▶ シージェイ チェイルジェダング コーポレイションの特許一覧
特表2024-529732新規なアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体及びそれを用いたＬ－バリン生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-08
(54)【発明の名称】新規なアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体及びそれを用いたＬ－バリン生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/00 20060101AFI20240801BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20240801BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240801BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240801BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240801BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240801BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240801BHJP
C12P 13/08 20060101ALI20240801BHJP
【ＦＩ】
C12N9/00 ZNA
C12N15/52 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P13/08 D
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509348
(86)(22)【出願日】2022-03-30
(85)【翻訳文提出日】2024-02-16
(86)【国際出願番号】 KR2022004474
(87)【国際公開番号】W WO2023027284
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】10-2021-0110890
(32)【優先日】2021-08-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514199250
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】オ、ヘナ
(72)【発明者】
【氏名】キム、ソン ヘ
(72)【発明者】
【氏名】イ、ヒソク
(72)【発明者】
【氏名】ユン、ヒョジン
(72)【発明者】
【氏名】ユン、ビョン フン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ジュ－ヨン
(72)【発明者】
【氏名】チェ、ソン ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】シム、ジヒョン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE05
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA08
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA24X
4B065AA24Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
本出願は、新規なアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）変異体を含むＬ－バリンを生産する微生物及び前記微生物を用いたＬ－バリンの生産方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列において４４番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）変異体。
【請求項2】
前記変異体は、さらに配列番号１のアミノ酸配列において４２番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものである、請求項１に記載の変異体。
【請求項3】
前記変異体は、配列番号１の４４番目の位置に対応するアミノ酸がアラニンで置換されたものである、請求項１に記載の変異体。
【請求項4】
前記変異体は、配列番号１の４４番目の位置に対応するアミノ酸がアラニンで、４２番目の位置に対応するアミノ酸がバリンで置換されたものである、請求項２に記載の変異体。
【請求項5】
前記変異体は、配列番号３で記載されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の変異体。
【請求項6】
前記変異体は、配列番号５で記載されたアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の変異体。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項8】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項9】
請求項１～６のいずれか一項に記載の変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、微生物。
【請求項10】
前記微生物は、配列番号１のポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物と比較してＬ－バリン生産能が増加した、請求項９に記載の微生物。
【請求項11】
前記微生物は、コリネバクテリウム属微生物である、請求項９に記載の微生物。
【請求項12】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項１１に記載の微生物。
【請求項13】
請求項９に記載の微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－バリン生産方法。
【請求項14】
前記培地で目的物質を回収する段階；をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、新規なアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）変異体を含むＬ－バリンを生産する微生物及び前記微生物を用いたＬ－バリンの生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－アミノ酸は、タンパク質の基本構成単位であり、薬品原料と食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として使用される。特に、分岐鎖アミノ酸（Ｂｒａｃｈｅｄ Ｃｈａｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，ＢＣＡＡ）は、必須アミノ酸であるＬ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシンを総称するものであり、前記分岐鎖アミノ酸は、抗酸化効果及び筋肉細胞のタンパク質合成作用を直接的に促進させる効果があることが知られている。
【0003】
一方、微生物を用いた分岐鎖アミノ酸の生産は、主に、エシェリキア属微生物またはコリネパクテリウム属微生物を通じて行われ、ピルビン酸から種々の段階を経てケトイソカプロン酸（２－ｋｅｔｏｉｓｏｃａｐｒｏａｔｅ）を前駆体として生合成されることが知られている［特許文献１、特許文献２］。しかし、前記微生物を通じたＬ－分岐鎖アミノ酸の生産は、工業的に大量製造が容易ではない問題がある。
【0004】
このような背景の下で本発明者らは、微生物を用いたＬ－バリンの生産能を向上させるための目的として微生物のＬ－バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子ｉｌｖＮ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ）の活性が強化された変異型を導入した時、Ｌ－バリンの生産能が顕著に増加することを確認した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】韓国登録特許第１０－０２２００１８号公報
【特許文献2】韓国登録特許第１０－０４３８１４６号公報
【特許文献3】米国特許第７６６２９４３号明細書
【特許文献4】米国特許第１０５８４３３８号明細書
【特許文献5】米国特許第１０２７３４９１号明細書
【特許文献6】韓国登録特許第１０－１１１７０２２号公報
【特許文献7】韓国登録特許第１０－０９２４０６５号公報
【特許文献8】国際公開第２００８－０３３００１号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５］：２４４４
【非特許文献2】Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７
【非特許文献3】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３
【非特許文献4】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４）
【非特許文献5】Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３ （１９９０）
【非特許文献6】Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４
【非特許文献7】［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／。］（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３
【非特許文献8】Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２
【非特許文献9】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）
【非特許文献10】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５
【非特許文献11】Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９
【非特許文献12】Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、９．５０－９．５１，１１．７－１１．８
【非特許文献13】Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０，Ｖｏｌ．２．１－１６
【非特許文献14】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２
【非特許文献15】“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ” ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１）
【非特許文献16】ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９
【非特許文献17】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐｐ ４５６－４６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、Ｌ－バリン生産を増大させる新規なアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体を含むＬ－バリンを生産する微生物及び前記微生物を用いたＬ－バリンの生産方法を開発し、本出願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本出願の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列において４４番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）変異体を提供することにある。
