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▶ ユース バイオ グローバル カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-08
(54)【発明の名称】軟骨関連疾患治療用組成物及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/32 20150101AFI20240801BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20240801BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20240801BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240801BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240801BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240801BHJP
【ＦＩ】
A61K35/32
C12N5/0775
C12N5/077
A61P19/08
A61P19/02
A61P29/00 101
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508478
(86)(22)【出願日】2022-08-11
(85)【翻訳文提出日】2024-03-01
(86)【国際出願番号】 KR2022011985
(87)【国際公開番号】W WO2023018244
(87)【国際公開日】2023-02-16
(31)【優先権主張番号】10-2021-0106922
(32)【優先日】2021-08-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0130412
(32)【優先日】2021-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524053052
【氏名又は名称】ユース バイオ グローバル カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＹＯＵＴＨ ＢＩＯ ＧＬＯＢＡＬ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】＃１２０１，２７３ Ｄｉｇｉｔａｌ－ｒｏ，Ｇｕｒｏ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ ０８３８１，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100130111
【弁理士】
【氏名又は名称】新保 斉
(72)【発明者】
【氏名】ユ、スン ホ
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ジ ヨン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC17
4B065BA30
4B065BD50
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087MA67
4C087NA14
4C087ZA96
4C087ZB15
(57)【要約】
電気刺激を印加して製造した軟骨関連疾患治療用薬学的組成物及びその製造方法に関するものであって、本発明の組成物は、具体的には、外部から由来した成長因子などの導入をせず、幹細胞凝集体に電気刺激のみを加える方式で製造が可能であり、高価な成長因子を使用せずに製造できるので、医療費を画期的に低下できるという長所を有する。また、本発明に係る軟骨関連疾患治療用組成物は、既存の軟骨関連疾患治療のために製造された細胞に比べて、成熟した軟骨細胞のマーカーであるＣＯＬ２を発現していないので、成熟した細胞に比べて免疫関連副作用が低いという長所を有する。
【選択図】図８ｃ
【選択図】図８ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の特徴:（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；
（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる
を有する軟骨前駆細胞又はその凝集体を有効成分として含む
ことを特徴とする軟骨関連疾患治療又は予防用薬学的組成物。
【請求項2】
前記軟骨関連疾患は、骨関節炎（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、関節炎（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、半月板異常（Ｍｅｎｉｓｃｕｓ ｄｅｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、半月板損傷（Ｔｅａｒ ｏｆ ｍｅｎｉｓｃｕｓ）、三角線維軟骨複合体損傷、外傷性軟骨損傷、及び退行性関節炎からなる群から選ばれるものである請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
前記薬学的組成物の有効成分は、前記軟骨前駆細胞と同質性の細胞を９０％以上含むものである請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
前記軟骨前駆細胞は、幹細胞から分化誘導されたものである請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞である請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項6】
前記分化誘導は、電気的刺激によるものである請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項7】
前記電気的刺激は、０超過２０Ｈｚ以下の周波数；
－２０Ｖ以上、２０Ｖ以下の振幅；及び
０超過８０％以下のデューティ比；を有するものである
請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項8】
前記軟骨前駆細胞は、間葉系幹細胞に比べて、ＣＯＬ１及びＣＯＬ５からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子又は遺伝子が暗号化するタンパク質の発現レベルが減少し；間葉系幹細胞に比べて、ＣＯＬ６遺伝子又は遺伝子が暗号化するタンパク質の発現レベルが増加するものである
請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項9】
前記軟骨前駆細胞は、間葉系幹細胞に比べて、ＧＪＢ２、ＧＪＣ１、ＰＥＣＡＭ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ７、ＣＬＤＮ１０及びＣＬＤＮ１９からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子又は遺伝子が暗号化するタンパク質の発現レベルが増加するものである請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項10】
前記薬学的組成物は、軟骨部位に直接移植されやすい投与剤形の形態である請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項11】
前記軟骨前駆細胞の凝集体は、スフェロイドの形態で凝集したものである請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項12】
前記スフェロイドの直径は０．５ｍｍ乃至１．５ｍｍである請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項13】
幹細胞に電気刺激を印加することによって軟骨前駆細胞又はその凝集体を製造する段階を含む、軟骨関連疾患治療又は予防用薬学的組成物の製造方法であって、前記軟骨前駆細胞は、下記の特徴：
（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；
（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる
を有する
ことを特徴とする製造方法。
【請求項14】
下記の特徴：（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；
（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる
を有する軟骨前駆細胞又はその凝集体を、これを必要とする個体に投与する段階を含む
ことを特徴とする軟骨関連疾患治療又は予防方法。
【請求項15】
軟骨関連疾患治療又は予防用薬剤の製造のための下記の特徴：（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；
（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる
を有する
ことを特徴とする軟骨前駆細胞又はその凝集体の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、電気刺激を印加して製造した軟骨関連疾患治療用薬学的組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
関節軟骨の損傷は、数百万人が経験している非常に普遍的な問題である。関節軟骨組織は、無血管性で、且つ幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を有していないので、大人の軟骨再生能力は制限的である。軟骨下骨にまで及ぶ欠陥は、線維又は線維軟骨性組織の形成を誘発し、修復された組織は、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）とは生化学的及び生物機械的に異なり、未成熟退化を経験するようになる。関節に問題が生じた場合は、痛症を起こしたり、動きに多くの制約を受けることになってしまう。過去には、適当な治療法も存在しておらず、今よりも比較的短い平均寿命のために、関節の寿命と実際の寿命との間に大きな差を示していなった。しかし、現在は、高齢化によって寿命が長くなったが、関節の寿命は、各種の環境的要因によって実際の寿命に付いて来ていない。膝を多く使用すると軟骨がすり減ると同時に、膝関節と靭帯に炎症が生じながら退行性関節炎が発生し、大韓民国の６５歳以上の高齢者人口１０人のうち８人が退行性関節炎に罹患している。老人性疾患としてのみ知られていた退行性関節炎は、現代では、誤った生活習慣、無理な運動による外傷性関節炎の増加などで若年層の関節炎を引き起こす要因となっている。
【0003】
このような軟骨関連疾患を治療するために、肋骨軟骨から分離された軟骨細胞を含有する人工軟骨を使用したり（韓国出願番号：１０－２００６－０１０６８１２）、幹細胞などを活用して治療する方法が研究中であるが、幹細胞を活用する方法は、主に高価な成長因子の添加を通じて軟骨細胞に分化させる方法を用いるので、臨床に活用するためには費用問題を解決しなければならない。このような費用及び免疫などの問題が未だに解決されていないので、このような問題を解決した軟骨関連疾患の治療のための治療剤の開発が必要な実情にある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
上記のような背景下で、本発明者等は、成長因子の添加がなくても軟骨関連疾患を治療できる治療剤を開発するために研究・努力した結果、幹細胞に電気刺激を印加する場合、成熟した軟骨細胞のマーカーであるＣＯＬ２を発現しないと共に、軟骨細胞の特徴を有している軟骨前駆細胞に分化できることを確認することによって本発明を完成した。
【0005】
そこで、本発明は、下記の特徴を有する軟骨前駆細胞又はその凝集体を有効成分として含む、軟骨関連疾患治療又は予防用薬学的組成物を提供することを目的とする。（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ）、サフラニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ）及びトルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）からなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる。
【0006】
また、本発明は、幹細胞に電気刺激を印加することによって軟骨前駆細胞又はその凝集体を製造する段階を含む、軟骨関連疾患治療又は予防用薬学的組成物の製造方法として；前記軟骨前駆細胞は、下記の特徴を有する製造方法を提供することを他の目的とする。（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる。
