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特表2024-529797逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-13
(54)【発明の名称】逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20240805BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20240805BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240805BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12M3/00 Z
C12N5/071
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023551665
(86)(22)【出願日】2023-06-29
(85)【翻訳文提出日】2023-09-01
(86)【国際出願番号】 KR2023009097
(87)【国際公開番号】W WO2024010279
(87)【国際公開日】2024-01-11
(31)【優先権主張番号】10-2022-0083336
(32)【優先日】2022-07-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523319324
【氏名又は名称】クレセル，シーオー．エルティーディー．
(74)【代理人】
【識別番号】110003797
【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チュン，ヒュン ミン
(72)【発明者】
【氏名】キム，シ－ユン
(72)【発明者】
【氏名】リー，スル－ギ
(72)【発明者】
【氏名】チュン，グジン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA09
4B029AA27
4B029BB11
4B029CC01
4B029GA08
4B029GB10
4B029HA09
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BA30
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、線維芽細胞と角化細胞を用いた人工皮膚に関し、より詳しくは、逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置に関する。このために、直交するＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸上で、平板１２０を独立して移送可能な３Ｄプリンタ１００と、上部に固定配置され、逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化された線維芽細胞貯蔵された線維芽細胞液容器１５０と、前記線維芽細胞液容器１５０に隣接して配置され、前記逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化された角化細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）が貯蔵された角化細胞液容器１４０と、一端が前記角化細胞液容器１４０に連結され、他端が噴射装置１６０に連結される第１の移送管１４５と、一端が前記線維芽細胞容器１５０に連結され、他端が前記噴射装置１６０に連結される第２の移送管１５５と、上部に前記第１及び第２の移送管１４５、１５５が独立して連結され、下部に前記第１の移送管１４５に連結される第１のノズル、及び前記第２の移送管１５５に連結される第２のノズルが備えられた前記噴射装置１６０とを含むことを特徴とする逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置が提供される。
【選択図】図１２
【選択図】図１２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
直交するＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸上で、平板１２０を独立して移送可能な３Ｄプリンタ１００と、上部に固定配置され、逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化された線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）が貯蔵された線維芽細胞液容器１５０と、
前記線維芽細胞液容器１５０に隣接して配置され、前記逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化された角化細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）が貯蔵された角化細胞液容器１４０と、
一端が前記角化細胞液容器１４０に連結され、他端が噴射装置１６０に連結される第１の移送管１４５と、
