特表 2024-529743 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用の応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-08

(54)【発明の名称】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用の応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/742 20150101AFI20240801BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240801BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240801BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240801BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240801BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240801BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20240801BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240801BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240801BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240801BHJP

【ＦＩ】

A61K35/742

A61P1/00

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K39/395 U

A61K39/395 T

A61K9/14

A61K9/19

A61K47/26

A61K9/08

A61K47/02

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024509507

(86)(22)【出願日】2022-10-09

(85)【翻訳文提出日】2024-02-16

(86)【国際出願番号】 CN2022124020

(87)【国際公開番号】W WO2023056962

(87)【国際公開日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】202111177854.3

(32)【優先日】2021-10-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522179507

【氏名又は名称】施慧達薬業集団（吉林）有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＩＨＵＩＤＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＧＲＯＵＰ （ＪＩＬＩＮ） ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ９９９， Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ， Ｂａｉｓｈａｎ， Ｊｉｌｉｎ， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110003823

【氏名又は名称】弁理士法人柳野国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】王勇

(72)【発明者】

【氏名】朱紅

(72)【発明者】

【氏名】張文華

(72)【発明者】

【氏名】▲けい▼艶秋

(72)【発明者】

【氏名】王丹

(72)【発明者】

【氏名】劉園園

(72)【発明者】

【氏名】王少鵬

(72)【発明者】

【氏名】鄭嘉輝

(72)【発明者】

【氏名】張蓉

(72)【発明者】

【氏名】李暁楠

(72)【発明者】

【氏名】徐興魯

(72)【発明者】

【氏名】姜聖彪

(72)【発明者】

【氏名】▲けい▼立超

(72)【発明者】

【氏名】▲ごう▼玉霞

(72)【発明者】

【氏名】邵石麗

(72)【発明者】

【氏名】韓停

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA11

4C076AA29

4C076BB11

4C076CC27

4C076DD23

4C076DD67

4C076GG06

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE03

4C085GG01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC68

4C087CA09

4C087MA02

4C087MA16

4C087MA43

4C087MA44

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA66

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明はＣｌｏｓｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌とペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）の併用のガンの治療における応用に関する。本発明は初めてＣｌｏｓｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用が結腸がんの治療効果を顕著に高めることができ、同時にペムブロリズマブの使用量を下げ、高効率且つ低毒性であることを発見した。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌の腫瘍溶解は多種の方式によってＴＭＥ免疫原性に影響し、ＴＭＥを一つの免疫抑制状態から免疫活性状態に変化させると同時に、免疫抑制性ＴＭＥを調節し、免疫耐性を打破することができる。最適な組み合わせ条件下でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用は約２０％のマウス腫瘍組織が完全に除去され、ＰＤ－１抗体による腫瘍患者の治療の受益範囲を拡大し、さらにＰＤ－１抗体による治療が失敗した患者にも顕著な治療効果があった。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用の結腸がん治療用薬物の製造におけるの応用。

【請求項2】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの使用順序は、先Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞後ペムブロリズマブであることを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項3】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞は注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末であることを特徴とする請求項２に記載の応用。

【請求項4】

結腸がん治療用薬物であって、前記薬物中の薬効成分はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブを含むことを特徴とする結腸がん治療用薬物。

【請求項5】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ ＭＷ－ＤＣＧ－ＬＣｖ－２６菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株番号はＶ１２／００１４８６であり）またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株であることを特徴とする請求項４に記載の薬物。

【請求項6】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株はＭＷ－ＤＣＧ－ＨＮＣｖ－１８菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８５であり）であることを特徴とする請求項４に記載の薬物。

【請求項7】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株はＭＷ－ＤＣＧ－ＣＣｖ－１７菌株（オーストラリア国立計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８７であり）であることを特徴とする請求項４に記載の薬物。

【請求項8】

前記薬物の中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞は注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末であり、前記注射用芽胞凍結乾燥粉末中の添加剤は１％スクロースであることを特徴とする請求項４に記載の薬物。

【請求項9】

前記注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌凍結乾燥粉末の凍結乾燥プロセスは、凍結段階－４０℃ ４ｈ、－３５℃１０ｍｉｎ同時に真空引き、－３０℃ １０ｍｉｎ、－２５℃ １０ｍｉｎ、－２０℃ ２６ｈ、－１５℃ ２ｈ、－１０℃ １０ｍｉｎ、－５℃ １０ｍｉｎ、０℃ １０ｍｉｎ、１０℃２ｈ、１５℃ １０ｍｉｎ、２０℃ ３ｈ、２７℃ ３ｈで凍結乾燥して調製を行うことであることを特徴とする請求項８に記載の薬物。

