特表 2024-529799 単一の分子分析物を検出及び定量化するための脱保護計数プローブ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-13

(54)【発明の名称】単一の分子分析物を検出及び定量化するための脱保護計数プローブ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/682 20180101AFI20240805BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20240805BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/682 Z

C12Q1/6876 Z ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024503889

(86)(22)【出願日】2022-07-14

(85)【翻訳文提出日】2024-03-21

(86)【国際出願番号】 US2022073707

(87)【国際公開番号】W WO2023004248

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】63/224,984

(32)【優先日】2021-07-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】511000957

【氏名又は名称】ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミシガン

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＣＨＩＧＡＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジョンソン－バック，アレグザンダー・エドマンド

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

分析物（例えば、核酸、タンパク質又は他の生体分子）の高感度、高特異度検出を可能にする、同じ分析物分子へのプローブの反復した結合の内部記録を保有する分子プローブを使用して、特異的及び非特異的結合事象の間をより良く識別するための分子アーキテクチャ及び方法が提供される。同じ分析物分子への（又は分析物分子に結合したプローブへの）プローブの反復した結合は、プローブ結合事象の数及び動態に依存するシグナル（例えば、蛍光又はケミルミネッセンス）の蓄積をもたらし、独立した結合事象の数が増加するにつれて、分析物分子の存在下での信頼増加を生じる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の分析物を検出するための分析物検出システムであって、
複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、シグナル領域を含み、シグナル領域が、複数のサプレッサー結合領域を含む、複数の第１のプローブ、
複数のサプレッサーであって、サプレッサーが、第１のプローブのサプレッサー結合領域と会合するように、各サプレッサーが、第１のプローブのサプレッサー結合領域に結合することができる第１のプローブ結合領域を含む、複数のサプレッサー、
複数の分析物結合パートナーであって、各分析物結合パートナーが、分析物に対する親和性を有する第１の分析物結合領域を含み、分析物結合パートナーのそれぞれが、第１のプローブのうち少なくとも１個と直接的に又は間接的に会合している、複数の分析物結合パートナー、
複数の第２のプローブであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、サプレッサーのうち１個以上に結合することができ、
分析物が、分析物結合パートナーの第１の分析物結合領域に結合している間に、第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に結合することができ、
分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、
分析物が、分析物結合パートナーのうち１個に結合している間に、第２のプローブのうち１個が、分析物に結合する場合、第２のプローブに結合されたそのような１個以上のサプレッサーが、分析物からの第２のプローブの脱会合後に第１のプローブから除去されることになるように、そのような第２のプローブはまた、サプレッサーのうち１個以上に結合する、複数の第２のプローブ、並びに
複数の標識プローブであって、各標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に対する親和性を有し、１個以上のサプレッサーの除去後に、１個以上の標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に結合することができ、これにより、分析物の検出を可能にする、複数の標識プローブ
を含むシステム。

【請求項2】

分析物結合パートナーの少なくとも一部分が、固体支持体に固定化された第１のプローブのうち少なくとも１個のおよそ１００ナノメートル以内で固体支持体において固定化されるように、分析物結合パートナーが、固体支持体への固定化によって第１のプローブと間接的に会合している、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

分析物結合パートナーのそれぞれが、固体支持体に固定化された第１のプローブのうち少なくとも１個のおよそ２０ナノメートル以内で固体支持体において固定化されている、請求項２に記載のシステム。

【請求項4】

各分析物結合パートナーが、第１のプローブのうち１個に物理的に連結されるように、分析物結合パートナーのそれぞれが、第１のプローブのうち１個と直接的に会合している、請求項１に記載のシステム。

【請求項5】

第１の分析物結合領域と分析物との間の親和性が、第２の分析物結合領域と分析物との間よりも少なくとも１０倍遅い解離の速度定数を含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項6】

シグナル領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドを含み、サプレッサー結合領域がそれぞれ、共通配列を含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項7】

共通配列が、約１０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドである、請求項６に記載のシステム。

【請求項8】

第１のプローブ相補配列が、共通配列と同じ長さである、請求項７に記載のシステム。

【請求項9】

サプレッサーがそれぞれ、第１のプローブ相補配列及び足場配列を含むサプレッサーオリゴヌクレオチドを含み、第１のプローブ相補配列が、第１のプローブオリゴヌクレオチドの共通配列に相補的であり、足場配列が、第１のプローブ相補配列から３’又は５’に位置し、サプレッサーオリゴヌクレオチドが、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるときに、足場配列が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしないように、足場配列が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにおける共通配列の３’又は５’にある配列に相補的ではない、請求項６に記載のシステム。

【請求項10】

各第２のプローブのサプレッサー相互作用領域が、サプレッサーオリゴヌクレオチドの第１のプローブ相補配列及び足場配列に相補的であるサプレッサー相補配列を含む第２のプローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項９に記載のシステム。

【請求項11】

足場領域が、約１ヌクレオチド～約６ヌクレオチドである、請求項９に記載のシステム。

【請求項12】

標識プローブが、オリゴヌクレオチドに連結されたシグナル伝達構成成分を含み、オリゴヌクレオチドが、第１のプローブ相補配列又はその部分配列を含む、請求項９に記載のシステム。

【請求項13】

シグナル伝達構成成分が、フルオロフォア、蛍光発生化合物、蛍光タンパク質、小分子有機フルオロフォア又はケミルミネッセンス生成酵素からなる群から選択される、請求項１２に記載のシステム。

【請求項14】

シグナル伝達構成成分が、小分子有機フルオロフォアであり、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７からなる群から選択される、請求項１３に記載のシステム。

【請求項15】

分析物結合パートナー及び第１のプローブのそれぞれが、１個以上のマイクロ粒子に結合され、第１のプローブのうち少なくとも１個が、各マイクロ粒子における分析物結合パートナーのうち少なくとも１個からおよそ１００ｎｍ以内にある、請求項１に記載のシステム。

【請求項16】

マイクロ粒子が、約１ミクロン～約１０ミクロンの直径を有する、請求項１５に記載のシステム。

【請求項17】

マイクロ粒子が、ビーズである、請求項１５に記載のシステム。

【請求項18】

分析物結合パートナー及び第１のプローブのそれぞれが、１個以上のナノ粒子に結合され、第１のプローブのうち少なくとも１個が、各ナノ粒子における分析物結合パートナーのうち少なくとも１個からおよそ１００ｎｍ以内にある、請求項１に記載のシステム。

【請求項19】

ナノ粒子が、金ナノ粒子である、請求項１８に記載のシステム。

【請求項20】

ナノ粒子が、液体試料における溶解又は懸濁された状態にとどまるのに十分な直径のものである、請求項１８に記載のシステム。

【請求項21】

固体支持体に固定化された多価捕捉用オリゴヌクレオチドプローブをさらに含むシステムであって、標識プローブが、オリゴヌクレオチドに連結されたシグナル伝達構成成分を含み、オリゴヌクレオチドが、第１のプローブ相補配列又はその部分配列及び多価捕捉用プローブ配列を含み、多価捕捉用オリゴヌクレオチドプローブが、標識プローブにおける多価捕捉用プローブ配列に相補的である１個以上の配列を含む、請求項２０に記載のシステム。

【請求項22】

固体支持体に固定化された多価捕捉用オリゴヌクレオチドプローブをさらに含むシステムであって、標識プローブが、オリゴヌクレオチドに連結されたシグナル伝達構成成分を含み、オリゴヌクレオチドが、第１のプローブ相補配列又はその部分配列及び多価捕捉用プローブ配列を含み、多価捕捉用オリゴヌクレオチドプローブが、標識プローブにおける多価捕捉用プローブ配列に相補的である１個以上の配列を含む、請求項４に記載のシステム。

【請求項23】

分析物が、核酸であり、第１の分析物結合領域が、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドを含み、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の第１の配列に相補的である配列を保有し、第２の分析物結合領域が、検出用オリゴヌクレオチドを含み、検出用オリゴヌクレオチドが、分析物の第２の配列に相補的である配列を保有する、請求項１に記載のシステム。

【請求項24】

分析物が、核酸であり、第１のプローブ及び分析物結合パートナーが、第１のプローブオリゴヌクレオチドのドメインであり、第１の分析物結合領域が、分析物の第１の配列に相補的である第１のプローブオリゴヌクレオチドの配列を含み、第１のプローブのサプレッサー結合領域がそれぞれ、第１のプローブオリゴヌクレオチド内の共通配列を含み、
サプレッサーがそれぞれ、第１のプローブ相補配列及び足場配列を含むサプレッサーオリゴヌクレオチドを含み、第１のプローブ相補配列が、第１のプローブオリゴヌクレオチドの共通配列に相補的であり、足場配列が、第１のプローブ相補配列から３’又は５’に位置し、サプレッサーオリゴヌクレオチドが、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるときに、足場配列が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしないように、足場配列が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにおける共通配列の３’又は５’にある配列に相補的ではなく、
第２のプローブが、第２のプローブオリゴヌクレオチドを含み、第２の分析物結合領域が、分析物の第２の配列に相補的である第２のプローブオリゴヌクレオチドにおける配列を含み、各第２のプローブのサプレッサー相互作用領域が、サプレッサーオリゴヌクレオチドの第１のプローブ相補配列及び足場配列又はそれぞれの部分の両方に相補的である第２のプローブオリゴヌクレオチド内のサプレッサー相補配列を含み、
標識プローブのそれぞれが、標識オリゴヌクレオチドに連結されたシグナル伝達構成成分を含み、標識オリゴヌクレオチドが、第１のプローブ相補配列又はその部分配列を含み、
システムが、表面に結合された捕捉用オリゴヌクレオチドをさらに含み、捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の第３の配列に相補的である配列を含み、第２のプローブが、第１のプローブからサプレッサーを除去しており、標識プローブが、第１のプローブに結合していて、第１のプローブ－標識プローブ－分析物複合体を形成する場合、第１のプローブ－標識プローブ－分析物複合体は、捕捉用オリゴヌクレオチドを介して表面に結合されることになる、請求項４に記載のシステム。

【請求項25】

第３の配列が、第２の配列と同じである、又は第２の配列の部分と重複する、請求項２４に記載のシステム。

【請求項26】

多重の第１のプローブオリゴヌクレオチドが、分析物にハイブリダイズすることができるように、分析物が、多重の第１の配列を保有する、請求項２４に記載のシステム。

【請求項27】

第１の配列のそれぞれが異なる、請求項２６に記載のシステム。

【請求項28】

競合用オリゴヌクレオチドをさらに含むシステムであって、試料が、分析物とは単一のヌクレオチドのみが異なる非標的分析物を含み、非標的分析物における単一のヌクレオチド差が、分析物の第２の配列に対応する領域にあり、競合用オリゴヌクレオチドが、分析物とよりも効率的に非標的分析物とハイブリダイズするように、競合用オリゴヌクレオチドが、分析物の第２の配列に対応する領域にある非標的分析物における配列に相補的である配列を含む、請求項２４に記載のシステム。

【請求項29】

分析物が、約１フェムトモル濃度～約１０００フェムトモル濃度の濃度で試料中に存在し、非標的分析物が、同じ又はより高い濃度で存在し、分析物が、非標的分析物よりも優先的に検出される、請求項２８に記載のシステム。

【請求項30】

分析物が、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含み、分析物結合パートナーが、分析物の第１の抗体若しくはその断片、第１のアプタマー又は第１のリガンドである、請求項２に記載のシステム。

【請求項31】

第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有する第２の結合パートナーを含み、サプレッサー相互作用領域が、第２の結合パートナーに連結され、第２の結合パートナーが、分析物の第２の抗体若しくはその断片、第２のアプタマー又は第２のリガンドである、請求項３０に記載のシステム。

【請求項32】

分析物結合パートナーが、第１の抗体であり、固体支持体が、ナノ粒子又はマイクロ粒子である、請求項３０に記載のシステム。

【請求項33】

ナノ粒子又はマイクロ粒子が、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンでコーティングされており、第１の抗体が、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、第１の抗体が、ビオチン化されており、第１のプローブが、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、第１のプローブが、ビオチン化されている、請求項３２に記載のシステム。

【請求項34】

第２のプローブの数が、サプレッサーの数を超える、請求項１～３４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項35】

第２のプローブの数が、第１のプローブの数を超える、請求項１～３４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項36】

標識プローブの数が、第２のプローブの数を超える、請求項１～３４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項37】

試料中の分析物を検出するためのキットであって、
複数の第１のプローブを含む第１の構成成分であって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、第１の分析物結合領域及びシグナル領域が、共通分子の一部として直接的に会合している、又は２個の別個の分子として間接的に会合している、第１の構成成分、
複数の標識プローブを含む第２の構成成分であって、各標識プローブが、シグナル領域と会合することができる、第２の構成成分、
複数のサプレッサーを含む第３の構成成分であって、各サプレッサーが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止する、又はサプレッサーが、標識プローブとシグナル領域との会合を防止する、第３の構成成分、並びに
複数の第２のプローブを含む第４の構成成分であって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有する、第４の構成成分
を含むキット。

【請求項38】

第１の分析物結合領域と分析物との間の親和性が、第２の分析物結合領域と分析物との間よりも少なくとも１０倍遅い解離の速度定数を含む、請求項３７に記載のキット。

【請求項39】

シグナル領域が、共通配列をそれぞれ含む複数の第１のプローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項３７～３８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項40】

共通配列が、約１０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドである、請求項３９に記載のキット。

【請求項41】

サプレッサーがそれぞれ、第１のプローブ相補領域及び足場領域を含むサプレッサーオリゴヌクレオチドを含み、第１のプローブ相補領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドの共通配列に相補的である配列を含み、足場領域が、第１のプローブ相補領域からすぐ３’又は５’に位置し、サプレッサーオリゴヌクレオチドが、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるときに、足場領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしないように、足場領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにおける共通配列のすぐ３’又は５’にある配列に相補的ではない配列を含む、請求項３８～３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項42】

第１のプローブ相補領域が、共通配列と同じ長さである、請求項４１に記載のキット。

【請求項43】

各第２のプローブのサプレッサー相互作用領域が、サプレッサーオリゴヌクレオチドの第１のプローブ相補領域及び足場領域の両方に相補的である配列を含むサプレッサー相補領域を含む第２のプローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項４１～４２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項44】

足場領域が、約１ヌクレオチド～約６ヌクレオチドである、請求項４１～４３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項45】

標識プローブが、シグナル伝達構成成分と、サプレッサーの第１のプローブ相補領域と同一の配列又はそのような配列の部分を含むオリゴヌクレオチド構成成分とを含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項46】

シグナル伝達構成成分が、フルオロフォア、蛍光発生化合物、蛍光タンパク質又はケミルミネッセンス生成酵素からなる群から選択される、請求項４５に記載のキット。

【請求項47】

シグナル伝達構成成分が、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７からなる群から選択される小分子有機フルオロフォアである、請求項４５に記載のキット。

【請求項48】

分析物が、核酸であり、第１の分析物結合領域が、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドを含み、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の第１の配列に相補的である配列を保有し、第２の分析物結合領域が、検出用オリゴヌクレオチドを含み、検出用オリゴヌクレオチドが、分析物の第２の配列に相補的である配列を保有する、請求項３７～４７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項49】

分析物が、核酸であり、第１の分析物結合領域が、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドを含み、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の配列に相補的である配列を保有する、請求項３７～４７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項50】

第２の分析物結合領域が、検出用オリゴヌクレオチドを含み、検出用オリゴヌクレオチドが、分析物の配列に相補的である配列を保有する、請求項３７～４７に記載のキット。

【請求項51】

各第１のプローブの第１の分析物結合領域が、分析物の第１の抗体若しくはその断片、第１のアプタマー又は第１のリガンドを含む、請求項３７～４７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項52】

第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物の第２の抗体若しくはその断片、第２のアプタマー又は第２のリガンドを含む、請求項３７～４７及び５１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項53】

第１の分析物結合領域及びシグナル領域が、２個の別個の分子であり、第１の分析物結合領域が、固体支持体に結合されている、請求項３７～５２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項54】

第１の構成成分が、第１の分析物結合領域とは別個の追加の分析物結合領域を含む、請求項５３に記載のキット。

【請求項55】

シグナル領域が、第１の分析物結合領域の１００ナノメートル以内の部位において固体支持体に結合されている、請求項５３に記載のキット。

【請求項56】

固体支持体が、ナノ粒子又はマイクロ粒子である、請求項５３～５５のいずれか一項に記載のキット。

【請求項57】

シグナル領域が、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、ナノ粒子又はマイクロ粒子が、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンでコーティングされており、第１の分析物結合領域が、ビオチン化されている、請求項５６に記載のキット。

【請求項58】

第１の構成成分及び第３の構成成分が、第１の反応混合物において提供される、請求項３７～５７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項59】

第２の構成成分及び第４の構成成分がそれぞれ、別々の反応混合物において提供され、第１の反応混合物の一部ではない、請求項５８に記載のキット。

【請求項60】

第２の構成成分及び第４の構成成分が、第１の反応混合物とは別々のものである第２の反応混合物において提供される、請求項５８に記載のキット。

【請求項61】

第１の構成成分、第２の構成成分及び第３の構成成分が、第１の反応混合物において提供される、請求項３７～５７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項62】

請求項３７～５７に記載のキットのうちいずれか１種を使用して試料中の分析物を検出する方法であって、
（ａ）試料の部分を第１の構成成分及び第３の構成成分と混合して、第１の反応混合物を形成するステップであって、第３の構成成分のサプレッサーが、第１の構成成分の複数の第１のプローブのシグナル領域に結合される、ステップ、
（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を第４の構成成分と混合して、第２の反応混合物を得るステップ、
（ｄ）第２のプローブが分析物に結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解するのに十分な条件下で、第２の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）の後の第２の反応混合物を第２の構成成分と混合して、第３の反応混合物を得るステップ、
（ｆ）標識プローブが、ステップ（ｄ）において１個以上のサプレッサーが除去又は分解された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件下で、第３の反応混合物をインキュベートするステップ、並びに
（ｇ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップ
を含む方法。

【請求項63】

第４の構成成分における第２のプローブの数が、第１の構成成分における第１のプローブの数を超える、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

請求項５８又は５９に記載のキットを使用して試料中の分析物を検出する方法であって、
（ａ）試料の部分を第１の反応混合物と混合するステップであって、第３の構成成分のサプレッサーが、第１の構成成分の複数の第１のプローブのシグナル領域に結合される、ステップ、
（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を第４の構成成分と混合して、第２の反応混合物を得るステップ、
（ｄ）第２のプローブが分析物に結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解するのに十分な条件下で、第２の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）の後の第２の反応混合物を第２の構成成分と混合して、第３の反応混合物を得るステップ、
（ｆ）標識プローブが、ステップ（ｄ）において１個以上のサプレッサーが除去又は分解された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件下で、第３の反応混合物をインキュベートするステップ、及び
（ｇ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップ
を含む方法。

【請求項65】

第４の構成成分における第２のプローブの数が、第１の構成成分における第１のプローブの数を超える、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

請求項６０に記載のキットを使用して試料中の分析物を検出する方法であって、
（ａ）試料の部分を第１の反応混合物と混合するステップであって、第３の構成成分のサプレッサーが、第１の構成成分の複数の第１のプローブのシグナル領域に結合される、ステップ、
（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を第２の反応混合物と混合して、第３の反応混合物を得るステップ、
（ｄ）第２のプローブが、分析物に結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解し、標識プローブが、１個以上のサプレッサーが除去された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件下で、第３の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｅ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップ
を含む方法。

【請求項67】

第４の構成成分における第２のプローブの数が、第１の構成成分における第１のプローブの数を超える、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

請求項６１に記載のキットを使用して試料中の分析物を検出する方法であって、
（ａ）試料の部分を第１の反応混合物と混合するステップであって、第３の構成成分のサプレッサーが、第１の構成成分の複数の第１のプローブのシグナル領域に結合される、ステップ、
（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を第４の構成成分と混合して、第２の反応混合物を得るステップ、
（ｄ）第２のプローブが、分析物に結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解するのに十分な条件下で、第２の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｅ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップ
を含む方法。

【請求項69】

標識プローブが、第１の反応混合物におけるシグナル領域と会合している、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

標識プローブが、第１の反応混合物のシグナル領域と会合しておらず、ステップ（ｄ）が、標識プローブが１個以上のサプレッサーが除去された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件を含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項71】

第４の構成成分における第２のプローブの数が、第１の構成成分における第１のプローブの数を超える、請求項６８～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、分析物結合領域及びシグナル領域を含み、分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、シグナル領域が、複数のサプレッサー及び複数の標識プローブと会合しており、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止する、複数の第１のプローブ、
複数の第２のプローブであって、各第２のプローブが、第１のプローブ結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、分析物が、第１のプローブの分析物結合領域に結合している間に、第１のプローブ結合領域が、第１のプローブに結合することができ、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、
分析物への分析物結合領域の相互作用が、第１のプローブ結合領域と第１のプローブとの間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、
第２のプローブのうち１個が、第１のプローブに結合する場合、サプレッサーのうち１個以上が、第１のプローブから除去され得る又は分解され得、
十分な数のサプレッサーの除去又は分解後に、複数の標識プローブから生じるシグナルが、分析物の非存在下で第１のプローブから生じるシグナルから識別可能となる、複数の第２のプローブ
を含む分析物検出システム。

【請求項73】

複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、分析物結合領域及びシグナル領域を含み、分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、シグナル領域が、複数のサプレッサーと会合している、複数の第１のプローブ、
複数の第２のプローブであって、各第２のプローブが、第１のプローブ結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、分析物が、第１のプローブの分析物結合領域に結合している間に、第１のプローブ結合領域が、第１のプローブに結合することができ、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、
分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第１のプローブ結合領域と第１のプローブとの間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、
第２のプローブのうち１個が、分析物に結合している間の第１のプローブのうち１個に結合する場合、サプレッサーのうち１個以上が、第１のプローブから除去され得る又は分解され得る、複数の第２のプローブ、並びに
複数の標識プローブであって、各標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に対する親和性を有し、１個以上のサプレッサーの除去又は分解後に、１個以上の標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に結合することができる、複数の標識プローブ
を含む分析物検出システム。

【請求項74】

第１の分析物結合領域と分析物との間の親和性が、第１のプローブ結合領域と第１のプローブとの間よりも少なくとも１０倍遅い解離の速度定数を含む、請求項７２又は７３に記載のシステム。

【請求項75】

シグナル領域が、共通配列をそれぞれ含む複数の第１のプローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項７２～７４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項76】

共通配列が、約１０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドである、請求項７５に記載のシステム。

【請求項77】

サプレッサーがそれぞれ、第１のプローブ相補領域及び足場領域を含むサプレッサーオリゴヌクレオチドを含み、第１のプローブ相補領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドの共通配列に相補的である配列を含み、足場領域が、第１のプローブ相補領域からすぐ３’又は５’に位置し、サプレッサーオリゴヌクレオチドが、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるときに、足場領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしないように、足場領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにおける共通配列のすぐ３’又は５’にある配列に相補的ではない配列を含む、請求項７５又は７６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項78】

第１のプローブ相補領域が、共通配列と同じ長さである、請求項７７に記載のシステム。

【請求項79】

各第２のプローブのサプレッサー相互作用領域が、サプレッサーオリゴヌクレオチドの第１のプローブ相補領域及び足場領域に相補的である配列を含むサプレッサー相補領域を含む第２のプローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項７７又は７８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項80】

足場領域が、約１ヌクレオチド～約６ヌクレオチドである、請求項７７～７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項81】

標識プローブが、シグナル伝達構成成分と、サプレッサーの第１のプローブ相補領域と同一の配列又はそのような配列の部分を含むオリゴヌクレオチド構成成分とを含む、請求項７７～８０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項82】

シグナル伝達構成成分が、フルオロフォア、蛍光発生化合物、蛍光タンパク質又はケミルミネッセンス生成酵素からなる群から選択される、請求項８１に記載のシステム。

【請求項83】

シグナル伝達構成成分が、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４からなる群から選択される小分子有機フルオロフォアである、請求項８１に記載のシステム。

【請求項84】

複数の第１のプローブが、固体支持体に結合されている、請求項７２～８３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項85】

第１のプローブの第１の分析物結合領域及びシグナル領域が、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン又は別のタンパク質の分子における隣接部位に結合されている、請求項７２～８３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項86】

第１のプローブの第１の分析物結合領域及びシグナル領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子における隣接部位に結合されている、請求項７２～８３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項87】

ナノ粒子が、金ナノ粒子である、請求項８６に記載のシステム。

【請求項88】

分析物が、核酸であり、第１の分析物結合領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子に結合された第１の捕捉用オリゴヌクレオチドを含み、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の第１の配列に相補的である配列を保有する、請求項７２～８３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項89】

第１のプローブの第１の分析物結合領域及びシグナル領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子における隣接部位に結合され、捕捉用オリゴヌクレオチドが、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、ナノ粒子又はマイクロ粒子が、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンでコーティングされており、捕捉用オリゴヌクレオチドが、ビオチン化されている、請求項７２～８３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項90】

第１のプローブのシグナル領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されている、請求項７２～８３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項91】

シグナル領域が、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、第１のプローブのシグナル領域が、ビオチン化されている、請求項９０に記載のシステム。

【請求項92】

分析物が、核酸であり、第１の分析物結合領域が、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドを含み、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の配列に相補的である配列を保有する、請求項７２～８３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項93】

第２のプローブの数が、第１のプローブの数を超える、請求項７２～９２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項94】

第２のプローブの数が、分析物と会合した第１のプローブの数よりも大きい、請求項７２～９２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項95】

分析物が、結合パートナーに連結された核酸であり、結合パートナーが、第１の分析物結合領域に対する親和性を有する、請求項７２～８３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項96】

