｒｓ１９２１６２２の役割を調査するために、本発明者らは、ｒｓ１９２１６２２及び周囲のゲノム領域（図１１ｅ）がｓＳＴ２転写を調節するかどうかを調べた。非コードバリアントが、一般にエンハンサーエレメントとして機能することによって遺伝子発現を調節することを考慮すると^５１、本発明者らはまず、ヒト脳微小血管内皮細胞株であるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞におけるｒｓ１９２１６２２座位でのエンハンサー活性を調べた。サイトカインＩＬ－３３（ＳＴ２Ｌのリガンド）の投与は、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞におけるｓＳＴ２の発現及び分泌を増加させた（両方Ｐ＜０．００１；図１２ａ、図１２ｂ）。更に、クロマチン免疫沈降（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ：ＣｈＩＰ）アッセイは、これらのＩＬ－３３処置ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞がｒｓ１９２１６２２座位にて活性エンハンサーヒストンマーク（すなわち、Ｈ３Ｋ２７ａｃ）の占有率の増加を呈し、ｓＳＴ２プロモータ領域で高レベルのＨ３Ｋ４ｍｅ３ヒストン修飾（活性プロモータ領域を指し示す）を伴ったことを示した（両方Ｐ＜０．０５；図１１ｆ及び図１２ｃ）。したがって、これらの結果は、ｒｓ１９２１６２２がｓＳＴ２遺伝子の潜在的エンハンサーエレメントに位置することを指し示している。

【0110】

ｒｓ１９２１６２２を保持する領域がｓＳＴ２発現の調節に寄与することを更に実証するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのアプローチを使用して、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞においてｒｓ１９２１６２２座位を保持するゲノム領域を欠失させた。したがって、本発明者らは、ｒｓ１９２１６２２座位を包含する二アレルの３８ｂｐ及び６７ｂｐの欠失（それぞれ、Δ３８ｂｐ及びΔ６７ｂｐと指定）を伴う、２つの異なるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞株を産生した（図１１ｅ及び図１３）。注目すべきことに、ｒｓ１９２１６２２座位に隣接する３８ｂｐ又は６７ｂｐの損失は、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞におけるｓＳＴ２転写レベルを有意に減少させ（Ｐ＜０．００１；図１１ｇ）、同時にｓＳＴ２タンパク質分泌を消失させた（Ｐ＜０．００１；図１１ｈ）。これらの結果は、まとめて、ｒｓ１９２１６２２含有領域が、内皮細胞におけるｓＳＴ２発現を調節するエンハンサーエレメントとしての推定上の調節的役割を有することを指し示している。

【0111】

ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおけるアルツハイマー病から保護する
循環ｓＳＴ２レベルがＡＤリスク及び関連するエンドフェノタイプと関連するという本発明者らの所見を考慮して、本発明者らは、ｒｓ１９２１６２２ ＡアレルがＡＤリスクの減少と関連するかどうかを調べた。したがって、本発明者らは、発見コホートとして以下の６つの独立したＡＤデータセットを使用した：中国人＿コホート＿１データセット；中国人＿コホート＿２のＷＧＳ及びアレイデータセット^５２；並びに、ヨーロッパ人家系の集団からの３つの公開データセット（すなわち、遅発性アルツハイマー病［Ｌａｔｅ－Ｏｎｓｅｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＬＯＡＤ］^５３、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ［ＡＤＣ］^{５４、５５}、及びアルツハイマー病神経画像処理イニシアチブ［Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ：ＡＤＮＩ］データセット）（Ｎ＝５，４３６のＨＣ、及びＮ＝５，５５６のＡＤ患者；表２、表６）。遺伝子型－表現型関連分析は、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルが全ての対象においてＡＤリスクと弱く関連していたことを示した（オッズ比［ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ：ＯＲ］＝０．９４５、Ｈａｎ及びＥｓｋｉｎのランダム効果モデル［ＲＥ２］＝８．９０Ｅ－２；表７）。それにもかかわらず、本発明者らは、ｒｓ１９２１６２２ ＡアレルとＡＰＯＥ－ε４との有意な遺伝的相互作用を観察した（Ｐ＝０．００４６）：ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいてＡＤリスクに対する有意な保護効果を発揮し（ＯＲ＝０．８６０、ＲＥ２＝３．１８Ｅ－２；図１４ａ及び表７）、この保護効果は、ＡＰＯＥ－ε４非キャリアでは存在しなかった（ＯＲ＝０．９６４、ＲＥ２＝５．２２Ｅ－１；図１５）。具体的には、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、男性ＡＰＯＥ－ε４キャリアよりも女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいてＡＤリスクに対するより顕著な保護効果を有していた（ＯＲ＝０．７１７、ＲＥ２＝１．７７Ｅ－４；図１４ｂ及び表８）。更に、ＡＤ関連エンドフェノタイプに関して、ｒｓ１９２１６２２バリアントの保護効果は、ＡＤを有するＡＰＯＥ－ε４キャリア全体では明らかではなかったが、認知症の発症の遅延、より良好な認知スコア、嗅内皮質の萎縮の減少、及び神経変性の減少（Ｐ－ｔａｕ１８１及びＮｆＬの血漿レベルによって指し示される）を含む、ＡＤを有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアでは有意であった（全てのＰ＜０．０５；図１４ｃ～図１４ｅ及び図１６～図１８）。

【0112】

ＡＤに対するｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの保護効果を確認するために、本発明者らは、独立した複製コホート（参加者の脳におけるＡβ沈着（すなわち、Ａβ^＋）がポジトロン放出断層撮影によって確認された、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｌｉｆｅｓｔｙｌｅコホート（ＡＩＢＬ；ｎ＝１９０））における、ＡＤ関連エンドフェノタイプを調べた^５６。ＡＰＯＥ－ε４アレルを保持するＡβ^＋対象のうち、発見コホートからの所見と一致して、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの存在は、ＡＩＢＬ前臨床アルツハイマー型認知複合（ＡＩＢＬ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ：ＡＩＢＬＰＡＣＣ）スコア、並びにエピソード想起及び認識を含む認知サブプロセスによって指し示されるように、認知能力の改善と関連していた（全てのＰ＜０．０５；図１４ｆ）。更に、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、アテンション処理能力及び灰白質体積を含むｒｓ１９２１６２２ Ａアレルとエンドフェノタイプとの関連によって指し示されるように、全体的なＡβ^＋ＡＰＯＥ－ε４キャリアよりも、女性のＡβ^＋ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいて強いＡＤ保護効果を発揮した（両方Ｐ＜０．０５；図１９）。重要なことに、灰白質体積を１０年間追跡したこのコホートからの１８３人のＡβ^＋ＡＰＯＥ－ε４キャリアのサブグループでは、灰白質萎縮の進行は、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルを保有する者の方が非キャリアよりも遅かった（Ｐ＜０．０５；図１４ｇ）。このようにして、これらの結果は、独立したＡβ^＋コホートにおけるＡＰＯＥ－ε４キャリア間の認知低下及び灰白質萎縮に対するｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの保護効果を検証する。

【0113】

アルツハイマー病を有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおけるｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの保持は、Ａβ沈着の減少及びミクログリア活性化の増加と関連する
ｒｓ１９２１６２２ ＡアレルがＡＰＯＥ－ε４キャリア、具体的には女性においてＡＤ保護効果を発揮するという本発明者らの所見を考慮して、本発明者らは続いて、この保護バリアントが死後ヒト脳におけるＡβ沈着を調節するかどうかを調べた。ＡＤ患者のうち、女性であるが男性ではないＡＰＯＥ－ε４キャリアは、ＡＰＯＥ－ε４非キャリアよりも前頭皮質においてより大きなＡβ沈着を呈した（Ｐ＜０．０５；図２０ａ、図２０ｂ）。しかしながら、ｒｓ１９２１６２２遺伝子型に従って更に層別化する際、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルを保持する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアは、このアレルを有しないものよりも有意に少ないＡβ沈着を呈し（Ｐ＜０．０５；図２１ａ、図２１ｂ、及び図２０ｃ）、これは、ｒｓ１９２１６２２ ＡアレルがＡβ関連病理学的変化に対するＡＰＯＥ－ε４の効果を減弱させることを示唆した。免疫組織化学的分析により、ＡＤを有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアは、ＡＰＯＥ－ε４非キャリアのものよりも低いＡβプラークのミクログリア被覆率（すなわち、Ｉｂａ－１^＋ミクログリアと共局在するＡβの割合の減少）を呈したことが明らかになったが（Ｐ＜０．０５；図２０ｄ、ｅ）、一方で、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルを保持するものは、Ｉｂａ－１^＋ミクログリアとＡβプラークとの共局在化の有意な増加を呈した（Ｐ＜０．０５；図２１ｃ、図２１ｄ）。このようにして、これらの結果は、ＡＤを有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいて、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルが、ミクログリア－Ａβ相互作用の増強及びＡβ病理学的病変の減少と関連することを示唆する。

【0114】

次に、分子レベルでミクログリア活性に対するｒｓ１９２１６２２バリアントの調節効果を調査するために、本発明者らは、ＵＫＢＢＮコホートからのＡＤを有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアの前頭皮質^５０におけるミクログリアｓｎＲＮＡ－ｓｅｑデータセットとの関連分析を行った。ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルの効果とミクログリア遺伝子発現に対するＣＳＦ ｓＳＴ２レベルの効果との間に強い負の相関があり（Ｐ＜０．０００１；図２２）、保護的なｒｓ１９２１６２２バリアントが、ＣＳＦ ｓＳＴ２レベルの調節を介してミクログリアにその調節効果を発揮するという考えを支持している。具体的には、本発明者らは、ｒｓ１９２１６２２遺伝子型と有意に関連した１，６９６個のミクログリア遺伝子を同定した：ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルを有しない患者と比較して、当該アレルを保持する患者では、発現がそれぞれアップレギュレート及びダウンレギュレートされた４４５個及び１，２５１個の遺伝子が存在した（偽発見率［ＦＤＲ］調整Ｐ＜０．０５；図２１ｅ）。更に、遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析は、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルと関連したミクログリア遺伝子のうちで、発現がアップレギュレートしたものは白血球遊走（ＦＤＲ調整Ｐ＝１．２Ｅ－４）及び自然免疫応答（ＦＤＲ調整Ｐ＝５．４Ｅ－３）と関連するが、一方で発現がダウンレギュレートしたものは、主にタンパク質リフォールディング（ＦＤＲ調整Ｐ＝８．１Ｅ－３）又はｍＲＮＡスプライシング（ＦＤＲ調整Ｐ＝７．７Ｅ－２）に関与することを示した（図２１ｆ）。