【請求項10】

前記ペムブロリズマブはＰＤ－１抗体注射液であることを特徴とする請求項３に記載の薬物。

【請求項11】

前記１×１０^７ＣＦＵ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞あたり、濃度１ｍｇ／ｍＬのペムブロリズマブ溶液０．２ｍｇを併用することを特徴とする請求項３に記載の薬物。

【請求項12】

前記ペムブロリズマブ溶液の溶媒は質量百分率濃度０．９％の塩化ナトリウム注射液であることを特徴とする請求項１１に記載の薬物。

【請求項13】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞は注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末であり、前記注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末の溶媒は滅菌注射用水と質量百分濃度０．９％塩化ナトリウム注射液であることを特徴とする請求項１１に記載の薬物。

【請求項14】

請求項３～１３のいずれか１項に記載の薬物の結腸がん治療におけるの応用。

【請求項15】

前記薬物中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの使用順序は、先Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞後ペムブロリズマブであることを特徴とする請求項１４に記載の応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本願は、２０２１年１０月０９日に中国特許庁へ提出された、出願番号ＣＮ２０２１１１１７７８５４．３であり、発明の名称「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とＰｄ－１抗体の併用の応用」である中国特許出願に基づく優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は生物医薬技術分野に属し、具体的にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ（クロストリジウム・ゴニイ）菌芽胞とペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）の併用の応用に関する。

【背景技術】

【0003】

腫瘍微小環境（Ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、ＴＭＥ）は、腫瘍成長において、腫瘍細胞、基質細胞（線維芽細胞、免疫・炎症細胞及びいくつかの血管内皮細胞などを含む）と細胞外基質及びそこに浸潤した生体分子などとともに構成する局所定常環境である。ＴＭＥは腫瘍の発生、発展、侵襲などに必要な物質基礎を提供し、腫瘍転移、再発などの多種の生物学的行為を制御する。同時にＴＭＥは腫瘍の薬剤耐性と耐放射性を増加させ、治療効果を低下させることができる。ＴＭＥ内の免疫調節は、腫瘍発生・発展において、重要な機能を持ち、多種のメカニズムにより、腫瘍局所免疫抑制を形成することができる。ＴＭＥ免疫治療戦略をどのように制御するか、積極的な免疫微小環境を再構築することは抗腫瘍治療の重点と難点である。

【0004】

ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）はＰＤ－１阻害剤薬物であり、ＰＤ－１は重要な免疫抑制分子であり、ＰＤ－１抗体は臨床で顕著な抗腫瘍効果を示し、後期転移患者に対する持続的な治療効果を含む。一般的には、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性は腫瘍ネオアンチゲン負荷及び腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中の免疫細胞浸潤の程度及び組成に依存すると考えられている。残念ながら、多くのよく見られる腫瘍は大量の突然変異と免疫細胞浸潤を示すことはないため、腫瘍は免疫チェックポイント阻害剤に感受性を有しなく、応答率が低く、２０％の患者だけに対して有効である。そのため、現在の重点研究方向の一つは、免疫治療に対してこれらの腫瘍をより敏感にさせる方法を開発することである。

【0005】

Ｃｌｏｓｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ（Ｃｌｏｓｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ）菌は厳格な嫌気性菌であり、腫瘍をそらす低酸素特性を有し、腫瘍の無酸素区のみに定植できる。Ｃｌｏｓｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌の腫瘍溶解は、大量の樹状細胞、好中球、マクロファージを含む先天免疫細胞及びＣＤ^３＋Ｔ、ＣＤ^４＋Ｔ、ＣＤ^８＋Ｔなどの特異的免疫細胞である免疫細胞を募集し、ＴＭＥに浸潤することができ、ＴＭＥ中の免疫細胞の浸潤程度及び組成を変えることができる。同時に腫瘍中のＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６などのサイトカイン、及びケモカインの発現の増強を促進する。以上から分かるように、Ｃｌｏｓｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌の腫瘍溶解は多種の方式によってＴＭＥ免疫原性に影響し、ＴＭＥを一つの免疫抑制状態から免疫活性状態に変化させる同時、免疫耐性を打破し、Ｃｌｏｓｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌と免疫チェックポイント阻害剤を併用して高効率抗腫瘍を可能にする。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、従来技術の不足に基づいて、Ｃｌｏｓｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用の応用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の技術方案は以下の通りである。

