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特表2024-529782長期持続型組換えヒトインターロイキン２融合タンパク質及びその調製方法並びに使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-08

(54)【発明の名称】長期持続型組換えヒトインターロイキン２融合タンパク質及びその調製方法並びに使用

(51)【国際特許分類】

C12N 5/10 20060101AFI20240801BHJP

C07K 19/00 20060101ALI20240801BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240801BHJP

A61P 1/16 20060101ALI20240801BHJP

A61P 11/00 20060101ALI20240801BHJP

A61P 37/02 20060101ALI20240801BHJP

A61K 47/64 20170101ALI20240801BHJP

A61K 38/20 20060101ALI20240801BHJP

C12N 15/12 20060101ALN20240801BHJP

C12N 15/62 20060101ALN20240801BHJP

C12N 15/26 20060101ALN20240801BHJP

C07K 14/55 20060101ALN20240801BHJP

C07K 14/765 20060101ALN20240801BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C07K19/00

A61P35/00

A61P1/16

A61P11/00

A61P37/02

A61K47/64

A61K38/20

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/26

C07K14/55

C07K14/765

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024513117

(86)(22)【出願日】2021-09-29

(85)【翻訳文提出日】2024-04-25

(86)【国際出願番号】 CN2021121808

(87)【国際公開番号】W WO2023024215

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】202110982310.8

(32)【優先日】2021-08-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518416300

【氏名又は名称】ベイジンブイディージェイバイオカンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ

(72)【発明者】

【氏名】リー，ズージィアン

(72)【発明者】

【氏名】ティエン，シンシォン

(72)【発明者】

【氏名】チォン，ジェンウェイ

(72)【発明者】

【氏名】マー，ロン

(72)【発明者】

【氏名】ジァン，イェンジン

(72)【発明者】

【氏名】スン，イーピン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，シャオルイ

(72)【発明者】

【氏名】ジャオ，ティンティン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，ジュン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076BB11

4C076CC07

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC27

4C076EE59

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA41

4C084CA18

4C084DA14

4C084MA66

4C084NA03

4C084NA12

4C084ZA59

4C084ZA75

4C084ZB07

4C084ZB26

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA04

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、インターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質を開示し、インターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合遺伝子を有するプラスミドをＣＨＯ細胞にエレクトロポレーショントランスフェクションすることにより、ヒト化組換えタンパク質を安定的、効率的に発現するＣＨＯモノクローナル細胞株が得られる。本発明のモノクローナル細胞株は、ヒトインターロイキン２の血漿中半減期を延長し、ヒトインターロイキン２類の薬物の調製や、腫瘍、免疫不全性疾患等の多様な疾患を治療するための薬物の調製に用いられる、インターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質を分泌、発現することができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトインターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質を発現させる発現系であって、
前記融合タンパク質は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加され且つ同等の機能を有するアミノ酸配列、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトインターロイキン２又はその変異体と、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加され且つ同等の機能を有するアミノ酸配列、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒト血清アルブミン又はその変異体とを含むことを特徴とする発現系。

【請求項2】

前記発現系は、ＣＨＯ細胞であり、好ましくは、前記発現系は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞であることを特徴とする請求項１に記載の発現系。

【請求項3】

前記ヒトインターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の発現系。

【請求項4】

前記融合タンパク質において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の１２５番目のアミノ酸は、システインではなく、好ましくは、前記１２５番目のアミノ酸は、セリン又はアラニンに置換されていることを特徴とする請求項３に記載の発現系。

【請求項5】

前記ヒトインターロイキン２又はその変異体は、前記ヒト血清アルブミン又はその変異体に直接に連結されているか、又は連結ペプチドを介して連結されており、
好ましくは、前記連結ペプチドの一般式は（Ｇ_ｎＳ）_ｍであり、ｎ、ｍはそれぞれ１～１０の整数であり、より好ましくは、ｎは１～４の整数であり、ｍは０～３の整数であることを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項6】

前記融合タンパク質のＮ末端は、シグナルペプチドを保有し、
好ましくは、前記シグナルペプチドは、分泌シグナルペプチドＣＤ３３であることを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項7】

前記シグナルペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５に示される配列を有することを特徴とする請求項６に記載の発現系。

【請求項8】

前記融合タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されるヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする請求項１に記載の発現系。

【請求項9】

前記ヒトインターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の発現系。

【請求項10】

腫瘍、肝炎、肺炎又は免疫不全疾患を治療するための薬物の調製における請求項１～９のいずれか一項に記載の発現系の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物製薬分野に関し、具体的にはヒトインターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質及びそのコード遺伝子並びに使用に関する。