【0007】
また、本発明は、下記の特徴を有する軟骨前駆細胞又はその凝集体を、これを必要とする個体に投与する段階を含む軟骨関連疾患治療又は予防方法を提供することを更に他の目的とする。（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる。
【0008】
また、本発明は、軟骨関連疾患治療又は予防用薬剤の製造のための下記の特徴を有する軟骨前駆細胞又はその凝集体の用途を提供する。（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる。
【0009】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されなく、言及していない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得るだろう。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記の特徴を有する軟骨前駆細胞又はその凝集体を有効成分として含む、軟骨関連疾患治療又は予防用薬学的組成物を提供する。
【0011】
（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；
【0012】
（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる。
【0013】
本発明の一実施例において、前記軟骨関連疾患は、骨関節炎（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、関節炎（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、半月板異常（Ｍｅｎｉｓｃｕｓ ｄｅｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、半月板損傷（Ｔｅａｒ ｏｆ ｍｅｎｉｓｃｕｓ）、三角線維軟骨複合体損傷、外傷性軟骨損傷、及び退行性関節炎からなる群から選ばれるものであってもよい。
【0014】
本発明の他の実施例において、前記薬学的組成物の有効成分は、前記軟骨前駆細胞と同質性（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）の細胞を９０％以上含むものであってもよい。
【0015】
本発明の更に他の実施例において、前記軟骨前駆細胞は、幹細胞から分化誘導されるものであってもよい。
【0016】
本発明の更に他の実施例において、前記幹細胞は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）であってもよい。
【0017】
本発明の更に他の実施例において、前記分化誘導は、電気的刺激によるものであってもよい。
【0018】
本発明の更に他の実施例において、前記電気的刺激は、
０超過２０Ｈｚ以下の周波数；－２０Ｖ以上、２０Ｖ以下の振幅；及び０超過８０％以下のデューティ比；を有するものであってもよい。
０超過２０Ｈｚ以下の周波数；－２０Ｖ以上、２０Ｖ以下の振幅；及び０超過８０％以下のデューティ比；を有するものであってもよい。
【0019】
本発明の更に他の実施例において、前記軟骨前駆細胞は、間葉系幹細胞に比べて、ＣＯＬ１及びＣＯＬ５からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子又は遺伝子が暗号化するタンパク質の発現レベルが減少し；間葉系幹細胞に比べて、ＣＯＬ６遺伝子又は遺伝子が暗号化するタンパク質の発現レベルが増加するものであってもよい。
【0020】
本発明の更に他の実施例において、前記軟骨前駆細胞は、間葉系幹細胞に比べて、ＧＪＢ２、ＧＪＣ１、ＰＥＣＡＭ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ７、ＣＬＤＮ１０及びＣＬＤＮ１９からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子又は遺伝子が暗号化するタンパク質の発現レベルが増加するものであってもよい。
【0021】
本発明の更に他の実施例において、前記薬学的組成物は、軟骨部位に直接移植されやすい投与剤形の形態であってもよい。
【0022】
本発明の更に他の実施例において、前記軟骨前駆細胞の凝集体は、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）の形態で凝集したものであってもよい。
【0023】
本発明の更に他の実施例において、前記スフェロイドの直径は０．５ｍｍ乃至１．５ｍｍであってもよい。
【0024】
また、本発明は、幹細胞に電気刺激を印加することによって軟骨前駆細胞又はその凝集体を製造する段階を含む、軟骨関連疾患治療又は予防用薬学的組成物の製造方法として；前記軟骨前駆細胞は、下記の特徴を提供する。（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる。
【0025】
また、本発明は、下記の特徴を有する軟骨前駆細胞又はその凝集体を、これを必要とする個体に投与する段階を含む軟骨関連疾患治療又は予防方法を提供する。（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる。
【0026】
また、本発明は、軟骨関連疾患治療又は予防用薬剤の製造のための下記の特徴を有する軟骨前駆細胞又はその凝集体の用途を提供する。（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる。
【発明の効果】
【0027】
本発明に係る軟骨関連疾患治療用組成物は、外部から由来した成長因子などの導入をせず、幹細胞凝集体に電気刺激のみを加える方式で製造が可能であり、高価な成長因子を使用せずに製造できるので、医療費を画期的に低下できるという長所を有する。また、本発明に係る軟骨関連疾患治療用組成物は、既存の軟骨関連疾患の治療のために製造された細胞に比べて、成熟した軟骨細胞のマーカーであるＣｏｌ２を発現していないので、成熟した細胞に比べて免疫関連副作用が低いという長所を有する。
【0028】
ただし、本発明の効果は、前記効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明又は特許請求の範囲に記載した発明の構成から推論可能な全ての効果を含む。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1a】細胞に電気刺激を与えることに関する図であって、電気刺激条件及び細胞に電気刺激を与える大略的な状態
【図1b】電気刺激を印加した細胞を位相差顕微鏡で観察した結果
【図1c】アルシアンブルー及びサフラニン－Ｏで染色した細胞を観察した結果
【図1d】Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ生存率／細胞毒性キット（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｋｉｔ）で細胞生存能を確認した結果
【図1e】単一マイクロマスの細胞数を示したもの
【図1f】細胞の膜抗原レベルを確認した結果
【図2a】電気刺激による細胞のカルシウムオシレーションを確認した図であって、Ｆｌｕｏ－４染色を通じてカルシウム移動を確認した結果
【図2b】細胞内のＣａ２＋濃度の変化を時間の流れに沿って確認した結果
【図2c】細胞のＦＩＴＣ強度を確認した結果
【図3a】電気刺激による遺伝子発現変化を確認した図であって、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ分析のためのワークフロー概略図
【図3b】２Ｄ（培養されたＡＤＳＣ）、６時間にわたって電気刺激を印加していない細胞マイクロマス、６時間にわたって電気刺激を印加した細胞マイクロマス、７２時間にわたって電気刺激を印加した細胞マイクロマスの遺伝子発現プロファイルをクラスター化した結果
【図3c】４個のサンプルで差等的に発現された遺伝子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ、ＤＥＧｓ）の発現を示すヒートマップを示した結果（上向きに調節された上位１０個のマーカーは右側に表示する。）
【図4a】電気刺激による軟骨形成マーカーの遺伝子発現を確認した図であって、４個のサンプルで明らかに上向きに調節された上位２０個の遺伝子に対する遺伝子オントロジー分析（ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示した結果
【図4b】電気刺激による軟骨形成マーカーの遺伝子発現を確認した図であって、４個のサンプルで明らかに上向きに調節された上位２０個の遺伝子に対する遺伝子オントロジー分析（ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示した結果
【図4c】電気刺激による軟骨形成マーカーの遺伝子発現を確認した図であって、４個のサンプルで明らかに上向きに調節された上位２０個の遺伝子に対する遺伝子オントロジー分析（ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示した結果
【図4d】ＮＣＢＩのＧＥＯ（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｍｎｉｂｕｓ）を活用して関節軟骨（左側）及び発達中の軟骨細胞（中間、ＢＭ－ＭＳＣｓの軟骨分化、右側）の遺伝子発現プロファイルを比較した結果
【図4e】ＮＣＢＩのＧＥＯ（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｍｎｉｂｕｓ）を活用して関節軟骨（左側）及び発達中の軟骨細胞（中間、ＢＭ－ＭＳＣｓの軟骨分化、右側）の遺伝子発現プロファイルを比較した結果
【図4f】ＮＣＢＩのＧＥＯ（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｍｎｉｂｕｓ）を活用して関節軟骨（左側）及び発達中の軟骨細胞（中間、ＢＭ－ＭＳＣｓの軟骨分化、右側）の遺伝子発現プロファイルを比較した結果
【図4g】軟骨母細胞（又は軟骨芽細胞）であるＧＯ００６０５９１の遺伝子オントロジーデータを活用して軟骨細胞の発達に関与する遺伝子の発現レベルを確認した結果
【図5a】電気刺激による細胞生存能及び細胞核型の変化を確認した図であって、３日間電気刺激を印加した凝縮された細胞マイクロマス及び断片化された細胞を９６－ウェルプレートに移した後、ＣＣＫ－８生存能分析キットで細胞の生存能を確認した結果
【図5b】電気刺激を印加した細胞サンプル別に細胞死関連遺伝子であるＳＨＡＲＰＩＮのｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果
【図5c】マイクロマスの単一細胞レベルで細胞死の程度をＡＯ／ＰＩ（ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ／Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色を通じて確認した結果
【図5d】幹細胞能と関連した遺伝子であるＭＫＩ６７、ＨＭＭＲ及びＴＯＰ２Ａなどの遺伝子の発現ヒートマップを示したもの
【図5e】電気刺激を印加したマイクロマスの細胞で正常核型を確認した結果
【図6a】電気刺激の印加による細胞のコラーゲン発現レベルの変化を確認した図であって、細胞の全てのコラーゲンの発現レベルの変化を微細な細胞数における変化まで含んで示したもの
【図6b】そのうち相当な変化を示したＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ６Ａ１及びＣＯＬ６Ａ３の発現変化を確認したもの
【図6c】ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルをＲＴ－ＰＣＲで確認した結果
【図6d】ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルをウェスタンブロッティングを通じて確認した結果
【図7a】電気刺激の印加によるタイプ１のコラーゲンの遺伝的発現調節を確認した結果を示す図であって、ＴＧＦβ信号伝達と関連したＲＢＦＯＸ２、ＮＦＩＣ、ＹＢＸ１及びＩＤ３などの転写因子遺伝子の発現を確認した結果
【図7b】ＣＯＬ１Ａ１のプロモーター／エンハンサーに結合する転写因子の発現レベルを確認した結果
【図7c】ＴＧＦβスーパーファミリー及びその受容体の発現レベルを示すヒートマップを示したもの
【図7d】遺伝子オントロジーデータポータルを活用してＧＯ０００７０４３（細胞－細胞接合アセンブリ）及びＧＯ００５１４９５（細胞骨格組織の陽性調節）の組織形成関連遺伝子の発現レベルを、電気刺激を印加した細胞での変化を通じて確認した結果