【0008】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用の結腸がん治療用薬物の製造におけるの応用。
結腸がん治療用薬物であって、薬物中の薬効成分はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブを含む。
本発明は好ましくは、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ ＭＷ－ＤＣＧ－ＬＣｖ－２６菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株番号はＶ１２／００１４８６であり）である。他の好ましい菌株はＭＷ－ＤＣＧ－ＨＮＣｖ－１８菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８５であり）、ＭＷ－ＤＣＧ－ＣＣｖ－１７菌株（オーストラリア国立計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８７であり）等である。
本発明は、好ましくは、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌は芽胞形態である。
本発明は、好ましくは、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞形態は凍結乾燥粉末剤であり、その添加剤は１％ショ糖である。
本発明は、好ましくは、前記ペムブロリズマブはＰＤ－１抗体注射液である。
さらに好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末剤の凍結乾燥プロセスは、凍結段階－４０℃ ４ｈ、－３５℃ １０ｍｉｎ同時に真空引き、－３０℃１０ ｍｉｎ、－２５℃ １０ｍｉｎ、－２０℃ ２６ｈ、－１５℃ ２ｈ、－１０℃１０ｍｉｎ、－５℃ １０ ｍｉｎ、０℃ １０ｍｉｎ、１０℃２ｈ、１５℃ １０ｍｉｎ、２０℃ ３ｈ、２７℃ ３ｈで凍結乾燥して調製を行う。
本発明の好ましい薬物の併用は１×１０^７ＣＦＵ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末あたり、濃度１ｍｇ／ｍＬのペムブロリズマブ注射液０．２ｍｇを組み合わせるものである。
さらに好ましくは、前記ペムブロリズマブ注射液の溶媒は質量百分率濃度０．９％の塩化ナトリウム注射液であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末の溶媒は、滅菌注射用水と質量百分率濃度０．９％塩化ナトリウム注射液である。
さらに好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用の使用順序は、先ゴシッククロストリジウム芽胞後ペムブロリズマブである。

【発明の効果】

【0009】

本発明は初めてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用が結腸がんの治療効果を顕著に高めることができ、同時にペムブロリズマブの使用量を下げ、高効率且つ低毒性であることを発見した。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌の腫瘍溶解は多
くの方式でＴＭＥ免疫原性に影響を与え、ＴＭＥを１つの免疫抑制状態から免疫活性状態に変化させる同時に、免疫抑制性ＴＭＥを調節し、免疫耐性を打破することができる。最適な併用条件下でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用は約２０％のマウス腫瘍組織を完全に除去し、ＰＤ－１抗体による腫瘍患者の治療の受益範囲を拡大し、さらにＰＤ－１抗体による治療が失敗した患者にも顕著な治療効果があった。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】実施例１におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞による治療のＣＴ２６．ＷＴ結腸がん腫瘍負荷マウスモデルの各群の腫瘍重量（ａ）、腫瘍抑制率（ｂ）であり、データには、＊がＣｏｎｔｒｏｌ群と比べてＰ＜０．０５、＊＊がＣｏｎｔｒｏｌ群と比べてＰ＜０．０１であることが示される。

【図2】実施例２におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用による治療のＭＣ３８結腸がん腫瘍負荷マウスモデルの各群の腫瘍重量（ａ）、腫瘍重量腫瘍抑制率（ｂ）であり、治療データには、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であることが示される。

【図3】実施例２におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用による治療のＭＣ３８結腸がん腫瘍負荷マウスモデルの各群の腫瘍体積変化であり、治療データには、＊がＣｏｎｔｒｏｌ群と比べてＰ＜０．０５、＊＊がＣｏｎｔｒｏｌ群と比べてＰ＜０．０１、＃がＣ．ｇｈｏｎｉｉ群と比べて、Ｃ．ｇｈｏｎｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群Ｐ＜０．０５、＃＃がＣ．ｇｈｏｎｉｉ群と比べて、Ｃ．ｇｈｏｎｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群Ｐ＜０．０１であることが示される。

【図4】実施例２におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用による治療のＭＣ３８結腸がん腫瘍負荷マウスモデルの実験終点腫瘍体積の腫瘍抑制率であり、データには、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であることが示される。

【図5】実施例２におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用による治療のＭＣ３８結腸がん腫瘍負荷マウスモデルの各ロット腫瘍体積の腫瘍抑制率であり、ａ図が実験ロット１、ｂ図が実験ロット２、ｃ図が実験ロット３である。

【図6】実施例２におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの併用によるＭＣ３８結腸がん腫瘍負荷マウスモデルの各群の腫瘍形態写真である。

【図7】実施例３におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの異なる投与順序による治療のＭＣ３８結腸がん腫瘍負荷マウスモデルの各群の腫瘍重量である。