結合パートナーが、ビオチンであり、第１の分析物結合領域が、ストレプトアビジンを含む、請求項９５に記載のシステム。

【請求項97】

第１の分析物結合領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子の表面にある、請求項９６に記載のシステム。

【請求項98】

シグナル領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子における隣接部位に結合されている、請求項９７に記載のシステム。

【請求項99】

分析物が、分析物結合領域に結合していない場合、第１のプローブ結合領域が、第１のプローブに結合することができない、請求項７２～９８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項100】

分析物結合領域への分析物の結合が、第１のプローブに対し第２のプローブの第１のプローブ結合領域のための結合部位を露出又は創出する、請求項７２～９９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項101】

第１のプローブが、アプタマーを含む、請求項７２～１００のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項102】

分析物結合領域が、アプタマーを含む、請求項１０１に記載のシステム。

【請求項103】

試料中の分析物を検出するためのキットであって、
複数の第１のプローブを含む第１の構成成分であって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有する、第１の構成成分、
複数の標識プローブを含む第２の構成成分であって、各標識プローブが、シグナル領域と会合することができる、第２の構成成分、
複数のサプレッサーを含む第３の構成成分であって、各サプレッサーが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止する、又はサプレッサーが、標識プローブとシグナル領域との会合を防止する、第３の構成成分、並びに
複数の第２のプローブを含む第４の構成成分であって、各第２のプローブが、第１のプローブ結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、分析物が、第１のプローブの分析物結合領域に結合している間に、第１のプローブ結合領域が、第１のプローブに結合することができ、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第１のプローブ結合領域と第１のプローブとの間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有する、第４の構成成分
を含むキット。

【請求項104】

第１の分析物結合領域と分析物との間の親和性が、第１のプローブ結合領域と第１のプローブとの間よりも少なくとも１０倍遅い解離の速度定数を含む、請求項１０３に記載のキット。

【請求項105】

シグナル領域が、共通配列をそれぞれ含む複数の第１のプローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０３～１０４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項106】

共通配列が、約１０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドである、請求項１０５に記載のキット。

【請求項107】

サプレッサーがそれぞれ、第１のプローブ相補領域及び足場領域を含むサプレッサーオリゴヌクレオチドを含み、第１のプローブ相補領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドの共通配列に相補的である配列を含み、足場領域が、第１のプローブ相補領域からすぐ３’又は５’に位置し、サプレッサーオリゴヌクレオチドが、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるときに、足場領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしないように、足場領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにおける共通配列のすぐ３’又は５’にある配列に相補的ではない配列を含む、請求項１０４～１０５のいずれか一項に記載のキット。

【請求項108】

第１のプローブ相補領域が、共通配列と同じ長さである、請求項１０７に記載のキット。

【請求項109】

各第２のプローブのサプレッサー相互作用領域が、サプレッサーオリゴヌクレオチドの第１のプローブ相補領域及び足場領域の両方に相補的である配列を含むサプレッサー相補領域を含む第２のプローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０７～１０８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項110】

足場領域が、約１ヌクレオチド～約６ヌクレオチドである、請求項１０７～１０９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項111】

標識プローブが、シグナル伝達構成成分と、サプレッサーの第１のプローブ相補領域と同一の配列又はそのような配列の部分を含むオリゴヌクレオチド構成成分とを含む、請求項１０７～１１０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項112】

シグナル伝達構成成分が、フルオロフォア、蛍光発生化合物、蛍光タンパク質又はケミルミネッセンス生成酵素からなる群から選択される、請求項１１１に記載のキット。

【請求項113】

シグナル伝達構成成分が、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７からなる群から選択される小分子有機フルオロフォアである、請求項１１１に記載のキット。

【請求項114】

分析物が、核酸であり、第１の分析物結合領域が、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドを含み、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の第１の配列に相補的である配列を保有する、請求項１０３～１１３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項115】

第１の構成成分が、固体支持体をさらに含み、第１の分析物結合領域が、固体支持体の表面に結合されている、請求項１０３～１１４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項116】

シグナル領域が、第１の分析物結合領域に隣接する部位において固体支持体に結合されている、請求項１１５に記載のキット。

【請求項117】

固体支持体が、ナノ粒子又はマイクロ粒子である、請求項１１５又は１１６に記載のキット。

【請求項118】

第１の分析物結合領域が、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、ナノ粒子又はマイクロ粒子が、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンでコーティングされており、第１の分析物結合領域が、ビオチン化されている、請求項１１７に記載のキット。

【請求項119】

シグナル領域が、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、ナノ粒子又はマイクロ粒子が、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンでコーティングされており、第１のプローブのシグナル領域が、ビオチン化されている、請求項１１７～１１８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項120】

分析物が、分析物結合領域に結合していない場合、第１のプローブ結合領域が、第１のプローブに結合することができない、請求項１０３～１１９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項121】

分析物結合領域への分析物の結合が、第１のプローブに対し第２のプローブの第１のプローブ結合領域のための結合部位を露出又は創出する、請求項１０３～１２０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項122】

第１のプローブが、アプタマーを含む、請求項１０３～１２１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項123】

分析物結合領域が、アプタマーを含む、請求項１２２に記載のキット。

【請求項124】

第１の構成成分及び第３の構成成分が、第１の反応混合物において提供される、請求項１０３～１２３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項125】

第２の構成成分及び第４の構成成分がそれぞれ、別々の反応混合物において提供され、第１の反応混合物の一部ではない、請求項１２４に記載のキット。

【請求項126】

第２の構成成分及び第４の構成成分が、第１の反応混合物とは別々のものである第２の反応混合物において提供される、請求項１２４に記載のキット。

【請求項127】

第１の構成成分、第２の構成成分及び第３の構成成分が、第１の反応混合物において提供される、請求項１０３～１２３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項128】

請求項１０３～１２３に記載のキットのうちいずれか１種を使用して試料中の分析物を検出する方法であって、
（ａ）試料の部分を第１の構成成分及び第３の構成成分と混合して、第１の反応混合物を形成するステップであって、第３の構成成分のサプレッサーが、第１の構成成分の複数の第１のプローブのシグナル領域に結合される、ステップ、
（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を第４の構成成分と混合して、第２の反応混合物を得るステップ、
（ｄ）第２のプローブが、分析物に結合した第１のプローブに結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解するのに十分な条件下で、第２の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）の後の第２の反応混合物を第２の構成成分と混合して、第３の反応混合物を得るステップ、
（ｆ）標識プローブが、ステップ（ｄ）において１個以上のサプレッサーが除去又は分解された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件下で、第３の反応混合物をインキュベートするステップ、並びに
（ｇ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップ
を含む方法。

【請求項129】

第４の構成成分における第２のプローブの数が、第１の構成成分における第１のプローブの数を超える、請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

請求項１２４又は１２５に記載のキットを使用して試料中の分析物を検出する方法であって、
（ａ）試料の部分を第１の反応混合物と混合するステップであって、第３の構成成分のサプレッサーが、第１の構成成分の複数の第１のプローブのシグナル領域に結合される、ステップ、
（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を第４の構成成分と混合して、第２の反応混合物を得るステップ、
（ｄ）第２のプローブが、分析物に結合した第１のプローブに結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解するのに十分な条件下で、第２の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）の後の第２の反応混合物を第２の構成成分と混合して、第３の反応混合物を得るステップ、
（ｆ）標識プローブが、ステップ（ｄ）において１個以上のサプレッサーが除去又は分解された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件下で、第３の反応混合物をインキュベートするステップ、及び
（ｇ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップ
を含む方法。

【請求項131】

第４の構成成分における第２のプローブの数が、第１の構成成分における第１のプローブの数を超える、請求項１３０に記載の方法。

【請求項132】

請求項１２６に記載のキットを使用して試料中の分析物を検出する方法であって、
（ａ）試料の部分を第１の反応混合物と混合するステップであって、第３の構成成分のサプレッサーが、第１の構成成分の複数の第１のプローブのシグナル領域に結合される、ステップ、
（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を第２の反応混合物と混合して、第３の反応混合物を得るステップ、
（ｄ）第２のプローブが、分析物に結合した第１のプローブに結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解し、標識プローブが、１個以上のサプレッサーが除去された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件下で、第３の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｅ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップ
を含む方法。

【請求項133】

第４の構成成分における第２のプローブの数が、第１の構成成分における第１のプローブの数を超える、請求項１３２に記載の方法。

【請求項134】

請求項１２７に記載のキットを使用して試料中の分析物を検出する方法であって、
（ａ）試料の部分を第１の反応混合物と混合するステップであって、第３の構成成分のサプレッサーが、第１の構成成分の複数の第１のプローブのシグナル領域に結合される、ステップ、
（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を第４の構成成分と混合して、第２の反応混合物を得るステップ、
（ｄ）第２のプローブが、分析物に結合した第１のプローブに結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解するのに十分な条件下で、第２の反応混合物をインキュベートするステップ、
（ｅ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップ
を含む方法。

【請求項135】

標識プローブが、第１の反応混合物におけるシグナル領域と会合している、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

標識プローブが、第１の反応混合物のシグナル領域と会合しておらず、ステップ（ｄ）が、標識プローブが１個以上のサプレッサーが除去された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件を含む、請求項１３４に記載の方法。

【請求項137】

第４の構成成分における第２のプローブの数が、第１の構成成分における第１のプローブの数を超える、請求項１３４～１３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項138】

分析物が、分析物結合領域に結合していない場合、第１のプローブ結合領域が、第１のプローブに結合することができない、請求項１２８～１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項139】

分析物結合領域への分析物の結合が、第１のプローブに対し第２のプローブの第１のプローブ結合領域のための結合部位を露出又は創出する、請求項１２８～１３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

第１のプローブが、アプタマーを含む、請求項１２８～１３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項141】

分析物結合領域が、アプタマーを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項142】

試料中の分析物を検出するための組成物であって、
複数の第１のプローブを含む第１の構成成分であって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有する、第１の構成成分、
複数の標識プローブを含む第２の構成成分であって、各標識プローブが、シグナル領域と会合することができる、第２の構成成分、
複数のサプレッサーを含む第３の構成成分であって、各サプレッサーが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止する、又はサプレッサーが、標識プローブとシグナル領域との会合を防止する、第３の構成成分、並びに
複数の第２のプローブを含む第４の構成成分であって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有する、第４の構成成分
を含む組成物。

【請求項143】

第１の分析物結合領域と分析物との間の親和性が、第２の分析物結合領域と分析物との間よりも少なくとも１０倍遅い解離の速度定数を含む、請求項１４２に記載の組成物。

【請求項144】

シグナル領域が、共通配列をそれぞれ含む複数の第１のプローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４２～１４３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項145】

共通配列が、約１０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドである、請求項１４４に記載の組成物。

【請求項146】

サプレッサーがそれぞれ、第１のプローブ相補領域及び足場領域を含むサプレッサーオリゴヌクレオチドを含み、第１のプローブ相補領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドの共通配列に相補的である配列を含み、足場領域が、第１のプローブ相補領域からすぐ３’又は５’に位置し、サプレッサーオリゴヌクレオチドが、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるときに、足場領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしないように、足場領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにおける共通配列のすぐ３’又は５’にある配列に相補的ではない配列を含む、請求項１４３～１４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項147】

第１のプローブ相補領域が、共通配列と同じ長さである、請求項１４６に記載の組成物。

【請求項148】

各第２のプローブのサプレッサー相互作用領域が、サプレッサーオリゴヌクレオチドの第１のプローブ相補領域及び足場領域の両方に相補的である配列を含むサプレッサー相補領域を含む第２のプローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４６～１４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項149】

足場領域が、約１ヌクレオチド～約６ヌクレオチドである、請求項１４６～１４８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項150】

標識プローブが、シグナル伝達構成成分と、サプレッサーの第１のプローブ相補領域と同一の配列又はそのような配列の部分を含むオリゴヌクレオチド構成成分とを含む、請求項１４６～１４９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項151】

シグナル伝達構成成分が、フルオロフォア、蛍光発生化合物、蛍光タンパク質又はケミルミネッセンス生成酵素からなる群から選択される、請求項１５０に記載の組成物。

【請求項152】

シグナル伝達構成成分が、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７からなる群から選択される小分子有機フルオロフォアである、請求項１５０に記載の組成物。

【請求項153】

分析物が、核酸であり、第１の分析物結合領域が、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドを含み、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の第１の配列に相補的である配列を保有し、第２の分析物結合領域が、検出用オリゴヌクレオチドを含み、検出用オリゴヌクレオチドが、分析物の第２の配列に相補的である配列を保有する、請求項１４２～１５２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項154】

分析物が、核酸であり、第１の分析物結合領域が、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドを含み、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の配列に相補的である配列を保有する、請求項１４２～１５２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項155】

第２の分析物結合領域が、検出用オリゴヌクレオチドを含み、検出用オリゴヌクレオチドが、分析物の配列に相補的である配列を保有する、請求項１４２～１５２に記載の組成物。

【請求項156】

各第１のプローブの第１の分析物結合領域が、分析物の第１の抗体若しくはその断片、第１のアプタマー又は第１のリガンドを含む、請求項１４２～１５２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項157】

第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物の第２の抗体若しくはその断片、第２のアプタマー又は第２のリガンドを含む、請求項１４２～１５２及び１５６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項158】

第１の構成成分が、固体支持体をさらに含み、第１の分析物結合領域が、固体支持体の表面に結合されている、請求項１４２～１５７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項159】

シグナル領域が、第１の分析物結合領域に隣接する部位において固体支持体に結合されている、請求項１５８に記載の組成物。

【請求項160】

固体支持体が、ナノ粒子又はマイクロ粒子である、請求項１５８又は１５９に記載の組成物。

【請求項161】

第１の分析物結合領域が、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、ナノ粒子又はマイクロ粒子が、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンでコーティングされており、第１の分析物結合領域が、ビオチン化されている、請求項１６０に記載の組成物。

【請求項162】

シグナル領域が、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、ナノ粒子又はマイクロ粒子が、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンでコーティングされており、第１のプローブのシグナル領域が、ビオチン化されている、請求項１６０～１６１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項163】

複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有する、複数の第１のプローブ、並びに
複数のサプレッサーであって、各サプレッサーが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止する、又はサプレッサーが、標識プローブとシグナル領域との会合を防止する、複数のサプレッサー
を含む組成物。

【請求項164】

複数の標識プローブであって、各標識プローブが、シグナル領域と会合することができる、複数の標識プローブ、並びに
複数の第２のプローブであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、１個以上のサプレッサーに結合する、それを除去する又はそれを分解することができる、複数の第２のプローブ
を含む組成物。

【請求項165】

複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有する、複数の第１のプローブ、
複数の標識プローブであって、各標識プローブが、シグナル領域と会合することができる、複数の標識プローブ、並びに
複数のサプレッサーであって、各サプレッサーが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止する、又はサプレッサーが、標識プローブとシグナル領域との会合を防止する、複数のサプレッサー
を含む組成物。

【請求項166】

第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含む第１のプローブであって、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、シグナル領域が、複数のサプレッサー及び標識プローブと会合しており、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止する、第１のプローブ、
第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含む第２のプローブであって、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、
分析物が、第１のプローブの第１の分析物結合領域に結合している間に、第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に結合することができ、
分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、
第２のプローブが、第１のプローブに結合した分析物に結合する場合、サプレッサーのうち１個以上が、第１のプローブから除去され得る又は分解され得、
十分な数のサプレッサーの除去又は分解後に、標識プローブから生じるシグナルが、分析物の非存在下で第１のプローブから生じるシグナルから識別可能になる、第２のプローブ
を含む分析物検出システム。

【請求項167】

第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含む第１のプローブであって、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、シグナル領域が、複数のサプレッサーと会合している、第１のプローブ、
第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含む第２のプローブであって、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、
分析物が、第１のプローブの第１の分析物結合領域に結合している間に、第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に結合することができ、
分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、
第２のプローブが、第１のプローブに結合している間の分析物に結合する場合、サプレッサーのうち１個以上が、第１のプローブから除去され得る又は分解され得る、第２のプローブ、並びに
第１のプローブのシグナル領域に対する親和性を有する標識プローブであって、１個以上のサプレッサーの除去又は分解後に、標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に結合することができる、標識プローブ
を含む分析物検出システム。

【請求項168】

複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、シグナル領域が、複数のサプレッサー及び複数の標識プローブと会合しており、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止する、複数の第１のプローブ、
複数の第２のプローブであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、
分析物が、第１のプローブの第１の分析物結合領域に結合している間に、第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に結合することができ、
分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、
第２のプローブのうち１個が、第１のプローブのうち１個に結合した分析物に結合する場合、サプレッサーのうち１個以上が、第１のプローブから除去され得る又は分解され得、
十分な数のサプレッサーの除去又は分解後に、複数の標識プローブから生じるシグナルが、分析物の非存在下で第１のプローブから生じるシグナルから識別可能となる、複数の第２のプローブ
を含む分析物検出システム。

【請求項169】

複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、シグナル領域が、複数のサプレッサーと会合している、複数の第１のプローブ、
複数の第２のプローブであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、
分析物が、第１のプローブの第１の分析物結合領域に結合している間に、第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に結合することができ、
分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、
第２のプローブのうち１個が、第１のプローブのうち１個に結合している間の分析物に結合する場合、サプレッサーのうち１個以上が、第１のプローブから除去され得る又は分解され得る、複数の第２のプローブ、並びに
複数の標識プローブであって、各標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に対する親和性を有し、１個以上のサプレッサーの除去又は分解後に、１個以上の標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に結合することができる、複数の標識プローブ
を含む分析物検出システム。

【請求項170】

第１の分析物結合領域と分析物との間の親和性が、第２の分析物結合領域と分析物との間よりも少なくとも１０倍遅い解離の速度定数を含む、請求項１６８又は１６９に記載のシステム。

【請求項171】

シグナル領域が、共通配列をそれぞれ含む複数の第１のプローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６８～１７０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項172】

共通配列が、約１０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドである、請求項１７１に記載のシステム。

【請求項173】

サプレッサーがそれぞれ、第１のプローブ相補領域及び足場領域を含むサプレッサーオリゴヌクレオチドを含み、第１のプローブ相補領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドの共通配列に相補的である配列を含み、足場領域が、第１のプローブ相補領域からすぐ３’又は５’に位置し、サプレッサーオリゴヌクレオチドが、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるときに、足場領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしないように、足場領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにおける共通配列のすぐ３’又は５’にある配列に相補的ではない配列を含む、請求項１７１又は１７２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項174】

第１のプローブ相補領域が、共通配列と同じ長さである、請求項１７３に記載のシステム。

【請求項175】

各第２のプローブのサプレッサー相互作用領域が、サプレッサーオリゴヌクレオチドの第１のプローブ相補領域及び足場領域に相補的である配列を含むサプレッサー相補領域を含む第２のプローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項１７３又は１７４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項176】

足場領域が、約１ヌクレオチド～約６ヌクレオチドである、請求項１７３～１７５のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項177】

標識プローブが、シグナル伝達構成成分と、サプレッサーの第１のプローブ相補領域と同一の配列又はそのような配列の部分を含むオリゴヌクレオチド構成成分とを含む、請求項１７３～１７６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項178】

シグナル伝達構成成分が、フルオロフォア、蛍光発生化合物、蛍光タンパク質又はケミルミネッセンス生成酵素からなる群から選択される、請求項１７７に記載のシステム。

【請求項179】

シグナル伝達構成成分が、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７からなる群から選択される小分子有機フルオロフォアである、請求項１７７に記載のシステム。

【請求項180】

複数の第１のプローブが、固体支持体に結合されている、請求項１６８～１７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項181】

第１のプローブの第１の分析物結合領域及びシグナル領域が、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン又は別のタンパク質の分子における隣接部位に結合されている、請求項１６８～１７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項182】

第１のプローブの第１の分析物結合領域及びシグナル領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子における隣接部位に結合されている、請求項１６８～１７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項183】

ナノ粒子が、金ナノ粒子である、請求項１８２に記載のシステム。

【請求項184】

分析物が、核酸であり、第１の分析物結合領域が、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドを含み、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の第１の配列に相補的である配列を保有し、第２の分析物結合領域が、検出用オリゴヌクレオチドを含み、検出用オリゴヌクレオチドが、分析物の第２の配列に相補的である配列を保有する、請求項１６８～１７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項185】

分析物が、核酸であり、第１の分析物結合領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子に結合された第１の捕捉用オリゴヌクレオチドを含み、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の第１の配列に相補的である配列を保有し、第２の分析物結合領域が、検出用オリゴヌクレオチドを含み、検出用オリゴヌクレオチドが、分析物の第２の配列に相補的である配列を保有する、請求項１６８～１７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項186】

第１のプローブの第１の分析物結合領域及びシグナル領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子における隣接部位に結合され、第１の分析物結合領域が、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、ナノ粒子又はマイクロ粒子が、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンでコーティングされており、第１の分析物結合領域が、ビオチン化されている、請求項１６８～１７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項187】

第１のプローブのシグナル領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されている、請求項１６８～１７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項188】

シグナル領域が、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、第１のプローブのシグナル領域が、ビオチン化されている、請求項１８７に記載のシステム。

【請求項189】

分析物が、核酸であり、第１の分析物結合領域が、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドを含み、第１の捕捉用オリゴヌクレオチドが、分析物の配列に相補的である配列を保有する、請求項１６８～１７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項190】

第２の分析物結合領域が、検出用オリゴヌクレオチドを含み、検出用オリゴヌクレオチドが、分析物の配列に相補的である配列を保有する、請求項１６８～１７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項191】

分析物が、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含み、各第１のプローブの第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有する第１の結合パートナーを含む、請求項１６８～１７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項192】

第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有する第２の結合パートナーを含み、サプレッサー相互作用領域が、第２の結合パートナーに連結されている、請求項１９１に記載のシステム。

【請求項193】

第１の結合パートナーが、分析物の第１の抗体若しくはその断片、第１のアプタマー又は第１のリガンドである、請求項１９１～１９２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項194】

第２の結合パートナーが、分析物の第２の抗体若しくはその断片、第２のアプタマー又は第２のリガンドである、請求項１９１～１９３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項195】

第１の抗体が、ナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されており、第１のプローブのシグナル領域が、隣接部位においてナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されている、請求項１９３に記載のシステム。

【請求項196】

第１の抗体が、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、ナノ粒子又はマイクロ粒子が、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンでコーティングされており、第１の抗体が、ビオチン化されている、請求項１９５に記載のシステム。

【請求項197】

シグナル領域が、ストレプトアビジン（又はアビジン又はニュートラアビジン）－ビオチン相互作用を介してナノ粒子又はマイクロ粒子に結合されるように、第１のプローブのシグナル領域が、ビオチン化されている、請求項１９６に記載のシステム。

【請求項198】

第２のプローブの数が、第１のプローブの数を超える、請求項１６８～１９７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項199】

第２のプローブの数が、分析物と会合した第１のプローブの数よりも大きい、請求項１６８～１９７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項200】

分析物が、結合パートナーに連結された核酸であり、結合パートナーが、第１の分析物結合領域に対する親和性を有する、請求項１６８～１７９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項201】

結合パートナーが、ビオチンであり、第１の分析物結合領域が、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンを含む、請求項２００に記載のシステム。

【請求項202】

第１の分析物結合領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子の表面にある、請求項２０１に記載のシステム。

【請求項203】

シグナル領域が、ナノ粒子又はマイクロ粒子における隣接部位に結合されている、請求項２０２に記載のシステム。

【請求項204】

試料中の分析物を検出するための分析物検出システムであって、
複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、シグナル領域及び第１のプローブ分析物結合領域を含み、シグナル領域が、サプレッサー結合領域を含み、第１のプローブ分析物結合領域が、分析物に結合することができ、多重の第１のプローブが、分析物の単一のコピーと相互作用することができるように、第１のプローブの部分のための第１のプローブ分析物結合領域が、同一ではない、複数の第１のプローブ、
複数のサプレッサーであって、少なくとも１個のサプレッサーが、第１のプローブのサプレッサー結合領域の実質的に全てと会合するように、各サプレッサーが、第１のプローブのサプレッサー結合領域に結合することができる第１のプローブ結合領域を含む、複数のサプレッサー、
複数の分析物結合パートナーであって、各分析物結合パートナーが、分析物に対する親和性を有する第１の分析物結合領域を含み、分析物結合パートナーのそれぞれが、第１のプローブのうち少なくとも１個と直接的に又は間接的に会合している、複数の分析物結合パートナー、
複数の第２のプローブであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、サプレッサーのうち１個以上に結合することができ、
分析物が、分析物結合パートナーの第１の分析物結合領域に結合している間に、また、第１のプローブの第１のプローブ分析物結合領域が、分析物に結合している間に、第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に結合することができ、
分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、分析物への第１のプローブ分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、
分析物が、分析物結合パートナーのうち１個に結合している間に、第２のプローブのうち１個が、分析物に結合する場合、第２のプローブに結合されたそのような１個以上のサプレッサーが、分析物からの第２のプローブの脱会合後に第１のプローブから除去されることになるように、そのような第２のプローブはまた、サプレッサーのうち１個以上に結合する、複数の第２のプローブ、並びに
複数の標識プローブであって、各標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に対する親和性を有し、１個以上のサプレッサーの除去後に、１個以上の標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に結合することができ、これにより、分析物の検出を可能にする、複数の標識プローブ
を含むシステム。

【請求項205】

各シグナル領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにおける第１の配列であり、第１のプローブ分析物結合領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにおける第２の配列であり、第２の配列が、分析物における第１の分析物配列に相補的であり、第１のプローブオリゴヌクレオチドの第１の配列が、分析物のいずれの配列にも相補的ではない、請求項２０４に記載のシステム。