【0009】
本出願のもう一つの目的は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することにある。
本出願の他の一つの目的は、本出願の変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を提供することにある。
本出願の他の一つの目的は、本出願の変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を提供することにある。
【0010】
本出願の他の一つの目的は、前記微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－バリン生産方法を提供することにある。
本出願の他の一つの目的は、本出願の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクターまたは本出願のポリヌクレオチドを含む微生物；それを培養した培地；またはそれらのうちの２以上の組み合わせを含むＬ－バリン生産用組成物を提供することにある。
本出願の他の一つの目的は、本出願の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクターまたは本出願のポリヌクレオチドを含む微生物；それを培養した培地；またはそれらのうちの２以上の組み合わせを含むＬ－バリン生産用組成物を提供することにある。
【0011】
本出願の他の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列において４４番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体のＬ－バリン生産用途を提供する。
【発明の効果】
【0012】
本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体を含む、微生物を培養する場合、既存の非変形ポリペプチドを有する微生物に比べて高収率のＬ－バリン生産が可能である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。即ち、本出願で開示された多様な要素の全ての組み合わせが、本出願の範囲に属する。また、以下に記載される具体的な記述により本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。また、本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として組み込まれ、本出願が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【0014】
前記目的を達成するための一態様として、本出願は、配列番号１のアミノ酸配列において４４番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）変異体を提供する。
【0015】
本出願において、用語「Ｌ－バリン」とは、必須アミノ酸の一つであり、構造的にＬ－ロイシン、Ｌ－イソロイシンと共に分岐鎖アミノ酸に該当する化学式（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨであるＬ－アミノ酸を意味する。
【0016】
本出願において、用語「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」は、Ｌ－バリン生合成において最初の酵素であり、アセト乳酸シンターゼとも呼ばれる。アセトヒドロキシ酸シンターゼは、ピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）のデカルボキシル化（ｄｅｃａｒｂｏｙｘｌａｔｉｏｎ）と他のピルビン酸分子との縮合反応を触媒し、バリンの前駆体であるアセト乳酸を生産したり、ピルビン酸のデカルボキシル化と２－ケト酪酸（２－ｋｅｔｏｂｕｔｙｒａｔｅ）との縮合反応を触媒し、イソロイシンの前駆体であるアセトヒドロキシブチレートを生産することができる。
【0017】
アセトヒドロキシ酸シンターゼは、ｉｌｖＢ及びｉｌｖＮ、両遺伝子によりコードされ、ｉｌｖＢ遺伝子はアセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニット（ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）を、ｉｌｖＮ遺伝子はアセトヒドロキシ酸シンターゼの小サブユニット（ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ）をそれぞれコードする。このうち、ｉｌｖＮ遺伝子によりコードされる小サブユニットがフィードバック阻害に大いに関与すると考えられる。
【0018】
前記ｉｌｖＮ遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼは、特にこれに制限されないが、配列番号１のアミノ酸配列を有することができる。
本出願の前記変異体は、既存のアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）アミノ酸配列において、特異的位置のアミノ酸が置換され、活性が強化されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願の前記変異体は、既存のアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）アミノ酸配列において、特異的位置のアミノ酸が置換され、活性が強化されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0019】
一つの具現例として、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に１以上または２以上のアミノ酸の置換を含む、アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）変異体であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0020】
具体的には、本出願の変異体は、配列番号１の４４番目の位置及び／又は４２番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。より具体的には、前記変異体は、前記位置でいずれか一つ以上または両位置もしくはこれらの対応する位置において他のアミノ酸で置換されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0021】
前記「他のアミノ酸」は、置換前のアミノ酸と異なるものであれば、制限されない。例えば、「配列番号１において４４番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された」と記載する場合、スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）を除いたアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）、アスパルテート（ａｓｐａｒｔａｔｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）またはロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）で置換されることを意味し、「配列番号１において４２番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された」と記載する場合、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）を除いたバリン、アスパラギン、グリシン、アルギニン、アスパルテート、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、セリン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンまたはスレオニンで置換されることを意味し得るが、これに制限されるものではない。
【0022】
一方、当業者であれば、当業界において知られている配列アラインメントを通じて任意のアミノ酸配列において本出願の配列番号１の４４番目、４２番目の位置に対応するアミノ酸を把握することができ、本出願において別途に記載しなくても「特定の配列番号において特異的位置のアミノ酸」を記載する場合、任意のアミノ酸配列においてそれと「対応する位置のアミノ酸」まで含む意味であることは自明である。したがって、配列番号１の配列番号１の４４番目、４２番目の位置に対応するアミノ酸で構成された群から選択されるいずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列も本出願の範囲に含まれる。
【0023】
一例として、配列番号１の４４番目、４２番目の位置に対応するアミノ酸中、１以上または２以上アミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合、非置換された（非変形された）アミノ酸配列より高い活性を有する変異体を提供することができる。
【0024】
具体的には、本出願の変異体は、前記配列番号１の４４番目及び／又は４２番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよいが、これに制限されない。
【0025】
具体的な例として、本出願の変異体は、配列番号１の４４番目の位置に対応するアミノ酸であるスレオニンがアラニンで及び／又は４２番目の位置に対応するアミノ酸であるアラニンがバリンで置換されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0026】
より具体的な例として、本出願の変異体は、配列番号３または配列番号５で記載されたアミノ酸配列を有するか、前記アミノ酸配列で必須的に成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0027】
また、本出願の変異体は、前記配列番号３または配列番号５で記載されたアミノ酸配列だけでなく８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９９％以上の相同性を有する変異体であり、配列番号１のＮ－末端から４４番のアミノ酸及び／又は４２番のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものを含むことができる。また、そのような相同性または同一性を有し、本出願の変異体に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本出願の範囲内に含まれることは自明である。
【0028】
例えば、前記アミノ酸配列のＮ－末端、Ｃ－末端及び／または内部に本出願の変異体の機能を変更しない配列の追加または欠失、自然に起こり得る突然変異、サイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）または保存的置換を有する場合である。
【0029】