【図7e】遺伝子オントロジーデータポータルを活用してＧＯ０００７０４３（細胞－細胞接合アセンブリ）及びＧＯ００５１４９５（細胞骨格組織の陽性調節）の組織形成関連遺伝子の発現レベルを、電気刺激を印加した細胞での変化を通じて確認した結果
【図8a】電気刺激を印加したスフェロイドを、実験動物であるウサギの後足大腿軟骨に埋め込んだ後、治療効果を確認した図であって、実験の全体的な進行過程を示したもの
【図8b】埋め込んでから１６週後に大腿を摘出し、マイクロＣＴによる軟骨再生を映像撮影で確認した結果
【図8c】埋め込んでから１６週後に大腿を摘出し、マイクロＣＴによる軟骨再生を映像撮影で確認した結果
【図8d】組織病理スライドを製作し、組織学的再生を代表的な軟骨染色方法を通じて確認した結果
【図8e】組織病理スライドを製作し、組織学的再生を代表的な軟骨染色方法を通じて確認した結果
【図8f】組織病理スライドを製作し、組織学的再生を代表的な軟骨染色方法を通じて確認した結果
【図8g】組織病理スライドを製作し、組織学的再生を代表的な軟骨染色方法を通じて確認した結果
【図8h】５匹のウサギの軟骨欠損に対する電気刺激を印加したスフェロイドの再生評価をスコアリングを通じて評価した結果
【図8i】５匹のウサギの軟骨欠損に対する電気刺激を印加したスフェロイドの再生評価をスコアリングを通じて評価した結果
【図8j】５匹のウサギの軟骨欠損に対する電気刺激を印加したスフェロイドの再生評価をスコアリングを通じて評価した結果
【図8k】５匹のウサギの軟骨欠損に対する電気刺激を印加したスフェロイドの再生評価をスコアリングを通じて評価した結果
【図8l】５匹のウサギの軟骨欠損に対する電気刺激を印加したスフェロイドの再生評価をスコアリングを通じて評価した結果
【図8m】実験動物の体重を確認することによって、欠損製作による炎症反応や動物の健康上の問題の影響を受けていないことを確認した結果
【発明を実施するための形態】
【0030】
本発明者等は、高価な成長因子の添加がなくても軟骨関連疾患を治療できる治療剤を開発するために研究・努力した結果、幹細胞に電気刺激を印加する場合、成熟した軟骨細胞のマーカーであるＣｏｌ２を発現しないと共に、軟骨細胞の特徴を有している軟骨前駆細胞に分化できることを確認し、これによって本発明を完成するに至った。
【0031】
そこで、本発明は、下記の特徴を有する軟骨前駆細胞又はその凝集体を有効成分として含む、軟骨関連疾患治療又は予防用薬学的組成物を提供する。
【0032】
（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる。
【0033】
本発明において、Ｃｏｌ２（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ２）は、関節軟骨及び硝子軟骨の基礎を形成するものであって、軟骨の全体のタンパク質の５０％、関節軟骨のコラーゲンのうち８５％～９０％を占める。上記のような特徴を有することから、成熟した軟骨細胞の典型的なマーカーとしてＣｏｌ２が活用されているが、本発明の軟骨前駆細胞は、上記のようなＣｏｌ２を全く発現していないので、成熟した軟骨細胞ではないという事実を確認することができる。
【0034】
本発明において、前記軟骨前駆細胞は、幹細胞、好ましくは、間葉系幹細胞に電気刺激を印加して製造したものであって、間葉系幹細胞の幹細胞能と関連した因子であるＭＫＩ６７、ＴＯＰ２Ａ及びＨＭＭＲなどの増殖マーカーを発現しないので、間葉系幹細胞自体とは異なる。前記軟骨前駆細胞は、軟骨細胞の特徴であるアルシアンブルー、サフラニン－Ｏなどによる基質染色が可能であるので、軟骨細胞と類似する特性を示す。しかし、成熟した軟骨細胞の典型的なマーカーであるＣＯＬ２を全く発現していないので、成熟した軟骨細胞への分化の前段階にある細胞を意味する。成長因子の添加又は遠心分離などの外部的な要因がなくても自然にスフェロイドの形態で凝集することによって、治療のための移植などに容易な剤形として活用され得る。
【0035】
本発明において、「スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）」という用語は、回転楕円体の形態の細胞凝集体を意味するものであって、これを生成するためには、一般的に９６－ウェルでの培養、ハンギングドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ）方法などが活用される。本発明の用途である軟骨関連疾患の治療のためには、細胞又はその凝集体を埋め込む段階が必要であるが、スフェロイド形態は、このような埋め込み過程に適している。埋め込みに使用される細胞凝集体をこのようにスフェロイドの形態で作るために遠心分離などの方法を活用するが、本発明の細胞凝集体は、このような別途の段階を経ず、単純に軟骨前駆細胞への分化誘導のための電気刺激の印加のみでも、移植に容易なスフェロイドの形態を形成することを確認した。
【0036】
前記軟骨関連疾患は、これに制限されないが、骨関節炎（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、関節炎（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、半月板異常（Ｍｅｎｉｓｃｕｓ ｄｅｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、半月板損傷（Ｔｅａｒ ｏｆ ｍｅｎｉｓｃｕｓ）、三角線維軟骨複合体損傷、外傷性軟骨損傷、及び退行性関節炎からなる群から選ばれるものであってもよい。
【0037】
本発明で使用される「予防」という用語は、本発明に係る薬学的組成物の投与によって軟骨関連疾患による症状を抑制させたり、発病を遅延させる全ての行為を意味する。
【0038】
本発明で使用される「治療」という用語は、本発明に係る薬学的組成物の投与によって軟骨関連疾患に対する症状が好転したり、有益に変更される全ての行為を意味する。
【0039】
前記薬学的組成物の有効成分は、前記軟骨前駆細胞と同質性の細胞を９０％以上含むものであってもよく、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上を含むものであってもよい。また、幹細胞から分化されるものであってよく、好ましくは、幹細胞は間葉系幹細胞であってもよい。
【0040】
本発明の間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）は、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞及び筋肉細胞などに分化できる細胞であって、試験管内で特定の培養条件下で軟骨、骨、筋肉、靭帯及び脂肪組織などへの分化誘導が可能である。間葉系幹細胞は、骨髓からの抽出が容易であり、様々な難治性疾患に対する細胞治療剤への利用可能性に対して多くの研究が進められている。軟骨は、再生力が不足しており、一度損傷した後は、これを治療することが非常に難しい。退行性関節炎は、関節の退行性変化によって発生するので、これを完全に停止させることはできなく、現在は薬物療法や物理治療などに依存している。しかし、関節炎を治療する確実な薬物が開発されていない状態であり、ステロイド製剤及び潤滑剤の長期間使用は、軟骨の変性を促進させる結果をもたらす。近年、自己軟骨細胞移植術が開発されたが、軟骨組織の制限、軟骨細胞の試験管培養中の脱分化、高年齢による細胞増殖の限界などが問題として残っている。よって、再生力が豊富な間葉系幹細胞の利用は、生物学的復元が破壊された軟骨を再生するのに効果的な細胞治療剤として応用され得る。細胞治療剤を用いた軟骨再生は、筋骨格系疾患のみならず、消化器系及び泌尿器系などの疾患に応用され得る。すなわち、局所的に軟骨組織を再生させることによって、逆流性食道炎及び尿道逆流などの疾病の治療に応用可能である。
【0041】
本発明の分化誘導は、電気的刺激によるものであってもよく、これに制限されるものではないが、前記電気的刺激の周波数は、０超過２０Ｈｚ以下の周波数を有するものであってもよく、好ましくは、３超過１５Ｈｚ以下の周波数又は５超過１２Ｈｚ以下の周波数を有するものであってもよく、さらに好ましくは、Ｈｚの周波数を有するものであってもよい。前記電気刺激の電圧は、－２０Ｖ以上、２０Ｖ以下の振幅を有するものであってもよく、好ましくは、－１５Ｖ以上、１５Ｖ以下の振幅、さらに好ましくは、－１０Ｖ以上、１０Ｖ以下の振幅を有するものであってもよい。
【0042】
本発明の軟骨前駆細胞は、これに制限されるものではないが、間葉系幹細胞に比べて、ＣＯＬ１及びＣＯＬ５からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子又は遺伝子が暗号化するタンパク質の発現レベルが減少し；間葉系幹細胞に比べて、ＣＯＬ６遺伝子又は遺伝子が暗号化するタンパク質の発現レベルが増加するものであってもよく；間葉系幹細胞に比べて、ＧＪＢ２、ＧＪＣ１、ＰＥＣＡＭ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ７、ＣＬＤＮ１０及びＣＬＤＮ１９からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子又は遺伝子が暗号化するタンパク質の発現レベルが増加するものであってもよい。
【0043】
本発明者等は、具体的な実施例を通じて、本発明の電気的刺激を印加した細胞が軟骨前駆細胞に分化可能であり、これを活用して軟骨関連疾患を治療できることを具体的に確認した。
【0044】
本発明の一実施例において、本発明者等は、イヌ間葉系幹細胞に特定の条件の電気刺激を印加する場合、細胞の凝集が起こることを確認した。細胞凝集体を確認したとき、外因性因子の追加がなくても軟骨前駆細胞への分化が起こることを確認し、アルシアンブルー及びサフラニン－Ｏ染色を行ったとき、基質染色が可能であることを確認し、これは、軟骨細胞の特性を有していることを確認した（実施例２－１参照）。このように製造された細胞の場合、分化過程で発生するカルシウムオシレーションが、電気刺激を印加していない細胞に比べて増加することを確認し、上記のような電気刺激を通じて細胞の凝集が発生し、これを通じて間葉系幹細胞の軟骨前駆細胞への分化が起こることを確認した（実施例２－２参照）。
【0045】
本発明の他の実施例において、特定の条件の電気刺激を印加した間葉系幹細胞の場合、電気刺激を印加したにもかかわらず、生存能の有意な差を確認することができなく（実施例３－２参照）、電気刺激を印加した細胞は、幹細胞能と関連している因子であるＭＫＩ６７、ＴＯＰ２Ａ及びＨＭＭＲなどのマーカーを発現しないので、間葉系幹細胞とは異なると共に（実施例３－３参照）、成熟した軟骨細胞の典型的なマーカーとして使用されているＣｏｌ２を全く発現していないので、成熟した軟骨細胞とは異なることを具体的に確認した（実施例３－４参照）。
【0046】
本発明の更に他の実施例において、ウサギの軟骨部位に欠損を誘導した後、上記のように電気刺激を印加して製造した軟骨前駆細胞をウサギの軟骨欠陥部位に移植した場合、欠陥があった部位を有効なレベルで再生できることを確認した（実施例５参照）。
【0047】
本発明者等は、上記のような結果を通じて、特定の条件の電気刺激を印加する場合、高価な成長因子を別途に添加しないとしても、間葉系幹細胞を間葉系幹細胞及び軟骨細胞と全て異なる軟骨前駆細胞に分化誘導可能であることを確認した。本発明の軟骨前駆細胞は、成熟した軟骨細胞のマーカーであるＣｏｌ２を全く発現しないという相違点を有するので、未成熟した細胞であって、成熟した細胞の移植時に主に発生する問題である免疫関連問題からより自由になると予想される。
【0048】
一方、本発明において、「薬学的組成物」は、疾病の予防又は治療を目的として製造されたものを意味し、それぞれ通常の方法によって多様な形態に剤形化して使用されてもよい。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形に剤形化することができ、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用することができる。
【0049】
本発明に係る薬剤学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。前記薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これに限定されなく、必要によって抗酸化剤、緩衝液などの他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、又は錠剤に製剤化することができる。適切な薬学的に許容される担体及び製剤化に関しては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９５）に開示されている方法を用いて各成分によって好適に製剤化することができる。本発明の薬剤学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤、又は経口摂取剤などに製剤化することができ、移植に容易な剤形の形態、好ましくは、スフェロイドの形態であってもよく、前記スフェロイドの直径は、これに制限されることはないが、０．５ｍｍ乃至１．５ｍｍ、好ましくは０．８ｍｍ乃至１．２ｍｍ、さらに好ましくは１．０ｍｍであってもよい。