【請求項206】

試料中の分析物を検出するための分析物検出システムであって、
複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、シグナル領域及びアンカー領域を含み、シグナル領域が、サプレッサー結合領域を含む、複数の第１のプローブ、
複数のサプレッサーであって、少なくとも１個のサプレッサーが、第１のプローブのサプレッサー結合領域の実質的に全てと会合するように、各サプレッサーが、第１のプローブのサプレッサー結合領域に結合することができる第１のプローブ結合領域を含む、複数のサプレッサー、
複数の分析物結合パートナーであって、各分析物結合パートナーが、分析物に対する親和性を有する第１の分析物結合領域を含み、分析物結合パートナーのそれぞれが、アンカー領域を介して第１のプローブのうち少なくとも１個と直接的に又は間接的に会合している、複数の分析物結合パートナー、
複数の第２のプローブであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、サプレッサーのうち１個以上に結合することができ、
分析物が、分析物結合パートナーの第１の分析物結合領域に結合している間に、また、第１のプローブの第１のプローブ分析物結合領域が、分析物に結合している間に、第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に結合することができ、
分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、分析物への第１のプローブ分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、
分析物が、分析物結合パートナーのうち１個に結合している間に、第２のプローブのうち１個が、分析物に結合する場合、第２のプローブに結合されたそのような１個以上のサプレッサーが、分析物からの第２のプローブの脱会合後に第１のプローブから除去されることになるように、そのような第２のプローブはまた、サプレッサーのうち１個以上に結合する、複数の第２のプローブ、並びに
複数の標識プローブであって、各標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に対する親和性を有し、１個以上のサプレッサーの除去後に、１個以上の標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に結合することができ、これにより、分析物の検出を可能にする、複数の標識プローブ
を含むシステム。

【請求項207】

分析物結合パートナーのそれぞれが、固体支持体に固定化された第１のプローブのうち少なくとも１個のおよそ１００ナノメートル以内で固体支持体において固定化されるように、分析物結合パートナーのそれぞれが、固体支持体への固定化によって第１のプローブのうち少なくとも１個と間接的に会合しており、第１のプローブが、アンカー領域を介して固体支持体に固定化されている、請求項２０６に記載のシステム。

【請求項208】

第１のプローブのアンカー領域が、第１のオリゴヌクレオチドであり、第１のプローブのシグナル領域が、第１のオリゴヌクレオチドとは別々のものである第２のオリゴヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチドが、アンカー相補配列を含み、サプレッサー結合領域が、アンカー相補配列とは別々のものでありかつ第１のオリゴヌクレオチドのいずれの配列にも相補的ではない、第２のオリゴヌクレオチドにおけるサプレッサー結合配列であり、多重の第２のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるように、第１のオリゴヌクレオチドが、アンカー相補配列に相補的な複数の配列を含む、請求項２０７に記載のシステム。

【請求項209】

各分析物結合パートナーが、第１のプローブのうち１個に物理的に連結されるように、分析物結合パートナーのそれぞれが、第１のプローブのうち１個と直接的に会合している、請求項２０６に記載のシステム。

【請求項210】

分析物が、核酸であり、第１のプローブの分析物結合パートナー及びアンカー領域が、それぞれ第１のプローブ第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列及び複数の第２の配列を含み、シグナル領域が、複数の第１のプローブ第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のプローブ第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、第３の配列及び第４の配列を含み、多重の第１のプローブ第２のオリゴヌクレオチドが、各第１のプローブ第１のオリゴヌクレオチドと会合するように、第３の配列が、複数の第２の配列のうち１個以上に相補的であり、第４の配列が、サプレッサー結合領域を含む、請求項２０９に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６３／２２４，９８４号明細書に基づく優先権を主張する。

【0002】

配列表
４６，１１７バイトのファイルサイズを有する、２０２２年７月１３日に作成された「ＵＭ－３９７１５－６０１＿ＳＱＬ」という表題の、本明細書と共に出願されたコンピュータ可読配列表は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

分子親和性プローブ、例えば、核酸オリゴヌクレオチド、アプタマー、抗体及び抗体断片は、生物学的混合物中の目的の標的バイオマーカー、例えば、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質、又はそれらの共有結合による修飾の同定及び定量化に使用されることが多い。しかし、そのようなプローブの使用の弱点は、これが典型的に、生物学的混合物中の表面及び他の構成成分への相当量の意図されない（又は非特異的な）結合を示すことである。これにより、意図される（特異的な）結合から生じる少量のシグナルを、意図されない（非特異的な）結合から生じる顕著なシグナルから識別することが極めて困難又は技術的に非実用的になるため、低（例えば、ピコモル濃度を下回る又はフェムトモル濃度を下回る）濃度の目的の標的を検出することを困難又は不可能にするバックグラウンドシグナルが産生される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

よって、特に低濃度の分析物の高感度及び高特異度検出を提供するための、改善されたシステム、方法及びキットの必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

（要旨）
本開示は、分析物（例えば、核酸、タンパク質又は他の生体分子）の高感度、高特異度検出を可能にする、同じ分析物分子への（又は分析物分子に結合したプローブへの）プローブの反復した結合の内部記録を保有する分子プローブを使用して、特異的及び非特異的結合の間をより良く識別するための一般化された分子アーキテクチャ及び方法を提供する。同じ分析物分子への（又は分析物分子に結合したプローブへの）プローブの反復した結合は、プローブ結合事象の数及び動態に依存するシグナル（例えば、蛍光又はケミルミネッセンス）の蓄積をもたらし、独立した結合事象の数が増加するにつれて、分析物分子の存在下での信頼増加を生じる。非特異的結合は、特異的結合と同じ親和性又は動態で同じ場所に反復して起こる可能性が低いため、同じ分析物分子への（又は分析物分子に結合したプローブへの）反復したプローブ結合から生じるシグナルの蓄積は、分析物分子の存在の特徴的なシグネチャーを構成する。

【0006】

本開示は、分子分析物の検出及び定量化のためのシステム、キット及び方法を提供する。一実施形態では、本開示は、試料中の分析物を検出するシステムを提供する。システムは、複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、シグナル領域を含み、シグナル領域が、複数のサプレッサー結合領域を含む、複数の第１のプローブ；複数のサプレッサーであって、少なくとも１個のサプレッサーが、第１のプローブのサプレッサー結合領域の実質的に全てと会合するように、各サプレッサーが、第１のプローブのサプレッサー結合領域に結合することができる第１のプローブ結合領域を含む、複数のサプレッサー；複数の分析物結合パートナーであって、各分析物結合パートナーが、分析物に対する親和性を有する第１の分析物結合領域を含み、分析物結合パートナーのそれぞれが、第１のプローブのうち少なくとも１個と直接的に又は間接的に会合している、複数の分析物結合パートナー；複数の第２のプローブであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、サプレッサーのうち１個以上に結合することができ、分析物が、分析物結合パートナーの第１の分析物結合領域に結合している間に、第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に結合することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、分析物が、分析物結合パートナーのうち１個に結合している間に、第２のプローブのうち１個が、分析物に結合する場合、第２のプローブに結合されたそのような１個以上のサプレッサーが、分析物からの第２のプローブの脱会合後に第１のプローブから除去されることになるように、そのような第２のプローブはまた、サプレッサーのうち１個以上に結合する、複数の第２のプローブ；並びに複数の標識プローブであって、各標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に対する親和性を有し、１個以上のサプレッサーの除去後に、１個以上の標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に結合することができ、これにより、分析物の検出を可能にする、複数の標識プローブを含む。

【0007】

別の実施形態では、上に記載されているシステムを使用するための構成成分を含むキットが提供される。キットは、複数の第１のプローブを含む第１の構成成分であって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、第１の分析物結合領域及びシグナル領域が、共通分子の一部として直接的に会合している、又は２個の別個の分子として間接的に会合している、第１の構成成分；複数の標識プローブを含む第２の構成成分であって、各標識プローブが、シグナル領域と会合することができる、第２の構成成分；複数のサプレッサーを含む第３の構成成分であって、各サプレッサーが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止する、又はサプレッサーが、標識プローブとシグナル領域との会合を防止する、第３の構成成分；並びに複数の第２のプローブを含む第４の構成成分であって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有する、第４の構成成分を含む。

【0008】

さらに別の実施形態では、上に記載されているキットを使用して試料中の分析物を検出するための方法が提供される。方法は、試料の部分を第１の構成成分及び第３の構成成分と混合して、第１の反応混合物を形成するステップであって、第３の構成成分のサプレッサーが、第１の構成成分の複数の第１のプローブのシグナル領域に結合される、ステップ；分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ；ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を第４の構成成分と混合して、第２の反応混合物を得るステップ；第２のプローブが分析物に結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解するのに十分な条件下で、第２の反応混合物をインキュベートするステップ；ステップ（ｄ）の後の第２の反応混合物を第２の構成成分と混合して、第３の反応混合物を得るステップ；標識プローブが、ステップ（ｄ）において１個以上のサプレッサーが除去又は分解された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件下で、第３の反応混合物をインキュベートするステップ；並びに第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップを含む。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、本開示の例示的な実施形態を表す。

【図2】図２は、本開示の例示的な実施形態を表す。

【図3-1】図３は、実施例１の例示的な分析物検出システムを表す。図３は、出現の順に、配列番号１（５コピーの配列番号２を含む）、配列番号３（配列番号４を含む）、配列番号６（５’から３’に、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む）、配列番号１０、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３及び配列番号１を開示する。

【図3-2】図３は、実施例１の例示的な分析物検出システムを表す。図３は、出現の順に、配列番号１（５コピーの配列番号２を含む）、配列番号３（配列番号４を含む）、配列番号６（５’から３’に、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む）、配列番号１０、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３及び配列番号１を開示する。

【図4-1】図４は、実施例１の分析物検出のための例示的な方法を表す。この例示的な実施形態において、第１のプローブがビオチン化カバースリップ表面に結合している場合のストレプトアビジン－金ナノ粒子を含む第１のプローブを使用するビオチン化ＤＮＡ配列の検出が示される。１個の金ナノ粒子及び１個のシグナル領域を有する第１のプローブ複合体が示されるが、各金ナノ粒子は、ビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１のための多重の結合部位に起因する、１個以上、例えば、１０個以上のシグナル領域を含む第１のプローブの部分であり得ることに留意されたい。図４は、出現の順に、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号６、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号６、配列番号３、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号５、配列番号１、配列番号１０、配列番号５、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１、配列番号１０、配列番号１０及び配列番号１０を開示する。

【図4-2】図４は、実施例１の分析物検出のための例示的な方法を表す。この例示的な実施形態において、第１のプローブがビオチン化カバースリップ表面に結合している場合のストレプトアビジン－金ナノ粒子を含む第１のプローブを使用するビオチン化ＤＮＡ配列の検出が示される。１個の金ナノ粒子及び１個のシグナル領域を有する第１のプローブ複合体が示されるが、各金ナノ粒子は、ビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１のための多重の結合部位に起因する、１個以上、例えば、１０個以上のシグナル領域を含む第１のプローブの部分であり得ることに留意されたい。図４は、出現の順に、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号６、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号６、配列番号３、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号５、配列番号１、配列番号１０、配列番号５、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１、配列番号１０、配列番号１０及び配列番号１０を開示する。

【図5】図５は、分析物オリゴヌクレオチドの存在下での実施例１からのカバースリップのＴＩＲＦ顕微鏡画像（左）及び分析物オリゴヌクレオチドの非存在下でのカバースリップのＴＩＲＦ顕微鏡画像（右）を表す。

【図6】図６は、分析物オリゴヌクレオチドの存在下で実施例１についての個々の第１のプローブから生じる蛍光点から分析データを光退色するステップ（左）及び分析物オリゴヌクレオチドの非存在下で実施例１についての個々の第１のプローブから生じる蛍光点から分析データを光退色するステップ（右）を表す。

【図7】図７は、実施例２において分析物あり又はなしでの第２のプローブのさまざまなインキュベーション時間後のＴＩＲＦ顕微鏡画像を表す。

【図8A】図８Ａは、異なるインキュベーション時間で種々の閾値を使用する、実施例２における実験についての定量化を表す。エラーバーは、同じ試料ウェルにおける別々の視野からの３個の測定値についての１標準偏差を表す。

【図8B】図８Ｂは、異なるインキュベーション時間で単一の３０，０００任意単位の閾値を使用する、実施例２における実験についての定量化を表す。エラーバーは、同じ試料ウェルにおける別々の視野からの３個の測定値についての１標準偏差を表す。

【図9】図９は、実施例３についての視野ごとの許容される粒子の数を表す。各データポイントは、２５視野の平均である。エラーバーは、１標準偏差を表す。

【図10-1】図１０は、実施例４の分析物検出のための例示的な方法を表す。この例示的な実施形態において、第１のプローブがビオチン化カバースリップ表面に結合している場合の、ストレプトアビジン－金ナノ粒子を含む第１のプローブを使用するタンパク質の検出が示される。１個の金ナノ粒子及び１個のシグナル領域を有する第１のプローブ複合体が示されるが、各金ナノ粒子は、ビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１のための多重の結合部位に起因する、１個以上、例えば、１０個以上のシグナル領域を含む第１のプローブの部分であり得ることに留意されたい。１個の第１の分析物結合領域を有する第１のプローブ複合体が示されるが、各金ナノ粒子は、ビオチン標識化捕捉抗体のための多重の結合部位に起因する、１個以上、例えば、１０個以上の第１の分析物結合領域を含む第１のプローブの部分であり得ることにも留意されたい。図１０は、出現の順に、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１１（５’から３’に、配列番号８及び配列番号９を含む）、配列番号１１、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１１、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１、配列番号１０及び配列番号１０を開示する。

【図10-2】図１０は、実施例４の分析物検出のための例示的な方法を表す。この例示的な実施形態において、第１のプローブがビオチン化カバースリップ表面に結合している場合の、ストレプトアビジン－金ナノ粒子を含む第１のプローブを使用するタンパク質の検出が示される。１個の金ナノ粒子及び１個のシグナル領域を有する第１のプローブ複合体が示されるが、各金ナノ粒子は、ビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１のための多重の結合部位に起因する、１個以上、例えば、１０個以上のシグナル領域を含む第１のプローブの部分であり得ることに留意されたい。１個の第１の分析物結合領域を有する第１のプローブ複合体が示されるが、各金ナノ粒子は、ビオチン標識化捕捉抗体のための多重の結合部位に起因する、１個以上、例えば、１０個以上の第１の分析物結合領域を含む第１のプローブの部分であり得ることにも留意されたい。図１０は、出現の順に、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１１（５’から３’に、配列番号８及び配列番号９を含む）、配列番号１１、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１１、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１、配列番号１０及び配列番号１０を開示する。

【図11A】図１１Ａは、ＰＡＩ－１分析物の存在下でのカバースリップのＴＩＲＦ顕微鏡画像（左）及びＰＡＩ－１分析物の非存在下でのカバースリップのＴＩＲＦ顕微鏡画像（右）を表す。

【図11B】図１１Ｂは、実施例４における実験についての定量化を表す。エラーバーは、同じ試料ウェルにおける５視野の５つの独立した群の１標準偏差を表す。

【図11C】図１１Ｃは、ＴＮＦ－アルファ分析物の存在下でのカバースリップのＴＩＲＦ顕微鏡画像（左）及びＴＮＦ－アルファ分析物の非存在下でのカバースリップのＴＩＲＦ顕微鏡画像（右）を表す。

【図12】図１２は、捕捉オリゴヌクレオチドを使用して、ビオチン化されていない核酸分析物を捕捉することができる、例示的なシステムを表す。図１２は、出現の順に、配列番号１２、配列番号６、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３及び配列番号１を開示する。

【図13】図１３は、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用が、固体支持体及び金ナノ粒子の間、並びに金ナノ粒子及びシグナル領域と捕捉オリゴヌクレオチド両方の間の金－チオール相互作用で置き換えられた、図１２の例示的なシステムを表す。図１３は、出現の順に、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３及び配列番号１５を開示する。

【図14】図１４は、捕捉抗体が、シグナル領域にコンジュゲートされ、固体支持体にさらに連結されているシリカナノ粒子にコンジュゲートされている、例示的な実施形態を表す。図１４は、出現の順に、配列番号１１、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３及び配列番号１５を開示する。

【図15】図１５は、シグナル領域及び捕捉オリゴヌクレオチドを介して、第１の分析物結合領域に結合するＤＮＡオリガミ（ＤＮＡオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた捕捉抗体）を使用する本開示の例示的な実施形態を表す。図１５は、出現の順に、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１４、配列番号１４、配列番号１１、配列番号１５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３及び配列番号３を開示する。

【図16】図１６は、捕捉抗体（第１の分析物結合領域）が、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介して固体支持体に直接的に固定化されている、本開示の例示的な実施形態を表す。図１６は、出現の順に、配列番号１１、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３及び配列番号１５を開示する。

【図17-1】図１７は、シグナル領域が、次いで反応して、標識を反応性基にコンジュゲートすることができる反応性基をブロックする嵩高いポリマーサプレッサーを分解する酵素を含む、サプレッサー相互作用領域によってカバーできない反応性基（アジド）を含む、本開示の例示的な実施形態を表す。

【図17-2】図１７は、シグナル領域が、次いで反応して、標識を反応性基にコンジュゲートすることができる反応性基をブロックする嵩高いポリマーサプレッサーを分解する酵素を含む、サプレッサー相互作用領域によってカバーできない反応性基（アジド）を含む、本開示の例示的な実施形態を表す。

【図18-1】図１８は、第１のプローブが固体支持体にカップリングされず、検出が非顕微鏡法を含み得る、本開示の例示的な実施形態を表す。図１８は、出現の順に、配列番号１２、配列番号１４、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１５、配列番号６、配列番号１２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号６、配列番号３、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１０、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０及び配列番号１０を開示する。

【図18-2】図１８は、第１のプローブが固体支持体にカップリングされず、検出が非顕微鏡法を含み得る、本開示の例示的な実施形態を表す。図１８は、出現の順に、配列番号１２、配列番号１４、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１５、配列番号６、配列番号１２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号６、配列番号３、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１０、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０及び配列番号１０を開示する。

【図19-1】図１９は、サプレッサーの除去が、シグナル領域と会合しているフルオロフォアを発光させて、シグナルを生成する、本開示の例示的な実施形態を表す。図１９は、出現の順に、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号６、配列番号６、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号６、配列番号３、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号５、配列番号１を開示する。

【図19-2】図１９は、サプレッサーの除去が、シグナル領域と会合しているフルオロフォアを発光させて、シグナルを生成する、本開示の例示的な実施形態を表す。図１９は、出現の順に、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号６、配列番号６、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号６、配列番号３、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号５、配列番号１を開示する。

【図20】図２０は、ナノ粒子が第１のプローブに含まれず、ビオチン化分析物がストレプトアビジンに結合することができ、シグナル領域がストレプトアビジンに結合することができる、本開示の例示的な実施形態を表す。図２０は、出現の順に、配列番号６、配列番号５、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３及び配列番号１６を開示する。

【図21】図２１は、図２０に図示される実施形態に従って行われた実験における、分析物の存在下でのカバースリップのＴＩＲＦ顕微鏡画像（左）及び分析物の非存在下でのカバースリップのＴＩＲＦ顕微鏡画像（右）を表す。

【図22】図２２は、第２のプローブが、それが分析物に結合するときに、第１のプローブに結合することができる、本開示の例示的なシステム及び方法を表す。

【図23-1】図２３は、第１の分析物結合領域が、分析物の結合の際にコンフォメーションを変化させて、第１のプローブへの第２のプローブの結合を可能にし得るアプタマーを含む、例示的なシステム及び方法を表す。図２３は、出現の順に、配列番号１８、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１８、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１９、配列番号３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１、配列番号１０、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０を開示する。

【図23-2】図２３は、第１の分析物結合領域が、分析物の結合の際にコンフォメーションを変化させて、第１のプローブへの第２のプローブの結合を可能にし得るアプタマーを含む、例示的なシステム及び方法を表す。図２３は、出現の順に、配列番号１８、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１８、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１９、配列番号３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１、配列番号１０、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０を開示する。

【図23-3】図２３は、第１の分析物結合領域が、分析物の結合の際にコンフォメーションを変化させて、第１のプローブへの第２のプローブの結合を可能にし得るアプタマーを含む、例示的なシステム及び方法を表す。図２３は、出現の順に、配列番号１８、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１８、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１９、配列番号３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１、配列番号１０、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０を開示する。

【図23-4】図２３は、第１の分析物結合領域が、分析物の結合の際にコンフォメーションを変化させて、第１のプローブへの第２のプローブの結合を可能にし得るアプタマーを含む、例示的なシステム及び方法を表す。図２３は、出現の順に、配列番号１８、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１８、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１９、配列番号３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号３、配列番号１、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１、配列番号１０、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１０を開示する。

【図24】図２４は、固定化された多価プローブを使用する標識された第１のプローブの選択的捕捉のための例示的なシステム及び方法を表す。

【図25A】図２５は、図２４に示されるシステム及び方法の作業実施例である。パネルＡは、シグナル領域１１１の例示的な配列（配列番号２０）、多価相互作用プローブ（親和性構成成分）に対して相補的である追加配列を含むように改変された標識プローブ（各標識プローブは配列番号２１）、及び多価標識相互作用プローブ（配列番号２２）である、を示す。パネルＢは、分析物が添加された（左パネル）及び分析物が添加されていない（右パネル）、パネルＡに示される例示的なシステムを使用して、チャンバーの全反射照明蛍光顕微鏡を使用して記録された画像を表す。各画像の下は、それぞれ、分析物チャンバー及びブランクチャンバーにおいて測定された蛍光強度を定量化するその対応するヒストグラムである。

【図25B】図２５は、図２４に示されるシステム及び方法の作業実施例である。パネルＡは、シグナル領域１１１の例示的な配列（配列番号２０）、多価相互作用プローブ（親和性構成成分）に対して相補的である追加配列を含むように改変された標識プローブ（各標識プローブは配列番号２１）、及び多価標識相互作用プローブ（配列番号２２）である、を示す。パネルＢは、分析物が添加された（左パネル）及び分析物が添加されていない（右パネル）、パネルＡに示される例示的なシステムを使用して、チャンバーの全反射照明蛍光顕微鏡を使用して記録された画像を表す。各画像の下は、それぞれ、分析物チャンバー及びブランクチャンバーにおいて測定された蛍光強度を定量化するその対応するヒストグラムである。

【図26A】図２６は、第１のプローブにおける分岐状シグナル領域対線状シグナル領域を使用する、本システム及び方法の実施形態の作業実施例である。パネルＡは、例示的なシグナル領域オリゴヌクレオチド１１１（配列番号２３）及び例示的なサプレッサーオリゴヌクレオチド（配列番号３）を表す。パネルＢは、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な領域及びサプレッサーオリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、第１のオリゴヌクレオチド（配列番号２４）及び一連の第２のオリゴヌクレオチド（配列番号２５）を含む分岐状シグナル領域を表す（配列番号３）。パネルＣ及びＤは、異なる長さ線状シグナル領域対分岐状シグナル領域の蛍光強度を定量化するヒストグラムを提供する（上パネルは分析物ありであり、下パネルは分析物なしの対照である）。

【図26B】図２６は、第１のプローブにおける分岐状シグナル領域対線状シグナル領域を使用する、本システム及び方法の実施形態の作業実施例である。パネルＡは、例示的なシグナル領域オリゴヌクレオチド１１１（配列番号２３）及び例示的なサプレッサーオリゴヌクレオチド（配列番号３）を表す。パネルＢは、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な領域及びサプレッサーオリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、第１のオリゴヌクレオチド（配列番号２４）及び一連の第２のオリゴヌクレオチド（配列番号２５）を含む分岐状シグナル領域を表す（配列番号３）。パネルＣ及びＤは、異なる長さ線状シグナル領域対分岐状シグナル領域の蛍光強度を定量化するヒストグラムを提供する（上パネルは分析物ありであり、下パネルは分析物なしの対照である）。

【図26C】図２６は、第１のプローブにおける分岐状シグナル領域対線状シグナル領域を使用する、本システム及び方法の実施形態の作業実施例である。パネルＡは、例示的なシグナル領域オリゴヌクレオチド１１１（配列番号２３）及び例示的なサプレッサーオリゴヌクレオチド（配列番号３）を表す。パネルＢは、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な領域及びサプレッサーオリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、第１のオリゴヌクレオチド（配列番号２４）及び一連の第２のオリゴヌクレオチド（配列番号２５）を含む分岐状シグナル領域を表す（配列番号３）。パネルＣ及びＤは、異なる長さ線状シグナル領域対分岐状シグナル領域の蛍光強度を定量化するヒストグラムを提供する（上パネルは分析物ありであり、下パネルは分析物なしの対照である）。

【図26D】図２６は、第１のプローブにおける分岐状シグナル領域対線状シグナル領域を使用する、本システム及び方法の実施形態の作業実施例である。パネルＡは、例示的なシグナル領域オリゴヌクレオチド１１１（配列番号２３）及び例示的なサプレッサーオリゴヌクレオチド（配列番号３）を表す。パネルＢは、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な領域及びサプレッサーオリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、第１のオリゴヌクレオチド（配列番号２４）及び一連の第２のオリゴヌクレオチド（配列番号２５）を含む分岐状シグナル領域を表す（配列番号３）。パネルＣ及びＤは、異なる長さ線状シグナル領域対分岐状シグナル領域の蛍光強度を定量化するヒストグラムを提供する（上パネルは分析物ありであり、下パネルは分析物なしの対照である）。

