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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-08
(54)【発明の名称】網膜および黄斑修復のための光受容細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240801BHJP
A61K 35/30 20150101ALI20240801BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240801BHJP
C12N 5/22 20060101ALN20240801BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
A61K35/30
A61P27/02
C12N5/22
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509370
(86)(22)【出願日】2022-08-19
(85)【翻訳文提出日】2024-04-05
(86)【国際出願番号】 US2022040853
(87)【国際公開番号】W WO2023023305
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】63/235,380
(32)【優先日】2021-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】398076227
【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】シン， マンディープ
(72)【発明者】
【氏名】ジョンストン， ロバート
(72)【発明者】
【氏名】エルドレッド， キアラ
(72)【発明者】
【氏名】ハッセー， カタジナ
(72)【発明者】
【氏名】ハディニアク， サラ
(72)【発明者】
【氏名】マクナーニー， クリスティーナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC09
4B065BA01
4B065BB04
4B065BB19
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB56
4C087BB64
4C087CA04
4C087MA58
4C087NA14
4C087ZA33
(57)【要約】
変性性黄斑疾患は、不治の失明の主要原因である。本開示は、短波長（Ｓ）、中波長（Ｍ）および長波長（Ｌ）感受性錐体光受容体が含まれる規定された網膜細胞サブタイプを含む、網膜および黄斑修復のための細胞ベースの治療薬、かかる細胞ベースの５治療薬の製造のための方法、ならびにかかる治療薬を使用する方法に関する。ある特定の実施形態では、本開示は、Ｌ錐体およびＭ錐体の集団を含む細胞性組成物であって、Ｌ錐体のＭ錐体に対する比（Ｌ：Ｍ）が、所定の範囲内に入る、細胞性組成物を対象とする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌ錐体およびＭ錐体の集団を含む細胞性組成物であって、Ｌ錐体のＭ錐体に対する比（Ｌ：Ｍ）が、所定の範囲内に入る、細胞性組成物。
【請求項2】
所定の前記Ｌ：Ｍ範囲が、約１．３：１～約２．８：１である、請求項１に記載の細胞性組成物。
【請求項3】
所定の前記Ｌ：Ｍ比が約２：１である、請求項１に記載の細胞性組成物。
【請求項4】
錐体の前記集団が、総錐体のパーセンテージとして、最大で約２％のＳ錐体を含む、請求項１に記載の細胞性組成物。
【請求項5】
錐体の前記集団が、総錐体のパーセンテージとして、最大で約５％のＳ錐体を含む、請求項１に記載の細胞性組成物。
【請求項6】
Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の集団の比（Ｓ：Ｍ：Ｌ）が、所定の範囲内に入る、請求項１に記載の細胞性組成物。
【請求項7】
前記Ｓ：Ｍ：Ｌが約１：３３：６６である、請求項６に記載の細胞性組成物。
【請求項8】
前記Ｓ：Ｍ：Ｌが約３：３３：６４である、請求項６に記載の細胞性組成物。
【請求項9】
所定の前記Ｓ：Ｍ：Ｌ比が、特定の網膜偏心度において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在する比である、請求項６に記載の細胞性組成物。
【請求項10】
前記特定の網膜偏心度が、中心窩小窩またはその周囲にある、請求項９に記載の細胞性組成物。
【請求項11】
前記特定の網膜偏心度の内側境界が、約０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界が、約０．１ｍｍの線形偏心度にある、請求項１０に記載の細胞性組成物。
【請求項12】
前記特定の網膜偏心度が、中心窩中央またはその周囲にある、請求項９に記載の細胞性組成物。
【請求項13】
前記特定の網膜偏心度の内側境界が、約０．１ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界が、約０．１７５ｍｍの線形偏心度にある、請求項１２に記載の細胞性組成物。
【請求項14】
前記組成物が、杆体（「Ｒ」）を含み、Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比が、所定の範囲内に入る、請求項１に記載の細胞性組成物。
【請求項15】
所定の前記Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比が、特定の網膜偏心度において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在する比である、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項16】
前記特定の網膜偏心度が、中心窩中央またはその周囲にある、請求項１５に記載の細胞性組成物。
【請求項17】
前記特定の網膜偏心度の内側境界が、約０．１７５ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界が、約０．７５０ｍｍの線形偏心度にある、請求項１６に記載の細胞性組成物。
【請求項18】
錐体の前記集団が、総錐体のパーセンテージとして、約１０％～約２０％のＳ錐体を含む、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項19】
杆体の集団が、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約５５％～約８０％の杆体を含む、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項20】
前記Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比が約６：１１：２３：６０である、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項21】
前記特定の網膜偏心度が、傍中心窩またはその周囲にある、請求項１５に記載の細胞性組成物。
【請求項22】
前記特定の網膜偏心度の内側境界が、約０．７５０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界が、約１．５０ｍｍの線形偏心度にある、請求項２１に記載の細胞性組成物。
【請求項23】
錐体の前記集団が、総錐体のパーセンテージとして、約７％～約１０％のＳ錐体を含む、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項24】
杆体の集団が、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約６０％～約９５％の杆体を含む、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項25】
前記Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比が約２：６：１２：８０である、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項26】
前記特定の網膜偏心度が、周中心窩またはその周囲にある、請求項１５に記載の細胞性組成物。
【請求項27】
前記特定の網膜偏心度の内側境界が、約１．５０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界が、約３．０ｍｍの線形偏心度にある、請求項２６に記載の細胞性組成物。
【請求項28】
錐体の前記集団が、総錐体のパーセンテージとして、約６％～約９％のＳ錐体を含む、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項29】
杆体の集団が、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約７５％～約９５％の杆体を含む、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項30】
前記Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比が約１：３：７：９０である、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項31】
前記特定の網膜偏心度が、周辺部黄斑またはその周囲にある、請求項１５に記載の細胞性組成物。
【請求項32】
前記特定の網膜偏心度の内側境界が、約３．０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界が、約４．５ｍｍの線形偏心度にある、請求項３１に記載の細胞性組成物。
【請求項33】
杆体の集団が、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約５５％～約８５％の杆体を含む、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項34】
前記Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比が約２：９：１９：７０である、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項35】
前記特定の網膜偏心度が、中心周囲網膜またはその周囲にある、請求項１５に記載の細胞性組成物。
【請求項36】
前記特定の網膜偏心度の内側境界が、約４．５０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界が、約６．０ｍｍの線形偏心度にある、請求項３５に記載の細胞性組成物。
【請求項37】
杆体の集団が、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約５０％～約８０％の杆体を含む、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項38】
前記Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比が約２：１１：２２：６５である、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項39】
前記特定の網膜偏心度が、周辺部網膜またはその周囲にある、請求項１５に記載の細胞性組成物。
【請求項40】
前記特定の網膜偏心度の内側境界が、約６．０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界が、約７．５ｍｍの線形偏心度にある、請求項３９に記載の細胞性組成物。
【請求項41】
前記Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比が約３：１０：２２：６５である、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項42】
前記特定の網膜偏心度が、遠周辺部網膜またはその周囲にある、請求項４１に記載の細胞性組成物。
【請求項43】
前記特定の網膜偏心度の内側境界が、約７．５０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界が、約７．５０ｍｍの線形偏心度よりも大きい、請求項２１に記載の細胞性組成物。
【請求項45】
杆体の集団が、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約６０％～約９０％の杆体を含む、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項46】
前記Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比が約２：７：１４：７５である、請求項１４に記載の細胞性組成物。
【請求項47】
前記組成物が、２つの領域を含み、各領域が、異なるＭ：Ｌ比を含む、請求項１に記載の細胞性組成物。
【請求項48】
前記組成物が、２つの領域を含み、各領域が、異なるＳ：Ｍ：Ｌ比を含む、請求項４７に記載の細胞性組成物。
【請求項49】
前記組成物が、２つの領域を含み、各領域が、異なるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を含む、請求項４８に記載の細胞性組成物。
【請求項50】
錐体の集団を含む細胞性組成物であって、前記錐体の外節のうちの１つまたは複数が、キャパシタンスを示し、前記組成物が、５００～２５００ｐＡの範囲内の膜電流によって特徴付けられる、細胞性組成物。
【請求項51】
Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の所定の集団を含む細胞性組成物を調製するための方法であって、オルガノイドが所望のＳ錐体とＭ錐体とＬ錐体との比を達成するように、前記オルガノイドを培養するステップを含む、方法。
【請求項52】
Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の所定の集団を含む細胞性組成物を調製するための方法であって、ａ）２つまたはそれよりも多くの独立したオルガノイドを培養するステップ；
ｂ）前記２つまたはそれよりも多くの独立したオルガノイドから得られた細胞を合わせて、所望のＳ錐体とＭ錐体とＬ錐体との比を達成するステップ
を含む、方法。
【請求項53】
請求項１から５０のいずれか一項に記載の細胞性組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む、加齢黄斑変性症を処置する方法。
【請求項54】
請求項１から５０のいずれか一項に記載の細胞性組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む、網膜変性症を処置する方法。
【請求項55】
前記網膜変性症が、加齢黄斑変性症、シュタルガルト病、錐体ジストロフィー、色覚異常、ベスト病、ミトコンドリア黄斑変性症、パターンジストロフィーまたはＲＤＳ関連黄斑変性症に起因する、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２１年８月２０日出願の米国仮特許出願第６３／２３５，３８０号に対する優先権を主張し、その内容は、参照によってその全体が組み込まれ、それに対して優先権が主張される。
本出願は、２０２１年８月２０日出願の米国仮特許出願第６３／２３５，３８０号に対する優先権を主張し、その内容は、参照によってその全体が組み込まれ、それに対して優先権が主張される。
【0002】
連邦支援の研究に関する陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金ＥＹ０３０８７２の下で政府の支援によりなされた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金ＥＹ０３０８７２の下で政府の支援によりなされた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【0003】
１．発明の分野
本開示は、杆体光受容体、短波長（Ｓ）、中波長（Ｍ）および長波長（Ｌ）感受性錐体光受容体、ならびに関連する網膜介在ニューロンが含まれる規定された網膜細胞サブタイプを含む、網膜および黄斑修復のための細胞ベースの治療薬、かかる細胞ベースの治療薬の製造のための方法、ならびにかかる治療薬を使用する方法に関する。
本開示は、杆体光受容体、短波長（Ｓ）、中波長（Ｍ）および長波長（Ｌ）感受性錐体光受容体、ならびに関連する網膜介在ニューロンが含まれる規定された網膜細胞サブタイプを含む、網膜および黄斑修復のための細胞ベースの治療薬、かかる細胞ベースの治療薬の製造のための方法、ならびにかかる治療薬を使用する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
２．背景
