特表 2024-529526 Ｂ７Ｈ６抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-06

(54)【発明の名称】Ｂ７Ｈ６抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240730BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240730BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240730BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240730BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240730BHJP

   G01N 33/531 20060101ALI20240730BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

C07K16/46

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61P35/00

A61K47/68

A61K48/00

A61K35/12

G01N33/53 D

G01N33/531 A

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506277

(86)(22)【出願日】2022-12-07

(85)【翻訳文提出日】2024-01-31

(86)【国際出願番号】 CN2022137095

(87)【国際公開番号】W WO2023104062

(87)【国際公開日】2023-06-15

(31)【優先権主張番号】202111485380.9

(32)【優先日】2021-12-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523346629

【氏名又は名称】ヘーフェイ ティージー イミュノファーマ カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100205659

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 拓也

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(74)【代理人】

【識別番号】100185269

【弁理士】

【氏名又は名称】小菅 一弘

(72)【発明者】

【氏名】ティエン ジーガン

(72)【発明者】

【氏名】カオ グオシュアイ

(72)【発明者】

【氏名】シャオ ウェイファ

(72)【発明者】

【氏名】スン ルイ

(72)【発明者】

【氏名】スン ハオユー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA92Y

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA95

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF68

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB26

4C085AA14

4C085AA21

4C085BB11

4C085BB31

4C085DD62

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA72

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA28

4H045EA50

4H045EA51

4H045FA74

(57)【要約】

本発明はＢ７Ｈ６抗体及びその使用を開示する。前記抗体は重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含む。本発明の抗体はＢ７Ｈ６に結合して、Ｂ７Ｈ６によるＮＫ細胞活化性受容体ＮＫｐ３０との結合を促進し、抗がん機能を有することができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ７Ｈ６に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含み、
前記重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記重鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記重鎖ＣＤＲ３は、ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１は、ＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記軽鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つ含み、
前記軽鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つ含む、Ｂ７Ｈ６に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、又は
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、（ｉ）前記重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は、（ｉｉ）前記軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

前記重鎖可変領域は、（ｉ）から選ばれた重鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、（ｉｉ）から選ばれた軽鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
１）前記重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるアミノ酸配列、
２）前記重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるアミノ酸配列、
３）前記重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるアミノ酸配列、又は
４）前記重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるアミノ酸配列、を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
１）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるアミノ酸配列、
２）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示されるアミノ酸配列、
３）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるアミノ酸配列、又は
４）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示されるアミノ酸配列、を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項7】

前記単離された抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

前記抗体は、モノクローナル抗体、マウス由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト修飾抗体、ヒト抗体、Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’，Ｆａｂ’－ＳＨ又はＦ（ａｂ’）_２である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列に結合することができる、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項10】

治療薬及び治療薬に結合した請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、免疫複合体。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び／又は請求項１０に記載の免疫複合体、及び薬学的に許容されるベクターを含む、組成物。

【請求項12】

サンプル中のＢ７Ｈ６を検出するためのキットであって、当該キットは、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、キット。

【請求項13】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの、サンプル中のＢ７Ｈ６を検出するための試薬の調製における使用。

【請求項14】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を予防及び／又は治療するための薬物の調製における使用であって、前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患であり、
選択可能に、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である、使用。

【請求項15】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む、核酸。

【請求項16】

請求項１５に記載の核酸を含む、組換えベクター又は形質転換体。

【請求項17】

請求項１５に記載の核酸、請求項１６に記載の発現ベクター又は形質転換体、又は請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを担持する、組換え細胞。

【請求項18】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１０に記載の免疫複合体、請求項１１に記載の組成物、請求項１５に記載の核酸、請求項１６に記載の組換えベクター又は形質転換体又は請求項１７に記載の組換え細胞を含む、薬物。

【請求項19】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１０に記載の免疫複合体、請求項１１に記載の組成物、請求項１８に記載の薬物、請求項１５に記載の核酸、請求項１６に記載の組換えベクター又は形質転換体又は請求項１７に記載の組換え細胞の、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患の治療及び／又は予防における使用。

【請求項20】

前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患であり、
選択可能に、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である、請求項１９に記載の使用。

【請求項21】

Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を治療及び／又は予防する方法であって、
１）請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
２）請求項１０に記載の免疫複合体、
３）請求項１１に記載の組成物、
４）請求項１８に記載の薬物、
５）請求項１５に記載の核酸、
６）請求項１６に記載の組換えベクター又は形質転換体、及び
７）請求項１７に記載の組換え細胞、のうちの少なくとも１つを被験者に投与することを含む、方法。

【請求項22】

前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患であり、
選択可能に、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

被験者がＢ７Ｈ６媒介性疾患を有するかどうかを診断するための方法であって、
１）請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
２）請求項１５に記載の核酸、
３）請求項１６に記載の組換えベクター又は形質転換体、及び
４）請求項１７に記載の組換え細胞、のうちの少なくとも１つを用いて検出対象サンプルにおけるＢ７Ｈ６を検出し、
前記Ｂ７Ｈ６の検出結果に基づいて、前記検出対象サンプルにおけるＢ７Ｈ６の含有量を決定すること、を含む、ことを特徴とする方法。

【請求項24】

前記検出対象サンプルにおけるＢ７Ｈ６の含有量が疾患の最低基準以上であることは、検出対象サンプルがＢ７Ｈ６媒介性疾患を有する患者から由来する指示である、ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患であり、
選択可能に、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である、ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

１）請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
２）請求項１５に記載の核酸、
３）請求項１６に記載の組換えベクター又は形質転換体、及び
４）請求項１７に記載の組換え細胞、のうちの少なくとも１つの、被験者がＢ７Ｈ６媒介性疾患を有するか否かについての診断における使用。

【請求項27】

前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患であり、
選択可能に、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である、請求項２６に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は抗体の分野に関し、具体的には、Ｂ７Ｈ６に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメント及び使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＮＫ細胞は体内で非常に重要な自然リンパ球であり、抗ウイルスおよび抗腫瘍において重要な役割を果たしている。ＮＫ細胞の表面は、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄなどを含む様々な活性化受容体を発現し、腫瘍細胞の表面に発現するリガンドを認識して結合し、これらのリガンドは、自身の遺伝子によってコードされ、細胞の悪性形質転換（腫瘍）などの条件下で細胞の表面に発現する。

【0003】

ＮＫｐ３０は重要なＮＫ細胞活性化受容体であり、そのリガンドに結合した後、活性化シグナルを伝達し、ＮＫ細胞による腫瘍の死滅を促進する。Ｂ７Ｈ６は膜タンパク質の形で発現する唯一の既知のＮＫｐ３０リガンドであり、Ｂ７－Ｈ６は黒色腫や肝臓癌などのさまざまな腫瘍組織で高発現しており、正常組織では発現せず、腫瘍特異的である。

【0004】

腫瘍微小環境におけるＴＧＦ－βなどのサイトカインは、ＮＫ細胞の表面でのＮＫｐ３０の発現を下方制御し、その結果、ＮＫ細胞はＮＫｐ３０－Ｂ７Ｈ６相互作用を使用して腫瘍を正確に識別して殺すことができず、腫瘍免疫逃避をもたらす。そのため、Ｂ７Ｈ６を標的とする治療性抗体薬を提供することが必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、従来の技術の欠点を克服して、ヒトおよびサルＢ７Ｈ６に結合して、Ｂ７Ｈ６とＮＫｐ３０との結合を促進することができるＢ７Ｈ６抗体及びその使用を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明による抗体は、Ｂ７Ｈ６とＮＫｐ３０との結合を促進することにより、ＮＫ細胞の抗がん機能を促進する。

【0007】

一態様では、本発明は、Ｂ７Ｈ６に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含み、
前記重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記重鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記重鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記軽鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記軽鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含む。

【0008】

いくつかの実施例では、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、又は、
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0009】

いくつかの実施例では、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、（ｉ）前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、及び／又は、（ｉｉ）前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0010】

いくつかの実施例では、前記重鎖可変領域は（ｉ）から選ばれた重鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、（ｉｉ）から選ばれた軽鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0011】

いくつかの実施例では、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
１）前記重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるアミノ酸配列、
２）前記重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるアミノ酸配列、
３）前記重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるアミノ酸配列、又は
４）前記重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施例では、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
１）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるアミノ酸配列、
２）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示されるアミノ酸配列、
３）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるアミノ酸配列、又は
４）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示されるアミノ酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施例では、前記単離された抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４である。

