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特表2024-529764カルシニューリン抑制剤と幹細胞を用いて免疫疾患を治療する方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-08

(54)【発明の名称】カルシニューリン抑制剤と幹細胞を用いて免疫疾患を治療する方法

(51)【国際特許分類】

A61K 45/00 20060101AFI20240801BHJP

A61P 37/06 20060101ALI20240801BHJP

A61P 37/08 20060101ALI20240801BHJP

A61P 11/02 20060101ALI20240801BHJP

A61P 27/02 20060101ALI20240801BHJP

A61P 19/02 20060101ALI20240801BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20240801BHJP

A61P 5/14 20060101ALI20240801BHJP

A61P 9/00 20060101ALI20240801BHJP

A61K 38/13 20060101ALI20240801BHJP

A61K 31/7076 20060101ALI20240801BHJP

A61K 35/28 20150101ALI20240801BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P37/06

A61P37/08

A61P11/02

A61P27/02

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P5/14

A61P9/00

A61K38/13

A61K31/7076

A61K35/28

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024510413

(86)(22)【出願日】2022-08-19

(85)【翻訳文提出日】2024-02-19

(86)【国際出願番号】 KR2022012435

(87)【国際公開番号】W WO2023022569

(87)【国際公開日】2023-02-23

(31)【優先権主張番号】10-2021-0109615

(32)【優先日】2021-08-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516244707

【氏名又は名称】カンステムバイオテックカンパニーリミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＫＡＮＧＳＴＥＭＢＩＯＴＥＣＨＣＯ．，ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】１７Ｆ，５１２，Ｔｅｈｅｒａｎ－ｒｏ，Ｇａｎｇｎａｍ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＫｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】カン、キュン－スン

(72)【発明者】

【氏名】シン、ナリ

(72)【発明者】

【氏名】ジュン、ナミ

(72)【発明者】

【氏名】イ、スンヒ

(72)【発明者】

【氏名】パク、ファンヒ

(72)【発明者】

【氏名】パク、ソヨン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA19

4C084DA11

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA331

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4C084ZA361

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4C084ZC751

4C086AA01

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4C086EA04

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA33

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4C087ZA33

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4C087ZB15

4C087ZC06

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明は、カルシニューリン抑制剤と幹細胞を共に用いて免疫疾患を治療する方法に関する。本発明で提供するカルシニューリン抑制剤と間葉系幹細胞を含む薬学組成物を用いると、従来のカルシニューリン抑制剤または間葉系幹細胞を用いて得られる免疫抑制の活性より顕著に高い水準の免疫抑制の活性を提供することができるため、過剰免疫により引き起こされる免疫疾患をより効果的に予防または治療するのに活用されるものである。
【選択図】図５ｄ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）カルシニューリン抑制剤またはその薬剤学的に許容可能な塩が含まれた第１組成物；及び
（ｂ）幹細胞またはその培養産物が含まれた第２組成物を含む、免疫疾患予防または治療用薬学組成物。

【請求項2】

前記カルシニューリン抑制剤は、シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ）、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）またはピメクロリムス（ｐｉｍｅｃｒｏｌｉｍｕｓ）である、請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項3】

前記幹細胞は、間葉系幹細胞である、請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項4】

前記間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、心筋由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、軟骨由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞及びそれらの組み合わせで構成された群から選択される、請求項３に記載の薬学組成物。

【請求項5】

前記免疫疾患は、過剰免疫により発病する免疫疾患である、請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項6】

前記過剰免疫により発病する免疫疾患は、アレルギー性免疫疾患または自己免疫疾患である、請求項５に記載の薬学組成物。

【請求項7】

前記アレルギー性免疫疾患は、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、肥満細胞症及びそれらの組み合わせで構成された群から選択される、請求項６に記載の薬学組成物。

【請求項8】

前記自己免疫疾患は、グレーブス病、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（ループス）、血管炎、アジソン病、多発性筋炎、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症及びそれらの組み合わせで構成された群から選択される、請求項６に記載の薬学組成物。

【請求項9】

前記第１組成物を先に１回または複数回投与しながら、さらに第２組成物を１回または複数回投与する、請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項10】

前記第２組成物を投与した後、第１組成物または第２組成物をそれぞれ個別に１回または複数回さらに投与する、請求項９に記載の薬学組成物。

【請求項11】

前記第２組成物を先に１回または複数回投与しながら、さらに第１組成物を１回または複数回投与する、請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項12】

前記第１組成物を投与した後、第１組成物または第２組成物をそれぞれ個別に１回または複数回さらに投与する、請求項１１に記載の薬学組成物。

【請求項13】

前記薬学組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項14】

免疫疾患が発病した個体にカルシニューリン抑制剤またはその薬剤学的に許容可能な塩が含まれた第１組成物及び幹細胞またはその培養産物が含まれた第２組成物を投与する段階を含む、免疫疾患の治療方法。