変性性黄斑疾患は、不治の失明の主要原因である。例には、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、シュタルガルト病、錐体ジストロフィー、色覚異常、ベスト病、ミトコンドリア黄斑変性症（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、パターンジストロフィー（ｐａｔｔｅｒｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ＲＤＳ関連黄斑変性症および他の形態の遺伝性黄斑ジストロフィーが含まれる。黄斑は、その高密度の錐体光受容体に起因して、高視力の視覚を可能にする。さらに、正常な黄斑における杆体、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の比は、正常な高視力の視覚の重要な決定因子である。変性性黄斑疾患における病的状態の主要な細胞性の原因は、ヒト黄斑における錐体光受容細胞の変性であり、これは、顔認識および読書のために要求される高い視力、中心視および明所視の減退を生じる。
変性性黄斑疾患は、不治の失明の主要原因である。例には、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、シュタルガルト病、錐体ジストロフィー、色覚異常、ベスト病、ミトコンドリア黄斑変性症（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、パターンジストロフィー（ｐａｔｔｅｒｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ＲＤＳ関連黄斑変性症および他の形態の遺伝性黄斑ジストロフィーが含まれる。黄斑は、その高密度の錐体光受容体に起因して、高視力の視覚を可能にする。さらに、正常な黄斑における杆体、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の比は、正常な高視力の視覚の重要な決定因子である。変性性黄斑疾患における病的状態の主要な細胞性の原因は、ヒト黄斑における錐体光受容細胞の変性であり、これは、顔認識および読書のために要求される高い視力、中心視および明所視の減退を生じる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
現在、変性性黄斑疾患と診断された患者のための選択肢は限定されている。さらに、かかる選択肢は、典型的には、罹患組織の実際の修復への道を提供するのではなく、変性の速度を低減させる。したがって、変性性黄斑疾患に対処するためのさらなる治療薬、特に、罹患組織の修復を提供することができる治療薬が、当該分野でなおも必要とされている。
【0006】
３．概要
ある特定の実施形態では、本開示は、杆体光受容体、短波長（Ｓ）、中波長（Ｍ）および長波長（Ｌ）感受性錐体光受容体、ならびに関連する網膜介在ニューロンが含まれる規定された網膜細胞サブタイプを含む、網膜および黄斑修復のための細胞ベースの治療薬、例えば、細胞性組成物、かかる細胞ベースの治療薬の製造のための方法、ならびにかかる治療薬を使用する方法を対象とする。
ある特定の実施形態では、本開示は、杆体光受容体、短波長（Ｓ）、中波長（Ｍ）および長波長（Ｌ）感受性錐体光受容体、ならびに関連する網膜介在ニューロンが含まれる規定された網膜細胞サブタイプを含む、網膜および黄斑修復のための細胞ベースの治療薬、例えば、細胞性組成物、かかる細胞ベースの治療薬の製造のための方法、ならびにかかる治療薬を使用する方法を対象とする。
【0007】
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｌ錐体およびＭ錐体の集団を含む細胞性組成物であって、Ｌ錐体のＭ錐体に対する比（Ｌ：Ｍ）が、所定の範囲内に入る、細胞性組成物を対象とする。ある特定の実施形態では、所定のＬ：Ｍ範囲は、約１．３：１～約２．８：１である。ある特定の実施形態では、所定のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、錐体の集団は、総錐体のパーセンテージとして、最大で約２％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、錐体の集団は、総錐体のパーセンテージとして、最大で約５％のＳ錐体を含む。
【0008】
ある特定の実施形態では、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の集団の比（Ｓ：Ｍ：Ｌ）は、所定の範囲内に入る。ある特定の実施形態では、Ｓ：Ｍ：Ｌは、約１：３３：６６である。ある特定の実施形態では、Ｓ：Ｍ：Ｌは、約３：３３：６４である。ある特定の実施形態では、所定のＳ：Ｍ：Ｌ比は、特定の網膜偏心度（retinal eccentricity）において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在する比である。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度は、中心窩小窩（ｆｏｖｅａｌ ｕｍｂｏ）またはその周囲にある。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度の内側境界は、約０ｍｍの線形偏心度（ｌｉｎｅａｒ ｅｃｃｅｎｔｒｉｃｉｔｙ）にあり、外側境界は、約０．１ｍｍの線形偏心度にある。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度は、中心窩中央（ｆｏｖｅａｌ ｃｅｎｔｅｒ）またはその周囲にある。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度の内側境界は、約０．１ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界は、約０．１７５ｍｍの線形偏心度にある。
【0009】
ある特定の実施形態では、組成物は、杆体（「Ｒ」）を含み、Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比は、所定の範囲内に入る。ある特定の実施形態では、所定のＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比は、特定の網膜偏心度において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在する比である。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度は、中心窩中央またはその周囲にある。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度の内側境界は、約０．１７５ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界は、約０．７５０ｍｍの線形偏心度にある。ある特定の実施形態では、錐体の集団は、総錐体のパーセンテージとして、約１０％～約２０％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、杆体の集団は、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約５５％～約８０％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比は、約６：１１：２３：６０である。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度は、傍中心窩またはその周囲にある。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度の内側境界は、約０．７５０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界は、約１．５０ｍｍの線形偏心度にある。ある特定の実施形態では、錐体の集団は、総錐体のパーセンテージとして、約７％～約１０％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、杆体の集団は、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約６０％～約９５％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比は、約２：６：１２：８０である。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度は、周中心窩またはその周囲にある。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度の内側境界は、約１．５０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界は、約３．０ｍｍの線形偏心度にある。ある特定の実施形態では、錐体の集団は、総錐体のパーセンテージとして、約６％～約９％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、杆体の集団は、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約７５％～約９５％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比は、約１：３：７：９０である。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度は、周辺部黄斑またはその周囲にある。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度の内側境界は、約３．０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界は、約４．５ｍｍの線形偏心度にある。ある特定の実施形態では、杆体の集団は、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約５５％～約８５％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比は、約２：９：１９：７０である。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度は、中心周囲網膜（ｐｅｒｉｃｅｎｔｒｉｃ ｒｅｔｉｎａ）またはその周囲にある。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度の内側境界は、約４．５０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界は、約６．０ｍｍの線形偏心度にある。ある特定の実施形態では、杆体の集団は、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約５０％～約８０％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比は、約２：１１：２２：６５である。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度は、周辺部網膜またはその周囲にある。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度の内側境界は、約６．０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界は、約７．５ｍｍの線形偏心度にある。ある特定の実施形態では、Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比は、約３：１０：２２：６５である。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度は、遠周辺部網膜（ｆａｒ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｒｅｔｉｎａ）またはその周囲にある。ある特定の実施形態では、特定の網膜偏心度の内側境界は、約７．５０ｍｍの線形偏心度にあり、外側境界は、約７．５０ｍｍの線形偏心度よりも大きい。ある特定の実施形態では、杆体の集団は、合わせた総錐体および杆体のパーセンテージとして、約６０％～約９０％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒの比は、約２：７：１４：７５である。
【0010】
ある特定の実施形態では、本開示は、２つの領域を含む組成物であって、各領域が異なるＭ：Ｌ比を含む、組成物を対象とする。ある特定の実施形態では、組成物は、２つの領域を含み、各領域は、異なるＳ：Ｍ：Ｌ比を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、２つの領域を含み、各領域は、異なるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を含む。
【0011】
ある特定の実施形態では、本開示は、錐体の集団を含む細胞性組成物であって、錐体の外節のうちの１つまたは複数が、キャパシタンスを示し、組成物が、５００～２５００ｐＡの範囲内の膜電流によって特徴付けられる、細胞性組成物を対象とする。
【0012】
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の所定の集団を含む細胞性組成物を調製するための方法であって、オルガノイドが所望のＳ錐体とＭ錐体とＬ錐体との比を達成するように、オルガノイドを培養するステップを含む、方法を対象とする。
【0013】
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の所定の集団を含む細胞性組成物を調製するための方法であって、ａ）２つまたはそれよりも多くの独立したオルガノイドを培養するステップ；およびｂ）２つまたはそれよりも多くの独立したオルガノイドから得られた細胞を合わせて、所望のＳ錐体とＭ錐体とＬ錐体との比を達成するステップ、を含む、方法を対象とする。
【0014】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される細胞性組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む、加齢黄斑変性症を処置する方法を対象とする。
【0015】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される細胞性組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む、網膜変性症を処置する方法を対象とする。
【0016】
ある特定の実施形態では、本開示の方法によって処置される網膜変性症は、加齢黄斑変性症、シュタルガルト病、錐体ジストロフィー、色覚異常、ベスト病、ミトコンドリア黄斑変性症、パターンジストロフィーまたはＲＤＳ関連黄斑変性症に起因する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
４．図面の簡単な説明
【0018】
【0019】
【0020】
【発明を実施するための形態】
【0021】
５．詳細な説明
本開示は、杆体ならびに短波長（Ｓ）、中波長（Ｍ）および長波長（Ｌ）感受性錐体光受容体が含まれる規定された網膜細胞サブタイプを含む、網膜および黄斑修復のための細胞ベースの治療薬、かかる細胞ベースの治療薬の製造のための方法、ならびにかかる治療薬の使用の方法に関する。本開示の細胞ベースの治療薬は、本明細書で黄斑修復細胞（ＭＡＲＣ）と呼ばれる。
本開示は、杆体ならびに短波長（Ｓ）、中波長（Ｍ）および長波長（Ｌ）感受性錐体光受容体が含まれる規定された網膜細胞サブタイプを含む、網膜および黄斑修復のための細胞ベースの治療薬、かかる細胞ベースの治療薬の製造のための方法、ならびにかかる治療薬の使用の方法に関する。本開示の細胞ベースの治療薬は、本明細書で黄斑修復細胞（ＭＡＲＣ）と呼ばれる。
【0022】
一態様では、本開示の主題は、ＭＡＲＣ治療的組成物を対象とする。例えば、限定ではないが、本開示は、錐体細胞の集団を含むＭＡＲＣ組成物であって、Ｓ（「青色」）錐体、Ｍ（「緑色」）錐体およびＬ（「赤色」）錐体の比が、特定の範囲内に入る、ＭＡＲＣ組成物を対象とする。図１に示されるように、網膜内の異なる前後偏心度における変性位置を標的化するように再生基材が設計され得るように、ＭＡＲＣにおける設計バリエーションが創出される。各標的位置を標的化するＭＡＲＣバリエーションは、その偏心度において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在する短波長（Ｓ）、中波長（Ｍ）、長波長（Ｌ）感受性錐体光受容体ならびに杆体（Ｒ）光受容体比（Ｓ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比）を模倣するように設計される。
【0023】
別の態様では、本開示は、ＭＡＲＣ治療薬の製造のための方法を対象とする。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ治療薬は、ヒト網膜オルガノイド培養を介して生成され得る。例えば、限定ではないが、ＭＡＲＣ治療薬は、Ｓ錐体、Ｍ錐体および／またはＬ錐体について特異的に富化する独自の幹細胞ベースのヒト網膜オルガノイドプロトコールを使用して生成され得る。Ｓ錐体、Ｍ錐体および／またはＬ錐体の特定の比について富化することによって、本明細書に記載される製造の方法は、正常な三色識別対象において特定のゾーンにおいて（または特定のゾーンにわたって）見出される近似細胞性組成を再生させるように設計されたＭＡＲＣ治療薬を産生することができる。