【0115】

マウス及びヒトの脳におけるミクログリアの最近の研究は、ＣＤ７４、ＡＰＯＥ、及びＴＲＥＭ２を含む「ミクログリア活性化遺伝子」のサブセットを明らかにし、その発現レベルは、ＡＤに関連してアップレギュレートし^{１２、１３}、かつミクログリアによるＡβ食作用に関与している^{６、５７、５８}。したがって、本発明者らは、これらの遺伝子がｒｓ１９２１６２２ Ａアレルと関連しているかどうかを調査した。興味深いことに、ＡＤを有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアのうち、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルは、アレル用量依存的様式で、これらのミクログリア活性化遺伝子の発現の増加、特にミクログリアにおけるＣＤ７４、ＡＰＯＥ、及びＴＲＥＭ２の転写レベルの増加、並びにＴＭＥＭ１６３^＋ミクログリアの割合の増加と関連していた（図２１ｇ）。対照的に、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルはまた、ＳＲＧＡＰ２、ＴＭＥＭ１１９、及びＰ２ＲＹ１２を含む恒常性遺伝子の発現減少と関連しており、これは一般に、反応性の低いミクログリア状態を指し示す^６、５７（図２１ｇ）。したがって、これらの結果は、ｒｓ１９２１６２２ Ａアレルが、ＡＤを有する女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいてミクログリアのより活性化された状態への移行を促進することを集合的に指し示す。

【0116】

ｓＳＴ２の３’－非翻訳領域の破壊は、５ＸＦＡＤマウスにおいて、ｓＳＴ２レベルを低減させ、アミロイド関連病態を軽減する
ｓＳＴ２レベルを低減させ、かつＡＤ関連遺伝子型を改良するためのより一般化された方法を確立するために、本発明者らは、ＳＴ２Ｌの発現に影響を与えることなくｓＳＴ２レベルを操作するための代替的な解決策を探索した。ｓＳＴ２及びＳＴ２Ｌはコード配列の大部分を共有するが、一方で、ｓＳＴ２転写物の３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）は固有である（図２３ａ）。したがって、ｓＳＴ２の３’ＵＴＲ領域は、ｓＳＴ２レベルを操作するための完全な標的であり得る。ｓＳＴ２の欠失を伴うマウスモデルの産生により、本発明者らは、ｓＳＴ２の３’ＵＴＲ領域の欠失が血清ｓＳＴ２レベルを有意に低減させることを見出した（図２３ｂ）。更に、ｓＳＴ２ ３’ＵＴＲの欠失はまた、６月齢のアミロイド形成マウスモデル、５ＸＦＡＤマウスにおいて可溶性及び不溶性の両方の内容物の皮質Ａβレベルを低減させた（図２３ｃ、図２３ｄ）。ｓＳＴ２の３’ＵＴＲの欠失もまた、アミロイドプラーク負荷の減少につながった（図２３ｅ～図２３ｈ）。まとめると、３’ＵＴＲ領域は、ｓＳＴ２レベル及びＡＤ関連病態を低減させるための良好な標的であり得る。

【0117】

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３’ＵＴＲ領域を標的とし、ｍＲＮＡのＲＮアーゼＨ媒介分解を引き起こし、かつ最終的に標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを低減させることができたので（図２４ａ）、ｓＳＴ２レベルを操作するための良好な翻訳ツールとして役立ち得た。本発明者らは、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３－３及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においてｓＳＴ２ ３’ＵＴＲ領域を特異的に標的とし得る全ての潜在的なＡＳＯについて系統的スクリーニングを実施した（図２４ｂ、図２５ａ、表９）。本発明者らは、上位１３のｍｓＳＴ２－ＡＳＯ及び上位１５の効率的なｈｓＳＴ２－ＡＳＯで２回目のスクリーニングを実施し、ｓＳＴ２転写物レベルを調べた。ほとんどのＡＳＯは、ｓＳＴ２転写物の低減の５０％超を示した（図２４ｃ、図２５ｂ）。更に、マウスｓＳＴ２ ＡＳＯの静脈内注射は、Ｃ５７マウスの血清ｓＳＴ２レベルを低減させ（図２４ｄ）、かつ５ＸＦＡＤマウスのＡβ負荷もまた減少させる（図２４ｅ、図２４ｆ）。これは、将来の臨床翻訳のための可能なヒントを提供する。

【0118】

考察
ＧＷＡＳ研究は、ほとんどのＡＤリスク遺伝子がミクログリアにおいて濃縮されており、それらの発現の変化がミクログリアの食作用機能を調節することを示唆している^６。それにもかかわらず、新たな研究は、脳環境における可溶性因子もまた、ミクログリア活性及び疾患関連病理学的変化を調節することを示唆している^{２０、２３}。ここで、本発明者らは、ｓＳＴ２（ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達のための分泌されたデコイ受容体）をエンコードする内皮遺伝子ＩＬ１ＲＬ１の発現が、遺伝子バリアントであるｒｓ１９２１６２２によって調節されることを報告する；このバリアントは、血漿及びＣＳＦ ｓＳＴ２レベルの調節を介してＡＤに対する保護効果を発揮し、これが次にミクログリア表現型及びＡＤにおけるＡβ蓄積を調節する。ｓＳＴ２レベルの上昇は、ＡＤ患者におけるより高いＡβ沈着と関連し、アミロイドーシスのマウスモデルにおいてＡβプラーク形成を増悪させ、かつＡβのミクログリアクリアランスを損なうが、一方で本発明者らは、ｒｓ１９２１６２２がｓＳＴ２発現をダウンレギュレートすることを示す；このバリアントは、ＡＤ及びより重度のＡＤ関連病理学的変化のリスクがより高い傾向にある女性ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおける、神経変性、認知低下、及びＡβ蓄積から保護する^５９。死後ヒト脳の分析は、ｒｓ１９２１６２２の保護効果が、ミクログリア－Ａβプラーク相互作用の調節によって媒介されることを示唆する。このようにして、本発明者らの結果は、内皮細胞によって分泌される可溶性タンパク質であるｓＳＴ２が、ミクログリアの活性を調節し、かつ脳環境におけるｓＳＴ２レベルの改変がミクログリアのＡβクリアランス能を損ない、したがってＡＰＯＥ－ε４と関連したＡＤのリスク及び病理学的変化を調節することを集合的に示す。

【0119】

ｓＳＴ２は、ＳＴ２Ｌの細胞外ドメインのみを含み、かつ独立して転写されるので^２６、ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達のための効果的なデコイ受容体である。ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達が、組織修復、Ａβクリアランス、及びシナプス貪食に関与するミクログリア活性のために不可欠な調節的役割を有することを考慮すると^{２８、２９、６０、６１}、脳ｓＳＴ２レベルの増加は、ミクログリア上のＳＴ２ＬへのＩＬ－３３の結合をブロックすることによってミクログリア機能及びＡＤ関連病理学的変化に影響を与える可能性が高い。ＡＤでは、Ａβの蓄積は、ミクログリアをＡβプラークに向かって遊走させ、それらを取り囲むバリアを形成するプロセスを延長させ、食作用クリアランスを開始させる^６２。ＡＤが進行するにつれて、これらのミクログリア機能が損なわれ、Ａβプラークの蓄積をもたらす^６３。この研究では、アミロイドーシスのマウスモデルにおけるｓＳＴ２注射は、ミクログリアとＡβとの相互作用、並びにその後のＡβの食作用を乱した（図４）。この所見は、これらのマウスにおいて、ＩＬ－３３投与がＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達を活性化し、かつＡβプラークへのミクログリア走化性を開始させ、続いてＡβ食作用を増強する^{２８、２９}という本発明者らの以前の観察と一致している。ＡＰＯＥ－ε４を保有するＡＤを有する患者の中で、ＡＤでのミクログリアにおけるｓＳＴ２の病理学的役割を更に裏付けると、ｒｓ１９２１６２２を保有する者（脳環境においてより低いｓＳＴ２レベルを有する者）は、非キャリアよりも増強されたミクログリア－Ａβプラーク相互作用及びより小さいＡβプラーク面積を呈した。このようにして、ｓＳＴ２による内因性ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達の乱れは、ミクログリア走化性、バリア形成、及びＡβ取り込みの障害をもたらし得、これらは全てその後にＡＤの病因に寄与する。

【0120】

ｓＳＴ２の調節機構とは何か？ 中国人の集団及びヨーロッパ人家系の集団における本発明者らの分析は、ｓＳＴ２レベルが、年齢、性別、及び遺伝子バリアントと関連するという以前の研究と裏付けられ^{４２、４４}、更に、遺伝的構成成分はｓＳＴ２レベルの調節において支配的な役割を果たし、ｓＳＴ２レベルの分散の５４．８６％を占めることを明らかにする。特に、本発明者らのＧＷＡＳ及びファインマッピング分析は、ｒｓ１９２１６２２をｓＳＴ２と関連する推定因果バリアントとして同定した（因果確率＝９９．９９％）；本発明者らのＣｈＩＰアッセイ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集実験は、ｒｓ１９２１６２２含有領域が内皮細胞におけるｓＳＴ２発現を調節するエンハンサーエレメントであることを検証した。これらの結果は、ｒｓ１９２１６２２がｓＳＴ２の重要な遺伝的調節因子であることを集合的に示唆する。そのため、ｒｓ１９２１６２２座位におけるエピジェネティック事象に関する将来の調査は、ｓＳＴ２の調節機構を解明するのに役立ち得る。実際、最近の研究は、ＴＮＦα媒介性のＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化が、内皮細胞からのｓＳＴ２の発現及び放出を誘導することができ^{６４、６５}、かつＮＦ－κＢシグナル伝達の阻害がｓＳＴ２生成を消失させることを示唆している^６６。ＮＦ－κＢが内皮細胞における遺伝子発現を調節する必須の転写因子であることを考慮すると^６７、ＮＦ－κＢが、内皮細胞におけるｓＳＴ２発現のｒｓ１９２１６２２媒介調節に関与する候補転写因子であるかどうかを調査することは興味深いであろう。