【請求項15】

前記免疫疾患は、過剰免疫により発病する免疫疾患である、請求項１４に記載の免疫疾患の治療方法。

【請求項16】

前記第１組成物を先に１回または複数回投与しながら、さらに第２組成物を１回または複数回投与する、請求項１４に記載の免疫疾患の治療方法。

【請求項17】

前記第２組成物を先に１回または複数回投与しながら、さらに第１組成物を１回または複数回投与する、請求項１４に記載の免疫疾患の治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、カルシニューリン抑制剤と幹細胞を共に用いて免疫疾患を治療する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫疾患は、外因性要因、遺伝性要因、内因性要因などの多様な原因によりインビボ免疫システムが損傷したり非正常に作動することにより引き起こされる疾患であり、免疫性が顕著に低下したり、または免疫性が急激に増加する様相を示す。特に、比較的病理症状の予測が可能な免疫性が低下する場合とは異なり、免疫性が急激に増加する場合には、予想できない多様な病理症状が伴われるため、これと関連した研究が盛んに進められている。

【0003】

免疫性が急激に増加する過剰免疫により発病する免疫疾患の一つであるアトピー性皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＡＤ）は、重度のかゆみと表皮バリア機能障害を伴った湿疹性皮膚病変を特徴とする慢性再発性皮膚疾患であり、その発病の原因は、過度な２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞媒介性の炎症反応により血清中総ＩｇＥ値が増加し、皮膚バリア機能障害が発生するためであることが知られている。このようなアトピー性皮膚炎の治療方法としては、軟化剤とコルチコステロイドまたはカルシニューリン抑制剤のような抗炎症剤を使用して表皮バリアを復旧する方法として知られているが、カルシニューリン抑制剤は、最も一般に使用される治療剤である。前記カルシニューリン抑制剤は、ＦＫ５０６－結合タンパク質－１２（ＦＫＢＰ－１２）に結合してセリン／スレオニンホスファターゼカルシニューリンを抑制し、後続的に活性化したＴ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）の核電位を防止することにより、結果的には、Ｔ細胞で前炎症性サイトカインのＮＦＡＴ媒介転写を抑制することにより、アトピー性皮膚炎を好転させる効果を示す。

【0004】

最近、アトピー性皮膚炎の治療に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を使用する方法が開発されているが、ＭＳＣは、自己再生が可能であり、損傷した組織再生のために種々の系統に分化することができ、先天及び適応免疫細胞の増殖、募集及び機能を調節する免疫調節剤として使用されている。また、前記ＭＳＣは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ_２）及びＴＧＦ－ベータを通じて肥満細胞の脱顆粒を抑制する方式としてアトピー性皮膚炎に対する治療効果を示すことが期待されているが（韓国公開特許第１０－２００９－０１１１２６９号、第１０－２０１０－０１０４３８５号、韓国登録特許第１０－１０７０７３０号など）、実質的な臨床実験では、アトピー性皮膚炎に対する特異的な治療効果を立証できていない実情である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】韓国公開特許第１０－２００９－０１１１２６９号

【特許文献2】韓国公開特許第１０－２０１０－０１０４３８５号

【特許文献3】韓国登録特許第１０－１０７０７３０号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明者らは、幹細胞を用いてアトピー性皮膚炎を効果的に治療する方法を開発するために鋭意研究努力した結果、間葉系幹細胞とカルシニューリン抑制剤を順次処理する場合、それぞれの間葉系幹細胞とカルシニューリン抑制剤を単独で処理した場合に比べて、免疫抑制の活性が増加することを確認し、本発明を完成した。

【0007】

本発明の主な目的は、カルシニューリン抑制剤またはその薬剤学的に許容可能な塩が含まれた第１組成物；及び幹細胞またはその培養産物が含まれた第２組成物を含む、免疫疾患予防または治療用薬学組成物を提供することにある。

【0008】

本発明の他の目的は、前記薬学組成物に含まれた第１組成物と第２組成物を免疫疾患が発病した個体に順次投与する段階を含む免疫疾患治療方法を提供することにある。

【0009】

本発明のまた他の目的は、免疫疾患予防または治療用薬学組成物の製造のためのカルシニューリン抑制剤と幹細胞の用途を提供することにある。

【発明を解決するための手段】

【0010】

上述の目的を達成するための本発明の一実施様態は、（ａ）カルシニューリン抑制剤またはその薬剤学的に許容可能な塩が含まれた第１組成物；及び（ｂ）幹細胞またはその培養産物が含まれた第２組成物を含む、免疫疾患予防または治療用薬学組成物を提供する。

【発明の効果】

【0011】

本発明で提供するカルシニューリン抑制剤と間葉系幹細胞を含む薬学組成物を使用すると、従来のカルシニューリン抑制剤または間葉系幹細胞を使用して得られる免疫抑制の活性より顕著に高い水準の免疫抑制の活性を提供することができるため、過剰免疫により引き起こされる免疫疾患をより効果的に予防または治療するのに活用できるものである。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ピメクロリムスまたは間葉系幹細胞が処理されたアトピー性皮膚炎動物モデルの皮膚病変重症度を比較した結果を示すグラフであり、ＭＳＣは、幹細胞単独投与群、Ｐｉｍｅはピメクロリムス単独投与群、ＭＳＣ＋Ｐｉｍｅは幹細胞とピメクロリムスの組み合わせ投与群を示す。

