特表 2024-529557 組換え霊芝免疫調節タンパク質の新規変異体及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-06

(54)【発明の名称】組換え霊芝免疫調節タンパク質の新規変異体及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/415 20060101AFI20240730BHJP

   C12N 15/29 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240730BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240730BHJP

   C07K 1/20 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240730BHJP

【ＦＩ】

C07K14/415 ZNA

C12N15/29

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C07K1/20

A61P35/00

A61K38/02

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024508592

(86)(22)【出願日】2022-08-08

(85)【翻訳文提出日】2024-02-08

(86)【国際出願番号】 CN2022110916

(87)【国際公開番号】W WO2023016419

(87)【国際公開日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】202110908697.2

(32)【優先日】2021-08-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522212354

【氏名又は名称】チャンチュン インテリクラウン ファーマシューティカル カンパニー，リミティド

(71)【出願人】

【識別番号】524053339

【氏名又は名称】シヤンハイ インテリクラウン バイオテクノロジー カンパニー、リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン、シン

(72)【発明者】

【氏名】ソン、ゴンミン

(72)【発明者】

【氏名】ジア、ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】チャン、シーティアン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA08

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA03

4C084BA44

4C084NA14

4C084ZB26

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA30

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、組換えタンパク質に関する。上記組換えタンパク質はスペーサーペプチド及び組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含み、但し、上記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。本発明はまた、疾患の治療における上記組換えタンパク質の応用に関する。
【選択図】無し

【特許請求の範囲】

【請求項1】

スペーサーペプチド及び組換え霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含む組換えタンパク質であって、
前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、
組換えタンパク質。

【請求項2】

前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１３及び１６～２１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項3】

前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１又は２に記載の組換えタンパク質。

【請求項4】

前記スペーサーペプチドは１～５個のＥＡを含む、
請求項１～３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。

【請求項5】

前記スペーサーペプチドは２個のＥＡを含む。
請求項１～４のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。

【請求項6】

前記スペーサーペプチドは配列番号８～９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～５のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。

【請求項7】

前記スペーサーペプチドは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～６のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。

【請求項8】

前記スペーサーペプチドは前記ｒＬＺ－８変異体のＮ末端に位置する、
請求項１～７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。

【請求項9】

配列番号１４、１５、２２～３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。

【請求項10】

配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～９のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質をコードする、
単離された核酸分子。

【請求項12】

請求項１１に記載の単離された核酸分子を含む、
ベクター。

【請求項13】

請求項１１に記載の単離された核酸分子及び／又は請求項１２に記載のベクターを含む、
細胞。

【請求項14】

真核細胞である、
請求項１３に記載の細胞。

【請求項15】

酵母細胞である、
請求項１３又は１４に記載の細胞。

【請求項16】

請求項１～１０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質を含む、
ポリペプチド。

【請求項17】

請求項１～１０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質を調製する方法であって、
請求項１～１０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質を発現する条件で、請求項１３～１５のいずれか１つに記載の細胞を培養することを含む、
方法。

【請求項18】

請求項１～１０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、請求項１１に記載の単離された核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３～１５のいずれか１つに記載の細胞及び／又は請求項１６に記載のポリペプチド、及び任意選択的に薬学的に許容される担体を含む、
医薬組成物。

【請求項19】

請求項１～１０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、請求項１１に記載の単離された核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３～１５のいずれか１つに記載の細胞、請求項１６に記載のポリペプチド及び／又は請求項１８に記載の医薬組成物を含む、
キット。

【請求項20】

請求項１～１０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、請求項１１に記載の単離された核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３～１５のいずれか１つに記載の細胞、請求項１６に記載のポリペプチド及び／又は請求項１８に記載の医薬組成物を含む、
薬物送達デバイス。

【請求項21】

腫瘍を予防、緩和又は治療する方法であって、
請求項１～１０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、請求項１１に記載の単離された核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３～１５のいずれか１つに記載の細胞、請求項１６に記載のポリペプチド及び／又は請求項１８に記載の医薬組成物を、必要がある対象に投与することを含む、
方法。

【請求項22】

前記腫瘍は固形腫瘍を含む、
請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記腫瘍はＥＧＦＲ発現及び／又はＥＧＦＲ発現異常を有する腫瘍を含む、
請求項２１又は２２に記載の方法。

【請求項24】

前記腫瘍は非固形腫瘍を含む、
請求項２１に記載の方法。

【請求項25】

前記腫瘍は、結腸直腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、神経芽腫、卵巣がん、扁平上皮がん及び／又は膵臓がんを含む、
請求項２１～２４のいずれか１つに記載の方法。

【請求項26】

腫瘍を予防、緩和又は治療するための薬物の調製における、請求項１～１０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、請求項１１に記載の単離された核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３～１５のいずれか１つに記載の細胞、請求項１６に記載のポリペプチド及び／又は請求項１８に記載の医薬組成物の使用。

【請求項27】

腫瘍を予防、緩和又は治療するための、請求項１～１０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、請求項１１に記載の単離された核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１３～１５のいずれか１つに記載の細胞、請求項１６に記載のポリペプチド及び／又は請求項１８に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、生物医学分野に関し、具体的には組換え霊芝免疫調節タンパク質の変異体（ｒＬＺ－８変異体）及び腫瘍の治療におけるその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

霊芝免疫調節タンパク質（ＬＺ－８）は、１９８９年にＫｉｎｏらによって赤色霊芝菌糸体抽出物から単離及び精製される。抽出されたＬＺ－８には１．３％の多糖類が含まれており、インビトロでは細胞分裂促進活性があり、インビボでは免疫調節活性がある。同時に、ＬＺ－８はヒツジ赤血球に対して凝集作用を有するが、ヒト赤血球（Ａ、Ｂ、ＡＢ及びＯ型）に対して凝集作用がない。インビボ研究では、ＬＺ－８を繰り返し投与すると、マウス全身性アレルギー反応を防ぐことが判明されている。

【0003】

組換え霊芝免疫調節タンパク質（ｒＬＺ－８）は、遺伝子組換え技術によって取得される。天然の霊芝免疫調節タンパク質と比べて、アミノ酸配列が同じ、活性が類似しているが、多糖類が含まれない。研究では、ｒＬＺ－８がインビトロで様々な腫瘍細胞アポトーシスを迅速且つ効率的に誘導できるだけでなく、インビボでは、マウス腫瘍モデルの腫瘍細胞を効果的に殺し、白血球レベルを維持又は増加できることが示されている。更に、組織線維症、限局性脳虚血、血小板減少症、骨粗鬆症及び心不全の治療におけるｒＬＺ－８の作用について関連特許が公開され、授権されている。

【0004】

組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）は、ｒＬＺ－８の１つ又は複数のアミノ酸を変異させることによって得られる。機構研究により、ｒＬＺ－８変異体はヒト細胞表面の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合して細胞内に取り込まれ、分解されないため細胞内に滞留することが判明されている。高強度の内部移行により、細胞膜の循環が遮断され、最終的に細胞が縮小し、破裂して死滅する。腫瘍細胞殺傷実験の結果では、ｒＬＺ－８変異体はｒＬＺ－８よりも優れた腫瘍殺傷効果を有することが示されている。Ｂｉａｃｏｒｅ研究結果では、ｒＬＺ－８変異体がＥＧＦＲとの親和性がより高いことが示され、複数のヒトがん細胞の同所性移植腫瘍モデルを用いたマウス実験の結果では、ｒＬＺ－８と比べて、ｒＬＺ－８変異体がマウス生存期間を延長し、腫瘍成長を抑制することが示されている。

【0005】

しかし、ｒＬＺ－８とｒＬＺ－８変異体が何れも腫瘍殺傷作用を示しているが、両方ともタンパク質発現レベル、工業化の難しさの課題に直面している。一方で、タンパク質分子が人間にとって安全かどうかも、医薬品開発における重要な考慮事項である。

【発明の概要】

【0006】

本願は、スペーサーペプチド及び組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含む組換えタンパク質を提供しており、但し、前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。本願の組換えタンパク質は、以下から選ばれる少なくとも１つの特徴を有する。（１）比較的高い発現量及び／又は分泌量（例えば、酵母発現系）、（２）比較的高い安全性、製剤化の安全性を満たすこと、例えば、前臨床安全性評価に合格する、及び／又は、臨床試験許可を取得すること、（３）内部移行により細胞に容易に取り込まれること、並びに（４）腫瘍成長への阻害、腫瘍細胞殺傷能力が高い。

【0007】

一態様によれば、本願は、スペーサーペプチド及び組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含む組換えタンパク質を提供しており、但し、前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。

【0008】

幾つかの実施形態において、前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１３及び１６～２１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0009】

幾つかの実施形態において、前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む。

【0010】

幾つかの実施形態において、前記スペーサーペプチドは１～５個のＥＡを含む。

【0011】

幾つかの実施形態において、前記スペーサーペプチドは２個のＥＡを含む。

【0012】

幾つかの実施形態において、前記スペーサーペプチドは配列番号８～９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0013】

幾つかの実施形態において、前記スペーサーペプチドは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0014】

幾つかの実施形態において、前記スペーサーペプチドは前記ｒＬＺ－８又はその変異体のＮ末端に位置する。

【0015】

幾つかの実施形態において、前記組換えタンパク質は配列番号１４、１５、２２～３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。

【0016】

幾つかの実施形態において、前記組換えタンパク質は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0017】

別の態様によれば、本願は、前記組換えタンパク質をコードする、単離された核酸分子を提供する。

【0018】

別の態様によれば、本願は、前記単離された核酸分子を含む、ベクターを提供する。

【0019】

別の態様によれば、本願は、前記単離された核酸分子及び／又は前記ベクターを含む、細胞を提供する。

【0020】

幾つかの実施形態において、前記細胞は真核細胞である。

【0021】

幾つかの実施形態において、前記細胞は酵母細胞である。

【0022】

別の態様によれば、本願は、前記組換えタンパク質を含む、ポリペプチドを提供する。

【0023】

別の態様によれば、本願は、前記組換えタンパク質を調製する方法であって、前記組換えタンパク質を発現する条件で、前記細胞を培養することを含む、方法を提供する。

【0024】

別の態様によれば、本願は、前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記ポリペプチド及び／又は前記細胞、及び任意選択的に薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。