一端が前記線維芽細胞容器１５０に連結され、他端が前記噴射装置１６０に連結される第２の移送管１５５と、
上部に前記第１及び第２の移送管１４５、１５５が独立して連結され、下部に前記第１の移送管１４５に連結される第１のノズル、及び前記第２の移送管１５５に連結される第２のノズルが備えられた前記噴射装置１６０とを含むことを特徴とする逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置。
【請求項2】
前記逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）は、一人の供与者から由来することを特徴とする請求項１に記載の逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置。
【請求項3】
前記線維芽細胞は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）バッジに、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、インシュリン、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、及びＮＥＡＡ（ｎｏｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）のうち、少なくとも１つを投入して分化させることを特徴とする請求項１に記載の逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置。
【請求項4】
前記ＤＭＥＭバッジは、分化開始日から６日目まで、３：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジであり、７日目から１３日目では、１：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジであり、
１４日目から２１日目では、３：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジであることを特徴とする請求項３に記載の逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置。
【請求項5】
分化開始日から２１日目まで、５％の前記ＦＢＳ、分化開始日から６日目まで、５μｇ／ｍｌの前記インシュリンと、１０ｎｇ／ｍｌの前記ＥＧＦ、
１４日目から２１日目まで、５μｇ／ｍｌの前記インシュリンと、１０ｎｇ／ｍｌの前記ＥＧＦ、
４日から６日目まで、２５ｎｇ／ｍｌの前記ＢＭＰ４、及び
７日目から１３日目まで、１％の前記ＮＥＡＡがそれぞれ投入されることを特徴とする請求項３に記載の逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置。
【請求項6】
前記角化細胞は、ＤＭＥＭバッジ又はｄｋＳＦＭ培養液に、ＦＢＳ、インシュリン、ＥＧＦ、ＢＭＰ４、ＮＥＡＡ、レチノイン酸、及びＣａＣｌ２のうち、少なくとも１つを投入して分化させることを特徴とする請求項１に記載の逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置。
【請求項7】
前記ＤＭＥＭバッジは、分化開始日から７日目まで、３：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジであり、前記ｄｋＳＦＭ培養液は、８日目から２１日目まで用いられることを特徴とする請求項６に記載の逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置。
【請求項8】
分化開始日から７日目まで、２％の前記ＦＢＳ、分化開始日から２１日目まで、５μｇ／ｍｌの前記インシュリン、
分化開始日から７日目まで、２５ｎｇ／ｍｌの前記ＥＧＦ、
８日目から２１日目まで、２０ｎｇ／ｍｌの前記ＥＧＦ、
分化開始日から７日目まで、２５ｎｇ／ｍｌの前記ＢＭＰ４、
８日目から１５日目まで、２０ｎｇ／ｍｌの前記ＢＭＰ４、
１６日目から２１日目まで、１０ｎｇ／ｍｌの前記ＢＭＰ４、
分化開始日から１５日目まで、１μｇ／ｍｌの前記レチノイン酸、及び
１８日目から２１日目まで、１．２ｍＭの前記ＣａＣｌ２がそれぞれ投入されることを特徴とする請求項６に記載の逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）と角化細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を用いた人工皮膚に関し、より詳しくは、逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、幹細胞から線維芽細胞を培養するか、角化細胞（又は、角質細胞）を培養して、人工皮膚を作られるということが多数の学術論文を通じて知られている。このため、実際に初代培養細胞は、商業会社（米国ＡＴＣＣ）から購買も可能である。
【0003】
