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特表2024-529545非天然核酸リガンド、及びこれの用途、並びにこれを有効成分として含む癌の予防または治療のための薬学的組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-06
(54)【発明の名称】非天然核酸リガンド、及びこれの用途、並びにこれを有効成分として含む癌の予防または治療のための薬学的組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240730BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240730BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240730BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240730BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
A61P35/00 ZNA
A61P35/02
A61K31/7088
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506938
(86)(22)【出願日】2022-08-05
(85)【翻訳文提出日】2024-02-09
(86)【国際出願番号】 KR2022011718
(87)【国際公開番号】W WO2023014192
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】10-2021-0104105
(32)【優先日】2021-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522435595
【氏名又は名称】インターオリゴ・コーポレイション
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＲＯＬＩＧＯ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ａ－Ｆ９０２，６６，Ｂｅｏｌｍａｌ－ｒｏ，Ｄｏｎｇａｎ－ｇｕ，Ａｎｙａｎｇ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １４０５８，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100112656
【弁理士】
【氏名又は名称】宮田 英毅
(74)【代理人】
【識別番号】100089118
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 宏明
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジュンファン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジョンウク
(72)【発明者】
【氏名】パク，ハンスル
(72)【発明者】
【氏名】イ，セナ
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA63
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
(57)【要約】
本開示の一側面は、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ；ＨＳＡ）に結合する新規非天然核酸リガンドとその用途に関するものであり、このような新規核酸リガンドは配列番号８（ＣＡＧＧ６ＣＧＡＧＣ６Ｇ６ＡＣＧＣＧ６Ｇ６Ｇ６ＧＡＣＣ）[ここで、前記６と表示された部分は５‐[Ｎ‐（１‐ナフチルメチル）カルボキサミド‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ]の核酸配列を含むものであり得る。
一方、本開示の一側面は、ヒト血清アルブミンに結合する新規非天然核酸リガンドを有効成分として含む、癌の治療のための薬学的組成物に関するものである。このような薬学的組成物は、癌の治療に対して優れた効果を奏する。
一方、本開示の一側面は、ヒト血清アルブミンに結合する新規非天然核酸リガンドを有効成分として含む、癌の治療のための薬学的組成物に関するものである。このような薬学的組成物は、癌の治療に対して優れた効果を奏する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する非天然核酸リガンドであって、配列番号８（ＣＡＧＧ６ＣＧＡＧＣ６Ｇ６ＡＣＧＣＧ６Ｇ６Ｇ６ＧＡＣＣ）の核酸配列を含むものである[ここで、前記６と表示された部分は５‐[Ｎ‐（１‐ナフチルメチル）カルボキサミド‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）]、非天然核酸リガンド。
【請求項2】
配列番号１～８から選択された核酸配列を有するものである、請求項１に記載の非天然核酸リガンド。
【請求項3】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する非天然核酸リガンド、またはこれの薬学的に許容可能な塩を含む癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項4】
前記非天然核酸リガンドが配列番号８（ＣＡＧＧ６ＣＧＡＧＣ６Ｇ６ＡＣＧＣＧ６Ｇ６Ｇ６ＧＡＣＣ）の核酸配列を含むものであり[ここで、前記６と表示された部分は５‐[Ｎ‐（１‐ナフチルメチル）カルボキサミド‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）]、前記組成物は一つ以上の前記非天然核酸リガンドを含む、請求項３に記載の癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項5】
前記配列番号８の核酸配列を含む非天然核酸リガンドは、配列番号１～８から選択された核酸配列を有するものである、請求項４に記載の癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項6】
前記癌は原発性または転移性癌である、請求項３に記載の癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項7】
これを必要とする対象体に静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻内、膣内、膀胱内、皮内、経皮内、局所、または、皮下投与されるものである、請求項３に記載の癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項8】
前記薬学的組成物は癌組織の外科的切除後に投与されるものである、請求項３に記載の癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項9】
前記癌は乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膀胱癌、小腸癌、精巣癌、甲状腺癌、肝臓癌、尿路上皮細胞癌、胆嚢胆道癌、皮膚癌、胃癌、脳腫瘍、腎臓癌及び急性骨髄性白血病であるものである、請求項３に記載の癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規非天然核酸リガンド、及びこれの用途と、これを有効成分として含む、癌の予防及び治療のための薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【0002】
世界保健機関（ＷＨＯ）によると、癌は世界的な４大非感染性疾患に属する。約一千万件の新たな発病ケースが毎年発生しており、全体死亡原因の約１２％を占め、三番目に多い死亡原因となっている。
【0003】
特に、膵臓は、胃や十二指腸、小腸、肝臓、胆嚢など多くの臓器に囲まれているため、癌の早期発見が困難なだけでなく、自覚症状を伴わず、進行が非常に早く、他の臓器への転移を引き起こすなどの性質を有するため、他の癌と比較して予後が非常に悪い癌である。部位別の癌の死亡率統計によると、膵臓癌が、５年相対生存率が最も低い。１５～２０％の膵臓癌患者は根治可能と見て手術を受けるが、手術を受けない患者の大部分は局所進行、または転移していると判断される。膵臓癌患者に対する治療オプションは非常に制限されており、化学療法に対する耐性がかなり高いという問題点がある。膵臓癌は他の臓器への転移が生じやすいという特性を有するので、早期に膵臓癌を検出して治療を行う必要がある。そのため、膵臓癌を標的として早期診断を容易にしたり、積極的治療を可能にしたりする新たな治療的アプローチ方法を開発する必要がある。
【0004】
また、乳癌は、女性にとって毎年４０,０００人以上の死亡の原因となる最もありふれた悪性腫瘍であり、生涯において９人の女性のうちの１人が乳癌に罹患し、乳癌の患者数も毎年約１５％ずつ増加する傾向にある。韓国では１９９５年の女性癌患者のうち、約１１.９％を乳癌が占めており、子宮頸がんと胃癌に続き三番目に多い癌となり、胃癌、肝臓癌、子宮癌、肺癌に続き五番目に死亡率が高い癌であり、その頻度は毎年増加傾向にある。早期診断が非常に重要だが、既に知られている多くの抗癌治療剤での治療にもかかわらず、癌が早く進行したり、転移したり、または危険な癌腫の場合、生存率が大幅に向上できずにいるのが現状である。
【0005】
特に、乳癌のうち三重陰性乳癌（ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ；ＴＮＢＣ）は、乳癌の証例の１０～２０％を占める。三重陰性乳癌は、エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現がなく、ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ‐２）が過発現しないか、ＨＥＲ‐２の増幅がない腫瘍と定義され、免疫組織化学を通じて診断される乳癌腫瘍の異種群である。三重陰性乳癌は、多くの化学療法薬品に対する速やかな耐性と適切な標的不足による攻撃的臨床挙動と不良予後を特徴とする。ＴＮＢＣ患者は他の類型の乳癌と比較して全般的に予後が悪く、早期に遠隔臓器で再発する確率と死亡率が高い。現在、利用可能な承認された標的療法はない。パクリタキセル及びこれの半合成誘導体などの、古典的な微小管標的化薬品（ＭＴＤ）は乳癌新生物の臨床調節において相当な成功を果たした。アントラサイクリン系及びタキサン系の化学療法は、三重陰性乳癌に対する標準療法である。しかし、結局は、ほとんどの三重陰性乳癌患者の初期療法に対する一時的反応後、薬品耐性、腫瘍の再発、及び／または転移が発生する。従って、原発性または転移性三重陰性乳癌を優れた効能で治療したり、三重陰性乳癌から他の臓器（特に肺）への転移を効果的に抑制したりする薬品を開発するのは非常に難しかった。三重陰性乳癌治療に対してより持続的な反応を達成する革新的で、より効果的な治療的アプローチ方法を至急開発する必要がある。
【0006】
そのほかに、肺癌、大腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膀胱癌、小腸癌、精巣癌、甲状腺癌、肝臓癌、尿路上皮細胞癌、胆嚢胆道癌、皮膚癌、胃癌、脳腫瘍、腎臓癌及び急性骨髄性白血病などの癌も世界的に非常によく見られるタイプの癌であり、これら癌の診断及び治療にも新たな治療アプローチ方法が常に求められている。
【0007】
一方、本発明者は、新規アプタマー（核酸リガンド）を、ＳＥＬＥＸを通じて発掘し、最適化した。これを通じて作り出した非天然核酸リガンドが、治療が特に難しくて予後が良くない、膵臓癌と三重陰性乳癌に優れた標的治療効果（静脈／腹腔内投与を通じた原発性及び転移性癌の治療）を有することを確認した。
【0008】
よって、本発明は、既存の治療剤に対する新たな代案を提示しており、新規のアプタマーを含む医薬品を用いて様々な癌腫に対する治療効果を期待することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
（特許文献１）韓国公開特許第２０１９‐０１２６３５６号
（特許文献２）米国登録特許第８,９６９,３１８号
（特許文献２）米国登録特許第８,９６９,３１８号
【非特許文献】
【0010】
（非特許文献１）Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ., Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｔａｍｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ, Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１９, ２４, ９４１
（非特許文献２）Ｚｈｏｕ, Ｊ.；Ｒｏｓｓｉ, Ｊ. Ａｐｔａｍｅｒｓ ａｓ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ. Ｎａｔ. Ｒｅｖ. Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１７, １６, １８１‐２０２.
（非特許文献３）Ｄｏｕｇａｎ, Ｈ.；Ｌｙｓｔｅｒ, Ｄ. Ｍ.；Ｖｏ, Ｃ. Ｖ.；Ｓｔａｆｆｏｒｄ, Ａ.；Ｗｅｉｔｚ, Ｊ. Ｉ.；Ｈｏｂｂｓ, Ｊ. Ｂ. Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｏｆ Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ. Ｎｕｃｌ. Ｍｅｄ. Ｂｉｏｌ. ２０００, ２７, ２８９‐２９７.
（非特許文献４）Ｐｏｖｓｉｃ, Ｔ. Ｊ., ｅｔ ａｌ. Ｐｒｅ‐ｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｎｔｉ‐ＰＥＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｅｇｎｉｖａｃｏｇｉｎ, ａ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ａｐｔａｍｅｒ. Ｊ ＡＬＬＥＲＧY ＣＬＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬ, ２０１６, １３８（６）, １７１２
（非特許文献５）Ｍ. Ｍ. Ｓｏｌｄｅｖｉｌｌａ, Ｈ. Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ, Ｆ. Ｐａｓｔｏｒ, Ａｐｔａｍｅｒｓ：Ａ Ｆｅａｓｉｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ｖｏｌ. ２０１６, ２０１６
（非特許文献２）Ｚｈｏｕ, Ｊ.；Ｒｏｓｓｉ, Ｊ. Ａｐｔａｍｅｒｓ ａｓ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ. Ｎａｔ. Ｒｅｖ. Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１７, １６, １８１‐２０２.