【0025】

別の態様によれば、本願は、前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記ポリペプチド及び／又は前記医薬組成物を含む、キットを提供する。

【0026】

別の態様によれば、本願は、前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記ポリペプチド及び／又は前記医薬組成物を含む、薬物送達デバイスを提供する。

【0027】

別の態様によれば、本願は、腫瘍を予防、緩和又は治療する方法であって、前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記ポリペプチド及び／又は前記医薬組成物を、必要がある対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0028】

別の態様によれば、本願は、前記薬物腫瘍を予防、緩和又は治療するための薬物の調製における、前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記ポリペプチド及び／又は前記医薬組成物の使用を提供する。

【0029】

別の態様によれば、本願は、腫瘍を予防、緩和又は治療するための、前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記ポリペプチド及び／又は前記医薬組成物を提供する。

【0030】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は非固形腫瘍を含む。

【0031】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は固形腫瘍を含む。

【0032】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍はＥＧＦＲ発現及び／又はＥＧＦＲ発現異常を有する腫瘍を含む。

【0033】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍はＥＧＦＲ変異に関連する腫瘍を含む。幾つかの実施形態において、前記腫瘍はＢＲＡＦ変異に関連する腫瘍を含む。幾つかの実施形態において、前記腫瘍はＫＲＡＳ変異に関連する腫瘍を含む。幾つかの実施形態において、前記腫瘍はＨＥＲ２変異に関連する腫瘍を含む。

【0034】

幾つかの実施形態において、前記腫瘍は、結腸直腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、神経芽腫、卵巣がん、扁平上皮がん及び／又は膵臓がんを含む。当業者であれば、以下の詳細な説明から本願の他の態様及び利点を容易に理解することができる。以下の詳細な説明では、本願の例示的な実施形態のみが示され、説明される。当業者が理解されるように、本願の内容により、当業者は、本願がカバーする発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された具体的な実施形態を変更することができる。対応的には、本願の図面及び明細書における記載は例示的なものに過ぎず、限定的なものではない。

【図面の簡単な説明】

【0035】

本願に関する発明の具体的な特徴は、添付の特許請求の範囲に記載されている。以下に詳細に説明する例示的な実施形態及び添付の図面を参照することによって、本願に関連する本発明の特徴及び利点をよりよく理解することができる。図面の簡単な説明は以下の通りである。

【0036】

【図1】ｒＬＺ－８（配列番号１０）を発現する複数の酵母菌株の結果を示すし、ここで、Ｍ：ｍａｒｋｅｒ、Ｓ：ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）作業参照品（１ｍｇ／ｍｌ）、１～１１：Ｎｏ．１～１１のｒＬＺ－８（配列番号１０）菌株である。

【図2】ｒＬＺ－８変異体（配列番号１３）を発現する複数の酵母菌株の結果を示すし、ここで、Ｍ：ｍａｒｋｅｒ、Ｓ：ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）作業参照品（１ｍｇ／ｍｌ）、１～１１：Ｎｏ．１～１１のｒＬＺ－８変異体（配列番号１３）菌株である。

【図3】ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８（配列番号１１）組換えタンパク質を発現する複数の酵母菌株の結果を示すし、ここで、Ｍ：ｍａｒｋｅｒ、Ｓ：ｒＬＺ－８（配列番号１０）作業参照品（０．５ｍｇ／ｍｌ）、１～６：Ｎｏ．１～６のＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８（配列番号１１）菌株である。

【図4】ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）組換えタンパク質を発現する複数の酵母菌株の結果を示すし、ここで、Ｍ：ｍａｒｋｅｒ、Ｓ：ｒＬＺ－８（配列番号１０）標準品（２５０ｍｇ／Ｌ）、１～６：Ｎｏ．１～６のＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）菌株である。

【図5】ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８（配列番号１２）組換えタンパク質を発現する複数の酵母菌株の結果を示すし、ここで、Ｍ：ｍａｒｋｅｒ、Ｓ：ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）作業参照品（１ｍｇ／ｍｌ）、１～１１：Ｎｏ．１～１１のＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８（配列番号１２）菌株である。

【図6】ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１５）組換えタンパク質を発現する複数の酵母菌株の結果を示すし、ここで、Ｍ：ｍａｒｋｅｒ、Ｓ：ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）作業参照品（１ｍｇ／ｍｌ）、１～１１：Ｎｏ．１～１１のＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１５）菌株である。

【図7】異なるスペーサーペプチドに結合するｒＬＺ－８又はその変異体の組換えタンパク質の発現結果の比較を示し、ここで、Ｍ：ｍａｒｋｅｒ、Ｓ：ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）作業参照品（１ｍｇ／ｍｌ）、１：ｒＬＺ－８変異体（配列番号１３）、２：ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）、３：ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１５）、４：ｒＬＺ－８（配列番号１０）、５：ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８（配列番号１１）、６：ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８（配列番号１２）である。

【図8】ＣＲ２００３５Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線。

【図9】ＣＲ５０４３Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図10】ＣＲ５０８２Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図11】ＣＲ３０９９Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図12】ＬＵ５１６２Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図13】ＬＵ１１６２４Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図14】ＬＵ１２３５Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図15】ＬＩ６６７７Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図16】ＬＩ６６６９Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図17】ＢＲ９４５７Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図18】ＢＲ９４６６Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図19】ＧＡ６８３３Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図20】ＧＡ２４３４Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図21】ＰＡ２００７８Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図22】ＰＡ０７８７Ｂオルガノイド系に作用する配列番号１４に示される組換えタンパク質の用量反応曲線を示す。

【図23】ＬＩ６６６９ヒト肝臓がん同所性移植腫瘍モデルにおける各治療群と対照群マウスの生存率変化を示す。

【図24】ｒＬＺ－８変異体の組換えタンパク質による肺がん細胞株Ａ５４９の殺傷作用を示す。

【図25】異なるスペーサーペプチドに結合するｒＬＺ－８又はその変異体の組換えタンパク質の発現結果の比較を示し、ここで、Ｍ：ｍａｒｋｅｒ、１：ｒＬＺ－８変異体４、２：ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体４（配列番号２５）、３：ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体４（配列番号３１）、４：ｒＬＺ－８変異体５、５：ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体５（配列番号２６）、６：ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体５（配列番号３２）、７：ｒＬＺ－８変異体６、８：ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体６（配列番号２７）、９：ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体６（配列番号３３）である。

【発明を実施するための形態】

【0037】

以下、特定の具体的な実施例により本願の発明の実施形態を説明し、当業者であれば、本明細書に開示された内容から、本願の発明の他の利点及び効果を容易に理解することができる。

【0038】

用語の定義

【0039】

本願において、「組換えタンパク質」という用語は、一般的に、組換え技術を使用して生成されたタンパク質を指す。組換えタンパク質には、（１）組換えＤＮＡ技術を使用して連結された異なる由来のＤＮＡ分子の組み合わせ発現によって生成された半合成又は合成のポリペプチド、（２）自然の状態で連結する部分とは関係のない、半合成又は合成に由来するポリペプチド、（３）自然の状態で連結するポリペプチド以外のポリペプチドに連結される、半合成又は合成に由来するポリペプチド、或いは（４）自然の状態で存在しない、半合成又は合成に由来するポリペプチドが含まれる。例えば、前記組換えタンパク質は、本願のスペーサーペプチドと本願の組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）とを連結して形成されるポリペプチドを指してもよい。

【0040】

本願において、「スペーサーペプチド」という用語は、一般的に、任意のドメインを連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを指す。本願において、スペーサーペプチドは組換え霊芝免疫調節タンパク質（ｒＬＺ－８）のＮ末端に位置する。例えば、スペーサーペプチドは、リーダーペプチドと組換え霊芝免疫調節タンパク質（ｒＬＺ－８）との間に位置してもよい。例えば、スペーサーペプチドはシグナルペプチドの一部であってもよい。例えば、スペーサーペプチドは、それが連結しているタンパク質の分泌を促進してもよい。

【0041】

本願において、「霊芝免疫調節タンパク質」という用語は、ＬＺ－８、ＬＺ８、Ｌｉｎｇ Ｚｈｉ－８又は霊芝タンパク質８と呼ばれ、一般的に、霊芝に由来する免疫調節タンパク質を指す。ＬＺ－８には、その対立遺伝子変異体、スプライス変異体、派生変異体、置換変異体、欠失変異体及び／又は挿入変異体（Ｎ末端メチオニンの付加を含む）、融合ポリペプチド及びその種間相同体も含まれる。本願において、前記ＬＺ－８は、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍに由来する免疫調節タンパク質を指してもよい。本願において、「組換え霊芝免疫調節タンパク質（ｒＬＺ－８）」という用語は、一般的に、組換え方法を使用して得られるＬＺ－８を指す。例えば、前記ＬＺ－８とｒＬＺ－８のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ登録番号Ｐ１４９４５を参照することができる。本願において、前記ＬＺ－８とｒＬＺ－８には、配列番号１０に示されるアミノ酸配列が含まれてもよい。

【0042】

本願において、「変異体」という用語は、一般的に、１つ又は複数の差異を含むことによって参照配列とは異なる配列を指す。当該参照配列は、組換え霊芝免疫調節タンパク質のアミノ酸配列であってもよい。当該差異は、アミノ酸の欠失、挿入、又は好ましくは置換であってもよい。変異体は、参照配列と同じ又は異なる機能作用を有してもよい。

【0043】

本願において、「アミノ酸変異」という用語は、一般的に、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び修飾を含む。

【0044】

本願において、「ＥＡ」という用語は、一般的に、グルタミン酸（Ｅ）及びアラニン（Ａ）がペプチド結合により連結されたペプチド断片を指す。

【0045】

本願において、「単離された」という用語は、一般的に、天然環境において通常それに付随又は相互作用する成分を実質的に含まない生物学的材料（例えばウイルス、核酸又はタンパク質）を指す。

【0046】

本願において、「単離された核酸分子」という用語は、一般的に、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成由来のＤＮＡ又はＲＮＡ又はその一部の組み合わせを指す。それが、天然環境に見られるポリヌクレオチドの全て又は一部と結合せず、或いは、天然環境において連結しないポリヌクレオチドに結合する。