【図2a】ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞の生存率変化を比較したグラフである。

【図2b】ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞の増殖能の変化を比較したグラフである。

【図2c】ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞の細胞周期プロファイルの変化を比較したグラフである。

【図2d】ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞の形態変化を比較したグラフである。

【図2e】ピメクロリムスの処理による幹細胞の表面マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ７３）の発現水準の変化を比較したグラフである。

【図3】ＣｏｎＡを処理したＰＢＭＣ細胞に対する幹細胞の免疫抑制の活性に及ぼすピメクロリムスの影響を分析した結果を示すグラフである。

【図4a】ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞から発現するＴＧＦ－βの水準を比較した結果を示すグラフである。

【図4b】ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞から発現するＰＧＥ_２の水準を比較した結果を示すグラフである。

【図4c】ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞から発現するＣＯＸ２の水準を比較した結果を示すウェスタンブロット写真及びその密度を分析した結果を示すグラフである。

【図5a】幹細胞とピメクロリムスを同様の条件で処理して得られた免疫抑制の活性を比較したグラフである。

【図5b】ピメクロリムスを先に処理し、幹細胞を後に処理して得られた免疫抑制の活性を比較したグラフである。

【図5c】幹細胞を先に処理し、ピメクロリムスを後に処理して得られた免疫抑制の活性を比較したグラフである。

【図5d】幹細胞とピメクロリムスを共に処理するものの、処理順序による免疫抑制の活性の変化を分析した結果を示すグラフである。

【0013】

本発明の用語「カルシニューリン抑制剤（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」とは、概して微生物の発酵過程で生成される免疫調節物質を意味するが、主に、Ｔ細胞の反応を抑制する効果を示すことが知られている。機能的に、前記カルシニューリン抑制剤は、リン酸化酵素の一種であるカルシニューリンの反応を阻害させて細胞内サイトカイン遺伝子の発現を抑制し、結果的に、多様な炎症性サイトカインの分泌を減少させることが知られている。

【0014】

本発明で提供するカルシニューリン抑制剤は、特にこれに制限されないが、一例として、シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ）、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、ピメクロリムス（ｐｉｍｅｃｒｏｌｉｍｕｓ）などであってもよく、他の例として、ピメクロリムスであってもよい。

【0015】

本発明の用語「薬剤学的に許容可能な塩」とは、前記カルシニューリン抑制剤の生物学的活性と物性を損傷させない剤形を意味する。前記薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容される陰イオンを含有する無毒性酸付加塩を形成する酸、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などのような無機酸、酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフロロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、サリチル酸などのような有機カルボン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などのようなスルホン酸などにより形成された酸付加塩が含まれる。例えば、薬学的に許容されるカルボン酸塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどにより形成された金属塩またはアルカリ土類金属塩、リシン、アルギニン、グアニジンなどのアミノ酸塩、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジエタノールアミン、コリン及びトリエチルアミンなどのような有機塩などが含まれる。一方、アムロジピンの場合、商業的に広く使用されるベシル酸塩が好ましい。

【0016】

本発明の用語「幹細胞」とは、優れた増殖力を有し、身体の種々の組織に分化が可能な細胞を意味する。

【0017】

本発明で提供する前記幹細胞は、特にこれに制限されないが、一例として、ヒトの成体幹細胞、ヒトの多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）、動物の胚芽幹細胞、動物の成体幹細胞、間葉系幹細胞などであってもよく、他の例として、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、心筋由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、軟骨由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞などの間葉系幹細胞であってもよく、また、他の例として、前記多様な間葉系幹細胞を単独でまたは多様に組み合わせて使用してもよい。

【0018】

本発明の用語「培養産物」とは、前記幹細胞を培養して得られる結果を意味するが、前記培養産物は、特にこれに制限されないが、一例として、全体培養物、全体培養物から得られた培養上澄液、全体培養物から得られた細胞体、前記細胞体を破砕して得られた細胞破砕物、前記細胞破砕物から得られた抽出物、前記抽出物から得られた分画物などであり得る。

【0019】

本発明の用語「免疫疾患」とは、外因性要因、遺伝性要因、内因性要因などの多様な原因によりインビボ免疫システムが損傷したり非正常に作動するということにより引き起こされる疾患を意味する。

【0020】

本発明において、前記免疫疾患は、特にこれに制限されないが、一例として、過剰免疫により発病する免疫疾患になることができ、他の例として、過剰免疫により発病するアレルギー性免疫疾患または自己免疫疾患になることができ、また、他の例として、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、肥満細胞症などのアレルギー性免疫疾患になることができ、また、他の例として、グレーブス病、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（ループス）、血管炎、アジソン病、多発性筋炎、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症などの自己免疫疾患になることができる。