本出願において用語「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、あるアミノ酸を類似の構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸で置換させることを意味する。そのようなアミノ酸の置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）における類似性に基づいて起こり得る。例えば、正で荷電された（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン、及びヒスチジンを含み；負で荷電された（酸性）アミノ酸は、グルタミン酸及びアスパルテートを含み；芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを含み、疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンを含む。また、アミノ酸は、電荷を帯びる（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ）側鎖を有するアミノ酸と電荷を帯びない（ｕｎｃｈａｒｇｅｄ）側鎖を有するアミノ酸に分類することができ、電荷を帯びる側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンを含み、電荷を帯びない側鎖を有するアミノ酸は、さらに非極性（ｎｏｎｐｏｌａｒ）アミノ酸または極性アミノ酸（ｐｏｌａｒ）に分類することができ、非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン．メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、極性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンを含むことに分類することができる。通常、保存性置換は、生成されたポリペプチドの活性にほぼ影響を及ぼさないか、または影響を及ぼさない。通常、保存的置換は、タンパク質またはポリペプチドの活性にほぼ影響を及ぼさないか、または影響を及ぼさない。
【0030】
また、変異体は、ポリペプチドの特性と２次構造に最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含み得る。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）タンパク質の移転（ｔｒａｎｓｆｅｒ）に関与するタンパク質のＮ－末端のシグナル（またはリーダー）配列とコンジュゲートすることができる。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製、または合成可能に、他の配列またはリンカーとコンジュゲートすることができる。
【0031】
本出願において用語、「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、一つ以上のアミノ酸が保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び／又は変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）され、前記変異体の変異前のアミノ酸配列と異なるが、機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）または特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が維持されるポリペプチドを指す。そのような変異体は、一般に、前記ポリペプチドのアミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸を変形し、前記変形ポリペプチドの特性を評価して同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）することができる。即ち、変異体の能力は、変異前のポリペプチドに比べて増加するか、変化しないか、または減少する。また、一部の変異体は、Ｎ－末端リーダー配列または膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）などの一つ以上の部分が除去された変異体を含み得る。他の変異体は、成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ－及び／又はＣ－末端から一部分が除去された変異体を含み得る。前記用語「変異体」は、変異型、変形、変異型ポリペプチド、変異タンパク質、変異及び変異体などの用語（英語表現では、ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｍｕｔａｎｔ、ｍｕｔｅｉｎ、ｄｉｖｅｒｇｅｎｔなど）を混用することができ、変異された意味で使用される用語であれば、これに制限されない。本出願の目的上、前記変異体は、配列番号１の４４番目の位置に対応するアミノ酸であるスレオニンがアラニンで置換された、配列番号３で記載されたアミノ酸配列；または配列番号１の４４番目の位置に対応するアミノ酸であるスレオニンがアラニンで置換され、４２番目の位置に対応するアミノ酸であるアラニンがバリンで置換された、配列番号５で記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【0032】
本出願において用語、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列相互間の類似の程度を意味し、百分率で表すことができる。用語の相同性及び同一性は、しばしば互換的に使用することができる。
【0033】
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準的な配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に使用することができる。実質的に、相同性を有したり（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に、配列の全体または一部と中程度または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイゼーションすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドにおける一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。
【0034】
任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定することができる。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３（１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／。］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。
【0035】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含む）及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）により開示されているように、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５の加重比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
【0036】
本出願の一例として、本出願の変異体は、Ｌ－バリンを生産する微生物の突然変異によるものであってもよい。前記微生物の突然変異は、当該分野において広く知られている様々な手段により行うことができ、物理的あるいは化学的突然変異の発生のいずれか一つの方法を用いることができる。例えば、本発明に適した化学的突然変異の誘発要因としてＮ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，ＮＴＧ）、ジエポキシブタン、エチルメタンスルホナート、マスタード化合物、ヒドラジン及び亜硝酸を含むが、このような化合物に制限されるものではない。また、物理的な突然変異の誘発要因は、紫外線及びガンマ放射線を含むことができるが、これに制限されない。
【0037】
本出願において、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）は、その発現が強化されてもよく、前記発現の強化によりＬ－バリンの生産能の増加をもたらすことができる。
【0038】
本出願において、用語「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」とは、ポリペプチドで列挙される位置のアミノ酸残基であるか、またはポリペプチドで列挙される残基と類似または同一または相同のアミノ酸残基を指す。対応する位置のアミノ酸を確認することは、特定の配列を参照する配列の特定のアミノ酸を決定することであってもよい。本出願で使用される「対応する領域」は、一般に、関連タンパク質または参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）タンパク質における類似または対応する位置を指す。
【0039】
例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１と整列（ａｌｉｇｎ）させ、これに基づいて前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基と対応するアミノ酸残基の数字の位置を参照して番号付けすることができる。例えば、本出願に記載されているような配列整列アルゴリズムは、クエリシーケンス（「参照配列」ともいう）と比べてアミノ酸の位置、または置換、挿入または欠失などの変形が発生する位置を確認することができる。
【0040】
このような整列には、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅｍａｎプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）などを用いることができるが、これに制限されず、当業界に知られている配列整列プログラム、ペアワイズ配列（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。
【0041】
本出願のもう一つの態様は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することである。
本出願において用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）で一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本出願において用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）で一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【0042】
本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３または配列番号５で記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことができる。本出願の一例として、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４または配列番号６の配列を有するか、または含むことができる。また、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４または配列番号６の配列からなるか、必須に構成されてもよい。
【0043】
本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）または本出願の変異体を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、本出願の変異体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われ得る。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４または配列番号６の配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満である塩基配列を有するか、含むか、または配列番号４または配列番号６の配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列からなるか、または必須に構成されてもよいが、これらに制限されない。このとき、前記相同性または同一性を有する配列において、配列番号３または配列番号５の４４番目の位置に対応するアミノ酸をコードするコドンは、アラニンをコードするコドンのうちの一つであってもよく、配列番号５の４２番目の位置に対応するアミノ酸をコードするコドンは、バリンをコードするコドンのうちの一つであってもよい。
【0044】