【0047】

本願において、「ベクター」という用語は、一般的に、挿入された核酸分子を宿主細胞内及び／又は宿主細胞間に移入する、適切な宿主内で自己複製できる核酸分子を指す。前記ベクターには、細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入に主に使用されるベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製に主に使用されるベクター、並びにＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳の発現に主に使用されるベクターが含まれてもよい。前記ベクターには、上記の各種機能を有するベクターも含まれる。前記ベクターは、適切な宿主細胞に導入される場合、転写され、ポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドであってもよい。一般的に、前記ベクターの適切な宿主細胞を培養することによって、前記ベクターは、所望の発現産物を産生することができる。

【0048】

本願において、「細胞」という用語は、一般的に、本願に記載される核酸分子を含み得るか、又はそれを含んでいるプラスミド又はベクター、或いは、本願に記載される抗体又はその抗原結合断片を発現できる個体細胞、細胞株又は細胞培養物を指す。前記細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれてもよい。天然的、偶発的又は意図的な突然変異により、子孫細胞は形態又はゲノムにおいて元の親細胞と必ずしも完全に同じであるとは限らないが、本願に記載される抗体又はその抗原結合断片を発現できればよい。前記細胞は、本願に記載されるベクターを使用してインビトロで細胞をトランスフェクトすることによって得られてもよい。前記細胞は、原核細胞（例えば大腸菌）であってもよく、真核細胞（例えば酵母細胞、例えばＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＳ０細胞又は骨髓腫細胞）であってもよい。場合によっては、前記細胞は哺乳動物細胞であってもよい。例えば、前記哺乳動物細胞はＣＨＯ－Ｋ１細胞であってもよい。本願において、「組換え細胞」という用語は、一般的に、その中に組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。前記組換え宿主細胞には、ある特定の細胞が含まれるだけでなく、それらの細胞の子孫も含まれる。

【0049】

本願において、「キット」という用語は、一般的に、本願の組換えタンパク質を投与するためにＥＧＦＲ発現及び／又はＥＧＦＲ異常発現に関連する病状を治療する成分を含むパッケージ化された製品を指す。キットの成分は、別々のバイアル（即ち、別々の部品を備えるキット）に含まれてもよく、或いは、単一のバイアルで提供されてもよい。キットには、緩衝剤、タンパク質安定化試薬、シグナル発生システム（例えば、蛍光シグナル発生システム）、抗体、対照タンパク質、及び試験容器などの試薬が含まれてもよい。キットには、前記方法を実行する明細書が含まれてもよい。

【0050】

本願において、「薬物送達デバイス」という用語には、（ｉ）活性成分を有する医薬組成物を対象に投与するための注入モジュール、（ｉｉ）組換えタンパク質、核酸分子、細胞、ベクター又はそれらの組み合わせからなる群より選ばれる活性成分を含む注入用医薬組成物、及び（ｉｉｉ）任意選択の薬効監視モジュールが含まれる。

【0051】

本願において、「腫瘍」という用語は、一般的に、全ての新生物細胞の成長及び増殖（悪性か良性かを問わず）並びに全ての前癌性と癌性細胞及び組織を指す。腫瘍には、固形腫瘍及び／又は非固形腫瘍（例えば、血液腫瘍、リンパ腫）が含まれてもよい。

【0052】

本願において、「薬学的に許容される担体」という用語は、一般的に、曝露される細胞又は哺乳動物に対して使用される用量及び濃度において非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤を指す。一般的には、生理学的に許容される担体はｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例には、緩衝液、抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、単糖類、二糖類及び他の炭水化物、キレート剤、糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、及び／又は非イオン性界面活性剤が含まれてもよい。

【0053】

本願において、「治療」という用語は、一般的に、治療を受ける個体における疾患の自然経過を変えることを目的とした臨床介入を指し、疾患の臨床経過中に予防又は治療を達成することを目的とする場合もある。必要を満たす治療効果は、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な任意の病理学的影響の軽減、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は軽減、並びに予後の改善又は軽減を含むが、これらに限定されない。幾つかの場合において、本願の組換えベクターは、疾患の発症を遅らせたり、疾患の進行を緩和したりするために使用してもよい。

【0054】

本願において、「投与」という用語は、一般的に、特定の用量の化合物（例えば、抗がん治療剤）又は医薬組成物（例えば、抗がん治療剤を含む医薬組成物）を対象（例えば、患者）に投与する方法を指す。投与は、非経口、肺内、鼻腔内、及び（局所治療に必要な場合）病巣内の投与を含む任意の適切な手段によって行われてもよい。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内又は皮下投与が含まれる。

【0055】

本明細書で言及される特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本願には、それらの機能的変異体、誘導体、類似体、相同体及びその断片が含まれてもよい。

【0056】

「機能性変異体」という用語は、天然に存在する配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を有するか、又は実質的に相同であるヌクレオチド配列によってコードされると共に天然に存在する配列の１種又は複数種の活性を有するポリペプチドを指す。本願の文脈において、任意の所定の配列の変異体は、その中の残基の特定の配列（アミノ酸であるかヌクレオチド残基であるかを問わず）の修飾により前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドが実質的に少なくとも１つの内因性機能を保持する配列を指す。元の機能活性が維持される限り、天然に存在するタンパク質及び／又はポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのアミノ酸残基及び／又はヌクレオチド残基の付加、欠失、置換、修飾、置換及び／又は変異によって変異体配列を得ることができる。

【0057】

本願において、「誘導体生物」という用語は、一般的に、得られたポリペプチド又はポリヌクレオチドが実質的に少なくとも１つの内因性機能が維持される限り、自己／ペア配列の１つ（又は複数）のアミノ酸残基の任意の置換、変異、修飾、置換、欠失及び／又は付加を含む、本願のポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。本願において、「類似体」という用語は、一般的に、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの任意の模擬物を含むポリペプチド又はポリヌクレオチドを指し、即ち当該模擬物が模擬するポリペプチド又はポリヌクレオチドの少なくとも１つの内源機能を有する化学化合物である。一般的には、修飾された配列は実質的に必要な活性又は能力が維持される限り、少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０以上）のアミノ酸置換などの、アミノ酸置換が行われてもよい。アミノ酸には、天然に存在しない類似体の使用が含まれてもよい。

【0058】

本願で使用されるタンパク質又はポリペプチドは、サイレンシングの変化を生じて機能的に同等のタンパク質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有してもよい。内因性機能が維持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性特性の類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換が行われてもよい。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、また、類似する親水性値を有する非極性頭部基を含むアミノ酸にはアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンが含まれる。

【0059】

本願において、「相同体」という用語は、一般的に、野生型アミノ酸配列及び野生型ヌクレオチド配列に対して、一定の相同性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。「相同性」という用語は、配列「同一性」と同等である。相同配列には、主題配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％同一であるアミノ酸配列が含まれてもよい。一般的には、相同体は、主題アミノ酸配列と同一である活性部位などを含む。相同性は、類似性（即ち類似する化学的特性／機能を持つアミノ酸残基）の観点から考慮してもよく、配列相同性の観点から相同性を表現してもよい。本願において、言及されるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の配列番号のいずれか１つ１つに対してパーセント相同性を有する配列は、言及される配列番号の全長において前記パーセント相同性を有する配列を指す。

【0060】

配列相同性を決定するために、配列アラインメントを行うことができ、これは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＮＥＥＤＬＥ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの使用、当業者に知られている様々な手段によって行うことができる。当業者は、比較される全長配列にわたって最適なアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。

【0061】

本願において、「及び／又は」という用語は、オプションのいずれか１つ又はオプションの２項を意味すると理解されるべきである。

【0062】

本願において、「包含」という用語は、一般的に、明示的に指定された特徴を含むが、他の要素を排除しないことを指す。

【0063】

本願において、「約」という用語は、一般的に、指定された値の０．５％～１０％以上又は以下の範囲内の変動、例えば、指定された値の０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、又は１０％以上又は以下の範囲内の変動を指す。

【0064】

発明の詳細

【0065】

組換えタンパク質

【0066】

一態様によれば、本願は、スペーサーペプチド及び組換え霊芝免疫調節タンパク質（ｒＬＺ－８）変異体を含む組換えタンパク質を提供しており、但し、前記ｒＬＺ－８は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。本願において、前記ｒＬＺ－８は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上）の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0067】

一態様によれば、本願は、スペーサーペプチド及び組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含む組換えタンパク質を提供しており、但し、前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。

【0068】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチド及び組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含み、但し、前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、１つのアミノ酸変異を含んでもよい。

【0069】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチド及び組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含み、但し、前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、２つのアミノ酸変異を含んでもよい。

【0070】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチド及び組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含み、但し、前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、１つのアミノ酸変異を含んでもよく、前記１つのアミノ酸変異は、Ｒ９、Ｌ１７、Ｄ２０、Ｄ７０、Ｋ４６及びＫ７４からなる群より選ばれるアミノ酸位置に位置してもよい。例えば、前記１つのアミノ酸変異は、Ｄ７０、Ｌ１７、Ｋ７４及びＫ４６からなる群より選ばれるアミノ酸位置に位置してもよい。

【0071】

本願において、Ｌ１７でのアミノ酸変異はＬ１７Ｋであってもよい。

【0072】

本願において、Ｄ７０でのアミノ酸変異Ｄ７０Ｋであってもよい。

【0073】

本願において、Ｋ４６でのアミノ酸変異Ｋ４６Ｅであってもよい。

【0074】

本願において、Ｋ７４でのアミノ酸変異Ｋ７４Ｅであってもよい。

【0075】

本願において、Ｄ２０でのアミノ酸変異Ｄ２０Ｈであってもよい。

【0076】

本願において、Ｒ９でのアミノ酸変異Ｒ９Ａであってもよい。

【0077】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチド及び組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含み、但し、前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、１つのアミノ酸変異を含んでもよく、且つ前記１つのアミノ酸変異は、Ｒ９Ａ、Ｌ１７Ｋ、Ｄ２０Ｈ、Ｋ４６Ｅ、Ｄ７０Ｋ及びＫ７４Ｅからなる群より選ばれてもよい。また、例えば、前記１つのアミノ酸変異は、Ｌ１７Ｋ、Ｋ４６Ｅ、Ｄ７０Ｋ及びＫ７４Ｅからなる群より選ばれてもよい。