【0050】
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内又は局所に適用）することができ、投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適宜選択され得る。
【0051】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／危険の比率で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効用量のレベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素によって決定され得る。
【0052】
本発明に係る薬学的組成物は、個別治療剤として投与されたり、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与されてもよく、単一又は多重投与されてもよい。前記各要素を全て考慮した上で、副作用なしで最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。
【0053】
また、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む軟骨関連疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0054】
本発明で使用される「投与」という用語は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
【0055】
本発明で使用される「個体」という用語は、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒトである霊長類、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシなどの哺乳類を意味する。
【0056】
また、本発明は、前記薬学的組成物の軟骨関連疾患の予防又は治療用途を提供する。
【0057】
また、本発明は、幹細胞に電気刺激を印加することによって軟骨前駆細胞又はその凝集体を製造する段階を含む、軟骨関連疾患治療又は予防用薬学的組成物の製造方法であって；前記軟骨前駆細胞は、下記の特徴を有する製造方法を提供する。（ａ）Ｃｏｌ２を発現しなく；（ｂ）前記軟骨前駆細胞には、アルシアンブルー、サフラニンＯ及びトルイジンブルーからなる群から選ばれる一つ以上によって基質染色が行われる。
【0058】
以下、本発明の理解を促進するために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎなく、下記の実施例によって本発明の内容が限定されることはない。
【実施例】
【0059】
実施例１．実験材料及び実験方法
１－１．１次細胞培養
４ヶ月の雌のビーグル犬３匹の腹部脂肪組織から、３個のバッチ（ｂａｔｃｈｅｓ）分量のイヌ（Ｃａｎｉｎｅ）脂肪由来の幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、以下、ＡＤＳＣ）を収得した。細胞を継代（ｐａｓｓａｇｅ）０で保管し、脂肪細胞、軟骨細胞及び造骨細胞への分化能を評価した。細胞を７５－ｃｍ２フラスコ（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋ、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）にプレーティングし、１０％のＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）及び１Ｘ抗生剤－抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）（ＧＩＢＣＯ）を含む低ブドウ糖のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＧＩＢＣＯ）で培養した。
１－１．１次細胞培養
４ヶ月の雌のビーグル犬３匹の腹部脂肪組織から、３個のバッチ（ｂａｔｃｈｅｓ）分量のイヌ（Ｃａｎｉｎｅ）脂肪由来の幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、以下、ＡＤＳＣ）を収得した。細胞を継代（ｐａｓｓａｇｅ）０で保管し、脂肪細胞、軟骨細胞及び造骨細胞への分化能を評価した。細胞を７５－ｃｍ２フラスコ（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋ、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）にプレーティングし、１０％のＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）及び１Ｘ抗生剤－抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）（ＧＩＢＣＯ）を含む低ブドウ糖のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＧＩＢＣＯ）で培養した。
【0060】
１－２．マイクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）培養及び電気刺激
３乃至５継代のイヌＡＤＳＣを分離した後、１ｘ抗生剤－抗真菌剤及び１ｘＧｌｕｔａＭａｘ（ＧＩＢＣＯ）を含む無血清培地であるｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ）で高密度（２．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）で懸濁させた。マイクロマスを生成するために、１０μｌの細胞懸濁液を３５－ｍｍ２の皿（ｄｉｓｈ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に置き、３７℃の温度及び５％のＣＯ２条件のインキュベーター（Ｎ－Ｂｉｏｔｅｋ、韓国）に付着できるように培養した。培養してから１時間後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ）を添加した。細胞は、細胞の慢性刺激を与えることができる多チャンネル刺激器（ｍｕｌｔｉ－ｃｈａｎｎｅｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）に入れた。イヌ１次ＡＤＳＣのマイクロマスは、２．０Ｈｚ周波数、１０Ｖ／ｃｍ及び１０ｍｓ条件の電気刺激（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ、以下、ＥＳ）の有無を異ならせて培養した。電気刺激を３日間印加した後、凝縮された細胞塊の形成を位相差顕微鏡（ｐｈａｓｅ－ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２，Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を通じて観察した。
３乃至５継代のイヌＡＤＳＣを分離した後、１ｘ抗生剤－抗真菌剤及び１ｘＧｌｕｔａＭａｘ（ＧＩＢＣＯ）を含む無血清培地であるｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ）で高密度（２．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）で懸濁させた。マイクロマスを生成するために、１０μｌの細胞懸濁液を３５－ｍｍ２の皿（ｄｉｓｈ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に置き、３７℃の温度及び５％のＣＯ２条件のインキュベーター（Ｎ－Ｂｉｏｔｅｋ、韓国）に付着できるように培養した。培養してから１時間後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ）を添加した。細胞は、細胞の慢性刺激を与えることができる多チャンネル刺激器（ｍｕｌｔｉ－ｃｈａｎｎｅｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）に入れた。イヌ１次ＡＤＳＣのマイクロマスは、２．０Ｈｚ周波数、１０Ｖ／ｃｍ及び１０ｍｓ条件の電気刺激（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ、以下、ＥＳ）の有無を異ならせて培養した。電気刺激を３日間印加した後、凝縮された細胞塊の形成を位相差顕微鏡（ｐｈａｓｅ－ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２，Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を通じて観察した。
【0061】
１－３．単一細胞準備及びＲＮＡシーケンシング
単一細胞の製造は、室温でＭＡＣＳ組織解離キット（ＭＡＣＳ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ、（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ））及びジェントルＭＡＣＳ解離器（ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ、（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ））を活用して行われた。細胞懸濁液を細胞ろ過器に移した後、完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）で洗浄した。細胞生存率の分析のための生存／死滅分析（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ａｓｓａｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅを活用し、９０％以下の細胞生存率を示すグループはカットオフする。）を行った。ＲＮＡシーケンシングは、マクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｋｏｒｅａ）のＲＮＡ－ｓｅｑ分析サービスを通じて行った。
単一細胞の製造は、室温でＭＡＣＳ組織解離キット（ＭＡＣＳ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ、（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ））及びジェントルＭＡＣＳ解離器（ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ、（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ））を活用して行われた。細胞懸濁液を細胞ろ過器に移した後、完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）で洗浄した。細胞生存率の分析のための生存／死滅分析（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ａｓｓａｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅを活用し、９０％以下の細胞生存率を示すグループはカットオフする。）を行った。ＲＮＡシーケンシングは、マクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｋｏｒｅａ）のＲＮＡ－ｓｅｑ分析サービスを通じて行った。
【0062】
単一細胞ライブラリの製造のために、製造会社の指針に従って約５００個程度の細胞をキャプチャーできるＮｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｌｉｂｒａｒｙ ＆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ３’ Ｖ３．１ゲルビード（Ｇｅｌ ｂｅａｄｓ）を使用し、細胞を１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓプラットホームに処理した。固有にバーコードされたｃＤＮＡライブラリは、単一細胞の液滴（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｄｒｏｐｌｅｔｓ）で逆転写、精製及びＰＣＲ過程を経てＲＮＡから製造することができる。ライブラリは、リード１（ｒｅａｄ １、細胞バーコード及び固有分子識別子［ＵＭＩ］）、８ｂｐインデックスリード（ｉｎｄｅｘ ｒｅａｄ、サンプルバーコード）及び９１ｂｐリード２（ｒｅａｄ ２、ＲＮＡリード）とリード長が２８ｂｐであるＨｉＳｅｑＸ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンシングした。