【0024】
別の態様では、本開示の主題は、網膜変性疾患を有する人において機能的欠損を好転させるための処置としての、ＭＡＲＣ移植による黄斑再生治療を対象とする。例えば、限定ではないが、本開示のＭＡＲＣ組成物の投与によって好転され得る網膜変性疾患には、加齢黄斑変性症、シュタルガルト病、錐体ジストロフィー、色覚異常、ベスト病、ミトコンドリア黄斑変性症、パターンジストロフィー、ＲＤＳ関連黄斑変性症および他の形態の遺伝性黄斑ジストロフィーが含まれる。本明細書に記載される場合、ＭＡＲＣ治療薬は、黄斑中に移植され得、かかる移植は、錐体光受容細胞の再生をもたらし得る。ＭＡＲＣ移植が、黄斑疾患に罹患した人において視力を保存および／または改善することができるだけではなく、ＭＡＲＣ送達が、本明細書で詳細に記載されるように、ＭＡＲＣ治療薬の、黄斑への最適な成熟化および統合を確実にするために実施される。
【0025】
明確さのために、限定としてではなく、本開示の主題の詳細な説明は、以下のサブセクションに分割される：
５．１ 定義
５．２ 黄斑修復細胞組成物における設計バリエーション
５．３ 黄斑修復細胞組成物を産生する方法
５．４ 黄斑修復細胞組成物を使用する処置の方法
５．１ 定義
５．２ 黄斑修復細胞組成物における設計バリエーション
５．３ 黄斑修復細胞組成物を産生する方法
５．４ 黄斑修復細胞組成物を使用する処置の方法
【0026】
５．１．定義
本明細書で使用される用語は一般に、本開示の文脈の範囲内の、各用語が使用される具体的な文脈における、当該分野のそれらの通常の意味を有する。ある特定の用語は、本開示の組成物および方法ならびにそれらをどのように作製および使用するかを記載する際のさらなるガイダンスを実務者に提供するために、以下、または本明細書の他の場所で議論される。
本明細書で使用される用語は一般に、本開示の文脈の範囲内の、各用語が使用される具体的な文脈における、当該分野のそれらの通常の意味を有する。ある特定の用語は、本開示の組成物および方法ならびにそれらをどのように作製および使用するかを記載する際のさらなるガイダンスを実務者に提供するために、以下、または本明細書の他の場所で議論される。
【0027】
本明細書で使用される場合、単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において用語「含む」と併せて使用される場合、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１つよりも多く」の意味とも一致する。
【0028】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「し得る／できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」およびそれらの異形は、本明細書で使用される場合、さらなる行為または構造の可能性を排除しない、オープンエンドの移行的な語句、用語または単語であることを意図している。本開示は、明示的に示されていてもいなくても、本明細書で示される実施形態または要素を「含む」、それ「からなる」およびそれ「から本質的になる」他の実施形態もまた企図する。
【0029】
用語「約」または「およそ」は、値がどのように測定または決定されるか、即ち、測定システムの制限に一部依存する、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当該分野の実務に従って、３標準偏差以内または３標準偏差を超えることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大で２０％、好ましくは最大で１０％、より好ましくは最大で５％、より好ましくはなおも最大で１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物学的システムまたはプロセスに関して、用語は、ある値の一桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内であることを意味し得る。
【0030】
５．２．黄斑修復細胞組成物における設計バリエーション
一態様では、本開示の主題は、ＭＡＲＣ治療的組成物を対象とする。例えば、限定ではないが、本開示は、錐体細胞の集団を含むＭＡＲＣ組成物であって、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の比が、特定の範囲内に入る、ＭＡＲＣ組成物を対象とする。図１に示されるように、網膜内の異なる前後偏心度における変性位置を標的化するように再生基材が設計され得るように、ＭＡＲＣにおける設計バリエーションが創出される。各標的位置を標的化するＭＡＲＣバリエーションは、その偏心度において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在するＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を模倣するように設計される。
一態様では、本開示の主題は、ＭＡＲＣ治療的組成物を対象とする。例えば、限定ではないが、本開示は、錐体細胞の集団を含むＭＡＲＣ組成物であって、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の比が、特定の範囲内に入る、ＭＡＲＣ組成物を対象とする。図１に示されるように、網膜内の異なる前後偏心度における変性位置を標的化するように再生基材が設計され得るように、ＭＡＲＣにおける設計バリエーションが創出される。各標的位置を標的化するＭＡＲＣバリエーションは、その偏心度において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在するＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を模倣するように設計される。
【0031】
ある特定の実施形態では、本開示のＭＡＲＣ組成物は、「ＭＡＲＣ１」組成物である。ＭＡＲＣ１組成物は、約０ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約０．１ｍｍの線形偏心度にある外側境界における中心窩小窩またはその周囲における中心窩中央再生のために設計される。ある特定のＭＡＲＣ１組成物では、Ｌ：Ｍ比は、約１．３：１～約２．８：１の範囲である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ１のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ１組成物は、（総錐体のパーセンテージとして）最大で約２％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ１組成物は、杆体を含有しない。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ１組成物は、約１：３３：６６：０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有する。
【0032】
ある特定の実施形態では、本開示のＭＡＲＣ組成物は、「ＭＡＲＣ２」組成物である。ＭＡＲＣ２組成物は、約０．１ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約０．１７５ｍｍの線形偏心度にある外側境界における小窩（ｆｏｖｅｏｌａ）またはその周囲における中心窩中央再生のために設計される。ある特定のＭＡＲＣ２組成物では、Ｌ：Ｍ比は、約１．３：１～約２．８：１の範囲である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ２のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ２組成物は、（総錐体のパーセンテージとして）最大で約５％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ２組成物は、杆体を含有しない。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ２組成物は、約３：３３：６４：０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有する。
【0033】
ある特定の実施形態では、本開示のＭＡＲＣ組成物は、「ＭＡＲＣ３」組成物である。ＭＡＲＣ３組成物は、約０．１７５ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約０．７５０ｍｍの線形偏心度にある外側境界における中心窩またはその周囲における中心窩中央再生のために設計される。ある特定のＭＡＲＣ３組成物では、Ｌ：Ｍ比は、約１．３：１～約２．８：１の範囲である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ３のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ３組成物は、（総錐体のパーセンテージとして）約１０％～約２０％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ３組成物は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約５５％～約８０％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ３組成物は、約６：１１：２３：６０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有する。
【0034】
ある特定の実施形態では、本開示のＭＡＲＣ組成物は、「ＭＡＲＣ４」組成物である。ＭＡＲＣ４組成物は、約０．７５０ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約１．５ｍｍの線形偏心度にある外側境界における傍中心窩またはその周囲における再生のために設計される。ある特定のＭＡＲＣ４組成物では、Ｌ：Ｍ比は、約１．３：１～約２．８：１の範囲である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ４のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ４組成物は、（総錐体のパーセンテージとして）約７％～約１０％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ４組成物は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約６０％～約９５％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ４組成物は、約２：６：１２：８０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有する。
【0035】
ある特定の実施形態では、本開示のＭＡＲＣ組成物は、「ＭＡＲＣ５」組成物である。ＭＡＲＣ５組成物は、約１．５ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約３．０ｍｍの線形偏心度にある外側境界における周中心窩またはその周囲における再生のために設計される。ある特定のＭＡＲＣ５組成物では、Ｌ：Ｍ比は、約１．３：１～約２．８：１の範囲である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ５のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ５組成物は、（総錐体のパーセンテージとして）約６％～約９％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ５組成物は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約７５％～約９５％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ５組成物は、約１：３：７：９０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有する。
【0036】
ある特定の実施形態では、本開示のＭＡＲＣ組成物は、「ＭＡＲＣ６」組成物である。ＭＡＲＣ６組成物は、約３．０ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約４．５ｍｍの線形偏心度にある外側境界における周辺部黄斑またはその周囲における再生のために設計される。ある特定のＭＡＲＣ６組成物では、Ｌ：Ｍ比は、約１．３：１～約２．８：１の範囲である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ６のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ６組成物は、（総錐体のパーセンテージとして）約６％～約９％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ６組成物は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約５５％～約８５％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ６組成物は、約２：９：１９：７０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有する。
【0037】
ある特定の実施形態では、本開示のＭＡＲＣ組成物は、「ＭＡＲＣ７」組成物である。ＭＡＲＣ７組成物は、約４．５ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約６．０ｍｍの線形偏心度にある外側境界における中心周囲網膜またはその周囲における再生のために設計される。ある特定のＭＡＲＣ７組成物では、Ｌ：Ｍ比は、約１．３：１～約２．８：１の範囲である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ７のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ７組成物は、（総錐体のパーセンテージとして）約６％～約９％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ７組成物は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約５０％～約８０％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ７組成物は、約２：１１：２２：６５であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有する。
【0038】
ある特定の実施形態では、本開示のＭＡＲＣ組成物は、「ＭＡＲＣ８」組成物である。ＭＡＲＣ８組成物は、約６．０ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約７．５ｍｍの線形偏心度にある外側境界における周辺部網膜またはその周囲における再生のために設計される。ある特定のＭＡＲＣ８組成物では、Ｌ：Ｍ比は、約１．３：１～約２．８：１の範囲である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ８のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ８組成物は、（総錐体のパーセンテージとして）約７％～約１０％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ８組成物は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約５０％～約８０％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ８組成物は、約３：１０：２２：６５であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有する。
【0039】
ある特定の実施形態では、本開示のＭＡＲＣ組成物は、「ＭＡＲＣ９」組成物である。ＭＡＲＣ９組成物は、約７．５ｍｍまたはそれよりも高い線形偏心度にある遠周辺部網膜またはその周囲における再生のために設計される。ある特定のＭＡＲＣ９組成物では、Ｌ：Ｍ比は、約１．３：１～約２．８：１の範囲である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ９のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ９組成物は、（総錐体のパーセンテージとして）約７％～約１０％のＳ錐体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ９組成物は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約６０％～約９０％の杆体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ９組成物は、約２：７：１４：７５であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有する。