【0014】

いくつかの実施例では、前記抗体はモノクローナル抗体、マウス由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト修飾抗体、ヒト抗体、Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’，Ｆａｂ’－ＳＨ又はＦ（ａｂ’）_２である。

【0015】

いくつかの実施例では、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列に結合することができる。

【0016】

他の態様では、本発明は免疫複合体を提供し、当該免疫複合体は治療薬及び治療薬に結合した上記の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。

【0017】

別の態様では、本発明は組成物を提供し、前記組成物は上記の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び／又は上記の免疫複合体、及び薬学的に許容されるベクターを含む。

【0018】

別の態様では、本発明はサンプル中のＢ７Ｈ６を検出するためのキットを提供し、当該キットには上記抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれる。

【0019】

別の態様では、本発明は、上記の抗体又はその抗原結合フラグメントの、サンプル中のＢ７Ｈ６を検出するための試薬の調製における使用を提供する。

【0020】

別の態様では、本発明は、上記の抗体又はその抗原結合フラグメントの、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を予防及び／又は治療するための薬物の調製における使用を提供し、前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患は、がん又は感染性疾患である。

【0021】

選択可能に、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である。

【0022】

別の態様では、本発明は、上記の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸を含む核酸を提供する。

【0023】

別の態様では、本発明は、上記の核酸を含む、組換えベクター又は形質転換体を提供する。

【0024】

一態様では、本発明は、組換え細胞を提供し、前記組換え細胞が、上記に記載の核酸、発現ベクター又は形質転換体を担持しているか、又は上記に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを発現している。

【0025】

他の態様では、本発明は、上記に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、免疫複合体、組成物、薬物、核酸、組換えベクター又は形質転換体又は組換え細胞を含む薬物を提供する。

【0026】

別の態様では、本発明は、上記に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、免疫複合体、組成物、薬物、核酸、組換えベクター又は形質転換体又は組換え細胞の、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患の治療及び／又は予防における使用を提供する。上記のように、前記抗体又はその抗原結合フラグメントはＢ７Ｈ６と効果的に結合することができ、さらに、Ｂ７Ｈ６とＮＫｐ３０の間の相互作用を促進し、ＮＫ細胞の抗がん機能を強化し、このため、前記抗体又はその抗原結合フラグメント、及び適切な条件下で前記抗体又はその抗原結合フラグメントを発現して得る物質は、すべてＢ７Ｈ６媒介性疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。

【0027】

別の態様では、本発明は、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。本発明の実施例によれば、前記方法は、１）以上に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、２）上記に記載の免疫複合体、３）上記に記載の組成物、４）上記に記載の薬物、５）上記に記載の核酸、６）上記に記載の組換えベクター又は形質転換体、及び、７）上記に記載の組換え細胞のうちの少なくとも１つを被験者に投与することを含む。上記のように、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｂ７Ｈ６と効果的に結合することができ、さらに、Ｂ７Ｈ６とＮＫｐ３０の間の相互作用を促進し、ＮＫ細胞の抗がん機能を強化し、このため、前記抗体又はその抗原結合フラグメント、及び適切な条件下で前記抗体又はその抗原結合フラグメントを発現して得る物質、又は前記抗体又はその抗原結合フラグメントを含む物質は、すべてＢ７Ｈ６媒介性疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。本発明の実施例の方法によれば、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。

【0028】

別の態様では、本発明は、被験者がＢ７Ｈ６媒介性疾患を有するかどうかを診断するための方法を提供する。本発明の実施例によれば、前記方法は、１）上記に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、２）上記に記載の核酸、３）上記に記載の組換えベクター又は形質転換体、及び４）上記に記載の組換え細胞、のうちの少なくとも１つを使用して検出対象サンプルにおけるＢ７Ｈ６を検出し、前記Ｂ７Ｈ６の検出結果に基づいて、前記検出対象サンプルにおけるＢ７Ｈ６の含有量を決定することを含む。上記のように、本発明の実施例の抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｂ７Ｈ６と効果的に結合することができ、このため、前記抗体又は抗原結合フラグメントはＢ７Ｈ６を検出することに用いられることができ、Ｂ７Ｈ６は、多種の疾患を媒介し、このため、被験者由来の生体サンプルに含まれる前記Ｂ７Ｈ６のレベルに基づいて、被験者がＢ７Ｈ６媒介性疾患を有するか否かを判定することができる。なお、さらに上記物質を使用して被験者検出対象サンプルにおけるＢ７Ｈ６の含有量を監視することができ、即ち、上記の物質は、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を有する被験者における疾患の病期分類にも使用でき、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患の予後を評価するためにも使用することができる。

【0029】

別の態様では、本発明は、１）以上に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、２）上記に記載の核酸、３）上記に記載の組換えベクター又は形質転換体、及び４）上記に記載の組換え細胞のうちの少なくとも１つの、被験者がＢ７Ｈ６媒介性疾患を有するか否かについての診断における使用を提供する。上記のように、本発明の実施例の抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｂ７Ｈ６と効果的に結合することができ、このため、前記抗体又は抗原結合フラグメントはＢ７Ｈ６を検出することに用いれることができ、Ｂ７Ｈ６は、多種の疾患を媒介し、このため、被験者由来の生体サンプルに含まれる前記Ｂ７Ｈ６のレベルに基づいて、被験者がＢ７Ｈ６媒介性疾患を有するか否かを判定することができる。

【0030】

上記技術的手段により、本発明は、ヒトおよびサルＢ７Ｈ６に結合することができる抗Ｂ７Ｈ６抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトおよびサルＢ７Ｈ６に結合する特性、Ｂ７Ｈ６とＮＫｐ３０との間の相互作用を促進することができる特性、及びＮＫ細胞の抗がん機能を促進することができる特性、のうちの少なくとも１種を有する。

【0031】

本発明の他の特徴及び利点について、以下の発明を実施するための形態において詳しく説明する。

【0032】

本発明の付加的な態様および利点は、以下の説明の中で一部与えられ、一部は以下の説明から明らかになるか、または本発明の実践を通して理解されるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0033】

本発明の上記及び／又は付加的な態様および利点について、以下の図面を参照すると、実施例の説明において明白で理解しやすくなり、
図面は、本発明のさらなる理解を提供するものであり、本明細書の一部を形成し、以下の実施形態とともに、本発明を説明するために使用されるが、本発明の限定を構成するものではない。図面において、

【図1】本発明の具体的な実施形態によるマウス由来Ｂ７Ｈ６抗体にヒトＢ７Ｈ６を結合するＥＬＩＳＡ結果図である。

【図2】本発明の具体的な実施形態によるマウス由来Ｂ７Ｈ６抗体にＨＬ６０－Ｂ７Ｈ６細胞を結合する結果図である。

【図3】本発明の具体的な実施形態によるヒト化Ｂ７Ｈ６抗体にヒトＢ７Ｈ６を結合するＥＬＩＳＡ結果図である。

【図4】本発明の具体的な実施形態によるヒト化Ｂ７Ｈ６抗体にＨＬ６０－Ｂ７Ｈ６細胞を結合する結果図である。

【図5】本発明の具体的な実施形態によるヒト化Ｂ７Ｈ６抗体にＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏ Ｂ７Ｈ６細胞を結合する結果図である。

【図6】本発明の具体的な実施形態によるヒト化Ｂ７Ｈ６抗体にサルＢ７Ｈ６を結合するＥＬＩＳＡ結果図である。

【図7】本発明の具体的な実施形態によるＢ７Ｈ６抗体が受容体ＮＫｐ３０の結合を促進する結果図である。

【図8】本発明の具体的な実施形態によるＢ７Ｈ６抗体媒介補体依存性細胞傷害効果の結果図である。

【図9】本発明の具体的な実施形態によるＢ７Ｈ６抗体がヌードマウスのヒト急性骨髄性白血病Ｕ－９３７腫瘍への対抗を促進する結果図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下、本発明の実施例を詳しく説明し、前記実施例の例示は図面において示される。以下に図面を参照しながら説明する実施例は例示であり、本発明を説明するためのものであり、本発明の制限を理解することはできない。