また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から製造することができるプローブ、例えば、本出願のポリヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることができる配列であれば、制限なく含まれる。前記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、９．５０－９．５１，１１．７－１１．８参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイゼーションし、それより相同性または同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイゼーションしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件を列挙することができる。
【0045】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、二つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語「相補的」は、互いにハイブリダイゼーション可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関し、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願のポリヌクレオチドは、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含み得る。
【0046】
具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用い、上述の条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよく、これに制限されるのではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節することができる。
【0047】
前記ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性程度に依存し、変数は当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、同上）。
【0048】
本出願のもう一つの態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することである。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチドを微生物で発現させるための発現ベクターであってもよいが、これに制限されない。
【0049】
本出願において、用語「ベクター」は、適切な宿主内で目的ポリペプチドを発現させることができるように、適切な発現調節領域（または発現調節配列）に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ製造物を含み得る。前記発現調節領域は、転写を開始し得るプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含み得る。ベクターは、適切な微生物内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノム自体に統合することができる。
【0050】
本出願で使用されるベクターは、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
【0051】
一例として細胞内における染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行われてもよいが、これらに限定されない。前記染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーを使用することができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存するか、または他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【0052】
本出願における用語「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを微生物または微生物内に導入し、微生物内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、微生物内で発現できる限り、微生物の染色体内に挿入されて位置するか、または染色体外に位置するかに関係なく、それらの全部を含み得る。また、前記ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、微生物内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態でも導入することができる。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体で発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で微生物に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位、及び翻訳終結信号を含み得る。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で微生物に導入され、微生物で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに制限されない。
【0053】
また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。
【0054】
本出願のもう一つの態様は、本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドを含む、微生物を提供することである。
本出願の微生物は、本出願の変異型ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを含んでもよい。
本出願の微生物は、本出願の変異型ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを含んでもよい。
【0055】
本出願において用語、「微生物（または、菌株）」とは、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が生じた微生物を全て含み、外部遺伝子が挿入されたり、または内在的遺伝子の活性が強化されたり、不活性化されるなどの原因により、特定の機序が弱化または強化された微生物であり、所望のポリペプチド、タンパク質または産物の生産のために遺伝的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む微生物であってもよい。本出願において「微生物」、「菌株」、「微生物」は、同一の意味として制限なく混用され得る。
【0056】
具体的には、前記微生物は、コリネバクテリウム属微生物、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0057】
本出願の菌株は、本出願の変異体、本出願のポリヌクレオチド及び本出願のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれか一つ以上を含む菌株；本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドを発現するように変形された菌株；本出願の変異体、または本出願のポリヌクレオチドを発現する菌株（例えば、組換え菌株）；または本出願の変異体活性を有する菌株（例えば、組換え菌株）であってもよいが、これらに制限されない。
【0058】
本出願の菌株は、Ｌ－バリンを生産する微生物であってもよい。
本出願において、用語「Ｌ－バリンを生産する微生物」とは、Ｌ－バリンを生物体内で生産することができる原核または真核微生物の菌株をいう。本発明の目的上、前記微生物は、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体を含めてＬ－バリンを生産することができる微生物であれば、原核細胞または真核細胞の両方とも可能であり、その例としてコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物の菌株を含むことができ、その例としてコリネバクテリウム・グルタミカムが挙げられる。
本出願において、用語「Ｌ－バリンを生産する微生物」とは、Ｌ－バリンを生物体内で生産することができる原核または真核微生物の菌株をいう。本発明の目的上、前記微生物は、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体を含めてＬ－バリンを生産することができる微生物であれば、原核細胞または真核細胞の両方とも可能であり、その例としてコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物の菌株を含むことができ、その例としてコリネバクテリウム・グルタミカムが挙げられる。
【0059】
前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体を含むＬ－バリンを生産する微生物は、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする染色体上の遺伝子が突然変異され、本発明によるアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体配列を含む微生物または／及び前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを導入させ、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体を含む微生物を全て含むが、これらに制限されない。
【0060】
また、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体を含むＬ－バリンを生産する微生物は、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体の活性が親株に比べて強化したものであってもよい。
【0061】
一例として、本出願の菌株は、本出願のポリヌクレオチドまたは本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、本出願の変異体を発現する細胞または微生物であり、本出願の目的上、本出願の菌株は、本出願の変異体を含めてＬ－バリンを生産することができる全ての微生物を含み得る。例えば、本出願の菌株は、天然の野生型微生物、またはＬ－バリンを生産する微生物に本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドが導入されることによりアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）変異体が発現され、Ｌ－バリン生産能が増加した組換え菌株であってもよい。前記Ｌ－バリン生産能が増加した組換え菌株は、天然の野生型微生物またはアセトヒドロキシ酸シンターゼ非変形微生物（即ち、野生型アセトヒドロキシ酸シンターゼ（配列番号１）を発現する微生物または変異型（配列番号３または配列番号５）タンパク質を発現しない微生物）に比べてＬ－バリン生産能が増加した微生物であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0062】