（非特許文献３）Ｄｏｕｇａｎ, Ｈ.；Ｌｙｓｔｅｒ, Ｄ. Ｍ.；Ｖｏ, Ｃ. Ｖ.；Ｓｔａｆｆｏｒｄ, Ａ.；Ｗｅｉｔｚ, Ｊ. Ｉ.；Ｈｏｂｂｓ, Ｊ. Ｂ. Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｏｆ Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ. Ｎｕｃｌ. Ｍｅｄ. Ｂｉｏｌ. ２０００, ２７, ２８９‐２９７.
（非特許文献４）Ｐｏｖｓｉｃ, Ｔ. Ｊ., ｅｔ ａｌ. Ｐｒｅ‐ｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｎｔｉ‐ＰＥＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｅｇｎｉｖａｃｏｇｉｎ, ａ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ａｐｔａｍｅｒ. Ｊ ＡＬＬＥＲＧY ＣＬＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬ, ２０１６, １３８（６）, １７１２
（非特許文献５）Ｍ. Ｍ. Ｓｏｌｄｅｖｉｌｌａ, Ｈ. Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ, Ｆ. Ｐａｓｔｏｒ, Ａｐｔａｍｅｒｓ：Ａ Ｆｅａｓｉｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ｖｏｌ. ２０１６, ２０１６
【発明の概要】
【技術的課題】
【0011】
本発明者は、新たな核酸リガンドを発見し、これの多様な癌腫における治療効果を確認して本開示を完成した。
【0012】
既存のＳＥＬＥＸ法とこれを用いて開発されたアプタマーは、長期間の研究にも克服し難い限界を示し、そのためアプタマーを用いた治療剤の提供が難しかった。実際、成功裏に開発された事例も、マクジェン以来１５年間一件もなかった。
【0013】
本開示は、新規核酸リガンドとその用途、及びこれを有効成分として含む、癌の治療のための薬学的組成物を提供することを目的とする。
【0014】
本開示は、体内安定性及び抗癌効果の優れた薬学的組成物を提供することを目的とする。
【0015】
具体的に、本開示は血漿タンパク質（例：アルブミン）に結合する核酸リガンドであり、血中に投与されると、血漿中のアルブミンタンパク質と結合し、これにより体内ヌクレアーゼによる分解や腎臓排泄を回避して癌組織に到達することができる。続いて、癌組織に到達した後には、エンドサイトーシスなどの経路によって細胞内に入って、意図する治療効果等を発揮することができる。このように、本開示の一実態様による核酸リガンドは、従来のアプタマーが有する生体内不安定性、速やかな腎クリアランス、及び細胞内への伝達不可などの問題を解決するものである。
【技術的解決方法】
【0016】
１. 本開示の一実態様は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する非天然核酸リガンドであり、配列番号８（ＣＡＧＧ６ＣＧＡＧＣ６Ｇ６ＡＣＧＣＧ６Ｇ６Ｇ６ＧＡＣＣ）の核酸配列を含むものであり[ここで、前記６と表示された部分は５‐[Ｎ‐（１‐ナフチルメチル）カルボキサミド‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）]、非天然核酸リガンドに関するものであってもよい。
【0017】
２. 一実態様において、前記非天然核酸リガンドは、配列番号１～８から選択された核酸配列を有し得る。
【0018】
３. 本開示の一実態様は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する非天然核酸リガンド、またはこれの薬学的に許容可能な塩を含む癌の予防または治療のための薬学的組成物として、前記非天然核酸リガンドが配列番号８（ＣＡＧＧ６ＣＧＡＧＣ６Ｇ６ＡＣＧＣＧ６Ｇ６Ｇ６ＧＡＣＣ）の核酸配列を含むもの[ここでの前記６と表示された部分は、５‐[Ｎ‐（１‐ナフチルメチル）カルボキサミド‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）である]に関するものであってもよい。
【0019】
４. 一実態様において、前記組成物は、一つ以上の前記非天然核酸リガンドを含み得る。
【0020】
５. 一実態様において、前記配列番号８の核酸配列を含む非天然核酸リガンドは、配列番号１～８から選択された核酸配列を有し得る。
【0021】
６. 一実態様において、前記癌は、原発性または転移性癌であってもよい。
【0022】
７. 一実態様において、前記癌は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膀胱癌、小腸癌、精巣癌、甲状腺癌、肝臓癌、尿路上皮細胞癌、胆嚢胆道癌、皮膚癌、胃癌、脳腫瘍、腎臓癌及び急性骨髄性白血病であってもよい。
【0023】
８. 一実態様において、前記乳癌は、三重陰性乳癌であってもよい。
【0024】
９. 一実態様において、前記癌は、膵臓癌であってもよい。
【0025】
１０. 一実態様において、前記薬学的組成物は、これを必要とする対象体に静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻内、膣内、膀胱内、皮内、経皮内、局所、または、皮下投与されてもよい。
【0026】
１１. 一実態様において、前記薬学的組成物は、癌組織の外科的切除後に投与されてもよい。
【0027】
１２. 本開示の一実態様は、本開示の一実施態様によるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する非天然核酸リガンド、または、これの薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を、これを必要とする対象体に投与する段階を含む、癌の予防または治療方法に関するものであってもよい。
【発明の効果】
【0028】
本開示の一実施態様による新規核酸リガンドは、単一の核酸リガンドとしてターゲットに対して優れた特異的結合親和性を示すことができる。
【0029】
一実施態様による新規核酸リガンドは、薬品として体内に投与する場合、血漿タンパク質に特異的に結合して優れた生体内安定性、緩やかな腎クリアランス、及びエンドサイトーシスなどの経路に細胞内に伝達可能という効果を奏することができる。新規核酸リガンドは、このような特性により治療的ターゲットに依存的な疾病に対する優れた治療効果を奏することができ、実際に臨床に適用される薬品として活用可能である。
【0030】
一実施態様による新規核酸リガンドは、生体内安定性、または緩やかな腎クリアランスを達成するために、製造後、他の巨大分子（例：ＰＥＧ）とともに用いなくても良いので、このような分子が核酸リガンドの構造に影響を与えたり、所望のターゲットに対する親和性または特異性を減少させたりする問題を排除することができる。これにより、核酸リガンドは、実験で確認された優れた治療的有効性を臨床に適用される薬品としてもそのまま維持することができる。
【0031】
一実施態様による新規核酸リガンドは、相対的に短い配列長さ（例：約２０個～約１００個、好ましくは約２５個～約７５個のオリゴヌクレオチド配列）を有し、他の物質とともに用いられなくても良い。これにより、大量生産工程で配置ごとに核酸リガンドの品質または性能が異なる問題が発生せず、品質管理が容易で、大量生産後に薬品として用いるための純度及び合成収率を満たす効果を奏する。結果的に、一実施態様による新規核酸リガンドは、自動合成機のみを用いて効率的に大量生産することができる。
【0032】
一実施態様による新規核酸リガンドは、タンパク質の３次元構造に結合することができ、このような結合によって、達成しようとする優れた治療的効果を奏することができる。
【0033】
本開示の一実施態様による薬学的組成物は、血漿タンパク質に特異的結合親和性を有する新規核酸リガンドを含み、様々な癌に対して効果的かつ優れた予防または治療をすることができる。
【0034】
一実施態様による薬学的組成物は、非経口投与（例えば、静脈投与または腹腔内投与）され、原発性または転移性癌、または腫瘍の成長を効果的に抑制することができる。
【0035】
一実施態様による薬学的組成物は、外科的切除後、転移性癌または腫瘍の生長を抑制したり、癌または腫瘍の転移を効果的に抑制したりすることができる。
【0036】
一実施態様による薬学的組成物は、非経口投与（例えば、静脈投与または腹腔内投与）され、原発性または転移性ＴＮＢＣ、または、膵臓癌に対して効果的かつ優れた予防または治療をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】図１は、一実施態様により核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）のヒト血清アルブミンに対するフィルター結合アッセイ（Ｆｉｌｔｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を通した結合力測定実験の結果図面（図１Ａ）及び結果分析グラフ（図１Ｂ）を示す。
【図2a】図２ａは、一実施態様により核酸ライブラリークローン（Ｃｌｏｎｅ）（クローン１～５）のヒト血清アルブミンに対するフィルター結合アッセイを通した結合力測定実験の結果図面（Ａ）及び結果分析グラフ（Ｂ）を示す。
【図3】図３は、本開示の核酸ライブラリープール及びクローンから、ヒト血清アルブミンに対する結合力の優れた全長核酸リガンドに選別された核酸リガンド（ＡＬ００７）に対して最適化を行った、ＡＬ００１（図３のＡ）、ＡＬ００２（図３のＢ）、ＡＬ００３（図３のＣ）、ＡＬ００４（図３のＤ）、ＡＬ００５（図３のＥ）、及びＡＬ００６（図３のＦ）の予測される二次構造を示す。
【図4】図４は、本開示の全長または最適化された核酸リガンド（ＡＬ００２、ＡＬ００３、ＡＬ００５、ＡＬ００６、及びＡＬ００７）のヒト血清アルブミンに対する結合力測定（ＥＬＩＳＡ Ｋｄ ａｓｓａｙ）の結果を示す。
【図7】図７は、膵臓癌動物モデルを用いた本開示の核酸リガンド（ＡＬ００６）のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効能の実験結果を示す。具体的には、図７のＡは、陰性または陽性対照薬品の投与群（ＰＢＳまたはゲムシタビン）と、ＡＬ００６投与群の相対的な腫瘍の大きさを測定して倍数変化で表現したグラフで、図７のＢは、実際の腫瘍組織を確認した写真である。
【図8】図８は、膵臓癌の動物モデルを用いた本開示の核酸リガンド（ＡＬ００６）のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効能実験を行った後、薬品投与による生体内の毒性有無（心臓（図８Ａ）、脾臓（図８Ｂ）、肝臓（図８Ｃ）、肺（図８Ｄ）、腎臓（図８Ｅ））を確認した実験結果を示す。
【図9】図９は、膵臓癌の動物モデルを用いた本開示の核酸リガンド（ＡＬ００６）のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効能実験を行った後、薬品投与による生体内の毒性有無（白血球（図９Ａ）、赤血球（図９Ｂ）、血小板（図９Ｃ）、ＡＳＴ（図９Ｄ）、ＡＬＴ（図９Ｅ））を確認した実験結果を示す。
【発明の実施のための最善の形態】
【0038】
本文書に記載された多様な実施様態または実施例は、本開示の技術的思想を明確に説明するための目的で例示されたものであり、これを特定の実施形態で限定するためのものではない。本開示の技術的思想は、本文書に記載された各実施様態または実施例の多様な変更（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、均等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）、代替物（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ）及び各実施様態または実施例の全部または一部から選択的に組み合わせられた実施様態または実施例を含む。また、本開示の技術的思想の権利範囲は、以下に提示される多様な実施様態または実施例や、これに関する具体的説明に限定されない。
【0039】
技術的または科学的な用語を含む本文書で用いられる用語は、異なって定義されない限り、本開示が属する技術分野で通常の知識を有する者に一般に理解される意味を有し得る。一般に用いられる辞書に定義されているような用語は、関連技術の文脈上有する意味と一致する意味を有すると解釈されるべきで、本開示で明白に定義しない限り、理想的または過度に形式的な意味で解釈されない。
【0040】
本文書で用いられる単数形の表現は、文脈上異なって意味しない限り複数形の意味を含み得、これは請求項に記載された単数形の表現にも同様に適用される。
【0041】