【0035】

なお、「第１の」、「第２の」といった用語は目的を説明するためのものにすぎず、相対的に重要性を示す若しくは暗に示す、または技術的特徴を明示する数を暗に示すとみなすことはできない。したがって、「第１の」、「第２の」と限定している特徴は１つまたは複数の該特徴を含むことを明示するまたは暗に示すことができ、本発明の説明において、特に明確かつ具体的に限定している場合を除き、「複数」の概念は２つ又は２つ以上である。

【0036】

以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明する。本明細書に記載の特定の実施形態は、本発明を例示および説明するためにのみ使用され、本発明を限定することを意図していないことを理解されたい。

【0037】

本明細書で開示する範囲の端点およびいかなる値も、正確な範囲または値に限定されず、これらの範囲または値はこれらの範囲または値に近い値を含むものとして理解されるべきである。数値範囲については、本明細書で具体的に開示されるものと見なされるべき各範囲の端点値間、各範囲の端点値と個々の点値間、および個々の点値間を互いに組み合わせて、１つ以上の新しい数値範囲が得られる。

【0038】

本発明の理解を容易にするために、以下にいくつかの技術用語と科学用語を具体的に定義する。本明細書において明示的に定義されている場合を除き、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解する意味を有している。アミノ酸残基の略語は、当分野で使用されている２０個の一般的なＬ－アミノ酸の１つを指す標準的な３文字および／または１文字コードである。

【0039】

本発明において、反対の記載がない場合、使用された抗原結合フラグメントという用語は「抗体フラグメント」であり、また、「抗体フラグメント」は、一般に抗原結合抗体フラグメントを意味し、抗体の完全な部分、一般に抗原結合領域または可変領域を含み得、抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖ、二重抗体、線状抗体、一本鎖抗体分子などが含まれる。

【0040】

「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」又は「ＣＤＲ配列」という用語とは、抗原結合を担う抗体におけるアミノ酸配列を指し、例えば、一般的に、軽鎖可変領域における２３－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）及び８９－９７（Ｌ３）付近、及び重鎖可変領域における３１－３５Ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）付近のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔなど、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、及び／又は「高可変リング」（例えば、軽鎖可変領域における２６－３２（ＬＩ）、５０－５２（Ｌ２）及び９１－９６（Ｌ３）、及び重鎖可変領域における２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）付近からのアミノ酸残基（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含む。

【0041】

「保存的修飾形態のアミノ酸配列」という用語とは、以下のようなアミノ酸修飾を指す。この修飾は、アミノ酸の置換、増加、欠失を含む、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に大きな影響を与えたり、変化させたりしない。修飾は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的な技術によって本発明の抗体に導入され得る。保存されたアミノ酸置換系におけるアミノ酸残基は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換された置換である。当該技術分野において、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが同定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β－分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。このため、本発明の抗体のＣＤＲ領域における１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基によって置換されてもよく、改変された抗体の保持された機能は、本明細書に記載の機能アッセイ方法を用いて試験され得る。好ましくは、保存的修飾は、数が１または２を超えない。

【0042】

ペプチドの場合、用語「実質的な相同性」は、２つのペプチドまたはそれらの特定の配列が、最適な整列および比較（ここで、ヌクレオチドの適切な挿入または欠失）のとき、少なくとも約８０％のアミノ酸、一般的に少なくとも約９０％～９５％、且つより好ましくは少なくとも約９８％～９９．５％のアミノ酸が同一であることを意味する。

【0043】

２つの配列間の同一性％は、配列を最適に照合する際に、配列が共有する同一位置の数によって変化する（つまり、相同性％＝同一位置の数／総位置数×１００）。このうち、最適照合系は、２つの配列の最適照合を達成するために導入する必要がある空の桁数と各空の桁の長さを考慮して決定される。２つの配列間の配列照合および同一性百分率の測定は、以下の非制限的な実施例で説明するように、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。

【0044】

当業者は、抗体の活性に実質的に影響を及ぼすことない（少なくとも９５％の活性を保持する）ことを前提として、本発明の配列を１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上）のアミノ酸に置換、添加、および／または欠損させて、前記抗体またはその機能性フラグメントの配列のバリエーションを得ることができる。それらはいずれも本発明の保護の範囲に含まれると考えられる。例えば、類似の性質を有するアミノ酸は可変領域において置換される。本発明の変異体の配列は、参照配列との適合性（または相同性）を少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％有し得る。本発明に記載の配列適合性は、配列解析ソフトウェアを用いて測定されることができる。例えばデフォルトのパラメータのコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮを使用する。本発明に記載されるアミノ酸配列は、すべてＮ末端からＣ末端までの態様で示されている。

【0045】

上記のように、本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であってもよいし、抗原結合部分のみを含んでもよく（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖフラグメント）、または機能に影響を与えるように修飾されていてもよい。本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗Ｂ７Ｈ６抗体を含む。いくつかの適用において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾は有用であり得るか、またはオリゴ糖鎖上のフコシャリド部分の不在は、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増強する抗体であり得る。他の適用では、ガラクトシル化修飾を実行して、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を変化させることができる。

【0046】

本明細書において使用される用語「機能性フラグメント」は、特に、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖を指す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、又はダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）などの抗体フラグメント、または化学修飾又はリポソームへの組み込みによって半減期を増加させることができる任意のフラグメントを指す。前記化学修飾は、例えばポリエチレングリコール（「ポリエチレングリコール化、ＰＥＧ化」）（Ｆｖ－ＰＥＧ、ｓｃＦｖ－ＰＥＧ、Ｆａｂ－ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２－ＰＥＧまたはＦａｂ’－ＰＥＧポリエチレングリコール化フラグメントと呼ばれる）（「ＰＥＧ」はポリエチレングリコールと呼ばれる）などのポリ（アルキロド）ジオールを付加することであり、前記フラグメントはＢ７Ｈ６結合活性を有する。好ましくは、前記機能性フラグメントは、その由来抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の部分配列からなるか、またはそれらを含む。その部分配列は、その由来抗体と同様の結合特異性と十分な親和性を保持するのに十分であり、Ｂ７Ｈ６に対して、その由来抗体の親和力の少なくとも１／１００に等しいことが好ましい。より好ましい態様では少なくとも１／１０に等しい。このような機能フラグメントには少なくとも５つのアミノ酸が含まれ、その由来の抗体配列の１０、１５、２５、５０及び１００個の連続アミノ酸が好ましい。

【0047】

上記のように、本発明は、Ｂ７Ｈ６に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、当該抗体は重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含むことを特徴とする。

【0048】

本発明によれば、前記抗体は、Ｂ７Ｈ６、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列に結合することができる。

【0049】

本発明の好ましい実施形態において、抗体の生体受容性をさらに高めるために、抗体をヒト化することもできる。すなわち、前記抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である。用語「キメラ抗体」とは、組換えＤＮＡ技術を用いて、ある種（例えば、マウス）からのモノクローナル抗体の定常領域のアミノ酸配列を、別の種（例えば、ヒト）からの抗体の定常領域に置換して得られる組換え抗体を指す。用語「ヒト化抗体」とは、組換えＤＮＡ技術を用いて、ある種（例えば、マウス）由来のモノクローナル抗体の定常領域および可変領域の非ＣＤＲ（Ｆｖ骨格領域（ＦＲ））アミノ酸配列を、別の種（例えばヒト）由来の抗体の定常領域および可変領域に置換して得られた組換え抗体である。つまり、１つの抗体の定常領域がヒト化されている場合、キメラ抗体と呼ばれ、定常領域および可変領域の非ＣＤＲアミノ酸配列は、完全にヒト化された場合、ヒト化抗体と呼ばれる。ヒト化方法は、従来の抗体工学技術を参照して実施することができるが、ここでは繰り返さない。

【0050】

本発明によるヒト化抗体の重鎖可変領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示され、軽鎖可変領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示され、又は、重鎖可変領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示され、軽鎖可変領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示される。

【0051】

本発明による免疫複合体は、治療薬、及び治療薬に結合した以上に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。前記抗体又はその抗原結合フラグメントを治療薬に結合する手段は、従来の手段であってよい。

【0052】

本発明による組成物は、以上に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び／又は上記免疫複合体、及び薬学的に許容されるベクターを含む。幾つかの実施形態において、前記組成物は、本発明の目的を達成するために共同で機能する限り、時間および／または空間的に分離された組み合わせを含む。例えば、前記組成物に含まれる成分は、全体として被験者に投与してもよいし、別々に投与してもよい。前記組成物に含まれる成分が別々に被験者に投与される場合、各成分は同時にまたは順次被験者に投与されてもよい。