【0021】

本発明の用語「予防」とは、本発明で提供する薬学組成物の投与により免疫疾患の発病を抑制させるか、または遅延させるあらゆる行為を意味する。

【0022】

本発明の用語「治療」とは、前記薬学組成物の投与により免疫疾患の発病が疑われたりまたは免疫疾患の発病が確認された個体の症状が好転または有益に変更させるあらゆる行為を意味する。

【0023】

本発明で提供する薬学組成物は、カルシニューリン抑制剤またはその薬剤学的に許容可能な塩が含まれた第１組成物と幹細胞またはその培養産物が含まれた第２組成物をそれぞれ個別に含むが、これらのカルシニューリンと幹細胞を同時に処理する場合、相互干渉によりこれらの有効成分により現れる免疫調節の活性が減少するため、本発明で提供する薬学組成物は、これらの各有効成分を個別に含む互いに異なる２種の組成物に分離した状態で含むように構成されたものであり、「第１組成物」と「第２組成物」という用語に製造または投与のための順序の意味が付与されることはない。

【0024】

前記第１組成物に含まれたカルシニューリン抑制剤またはその薬剤学的に許容可能な塩は、総組成物の重量に比べて０．０００１～５０重量％で含めてもよく、具体的には０．０１重量％～１０重量％で含めてもよいが、これに制限されない。

【0025】

前記第２組成物に含まれた幹細胞の場合、１ｘ１０^５～９ｘ１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、具体的には、５ｘ１０^５～５ｘ１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、さらに具体的には１ｘ１０^６～１ｘ１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍｌで含めてもよく、幹細胞培養産物の場合、０．００１～８０、具体的には０．００１～７０、さらに具体的には０．００１～６０重量％で含めてもよいが、これに制限されない。

【0026】

また、前記第１組成物及び第２組成物は、それぞれ薬学組成物の製造に通常用いる薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含めてもよく、前記担体は、非自然的担体（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｉｎｇｃａｒｒｉｅｒ）を含めてもよい。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、凍結保存剤、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱油が挙げられる。

【0027】

また、前記薬学組成物は、それぞれ常法により錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、経皮吸収剤、ゲル剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、カタプラズマ剤、ペースト剤、スプレー、皮膚乳化液、皮膚懸濁液、経皮伝達性パッチ、薬物含有包帯または坐剤の形態に剤形化して使用することができる。

【0028】

具体的には、剤形化する場合、通常用いる充填剤、重量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤されることができる。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などを含むが、これに制限されない。このような固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカルボネート、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤されることができる。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤なども使用され得る。経口のための液状物、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを添加して調剤されることができる。非経口投与のための製剤は、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤を含む。非水性溶剤及び懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテプゾール、マクロゴール、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。

【0029】

本発明の一実施例によると、アトピー皮膚炎動物モデルに間葉系幹細胞を投与すると、アトピー性皮膚病変が好転する効果を示すが、カルシニューリン抑制剤の一種であるピメクロリムスと間葉系幹細胞を共に処理する場合には、幹細胞を単独で処理する場合よりも治療効率が低下することを確認し、その原因を分析することにした。

【0030】

そのために、前記ピメクロリムスが幹細胞に如何なる影響を及ぼすかに関して研究した結果、ピメクロリムスは、幹細胞の生存率、増殖能、細胞形態、細胞周期、表面マーカーの発現水準などのような多様な事項については全く影響を及ぼさないが、幹細胞から発現するＣＯＸ２の発現を抑制する方式でプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ_２）の発現を抑制し、幹細胞の免疫抑制の活性を低下させる効果を奏することを確認した。

【0031】

これにより、ピメクロリムスと間葉系幹細胞を共に用いて免疫抑制の活性を上昇させる方法を開発するために多様な研究を進めた結果、ピメクロリムスと幹細胞は、組み合わせ処理方法により、免疫抑制の活性が大きい偏差を示す結果を招くことを確認した。即ち、幹細胞の免疫抑制の活性をピメクロリムスが干渉することもでき、ピメクロリムスが示す免疫抑制の活性にも幹細胞が影響を及ぼすことを確認し、幹細胞とピメクロリムスを順次処理する場合、免疫抑制の活性が相乗効果を示すことを確認した。

【0032】

具体的には、ピメクロリムスを先に処理し、一定時間が経過した後に幹細胞をさらに処理するか、または幹細胞を先に処理し、一定時間が経過した後にピメクロリムスをさらに処理する場合、免疫抑制の活性を顕著に増加させることができ、最も効率的な免疫抑制の活性はピメクロリムスを先に処理し、一定時間が経過した後に幹細胞をさらに処理することにより得られることを確認した。