【0063】
データ分析のためのＦＡＳＴＱファイルを生成するためには、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｖ３．１．０（１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓ）を使用した。このために、データをイヌ（ｃａｎｉｎｅ）の参照ゲノム（ＣａｎＦａｍ３．１ ｒｅｌｅａｓｅ １００）と整列し、ＵＭＩ及び細胞バーコードで遺伝子の発現を測定し、細胞クラスターを決定した後、差等遺伝子発現分析を行った。多くのデータセットに正規化するために、最終集計データセットはＳｅｕｒａｔ ３．１．３によって持って来た。ミトコンドリアの比率が＞０．２である細胞集団は、低いＵＭＩ含量を含む細胞をろ過するためにフィルタリングした。ＵＭＡＰ（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）分析は、統計的に有意な主成分をベースにして行った。全てのクラスターと残り細胞との特異的なマーカー比較は、最小細胞百分率（ｍｉｎｉｍｕｍ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌｓ）の最小分率（ｍｉｎｉｍｕｍ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を活用して決定し、Ｗｉｌｃｏｘ順位合計テストを行い、有意な結果のみを報告した。
【0064】
１－４．オンラインデータベースを活用したゲノム分析
イヌＡＤＳＣの軟骨分化を評価するために、ＮＣＢＩ ＧＥＯ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ）を活用して転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）の変化を分析した。このために、ＧＳＥ３２３９８（成長板軟骨に比べて、ヒトの関節軟骨で変化した上位２５０個の遺伝子）、ＧＳＥ５１８１２（発達してから１７週後にヒト関節軟骨細胞で変化した上位２３９個の遺伝子が、週別に軟骨細胞と比較して６胚発生）、及びＧＳＥ１９６６４（軟骨形成の間、時間の経過と共に健康なヒトＢＭＳＣ（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）で変化した上位１２８個の遺伝子）転写体を使用した。重要なプローブリストを分析するために、ＧＯアノテーション（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）とＰＡＮＴＨＥＲ分類システム（ＰＡＮＴＨＥＲ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。
イヌＡＤＳＣの軟骨分化を評価するために、ＮＣＢＩ ＧＥＯ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ）を活用して転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）の変化を分析した。このために、ＧＳＥ３２３９８（成長板軟骨に比べて、ヒトの関節軟骨で変化した上位２５０個の遺伝子）、ＧＳＥ５１８１２（発達してから１７週後にヒト関節軟骨細胞で変化した上位２３９個の遺伝子が、週別に軟骨細胞と比較して６胚発生）、及びＧＳＥ１９６６４（軟骨形成の間、時間の経過と共に健康なヒトＢＭＳＣ（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）で変化した上位１２８個の遺伝子）転写体を使用した。重要なプローブリストを分析するために、ＧＯアノテーション（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）とＰＡＮＴＨＥＲ分類システム（ＰＡＮＴＨＥＲ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。
【0065】
１－５．カルシウムオシレーション（Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）測定
イヌ１次ＡＤＳＣを２～２．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で懸濁させ、細胞懸濁液１０μｌの液滴をＣｅｌｌＢＩＮＤ表面３５－ｍｍ２の皿（ｄｉｓｈ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に置いた。イヌＡＤＳＣのマイクロマスごとに電気刺激印加の有無（刺激条件：２．０Ｈｚの周波数で１０ｍｓの間に１０Ｖ／ｃｍ）を異ならせて培養した。ＥＳを印加してから１４時間後、プロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ）がないＦｌｕｏ－４試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を製造企業のプロトコルに従って３０分間１：１の比率で培地にローディングした。カルシウムオシレーションは、１０分間インキュベーションなしで４８８ｎｍに１秒露出させて刺激させた後、１ｆｐｓを記録した。蛍光強度の時間経過分析（Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ）は、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２，Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を活用して分析した。
イヌ１次ＡＤＳＣを２～２．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で懸濁させ、細胞懸濁液１０μｌの液滴をＣｅｌｌＢＩＮＤ表面３５－ｍｍ２の皿（ｄｉｓｈ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に置いた。イヌＡＤＳＣのマイクロマスごとに電気刺激印加の有無（刺激条件：２．０Ｈｚの周波数で１０ｍｓの間に１０Ｖ／ｃｍ）を異ならせて培養した。ＥＳを印加してから１４時間後、プロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ）がないＦｌｕｏ－４試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を製造企業のプロトコルに従って３０分間１：１の比率で培地にローディングした。カルシウムオシレーションは、１０分間インキュベーションなしで４８８ｎｍに１秒露出させて刺激させた後、１ｆｐｓを記録した。蛍光強度の時間経過分析（Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ）は、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２，Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を活用して分析した。
【0066】
１－６．総グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）測定
グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ、以下、ＧＡＧ）の測定のために細胞をＰＢＳで洗浄した後、パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）で２０分間固定し、染色前まで４℃で保管した。細胞は、アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ、ＩＨＣ ｗｏｒｌｄ）溶液を用いて室温で３０分間培養したり、サフラニン－Ｏ（Ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ、ＩＨＣ ｗｏｒｌｄ）溶液を用いて室温で１時間にわたって培養した後、蒸留水で複数回濯いだ。ＧＡＧの蓄積は、デジタルＵＳＢカメラを活用して撮影した（Ｍｙ ｆｉｒｓｔ ｌａｂ、ＵＳＡ）
１－７．流動細胞分析（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
前記実施例１－３で準備した単一細胞をＡｌｅｘａ４８８ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ４４（ＭＣＡ１０４１Ａ４８８、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ９０（１２－５９００－４２、ＢＤ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ２９（３０３０２４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ａｌｅｘａ４８８ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ４５（ＭＣＡ１０４２Ｆ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ａｌｅｘａ６４７ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ７３（Ｂｓ－４８３４Ｒ－Ａ６４７、Ｂｉｏｓｓ）、ＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ５４（ＧＴＸ７６２７４、ＧｅｎｅＴｅｘ）、ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ４９ｄ（３０４３０８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ３４（５５９３６９、ＢＤ）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕ／ｄｏｇ ＨＬＡ－ＤＲ（３６１６０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）又はＡＰＣ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ８０（１０４７１４、ＢＤ）を４℃で２０分間処理して染色した。流動細胞分析は、延世大学の臨床研究機関のＢＤ ＬＳＲＩＩ分析サービスを用いて行った。
グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ、以下、ＧＡＧ）の測定のために細胞をＰＢＳで洗浄した後、パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）で２０分間固定し、染色前まで４℃で保管した。細胞は、アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ、ＩＨＣ ｗｏｒｌｄ）溶液を用いて室温で３０分間培養したり、サフラニン－Ｏ（Ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ、ＩＨＣ ｗｏｒｌｄ）溶液を用いて室温で１時間にわたって培養した後、蒸留水で複数回濯いだ。ＧＡＧの蓄積は、デジタルＵＳＢカメラを活用して撮影した（Ｍｙ ｆｉｒｓｔ ｌａｂ、ＵＳＡ）
１－７．流動細胞分析（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
前記実施例１－３で準備した単一細胞をＡｌｅｘａ４８８ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ４４（ＭＣＡ１０４１Ａ４８８、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ９０（１２－５９００－４２、ＢＤ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ２９（３０３０２４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ａｌｅｘａ４８８ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ４５（ＭＣＡ１０４２Ｆ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ａｌｅｘａ６４７ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ７３（Ｂｓ－４８３４Ｒ－Ａ６４７、Ｂｉｏｓｓ）、ＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ５４（ＧＴＸ７６２７４、ＧｅｎｅＴｅｘ）、ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ４９ｄ（３０４３０８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ３４（５５９３６９、ＢＤ）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕ／ｄｏｇ ＨＬＡ－ＤＲ（３６１６０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）又はＡＰＣ ａｎｔｉ－ｄｏｇ ＣＤ８０（１０４７１４、ＢＤ）を４℃で２０分間処理して染色した。流動細胞分析は、延世大学の臨床研究機関のＢＤ ＬＳＲＩＩ分析サービスを用いて行った。