【背景技術】

【0002】

インターロイキン２（ＩＬ－２）は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞によって産生される１５．５ｋＤ糖タンパク質であり、生体の免疫応答において重要な役割を果たす。（ヒト）インターロイキン２（（ｈ）ＩＬ－２）は、１３３個のアミノ酸残基からなり（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、１つの鎖内ジスルフィド結合と成熟タンパク質の１２５番目のアミノ酸残基に位置する１つのシステインを有し、このシステインは、他の２つのシステインとミスマッチジスルフィド結合を形成しやすいが、ジスルフィド結合が異常にペアリングしたＩＬ－２は活性がない。そのシステインをセリン又はアラニンに変異させることにより、ＩＬ－２の活性を変化させることなく、この問題を回避することができる。ＩＬ－２は、主にＴ細胞、大顆粒リンパ球、単球、Ｂ細胞を含む免疫細胞に作用し、細胞増殖とサイトカイン分泌を促進する。インビボにおいて、ＩＬ－２は、抗腫瘍、抗微生物感染及び免疫調節等などの作用を奏する。単独で又はＩＦＮ－α、モノクローナル抗体、ＬＡＫ細胞等などと併用して臨床に用いることにより、腎細胞癌、転移性黒色腫及びリンパ腫等などに対して一定の治療作用を有し、結腸癌に対しても治療効果を有し、腫瘍患者の放射線治療、化学治療に対する耐性を向上させることもできる。現在、臨床では、腫瘍、ウイルス性肝炎等などの治療に幅広く使用され、治療効果が顕著である。しかし、上記疾患は、一般的に病程が長いため、ＩＬ－２を長期間使用する必要があるが、ＩＬ－２の血漿中半減期は、わずか２時間程度であり、薬効を維持するために大用量で頻繁に注射する必要があり、治療コストを大幅に上昇させるだけでなく、患者の苦痛を増加させ、副反応を増加させる。

【0003】

融合タンパク質を構築して薬物分子量を増加させる方法により薬物の半減期を延長することが行われている。血清アルブミンは、血漿の重要な成分であり、多くの内因性因子及び外因性薬物の担体でもあり、通常は糸球体を透過しにくい。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、５８５個のアミノ酸残基からなるタンパク質（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）であり、その分子量は約６６．５ＫＤであり、血漿中半減期は２週間以上と長い。

【0004】

特許出願ＣＮ１０４７８９５９４Ａには、密度が４．０×１０^６細胞／ｍＬである８０ｍＬの種子液を基に、３日目の細胞密度が６．４×１０^６細胞／ｍＬに達し、３日目以降の降温による細胞密度の変化が大きくなく、最終タンパク質濃度が１１８ｍｇ／Ｌである、安定細胞株の３Ｌ振盪フラスコでの流加培養が開示されている。細胞株での高発現量は、近年の抗体等の生体高分子の生産における基本的な要求である。

【0005】

そのため、より発現量が高く、より長期持続型のあるヒトインターロイキン２と血清アルブミンとの融合タンパク質が求められる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、ヒトインターロイキン２の血漿中半減期を延長することができるヒトインターロイキン２と血清アルブミンとの融合タンパク質及びそのコード遺伝子を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の目的を達成するために、本発明は、哺乳動物真核発現系を利用してヒトインターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質を発現し、両者を直接に連結するか、又は連結ペプチドを介して連結した長期持続型の組換えヒトインターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質及びその調製方法を提供する。

【0008】

第１の態様では、本発明は、ヒトインターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質を発現させる発現系を提供し、
前記融合タンパク質は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加され且つ同等の機能を有するアミノ酸配列、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトインターロイキン２又はその変異体と、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加され且つ同等の機能を有するアミノ酸配列、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒト血清アルブミン又はその変異体とを含む発現系を提供する。

【0009】

本発明において、前記発現系は、ＣＨＯ細胞であり、好ましくは、前記発現系は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞である。

【0010】

本発明は、意外にも、ＣＨＯ細胞を用いる場合、特にＣＨＯ－Ｋ１細胞株を用いる場合、細胞発現量が非常に高く、４ｇ／Ｌに達することができ、且つ発現された融合タンパク質が高活性を有し、インビトロで特定の細胞、例えばＮＫ細胞及び／又はＴ細胞に対して強く増殖を促進する作用を有することを見出した。