【0121】

本研究において、死後ヒト脳の単一核トランスクリプトームプロファイリングは、ｓＳＴ２が主に脳内皮細胞で発現されることを示す（図１１）。脳におけるｓＳＴ２発現の調節不全は、ＡＤに関連する病理学的変化を増悪させ、特にミクログリアの食作用能を損なう。このようにして、本発明者らの結果は、分泌された可溶性因子であるｓＳＴ２を介して脳内のミクログリアの活性を媒介するＡＤにおける、脳血管構造の新規な病原的役割を実証する。実際、Ａβ及びタウ関連の病理学的変化とは別に、神経血管性機能不全は、ＡＤの初期に起こり、かつその病因に関与している^６８。脳トランスクリプトームプロファイリングは、血管新生及び抗原提示と関連するＡＤの内皮細胞における多数の調節不全遺伝子を明らかにした^５０。更に、ＡＰＯＥ－ε４は、トロンビン及びプラスミンなどの血液由来タンパク質の漏出をもたらし^{６９、７０}、シナプス損失をもたらす^{７１、７２}、血液脳関門の破壊を増悪させることが最近示された。ＡＤを引き起こす脳血管構造の正確な病理学的機能は不明なままであるが、一方で末梢システムでは、血管構造分泌可溶性のサイトカイン及びケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１）が、一般に免疫細胞の活性化及び遊走を調節し、それによって組織における免疫応答を媒介する^７３。同様に、新たな研究は、脳血管構造が栄養素の供給及び代謝産物の除去を担うだけでなく、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、及びＭＣＰ－１などの可溶性炎症性タンパク質の重要な供給源としてもまた機能することを示唆している^{７４、７５}。したがって、ｓＳＴ２に加えて、血管構造と他の細胞型との他の可溶性因子ベースのクロストークが脳内で起こり得る。したがって、そのようなクロストークのそれらの構成成分及びメディエータを同定することは、脳血管構造の役割の本発明者らの理解を拡大し、かつＡＤの新規な病理学的機構への洞察を提供し得る。

【0122】

本発明者らの遺伝子分析は、ｒｓ１９２１６２２が、ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいてＡＤに対する保護効果を発揮することを実証し、このことは、ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達とＡｐｏＥとの間における潜在的な相互作用を示唆した。リポタンパク質、及びＡβプラークの主要な構成成分であるＡｐｏＥは、コレステロール輸送、脂質代謝、及びＡβクリアランスを含む様々な機能を有する^６、７６。脳において、ＡｐｏＥは主にアストロサイトによって生成され、その発現は、ＡＤを含む神経病理学的状態の下においてミクログリアではアップレギュレートされる^{１２、７７}。アミロイド症マウスモデルの単一細胞ＲＮＡシーケンシングにより、ミクログリア亜集団が恒常性状態から、「疾患関連ミクログリア」又は「活性化応答ミクログリア」と称される活性化状態へと移行することが明らかになった^６、５７。この活性化状態は、パターン認識、脂質代謝、及びリソソーム経路と関連し、かつ検出、貪食、及び分解^{７８～８１}を含む食作用プロセスの重要な調節因子である、ミクログリア活性化遺伝子（ＡＰＯＥ、ＡＸＬ、ＴＲＥＭ２、及びＣＤ７４を含む）^{１２、１３、５７、５８}の発現増加を特徴とする。対照的に、脳におけるＡＰＯＥ及びＴＲＥＭ２の機能の乱れは、このミクログリア活性化状態の誘導を消失させ、恒常性状態のミクログリアをロックし、その結果、より低いＡβ食作用能をもたらす^６、５７。このようにして、ＡｐｏＥ媒介性ミクログリア活性化は、ＡＤに対する保護的役割を有し得、Ａβクリアランス及び脳恒常性のために要求され得る。本研究では、ヒト死後脳のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ分析により、ＡＰＯＥ－ε４を保有するＡＤ患者において、ｒｓ１９２１６２２の存在が、前述したミクログリア活性化遺伝子の発現増加を特徴とする、恒常性状態から活性化状態へのミクログリアの移行を調節することが明らかになった（図２１）。したがって、ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達及びＡｐｏＥが収束して、ミクログリアにおけるこれらの特定の遺伝子の発現を調節し、それによって、ミクログリアの活性化状態及びＡβクリアランス能を調節し得る。興味深いことに、末梢において、ＩＬ－３３投与は、アテローム性動脈硬化症のＡｐｏＥ^－／－モデルにおけるマクロファージ泡沫細胞（アテローム性動脈硬化症を引き起こす脂質含有マクロファージ）の形成、及びアテローム硬化性プラークの発生を改良する^８２。したがって、ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達の調節が、ＡＤにおける脂質代謝の調節を介したＡβ蓄積に対するＡＰＯＥ－ε４の有害な影響を低減させるかどうかを決定することは興味深いであろう。実際、コレステロール流出を担うＡＢＣＡ１（ＡＴＰ結合カセットトランスポータＡ１）及びＡＢＣＧ１（ＡＴＰ結合カセットトランスポータＧ１）は、その発現がｒｓ１９２１６２２によってアップレギュレートされるミクログリア遺伝子の中にある^８３。更に、これらの２つの遺伝子は、ＡｐｏＥ脂質化において必須の役割を果たし^{８４、８５}、これは、Ａβ分解に関与するが^８６、ＡＰＯＥ－ε４キャリアにおいて損なわれる^{８７、８８}。これらの２つの遺伝子は、ＡＤにおけるＡｐｏＥ媒介シグナル伝達及びＩＬ－３３／ＳＴ２媒介シグナル伝達の両方によって共有される重要な構成成分であり得るが、一方で、どのようにしてこれらの２つのシグナル伝達経路間のクロストークに関与するのかは、更なる研究を待つ。

【0123】

本発明者らの所見は、ｓＳＴ２がＡＤの有望な治療標的であることを集合的に示唆する。第１に、ｓＳＴ２は主に内皮細胞によって発現されるので、これはｓＳＴ２発現の細胞型特異的操作を可能にし、その操作は血液脳関門を通過する必要がない可能性がある。第２に、ｓＳＴ２レベルは、軽度認知障害又は初期ＡＤの患者において上昇しており^{２８、３６}、これは、早期介入戦略におけるｓＳＴ２の適用可能性を示唆している。第３に、本発明者らが示したｒｓ１９２１６２２座位の欠失は、ヒト脳内皮細胞株において高い有効性で行うことができ、ＳＴ２Ｌの活性を破壊することなくｓＳＴ２の発現及び分泌を特異的にサイレンシングする実行可能な方法であり得る；これは、ｓＳＴ２のエピジェネティック制御及び転写制御がＳＴ２Ｌのエピジェネティック及び転写制御とは異なり^８９、ｒｓ１９２１６２２はＳＴ２ＬではなくｓＳＴ２の発現のみを調節するからである。第４に、ｒｓ１９２１６２２が一般的なＡＤ関連バリアントであることを本発明者らが示したように、この遺伝子バリアントを標的とするｓＳＴ２の操作を、高いｓＳＴ２レベル（例えば、ＡＰＯＥ－ε４を保有するがｒｓ１９２１６２２ Ａアレルを保有しない女性患者は、ＡＤ患者の６．２％～１２．２％を占める）を有する患者の特定のサブグループのために開発することができ、患者の層別化及び精密医療を可能にした。くわえて、ｓＳＴ２はまた、アテローム性動脈硬化症及び敗血症において潜在的な病原的役割を有する^{８２、９０}ＣＶＤの周知のバイオマーカであるため^{３５、３７}、ｓＳＴ２を標的とするそのようなゲノムベースの操作もまた、そのような末梢疾患の治療に有益であり得る。

【0124】

それにもかかわらず、ＡＤにおけるｓＳＴ２の機能及び調節に関しては更に説明する必要があることが残っている。最初に、脳内のｓＳＴ２レベルの増加がＡＤの病因に寄与することを本発明者らは実証したが^９１、末梢内皮細胞によって生成されるｓＳＴ２の主要なプールを構成する血漿ｓＳＴ２が、ＡＤにおいて病理学的役割を果たすかどうかは不明のままである。血漿ｓＳＴ２レベルとＣＳＦ ｓＳＴ２レベルとの正の相関は、ｓＳＴ２が血液脳関門透過性であり得ることを示唆する。したがって、末梢ｓＳＴ２が脳実質に浸透し、疾患に関連する病理学的変化に寄与し得るかどうかを確認するために、更なる調査が必要である。実際、最近の研究は、バルサルタンなどのいくつかのアンジオテンシン受容体ブロッカーが、心不全患者の末梢ｓＳＴ２レベルを低減させることができることを示している^９２。これらの薬物がまた、ＡＤ患者の末梢ｓＳＴ２レベルも調節し、疾患関連の病理学的変化を改良することができるかどうかを調べることは興味深い。第２に、複数のコホートにおける本発明者らの関連分析は、ｒｓ１９２１６２２がＡＰＯＥ－ε４キャリア、特に女性においてＡＤから保護することを一貫して実証した。このバリアントは、男性及び女性の両方においてｓＳＴ２発現を調節するが、一方で、ＡＤにおけるこの性別特異的保護効果の理由は不明のままである。注目すべきことに、エストロゲン及びテストステロンを含む性ホルモンは、ＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達に対して異なる調節効果を有する^{９３、９４}。したがって、そのようなシグナル伝達がＡＤの男性及び女性において異なる活性及び機能を有するかどうかを調べることは興味深いであろう。最後に、ＩＬ－３３、ＳＴ２Ｌ、及びｓＳＴ２は全てＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達に寄与するので、ｓＳＴ２レベルの増加に加えて、ＩＬ－３３及び／又はＳＴ２Ｌの調節不全もまたＡＤに寄与し得る。最近の研究は、ＩＬ３３遺伝子における遺伝子バリアントがＡＤリスクと関連すること^９５、及び脳ＩＬ－３３転写物及びタンパク質レベルがＡＤにおいて生理学的状態よりも低いこと^{３６、９５}を示す。したがって、ゲノムレベル及び遺伝子レベルの両方でのＡＤにおけるｓＳＴ２、ＩＬ－３３、及びＳＴ２Ｌの将来の統合研究は、損なわれたＩＬ－３３／ＳＴ２シグナル伝達がどのようにＡＤ病因に寄与するかを更に明らかにし得る。