【0067】
１－８．ＲＴ ｑＰＣＲ分析
製造企業のプロトコルに従ってＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、３日間多様な条件で培養されたイヌＡＤＳＣでトータルＲＮＡを分離した。ＲＮＡ濃度は、バイオスペクトロメーター（ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて測定し、逆転写反応は、ＴＯＰｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を用いて０．３μｇ～０．５μｇのトータルＲＮＡで行った。ＧＡＰＤＨ及びＣＯＬ１Ａ１に対するリアルタイムＰＣＲは、１０ｎｇのｃＤＮＡ／チューブが含まれたＳＹＢＲ ２ｘ Ｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とＣＦＸ連結Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて行った。具体的には、サンプルを９５℃で１５分間維持した後、９５℃で１０秒間の変性段階、６０℃で３０秒間の拡張及びアニーリング段階を含む４０回の増幅サイクルを行った。
製造企業のプロトコルに従ってＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、３日間多様な条件で培養されたイヌＡＤＳＣでトータルＲＮＡを分離した。ＲＮＡ濃度は、バイオスペクトロメーター（ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて測定し、逆転写反応は、ＴＯＰｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を用いて０．３μｇ～０．５μｇのトータルＲＮＡで行った。ＧＡＰＤＨ及びＣＯＬ１Ａ１に対するリアルタイムＰＣＲは、１０ｎｇのｃＤＮＡ／チューブが含まれたＳＹＢＲ ２ｘ Ｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とＣＦＸ連結Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて行った。具体的には、サンプルを９５℃で１５分間維持した後、９５℃で１０秒間の変性段階、６０℃で３０秒間の拡張及びアニーリング段階を含む４０回の増幅サイクルを行った。
【0068】
ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現レベルに正規化し、相対的な遺伝子発現レベルは、２－△△ＣＴ方法を用いて計算した。プライマー配列は、Ｐｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴを使用し、下記のように独自に決定した：イヌＧＡＰＤＨ正方向プライマー５’－ＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡ、逆方向プライマー５’－ＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＴＧＡ；イヌＣＯＬ１Ａ１正方向プライマー５’－ＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧＴＣＡ、逆方向プライマー５’－ＣＡＧＡＣＡＧＧＧＣＣＡＡＴＡＴＣＣＡＴ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）。
【0069】
１－９．ウェスタンブロット分析
細胞をｉｃｅ－ｃｏｌｄ ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、ホスファターゼ阻害剤カクテル（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌｓ、ｇｅｎＤＥＰＯＴ）を含有するＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（ＲＩＰＡ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、ｇｅｎＤＥＰＯＴ）で収穫した。タンパク質の濃度は、ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。タンパク質のサンプルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから分離した後、標準手順を用いてＰＶＤＦメンブレン（ＡＴＴＯ）に電気移動（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）させた。０．０５％のＴＢＳＴに溶かした５％の無脂肪粉ミルクでメンブレンを遮断した後、４℃のプラットホーム（ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）で１２時間にわたって１次抗体と共にインキュベーションした。膜を１５分間ＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、ＨＲＰ－接合二次抗体（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＧｅｎｅＴｅｘ）を含むＴＢＳＴで１％の脱脂乳と共に１時間にわたってインキュベーションした。混成化されたメンブレンをＴＢＳＴ緩衝液で洗浄し、向上した化学発光検出キット（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｍｅｒｋ）及びＬＡＳ５００イメージングシステム（ＬＡＳ５００ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて視覚化した。
細胞をｉｃｅ－ｃｏｌｄ ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、ホスファターゼ阻害剤カクテル（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌｓ、ｇｅｎＤＥＰＯＴ）を含有するＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（ＲＩＰＡ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、ｇｅｎＤＥＰＯＴ）で収穫した。タンパク質の濃度は、ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。タンパク質のサンプルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから分離した後、標準手順を用いてＰＶＤＦメンブレン（ＡＴＴＯ）に電気移動（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）させた。０．０５％のＴＢＳＴに溶かした５％の無脂肪粉ミルクでメンブレンを遮断した後、４℃のプラットホーム（ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）で１２時間にわたって１次抗体と共にインキュベーションした。膜を１５分間ＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、ＨＲＰ－接合二次抗体（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＧｅｎｅＴｅｘ）を含むＴＢＳＴで１％の脱脂乳と共に１時間にわたってインキュベーションした。混成化されたメンブレンをＴＢＳＴ緩衝液で洗浄し、向上した化学発光検出キット（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｍｅｒｋ）及びＬＡＳ５００イメージングシステム（ＬＡＳ５００ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて視覚化した。
【0070】
１－１０．核型分析（Ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）
サンプリングのために、ＥＳによって誘導された細胞凝縮物を７０μｍの気孔サイズのナイロンメッシュを用いて均一な単一細胞懸濁液で破壊させた。細胞懸濁液を１５ｍｌのチューブに収集した後、４５０ ｘ ｇで５分間遠心分離した。培地を吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）した後、ペレットを新しい培地に懸濁し、ＧｅｎＤｉｘ ＫａｒｙｏｔｙｐｉｎｇサービスのＧ－ｂａｎｄｉｎｇ染色及び染色体映像分析機システム（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎａｌｙｚｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて核型を分析した。
サンプリングのために、ＥＳによって誘導された細胞凝縮物を７０μｍの気孔サイズのナイロンメッシュを用いて均一な単一細胞懸濁液で破壊させた。細胞懸濁液を１５ｍｌのチューブに収集した後、４５０ ｘ ｇで５分間遠心分離した。培地を吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）した後、ペレットを新しい培地に懸濁し、ＧｅｎＤｉｘ ＫａｒｙｏｔｙｐｉｎｇサービスのＧ－ｂａｎｄｉｎｇ染色及び染色体映像分析機システム（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎａｌｙｚｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて核型を分析した。
【0071】
１－１１．統計分析
全てのデータは、平均±標準偏差で表示した（ｎ＝個別サンプル数）。全ての統計分析は、ＭＳ Ｅｘｃｅｌソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ３６５）を用いて行い、＜０．０５のＰ値は、有意な差を示すものと見なした。
全てのデータは、平均±標準偏差で表示した（ｎ＝個別サンプル数）。全ての統計分析は、ＭＳ Ｅｘｃｅｌソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ３６５）を用いて行い、＜０．０５のＰ値は、有意な差を示すものと見なした。
【0072】
実施例２．幹細胞への電気刺激印加を通じた軟骨前駆細胞の製造
２－１．電気刺激印加によるＡＤＳＣの軟骨化
ＥＳ（１０Ｖ／ｃｍ、１０ｍｓ、２Ｈｚ周波数）でイヌＡＤＳＣ（ＭＳＣ）を刺激した後、刺激によって凝集した細胞を確認した。イヌＡＤＳＣのマイクロマス培養は、血清及び外因性因子を追加せずに行った（図１ａ）。ＥＳを印加してから３日が経過した後、ＥＳ印加の有無による凝集体の軟骨基質関連分子の免疫組織化学染色結果を位相差顕微鏡を通じて確認した。その結果、図１ｂに示したように、ＥＳを印加していない細胞に比べて、ＥＳを印加した細胞でシート形態（ｓｈｅｅｔ ｌｉｋｅ）の細胞凝集及びさらに大きい凝集を確認した。また、ＥＳによって刺激された細胞でアルシアンブルー及びサフラニン－Ｏ染色を行った後で観察したとき、図１ｃに示したように、プロテオグリカンの沈着を確認することができた。
２－１．電気刺激印加によるＡＤＳＣの軟骨化
ＥＳ（１０Ｖ／ｃｍ、１０ｍｓ、２Ｈｚ周波数）でイヌＡＤＳＣ（ＭＳＣ）を刺激した後、刺激によって凝集した細胞を確認した。イヌＡＤＳＣのマイクロマス培養は、血清及び外因性因子を追加せずに行った（図１ａ）。ＥＳを印加してから３日が経過した後、ＥＳ印加の有無による凝集体の軟骨基質関連分子の免疫組織化学染色結果を位相差顕微鏡を通じて確認した。その結果、図１ｂに示したように、ＥＳを印加していない細胞に比べて、ＥＳを印加した細胞でシート形態（ｓｈｅｅｔ ｌｉｋｅ）の細胞凝集及びさらに大きい凝集を確認した。また、ＥＳによって刺激された細胞でアルシアンブルー及びサフラニン－Ｏ染色を行った後で観察したとき、図１ｃに示したように、プロテオグリカンの沈着を確認することができた。
【0073】