【図27】図２７は、比較が、標的分析物及び単一ヌクレオチド置換のみによって異なる非標的分析物の間で行われることを除いて、実施例６に記載される分析物検出システムを使用する作業実施例である。標的分析物（標的ＤＮＡ）、非標的分析物（単一ヌクレオチド置換（Ａ－Ｔ）及び分析物なしの対照（ブランク）を用いて、試料から測定された定量化された強度を示すヒストグラム。パネルの一番上の行は、競合用プローブが試料に添加された場合対競合用プローブなし（下の行）の強度を示す。競合用プローブは、非標的分析物に対して相補的である１０ｂｐのオリゴヌクレオチドである。

【図28-1】図２８は、第１のプローブオリゴヌクレオチド（シグナル領域）が、分析物に直接的に結合し、かつ多重の部位で分析物に結合することができる分析物結合配列を含む、核酸分析物を含む作業実施例である。上パネルは、４個のサプレッサーオリゴヌクレオチド（配列番号３）にもそれぞれハイブリダイズされた、２個のシグナルプローブ（配列番号２７）にハイブリダイズされた分析物（配列番号２６）を表す。分析物上の配列（第１の配列）に相補的な領域（検出オリゴヌクレオチド）を介して分析物にハイブリダイズされ、サプレッサー相補領域を有する、第２のプローブオリゴヌクレオチド（配列番号６）も示される。下パネルは、濃度の関数としてプロットされたＦＯＶあたりの強度閾値をパスするスポットの数を定量化するグラフを示す。

【図28-2】図２８は、第１のプローブオリゴヌクレオチド（シグナル領域）が、分析物に直接的に結合し、かつ多重の部位で分析物に結合することができる分析物結合配列を含む、核酸分析物を含む作業実施例である。上パネルは、４個のサプレッサーオリゴヌクレオチド（配列番号３）にもそれぞれハイブリダイズされた、２個のシグナルプローブ（配列番号２７）にハイブリダイズされた分析物（配列番号２６）を表す。分析物上の配列（第１の配列）に相補的な領域（検出オリゴヌクレオチド）を介して分析物にハイブリダイズされ、サプレッサー相補領域を有する、第２のプローブオリゴヌクレオチド（配列番号６）も示される。下パネルは、濃度の関数としてプロットされたＦＯＶあたりの強度閾値をパスするスポットの数を定量化するグラフを示す。

【図29】図２９は、標的分析物（配列番号２８）がストレプトアビジンコーティングマイクロ粒子の表面上で捕捉され、標的分析物と比較して単一ヌクレオチド置換を有する非標的分析物（配列番号２９）を使用して、アッセイ感度が決定されたことを除いて、図２８に記載されるシステムを使用する作業実施例である。表面結合ビーズは、標的（上側パネル）対非標的（下側パネル）のさまざまな濃度、並びにまた標的及び過剰の非標的分析物の両方を含む試料（下側パネル、右側）で、対物レンズ型薄層斜光照明（ＨＩＬＯ）顕微鏡法（蛍光）及び明視野顕微鏡法（明視野）によって画像化された。標的及び非標的分析物の濃度の関数として平均ビーズ蛍光強度を示すグラフィック表現も提供される。右下グラフは、混合された試料と標的及び非標的分析物の両方を含む試料についての平均蛍光強度を提供する。

【図30】図３０は、第２のプローブを用いるインキュベーションステップが２５％のウマ血清中で行われたことを除いて、実施例６に記載されるアッセイを使用する作業実施例である。グラフは、明るい蛍光点（スポット）の数、並びに分析物あり又はなし（左対右）及びウマ血清あり又はなし（下対上）の試料におけるそれぞれの相対強度を表す。

【図31-1】図３１は、ビオチン化捕捉オリゴヌクレオチドを使用して、分析物を表面に局在化させることを除いて、図２８に記載されるものと類似する検出システムを使用する作業実施例である。ビオチン化捕捉オリゴヌクレオチド（配列番号３０）は、分析物（配列番号３１）にハイブリダイズされていることを示す。その検出オリゴヌクレオチドを介するシグナル領域（配列番号３２）及び第２のプローブ（配列番号３３）は、分析物に直接的にハイブリダイズされていることが示される。サプレッサー（配列番号３）も、シグナル領域にハイブリダイズされていることが示され、第２のプローブのサプレッサー相補領域は、サプレッサーオリゴヌクレオチドと近接して示される。下側の画像は、分析物が存在した場合（左パネル）及び分析物が存在しなかった場合（右パネル）のチャンバーの全反射照明蛍光顕微鏡法を使用して記録された。

【図31-2】図３１は、ビオチン化捕捉オリゴヌクレオチドを使用して、分析物を表面に局在化させることを除いて、図２８に記載されるものと類似する検出システムを使用する作業実施例である。ビオチン化捕捉オリゴヌクレオチド（配列番号３０）は、分析物（配列番号３１）にハイブリダイズされていることを示す。その検出オリゴヌクレオチドを介するシグナル領域（配列番号３２）及び第２のプローブ（配列番号３３）は、分析物に直接的にハイブリダイズされていることが示される。サプレッサー（配列番号３）も、シグナル領域にハイブリダイズされていることが示され、第２のプローブのサプレッサー相補領域は、サプレッサーオリゴヌクレオチドと近接して示される。下側の画像は、分析物が存在した場合（左パネル）及び分析物が存在しなかった場合（右パネル）のチャンバーの全反射照明蛍光顕微鏡法を使用して記録された。

【図32A】図３２は、パネルＡに示されるタンパク質分析物検出システムを使用する作業実施例である。パネルは、抗原（Ａ）の存在下でビオチン－ストレプトアビジン相互作用（分析物結合パートナーを表す）を介して平面に付着した捕捉抗体を表す。サプレッサー相補領域を持つオリゴヌクレオチド（配列番号１１）にコンジュゲートされた抗原（Ａ）に対する親和性を有する検出抗体を含む第２のプローブが示される。シグナル領域（第１のプローブ）は、捕捉抗体に隣接する表面に付着され、図２６に示される分岐状オリゴヌクレオチド配置を含む。シグナル領域（第１のプローブ）は、第１のオリゴヌクレオチド（配列番号２４）及び第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた一連の第２のオリゴヌクレオチド（配列番号３）を含み、ここで、第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な領域及びシグナル領域にここでハイブリダイズされたことが示されるサプレッサーオリゴヌクレオチド（配列番号２５）に相補的な領域を含む。パネルＢは、抗原が存在した場合（左パネル）及び抗原が存在しなかった場合（右パネル）のチャンバーの全反射照明蛍光顕微鏡法を使用して記録された画像を提供する。

【図32B】図３２は、パネルＡに示されるタンパク質分析物検出システムを使用する作業実施例である。パネルは、抗原（Ａ）の存在下でビオチン－ストレプトアビジン相互作用（分析物結合パートナーを表す）を介して平面に付着した捕捉抗体を表す。サプレッサー相補領域を持つオリゴヌクレオチド（配列番号１１）にコンジュゲートされた抗原（Ａ）に対する親和性を有する検出抗体を含む第２のプローブが示される。シグナル領域（第１のプローブ）は、捕捉抗体に隣接する表面に付着され、図２６に示される分岐状オリゴヌクレオチド配置を含む。シグナル領域（第１のプローブ）は、第１のオリゴヌクレオチド（配列番号２４）及び第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた一連の第２のオリゴヌクレオチド（配列番号３）を含み、ここで、第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な領域及びシグナル領域にここでハイブリダイズされたことが示されるサプレッサーオリゴヌクレオチド（配列番号２５）に相補的な領域を含む。パネルＢは、抗原が存在した場合（左パネル）及び抗原が存在しなかった場合（右パネル）のチャンバーの全反射照明蛍光顕微鏡法を使用して記録された画像を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本開示は、ある特定の図面を参照しつつ特定の実施形態について記載するが、主題はそれに限定されない。記載されている図面は、単なる概略図であり、限定を目的としない。図面において、要素のいくつかのサイズは、誇張又は歪曲されている場合があり、説明目的のため縮尺通りに描かれていない。

【0011】

本開示は、本開示の主題の一部の（ただし全てのではない）実施形態が示されている、添付の図面に関する記載を提供するであろう。実際に、主題は、多くの異なる形態で具体化され得、本明細書に示されている実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が全ての法的要件を満たすことができるように提供される。

【0012】

ある特定の用語法は、次の記載において単に便宜上使用されており、限定するものではない。

【0013】

定義
他の事柄が特に記述されない限り、本開示の要素は、１回目の出現の際に「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」として指定され、２回目の又はその後の出現について「その（ｔｈｅ）」又は「前記」として指定される。本明細書に特に示されない限り、用語「ある」、「ある」及び「その」は、１つの要素に限定されないが、その代わりに、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味すると読み取られるべきである。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２以上のものを意味する。用語法は、上に記される単語、その派生語及び同様の重要性の単語を含む。

【0014】

特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、選択肢のみを指すこと又は選択肢が相互排他的であることが明確に指し示されない限り、「及び／又は」を意味するように使用される。

【0015】

用語「約」の使用は、数値と共に使用される場合、＋／－１０％を含むことが意図される。例えば、アミノ酸の数が、約２００個として同定される場合、これは、１８０～２２０個（プラスマイナス１０％）を含むであろう。

【0016】

他に定義がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意義を有する。

【0017】

本明細書で使用される場合、「ある分析物に対する親和性」及び「その分析物に対する親和性」は、分析物それ自体に対する親和性を含むのみならず、分析物と会合した構成成分に対する親和性を含むこともできることが理解されるべきである。限定ではなく例として、分析物は、本開示のシステム及び方法への適用に先立ち結合パートナーに連結されてよい（結合パートナーが、第１のプローブの第１の分析物結合領域に対する親和性を有する場合）。よって、システムの一部又は構成成分が、「ある分析物に対する親和性」又は「その分析物に対する親和性」を有すると言われる場合、これは、分析物への結合パートナーに対する親和性を意味し得ることが理解されるべきである。換言すると、親和性は、分析物それ自体又は分析物と会合した構成成分のいずれかに対する親和性を含むことが理解されるべきである。

【0018】

本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、いずれかの長さのアミノ酸配列を指す。

【0019】

本明細書で使用される場合、「相補的ではない」は、所与の配列が、別の配列に完全に相補的という訳ではないものの延長された時間及び低い温度のものであるアニーリング条件下でハイブリダイズすることができるが、標準条件下でアニール又はハイブリダイズするとは予想されないであろうことを意味する。例えば、標準条件は、約２５℃の温度、約７のｐＨの水溶液中の約１５０ｍＭのナトリウムイオン濃度と、他の配列を超えた約５０ｎＭの濃度のオリゴヌクレオチド配列であり得る。

【0020】

本明細書で使用される場合、「相補的」は、所与の配列が、完全にではないとしても、少なくとも部分的に、別の配列に相補的であり、延長された時間及び低い温度のものであるアニーリング条件下でハイブリダイズすることができ、標準条件下でアニール又はハイブリダイズすることが予想されるであろうことを意味する。例えば、標準条件は、約２５℃の温度、約７のｐＨの水溶液中の約１５０ｍＭのナトリウムイオン濃度と、他の配列を超えた約５０ｎＭの濃度のオリゴヌクレオチド配列であり得る。

【0021】

本開示のシステム及び方法の一般原則は、第１の分析物結合領域を介して分析物に安定的に結合することができ、複数のサプレッサーを含むシグナル領域を含む、第１のプローブを含む。第２のプローブは、分析物が第１のプローブに結合している場合、分析物に（又は第１のプローブに）一過的に結合することができ、サプレッサーのうち１個以上を直接的に又は間接的に除去又は分解することができる。ある特定の態様では、シグナル領域は、標識プローブをさらに含むことができ、標識プローブのシグナルは、結合されたサプレッサーによって防止され、サプレッサーの除去又は分解は、標識プローブの検出を可能にすることができる。限定ではなく例として、サプレッサーの除去又は分解は、フルオロフォアを脱クエンチング（ｄｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）することにより、標識プローブの検出を可能にすることができる。ある特定の他の態様では、サプレッサーの除去又は分解は、シグナル領域への標識プローブの結合を可能にし、第１のプローブに結合した標識プローブの検出を可能にすることができる。この状況下であっても、サプレッサーは、同じ第１のプローブに結合する標識からの蛍光を抑制するためのクエンチャーで標識されていてよく、これにより、全て（又はほぼ全て）のサプレッサーの除去が、第１のプローブに結合する蛍光標識からの最大限に明るいシグナルのために要求される。換言すると、サプレッサー除去は、１個以上のクエンチャーを除去すると共に、１個以上の標識プローブのその後の結合を可能にすることができ、これらは両者共に、蛍光シグナルの蓄積に寄与するであろう。よって、システム及び方法は、分析物への又は分析物に結合した第１のプローブ（複数可）への第２のプローブの反復した結合によるシグナル増幅を達成する。この増幅は、必ずしも酵素によるものではないが、標識プローブと併せて又はその一部として、限定ではなく例として、サプレッサーの分解若しくは除去又はシグナルの生成などの特異的な機能のための酵素を任意選択的に組み込むことができる。

【0022】

図１に示す通り、本開示の例示的なシステムは、少なくとも１個の分析物１６と安定的に結合することができる第１の分析物結合領域１２及び複数のサプレッサー１８と会合するシグナル領域１４を含む、第１のプローブ１０を含むことができる。第２のプローブ２０は、分析物１６に一過的に結合することができる第２の分析物結合領域２２、及び１個以上のサプレッサー１８を直接的に又は間接的に除去又は分解することができるサプレッサー相互作用領域２４を含む。標識プローブ３０は、シグナルを生成することができ、１個以上のサプレッサー１８の除去若しくは分解後にシグナル領域１４と会合することができる、又はシグナル領域に存在することができ、シグナル領域において、サプレッサー１８は、除去又は分解されるまで、標識プローブ３０からのシグナルを防止する。いくつかのサプレッサー１８が除去された場合であっても、残っているサプレッサー１８は、第１のプローブと会合したいかなる標識プローブ３０からのシグナルも防止又は低減することができる。

【0023】

図２のケース１は、第１のプローブ１０が、少なくとも１個の分析物１６に結合するための第１の分析物結合領域１２及び複数のサプレッサー１８と会合するシグナル領域１４を含む、本開示の例示的なシステム及び方法をさらに描写する。第２の分析物結合領域２２及びサプレッサー相互作用領域２４を含む第２のプローブ２０は、第１の分析物結合領域１２からの分析物１６の解離と比べて迅速に、第２の分析物結合領域２２を介して分析物に結合し、サプレッサー１８のうち１個以上を直接的に又は間接的に除去又は分解することができる。この結合は、有意に第２のプローブ２０の局所的濃度を増加させ、第１のプローブと会合した分析物に結合していない第２のプローブによるサプレッサー除去又は分解の速度と比べて、第１のプローブと会合した分析物に結合した第２のプローブによるサプレッサー除去又は分解の速度を増加させることができる。第１の分析物結合領域と分析物との間よりも一過的な、第２の分析物結合領域と分析物との間の相互作用を有することにより、サプレッサーの多重のコピーが、第１のプローブと会合した分析物への多重の第２のプローブの連続的結合によって迅速に除去され得、これにより、後述する通り分析物の非存在下よりも激しいシグナルがもたらされ得る。１個以上のサプレッサー１８を除去することにより、結合部位が、標識プローブ３０のために露出され、次いで標識プローブ３０は、サプレッサーが除去された箇所に結合することができ、次いでシグナル検出のために使用され得る。図２のケース２に示す通り、分析物の非存在下では、第２のプローブ２０の局所的濃度が、第２の分析物結合領域２２を介した分析物１６へのその結合によって増強されないため、第２のプローブ２０によるサプレッサー１８の除去は遅く、これにより、低強度シグナルを生じる遅く非効率的な反応がもたらされる。各第２のプローブは、１個以上のサプレッサーを除去又は分解することができるが、分析物への反復した第２のプローブ結合及び分析物に結合していない第１のプローブへの第２のプローブの非効率的な結合の間の最良の区別を確実にするために、第２のプローブの異なるコピーの多重の連続的結合事象が、最大限に激しいシグナルのために要求されるように、各第２のプローブは、第１のプローブ上に存在する少数のサプレッサーのみを除去するべきである。

【0024】

したがって、分析物の検出は、第１のプローブが、ある特定の最小数のサプレッサーが除去されたかについて決定することにより達成され得る。さらに、分析物と会合した第１のプローブのコピーの数は、分析物の濃度に比例することが予想され、第１のプローブが、分析物と比べて過剰に存在すると仮定するため、ある特定の最小のサプレッサーが除去された第１のプローブのコピーの数を計数する又は他の仕方で定量化することは、分析物を定量化するための機構を提供することができる。

【0025】

図２のケース１及びケース２の両方は、各第１のプローブから除去されたサプレッサーの数に関して分布（例えば、ポアソン若しくは二項分布又は他の分布）をもたらすであろうが、第１のプローブから除去されたサプレッサーの平均数は、ケース１及びケース２で別個のものとなるであろう。例えば、ケース１が、各第１のプローブからの平均で２０コピーのサプレッサーの除去又は分解をもたらすが、ケース２が、各第１のプローブからの平均で僅か２コピーのサプレッサーの除去又は分解をもたらし、両方のケースが、除去又は分解されたサプレッサーのコピー数に関してポアソン統計を示す場合、１コピーの第１のプローブからの少なくとも２０コピーのサプレッサーの除去が、分析物の非存在下では僅か６．４×１０^－１２％の確率で起こるが、分析物の存在下では＞５０％の確率で起こることが予測される。したがって、２０コピーのサプレッサーが除去された１コピーの第１のプローブの検出は、ケース２（分析物の非存在）から生じた可能性が低く、ケース１（分析物の存在）から生じた非常に可能性が高い。

【0026】

よって、本開示の一般原則は、第１の分析物結合領域、及び多重のサプレッサーを有するシグナル領域を含む第１のプローブを含むシステムとして記載され得、第１の分析物結合領域は、分析物（又は分析物に結合した場合の第１のプローブ）と一過的に会合することができる第２のプローブよりも安定的に分析物と会合することができ、第２のプローブは、分析物（又は分析物に結合した場合の第１のプローブ）に結合し、十分な長さの時間後にサプレッサーのうち１個以上を直接的に又は間接的に除去又は分解することができ、それに続いて、好適な検出方法によるサプレッサーの除去の検出が為され、例えば、限定ではなく例として、シグナル領域と会合したフルオロフォアシグナルを検出させるための第１のプローブのシグナル領域からのクエンチャー（サプレッサー）の除去など、１個以上のサプレッサーを除去し、１個以上のサプレッサーが除去された箇所に結合することができる標識を加えた後に、第１のプローブのシグナル領域からのシグナルを識別可能にすること、又は１個以上のサプレッサーの除去を検出するための他の好適な方法、又は例えば、ゲル電気泳動若しくはカラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、サイズ排除、ゲル濾過、逆相、ＨＰＬＣ又はＦＰＬＣ）によって検出可能な移動度シフトによって又は動的光散乱によって測定される正味電荷、質量、電荷／質量比又は流体力学半径の変化などの第１のプローブの特性の変化を検出するための他の好適な方法、又は上述の特性の１種以上の変化を検出することができる他のいずれかの技法が為される。例えば、各サプレッサーが、大きい分子量（例えば、分子量＞１，０００ダルトンを有するポリエチレングリコール又は他のポリマー）又は大きい流体力学半径（例えば、強固な二本鎖ＤＮＡ＞１０ナノメートルの長さ）又は第１のプローブの残りと有意に異なる電荷／質量比（例えば、複合体が全体的な負又は中性電荷を有する同じｐＨで正味の正電荷を有するポリヒスチジンなどのポリマー）を有する部分に連結された場合、各サプレッサーの除去は、第１のプローブ複合体の全体的な質量及び／若しくは流体力学半径を低減させる、又はその正味電荷若しくは電荷／質量比を有意に変更するであろう；この変化は、サプレッサーの除去後に第１のプローブの電気泳動移動度の変化をもたらし、これは、アガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出され得る。限定ではなく例として、約２，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールスペーサーに連結された約２０コピーの標識プローブに結合した第１のプローブ（すなわち、以前のインキュベーションステップにおいて分析物に結合した第１のプローブ）は、約２コピーの同じ標識プローブに結合した第１のプローブ（すなわち、以前のインキュベーションステップにおいて分析物に結合していない第１のプローブ）よりも約３６，０００ダルトン大きい全体的なモル質量を有するであろう。分子量のそのような差は、トリス－ホウ酸塩－ＥＤＴＡなどの好適なランニング緩衝剤中で約１０Ｖ／ｃｍで２０～３０分間泳動された５～１０％ポリアクリルアミドゲルにおける第１のプローブの移動度の差によって検出され得る。そのような実験において、多重のコピーのポリエチレングリコールスペーサーを有するシフトしたバンドの存在（したがって、分析物の存在）は、例えば、フルオロフォア又は放射性同位元素、例えば、リン－３２又はイオウ－３５を有する標識プローブの使用によって、また、適切な蛍光測定（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）、放射測定又はリン光測定（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）イメージャ又はスキャナを使用して高感度に検出して、分析物の非存在下である以外は同一の又はほぼ同一の条件下でインキュベートされた第１のプローブを表す対照バンドと比べてシフトしたバンドを検出することができる。一般に、第１のプローブの移動度はまた、混合物中に存在し得る個々の過剰な標識プローブの移動度とも異なるであろうが、多重の標識プローブに結合した第１のプローブよりもはるかに低い分子量のものであろう。その代わりに、１個以上のサプレッサーの除去は、大きい分子量、大きい流体力学半径又は第１のプローブとは有意に異なる電荷／質量比を有する部分に連結された標識プローブのために１個以上の結合部位を露出することができる；共通の第１のプローブへの多重のそのような標識プローブの結合は、第１のプローブ複合体の質量及び／若しくは流体力学半径の有意な増加をもたらし、又は第１のプローブ複合体の正味電荷若しくは電荷／質量比を有意に変更し、標識の結合後の第１のプローブの電気泳動移動度の変化をもたらすであろう。

【0027】

本開示のシステム及び方法のための一般設計検討事項は、シグナル領域からの多重のコピーのサプレッサーの除去又は分解が、分析物の存在下で、その非存在下よりも効率的であることの要求であり得る。この効率差を達成するために、次の（ｆｏｌｌｏｗ）条件が満たされ得る：（１）第２のプローブ及び分析物（又は第２のプローブ及び分析物に結合した場合の第１のプローブ）の間の相互作用は、多重のコピーの第２のプローブが、実験の時間枠内で各コピーの分析物（又は分析物に結合した第１のプローブ）に結合しそれから解離することができる、十分に速い結合及び解離の速度定数を有するべきである；（２）第２のプローブが、分析物に（又は分析物に結合した場合の第１のプローブに）結合している場合、シグナル領域からの１個以上のサプレッサーの除去は、第２のプローブが、分析物に（又は第１のプローブに）結合していない場合よりもはるかに効率的となるべきであり、例えば、分析物（又は第１のプローブ）と第２のプローブとの会合は、シグナル領域からのサプレッサーの除去を加速することができる、第２のプローブのバルク濃度よりも＞１０、＞１００又は＞１０００倍高い、会合しているシグナル領域に近接した第２のプローブの局所的有効濃度を産生することができる；（３）分析物（又は分析物に結合した場合の第１のプローブ）への第２のプローブの結合は、第２のプローブが解離前に高い確率で１個以上のサプレッサーを除去又は分解するのに十分な時間がある、十分に高い親和性で起こるべきである；並びに（４）分析物が第１の分析物結合領域から解離する前に、多重の逐次コピーの第２のプローブが、分析物及び第１のプローブの同じ複合体に結合することが可能となるように、第１の分析物結合領域からの分析物の解離の速度定数は、分析物（又は分析物に結合した場合の第１のプローブ）からの第２のプローブの解離の速度定数よりも有意に遅くあるべきである。

【0028】

システム
一部の実施形態では、複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、シグナル領域が、複数のサプレッサー及び複数の標識プローブと会合しており、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止する、複数の第１のプローブ；並びに複数の第２のプローブであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ；分析物が、第１のプローブの第１の分析物結合領域に結合している間に、第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に結合することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、第２のプローブのうち１個が、第１のプローブのうち１個に結合した分析物に結合する場合、サプレッサーのうち１個以上が、第１のプローブから除去され得る又は分解され得、十分な数のサプレッサーの除去又は分解後に、複数の標識プローブから生じるシグナルが、分析物の非存在下で第１のプローブから生じるシグナルから識別可能となる、複数の第２のプローブを含むことができる分析物検出システムが提供される。

【0029】

一部の実施形態では、複数の第１のプローブであって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、シグナル領域が、複数のサプレッサーと会合している、複数の第１のプローブ；複数の第２のプローブであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、分析物が、第１のプローブの第１の分析物結合領域に結合している間に、第２のプローブの第２の分析物結合領域が、分析物に結合することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、第２のプローブのうち１個が、第１のプローブのうち１個に結合している間の分析物に結合する場合、サプレッサーのうち１個以上が、第１のプローブから除去され得る又は分解され得る、複数の第２のプローブ；並びに複数の標識プローブであって、各標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に対する親和性を有し、１個以上のサプレッサーの除去又は分解後に、１個以上の標識プローブが、第１のプローブのシグナル領域に結合することができる、複数の標識プローブを含むことができる分析物検出システムが提供される。