【0033】

本発明の他の様態は、前記薬学組成物を免疫疾患が発病するか、または発病する可能性がある個体に投与する段階を含む免疫疾患の予防または治療方法を提供する。

【0034】

その時、前記カルシニューリン抑制剤、幹細胞、免疫疾患、予防及び治療の定義は、前記で説明した通りである。

【0035】

本発明の用語、「投与」とは、適切な方法で個体に所定の物質を導入する行為を意味する。

【0036】

本発明の用語、「個体」とは、前記免疫疾患が発症又は発症する可能性があるヒトを含むラット、ラット、家畜などのすべての動物を意味する。具体的な例として、ヒトを含む哺乳動物であり得る。

【0037】

本発明で提供する免疫疾患の予防または治療方法は、具体的には、免疫疾患が発病した個体に薬学的に有効な量の前記第１組成物及び第２組成物を投与する段階を含むことができる。

【0038】

本発明で提供する第１組成物及び第２組成物を投与する方式は、特にこれに制限されないが、一例として、前記第１組成物を先に１回または複数回投与しながら、さらに第２組成物を１回または複数回投与する方式であってもよく、他の一例として、前記第２組成物を投与した後、第１組成物または第２組成物をそれぞれ個別に１回または複数回さらに投与する方式であってもよい。

【0039】

また、他の一例として、前記第２組成物を先に１回または複数回投与しながら、さらに第１組成物を１回または複数回投与する方式であってもよく、また他の一例として、前記第１組成物を投与した後、第１組成物または第２組成物をそれぞれ個別に１回または複数回さらに投与する方式であってもよい。

【0040】

併せて、前記第１組成物と第２組成物を投与する方式は１回で行うこともでき、繰り返して行うこともできるが、繰り返して行う場合には、第１組成物の投与回数と第２組成物の投与回数が同一であるように行うこともでき、同一でないように行うこともできる。

【0041】

一例として、第１組成物、第２組成物及び第１組成物の順序で投与するか、または第２組成物、第１組成物及び第２組成物の順序で投与することができ、他の例として、第１組成物、第２組成物、第１組成物及び第２組成物の順序で投与するか、または第２組成物、第１組成物、第２組成物及び第１組成物の順序で投与することができ、また、他の例として、第１組成物、第２組成物、第１組成物、第２組成物及び第１組成物の順序で投与するか、または第２組成物、第１組成物、第２組成物、第１組成物及び第２組成物の順序で投与することができ、また、他の例として、第１組成物、第２組成物、第１組成物、第２組成物、第１組成物及び第２組成物の順序で投与するか、または第２組成物、第１組成物、第２組成物、第１組成物、第２組成物及び第１組成物の順序で投与することができる。また、他の例として、第１組成物を先に１回または複数回投与し、その後、第２組成物を１回または複数回投与した後、その後、第１組成物を１回または複数回投与可能であり、その反対も可能である。

【0042】

本発明の用語、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率で疾患を治療するのに十分であり、副作用を引き起こさない程度の量を意味し、有効用量の水準は、患者の性別、年齢、体重、健康状態、疾病の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路、及び排出比率、治療期間、配合または同時に使用する薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られている要素により当業者によって容易に決定されることができる。

【0043】

具体的には、本発明の組成物は、固形分を基準として１日０．０００１～１００ｍｇ／体重ｋｇで、さらに具体的には０．００１～１００ｍｇ／体重ｋｇで投与することができる。投与は、前記推奨投与量を一日に１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。

【0044】

本発明の免疫疾患の予防または治療方法において、前記組成物を投与する投与経路及び投与方式は、特に制限されず、所望の該当部位に前記組成物を含む組成物が到達できる限り、任意の投与経路及び投与方式に従うことができる。具体的には、前記組成物は、経口または非経口の多様な経路を通じて投与されることができ、その投与経路の非制限的な例としては、皮下、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻側内または吸入などを通じて投与されることが挙げられる。

【0045】

本発明のまた他の様態は、免疫疾患の予防または治療用薬学組成物の製造のためのカルシニューリン抑制剤と幹細胞の用途を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0046】

以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0047】

実施例１：アトピー性皮膚炎動物モデルに対するピメクロリムスと間葉系幹細胞の影響
まず、アトピー性皮膚炎の動物モデルを製作した。

【0048】

具体的には、ＮＣ／Ｎｇａマウス（雄性、７週齢）の耳下側から尾上方に毛を除去し、Ｄｆ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｆａｒｉｎａｅ；Ｂｉｏｓｔｉｒ－ＡＤ，Ｂｉｏｓｔｉｒ，Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）１００ｍｇ／ｈｅａｄを綿棒で除毛された背中と耳の後ろ側に週２回、３週間（合計６回）塗布して皮膚病変を誘導することにより、アトピー性皮膚炎の動物モデルを製作した。

【0049】

次に、前記動物モデルにカルシニューリン抑制剤として知られたピメクロリムス（Ｐｉｍｅｃｒｏｌｉｍｕｓ）と間葉系幹細胞（ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）をそれぞれ個別にまたは組み合わせて投与した後、７日間皮膚病変の変化を分析した。