ところが、このような初代培養細胞は、増殖に限界があり、物品（ＬＯＴ）別に変化が非常に大きい。例えば、一度購入した初代培養細胞は、増殖を通じて、６つの人工皮膚を作ることができるが、追加生産のためには、再度、初代培養細胞を購入しなければならなかった。しかし、各初代培養細胞毎の特性変化が大きいため、作られた人工皮膚の特性が一定でなかった。これは、いずれの供与者から初代培養細胞をもらったかによって、異なるためである。
【0004】
そこで、一定の特性を有する人工皮膚を大量生産することができる技術の研究開発が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、前記のような問題点を解決するためになされたものであって、本発明の目的は、逆分化幹細胞から分化された線維芽細胞と角化細胞を用いて、人工皮膚の製造装置を提供することである。
【0006】
但し、本発明の目的は、以上で言及したことに限定されず、言及していない他の目的は、以下の記載から、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者にとって、明確に理解されるだろう。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記目的を達成するために、直交するＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸上で、平板１２０を独立して移送可能な３Ｄプリンタ１００と、上部に固定配置され、逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化された線維芽細胞が貯蔵された線維芽細胞液容器１５０と、線維芽細胞液容器１５０に隣接して配置され、逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化された角化細胞が貯蔵された角化細胞液容器１４０と、一端が角化細胞液容器１４０に連結され、他端が噴射装置１６０に連結される第１の移送管１４５と、一端が線維芽細胞容器１５０に連結され、他端が噴射装置１６０に連結される第２の移送管１５５と、上部に前記第１及び第２の移送管１４５、１５５が独立して連結され、下部に前記第１の移送管１４５と連結される第１のノズル、及び前記第２の移送管１５５と連結される第２のノズルが備えられた前記噴射装置１６０とを含むことを特徴とする逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置が提供される。
【0008】
前記供与者は、一人である。
【0009】
また、噴射ステップ（Ｓ１６０）において、線維芽細胞と角化細胞は、パターン形状に噴射される。
【0010】
前記線維芽細胞の分化ステップ（Ｓ１４０）は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）バッジに、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、インシュリン、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、及びＮＥＡＡ（ｎｏｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）のうち、少なくとも１つを投入して分化させる。
【0011】
前記ＤＭＥＭバッジは、分化開始日から６日目まで、３：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジであり、７日目から１３日目では、１：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジであり、１４日目から２１日目では、３：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジである。
【0012】
分化開始日から２１日目まで、５％の前記ＦＢＳ、分化開始日から６日目まで、５μｇ／ｍｌの前記インシュリンと１０ｎｇ／ｍｌの前記ＥＧＦ、１４日目から２１日目まで、５μｇ／ｍｌの前記インシュリンと１０ｎｇ／ｍｌの前記ＥＧＦ、４日から６日目まで、２５ｎｇ／ｍｌの前記ＢＭＰ４、及び７日目から１３日目まで、１％の前記ＮＥＡＡがそれぞれ投入される。
【0013】
また、角化細胞の分化段階（Ｓ１２０）は、ＤＭＥＭバッジ又はｄｋＳＦＭ培養液に、ＦＢＳ、インシュリン、ＥＧＦ、ＢＭＰ４、ＮＥＡＡ、レチノイン酸、及びＣａＣｌ２のうち、少なくとも１つを投入して分化させる。
【0014】
前記ＤＭＥＭバッジは、分化開始日から７日目まで、３：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジであり、前記ｄｋＳＦＭ培養液は、８日目から２１日目まで用いられる。
【0015】
また、分化開始日から７日目まで、２％のＦＢＳ、分化開始日から２１日目まで、５μｇ／ｍｌの前記インシュリン、分化開始日から７日目まで、２５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、８日目から２１日目まで、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、分化開始日から７日目まで、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、８日目から１５日目まで、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１６日目から２１日目まで、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、分化開始日から１５日目まで、１μｇ／ｍｌの前記レチノイン酸、及び１８日目から２１日目まで、１．２ｍＭのＣａＣｌ２がそれぞれ投入される。