本文書で用いられる「第１」、「第２」、または「最初」、「二番目」等の表現は、文脈上異なって意味しない限り、複数の対象を指すときに、ある対象を他の対象と区分するために用いられ、当該対象間の順序または重要度を限定するものではない。
【0042】
本文書で用いられる「Ａ、Ｂ、及びＣ」、「Ａ、Ｂ、またはＣ」、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」、または「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも一つ」、「Ａ、Ｂ、または、Ｃの少なくとも一つ」、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣの少なくとも一つ」、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちから選択された少なくとも一つ」、「Ａ、Ｂ、または、Ｃのうちから選択された少なくとも一つ」、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣのうちから選択された少なくとも一つ」等の表現は、それぞれ羅列された項目、または羅列された項目の可能な限り全ての組み合わせを意味し得る。例えば、「Ａ及びＢのうちから選択された少なくとも一つ」は、（１）Ａ、（２）Ａの少なくとも一つ、（３）Ｂ、（４）Ｂの少なくとも一つ、（５）Ａの少なくとも一つ及びＢの少なくとも一つ、（６）Ａの少なくとも一つ及びＢ、（７）Ｂの少なくとも一つ及びＡ、（８）Ａ及びＢをいずれも指すことができる。
【0043】
本開示で用いられる用語「略」、または「概ね」は、技術分野の熟練した技術者に広く知られているとおり、それぞれの値に対する通常の誤差範囲を示し得る。これは本明細書に記載された数値または範囲の脈絡で、一実施様態で言及されるか、または請求された数値または範囲の±２０％、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％であることを意味し得る。
【0044】
本開示で用いられる用語「アプタマー」は、ただ一つのターゲットに対する特異的結合親和性を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【0045】
本開示で用いられる用語「ＳＥＬＥＸ」、「ＳＥＬＥＸ技術」、「ＳＥＬＥＸ法」、「ＳＥＬＥＸ工程」は、相互交換的に用いられ得、望ましい方法（例：タンパク質に結合）によってターゲットと相互作用する核酸を選別する過程と、選別された核酸を増幅する過程を組み合わせた方法を意味し得る。このようなＳＥＬＥＸ法は、標的分子に高い特異性で結合することができる核酸分子を選別するための試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）法であり、米国特許第５,４７５,０９６号（「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」）と米国特許第５,２７０,１６３号（ＷＯ ９１／１９８１３号、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」）に記載されている。
【0046】
本開示は、一実態様において、従来は存在不可能であるとされていた新たな部類（ｃｌａｓｓ）の核酸化合物である、新規非天然核酸リガンドに関するものである。
【0047】
本開示で用いられる用語「新規核酸リガンド」、「核酸リガンド」、「非天然核酸リガンド」、「新規非天然核酸リガンド」は、互いに相互交換的に用いられる。
【0048】
本開示で用いられる用語「非天然」は、自然界では発生しないことを意味し、このような側面から、本開示の一実施例による新規核酸リガンドは、標的に結合される公知の生理学的機能を有する核酸でなくてもよい。
【0049】
一実態様において、新規核酸リガンドは、血漿タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）に対して特異的結合親和性を有し得る。
【0050】
本開示で用いられる用語「特異的結合親和性」は、核酸リガンドが混合物またはサンプル内に存在するターゲットではない他の構成要素、または成分に結合することより、一般にはるかに高い親和度でそのターゲットに結合することを意味し得る。
【0051】
一実態様において、ターゲットは３次元構造を有するものであってもよい。一実態様において、ターゲットは、ワトソン／クリック型塩基対の形成または３重ヘリックス結合（ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ ｂｉｎｄｉｎｇ）に主に依存するメカニズムを通じて核酸と結合するポリヌクレオチドは含まない。
【0052】
一実態様において、新規核酸リガンドは、ターゲットと３次元的に結合したり、ターゲットの３次元的構造を認識したり、または、自ら３次元的構造を形成してターゲットと相互作用したりすることができる。新規核酸リガンドはターゲットと結合したり、ターゲットの３次元的構造を認識したり、または、ターゲットと相互作用してそれぞれのターゲットの特性を調節したりすることができる。例えば、一実施態様による新規核酸リガンドは、ターゲットタンパク質に結合してタンパク質の活性を阻害したり、シグナル伝達経路を遮断したり、シグナル伝達経路の下流のタンパク質の活性を抑制したりすることがある。
【0053】
本開示で用いられる、用語「結合」、または「相互作用」は、生理条件下で、例えば、パイスタッキング（ｐｉ‐ｓｔａｃｋｉｎｇ）、静電気的相互作用、疎水性相互作用、イオン性相互作用、及び／または水素結合相互作用などによる、二つの分子間の会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を意味し得る（例：核酸リガンドとターゲット間の安定した会合）。
【0054】
本開示で用いられる用語「調節」は、ターゲットの機能的特性、生物学的活性、及び／または生物学的機作（または経路）を変化させることを意味し得る。例えば、ターゲットの特性、活性、及び／または機作を上方調節したり（例：活性化または刺激させる場合）、下方調節したり（例：阻害または抑制する場合）、または、それ以外に変化させたりすることもできる。例えば、ターゲットが細胞の場合、調節される細胞の特性は細胞生存率、細胞増殖、遺伝子の発現、細胞形態学、細胞活性化、リン酸化、カルシウム動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、脱顆粒化、細胞移動、及び／または細胞分化があり得る。
【0055】
一実態様において、新規核酸リガンドは、約１００個以下のヌクレオチドからなってもよい。具体的には、新規核酸リガンドは、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、または、３０個以下のヌクレオチドからなるものであってもよい。一実態様において、新規核酸リガンドは１０個～１０５個、１０個～１００個、１５個～９５個、１５個～９０個、２０個～８５個、２０個～８０個、２５個～７５個、２５個～７０個、２５個～６５個、または、２５個～６０個のヌクレオチドからなってもよい。
【0056】
一実態様において、前記新規核酸リガンドは、配列番号８（ＣＡＧＧ６ＣＧＡＧＣ６Ｇ６ＡＣＧＣＧ６Ｇ６Ｇ６ＧＡＣＣ）の核酸配列を含むもの[ここで、前記６と表示された部分は５‐[Ｎ‐（１‐ナフチルメチル）カルボキサミド‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）]であってもよく、具体的には、配列番号１～８からなる群から選択されたいずれか一つの核酸配列であってもよい。
【0057】
一実態様において、ヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、これらの変形したヌクレオチド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよい。
【0058】
変形したヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５'方向、３'方向、またはオリゴヌクレオチド配列内に位置する任意のヌクレオチドの少なくとも一つに連結され得、好ましくはオリゴヌクレオチドの５'方向に連結される。
【0059】
本開示で用いられる「変形したヌクレオチド」は、天然発生ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及びＣ）の類似体、置換体またはエステルを意味し得、通常の技術者が簡単に用いることができる変形ヌクレオチドを包括する広範囲な概念を意味し得る。例えば、変形したヌクレオチドはＣ‐５位置での置換を有するか（例：Ｃ‐５変形したピリミジン）ヌクレオチドを構成する糖類（リボースまたはデオキシリボース）が変形するか、または、このような変形をいずれも有するヌクレオチドを意味してもよい。
【0060】
一実態様において、Ｃ‐５変形したピリミジンは、Ｃ‐５変形したアミノカルボニルピリミジンを意味し得、例えば、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｂｚ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（ｉＢｕ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐フェネチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｐｅ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐チオフェニルメチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｔｈ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｔｒｐ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐[１‐（３‐トリメチルアンモニウム）プロピル]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジンクロリド、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン）、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（Ｂｚ‐ｄＣ）、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（ｉＢｕ‐ｄＣ）、５‐（Ｎ‐フェネチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（Ｐｅ‐ｄＣ）、５‐（Ｎ‐チオフェニルメチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（Ｔｈ‐ｄＣ）、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（Ｔｒｐ‐ｄＣ）、５‐（Ｎ‐[１‐（３‐トリメチルアンモニウム）プロピル]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジンクロリド、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（Ｎａｐ‐ｄＣ）、及び／または５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジンを含み得るが、これに制限されない。
【0061】
一実態様において、リボース糖（Ｒｉｂｏｓｅ ｓｕｇａｒ）の２'位置変形を有する変形したヌクレオチドは、２'‐デオキシ‐２'‐フルオロウリジン（Ｕｆ）、２'‐デオキシ‐２'‐フルオロシチジン（Ｃｆ）、２'‐ヒドロキシアデノシン（Ａｒ）、２'‐メトキシアデノシン（Ａｍ）、２'‐メトキシグアノシン（Ｇｍ）を含み得るが、これに制限されない。
【0062】
一実態様において、Ｃ‐５変形及びリボース糖（Ｒｉｂｏｓｅ ｓｕｇａｒ）の２'位置変形をいずれも有する変形したヌクレオチドは、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルウリジン、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロウリジン、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルウリジン、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロウリジン、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルウリジン、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐フルオロウリジン、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルウリジン、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロウリジン、５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルウリジン、及び／または５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐フルオロウリジンを含み得るが、これに制限されない。