【図8】実施例３におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブの異なる投与順序による治療のＭＣ３８結腸がん腫瘍負荷マウスモデルの各群の腫瘍体積変化である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本発明を具体的な実施例を参照してさらに詳細に説明する。記載の実施例は、公衆に理解させつために、列挙された技術的な態様の一部であり、本発明の保護範囲を限定するのではなく、本発明を説明するためのみに使用されるものであり、本発明の保護範囲は請求項によって規定される。

【0012】

実施例１Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞による結腸がん腫瘍負荷マウスモデルへの治療効果

【0013】

材料：注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末、菌株はＭＷ－ＤＣＧ－ＬＣｖ－２６菌株で、この菌株はオーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株保存番号がＶ１２／００１４８６で、山東新創生物科学技術有限公司が開発した。注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞を活性成分とし、１％ショ糖を添加剤とし、－４０℃ ４ｈ、－３５℃ １０ｍｉｎ同時に真空引き、－３０℃ １０ｍｉｎ、－２５℃ １０ｍｉｎ、－２０℃ ２６ｈ、－１５℃ ２ｈ、－１０℃ １０ｍｉｎ、－５℃ １０ｍｉｎ、０℃ １０ｍｉｎ、１０℃２ｈ、１５℃ １０ｍｉｎ、２０℃ ３ｈ、２７℃ ３ｈという凍結乾燥プログラムにより調製し；仕様は１×１０^８ＣＦＵ／本、対照品の凍結乾燥粉末、ロット番号：２０１８０３００１Ｆ、山東新創生物科学技術有限公司が開発し、１％ショ糖溶液１ｍＬで上記凍結乾燥プロセスにより調製し；０．９％塩化ナトリウム注射液、ロット番号：１８０３１２２１６１、辰欣薬業股▲ふん▼有限公司が販売しており；滅菌注射用水、ロット番号：１７０４２４２１６３、辰欣薬業股▲ふん▼有限公司が販売しており；ＣＴ２６．ＷＴ結腸がん細胞、番号：３１３１Ｃ０００１０００８０００３７、中国科学院上海生命科学研究院細胞資源センターで販売されており；ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス、動物合格証明書番号：Ｎｏ．１１４０１３０００８８５５７（１２０匹）、Ｎｏ．１１４０１３０００８９７２１（６０匹）、Ｎｏ．１１４０１３０００８９７２１（６０匹）、北京華阜康生物科学技術有限公司が販売している。

【0014】

方法：ＣＴ２６．ＷＴ細胞を必要な細胞数に蘇生・継代し、濃度７．５×１０^６個／ｍＬの接種用細胞懸濁液を調製し、細胞生存率が９０％以上でＢＡＬＢ／ｃマウス結腸がんの皮下移植腫瘍モデルの構築に用い、マウス右前肢皮下に細胞懸濁液０．２ｍＬを接種し、１０日間程度で腫瘍体積約０．３０ｃｍ^３の実験動物を選択して試験に用い、腫瘍形成が合格したマウスは抽選法でランダムに対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、低用量治療群（ＬＣ．ｇｈｏｎｉｉ）、中用量治療群（Ｍ Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ）、高用量治療群（Ｈ Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ）という４群に分けられ、各群のいずれも８匹であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末は、まず滅菌注射水０．１ｍＬで再溶解した後、質量百分率濃度０．９％の塩化ナトリウム注射液で、それぞれ濃度５×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ、１×１０^８ｃｆｕ／ｍＬ、２×１０^８ｃｆｕ／ｍＬの懸濁液調製し、腫瘍内に０．１ｍＬ注射し、１日おきに１回で、合計５回投与し、投与量がそれぞれ５×１０^６ｃｆｕ／回、１×１０^７ｃｆｕ／回、２×１０^７ｃｆｕ／回であり、対照群の対照品濃度が高用量治療群と同じであり、投与開始後、動物の行動、死亡または瀕死などの臨床症状を毎日に観察し、すべての生存動物は最終投与後２日目に解剖を行い、腫瘍重量を測定し、腫瘍重量で腫瘍抑制率を計算し、腫瘍重量腫瘍抑制率（ＩＲＴＷ％）＝（対照群平均腫瘍重量－実験群平均腫瘍重量）／対照群平均腫瘍重量×１００％。上記の実験方法で、それぞれ３ロッドの独立実験を繰り返した。

【0015】

結果：実験間中、３ロットの実験ですべての動物は瀕死／死亡の状況が見られなかった。実験終了、３ロットの実験各群の腫瘍負荷マウスの平均腫瘍重量及び治療群の腫瘍抑制率を表１、表２に示す。