【0053】

「薬学的に許容できる」という用語は、組成物の投与を妨げる有害な生理反応を起こさずに、組成物を被験者に投与できることを示している。例えば、「薬学的に許容されるベクター」は、一般的に安全で、無毒で、望ましい医薬組成物の調製に有用なベクターを意味し、好ましくは、これらのベクターまたは希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、グルコース、マンニトール、ブドウ糖、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセロール、ヒアルロン酸、エタノール、ポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール、トリグリセリド、５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームや非水系媒体、例えば不揮発油を用いることもできる。

【0054】

本発明の組成物はまた、互いに組み合わせて、または１つ以上の他の治療化合物と組み合わせて、例えば化学療法剤と組み合わせて投与することができる。このため、前記組成物はまた、化学療法剤を含有してもよい。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、又は免疫複合体はまた第２の治療薬と組み合わせてもよい。前記第２の治療薬の例示的な試薬として、Ｂ７Ｈ６活性を阻害する他の試薬（他の抗体またはその抗原結合フラグメント、ペプチド阻害剤、小分子アンタゴニストなどを含む）および／またはＢ７Ｈ６上流または下流のシグナル伝達を妨害する試薬を含むが、これらに限定するものではない。

【0055】

一般に、抗体またはその抗原結合フラグメントは、有効量、すなわち、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、Ｂ７Ｈ６に関連する疾患などの治療される疾患に関連する症状の予防または緩和を引き起こす量で投与される。被験者に投与される組成物の有効量は、疾患のタイプと重症度、および一般的な健康状態、年齢、性別、体重、薬物に対する耐性などの個人の特徴に依存する疾患の重症度とタイプにもよるが、当業者はこれらの要因などに基づいて適切な投与量を決定することができる。

【0056】

本発明によるサンプル中のＢ７Ｈ６を検出するためのキットは、上記の抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する。前記サンプルは、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を有する患者（特に移植拒絶反応、自己免疫疾患、感染性疾患又はがん患者、より好ましくは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種を有する患者）の組織であり得る。前記キットは、コーティング溶液などの、Ｂ７Ｈ６を検出するための従来の試薬を含んでもよい。

【0057】

本発明は、上記の抗体又はその抗原結合フラグメントの、サンプル中のＢ７Ｈ６を検出するための試薬の調製における使用をさらに提供する。上記のように、前記サンプルは、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を有する患者由来の組織であってもよく、ここでは説明を省略する。本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントはＢ７Ｈ６と良好な親和性を有し、サンプル中のＢ７Ｈ６を効率的に検出することができる。

【0058】

本発明は前記抗体又はその抗原結合フラグメント、免疫複合体、組成物、核酸、組換えベクター又は形質転換体又は組換え細胞の、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を予防及び／又は治療するための薬物の調製における使用をさらに提供する。好ましくは、前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患は、移植拒絶反応、自己免疫疾患、感染性疾患又はがんである。より好ましくは、前記がんはＢ７Ｈ６を発現するがんである。さらに好ましくは、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である。より好ましくは、前記感染性疾患は、ＨＩＶウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス感染を含むが、これらに限定されない。

【0059】

本発明は、上記に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、免疫複合体、組成物、核酸、組換えベクター又は形質転換体又は組換え細胞を含む薬物に関する。

【0060】

本発明の幾つかの具体的な実施例によれば、上記薬物は、以下の付加的な技術的特徴のうちの少なくとも１つを含んでもよい。

【0061】

本発明の幾つかの具体的な実施例によれば、前記薬物は、薬学的に許容されるベクター及び有効量の前記抗体又はその抗原結合フラグメント、免疫複合体、組成物、核酸、組換えベクター又は形質転換体又は組換え細胞を含む。

【0062】

本発明は、さらに、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患（以上のように）を予防及び／又は治療する方法に関する。当該方法は、有効量の本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、免疫複合体、組成物、組換え細胞、核酸及び薬物のうちの少なくとも１種を患者に投与することを含む。投与の手段は、経口投与、鼻腔内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与または静脈内投与または腹腔内投与であってよい。上記のように、前記抗体又はその抗原結合フラグメントはＢ７Ｈ６と効果的に結合することができ、さらに、Ｂ７Ｈ６とＮＫｐ３０の間の相互作用を促進し、ＮＫ細胞の抗がん機能を強化する。このため、前記抗体又はその抗原結合フラグメント、及び適切な条件下で前記抗体又はその抗原結合フラグメントを発現して得る物質、又は前記抗体又はその抗原結合フラグメントを含む物質はいずれもＢ７Ｈ６媒介性疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。本発明の実施例の方法によれば、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。

【0063】

本発明の幾つかの具体的な実施例によれば、上記方法は以下の付加的技術的特徴のうちの少なくとも１つをさらに含んでもよい。

【0064】

本発明の具体的な実施例によれば、前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患である。

【0065】

本発明の具体的な実施例によれば、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である。

【0066】

本発明に記載された「患者」又は「被験者」は、一般に、霊長類および／またはげっ歯類などの哺乳動物、特にヒトまたはマウスを指す。

【0067】

当業者は、本発明に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡ分子をベクター（特に発現ベクター）にクローニングし、そして、宿主細胞を形質転換し、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを発現誘導することにより得ることができる。このため、本発明はさらに、上記抗体またはその抗原結合フラグメント（単離された）をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクターおよび形質転換体を提供する。前記核酸は、遺伝子工学的手段により得られる発現カセットであることが好ましい。

【0068】

組換えベクターは、クローンベクターを指してもよいし、発現ベクターを指してもよい。前記組換えベクターは、前記核酸と市販のベクター（例えば、プラスミドやウイルスベクター）とを作動的に結合することによって得られ、一般的に用いられるプラスミドとしては、ｐＳｅＴａｇ２、ＰＥＥ１４、ｐＭＨ３などが挙げられる。

【0069】

本発明の発現ベクターは、コードされた前記抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域及び／又は定常領域のＤＮＡ配列を含んでもよい。しかしながら、２種の発現ベクターを別々に構築してもよい。１種は、重鎖可変領域及び定常領域を含有し、他種は軽鎖可変領域及び定常領域を含有し、哺乳動物細胞を共同にトランスフェクションする。１つの好ましい実施形態において、前記発現ベクターは、プロモーター、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、及び少なくとも１種のスクリーニング用の少なくとも１つの抗薬遺伝子をさらに含む。

【0070】

本発明に記載の宿主細胞は、原核宿主細胞、真核宿主細胞又はバクテリオファージであってよい。前記原核宿主細胞は大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス又はプロテウスミラビリスなどであってよい。前記真核宿主細胞は、パスツールピキア酵母、出芽酵母、分裂酵母、トリコデルマなどの真菌、アワヨトウなどの昆虫細胞、タバコなどの植物細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞などの哺乳動物細胞であってよい。幾つかの実施形態において、好ましくは、本発明に記載の宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、より好ましくはＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞又はＣＯＳ細胞である。

【0071】

本発明は組換え細胞に関し、前記組換え細胞が、上記に記載の核酸、組換えベクター又は形質転換体、又は抗体又は抗原結合フラグメントを担持している。前記組換え細胞は、前記発現ベクターをトランスフェクション又は形質転換することによって得られる。本発明の実施例によれば、前記組換え細胞は適切な条件で上記抗体を効果的に発現することができ、前記抗体又はその抗原結合フラグメントはＢ７Ｈ６と効果的に結合することができ、さらに、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を予防及び／又は治療する良好な効果を有する。

【0072】

なお、本発明に記載の組換え細胞は特に限定されず、原核細胞、真核細胞又はバクテリオファージであってよい。前記原核細胞は、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス又はプロテウスミラビリスなどであってよい。前記真核細胞は、パスツールピキア酵母、出芽酵母、分裂酵母、トリコデルマなどの真菌、アワヨトウなどの昆虫細胞、タバコなどの植物細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞などの哺乳動物細胞であってよい。幾つかの実施例において、好ましくは、本発明に記載の組換え細胞は哺乳動物細胞であり、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞又はＣＯＳ細胞を含み、且つ動物生殖細胞、受精卵又は胚性幹細胞を含まない。