【0125】

要約すると、本発明者らは、脳内の可溶性タンパク質であるｓＳＴ２によって媒介されるミクログリア機能不全に関与する、ＡＤの代替病原性機構を発見した。内皮細胞分泌ｓＳＴ２の調節不全は、ｓＳＴ２の血漿及びＣＳＦレベルの増加をもたらし、ミクログリアによるＡβクリアランスを損ない、これによりＡＤにおけるＡβ蓄積の増悪をもたらす。更に、本発明者らは、ｓＳＴ２発現をダウンレギュレートするＡＤ保護遺伝子バリアントｒｓ１９２１６２２が、ミクログリアシグナル伝達の調節を介してＡＤのＡＰＯＥ－ε４関連リスク及び病理学的変化を減弱させることを見出した。一致して、３’－ＵＴＲ標的化ＡＳＯ又はゲノム編集によるｓＳＴ２発現及びタンパク質レベルの減少は、ＡＤ関連病理学的変化を改良した。このようにして、ｓＳＴ２（ＡＤの新規バイオマーカ及び潜在的な薬物標的）の循環レベルがどのように遺伝的に調節されるかをよりよく理解することは、介入戦略及び臨床試験の設計を支援することができる。

【0126】

方法及び材料
中国人＿コホート＿１の参加者募集
２０１３年４月から２０１８年２月までに香港中文大学医学院プリンス・オブウェールズ病院（ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｅ ｏｆ Ｗａｌｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）の専門外来部門を訪問した、ＡＤ患者３４５人及びＨＣ３４５人を含む、６０歳以上の合計６９０人の香港人参加者が募集された。ＡＤの臨床診断は、「Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ’ｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、第５版（ＤＳＭ－５）に基づいて確立された^９６。全ての参加者が、病歴評価、臨床評価、Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＭｏＣＡ）試験を用いた認知及び機能評価、並びにＭＲＩによる神経画像評価を受けた^{９７、９８}。ＡＤ又は精神障害以外の任意の有意な神経疾患を有する参加者は除外した。年齢、性別、学年、病歴、及びＣＶＤの病歴（すなわち、心臓疾患、高血圧、真性糖尿病、及び高脂血症）を記録した。ＤＮＡ及び血漿試料を全血試料から調製し、使用するまで－８０℃で保存した。Ｔ１強調ＭＲＩを使用して、Ｐｒｉｎｃｅ ｏｆ Ｗａｌｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌからの１９２人の参加者（ｎ＝７７のＡＤ患者、ｎ＝１１５のＨＣ）から脳画像処理データを検索した。未処理画像処理ファイルを匿名化し、灰白質体積の分析のためにＡｃｃｕＢｒａｉｎ（登録商標）ＩＶ１．２（ＢｒａｉｎＮｏｗ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、Ｃｈｉｎａ）によってプロセシングした。ＣＶＤの病歴のない参加者のみからなるサブコホートもまた、中国人＿コホート＿１（「非ＣＶＤコホート」；ｎ＝８６のＡＤ患者、ｎ＝９７のＨＣ）から選択した。

【0127】

この研究は、Ｐｒｉｎｃｅ ｏｆ Ｗａｌｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、及びＨｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって承認された。全ての参加者が、研究登録及び試料収集の両方について書面によるインフォームドコンセントを提供した。

【0128】

ヒト血液試料からのＤＮＡ及び血漿の抽出
本発明者らは、参加者からの全血試料（３ｍＬ）をＫ３ＥＤＴＡチューブ（ＶＡＣＵＥＴＴＥ）へと収集した。本発明者らは、試料を２，０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離して、細胞ペレットと血漿とを分離した。血漿を収集し、アリコートに分け、使用するまで－８０℃で保存した。本発明者らは、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＳＰ ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＱＩＡＧＥＮ）においてＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＤＳＰ ＤＮＡ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出するために、細胞ペレットを、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ ＰａｎｏｒＯｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｏｒｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、Ｃｈｉｎａ）へと送った。ゲノムＤＮＡを、水又は溶出緩衝液ＡＴＥ（ＱＩＡＧＥＮ）で溶出し、４℃にて保存した。本発明者らは、ＢｉｏＤｒｏｐ μＬＩＴＥ＋（ＢｉｏＤｒｏｐ）によってＤＮＡ濃度を決定した。

【0129】

ＵＫＢＢＮデータセット
以下の試料を、ＭＲＣ ＵＫＢＢＮ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ）から得た：ＣＳＦ試料、前頭皮質切片、凍結前頭皮質組織、及びゲノムＤＮＡ試料（表３）。ＵＫＢＢＮデータセットからの最初の試料選択のために、他の神経変性疾患、血管疾患、中毒状態、感染症、プリオン、炎症性疾患、構造的脳障害、代謝／栄養性疾患、心的外傷、せん妄、遺伝性障害（例えば、ダウン症候群）、又は他の全身性疾患を有する対象を除外した。ＣＳＦ試料については、死後期間３０時間以下の試料を選択し、合計８６人の参加者（ｎ＝７５のＡＤ患者、ｎ＝１１のＨＣ）を得た。くわえて、ＵＫＢＢＮ（ｎ＝１２のＡＤ患者、ｎ＝９のＨＣ）からの凍結前頭皮質試料からのｓｎＲＮＡ－ｓｅｑデータを、本発明者らの以前に公開されたデータセットから得た^５０。

【0130】

関連研究のための他のコホート及びデータ
複製研究のために以下のデータを得た：（ｉ）参加者は以前に記載されたように募集した、中国人＿コホート＿２からのゲノムデータ、人口統計学データ、及び臨床データ^５２；（ｉｉ）ＬＯＡＤ Ｆａｍｉｌｙ Ｓｔｕｄｙからのゲノムデータ、人口統計データ、及び臨床データ^５３；（ｉｉｉ）ＮＩＡ ＡＤＣコホートからのゲノムデータ、人口統計学データ、及び臨床データ^{５４、５５}；（ｉｖ）ＡＤＮＩコホートからのゲノムデータ、人口統計学データ、臨床及び脳画像処理データ；（ｖ）ＧＴＥｘデータセットからのゲノムデータ、人口統計学データ、及びトランスクリプトームデータ^{４８、４９}；（ｖｉ）Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＤＲＣ）コホートからの血漿バイオマーカデータ、ＣＳＦバイオマーカデータ、人口統計データ、及び臨床データ^４０；（ｖｉｉ）オンラインデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｗｃ－ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｓｈｉｎｙａｐｐｓ．ｉｏ／ａｇｉｎｇ＿ｐｌａｓｍａ＿ｐｒｏｔｅｏｍｅ／）から検索したＩＮＴＥＲＶＡＬ及びＬｏｎＧｅｎｉｔｙコホートの血漿バイオマーカデータ及び人口統計データ^４２；（ｖｉｉｉ）日本人コホートからのＣＳＦバイオマーカ及びの人口統計学データ^４３；並びに、（ｉｘ）ＡＩＢＬコホートからのゲノムデータ、人口統計学データ、臨床及び脳画像処理データ^５６。

【0131】

ヒト試料及び細胞株におけるタンパク質レベルの測定
中国人＿コホート＿１からの６１３人の参加者におけるｓＳＴ２の血漿レベル（ｎ＝２７７のＡＤ患者、ｎ＝３３６のＨＣ）、ＵＫＢＢＮコホートからの８６人の参加者におけるｓＳＴ２のＣＳＦレベル（ｎ＝７５のＡＤ患者、ｎ＝１１のＨＣ）、及びｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞によって分泌されたｓＳＴ２のレベルを、Ｈｕｍａｎ ＳＴ２／ＩＬ－３３ Ｒ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＤＳＴ２００；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。中国人＿コホート＿１からの参加者におけるＮｆＬ（ｎ＝１３５のＡＤ患者、ｎ＝１１６のＨＣ）及びＰ－ｔａｕ１８１（ｎ＝１４５のＡＤ患者、ｎ＝１２６のＨＣ）の血漿レベルを、それぞれ、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ ＮＦ－ｌｉｇｈｔ ＳＩＭＯＡ Ａｓｓａｙ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｋｉｔ（１０３１８６）及びＰ－Ｔａｕ １８１ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｖ２ Ｋｉｔ（１０３７１４）を用いて、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ Ｌａｂ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって測定した。