【0078】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチド及び組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含み、但し、前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、１つのアミノ酸変異を含んでもよく、且つ前記１つのアミノ酸変異は、Ｌ１７Ｋ、Ｄ７０Ｋ及びＫ４６Ｅからなる群より選ばれてもよい。

【0079】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチド及び組換え霊芝免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含み、但し、前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、２つのアミノ酸変異を含んでもよく、且つ前記２つのアミノ酸変異は、Ｋ４６Ｅ及びＫ７４Ｅからなる群より選ばれてもよい。また、例えば、前記２つのアミノ酸変異は、Ｌ１７Ｋ及びＤ７０Ｋからなる群より選ばれてもよい。

【0080】

例えば、前記ｒＬＺ－８変異体は、配列番号１３及び１６～２１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記ｒＬＺ－８変異体は、配列番号１３及び１６～２１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上）の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0081】

本願において、前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記ｒＬＺ－８変異体は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上）の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。本願において、前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は配列番号１３に示されてもよい。

【0082】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは１～５個のＥＡを含んでもよい。例えば、前記スペーサーペプチドは２個のＥＡを含んでもよい。

【0083】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１３及び１６～２１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは１～５個のＥＡを含んでもよい。例えば、前記スペーサーペプチドは２個のＥＡを含んでもよい。

【0084】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0085】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0086】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0087】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0088】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0089】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0090】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0091】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0092】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0093】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0094】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0095】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0096】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0097】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８変異体を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0098】

本願において、前記スペーサーペプチドは、前記ｒＬＺ－８又はその変異体のＮ末端に位置してもよい。本願において、前記組換えタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、順に前記スペーサーペプチドと前記ｒＬＺ－８変異体を含んでもよい。

【0099】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0100】

本願において、前記組換えタンパク質はスペーサーペプチドとｒＬＺ－８を含んでもよく、且つ前記ｒＬＺ－８は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記スペーサーペプチドは配列番号９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0101】

本願において、前記スペーサーペプチドは前記ｒＬＺ－８のＮ末端に位置してもよい。本願において、前記組換えタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、順に前記スペーサーペプチドと前記ｒＬＺ－８を含んでもよい。

【0102】

本願において、前記組換えタンパク質は、配列番号１４、１５及び２２～３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。本願において、前記組換えタンパク質は、配列番号１４、１５及び２２～３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上）の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0103】

例えば、前記組換えタンパク質は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、前記組換えタンパク質は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上）の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0104】

核酸、ベクター及び細胞

【0105】

別の態様によれば、本願は、前記組換えタンパク質を含むポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドにおいて、前記組換えタンパク質は、他のタンパク質又はポリペプチドと共有結合又は非共有結合で連結してもよい。

【0106】

別の態様によれば、本願は、本願に記載の組換えタンパク質及び／又はポリペプチドをコードすることができる１種又は複数種の核酸分子を提供する。本願に記載の核酸分子は単離されたものであってもよい。例えば、それは、（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの、インビトロでの増幅による生成、（ｉｉ）クローン組換えによる生成、（ｉｉｉ）酵素切断及びゲル電気泳動分画単離などによる精製、或いは（ｉｖ）化学合成などによる合成といった方法によって産生されるか又は合成される。幾つかの実施形態において、前記単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術によって調製された核酸分子である。

【0107】

別の態様によれば、本願は、本願に記載の核酸分子を含むことができるベクターを提供する。また、前記ベクターには、適切な宿主細胞内及び適切な条件で当該ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などの、他の遺伝子が含まれてもよい。また、前記ベクターは、適切な宿主におけるコード領域の正確な発現を可能にする発現制御エレメントを含んでもよい。このような制御エレメントは当業者に周知であり、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー及び遺伝子転写又はｍＲＮＡ翻訳を調節する他の制御エレメントなどを含んでもよい。前記ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ又は例えば遺伝子工学において一般的に使用される他のベクターなどを含んでもよい。例えば、前記ベクターは発現ベクターである。例えば、前記ベクターは、真核細胞（例えば、酵母細胞）における発現に適したベクターである。

【0108】

別の態様によれば、本願は、本願に記載の核酸分子又は本願に記載のベクターを含むことができる細胞を提供する。幾つかの実施形態において、各種の細胞又は各細胞は、本願に記載の１つ又は１種の核酸分子又はベクターを含んでもよい。幾つかの実施形態において、各種の細胞又は各細胞は、本願に記載の複数（例えば、２個以上）又は複数種（例えば、２種以上）の核酸分子又はベクターを含んでもよい。例えば、本願に記載のベクターを、例えば、植物由来の細胞、真菌又は酵母細胞などの真核細胞などの前記宿主細胞に導入してもよい。エレクトロポレーション、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅトランスフェクト、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎトランスフェクトなどの、当該分野で既知の方法によって本願に記載のベクターを前記宿主細胞に導入してもよい。

【0109】

別の態様によれば、本願は、前記組換えタンパク質を調製する方法であって、前記組換えタンパク質を発現する条件で、前記細胞を培養することを含む、方法を提供する。例えば、適切な培地、適切な温度及び培養時間などを使用してもよい。

【0110】

医薬組成物、キット及び薬物送達デバイス

【0111】

別の態様によれば、本願は、前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記ポリペプチド及び／又は前記細胞、及び任意選択的に薬学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）を含む医薬組成物を提供する。前記薬学的に許容される担体は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物、塩形成対イオン、金属錯体、及び／又は非イオン性界面活性剤を含んでもよい。本願の医薬組成物は、２つ以上の活性化合物、一般的に互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する化合物を含んでもよい。このような薬物の種類及び有効量は、例えば製剤に存在する拮抗剤の量及び種類、及び対象の臨床パラメータに依存する。本願に記載の医薬組成物は、予防及び／又は治療有効量の前記組換えタンパク質及び／又はポリペプチドを含んでもよい。前記予防及び／又は治療有効量は、罹患している又は発症のリスクがある対象における疾患又は病症及び／又はその任意の合併症を予防及び／又は治療（少なくとも部分的治療）するのに必要な用量である。

【0112】

別の態様によれば、本願は、前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記ポリペプチド及び／又は前記医薬組成物を含むキットを提供する。それは、本願に記載の抗原結合タンパク質、ベクター、核酸分子、細胞、免疫複合体、及び／又は本願に記載の医薬組成物を、一般的に使用される単一の容器に含んでもよく、任意選択的に１種又は複数種の治療剤と組み合わせて、任意選択的にキットに配合されてもよい。

【0113】

別の態様によれば、本願は、前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記ポリペプチド及び／又は前記医薬組成物を含む薬物送達デバイスを提供する。

【0114】

治療方法

【0115】

別の態様によれば、本願は、腫瘍を予防、緩和又は治療する方法であって、前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記ポリペプチド及び／又は前記医薬組成物を、必要がある対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0116】

別の態様によれば、本願は、腫瘍を予防、緩和又は治療するための薬物の調製における、前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記ポリペプチド及び／又は前記医薬組成物の使用を提供する。

【0117】

別の態様によれば、本願は、腫瘍を予防、緩和又は治療するための前記組換えタンパク質、前記単離された核酸分子、前記ベクター、前記細胞、前記ポリペプチド及び／又は前記医薬組成物を提供する。

【0118】

例えば、前記腫瘍は、固形腫瘍及び／又は非固形腫瘍（例えば、血液腫）を含んでもよい。

【0119】

例えば、前記腫瘍は、ＥＧＦＲ発現を有する腫瘍であってもよい。例えば、前記腫瘍は、ＥＧＦＲ発現異常に関連する腫瘍であってもよい。例えば、前記腫瘍は、ＥＧＦＲ過剰発現を有する腫瘍であってもよい。

【0120】

例えば、前記腫瘍は、ＥＧＦＲ変異に関連する腫瘍を含んでもよい。例えば、前記腫瘍は、ＢＲＡＦ変異に関連する腫瘍を含んでもよい。例えば、前記腫瘍は、ＫＲＡＳ変異に関連する腫瘍を含んでもよい。例えば、前記腫瘍は、ＨＥＲ２変異に関連する腫瘍を含んでもよい。

【0121】

例えば、前記腫瘍は、結腸直腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、神経芽腫、卵巣がん、扁平上皮がん及び膵臓がんからなる群より選ばれる１種又は複数種であってもよい。

【0122】

如何なる理論にも制限されることを意図するものではなく、以下の実施例は、本願の発明の各技術的解決手段を説明するものに過ぎず、本願の発明の範囲を限定するものではない。

【0123】

実施例

【0124】

実施例１ ｒＬＺ－８とｒＬＺ－８変異体の発現ベクターの構築

【0125】

（１）ｒＬＺ－８（アミノ酸配列は配列番号１０に示される）ＤＮＡとｒＬＺ－８変異体（アミノ酸配列は配列番号１３に示される）ＤＮＡをそれぞれテンプレートとして、フォワードプライマーＦ及びリバースプライマーＲを使用して、ＰＣＲによりｒＬＺ－８とｒＬＺ－８変異体遺伝子断片を増幅した。取得した遺伝子断片にはＥＡＥＡのＤＮＡ配列が含まれないが、５’末端及び３’末端にはそれぞれＸｈｏ Ｉ及びＸｂａ Ｉ酵素切断部位がある。

【0126】

フォワードプライマーＦ及びリバースプライマーＲの情報は以下の通りである。

【0127】

フォワードプライマーＦ：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡ（配列番号１）

【0128】

リバースプライマーＲ：ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＴＴＧＡＧＣＧＡＴＡ（配列番号２）

【0129】

（２）ｒＬＺ－８（アミノ酸配列は配列番号１０に示される）及びｒＬＺ－８変異体（アミノ酸配列は配列番号１３に示される）遺伝子断片をＸｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ二重酵素で切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して空の発現ベクターに連結し、組換え発現ベクターを取得した。

【0130】

実施例２ ＥＡＥＡ配列を有するｒＬＺ－８とｒＬＺ－８変異体の発現ベクターの構築

【0131】

（１）ピキアコドン優先順位に基づいて、コドン適応指数及びＲＮＡ二次構造分析などの影響を総合的に考慮し、ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８（アミノ酸配列は配列番号１１に示される）及びＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（アミノ酸配列は配列番号１４に示される）に対してコドン最適化を行った。発現ベクターの構築を容易にするために、最適化後のＤＮＡ配列の５’－及び３’－末端にＸｈｏ Ｉ及びＸｂａ Ｉの制限性酵素切断部位をそれぞれ追加し、ＤＮＡ配列を人工的に合成した後、ｐＵＣ５７クローンベクター、即ちｐＵＣ５７－ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８及びｐＵＣ５７－ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体にロードされた。