【0040】
ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ設計は、１つまたは複数の隣接ゾーンまたは非隣接ゾーンに跨がって位置するように組み合わされる。例えば、限定ではないが、本開示は、錐体細胞の集団を含むＭＡＲＣ組成物であって、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の比が、組成物の１つの領域では、特定の範囲内に入り、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の比が、組成物の別の領域では、別の特定の範囲内に入る、ＭＡＲＣ組成物を対象とする。１つまたは複数の隣接または非隣接の前後偏心度に跨がって位置する変性位置を標的化するように再生基材が設計され得るように、ＭＡＲＣにおけるかかる設計バリエーションが創出され得る。各標的位置を標的化するＭＡＲＣバリエーションは、標的化された偏心度において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在するＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を模倣するように設計され得る。
【0041】
ある特定の実施形態では、本開示のＭＡＲＣ組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８または９つの異なる領域を含み得、各領域は、標的化された偏心度において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在するＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を模倣するように設計され得る。例えば、限定ではないが、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域およびＭＡＲＣ２組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域およびＭＡＲＣ３組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域およびＭＡＲＣ４組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域およびＭＡＲＣ５組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ５組成物を含む領域およびＭＡＲＣ６組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ６組成物を含む領域およびＭＡＲＣ７組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ７組成物を含む領域およびＭＡＲＣ８組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ８組成物を含む領域およびＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含み得る。
【0042】
ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域、ＭＡＲＣ５組成物を含む領域、ＭＡＲＣ６組成物を含む領域、ＭＡＲＣ７組成物を含む領域、ＭＡＲＣ８組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含み得る。例えば、限定としてではなく、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ３組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ４組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ５組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域、ＭＡＲＣ５組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ６組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域、ＭＡＲＣ５を含む領域、ＭＡＲＣ６組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ７組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域、ＭＡＲＣ５を含む領域、ＭＡＲＣ６を含む領域、ＭＡＲＣ７組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ８組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域、ＭＡＲＣ５を含む領域、ＭＡＲＣ６を含む領域、ＭＡＲＣ７を含む領域、ＭＡＲＣ８組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含み得る。
【0043】
ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣは、不連続な領域、例えば、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域およびＭＡＲＣ３組成物を含む領域を含み得る。不連続な領域を含むかかるＭＡＲＣのさらなる非限定的な例には、以下が含まれる：ＭＡＲＣ１組成物を含む領域およびＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ５、ＭＡＲＣ６、ＭＡＲＣ７、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ２組成物を含む領域およびＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ５、ＭＡＲＣ６、ＭＡＲＣ７、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ３組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ５、ＭＡＲＣ６、ＭＡＲＣ７、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ４組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ６、ＭＡＲＣ７、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ５組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ７、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ６組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ７組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ５またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ８組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ５またはＭＡＲＣ６組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ならびにＭＡＲＣ９組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ５、ＭＡＲＣ６またはＭＡＲＣ７組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ。
【0044】
ある特定の実施形態では、本開示のＭＡＲＣ組成物は、錐体細胞の集団を含み得、錐体の外節のうちの１つまたは複数は、大きいキャパシタンスを示す。本明細書で使用される場合、錐体の外節のうちの１つまたは複数が大きいキャパシタンスを示すＭＡＲＣ組成物は、５００～２５００ｐＡの範囲内の膜電流によって特徴付けられるＭＡＲＣ組成物を指す。
５．３ 黄斑修復細胞組成物を産生する方法
５．３ 黄斑修復細胞組成物を産生する方法
【0045】
一態様では、本開示は、ＭＡＲＣ治療薬の製造に関する。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣは、ヒト網膜オルガノイド培養を介して生成され得る。例えば、限定ではないが、ＭＡＲＣは、Ｓ錐体、Ｍ錐体および／またはＬ錐体について特異的に富化する独自の幹細胞ベースのヒト網膜オルガノイドプロトコールを使用して生成され得る。Ｓ錐体、Ｍ錐体および／またはＬ錐体の特定の比について富化することによって、本明細書に記載される製造の方法は、正常な三色識別対象において特定のゾーンにおいて（または特定のゾーンにわたって）見出される近似細胞性組成を再生させるように設計されたＭＡＲＣを産生することができる。
【0046】
例えば、限定ではないが、本開示は、黄斑修復細胞の集団への細胞の分化を指向させることが可能な条件下で、細胞を１つまたは複数のシグナル伝達分子と接触させることによって、黄斑修復細胞の集団への細胞の指向性の分化を誘導するための方法を対象とする。ある特定の実施形態では、黄斑修復細胞の集団へと分化するように誘導される細胞は、胚性幹細胞、誘導非胚性多能性細胞または操作された多能性細胞である。ある特定の実施形態では、黄斑修復細胞の集団へと分化するように誘導される細胞に接触させるために使用されるシグナル伝達分子は、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、ならびにそれらの組合せである。
【0047】
ある特定の実施形態では、黄斑修復細胞の集団は、オルガノイドから調製される。例えば、限定としてではなく、黄斑修復細胞の集団の調製において使用されるオルガノイドは、以下の「一般的オルガノイド分化プロトコール」に従って調製され得る。オルガノイドの調製および分化のための基礎として、当業者は、適切な胚性幹細胞（ＥＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、例えば、限定としてではなく、Ｈ７ ＷＡ０７、Ｈ７ｉＣａｓ９ ＥＳＣまたはＥＰ１．１ ｉＰＳＣを選択することができる。凝集させるために、次いで、細胞は、完全な解離を確実にするために、例えば、３７℃で約１２分間、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳＣＲ００５、Ｓｉｇｍａ）中で継代され得る。次いで、細胞は、５０μＬのｍＴｅＳＲ１中３，０００細胞／ウェルで、９６ウェル超低接着丸底Ｌｉｐｉｄｕｒｅコーティングプレート（５１０１１６１０、ＮＯＦ）または超低付着マイクロプレート（７００７、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に播種され得るが、代替的な密度および容器が、本プロトコールの範囲内とみなされる。次いで、細胞は、生存を増強するために、低酸素条件（例えば、約１０％ＣＯ２および約５％Ｏ２）中に約２４時間置かれ得る。細胞は、２４時間かけて重力によって自然に凝集する。
【0048】
約１日目に、細胞は、正常酸素圧条件（例えば、約５％ＣＯ２）に移動され得る。１～３日目または約１～３日目に、約３μＭのＷｎｔ阻害剤（ＩＷＲ１ｅ：６８１６６９、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および約１％（ｖ／ｖ）のＭａｔｒｉｇｅｌを含有するＢＥ６．２培地または他の適切な培地約５０μＬが、各ウェルに添加され得る。４～９日目または約４～９日目に、約１００μＬの培地が各ウェルから除去され得、約１００μＬの培地が添加され得る。４～５日目または約４～５日目に、約３μＭのＷｎｔ阻害剤および約１％のＭａｔｒｉｇｅｌを含有するＢＥ６．２培地または他の適切な培地が添加され得る。６～７日目または約６～７日目に、約１％のＭａｔｒｉｇｅｌ（３５４２３０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＢＥ６．２培地または他の適切な培地が添加され得る。８～９日目または約８～９日目に、約１％のＭａｔｒｉｇｅｌおよび約１００ｎＭのＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（ＳＡＧ：５６６６６０、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有するＢＥ６．２培地または他の適切な培地が添加され得る。
【0049】
１０日目または約１０日目に、凝集物は、１５ｍＬチューブ（または他の許容可能な容器）に移され得、約５ｍＬのＤＭＥＭ（１１８８５０８４、Ｇｉｂｃｏ）または他の適切な培地中で約３回すすがれ、未処置の１０ｃｍポリスチレンペトリ皿または他の適切な容器中で約１００ｎＭのＳＡＧを含むＢＥ６．２または他の適切な培地中に再懸濁され得る。この時点から、培地は、約１日おきに交換され得る。凝集物は、モニタリングされ、一緒にまたはプレートの底にくっついた場合、手動で分離され得る。
【0050】
１３～１６日目または約１３～１６日目に、約１００ｎＭのＳＡＧを含むＬＴＲ培地または他の適切な培地が添加され得る。１６日目または約１６日目に、網膜小胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｖｅｓｉｃｌｅ）は、例えば、鋭利なタングステン針を使用して、手動で切り出され得る。切り出し後、細胞は、１５ｍＬチューブまたは他の許容可能な容器中に移され、約５ｍＬのＤＭＥＭまたは他の許容可能な培地で約２回洗浄され得る。１６～２０日目または約１６～２０日目に、細胞は、ＬＴＲまたは他の許容可能な培地中で維持され、約５ｍＬのＤＭＥＭまたは他の許容可能な培地で約２回洗浄された後、死細胞を洗浄して除くために、新たなプレートまたは他の許容可能な容器に移され得る。生存および分化を増加させるために、約１．０４μＭのオール－トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ；Ｒ２６２５；Ｓｉｇｍａ）が、約２０～４３日目に、ＬＴＲ培地または他の許容可能な培地に添加され得る。以下で注目するように、約１．０４μＭのオール－トランスレチノイン酸への曝露のさらなる時間ウインドウが、所望のＬ錐体またはＭ錐体の細胞組成に依存して追加され得る。約１０μＭのガンマ－セクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴ、５６５７７０、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が、約２８～４２日目に、ＬＴＲまたは他の許容可能な培地に添加され得る。ある特定の実施形態では、オルガノイドは、凝集を低減させるために、低い密度（１０ｃｍの皿１つ当たり約１０～約２０）で成長され得る。定期的に、オルガノイドは、適切な網膜オルガノイド成長を示す透明な薄層構造の非存在に基づいて、プレートから間引かれ得る。
【0051】
ある特定の実施形態では、黄斑修復細胞の集団は、Ｓ（青色）錐体について富化される。例えば、限定としてではなく、Ｓ（青色）錐体について富化された黄斑修復細胞の集団は、上記一般的オルガノイド分化プロトコールによって産生され得、オルガノイドを生成するために用いられるＥＳＣまたはｉＰＳＣは、Ｔｈｒβ（Ｔｈｒβ１およびＴｈｒβ２）ノックアウトを含む。例えば、限定としてではなく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、Ｅｌｄｒｅｄらに詳細に記載されるように、ＴｈｒβのＤＮＡ結合ドメインの一部をコードする共有のエクソンを欠失させるために、例えば、ヒトＥＳＣにおいて使用され得る。しかし、種々の他の戦略が、Ｔｈｒβ発現をノックアウトするために使用され得、本開示の主題の範囲内と考えられる。
【0052】
ある特定の実施形態では、黄斑修復細胞の集団は、Ｍ（緑色）錐体について富化される。例えば、限定としてではなく、Ｍ（緑色）錐体について富化された黄斑修復細胞の集団は、上記一般的オルガノイド分化プロトコールによって産生され得るが、オルガノイドは、約４３～約１３０日目にＲＡにさらに曝露され、これが、Ｍ（緑色）錐体が富化された細胞の集団を、約２００日目までに生じる。
【0053】
ある特定の実施形態では、黄斑修復細胞の集団は、Ｌ（赤色）錐体について富化される。例えば、限定としてではなく、Ｌ（赤色）錐体について富化された黄斑修復細胞の集団は、上記一般的オルガノイド分化プロトコールによって産生され得るが、オルガノイドは、約１３０日目～約２００日目にＲＡにさらに曝露され、Ｌ錐体が富化された細胞の集団を、２００日目に生じた。