【0132】

遺伝子型判定のための全ゲノムシーケンシング及びＳＮＰアレイ
中国人＿コホート＿１（ｎ＝２３３のＡＤ患者、ｎ＝１９４のＨＣ）からの４２７名の参加者からのＤＮＡ試料を、ライブラリ構築及び全ゲノムシーケンシングのためにＮｏｖｏｇｅｎｅ（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ、Ｃｈｉｎａ）に提出した。試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘプラットフォーム（平均深さ：５倍）でシーケンシングし、個々の遺伝子型を、ＧｏｔＣｌｏｕｄパイプラインを用いて分析した^４６。ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙｓ（それぞれ、ｒｓ１９２１６２２、Ｃ＿＿＿１２２６１４６＿１０、カタログ番号４３５１３７６；ｒｓ７４１２、Ｃ＿＿＿９０４９７３＿１０、カタログ番号４３５１３７６；及び、ｒｓ４２９３５８、Ｃ＿＿＿３０８４７９３＿２０、カタログ番号４３５１３７６；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた、ｃｈｒ２：１０２９６６０６７（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）、ＡＰＯＥ－ε２、及びＡＰＯＥ－ε４の遺伝子型判定のために、ＳＮＰアレイを使用して、中国人＿コホート＿１（ｎ＝１１２のＡＤ患者、ｎ＝１５１のＨＣ）からの２６３個のゲノムＤＮＡ試料及びＵＫＢＢＮコホート（ｎ＝１０２のＡＤ患者、ｎ＝１１のＨＣ）からの１１３個のゲノムＤＮＡ試料を遺伝子型判定した。本発明者らは、７５００ Ｆａｓｔ ａｎｄ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、リアルタイム定量的ＰＣＲを実施した。本発明者らは、結果をＥＤＳファイルに保存し、ＳＮＰの共同遺伝子型判定のために、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に入力した。

【0133】

死後ヒト脳切片の免疫組織化学的染色
ＡＤ患者７８人からの、ホルマリン固定しパラフィン包埋した死後の前頭皮質切片を、ＵＫＢＢＮコホートから得た。切片を、最初に脱パラフィンし、キシレン及び段階的エタノール溶液で再水和した。Ａβを染色するために、切片を、最初に室温で５分間にわたりギ酸で処理した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％過酸化水素溶液でクエンチした。次いで、切片を、マウス抗ヒトＡβ抗体（１：５００、クローンＮＡＢ２２８、ＳＣ－３２２７７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と、４℃にて一晩インキュベートした。洗浄後、切片をＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（ＱＤ ４４０－ＸＡＫＥ、ＲＴＵ、ＢｉｏＧｅｎｅｘ）とインキュベートし、シグナルを３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質（ＱＤ ４４０－ＸＡＫＥ、ＢｉｏＧｅｎｅｘ）で発生させた。ミクログリア及びＡβタンパク質を共染色するために、二重免疫組織化学的染色を実施した；脱パラフィン及び再水和の後、切片を、クエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）で２５分間にわたり処理し、ブロッキング処理し、その後、内因性ペルオキシダーゼ活性を３％過酸化水素溶液によってクエンチした。次いで、切片を、マウス抗ヒトＡβ抗体（ＳＣ－３２２７７）及びウサギ抗ヒトＩｂａ－１抗体（１：１００、０１９－１９７４１、ポリクローナル、富士フイルム和光純薬株式会社）と４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、切片を、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇ及びＡＰ標識抗ウサギＩｇ（ＨＫ５９７－５０Ｋ、二重染色キット、ＢｉｏＧｅｎｅｘ）とインキュベートし、続いて、ＤＡＢ（ＱＤ４４０－ＸＡＫＥ、ＢｉｏＧｅｎｅｘ）及びＦａｓｔ Ｒｅｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＨＫ１８２－５ＫＥ、ＢｉｏＧｅｎｅｘ）で基質を発生させた。次いで、切片をマイヤーのヘマトキシリン（ＨＫ１００－９Ｋ、ＢｉｏＧｅｎｅｘ）で対比染色し、カバーガラスを取り付けた。洗浄に使用した緩衝液は、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を有するトリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）であり、一次抗体をＴＢＳで希釈した。画像は、ＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１スキャナで撮影し、ＺＥＮ顕微鏡ソフトウェアｖ３．２（ＺＥＩＳＳ）でプロセシングした。

【0134】

Ａβプラークを定量化するために、本発明者らは、各切片のランダム画像を１０枚撮影した。バックグラウンド減算及び閾値調整の後、本発明者らは、Ｆｉｊｉ－ＩｍａｇｅＪ（ｖ１．５３ｃ）のＡｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ関数を用いてＡβプラークを分析した。本発明者らは、各切片の総Ａβ面積、Ａβプラークの数、及びプラークサイズの中央値を決定した。本発明者らは、総Ａβ面積を総画像面積（１０ｍｍ^２）で割ることによって、Ａβプラーク負荷（面積％）を計算した。ミクログリア－Ａβ共染色を定量化するために、本発明者らは、各切片の２０個のランダム画像を選択し、それらをＣｏｌｏｕｒ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ関数でプロセシングして、データを３つのカラーチャネル（すなわち、ＤＡＢ、Ｆａｓｔ Ｒｅｄ、及びヘマトキシリン）に分離した。閾値を調整した後、本発明者らは、Ｃｒｅａｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ関数を用いてＡβプラーク及びミクログリアを選択し、次いで、Ａｎａｌｙｚｅ関数を用いてそれらを分析した。本発明者らは、Ｉｂａ－１染色と共局在した総Ａβ面積及びＡβ面積を決定した。本発明者らは、Ｉｂａ－１染色と共局在したＡβ面積を総Ａβ面積で割ることによって、ミクログリアと共局在したＡβプラーク面積（総Ａβ％）を計算した。２名の独立した研究者が、切片染色、画像取得、及び画像定量化を実施した；それらはまた、盲検様式で画像をランダムに選択及び定量化した。

【0135】

ＧＷＡＳの関連分析及びデータの視覚化
以下のパラメータ：－－ｋｅｅｐ－ａｌｌｅｌｅ－ｏｒｄｅｒ、－－ｌｉｎｅａｒ、－－ｃｉ ０．９５、－－ｈｗｅ ０．００００１、及び－－ｍａｆ ０．０５を用いて、年齢、性別、ＡＤ診断、及び共変数としての上位５つの主構成成分について調整した、ＰＬＩＮＫソフトウェア（ｖ１．９）を用いて、中国人＿コホート＿１におけるゲノムワイドレベルでのＳＮＰと血漿ｓＳＴ２レベルとの関連分析を実施した^９９。データを視覚化するために、Ｒ ｑｑｍａｎパッケージ（ｖ０．１．４）のマンハッタン（）関数及びｑｑ（）関数をそれぞれ用いて、マンハッタンプロット及び分位数プロットを産生した。ＩＬ１ＲＬ１座位の領域プロットは、ＬｏｃｕｓＺｏｏｍを用いて産生した。血漿ｓＳＴ２レベルに対するＩＬ１ＲＬ１座位の効果のファインマッピング分析を、以下のパラメータ：－－ｈｗｅ ０．００００１、－－ｍａｆ ０．０５、－－ｒ、－－ｍａｔｒｉｘ、－－ｃｈｒ ２、－－ｆｒｏｍ－ｂｐ １０２００００００、及び－－ｔｏ－ｂｐ １０４００００００を用いて、ＰＬＩＮＫソフトウェア（ｖ１．９）から産生された関連試験結果及びペアワイズ連鎖不平衡情報と共に、ＣＡＶＩＡＲソフトウェア（ｖ２．２）を使用して実施した^４７。ファインマッピングされた領域プロットは、Ｒ ｐｌｏｔｌｙパッケージ（ｖ４．９．１）のｐｌｏｔ＿ｌｙ（）関数を用いて産生された。Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ（ｖ４．２）を用いて、連鎖不平衡及びハプロタイプ構造をプロットした。全ての独立したｓＳＴ２関連バリアント（ｒ^２＜０．２）を同定するために、ｓＳＴ２ ＧＷＡＳにかかるＰ＜１Ｅ－５のバリアントを、ＰＬＩＮＫソフトウェア（ｖ１．９）（パラメータ：－－ｈｗｅ ０．００００１、－－ｍａｆ ０．０５、－－ｃｌｕｍｐ－ｐ１ ０．００００１、－－ｃｌｕｍｐ－ｒ２ ０．２、－－ｃｈｒ ２、及び－－ｃｌｕｍｐ－ｋｂ ２０００）による分析に供し、２９個の独立したｓＳＴ２関連バリアントを得た。Ｒ ｒｅｌａｉｍｐｏパッケージ（ｖ２．２－３）のｃａｌｃ．ｒｅｌｉｍｐ（）関数^{１００、１０１}を使用して、ｓＳＴ２レベル分散に対する遺伝的要因（すなわち、２９の独立したｓＳＴ２関連バリアント）及び非遺伝的要因（すなわち、年齢及び性別）の寄与を定量化した。

【0136】

組織レベル及び単一細胞レベルでのトランスクリプトームデータセットにおけるｒｓ１９２１６２２の関連分析
ＧＴＥｘデータセットからのヒト組織ｓＳＴ２及びＳＴ２Ｌ転写物レベル^{４８、４９}並びにｒｓ１９２１６２２遺伝子型データを、年齢、性別、ＲＮＡ完全性（すなわち、ＲＮＡ完全性番号）及び集団構造（すなわち、上位４つの主構成成分）について調整して、遺伝子型－発現関連試験に使用した。転写物レベルのランクベースの正規化を、ＧｅｎＡＢＥＬパッケージ（ｖ１．８）のＲ ｒｎｔｒａｎｓｆｏｒｍ（）関数を用いて実施した。