【0063】
一実態様において、Ｃ‐５変形及びリボース糖（Ｒｉｂｏｓｅ ｓｕｇａｒ）の２'位置変形をいずれも有する変形したヌクレオチドは、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルシチジン、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロシチジン、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルシチジン、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロシチジン、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルシチジン、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐フルオロシチジン、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルシチジン、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロシチジン、５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルシチジン、及び／または５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐フルオロシチジンを含み得るが、これに制限されない。
【0064】
一実態様において、変形したヌクレオチドは５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｂｚ‐ｄＵ）、または５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）であってもよく、これにより新規核酸リガンドをなすヌクレオチドの少なくとも一つはこのような変形したヌクレオチドであってもよい。
【0065】
一実態様において、新規核酸リガンドは、配列番号１～配列番号８からなる群から選択された一つの核酸配列からなるものであってもよい。
【0066】
一実態様において、新規核酸リガンドは、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡからなる群から選択されたものであってもよい。
【0067】
一実態様において、新規核酸リガンドは、必要に応じて５'末端前方または３'末端後方にビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を結合して用いられてもよい。
【0068】
一実態様において、新規核酸リガンドは、必要に応じて５'末端前方または３'末端後方に蛍光物質（例：ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＢＨＱ‐１、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ｒｏｄａｍｉｎｅ、またはＴｅｘａｓ Ｒｅｄなど）を結合して用いられてもよい。
【0069】
変形ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３'方向に連結される場合、変形ヌクレオチドの３'方向にｉｄＴ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＥＧまたは２'ＯＭｅＮｕ（２'‐Ｍｅｔｈｏｘｙ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）をさらに結合させることができる。
【0070】
変形ヌクレオチドの３'方向にｉｄＴ、ＬＮＡ、ＰＥＧまたは２'ＯＭｅＮｕをさらに結合させることによって、ヌクレアーゼの攻撃からオリゴヌクレオチドの３'末端を保護することができ、これによってオリゴヌクレオチドが体内で分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）されるスピードを下げ、変形ヌクレオチドがより長い間オリゴヌクレオチドに結合されているようにして、変形ヌクレオチドの抗癌効能を増加させることができる。
【0071】
オリゴヌクレオチドと変形ヌクレオチドを連結するための一方法は、前述したオリゴヌクレオチドの５'末端及び３'末端の少なくとも一つに、前述した変形ヌクレオチドを結合させる段階を含み得る。
【0072】
本開示のオリゴヌクレオチド配列に含まれたそれぞれの核酸ヌクレオチドは、変形ヌクレオチドに置換され得、オリゴヌクレオチド配列はその配列内に１個以上の変形ヌクレオチドを含み得る。
【0073】
本開示のオリゴヌクレオチドは、血漿タンパク質に対する特異的結合親和性を有する核酸リガンドであってもよい。また、本開示の核酸リガンドは癌の治療効果を奏し得る。本開示の核酸リガンドは表１に示されたものであってもよい。表１の核酸塩基配列で６と示された部分は、５‐[Ｎ‐（１‐ナフチルメチル）カルボキサミド‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）を意味する。また、下記の核酸リガンドはＤＮＡで構成され、デオキシリボース基盤の核酸からなり、具体的にＧは、２'‐デオキシグアノシン（２'‐ｄｅｏｘｙＧｕａｎｏｓｉｎｅ）、Ｃは２'‐デオキシシチジン（２'‐ｄｅｏｘｙＣｙｔｉｄｉｎｅ）、Ａは２'‐デオキシアデノシン（２'‐ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、及びＴはチミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を意味する。
【0074】
【表1】
【0075】
また、本開示は、前述したオリゴヌクレオチド、核酸リガンドまたは、その薬学的に許容可能な塩を含む癌の治療のための薬学的組成物を提供する。オリゴヌクレオチドまたは核酸リガンドは、前述した通りである。一実態様において、薬学的組成物は薬品伝達組成物であってもよい。
【0076】
本開示の一実施例による薬学的組成物において、新規核酸リガンドは、エンドサイトーシスなどの経路によって治療的ターゲットが存在する癌細胞内に伝達され得る。ここで、前記新規核酸リガンドは、薬学的組成物が投与される対象体の体内に存在する血漿タンパク質に結合し得る。これにより、新規核酸リガンドを含む薬学的組成物は、優れた生体内安定性及び緩やかな腎クリアランス（優れた体内残留時間）を示すことができ、新規核酸リガンドは癌組織に到達した後、前記エンドサイトーシスなどの経路によって癌細胞内に入ることができる。
【0077】
本開示で用いられる用語「対象体」は、ターゲットまたはその作用により誘発される疾患、または病気を有したり疾患または病気を発症したりし得るヒトを含む哺乳類、例えば、霊長類、マウス、ラット（ｒａｔ）、ハムスター、ウサギ、馬、羊、豚、ヤギ、牛、犬または猫であってもよく、これに制限されないが、好ましくはヒトであってもよい。
【0078】
本開示で用いられる用語「エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ；内包作用）」は、細胞が細胞膜外部の物質を細胞膜内部に運ぶ細胞作用を指す。エンドサイトーシスは、外部物質を細胞膜で取り囲んで細胞内へ入れた後、細胞内に小胞を形成して取り込んだ物質を分解した後、再利用したり、外部に排出したりすることができる。エンドサイトーシスは、活性化方法や関与するタンパク質の種類によって、マクロピノサイトーシス、クラスリン（ｃｌａｔｈｒｉｎ）タンパク質が関与する受容体媒介内包作用、カベオラ（ｃａｖｅｏｌａｅ）内包作用などに区分され得る。
【0079】
一実態様において、薬学的組成物は血漿タンパク質をさらに含み得る。この場合、薬学的組成物は血漿タンパク質と新規核酸リガンドが結合された形態や新規核酸リガンド単独の形態であってもよく、前記血漿タンパク質は治療対象の体外に存在するタンパク質であってもよい。
【0080】
本開示の一実施例による薬学的組成物において、新規核酸リガンドは、マクロピノサイトーシス経路によって治療的ターゲットが存在する癌細胞内に伝達され得る。
【0081】
本開示で用いられる用語「マクロピノサイトーシス（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）」は、エンドサイトーシスのうちの一種であり、細胞骨格タンパク質であるアクチンによって細胞膜が細胞外部に突出して再び収縮する過程中に小袋が形成され得、形成された小袋が細胞内に入って分離され、約０.２μｍ～５μｍの直径を有する小胞（マクロピノソーム）を形成し得る。
【0082】
マクロピノサイトーシスは、最近注目されている腫瘍代謝の一翼を担う。マクロピノサイトーシスを通じて腫瘍細胞の速やかな成長に必要な栄養分（例えば、グルタミン、アルブミンなど）を癌細胞内に供給して代謝に用いることができる。即ち、マクロピノサイトーシスによって形成された小胞内には細胞外液、細胞外分子などが含まれ得る。
【0083】
一実態様において、核酸リガンドは、血漿タンパク質と結合することによって、マクロピノサイトーシスによって細胞内に伝達される効率が高くなり得る。即ち、血漿タンパク質と結合された核酸リガンドは、血漿タンパク質と結合していない核酸リガンドと比べて細胞内に伝達される効果が優れ得る。
【0084】
本開示の一実施態様による核酸リガンドは、エンドサイトーシスの多様なメカニズムを通じて細胞質内に伝達され得る。癌細胞の急激な増殖に必要な必須栄養分を供給する主な経路として注目されているマクロピノサイトーシスだけでなく、その他のエンドサイトーシス経路が核酸リガンドの伝達に関与し得る。
【0085】
本開示で用いられる用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なメリット／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は患者の体重、性別、年齢、健康状態、重症度、適応症、薬品の活性、薬品に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比、治療期間、同時に用いられる薬品を含む要素、及びその他の医学分野で周知の要素によって決定され得る。
【0086】
本開示は、前述した薬学的組成物を含む薬品伝達デバイスを提供する。
【0087】
一側面では、前記薬学的組成物、薬品伝達組成物または薬品伝達デバイスを投与及び／または外科的に移植することによって、癌を治療／または予防する方法が提供される。また別の側面では、前記薬学的組成物、薬品伝達組成物または薬品伝達デバイスを投与及び／または外科的に移植することによって、原発性癌の再増殖を予防する方法が提供される。また別の側面では、前記薬学的組成物、薬品伝達組成物または薬品伝達デバイスを投与及び／または外科的に移植することによって、癌の再発及び／または転移を予防する方法が提供される。特定の実施様態において、前記方法は、癌または腫瘍の外科的切除後の前記薬学的組成物、薬品伝達組成物または薬品伝達デバイスを投与及び／または移植することを追加で含む。特定の実施様態では、前記方法は、癌または腫瘍の切除部位に前記薬学的組成物、薬品伝達組成物または薬品伝達デバイスを移植することを追加で含む。
【0088】
癌の治療のための薬学的組成物、薬品伝達組成物または薬品伝達デバイスに含まれるオリゴヌクレオチド、核酸リガンド、またはこれの薬学的に許容可能な塩の含量は、癌の予防または治療に効果を奏し得る含量であり、対象の状態及び／または疾患の重症度により適宜調節され得る。
【0089】
本開示で用いられる用語「薬学的に許容可能な」は、ある物質が薬学的組成物の有効成分の作用と相互作用しない無毒性であることを意味し得、例えば、各国の管理機関によって承認されたか、各国の薬局方で列挙されたものを意味し得る。本開示で用いられる用語「薬学的に許容可能な塩」は、イオン性結合を含有し、化合物を対象体に投与するのに適した酸または塩基と反応させて通常生産された生成物を意味し得る。
【0090】
一実態様において、薬学的組成物は、個別の治療剤として投与されるか、他の治療剤と併用投与され得、他の治療剤と併用投与される場合、順次または同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。本開示の薬学的組成物の投与時には、副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