一例として、前記生産能が増加した組換え菌株は、変異前の親株または非変形微生物のＬ－バリン生産能に比べて約１％以上、具体的には、約１％以上、約２．５％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約１０．５％以上、約１１％以上、約１１．５％以上、約１２％以上、約１２．５％以上、約１３％以上、約１３．５％以上、約１４％以上、約１４．５％以上、約１５％以上、約１５．５％以上、約１６％以上、約１６．５％以上、約１７％以上、約１７．５％以上、約１８％以上約１８．１％以上、約１８．２％以上、約１８．３％以上、約１８．４％以上または約１８．５％以上（上限値に特別な制限はなく、例えば、約２００％以下、約１５０％以下、約１００％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下または約１５％以下であってもよい）が増加されたものであってもよいが、変異前の親株または非変形微生物の生産能に比べて＋値の増加量を有する限り、これらに制限されない。他の例において、前記生産能が増加した組換え菌株は変異前の親株または非変形微生物に比べて、Ｌ－バリン生産能が約１．１倍以上、約１．１２倍以上、約１．１３倍以上、約１．１４倍以上、約１．１５倍以上、約１．１６倍以上、約１．１７倍以上または１．１８倍以上（上限値に特別な制限はなく、例えば、約１０倍以下、約５倍以下、約３倍以下、約２倍以下、約１．５倍以下または約１．２倍以下であってもよい）が増加されたものであってもよいが、これに制限されない。前記用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などをすべて含む範囲であり、約という用語に続く数値と同等又は類似の範囲の数値を全て含むが、これに制限されない。
【0063】
本出願において、用語「非変形微生物」とは、微生物に自然に生じ得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株または天然型菌株自体であるか、自然的または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する前の菌株を意味する。例えば、前記非変形微生物は、本明細書に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット（ｉｌｖＮ）の変異体が導入されていないか、または導入される前の菌株を意味する。前記「非変形微生物」は、「変形前の菌株」、「変形前の微生物」、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」または「基準微生物」と混用され得る。
【0064】
本出願のまた他の一例として、本出願の微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・スタチオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）またはコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよい。
【0065】
本出願において用語、ポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。前記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上方制御（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上方制御、過剰発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを全て含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化した場合、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が、内在的活性に比べて「強化」、「上方制御」、「過剰発現」または「増加」するとは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。
【0066】
前記強化は、外来のポリペプチドを導入するか、または内在的なポリペプチドの活性強化及び／又は濃度（発現量）を通じて達成することができる。前記ポリペプチドの活性の強化有無は、当該ポリペプチドの活性程度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。
【0067】
前記ポリペプチドの活性の強化は、当該分野においてよく知られた様々な方法の適用が可能であり、目的のポリペプチドの活性を変形前の微生物より強化させることができる限り、制限されない。具体的には、分子生物学の日常的な方法である当業界の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を利用したものであってもよいが、これに制限されない（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０，Ｖｏｌ．２．１－１６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
【0068】
具体的には、本出願のポリペプチド活性の強化は、
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形するか、または化学的に修飾；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に制限されるものではない。
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形するか、または化学的に修飾；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に制限されるものではない。
【0069】
より具体的には、
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの微生物内への導入により達成されるものであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、微生物内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、微生物内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが微生物内に導入されることにより行うことができるが、これらに制限されない。前記ベクターは、前述の通りである。
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの微生物内への導入により達成されるものであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、微生物内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、微生物内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが微生物内に導入されることにより行うことができるが、これらに制限されない。前記ベクターは、前述の通りである。
【0070】
前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（または発現調節配列）を活性の強力な配列での交換は、例えば、前記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換またはそれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び解読の終結を調節する配列などを含み得る。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターと交換させることであってもよいが、これらに制限されない。
【0071】
公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（米国特許第７６６２９４３号明細書）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国特許第１０５８４３３８号明細書）、Ｏ２プロモーター（米国特許第１０２７３４９１号明細書）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これらに制限されない。
【0072】
前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これらに制限されない。
【0073】
前記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換またはそれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行うことができるが、これらに制限されない。このときに使用されるベクターは、染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、前述の通りである。
【0074】
前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの微生物内の導入であってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限はない。前記導入に用いられる方法は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりポリペプチドが生成し、その活性が増加されてもよい。
【0075】
本出願において、用語「導入」とは、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体をコードするポリヌクレオチドまたはそれを含むベクターを微生物に伝達する方法を意味する。そのような導入は、当業界の常法により容易に行うことができる。一般に、ＣａＣｌ２沈殿法、ＣａＣｌ２方法にＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）という還元物質を用いることにより効率を高めたＨａｎａｈａｎ方法、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を利用した撹はん法、ＰＥＧを利用した形質転換法、デキストラン硫酸塩、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介された形質転換方法などがある。前記ベクターを形質転換させるための方法は、前記例に限定されず、当業界において通常使用される形質転換または形質感染方法が制限なく用いられる。また、前記伝達されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できる限り、微生物の染色体内に挿入されて位置するか、または染色体外に位置することができる。また、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態で導入されてもかまわない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体で発現するのに必要な全ての要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で微生物に導入することができ、これらに限定されるものではない。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、以下「ＯＲＦ」と略称する）に作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で微生物に導入され、微生物で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、特にこれに限定されるものではない。
【0076】
前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが微生物内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したものであるか、または外来ポリヌクレオチドが微生物内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したものであってもよい。
【0077】
前記８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形したり化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が格納されたデータベースと比較することにより、配列の類似性の程度にしたがって、鋳型タンパク質候補を決定し、それに基づいて構造を確認し、変形または化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。
【0078】
このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたポリペプチドの活性または濃度を基準にして増加するか、または当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加することであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0079】
本出願の微生物においてポリヌクレオチドの一部または全部の変形は、（ａ）微生物内の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換えまたは遺伝子はさみ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ｅ．ｇ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を用いたゲノム編集及び／又は（ｂ）紫外線及び放射線などのような光及び／又は化学物質処理により誘導されてもよいが、これらに制限されない。前記遺伝子の一部または全体の変形方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法を含むことができる。例えば、目的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を起こさせるようにして、遺伝子の一部または全体の欠損がなされてもよい。前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含み得るが、これらに制限されるものではない。
【0080】
本出願の微生物において、変異体、ポリヌクレオチド及びＬ－バリンなどは、前記他の様態で記載した通りである。
本出願のもう一つの態様は、前記微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－バリン生産方法を提供する。
本出願のもう一つの態様は、前記微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－バリン生産方法を提供する。
【0081】
具体的には、本出願のＬ－バリン生産方法は、本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドまたは本出願のベクターを含むコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を培地で培養する段階を含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0082】
本出願において、用語「培養」とは、本出願の微生物を適切に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び／又は流加式であってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0083】
本出願において用語、「培地」とは、本出願の微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば、特別な制限なくいずれも使用できるが、本出願の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。
【0084】
例えば、コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は、文献［“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ” ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１）］で見ることができる。
【0085】
本出願において、前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどのような炭水化物；マンニトール、ソルビトールなどのような糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのような有機酸；グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのようなアミノ酸などを含むことができる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、バガス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜（即ち、還元糖に転換された糖蜜）などのような炭水化物を使用することができ、その他の適量の炭素源を制限なく多様に利用することができる。これらの炭素源は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。
【0086】
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのような無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などのような有機窒素源が使用され得る。これらの窒素源は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。
【0087】
前記リン源としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、またはそれに対応するナトリウム含有塩などが含まれ得る。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用されることができ、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び／又は適切な前駆体などが含まれ得る。これらの構成成分または前駆体は、培地に回分式または連続式で添加され得る。しかし、これに限定されるものではない。
【0088】
また、本出願の微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培地に適切な方式で添加し、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中は脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができ、これに限定されるものではない。
【0089】
本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃ 具体的には、２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間培養することができるが、これに限定されるものではない。
【0090】
本出願の培養により生産されたＬ－バリンは、培地中に分泌されるか、または細胞内に残存する。
本出願のＬ－バリン生産方法は、本出願の微生物を準備する段階、前記菌株を培養するための培地を準備する段階、またはそれらの組み合わせ（順は無関係、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば、前記培養段階の前に、さらに含むことができる。
本出願のＬ－バリン生産方法は、本出願の微生物を準備する段階、前記菌株を培養するための培地を準備する段階、またはそれらの組み合わせ（順は無関係、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば、前記培養段階の前に、さらに含むことができる。
【0091】
本出願のＬ－バリン生産方法は、前記培養による培地（培養が行われた培地）または本出願の微生物からＬ－バリンを回収する段階をさらに含むことができる。前記回収する段階は、前記培養する段階の後にさらに含むことができる。
【0092】
前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて所望のＬ－バリンを収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたはそれらの方法を組み合わせて使用することができ、当該分野において公知となった適切な方法を用いて培地または微生物から所望のＬ－バリンを回収することができる。
【0093】
また、本出願のＬ－バリン生産方法は、さらに精製段階を含み得る。前記精製は、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて行うことができる。一例として、本出願のＬ－バリン生産方法が回収段階と精製段階の両方を含む場合、前記回収段階及び精製段階は、順序に関係なく連続的または非連続的に行われるか、または同時にまたは一つの段階に統合されて行うことができるが、これに制限されるものではない。
【0094】
本出願の方法において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物などは、前記他の様態で記載した通りである。
本出願のもう一つの態様は、本出願の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または本出願のポリヌクレオチドを含む微生物；それを培養した培地；あるいは、それらのうちの２以上の組み合わせを含むＬ－バリン生産用組成物を提供することである。
本出願のもう一つの態様は、本出願の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または本出願のポリヌクレオチドを含む微生物；それを培養した培地；あるいは、それらのうちの２以上の組み合わせを含むＬ－バリン生産用組成物を提供することである。
【0095】
本出願の組成物は、アミノ酸生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含むことができ、そのような賦形剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0096】
本出願の組成物において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、菌株、培地及びＬ－バリンなどは、前記他の様態で記載した通りである。
本出願のもう一つの態様は、配列番号１のアミノ酸配列において４４番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体のＬ－バリン生産用途を提供する。
本出願のもう一つの態様は、配列番号１のアミノ酸配列において４４番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体のＬ－バリン生産用途を提供する。
【0097】
本出願の用途において、変異体及びＬ－バリンなどは、前記他の様態で記載した通りである。
以下、本出願を実験例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、下記実施例は、本出願を例示するための好ましい実施様態に過ぎず、したがって、本出願の権利範囲をこれに限定するとは意図されない。一方、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野または類似技術の分野で熟練した通常の技術者であれば、十分に理解し、容易に行うことができる。
以下、本出願を実験例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、下記実施例は、本出願を例示するための好ましい実施様態に過ぎず、したがって、本出願の権利範囲をこれに限定するとは意図されない。一方、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野または類似技術の分野で熟練した通常の技術者であれば、十分に理解し、容易に行うことができる。
【0098】
実施例１．人工変異法を通じたバリン生産能増加変異株の選別
実施例１－１．ＵＶ照射を通じた人工突然変異の誘発
バリン生産能が増加した変異株を選別するために、バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（韓国登録特許第１０－１１１７０２２号公報）を寒天を含む栄養培地に塗抹して３０℃で３６時間培養した。このようにして得られた数百個のコロニーを室温でＵＶを照射して菌株内のゲノム上にランダム突然変異を誘発させた。
実施例１－１．ＵＶ照射を通じた人工突然変異の誘発