【0030】

上述の実施形態のいずれかでは、第１のプローブの分析物結合領域及びシグナル領域が、平面の表面、マイクロ粒子又はナノ粒子などの固体支持体におけるそれらの近接により互いと間接的に会合していた別個の分子実体であり得ることが理解されるべきである。例えば、分析物結合領域は、ストレプトアビジンコーティングされた表面に結合されたビオチン化捕捉用オリゴヌクレオチドを含むことができ、シグナル領域は、サプレッサーオリゴヌクレオチドにおける配列に相補的である複数のサプレッサー結合配列を含む別々のビオチン化オリゴヌクレオチドを含むことができる。この例では、第２のプローブが、捕捉用オリゴヌクレオチドに結合した分析物と会合する際に、第１のプローブのシグナル領域に結合されたサプレッサーと相互作用するのに十分に近近接することができるように、捕捉用オリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチドのための結合部位は、互いの１００ナノメートル以内、より好ましくは、互いの２０ナノメートル以内となるべきである。

【0031】

一部の実施形態では、分枝状シグナル領域構造が使用され得る。上述の例を参照すると、別々のビオチン化オリゴヌクレオチドは、代わりに、複数の第３のオリゴヌクレオチドに存在する配列に相補的である複数の配列を含むことができる。この例では、第３のオリゴヌクレオチドは、別々のビオチン化オリゴヌクレオチドに相補的な第１の配列、及びサプレッサー結合領域（この例では、サプレッサーは、オリゴヌクレオチドである）を表す第２の配列を含み、第２の配列は、別々のビオチン化オリゴヌクレオチドに相補的ではない。このようにして、図２６のパネルＢに示す通り、別々のビオチン化オリゴヌクレオチドと会合している多重の第３のオリゴヌクレオチドが存在する。

【0032】

本技術の実施形態は、分析物を検出するためのシステムに関する。例えば、一部の実施形態では、本技術は、本明細書に記載されている１種以上の標的分析物を定量化するためのシステムであって、本明細書に記載されている分析物結合領域、シグナル伝達領域、サプレッサー及び任意選択的な標識プローブを含む第１のプローブ、並びに本明細書に記載されているサプレッサー相互作用領域を含む第２のプローブを含むシステムを提供する。さらに、一部のシステム実施形態は、存在するのであれば分析物を含む試料と第１のプローブ及び第２のプローブのインキュベーション後に、第１のプローブからのシグナルを記録する検出構成成分を含む。例えば、一部の実施形態では、検出構成成分は、例えば、分析物と第１のプローブ及び第２のプローブとの相互作用後に、第１のプローブから産生されたシグナルを記録する。一部の実施形態では、検出構成成分は、複数の標識プローブを含む第１のプローブによって提供されるシグナルの強度を記録する。

【0033】

システム実施形態は、シグナル（例えば、複数の標識プローブを含む第１のプローブからの）を処理し、分析物を含む試料として試料を同定するための分析プロセス（例えば、マイクロプロセッサーに分析プロセスを実行するように指示する、例えば、ソフトウェアにおいてコードされた、命令のセットにおいて具体化された）を含むことができる。一部の実施形態では、分析プロセスは、複数の標識プローブを含む第１のプローブによって産生されたシグナルの強度を入力データとして使用する。一部の実施形態では、分析プロセス、例えば、限定ではなく例として、正規化又は平坦化アルゴリズムは、測定器具における公知バイアスによって引き起こされるシグナルレベルの体系的変動、例えば、限定ではなく例として、顕微鏡視野にわたる蛍光励起の強度の変動を補正する。一部の実施形態では、システムは、分析物を含む。システムの実施形態は、検出される分析物に限定されない。例えば、一部の実施形態では、分析物は、ポリペプチド、例えば、タンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、標的分析物は、核酸である。一部の実施形態では、標的分析物は、本明細書に記載されている小分子、代謝物、金属イオン、生体分子、又は他の分子若しくは実体である。

【0034】

本技術の一部のシステム実施形態は、分析物の検出及び定量化のための構成成分を含む。一部のシステム実施形態は、第１のプローブのシグナル領域と会合した標識プローブのシグナル伝達構成成分を励起するための照明構成を含む蛍光顕微鏡である検出構成成分を含む。一部の実施形態は、蛍光検出器、例えば、強化電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、電子増倍電荷結合素子（ＥＭ－ＣＣＤ）、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を含む検出器、及び／又は単一の発色団からの蛍光放出を検出することができる別の検出器を含む。一部の特定の実施形態は、レンズのないイメージングのために構成された構成成分、例えば、レンズのない顕微鏡、例えば、レンズを使用することなく検出器（例えば、ＣＭＯＳ）において直接的にイメージングするための検出及び／又はイメージング構成成分を含む。

【0035】

一部の実施形態は、コンピュータ、並びにコンピュータが、データ取得及び／又はデータを処理するための分析プロセスを実行する、例えば、制御するための命令をコードするソフトウェアを含む。

【0036】

一部の実施形態は、例えば、波長の特異的な範囲又は波長の多重の範囲内で選択的に蛍光を検出するための、光学、例えば、レンズ、鏡、ダイクロイックミラー、光学フィルターなどを含む。

【0037】

例えば、一部の実施形態では、コンピュータに基づく分析ソフトウェアは、検出アッセイによって生成された生データ（例えば、１種以上の分析物の存在、非存在又は量）を臨床医のために予測値のデータへと翻訳するために使用される。臨床医は、いずれか好適な手段を使用して予測データにアクセスすることができる。

【0038】

一部のシステム実施形態は、それにより本技術の実施形態が実施され得る、コンピュータシステムを含む。様々な実施形態では、コンピュータシステムは、情報を通信するためのバス又は他の通信機構、及び情報を処理するためのバスと繋がれたプロセッサーを含む。様々な実施形態では、コンピュータシステムは、バスに繋がれた、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）又は他の動的記憶デバイスであり得るメモリ、及びプロセッサーによって実行されるべき命令を含む。メモリはまた、プロセッサーによって実行されるべき命令の実行中にテンポラリ変数又は他の中間情報を記憶するために使用され得る。様々な実施形態では、コンピュータシステムは、プロセッサーのための静的情報及び命令を記憶するための、バスに繋がれたリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）又は他の静的記憶デバイスをさらに含むことができる。情報及び命令を記憶するために、記憶デバイス、例えば、磁気ディスク又は光ディスクが提供され、バスに繋がれてよい。

【0039】

様々な実施形態では、コンピュータシステムは、バスを介して、コンピュータ使用者に情報をディスプレイするためのディスプレイ、例えば、陰極線管（ＣＲＴ）又は液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）に繋がれる。英数字及び他のキーを含む入力デバイスは、プロセッサーに情報及びコマンド選択を通信するためのバスに繋がれてよい。別の種類の使用者入力デバイスは、プロセッサーに指示情報及びコマンド選択を通信し、ディスプレイにおけるカーソル動作を制御するための、カーソル制御、例えば、マウス、トラックボール又はカーソル指示キーである。この入力デバイスは典型的に、第１の軸（例えば、ｘ）及び第２の軸（例えば、ｙ）である２つの軸における２つの自由度を有し、これは、デバイスが平面における位置を指定することを可能にする。

【0040】

コンピュータシステムは、本技術の実施形態を実行することができる。本技術のある特定のインプリメンテーションと一致して、結果は、メモリに含有される１個以上の命令の１個以上のシーケンスを実行するプロセッサーに応答してコンピュータシステムによって提供され得る。そのような命令は、別のコンピュータ可読媒体、例えば、記憶デバイスからメモリへと読み込まれ得る。メモリに含有される命令のシーケンスの実行は、プロセッサーに、本明細書に記載されている方法を実行させることができる。その代わりに、ハードワイヤード回路が、本教示を実施するために、ソフトウェア命令の代わりに又はそれと組み合わせて使用され得る。よって、本技術のインプリメンテーションは、ハードウェア回路及びソフトウェアのいかなる特異的な組合せにも限定されない。

【0041】

用語「コンピュータ可読媒体」は、本明細書で使用される場合、実行のためにプロセッサーへの命令の提供に関与するいずれかの媒体を指す。そのような媒体は、不揮発性媒体、揮発性媒体及び伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態を取ることができる。不揮発性媒体の例は、光又は磁気ディスク、例えば、記憶デバイスを含むことができるがこれらに限定されない。揮発性媒体の例は、動的メモリを含むことができるがこれらに限定されない。伝送媒体の例は、バスを含むワイヤを含む同軸ケーブル、銅線及び光ファイバーを含むことができるがこれらに限定されない。

【0042】

コンピュータ可読媒体の一般的な形態は、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、フラッシュ媒体、磁気テープ又は他のいずれかの磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、他のいずれかの光媒体、パンチカード、ペーパーテープ、孔のパターンを有する他のいずれかの物理的媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、他のいずれかのメモリチップ若しくはカートリッジ、又はコンピュータが読み取ることができる他のいずれかの有形媒体を含む。

【0043】

コンピュータ可読媒体の様々な形態は、実行のためにプロセッサーに１個以上の命令の１個以上のシーケンスを運ぶことに関与し得る。例えば、命令は最初に、リモートコンピュータの磁気ディスクにおいて運ばれ得る。リモートコンピュータは、その動的メモリへと命令をロードし、ネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネット、電話回線）にわたり命令を送ることができる。ローカルコンピュータシステムは、データを受け取り、それをバスに伝送することができる。バスは、データをメモリに運ぶことができ、そこから、プロセッサーは、命令を回収及び実行する。メモリによって受け取られた命令は、任意選択的に、プロセッサーによる実行の前又は後のいずれかで、記憶デバイスにおいて記憶され得る。

【0044】

様々な実施形態に従って、方法を実行するプロセッサーによって実行されるように構成された命令は、コンピュータ可読媒体において記憶される。コンピュータ可読媒体は、デジタル情報を記憶するデバイスであり得る。例えば、コンピュータ可読媒体は、ソフトウェアを記憶するための、当技術分野で公知の通りのコンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）を含む。コンピュータ可読媒体は、実行されるように構成された命令の実行に好適なプロセッサーによってアクセスされる。

【0045】

そのようなコンピュータシステムに従って、本明細書に提供される本技術の一部の実施形態は、データ（例えば、分析物の存在、非存在、濃度）を収集、記憶及び／又は分析するための機能性をさらに含む。例えば、一部の実施形態は、例えば、命令を記憶及び実行し、標識シグナル、シグナル強度及び／又は検出データを分析し、データを使用して計算を実行し、データを転換し、データを記憶するための、プロセッサー、メモリ及び／又はデータベースを含むシステムを考慮する。一部の実施形態では、アルゴリズムは、統計モデルをデータに適用する。

【0046】

多くの診断法は、１種以上の核酸の存在又はそのヌクレオチド配列の決定を伴う。

【0047】

一部の実施形態では、１種以上の分析物の存在、非存在、濃度、量又は配列特性を表す変数を含む方程式は、診断を下す又は分析物の存在若しくは品質を評価することにおける用途を見出す値を産生する。したがって、一部の実施形態では、この値は、デバイスによって、例えば、結果に関する指標（例えば、ＬＥＤ、ディスプレイ上のアイコン、音その他）によって提示される。一部の実施形態では、デバイスは、値を記憶する、値を伝送する、又は追加の計算のために値を使用する。一部の実施形態では、方程式は、１種以上の分析物の存在、非存在、濃度、量又は特性を表す変数を含む。

【0048】

よって、一部の実施形態では、本技術は、分析的アッセイにおいて訓練された可能性が低い臨床医が、生データを理解する必要がないという、さらなる利益を提供する。データは、その最も有用な形態で臨床医に直接的に提示される。一部の実施形態では、次いで臨床医は、対象のケアを最適化するために情報を利用することができる。本技術は、アッセイを行う研究室、情報提供者、医療関係者（ｐｅｒｓｏｎａｌ）及び／又は対象の間で、情報を受け取り、処理し、伝送することができるいずれかの方法を考慮する。例えば、本技術の一部の実施形態では、試料は、対象から得られ、世界のいずれかの一部（例えば、対象が住んでいる又は情報が最終的に使用される国とは異なる国）に位置するプロファイリングサービス（例えば、医療施設における臨床研究室、ゲノムプロファイリング事業など）に提出されて、生データが生成される。試料が、組織又は他の生体試料を含む場合、対象は、医療センターを訪問して、試料を得て、プロファイリングセンターに送ることができる、又は対象は、自身で試料を収集し、それをプロファイリングセンターに直接送ることができる。試料が、以前に決定された生物学的情報を含む場合、情報は、対象によってプロファイリングサービスに直接送られてよい（例えば、情報を含有する情報カードが、コンピュータによってスキャンされ、データが、電子通信システムを使用してプロファイリングセンターのコンピュータに伝送され得る）。プロファイリングサービスによって受け取られたら、試料が処理され、対象に望まれる診断又は予後情報に特異的なプロファイルが産生される。次いで、プロファイルデータが、処置担当の臨床医による解釈に好適なフォーマットで用意される。例えば、生データを提供するよりもむしろ、用意されたフォーマットは、特定の処置選択肢の推奨と共に、対象の診断又はリスク評価を表すことができる。データは、いずれか好適な方法によって臨床医にディスプレイされ得る。例えば、一部の実施形態では、プロファイリングサービスは、臨床医のために印刷されても（例えば、ポイントオブケアにおいて）、コンピュータモニタにおいて臨床医にディスプレイされてもよい報告を生成する。一部の実施形態では、情報は先ず、ポイントオブケア又は地域の施設において分析される。次いで生データは、さらなる分析のために及び／又は生データを臨床医若しくは患者に有用な情報に変換するために、中央処理施設に送られる。中央処理施設は、データ分析のプライバシー（全データは、均一なセキュリティープロトコールで中央施設において記憶される）、スピード及び均一性の利点を提供する。次いで中央処理施設は、対象の処置後のデータの運命を制御することができる。例えば、電子通信システムを使用して、中央施設は、臨床医、対象又は研究者にデータを提供することができる。一部の実施形態では、対象は、電子通信システムを使用してデータにアクセスすることができる。対象は、結果に基づきさらなる介入又はカウンセリングを選ぶことができる。一部の実施形態では、データは、研究用途に使用される。例えば、データは、疾患に関連する特定の状態の有用な指標としてのマーカーの包含又は排除をさらに最適化するために使用され得る。

【0049】

分析物
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物は、本開示のシステム及び方法を使用する検出のための任意の好適な分子であり得る。例として、限定されるものではないが、分析物は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、生物学的に誘導されたＤＮＡ配列若しくはＤＮＡ断片、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、生物学的に誘導されたＲＮＡ配列若しくはＲＮＡ断片、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、炭水化物、例えば、多糖若しくはオリゴ糖、低分子若しくは代謝産物、又はそれらの組合せであり得る。さらなる例として、限定されるものではないが、分析物は、リボヌクレオタンパク質、リボソーム、ウイルス粒子、ＤＮＡ配列に結合したＤＮＡ結合タンパク質、タンパク質及び脂質（リポタンパク質）、又はタンパク質及び炭水化物（プロテオグリカン、糖タンパク質）を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物が核酸である場合、分析物は、例として、限定されるものではないが、単一ヌクレオチド多型、単一ヌクレオチド突然変異、１個以上のヌクレオチドを含む挿入突然変異、１個以上のヌクレオチドを含む欠失突然変異、１個以上のヌクレオチドを含む置換突然変異、脱塩基部位、一本鎖若しくは二本鎖破壊、又は５－メチルシトシン、Ｎ^６－メチルアデノシン若しくは他の化学的改変などの化学的改変を保持する１個以上のヌクレオチドなどの配列バリアントを含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物が、例として、限定されるものではないが、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、生物学的に誘導されたＤＮＡ配列若しくはＤＮＡ断片、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、生物学的に誘導されたＲＮＡ配列若しくはＲＮＡ断片などの核酸である又は核酸を含む場合、分析物は、任意の好適な長さを有することができる。例として、限定されるものではないが、そのような実施形態において、分析物の核酸構成成分は、約１～約５００ヌクレオチド、約１～約４００ヌクレオチド、約１～約３００ヌクレオチド、約１～約３００ヌクレオチド、約１～約２００ヌクレオチド、約１～約１００ヌクレオチド、約１～約５０ヌクレオチド、約１～約４０ヌクレオチド、約１～約３０ヌクレオチド、約１～約２５ヌクレオチド、約１～約２０ヌクレオチド、約１～約１０ヌクレオチド、約５～約５００ヌクレオチド、約５～約４００ヌクレオチド、約５～約３００ヌクレオチド、約５～約２００ヌクレオチド、約５～約１００ヌクレオチド、約５～約５０ヌクレオチド、約５～約４０ヌクレオチド、約５～約３０ヌクレオチド、約５～約２５ヌクレオチド、約５～約２０ヌクレオチド、約５～約１０ヌクレオチド、約１０～約５００ヌクレオチド、約１０～約４００ヌクレオチド、約１０～約３００ヌクレオチド、約１０～約２００ヌクレオチド、約１０～約１００ヌクレオチド、約１０～約５０ヌクレオチド、約１０～約４０ヌクレオチド、約１０～約３０ヌクレオチド、約１０～約２５ヌクレオチド、約１０～約２０ヌクレオチド、約２０～約５００ヌクレオチド、約２０～約４００ヌクレオチド、約２０～約３００ヌクレオチド、約２０～約２００ヌクレオチド、約２０～約１００ヌクレオチド、約２０～約５０ヌクレオチド、約２０～約４０ヌクレオチド、約２０～約３０ヌクレオチド、約２０～約２５ヌクレオチド、約２５～約５００ヌクレオチド、約２５～約４００ヌクレオチド、約２５～約３００ヌクレオチド、約２５～約２００ヌクレオチド、約２５～約１００ヌクレオチド、約２５～約５０ヌクレオチド、約２５～約４０ヌクレオチド、約２５～約３０ヌクレオチド、約３０～約５００ヌクレオチド、約３０～約４００ヌクレオチド、約３０～約３００ヌクレオチド、約３０～約２００ヌクレオチド、約３０～約１００ヌクレオチド、約３０～約５０ヌクレオチド、約３０～約４０ヌクレオチド、約４０～約５００ヌクレオチド、約４０～約４００ヌクレオチド、約４０～約３００ヌクレオチド、約４０～約２００ヌクレオチド、約４０～約１００ヌクレオチド、約４０～約５０ヌクレオチド、約５０～約５００ヌクレオチド、約５０～約４００ヌクレオチド、約５０～約３００ヌクレオチド、約５０～約２００ヌクレオチド、約５０～約１００ヌクレオチド、約１００～約５００ヌクレオチド、約１００～約４００ヌクレオチド、約１００～約３００ヌクレオチド、約１００～約２００ヌクレオチド、約２００～約５００ヌクレオチド、約２００～約４００ヌクレオチド、約２００～約３００ヌクレオチド、約３００～約５００ヌクレオチド、約３００～約４００ヌクレオチド、約４００～約５００ヌクレオチド、約１、５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００以上のヌクレオチドの長さを有することができる。さらなる例として、限定されるものではないが、分析物は、メッセンジャーＲＮＡ、プレ－メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、細胞外ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、プライマリーマイクロＲＮＡ、プレ－マイクロＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、長鎖介在性ノンコーディングＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、トランス－腎ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、細胞外ＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ、トランス－腎ＤＮＡ又はウイルスＤＮＡであり得る。

【0050】

本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、分析物は、１フェムトモル濃度程度の低い濃度で試料中に存在してよい。分析物が核酸である実施形態において、分析物は、１フェムトモル濃度程度の低い濃度で混合試料中に存在してよく、ここで、試料は、１フェムトモル濃度過剰、一部の実施形態において、１ミリリットルあたり１ピコグラム過剰の濃度の非標的分析物を含み、分析物及び非標的分析物は、単一ヌクレオチド置換によってのみ異なる。この実施形態において、本システム、方法及びキットを使用して、そのような試料中の分析物の存在を選択的に決定することができる。

【0051】

分析物が、第１の分析物結合領域及び／又は第２の分析物結合領域が結合することができる別の構成成分にカップリングされ得ることが理解されるべきである。例として、限定されるものではないが、分析物は、ストレプトアビジンとのカップリングのために、ビオチンにコンジュゲートされ得る。あるいは、例として、限定されるものではないが、分析物がオリゴヌクレオチドを含む場合、本明細書に開示される捕捉オリゴヌクレオチドは、分析物に直接的に結合し得る。あるいは、例として、限定されるものではないが、分析物が、ペプチド、炭水化物、エピジェネティック改変若しくは翻訳後改変を含む又はそれらである場合、本明細書に開示される捕捉抗体は、分析物に直接的に結合し得る。一部の例は、ビオチン化又はそうでなければ表面と相互作用を可能にするように改変された分析物を実証したが、上記で論じられたように、本発明によって必要とされず、分析物が核酸である例において、マイクロ粒子、ナノ粒子若しくは平面と会合する又は会合することができる捕捉オリゴヌクレオチドが使用されてよいことが理解されるべきである。

【0052】

分析物を含有する試料が、標的分析物よりかなり過剰の濃度の多くの非標的分析物を含んでいてよいことが理解されるべきである。本開示のシステム、方法及びキットを、唾液、血液、尿、精液、細胞抽出物及び他の体液などの生体試料を含むこれらの混合試料中の分析物を検出するために使用することができることも理解されるべきである。

【0053】

この開示全体を通して、本開示のシステム及び方法の要素をカップリングするためにさまざまな化学が使用され得ることが理解されるべきである。例として、限定されるものではないが、これらとしては、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用、金－チオール相互作用、クリックケミストリー試薬対、例えば、アジド＋アルキン及びトランス－シクロオクテン＋テトラジン、カルボン酸及びアミンの間のＥＤＣ－ＮＨＳカップリング、チオール－マレイミドカップリング、アミン－ＮＨＳエステルカップリング、静電相互作用、核酸二重鎖の同軸スタッキング、水素結合相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力などが挙げられ得る。そのような化学及び標準的なカップリング技法は、例として、限定されるものではないが、第１の分析物結合領域、シグナル領域、第１のプローブ、第２のプローブ、標識及び標識プローブ、ナノ粒子並びに固体支持体のカップリングに適用され得る。

【0054】

第１のプローブ
本開示のシステム、キット及び方法は、本明細書に記載される第１のプローブを利用することができる。本開示の実施形態のいずれかにおいて、第１のプローブ又はその複数は、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含むことができる。第１のプローブが、１個以上のシグナル領域及び／又は１個以上の第１の分析物結合領域を含むことができることが理解されるべきである。一例において、各第１のプローブは、単一の第１の分析物結合領域及び複数のシグナル領域を含む。例として、限定されるものではないが、第１のプローブは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれらの間の任意の範囲の、シグナル領域及び／又は第１の分析物結合領域を含むことができる。さらなる例として、限定されるものではないが、第１のプローブは、１０個以上のシグナル領域及び／又は第１の分析物結合領域を含むことができる。

【0055】

本開示の実施形態のいずれかにおいて、第１のプローブは、コロイド粒子、金ナノ粒子などのナノ粒子、脂質ベシクル、表面、表面の領域、水性二相系の相、１個以上のＤＮＡオリゴヌクレオチド、１個以上のＲＮＡオリゴヌクレオチド、１個以上のロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド、１個以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチド、１個以上の抗体若しくは抗体断片、１個以上のアプタマー、１個以上のフルオロフォア若しくは他の発色団、１個以上の反応性化学官能基、又はそれらの組合せを含むことができる。例として、限定されるものではないが、金ナノ粒子は、１０～４０ｎｍの直径を有することができる。さらなる例として、限定されるものではないが、フルオロフォア又は発色団は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７であり得る。またさらなる例として、限定されるものではないが、１個以上の反応性化学官能基は、ＮＨＳエステル、アミン、アルキン、アジド、トランス－シクロオクテン又はテトラジンを含むことができる。前述の構成成分が、第１の分析物結合領域、シグナル領域、その両方、若しくは第１のプローブと会合している標識プローブであり得る又はその一部であり得ることが理解されるべきである。

【0056】

本開示の実施形態のいずれかにおいて、第１のプローブ又はその複数は、固体支持体に結合することができる。ある特定の態様において、固体支持体は、ナノ粒子又はマイクロ粒子である。

【0057】

本開示の実施形態のいずれかにおいて、第１のプローブ又はその複数は、溶液又はコロイド懸濁液中に存在し得る。

【0058】

ナノ粒子、マイクロ粒子又は平面
本開示の実施形態のいずれかにおいて、第１の分析物結合領域、シグナル領域又は各第１のプローブの両方は、ナノ粒子、マイクロ粒子又は平面（まとめて「支持体」）に結合することができる。第１の分析物結合領域及びシグナル領域の両方が支持体に結合されるそのような実施形態において、各第１のプローブの第１の分析物結合領域及びシグナル領域は、支持体上の隣接部位に結合することができる。例として、限定されるものではないが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域は、互いの約１００ｎｍ以内にあり得る。さらなる例として、限定されるものではないが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域は、ナノ粒子上で互いの約１００ｎｍ、約９０ｎｍ、約８０ｎｍ、約７０ｎｍ、約６０ｎｍ、約５０ｎｍ、約４０ｎｍ、約３０ｎｍ、約２５ｎｍ、約２０ｎｍ、約１０ｎｍ以下以内にあり得る。第１の分析物結合領域及びシグナル領域の間の距離が、第２のプローブが分析物（又は第１のプローブ）及びシグナル領域と同時に相互作用することができるのに十分に小さくなければならないことが理解されるべきである。本開示全体を通して使用される場合、隣接が、前述の意味及び範囲を有し得ることが理解されるべきである。例として、限定されるものではないが、支持体は、ナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、磁気ナノ粒子、シリカナノ粒子、リポソーム、脂質ナノディスク、ポリスチレンナノ粒子などのポリマー系ナノ粒子、ビーズなどのマイクロ粒子であり得、ここで、マイクロ粒子は、約１マイクロメートル～約１０マイクロメートル、より好ましくは、約５～１０マイクロメートルの直径を有する。各種類の支持体は、所望の構成成分、例えば、本開示のプローブの共有結合性又は非共有結合性固定化のための異なる表面基を用いて容易に合成することができる。またさらなる例として、限定されるものではないが、支持体は、ＤＮＡ又はＲＮＡナノ構造、例えば、ＤＮＡオリガミ、ＤＮＡナノキューブ、ＤＮＡバレル、ＤＮＡタイル、ＤＮＡブリック、ＲＮＡオリガミ、又はそれらの所望の配列によってガイドされる様式での複雑な二次元若しくは三次元形状へのＤＮＡ若しくはＲＮＡ鎖の自己アセンブリーによって形成される他の類似のナノスケールの構造であり得る。理論に拘束されないが、そのような支持体が、構造への異なる構成成分の部位特異的アンカリングを可能にすること、それが多重の機能的構成成分の相対位置を制御するのを可能にすることによって、本開示のシステム及び方法において特に有利であり得ると予想される。