【0050】

具体的には、Ｄｆを最終処理し、３日間が経過した時点でＤｆを処理した皮膚病変部位にピメクロリムスまたは幹細胞を処理したが、前記ピメクロリムスは０．２ｇ／ｈｅａｄの用量で１回／１日の頻度で７日間処理し、幹細胞は２×１０^６細胞数の幹細胞を皮下注射した。その時、陰性対照群（ＮＣ）としては、アトピー性皮膚炎が誘導されていないマウスを用い、陽性対照群（ＰＣ）としては、アトピー性皮膚炎が誘導された後、ピメクロリムスまたは幹細胞を処理しなかったマウスを用いた。

【0051】

前記皮膚病変の変化は、皮膚病変重症度を測定し、これを比較する方式で分析したが、紅斑、瘢痕／乾燥、浮腫及びびらんの４つの症状を対象に、０点～３点（０：なし、１：軽症、２：中等度、３：重症）で点数化した（図１）。

【0052】

図１は、ピメクロリムスまたは間葉系幹細胞が処理されたアトピー性皮膚炎の動物モデルの皮膚病変重症度を比較した結果を示すグラフであり、ＭＳＣは幹細胞単独投与群、Ｐｉｍｅはピメクロリムス単独投与群、ＭＳＣ＋Ｐｉｍｅは幹細胞とピメクロリムスの組み合わせ投与群を示す。

【0053】

図１で見られるように、幹細胞を単独で投与すると、アトピー性皮膚炎の病変を緩和させる効果を示したが、幹細胞とピメクロリムスを組み合わせて投与すると、アトピー性皮膚炎の病変を緩和させる効果が減少することを確認した。

【0054】

前記結果から、幹細胞のアトピー性皮膚炎の治療効果をピメクロリムスが抑制する様相を示すことを確認することができたが、これは、アトピー性皮膚炎の治療剤として知られたカルシニューリン抑制剤と幹細胞の相乗効果を期待した意図とは相反した結果であると解釈された。

【0055】

実施例２：幹細胞自体に及ぼすピメクロリムスの影響分析
前記実施例１で得られた結果の原因が、ピメクロリムスが幹細胞に影響を及ぼした結果であると仮定し、ピメクロリムスが幹細胞自体に如何なる影響を及ぼすかを分析した。

【0056】

まず、幹細胞（ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）を培養しながら多様な濃度のピメクロリムスを３日間処理した後、ＭＴＴ分析法を用いて幹細胞の生存率の変化を比較した（図２ａ）。

【0057】

図２ａは、ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞の生存率の変化を比較したグラフである。

【0058】

図２ａで見られるように、０．１～１μｇ／ｍｌの範囲のピメクロリムスは、幹細胞の生存率を変化させていないことを確認した。

【0059】

次に、幹細胞（ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）を培養しながら多様な濃度のピメクロリムスを３日間処理した後、幹細胞の増殖能の変化を比較した（図２ｂ）。

【0060】

図２ｂは、ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞の増殖能の変化を比較したグラフである。

【0061】

図２ｂで見られるように、０．０１～１００ｎｇ／ｍｌの範囲のピメクロリムスは、幹細胞の増殖能を変化させていないことを確認した。

【0062】

次に、幹細胞（ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）を培養しながら多様な濃度のピメクロリムスを３日間処理した後、細胞周期分析法を用いて幹細胞の細胞周期プロファイル変化を比較した（図２ｃ）。

【0063】

図２ｃは、ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞の細胞周期プロファイル変化を比較したグラフである。

【0064】

図２ｃで見られるように、０．０１～１００ｎｇ／ｍｌの範囲のピメクロリムスは、幹細胞の細胞周期プロファイルを変化させていないことを確認した。

【0065】

次に、幹細胞（ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）を培養しながら多様な濃度のピメクロリムスを３日間処理した後、幹細胞の形態変化を比較した（図２ｄ）。

【0066】

図２ｄは、ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞の形態変化を比較したグラフである。

【0067】

図２ｄで見られるように、０．０１～１００ｎｇ／ｍｌの範囲のピメクロリムスは、幹細胞の形態を変化させていないことを確認した。

【0068】

最後に、幹細胞（ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）を培養しながら１００ｎｇ／ｍｌのピメクロリムスを３日間処理した後、フローサイトメトリーを使用して幹細胞の表面マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ７３）の発現水準を比較した（図２ｅ）。

【0069】

図２ｅは、ピメクロリムスの処理による幹細胞の表面マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ７３）の発現水準変化を比較したグラフである。

【0070】

図２ｅで見られるように、１００ｎｇ／ｍｌのピメクロリムスを処理しても、幹細胞の表面マーカーの発現水準が変化していないことを確認した。

【0071】

前記結果を総合すると、ピメクロリムスは、幹細胞自体には如何なる影響も及ぼさないことが分かった。

【0072】

実施例３：幹細胞の免疫調節能に及ぼすピメクロリムスの影響分析
前記実施例２の結果から、ピメクロリムスは、幹細胞自体には如何なる影響も及ぼさないことを確認したため、前記ピメクロリムスが幹細胞の免疫調節能を干渉するかどうかを分析した。