【0137】

単一細胞レベルでのヒト前頭皮質におけるｓＳＴ２及びＳＴ２Ｌの転写レベルは、修飾された参照ゲノムを用いて、本発明者らが以前に公開したｓｎＲＮＡ－ｓｅｑデータセットのＦＡＳＴＱファイルを再編成することによって得た^５０。具体的には、元のＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８プレｍＲＮＡ参照ゲノムのＧＴＦファイル中のＩＬ１ＲＬ１領域（ｃｈｒ２：１０２、３１１、５６３～１０２、３５２、０３７）を３つの部分：ｓＳＴ２特異的領域（ｃｈｒ２：１０２、３４３、４１６～１０２、３４６、１００）、ＳＴ２Ｌ特異的領域（ｃｈｒ２：１０２、３１１、５６３～１０２、３３７、１４７、及び１０２、３４６、１０１～１０２、３５２、０３７）、並びに重複領域（ｃｈｒ２：１０２、３３７、１４８～１０２、３４３、４１５）へと分離した。修飾された参照ゲノムを、新しいＧＴＦファイル及び元のＦＡＳＴＡファイルを用いてＣｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ（ｖ３．０．１）によって産生した。その後の品質管理工程では、遺伝子レベルの定量化及び細胞型同定を上記のように実施した^５０。各細胞クラスターにおける遺伝子型と候補遺伝子発現との関連分析のために、年齢、性別、ＡＤ診断、及び死後期間について調整して、線形回帰分析を実施した。有意レベルを、ＦＤＲで調整したＰ＜０．０５に設定した。関連遺伝子のＧＯ分析を、ＤＡＶＩＤ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓを用いて実施した^{１０２、１０３}。

【0138】

ｒｓ１９２１６２２とアルツハイマー病リスクとの関連の分析
ＡＤリスクに対するｒｓ１９２１６２２遺伝子型の影響を調べるために、メタ分析を実施した。具体的には、６つのＡＤデータセット（すなわち、中国人＿コホート＿１データセット、中国人＿コホート＿２のＷＧＳ及びアレイデータセット、並びにＬＯＡＤ、ＡＤＣ、及びＡＤＮＩデータセット）からのＡＰＯＥ－ε４キャリア及び非キャリアについての効果量（すなわち、対数オッズ比）及び標準誤差（ＳＥ）を、年齢、性別、及び上位５つの主構成成分を共変数として用いたロジスティック回帰を用いて決定した。結果をまとめ、ＭＥＴＡＳＯＦＴ（ｖ２．０．０）によってプロセシングして^１０４、Ｈａｎ及びＥｓｋｉｎのランダム効果モデル（ＲＥ２）の下における関節リスク効果及び有意性レベルを推定した。次いで、結果をＦｏｒｅｓｔＰＭＰｌｏｔ（ｖ１．０．２）に入力して、データ視覚化のためのフォレストプロットを産生した。

【0139】

マウスにおけるインビボ実験
本発明者らは、全てのマウスをＨＫＵＳＴ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容した。全ての動物実験は、ＨＫＵＳＴ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、ＨＫＵＳＴのＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙのガイドラインに従って実施された。本発明者らは、２２℃及び相対湿度６０％で、１２時間の明／暗サイクル、並びに食物及び水を自由に摂取させて、ケージ当たり４匹の同性マウスを収容した。野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。５ＸＦＡＤマウスを、ヒトＡＰＰにおけるＫ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ（スウェーデン）、Ｉ７１６Ｖ（フロリダ）、及びＶ７１７Ｉ（ロンドン）突然変異、並びにヒトＰＳＥＮ１におけるＭ１４６Ｌ及びＬ２８６Ｖ突然変異を過剰発現させることによって、以前に記載されるように産生した^１００。本発明者らは、尾部又は耳の生検標本のＰＣＲ分析によって遺伝子型を確認した。ｓＳＴ２ ３’ＵＴＲ欠失マウスは、ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって産生した。ｓＳＴ２ ３’ＵＴＲ欠失マウスは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性欠失によって産生した。ｇＲＮＡの配列は５’－ＧＴＣＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＴＡＣＡＡ－３’及び５’－ＧＡＣＡＣＴＣＴＡＣＴＴＧＴＡＣＣＴＡＧ－３’であった。本発明者らは、尾部又は耳の生検標本のＰＣＲ分析によって遺伝子型を確認した。本発明者らは、年齢が一致する群で全てのインビボ実験を実施し、マウスを実験条件にランダムに割り当てた。本発明者らは、主に同様の種類の実験での本発明者らの経験に基づいて試料サイズを選んだ。本発明者らは、明期の最中に全ての動物実験を行った。マウス組換えｓＳＴ２－Ｆｃ（１００４－ＭＲ－０５０；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ミニ浸透圧ポンプ（モデル１００４；Ａｌｚｅｔ）を介して０．１１μＬ／時で、５ＸＦＡＤマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ）へと送達した。具体的には、ポンプを右半球の上の脳室内に植え込み、人工脳脊髄液（１１９ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、２６．２ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、及び１１ｍＭ ｄグルコース）中の、マウス組換えｓＳＴ２－Ｆｃタンパク質（ポンプ当たり２４０ｎｇ；１０μｇ／ｍＬ）又はヒトＩｇＧ（対照として）を負荷した。投与の２８日後、マウスを、イソフルランで麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）を経心臓的に灌流し、マウスの脳を収集した。４０ｍｇ／ｋｇのマウスｓＳＴ２ ＡＳＯを、Ｃ５７マウス及び５ＸＦＡＤマウスへと静脈内注射した。投与の５日後、マウスを、イソフルランで麻酔し、ＰＢＳで灌流し、血清及び脳を収集した。

【0140】

マウス脳の免疫組織化学的染色
マウス脳の左半球を、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で２４時間にわたり固定し、３０％スクロースへ移し、切片化するまで４℃で保存した。脳を、振動ブレードミクロトーム（ＶＴ１０００Ｓ、Ｌｅｉｃａ）で５０μｍ切片へと冠状に切断し、使用するまで－２０℃で凍結保護溶液（３０％グリセロール、３０％エチレングリコール、及びＰＢＳ）中で保存した。免疫組織化学のために、切片を、ＰＢＳＴ（すなわち、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）ですすぎ、次いで、抗原回復のために室温で５分間にわたりギ酸で処理し、続いて内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチするために３％過酸化水素溶液で１０分間にわたり処理した。切片を、ＰＢＳＴ中５％ウマ血清で２時間にわたりブロックし、次いで、ブロッキング緩衝液中４Ｇ８抗体（１：１０００、８００７０３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で４℃にて一晩標識した。翌日、切片を、ビオチンコンジュゲート抗マウス二次抗体（１：１０００、ＢＡ ２０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、続いてアビジン－ビオチン－ＨＲＰ複合体（ＰＫ－６１００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベートし、シグナルを、ＤＡＢ（ＳＫ－４１００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で発生させた。画像処理は、Ｌｅｉｃａ ＤＭ６０００ Ｂ化合物顕微鏡を用いて実施した。Ｆｉｊｉ－ＩｍａｇｅＪ（ｖ１．５３ｃ）のＡｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ関数を用いて、皮質切片のＡβプラーク面積を分析した。具体的には、皮質領域（約２００～３００μｍ離れている）におけるマウス当たり４つの脳切片を分析し、Ａβプラークが占有する皮質面積の平均パーセンテージを計算した。

【0141】

免疫蛍光分析のために、本発明者らは、切片を洗浄し、それらを１μＭ Ｘ－３４中で１０分間にわたりインキュベートした。次いで、本発明者らは、それらをＸ－３４緩衝液（ＰＢＳ中４０％ＥｔＯＨ）で洗浄し、次いでＰＢＳ中で洗浄した。次いで、本発明者らは、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中４％ウマ血清、１％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］、及び０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中で２時間切片をブロックした。実験において使用される一次抗体には、マウス抗Ａβ抗体（１：１０００、クローン４Ｇ８、８００７０３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ウサギ抗Ｉｂａ－１（１：１０００、０１９－１９７４１、和光）、及びラット抗Ｋｉ６７（１：２００、クローンＳｏｌＡ１５、１４－５６９８－８０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる；本発明者らは、これらをブロッキング緩衝液で希釈し、切片を４℃で一晩インキュベートした。その後、切片を、ブロッキング緩衝液中のマウス、ウサギ、及びラットＩｇ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、５６８、及び６４７；１：１０００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対するフルオロフォアコンジュゲート二次抗体と、室温で２時間にわたりインキュベートし；ＰＢＳＴで広範囲に洗浄し；ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ（１：３０００００、Ｓ７０２０、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＤＡＰＩ（１：５０００、Ｄ３５７１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し；ＦｌｕｏｒＳａｖｅ（商標）試薬（３４５７８９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてマウントした。

【0142】

本発明者らは、Ｌｅｉｃａ ４０倍油浸対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡を用いて画像処理を実施した。本発明者らは、１μｍの工程サイズで各マウス皮質から、合計４０μｍの５つの画像を撮影し、次いでそれらを、最大強度Ｚ投射を有する単一の画像へと統合した。本発明者らは、抗Ａβ免疫標識（すなわち、４Ｇ８）及びＸ－３４染色を用いて３つの異なるプラーク形態を同定した：（ｉ）プラークコアのない繊維状Ｘ－３４及び４Ｇ８標識によって特徴付けられる繊維状プラーク；（ｉｉ）Ｘ－３４標識コアで半径方向外側に突出する４Ｇ８アミロイド原線維を特徴とするコンパクトなプラーク；及び、（ｉｉｉ）４Ｇ８標識なしのＸ－３４標識コアを特徴とする不活性プラーク。本発明者らは、カスタムマクロを使用して個々のＡβプラークをセグメント化し、各プラークの種類を手動で同定した。プラーク関連ミクログリアについて、本発明者らは、プラーク及びプラークと接触しているプロセスを取り囲むバリア内のＤＡＰＩ^＋核染色によって定義されるように、小さいプラーク（すなわち、半径≦８μｍ）及び大きいプラーク（すなわち、半径＞８μｍ）を取り囲むミクログリアの数を手動で計数した。本発明者らは、Ｋｉ６７^＋ミクログリアを、核内にＫｉ６７シグナルを有するミクログリアとして定義した。Ａβプラークのミクログリア被覆率を定量化するために、本発明者らは、コンパクトなプラークのみを選択した。本発明者らは、分析のためにプラークの中心を通って０．５μｍ離れた１０個の光学スライスを使用した。本発明者らは、Ｆｉｊｉ－ＩｍａｇｅＪ（ｖ１．５３ｃ）においてカスタマイズされたマクロを用いて全ての画像をプロセシングした。各スライスで、閾値を調整した後、本発明者らは、分析粒子及び線に対する面積の関数を用いてプラークの周囲を決定した。本発明者らはまた、ミクログリア染色と共局在するプラーク周囲及びプラーク周囲の弧を決定した。本発明者らは、Ｉｂａ－１免疫標識細胞（群当たり約２５個のプラーク）と密接（１μｍ以内）に接触している、三次元（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ：３Ｄ）スタックにわたるプラーク周囲の弧を合計することによって、ミクログリアによって覆われたプラーク周囲の割合を計算した。本発明者らは、Ｉｍａｒｉｓ ｖ９．７．２（Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてミクログリア－プラーク相互作用の３Ｄ再構成を行った。