【0059】

またさらなる例として、限定されるものではないが、第１のプローブのシグナル領域は、シグナル領域がストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介して支持体に結合されるように、ビオチン化され得る。

【0060】

またさらなる例として、限定されるものではないが、第１の分析物結合領域は、捕捉オリゴヌクレオチドの形態であり得る。この例において、捕捉オリゴヌクレオチドがストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介して支持体に結合されるように、捕捉オリゴヌクレオチドはビオチン化され、ここで、第１のプローブのシグナル領域は、支持体上の隣接部位に結合され得る。

【0061】

第１のプローブが、ナノ粒子を介して固体支持体に又は固体支持体に直接的に、さらに結合され得ることが理解されるべきである。例として、限定されるものではないが、そのような連結は、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介してであり得る。

【0062】

第１の分析物結合領域
本開示の前述の実施形態のいずれかにおいて、第１のプローブは、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含むことができる。一部の実例において、第１の分析物結合領域は、第１のプローブから分離され得る。例えば、第１の分析物結合領域は、支持体と会合している捕捉オリゴヌクレオチドであり得、シグナル領域は、上記で論じられたように、近接して、支持体に付着された別々のオリゴヌクレオチドであり得る。別の例において、捕捉オリゴヌクレオチドは、分析物に対して相補的である第１の配列（分析物が核酸である場合）、及び別々のオリゴヌクレオチド上の配列に対して相補的な配列を有する第２の配列（又は複数の第２の配列）を含み得、ここで、別々のオリゴヌクレオチドは、シグナル領域を含む。

【0063】

好ましくは、第２のプローブ及び分析物の間の相互作用は、実験のタイムフレームの間に、第２のプローブの多重のコピーが分析物の各コピーに結合しそれから解離するための十分に速い結合及び解離の速度定数を有していなければならない。

【0064】

第１の分析物結合領域は、分析物に対する親和性を有することができる。第１の分析物結合領域と分析物との間の相互作用は、式：

【0065】

【数1】

に従って、複合体の現在の濃度Ｃに対する、時間に関する分子複合体の濃度の変化の瞬間的な速度のｄＣ／ｄｔに関する比例定数ｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}を指す解離の速度定数によって特徴付けられ得、均質な一次化学反応について、２つ以上の構成に解離する前の個々の複合体の平均滞留時間の逆数に等しい。この速度定数は、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴及び単分子全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法を含むいくつかの確立されたアプローチを使用して測定され得る。ＴＩＲＦ顕微鏡法において、例として、限定されるものではないが、最初に、第１の分析物結合領域を、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用などの好適な固定化化学を介して、カバースリップなどの好適な固体支持体に固定化することができる。次に、Ｃｙ５などの好適なフルオロフォアで標識された分析物は、固体支持体と接触している水溶液に導入され得、好適なインキュベーション期間（例えば、１時間）、第１の分析物結合領域に結合させることができる。次に、分析物溶液が除去され得、好適な緩衝液、例えば、５０μｇ／ｍＬのプロトカテキュ酸－３，４－ジオキシゲナーゼ及び５ｍＭの３，４－ジヒドロキシ安息香酸を含有するものなどの好適な酸素スカベンジャー系を含有するリン酸緩衝生理食塩水が、一定流下で導入され得る。インキュベーション時間の関数としての表面からの分析物の消失は、好適なレーザー源（例えば、６４０ｎｍの連続波レーザー）からの照射下で、好適な検出器（例えば、科学的相補型酸化膜半導体、ｓＣＭＯＳ、センサー）を用いるＴＩＲＦ顕微鏡法によって測定され得、時間の関数としての表面結合分析物からの残ったシグナルは、単一指数関数的減衰関数の形式

【0066】

【数2】

（式中、Ａは、定数であり、ｙは、表面結合分析物からの蛍光シグナルの量であり、ｅは、自然対数の底であり、ｔは、時間である）にフィッティングされ得る。上記の式は、低いバックグラウンドシグナルを伴う一次反応の測定のために好適であるが、当業者には、多重の速度定数（すなわち、多指数方程式）を示す動態学の場合において、又は著しいバックグラウンドシグナルが存在する場合において（すなわち、指数項に追加された定数項を有する方程式）、他の関連する指数方程式が、使用されてよいことが認識される。同じ速度定数が、任意の速度定数が表面化学（例えば、どの結合パートナーが固定化されるかを変更する）又は標識化化学に対する変化によって乱され得るという警告を伴って、表面上の蛍光標識されていない分析物を提示すること、及び代わりに表面からの蛍光標識された第１の分析物結合領域の解離をモニタリングすることによって測定され得ることも理解されるべきである。結合パートナーの組成、緩衝液条件及び温度を含む、可能な限り近い最終アッセイ条件と似ている条件下で任意の関連する速度定数を測定することが好ましい。

【0067】

ある特定の態様において、第１の分析物結合領域への分析物の結合は、安定として特徴付けられ得る。この「安定性」が、第１の分析物結合領域と分析物との間対第２の分析物結合領域と分析物との間の解離のより遅い速度を指すことが理解されるべきである。前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の分析物結合領域と分析物との間の親和性は、第２の分析物結合領域と分析物との間よりも１０倍遅い解離の速度定数を含むことができる。例として、限定されるものではないが、第１の分析物結合領域と分析物との間の親和性は、第２の分析物結合領域と分析物との間よりも少なくとも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍又は１００倍遅い解離の速度定数を含むことができる。

【0068】

本開示の実施形態のいずれかにおいて、第１の分析物結合領域が、分析物に十分に結合することができる任意の領域であり得ることが理解されるべきである。例として、限定されるものではないが、分析物が核酸である場合、第１の分析物結合領域は、分析物のオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片に対して相補的である核酸配列を含むことができ、あるいはジンクフィンガードメイン、デッドＣａｓ９酵素（ｄＣａｓ９）、リボヌクレオタンパク質複合体又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質ドメインなどのＤＮＡ又はＲＮＡ結合タンパク質を含むことができる。さらなる例として、限定されるものではないが、分析物が、タンパク質、ペプチド又はオリゴペプチドである場合、第１の分析物結合領域は、第１の抗体若しくはその断片、核酸若しくはペプチドアプタマー、又は分析物に対する親和性を有する分析物のリガンドなどの第１の結合パートナーを含むことができる。そのような実施形態において、第１の分析物結合領域は、支持体に結合され得、第１のプローブのシグナル領域は、隣接部位で支持体に結合され得る。さらなる例として、限定されるものではないが、分析物がビオチンなどの別の構成成分と会合している場合、第１の分析物結合領域は、分析物、例えば、ビオチン化分析物の場合において、ストレプトアビジンと会合している構成成分と会合することができる。あるいは、第１の分析物結合ドメインは、ビオチン化されているビオチン化捕捉オリゴヌクレオチドを含み得る。この捕捉オリゴヌクレオチドは、第１のプローブのシグナル領域、又はシグナル領域を持つ別々のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする配列をさらに含み得る。ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を用いる本開示の任意の実施形態において、高い親和性及び特異性でビオチンと相互作用する他の関連タンパク質、例えば、アビジン及びニュートラアビジンが、ストレプトアビジンの代わりに置換され得ることが理解されるべきである。例として、限定されるものではないが、第１の分析物結合領域は、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介してナノ粒子に結合され得、ここで、第１の分析物結合領域はビオチン化され、ナノ粒子はストレプトアビジンでコーティングされている。さらなる例として、限定されるものではないが、分析物が、低分子、例えば、多糖又はオリゴ糖などの炭水化物である場合、第１の分析物結合領域は、分析物に結合することができる捕捉抗体又はアプタマーを含むことができ、同様に、第２の分析物結合領域は、分析物に結合することができる抗体又はアプタマーを含むことができる。

【0069】

前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物が核酸である場合、第１の分析物結合領域は、分析物の配列に対して相補的である配列を含むことができる第１の捕捉オリゴヌクレオチドを含むことができる。第１の分析物結合領域が第１の捕捉オリゴヌクレオチドを含む実施形態において、第１のプローブの第１の分析物結合領域及びシグナル領域は、本明細書に記載される支持体上の隣接部位に結合され得、ここで、例えば、支持体は、ストレプトアビジンでコーティングされ、第１の捕捉オリゴヌクレオチドがストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介して支持体に結合されるように、第１の捕捉オリゴヌクレオチドは、ビオチン化され得る。あるいは、分析物が、結合パートナーに連結された核酸である場合、結合パートナーは、第１の分析物結合領域に対する親和性を有することができる。

【0070】

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の捕捉オリゴヌクレオチドは、約８ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドの長さを有することができる。例として、限定されるものではないが、第１の捕捉オリゴヌクレオチドは、約８ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約８ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約８ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約８ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約８ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約８ヌクレオチド～約１５ヌクレオチド、約８ヌクレオチド～約１０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約１５ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約８、１０、１５、２０、２５、３０、４０又は５０ヌクレオチドの長さを有することができる。

【0071】

前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物が、結合パートナーに連結された核酸である場合、結合パートナーは、第１の分析物結合領域についての親和性を有することができる。例として、限定されるものではないが、結合パートナーは、ビオチンであり得、第１の分析物結合領域は、ストレプトアビジンを含み得る。

【0072】

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の分析物結合領域は、支持体の表面上にあり得る。そのような実施形態において、シグナル領域は、ナノ粒子上の隣接部位に結合され得る。

【0073】

本開示の実施形態のいずれかにおいて、捕捉オリゴヌクレオチドが、第１のプローブに含まれる場合、捕捉オリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドの安定性若しくは特異性を増加させる、又は分析物についての捕捉オリゴヌクレオチドの親和性を増加させる若しくは減少させる、改変を含むことができる。例として、限定されるものではないが、改変は、ＬＮＡヌクレオチド、ＵＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオチド、２’－フルオロリボヌクレオチド、ホスホロチオエート改変、及びそれらの組合せを含むことができる。

【0074】

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１のプローブは、１個以上の第１の分析物結合領域をそれぞれ含むことができる。

【0075】

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の分析物結合領域は、１個以上の分析物に結合することができる。
シグナル領域
本開示の前述の実施形態のいずれかにおいて、第１のプローブは、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含むことができる。

【0076】

前述の実施形態のいずれかにおいて、シグナル領域は、複数のサプレッサーと会合している可能性がある。ある特定の態様において、シグナル領域は、サプレッサーに加えて、複数の標識プローブと会合している可能性があり、ここで、サプレッサーは、両方がシグナル領域と会合しているときに、標識プローブの検出を防止する。例として、限定されるものではないが、標識プローブは、フルオロフォアで標識され得、サプレッサーは、サプレッサー及び標識プローブが両方ともシグナル領域と会合しているときに、フルオロフォアからの蛍光シグナルの生成を低減する又は防止する消光剤で標識され得る。あるいは、複数の標識プローブは、１個以上のサプレッサーの除去又は分解後に、シグナル領域と会合している可能性がある。各標識プローブが、一価又は二価の結合様式を介して、例えば、そのそれぞれが独立して又は共同的な方法でシグナル領域と相互作用する１個、２個、又はそれよりも多くの別個の部分を介して、シグナル領域と会合することができることが理解されるべきである。例として、限定されるものではないが、標識オリゴヌクレオチドなどの標識プローブは、シグナル領域のオリゴヌクレオチド構成成分、例えば、第１のプローブオリゴヌクレオチドなどの１個以上の構成成分と、１つ、２つ、又はそれよりも多くの別個の二本鎖相互作用を形成することができる。さらなる例として、限定されるものではないが、１個のサプレッサーの除去は、標識プローブの結合のために必要であり得る。さらなる例として、限定されるものではないが、２個以上のサプレッサーが、標識プローブの結合のために必要であり得る。またさらなる例として、限定されるものではないが、２個以上の隣接サプレッサーが、標識プローブの結合のために必要であり得る。

【0077】

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１のプローブは、１個以上のシグナル領域を含むことができる。一部の実施形態において、第１のプローブは、約１～約２０個のシグナル領域を含んでいてよい。一部の実施形態において、第１のプローブは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９個のシグナル領域を含んでいてよい。

【0078】

一部の実施形態において、シグナル領域は、アンカーオリゴヌクレオチド及び複数のシグナルオリゴヌクレオチドを含んでいてよく、ここで、各シグナルオリゴヌクレオチドは、アンカーオリゴヌクレオチド上の配列に対して相補的である第１の配列、及びサプレッサーオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的である（しかし、アンカーオリゴヌクレオチド上の任意の配列に対して相補的ではない）第２の配列を含む。この方法において、多重のシグナルオリゴヌクレオチド（又はシグナル領域）が、アンカーオリゴヌクレオチドと会合していてよい。一部の実施形態において、アンカーオリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチド上の配列であり得る。一部の実例において、アンカーオリゴヌクレオチドは、必要ではなく、シグナルオリゴヌクレオチドは、分析物上の配列に対して相補的である配列を含む。この方法において、多重のシグナル領域（第１のプローブ）が、分析物の単一コピーと直接的に会合していてよい。

【0079】

一部の実施形態において、シグナル領域は、サプレッサーによってブロックされ得る、及びその後、サプレッサーの除去又は分解後に反応され得る、反応性基を含むことができる。例として、限定されるものではないが、反応性基は、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチン若しくは他のアジド反応性クリックケミストリー部分、トランス－シクロオクテン、テトラジン、メチルテトラジン、チオール又はアミンであり得る。好ましくは、反応性基は、中性ｐＨ付近の水溶液中で高い安定性を有する。

【0080】

一部の実施形態において、シグナル領域は、共通配列をそれぞれ含む複数の第１のプローブオリゴヌクレオチドを含むことができる。そのような実施形態において、共通配列は、約１０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドであり得る。ロックド核酸（ＬＮＡ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ）などの改変ヌクレオチドが配列に組み込まれる場合、１０程度の少ないヌクレオチドが使用され得る。一般に、典型的なヌクレオチド存在量（約２５～７５％のＧＣ含有量）を有するＤＮＡについて、より小さい実現可能な配列は、一般に、室温及び一般的に使用される緩衝液において、少なくとも１５～２０ヌクレオチドの長さである。例として、限定されるものではないが、共通配列は、約１０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約４０オリゴヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約１０、１４、１５、２０、２５、３０、４０又は５０ヌクレオチドであり得る。例として、限定されるものではないが、シグナル領域は、約１～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチドを含むことができる。さらなる例として、限定されるものではないが、シグナル領域は、好ましくは、２０個以下の第１のプローブオリゴヌクレオチドを含む。またさらなる例として、限定されるものではないが、シグナル領域は、約１～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１～約２５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１～約２０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１～約１５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１～約１０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１～約５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２～約２５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２～約２０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２～約１５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２～約１０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２～約５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約３～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約３～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約３～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約３～約２５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約３～約２０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約３～約１５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約３～約１０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約３～約５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約４～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約４～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約４～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約４～約２５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約４～約２０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約４～約１５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約４～約１０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約４～約５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約５～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約５～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約５～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約５～約２５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約５～約２０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約５～約１５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約５～約１０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約６～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約６～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約６～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約６～約２５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約６～約２０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約６～約１５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約６～約１０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約７～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約７～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約７～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約７～約２５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約７～約２０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約７～約１５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約７～約１０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約８～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約８～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約８～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約８～約２５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約８～約２０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約８～約１５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約８～約１０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約９～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約９～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約９～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約９～約２５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約９～約２０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約９～約１５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約９～約１０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１０～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１０～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１０～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１０～約２５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１０～約２０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１０～約１５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約１５～約２０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２０～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２０～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２０～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２０～約２５個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２５～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２５～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約２５～約３０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約３０～約５０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約３０～約４０個の第１のプローブオリゴヌクレオチド、約４０～約４０個の第１のプローブヌクレオチド、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０個若しくはそれよりも多くの第１のプローブオリゴヌクレオチドを含むことができる。

【0081】

前述の実施形態のいずれかにおいて、シグナル領域が核酸を含む場合、例えば、例として、限定されるものではないが、シグナル領域が複数の第１のプローブオリゴヌクレオチドを含む場合、シグナル領域は、任意の好適な長さを有することができ、好ましくは、シグナル領域内の任意の連続する核酸分子の長さは、２００ヌクレオチド又はそれよりも短い。例として、限定されるものではないが、そのような実施形態において、シグナル領域は、約１０～約２００ヌクレオチド、約１０～約１５０ヌクレオチド、約１０～約１００ヌクレオチド、約１０～約５０ヌクレオチド、約１０～約４０ヌクレオチド、約１０～約３０ヌクレオチド、約１０～約２５ヌクレオチド、約１０～約２０ヌクレオチド、約２０～約２００ヌクレオチド、約２０～約１５０ヌクレオチド、約２０～約１００ヌクレオチド、約２０～約５０ヌクレオチド、約２０～約４０ヌクレオチド、約２０～約３０ヌクレオチド、約２０～約２５ヌクレオチド、約２５～約２００ヌクレオチド、約２５～約１５０ヌクレオチド、約２５～約１００ヌクレオチド、約２５～約５０ヌクレオチド、約２５～約４０ヌクレオチド、約２５～約３０ヌクレオチド、約３０～約２００ヌクレオチド、約３０～約１５０ヌクレオチド、約３０～約１００ヌクレオチド、約３０～約５０ヌクレオチド、約３０～約４０ヌクレオチド、約４０～約２００ヌクレオチド、約４０～約１５０ヌクレオチド、約４０～約１００ヌクレオチド、約４０～約５０ヌクレオチド、約５０～約２００ヌクレオチド、約５０～約１５０ヌクレオチド、約５０～約１００ヌクレオチド、約１００～約２００ヌクレオチド、約１００～約１５０ヌクレオチド、約１５０～約２００ヌクレオチド、約１０、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、又はそれよりも長いヌクレオチドであり得る。

【0082】

サプレッサー
前述の実施形態のいずれかにおいて、シグナル領域は、複数のサプレッサーと会合している可能性がある。

【0083】

例として、限定されるものではないが、各サプレッサーは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、シグナル領域上の化学基の反応性を抑制するｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）若しくはフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などの化学保護基、エンドヌクレアーゼ切断部位、ペプチド配列、プロテアーゼ切断部位、タンパク質サブユニット、酵素阻害剤、又はＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ若しくはＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒなどの蛍光消光剤を含むことができる。一部の実施形態において、サプレッサーは、酵素のための基質であり得る嵩高いポリマー置換基であり得る。

【0084】

前述の実施形態のいずれかにおいて、シグナル領域が、共通配列をそれぞれ含む複数の第１のプローブオリゴヌクレオチドを含む場合、サプレッサーは、第１のプローブ相補領域、及び任意選択的に足場（ｔｏｅｈｏｌｄ）領域を含むことができるサプレッサーオリゴヌクレオチドをそれぞれ含むことができ、第１のプローブ相補領域は、第１のプローブオリゴヌクレオチドの共通配列に対して相補的である配列を含み、足場領域は、第１のプローブ相補領域からすぐ３’又は５’に位置し、サプレッサーオリゴヌクレオチドが、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるときに、足場領域が、第１のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしないように、第１のプローブオリゴヌクレオチドにおける共通配列のすぐ３’又は５’にある配列に相補的ではない。そのような実施形態において、第１のプローブ相補領域は、共通配列と同じ長さを有することができる。そのような実施形態において、足場領域は、存在する場合、約１ヌクレオチド～約６ヌクレオチドを含むことができる。例として、限定されるものではないが、足場領域は、約１ヌクレオチド～約６ヌクレオチド、約２ヌクレオチド～約５ヌクレオチド、約２ヌクレオチド～約４ヌクレオチド、約３ヌクレオチド～約６ヌクレオチド、約３ヌクレオチド～約５ヌクレオチド、約３ヌクレオチド～約４ヌクレオチド、約４ヌクレオチド～約６ヌクレオチド、約４ヌクレオチド～約５ヌクレオチド、約５ヌクレオチド～約６ヌクレオチド、約１、２、３、４、５又は６ヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態において、足場の長さ、配列及び／又は結合の自由エネルギーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＺｈａｎｇ及びＷｉｎｆｒｅｅ、「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＤＮＡ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｔｏｅｈｏｌｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３１（４７）：７３０３～１７３１４頁（２００９）によって教示される原理に従って、約１Ｍ^－１秒^－１～約１０００Ｍ^－１秒^－１の足場媒介鎖交換の測定速度定数が得られるように選択される。

【0085】

第２のプローブ
本開示の実施形態のいずれかにおいて、第２のプローブは、サプレッサー相互作用領域を介して、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個に結合する、それを除去する又はそれを分解することが可能であり得る。例として、限定されるものではないが、第２のプローブは、１個以上のＤＮＡオリゴヌクレオチド、１個以上のＲＮＡオリゴヌクレオチド、１個以上のロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド、１個以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチド、１個以上の抗体若しくは抗体断片、１個以上のアプタマー、酵素、ヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ Ｈ、Ｃａｓ９ファミリーヌクレアーゼ、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ若しくはその突然変異体、又はそれらの組合せを含むことができる。これらの要素のそれぞれが、第２の分析物結合領域若しくはサプレッサー相互作用領域であり得る又はその一部であり得ることが理解されるべきである。

【0086】

ある特定の態様において、第２のプローブは、サプレッサー相互作用領域を介して、直接的に、サプレッサーのうち１個に結合する、それを除去する又はそれを分解することが可能であり得る。例として、限定されるものではないが、サプレッサー相互作用領域は、相補性又は酵素作用を介して、サプレッサーのうち１個に結合する、それを除去する又はそれを分解することが可能であり得る。

【0087】

ある特定の態様において、第２のプローブは、分析物に結合することによって、サプレッサーの除去を完了させることができる第３のプローブのための結合部位を創出することができ、ここで、第３のプローブは、第２のプローブが局所的に高濃度で存在する場合に高い確率で、サプレッサーのみ除去することができる。第３のプローブのための結合部位は、サプレッサー上にある又は第１のプローブそれ自身上にあり得るが、いずれかの場合においても、シグナル領域からのサプレッサーの消失を引き起こす。第３のプローブがシグナル領域に結合する場合において、第３のプローブそれ自身は、標識プローブ又は標識プローブ結合部位を含むことができる。

【0088】

ある特定の態様において、第２のプローブは、第３のプローブとして作用する酵素のための活性部位を創出する様式でサプレッサーに結合することができ、酵素は、次いで、サプレッサーを分解することができる。例として、限定されるものではないが、酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈ又は制限エンドヌクレアーゼであり得る。

【0089】

ある特定の態様において、第２のプローブは、第３のプローブとして、サプレッサーを分解又は除去することができる、酵素のための必要な補因子又は補酵素を含むことができる。第２のプローブの近くでの高い局所濃度の補因子又は補酵素の存在は、酵素が、サプレッサーの近くで分解するのを可能にする。例として、限定されるものではないが、補酵素は、ＮＡＤ^＋／ＮＡＤＨを可撓性リンカーにテザリングすることができ、次に、Ｆｕら、「Ｍｕｌｔｉ－ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｎ ＤＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｗｉｎｇｉｎｇ ａｒｍ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈ．９：５３１～５３６頁（２０１４）に記載されるものなどの近くの酵素の活性を有効にし得る。

【0090】

本開示の実施形態のいずれかにおいて、第２のプローブの数は、第１のプローブの数よりも過剰であり得る。本開示の実施形態のいずれかにおいて、第２のプローブの数は、分析物と会合している第１のプローブの数よりも多いことがある。

【0091】

第２の分析物結合領域
本開示の実施形態のいずれかにおいて、各第１のプローブの第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有する第１の結合パートナーを含む場合、第２の分析物結合領域は、分析物に対する親和性を有する第２の結合パートナーを含むことができ、ここで、サプレッサー相互作用領域は、第２の結合パートナーに連結される。例として、限定されるものではないが、第２の結合パートナーは、抗体若しくはその断片、一本鎖可変断片、ナノボディ、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、低分子、代謝産物、オリゴペプチド配列、ポリペプチド、核酸、又は分析物についての親和性を有する任意の他のリガンドであり得る。