【0132】

（２）ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８（アミノ酸配列は配列番号１１に示される）ＤＮＡをテンプレートとして、フォワードプライマーＦ３及びフォワードプライマーＲ３を使用して、ＰＣＲによりｒＬＺ－８遺伝子断片を増幅した。取得した遺伝子断片にはＥＡＥＡのＤＮＡ配列が含まれ、５’末端及び３’末端にはそれぞれＸｈｏ Ｉ及びＸｂａ Ｉ酵素切断部位がある。

【0133】

フォワードプライマーＦ３及びフォワードプライマーＲ３の情報は以下の通りである。

【0134】

フォワードプライマーＦ３：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴ（配列番号３）

【0135】

リバースプライマーＲ３：ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＴＴＧ（配列番号４）

【0136】

（３）ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（アミノ酸配列は配列番号１４に示される）ＤＮＡをテンプレートとして、フォワードプライマーＭ１３Ｆ及びリバースプライマーＭ１３Ｒを使用して、ＰＣＲによりｒＬＺ－８変異体遺伝子断片を増幅した。取得した遺伝子断片にはＥＡＥＡのＤＮＡ配列が含まれ、５’末端及び３’末端にはそれぞれＸｈｏ Ｉ及びＸｂａ Ｉ酵素切断部位がある。

【0137】

フォワードプライマーＭ１３Ｆ及びリバースプライマーＭ１３Ｒの情報は以下の通りである。

【0138】

フォワードプライマーＭ１３Ｆ：ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧ（配列番号５）

【0139】

リバースプライマーＭ１３Ｒ：ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ（配列番号６）

【0140】

（４）ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８及びＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体遺伝子断片をＸｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ二重酵素で切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して空の発現ベクターに連結し、組換え発現ベクターを取得した。

【0141】

同様の方法により、Ｎ末端がアミノ酸配列「ＥＡＥＡ」に連結するｒＬＺ－８変異体１（アミノ酸配列は配列番号１６に示される）、ｒＬＺ－８変異体２（アミノ酸配列は配列番号１７に示される）、ｒＬＺ－８変異体３（アミノ酸配列は配列番号１８に示される）、ｒＬＺ－８変異体４（アミノ酸配列は配列番号１９に示される）、ｒＬＺ－８変異体５（アミノ酸配列は配列番号２０に示される）、ｒＬＺ－８変異体６（アミノ酸配列は配列番号２１に示される）の組換えタンパク質をそれぞれ構築した。

【0142】

実施例３ ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ配列を有するｒＬＺ－８とｒＬＺ－８変異体の発現ベクターの構築

【0143】

（１）それぞれＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８ ＤＮＡ（アミノ酸配列は配列番号１２に示される）及びＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（アミノ酸配列は配列番号１５に示される）ＤＮＡをテンプレートとして、フォワードプライマーＦ２及びリバースプライマーＲを使用して、ＰＣＲによりＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８及びＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体遺伝子断片を増幅した。取得した遺伝子断片にはＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫのＤＮＡ配列が含まれ、５’末端及び３’末端にはそれぞれＸｈｏ Ｉ及びＸｂａ Ｉ酵素切断部位がある。

【0144】

フォワードプライマーＦ２及びリバースプライマーＲの情報は以下の通りである。

【0145】

フォワードプライマーＦ２：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＴＡＡＡＡＴＧＴＣＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡ（配列番号７）

【0146】

リバースプライマーＲ：ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＴＴＧＡＧＣＧＡＴＡ（配列番号２）

【0147】

（２）ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８（アミノ酸配列は配列番号１２に示される）及びＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（アミノ酸配列は配列番号１５に示される）遺伝子断片をＸｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ二重酵素で切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して空の発現ベクターに連結し、組換え発現ベクターを取得した。

【0148】

同様の方法によって、Ｎ末端がアミノ酸配列「ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ」に連結するｒＬＺ－８変異体１（アミノ酸配列は配列番号１６に示される）、ｒＬＺ－８変異体２（アミノ酸配列は配列番号１７に示される）、ｒＬＺ－８変異体３（アミノ酸配列は配列番号１８に示される）、ｒＬＺ－８変異体４（アミノ酸配列は配列番号１９に示される）、ｒＬＺ－８変異体５（アミノ酸配列は配列番号２０に示される）、ｒＬＺ－８変異体６（アミノ酸配列は配列番号２１に示される）の組換えタンパク質をそれぞれ構築した。

【0149】

実施例４ ピキア発現菌株の構築

【0150】

（１）コンピテント細胞の調製：

【0151】

ピキア空の菌株をＹＰＤ液体培地に接種し、ＯＤ６００＝１．３～１．５の間になるまで、２８．５℃で１６～１８ｈ培養し、コンピテントを調製した。菌液を３０ｍｉｎ氷浴し、無菌クリーンベンチに置いて各管４０ｍＬで４個の５０ｍＬの遠心分離管に分注した。１５００ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離した。上清を捨て、菌体を収集し、予冷した滅菌再蒸留水１６０ｍＬで細胞を十分に再懸濁させ、１５００ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離した。上清を更に捨て、菌体を収集し、予冷した滅菌再蒸留水８０ｍＬで細胞を十分に再懸濁させ、１５００ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離した。菌体を収集し、予冷滅菌した１Ｍのソルビトール溶液１０ｍＬで細胞を十分に再懸濁させ、１５００ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離した。細菌細胞沈殿を収集し、予冷滅菌した１Ｍのソルビトール溶液５００μＬで再懸濁させて使用に備えた。

【0152】

（２）組換えプラスミドの線形化

【0153】

トランスフェクションして酵母細胞に入り込ませるように、組換えプラスミドをＢｓｐ Ｈ Ｉで線形化した。

【0154】

（３）エレクトロトランスフェクション

【0155】

８０μＬの酵母コンピテント細胞を２ｍｍのエレクトリックカップに取り、５～１０μｇの線形化した組換えプラスミドを加え、均一に混合し、氷上に５ｍｉｎ静置した。エレクトロトランスフェクションパラメータの設定：Ｖ＝１．５ｋｖ、ｕ＝２５μＦ、Ｒ＝２００Ω、放電時間４．５～４．９ｍｓの間であった。エレクトロトランスフェクション後に直ちに１ｍＬの１ＭのＳｏｒｂｉｔｏｌを加え、２８．５℃の温度を維持して１ｈインキュベートした。Ｚｅｏｃｉｎ抗性１００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤＳ固体培地プレートに５０～２００μＬの菌液を塗布した。２８．５℃の温度を維持してインキュベータにおいて２～３日インキュベートした。

【0156】

実施例５ 高発現菌株スクリーニング

【0157】

Ｚｅｏｃｉｎ陽性クローンコロニーを選択し、１０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種して培養し、分光光度計を使用してＯＤ値が約６になるまで６００ｎｍでＯＤ値を検出した。４０μｌ活性化菌液を２５ｍＬの新しいＹＰＤ液体培地に接種し、２８．５℃、２２５ｒｐｍの条件で７２ｈ培養した。１ｍＬの菌液を１３０００ｇ、４℃で低温で遠心分離し、上清を取ってＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、実施例１～３で構築した６つの発現ベクターにおける標的タンパク質の複数のクローンの発現を検出した。

【0158】

高発現酵母菌株のスクリーニング結果は図１～６に示された。ｒＬＺ－８（配列番号１０）、クローンＮｏ．３の発現量が比較的高く（図１）、ｒＬＺ－８変異体（配列番号１３）、クローンＮｏ．１０の発現量が比較的高く（図２）、ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８（配列番号１１）、クローンＮｏ．６の発現量が比較的高く（図３）、ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）クローンＮｏ．７の発現量が比較的高く（図４）、ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８（配列番号１２）、クローンＮｏ．７の発現量が比較的高く（図５）、ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１５）、クローンＮｏ．２の発現量が比較的高かった（図６）。

【0159】

実施例６ 異なるスペーサー配列によるｒＬＺ－８とｒＬＺ－８変異体タンパク質発現への影響

【0160】

（１）

【0161】

実施例５の方法に従って、実施例１～３で構築した複数の発現ベクターにおける標的タンパク質の発現を比較し、結果は図７に示された。

【0162】

ＥＡＥＡは、ｒＬＺ－８（配列番号１０）及びｒＬＺ－８変異体（配列番号１３）発現分泌に対して何れも促進作用を有し、また、ｒＬＺ－８変異体（配列番号１３）に対する促進作用はｒＬＺ－８（配列番号１０）より優れている（図７のレーン１、２、４及び５）。

【0163】

ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫは、ｒＬＺ－８（配列番号１０）及びｒＬＺ－８変異体（配列番号１３）発現分泌に対して何れも促進作用を有し、また、ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫのｒＬＺ－８（配列番号１０）に対する促進作用はｒＬＺ－８変異体（配列番号１３）より優れている（図７のレーン１、３、４及び６）。

【0164】

ＥＡＥＡ及びＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫは、何れもタンパク質発現分泌を向上させる作用を有し、且つ両者の異なるタンパク質発現分泌に対する促進作用が異なり、ここで、ＥＡＥＡがｒＬＺ－８変異体（配列番号１３）に対して最適な促進作用を有する一方（図７のレーン１、２及び３）、ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫがｒＬＺ－８（配列番号１０）に対して最適な促進作用を有する（図７のレーン４、５及び６）。

【0165】

（２）

【0166】

実施例５の方法に従って、実施例１～３で構築した９つの発現ベクターにおける標的タンパク質（ｒＬＺ－８変異体４～ｒＬＺ－８変異体６に基づく）の発現を比較し、結果は図２５に示された。

【0167】

結果は、ＥＡＥＡがタンパク質発現分泌を向上させる作用を有し、また、ｒＬＺ－８変異体４（配列番号１９）、ｒＬＺ－８変異体５（配列番号２０）及びｒＬＺ－８変異体６（配列番号２１）に対して最適な促進作用を有することを示した。