【0011】

いくつかの実施形態では、前記ヒトインターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0012】

ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列は、１３３個のアミノ酸残基からなるヒトインターロイキン２であり、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列は、５８５個のアミノ酸残基からなるヒト血清アルブミンである。

【0013】

いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の１２５番目のアミノ酸は、システインではなく、好ましくは、前記１２５番目のアミノ酸は、セリン又はアラニンに置換されている。

【0014】

いくつかの実施形態では、前記ヒトインターロイキン２又はその変異体は、前記ヒト血清アルブミン又はその変異体に直接に連結されているか、又は前記ヒトインターロイキン２又はその変異体は、連結ペプチドを介して前記ヒト血清アルブミン又はその変異体に連結されている。

【0015】

本発明の前記融合タンパク質において、前記融合タンパク質に含まれる２つの部分の間に大きな間隔を持たせ、ヒトインターロイキン２の部分を最大限にインターロイキン２の受容体と結合させるために、ヒトインターロイキン２又はその変異体と前記ヒト血清アルブミン又はその変異体との間に連結ペプチドが設けられており、好ましくは、前記連結ペプチドの一般式は（Ｇ_ｎＳ）_ｍであり、ｎ、ｍはそれぞれ１～１０の整数であり、より好ましくは、ｎは１～４の整数であり、ｍは０～３の整数である。

【0016】

いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質のＮ末端は、シグナルペプチドを保有し、
好ましくは、前記シグナルペプチドは、分泌シグナルペプチドＣＤ３３であり、より好ましくは、前記シグナルペプチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５に示されるＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡである。

【0017】

いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。

【0018】

本発明においては、ＮＣＢＩに開示されているヒトインターロイキン２とヒト血清アルブミンの遺伝子配列に基づいて、哺乳動物におけるコドンバイアスに従って遺伝子配列の最適化を行い、最適化された融合タンパク質の遺伝子配列を発現ベクターに構築し、宿主細胞にトランスフェクションし、宿主細胞で発現させ、目的タンパク質を単離、精製する。

【0019】

本発明の最適化された融合タンパク質遺伝子配列について、そのＮ末端にシグナルペプチドを付加して、好ましくは分泌シグナルペプチドＣＤ３３配列を付加して、発現ベクターに構築し、得られたベクターを宿主細胞にトランスフェクションし、宿主細胞で発現させ、目的タンパク質を単離、精製する。

【0020】

本発明において、最適化された、Ｎ末端にシグナルペプチドを保有し、発現ベクターに構築された遺伝子配列がＳＥＱＩＤＮＯ：３に示される。

【0021】

いくつかの実施形態では、前記ヒトインターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有する。

【0022】

ここで、ＳＥＱＩＤＮＯ：４は、７２８個のアミノ酸残基配列からなるタンパク質であり、そのうち、アミノ末端の１番目から１３３番目までは、ヒトインターロイキン２のコード配列であり、アミノ末端の１３４番目から１４３番目までは、連結ペプチドのコード配列ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒであり、アミノ末端の１４４番目から７２８番目までは、ヒト血清アルブミンのコード配列である。

【0023】

第２の態様では、本発明は、腫瘍、肝炎、肺炎又は免疫不全疾患を治療するための薬物の調製における前記発現系の使用を提供する。

【発明の効果】

【0024】

本発明は、インターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質を発現させる発現系を開示し、インターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合遺伝子を有するプラスミドをＣＨＯ細胞にエレクトロポレーショントランスフェクションすることにより、ヒト化組換えタンパク質を安定的、効率的に発現するＣＨＯモノクローナル細胞株が得られる。本発明のモノクローナル細胞株は、ヒトインターロイキン２の血漿中半減期を延長し、ヒトインターロイキン２類の薬物の調製や、腫瘍、免疫不全性疾患等の多様な疾患を治療するための薬物の調製に用いられる、インターロイキン２とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質を分泌、発現することができる。

【0025】

本発明は、クローンスクリーニングにより高い発現量を実現するだけでなく、細胞構築において、最適化された融合タンパク質遺伝子配列のＮ末端にシグナルペプチドを付加することも発現量が高い原因の一つである。

【0026】

本発明の細胞株は、発現量が高く、４ｇ／Ｌに達することができるだけでなく、発現された融合タンパク質が高活性を有し、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞に対して強く増殖を促進する作用を有する。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】図１は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１クローンスクリーニングにおけるウェルプレート培養上清の還元電気泳動の分析結果を示し、上清は、２０μＬでローディングした。