【0073】

実施例３－１：ＭＬＲ分析
コンカナバリンＡ（ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ、ＣｏｎＡ）を処理したＰＢＭＣ細胞を培養し、これに対し、ピメクロリムスと間葉系幹細胞（ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）をそれぞれ個別にまたは組み合わせて処理した後、これらの各実験群で測定した免疫抑制の活性を比較した（図３）。その時、陰性対照群（ＮＣ）としてはＣｏｎＡを処理せず、幹細胞と共培養せず、ピメクロリムスを処理していないＰＢＭＣ細胞を用い、陽性対照群（ＰＣ）としてはＣｏｎＡを処理し、幹細胞と共培養せず、ピメクロリムスを処理していないＰＢＭＣ細胞を用いた。

【0074】

図３は、ＣｏｎＡを処理したＰＢＭＣ細胞に対する幹細胞の免疫抑制の活性に及ぼすピメクロリムスの影響を分析した結果を示すグラフである。

【0075】

図３で見られるように、ＣｏｎＡを処理した陽性対照群では免疫活性が増加したが、幹細胞またはピメクロリムスの処理により免疫活性が抑制されることを確認した。ただし、幹細胞を単独で処理した場合に現れる免疫抑制の活性は、ピメクロリムスの処理により減少する結果を示すことを確認した。

【0076】

実施例３－２：免疫活性調節因子の発現水準の分析
前記実施例３－１の結果から幹細胞の免疫抑制の活性がピメクロリムスにより抑制されることを確認したため、幹細胞から発現する免疫活性調節因子であるＴＧＦ－βまたはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ_２）の発現水準がピメクロリムスにより影響を受けるかどうかを確認した。

【0077】

具体的には、ｈＵＣＢ－ＭＳＣを６ウェル細胞培養プレートに１ウェル当たり１．５×１０^５個の細胞の密度で接種し、２４時間培養した後、多様な濃度のピメクロリムスを処理し、７２時間さらに培養した。培養が終了した後、遠心分離して上層液を得、得られた上層液をＥＬＩＳＡキットであるＨｕｍａｎＴＧＦ－β１ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）及びＨｕｍａｎＰＧＥ_２ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）に適用し、ＴＧＦ－βまたはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ_２）の発現水準を分析した（図４ａ及び４ｂ）。

【0078】

図４ａは、ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞から発現するＴＧＦ－βの水準を比較した結果を示すグラフである。

【0079】

図４ａで見られるように、０．０１～１００ｎｇ／ｍｌの範囲のピメクロリムスが処理された幹細胞から発現するＴＧＦ－βの水準は、大きい変化を示さないことを確認した。

【0080】

図４ｂは、ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞から発現するＰＧＥ_２の水準を比較した結果を示すグラフである。

【0081】

図４ｂで見られるように、０．０１～１００ｎｇ／ｍｌの範囲のピメクロリムスが処理された幹細胞から発現するＰＧＥ_２の水準は、ピメクロリムスの処理濃度に比例して急激に減少することを確認した。

【0082】

実施例３－３：ＣＯＸ２発現水準の分析
前記実施例３－２の結果からピメクロリムスを幹細胞に処理すると、免疫活性の調節因子であるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ_２）の発現を抑制する効果を示すことを確認したため、これを検証するために、ＣＯＸ２の発現水準を分析した。即ち、前記ＰＧＥ_２は、ＣＯＸ（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）により膜リン脂質から放出されたアラキドン酸から合成されることが知られているため、先に確認されたＰＧＥ_２の発現抑制の原因がＣＯＸの発現抑制であるかどうかを確認することにした。

【0083】

前記実施例３－２の方法によりピメクロリムスが処理された幹細胞を得、それを遠心分離して沈殿した細胞を収集した後、それを破砕して細胞破砕物を得、得られた細胞破砕物とＣＯＸ２抗体を用いたウェスタンブロット分析を行った（図４ｃ）。その時、内部対照群としては、ＧＡＰＤＨを用いた。

【0084】

図４ｃは、ピメクロリムスの処理濃度による幹細胞から発現するＣＯＸ２の水準を比較した結果を示すウェスタンブロットの写真及びその密度を分析した結果を示すグラフである。

【0085】

図４ｃで見られるように、０．０１～１００ｎｇ／ｍｌの範囲のピメクロリムスが処理された幹細胞から発現するＰＧＥ_２の水準は、ピメクロリムスの処理濃度に比例して急激に減少することを確認した。

【0086】

前記実施例３－１～３－３の結果を総合すると、ピメクロリムスは幹細胞に作用してＣＯＸ２の発現を抑制することにより幹細胞でＰＧＥ_２の発現水準を抑制し、このようなＰＧＥ_２の発現水準の抑制により幹細胞が示す免疫抑制の活性が減少することが分かった。