【0168】

実施例７ 組換えタンパク質の構造同定

【0169】

本実施例では、ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８（配列番号１１）、ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）、ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８（配列番号１２）、ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１５）、ｒＬＺ－８（配列番号１０）及びｒＬＺ－８変異体（配列番号１３）タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を測定した。組換えタンパク質をトリプシンで加水分解により処理された後、逆相クロマトグラフィーにより加水分解を経て生成したペプチドセグメントを分離し、質量分析により各ペプチドセグメントのアミノ酸を測定して、Ｎ末端アミノ酸配列を取得した。具体的なステップは以下の通りである。

【0170】

（１）サンプル溶液の調製
組換えタンパク質２５０μｇを取り、２００μｌの１０Ｍ尿素溶液を加え、水で２５０μｌになるまで補充し、均一に混合した後に恒温ミキサーに置いて６５℃で３０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート終了後にサンプルを室温に冷却し、ＳＥＣカラムにより緩衝溶液を０．１Ｍの炭酸水素アンモニウム溶液で置換し、顕微分光光度計で最終タンパク質濃度を測定した。

【0171】

（２）酵素分解

【0172】

５０μｇの供試品タンパク質を取り、０．１Ｍの炭酸水素アンモニウム溶液で０．５μｇ／μｌに希釈し、０．５μｇのトリプシンを加え、均一に混合した後に３７℃で２０ｈインキュベートした。インキュベート終了後、等体積の０．１％のギ酸溶液を加えるか、又は４℃で酵素分解反応を停止し、上記溶液を４℃、１２０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離し、上清を取ってサンプリング分析により検出された。

【0173】

（３）クロマトグラフィー条件及び溶出手順

【0174】

３．１クロマトグラフィー条件

【表1】

【0175】

３．２溶出手順

【表2】

【0176】

結果は、上記組換えタンパク質のＮ末端アミノ酸配列が理論配列と何れも一致することを示した。

【0177】

実施例８ ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体及びＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体による腫瘍細胞への殺傷作用の検出

【0178】

ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＴＭ－Ｆｌｏｕｒ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔキットを使用し、ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）及びＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１５）によるインビトロでの腫瘍細胞（ヒト非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９細胞株）への殺傷作用を測定した。組換えタンパク質を２％のウシ胎児血清培養液で希釈し、濃度が１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、３．１２５μｇ／ｍＬ、１．５６２５μｇ／ｍＬ、０．７８１２５μｇ／ｍＬ、０．３９０６２５μｇ／ｍＬ、０．１９５３１２５μｇ／ｍＬ、０．０９７６５６２５μｇ／ｍＬ、合計１１濃度である供試品溶液を調製した。

【0179】

Ａ５４９細胞を含む９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで上記希釈液を加え、各群の濃度に３つの平行なウェルがあり、それらにマークを付けた。細胞対照群（即ち細胞のみを含む）１００μＬ／ウェルを設定し、６つの平行ウェルがあり、ＣＯ２の濃度が５％、温度が３７℃であるＣＯ２インキュベータに入れて４８ｈ培養した。

【0180】

各ウェルに調製したＣｅｌｌＴｉｔｅｒＴＭ－Ｆｌｏｕｒ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（１ｍｌＬ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌ ＧＦ－ＡＦＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１００μＬを加え、振とうして均一に混合し、ＣＯ２の濃度が５％、温度が３７℃であるＣＯ２インキュベータに入れて３０ｍｉｎ以上インキュベートし、マイクロプレートリーダーを使用して４００ＥＸ／５０５ＥＭの波長で蛍光値を検出し、ＩＣ５０値と計算した。

【0181】

結果は、図２４に示すように（但し、群１と群２は、それぞれＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）及びＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１５）の結果に対応する）、ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）のＩＣ５０は１．２１μｇ／ｍｌ、ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１５）のＩＣ５０は１．９１μｇ／ｍｌであった。結果は、ＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）及びＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１５）が肺がん細胞株Ａ５４９に対して何れも殺傷作用を有し、但しＥＡＥＡ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１４）の殺傷効果がＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ＋ｒＬＺ－８変異体（配列番号１５）より優れることを示した。

【0182】

実施例９ 組換えタンパク質によるインビトロでの腫瘍成長への阻害（ＰＤＸＯモデル）

【0183】

実験の前日（ｄａｙ－１）、スクリーニングを実行するためのオルガノイド（ｏｒｇａｎｏｉｄ）の正しいサイズを定義するために、５０％のＭａｔｒｉｇｅｌを使用して１：１の比率で必要なオルガノイド数を処理した。

【0184】

０日目：オルガノイド接種

【0185】

ａ）１００ｘＤｉｓｐａｓｅ溶液２０μｌを６ウェルプレート（２ｍＬの有機体培地を含む）に加え、各ウェルからオルガノイドを収集した。ｂ）６ウェルプレートをインキュベータに戻し、３７℃で３０分間培養した。ｃ）６ウェルプレートからオルガノイドを収集し、予め湿らせた１００μｍフィルターにより５０ｍＬのプラスチックチューブに移した。ｄ）全てのウェルが１００μｍフィルターによりろ過した後、予め湿らせた２０μｍフィルターによりストリームをろ過した。ｅ）２０μｍフィルターを反転し、新しい５０ｍＬチューブにオルガノイドを回収した。ｆ）対応する培地にオルガノイドを収集して再懸濁させた。オルガノイドを計算して濃度を取得した。ｇ）培地で細胞濃度を適切な濃度に調整した。ｈ）最終濃度が５％ｖ／ｖになるまでＭａｔｒｉｇｅｌを添加し、オルガノイドを氷上に再懸濁させた。ｉ）Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐディスペンサーで４０μＬの細胞懸濁液を３８４ウェルプレートに加えた。接種密度は下記表１に示され、接種密度はオルガノイドの形態及びオルガノイドの成長条件に関係した。ｊ）組換えタンパク質を添加する前にスクリーニングプレートをインキュベータに戻した。接種後の２～４時間に組換えタンパク質溶液を添加してオルガノイドを処理した。実施例で使用する組換えタンパク質のスペーサー配列のアミノ酸配列は配列番号８に示され、ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は配列番号１３に示され、組換えタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１４に示された。

【表3】

【0186】

５日目：検出終了時に検出プレートの発光ＣＴＧシグナルを読み取った。Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐディスペンサーにより、各ウェルに４０μＬのＣＴＧ ３Ｄを添加し、プレート発振器に内容物を５分間混合し、次に室温で暗所で３０分間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで発光シグナ具を読み取った。

【0187】

データ分析：

【0188】

データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５．０を使用してグラフィックにより示された。生存率の計算式は以下に示された。

【0189】

生存率（％）＝（ＬｕｍＴｅｓｔ ａｒｔｉｃｌｅ －ＬｕｍＭｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔｒｏｌ）／（ＬｕｍＮｏｎｅ ｔｒｅａｔｅｄ －ＬｕｍＭｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔｒｏｌ）×１００％。陽性対照（スタウロスポリン、５μＭ）は全て又はほぼ全てのオルガノイドを殺すように設定されているため、培地を陽性対照（スタウロスポリン、５μＭ）と同様に制御した。

【0190】

（１）結腸直腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ）

【表4】

【0191】

結果は、表２、図８～図１１に示すように、配列番号１４に示される組換えタンパク質がＥＧＦＲ野生型（ＣＲ２００３５Ｂ、図８）、ＫＲＡＳ変異（ＣＲ５０４３Ｂ、図９）、ＢＲＡＦ変異（ＣＲ５０８２Ｂ、図１０）及びＥＧＦＲとＫＲＡＳが同時に変異（ＣＲ３０９９Ｂ、図１１）する結腸直腸がん細胞に対して何れも阻害作用を有することが示された。

【0192】

（２）肺がん

【表5】

【0193】

結果は、表３、図１２～図１４に示すように、配列番号１４に示される組換えタンパク質がＥＧＦＲ野生型（ＬＵ１２３５Ｂ、図１４）、ＫＲＡＳ変異（ＬＵ５１６２Ｂ、図１２）及びＢＲＡＦ変異（ＬＵ１１６２４Ｂ、図１３）の肺がん細胞に対して阻害作用を有することが示された。

【0194】

（３）肝臓がん

【表6】

【0195】

結果は、表４、図１５～図１６に示すように、配列番号１４に示される組換えタンパク質がＥＧＦＲ野生型肝臓がん細胞（ＬＩ６６７７Ｂ、図１５及びＬＩ６６６９Ｂ、図１６）に対して阻害作用を有することが示された。

【0196】

（４）乳がん

【表7】

【0197】

結果は、表５、図１７～図１８に示すように、配列番号１４に示される組換えタンパク質がＨＥＲ２変異の乳がん細胞（ＢＲ９４５７Ｂ、図１７及びＢＲ９４６６Ｂ、図１８）に対して阻害作用を有することが示された。

【0198】

（５）胃がん

【表8】

【0199】

結果は、表６、図１９～図２０に示すように、配列番号１４に示される組換えタンパク質がＥＧＦＲ野生型（ＧＡ６８３３Ｂ、図１９）及びＢＲＡＦ変異（ＧＡ２４３４Ｂ、図２０）の胃がん細胞に対して阻害作用を有することが示された。

【0200】

（６）膵臓がん

【表9】

【0201】

結果は、表７、図２１～図２２に示すように、配列番号１４に示される組換えタンパク質がＥＧＦＲ野生型（ＰＡ２００７８Ｂ、図２１）及びＫＲＡＳとＢＲＡＦが同時に変異（ＰＡ０７８７Ｂ，図２２）する膵臓がん細胞に対して何れも阻害作用を有することが示された。

【0202】

実施例１０ 組換えタンパク質によるインビボでの腫瘍成長への阻害（ＰＤＸモデル）

【0203】

本実施例では、肝臓がんＬＩ６６６９同所性移植ＢＡＬＢ／ｃ雄ヌードマウスモデルにおける被験物である配列番号１４に示される組換えタンパク質の薬効を評価した。

【0204】

実験設計：

【0205】

各群の動物数及び詳細な投与経路、用量及び投与計画は下記の表８に示された。

【表10】

【0206】

ここで、ｉ．ｐ．は腹腔内注射を表し、ｉ．ｖ．は尾静脈内注射を表し、ｐ．ｏ．は経口強制投与を表す。

【0207】

この実験の主な観察指標は以下の通りである：

【0208】

相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）、即ちある時点で、治療群と対照群の相対腫瘍体積又は腫瘍重量のパーセンテージである。計算式は以下の通りである：