【0073】

なお、本願の明細書に記載の「適切な条件」とは、本願前記抗体又はその抗原結合フラグメント発現に適合する条件である。抗体または抗原結合フラグメントの発現に適した条件には、これらに限定されないが、適切な形質転換またはトランスフェクション方法、適切な形質転換またはトランスフェクション条件、健康な宿主細胞の状態、適切な宿主細胞密度、適切な細胞培養環境、および適切な細胞培養時間が含まれることは、当業者によって容易に理解される。「適切な条件」は特に限定されず、当業者は、実験室の具体的な環境に応じて前記抗体またはその抗原結合フラグメントの発現に最も好適な条件を最適化し得る。

【0074】

本発明は、さらに、上記に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、免疫複合体、組成物、薬物、核酸、組換えベクター又は形質転換体又は組換え細胞の、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患の治療及び／又は予防における使用に関する。上記のように、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｂ７Ｈ６と効果的に結合することができ、さらに、Ｂ７Ｈ６とＮＫｐ３０の間の相互作用を促進し、ＮＫ細胞の抗がん機能を強化し、このため、前記抗体又はその抗原結合フラグメント、及び適切な条件下で前記抗体又はその抗原結合フラグメントを発現して得る物質はすべてＢ７Ｈ６媒介性疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。

【0075】

本発明の具体的な実施例によれば、上記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患の治療及び／又は予防における使用は、さらに、以下の付加的技術的特徴のうちの少なくとも１つを含んでもよい。

【0076】

本発明の具体的な実施例によれば、前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患である。

【0077】

本発明の具体的な実施例によれば、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である。

【0078】

本発明の他の態様では、本発明は、被験者がＢ７Ｈ６媒介性疾患を有するかどうかを診断するための方法を提供する。本発明の具体的な実施例によれば、前記方法は、１）上記に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、２）上記に記載の核酸、３）上記に記載の組換えベクター又は形質転換体、及び４）上記に記載の組換え細胞のうちの少なくとも１つを使用して検出対象サンプルにおけるＢ７Ｈ６を検出し、前記Ｂ７Ｈ６の検出結果に基づいて、前記検出対象サンプルにおけるＢ７Ｈ６の含有量を決定することを含む。上記のように、本発明の実施例の抗体又は抗原結合フラグメントはＢ７Ｈ６と効果的に結合することができ、このため、前記抗体又は抗原結合フラグメントはＢ７Ｈ６を検出することに用いれることができ、Ｂ７Ｈ６は、多種の疾患を媒介し、このため、被験者由来の生体サンプルに含まれる前記Ｂ７Ｈ６のレベルに基づいて、被験者がＢ７Ｈ６媒介性疾患を有するか否かを判定することができる。なお、さらに、上記物質を利用して被験者検出対象サンプルにおけるＢ７Ｈ６の含有量を監視することができ、即ち、上記の物質は、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を有する被験者における疾患の病期分類にも使用でき、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患の予後を評価するためにも使用することができる。

【0079】

本発明の具体的な実施例によれば、上記方法はさらに、以下の付加的技術的特徴のうちの少なくとも１つを含んでもよい。

【0080】

本発明の具体的な実施例によれば、前記検出対象サンプルにおけるＢ７Ｈ６の含有量が疾患の最低基準以上であることは、検出対象サンプルがＢ７Ｈ６媒介性疾患を有する患者に由来することを示すものである。前記最低基準の値は、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を有する多数の個人および多数の健常個体において検出対象サンプル中のＢ７Ｈ６の含有量に対する差異比較分析および検証によって決定されることができる。

【0081】

本発明の具体的な実施例によれば、前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患である。

【0082】

本発明の具体的な実施例によれば、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である。

【0083】

本発明の具体的な実施例によれば、前記検出対象サンプルは、組織、細胞、血液、血清、汗、糞便、及び尿のうちの少なくとも１つを含む。

【0084】

本発明の別の態様では、本発明は、１）以上に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、２）上記に記載の核酸、３）上記に記載の組換えベクター又は形質転換体、及び４）上記に記載の組換え細胞のうちの少なくとも１つの、被験者がＢ７Ｈ６媒介性疾患を有するか否かについての診断における使用を提供する。上記のように、本発明の実施例の抗体又は抗原結合フラグメントはＢ７Ｈ６と効果的に結合することができ、このため、前記抗体又は抗原結合フラグメントはＢ７Ｈ６を検出することに用いれることができ、Ｂ７Ｈ６は、多種の疾患を媒介し、このため、被験者由来の生体サンプルに含まれる前記Ｂ７Ｈ６のレベルに基づいて、被験者がＢ７Ｈ６媒介性疾患を有するか否かを判定することができる。

【0085】

本発明の具体的な実施例によれば、上記使用はさらに、以下の付加的技術的特徴のうちの少なくとも１つを含む。

【0086】

本発明の具体的な実施例によれば、前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患である。

【0087】

本発明の具体的な実施例によれば、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である。

【0088】

本発明に記載の配列に対する説明は表１に示される。

【0089】

【表1(01)】

【表1(02)】

【表1(03)】

【表1(04)】

【表1(05)】

【表1(06)】

【0090】

本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸は本発明の範囲内にあり、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に基づいて、当業者は対応する核酸配列を容易に得ることができ、表２に示される。

【0091】

【表2(01)】

【表2(02)】

【表2(03)】

【表2(04)】

【表2(05)】

【表2(06)】

【表2(07)】

【表2(08)】

【表2(09)】

【表2(10)】

【表2(11)】

【表2(12)】

【表2(13)】

【表2(14)】

【表2(15)】

【0092】

以下、実施例によって本発明を詳しく説明する。実施例又は検出例において、具体的な条件を示さない実験方法の場合、それらは通常の条件に従って行われる。

【0093】

以下、実施例を参照して本発明の手段を解釈する。以下に説明する実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の制限を理解することはできない。具体的な技術または条件が実施例に示されていない場合は、当該技術分野の文献に記載されている技術または条件に従って、または製品明細書に従って実施されるものとする。使用される試薬または器具は、製造業者が特定されない場合に市販されている従来の製品である。

【0094】

実施例１ 抗体の調製

【0095】

ヒトＢ７Ｈ６に対するマウス由来モノクローナル抗体を生成し、精製した組換えＢ７Ｈ６細胞外領域Ｆｃ融合タンパク質（Ｂ７Ｈ６－Ｆｃ）（組換えＢ７Ｈ６細胞外領域Ｆｃ融合タンパク質、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示される）を抗原とし、Ｂａｌｂ／ｃマウス（９週齢、上海ＳＬＡＣより購入、体重約２０ｇ）を免疫した。

【0096】

免疫マウスを精製抗原と完全フロイントアジュバントを用いて３回免疫し、尾静脈瀉血後に免疫応答を検出する。抗ヒトＢ７Ｈ６免疫グロブリンを有するマウスは、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって血清をスクリーニングすることによって得られる。最も高い抗Ｂ７Ｈ６免疫グロブリンを有するマウス由来の脾細胞を、マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５８１）と融合させる。融合したハイブリドーマ細胞について抗体をスクリーニングし、マウスモノクローナル抗体を得る。

【0097】

候補ハイブリドーマ細胞の総数を１０６個まで培養し、８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で総ＲＮＡを抽出する。総ＲＮＡを鋳型として用い、逆転写によってｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を合成し、さらにｃＤＮＡを鋳型としてハイブリドーマ細胞の対応する可変領域核酸配列をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ増幅反応に使用されるプライマー配列は、抗体の可変領域の第１フレーム領域またはシグナルペプチド領域および定常領域に相補的である（Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，１２１－１２８及びＣｏｌｏｍａ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，１５２－１５６）。５０μｌの反応系において、ｃＤＮＡ ２μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液５μＬ、上流および下流のプライマー２μＬ（５μｍｏｌ）、ｄＮＴＰ ２μＬ、Ｔａｑ酵素 １μＬＬ（Ｔａｋａｒａ、Ｅｘ Ｔａｑ）、Ｈ_２Ｏ ３８μＬをそれぞれ加えて、９５℃で５ｍｉｎ予備変性し、温度サイクルに入り、ＰＣＲ増幅を行う。反応条件は以下の通りである。９４℃で３０Ｓ変性し、５８℃で４５Ｓアニーリングし、７２℃で５０Ｓ伸長し、合計３２個のサイクルを行い、そして、７２℃で７ｍｉｎ伸長する。増幅産物をシーケンシングした後、マウスモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域配列（アミノ酸配列及び核酸配列を含む）を得る。