【0054】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される黄斑修復細胞の集団は、所望のＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を達成するために適切な数の杆体細胞とさらに組み合わされる、本明細書に記載されるように調製され、所望のＳ錐体とＭ錐体とＬ錐体との比を達成するために組み合わされた適切な数の錐体細胞の混合物を介して、正常な三色識別対象において特定のゾーンにおいて（または特定のゾーンにわたって）見出される近似細胞性組成を再生させる。
【0055】
ある特定の実施形態では、黄斑修復細胞の集団は、例えば、独立したオルガノイドで産生され、次いで、所望のＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を達成するために適切な数の杆体細胞とさらに組み合わされる、所望のＳ錐体とＭ錐体とＬ錐体との比を達成するために混合され得る。例えば、限定としてではなく、表１は、本明細書に記載されるＭＡＲＣ１～ＭＡＲＣ９組成物を産生するための、細胞組成物の例示的な組合せ（それらの産生において使用される甲状腺ホルモンＴ３濃度およびレチノイン酸濃度条件ならびに培養の持続時間が含まれる）を提供する。
表１．
表１．
【表1】
【0056】
例えば、１つまたは複数の隣接ゾーンまたは非隣接ゾーンに跨がって位置する組成物を産生するためのさらなる組合せは、第１のゾーンの特色を有する細胞組成物を産生し、それを、第２の（または引き続く）ゾーンの特色を有する細胞と対にすることによって、類似の様式で産生され得る。
【0057】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される黄斑修復細胞の集団からは、非神経網膜細胞が枯渇される。例えば、限定としてではなく、黄斑修復細胞のかかる集団からは、前脳様細胞、前脳前駆体細胞および／または網膜色素上皮細胞が枯渇され得る。枯渇を検証するために使用され得る前脳様細胞および／または前脳前駆体細胞のマーカーには、ＮＫＸ２．２、ＲＧＣＣ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＢＴＧ２、ＧＡＤＤ４５ＡおよびＧＡＤＤ４５Ｇのうちの１つまたは複数が含まれるがこれらに限定されない。枯渇を検証するために使用され得る網膜色素上皮細胞のマーカーには、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＧＲＡＭＤ３およびＰＩＴＰＮＡのうちの１つまたは複数が含まれるがこれらに限定されない。
【0058】
５．４．黄斑修復細胞組成物を使用する処置の方法
別の態様では、本開示の主題は、網膜変性疾患を有する人において機能的欠損を好転させるための処置としての、ＭＡＲＣ移植による黄斑再生治療を対象とする。例えば、限定ではないが、本開示のＭＡＲＣ組成物の投与によって好転され得る網膜変性疾患には、加齢黄斑変性症、シュタルガルト病、錐体ジストロフィー、色覚異常、ベスト病、ミトコンドリア黄斑変性症、パターンジストロフィー、ＲＤＳ関連黄斑変性症および他の形態の遺伝性黄斑ジストロフィーが含まれる。本明細書に記載される場合、ＭＡＲＣ治療薬は、黄斑中に移植され得、かかる移植は、錐体光受容細胞の再生をもたらし得る。ＭＡＲＣ移植が、黄斑疾患に罹患した人において視力を保存および／または改善することができるだけではなく、ＭＡＲＣ送達が、本明細書で詳細に記載されるように、ＭＡＲＣ治療薬の、黄斑への最適な成熟化および統合を確実にするために実施される。
別の態様では、本開示の主題は、網膜変性疾患を有する人において機能的欠損を好転させるための処置としての、ＭＡＲＣ移植による黄斑再生治療を対象とする。例えば、限定ではないが、本開示のＭＡＲＣ組成物の投与によって好転され得る網膜変性疾患には、加齢黄斑変性症、シュタルガルト病、錐体ジストロフィー、色覚異常、ベスト病、ミトコンドリア黄斑変性症、パターンジストロフィー、ＲＤＳ関連黄斑変性症および他の形態の遺伝性黄斑ジストロフィーが含まれる。本明細書に記載される場合、ＭＡＲＣ治療薬は、黄斑中に移植され得、かかる移植は、錐体光受容細胞の再生をもたらし得る。ＭＡＲＣ移植が、黄斑疾患に罹患した人において視力を保存および／または改善することができるだけではなく、ＭＡＲＣ送達が、本明細書で詳細に記載されるように、ＭＡＲＣ治療薬の、黄斑への最適な成熟化および統合を確実にするために実施される。
【0059】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、錐体細胞の集団を含む黄斑修復細胞組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む、加齢黄斑変性症、シュタルガルト病、錐体ジストロフィー、色覚異常、ベスト病、ミトコンドリア黄斑変性症、パターンジストロフィー、ＲＤＳ関連黄斑変性症および他の形態の遺伝性黄斑ジストロフィーを処置することであって、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の比が、各標的化された位置に対応する比の範囲内に入り、それにより、標的化された偏心度において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在するＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を模倣する、処置することを対象とする。
【0060】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＭＡＲＣ１組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約０ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約０．１ｍｍの線形偏心度にある外側境界における中心窩小窩またはその周囲における中心窩中央再生のために設計されたＭＡＲＣ１組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｌ：Ｍ比が約１．３：１～約２．８：１の範囲であるＭＡＲＣ１組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ１のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体のパーセンテージとして）最大で約２％のＳ錐体を含むＭＡＲＣ１組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、杆体を含有しないＭＡＲＣ１組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約１：３３：６６：０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有するＭＡＲＣ１組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。
【0061】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＭＡＲＣ２組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約０．１ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約０．１７５ｍｍの線形偏心度にある外側境界における小窩またはその周囲における中心窩中央再生のために設計されたＭＡＲＣ２組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｌ：Ｍ比が約１．３：１～約２．８：１の範囲であるＭＡＲＣ２組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ２のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体のパーセンテージとして）最大で約５％のＳ錐体を含むＭＡＲＣ２組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、杆体を含有しないＭＡＲＣ２組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約３：３３：６４：０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有するＭＡＲＣ２組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。
【0062】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＭＡＲＣ３組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約０．１７５ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約０．７５０ｍｍの線形偏心度にある外側境界における中心窩またはその周囲における中心窩中央再生のために設計されたＭＡＲＣ３組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｌ：Ｍ比が約１．３：１～約２．８：１の範囲であるＭＡＲＣ３組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ３のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体のパーセンテージとして）約１０％～約２０％のＳ錐体を含むＭＡＲＣ３組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約５５％～約８０％の杆体を含むＭＡＲＣ３組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約６：１１：２３：６０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有するＭＡＲＣ３組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。
【0063】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＭＡＲＣ４組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約０．７５０ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約１．５ｍｍの線形偏心度にある外側境界における傍中心窩またはその周囲における再生のために設計されたＭＡＲＣ４組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｌ：Ｍ比が約１．３：１～約２．８：１の範囲であるＭＡＲＣ４組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ４のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体のパーセンテージとして）約７％～約１０％のＳ錐体を含むＭＡＲＣ４組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約６０％～約９５％の杆体を含むＭＡＲＣ４組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約２：６：１２：８０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有するＭＡＲＣ４組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。
【0064】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＭＡＲＣ５組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約１．５ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約３．０ｍｍの線形偏心度にある外側境界における周中心窩またはその周囲における再生のために設計されたＭＡＲＣ５組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｌ：Ｍ比が約１．３：１～約２．８：１の範囲であるＭＡＲＣ５組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ５のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体のパーセンテージとして）約６％～約９％のＳ錐体を含むＭＡＲＣ５組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約７５％～約９５％の杆体を含むＭＡＲＣ５組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約１：３：７：９０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有するＭＡＲＣ５組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。
【0065】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＭＡＲＣ６組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約３．０ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約４．５ｍｍの線形偏心度にある外側境界における周辺部黄斑またはその周囲における再生のために設計されたＭＡＲＣ６組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｌ：Ｍ比が約１．３：１～約２．８：１の範囲であるＭＡＲＣ６組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ６のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体のパーセンテージとして）約６％～約９％のＳ錐体を含むＭＡＲＣ６組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約５５％～約８５％の杆体を含むＭＡＲＣ６組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約２：９：１９：７０であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有するＭＡＲＣ６組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。
【0066】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＭＡＲＣ７組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約４．５ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約６．０ｍｍの線形偏心度にある外側境界における中心周囲網膜またはその周囲における再生のために設計されたＭＡＲＣ７組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｌ：Ｍ比が約１．３：１～約２．８：１の範囲であるＭＡＲＣ７組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ７のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体のパーセンテージとして）約６％～約９％のＳ錐体を含むＭＡＲＣ７組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約５０％～約８０％の杆体を含むＭＡＲＣ７組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約２：１１：２２：６５であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有するＭＡＲＣ７組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。
【0067】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＭＡＲＣ８組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約６．０ｍｍの線形偏心度にある内側境界および最大で約７．５ｍｍの線形偏心度にある外側境界における周辺部網膜またはその周囲における再生のために設計されたＭＡＲＣ８組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｌ：Ｍ比が約１．３：１～約２．８：１の範囲であるＭＡＲＣ８組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ８のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体のパーセンテージとして）約７％～約１０％のＳ錐体を含むＭＡＲＣ８組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約５０％～約８０％の杆体を含むＭＡＲＣ８組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約３：１０：２２：６５であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有するＭＡＲＣ８組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。