【0143】

ミクログリアＡβ食作用能の評価
ミクログリアＡβ食作用能は、以前に記載されたように調べた^２９。簡潔には、４月齢の５ＸＦＡＤ又は野生型マウスに、メトキシ－Ｘ０４（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射してＡβを標識した。マウスをメトキシ－Ｘ０４注射の３時間後にイソフルランで麻酔し、左心室を氷冷ＰＢＳで灌流した。マウスの前脳を、単離し、切り刻み、酵素消化のために５Ｕ／ｍＬのパパイン（ＬＳ００３１２６）及び３５Ｕ／ｍＬのＤＮアーゼＩ（ＬＳ００２１４０；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）において３７℃にて３０分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、ミエリンデブリを、３０％等張パーコール（Ｐ１６４４；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）勾配遠心分離によって枯渇させ、単核細胞懸濁液を、氷冷１０％熱不活性化ＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で得た。細胞集団同定のために、異なる試料細胞懸濁液の混合物から非染色対照を調製した。ミクログリアを標識するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートマウスＣＤ１１ｂ抗体（１：２００；５３－０１１２－８２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、細胞懸濁液を４℃で４５分間にわたり染色した。得られた標識細胞懸濁液を、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘセルソータ・フローサイトメータを用いて分析した。ミクログリア細胞集団について記録された散布図データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ１０．５．０（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析した。

【0144】

細胞培養システムにおけるｒｓ１９２１６２２保持領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム欠失
ヒト脳微小血管内皮細胞株（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）を、Ｃｅｄａｒｌａｎｅから購入し、以前記載されたように培養した^１０１。簡潔には、本発明者らは、組織培養プレートを、１００μｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３７℃にて、５％ＣＯ_２で１時間にわたりコーティングした。その後、本発明者らは、プレートを、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、完全培養培地（５％ＦＢＳ［ＨｙＣｌｏｎｅ］、１％の化学的に定義された脂質濃縮物［Ｇｉｂｃｏ］、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［Ｇｉｂｃｏ］、５μｇ／ｍＬアスコルビン酸［Ｓｉｇｍａ］、１．４μＭヒドロコルチゾン［Ｓｉｇｍａ］、１ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ［ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ］、１０Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン［Ｇｉｂｃｏ］で補充された、内皮細胞増殖培地－２［ＥＧＭ－２］［Ｌｏｎｚａ］）と交換した。培養細胞を０．０５％トリプシンで５分間にわたり解離させ、２５，０００細胞／ｃｍ^２で再プレーティングし、５％ＣＯ_２インキュベータ内で３７℃にて培養に戻した。播種の３～４日後、細胞は、コンフルエンスに達し、継代することができた。本発明者らは、実験のために２７継代～３５継代の細胞を使用した。

【0145】

ＣｈＩＰ定量的ＰＣＲ（ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ）実験のために、本発明者らは、処理の２時間前にｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の培地を完全に変更した。本発明者らは、次いで、培養細胞を、ビヒクル対照として組換えヒトＩＬ－３３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）又はＤＰＢＳで２４時間にわたり処理した。

【0146】

内皮細胞における単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ）編集の効率を評価するために、本発明者らは、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂ装置（Ｌｏｎｚａ）を備えたＨｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用いたヌクレオフェクションによる単一ＣＲＩＳＰＲ構築物で、５×１０^５個のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、本発明者らは、培養培地を１μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有する完全培養培地へと変更した。ピューロマイシン選択の３日後、本発明者らは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、続いてＴ７ＥＩ（ＮＥＢ）編集効率試験を行った。４つ全てのｓｇＲＮＡが高い編集効率を呈した（データ示さず）。

【0147】

ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞においてｒｓ１９２１６２２を保持する領域を欠失させるために、二重ガイドＲＮＡ媒介ノックアウトアプローチを利用した。サンガーシーケンシングによってｒｓ１９２１６２２の上流側及び下流側３００ｂｐから、細胞の遺伝子型を決定した。潜在的化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ガイドＲＮＡのスクリーニングを、ｒｓ１９２１６２２の上流側及び下流側１００ｂｐでＣＲＩＳＰＲ設計ツール（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を用いて実施した。以下のｓｇＲＮＡを利用した：ｓｇＲＮＡ－１，５’－ＴＴＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＧＡＡＧ－３’（配列番号１）；ｓｇＲＮＡ－２，５’－ＣＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＧ－３’（配列番号２）；ｓｇＲＮＡ－３，５’－ＡＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＡＧＣＣＡＴ－３’（配列番号３）；及び、ｓｇＲＮＡ－４，５’－ＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＴＡＧＴＧＣＣＴＡ－３’（配列番号４）。ｓｇＲＮＡを、ｓｇＲＮＡカセット、ヒトコドン最適化ＳｐＣａｓ９、及びピューロマイシン耐性遺伝子を含有する、ＰＸ４５９ｖ２へとサブクローニングした。

【0148】

二重ｇＲＮＡ媒介欠失細胞株を産生するために、ｓｇＲＮＡ－１／ｓｇＲＮＡ－４（標的６７ｂｐ欠失）、又はｓｇＲＮＡ－２／ｓｇＲＮＡ－３（標的３８ｂｐ欠失）、又はｓｇＲＮＡなし対照としてのＰＸ４５９ｖ２を含有するプラスミドで、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日から開始して３日間のピューロマイシン選択（１μｇ／ｍＬ）後、ピューロマイシン耐性細胞を２つの２４ウェルプレートに播種した。培地を週２回交換した。単一コロニーが観察された３週間後、１コロニーのみを含有するウェルを１２ウェルプレートに継代した。各クローンを遺伝子型判定し、標的欠失が生じた可能性のあるクローンをサンガーシーケンシングに供した。このプロトコルにより、６つの対照系統、３８ｂｐ欠失を有する８系統、及び６７ｂｐ欠失を有する１０系統が産生された。

【0149】

ヒト患者におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集
アルツハイマー病の診断を受け、かつＡＤの高リスクを指し示す遺伝子マーカ（例えば、女性患者ＡＰＯＥ－ε４キャリア）を持つように遺伝子型判定されたヒト患者に、ｓ１９２１６２２座位から上流側及び下流側約１００ｂｐの領域に及ぶ、ｒｓ１９２１６２２座位を包含するゲノム配列を欠失させることを目的とした二重ガイドＲＮＡ媒介ゲノム編集システムにおいて、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼ及び２つのｓｇＲＮＡをエンコードする、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム又はリボ核タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＲＮＰ）複合体をエンコードするＤＮＡ又はＲＮＡからパッケージングされたウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター若しくはアデノ随伴ウイルスベクター）又は脂質ナノ粒子を、静脈内注射によって投与する。ｓｇＲＮＡ標的化及び欠失戦略は、培養システムで使用されるものと同じである（最後のセクションを参照されたい）。ヒト患者におけるｓＳＴ２ゲノム領域を標的とするＣＲＩＳＰＲ編集のために、ｓｇＲＮＡ、及びＣａｓ９をエンコードするｍＲＮＡを保有する脂質ナノ粒子を、０．０１～２ｍｇ／ｋｇ；０．０２～１．０ｍｇ／ｋｇ；０．０５～０．５ｍｇ／ｋｇ；又は０．１～０．３ｍｇ／ｋｇの患者体重の範囲で患者へ送達する。４週間後、０．１ｍｇ／ｋｇのナノ粒子の投与は、標的タンパク質（例えば、ｓＳＴ２タンパク質）の循環レベルの約５０％の低減を達成するものと予想されるが、一方で、０．３ｍｇ／ｋｇのナノ粒子の投与は、標的タンパク質レベルの８０％を超える低減を達成するものと予想される。

【0150】

ｓＳＴ２アンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング
ｓＳＴ２アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の特異性は、マウスゲノム参照（ＧＲＣｍ３８）及びヒトゲノム参照（ＧＲＣｈ３７）における他の転写物中では、同じ配列はなく、配列と１～２のミスマッチもないことによって定義された。全てのＡＳＯは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって合成された。各ＡＳＯの効果を調べるために、マウス線維芽細胞ＮＩＨ－３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＡＴＣＣ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて５００ｎＭ ＡＳＯでトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後に細胞を収集した。細胞溶解のタンパク質量を測定して、培地ｓＳＴ２レベルのレベルを正規化した。