【0092】

前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物が核酸であり、第１の分析物結合領域が、分析物の第１の配列に対して相補的である配列を含むことができる第１の捕捉オリゴヌクレオチドを含むことができる場合、第２の分析物結合領域は、分析物の第２の配列に対して相補的である配列を有する検出オリゴヌクレオチドを含むことができる。検出オリゴヌクレオチドの代わりに、第２の分析物結合領域が、検出部分、例えば、例として、限定されるものではないが、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ結合タンパク質、触媒的デッドＣａｓ９酵素（ｄＣａｓ９）－ガイドＲＮＡ複合体、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、リボヌクレオタンパク質複合体、抗体、アプタマー又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン（ＭＢＤ）を含むことができることが理解されるべきである。理論に拘束されないが、アプローチの動態学的性質は、突然変異ＤＮＡ又はＲＮＡ配列及び野生型配列などの関連配列の間の区別を容易にする。前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物が核酸である場合、第２の分析物結合領域は、１個以上のヌクレオチドによって、又は分析物配列に存在する若しくは存在しないもとは別個の、化学改変、例えば、例として、限定されるものではないが、５－メチルシトシン若しくはＮ^６－メチルアデノシンの存在若しくは非存在によって、分析物と異なる類似の配列に結合するときと比較して、分析物に結合するときに別個の結合又は解離動態を示し得る。例として、限定されるものではないが、第２の分析物結合領域は、分析物配列から、類似の配列からよりもゆっくりと（例えば、約２倍超、約５倍又は約１０倍超ゆっくりと）解離し得る。例として、限定されるものではないが、第２の分析物結合領域は、分析物配列から、関連配列からよりも迅速に（例えば、約２倍超、約５倍又は約１０倍超迅速に）解離し得る。そのような実施形態において、第２の分析物結合領域は、分析物から、関連配列からとは異なる解離の動態を示すことによって、分析物及び関連配列の間を識別し得、結果として、分析物の存在下で、関連配列の存在下よりも、第１のプローブからのサプレッサー除去の異なる程度を与え得る。そのような実施形態において、分析物の存在は、したがって、サプレッサーの除去後の十分に明るい点の存在又は非存在によって、関連配列の存在から識別され得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、第２の分析物結合領域が検出オリゴヌクレオチドを含む場合、検出オリゴヌクレオチドの長さ及び配列は、その両方が、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｓ．Ｌ．ら「Ｕｌｔｒａｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ｆｒｅｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｎｔ ＤＮＡ ｂｙ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４０、１１７５５～１１７６２頁（２０１８）及びＪｏｈｎｓｏｎ－Ｂｕｃｋ，Ａ．ら、「Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ １５３、３～１２頁（２０１９）における技法のクエリープローブについて概説されるものなどの原理に従って、関連配列と比較して、分析物との結合又は解離の動態の有意な相違を達成するように設計され得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物が核酸である場合、第２の分析物結合領域が、検出オリゴヌクレオチドを含む場合に、関連配列に対して相補的であるが関連配列よりも分析物にあまり相補的ではない核酸配列を含む１個以上の競合用プローブは、第２のプローブとのインキュベーションステップの間に添加されて、関連配列への第２の分析物結合領域の結合の程度を低減し得る。そのような競合用プローブの設計及び使用は、例えば、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｓ．Ｌ．ら 「Ｕｌｔｒａｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ｆｒｅｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｎｔ ＤＮＡ ｂｙ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４０、１１７５５～１１７６２頁（２０１８）によって教示されている。

【0093】

サプレッサー相互作用領域
前述の実施形態のいずれかにおいて、サプレッサー相互作用領域は、直接的に又は間接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができる任意の領域であり得る。

【0094】

前述の実施形態のいずれかにおいて、サプレッサーが、第１のプローブ相補領域、及び任意選択的に足場領域を含むことができるサプレッサーオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む場合、第２のプローブのサプレッサー相互作用領域は、第１のプローブ相補領域の全部ではないにしても少なくとも一部分に相補的であり、及び存在する場合、サプレッサーオリゴヌクレオチドの足場領域の全部ではないにしても少なくとも一部分に相補的である配列を含むサプレッサー相補領域を含む第２のプローブオリゴヌクレオチドを含むことができる。サプレッサー相補領域のサプレッサーオリゴヌクレオチドに対する相補性に起因して、サプレッサー相互作用領域は、サプレッサーと会合することができ、第１のプローブのシグナル領域からそれを除去することができる。一部の実施形態において、サプレッサー相互作用領域の長さ、配列及び／又はサプレッサーオリゴヌクレオチドへの結合の自由エネルギーは、Ｚｈａｎｇ及びＷｉｎｆｒｅｅ、「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＤＮＡ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｔｏｅｈｏｌｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３１（４７）：７３０３～１７３１４頁（２００９）によって教示される原理に従って、約１Ｍ^－１秒^－１～約１０００Ｍ^－１秒^－１の鎖交換の測定速度定数が得られるように選択される。

【0095】

シグナル領域からのサプレッサーの除去又は分解のメカニズムが、さまざまなメカニズムによって起こり得ることが理解されるべきである。例として、限定されるものではないが、シグナル領域からの１個以上のサプレッサーの除去又は分解のメカニズムは、ワトソン－クリック型塩基対合、非古典的塩基対合、足場媒介鎖交換（ＴＭＳＤ）、足場交換、エンドヌクレアーゼ若しくはエキソヌクレアーゼによる分解若しくは部分的分解、ＲＮＡ若しくはＤＮＡヘリックス活性、求核置換（酵素的又は非酵素的）、加水分解（酵素的又は非酵素的）、アミノ交換（酵素的又は非酵素的）又はジスルフィド交換（酵素的又は非酵素的）であり得る。

【0096】

本開示は、一般に、第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含むことができるシステムを開示するが、代替の実施形態において、第１のプローブがアプタマーを含む場合、第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域よりもむしろ、第１のプローブ結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含むことができることが理解されるべきである。そのような実施形態において、第１のプローブの第１の分析物結合領域への分析物の結合の際に、第１のプローブは、第１のプローブ結合領域のための結合部位を露出又は創出するコンフォメーション変化を受け得る。例として、限定されるものではないが、第１のプローブは、分析物の結合の際に、そのようなコンフォメーション変化を受け得るアプタマーを含むことができる。さらなる例として、限定されるものではないが、第１の分析物結合領域は、アプタマー、例えば、例として、限定されるものではないが、核酸アプタマーを含むことができる。本開示のキット及び方法が、このシステムを組み込むように改変され得ること、並びに分析物への第１のプローブ結合及び分析物への第２のプローブ結合の間の動態学的関係が、例えば、それが分析物に結合しているときに、第１のプローブに対する第１のプローブ結合領域を介して、分析物への第１のプローブ結合及び第１のプローブへの第２のプローブ結合に適用され得ることが理解されるべきである。またさらなる例として、限定されるものではないが、第１のプローブ、例えば、第１の分析物結合領域が、アプタマーを含む場合、アプタマーは、可撓性ループを含むヌクレオチド配列を含むことができ、ここで、アプタマーへの分析物の結合は、ループを開いて、第２のプローブの第１のプローブ結合領域のための結合部位を露出させることができる。本開示のシステム及び方法の第１のプローブ、第２のプローブ及び他の要素に関する開示が、そのような代替の実施形態に適用され得ることが理解されるべきである。

【0097】

またさらなる例として、限定されるものではないが、第１の分析物結合領域は、分析物、例えば、例として、限定されるものではないが、金属イオン、有機低分子、単糖、多糖若しくはオリゴ糖、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の結合の際にコンフォメーションが変化し得るアプタマーを含むことができ、第２のプローブの第１のプローブ結合領域のための結合部位、例として、限定されるものではないが、分析物の結合の際に創出される結合部位に対して相補的であるヌクレオチド配列の創出又は改変をもたらす。相補的プローブによって検出が可能になるようにコンフォメーションが変化し得る例示的なアプタマーに基づくプローブは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれるＷｅｎｇら、「Ｓｉｎｇｌｅ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｗｉｔｈ Ａｐｔａｓｅｎｓｏｒｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１９、９１、２、１４２４～１４３１頁に詳細に記載されている。これらの代替の実施形態のいずれかにおいて、アプタマーは、核酸アプタマーであり得る。

【0098】

第２のプローブが、それが分析物に結合しているときに第１のプローブに結合することができる例示的なシステムは、図２２に表される。図２２のケース１は、第１のプローブ１０が、少なくとも１個の分析物１６に結合するための第１の分析物結合領域１２、及び複数のサプレッサー１８と会合しているシグナル領域１４を含む、例示的なシステムを表す。第１のプローブ結合領域２５及びサプレッサー相互作用領域２４を含む第２のプローブ２０は、第１の分析物結合領域１２からの分析物１６の解離と比べて迅速に、第１のプローブ結合領域２５を介して、第１のプローブに結合し、直接的に又は間接的に、サプレッサー１８のうち１個以上を除去又は分解することができる。この結合は、有意に第２のプローブ２０の局所濃度を増加させ、第１のプローブ結合領域を介して結合していない第２のプローブによるサプレッサーの除去又は分解の速度と比べて、第１のプローブ結合領域を介して第１のプローブに結合した第２のプローブによるサプレッサーの除去又は分解の速度を増加させることができる。第１の分析物結合領域と分析物との間よりも、第１のプローブ結合領域２５及び第１のプローブ１０の間のより一過的な相互作用を有することによって、サプレッサー１８の多重のコピーは、第１のプローブへの第２のプローブの多重の連続的な結合事象によって迅速に除去され得、下記で論じられるように、分析物の非存在下よりも強いシグナルをもたらし得る。１個以上のサプレッサー１８を除去することによって、結合部位は、サプレッサーが除去された場合に次いで結合することができ、シグナル検出のために次いで使用され得る、標識プローブ３０のために露出される。図２２のケース２に示されるように、分析物の非存在下で、第１の分析物結合領域１２は、第１のプローブ結合領域２５のための十分に形成された結合部位を欠く。結果として、第２のプローブ２０の局所濃度が、第１のプローブ結合領域２５を介する第１の分析物結合領域へのその結合によって増強されないため、第２のプローブ２０によるサプレッサー１８の除去は遅く、これにより、低強度のシグナルを生じる遅く非効率的な反応がもたらされる。

【0099】

第１の分析物結合領域が、分析物の結合の際にコンフォメーションを変化させ、第２のプローブが第１のプローブに結合するのを可能にし得るアプタマーを含む、さらなる例示的な実施形態が、図２３に表される。図２３は、低分子分析物（アデノシン）１１６が、第１の分析物結合領域１１２内でＤＮＡアプタマー配列（第１の結合パートナー、１２６）とのその相互作用を介して検出されるシステムを表す。アプタマー１２６への分析物１１６の結合は、ワトソン－クリック型塩基対合を介して、第２のプローブ１２０の第１のプローブ結合領域１２５のための結合部位を露出させる。第１の分析物結合領域１１２への第１のプローブ結合領域１２５の結合の際に、第２のプローブ１２０は、高い局所濃度で存在し、サプレッサー相補領域１２４を介した足場媒介鎖交換による、第１のプローブのシグナル領域からのサプレッサー１１８（第１のプローブ１１０のシグナル領域１１１の第１のプローブオリゴヌクレオチド１１４に対して相補的である第１のプローブ相補領域１１８ａを含む）及び足場領域１１８ｂ）の効率的な除去をもたらす。第１の分析物結合領域１１２への第２のプローブ１２０の結合の一過的な性質に起因して、第２のプローブ１２０は、第１のプローブ１１０から迅速に解離する。第２のプローブ１２０の多重のコピーによるサプレッサー１１８の逐次的な結合及び除去の後、多重の第１のプローブオリゴヌクレオチド１１４は、標識プローブ１３０（オリゴヌクレオチド構成成分１３２及びシグナル伝達構成成分１３４を含む）が結合するのに利用可能なる。第１のプローブ１１０のシグナル領域１１１への多重の標識プローブ１３０の結合は、分析物の存在を示す明るいシグナルを生じる。アプタマー及び第１のプローブ結合領域のための結合部位を含む第１の分析物結合領域の配列は、Ｗｅｎｇら、「Ｓｉｎｇｌｅ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｗｉｔｈ Ａｐｔａｓｅｎｓｏｒｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１９、９１、２、１４２４～１４３１頁から得られる。この例示的な実施形態において、シグナル領域及び第１の分析物結合領域は、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用によって金ナノ粒子１１２ｂに結合され、第１のプローブは、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介して固体支持体１１２ａに結合される。

【0100】

標識プローブ
本開示の実施形態のいずれかにおいて、標識プローブは、シグナル伝達構成成分を含むことができる。標識プローブは、シグナル領域と会合している可能性があり、ここで、サプレッサーは、標識プローブからのシグナルを防止することができ、又は標識プローブは、１個以上のサプレッサーが除去又は分解されたら、シグナル領域に結合することが可能であり得る。

【0101】

本開示の実施形態のいずれかにおいて、サプレッサーが第１のプローブ相補領域を含む場合、標識プローブは、シグナル伝達構成成分及びオリゴヌクレオチド構成成分を含むことができ、ここで、オリゴヌクレオチド構成成分は、サプレッサーの第１のプローブ相補領域又はそのような配列の一部分と同一の配列を含む。

【0102】

本開示の実施形態のいずれかにおいて、シグナル伝達構成成分は、任意の好適なシグナル伝達構成成分であり得る。例として、限定されるものではないが、シグナル伝達構成成分は、フルオロフォア、蛍光発生化合物、蛍光発生酵素基質、蛍光タンパク質又は化学発光生成酵素であり得る。さらなる例として、限定されるものではないが、シグナル伝達構成成分は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７からなる群から選択される低分子フルオロフォアであり得る。

【0103】

本開示の実施形態のいずれかにおいて、標識プローブは、親和性捕捉構成成分に対する特異的親和性を有する又はシグナル伝達構成成分の代わりにそのような親和性構成成分を含むことができる親和性構成成分をさらに含むことができる。一部の実施形態において、親和性構成成分及び親和性捕捉構成成分の間の相互作用は、周囲温度で一過的又は不安定であるが、同じシグナル伝達領域上に存在する多重の標識が、同じ表面又は他の物体、例えば、コロイド粒子、ナノ粒子又はタンパク質上の多重の親和性捕捉構成成分に結合する場合、アビディティー効果を介して安定になる。そのような状況下で、標識の多重のコピーを保持するシグナル伝達領域のみが、表面で親和性捕捉構成成分に安定に結合される可能性がある。一部の実施形態において、親和性捕捉構成成分は、顕微鏡スライド、カバースリップ、マルチウェルプレート又はマイクロ流体チップなどのアッセイ表面上に提示される。一部の実施形態において、親和性捕捉構成成分は、マイクロ粒子、コロイド粒子、ビーズ、ナノ構造又は生体部分上に提示される。一部の実施形態において、親和性構成成分は、表面捕捉構成成分の相補配列又は部分的相補配列と相互作用するオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、親和性構成成分及び親和性捕捉構成成分は、３～１２塩基対を介して相互作用する。一部の実施形態において、親和性構成成分及び親和性捕捉構成成分は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ二重鎖の平滑末端、付着末端又は同軸スタッキングを介して相互作用する。親和性構成成分／親和性捕捉構成成分系を使用することによって、第１のプローブは、標識プローブがシグナル伝達領域に結合した後に、表面で捕捉され得る。例示的な一実施形態において、多価結合が、多重のサプレッサーが、分析物の存在に起因して除去又は分解された第１のプローブを選択的に捕捉するために使用される（図２４）。ケース１において、少数（例えば、０又は１）のサプレッサー１８のみが、分析物の非存在下での第２のプローブと第１のプローブとの非効率的な相互作用に起因して、第１のプローブ１０のシグナル領域１１から除去され、第１のプローブと会合している少数（例えば、０又は１）の標識プローブ３０のみの存在又はアクセス性をもたらした。１個又は複数の標識プローブは親和性構成成分を依然として保持するが、固体支持体１２ａ又は他の構成成分とのそれらの会合は、多価標識相互作用プローブ上に存在する個々の親和性構成成分と個々の親和性捕捉構成成分４２との低親和性相互作用によって非効率的になる。結果として、少数の標識を保持する第１のプローブはほとんど又は全く、多価標識相互作用プローブ４０と会合しない。対照的に、ケース２は、多重のサプレッサー１８が、分析物１６の存在に起因して除去又は分解され、第１のプローブ１０のシグナル領域１１への多くの標識プローブ３０の結合をもたらす、第１のプローブ１０を表す。結果として、第１のプローブ１０は、親和性構成成分の多重のコピーを提示し、多価標識相互作用プローブの親和性捕捉構成成分４２との多価相互作用をもたらし、これにより、ケース１と比較して、効率的な、迅速な、又は高親和性の捕捉をもたらす。多価標識相互作用プローブを捕捉のために使用することができるが、第１のプローブと会合している標識プローブへの多価標識相互作用プローブの結合が、本開示に記載されるシグナルの検出を可能にし得るように、シグナル伝達構成成分とも会合させ得ることが理解されるべきである。多価標識相互作用プローブが、溶液又は懸濁液中で行われるシステムの構成成分間の反応を可能にするのに有用であり得ることが理解されるべきである。これは、下記の実施例７においてさらに例示される。再び、上記に暗示されるように、標識プローブは、多価標識相互作用プローブとの相互作用を可能にする追加の配列又は領域を含んでいなければならない。第２のプローブが、サプレッサープローブより過剰、好ましくは、少なくとも２倍過剰であることが、（本明細書に記載される全ての実施形態において重要であるが）多価捕捉の文脈において特に重要である。さらにまた、第２のプローブは、第１のプローブより過剰でなければならず、標識プローブは、第２のプローブより過剰でなければならない。

【0104】

キット
本開示の方法を行うために十分な構成成分を有するキットが、本開示内に包含され、関連する方法を実施するために必要な構成成分を含むことができることが理解されるべきである。

【0105】

一部の実施形態において、試料中の分析物を検出するためのキットであって、複数の第１のプローブを含む第１の構成成分であって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有する、第１の構成成分、複数の標識プローブを含む第２の構成成分であって、各標識プローブが、シグナル領域と会合することができる、第２の構成成分、複数のサプレッサーを含む第３の構成成分であって、各サプレッサーが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止する、又はサプレッサーが、標識プローブとシグナル領域との会合を防止する、第３の構成成分、並びに複数の第２のプローブを含む第４の構成成分であって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有する、第４の構成成分を含むキットが提供される。

【0106】

前述のキットのいずれかにおいて、第１の構成成分、第２の構成成分、第３の構成成分及び第４の構成成分は、個々に又は様々な組合せで提供され得る。例として、限定されるものではないが、第１の構成成分及び第３の構成成分は、第１の反応混合物において提供され得る。そのような実施形態において、第２の構成成分及び第４の構成成分は、別々の反応混合物において提供され得、第１の反応混合物の一部ではない。あるいは、第２の構成成分及び第４の構成成分は、第２の反応混合物として提供され得る。さらなる例として、限定されるものではないが、第１の構成成分、第２の構成成分及び第３の構成成分は、第１の反応混合物において提供され得る。そのような実施形態において、第４の構成成分は、第１の反応混合物の一部ではあり得ない。

【0107】

前述のキットの実施形態のいずれかにおいて、キットは、第５の構成成分として又は本明細書に開示されるキットの構成成分の他の反応混合物のいずれかの構成成分として、多価相互作用プローブをさらに含むことができる。

【0108】

本開示のキットの構成成分が、本明細書に記載される構成成分のそれぞれについて記載されるさまざまな代替の配置を含む、本開示の実施形態のいずれかの対応する要素の特徴及び特性を有することができることが理解されるべきである。

【0109】

方法
一部の実施形態において、試料中の分析物を検出するための方法は、（ａ）試料の少なくとも一部分を、複数の第１のプローブ及び複数のサプレッサーと混合して、第１の反応混合物を形成するステップであって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、各サプレッサーが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止することができ、又はサプレッサーが、標識プローブとシグナル領域との会合を防止することができ、サプレッサーが、複数の第１のプローブのシグナル領域に結合している、ステップ、（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を複数の第２のプローブと混合して、第２の反応混合物を得るステップであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有する、ステップ、（ｄ）第２のプローブが、分析物に結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解するのに十分な条件下で、第２の反応混合物をインキュベートするステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）の後の第２の反応混合物を複数の標識プローブと混合して、第３の反応混合物を得るステップであって、各標識プローブが、シグナル領域と会合することができる、ステップ、（ｆ）標識プローブが、ステップ（ｄ）において１個以上のサプレッサーが除去又は分解された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件下で、第３の反応混合物をインキュベートするステップ、並びに（ｇ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップを含むことができる。

【0110】

前述の方法において、ステップ（ａ）の前に、サプレッサーが、試料に添加される前に複数の第１のプローブのシグナル領域に結合されるように、複数の第１のプローブ及び複数のサプレッサーが、混合され得ることが理解されるべきである。前述の方法において、複数の第１のプローブが、複数のサプレッサー及び／又は標識プローブを添加する前に、分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、分析物とインキュベートされ得ることも理解されるべきである。複数の標識プローブ及び複数の第２のプローブが、同時に添加され得、別々のステップにおいて添加及びインキュベートされる必要がないこともさらに理解されるべきである。

【0111】

一部の実施形態において、試料中の分析物を検出するための方法は、（ａ）試料の少なくとも一部分を、複数の第１のプローブと混合して、第１の反応混合物を形成するステップであって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、各シグナル領域が、複数のサプレッサーと会合しており、各サプレッサーが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止することができ、又はサプレッサーが、標識プローブとシグナル領域との会合を防止することができ、サプレッサーが、複数の第１のプローブのシグナル領域に結合している、ステップ、（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を複数の第２のプローブと混合して、第２の反応混合物を得るステップであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合する、それを除去する又はそれを分解することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有する、ステップ、（ｄ）第２のプローブが、分析物に結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解するのに十分な条件下で、第２の反応混合物をインキュベートするステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）の後の第２の反応混合物を複数の標識プローブと混合して、第３の反応混合物を得るステップであって、各標識プローブが、シグナル領域と会合することができる、ステップ、（ｆ）標識プローブが、ステップ（ｄ）において１個以上のサプレッサーが除去又は分解された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件下で、第３の反応混合物をインキュベートするステップ、並びに（ｇ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップを含むことができる。

【0112】

一部の実施形態において、試料中の分析物を検出するための方法は、（ａ）試料の少なくとも一部分を、複数の第１のプローブと混合して、第１の反応混合物を形成するステップであって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、各シグナル領域が、複数のサプレッサーを会合しており、各サプレッサーが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止することができ、又はサプレッサーが、標識プローブとシグナル領域との会合を防止することができ、サプレッサーが、複数の第１のプローブのシグナル領域に結合している、ステップ、（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を、複数の第２のプローブ及び複数の標識プローブと混合して、第２の反応混合物を得るステップであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合し、それを除去する又はそれを分解することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有し、各標識プローブが、シグナル領域と会合することができる、ステップ、（ｄ）第２のプローブが、分析物に結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解し、かつ標識プローブが、１個以上のサプレッサーが除去又は分解された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件下で、第２の反応混合物をインキュベートするステップ、並びに（ｅ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップを含むことができる。

【0113】

一部の実施形態において、試料中の分析物を検出するための方法は、（ａ）試料の少なくとも一部分を、複数の第１のプローブ及び複数の標識プローブと混合して、第１の反応混合物を形成するステップであって、各第１のプローブが、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を含み、第１の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、各シグナル領域が、複数のサプレッサーを会合しており、各サプレッサーが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが両者共に、シグナル領域と会合している場合、サプレッサーが、標識プローブの検出を防止することができ、又はサプレッサーが、標識プローブとシグナル領域との会合を防止することができ、各標識プローブが、シグナル領域と会合することができ、サプレッサー及び標識プローブが、複数の第１のプローブのシグナル領域に結合している、ステップ、（ｂ）分析物が第１の分析物結合領域に結合するのに十分な条件下で、第１の反応混合物をインキュベートするステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の後の第１の反応混合物を、複数の第２のプローブと混合して、第２の反応混合物を得るステップであって、各第２のプローブが、第２の分析物結合領域及びサプレッサー相互作用領域を含み、第２の分析物結合領域が、分析物に対する親和性を有し、サプレッサー相互作用領域が、間接的に又は直接的に、サプレッサーのうち１個以上に結合し、それを除去する又はそれを分解することができ、分析物への第１の分析物結合領域の相互作用が、第２の分析物結合領域と分析物との間の解離の速度定数よりも遅い解離の速度定数を有する、ステップ、（ｄ）第２のプローブが、分析物に結合しそれから解離し、複数の第１のプローブのシグナル領域から１個以上のサプレッサーを除去する又は１個以上のサプレッサーを分解するのに十分な条件下で、第２の反応混合物をインキュベートするステップ、並びに（ｅ）第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップを含むことができる。そのような実施形態において、標識プローブは、第１の反応混合物のシグナル領域と会合していない可能性があり、ステップ（ｄ）は、標識プローブが１個以上のサプレッサーが除去された第１のプローブのシグナル領域と会合することを可能にするのに十分な条件を含む。あるいは、そのような実施形態において、標識プローブは、第１の反応混合物においてシグナル領域と会合している可能性がある。

【0114】

前述の方法のいずれかにおいて、方法は、標識プローブに会合した第１のプローブを、標識プローブの親和性構成成分に結合することができる親和性捕捉構成成分を含む多価標識相互作用プローブとインキュベートするステップをさらに含むことができ、存在する場合、十分な数の標識プローブによる第１のプローブの捕捉のため又は検出のためのいずれかで、多価標識相互作用プローブは、シグナル伝達成分を含むことができる。

【0115】

前述の方法のいずれかにおいて、第２のプローブの数は、第１のプローブの数より過剰であり得る。

【0116】

前述の方法において、第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップが、標識プローブの直接的な又は間接的な検出を含むさまざまなメカニズムによって行われ得ることが理解されるべきである。例として、限定されるものではないが、各第１のプローブから除去されたサプレッサーのコピーの数の測定及び／又は定量化は、蛍光顕微鏡法、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法、エピ蛍光顕微鏡法、共焦点蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、化学発光、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、カバースリップ、顕微鏡スライド若しくはアッセイプレートの表面への第１のプローブの吸着、結合若しくはコンジュゲーションによって行われ得、前記吸着、結合又はコンジュゲーションは、サプレッサーの除去によって増強又は阻害される。さらなる例として、シグナル領域が、サプレッサーによってブロックされるシグナル領域上の反応性基を含むことができる場合、１個以上のサプレッサーの除去又は分解の際に、反応性基は、対応する反応性基及びフルオロフォアなどのシグナル伝達構成成分を保持する試薬と反応することができる。またさらなる例として、限定されるものではないが、サプレッサー単独の除去は、例えば、第１のプローブの質量又は流体力学半径が、例えば、電気泳動移動度の変化によって測定するのに十分に変化する場合、シグナル領域と会合している標識プローブを必要とすることなく、検出可能なシグナルとして作用することができる。