【0098】

実施例２：マウス由来Ｂ７Ｈ６抗体のＥＬＩＳＡ結合実験

【0099】

ＥＬＩＳＡ実験はＢ７Ｈ６抗体の結合特性を検出するためのものである。Ｂ７Ｈ６細胞外領域Ｆｃ融合タンパク質（Ｂ７Ｈ６－Ｆｃ）は９６ウェルプレートにコーティングされ、抗体添加後のシグナルの強度を用いて抗体とＢ７Ｈ６との結合特性を判断する。

【0100】

ＰＢＳ緩衝液でＢ７Ｈ６－Ｆｃ融合タンパク質（アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示される）を１μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬ／ウェルの体積で９６ウェルプレートに加えて、４℃で一晩放置する。９６ウェルプレートにおけるＰＢＳ緩衝液を吸い出し、ＰＢＳＴ（ｐＨ７．２ＰＢＳが０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む）緩衝液でウェルプレートを６回洗浄した後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／１０％ＢＳＡを加えて、３７℃で２ｈインキュベートしてブロッキングする。ブロッキング剤を除去し、ＰＢＳＴでウェルプレートを６回洗浄した後、ＰＢＳＴ／０．０５％ＢＳＡを用いて適切な濃度まで希釈した１００μＬ／ウェルの検出対象Ｂ７Ｈ６抗体を加え、３７℃で１ｈインキュベートする。反応系を除去し、ＰＢＳＴでウェルプレートを６回洗浄した後、１００μＬ／ウェルでＰＢＳＴ／０．０５％ＢＳＡを用いてＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識の抗マウス抗体二次抗体を希釈し、３７℃で１ｈインキュベートする。ＰＢＳＴでウェルプレートを６回洗浄した後、８０μＬ／ウェルのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を加え、室温で３ｍｉｎインキュベートし、８０μＬ／ウェルの４Ｍ硫酸を加えて反応を停止させる。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｍｍで吸光度値を読み取る。結果（図１）により、本発明のマウス由来抗体１２Ｆ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、１２Ｇ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）がＢ７Ｈ６に結合することができることを示す。

【0101】

実施例３：マウス由来Ｂ７Ｈ６抗体のフローサイトメトリー結合実験

【0102】

フローサイトメトリー実験は、Ｂ７Ｈ６抗体の結合特性を検出することに用いられ、ＨＬ６０細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－２４０）においてＢ７Ｈ６タンパク質（ＨＬ６０－Ｂ７Ｈ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）を過剰発現し、発現ベクターはｐＬＶＸ－ＥＦ１ａ－Ｂ７Ｈ６－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎであり、抗体添加後のシグナルの強度を用いて抗体とＢ７Ｈ６との結合特性を判断する。

【0103】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５×１０^５細胞／ウェルの６ウェルプレートに播種し、二重抗体を含まないＤＭＥＭ培地で一晩培養する。トランスフェクション前に培地を廃棄し、二重抗体を含まない新鮮なＤＭＥＭ培地を１ｍＬ加える。ｐＬＶＸ－ＥＦ１ａ－Ｂ７Ｈ６－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ（ｐＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターの制限酵素切断部位ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとの間にはＢ７Ｈ６タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）が挿し込まれたコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）、ｐＭＤ２Ｇ、ｐｓＰＡＸ２ベクター（合計３μｇ）を２：１：１の割合で２００μｌの血清なしＤＭＥＭ培地に加えて、１２μｇのポリエーテルイミド（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ有限公司製）を加える。均一に混合した後１６ｍｉｎ静置し、そして、すべての液体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した６ウェルプレートに加える。６ｈ培養した後、培地を廃棄し、新鮮な完全ＤＭＥＭ培地を入れて培養する。４８ｈトランスフェクションした後、細胞培養上清を受け取り、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を過ぎればウイルス上清となる。ウイルス上清を１×１０^４ ＨＬ６０細胞を含有する６ウェルプレートにすべて添加し、最終濃度４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を加え、１２ｈ培養する。その後、上清を捨て、新鮮な完全ＲＰＭＩ１６４０培地を加える。得られた細胞はＨＬ６０－Ｂ７Ｈ６細胞である。

【0104】

ＰＢＳでＨＬ６０－Ｂ７Ｈ６細胞を２×１０^６／ｍＬまで希釈し、１００μＬ／チューブの体積で１．５ｍｌのＥＰチューブに加えて、その内に１０μＬ／チューブのヤギ血清を加え、４℃で３０ｍｉｎブロッキングする。１μｇ／チューブのＢ７Ｈ６抗体を加え、４℃で３０ｍｉｎインキュベートする。ＥＰチューブに１ｍＬのＰＢＳを加え、４℃で３５００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、ＰＢＳで再度洗浄する。遠心分離後上清を捨て、１００μｌ／チューブのＰＢＳで細胞を再懸濁し、その内に０．１μＬ／チューブＡｌｅｘａ－６４７標識のヤギ抗マウス抗体二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、４℃の暗所で３０ｍｉｎインキュベートする。ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離後上清を捨てる。２００μＬ／チューブのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーを用いて検出し、結果を図２に示し、本発明のマウス由来抗体１２Ｆ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、１２Ｇ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）がＢ７Ｈ６に結合することができることを更に示す。

【0105】

実施例４：マウス抗体のヒト化実験

【0106】

Ｂ７Ｈ６抗体の軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を参照して、その非ＣＤＲ領域に最も一致するヒト化鋳型を選択する。マウス由来抗体ＣＤＲ領域を選択されたヒト化鋳型に移植し、ヒト由来鋳型のＣＤＲ領域を置換して、ヒト化抗体を得る。そして、マウス由来抗体の三次元構造に基づいて、埋め込み残基、ＣＤＲ領域と直接相互作用する残基、及びＶＬおよびＶＨの三次元構造に重要な影響を与える残基に対してリバート変異を行い、ヒト化後の抗体を得、ヒト化Ｂ７Ｈ６抗体１２Ｆ５の重鎖可変領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示され、軽鎖可変領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示され、又は、ヒト化Ｂ７Ｈ６抗体１２Ｇ４の重鎖可変領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示され、軽鎖可変領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示される。

【0107】

実施例５：ヒト化Ｂ７Ｈ６抗体のＥＬＩＳＡ結合実験

【0108】

ＥＬＩＳＡ実験はヒト化Ｂ７Ｈ６抗体の結合特性を検出することに用いられる。Ｂ７Ｈ６細胞外領域Ｆｃ融合タンパク質（Ｂ７Ｈ６－Ｆｃ）が９６ウェルプレートにコーティングされ、抗体添加後のシグナルの強度を用いて抗体とＢ７Ｈ６との結合特性を判断する。

【0109】

ＰＢＳ緩衝液でＢ７Ｈ６－Ｆｃ融合タンパク質（アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示される）を１μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬ／ウェルの体積で９６ウェルプレートに加えて、４℃で一晩放置する。９６ウェルプレートにおけるＰＢＳ緩衝液を吸い出し、ＰＢＳＴ（ｐＨ７．２ ＰＢＳが０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する）緩衝液でウェルプレートを６回洗浄した後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／１０％ＢＳＡを加え、３７℃で２ｈインキュベートしてブロッキングを行う。ブロッキング剤を除去し、ＰＢＳＴでウェルプレートを６回洗浄した後、ＰＢＳＴ／０．０５％ＢＳＡで適切な濃度まで希釈された１００μＬ／ウェルの検出対象Ｂ７Ｈ６抗体を加え、３７℃で１ｈインキュベートする。反応系を除去し、ＰＢＳＴでウェルプレートを６回洗浄した後、１００μＬ／ウェルでＰＢＳＴ／０．０５％ＢＳＡを用いてＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識のマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を希釈し、３７℃で１ｈインキュベートする。ＰＢＳＴでウェルプレートを６回洗浄した後、８０μＬ／ウェルのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を加え、室温で３ｍｉｎインキュベートし、８０μＬ／ウェルの４Ｍ硫酸を加えて反応を停止させる。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｍｍで吸光度値を読み取る。結果（図３）により、本発明のヒト化抗体ｈ１２Ｆ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ｈ１２Ｇ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）がＢ７Ｈ６に結合することができることを示す。