【0091】
さらに、本開示は、前述した癌の治療のための薬学的組成物の製造方法を提供する。
【0092】
本開示の薬学的組成物製造方法は、前述した核酸リガンドが分散した分散液を製造する段階を含む。
【0093】
一実態様において、核酸リガンドが分散した分散液は、核酸リガンドを薬学的に許容可能な担体、希薄剤、及び／または賦形剤と混合させて製造することができる。本開示の「薬学的に許容可能な担体、希薄剤、及び／または賦形剤」は、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）でヒトに用いられてもよいものとして承認された任意の補助剤、担体、賦形剤、滑沢剤、甘味剤、希薄剤、保存剤、染料／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張化剤、溶媒、界面活性剤または乳化剤を制限なく含む。例示的な薬学的に許容可能な担体は、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；コーンスターチ及びジャガイモ澱粉などのデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及びセルロースアセテート；トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、動物及び植物性脂肪、パラフィン、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；ピーナッツオイル、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などのオイル；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；水；等張食塩水；点滴液；エチルアルコール；リン酸塩緩衝液（例えば、ＰＢＳ）；及び薬剤学的剤形に用いられる任意の他の和合性物質を含むが、これに制限されない。
【0094】
本開示は、一実態様において、一実態様による新規リガンドを、これを必要とする対象体に薬学的に有効な量で投与する段階を含む、癌を予防または治療する方法に関するものであってもよい。
【0095】
本開示は、一実態様において、癌を予防または治療するための薬剤製造のための一実施例による新規核酸リガンドの用途に関するものであってもよい。
【0096】
本開示は、一実態様において、癌の予防または治療に用いるための一実施例による新規核酸リガンドに関するものであってもよい。
【0097】
本開示の薬剤学的組成物、用途、治療方法に記載された事項は、互いに矛盾しない限り同一に適用され得る。
【0098】
本開示は、前述した実施様態及び後述する実施例を通じてより一層明確になるはずである。以下では、本開示の添付の表を参照して記述される実施例を通じ、該業界の通常の技術者が容易に理解して実現することができるように詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本開示を例示的に説明するためのものであり、本開示の範囲はこれら実施例に限定されない。
【0099】
本開示の一実態様による核酸リガンドを得るために下記の実施例を行った。
【0100】
［実施例１］新規核酸リガンドの選別
ＳＥＬＥＸ技術を用いてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ａｂｃａｍ、英国、製品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ ｔａｇ）、カタログナンバー：ａｂ２１７８１７）に結合する核酸リガンドを得た。具体的な新規核酸リガンドの選別方法は、下記に記載する。
ＳＥＬＥＸ技術を用いてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ａｂｃａｍ、英国、製品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ ｔａｇ）、カタログナンバー：ａｂ２１７８１７）に結合する核酸リガンドを得た。具体的な新規核酸リガンドの選別方法は、下記に記載する。
【0101】
１.ＳＥＬＥＸのためのライブラリーの製作
核酸ライブラリーの鋳型は、ビオチンが含まれた５'末端プライマーの結合部位と、３'末端プライマーの結合部位、中央部に４０個の連続的な任意の配列で[Ｂｉｏｔｉｎ‐ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ‐Ｎ（４０）‐ＣＡＧＧＣＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＴＣＡ]（配列番号９）構成されている。このような核酸ライブラリーの鋳型は、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した（トライリンク、米国）。
核酸ライブラリーの鋳型は、ビオチンが含まれた５'末端プライマーの結合部位と、３'末端プライマーの結合部位、中央部に４０個の連続的な任意の配列で[Ｂｉｏｔｉｎ‐ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ‐Ｎ（４０）‐ＣＡＧＧＣＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＴＣＡ]（配列番号９）構成されている。このような核酸ライブラリーの鋳型は、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した（トライリンク、米国）。
【0102】
変形ヌクレオチド５‐[Ｎ‐（１‐ナフチルメチル）カルボキサミド‐２'‐デオキシウリジン（５‐[Ｎ‐（１‐ｎａｐｈｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ]‐２'‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ；ＮａｐｄＵ）が含まれた核酸ライブラリーを製作するために次の通り行った。ストレプトアビジンタンパク質で表面改質された５００μｌの（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）レジンと５ＭのＮａＣｌ溶液に溶けている核酸ライブラリーを１時間反応させ、ビオチンが結合されているライブラリーをレジンに固定した。変形ヌクレオチドが含まれた二本鎖ＤＮＡを製造するために、５'ｐｒｉｍｅｒとｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、Ｎａｐ‐ｄＵＴＰ）、ＫＯＤ ＸＬＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｒｉｓ ＨＣＬ（ｐＨ７.８）、１Ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒを混合したｂｕｆｆｅｒを、７０℃で２時間反応させた。この過程で生産された二本鎖ＤＮＡに２０ｍＭのＮａＯＨを入れて一本鎖に分離した後、分離した上澄み液をＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（７００ｍＭのＨＣＬ、１８０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.４５％のＴｗｅｅｎ２０）溶液で中和した。中和したライブラリーはＡｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ‐１５（メルクミリポア、米国）を用いて濃縮した後、ＵＶ分光光度計で定量した。
【0103】
２.ヒト血清アルブミン特異的な核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）選抜
ＳＥＬＥＸ用のヒト血清アルブミンは、ヒスチジンタグ（６ｘ Ｈｉｓ‐ｔａｇ）が含まれたタンパク質を用いた。タンパク質のＨｉｓ‐ｔａｇが結合する磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ）のＤｙｎａｂｅａｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）と、バッファＳＢ１８（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０.０５％のＴｗｅｅｎ２０；以下同一）に溶けているヒト血清アルブミン組換えタンパク質を２５℃、１２００ｒｐｍ、３０分間反応させた後、磁石を用いてバッファＳＢ１８で３回洗浄し、ビーズに固定されたヒト血清アルブミンを準備した。
ＳＥＬＥＸ用のヒト血清アルブミンは、ヒスチジンタグ（６ｘ Ｈｉｓ‐ｔａｇ）が含まれたタンパク質を用いた。タンパク質のＨｉｓ‐ｔａｇが結合する磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ）のＤｙｎａｂｅａｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）と、バッファＳＢ１８（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０.０５％のＴｗｅｅｎ２０；以下同一）に溶けているヒト血清アルブミン組換えタンパク質を２５℃、１２００ｒｐｍ、３０分間反応させた後、磁石を用いてバッファＳＢ１８で３回洗浄し、ビーズに固定されたヒト血清アルブミンを準備した。
【0104】
ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の三次構造の形成を誘導するため、９５℃から３７℃まで温度を下げて反応させた。非特異的結合を防止するために前記反応液にタンパク質競争緩衝液（１ｕＭのプロトロンビン、１ｕＭのカゼイン）を混合し、ヒト血清アルブミンが固定されている磁性ビーズとサーモミキサーで３７℃、１２００ｒｐｍ、１時間反応させた。磁石を用いて上澄み液を除去した後、バッファＳＢ１８を添加して５回洗浄し、２ｍＭのＮａＯＨ溶液を用いてターゲットタンパク質に結合した核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を回収した後、８ｍＭのＨＣｌ溶液で中和した。
【0105】
中和した核酸ライブラリーにｑＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ[５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ）（配列番号：１０）、３'プライマー（Ｂｉｏｔｉｎ‐ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ）（配列番号：１１）、１Ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ、ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰ]を混合した後、９６℃で１５秒、５５℃で１０秒、及び６８℃で３０分の条件で１サイクル（ｃｙｃｌｅ）、そして、９６℃で１５秒、７２℃で１分の条件で２０サイクルを繰り返し、二本鎖オリゴＤＮＡを製造した。
【0106】
二本鎖オリゴＤＮＡを、ストレプトアビジン磁性ビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国；以下同一）と常温で反応させて固定し、２０ｍＭのＮａＯＨ溶液を添加してａｎｔｉ‐ｓｅｎｓｅ鎖を除去した。磁性ビーズに固定されているｓｅｎｓｅ鎖を鋳型として、前記ライブラリー製造と同一の方法でライブラリープール（ｐｏｏｌ）を合成し、次のラウンドに用いた。前記ＳＥＬＥＸラウンドは計８回繰り返し行った。
【0107】
３. 核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）のヒト血清アルブミンに対する結合力測定：フィルター結合アッセイ（Ｆｉｌｔｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）
ヒト血清アルブミンに結合する核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の結合力を測定するためにフィルター結合アッセイを行った。
ヒト血清アルブミンに結合する核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の結合力を測定するためにフィルター結合アッセイを行った。
【0108】