【0209】

Ｔ／Ｃ％＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（ＴＲＴＶ：治療群平均ＲＴＶ、ＣＲＴＶ：対照群平均ＲＴＶ、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０であり、Ｖ０は群分け時の当該動物の腫瘍体積、Ｖｔは治療後の当該動物の腫瘍体積である）、

【0210】

或いは、Ｔ／Ｃ％＝ＴＴＷ／ＣＴＷ×１００％（ＴＴＷ：実験終了時の治療群の腫瘍平均重量であり、ＣＴＷ：実験終了時の対照群の腫瘍平均重量である）。

【0211】

相対腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）、計算式は以下の通りである。

【0212】

ＴＧＩ％＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％（ＴとＣはそれぞれ、ある特定の時点での治療群と対照群の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）又は腫瘍重量（ＴＷ）である）。

【0213】

実験動物：

【表11】

【0214】

実験動物飼育室の環境条件：

【表12】

【0215】

実験方法：

【0216】

ＬＩ６６６９は、アジア人患者の肝臓がん病変から確立されたＨｕＰｒｉｍｅ(R)同所性移植モデルである。当該モデルには腫瘍が破裂する特定の傾向がある。

【0217】

ＨｕＰｒｉｍｅ(R)肝臓がん同所性移植モデルＬＩ６６６９担腫瘍マウスから腫瘍組織を採取し、直径２～３ｍｍの腫瘍片に切断し、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス肝臓の左上葉に接種した。

【0218】

担腫瘍マウスの平均腫瘍体積が約５０～１５０ｍｍ３に達したら、マウスを体重に基づいて「３．実験設計」の表３に従ってランダムに群分けした。群分けの当日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ１から投与を開始した。群分けの当日は０日目として定義された。

【0219】

マウスの体重に基づいて、ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒＴＭ（バージョン番号３．１．３９９．１９、供給者Ｓｔｕｄｙｌｏｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｃ．、Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して群分けした。

【0220】

「Ｍａｔｃｈｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ」ランダム群分けの方法を選択して群分けし、当該アルゴリズムは、選択した全ての動物個体の体重測定値を、選択した全ての動物の平均値とマッチした。まず、平均値が選択された全ての動物の平均値のペアを選択し、次に当該群の平均値が選択された全ての動物の平均値とマッチする（又はできる限り近接する）ように群に割り当てられた。各群の測定結果の最終平均値は、他の群の最終平均値にできる限り近接する。

【0221】

実験観察及びデータ収集：

【0222】

腫瘍細胞接種後の定期的なモニタリングには、腫瘍成長及び治療による動物の正常な行動への影響が含まれ、具体的な内容には、実験動物の活動、餌と水の摂取量、体重の増減、目、被毛及びその他の異常が含まれた。試験中に観察された臨床症状は全て、生データに記録された。投与開始後、マウスの体重を週に２回測定した。観察により、安楽死を必要とするマウス及び対応する生存期間が記録された。

【0223】

腫瘍体積は、実験終了後、マウスを解剖する時に測定された。腫瘍体積の計算式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝１／２×（ａ×ｂ２）（但し、ａは長径、ｂは短径を表す）。実験では、ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒＴＭ（バージョン号３．１．３９９．１９、供給者Ｓｔｕｄｙｌｏｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｃ．）ソフトウェアを使用し、腫瘍の長径と短径の測定及び動物体重の測定を含むデータを収集し、生データは天秤とノギスで測定した後にソフトウェアに直接導入され、データの何れの変化もこのソフトウェアに記録された。投与、腫瘍測定及び体重の測定などの全てのプロセスは何れも、生物学的安全キャビネット又はクリーンベンチで行われた。

【0224】

統計学的分析：

【0225】

異なる治療群間で特定の日の腫瘍体積を比較するために、最初にＢａｒｔｌｅｔｔ検出を使用して全ての群間の分散均一性の仮定を検証した。Ｂａｒｔｌｅｔｔ検出のｐ値が０．０５以上である場合、一元配置分散分析は、全ての群の平均値が等しいかどうかの検出に使用された。一元配置分散分析のｐ値が０．０５未満である場合、Ｔｕｋｅｙ ＨＳＤ検出を使用して全ての群間でペアごとに比較し、又はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔ検出を使用して各治療群と対照群との間でペアごとに比較した。Ｂａｒｔｌｅｔｔ検出のｐ値が０．０５未満である場合、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検出は、全ての群の中央値が等しいかどうかの検出に使用された。Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検出のｐ値が０．０５未満である場合、Ｃｏｎｏｖｅｒ検出を使用して全ての群間でペアごとに比較し、又は各治療群と対照群との間でペアごとに比較し、複数の検出の群数に基づいて対応するｐ値を修正した。

【0226】

また、探索的データ分析の目的で、任意の時点で全ての群間でペアごとに比較した。このような比較では、特定の時点で比較される２つの群の腫瘍体積データのみを使用するため、複数の検出による修正を必要としなかった。まず、Ｂａｒｔｌｅｔｔ検出を使用して２つの群間の分散均一性の仮定を検証し、Ｂａｒｔｌｅｔｔ検出のｐ値が０．０５以上である場合、Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ検出を使用して２つの群の平均値が等しいかどうかを比較し、Ｂａｒｔｌｅｔｔ検出のｐ値が０．０５未満である場合、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検出を使用して２つの群の中央値が等しいかどうかを比較した。

【0227】

全ての統計学的分析及びグラフィック描画は、Ｒ言語環境（バージョン３．３．１）で実行された。特に明記しない限り、全ての検出は両側検定であり、ｐ値が０．０５未満である場合、統計的に有意であると見なされた。

【0228】

実験結果：

【0229】

結果は表９及び図２３に示された。配列番号１４に示される組換えタンパク質５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．Ｑ３Ｄ）群の生存期間の中央値（２８日より大きい）は対照群（１７日）よりも大きく、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。更に、配列番号１４に示される組換えタンパク質の各群は、明らかなマウス毒性作用が示されなかった。本願の組換えタンパク質は肝臓がんマウスの生存期間を効果的に延長できることが示された。

【表13】

【0230】

注記：ａ．平均値±ＳＥＭ、ｂ．群１との比較。

【0231】

実施例１１ 組換えタンパク質によるインビトロでの有効性実験

【0232】

この実験では、ＥｒｂｉｔｕｘによるＡ４３１細胞株の増殖への阻害作用を陽性対照として、配列番号１４に示される組換えタンパク質による複数のがん細胞株の増殖への阻害作用を調べた。この実験では、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏキットを使用して細胞生存率を検出した。当該試薬には、組換えルシフェラーゼ及びルシフェリンが含まれ、ルシフェラーゼは基質の酸化反応を触媒作用し、冷光シグナルを放出した。当該酸化反応は生細胞の溶解後に放出されたＡＴＰに依存し、反応によって生成された冷光シグナルは生細胞の数を間接的に反映することができる。

【0233】

具体的なステップは以下の通りである。

【0234】

１）標的細胞を収集してカウントし、細胞を９６ウェルプレートに接種した。

【0235】

２）９６ウェルプレートを３７℃の細胞インキュベータに入れ、約１６～２０時間インキュベートした。

【0236】

３）予め調製された測定待ちのサンプル作動液及び陽性対照を対応するウェルに加えた。

【0237】

４）３７℃の細胞インキュベータに７２時間培養し続けた。

【0238】

５）インキュベート終了後、Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ検出試薬作動液を対応するウェルに加え、シグナルを安定させるように室温で放置した。

【0239】

６）ＰＨＥＲＡＳｔａｒ ＦＳＸを使用して読み取って検出した。

【0240】

結果は表１０に示された。配列番号１４に示される組換えタンパク質濃度が０．１ｍｇ／ｍＬの条件で、５６３７、ｈＣＩ－Ｈ２９２、Ｃａｌｕ－１、ＡＣＨＮ、ＡｓＰＣ－１、ＯＶＣＡＲ８、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ、Ｂｅｌ－７４０２、ＳＫ－ＨＥＰ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＨＥＰ Ｇ２、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＨＬＥ、Ａ５４９及びＳＮＵ－３９８に対して何れも一定の成長阻害作用を有した。

【表14】

【0241】

実施例１２ 組換えタンパク質の前臨床安全性評価試験

【0242】

（１）ヒト赤血球のインビトロ溶血実験

【0243】

この実施例では、配列番号１４に示される組換えタンパク質がインビトロでヒト赤血球の溶解又は凝集を引き起こすかどうかを研究した。

【0244】

インビトロ試験管法を使用し、供試品（即ち、配列番号１４に示される組換えタンパク質）によるヒト赤血球の溶解及び凝集への影響を観察し、使用した製剤の濃度は２．５ｍｇ／ｍＬであった。

【0245】

健康な人から赤血球を採取し、塩化ナトリウム注射液で２％（ｖ／ｖ）の懸濁液を調製した。ことなる容量（２．５ｍＬ～２．９ｍＬ）の塩化ナトリウム注射液及びことなる容量（０．５ｍＬ～０．１ｍＬ）の供試品を、２．０ｍＬの２％ヒト赤血球懸濁液が含まれたガラス試験管にそれぞれ加え、同時に３．０ｍＬの塩化ナトリウム注射液及び３．０ｍＬの滅菌注射水を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として２．０ｍＬの２％ヒト赤血球懸濁液が含まれたガラス試験管に加え、各試験管の総体積は５．０ｍＬであり、電気インキュベーターに入れて３時間インキュベートし、赤血球の溶解及び凝集状況を観察した。

【0246】

その結果、供試品管と陰性対照品の塩化ナトリウム注射液管では、赤血球が管の底に沈んでいるのが確認され、上層の溶液が無色透明で、振とう後に管の底の赤血球が均一に分散し、溶血及び凝集が各、陽性対照滅菌注射用水管の溶液が透明な赤色で、層化がなく、管の底に細胞が残留せず、陽性対照品滅菌注射用水管が完全に溶血したことが分かった。