【0016】

【表1】

【0017】

【表2】

【0018】

各ロットの治療群の腫瘍重量はＣｏｎｔｒｏｌ群と比較してＣｏｎｔｒｏｌ群より小さく、ＭＣ．ｇｈｏｎｉｉ群の抗腫瘍効果が最も高い（図１中ａ）。各用量治療群はいずれも腫瘍
成長に対する抑制作用を示し、実験ロット１と３中のＭＣ．ｇｈｏｎｉｉ群の腫瘍重量抑制率の効果が最も良く、実験ロット２中のＬＣ．ｇｈｏｎｉｉ群の腫瘍重量抑制率の効果が最も良い。３ロットの実験結果に基づいて統計学的分析を行ったところ、ＨＣ．ｇｈｏｎｉｉ群の腫瘍重量腫瘍抑制率はＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意差があり（ｐ＜０．０５）、ＬＣ．ｇｈｏｎｉｉ群とＭＣ．ｇｈｏｎｉｉ群の腫瘍重量腫瘍抑制率はＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して極めて有意差があり（ｐ＜０．０１）、図１中ｂに示した。

【0019】

以上、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末は結腸がんの成長に対して抑制作用があり、また研究によりＭＣ．ｇｈｏｎｉｉ群（１×１０^７ｃｆｕ／回）は他の治療群の効果より優れている。したがって、次のＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂとの併用において、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉの好ましい用量が１×１０^７ｃｆｕ／回とした。

【0020】

実施例２Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの併用によるＰＤ－１ヒト化遺伝子トランスフェクション結腸がん腫瘍負荷マウスモデルへの治療効果

【0021】

材料：注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末、山東新創生物科学技術有限公司が開発した。製造方法は実施例１の材料と同じ、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ注射液、ロット番号：Ｓ００１１８８、仕様：１００ｍｇ／４ｍＬ、米国メルクが販売しており；対照品凍結乾燥粉末、ロット番号：２０１９１０００２Ｆ、２０１８０３００１Ｆ、山東新創生物科学技術有限公司が開発し、製造方法は実施例１の材料と同じ、０．９％塩化ナトリウム注射液、ロット番号：１８０９２８２１６１、辰欣薬業股▲ふん▼有限公司が販売しており；滅菌注射用水、ロット番号：１９０２２１２６２、辰欣薬業股▲ふん▼有限公司が販売しおり；ＭＣ３８結腸がん細胞、商品番号：Ｔ１９１７、Ａｂｍ生物科技有限公司が販売しており；Ｃ５７ＢＬ／６ＰＤ－１ヒト化遺伝子工学マウス、動物合格証明書番号：Ｎｏ．２０１７００１０００２５００（９０匹）、Ｎｏ．３１２０２４３００００８７５７（３５匹）、Ｎｏ．２０１７００１０００１３１１９（５０匹）、上海南方模式生物科学技術株式会社が販売している。

【0022】

方法：ＭＣ３８細胞を必要な細胞数に蘇生・継代し、濃度７．５×１０^６個／ｍＬの接種用細胞懸濁液を調製し、細胞生存率が９０％以上でＣ５７ＢＬ／６ＰＤ－１ヒト化遺伝子工学マウス結腸がん皮下移植腫瘍モデルを構築し、マウス右前肢皮下に細胞懸濁液０．２ｍＬを接種し、１０日程度で腫瘍体積が０．１５ｃｍ^３より大きい実験動物を選択して試験に用い、ランダム原則で、要求に満たす動物を選別し、抽選法で対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞治療群（Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ）、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群とＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの併用群（Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）という４群に分け、各群のいずれも５匹以上で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末は、まず０．１ｍＬの滅菌注射水で再溶解された後、質量百分率０．９％塩化ナトリウム注射液で濃度１×１０^８ｃｆｕ／ｍＬの懸濁液を調製し、腫瘍内に０．１ｍＬ注射し、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群とＣ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群に芽胞を１×１０^７ｃｆｕ／回注射し、Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群への用量は０ｃｆｕ／回で、１日おきに１回で、合計６回投与した。Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ注射液を０．９％塩化ナトリウム注射液で最終濃度１ｍｇ／ｍＬの作動液に希釈し、腹腔内０．２ｍＬ注射し、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群とＣ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群にＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂを０．２ｍｇ／回注射し、Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＣ．ｇｈｏｎｉｉ群に０．９％塩化ナトリウム注射液０．２ｍＬを２回／１週で、合計４回投与した。

【0023】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞を優先的に投与してから、ＰＤ－１抗体を投与し、投与順序は以下の通りである。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞は１日目から１日おきに１回注射し、３、６、９、１３日目にそれぞれＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂを注射した。