【発明の効果】
【0016】
本発明によると、１人の供与者から供与された逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）を用いて、皮膚細胞を作り出すので、増殖に限界がなく、作られた細胞間の特性差が少ないため、品質が一定である。
【0017】
但し、本発明により得られる効果は、以上で言及した効果に限定されず、言及していない他の効果は、以下の記載から、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者にとって明確に理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
この明細書における添付の図面は、本発明の好適な実施例を例示しており、後述する発明の詳細な説明と共に本発明の技術思想を更に理解させる役割を果たすので、本発明は、このような図面に記載された事項に限定して解析されてはいけない。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下では、添付の図面を参考として、本発明の実施例について本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように詳しく説明する。しかし、本発明に関する説明は、構造的乃至機能的な説明のための実施例に過ぎないので、本発明の権利範囲は、本文に説明された実施例により制限されることと解析されてはいけない。すなわち、実施例は、様々な変更が可能であり、様々な形態を有することができるので、本発明の権利範囲は、技術的思想を実現することができる均等物を含むことと理解されなければならない。また、本発明で提示された目的又は効果は、特定の実施例がこれを全て含むべきであるか、このような効果のみを含むべきであるという意味ではないので、本発明の権利範囲は、これにより制限されることと理解されてはいけない。
【0020】
本発明における用語の意味は、以下のように理解される。
【0021】
「第１」、「第２」などの用語は、ある構成要素を他の構成要素から区別するためのものであり、これらの用語によって権利範囲が限定されてはいけない。例えば、第１の構成要素は、第２の構成要素と名付けられ、同様に、第２の構成要素も、第１の構成要素と名付けられることができる。ある構成要素が他の構成要素に「連結されて」いることは、該当他の構成要素に直接して連結されることもできるが、中間に他の構成要素が存在することもあり得ると理解されるべきである。これに対して、ある構成要素が他の構成要素に「直接連結されて」いることは、中間に他の構成要素が存在しないことと理解されるべきである。一方、構成要素間の関係を説明する他の表現、すなわち、「～間に」と「すぐ～間に」、又は「～に隣接する」と「～に直接隣接する」なども同様に解析されるべきである。
【0022】
単数の表現は、文脈上、明らかに異なることを意味しない限り、複数の表現を含む。また、「含む」又は「有する」等の用語は、説示された特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、パーツ、又はこれらを組み合わせたものが存在することを指定しようとすることであり、１つ又はその以上の他の特徴や数字、ステップ、動作、構成要素、パーツ、又はこれらを組み合わせたものの存在又は付加可能性を排除しないことと理解すべきである。
【0023】
ここで用いられる全ての用語は、異なった定義しない限り、本発明が属する分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されることと同一の意味を有する。一般に使用される辞書に定義されている用語は、関連技術の文脈上有する意味と一致することと解析されるべきであり、本発明において明らかに定義されない限り、理想的又は過度に形式的な意味を有するものと解析できない。
【0024】
図１３は、本発明による逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造方法を概略的に示すフローチャートである。図１３に示しているように、まず、「１」である供与者の逆分化幹細胞を準備する（Ｓ１００）。
【0025】
図１は、ＢＪ－ｉＰＳＣのＡＰ染色（左）と、全分化能マーカー免疫蛍光染色（右）の写真である。図１に示しているように、ＢＪ線維芽細胞由来のヒト誘導万能幹細胞（ＢＪ－ｉＰＳＣ）を、エピソーマルベクター（Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｖｅｃｔｏｒ）（ｐＣＸＬＥ－Ｈｏｃｔ３／４－ｓｈｐ５３－Ｆ、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ、ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬ； Ａｄｄｇｅｎｅ製品）、及び４Ｄ－ヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）技術を活用して、準備する。