まず６回目のラウンドと８回目のラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）にｑＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ[５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ）（配列番号：１０）、３'プライマー（Ｂｉｏｔｉｎ‐ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ）（配列番号：１１）、１Ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ、ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰ]を混合し、９６℃で１５秒及び７２℃で１分の条件で２０サイクル繰り返して二本鎖オリゴＤＮＡを製造した。二本鎖オリゴＤＮＡをストレプトアビジン磁性ビーズと常温で反応させて固定し、２０ｍＭのＮａＯＨ溶液を添加してａｎｔｉ‐ｓｅｎｓｅ鎖を除去した。Ａｎｔｉ‐ｓｅｎｓｅが除去された磁性ビーズをバッファＳＢ１７（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０.０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０；以下同一）を用いて２回洗浄した後、１６ｍＭのＮａＣｌを用いて１回洗浄した。洗浄が完了した磁性ビーズとｓｅｎｓｅ結合体に５'ｐｒｉｍｅｒとｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、Ｎａｐ‐ｄＵＴＰ）、ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｒｉｓ ＨＣＬ（ｐＨ７.８）、１Ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒを添加し、６８℃で１時間反応させて変形核酸が含まれた核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を製造した。最後に２０ｍＭのＮａＯＨを添加してａｎｔｉ‐ｓｅｎｓｅ鎖を回収し、８０ｍＭのＨＣｌで中和した。
【0109】
中和した核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）１ｐｍｏｌｅとα‐３２Ｐ ＡＴＰ、ＴｄＴ、及びＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）を混合した後、３７℃で３０分間反応させて核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の末端をα‐３２Ｐ ＡＴＰと標識した。その後、７０℃で１０分間処理してＴｄＴ酵素を不活性化させた。標識された核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）は、Ｍｉｃｒｏ ｓｐｉｎ Ｇ５０ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア、米国）を用いて精製し、ベータカウンター機器を用いて定量した。
【0110】
定量値を基準に、２００００ｃｐｍの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を９５℃から３７℃まで１℃ごとに１０秒ずつ反応させ、三次構造の形成を誘導した。構造が安定化した核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）とバッファＳＢ１８を用いて段階希釈させたヒト血清アルブミンを３７℃で３０分間反応させ、ゾルバックスレジン（ｚｏｒｂａｘ ｒｅｓｉｎ；アジレント、米国）を添加して５分間さらに反応させた。反応が完了したサンプルをＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ‐ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ（メルクミリポア、米国）に移した後、真空で溶液を除去し、フィルターを通過できなかったサンプルはバッファＳＢ１８で洗浄した。真空でバッファＳＢ１８を除去した後、フィルタプレートをイメージプレートに１６時間露出させ、ＦＬＡ‐５１００（富士フイルム、日本）でイメージを定量化した。フィルター結合アッセイを通じて得られた値はシグマプロット１１という分析ソフトウェアを用いて分析し、陰性対照群として、ＳＥＬＥＸを行っていない核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）であるＮａｐ ｌｉｂｒａｒｙを用いた。
【0111】
図１は、核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）のヒト血清アルブミンに対する結合力をフィルター結合アッセイ方法で測定した結果である。図１によると、６回目及び８回目のラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）のいずれも、ヒト血清タンパク質に対する結合力が確認され、陰性対照群であるＮａｐ ｌｉｂｒａｒｙは結合力を確認できなかった。
【0112】
４.核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の塩基配列の分析
フィルター結合アッセイを通じて結合力が確認された核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）のサンプルを、５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ）（配列番号：１０）と３'プライマー（ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ）（配列番号：１２）を用いてＰＣＲ過程を通じて増幅し、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔを用いてクローニングしてＥ. ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞に形質転換させた。形質転換されたＥ. ｃｏｌｉの単一コロニーからプラスミドを抽出し、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）キット（エンジノミクス、韓国）を用いて増幅した。増幅されたＲＣＡサンプルは、ＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）と毛細血管電気泳動法で塩基配列分析（ソルジェント、韓国）を実施した。塩基配列分析が完了した核酸配列は、当社製作のソフトウェアを用いて分析し、発現頻度が多い配列を選抜した。
フィルター結合アッセイを通じて結合力が確認された核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）のサンプルを、５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ）（配列番号：１０）と３'プライマー（ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ）（配列番号：１２）を用いてＰＣＲ過程を通じて増幅し、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔを用いてクローニングしてＥ. ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞に形質転換させた。形質転換されたＥ. ｃｏｌｉの単一コロニーからプラスミドを抽出し、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）キット（エンジノミクス、韓国）を用いて増幅した。増幅されたＲＣＡサンプルは、ＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）と毛細血管電気泳動法で塩基配列分析（ソルジェント、韓国）を実施した。塩基配列分析が完了した核酸配列は、当社製作のソフトウェアを用いて分析し、発現頻度が多い配列を選抜した。
【0113】
塩基配列を分析した結果選抜された全長核酸リガンドは、表２に記載されたクローン１、クローン２、クローン３、クローン４、クローン５であり、表２に記載された核酸塩基配列の６と示された部分は、５‐[Ｎ‐（１‐ナフチルメチル）カルボキサミド‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）を意味する。
【0114】
【表2】
【0115】
*全長リガンドは太字及び下線処理した。
【0116】
**全長リガンドであるクローン１、クローン２、クローン３、クローン４、クローン５に対するフィルター結合アッセイの結果は、図２ａの通りである。
【0117】
***全長リガンドのうち、クローン２（ＡＬ００７）を最適化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）した配列はＡＬ００１、ＡＬ００２、ＡＬ００３、ＡＬ００４、ＡＬ００５、ＡＬ００６である。
【0118】
［実施例２］クローン核酸リガンドの合成及び結合力測定
２‐１. フィルター結合アッセイ
前記記載された塩基配列分析を通じて選抜された核酸配列に対し、塩基配列分析に用いられた二本鎖ＤＮＡを鋳型として、５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ）（配列番号：１０）と３'プライマー（ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ）（配列番号：１２）を用いてＰＣＲ過程を通じてクローン核酸リガンドを合成した。前述したフィルター結合アッセイと同一の方法でクローン核酸リガンドのターゲットタンパク質に対する結合力を測定した。
２‐１. フィルター結合アッセイ
前記記載された塩基配列分析を通じて選抜された核酸配列に対し、塩基配列分析に用いられた二本鎖ＤＮＡを鋳型として、５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ）（配列番号：１０）と３'プライマー（ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ）（配列番号：１２）を用いてＰＣＲ過程を通じてクローン核酸リガンドを合成した。前述したフィルター結合アッセイと同一の方法でクローン核酸リガンドのターゲットタンパク質に対する結合力を測定した。
【0119】
図２ａは、核酸ライブラリークローンのヒト血清アルブミンに対する結合力をフィルター結合アッセイ方法で測定した結果である。図２ａによると、クローン１、クローン２、クローン３、クローン５のヒト血清タンパク質に対する結合力が確認され、陰性対照群であるＮａｐ ｌｉｂｒａｒｙは結合力を確認できなかった。
【0120】
結合力が確認された４つのクローンのうち、結合力が最も優れたクローン２をオリジナルの全長核酸リガンド（Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として最適化のための切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）過程を行った。結果は下記に記述する。
【0121】
２‐２. ビーズ基盤のＥＬＩＳＡ結合アッセイ（Ｂｅａｄ ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）
前記記載された塩基配列分析を通じて選抜された核酸配列に対し、塩基配列分析に用いられた二本鎖ＤＮＡを鋳型として、５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ）（配列番号：１０）と３'プライマー（ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ）（配列番号：１２）を用いてＰＣＲ過程を通じてクローン核酸リガンドを合成した。
前記記載された塩基配列分析を通じて選抜された核酸配列に対し、塩基配列分析に用いられた二本鎖ＤＮＡを鋳型として、５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ）（配列番号：１０）と３'プライマー（ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ）（配列番号：１２）を用いてＰＣＲ過程を通じてクローン核酸リガンドを合成した。
【0122】