【0024】

観測及び評価指標：投与開始後、動物の行動、死亡又は瀕死の状況を毎日に観察し、１～２日ごとに腫瘍体積を観測し、実験最後に測定した腫瘍体積で腫瘍抑制率を計算し、すべての生存動物は最終投与後の２日目に解剖を行い、腫瘍重量を秤量し、腫瘍重量で腫瘍抑制率を計算した。
腫瘍重量腫瘍抑制率（ＩＲ_ＴＷ％）＝（対照群平均腫瘍重量－実験群平均腫瘍重量）／対照群平均腫瘍重量×１００％；
腫瘍体積腫瘍抑制率（ＩＲ_ＴＶ％）＝１－（実験群開始平均腫瘍体積－実験群終了平均腫瘍体積）／（対照群開始平均腫瘍体積－対照群終了平均腫瘍体積）×１００％；
治癒率（％）＝各組の治癒した動物の数／各組の実験動物群の数×１００％（時間ノードは試験終了）。

【0025】

上記の実験方法で、それぞれ独立実験を３ロッド繰り返した。
結果：実験間中、実験ロット１中の対照群１匹のマウスが死亡し、その他の各ロットの各群は死亡或いは瀕死の情況が現れなかった。

【0026】

１、各群の腫瘍負荷マウスの平均腫瘍重量と腫瘍抑制率

【0027】

３ロッドの試験における各群の腫瘍負荷マウスの平均腫瘍重量を表３に示す。各治療群の平均腫瘍重量はいずれもＣｏｎｔｒｏｌ群より小さく、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群の腫瘍重量はいずれの薬物単独治療群よりも小さく、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて極めて顕著に低下した（Ｐ＜０．０１）。Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群の平均腫瘍重量も、単独Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群および単独Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群より有意に小さくなった（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０５）（図２中のａ）。

【0028】

【表3】

【0029】

３ロットの実験結果に基づいて、統計学的な分析を行ったところ、各治療群は、腫瘍成長に対する抑制作用を示し、腫瘍抑制率はいずれも３０％以上で、腫瘍抑制率はＣ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群＞Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群＞Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群と表現された（図２中のｂ）。Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂが同じ用量で投与された後、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群は単独Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群より腫瘍抑制率がそれぞれ約２０％、２０％、２５％向上した（表４）。

【0030】

【表4】

【0031】

２、各群の腫瘍負荷マウスの平均腫瘍体積と腫瘍抑制率

【0032】

実験開始前に群を分けた時、各ロットの各群の平均腫瘍体積に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。ロット３の試験における腫瘍負荷マウス投与末期において、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群及びＣ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群の腫瘍体積はＣｏｎｔｒｏｌ群（ｐ＝０．００１、ｐ＝０．００００５３、ｐ＝０．０００）より有意に小さかった。Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群の腫瘍体積はＣ．ｇｈｏｎｉｉ群とＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群より明らかに小さく、１０日目に併用群とＣｏｎｔｒｏｌ群の平均腫瘍体積との有意差が認められたが、この時Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群の腫瘍体積はＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群より１倍近く小さかった（図３）。

【0033】

腫瘍体積で腫瘍抑制率を計算し、３ロッドの試験の間に、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群の腫瘍抑制率はすべて他の各群の腫瘍抑制率より大きかった（図４）。

【0034】

Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂは、３ロット試験で投与後７日目、２回投与、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ投与量０．４ｍｇを完了した後、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群の腫瘍抑制率はそれぞれ５１．２９％（５０％より大きい）、４９．７８％（約５０％）、５９．３３％（５０％より大きい）であり、この時の単独Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群の腫瘍抑制率はそれぞれ２５．６７％、７．６８％、３５．１０％であった。単独Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群に、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂを３回で、０．６ｍｇ投与した後、その腫瘍抑制率は、ＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂをＣ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群に２回で、０．４ｍｇ投与された時の腫瘍抑制率に達し、それぞれ６９．３１％、５２．８３％、５３．０８％（図５）であった。以上のことから分かるように、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群はＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの抗腫瘍効果を顕著に高め、同様の治療効果を得るためにＣ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群では必要なＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの使用量は５０％低下し、高効率且つ低毒性であった。