【0026】
リプログラミングされたＢＪ－ｉＰＳＣ細胞の全分化能（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を検証するために、アルカリフォスターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色を行い、図１でのように、全てのｉＰＳＣ ｃｏｌｏｎｙで染色されることを確認した。また、全分化能マーカーであるＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ４抗体を用いて、免疫蛍光染色を行い、マーカーが発現されることを確認した。
【0027】
次の逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）から線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を分化するステップ（Ｓ１４０）と、逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）から角化細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を分化するステップ（Ｓ１２０）とが、同時に独立して又は順次行われる。
【0028】
線維芽細胞の分化
以下、添付の図面を参照して、線維芽細胞の分化（Ｓ１４０）を詳しく説明する。図２は、本発明で用いられる線維芽細胞の分化過程を示すフローチャートである。図２に示しているように、まず、分化開始３日前（Ｄ－３）から、分化開始１日前（Ｄ－１）の間に、ｍＴｅＳＲＴＭ－１のバッジを準備する。ｍＴｅＳＲＴＭ－１のバッジは、高度に専門化された血清－無含有完全細胞培養バッジである。
以下、添付の図面を参照して、線維芽細胞の分化（Ｓ１４０）を詳しく説明する。図２は、本発明で用いられる線維芽細胞の分化過程を示すフローチャートである。図２に示しているように、まず、分化開始３日前（Ｄ－３）から、分化開始１日前（Ｄ－１）の間に、ｍＴｅＳＲＴＭ－１のバッジを準備する。ｍＴｅＳＲＴＭ－１のバッジは、高度に専門化された血清－無含有完全細胞培養バッジである。
【0029】
ついで、分化開始日（Ｄ０）に、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）バッジは、分化開始日から６日目まで、３：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジであり、７日目～１３日目では、１：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジであり、１４日目～２１日目では、３：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジである。具体的に、６０ｍｍの皿に、５５個の杯状体（ｈｉＰＳＣｓ－ＥＢ）を播種する。
【0030】
また、分化開始日（Ｄ０）から２１日目（Ｄ２１）まで、５％のＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、分化開始日（Ｄ０）から６日目（Ｄ６）まで、５μｇ／ｍｌのインシュリンと１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、１４日目（Ｄ１４）（継代培養）から２１日目（Ｄ２１）まで、５μｇ／ｍｌのインシュリンと１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、４日目（Ｄ４）から６日目（Ｄ６）まで、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、及び７日目（Ｄ７）から１３日目（Ｄ１３）まで、１％のＮＥＡＡ（ｎｏｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）がそれぞれ投入される。そして、１８日目（Ｄ１８）に、継代培養をする。
【0031】
ここで、ＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）では、分化開始３日前（Ｄ－３）から１２日目（Ｄ１２）まで、ｈＥＳＣ－ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１００）でコーティングされた皿を用い、１３日目（Ｄ１３）から２１日目（Ｄ２１）の間には、Ｔｙｐｅ Ｉコラーゲンでコーティングされた皿を用いる。このような過程により、２１日目（Ｄ２１）に、線維芽細胞の分化が完成する。
【0032】