【図2】図２は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１クローンスクリーニングにおける流加培養によるＤ１３上清の非還元電気泳動の分析結果を示し、上清は、５μＬでローディングした。

【図3】図３は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１クローン＃９のモノクローナルスクリーニングにおける流加培養によるＤ１３上清の非還元電気泳動の分析結果を示し、上清は、３μＬでローディングした。

【図4】図４は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１クローン＃９－６のモノクローナルスクリーニングにおける流加培養によるＤ１３上清の非還元電気泳動の分析結果を示し、上清は、２μＬでローディングした。

【図5】図５は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の培養動態曲線を示す。１２５ｍＬの振盪フラスコで流加培養し、初期細胞密度は、０．３×１０^６細胞／ｍＬであり、初期培養体積は、２５ｍＬであり、最大生細胞密度は、１９．３×１０^６細胞／ｍＬになった。

【図6】図６は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の低密度接種培養プロセスによって得られた上清Ｄ７－Ｄ１３におけるタンパク質発現量の動態曲線を示す。

【図7】図７は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の発現上清の非還元電気泳動の分析結果を示し、上清は、１μＬでローディングした。

【図8】図８は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の培養動態曲線を示す。１Ｌの振盪フラスコで流加培養し、初期細胞密度は、２×１０^６細胞／ｍＬであり、初期培養体積は、３００ｍＬであり、最大生細胞密度は、１６×１０^６細胞／ｍＬになった。

【図9】図９は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の高密度接種培養プロセスにより得られた上清Ｄ０－Ｄ１０におけるタンパク質発現量の動態曲線を示す。

【図10】図１０は、ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の発現上清の非還元電気泳動の分析結果を示し、上清は、５μＬでローディングした。

【図11】図１１は、ＩＬ－２－ＨＳＡがＮＫ－９２の増殖を刺激した曲線を示す。

【図12】図１２は、ＩＬ－２－ＨＳＡがＣＴＬＬ－２の増殖を刺激した曲線を示す。

【発明を実施するための形態】

【0028】

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明の実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定するものではなく、本発明の思想を前提として本発明を簡単に改良したものは、いずれも本発明の保護範囲に属することが理解されるだろう。

【0029】

実施例１安定化細胞株の構築
トランスフェクションの前日に、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の密度を０．５×１０^６細胞／ｍＬに調整した。トランスフェクションの当日、線形化処理された、高濃度のエンドトキシンフリーのプラスミドを用意し、ＣＨＯ－Ｋ１細胞密度及び生存率を測定し、細胞生存率が９７％を超えていることを確保した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞をＣＤＣＨＯ培地で２回洗浄した後、７００μＬの細胞懸濁液＋４０μｇのプラスミドのエレクトロポレーショントランスフェクション反応系を配置し、均一に混合した後、４ｍｍ電極カップに移した。電極カップをエレクトロポレーショントランスフェクション装置に入れ、電気ショックパラメータを３００Ｖ、１０００μＦに設定し、電気ショックを１回行い、電気ショック後の細胞懸濁液を予熱された新鮮なＣＤＣＨＯ培地に移し、３７℃で２０ｍｉｎインキュベートした。インキュベートした細胞懸濁液を９６ウェルプレートに均一に接種し、２４ｈトランスフェクションした後、加圧し、最終選択圧が２５～５０μＭＭＳＸとなるようにメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有するＣＤＣＨＯ培地を加え、５％ＣＯ_２、３７℃で静置培養した。

【0030】

実施例２高発現モノクローナル細胞株のスクリーニング
９６ウェルプレートにおけるモノクローンが適切な大きさに成長した後、モノクローンの選別を開始し、すべてのクローンを新しい９６ウェルプレートに移し、５％ＣＯ_２、３７℃で静置培養した。ウェル内の細胞が満杯になった後、ウェルプレートにおける上清を取って還元電気泳動を行い、融合タンパク質の発現状況を検出し、発現量が最も高い９個のクローン株（図１参照）を選出し、振盪フラスコ培養まで徐々に拡大した。９個のクローンを２５ｍＬ体積の振盪フラスコで流加培養し、培養上清を回収した後、非還元電気泳動同定（図２参照）を行った。発現状況が最も良い細胞株＃９を選定した。細胞株＃９に対して限界希釈法によりモノクローナル細胞株のスクリーニングを行い、０．３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、スクリーニングして１１個の高発現細胞株を得て、２５ｍＬ体積の振盪フラスコで流加培養を行い、上清に対して非還元電気泳動同定（図３を参照）を行った。発現状況が最も良い細胞株＃９－６を選定し、細胞株＃９－６に対して限界希釈法により再びモノクローナル細胞株のスクリーニングを行い、スクリーニングして７個の高発現細胞株を得て、２５ｍＬ体積の振盪フラスコで流加培養を行い、上清に対して非還元電気泳動同定（図４を参照）を行った。安定性がよく、発現量が高い細胞株＃９－６－７を選定し、安定高発現細胞株ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１とした。