【0035】

３、治癒率

【0036】

３ロッドの実験Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群はそれぞれ約２０％（１／６、１／５、１／６）のマウスの腫瘍が完全に消失し（表５）、実験終点まで腫瘍の成長が見られなかったが、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群とＣ．ｇｈｏｎｉｉ群はいずれも腫瘍の完全の消失が現れず、治癒率は０％であった。これはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞が腫瘍の酸素欠乏領域で発芽し、多種の方式によってＴＭＥ免疫原性に影響し、ＴＭＥを一つの免疫抑制状態から免疫活性状態に変化させる同時、免疫抑制性ＴＭＥを調節し、免疫耐性を打破する可能性がある。Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂを併用すると、ＰＤ－１抗体治療効果をさらに増幅することができ、約２０％のマウスが治癒された。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌は腫瘍患者の免疫治療に優れた「増感剤」になることが期待されている。各群の腫瘍の形態は図６に示される。

【0037】

【表5】

【0038】

実施例３Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞及びＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの投与順序によるＰＤ－１ヒト化トランスフェクション結腸がん腫瘍負荷マウスモデルの治療効果への影響

【0039】

材料：注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末、山東新創生物科学技術有限公司が開発し、製造方法は実施例１の材料と同じ；Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ注射液、ロット番号：Ｓ００６６４８、仕様：１００ｍｇ／４ｍＬ、米国メルクが販売しており；対照品凍結乾燥粉末、ロット番号２０１９１０００２Ｆ、山東新創生物科学技術有限公司が開発し、製造方法は実施例１の材料と同じ；０．９％塩化ナトリウム注射液、ロット番号：Ｊ１８０７０１０４、山東華魯製薬有限公司が販売しており；滅菌注射用水、ロット番号：１９０２２１２６２、辰欣薬業股▲ふん▼有限公司が販売しており；ＭＣ３８結腸がん細胞、商品番号Ｔ１９１７、Ａｂｍ生物科技有限会社が販売しており；Ｃ５７ＢＬ／６ＰＤ－１ヒト化遺伝子工学マウス、動物合格証明書番号：Ｎｏ．２０１７００１０００２５００（９０匹）、上海南方模式生物科学技術株式会社が販売している。

【0040】

方法：Ｃ５７ＢＬ／６ＰＤ－１ヒト化遺伝子工学マウスＭＣ３８結腸がん皮下移植腫瘍モデルの構築方法は実施例２と同じ、抽選法でモデリングに成功したマウスを、Ａ対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｂ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞群（Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ）、Ｃ Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群、Ｄ 先Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ後Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群、Ｅ先Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ後Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群、Ｆ Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ併用群にランダムに分け、各群がいずれも８匹であり、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉの投与量はそれぞれ０ｃｆｕ／回、１×１０^７ｃｆｕ／回、０ｃｆｕ／回、１×１０^７ｃｆｕ／回、１×１０^７ｃｆｕ／回と１×１０^７ｃｆｕ／回、投与容量が０．１ｍＬ／回、１日おきに１回投与し、１ｍｇ／ｍＬのＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ注射液０．２ｍＬを腹腔内投与し、用量は０．２ｍｇ／回、１日おきに１回投与した。第１段階の投与過程を表６に示す。

【0041】

【表6】

【0042】

第１段階の投与が終了した後、６日間観察してから、第２段階としては、第１段階の投与過程を繰り返した。

【0043】

観測及び評価指標：投与開始後、動物の行動、死亡或いは瀕死の情況を毎日に観察し、１～２日おきに腫瘍体積を観測し、そして実験最後に測定した腫瘍体積で腫瘍抑制率を計算した。すべての生存動物を第２段階の最終投与後の８日目に解剖した。腫瘍重量を秤量し、腫瘍重量で腫瘍抑制率を計算した。
腫瘍重量腫瘍抑制率（ＩＲＴＷ％）＝（対照群平均腫瘍重量－実験群平均腫瘍重量）／対照群平均腫瘍重量×１００％；
治癒率（％）＝各組の治癒した動物の数／組の実験動物群の数×１００％（時間ノードは試験終了）。

【0044】

結果：実験の間、Ｃｏｎｔｒｏｌ群は大きすぎる腫瘍或いは潰瘍により４匹の動物が死亡し、その他の各群は動物の死亡或いは瀕死の情況が現れなかった。

【0045】

１、腫瘍重量と腫瘍抑制率

【0046】

Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群、先Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ後Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群、先Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ後Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群の腫瘍重量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群（ｐ＝０．００５、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００）より顕著に小さかった。各群の腫瘍重量測定結果を表７、図７に示す。

【0047】

【表7】

【0048】

腫瘍重量に従って、腫瘍抑制率を計算した結果、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群、先Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ後Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群、先Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ後Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群の腫瘍抑制率は、それぞれ３７．３９％、７６．２０％、８７．２６％、９２．７１％、９２．１９％であり、各治療群はいずれも腫瘍成長に対する明らかな抑制作用を示した（表８参照）。