【0151】

他の統計学的分析及びデータの視覚化
ヒト対象の残りの統計学的分析について、ＡＤ関連エンドフェノタイプと、ｓＳＴ２レベル及びｒｓ１９２１６２２遺伝子型との関連の有意性を、線形回帰分析によって決定した。ＣＳＦ ｓＳＴ２レベルカットオフは、Ｒのｏｐｔｉｍａｌ．ｃｕｔｐｏｉｎｔｓ（）関数、及びＯｐｔｉｍａｌＣｕｔｐｏｉｎｔｓパッケージのＹｏｕｄｅｎ法（ｖ１．１－４）を用いて、Ｙｏｕｄｅｎインデックスの最大値で、ＣＳＦ ｓＳＴ２のレベルに従って決定した^１０５。認知症発症年齢とｒｓ１９２１６２２ Ａアレルとの関連を調べるために、Ｒの生存パッケージ（ｖ１．３－２４）のｃｏｘｐｈ（）関数を用いて、性別及び上位５主構成成分を共変数として、コックス回帰を実施した。有意レベルをＰ＜０．０５に設定した。データの視覚化のために、Ｒのｐｌｏｔ（）関数を使用してボルケーノプロットを産生し、Ｒ ｇｇｐｌｏｔ２パッケージ（ｖ３．２．１）のｇｇｐｌｏｔ（）関数を使用して、ドットプロットを産生した。マウス及び細胞培養システム実験から得られたデータについて、独立スチューデントｔ検定、又は一元配置分散分析若しくは二元配置分散分析、続いて指し示されるボンフェローニ事後検定によって、差の有意性を評価した。有意レベルをＰ＜０．０５に設定した。全ての統計学的プロットは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて産生した。

【0152】

データ可用性
中国人＿コホート＿１からの個々の参加者によって与えられる同意フォームは、研究内容が、病院及び研究チームの管理下において非公開に保たれることを述べた。したがって、個々の参加者の表現型、ゲノム、及びプロテオミクスデータが利用可能であり、かつ正式な共同研究において共有される。データ共有及びプロジェクト協調のための用途は、ＨＫＵＳＴでホストされるレビューパネルによってプロセシング及びレビューされる。研究者は、本研究と関連したデータ共有及びプロジェクト協力の詳細について［[e-mail]］に連絡してもよい。

【0153】

コード可用性
データ分析及びデータ視覚化に使用される全てのコードのリクエストは、対応する作成者、及びＨＫＵＳＴでホストされるレビューパネルによって迅速にレビューされて、リクエストが任意の知的財産、機密性、又はその他のライセンス義務の対象であることを検証する。制限がない場合、対応する作成者は、コードを共有するために要求者と通信する。

【0154】

本出願で引用された、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号又は均等物を含む全ての特許、特許出願、及び他の刊行物は、全ての目的のために全体が参照により組み込まれる。

【0155】

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【0166】

【表1-1】

【0167】

【表1-2】

【0168】

【表2】

【0169】

【表3】

【0170】

【表4-1】

【0171】

【表4-2】

【0172】

【表4-3】

【0173】

【表4-4】

【0174】

【表4-5】

【0175】

【表4-6】

【0176】

【表4-7】

【0177】

【表4-8】

【0178】

【表4-9】

【0179】

【表4-10】

【0180】

【表4-11】

【0181】

【表4-12】

【0182】

【表4-13】

【0183】

【表4-14】

【0184】

【表4-15】

【0185】

【表4-16】

【0186】

【表4-17】

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【表4-18】

【0188】

【表5】

【0189】

【表6】

【0190】

【表7】

【0191】

【表8】

【0192】

【表9-1】

【0193】

【表9-2】

【0194】

【表9-3】

【0195】

【表9-4】

【0196】

【表9-5】

【0197】

【表9-6】

【0198】

【表9-7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-04-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0198】

【表9-7】

本願発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
アルツハイマー病（ＡＤ）の治療又はＡＤのリスクの低減を必要とする個人においてＡＤを治療するため又はＡＤのリスクを低減するための方法であって、ｒｓ１９２１６２２、並びに／又は表４及び表５に列挙されたそれ以外の５７４個のｓＳＴ２関連遺伝子バリアントのいずれか１個若しくは複数、並びに／又はｓＳＴ２遺伝子／転写物の３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）を包含するゲノム配列を破壊する有効量の組成物を前記個人へと投与する工程を含む、方法。
＜２＞
前記投与する工程の前に、前記個人のゲノムの少なくとも一部をシーケンシングすることを更に含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
前記個人が、ＡＰＯＥ－ε４キャリア又は非ＡＰＯＥ－ε４キャリアである、＜１＞に記載の方法。
＜４＞
前記個人が、女性又は男性である、＜１＞に記載の方法。
＜５＞
前記個人が、ｒｓ１９２１６２２にＡアレル若しくはＧアレルを有するか、又は前記個人が、表４若しくは表５に示される特定の遺伝子座に少なくとも１つのアレルを有する、＜１＞に記載の方法。
＜６＞
前記個人が、ＡＤと診断されているか、又は前記個人が、まだＡＤと診断されていないが、ＡＤの既知のリスク因子を有する、＜１＞に記載の方法。
＜７＞
ｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）を包含する前記ゲノム配列が、ｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）の上流側及び下流側約３００塩基対、好ましくはｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）の上流側及び下流側約２５０塩基対、２００塩基対、１５０塩基対、１００塩基対、５０塩基対、３０塩基対、又は２０塩基対の配列を含む、＜１＞に記載の方法。
＜８＞
前記組成物が、ｒｓ１９２１６２２又は前記ｓＳＴ２遺伝子の前記３’－ＵＴＲを包含する前記ゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミニＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、＜１＞に記載の方法。
＜９＞
前記組成物が、スモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼ及びｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）を包含する前記ゲノム配列内の２つの位置を標的とする２つのｓｇＲＮＡをコードする１又は複数のベクターを含む、＜１＞に記載の方法。
＜１０＞
前記組成物が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び２つのｓｇＲＮＡをコードする１つのベクターを含む、＜９＞に記載の方法。
＜１１＞
前記１又は複数のベクターが、１又は複数のウイルスベクターである、＜９＞又は＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞
前記組成物が、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射によって投与されるか、又は経口投与若しくは経鼻投与によって投与される、＜１＞に記載の方法。
＜１３＞
前記組成物が、溶液、懸濁液、粉末、ペースト、錠剤、又はカプセルの形態で投与される、＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞
アルツハイマー病（ＡＤ）の治療又はＡＤのリスクの低減を必要とする個人においてＡＤを治療するため又はＡＤのリスクを低減するためのキットであって、ｒｓ１９２１６２２（若しくは表４若しくは表５の別の遺伝子座）又はｓＳＴ２遺伝子の３’－ＵＴＲを包含するゲノム配列を破壊する組成物を含有する容器を含む、キット。
＜１５＞
前記組成物が、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射のために製剤化されているか、又は経口投与若しくは経鼻投与のために製剤化されている、＜１４＞に記載のキット。
＜１６＞
前記組成物が、ｒｓ１９２１６２２又は前記ｓＳＴ２遺伝子の前記３’－ＵＴＲを包含する前記ゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミニＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、＜１４＞に記載のキット。
＜１７＞
前記組成物が、スモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってガイドされるエンドヌクレアーゼ及びｒｓ１９２１６２２（又は表４若しくは表５の別の遺伝子座）を包含する前記ゲノム配列内の２つの位置を標的とする２つのｓｇＲＮＡをコードする１又は複数のベクターを含む、＜１４＞に記載のキット。
＜１８＞
前記組成物が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び２つのｓｇＲＮＡをコードする１つのベクターを含む、＜１７＞に記載のキット。
＜１９＞
前記個人のゲノムの少なくとも一部をシーケンシングするための薬剤を含有する第２の容器を更に含む、＜１４＞に記載のキット。
＜２０＞
前記組成物の投与のための取扱説明を更に含む、＜１４＞に記載のキット。

【手続補正2】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アルツハイマー病（ＡＤ）の治療又はＡＤのリスクの低減を必要とする個人においてＡＤを治療するため又はＡＤのリスクを低減するための方法において使用するための、ｓＳＴ２遺伝子／転写物の３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）を包含するゲノム配列を破壊する医薬組成物であって、前記方法は有効量の前記医薬組成物を前記個人へと投与する工程を含む、医薬組成物。

【請求項2】

前記方法は、前記投与する工程の前に、前記個人のゲノムの少なくとも一部をシーケンシングすることを更に含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記個人が、ＡＰＯＥ－ε４キャリア又は非ＡＰＯＥ－ε４キャリアである、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記個人が、女性又は男性である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記個人が、ＡＤと診断されているか、又は前記個人が、まだＡＤと診断されていないが、ＡＤの既知のリスク因子を有する、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記ｓＳＴ２遺伝子の前記３’－ＵＴＲを包含する前記ゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミニＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項7】

表９に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち１又は複数を含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項8】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び２つのｓｇＲＮＡをコードする１つのベクターを含む、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記１又は複数のベクターが、１又は複数のウイルスベクターである、請求項７又は請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射によって投与されるか、又は経口投与若しくは経鼻投与によって投与される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項11】

溶液、懸濁液、粉末、ペースト、錠剤、又はカプセルの形態である、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

アルツハイマー病（ＡＤ）の治療又はＡＤのリスクの低減を必要とする個人においてＡＤを治療するため又はＡＤのリスクを低減するためのキットであって、ｓＳＴ２遺伝子の３’－ＵＴＲを包含するゲノム配列を破壊する組成物を含有する容器を含む、キット。

【請求項13】

前記組成物が、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、若しくは頭蓋内注射のために製剤化されているか、又は経口投与若しくは経鼻投与のために製剤化されている、請求項１２に記載のキット。

【請求項14】

前記組成物が、前記ｓＳＴ２遺伝子の前記３’－ＵＴＲを包含する前記ゲノム配列を標的とする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミニＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１２に記載のキット。

【請求項15】

前記組成物が、表９に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち１又は複数を含む、請求項１２に記載のキット。

【請求項16】

前記組成物が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び２つのｓｇＲＮＡをコードする１つのベクターを含む、請求項１５に記載のキット。

【請求項17】

前記個人のゲノムの少なくとも一部をシーケンシングするための薬剤を含有する第２の容器を更に含む、請求項１２に記載のキット。

【請求項18】

前記組成物の投与のための取扱説明を更に含む、請求項１２に記載のキット。

【国際調査報告】