【0068】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＭＡＲＣ９組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約７．５ｍｍまたはそれよりも高い線形偏心度にある遠周辺部網膜またはその周囲における再生のために設計されたＭＡＲＣ９組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｌ：Ｍ比が約１．３：１～約２．８：１の範囲であるＭＡＲＣ９組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、ＭＡＲＣ９のＬ：Ｍ比は、約２：１である。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体のパーセンテージとして）約７％～約１０％のＳ錐体を含むＭＡＲＣ９組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、（総錐体＋杆体のパーセンテージとして）約６０％～約９０％の杆体を含むＭＡＲＣ９組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。ある特定の実施形態では、方法は、約２：７：１４：７５であるＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を有するＭＡＲＣ９組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。
【0069】
ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の隣接ゾーンまたは非隣接ゾーンに跨がって位置するように設計されたＭＡＲＣの、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む。例えば、限定ではないが、本開示は、錐体細胞の集団を含むＭＡＲＣ組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含む方法であって、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の比が、組成物の１つの領域では、特定の範囲内に入り、Ｓ錐体、Ｍ錐体およびＬ錐体の比が、組成物の別の領域では、別の特定の範囲内に入る、方法を対象とする。１つまたは複数の隣接または非隣接の前後偏心度に跨がって位置する変性位置を標的化するように再生基材が設計され得るように、ＭＡＲＣにおけるかかる設計バリエーションが創出され得る。各標的位置を標的化するＭＡＲＣバリエーションは、標的化された偏心度において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在するＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を模倣するように設計され得る。
【0070】
ある特定の実施形態では、方法は、１、２、３、４、５、６、７、８または９つの異なる領域を含むＭＡＲＣ組成物の、それを必要とする患者の黄斑中への生着を含み、各領域は、標的化された偏心度において、正常な色覚を有する三色識別患者において天然に存在するＳ：Ｍ：Ｌ：Ｒ比を模倣するように設計され得る。例えば、限定ではないが、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域およびＭＡＲＣ２組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域およびＭＡＲＣ３組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域およびＭＡＲＣ４組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域およびＭＡＲＣ５組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ５組成物を含む領域およびＭＡＲＣ６組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ６組成物を含む領域およびＭＡＲＣ７組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ７組成物を含む領域およびＭＡＲＣ８組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ８組成物を含む領域およびＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含み得る。
【0071】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域、ＭＡＲＣ５組成物を含む領域、ＭＡＲＣ６組成物を含む領域、ＭＡＲＣ７組成物を含む領域、ＭＡＲＣ８組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含み得る。例えば、限定としてではなく、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ３組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ４組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ５組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域、ＭＡＲＣ５組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ６組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域、ＭＡＲＣ５を含む領域、ＭＡＲＣ６組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ７組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域、ＭＡＲＣ５を含む領域、ＭＡＲＣ６を含む領域、ＭＡＲＣ７組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ８組成物を含む領域を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域、ＭＡＲＣ２組成物を含む領域、ＭＡＲＣ３組成物を含む領域、ＭＡＲＣ４組成物を含む領域、ＭＡＲＣ５を含む領域、ＭＡＲＣ６を含む領域、ＭＡＲＣ７を含む領域、ＭＡＲＣ８組成物を含む領域および／またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含み得る。
【0072】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのＭＡＲＣ組成物は、不連続な領域、例えば、ＭＡＲＣ１組成物を含む領域およびＭＡＲＣ３組成物を含む領域を含み得る。不連続な領域を含む、本明細書に記載される方法における使用のためのかかるＭＡＲＣ組成物のさらなる非限定的な例には、以下が含まれる：ＭＡＲＣ１組成物を含む領域およびＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ５、ＭＡＲＣ６、ＭＡＲＣ７、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ２組成物を含む領域およびＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ５、ＭＡＲＣ６、ＭＡＲＣ７、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ３組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ５、ＭＡＲＣ６、ＭＡＲＣ７、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ４組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ６、ＭＡＲＣ７、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ５組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ７、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ６組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ８またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ７組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ５またはＭＡＲＣ９組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ＭＡＲＣ８組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ５またはＭＡＲＣ６組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ；ならびにＭＡＲＣ９組成物を含む領域およびＭＡＲＣ１、ＭＡＲＣ２、ＭＡＲＣ３、ＭＡＲＣ４、ＭＡＲＣ５、ＭＡＲＣ６またはＭＡＲＣ７組成物を含む領域を含むＭＡＲＣ。
【0073】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に関連するＭＡＲＣ送達は、網膜下空間への細胞または他の材料のアクセスおよび送達のためのデバイスを使用して実施される。例えば、限定ではないが、本明細書に記載される方法に関連するＭＡＲＣ送達のためのデバイスは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４５０７４（ＷＯ２０２００２８８９２）に記載されるデバイスであり得る。
【0074】
簡潔に述べると、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４５０７４（ＷＯ２０２００２８８９２）に記載されるデバイスなどの、本明細書に記載される方法に関連するＭＡＲＣ送達のためのデバイスは、経強膜側を介して網膜下空間にアクセスすることができる。これは、ａｂ ｅｘｔｅｍｏアプローチである。ある特定の実施形態では、細胞送達デバイスは、例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４５０７４（ＷＯ２０２００２８８９２）の図１～８に示されるように、可撓性外側表面によって取り囲まれた２つの積み重なった層を含み得る。ある特定の実施形態では、デバイスは、それが網膜下空間に前進させられる際に眼の天然の曲率に合うように、可撓性であるように構成され得る。ある特定の実施形態では、デバイスを適所に置いた後、可撓性外側表面は、網膜および網膜色素上皮および脈絡膜のデリケートな組織を保護するように構成されるが、２つの積み重なった層間には、送達される材料または細胞の通りやすい通路もまた存在する。
【0075】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に関連する使用のためのデバイスは、網膜下空間を開くプロセスの間の網膜下空間の可視化を可能にするために、ガイド針に直接組み込まれた光干渉断層撮影センサーを含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に関連する使用のためのデバイスは、伝播トンネルを安全にナビゲートするために、可撓性カニューレおよび注入器システムを含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に関連する使用のためのデバイスは、それを損傷するリスクが低減または除外された、ＭＡＲＣ組成物に対して力を発揮するプランジャーシステムを含み得る。
【実施例】
【0076】
以下の実施例は、本開示の主題の例示に過ぎず、決して限定と解釈すべきではない。
【0077】
（実施例１）
Ｓ錐体に対してＬ／Ｍ錐体が富化されたオルガノイドの調製
参照によってその全体が本明細書に組み込まれるEldred et al.,Science 2018, 362:6411 (2018):eaau6348,（Ｅｌｄｒｅｄら）に詳細に記載されるように、ヒトオルガノイドは、Ｓ錐体とその後のＬ錐体およびＭ錐体の時間的生成が含まれる、ヒト網膜において観察される錐体サブタイプの特定を再現することができる。さらに、この調節は、甲状腺ホルモンシグナル伝達によって制御され、これは、核ホルモン受容体である甲状腺ホルモン受容体β（Ｔｈｒβ）を介して錐体サブタイプ運命を制御するために必要かつ十分である。Ｅｌｄｒｅｄらに記載され、以下に概説されるように、本実施例は、Ｓ錐体に対してＬ／Ｍ錐体が富化されたオルガノイドを調製するための例示的な方法を提供する。
Ｓ錐体に対してＬ／Ｍ錐体が富化されたオルガノイドの調製
参照によってその全体が本明細書に組み込まれるEldred et al.,Science 2018, 362:6411 (2018):eaau6348,（Ｅｌｄｒｅｄら）に詳細に記載されるように、ヒトオルガノイドは、Ｓ錐体とその後のＬ錐体およびＭ錐体の時間的生成が含まれる、ヒト網膜において観察される錐体サブタイプの特定を再現することができる。さらに、この調節は、甲状腺ホルモンシグナル伝達によって制御され、これは、核ホルモン受容体である甲状腺ホルモン受容体β（Ｔｈｒβ）を介して錐体サブタイプ運命を制御するために必要かつ十分である。Ｅｌｄｒｅｄらに記載され、以下に概説されるように、本実施例は、Ｓ錐体に対してＬ／Ｍ錐体が富化されたオルガノイドを調製するための例示的な方法を提供する。
【0078】
オルガノイド中の錐体細胞の特定がヒト網膜における発生を再現するかどうかを決定するために、Ｅｌｄｒｅｄらは、ヒトオルガノイド中の錐体サブタイプの特色を、成人網膜組織のものと比較した。成人ヒト網膜および分化の２００日目のオルガノイドは、Ｓ－オプシンまたはＬ／Ｍ－オプシンの発現によって示されるように、Ｓ錐体のＬ／Ｍ錐体に対する類似の比を示した（成人、Ｓ＝１３％、Ｌ／Ｍ＝８７％；オルガノイド、Ｓ＝２９％、Ｌ／Ｍ＝７１％）（Ｅｌｄｒｅｄらの図１、ＢおよびＣ、ならびに図Ｓ１Ａ）。Ｅｌｄｒｅｄらは、比における差異が、最終分化した成人網膜と比較した、約６か月の時点でのオルガノイドの未熟さに起因する可能性が高いことを示している。Ｅｌｄｒｅｄらはまた、それらの極端に高い類似性に起因して、Ｌ－オプシンタンパク質およびＭ－オプシンタンパク質の両方を認識する抗体を用いて、Ｌ／Ｍ錐体を試験した。Ｓ錐体およびＬ／Ｍ錐体は共に、光受容体分化のために重要な転写因子である錐体－杆体－ホメオボックス転写因子（ＣＲＸ）を発現し（Ｅｌｄｒｅｄらの図２、ＡおよびＥ）、これは、オルガノイドにおける適切な運命特定を示している。さらに、Ｅｌｄｒｅｄらは、オルガノイドおよび網膜中の錐体が、Ｓ錐体のものよりも長い外節および広い内節を有するＬ／Ｍ錐体を伴って、類似の形態学を示したことを示した（Ｅｌｄｒｅｄらの図２、Ｂ～ＤおよびＦ～Ｈ）。錐体の外節は、成人網膜中よりも、オルガノイド中で短いこともまた示されており、これは、出生後の成熟化と一致している（Ｅｌｄｒｅｄらの図２、ＤおよびＨ）。したがって、Ｅｌｄｒｅｄらは、ヒト網膜オルガノイド中の錐体サブタイプが、ヒト網膜の錐体のものと類似の分布、遺伝子発現パターンおよび形態学を示したことに注目した。
【0079】
Ｅｌｄｒｅｄらは、オルガノイド中の錐体サブタイプ特定の発生的動態もまた試験した。ヒト網膜では、Ｓ錐体は、胎生１１～３４週（７７～２３８日）の間に生成されるが、Ｌ／Ｍ錐体は、胎生１４～３７週（９８～２５９日）の間に、より遅くに特定される。Ｅｌｄｒｅｄらは、３６０日間の分化にわたって、抗体染色によって、オルガノイド中のＳ錐体およびＬ／Ｍ錐体の比および密度を追跡した。Ｓ－オプシンを発現する錐体が、１５０日目に最初に観察された（Ｅｌｄｒｅｄらの図２、Ｉ、ＬおよびＭ）。Ｓ錐体の密度は、Ｌ／Ｍ－オプシンを発現する錐体が観察され始めた（Ｅｌｄｒｅｄらの図２、Ｊ～Ｍ）時点である１７０日目に頭打ちになった（Ｅｌｄｒｅｄらの図２Ｍ）。Ｌ／Ｍ錐体の集団は、定常状態密度に達する３００日目まで劇的に増加した（Ｅｌｄｒｅｄらの図２、Ｋ～Ｍ）。網膜オルガノイドにおけるＳ－オプシンの発現開始とＬ／Ｍ－オプシンの発現開始との間の２０日間の差異は、胎児網膜におけるＳ錐体およびＬ／Ｍ錐体の出現において観察された２０日間の差異と類似している。これらの観察は、網膜発生の間のＳ錐体特定からＬ／Ｍ錐体特定への時間的切り換えを示している。