【0110】

実施例６：ヒト化Ｂ７Ｈ６抗体のフローサイトメトリー結合実験

【0111】

フローサイトメトリー実験はＢ７Ｈ６抗体の結合特性を検出することに用いられ、ＨＬ６０細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－２４０）にＢ７Ｈ６タンパク質（ＨＬ６０－Ｂ７Ｈ６）（例えば実施例３に示す）を過剰発現し、抗体添加後のシグナルの強度を用いて抗体とＢ７Ｈ６との結合特性を判断する。

【0112】

ＰＢＳでＨＬ６０－Ｂ７Ｈ６細胞を２×１０^６／ｍＬまで希釈し、１００μＬ／チューブの体積で１．５ｍＬのＥＰチューブに加えて、その内に１０μＬ／チューブのマウス血清を加え、４℃で３０ｍｉｎブロッキングする。１μｇ／チューブのＢ７Ｈ６抗体を加えて、４℃で３０ｍｉｎインキュベートする。ＥＰチューブに１ｍＬのＰＢＳを加え、４℃で３５００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、ＰＢＳで再度洗浄する。遠心分離後上清を捨て、１００μＬ／チューブのＰＢＳで細胞を再懸濁し、その内に１μＬ／チューブのＡｌｅｘａ－６４７標識のマウス抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、４℃の暗所で３０ｍｉｎインキュベートする。ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離後上清を捨てる。２００μＬ／チューブのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーを用いて検出し、結果は図４に示され、本発明のヒト化抗体ｈ１２Ｆ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ｈ１２Ｇ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）がＢ７Ｈ６に結合することができることを更に示す。

【0113】

実施例７：ヒト化Ｂ７Ｈ６抗体のフローサイトメトリー結合実験

【0114】

フローサイトメトリー実験はヒト化Ｂ７Ｈ６抗体の結合特性を検出することに用いられ、ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－２４０）にはサルＢ７Ｈ６タンパク質（ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏ－Ｂ７Ｈ６）を過剰発現し、抗体添加後のシグナルの強度を用いて抗体とＢ７Ｈ６との結合特性を判断する。

【0115】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５×１０^５細胞／ウェルで６ウェルプレートに接種し、二重抗体を含まないＤＭＥＭ培地で一晩培養する。トランスフェクションの前に培地を捨てる。１ｍＬの新鮮な二重抗体を含まないＤＭＥＭ培地を加える。ｐＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ｃｙｎｏＢ７Ｈ６－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ（ｐＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターの制限酵素切断部位ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとの間にサルＢ７Ｈ６タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）が差し込まれたコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、ｐＭＤ２Ｇ、ｐｓＰＡＸ２ベクター（合計３μｇ）を２：１：１の割合で２００μＬの血清なしＤＭＥＭ培地に加え、１２μｇのポリエーテルイミド（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ有限公司製）を加える。均一に混合した後１６ｍｉｎ静置し、そして、すべての液体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した６ウェルプレートに加える。６ｈ培養した後、培地を捨て、新鮮な完全ＤＭＥＭ培地を入れて培養する。４８ｈトランスフェクションした後、細胞培養上清を受け取り、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を過ぎればウイルス上清となる。ウイルス上清をすべて１×１０^４ＣＨＯ－Ｋ１細胞を含有する６ウェルプレートに加え、最終濃度４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を加え、１２ｈ培養する。その後、上清を捨て、新鮮な完全ＲＰＭＩ１６４０培地を加える。得られた細胞はＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏ Ｂ７Ｈ６細胞である。

【0116】

ＰＢＳでＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＢ７Ｈ６細胞を２×１０６／ｍＬまで希釈し、１００μＬ／チューブの体積で１．５ｍＬのＥＰチューブに加え、その内に１０μＬ／チューブのマウス血清を加え、４℃で３０ｍｉｎブロッキングする。１μｇ／チューブのヒト化Ｂ７Ｈ６抗体を加え、４℃で３０ｍｉｎインキュベートする。ＥＰチューブに１ｍＬのＰＢＳを加え、４℃で３５００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、ＰＢＳで再度洗浄する。遠心分離後上清を捨て、１００μＬ／チューブのＰＢＳで細胞を再懸濁し、その内に１μＬ／チューブのＡｌｅｘａ－６４７標識のマウス抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、４℃の暗所で３０ｍｉｎインキュベートする。ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離後上清を捨てる。２００μＬ／チューブのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーを用いて検出し、結果は図５に示されるように、本発明の抗体ｈ１２Ｆ５、ｈ１２Ｇ４がサルＢ７Ｈ６に結合することができることを更に示す。

【0117】

実施例８：ヒト化Ｂ７Ｈ６抗体のＥＬＩＳＡ結合実験

【0118】

ＥＬＩＳＡ実験はヒト化Ｂ７Ｈ６抗体の結合特性を検出することに用いられる。サルＢ７Ｈ６細胞外領域Ｆｃ融合タンパク質（ｃｙｎｏＢ７Ｈ６－Ｆｃ）は９６ウェルプレートにコーティングされ、抗体添加後のシグナルの強度を用いて抗体とＢ７Ｈ６との結合特性を判断する。

【0119】

ＰＢＳ緩衝液でｃｙｎｏＢ７Ｈ６－Ｆｃ融合タンパク質（アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示される）を１μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬ／ウェルの体積で９６ウェルプレートに加え、４℃で一晩放置する。９６ウェルプレートにおけるＰＢＳ緩衝液を吸い出し、ＰＢＳＴ（ｐＨ７．２ ＰＢＳが０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する）緩衝液でウェルプレートを６回洗浄した後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／１０％ＢＳＡを加え、３７℃で２ｈインキュベートしてブロッキングする。ブロッキング剤を除去し、ＰＢＳＴでウェルプレートを６回洗浄した後、ＰＢＳＴ／０．０５％ＢＳＡで適切な濃度まで希釈する１００μＬ／ウェルの検出対象Ｂ７Ｈ６抗体を加え、３７℃で１ｈインキュベートする。反応系を除去し、ＰＢＳＴでウェルプレートを６回洗浄した後、１００μＬ／ウェルでＰＢＳＴ／０．０５％ＢＳＡを用いてＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識のマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を希釈し、３７℃で１ｈインキュベートする。ＰＢＳＴでウェルプレートを６回洗浄した後、８０μＬ／ウェルのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を加え、室温で３ｍｉｎインキュベートし、８０μＬ／ウェルの４Ｍ硫酸を加えて反応を停止させる。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｍｍで吸光度値を読み取る。結果（図６）は本発明のヒト化抗体ｈ１２Ｇ４がサルＢ７Ｈ６に結合することができることを示す。

【0120】

実施例９：インビトロ結合親和性及び動態実験

【0121】

Ｂｉａｃｏｒｅ法は、タンパク質間の親和性および動態を客観的に検出するための公知の検出方法であり、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００が本発明のＢ７Ｈ６抗体を分析することにより親和性および結合動態を特徴付ける。

【0122】

標準的なアミノカップリング法を使用して、Ｂ７Ｈ６細胞外Ｆｃ融合タンパク質（Ｂ７Ｈ６－Ｆｃ）をＣＭ５（ＧＥ）チップに共有結合させる。そして、ＰＢＳに希釈された一連の濃度勾配のＢ７Ｈ６抗体を各サイクルに注入し、注入後１０ｍＭのＮａＯＨ溶液で再生する。抗原－抗体結合動態を３分間、解離動態を１０分間追跡し、得られたデータをＧＥのＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルで解析した。この方法で測定されたマウス由来１２Ｆ５のＫＤ値は２．２ｎＭであり、マウス由来１２Ｇ４のＫＤ値は０．１５ｎＭである。

【0123】

実施例１０：抗体の、Ｂ７Ｈ６がＮＫｐ３０に結合することを促進する能力に対するスクリーニング

【0124】

Ｂ７Ｈ６抗体はＢ７Ｈ６細胞外領域との結合により、Ｂ７Ｈ６及びその受容体ＮＫｐ３０のシグナル伝達経路を促進し、フローサイトメトリー実験は、Ｂ７Ｈ６抗体による受容体ＮＫｐ３０との結合の強化を検出することに用いられる。