バリン生産能が増加した変異株を選別するために、バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（韓国登録特許第１０－１１１７０２２号公報）を寒天を含む栄養培地に塗抹して３０℃で３６時間培養した。このようにして得られた数百個のコロニーを室温でＵＶを照射して菌株内のゲノム上にランダム突然変異を誘発させた。
【0099】
実施例１－２．突然変異誘発菌株の発酵力価の評価及び菌株の選別
親株として使用されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べてＬ－バリンの生産能が増加した変異株を選別するために、ランダム突然変異が引き起こされた菌株を対象に発酵力価の実験を行った。それぞれのコロニーは、栄養培地で継代培養された後、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ－バリンの濃度を分析し、分析したＬ－バリンの濃度を下記の表１に示した。
親株として使用されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べてＬ－バリンの生産能が増加した変異株を選別するために、ランダム突然変異が引き起こされた菌株を対象に発酵力価の実験を行った。それぞれのコロニーは、栄養培地で継代培養された後、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ－バリンの濃度を分析し、分析したＬ－バリンの濃度を下記の表１に示した。
【0100】
［栄養培地（ｐＨ７．２）］
ブドウ糖１０ｇ、肉抽出物５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、酵母抽出物５ｇ、寒天２０ｇ、ウレア２ｇ（蒸溜水１リットルを基準）
［生産培地（ｐＨ７．０）］
ブドウ糖１００ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、とうもろこし浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、第２リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン－ＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇ（蒸溜水１リットルを基準）
ブドウ糖１０ｇ、肉抽出物５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、酵母抽出物５ｇ、寒天２０ｇ、ウレア２ｇ（蒸溜水１リットルを基準）
［生産培地（ｐＨ７．０）］
ブドウ糖１００ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、とうもろこし浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、第２リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン－ＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇ（蒸溜水１リットルを基準）
【0101】
【表1-1】
【0102】
【表1-2】
【0103】
表１の結果を基盤に、対照群であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株に比べてバリン生産量が最も多く増加したＣ１４菌株を選別した。
実施例２．遺伝子シーケンシングを通じた変異の確認
前記菌株の主な遺伝子をシーケンシングしてＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株及びコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７野生型菌株と比較した。その結果、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株及びバリン生産能が増加した前記Ｃ１４菌株は、ｉｌｖＮ遺伝子ＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）領域の特定の位置に塩基配列変異を含めていることを確認した。具体的には、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株は、前記ｉｌｖＮ遺伝子の開始コドンから１２５番目に位置した塩基に１個の変異が導入され、既存のＧＣＡからＧＴＡに変わった、４２番目のアミノ酸アラニンがバリンに置換された形態であることを確認した。
実施例２．遺伝子シーケンシングを通じた変異の確認
前記菌株の主な遺伝子をシーケンシングしてＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株及びコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７野生型菌株と比較した。その結果、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株及びバリン生産能が増加した前記Ｃ１４菌株は、ｉｌｖＮ遺伝子ＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）領域の特定の位置に塩基配列変異を含めていることを確認した。具体的には、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株は、前記ｉｌｖＮ遺伝子の開始コドンから１２５番目に位置した塩基に１個の変異が導入され、既存のＧＣＡからＧＴＡに変わった、４２番目のアミノ酸アラニンがバリンに置換された形態であることを確認した。
【0104】
バリンの生産量が最も多く増加したＣ１４菌株は、親株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐが含まれたＡ４２Ｖ変異を同一に含み、これと共にｉｌｖＮ遺伝子の開始コドンから１３０番目に位置した塩基に１個の変異が導入され、既存のＡＣＣからＧＣＣに変わった、４４番目のアミノ酸スレオニンがアラニンに置換された形態であることを確認した。
【0105】
前記変異領域を分析してみた結果、バリン生合成酵素のＥｆｆｅｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎに影響を与えることが確認され、当該タンパク質の活性が強化されると予想した。以下の実施例では、前記ｉｌｖＮ遺伝子内におけるＯＲＦの特定の位置に挿入されたＡ４２Ｖ、Ｔ４４Ａ変異の個別効果と統合適用時にコリネバクテリウム属微生物の分岐鎖アミノ酸であるバリン生産能に影響を及ぼすかどうかを確認することにした。また、４４番目のアミノ酸スレオニンの位置変異に対してアラニン以外の他のアミノ酸で置換される場合、コリネバクテリウム属微生物の分岐鎖アミノ酸であるバリン、イソロイシン、ロイシンの生産能に影響を及ぼすかどうかを確認することにした。
【0106】
実施例３．ｉｌｖＮ変異が導入されたＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株の製作及びバリン生産能の確認
実施例３－１．コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株においてｉｌｖＮ変異が導入された菌株の製作及びＬ－バリン生産能の評価
配列番号６で表示されるｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ＋Ｔ４４Ａ）変異型をグルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに挿入するために、ターゲット変異を含むベクターを製作した。具体的には、前記Ｃ１４菌株のゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Ｉｎｔｒｏｎ社、Ｃａｔ．Ｎｏ １７０４５）を用いてキットに提供されたプロトコルにより抽出し、前記ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒変性、５５℃で３０秒アニーリング、及び７２℃で１５０秒間重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応を行い、配列番号７と配列番号８を用いて１０１０ｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「変異導入断片１」と命名する）を得た。
実施例３－１．コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株においてｉｌｖＮ変異が導入された菌株の製作及びＬ－バリン生産能の評価
配列番号６で表示されるｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ＋Ｔ４４Ａ）変異型をグルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに挿入するために、ターゲット変異を含むベクターを製作した。具体的には、前記Ｃ１４菌株のゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Ｉｎｔｒｏｎ社、Ｃａｔ．Ｎｏ １７０４５）を用いてキットに提供されたプロトコルにより抽出し、前記ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒変性、５５℃で３０秒アニーリング、及び７２℃で１５０秒間重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応を行い、配列番号７と配列番号８を用いて１０１０ｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「変異導入断片１」と命名する）を得た。
【0107】
前記で得られた変異導入断片１を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）で処理されたｐＤＺベクター（韓国登録特許第１０－０９２４０６５号公報及び国際公開第２００８－０３３００１号）とＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．、日本国大津）を用いて連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。前記製作した遺伝子を大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた後、これをカナマイシン含有ＬＢ培地で選別し、ＤＮＡ－ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（ｉＮｔＲＯＮ社）でＤＮＡを得て前記変異導入断片１を含むベクターｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ＋Ｔ４４Ａ）を製造した。
【0108】
【表2】
【0109】
前記ｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ＋Ｔ４４Ａ）を染色体上における相同組換えによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号７と配列番号８を利用したＰＣＲを通じて染色体上でｉｌｖＮ遺伝子のＯＲＦ内における配列番号１のアミノ酸４２番の位置にアラニンがバリンで、アミノ酸４４番の位置にスレオニンがアラニンでそれぞれ置換された菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ＋Ｔ４４Ａ）と命名した。
【0110】
バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ＋Ｔ４４Ａ）のバリン生産能を比較するためにフラスコ評価を行った。それぞれ菌株を栄養培地で継代培養した後、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ－バリンの濃度を分析し、分析したＬ－バリンの濃度を下記表３に示した。
【0111】
［栄養培地（ｐＨ７．２）］
ブドウ糖１０ｇ、肉抽出物５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、酵母抽出物５ｇ、寒天２０ｇ、ウレア２ｇ（蒸溜水１リットルを基準）