【0080】
Ｅｌｄｒｅｄらは次に、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来オルガノイドの発生の２５０日間を通じて、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を実施した。Ｅｌｄｒｅｄらは、Ｓ－オプシンＲＮＡが、１１１日目に最初に発現され、１６０日目に頭打ちになったが、Ｌ／Ｍ－オプシンＲＮＡは、１６０日目に発現され、１８０日目の後に一定のままであったことを見出し、これは、オルガノイドおよび胎児網膜における光受容体成熟化のタイムラインと一致している（Ｅｌｄｒｅｄらの図２Ｎおよび図Ｓ１Ｂ）。さらに、ＣＲＸ ＲＮＡおよびＣＲＸタンパク質が、オルガノイドにおいてオプシンの前に発現され、これは、ヒト発生と類似している（Ｅｌｄｒｅｄらの図２Ｎおよび図Ｓ１、Ｂ～Ｇ）。したがって、ヒトオルガノイドは、ヒト網膜において観察される錐体サブタイプ特定の発生タイムラインの多くの局面を再現し、これらの発生的変化の機構を発見するためのモデルシステムを提供する。
【0081】
ヒト錐体サブタイプ特定におけるＴｈｒβ２の役割を直接試験するために、Ｅｌｄｒｅｄらは、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、Ｔｈｒβ２の第１エクソンにおける早期の転写終結を生じるホモ接合性変異を生成した（Ｅｌｄｒｅｄらの図Ｓ２Ａ）。驚くべきことに、これらの変異体幹細胞に由来をするオルガノイドは、遺伝子型的に野生型のオルガノイドと、錐体サブタイプ比における差異を示さなかった［野生型、Ｓ＝６２％、Ｌ／Ｍ＝３８％；Ｔｈｒβ２ノックアウト（ＫＯ）、Ｓ＝５９％、Ｌ／Ｍ＝４１％；Ｐ＝０．８３］。ＳのＬ／Ｍに対する比は、オルガノイド分化における可変性におそらくは起因して、野生型対照およびＴｈｒβ２ ＫＯオルガノイドの両方について高い。したがって、他の種に基づく以前の示唆とは異なり、Ｅｌｄｒｅｄらは、Ｔｈｒβ２を、ヒトにおける錐体サブタイプ特定にとって不可欠なものではないと考えている（Ｅｌｄｒｅｄらの図３、Ａ～Ｃ）。
【0082】
Ｔｈｒβ２単独がヒト錐体サブタイプ特定のために要求されるわけではないので、Ｅｌｄｒｅｄらは、Ｔｈｒβ１およびＴｈｒβ２が共に、ヒトにおける錐体サブタイプ特定のために要求されるかどうかを調べた。Ｔｈｒβ機能（Ｔｈｒβ１およびＴｈｒβ２）を完全に除去するために、Ｅｌｄｒｅｄらは、ヒトＥＳＣにおいてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、ＴｈｒβのＤＮＡ結合ドメインの一部をコードする共有のエクソンを欠失させた（Ｅｌｄｒｅｄらの図Ｓ２Ａ）。Ｔｈｒβヌル変異体網膜オルガノイドは、全ての錐体の、Ｓサブタイプへの完全な変換を示した（野生型、Ｓ＝２７％、Ｌ／Ｍ＝７３％；Ｔｈｒβ ＫＯ、Ｓ＝１００％、Ｌ／Ｍ＝０％；Ｐ＜０．０００１）（Ｅｌｄｒｅｄらの図３、Ｄ～ＥおよびＨ）。これらの変異体では、全ての錐体がＳ－オプシンを発現し、Ｓ錐体の形態学を有した（Ｅｌｄｒｅｄらの図３、ＩおよびＪ）。したがって、Ｔｈｒβは、ヒト網膜においてＬ／Ｍを活性化するため、およびＳ錐体運命を抑制するために要求される。
【0083】
Ｅｌｄｒｅｄらにおいて注目されたように、Ｔｈｒβは、甲状腺ホルモンのより活性な形態であるトリヨードチロニン（Ｔ３）に高い親和性で結合して、遺伝子発現を調節する。さらに、Ｔ３の枯渇または添加は、げっ歯類においてＳ錐体のＭ錐体に対する比を変更する。Ｌ／Ｍ錐体はＳ錐体の後に分化するので、Ｅｌｄｒｅｄらは、Ｔ３が、網膜発生において後期にＴｈｒβを介して作用して、Ｌ／Ｍ錐体運命を誘導し、Ｓ錐体運命を抑制すると仮説を立てた。この仮説の１つの予測は、発生における早期のＴ３の添加が、Ｌ／Ｍ運命を誘導し、Ｓ運命を抑制するというものである。このモデルを試験するために、Ｅｌｄｒｅｄらは、２０日目から開始して５０日目まで、ＥＳＣ由来オルガノイドおよびｉＰＳＣ由来オルガノイドに２０ｎＭのＴ３を添加し、分化の２００日目まで継続させた。Ｅｌｄｒｅｄらは、錐体細胞の、Ｌ／Ｍ運命への劇的な変換を観察した（野生型、Ｓ＝２７％、Ｌ／Ｍ＝７３％；野生型＋Ｔ３、Ｓ＝４％、Ｌ／Ｍ＝９６％；Ｐ＜０．０１）（Ｅｌｄｒｅｄらの図３、ＦおよびＨ、ならびに図Ｓ２Ｂ）。したがって、Ｔ３の早期添加が、Ｌ／Ｍ運命を誘導し、Ｓ運命を抑制するのに十分である。
【0084】
Ｔ３がＴｈｒβを介して錐体サブタイプ特定を制御するように特異的に作用するかどうかを試験するために、Ｅｌｄｒｅｄらは、早期Ｔ３添加によってＴｈｒβ変異体オルガノイドを分化させた。Ｔｈｒβ変異は、Ｔ３の効果を完全に抑制し、Ｓ錐体のみを有するオルガノイドを生成した（野生型＋Ｔ３、Ｓ＝４％、Ｌ／Ｍ＝９６％；Ｔｈｒβ ＫＯ＋Ｔ３、Ｓ＝１００％、Ｌ／Ｍ＝０％；Ｐ＜０．０００１）（Ｅｌｄｒｅｄらの図３、Ｆ～Ｈ）。これらの結果に基づいて、Ｅｌｄｒｅｄらは、Ｔ３がＴｈｒβを介してＬ／Ｍ錐体運命を促進し、Ｓ錐体運命を抑制するように作用すると結論付けた。
【0085】
Ｅｌｄｒｅｄらはまた、Ｔ３で処置した場合にＬ／Ｍ－オプシンを発現する網膜芽細胞腫細胞系において、甲状腺ホルモンシグナル伝達を介したＬ／Ｍ－オプシン発現の調節を確認した（Ｅｌｄｒｅｄらの図Ｓ２、ＣおよびＤ）。Ｌ／Ｍ－オプシン発現の、Ｔ３で誘導される活性化は、ＴｈｒβのＲＮＡ干渉ノックダウンの際に抑制され（Ｅｌｄｒｅｄらの図Ｓ２、ＥおよびＦ）、これは、ヒトオルガノイドにおいて観察される抑制と類似している。
【0086】
Ｅｌｄｒｅｄらは、オルガノイドにおいて、早期Ｔ３添加が、錐体細胞をＬ／Ｍ運命に変換しただけでなく、錐体密度を劇的に増加させたこともまた実証した（Ｅｌｄｒｅｄらの図３、ＦおよびＫ）。さらに、Ｔ３は、Ｔｈｒβを介して、錐体密度を制御するように特異的に作用する（Ｅｌｄｒｅｄらの図３、ＧおよびＫ）。早期Ｔ３添加は、Ｌ／Ｍ錐体生成の時間的ウインドウを進行させ延長させることによって、錐体密度を増加させ得る。
【0087】
合わせると、これらの結果は、Ｔ３が、発生中のヒト網膜組織において、Ｔｈｒβを介して、Ｌ／Ｍ錐体運命を促進し、Ｓ錐体運命を抑制するようにシグナル伝達することを実証している。
【0088】
Ｅｌｄｒｅｄらによって記載された材料および方法
【0089】
細胞系。Ｈ７ ＥＳＣ（ＷＡ０７、ＷｉＣｅｌｌ）およびエピソーム由来ＥＰ１．１ ｉＰＳＣ系を分化に使用したが、セクション５．３に上記したように、他の適切な細胞系が、当該分野で公知である。ＷＥＲＩ－Ｒｂ１網膜芽細胞腫細胞は、ＡＴＣＣから得た。細胞維持およびオルガノイド分化のプロトコールは、Ｅｌｄｒｅｄらの補足的材料に記載されている。
【0090】
ＣＲＩＳＰＲ変異。全ての変異を、Ｈ７ ＥＳＣにおいて生成した。細胞を、誘導性Ｃａｓ９エレメントを発現するように改変した。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）トランスフェクションのためのプラスミドを、Ｔ２ＡをＰ２Ａ配列で置き換えることによってｐＸ４５９＿Ｖ２．０プラスミド（６２９８８、Ａｄｄｇｅｎｅ）から改変されたｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏプラスミドを使用することによって、生成した。変異を、ポリメラーゼ連鎖反応配列決定を用いて確認した。欠失の遺伝子略図は、Ｅｌｄｒｅｄらの図Ｓ２Ａに示される。詳細なトランスフェクション手順、ｇＲＮＡ配列および相同性アーム配列は、Ｅｌｄｒｅｄらの補足的材料中に含まれている。
【0091】
免疫組織化学。一次抗体を、以下の希釈で、Ｅｌｄｒｅｄらにおいて使用した：ヤギ抗ＳＷ－オプシン（オルガノイドについては１：２００、ヒト網膜については１：５００）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗ＬＷ／ＭＷ－オプシン（オルガノイドについては１：２００、ヒト網膜については１：５００）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＣＲＸ（１：５００）（Ａｂｎｏｖａ）およびマウス抗ロドプシン（１：５００）（ＧｅｎｅＴｅｘ）。全ての二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート化し（１：４００）、ロバにおいて作製した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。オルガノイド、網膜およびＷＥＲＩ－Ｒｂ１細胞の固定、顕微鏡および画像処理のための詳細な方法は、Ｅｌｄｒｅｄらの補足的材料中に含まれている。
【0092】
オルガノイド齢。オプシン発現時間経過。時間経過実験のためのＥＰ１ ｉＰＳＣ由来オルガノイドを、Ｅｌｄｒｅｄらにおいて、分析のために１０日増分へとビニングした。オルガノイドを、１３０日目［実際は１２９日目（ｎ＝３オルガノイド）］、１５０日目［実際は１５２日目（ｎ＝４オルガノイド）］、１７０日目［実際は１７３日目（ｎ＝２オルガノイド）］、２００日目［実際は１９４～１９９日目（ｎ＝７オルガノイド）］、２９０日目［実際は２９１日目（ｎ＝３オルガノイド）］および３６０日目［実際は３６１日目（ｎ＝３オルガノイド）］へとビニングした。外節の長さおよび内節の幅の定量化を、３６１日目のオルガノイドにおいて測定した（ｎ＝３オルガノイド）。
【0093】
異なる条件におけるオプシン発現。Ｔｈｒｂ２ ＫＯおよび対照のためのｉＣａｓ９ Ｈ７ ＥＳＣ由来オルガノイドを、Ｅｌｄｒｅｄらにおいて、２００日目に分析した。Ｔｈｒｂ ＫＯ、対照および野生型＋Ｔ３のためのオルガノイドを、Ｅｌｄｒｅｄらにおいて、２つの時点で分析した：２つのオルガノイドを、各群について１９９日目に取得し、１つのオルガノイドを、各群について２７７日目に取得した。Ｔ３で処置したオルガノイドを、異なる分化について、１９５日目と２００日目との間の時点で取得した。各処置群および遺伝子型について、オルガノイドを、並行して成長させた対照オルガノイドと比較した。
【0094】
ＲＮＡ－ｓｅｑ時間経過。ＥＰ１ ｉＰＳＣ由来オルガノイドを、Ｅｌｄｒｅｄらにおいて、分化の１０日目～２５０日目の範囲の時点で分析した。Ｅｌｄｒｅｄらは、１０日目（ｎ＝３オルガノイド）、２０日目（ｎ＝２オルガノイド）、３５日目（ｎ＝３オルガノイド）、６９日目（ｎ＝３オルガノイド）、１１１日目（ｎ＝３オルガノイド）、１２８日目（ｎ＝３オルガノイド）、１５８日目（ｎ＝２オルガノイド）、１７３日目（ｎ＝３オルガノイド）、１８１日目（ｎ＝３オルガノイド）、２００日目（ｎ＝３オルガノイド）および２５０日目（ｎ＝３オルガノイド）に、試料を取得した。個々のオルガノイドからのＲＮＡを、Ｚｙｍｏ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造業者の指示に従って使用することによって抽出した。ライブラリーを、Ｅｌｄｒｅｄらにおいて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡキットを使用して調製し、単一２００塩基対読み取りを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００で配列決定した。
【0095】
ＲＮＡ－ｓｅｑ時間経過分析。発現レベルを、Ｅｌｄｒｅｄらにおいて、以下のパラメーター：「－ｂ １００ －１ ２００ －ｓ １０ －ｔ ２０－単一」と共にＫａｌｌｉｓｔｏ（バージョン０．３４．１）を使用して定量化した。Ｇｅｎｃｏｄｅ ｒｅｌｅａｓｅ ２８包括的アノテーションを、参照トランスクリプトームとして使用した。次いで、転写物パーミリオン（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）（ＴＰＭ）値（Ｅｌｄｒｅｄらの表Ｓ１）を使用して、Ｐｒｉｓｍにおいてグラフを生成し、ｇｇｐｌｏｔ２を使用してＲにおいてヒートマップを生成した。最良の低いＴＰＭカットオフを同定するために、転写物の分布をプロットした（Ｅｌｄｒｅｄらの図Ｓ５Ａ）。閾値は、０．７ｌｏｇ（ＴＰＭ＋１） － ５ＴＰＭ － であると決定され、この値を、ヒートマップのための変曲点として使用した。Ｅｌｄｒｅｄらの図Ｓ３、Ａ～Ｃについてのヒートマップは、Hoshino et al., Dev. Cell 43, 763-779.e4 (2017)からのＣＰＭ値を使用することによって、同様に作製した。
【0096】
測定および定量化。Ｅｌｄｒｅｄらにおける網膜面積および細胞形態学の測定は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用することによって行った。Ｅｌｄｒｅｄらにおける定量化および統計学（ＲＮＡ－ｓｅｑデータを除く）は、０．０１の有意性カットオフを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで行った。統計的検定は、Ｅｌｄｒｅｄらの図の説明文に列挙され、全てのエラーバーは、ＳＥＭを表す。
【0097】
（実施例２）
Ｌ錐体に対してＭ錐体が富化されたオルガノイドの調製
参照によってその全体が本明細書に組み込まれるHadyniak et al.,bioRxiv, 2021.03.30.437763 (2021)（Ｈａｄｙｎｉａｋら）に詳細に記載されるように、ヒトオルガノイドは、Ｌ錐体およびＭ錐体の時間的生成が含まれる、ヒト網膜において観察される錐体サブタイプの特定を再現することができる。さらに、この調節は、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達によって制御される。Ｈａｄｙｎｉａｋらに記載され、以下に概説されるように、本実施例は、Ｌ錐体に対してＭ錐体が富化されたオルガノイドを調製するための例示的な方法を提供する。
Ｌ錐体に対してＭ錐体が富化されたオルガノイドの調製
参照によってその全体が本明細書に組み込まれるHadyniak et al.,bioRxiv, 2021.03.30.437763 (2021)（Ｈａｄｙｎｉａｋら）に詳細に記載されるように、ヒトオルガノイドは、Ｌ錐体およびＭ錐体の時間的生成が含まれる、ヒト網膜において観察される錐体サブタイプの特定を再現することができる。さらに、この調節は、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達によって制御される。Ｈａｄｙｎｉａｋらに記載され、以下に概説されるように、本実施例は、Ｌ錐体に対してＭ錐体が富化されたオルガノイドを調製するための例示的な方法を提供する。
【0098】
Ｈａｄｙｎｉａｋらに記載されるように、ＲＡシグナル伝達は、ヒト網膜オルガノイドにおいて、Ｍ錐体運命を早期に促進し、Ｌ錐体運命を抑制する。ヒト網膜オルガノイドの分化には、早期網膜パターン形成を促進するための、２０～４３日目のオール－トランスＲＡ（本明細書で以後ＲＡと呼ばれる）の添加が伴う（Ｈａｄｙｎｉａｋらの図Ｓ５）。ＲＡは、原始的網膜分化の最後および細胞運命特定の完全な持続時間を含む時間枠である、４３日目～２００日目には添加しなかった（「ＲＡなし」）。
【0099】
Ｈａｄｙｎｉａｋらは、ヒト網膜オルガノイド発生の間のＭ錐体およびＬ錐体生成のタイミングを試験するために、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアプローチを最初に使用した。１２０日目に、Ｈａｄｙｎｉａｋらは、Ｍ錐体およびＬ錐体をほとんど観察しなかった（Ｈａｄｙｎｉａｋらの図４Ａ、Ｓ６Ａ）。Ｈａｄｙｎｉａｋらは、１４０日目に、顕著な数のＭ錐体およびＬ錐体を最初に観察した（Ｈａｄｙｎｉａｋらの図４Ａ、Ｓ６Ａ）。１４０日目から２００日目まで、オルガノイドは、Ｌ錐体について富化された（Ｈａｄｙｎｉａｋらの図４Ａ～Ｂ、Ｓ６Ａ）。これらの観察は、このプロトコールを用いて分化させたヒト網膜オルガノイドが、ヒト胎児発生におけるようなＬ錐体の前にＭ錐体の大きい集団を生成させるための発生的合図を欠いていることを示唆した。
【0100】
ＲＡの添加が網膜オルガノイドにおいてＭ錐体生成を誘導したかどうかを試験するために、Ｈａｄｙｎｉａｋらは、異なる時間枠にわたって１．０μＭのＲＡを添加し、２００日目にＭ錐体およびＬ錐体を評価した（Ｈａｄｙｎｉａｋらの図４Ｃ）。発生全体を通じて追加のＲＡ中で成長させたオルガノイドは、分化することができず、最小限のＭ錐体またはＬ錐体を生じた（Ｎ＝６）。４３～１３０日目の、発生における早期のＲＡの添加は、２００日目に、ほぼ排他的にＭ錐体のオルガノイドを生じた（９８．３５％のＭ、１．６５％のＬ、０％の共発現；Ｈａｄｙｎｉａｋらの図４Ｄ～Ｅ；「早期ＲＡ」）。この観察を補強するために、Ｈａｄｙｎｉａｋらは、「早期ＲＡ」条件で成長させたＥＳＣ由来オルガノイドに対してＲＮＡ－ｓｅｑを実施し、高いＭ－オプシンおよび最小限のＬ－オプシン発現を観察した（Ｈａｄｙｎｉａｋらの図Ｓ１Ｃ）。Ｈａｄｙｎｉａｋらは、「早期ＲＡ」条件で成長させたｉＰＳＣ由来オルガノイドについての以前に公開されたＲＮＡ－ｓｅｑデータもまた分析し、Ｍ－オプシンのほぼ排他的な発現を観察した（Ｈａｄｙｎｉａｋらの図Ｓ１Ｄ）。１３０～２００日目の、発生における後期のＲＡの添加は、２００日目に、さらなるＲＡなしで成長させたオルガノイドと類似の、Ｌ錐体が富化されたオルガノイドを生じた（６．３５％のＭ、９２．５６％のＬ、１．１０％の共発現；Ｈａｄｙｎｉａｋらの図４Ｄ～Ｅ；「後期ＲＡ」）。Ｈａｄｙｎｉａｋらは、実験条件にわたって、２００日目に、全体的なＭ／Ｌ錐体密度における有意な差異を観察しなかった（Ｈａｄｙｎｉａｋらの図Ｓ６Ｂ）。合わせると、これらのデータは、網膜オルガノイド発生の早期に、Ｍ錐体を誘導し、Ｌ錐体を抑制するのに、ＲＡが十分であることを示している。