ＥＳが細胞の死滅に及ぼす影響を確認するために、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ試薬を使用した生存力評価を行った。その結果、図１ｄに示したように、ＥＳ印加の有無は、細胞の生存力に有意な差を与えないことを確認することができた。また、凝集体は、図１ｅに示したように、約１０５個の細胞を含んでいることを確認した。ＥＳ印加による細胞膜タンパク質の変化を確認するために、表面分子に対する抗体を使用した流動細胞分析を行った。単相で成長するＡＤＳＣと膜タンパク質の発現を比較したとき、図１ｆに示したように、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ５４、ＣＤ３４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ８０は、類似する発現を示すことを確認することができた。
【0074】
本発明者等は、上記のような結果を通じて、ＥＳが、イヌＡＤＳＣの非常に稠密な軟骨形成前の凝縮（ｐｒｅｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）を誘導することを確認することができた。
【0075】
２－２．軟骨化過程でのカルシウムオシレーション確認
ＥＳによる軟骨形成は、軟骨発達で観察される自発的な細胞内のカルシウムオシレーションを再生産することが以前に報告されている。本発明者等は、ＥＳを印加したとき、本発明のイヌＡＤＳＣマイクロマスでも、これと類似するカルシウムオシレーションが発生するかどうかをモニタリングした。Ｆｌｕｏ－４ Ｄｉｒｅｃｔを使用したカルシウム蛍光測定は、図２ａに示したように、ＥＳを印加していない対照群に比べて、ＥＳを受けた細胞塊においてさらに規則的な周波数及び高い振幅で変動することを確認した。より具体的には、図２ｂ及び図２ｃに示したように、電気的に刺激された細胞凝集体は、典型的なカルシウムオシレーションのＣａ２＋変動パターンを示した。このような結果は、外因性因子がないＥＳ印加条件でも、マイクロマス凝集過程の間にＡＤＳＣ細胞内の軟骨形成前の凝縮が誘導されることを示す。
ＥＳによる軟骨形成は、軟骨発達で観察される自発的な細胞内のカルシウムオシレーションを再生産することが以前に報告されている。本発明者等は、ＥＳを印加したとき、本発明のイヌＡＤＳＣマイクロマスでも、これと類似するカルシウムオシレーションが発生するかどうかをモニタリングした。Ｆｌｕｏ－４ Ｄｉｒｅｃｔを使用したカルシウム蛍光測定は、図２ａに示したように、ＥＳを印加していない対照群に比べて、ＥＳを受けた細胞塊においてさらに規則的な周波数及び高い振幅で変動することを確認した。より具体的には、図２ｂ及び図２ｃに示したように、電気的に刺激された細胞凝集体は、典型的なカルシウムオシレーションのＣａ２＋変動パターンを示した。このような結果は、外因性因子がないＥＳ印加条件でも、マイクロマス凝集過程の間にＡＤＳＣ細胞内の軟骨形成前の凝縮が誘導されることを示す。
【0076】
実施例３．電気刺激によって製造された軟骨前駆細胞の特性確認
３－１．転写体プロファイルの確認
ＥＳによって刺激された細胞の塊から単一細胞を分離した。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリは、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットホームで準備され、データは、データ分析のためのツールキットである標準Ｓｅｕｒａｔによって持って来た。細胞の転写体プロファイルを確認するための全体の実験は、図３ａに示した。具体的には、Ｌｏｕｐｅ Ｃｅｌｌ Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて正規化されたデータセットを分析し、可変性の高い遺伝子を識別し、１２個のクラスターを４個のデータセットに細分化した（図３ｂ）。また、図３ｃに示したように、２Ｄ ＡＤＳＣが、表現型と機能において、ＥＳを印加した細胞マイクロマスと転写体部分で相当の相違点を有することを発見した。
３－１．転写体プロファイルの確認
ＥＳによって刺激された細胞の塊から単一細胞を分離した。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリは、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットホームで準備され、データは、データ分析のためのツールキットである標準Ｓｅｕｒａｔによって持って来た。細胞の転写体プロファイルを確認するための全体の実験は、図３ａに示した。具体的には、Ｌｏｕｐｅ Ｃｅｌｌ Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて正規化されたデータセットを分析し、可変性の高い遺伝子を識別し、１２個のクラスターを４個のデータセットに細分化した（図３ｂ）。また、図３ｃに示したように、２Ｄ ＡＤＳＣが、表現型と機能において、ＥＳを印加した細胞マイクロマスと転写体部分で相当の相違点を有することを発見した。
【0077】
オープンソースＧＯ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎとＰＡＮＴＨＥＲデータベース分析道具を使用し、４個のデータセットの遺伝子発現パターンを探索した。６時間にわたってＥＳを印加したＡＤＳＣマイクロマスで陽性子イオン輸送（ｐｒｏｔｏｎ ｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、オルニチン代謝（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、生物発生（ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及びカルシウムイオンの出入り（ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ ｉｍｐｏｒｔ／ｒｅｌｅａｓｅ）と関連した各遺伝子が上向きに調節されることを確認した（図４ａ）。ＥＳを印加していない細胞マイクロマスでは、軟骨凝縮（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）、カルシウムイオン膜横断輸送（ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、骨格筋組織発達（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、ＮＦ－κＢ経路（ＮＦ－κＢ ｐａｔｈｗａｙ）及び免疫細胞の化学走化性（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）と関連した遺伝子が上向きに調節されることを確認した（図４ｂ）。７２時間にわたってＥＳを印加した細胞マイクロマスは、プロスタグランジン合成（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、多細胞有機体発達（ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、アルギニン異化作用（ａｒｇｉｎｉｎｅ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ）及び細胞死陰性調節（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）と関連した遺伝子が上向きに調節されることを確認した（図４ｃ）。
【0078】
上記のような遺伝子発現パターンの役割を理解するために、公開的に利用可能な軟骨前駆細胞分化（ｐｒｅｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）遺伝子発現データ細胞との比較を行った。その結果、図４ｄ乃至図４ｆに示したように、７２時間にわたってＥＳを印加した細胞マイクロマスは、胚軟骨形成凝縮（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｃｏｎｄｅｓａｔｉｏｎ）から関節軟骨細胞分化（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の間に上向きに調節された相当の数の遺伝子が軟骨形成前の変化（ｐｒｅｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ）を誘導することを確認した。軟骨母細胞（ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）の分化と関連した核心因子を識別するための研究を行ったとき、骨軟骨前駆細胞でのＲＵＮＸ２とＳＯＸ９との間の均衡は、軟骨細胞と造骨細胞の分化に必須な役割をすることが確認された。ＥＳを印加したマイクロマスに対する現在のデータは、ＲＵＮＸ２及びその抑制因子ＮＫＸ３．２のレベルが軟骨前駆細胞の典型的な量に特異的に変更されたことを示す（図４ｅ）。
【0079】
本発明者等は、上記のような結果を通じて、ＥＳによって触発されたイヌＡＤＳＣの凝縮が軟骨母細胞発達段階と類似する表現型を誘導することを確認した。
【0080】
３－２．生存能の確認
ＥＳによる生理的ストレスは、多くの細胞過程に影響を及ぼし、多様な生理的及び病理学的結果をもたらし得るので、ＥＳ刺激を３日間印加したＡＤＳＣに対して、ＣＣＫ－８ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔを用いて細胞生存能を確認した。その結果、図５ａに示したように、ＥＳ刺激印加は、イヌＡＤＳＣマイクロマスの生存力に影響を及ぼさないことを確認することができた。ＧＯデータベース分析を行ったときにも、図５ｂに示したように、電気的露出が細胞死と関連した遺伝子であるＳＨＡＲＰＩＮの発現に影響を与えないことを確認した。細胞マイクロマスを機械的及び酵素的に解離させて製造した単一ＡＤＳＣ懸濁液にＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）染色を行った。その結果、図５ｃに示したように、ＰＩ染色された細胞数は、ＥＳ印加の有無と関係がないことが確認された。
ＥＳによる生理的ストレスは、多くの細胞過程に影響を及ぼし、多様な生理的及び病理学的結果をもたらし得るので、ＥＳ刺激を３日間印加したＡＤＳＣに対して、ＣＣＫ－８ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔを用いて細胞生存能を確認した。その結果、図５ａに示したように、ＥＳ刺激印加は、イヌＡＤＳＣマイクロマスの生存力に影響を及ぼさないことを確認することができた。ＧＯデータベース分析を行ったときにも、図５ｂに示したように、電気的露出が細胞死と関連した遺伝子であるＳＨＡＲＰＩＮの発現に影響を与えないことを確認した。細胞マイクロマスを機械的及び酵素的に解離させて製造した単一ＡＤＳＣ懸濁液にＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）染色を行った。その結果、図５ｃに示したように、ＰＩ染色された細胞数は、ＥＳ印加の有無と関係がないことが確認された。
【0081】
３－３．軟骨前駆細胞への分化の有無確認
成体幹細胞は、成長している一般的な細胞と比較するとき、ＭＫＩ６７、ＴＯＰ２Ａ及びＨＭＭＲなどの代表的な増殖マーカーを発現する。上記のような増殖マーカーは、図５ｄに示したように、ＥＳ印加の有無とは関係なく、凝集した細胞で発現されないことを確認した。このようにＥＳを印加した細胞で核型を観察した結果、図５ｅに示したように、核型の変化が発生しないことを確認した。
成体幹細胞は、成長している一般的な細胞と比較するとき、ＭＫＩ６７、ＴＯＰ２Ａ及びＨＭＭＲなどの代表的な増殖マーカーを発現する。上記のような増殖マーカーは、図５ｄに示したように、ＥＳ印加の有無とは関係なく、凝集した細胞で発現されないことを確認した。このようにＥＳを印加した細胞で核型を観察した結果、図５ｅに示したように、核型の変化が発生しないことを確認した。
【0082】
本発明者等は、上記のような結果を通じて、細胞が凝集する場合、これ以上幹細胞ではない成熟した細胞類型への分化が進められることを確認した。
【0083】
３－４．コラーゲン生成レベルの変化確認
軟骨細胞の主な機能は、コラーゲンタイプ２、４、６、１０、１１、１２及び１４などの細胞外基質を合成することであるので、本発明のＥＳを印加した細胞の分化有無を確認するためにコラーゲン生成レベルを確認した。その結果、図６ａに示したように、ＥＳ刺激の有無とは関係なく、イヌＡＤＳＣのマイクロマスでＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ５Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ６Ａ５、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ１３Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ２１Ａ１、ＣＯＬ２３Ａ１、ＣＯＬ２４Ａ１、ＣＯＬ２４Ａ１及びＣＯＬ２７Ａ１の発現が増加することを確認した。そのうち、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２及びＣＯＬ６Ａ１／３の発現は、ＡＤＳＣマイクロマスで強力且つ均一に増加することを確認した。ＥＳを印加した細胞の場合、ＥＳを印加していない場合に比べて、ＣＯＬ６Ａ３及びＣＯＬ１６Ａ１がマイクロマスで全体的に抑制されることを確認した。