【0031】

実施例３安定細胞株の１２５ｍＬ振盪フラスコでの流加培養
ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の培養発現を開始した当日、０．３×１０^６細胞／ｍＬで２５～５０μＭＭＳＸを含む基礎培地２５ｍＬを１２５ｍＬの振盪フラスコに接種し、この時、Ｄ０と記し、５％ＣＯ_２、３７℃、１３５ｒｐｍのシェーカーで培養した。接種後Ｄ４からサンプリング計数を開始し、細胞密度が１０×１０^６細胞／ｍＬになると、培養温度を３３℃に下げた。Ｄ５にサプリメント培地の流加を開始し、グルコース濃度を３～４ｇ／Ｌに制御した。Ｄ１３まで培養すると、培養を終了し、細胞培養液上清を収集し、融合タンパク質の発現量を測定したところ、４．３６ｍｇ／ｍＬであった。

【0032】

ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の培養動態曲線を図５に示す。図５から分かるように、培養前期において、細胞は対数増殖期にあり、密度増加が速いが、培養後期において、細胞はタンパク質生産段階に入り、細胞密度が安定となる傾向にある。最大生細胞密度は、１９．３×１０^６細胞／ｍＬに達している。

【0033】

ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の上清発現量の動態曲線を図６に示す。図６から分かるように、Ｄ７－Ｄ１３において、培養日数の増加に伴い、細胞タンパク質の発現量は、増加傾向を示す。Ｄ１３の発現量は、４．３６ｍｇ／ｍＬである。

【0034】

ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の発現上清の非還元電気泳動分析を図７に示す。図７から分かるように、Ｄ７－Ｄ１３において、培養日数の増加に伴い、細胞タンパク質の発現量は、増加傾向を示す。目標タンパク質のバンドは単一であり、不純物のバンドはない。

【0035】

実施例４安定細胞株の１Ｌ振盪フラスコでの流加培養
ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞を２×１０^６細胞／ｍＬの密度で振盪フラスコに５０ｍＬ接種し、５％ＣＯ_２、３７℃、１３５ｒｐｍのシェーカーで培養した。毎日サンプリングして計数し、細胞状態を観察し、２５～５０μＭＭＳＸを含む基礎培地を追加し、細胞密度が２×１０^６細胞／ｍＬになるように毎日調整し、細胞培養液の体積が３００ｍＬになると、基礎培地の追加を停止し、培養を継続し、このとき、Ｄ０とした。毎日サンプリングして計数するとともに、培養上清を１ｍＬ残した。細胞密度が６×１０^６～７×１０^６細胞／ｍＬになると、培養温度を３３℃に下げた。Ｄ２からサプリメント培地の流加培養を開始し、グルコース濃度を３ｇ／Ｌに制御した。Ｄ１０まで培養すると、培養を終了し、細胞培養液上清を回収し、Ｄ０～Ｄ１０の上清タンパク質の発現量を測定した。Ｄ１０に回収した上清から測定した融合タンパク質の発現量は、３．１２ｍｇ／ｍＬであった。

【0036】

ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の培養動態曲線を図８に示す。図８から分かるように、培養前期において、細胞は対数増殖期にあり、密度増加が速いが、培養後期において、細胞はタンパク質生産段階に入り、細胞密度が安定となる傾向にある。最大生細胞密度は、１６×１０^６細胞／ｍＬに達している。

【0037】

ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の上清の発現量の動態曲線を図９に示す。図９から分かるように、培養日数の増加に伴い、細胞タンパク質の発現量は、増加傾向を示す。

【0038】

ＩＬ－２－ＨＳＡ／ＣＨＯＫ１細胞の発現上清の非還元電気泳動分析を図１０に示す。図１０から分かるように、培養日数の増加に伴い、細胞タンパク質の発現量は、増加傾向を示す。目標タンパク質のバンドは単一であり、不純物のバンドはない。