ＰＣＲ過程を通じてビオチンが標識された核酸リガンドの三次構造の形成を誘導するために、９５℃から３７℃まで１℃ごとに１０秒ずつ徐々に温度を下げて反応させた。準備された核酸リガンドと、２００ｎＭから５倍ずつ段階希釈したヒト血清アルブミンを３７℃で３０分間結合させた後、ヒスチジンプルダウンビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）を入れて３０分間２５℃で反応させた。磁石を用いて上澄み液を除去した後、バッファＳＢ１８で３回洗浄し、１：１０,０００に薄めたストレプトアビジン‐ホースラディッシュ酸化酵素（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）の試薬を添加して２５℃で３０分間反応させた。再び磁石を用いて上澄み液を除去した後、バッファＳＢ１８で３回洗浄して化学発光溶液ＥＣＬ Ｋｉｔ（エルピス、韓国）を反応させた。蛍光値を測定するために磁石を用いて上澄み液を分離し、白のプレートに移してＧｌｏｍａｘプレート測定機（プロメガ、米国）のルミネッセンスプロトコル（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いた。測定された結果値はシグマプロット１１という分析ソフトウェアを用いて分析した。
【0123】
図２ｂは、核酸ライブラリークローンのヒト血清アルブミンに対する結合力を、ビーズ基盤のＥＬＩＳＡ結合アッセイで測定した結果である。図２ｂによると、クローン６、クローン７、クローン８、クローン９、クローン１０のヒト血清タンパク質に対する結合力が確認された。
【0124】
［実施例３］全長核酸リガンドの最適化（Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）
クローン２の最適化過程は、次の通りである。まず、全長核酸リガンドの２Ｄ構造の予測にはエムフォールド（Ｍｆｏｌｄ）ウェブサーバを用い、これを基に全長核酸リガンドの両末端から長さを縮め、最短の最適化された核酸リガンドを導き出した。全長核酸リガンド（太字及び下線）と、最適化された核酸リガンドは、表１に記載されたＡＬ００１、ＡＬ００２、ＡＬ００３、ＡＬ００４、ＡＬ００５、ＡＬ００６、ＡＬ００７であり、ＡＬ００１、ＡＬ００２、ＡＬ００３、ＡＬ００４、ＡＬ００５、ＡＬ００６の予測構造は図３に示した。前記ＡＬ００１～ＡＬ００７に対する計算及び測定分子量は下記表３に整理した。
クローン２の最適化過程は、次の通りである。まず、全長核酸リガンドの２Ｄ構造の予測にはエムフォールド（Ｍｆｏｌｄ）ウェブサーバを用い、これを基に全長核酸リガンドの両末端から長さを縮め、最短の最適化された核酸リガンドを導き出した。全長核酸リガンド（太字及び下線）と、最適化された核酸リガンドは、表１に記載されたＡＬ００１、ＡＬ００２、ＡＬ００３、ＡＬ００４、ＡＬ００５、ＡＬ００６、ＡＬ００７であり、ＡＬ００１、ＡＬ００２、ＡＬ００３、ＡＬ００４、ＡＬ００５、ＡＬ００６の予測構造は図３に示した。前記ＡＬ００１～ＡＬ００７に対する計算及び測定分子量は下記表３に整理した。
【0125】
【表3】
【0126】
［実施例４］最適化された核酸リガンドのヒト血清アルブミンに対する結合力測定：ビーズ基盤ＥＬＩＳＡ結合アッセイ（Ｂｅａｄ ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）
最適化された核酸リガンドのヒト血清アルブミンに対する結合力を確認するためにビーズ基盤ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。
最適化された核酸リガンドのヒト血清アルブミンに対する結合力を確認するためにビーズ基盤ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。
【0127】
核酸リガンドは、Ｍｅｒｍａｄｅ １２またはＭｅｒｍａｄｅ ４８（バイオオートメーション、米国）を用いて合成した。合成工程は３'末端から５'末端に行い、Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ→Ｃｏｕｐｌｉｎｇ→Ｃａｐｐｉｎｇ→Ｏｘｉｄａｔｉｏｎを一つのサイクルとして、一つのヌクレオチドごとに順次合成した。
【0128】
合成が完了した核酸リガンドは、Ｂｉｏｔｉｎ‐１１‐ＵＴＰ、ＴｄＴ、及びＴｄＴ反応溶液（ｐｉｅｒｃｅ、米国）を混合した後、３７℃で３０分間反応させて核酸リガンドの末端をビオチンで標識した。その後、ＥＤＴＡを処理してＴｄＴ酵素を不活性化させた。
【0129】
ビオチンが標識された核酸リガンドの三次構造の形成を誘導するために、９５℃から３７℃まで１℃ごとに１０秒ずつ徐々に温度を下げて反応させた。準備された核酸リガンドと２００ｎＭから４.６５倍ずつ段階希釈したヒト血清アルブミンを３７℃で３０分間結合させた後、ヒスチジンプルダウンビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）を入れて３０分間２５℃で反応させた。磁石を用いて上澄み液を除去した後、バッファＳＢ１８で３回洗浄して１：１０,０００に薄めたストレプトアビジン‐ホースラディッシュ酸化酵素（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）の試薬を添加し、２５℃で３０分間反応させた。再び磁石を用いて上澄み液を除去した後、バッファＳＢ１８で３回洗浄して化学発光溶液ＥＣＬ Ｋｉｔ（エルピス、韓国）を反応させた。蛍光値を測定するために磁石を用いて上澄み液を分離し、白のプレートに移してＧｌｏｍａｘプレート測定機（プロメガ、米国）のルミネッセンスプロトコル（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いた。測定された結果値はシグマプロット１１という分析ソフトウェアを用いて分析した。
【0130】
図４は、全長核酸リガンドであるＡＬ００７と、最適化された核酸リガンドであるＡＬ００２、ＡＬ００３、ＡＬ００５、ＡＬ００６のヒト血清タンパク質に対する結合力アッセイ結果である。核酸リガンドとタンパク質間の親和力を示すＫｄ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）値はそれぞれ、ＡＬ００２：２０.７２ｎＭ、ＡＬ００３：２.２４ｎＭ、ＡＬ００５：１４.７ｎＭ、ＡＬ００６：１９.０２ｎＭ、ＡＬ００７：１２４.１８ｎＭである。
【0131】
［実施例５］ヒト血清アルブミン標的核酸リガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ効能実験
５‐１. 細胞培養
膵臓癌細胞株のＭｉａｐａｃａ‐２は、ＡＴＣＣ（米国）から分譲を受けて実験に用い、１０％のＦＢＳと１％の抗生剤が含まれたＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件のインキュベーターで培養した。継代培養は細胞が培養容器の８０％以上に増殖した際に行った。その方法は次の通りである。ＰＢＳで洗浄した細胞に０.０５％のトリプシン‐ＥＤＴＡを添加して３分間反応させ、新たな培地を添加してトリプシンを不活性化させる。遠心分離機を用いて細胞を得た後、新しい培養容器に１：６の比率で薄めて培養した。すべての細胞は、マイコプラズマの汚染の有無を、ｋｉｔ（バイオマックス、韓国）を用いてＰＣＲ方法で確認し、汚染が検出されていない細胞のみを用いて実験を進めた。
５‐１. 細胞培養
膵臓癌細胞株のＭｉａｐａｃａ‐２は、ＡＴＣＣ（米国）から分譲を受けて実験に用い、１０％のＦＢＳと１％の抗生剤が含まれたＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件のインキュベーターで培養した。継代培養は細胞が培養容器の８０％以上に増殖した際に行った。その方法は次の通りである。ＰＢＳで洗浄した細胞に０.０５％のトリプシン‐ＥＤＴＡを添加して３分間反応させ、新たな培地を添加してトリプシンを不活性化させる。遠心分離機を用いて細胞を得た後、新しい培養容器に１：６の比率で薄めて培養した。すべての細胞は、マイコプラズマの汚染の有無を、ｋｉｔ（バイオマックス、韓国）を用いてＰＣＲ方法で確認し、汚染が検出されていない細胞のみを用いて実験を進めた。
【0132】
５‐２. 核酸リガンドの細胞成長阻害効果を確認
前記記載された方法で培養された細胞を９６‐ｗｅｌｌ培養容器の各ｗｅｌｌに１Ｘ１０４個ずつ分株して１６時間培養した。培養容器に付着された細胞の培地をＦＢＳとグルタミンが含まれていないＤＭＥＭ培地に交替し、１６時間再び培養してマクロピノサイトーシスを活性化した。その後、事前にウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ、米国）と３０分間結合させた、最適化された核酸リガンドＡＬ００６を処理して２４時間培養し、各ｗｅｌｌにＷＳＴ（ドンインＬＳ、韓国）の試薬を１０μｌずつ添加して２時間培養して生成されたホルマザンをＧｌｏｍａｘプレート測定機（プロメガ、韓国）の吸光度測定プロトコルで測定した。本実験では、ウシ血清アルブミンを陰性対照群として用いた。
前記記載された方法で培養された細胞を９６‐ｗｅｌｌ培養容器の各ｗｅｌｌに１Ｘ１０４個ずつ分株して１６時間培養した。培養容器に付着された細胞の培地をＦＢＳとグルタミンが含まれていないＤＭＥＭ培地に交替し、１６時間再び培養してマクロピノサイトーシスを活性化した。その後、事前にウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ、米国）と３０分間結合させた、最適化された核酸リガンドＡＬ００６を処理して２４時間培養し、各ｗｅｌｌにＷＳＴ（ドンインＬＳ、韓国）の試薬を１０μｌずつ添加して２時間培養して生成されたホルマザンをＧｌｏｍａｘプレート測定機（プロメガ、韓国）の吸光度測定プロトコルで測定した。本実験では、ウシ血清アルブミンを陰性対照群として用いた。
【0133】
図５は、最適化された核酸リガンドＡＬ００６の膵臓癌細胞株Ｍｉａｐａｃａ‐２に対する細胞成長阻害効果（抗癌効能）結果である。図５によると、最適化された核酸リガンドＡＬ００６の場合、細胞成長阻害効果が濃度依存的に有意味に減少し、核酸リガンドを処理していない陰性対照群であるウシ血清アルブミンの場合、阻害効果が微々たることを確認した。
【0134】
［実施例６］膵臓癌の異種移植動物モデルを用いた核酸リガンドを含む薬学組成物のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効能実験
６‐１. 動物モデルの準備
雄マウスのＢａｌｂ／ｃ‐ｎｕ（５週齢）は、ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（ソンナム、韓国）から購入し、すべての動物実験はソウル大学動物実験倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）の規定に従って行われた。
６‐１. 動物モデルの準備
雄マウスのＢａｌｂ／ｃ‐ｎｕ（５週齢）は、ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（ソンナム、韓国）から購入し、すべての動物実験はソウル大学動物実験倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）の規定に従って行われた。
【0135】
５‐１項に記載した方法で培養されたＭｉａｐａｃａ‐２細胞株（１Ｘ１０６ｃｅｌｌ）と、１００μｌのマトリゲル混合物（１ＸＰＢＳ：マトリゲル=５０：５０ｖｏｌ.）を混合し、準備された雄マウスであるＢａｌｂ／ｃ‐ｎｕの右わき腹（ｒｉｇｈｔ ｆｌａｎｋ）に皮下注射した。皮下注射した細胞が増殖して３０ｍｍ３サイズの腫瘍が形成された時、陽性対照群薬品（ゲムシタビン）と最適化された核酸リガンドＡＬ００６をそれぞれ静脈注射して腫瘍抑制効能を比較した。
【0136】
６‐２. 膵臓癌の異種移植動物モデルでヒト血清アルブミン標的核酸リガンドの腫瘍抑制効能を確認
各実験グループの実験動物数は５匹であった。ゲムシタビン（１ｍｇ）は３日に１回、計５回繰り返し投与し（Ｄａｙ０、３、６、９、１２）、最適化された核酸リガンドＡＬ００６（５０μｇ）は２日に１回、計７回繰り返し投与（Ｄａｙ０、２、４、６、８、１０、１２）した。腫瘍の大きさは[１／２ｘ最長直径ｘ最短直径]の計算法を用いて２日ごとに測定した（図６参照）。
各実験グループの実験動物数は５匹であった。ゲムシタビン（１ｍｇ）は３日に１回、計５回繰り返し投与し（Ｄａｙ０、３、６、９、１２）、最適化された核酸リガンドＡＬ００６（５０μｇ）は２日に１回、計７回繰り返し投与（Ｄａｙ０、２、４、６、８、１０、１２）した。腫瘍の大きさは[１／２ｘ最長直径ｘ最短直径]の計算法を用いて２日ごとに測定した（図６参照）。
【0137】
腫瘍抑制効能結果（抗癌効能）は図７の通りであり、陽性対照群であるゲムシタビン薬品と比べて最適化された核酸リガンドＡＬ００６は、極めて優れた腫瘍抑制効果を奏した。
【0138】
６‐３. 膵臓癌の異種移植動物モデルにおけるヒト血清アルブミン標的核酸リガンドの生体内安定性
実験薬品の投与が終わった後、犠牲にしたマウスの臓器摘出及び重さの測定を行い、血液を分析して薬品投与による毒性の有無を確認した。
実験薬品の投与が終わった後、犠牲にしたマウスの臓器摘出及び重さの測定を行い、血液を分析して薬品投与による毒性の有無を確認した。