軟骨細胞の主な機能は、コラーゲンタイプ２、４、６、１０、１１、１２及び１４などの細胞外基質を合成することであるので、本発明のＥＳを印加した細胞の分化有無を確認するためにコラーゲン生成レベルを確認した。その結果、図６ａに示したように、ＥＳ刺激の有無とは関係なく、イヌＡＤＳＣのマイクロマスでＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ５Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ６Ａ５、ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ１３Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ２１Ａ１、ＣＯＬ２３Ａ１、ＣＯＬ２４Ａ１、ＣＯＬ２４Ａ１及びＣＯＬ２７Ａ１の発現が増加することを確認した。そのうち、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２及びＣＯＬ６Ａ１／３の発現は、ＡＤＳＣマイクロマスで強力且つ均一に増加することを確認した。ＥＳを印加した細胞の場合、ＥＳを印加していない場合に比べて、ＣＯＬ６Ａ３及びＣＯＬ１６Ａ１がマイクロマスで全体的に抑制されることを確認した。
【0084】
しかし、ＭＳＣの軟骨形成と共に発現され、成熟した軟骨細胞のマーカーとして知られているＣｏｌ２の場合、図６ｂに示したように、ＥＳ印加の有無とは関係なく、発現されないことを確認することができた。既存の間葉系幹細胞に電気刺激を印加し、幹細胞を軟骨細胞に分化させる方法を開示している既出願特許（ＫＲ１０－２０１５－００４７３６１）では、比較例を通じて、成熟した軟骨細胞のマーカーとして使用されるＣｏｌ２の発現が、成長因子を添加した間葉系幹細胞及び電気刺激を印加した間葉系幹細胞の全てにおいて有意なレベルに増加したことを確認したが、本発明の電気刺激を印加した細胞凝集体は、これとは異なり、Ｃｏｌ２を全く発現していないことを確認した。
【0085】
一方、コラーゲンタイプ１に対するＥＳの効果を確認するために、ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行った。その結果、図６ｃに示したように、ＥＳを印加した細胞の場合、そうでない細胞に比べてＣＯＬ１Ａ１の発現が大きく増加することを確認した。ＣＯＬ１Ａ１の発現は、ウェスタンブロッティングを通じて確認したときにも、図６ｄに示したように発現が大きく増加することを確認した。
【0086】
３－５．電気刺激印加によるコラーゲン調節関連因子の発現確認
コラーゲンタイプ１を選定し、電気刺激によって発現レベルが変化するメカニズムを分析した。メカニズムの分析のために、多様なソースのエンハンサーを統合したＧｅｎｅＨａｎｃｅｒで提供するオープンソースデータベースを活用した。ＥＳを印加した細胞でＣＯＬ１Ａ１の発現と関連があることで知られている転写因子ＮＲ４Ａ１、ＲＢＦＯＸ２、ＮＦＩＣ、ＩＤ３、ＨＤＧＦ、ＢＭＩ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＨＬＴＦ及びＳＭＣ３のレベルは、時間の経過と共に相当減少することを確認した（図７ａ）。これとは反対に、ＴＣＦ１２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＡＴＦ４、ＡＲＩＤ４Ｂ、ＳＭＡＲＣＡ５、ＧＴＦ２Ｆ１、ＬＡＲＰ７、ＨＤＡＣ２及びＹＹ１などの転写因子は、ＥＳを印加した後、７２時間にわたって細胞マイクロマスで増加することを確認した（図７ｂ）。
コラーゲンタイプ１を選定し、電気刺激によって発現レベルが変化するメカニズムを分析した。メカニズムの分析のために、多様なソースのエンハンサーを統合したＧｅｎｅＨａｎｃｅｒで提供するオープンソースデータベースを活用した。ＥＳを印加した細胞でＣＯＬ１Ａ１の発現と関連があることで知られている転写因子ＮＲ４Ａ１、ＲＢＦＯＸ２、ＮＦＩＣ、ＩＤ３、ＨＤＧＦ、ＢＭＩ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＨＬＴＦ及びＳＭＣ３のレベルは、時間の経過と共に相当減少することを確認した（図７ａ）。これとは反対に、ＴＣＦ１２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＡＴＦ４、ＡＲＩＤ４Ｂ、ＳＭＡＲＣＡ５、ＧＴＦ２Ｆ１、ＬＡＲＰ７、ＨＤＡＣ２及びＹＹ１などの転写因子は、ＥＳを印加した後、７２時間にわたって細胞マイクロマスで増加することを確認した（図７ｂ）。
【0087】
前記各因子は、ＴＧＦβ信号伝達と関連があるので、ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルに変化をもたらす。ＣＯＬ１Ａ１と関連のある転写因子の発現が増加するにもかかわらず、ＣＯＬ１Ａ１の発現は有意に減少した。このような結果を通じて、前記転写因子以外の他の要因がＣＯＬ１Ａ１の発現に影響を与えていることを確認した。
【0088】
実施例４．本発明の軟骨前駆細胞の組織形成能確認
細胞骨格でのＥＳの役割を確認するために、細胞－細胞接合（ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を含む細胞骨格組織（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を具体的に調節する遺伝子の発現を確認した。その結果、図７ｄ及び図７ｅに示したように、軟骨細胞外基質（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）の機能に必須なものとして報告されたコネキシン（Ｃｏｎｎｅｘｉｎｓ（ＧＪＢ２／ＧＪＣ１））、細胞接着タンパク質（ＰＥＣＡＭ１）及びクローディン（ｃｌａｕｄｉｎｓ（ＣＬＤＮ２／ＣＬＤＮ７／ＣＬＤＮ１０／ＣＬＤＮ１９））の発現が有意に上向きに調節されることを確認した。
細胞骨格でのＥＳの役割を確認するために、細胞－細胞接合（ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を含む細胞骨格組織（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を具体的に調節する遺伝子の発現を確認した。その結果、図７ｄ及び図７ｅに示したように、軟骨細胞外基質（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）の機能に必須なものとして報告されたコネキシン（Ｃｏｎｎｅｘｉｎｓ（ＧＪＢ２／ＧＪＣ１））、細胞接着タンパク質（ＰＥＣＡＭ１）及びクローディン（ｃｌａｕｄｉｎｓ（ＣＬＤＮ２／ＣＬＤＮ７／ＣＬＤＮ１０／ＣＬＤＮ１９））の発現が有意に上向きに調節されることを確認した。
【0089】
このような結果は、前記実施例２－１のＧＡＧ染色結果と符合する。細胞マイクロマスにＥＳを印加する場合、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）を構成する二つのＧＡＧであるコンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）及びケラタン硫酸（ｋｅｒａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）の生合成と関連した遺伝子の相当高い発現を誘導する。このようなデータは、電気刺激が軟骨前駆細胞への分化を直接誘導することができ、軟骨基質及び軟骨前駆細胞の可塑性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を刺激し、硝子軟骨を復旧できることを意味する。
【0090】
実施例５．本発明の軟骨前駆細胞の生体内の治療効果確認
電気刺激を印加した軟骨前駆細胞凝集体の軟骨組織への分化及び組織生着による軟骨の組織学的再生及び復旧を生体内で確認するために、４ｋｇ以上の骨成熟が完了した実験用ニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷ ｒａｂｂｉｔ）の大腿軟骨に４ｍｍの直径（ウサギの平均軟骨の厚さ０．３ｍｍ）の小さい軟骨欠損部位を生成し、８個の電気刺激凝集体を埋め込んだ後、フィブリングルーを塗布することによって凝集体を固定した。本実験の全体的な進行過程は、図８ａに示した。埋め込んだ電気刺激凝集体は、イヌの脂肪油由来の間葉系幹細胞から由来するので、異種間の移植を考慮した上で、免疫抑制剤であるサイクロスポリンを１日１回静脈投与（１０ｍｇ／ｋｇ）し、２週以内に適用したり、又は正常な健康状態を示さない場合は直ぐ中断した。埋め込んでから１６週を経過したとき、剖検によって大腿軟骨を摘出した後、マイクロ単位の解像度を有するマイクロＣＴ撮影を通じて大腿軟骨の欠損及び再生を映像撮影を通じて獲得したイメージで評価した。その結果、図８ｂ及び図８ｃに示したように、電気刺激を印加した凝集体を埋め込んだ欠損部位は、４ヶ月後、埋め込まれた部位で軟骨層として評価される範囲を収復することが確認された。
電気刺激を印加した軟骨前駆細胞凝集体の軟骨組織への分化及び組織生着による軟骨の組織学的再生及び復旧を生体内で確認するために、４ｋｇ以上の骨成熟が完了した実験用ニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷ ｒａｂｂｉｔ）の大腿軟骨に４ｍｍの直径（ウサギの平均軟骨の厚さ０．３ｍｍ）の小さい軟骨欠損部位を生成し、８個の電気刺激凝集体を埋め込んだ後、フィブリングルーを塗布することによって凝集体を固定した。本実験の全体的な進行過程は、図８ａに示した。埋め込んだ電気刺激凝集体は、イヌの脂肪油由来の間葉系幹細胞から由来するので、異種間の移植を考慮した上で、免疫抑制剤であるサイクロスポリンを１日１回静脈投与（１０ｍｇ／ｋｇ）し、２週以内に適用したり、又は正常な健康状態を示さない場合は直ぐ中断した。埋め込んでから１６週を経過したとき、剖検によって大腿軟骨を摘出した後、マイクロ単位の解像度を有するマイクロＣＴ撮影を通じて大腿軟骨の欠損及び再生を映像撮影を通じて獲得したイメージで評価した。その結果、図８ｂ及び図８ｃに示したように、電気刺激を印加した凝集体を埋め込んだ欠損部位は、４ヶ月後、埋め込まれた部位で軟骨層として評価される範囲を収復することが確認された。
【0091】
上記のような結果を確認するために、軟骨基質染色を行った。その結果、図８ｃ乃至図８ｇに示したように電気刺激を印加した凝集体を埋め込んだ場合、軟骨基質染色としてアルシアンブルー、トライクロム、サフラニンＯの組織染色スライドで欠損に対する埋め込まれた凝集体の組織学的評価で正常軟骨組織の特性と類似する軟骨細胞への分化及び軟骨基質の回復を確認することができた。また、生体内で長期間の生着、周辺の正常軟骨との連結、及び下部の骨組織との滑らかな組織接合性を示すことを確認した。このような結果は、上記で確認した組織病理染色結果と符合する。
【0092】
これをスコアリングした図表において、５匹のウサギで平均的に有意な再生及び回復を確認し、その結果を図８ｈ乃至図８ｍに示した。このようなデータでは、実験動物の軟骨欠損部位又は埋め込んだ凝集体部位で炎症が観察されておらず、実験動物の体重変化及び肉眼観察を通じてヘルスモニタリングを実施したとき、異常症状が観察されないことを確認し、埋め込んだ凝集体の効力を評価するにおいて追加的な影響は考慮されなかった。
【0093】
以上で述べた本発明の説明は、例示のためのものであって、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想や必須な特徴を変更せずとも他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解できるだろう。そのため、以上で記述した各実施例は、全ての面で例示的なものであって、限定的なものではない。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図4e】
【図4f】
【図4g】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図7e】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図8e】
【図8f】
【図8g】
【図8h】
【図8i】
【図8j】
【図8k】
【図8l】
【図8m】
【国際調査報告】