【0039】

従来技術における振盪フラスコ流加培養と比較して、本発明は、細胞密度、細胞生存率が高く、図８に示すように、６－１０日目に細胞密度が１４×１０^６～１６×１０^６細胞／ｍＬに達し、また、本発明の細胞タンパク質の発現量も高く、図９に示すように、１０日目の発現量が３．１２ｍｇ／ｍＬである。本願において、細胞密度が１４×１０^６～１６×１０^６細胞／ｍＬである場合でも発現量は高く、このような細胞密度では細胞活性が依然として良好であることを示す。

【0040】

実施例５融合タンパク質の活性実験１：ＮＫ－９２細胞に対するＩＬ－２－ＨＳＡの増殖作用の検出
本実施例では、ＮＫ－９２細胞（ＡＴＣＣ^（Ｒ）ＣＲＬ－２４０７^ＴＭ、５０歳男性の悪性非ホジキンリンパ腫患者の末梢血単核球から誘導されたＩＬ－２依存性ＮＫ細胞株）を用いて、ＩＬ－２－ＨＳＡの生物学的活性を評価した。

【0041】

（１）液体窒素タンクから凍結保存したＮＫ－９２細胞を１本取り出し、対数増殖期まで蘇生培養した。
（２）遠心分離して十分量の細胞を収集し、ＩＬ－２を含まない完全培地で再懸濁し、２４時間飢餓培養した。
（３）飢餓培養したＮＫ－９２細胞を遠心分離し、ＩＬ－２を含まない完全培地で再懸濁し、計数し、細胞密度を５×１０^５個／ｍＬに調整し、１ウェルあたり９０μＬの体積で９６ウェルプレートに加えた。
（４）サンプル溶液の調製：培地でＩＬ－２－ＨＳＡサンプルとｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、商品番号：２０２－ＩＬ）を５０．６７ｎＭに予備希釈し、４倍勾配で９つの濃度に希釈した。１０μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートの対応するウェルに加え、各濃度は３重複にして、陰性対照群は、１０μＬ／ｗｅｌｌの培地を加え、均一に混合した。
（５）３７℃、５％ＣＯ_２の条件で７２時間培養した後、溶融して均一に混合したＭＴＳ検出試薬を２０μＬ／ｗｅｌｌで上記の９６ウェルプレートに加え、振とう器で振とうして均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ_２の細胞インキュベーターに置いて１～４時間インキュベートを継続した。
（６）インキュベーション終了後、振とうして均一に混合し、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍ波長における吸光度を測定した。
（７）データは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８ソフトウェアで分析し、薬物濃度Ｘの対数値を横軸とし、ＯＤ_４９０を縦軸とし、４パラメータロジスティックフィット分析で薬物効果曲線をフィッティングした。得られたＥＣ_５０値を表１に、増殖曲線を図１１に示す。

【0042】

【表1】

【0043】

図１１から分かるように、ＩＬ－２－ＨＳＡは、用量依存的にＮＫ－９２細胞の増殖を誘導する。この実験条件では、ＩＬ－２－ＨＳＡは、等モルのｒｈＩＬ－２よりもＮＫ－９２の増殖を刺激する活性が優れている（約４倍程度）。

【0044】

実施例６融合タンパク質の活性実験２：ＣＴＬＬ－２細胞に対するＩＬ－２－ＨＳＡの増殖作用の検出
本実施例では、ＣＴＬＬ－２細胞（ＡＴＣＣ^（Ｒ）ＴＩＢ－２１４^ＴＭ、マウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株、ＩＬ－２依存型）を用いて、ＩＬ－２－ＨＳＡの生物学的活性を評価した。

【0045】

中国薬局方におけるヒトインターロイキン２の生物学的活性測定法（ＣＴＬＬ－２細胞／ＭＴＴ比色法）を参照し、ＣＴＬＬ－２細胞を３００００個／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、連続段階希釈された国家標準品及びＩＬ－２－ＨＳＡを加え、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１８～２４時間培養した後、ＭＴＳ検出試薬を加え、１～４時間インキュベートし続け、振とうして均一に混合し、マイクロプレートリーダーで波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８ソフトウェアで分析し、希釈度Ｘの対数を横軸とし、ＯＤ_４９０を縦軸とし、４パラメータロジスティックフィット分析で薬物効果曲線をフィッティングし、得られたＥＣ_５０値を表２に示し、増殖曲線を図１２に示す。

【0046】

ＩＬ－２－ＨＳＡの生物学的活性は、以下の式で計算される。

【数1】