図３ａは、ＡＴＣＣで常用中のヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）の写真であり、図３ｂは、本発明により逆分化幹細胞から分化された線維芽細胞の写真である。図３ａと図３ｂを対比すると、本発明により分化された線維芽細胞（図３ｂ）は、細胞質が長く伸び、且つ、図３ａに一致した形状ではないが、類似した形状（代表形状である間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）形状）を備えていることを確認できる。
【0033】
また、図４は、本発明により分化された線維芽細胞のビメンチン（ＶＩＭＥＮＴＩＮ）マーカーを通じて、タンパク質発現量を示すグラフである。図４から、１００個の細胞を分化すると、９７．９４個の細胞でビメンチンマーカーがよく発現していることを確認できる。たとえ、約２％の未線維芽細胞状態が残っているが、全体としては、高純度の線維芽細胞によく分化していることを示す。
【0034】
分化された線維芽細胞において、線維芽細胞マーカーが発現するか、また、特異的ｍＲＮＡが発現するかを確認するために、蛍光染色及びリアルタイム重合酵素連鎖反応（ｑＰＣＲ、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。図５ａ乃至図５ｃは、分化された線維芽細胞（ｉＰＳＣ－Ｆ）の特異マーカー及び核を、様々な光学染色薬で染色した写真であり、図５ｄは、図５ａ～図５ｃを合わせた写真である。図５ａは、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）光学染色薬で染色したビメンチンマーカーの写真であり、図５ｂは、ＴＲＩＴＣ（Ｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）光学染色薬で染色したフィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）マーカーの写真であり、図５ｃは、ＤＡＰＩ（４’、６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）光学染色薬で核を染色した写真である。図５ｄの写真から、分化された細胞が線維芽細胞であることを確認できる。
【0035】
図６ａ～図６ｅは、線維芽細胞の特異マーカーに対するＲＮＡ発現量を示すグラフである。図６ａは、ＣＯＬ１Ａ１マーカーに対する発現量を示すグラフであって、未分化状態である逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）である場合、発現量が無く、実際供与者の初代培養細胞である線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ－）、及び本発明により逆分化幹細胞から線維芽細胞に分化を誘導した細胞（ｉＰＳＣ－Ｆ）では、マーカーがそれぞれ、１００倍及び８０倍に増幅して、高い遺伝子発現量を示している。
【0036】
図６ｂは、ＣＯＬ３Ａ１マーカーに対する発現量を示すグラフである。図６ｂにおいて、未分化状態である逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）であるとき、発現量が無く、実際供与者の初代培養細胞である線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ－）、及び本発明により逆分化幹細胞から線維芽細胞に分化を誘導した細胞（ｉＰＳＣ－Ｆ）では、マーカーがそれぞれ、７０、０００倍及び５０、０００倍に増幅して、高い遺伝子発現量を示す。
【0037】
図６ｃは、ＣＯＬ１Ａ２マーカーに対する発現量を示すグラフである。図６ｃでは、未分化状態である逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）であるとき、発現量が無く、実際供与者の初代培養細胞である線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ－）、及び本発明により逆分化幹細胞から線維芽細胞に分化を誘導した細胞（ｉＰＳＣ－Ｆ）では、マーカーがそれぞれ、５０倍及び３０倍に増幅して、高い遺伝子発現量を示している。
【0038】
図６ｄは、ビメンチンマーカーに対する発現量を示すグラフである。図６ｄでは、未分化状態である逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）であるとき、発現量が殆ど無く（約１）、実際供与者の初代培養細胞である線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ－）、及び本発明により逆分化幹細胞から線維芽細胞に分化を誘導した細胞（ｉＰＳＣ－Ｆ）では、マーカーがそれぞれ、３３倍及び３７倍に増幅して、高い遺伝子発現量を示している。
【0039】
図６ｅは、未分化状態である逆分化幹細胞からのみ出るＳＯＸ２マーカーに対するグラフである。図６ｅに示しているように、未分化状態である逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）であるとき、１．０の発現量を示し、実際供与者の初代培養細胞である線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ－）、及び本発明により逆分化幹細胞から線維芽細胞に分化を誘導した細胞（ｉＰＳＣ－Ｆ）では、発現量が無かった。これらの図６ａ～図６ｅから、逆分化幹細胞から線維芽細胞に分化が確実に行われたことを確認できる。