【0139】
生体内安定性試験の結果は、図８と図９の通りである。陽性対照群薬品であるゲムシタビン投与群は、脾臓が肥大化して肝臓の重さが減少する副作用が確認されたが、最適化された核酸リガンドＡＬ００６投与群は、肝臓と脾臓を含む心臓、肺、腎臓などに副作用がないことを確認した。
【0140】
特に、肝臓の損傷指標であるＡＳＴとＡＬＴを測定した結果、陽性対照群薬品であるゲムシタビン投与群の肝臓の数値が増加したことを確認し、白血球と血小板数値が減少する副作用が見られた。最適化された核酸リガンドであるＡＬ００６投与群の場合、肝臓の損傷指標と白血球、血小板、赤血球に異常数値は見られなかった。
【0141】
［実施例７］ヒト血清アルブミン標的核酸リガンドの三重陰性乳癌同所移植の動物モデルにおける効能実験
乳癌、特に三重陰性乳癌に対する抗癌効能を評価するにあたっては、どのようなｉｎ‐ｖｉｖｏ実験モデルを選択して用いるかが重要である。人体内の免疫学的及び生理学的作用は複雑に作用するので、動物における非臨床実験の結果がヒトへの抗癌効能として信頼性を有するためには、ヒトの体内環境と類似のモデルを用いることが必要なためである。特に、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）の場合、侵襲性、転移性及び再発性があり、早期に遠隔臓器で再発する確率と死亡率が高いので、モデルの選定がより一層重要となり得る。
乳癌、特に三重陰性乳癌に対する抗癌効能を評価するにあたっては、どのようなｉｎ‐ｖｉｖｏ実験モデルを選択して用いるかが重要である。人体内の免疫学的及び生理学的作用は複雑に作用するので、動物における非臨床実験の結果がヒトへの抗癌効能として信頼性を有するためには、ヒトの体内環境と類似のモデルを用いることが必要なためである。特に、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）の場合、侵襲性、転移性及び再発性があり、早期に遠隔臓器で再発する確率と死亡率が高いので、モデルの選定がより一層重要となり得る。
【0142】
現在利用可能な前臨床自発転移性ＴＮＢＣの同所マウスモデル（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ＴＮＢＣ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ）には、免疫不全ヒトＭＤＡ‐モデルＭＢ‐２３１と、免疫適格マウスのモデル４Ｔ１が存在する。ここで、ヒト由来の癌細胞である、細胞株ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１の場合、マウスに対する移植は異種移植に該当するため、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（Ｎｏｎ Ｏｂｅｓｅ Ｄｉａｂｅｔｉｃ‐Ｓｅｖｅｒｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）マウス、またはヌード（ｎｕｄｅ）マウスを用いらなければならないという限界がある。このような点で、異種移植された癌細胞（ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ）は宿主がヒトではないので、基本的にマウス実験のように侵襲的または攻撃的ではない。従って、一般に異種移植を行う際はマトリゲルを用いるが、これはヒト由来の癌細胞がマウス体内で十分に生着がなされないためである。ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１モデルはヒトの細胞株をマウスに移植する異種移植モデルなので、４Ｔ１、ＣＴ２６、ＭＣ３８、Ｂ１６Ｆ１０等のマウス細胞のように、マウス内で早く育たない。侵襲性／攻撃性（Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）が相対的に低いので、マウスモデルでも転移があまり発生せず、異種移植で用いなければならないＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、またはヌードマウスの場合、免疫細胞が一部または全て存在しないため、免疫体系が除去されるか正しく作動しないので、ヒトへの抗癌効能として信頼するには限界があり得、特にＴＮＢＣのような侵襲性及び転移性癌の場合、癌発生と抗癌機作を十分に実現して評価できないため限界が存在し得る。また、癌転移のメカニズムで免疫細胞が寄与する部分もあるので、免疫不全マウスを用いらざるを得ないＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１モデルは、４Ｔ１モデルと比べてＴＮＢＣに対する効能を評価するのに限界があるため、正しい評価結果を導き出すのが難しい。これに対し、本実験では、４Ｔ１のマウスモデルを用いて原発性ＴＮＢＣと転移性ＴＮＢＣ（即ち、他の臓器への癌の転移、または外科的手術除去後にも他の臓器で発生する転移性癌）に対する本発明の核酸リガンドの予防または治療効果を評価しようとした。即ち、４Ｔ１のマウスモデルはマウスの脂肪パッド（４ｔｈ Ｆａｔ ｐａｄ）に４Ｔ１腫瘍細胞を注入した後に育った原発腫瘍を標的治療するための原発性ＴＮＢＣモデルであるのみならず、転移性乳癌モデルであり、前記のように育った原発腫瘍を外科的に完全に除去すれば、残存する腫瘍細胞が異なる臓器、特に肺に自発的転移され、乳癌の自発的転移モデルが生まれる。このとき、４Ｔ１細胞にルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）がタグ（ｔａｇｇｉｎｇ）された細胞を用いると、注入した腫瘍細胞をルシフェリン（Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）及び生物発光イメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて多様な視点からイメージングできるので、抗癌剤による原発腫瘍の治療効果及び乳癌の転移の治療効果を観察できる有用なモデルである。
【0143】
７‐１. 細胞培養
４Ｔ‐１ Ｌｕ２三重陰性乳癌の細胞株は、ＡＴＣＣ（米国）から分譲を受けて実験に用い、ＡＴＣＣ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＰＭＩ‐１６４０（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）に１０％のＦＢＳ、１％の抗生剤を入れた培地を用いて培養した。継代培養方法は５‐１項に記載した方法と同一である。
４Ｔ‐１ Ｌｕ２三重陰性乳癌の細胞株は、ＡＴＣＣ（米国）から分譲を受けて実験に用い、ＡＴＣＣ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＰＭＩ‐１６４０（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）に１０％のＦＢＳ、１％の抗生剤を入れた培地を用いて培養した。継代培養方法は５‐１項に記載した方法と同一である。
【0144】
７‐２. 動物モデルの準備
雌マウスＢａｌｂ／ｃ（７週齢）は、ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（ソンナム、韓国）から購入し、すべての動物実験は成均館大学動物実験倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）の規定に従って行われた。
雌マウスＢａｌｂ／ｃ（７週齢）は、ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（ソンナム、韓国）から購入し、すべての動物実験は成均館大学動物実験倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）の規定に従って行われた。
【0145】
７‐１項に記載された方法で培養された４Ｔ‐１ Ｌｕ２細胞株（５Ｘ１０５ｃｅｌｌ）を１Ｘ ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）溶液３０μｌで薄め、準備されたＢａｌｂ／ｃ雌マウスの脂肪パッド（４ｔｈ ｆａｔ ｐａｄ）に注射した。注射した細胞が増殖して６０ｍｍ３サイズの腫瘍が形成された時、腫瘍切除ないし未切除群に分けて陽性対照群薬品（ゲムシタビン）と、陰性対照群薬品（ＨＥＲ２標的核酸リガンド；配列番号２３）、及び最適化された核酸リガンドＡＬ００６をそれぞれ腹腔注射（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＩＰ）して腫瘍の抑制効能を比較した。
【0146】
７‐３. 転移及び再発抑制効能の確認
７‐３‐１. 腫瘍未切除動物モデルにおける転移及び再発抑制効能の確認
各実験群の動物数は５匹であった。陽性対照群薬品であるゲムシタビン（１ｍｇ）と試験薬品である最適化された核酸リガンドＡＬ００６（３０μｇ、１００μｇ、３００μｇ）は、２日に１回、計６回（Ｄａｙ０、２、４、６、８）注射した。腫瘍の大きさは[腫瘍の長軸ｘ（腫瘍の短軸）２ｘ０.５]の計算法を用いて２日ごとに測定した。
７‐３‐１. 腫瘍未切除動物モデルにおける転移及び再発抑制効能の確認
各実験群の動物数は５匹であった。陽性対照群薬品であるゲムシタビン（１ｍｇ）と試験薬品である最適化された核酸リガンドＡＬ００６（３０μｇ、１００μｇ、３００μｇ）は、２日に１回、計６回（Ｄａｙ０、２、４、６、８）注射した。腫瘍の大きさは[腫瘍の長軸ｘ（腫瘍の短軸）２ｘ０.５]の計算法を用いて２日ごとに測定した。
【0147】
腫瘍未切除実験における腫瘍抑制効能の確認結果は図１１の通りである。薬品未処理群と比較して最適化された核酸リガンドＡＬ００６は、用量が増加するほど極めて優れた腫瘍抑制効果を奏した。特に、最適化された核酸リガンドＡＬ００６の３００μｇ処理群は、陽性対照群薬品であるゲムシタビン処理群より腫瘍抑制効能が高いことが確認された。
【0148】
７‐３‐２. 腫瘍切除動物モデルにおける転移及び再発抑制効能を確認
腫瘍切除動物モデルの場合、注射した細胞が増殖して６０ｍｍ３サイズの腫瘍が形成された時、腫瘍を手術的に除去した。陽性対照群薬品であるゲムシタビン（１ｍｇ）と陰性対照群であるＨｅｒ２標的核酸リガンド（３００μｇ）、及び試験薬品である最適化された核酸リガンドＡＬ００６（３０μｇ、３００μｇ、６００μｇ）は、低用量を投与（３０μｇ）する場合、２日に１回、計６回（Ｄａｙ０、２、４、６、８）注射し、高用量を投与（３００μｇ、６００μｇ）する場合、２日に１回、計１５回（Ｄａｙ０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８）腹腔内注射した。
腫瘍切除動物モデルの場合、注射した細胞が増殖して６０ｍｍ３サイズの腫瘍が形成された時、腫瘍を手術的に除去した。陽性対照群薬品であるゲムシタビン（１ｍｇ）と陰性対照群であるＨｅｒ２標的核酸リガンド（３００μｇ）、及び試験薬品である最適化された核酸リガンドＡＬ００６（３０μｇ、３００μｇ、６００μｇ）は、低用量を投与（３０μｇ）する場合、２日に１回、計６回（Ｄａｙ０、２、４、６、８）注射し、高用量を投与（３００μｇ、６００μｇ）する場合、２日に１回、計１５回（Ｄａｙ０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８）腹腔内注射した。
【0149】
転移及び再発抑制効能を確認するために、薬品投与後、約７日の間隔で５０日が経過するまで、実験動物用の蛍光イメージ分析機（Ａｎｉｍａｌ ｉｎ‐ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎａｌｙｚｅｒ、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ；以下ＩＶＩＳ）で撮影した。実験動物は一匹当り１５０ｍｇ／ｋｇの濃度でルシフェリンを注射し、１０分反応後、ＩＶＩＳ撮影を行った。
【0150】
低用量投与群の転移及び再発抑制効果の結果は図１２の通りである。薬品未処理群は、腫瘍切除後、３９日目に全て斃死したが、最適化された核酸リガンドＡＬ００６を３０μｇ投与した実験群は５３日目まで一部個体が生存した。
【0151】
最適化された核酸リガンドＡＬ００６の腫瘍の転移及び再発抑制効果を比較するために、高用量投与群（３００μｇ、６００μｇ）と陽性対照群（ゲムシタビン１ｍｇ）、陰性対照群（Ｈｅｒ２標的核酸リガンド３００μｇ）を追加し、結果は図１３の通りである。薬品未処理群と陽性対照群（ゲムシタビン１ｍｇ）、陰性対照群（Ｈｅｒ２標的核酸リガンド３００μｇ）の場合、腫瘍切除後、４２日目に全て斃死した。最適化された核酸リガンドＡＬ００６の高用量投与群の場合、７３日目まで一部個体が生存し、ＩＶＩＳ結果、転移及び再発は確認されなかった。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】