【0087】

実施例４：免疫抑制の活性に及ぼす幹細胞とピメクロリムスの相関関係
前記実施例３を通じてピメクロリムスが幹細胞の免疫抑制の活性を減少させる効果を示すことを確認したため、そのような効果をより深く分析するために、多様な条件を設定し、ＭＬＲ分析法でその結果を分析した。

【0088】

具体的には、コンカナバリンＡ（ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ、ＣｏｎＡ）を処理したＰＢＭＣ細胞を７日間培養しながら、ピメクロリムスと間葉系幹細胞（ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）をそれぞれ個別にまたは組み合わせて処理した後、これらの各実験群で測定した免疫抑制の活性を比較した。
その時、ピメクロリムスと間葉系幹細胞の組み合わせ様相により１０個の実験群を設定した（表１）

【0089】

【表1】

【0090】

前記各実験群の実験結果を分析目的に応じて分類して分析した（図５ａ～５ｂ）。

【0091】

まず、幹細胞とピメクロリムスを同様の処理条件で比較した結果を分析した（図５ａ）。

【0092】

図５ａは、幹細胞とピメクロリムスを同様の条件で処理して得られた免疫抑制の活性を比較したグラフである。

【0093】

図５ａで見られるように、幹細胞とピメクロリムスを同時に処理した場合には、処理時間と無関係に免疫抑制の活性が示されなかった（実験群１及び６）。

【0094】

また、幹細胞とピメクロリムスをそれぞれ処理した場合には、処理時間により多少差があるが、全体的にピメクロリムスの免疫抑制の活性が幹細胞の免疫抑制の活性より比較優位を示した（実験群２及び３；実験群５及び９）。

【0095】

次に、ピメクロリムスを先に処理し、幹細胞を後に処理した結果を分析した（図５ｂ）。
図５ｂは、ピメクロリムスを先に処理し、幹細胞を後に処理して得られた免疫抑制の活性を比較したグラフである。

【0096】

図５ｂで見られるように、ピメクロリムスを処理した後に順次幹細胞を処理した場合には、１０実験群中、最も高い免疫抑制の活性を示した（実験群４）。

【0097】

このような結果は、同様の条件でピメクロリムスと幹細胞をそれぞれ個別に処理した結果（実験群２及び５）と比較する場合、比較優位を示すため、ピメクロリムスと幹細胞が相乗効果を示すことが分析された。

【0098】

また、幹細胞を先に処理し、ピメクロリムスを後に処理した結果を分析した（図５ｃ）。
図５ｃは、幹細胞を先に処理し、ピメクロリムスを後に処理して得られた免疫抑制の活性を比較したグラフである。

【0099】

図５ｃで見られるように、幹細胞のみを処理した場合よりは、幹細胞を処理した後に順次ピメクロリムスを処理した場合に、比較優位の免疫抑制の活性を示した（実験群３及び７）。

【0100】

それだけでなく、幹細胞のみを処理した場合よりは、幹細胞とピメクロリムスを同時ではないが、順次処理した場合に、比較優位の免疫抑制の活性を示した（実験群８及び１０）。

【0101】

最後に、幹細胞とピメクロリムスを共に処理するが、処理順序による変化を分析した（図５ｄ）。

【0102】

図５ｄは、幹細胞とピメクロリムスを共に処理するが、処理順序による免疫抑制活性の変化を分析した結果を示すグラフである。

【0103】

図５ｄで見られるように、幹細胞とピメクロリムスを同時に処理した場合には、免疫抑制の活性が示されなかったが（実験群１）、幹細胞とピメクロリムスを処理順序の多様な組み合わせにより順次処理した場合には、優れた免疫抑制の活性を示した（実験群４及び７）。

【0104】

特に、ピメクロリムスを先に処理した後、幹細胞を後に処理した場合（実験群４）には、幹細胞を先に処理した後、ピメクロリムスを後に処理した場合（実験群７）よりも相対的に優れた免疫抑制の活性を示した。

【0105】

前記分析結果を総合すると、それぞれ免疫抑制の活性を示すピメクロリムスと幹細胞は組み合わせ処理方法により、免疫抑制の活性が大きい偏差を示す結果を招くことを確認した。即ち、実施例３の結果によると、幹細胞の免疫抑制の活性をピメクロリムスが一方的に干渉するように確認されたが、実際には、ピメクロリムスが示す免疫抑制の活性にも幹細胞が影響を及ぼし得ることを確認した。

【0106】

結果的に見ると、幹細胞とピメクロリムスは共に処理する場合、相乗効果を示し得るが、そのためには、同時に処理するものではなく、順次処理する方法を使用しなければならないことが分かった。特に、このように順次処理する場合に、ピメクロリムスを先に処理した後、幹細胞を処理すると、最も優れた免疫抑制の活性を示すことをさらに確認した。

【0107】

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

【図1】