【0125】

ＰＢＳでＨＬ６０－Ｂ７Ｈ６細胞（上記と同じ）を２×１０^６／ｍｌまで希釈し、１００μＬ／チューブの体積で１．５ｍＬのＥＰチューブに加え、その内に１０μＬ／チューブのマウス血清を加え、４℃で３０ｍｉｎブロッキングする。４μｇ／チューブのＮＫｐ３０細胞外領域Ｆｃ融合タンパク質（ＮＫｐ３０－Ｆｃ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、本実験室の発現）を加え、４℃で３０ｍｉｎインキュベートする。Ｂ７Ｈ６抗体を加え、４℃で３０ｍｉｎインキュベートする。ＥＰチューブに１ｍＬのＰＢＳを加え、４℃で３５００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、ＰＢＳで再度洗浄する。遠心分離後上清を捨て、１００μｌ／チューブでＰＢＳ細胞を再懸濁し、その内に１μＬ／チューブ６４７標識のマウス抗ヒト抗体二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、４℃の暗所で３０ｍｉｎインキュベートする。ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離後上清を捨てる。２００μＬ／チューブのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーを用いて検出し、結果は図７に示されるように、本発明のマウス由来１２Ｆ５抗体はＢ７Ｈ６と受容体ＮＫｐ３０との結合を促進することができることを分けることができる。

【0126】

実施例１１：補体依存性細胞傷害性検出

【0127】

補体依存性細胞傷害性実験は、腫瘍細胞を殺すことにおけるＢ７Ｈ６抗体の効果を検出するために使用される。使用された腫瘍細胞はＨＬ６０－Ｂ７Ｈ６細胞である。

【0128】

（１）腫瘍細胞を血清なしＲＰＭＩ－１６４０培地で再懸濁して、カウントする。完全ＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて４×１０^５／ｍＬまで希釈する。２５μＬ／ウェルの体積で希釈された細胞を９６ウェル丸底板に加える。
（２）血清なしＲＰＭＩ－１６４０培地でＢ７Ｈ６抗体又は対照マウスＩｇＧを希釈し、２５μＬ／ウェルの体積で希釈されたＢ７Ｈ６抗体又はマウスＩｇＧを９６ウェル丸底板に加える。
（３）１ｍＬの超純水でウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を溶解して、そして、１ｍＬの血清なしＲＰＭＩ－１６４０培地を加え、均一に混合した後作動液とする。４０μＬ／ウェルの体積で補体作動液を９６ウェル丸底板に加える。３７℃で３０ｍｉｎインキュベートする。
（４）１１０μＬ／ウェルの体積で完全ＲＰＭＩ－１６４０培地を９６ウェル丸底板に加えて、１μＬ／ウェルの体積で９６ウェル丸底板に７－ＡＡＤ（ＢＤ）を加え、均一に混合する。ウェルからすべての液体をフローサイトメトリーチューブに移し、フローサイトメトリーを使用して検出する。結果は、図８に示されるように、本発明のＢ７Ｈ６マウス由来１２Ｆ５抗体は補体依存的な細胞傷害作用を有する。

【0129】

実施例１２：Ｂ７Ｈ６抗体によるマウス抗がん能力の促進

【0130】

体内薬効実験は、Ｂ７Ｈ６抗体によるヌードマウスの抗がん機能の促進を検出することに用いられる。使用した腫瘍細胞はそれぞれ急性骨髄性白血病Ｕ－９３７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１９５３．２）である。

【0131】

（１）ヌードマウスの右腹側皮下腫瘍、各マウスには１．５×１０^６個のＵ－９３７細胞があり、そして、マウスはランダムにグループ化される。
（２）５、７、９、１１、１３日目に、マウスの腹腔内に抗体を注射し、マウスあたり１ｍｇを投与する。
（３）腫瘍の体積は２日ごとに測定される。

【0132】

結果は図９に示されるように、本発明のマウス由来抗体１２Ｆ５は抗がん機能を有することを分かる。

【0133】

以上の実験結果から分かるように、本発明で得られた抗体はヒト及びサルＢ７Ｈ６に結合することができ、Ｂ７Ｈ６とＮＫｐ３０との相互作用を促進することができ、マウスの抗がんを促進することができる。

【0134】

以上、本発明の好適な実施形態について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明の技術的概念の範囲内で、本発明の技術的解決の様々な単純な変形は、任意の他の適切な様式における様々な技術的特徴の組み合わせを含めて実施されてもよく、これらの単純な変形および組合せもまた、本発明に開示される内容とみなされるべきであり、全て本発明の保護の範囲内である。

【0135】

本明細書の説明において、「１つの実施例」、「いくつかの実施例」、「例示」、「具体的な例示」又は「幾つかの例示」等の用語が含まれた説明は、当該実施例又は例を用いて説明される具体的な特徴、構造、材料又は利点が本発明の少なくとも１つの実施例又は例示に含まれることが意図されるものである。本明細書において、上記用語に関する例示的な表現は、必ずしも同一の実施例又は例に関するものとは限らない。なお、説明される具体的な特徴、構造、材料又は利点はいずれか１つ又は複数の実施例もしくは例で、適切な方式で組み合わせることができる。さらに、互いに矛盾しない限り、当業者は、本明細書に記載の異なる実施例または例示及び異なる実施例または例示の特徴を、融合するか又は組み合わせることができる。

【0136】

以上、本発明の実施例について示して説明したが、上記実施例が例示であり、本発明の制限を理解することはできない。当業者は本発明の範囲内で上記実施例を変更、修正、置換、および変形することができる。

【0137】

本願は２０２１年１２月０７日に中国特許局に提出された、出願番号が２０２１１１４８５３８０．９である中国特許出願の優先権を主張し、その全ての内容は援用によって本願に組み合わせられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

2024529526000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-01-31

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ７Ｈ６に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含み、
前記重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記重鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記重鎖ＣＤＲ３は、ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１は、ＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つを含み、
前記軽鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つ含み、
前記軽鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列から選ばれた少なくとも１つ含む、Ｂ７Ｈ６に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、又は
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、（ｉ）前記重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は、（ｉｉ）前記軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるアミノ酸配列及びその保存的修飾形態のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

前記重鎖可変領域は、（ｉ）から選ばれた重鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、（ｉｉ）から選ばれた軽鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
１）重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列、及び軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるアミノ酸配列、
２）前記重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるアミノ酸配列、
３）前記重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるアミノ酸配列、又は
４）前記重鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖可変領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
１）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるアミノ酸配列、
２）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示されるアミノ酸配列、
３）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるアミノ酸配列、又は
４）前記重鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるアミノ酸配列、及び前記軽鎖、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示されるアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項7】

単離された抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

前記抗体は、モノクローナル抗体、マウス由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト修飾抗体、ヒト抗体、Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’，Ｆａｂ’－ＳＨ又はＦ（ａｂ’）_２である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列に結合することができる、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項10】

治療薬及び治療薬に結合した請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、免疫複合体。

【請求項11】

請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容されるベクターを含む、組成物。

【請求項12】

サンプル中のＢ７Ｈ６を検出するためのキットであって、当該キットは、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、キット。

【請求項13】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの、サンプル中のＢ７Ｈ６を検出するための試薬の調製における使用。

【請求項14】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患を予防及び／又は治療するための薬物の調製における使用であって、前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患であり、
選択可能に、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である、使用。

【請求項15】

請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む、核酸。

【請求項16】

請求項１５に記載の核酸を含む、組換えベクター又は形質転換体。

【請求項17】

請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを担持する、組換え細胞。

【請求項18】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１０に記載の免疫複合体、請求項１１に記載の組成物、請求項１５に記載の核酸、請求項１６に記載の組換えベクター又は形質転換体又は請求項１７に記載の組換え細胞を含む、薬物。

【請求項19】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１０に記載の免疫複合体、請求項１１に記載の組成物、請求項１５に記載の核酸、請求項１６に記載の組換えベクター又は形質転換体又は請求項１７に記載の組換え細胞の、Ｂ７Ｈ６媒介性疾患の治療及び／又は予防における使用。

【請求項20】

前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患であり、
選択可能に、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である、請求項１９に記載の使用。

【請求項21】

１）請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
２）請求項１５に記載の核酸、
３）請求項１６に記載の組換えベクター又は形質転換体、及び
４）請求項１７に記載の組換え細胞、のうちの少なくとも１つの、被験者がＢ７Ｈ６媒介性疾患を有するか否かについての診断における使用。

【請求項22】

前記Ｂ７Ｈ６媒介性疾患はがん又は感染性疾患であり、
選択可能に、前記がんは肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、大腸がん、乳がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平上皮がん、及び頭頸部がんのうちの少なくとも１種である、請求項２１に記載の使用。

【国際調査報告】