【0247】

以上から分かるように、製剤の濃度が２．５ｍｇ／ｍＬである供試品はインビトロでヒト赤血球に対して溶血作用がなく、赤血球の凝集を引き起こさなかった。

【0248】

（２）バマミニ豚の毒性試験

【0249】

この実施例では、配列番号１４に示される組換えタンパク質をバマミニ豚に静脈内注入した後の毒性反応及びインビボでの代謝状況、及び投与期間終了後の４週間の毒性反応の回復状況を研究した。

【0250】

バマミニ豚４０匹（雄雌それぞれ２０匹）を、各群に雄雌それぞれ５匹で４群にランダムに群分けした。群１に補助剤対照としてプラセボを与え、群２、３、４に供試品（即ち、配列番号１４に示される組換えタンパク質）０．５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ与えた。１日に１回投与し、２８日連続投与で静脈内注入により投与された。投与容量は２ｍＬ／ｋｇ、注入速度は３０ｍＬ／ｋｇ／ｈであった。最初の雄雌それぞれ３匹／群の動物を投与の４週間後（Ｄ２９）に安楽死させ、残りの各群の雄雌それぞれ２匹の動物を、最終投与終了後の回復４週間後（Ｄ５７）に安楽死させた。

【0251】

試験中、動物に対して、臨床観察、体重、体温、心電図、眼科検査、血球数、凝固機能、血液生化学、尿検査、Ｔリンパ球サブセット、抗体検出、毒物動態学、臓器重量、肉眼的観察及び病理組織学的検査を行った。

【0252】

その結果、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇの用量を１日１回、２８日間連続投与でバマミニ豚に繰り返し静脈内注入すると、各群の動物は死亡又は瀕死の状態が見られず、重篤な臨床毒性及び副作用が見られず、各用量群の動物の体重及び体重増加、眼科検査、尿分析、Ｔリンパ球サブセットは何れも毒物学的に有意な変化が見られず、供試品の各用量群Ｄ２９又はＤ５７の臓器重量、臓器重量／脳重量の比は統計的変化が見られず、投与期間終了（Ｄ２９）及び回復期間終了（Ｄ５７）に、肉眼的観察及び顕微鏡検査では何れも供試品に関連する異常な変化が見られなかったことが分かった。

【0253】

（３）呼吸系機能への影響に関する安全性薬理試験

【0254】

この実施例では、配列番号１４に示される組換えタンパク質の静脈内注射投与によるラット呼吸系機能への影響を研究した。

【0255】

ＳＤラット４０匹（雄雌それぞれ２０匹、ＳＰＦグレード）を、各群に１０匹（雄雌それぞれ５匹）で４群にランダムに群分けした。補助剤対照品及び０．５、２、８ｍｇ／ｋｇの供試品（即ち、配列番号１４に示される組換えタンパク質）をそれぞれ投与し、単回静脈内注射により投与された。投与容量は１０ｍＬ／ｋｇであった。投与の前日、投与後の１０ｍｉｎ、２４ｈに動物を記録ボックス内に入れ、動物の呼吸機能指標を検出した。

【0256】

その結果は、補助剤対照群と比較して、供試品群の動物は、投与の前日、投与後の１０ｍｉｎ及び２４ｈに、一回換気量、分時換気量及び呼吸頻度には統計的差異（Ｐ＞０．０５）及び変化傾向が見られなかったことが分かった。

【0257】

従って、０．５、２、８ｍｇ／ｋｇの用量での供試品の単回静脈内注射投与は、ＳＤラット呼吸系機能に明らかな影響を与えなかった。

【0258】

（４）中枢神経系機能への影響に関する安全性薬理試験

【0259】

この実施例では、配列番号１４に示される組換えタンパク質の静脈内注射投与によるラット中枢神経系機能への影響を研究した。

【0260】

ＳＤラット４０匹（雄雌それぞれ２０匹、ＳＰＦグレード）を、各群に１０匹（雄雌それぞれ５匹）で４群にランダムに群分けした。補助剤対照品及び０．５、２、８ｍｇ／ｋｇの供試品（即ち配列番号１４に示される組換えタンパク質）をそれぞれ投与し、単回静脈内注射により投与された。投与容量は１０ｍＬ／ｋｇであった。ブラインド設計では、投与情報は実験観察者に秘密保持し、投与の前日、投与後の１０ｍｉｎ、２４ｈに、同じ実験観察者が機能併用観察法（ＦＯＢ）を使用して動物を観察し、結果を記録した。機能併用観察法には、ゲージ内観察、手掴み観察、開放環境観察、刺激反応観察、前肢爪握力、後肢開放範囲、体温測定などが含まれた。投与後のデータから投与前の値を差し引いて得られたデータを統計的に分析した。

【0261】

その結果、補助剤対照群と比較して、供試品の各群動物は、投与後の１０ｍｉｎ及び２４ｈに、ゲージ内観察、手掴み観察、開放環境観察、刺激反応、前肢爪握力、後肢開放範囲、体温に何れも異常が見られないことが見出された。

【0262】

０．５、２、８ｍｇ／ｋｇの用量での供試品の単回静脈内注射投与は、ＳＤラット中枢神経系機能に明らかな影響を与えなかった。

【0263】

（５）心血管系機能への影響に関する安全性薬理試験

【0264】

この実施例では、配列番号１４に示される組換えタンパク質の静脈内注射投与による意識のあるバマミニ豚の心血管系機能への影響を研究した。

【0265】

８匹のバマミニ豚（雄雌それぞれ４匹、通常グレード）を使用し、クロスオーバー設計により、０．５、３ｍｇ／ｋｇの用量の供試品（即ち、配列番号１４に示される組換えタンパク質）及び補助剤対照を静脈内注入により投与し（供試品０．５ｍｇ／ｋｇと３ｍｇ／ｋｇの用量はそれぞれ、約有効用量の８．４倍と５０．６倍である）、投与容量は２ｍＬ／ｋｇ、投与速度は３０ｍＬ／ｋｇ／ｈであった。投与前の少なくとも２時間～投与後の約４８時間の動物心電図、血圧、体温などの各指標のデータを収集し、検出時点として投与前の１．５ｈ内、投与後の０．２５ｈ（±５ｍｉｎ）、０．５ｈ（±５ｍｉｎ）、１ｈ（±１０ｍｉｎ）、１．５ｈ（±１０ｍｉｎ）、２ｈ（±１０ｍｉｎ）、３ｈ（±１５ｍｉｎ）、４ｈ（±２０ｍｉｎ）、６ｈ（±３０ｍｉｎ）、８ｈ（±４５ｍｉｎ）、１２ｈ（±４５ｍｉｎ）、２４ｈ（±１ｈ）、４８ｈ（±１ｈ）に心電図、血圧、体温などの各指標データに対して統計的に分析及び評価を行った。

【0266】

その結果、補助剤対照と比較して、３ｍｇ／ｋｇの供試品を投与した後、０．５ｈ～６ｈに心拍数が増加した。２ｈ～４ｈにＱＴｃＢ間隔が短縮された。０．５ｈ～６ｈにＴ波電圧が上昇した。

【0267】

補助剤対照と比較して、３ｍｇ／ｋｇの供試品を投与した後、ＲＲ間隔、ＰＲ間隔及びＱＴ間隔で心拍数に関連した変化が発生した。

【0268】

供試品の各用量で、動物の他の心電図指標（ＱＲＳ持続時間、ＱＲＳ電圧、ＳＴセグメント電圧、Ｔｐ－ｅ間隔、Ｐ波幅）、血圧指標（収縮期血圧、拡張期血圧、平均動脈圧、脈圧差）及び体温は、補助剤対照の同じ時点での各指標との比較が、統計的に差がなく（Ｐ＞０．０５）、変化の傾向が見られなかった。

【0269】

有効用量範囲内の供試品の静脈内注入投与は、意識のあるバマミニ豚の心血管機能及び体温に明らかな影響がなかったことが分かった。

【0270】

以上から分かるように、供試品は、有効用量範囲内で潜在的な毒性標的臓器が見られず、不可逆的な毒性が見られず、中枢神経系、呼吸系及び心血管系機能に明らかな影響がなかった。

【0271】

前述の詳細な説明は、解釈や例として提供されたものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。現在、本願に列挙された実施形態に対する様々な変更は、当業者にとって明らかであり、且つ添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内に保持された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【配列表】

2024529557000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-02-08

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

スペーサーペプチド及び組換え霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）免疫調節タンパク質変異体（ｒＬＺ－８変異体）を含む組換えタンパク質であって、
前記ｒＬＺ－８変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、
組換えタンパク質。

【請求項2】

前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１３及び１６～２１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項3】

前記ｒＬＺ－８変異体は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項4】

前記スペーサーペプチドは１～５個のＥＡを含む、
請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項5】

前記スペーサーペプチドは２個のＥＡを含む。
請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項6】

前記スペーサーペプチドは配列番号８～９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項7】

前記スペーサーペプチドは配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項8】

前記スペーサーペプチドは前記ｒＬＺ－８変異体のＮ末端に位置する、
請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項9】

配列番号１４、１５、２２～３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項10】

配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項11】

請求項１に記載の組換えタンパク質をコードする、
単離された核酸分子。

【請求項12】

請求項１１に記載の単離された核酸分子を含む、
ベクター。

【請求項13】

請求項１１に記載の単離された核酸分子を含む、
細胞。

【請求項14】

真核細胞である、
請求項１３に記載の細胞。

【請求項15】

酵母細胞である、
請求項１３に記載の細胞。

【請求項16】

請求項１に記載の組換えタンパク質を含む、
ポリペプチド。

【請求項17】

請求項１に記載の組換えタンパク質を調製する方法であって、
請求項１に記載の組換えタンパク質を発現する条件で、請求項１３に記載の細胞を培養することを含む、
方法。

【請求項18】

請求項１に記載の組換えタンパク質及び任意選択的に薬学的に許容される担体を含む、
医薬組成物。

【請求項19】

請求項１に記載の組換えタンパク質を含む、
キット。

【請求項20】

請求項１に記載の組換えタンパク質を含む、
薬物送達デバイス。

【請求項21】

腫瘍を予防、緩和又は治療するための、請求項１８に記載の医薬組成物。

【国際調査報告】