【0040】
角化細胞の分化
以下、添付の図面を参照して、角化細胞の分化（Ｓ１２０）について詳しく説明する。図７は、本発明で用いられる角化細胞の分化過程を示すフローチャートである。図７に示しているように、まず、分化開始３日前（Ｄ－３）から分化開始１日前（Ｄ－１）の間に、ｍＴｅＳＲＴＭ－１のバッジを準備する。
以下、添付の図面を参照して、角化細胞の分化（Ｓ１２０）について詳しく説明する。図７は、本発明で用いられる角化細胞の分化過程を示すフローチャートである。図７に示しているように、まず、分化開始３日前（Ｄ－３）から分化開始１日前（Ｄ－１）の間に、ｍＴｅＳＲＴＭ－１のバッジを準備する。
【0041】
ＤＭＥＭバッジは、分化開始日（Ｄ０）から日目（Ｄ７）まで、３：１組成のＤＭＥＭ／Ｆ１２バッジであり、また、ｄｋＳＦＭ培養液は、８日目（Ｄ８）から２１日目（Ｄ２１）まで用いられる。
【0042】
また、分化開始日（Ｄ０）から７日目（Ｄ７）まで、２％のＦＢＳ、分化開始日（Ｄ０）から２１日目（Ｄ２１）まで、５μｇ／ｍｌのインシュリン、分化開始日（Ｄ０）から７日目（Ｄ７）まで、２５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、８日目（Ｄ８）から２１日目まで、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、分化開始日（Ｄ０）から７日目（Ｄ７）まで、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、８日目（Ｄ８）から１５日目（Ｄ１５）まで、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１６日目（Ｄ１６）から２１日目（Ｄ２１）まで、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、分化開始日（Ｄ０）から１５日目（Ｄ１５）まで、１μｇ／ｍｌのレチノイン酸、及び１８日目（Ｄ１８）から２１日目（Ｄ２１）まで、１．２ｍｍのＣａＣｌ２がそれぞれ投入される。
【0043】
ここで、ＥＣＭでは、分化開始３日前（Ｄ－３）から２１日目（Ｄ２１）まで、ｈＥＳＣ－ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１００）でコーティングされた皿を用いる。このような過程により、２１日目（Ｄ２１）に、角化細胞の分化が完成する。
【0044】
図８ａは、ＡＴＣＣで常用中のヒト角化細胞の写真であり、図８ｂは、本発明により逆分化幹細胞から分化された角化細胞の写真である。図８ａ及び図８ｂに示しているように、本発明により分化された角化細胞（図８ｂ）は、細胞質が丸い多角形状に分化し、且つ、図８ａに類似した形状を有していることが確認できる。
【0045】
図９は、本発明により分化された角化細胞のＫＲＴ１４マーカーを通じて、タンパク質発現量を示すグラフである。図９に示しているように、１００個の細胞を分化したとき、８６．１７個の細胞で、ＫＲＴ１４マーカーがよく発現していることが確認できる。たとえ、一部未角化細胞が残っているが、全体としては、角化細胞によく分化したことを示す。
【0046】
図１０ａ～図１０ｂは、各細胞の特異マーカー及び核を、様々な光学染色薬で染色した写真であり、図１０ｃは、図１０ａ乃至図１０ｂを合わせた写真である。図１０ａは、ＴＲＩＴＣ光学染色薬で染色したＫＲＴ１４マーカーの写真であり、図１０ｂは、ＤＡＰＩ光学染色薬で核を染色した写真である。図１０ｃの写真から、分化した細胞が角化細胞細胞であることが確認できる。
【0047】
【0048】
図１１ａは、ＫＲＴ１４マーカーに対する発現量を示すグラフであって、未分化状態である逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）であるとき、発現量が無く、実際供与者の初代培養細胞である角化細胞（Ｋｅｒａ－）、及び本発明により逆分化幹細胞から角化細胞に分化を誘導した細胞（ｉＰＳＣ－Ｋ）では、マーカーがそれぞれ、約４、５００倍及び１、５００倍に増幅して、高い遺伝子発現量を示している。
【0049】
図１１ｂは、ＮＰ６３マーカーに対する発現量を示すグラフであって、未分化状態である逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）であるとき、発現量が無く、実際供与者の初代培養細胞である角化細胞（Ｋｅｒａ－）、及び本発明により逆分化幹細胞から角化細胞に分化を誘導した細胞（ｉＰＳＣ－Ｋ）では、マーカーがそれぞれ、約５、５００倍及び１、０００倍に増幅して、高い遺伝子発現量を示している。
【0050】
図１１ｃは、インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）マーカーに対する発現量を示すグラフであって、未分化状態である逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）であるとき、発現量が極めて一部現れ（約１）、実際供与者の初代培養細胞である角化細胞（Ｋｅｒａ－）、及び本発明により逆分化幹細胞から角化細胞に分化を誘導した細胞（ｉＰＳＣ－Ｋ）では、マーカーがそれぞれ、約５０倍及び３０倍に増幅して、高い遺伝子発現量を示している。