【0049】

【表8】

【0050】

２、腫瘍体積と腫瘍抑制率

【0051】

各群の腫瘍体積は、治療の前、有意差がなかった（ｐ＞０．０５）。Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群、先Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ後Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群、先Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ後Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群、Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ併用群の腫瘍体積は、投与末期には、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群（ｐ＝０．００２、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００、ｐ＝０．０００、図８）より有意に小さかった。腫瘍抑制率は、先Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ後Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群＞Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ併用群＞先Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ後Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群＞Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群＞Ｃｏｎｔｒｏｌ群と表現した（表９参照）。

【0052】

【表9】

【0053】

３、治癒率

【0054】

試験の間の各群の治癒率を表１０に示した。

【0055】

【表10】

【0056】

先Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ後Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ群のマウス腫瘍治癒率は、他の群より明らかに高く、先Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ後Ｃ．ｇｈｏｎｉｉ群とＣ．ｇｈｏｎｉｉ＋Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ併用群治癒率の２倍であった。これは、先に腫瘍内にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞を投与することが有効であり、腫瘍組織を区別せず、ＴＭＥを破壊するとともに、細菌による腫瘍溶解の後も免疫細胞を募集しＴＭＥを浸潤し、免疫細胞によるＴＭＥへの浸潤程度と組成を変更し、細胞溶解生成物で大量のＣＤ８^＋Ｔ細胞が吸引し、凝集することを含み、腫瘍溶解細菌の後にＰＤ－１抗体を用いて治療し、免疫治療中の免疫抑制を回避し、Ｔ細胞による腫瘍細胞への大規模な攻撃を開始させ、「二重」の抗がん効果を発揮することが考えられる。そのため、腫瘍溶解細菌と免疫阻害剤を併用する場合の投与順序は、腫瘍の治療効果にも非常に重要である。

【0057】

以上より、優先的にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞を用いた治療と免疫療法との併用で、抗腫瘍効果が増強され、免疫薬物の使用量を低下させ、高効率且つ低毒性である。

【0058】

上記の実施例によれは、本発明が詳細に説明されたが、本発明の一部の実施例にすぎず、すべての実施例ではなく、本実施例に従って、他の実施形態を創造的ではなく得ることができ、これらの実施例はすべて本発明の保護範囲に属する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【手続補正書】

【提出日】2024-02-22

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

結腸がん治療用薬物であって、前記薬物中の薬効成分はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞とペムブロリズマブを含むことを特徴とする結腸がん治療用薬物。

【請求項2】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ ＭＷ－ＤＣＧ－ＬＣｖ－２６菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株番号はＶ１２／００１４８６であり）またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株であることを特徴とする請求項１に記載の薬物。

【請求項3】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株はＭＷ－ＤＣＧ－ＨＮＣｖ－１８菌株（オーストラリア国家計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８５であり）であることを特徴とする請求項１に記載の薬物。

【請求項4】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌を馴化した菌株はＭＷ－ＤＣＧ－ＣＣｖ－１７菌株（オーストラリア国立計量研究院に保存され、菌株保存番号はＶ１２／００１４８７であり）であることを特徴とする請求項１に記載の薬物。

【請求項5】

前記薬物の中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞は注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末であり、前記注射用芽胞凍結乾燥粉末中の添加剤は１％スクロースであることを特徴とする請求項１に記載の薬物。

【請求項6】

前記注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末の凍結乾燥プロセスは、凍結段階－４０℃ ４ｈ、－３５℃１０ｍｉｎ同時に真空引き、－３０℃ １０ｍｉｎ、－２５℃ １０ｍｉｎ、－２０℃ ２６ｈ、－１５℃ ２ｈ、－１０℃ １０ｍｉｎ、－５℃ １０ｍｉｎ、０℃ １０ｍｉｎ、１０℃２ｈ、１５℃ １０ｍｉｎ、２０℃ ３ｈ、２７℃ ３ｈで凍結乾燥して調製を行うことであることを特徴とする請求項５に記載の薬物。

【請求項7】

前記ペムブロリズマブはＰＤ－１抗体注射液であることを特徴とする請求項１に記載の薬物。

【請求項8】

前記１×１０^７ＣＦＵ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞あたり、濃度１ｍｇ／ｍＬのペムブロリズマブ溶液０．２ｍｇを併用することを特徴とする請求項１に記載の薬物。

【請求項9】

前記ペムブロリズマブ溶液の溶媒は質量百分率濃度０．９％の塩化ナトリウム注射液であることを特徴とする請求項８に記載の薬物。

【請求項10】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞は注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末であり、前記注射用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｈｏｎｉｉ菌芽胞凍結乾燥粉末の溶媒は滅菌注射用水と質量百分濃度０．９％塩化ナトリウム注射液であることを特徴とする請求項８に記載の薬物。

【国際調査報告】