【0101】
Ｈａｄｙｎｉａｋらによって記載された材料および方法
【0102】
細胞系維持。Ｈ７ ＥＳＣ（ＷＡ０７、ＷｉＣｅｌｌ）およびエピソーム由来ＥＰ１．１ ｉＰＳＣを、網膜オルガノイド分化のために、Ｈａｄｙｎｉａｋらにおいて使用した。幹細胞を、Ｈａｄｙｎｉａｋらにおいて、１％（ｖ／ｖ）のＭａｔｒｉｇｅｌ－ＧＦＲ（商標）（３５４２３０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コーティング皿上でｍＴｅＳＲ（商標）（８５８５７、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持し、ＨＥＲＡｃｅｌｌ １５０ｉまたは１６０ｉ １０％ＣＯ２および５％Ｏ２インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３７℃で成長させた。細胞を、Ｈａｄｙｎｉａｋらにおいて、Wahlin et al., Sci Rep 7, 766 (2017)と同様に、コンフルエンスに従って４～５日毎に継代し、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳＣＲ００５、Ｓｉｇｍａ）を７～１２分間用いて継代して、単一細胞へと解離させた。Ａｃｃｕｔａｓｅ中の細胞を、１：２でｍＴｅＳＲ（商標）１プラス５μＭのブレビスタチン（Ｂｌｅｂ、Ｂ０５６０、Ｓｉｇｍａ）に添加し、１５０ｇで５分間ペレット化し、ｍＴｅＳＲ（商標）１プラスＢｌｅｂ中に懸濁し、１ウェル当たり５，０００～１５，０００細胞で、６ウェルプレート中にプレートした。継代の４８時間後、および再度の継代まで２４時間毎に細胞にｍＴｅＳＲ（商標）を供給した。細胞のストレスを最小化するため、抗生物質は使用しなかった。
【0103】
Ｗｅｒｉ－Ｒｂ－１網膜芽細胞腫細胞は、ＡＴＣＣから得、Ｈａｄｙｎｉａｋらにおいて、ＲＰＭＩ １６４０培地（１１８７５１３５、Ｇｉｂｃｏ）＋１０％胎仔ウシ血清（１６１４００７１、Ｇｉｂｃｏ）＋１×ペニシリン－ストレプトマイシン（３０－００２－ＣＩ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、ＨＥＲＡｃｅｌｌ １５０ｉまたは１６０ｉ ５％ＣＯ２インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３７℃で維持した。細胞を、１５０ｇで５分間ペレット化し、新たな培地中に再懸濁することによって、約１×１０５～２×１０６細胞／ｍＬで、コーティングされていないフラスコ中に４日毎に継代した。
【0104】
細胞系を、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（ＬＴ０７、Ｌｏｎｚａ）を使用して、マイコプラズマについて毎月試験した。
【0105】
細胞培養培地。幹細胞培地ｍＴｅＳＲ１（８５８５７、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｅ６サプリメント：９７０μｇ／ｍＬのインスリン（１１３７６４９７００１、Ｒｏｃｈｅ）、５３５μｇ／ｍＬのホロ－トランスフェリン（Ｔ０６６５、Ｓｉｇｍａ）、３．２０ｍｇ／ｍＬのＬ－アスコルビン酸（Ａ８９６０、Ｓｉｇｍａ）、０．７μｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム（Ｓ５２６１、Ｓｉｇｍａ）。早期網膜分化のためのＢＥ６．２培地：ＤＭＥＭ（１１８８５０８４、Ｇｉｂｃｏ）中２．５％のＥ６サプリメント（上記）、２％のＢ２７サプリメント（５０×）マイナスビタミンＡ（１２５８７０１０、Ｇｉｂｃｏ）、１％のＧｌｕｔａｍａｘ（３５０５００６１、Ｇｉｂｃｏ）、１％のＮＥＡＡ（１１１４００５０、Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルベート（１１３６００７０、Ｇｉｂｃｏ）および０．８７ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ。ＬＴＲ（長期網膜）培地：ＤＭＥＭ（１１８８５０８４、Ｇｉｂｃｏ）中２％のＢ２７のサプリメント（５０×）（１７５０４０４４、Ｇｉｂｃｏ）、１０％の熱不活化ＦＢＳ（１６１４００７１、Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１％のＮＥＡＡ、１％のＧｌｕｔａｍａｘおよび１ｍＭのタウリン（Ｔ－８６９１、Ｓｉｇｍａ）を含む２５％のＦ１２（１１７６５０６２、Ｇｉｂｃｏ）。ＲＰＭＩ＋補充培地：ＲＰＭＩ培地１６４０（１１８７５１３５、Ｇｉｂｃｏ）中１０％の熱不活化ＦＢＳ（１６１４００７１、Ｇｉｂｃｏ）、２．５％のペニシリン（３０－００２－ＣＩ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。
【0106】
レチノイン酸処置：オルガノイドについて、ＬＴＲ中１．０４μＭのオール－トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ；Ｒ２６２５；Ｓｉｇｍａ）。
【0107】
甲状腺ホルモン処置：Ｗｅｒｉ－Ｒｂ１細胞について、ＲＰＭＩ＋補充培地中１００ｎＭのＴ３（Ｔ６３９７、Ｓｉｇｍａ）。
【0108】
オルガノイド分化。オルガノイドを、軽微なバリエーションを伴って、Eldred etal. 2018に記載されるように、Ｈ７ ＷＡ０７、Ｈ７ｉＣａｓ９ ＥＳＣまたはＥＰ１．１ ｉＰＳＣから分化させた（Ｈａｄｙｎｉａｋらの図Ｓ５）。多能性幹細胞は良好に維持された。最小限の自発的分化を有する～自発的分化を有さない培養物を、凝集に使用した。凝集させるために、細胞を、完全な解離を確実にするために、３７℃で１２分間、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳＣＲ００５、Ｓｉｇｍａ）中で継代した。細胞を、５０μＬのｍＴｅＳＲ１中３，０００細胞／ウェルで、９６ウェル超低接着丸底Ｌｉｐｉｄｕｒｅコーティングプレート（５１０１１６１０、ＮＯＦ）または超低付着マイクロプレート（７００７、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に播種した。細胞を、生存を増強するために、低酸素条件（１０％ＣＯ２および５％Ｏ２）中に２４時間置いた。細胞は、２４時間かけて重力によって自然に凝集した。
【0109】
１日目に、細胞を正常酸素圧条件（５％ＣＯ２）に移動させた。１～３日目に、３μＭのＷｎｔ阻害剤（ＩＷＲ１ｅ：６８１６６９、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および１％（ｖ／ｖ）のＭａｔｒｉｇｅｌを含有するＢＥ６．２培地５０μＬを、各ウェルに添加した。４～９日目に、１００μＬの培地を各ウェルから除去し、１００μＬの培地を添加した。４～５日目に、３μＭのＷｎｔ阻害剤および１％のＭａｔｒｉｇｅｌを含有するＢＥ６．２培地を添加した。６～７日目に、１％のＭａｔｒｉｇｅｌ（３５４２３０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＢＥ６．２培地を添加した。８～９日目に、１％のＭａｔｒｉｇｅｌおよび１００ｎＭのＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（ＳＡＧ：５６６６６０、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有するＢＥ６．２培地を添加した。
【0110】
１０日目に、凝集物を、１５ｍＬチューブに移し、５ｍＬのＤＭＥＭ（１１８８５０８４、Ｇｉｂｃｏ）中で３回すすぎ、未処置の１０ｃｍポリスチレンペトリ皿中で１００ｎＭのＳＡＧを含むＢＥ６．２中に再懸濁した。この時点から、培地を１日おきに交換した。凝集物をモニタリングし、一緒にまたはプレートの底にくっついた場合、手動で分離した。
【0111】
１３～１６日目に、１００ｎＭのＳＡＧを含むＬＴＲ培地を添加した。１６日目に、網膜小胞を、鋭利なタングステン針を使用して、手動で切り出した。切り出し後、細胞を１５ｍＬチューブ中に移し、５ｍＬのＤＭＥＭで２回洗浄した。１６～２０日目に、細胞をＬＴＲ中で維持し、５ｍＬのＤＭＥＭで２回洗浄した後、新たなプレートに移して、死細胞を洗浄して除いた。生存および分化を増加させるために、１．０４μＭのオール－トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ；Ｒ２６２５；Ｓｉｇｍａ）を、２０～４３日目に、ＬＴＲ培地に添加した。１．０４μＭのさらなる時間ウインドウを、実験条件に依存して追加した。１０μＭのガンマ－セクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴ、５６５７７０、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、２８～４２日目に、ＬＴＲに添加した。オルガノイドを低い密度（１０ｃｍの皿１つ当たり１０～２０）で成長させて、凝集を低減させた。定期的に、オルガノイドを、適切な網膜オルガノイド成長を示す透明な薄層構造の非存在に基づいて、プレートから間引いた。
【0112】
ＲＮＡ－Ｓｅｑ実験。ＥＰ１ ｉＰＳＣ由来オルガノイドを、前もって成長させ、Ｅｌｄｒｅｄらについて、分化の１０日目～２５０日目の範囲の時点で分析した。試料を、１０日目（Ｎ＝３）、２０日目（Ｎ＝２）、３５日目（Ｎ＝３）、６９日目（Ｎ＝３）、１１１日目（Ｎ＝３）、１２８日目（Ｎ＝３）、１５８日目（Ｎ＝２）、１７３日目（Ｎ＝３）、１８１日目（Ｎ＝３）、２００日目（Ｎ＝３）および２５０日目（Ｎ＝３）に取得した。
【0113】
Ｈ７ ＥＳＣ由来オルガノイドを、３２９日目に取得した（Ｎ＝３）。
【0114】
Ｗｅｒｉ－Ｒｂ－１試料を、対照ＲＰＭＩ＋補充培地またはＴ３で処置したＲＰＭＩ＋補充培地中で、４日間成長させた（Ｎ＝１）。
【0115】
個々の試料からのＲＮＡを、Ｚｙｍｏ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｒ２０６２、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造業者の指示に従って使用して抽出した。ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡキットを使用して調製し、単一７５ｂｐ読み取りを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００で配列決定した。
【0116】
ヒト網膜およびオルガノイドの調製および凍結切片化。ヒト網膜。ドナー試料を、死後１０．９時間の時点でドライアイス上で瞬間凍結させ、－８０℃で貯蔵した。ヒト眼を、１×ＰＢＳ中で室温にし、網膜を眼から切り出した。網膜を、１０％中性緩衝ホルマリン（ＨＴ５０１１２８、Ｓｉｇｍａ）中で４５分間固定し、１×ＰＢＳ中で洗浄した。網膜の小切片を、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（４５８３、Ｓａｋｕｒａ）中にマウントし、ドライアイス上に置いて凍結させ、－８０℃で貯蔵した。網膜を、１０μｍ切片で切片化した。スライドを、１０％中性緩衝ホルマリン（ＨＴ５０１１２８、Ｓｉｇｍａ）中で１５分間の固定後ステップを伴って、６時間～一晩風乾し、１×ＰＢＳ中で洗浄した。スライドを乾燥させ、使用前に３か月未満にわたって－８０℃で貯蔵した。
【0117】
オルガノイド。オルガノイドを、１０％中性緩衝ホルマリン（ＨＴ５０１１２８、Ｓｉｇｍａ）中で４５分間固定し、１×ＰＢＳ中で洗浄した。オルガノイドを、０．１Ｍのリン酸緩衝溶液中２５％のスクロース中に一晩置き、次いで、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（４５８３、Ｓａｋｕｒａ）中にマウントし、ドライアイス上に置いて凍結させ、－８０℃で貯蔵した。オルガノイドを、１０μｍ切片で切片化した。スライドを、１０％中性緩衝ホルマリン（ＨＴ５０１１２８、Ｓｉｇｍａ）中で１５分間の固定後ステップを伴って、６時間～一晩風乾し、１×ＰＢＳ中で洗浄した。スライドを乾燥させ、使用前に３か月未満にわたって－８０℃で貯蔵した。
【0118】
Ｈａｄｙｎｉａｋらにおいて用いたオルガノイド細胞系：ＲＡなし：Ｈ７ ＥＳＣ（Ｎ＝３）；早期ＲＡ：Ｈ７ ＥＳＣ（Ｎ＝１）、Ｈ７ ｉＣａｓ９ ＥＳＣ（Ｎ＝２）；および後期ＲＡ：Ｈ７ｉＣａｓ９ ＥＳＣ（Ｎ＝５）。
【0119】
ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。ＢａｓｅＳｃｏｐｅ ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、製造業者の指示に従って、いくつかの変更で改変して、実施した。プローブ配列は、ヒトゲノムｈｇ３８由来のＯＰＮ１ＭＷおよびＯＰＮ１ＬＷ ｍＲＮＡ配列ＮＭ＿０００５１３．２ ＮＭ＿０２００６１．５に基づいて、ＡＣＤ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅが設計した。
【0120】
切片を、－８０℃での貯蔵から室温にし、１×ＰＢＳ中で再湿潤化した。試料を、製造業者の指示に従って事前処置した：１０分間のＲＮＡｓｃｏｐｅ過酸化水素と、その後の、ｄＨ２Ｏ中で１回の洗浄、次いで、１×ＰＢＳ中で２回の洗浄。
【0121】
ＲＮＡｓｃｏｐｅプロテアーゼＩＩＩを、ＨＥＫ２９３細胞について、１×ＰＢＳ中１：１５希釈で、湿潤チャンバー中で１５分間適用した。ＲＮＡｓｃｏｐｅプロテアーゼＩＶを、オルガノイドおよびヒト眼試料について、湿潤チャンバー中で２０分間適用した。試料を、１×ＰＢＳで２回洗浄した。
【0122】
プローブを、製造業者が示唆した濃度で、蓋およびインサート付きのＨｙｂＥＺ湿度制御ラック中で試料に添加し、ＨｙｂＥＺオーブン中に４０℃で２時間入れた。試料を、１×ＲＮＡｓｃｏｐｅ洗浄緩衝液中で２分間で２回洗浄した。
【0123】
増幅および発色洗浄を、Ｈａｄｙｎｉａｋらにおいて、推奨濃度に対する変更なしに、製造業者の試薬を用いて行った。全ての洗浄を、室温（ＲＴ）で、またはＨｙｂＥＺオーブン中で４０℃で、蓋およびインサート付きのＨｙｂＥＺ湿度制御ラック中で行った。
【0124】
１×ＲＮＡＳｃｏｐｅ緩衝液中で２分間の洗浄２回を、各試薬洗浄の間に実施した。最終洗浄は、水道水中であった。スライドを、ＨｙｂＥＺオーブン中で、６５℃で最低３０分間ベークした。試料を、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈ－５０００）封入剤および密封カバースリップを用いて保存した。
【0125】
オルガノイドのイメージング。全ての連続切片化したオルガノイドをイメージングし、手動で計数した。１５０個未満の錐体（ｎ≦１５０）を有したオルガノイドは、Ｈａｄｙｎｉａｋらでは、分析から除去した。統計的検定は、Ｈａｄｙｎｉａｋらの図の説明文中に列挙され、全てのエラーバーは、ＳＥＭを表す。
【0126】
（実施例３）
レチノイン酸（ＲＡ）を欠如する培養条件における光受容体正体の比における時間的バリエーション
網膜オルガノイドを、４３日目（早期網膜発生の最後）の後に、外因性ＲＡの添加を欠如する培地中で、実施例１および２に概して記載されたように、成長させた。オルガノイドを、発生にわたる種々の時点において、Ｓ－オプシンおよびＭ／Ｌ－オプシンについて染色した。このデータから、錐体サブタイプの密度を、経時的に定量化した。図４に示されるように、本プロトコールの遂行は、錐体細胞の１００％を構成する、最初に特定されるＳ錐体を生じる。Ｍ／Ｌ錐体特定が開始すると、錐体のサブ集団は、ＳオプシンおよびＭ／Ｌオプシンを共発現する。この共発現は、後に解消され、経時的に、Ｍ／Ｌ錐体が、錐体サブタイプの大部分を構成する。１３０日目には、５０％よりも多くの錐体が、Ｍ／Ｌ正体のものであり、この近似比は、研究したさらなる時点において持続する。
レチノイン酸（ＲＡ）を欠如する培養条件における光受容体正体の比における時間的バリエーション
網膜オルガノイドを、４３日目（早期網膜発生の最後）の後に、外因性ＲＡの添加を欠如する培地中で、実施例１および２に概して記載されたように、成長させた。オルガノイドを、発生にわたる種々の時点において、Ｓ－オプシンおよびＭ／Ｌ－オプシンについて染色した。このデータから、錐体サブタイプの密度を、経時的に定量化した。図４に示されるように、本プロトコールの遂行は、錐体細胞の１００％を構成する、最初に特定されるＳ錐体を生じる。Ｍ／Ｌ錐体特定が開始すると、錐体のサブ集団は、ＳオプシンおよびＭ／Ｌオプシンを共発現する。この共発現は、後に解消され、経時的に、Ｍ／Ｌ錐体が、錐体サブタイプの大部分を構成する。１３０日目には、５０％よりも多くの錐体が、Ｍ／Ｌ正体のものであり、この近似比は、研究したさらなる時点において持続する。
【0127】
本出願を通じて引用された全ての図、ならびに全ての参考文献、特許および公開された特許出願および受託番号の内容は、参照によって明示的に本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】