【0051】
図１１ｄは、未分化状態である逆分化幹細胞でのみ出るＳＯＸ２マーカーに対するグラフである。図１１ｄに示しているように、未分化状態である逆分化幹細胞（ｉＰＳＣ）であるとき、１．０の発現量を示し、実際供与者の初代培養細胞である角化細胞（Ｋｅｒａ－）、及び本発明により逆分化幹細胞から角化細胞に分化を誘導した細胞（ｉＰＳＣ－Ｋ）では、マーカーの発現量が無かった。これらの図１１ａ乃至図１１ｄから、逆分化幹細から角化細胞に分化が確実に行われたことが確認できる。
【0052】
人工皮膚の製造
以下、添付の図面を参照して、人工皮膚の製造過程を詳しく説明する。３Ｄプリンタで分化された角化細胞と線維芽細胞を、特定のパターンに噴射する（Ｓ１６０）。図１２は、本発明による３Ｄプリンタの概略的な斜視図である。図１２に示しているように、移送ステージ１８１は、Ｚ軸駆動部１８５により、Ｚ軸方向（上下方向）に往復移送可能である。
以下、添付の図面を参照して、人工皮膚の製造過程を詳しく説明する。３Ｄプリンタで分化された角化細胞と線維芽細胞を、特定のパターンに噴射する（Ｓ１６０）。図１２は、本発明による３Ｄプリンタの概略的な斜視図である。図１２に示しているように、移送ステージ１８１は、Ｚ軸駆動部１８５により、Ｚ軸方向（上下方向）に往復移送可能である。
【0053】
Ｘ軸駆動部１８２は、移送ステージ１８１上に設置され、Ｙ軸駆動部１８４と載置テーブル１１０をＸ軸方向に往復移送させる。Ｙ軸駆動部１８４は、Ｘ軸駆動部１８２上に設置され、載置テーブル１１０をＹ軸方向に往復移送させる。このため、Ｘ、Ｙ、Ｚ軸駆動部１８２、１８４、１８５には、サーボモータと駆動回路が内蔵される。
【0054】
平板１２０は、載置テーブル１１０上に固定され、角化細胞液と線維芽細胞液が蒸着される。
【0055】
角化細胞液容器１４０には、本発明により分化された角化細胞が液体と混入しており、線維芽細胞容器１５０には、本発明により分化された線維芽細胞が液体と混入している。
【0056】
第１の移送管１４５は、角化細胞液容器１４０と噴射装置１６０の間に連結され、ポンプ（図示せず）の吸入力により、角化細胞液を噴射装置１６０に移送する。第２の移送管１５５は、線維芽細胞液容器１５０と噴射装置１６０の間に連結され、ポンプ（図示せず）の吸入力により、線維芽細胞液を噴射装置１６０に移送する。
【0057】
噴射装置１６０の下端には、第１、２のノズル１２５が独立して位置し、平板１２０に向けて断続的に液体を噴射する。
【0058】
人工皮膚を具現するために、角化細胞液と線維芽細胞液は選別的に噴射されて、複数の層を形成する。また、３Ｄプリンタ１００は、予めプログラムされた特定のパターン（しわ状、波状、指紋など）で、角化細胞液と線維芽細胞液を噴射することができる。
【0059】
噴射が完了した平板１２０は、共培養されることで、人工皮膚が完成する（Ｓ１８０）。
【0060】
本発明のＸ、Ｙ、Ｚ軸駆動部１８２、１８４、１８５は、Ｘ、Ｙ、Ｚ軸直交ロボットによっても具現される。また、本発明は、人工皮膚の他に、角膜、腫瘍など、各種の人体組織の模写、人工臓器、人工組織などの形成、培養にも使用することができる。
【0061】
前述したように、本発明の好適な実施例に対する詳細な説明は、当業者が本発明を具現し実施できるように提供されている。前記では、本発明の好適な実施例を参照して説明したが、当該技術分野における熟練した当業者は、本発明の領域から逸脱しない範囲内で、本発明を様々に修正及び変更できることを理解するだろう。例えば、当業者は、上述した実施例に記載された各構成を互いに組み合わせる方式に利用することができる。そこで、本発明は、ここに現れた実施形態に制限しようとすることではなく、ここで開示された原理及び新規の特徴と一致する最広の範囲を付与しようとすることである。
【0062】
本発明は、本発明の精神及び必須の特徴を逸脱しない範囲で、他の特定の形態に具体化することができる。そこで、前記の詳細な説明は、全ての面で制限的に解析されてはいけず、例示的なことと考えられるべきである。本発明の範囲は、添付の請求項の合理的解析により決められ、本発明の等価範囲内での全ての変更は、本発明の範囲に含まれる。本発明は、ここに現れた実施形態に制限しようとすることではなく、ここで開示された原理及び新規の特徴と一致する最広の範囲を付与しようとすることである。また、特許請求の範囲で明示的な引用関係がない請求項を組み合わせて、実施例を構成するか、出願後の補正により、新たな請求項として含むことができる。
【産業上利用可能性】
【0063】
本発明は、線維芽細胞と角化細胞を用いた人工皮膚に関し、より詳しくは、逆分化幹細胞から分化された細胞を用いた人工皮膚の製造装置に関する。
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図6e】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【図9】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】