［生産培地（ｐＨ７．０）］
ブドウ糖１００ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、とうもろこし浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、第２リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン－ＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇ（蒸溜水１リットルを基準）
ブドウ糖１０ｇ、肉抽出物５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、酵母抽出物５ｇ、寒天２０ｇ、ウレア２ｇ（蒸溜水１リットルを基準）
［生産培地（ｐＨ７．０）］
ブドウ糖１００ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、とうもろこし浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、第２リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン－ＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇ（蒸溜水１リットルを基準）
【0112】
【表3】
【0113】
その結果、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ＋Ｔ４４Ａ）菌株のＬ－バリン生産能は、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べて１８．５％増加することを確認した。
実施例３－２．コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株においてｉｌｖＮ変異が導入された菌株の製作及びＬ－バリン生産能の評価
配列番号３で表示されるｉｌｖＮ（Ｔ４４Ａ）変異型をグルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに挿入するために、ターゲット変異を含むベクターを製作した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Ｉｎｔｒｏｎ社、Ｃａｔ．Ｎｏ １７０４５）を用いてキットに提供されたプロトコルにより抽出し、前記ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒変性、５５℃で３０秒アニーリング、及び７２℃で１５０秒間重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応を行い、配列番号９と配列番号１０を用いて５１５ｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「変異導入断片２」と命名する）及び配列番号１１と配列番号１２を用いて５１８ｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「変異導入断片３」と命名する）をそれぞれ得た。
実施例３－２．コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株においてｉｌｖＮ変異が導入された菌株の製作及びＬ－バリン生産能の評価
配列番号３で表示されるｉｌｖＮ（Ｔ４４Ａ）変異型をグルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに挿入するために、ターゲット変異を含むベクターを製作した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Ｉｎｔｒｏｎ社、Ｃａｔ．Ｎｏ １７０４５）を用いてキットに提供されたプロトコルにより抽出し、前記ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒変性、５５℃で３０秒アニーリング、及び７２℃で１５０秒間重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応を行い、配列番号９と配列番号１０を用いて５１５ｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「変異導入断片２」と命名する）及び配列番号１１と配列番号１２を用いて５１８ｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「変異導入断片３」と命名する）をそれぞれ得た。
【0114】
前記で得られた変異導入断片２、３を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）で処理されたｐＤＺベクター（韓国登録特許第１０－０９２４０６５号公報及び国際公開第２００８－０３３００１号）とＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．、日本国大津）を用いて連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。前記製作した遺伝子を大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた後、これをカナマイシン含有ＬＢ培地で選別し、ＤＮＡ－ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（ｉＮｔＲＯＮ社）でＤＮＡを得て前記変異導入断片２、３を含むベクターｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ｔ４４Ａ）を製造した。
【0115】
【表4】
【0116】
前記ｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ｔ４４Ａ）を染色体上における相同組換えによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）。前記相同組換えによりＡ４２Ｖ変異が戻され、Ｔ４４Ａ変異が導入された。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号９と配列番号１２を利用したＰＣＲを通じて染色体上でｉｌｖＮ遺伝子のＯＲＦ内における配列番号１のアミノ酸４４番の位置にスレオニンがアラニンで置換された菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＮ（Ｔ４４Ａ）と命名した。
【0117】
製作された菌株のＬ－バリン生産能を比較するために、前記実施例３－１と同様の方法で培養してＬ－バリンの濃度を分析し、分析したＬ－バリンの濃度を下記表５に示した。
【0118】
【表5】
【0119】
その結果、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＮ（Ｔ４４Ａ）及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ＋Ｔ４４Ａ）菌株のＬ－バリン生産能は、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べてそれぞれ７．４％、１８．５％増加することを確認した。
【0120】
実施例３－３：コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ菌株においてｉｌｖＮ変異が導入された菌株の製作及びＬ－バリン生産能の評価
Ｌ－バリンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株でもＬ－バリン生産能増加の効果があるかどうかを確認するために、野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐｐ ４５６－４６７］を導入してＬ－バリン生産能が向上した菌株を製作した。
Ｌ－バリンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株でもＬ－バリン生産能増加の効果があるかどうかを確認するために、野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐｐ ４５６－４６７］を導入してＬ－バリン生産能が向上した菌株を製作した。
【0121】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Ｉｎｔｒｏｎ社、Ｃａｔ．Ｎｏ １７０４５）を用いてキットに提供されたプロトコルにより抽出した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ｉｌｖＮ遺伝子にＡ４２Ｖ変異を導入するベクターを製作するために、配列番号１３と配列番号１４のプライマー対及び配列番号１５と配列番号１６のプライマー対を用いて遺伝子断片（Ａ、Ｂ）をそれぞれ得た。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒変性、５５℃で３０秒アニーリング、及び７２℃で６０秒間の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応を行った。
【0122】
その結果、断片Ａ、Ｂでそれぞれ５２８ｂｐ、５０９ｂｐのポリヌクレオチドを得ることができた。前記両断片を鋳型として配列番号１３と配列番号１６を用いてオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行って１０１０ｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「変異導入断片４」と命名する）を得た。
【0123】
前記で得られた変異導入断片４を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターとＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を用いてライゲーションした。前記製作した遺伝子を大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた後、これをカナマイシン含有ＬＢ培地で選別し、ＤＮＡ－ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（ｉＮｔＲＯＮ社）でＤＮＡを得た。前記ｉｌｖＮ遺伝子のＡ４２Ｖ変異の導入を目的とするベクターをｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）と命名した。
【0124】
【表6】
【0125】
その後、前記ｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）を染色体上における相同組換えにより野生型であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号１３と配列番号１６を利用したＰＣＲを通じて遺伝子断片を増幅した後、遺伝子配列分析を通じて変異挿入菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖと命名した。
【0126】
最後に、前記コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖを前記実施例３－１及び実施例３－２と同様な方法でそれぞれのベクターを形質転換させた菌株を製作し、それぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ：：ｉｌｖＮ（Ｔ４４Ａ）、ＣＪ７Ｖ：：ｉｌｖＮ （Ａ４２Ｖ＋Ｔ４４Ａ）と命名した。製作された菌株のＬ－バリン生産能を比較するために、前記実施例３－１と同様の方法で培養してＬ－バリンの濃度を分析し、分析したＬ－バリンの濃度を下記表７に示した。
【0127】
【表7】
【0128】
その結果、ＣＪ７Ｖ：：ｉｌｖＮ（Ｔ４４Ａ）及びＣＪ７Ｖ：：ｉｌｖＮ （Ａ４２Ｖ＋Ｔ４４Ａ）菌株のＬ－バリン生産能は、ＣＪ７Ｖに比べてそれぞれ８．５％、１２．３％増加することを確認した。
【0129】
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【配列表】
【国際調査報告】