【0117】

前述の方法のいずれかにおいて、第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップは、シグナルを測定するのに好適な任意の時間、例えば、例として、限定されるものではないが、約１ミリ秒～約１０分であり得る。例として、限定されるものではないが、第１のプローブのシグナル領域と会合している標識プローブから生成されたシグナルを測定して、試料中の分析物の存在を決定するステップは、約１ミリ秒～約１０分、約１ミリ秒～約５分、約１ミリ秒～約１分、約１ミリ秒～約３０秒、約１ミリ秒～約１５秒、約１ミリ秒～約１０秒、約１ミリ秒～約１０秒、約１ミリ秒～約５秒、約１ミリ秒～約１秒、約１ミリ秒～約５００ミリ秒、約１ミリ秒～約４００ミリ秒、約１ミリ秒～約３００ミリ秒、約１ミリ秒～約２００ミリ秒、約１ミリ秒～約１００ミリ秒、約１ミリ秒～約５０ミリ秒、約１ミリ秒～約３０ミリ秒、約１ミリ秒～約２０ミリ秒、約１ミリ秒～約１０ミリ秒、約１０ミリ秒～約１０分、約１０ミリ秒～約５分、約１０ミリ秒～約１分、約１０ミリ秒～約３０秒、約１０ミリ秒～約１５秒、約１０ミリ秒～約１０秒、約１０ミリ秒～約１０秒、約１０ミリ秒～約５秒、約１０ミリ秒～約１秒、約１０ミリ秒～約５００ミリ秒、約１０ミリ秒～約４００ミリ秒、約１０ミリ秒～約３００ミリ秒、約１０ミリ秒～約２００ミリ秒、約１０ミリ秒～約１００ミリ秒、約１０ミリ秒～約５０ミリ秒、約１０ミリ秒～約３０ミリ秒、約１０ミリ秒～約２０ミリ秒、約２０ミリ秒～約１０分、約２０ミリ秒～約５分、約２０ミリ秒～約１分、約２０ミリ秒～約３０秒、約２０ミリ秒～約１５秒、約２０ミリ秒～約１０秒、約２０ミリ秒～約１０秒、約２０ミリ秒～約５秒、約２０ミリ秒～約１秒、約２０ミリ秒～約５００ミリ秒、約２０ミリ秒～約４００ミリ秒、約２０ミリ秒～約３００ミリ秒、約２０ミリ秒～約２００ミリ秒、約２０ミリ秒～約１００ミリ秒、約２０ミリ秒～約５０ミリ秒、約２０ミリ秒～約３０ミリ秒、約３０ミリ秒～約１０分、約３０ミリ秒～約５分、約３０ミリ秒～約１分、約３０ミリ秒～約３０秒、約３０ミリ秒～約１５秒、約３０ミリ秒～約１０秒、約３０ミリ秒～約１０秒、約３０ミリ秒～約５秒、約３０ミリ秒～約１秒、約３０ミリ秒～約５００ミリ秒、約３０ミリ秒～約４００ミリ秒、約３０ミリ秒～約３００ミリ秒、約３０ミリ秒～約２００ミリ秒、約３０ミリ秒～約１００ミリ秒、約３０ミリ秒～約５０ミリ秒、約５０ミリ秒～約１０分、約５０ミリ秒～約５分、約５０ミリ秒～約１分、約５０ミリ秒～約３０秒、約５０ミリ秒～約１５秒、約５０ミリ秒～約１０秒、約５０ミリ秒～約１０秒、約５０ミリ秒～約５秒、約５０ミリ秒～約１秒、約５０ミリ秒～約５００ミリ秒、約５０ミリ秒～約４００ミリ秒、約５０ミリ秒～約３００ミリ秒、約５０ミリ秒～約２００ミリ秒、約５０ミリ秒～約１００ミリ秒、約１００ミリ秒～約１０分、約１００ミリ秒～約５分、約１００ミリ秒～約１分、約１００ミリ秒～約３０秒、約１００ミリ秒～約１５秒、約１００ミリ秒～約１０秒、約１００ミリ秒～約１０秒、約１００ミリ秒～約５秒、約１００ミリ秒～約１秒、約１００ミリ秒～約５００ミリ秒、約１００ミリ秒～約４００ミリ秒、約１００ミリ秒～約３００ミリ秒、約１００ミリ秒～約２００ミリ秒、約２００ミリ秒～約１０分、約２００ミリ秒～約５分、約２００ミリ秒～約１分、約２００ミリ秒～約３０秒、約２００ミリ秒～約１５秒、約２００ミリ秒～約１０秒、約２００ミリ秒～約１０秒、約２００ミリ秒～約５秒、約２００ミリ秒～約１秒、約２００ミリ秒～約５００ミリ秒、約２００ミリ秒～約４００ミリ秒、約２００ミリ秒～約３００ミリ秒、約３００ミリ秒～約１０分、約３００ミリ秒～約５分、約３００ミリ秒～約１分、約３００ミリ秒～約３０秒、約３００ミリ秒～約１５秒、約３００ミリ秒～約１０秒、約３００ミリ秒～約１０秒、約３００ミリ秒～約５秒、約３００ミリ秒～約１秒、約３００ミリ秒～約５００ミリ秒、約３００ミリ秒～約４００ミリ秒、約４００ミリ秒～約１０分、約４００ミリ秒～約５分、約４００ミリ秒～約１分、約４００ミリ秒～約３０秒、約４００ミリ秒～約１５秒、約４００ミリ秒～約１０秒、約４００ミリ秒～約１０秒、約４００ミリ秒～約５秒、約４００ミリ秒～約１秒、約４００ミリ秒～約５００ミリ秒、約５００ミリ秒～約１０分、約５００ミリ秒～約５分、約５００ミリ秒～約１分、約５００ミリ秒～約３０秒、約５００ミリ秒～約１５秒、約５００ミリ秒～約１０秒、約５００ミリ秒～約１０秒、約５００ミリ秒～約５秒、約５００ミリ秒～約１秒、約１秒～約１０分、約１秒～約５分、約１秒～約１分、約１秒～約３０秒、約１秒～約１５秒、約１秒～約１０秒、約１秒～約１０秒、約１秒～約５秒、約５秒～約１０分、約５秒～約５分、約５秒～約１分、約５秒～約３０秒、約５秒～約１５秒、約５秒～約１０秒、約５秒～約１０秒、約１０秒～約１０分、約１０秒～約５分、約１０秒～約１分、約１０秒～約３０秒、約１０秒～約１５秒、約１５秒～約１０分、約１５秒～約５分、約１５秒～約１分、約１５秒～約３０秒、約３０秒～約１０分、約３０秒～約５分、約３０秒～約１分、約１分～約１０分、約１分～約５分、約５分～約１０分又は約１ミリ秒、１０ミリ秒、２０ミリ秒、３０ミリ秒、５０ミリ秒、１００ミリ秒、２００ミリ秒、３００ミリ秒、４００ミリ秒、５００ミリ秒、１秒、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、１分、５分又は１０分であり得る。

【0118】

前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物の量は、少なくとも１コピー（１．６６×１０^－２４モル）であり得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物の量は、約１コピー（１．６６×１０^－２４モル）～約６×１０^２０コピー（１ミリモル）であり得る。例として、限定されるものではないが、分析物の量は、約１０００～１００，０００，０００コピーであり得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物の量は、約１アトモル～約１００ピコモルであり得る。例として、限定されるものではないが、分析物の量は、約１アトモル～約１フェムトモルであり得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、試料中の分析物の濃度は、少なくとも１ゼプトモル濃度、少なくとも１アトモル濃度又は少なくとも１フェムトモル濃度であり得る。例として、限定されるものではないが、試料中の分析物の濃度は、約１アトモル濃度～約１ナノモル濃度であり得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、試料中の分析物の濃度は、１ミリリットルあたり少なくとも１フェムトグラム、１ミリリットルあたり少なくとも１ピコグラム又は１ミリリットルあたり少なくとも１ナノグラムであり得る。例として、限定されるものではないが、試料中の分析物の濃度は、１ミリリットルあたり約１フェムトグラム～１ミリリットルあたり約１００ナノグラムであり得る。例として、限定されるものではないが、試料中の分析物の濃度は、１ミリリットルあたり約１０フェムトグラム～１ミリリットルあたり約１ナノグラムであり得る。

【0119】

前述の方法のいずれかにおいて、十分な条件は、核酸検出について、第１のプローブへの分析物の添加後の全てのステップの間、少なくとも１０ｍＭ、好ましくは、少なくとも１００ｍＭの緩衝液のイオン強度、約５～約９の緩衝液のｐＨ、及び約４℃～約５０℃の温度であり得る。アッセイの任意の必須の構成成分（分析物、プローブなど）が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ又はホスホロチオエート改変なしのＲＮＡヌクレオチドを含む場合、少なくとも１ミリモル濃度若しくは少なくとも１０ミリモル濃度の最終濃度、又は混合物中の全ての二価及び三価金属カチオンの合計濃度よりも高い濃度までエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加することが好ましいことがある。ＲＮａｓｅｓが、混合物中に存在することが公知であり、アッセイの意図されるメカニズム（例えば、サプレッサー分解）の一部ではない場合、アッセイにおけるＲＮＡ構成成分の望まない分解を阻害するために、十分な濃度のＲＮａｓｅ阻害剤を添加することが有利であり得る。前述の方法のいずれかにおいて、条件は、タンパク質について、第１のプローブへの分析物の添加後、約１０ｍＭ～約５００ｍＭの緩衝液のイオン強度、約５～約９の緩衝液のｐＨ、及び約４℃～約５０℃の温度であり得る。前述の方法のいずれかにおいて、分析物が第１のプローブの第１の分析物結合領域に結合するステップは、約１０分～約２４時間行うことが可能であり得る。前述の方法のいずれかにおいて、第２のプローブを第１のプローブ及び分析物を含有する混合物とインキュベートするステップは、約１分～約２４時間行うことが可能であり得る。

【0120】

前述の方法のいずれかにおいて、構成成分、例えば、第１のプローブ及び第２のプローブが、本開示の実施形態のいずれかからの特徴及び特性を有することができることが理解されるべきである。本開示は、本明細書に記載されるシステム及びキットの構成成分部分（第１のプローブ、分析物結合領域、シグナル領域、サプレッサー、第２のプローブ、標識プローブ、多価捕捉プローブ、捕捉プローブなど）のさまざまな配置の組合せのそれぞれについて別々の方法を記載しないが、当業者は、過度の実験なく、本明細書に記載されるさまざまな代替の構成成分の配置及び実施形態により本明細書に記載される方法を改変することができることも理解されるべきである。

【実施例】

【0121】

［実施例１］ ＤＮＡ配列の検出
この実施例及びその関連データを図３～６に表す。

【0122】

ストレプトアビジンコーティング金ナノ粒子（２０ｎｍの名目直径、１１２ｂ）を、ビオチンコーティング顕微鏡カバースリップ（固体支持体、１１２ａ）に結合させた。相補的サプレッサーＤＮＡオリゴヌクレオチド１１８（配列番号３）のための５当量の結合部位（第１のプローブオリゴヌクレオチド、１１４（配列番号２））を含むビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１（シグナル領域）（配列番号１）を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中の１０倍モル過剰の相補的サプレッサーＤＮＡオリゴヌクレオチド１１８（配列番号３）と混ぜ合わせ、７０℃に加熱すること及び次いで５分間室温（およそ２２℃）に冷却することによって、熱的にアニールした。各サプレッサーＤＮＡオリゴヌクレオチド１１８は、第１のプローブ相補領域１１８ａ（配列番号４）及びＧＡＴを含む５’足場領域１１８ｂを含んでいた。ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６（配列番号５）を、１００倍モル過剰のビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１（配列番号１）及び相補的サプレッサーＤＮＡオリゴヌクレオチド１１８（配列番号３）の混合物と混ぜ合わせ、次いでストレプトアビジンコーティング金ナノ粒子を含有するカバースリップ表面に添加して、ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６（配列番号５）及びビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１／サプレッサーＤＮＡオリゴヌクレオチド１１８複合体を金ナノ粒子に結合させて、第１の分析物結合領域１１２、この場合においてストレプトアビジンを含む第１のプローブ１１０を得た。約１０個のビオチン化オリゴヌクレオチドのみが、これらの条件下で各金ナノ粒子に結合することができると推定され、よって、およそ１０％の金ナノ粒子が、１コピー以上のビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６を含有すると予想され、大部分が、ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６のコピーを含有しないと予想されるが、しかしながら、全てのナノ粒子が、ビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１及びサプレッサーＤＮＡオリゴヌクレオチド１１８の約９～１０コピーの複合体を含有すると予想される。対応する陰性対照において、ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６は除外され、ビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１／サプレッサーＤＮＡオリゴヌクレオチド１１８複合体のみが、金ナノ粒子とともにインキュベートされた。２０分後、過剰のオリゴヌクレオチド溶液を除去し、表面を４×ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。

【0123】

次に、第２のプローブ１２０（配列番号６）を、４×ＰＢＳ緩衝液中の２５ナノモル濃度（ｎＭ）の濃度でカバースリップ表面に添加した。第２のプローブ１２０は、ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６と１０個の相補的塩基対を形成する検出オリゴヌクレオチド部分１２２（配列番号７）、並びに不活性ポリ（デオキシチミジン）リンカー（配列番号８）、及び足場媒介鎖置換（ＴＭＳＤ）によって、ビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１からサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８を除去することができるサプレッサー相補領域１２４（配列番号９）を含んでいた。各サプレッサーオリゴヌクレオチド１１８が、サプレッサーオリゴヌクレオチド１１８が第１のプローブ１１０に結合される場合、３個のヌクレオチドのみの足場配列を含有するので、ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６も存在する限り（例えば、これは陰性対照実験に存在しない）、サプレッサーオリゴヌクレオチド１１８の除去は、２５ｎＭの第２のプローブ１２０の存在下で非効率的である。しかしながら、第２のプローブ１２０がビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６に結合している場合、３ヌクレオチドの足場は、第２のプローブ１２０について、ＴＭＳＤによって近位の第１のプローブ１１０からサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８の正確に１コピーを迅速に除去するために、十分である。さらにまた、第２のプローブ１２０が、１０塩基対の長さについて、ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６とのみ相補的であるので、第２のプローブ１２０は、２５℃のインキュベーション温度でビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６から迅速に解離し、第２のプローブ１２０の別のコピーがビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合し、ＴＭＳＤによってサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８の別のコピーを除去し、解離するのを可能にする。そのような結合の多くのサイクル後、サプレッサーオリゴヌクレオチド１１８の多くのコピーが、同じナノ粒子（ナノ粒子及びビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１のうち１個以上のコピーの複合体が、それ自身が第１のプローブ１１０と考えられ得ることに留意されたい）に付着した１個以上のシグナル領域１１１から除去された。

【0124】

３０～１３０分（この場合において４５分）のインキュベーション期間後、第２のプローブ１２０の溶液を除去し、１０ｎＭの蛍光標識された標識オリゴヌクレオチド１３０（配列番号１０）を含有する新たな溶液を添加した。標識オリゴヌクレオチド１３０は、シグナル伝達構成成分１３４、この場合においてＣｙ５フルオロフォア、及びサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８のための結合部位に対して相補的な、したがって、サプレッサーオリゴヌクレオチド１１８のコピーが除去されたこれらの部位に結合するＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチド構成成分１３２を含んでいた。室温で１０分のインキュベーション期間後、蛍光標識された標識オリゴヌクレオチド１３０の溶液を除去し、４×ＰＢＳ中の酸素スカベンジャー系（プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼ、３，４－ジヒドロキシ安息香酸及びトロロクス）を含む溶液を添加した。表面結合ナノ粒子複合体の蛍光強度を、６４０ｎｍの連続波レーザーからの励起を用いる対物レンズ型全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡及び約５００ミリ秒の露出時間を用いる科学的相補型金属酸化膜半導体（ｓＣＭＯＳ）カメラを使用する検出によって測定した。

【0125】

図５に示されるように、測定は、ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６の存在下（「１：１００分析物：カウンター混合物」）の実験について多くの明るい点を明らかにしたがビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６の非存在下（「０：１００分析物：カウンター混合物」）で行われた実験における同じように明るい点の欠如は、単一の第１のプローブ１１０の部分として単一の金ナノ粒子に結合したビオチン化シグナル領域オリゴヌクレオチド１１１からのサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８の多くのコピー数の除去が、ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６の存在下で、その非存在下よりも効率的であることを示した。図５における画像のコントラストが、二量体スポットを不可視にするように調整されたことに留意すべきであるが、しかしながら、両画像は、同じコントラスト範囲に調整され、同一の照明及び検出条件下で収集された。さらにまた、試料の高強度のレーザー励起光への曝露の延長は、図６に示されるように、粒子あたりの光退色ステップの数の分析を可能にし、＞１０の光退色ステップを示す（蛍光標識された標識オリゴヌクレオチド１３０の＞１０コピーの存在、したがって、サプレッサーオリゴヌクレオチド１１８の＞１０コピーの除去を示す）粒子は、ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６が存在する実験（「１：１００分析物：カウンター混合物」）において一般的であるが、ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６が除外された陰性対照実験（「０：１００分析物：カウンター混合物」）において、まれ又は存在しない。ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６の非存在下では、大部分の粒子が、わずか１～５つの光退色ステップを示し、＞１０の光退色ステップを示さなかった。

【0126】

総合すれば、これらの結果は、第２のプローブ１２０及びビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６の相互作用が、ビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６の非存在下で可能であるよりも高い効率で、第１のプローブ１１０の各コピーからのサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８ノ数コピーの除去をもたらし、したがって、明るい点の存在を、混合物中のビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６の存在を推論するために使用することができることを示す。

【0127】

［実施例２］ 第２のプローブのインキュベーション時間の効果の評価
別々の実験において、第２のプローブ１２０を除去し、蛍光標識された標識オリゴヌクレオチド１３０の添加による処理の前に、第２のプローブ１２０を、１５、３０、６０又は８６分の種々の時間量でロードされたナノ粒子とともにインキュベートさせたことを除いて、実施例１の方法論に従った。分析物あり（＋標的）又は分析物なし（－標的）での様々な時点についてのＴＩＲＦ顕微鏡画像を提供する図７に示されるように、より長いインキュベーション時間により増加した点の数及び蛍光強度は、より長いインキュベーション時間が、同じ分析物がロードされた粒子へのより多くの第２のプローブ１２０の結合事象を可能にし、このようにして、より多くのサプレッサーが除去され、個々の第１のプローブからのより強いシグナルを生成するという予想と一致する。

【0128】

図８Ａ～８Ｂは、異なるインキュベーション時間についての種々の閾値（図８Ａ）又は３０，０００任意単位の単一閾値の使用（図８Ｂ）のいずれかによる、図７における結果の定量化を表す。ＦＯＶあたりの許容されるスポット（又は許容されるカウント）は、最小強度閾値を満たす点を含む。この実験における種々の閾値の場合において（図８Ａ）、閾値を、陰性対照測定における視野（ＦＯＶ）あたり１０よりも少ない許容されるカウントを維持しながら、各実験条件について（すなわち、各インキュベーション時間について）、陽性対照（＋標的）測定における許容されるスポットの数及び陰性対照（－標的）測定における許容されるスポットの数の間の相違を最大化するように手作業で選択した。単一の閾値を用いる分析の場合において（図８Ｂ）、最も長いインキュベーション時間（８６分）について選択された閾値を、全ての実験条件に適用した。異なる閾値を異なるインキュベーション時間のために使用する場合、分析物あり及びなし（それぞれ、＋標的及び－標的）での実験間の類似の区別を、３０、６０及び８６分のインキュベーションを用いる実験について達成することができる。３０，０００任意単位の単一強度閾値が全てのインキュベーション時間について使用される場合、非常に明るい点の数が、時間経過を通して増加し続けることが明らかである。

【0129】

［実施例３］ 種々の分析物濃度の効果の評価
別々の実験において、図３に示されるもの（この実験についての分析物の配列は、５’－ビオチン－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧ（配列番号１７）であった）と類似する標的ＤＮＡオリゴヌクレオチド（分析物）を、種々の濃度（１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、１００フェムトモル濃度（ｆＭ）、１０ｆＭ、１ｆＭ又は０ｆＭ）で、ストレプトアビジン改変金ナノ粒子でコーティングされた顕微鏡カバースリップに導入し、３０分間インキュベートして、ビオチン化標的ＤＮＡオリゴヌクレオチド（分析物）の捕捉を可能にした。次いで、サプレッサーオリゴヌクレオチドに結合したシグナル領域を、５０ｎＭで導入し、２０分間インキュベートして、それを同じナノ粒子に結合させた。次いで、２２．５℃で、第２のプローブの存在下、６０分のインキュベーションを使用したが、実施例１に記載されるようにして実験を行った。シグナル領域上の露出部位への蛍光標識された標識オリゴヌクレオチドの結合後、明るい点を再び観察し、明るい点の数は、粒子とともにインキュベートされた標的オリゴヌクレオチド（分析物）の濃度に依存した。それぞれ、２５，０００及び１００，０００任意単位の最小閾値及び最大閾値の間の蛍光強度を有する粒子の数の定量化を、図９に示し、標的（分析物）の濃度をこのアプローチを使用して定量化できることを示す。

【0130】

１０ｆＭ以上の全ての濃度は、陰性対照実験の平均シグナルよりも少なくとも３標準偏差大きい強度閾値（許容されるカウント）を満たす視野あたりの明るい点のカウントを与え、およそ１０ｆＭの検出限界を示唆した。これは、わずか１２．５秒の測定時間（視野あたり０．５秒×２５視野）のみを必要とした。

【0131】

［実施例４］ タンパク質の検出
この実施例及びその関連データを図１０～１１Ｃに表す。

【0132】

この実験は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド検出のために使用された同じアプローチを、タンパク質などの他の種類の生体分子分析物の検出のために適用することができることを実証するために実施した。

【0133】

図１０に示されるシステムを、タンパク質分析物ＰＡＩ－１（プラスミノーゲン活性化因子阻害因子－１）（分析物、１１６）を検出するために設計された実験において実証した。この実験において、ストレプトアビジンコーティング金ナノ粒子（２０ｎｍの名目直径）を、ビオチンコーティング顕微鏡カバースリップに結合させた。次に、第１のプローブ相補領域１１８ａ（配列番号４）及び配列ＧＡＴを有する足場領域１１８ｂを含む相補的サプレッサーＤＮＡオリゴヌクレオチド１１８（配列番号３）のための５当量の結合部位（第１のプローブオリゴヌクレオチド１１４（配列番号２））を含むビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド（シグナル領域、１１１）（配列番号１）を、１×ＰＢＳ緩衝液中の１０倍モル過剰のサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８と混ぜ合わせ、７０℃に加熱すること及び次いで５分間室温に冷却することによって、熱的にアニールした。ＰＡＩ－１に対するビオチン標識化捕捉抗体（第１の結合パートナー、１２６）を、１×ＰＢＳ中の４倍モル過剰のビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１／サプレッサーオリゴヌクレオチド１１８混合物と混ぜ合わせ、次いで、ストレプトアビジンコーティング金ナノ粒子１１２ｂを含有するスライド表面１１２ａに添加して、捕捉抗体及びビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１／サプレッサーオリゴヌクレオチド１１８複合体を金ナノ粒子１１２ｂに、室温で２０分間結合させて、第１の分析物結合領域１１２を含む第１のプローブ１１０を形成した。溶液を除去し、表面を１×ＰＢＳで４回洗浄した。

【0134】

次に、１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１×ＰＢＳ中の４ｎｇ／ｍＬの濃度の分析物ＰＡＩ－１ １１６（Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｐ／Ｎ １７１Ｄ７０００１、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから調製）を含有する混合物を、表面に添加した。対応する陰性対照において、ＰＡＩ－１分析物標準混合物を除外し、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの１×ＰＢＳ中溶液を代わりに添加した。任意の分析物の存在の捕捉を可能にする３０分後、溶液を除去し、表面を１×ＰＢＳで２回洗浄した。

【0135】

次に、第２のプローブ１２０を得るためにジベンゾシクロオクチン／アジドクリックケミストリーを使用して、第２のプローブオリゴヌクレオチドに共有結合的にコンジュゲートされたＰＡＩ－１（第２の結合パートナー、１２８）に対するＦａｂ（抗体）断片、すなわち、Ｆａｂ－第２のプローブオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含有する１×Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）中２４ｎＭの濃度で、表面に添加した。第２のプローブ１２０が分析物１１６に結合されている場合、各第２のプローブ１２０の３ヌクレオチドの足場は、第２のプローブについて、第２のプローブ１２０が、第１のプローブ１１０の近傍に局所的に高濃度で存在するので、ＴＭＳＤによって近位の第１のプローブ１１０からサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８の１コピーを迅速に除去するために、十分である。さらにまた、Ｆａｂが分析物１１６と一過的にのみ結合するので、第２のプローブ１２０は、２５℃のインキュベーション温度でＰＡＩ－１から迅速に解離し、第２のプローブ１２０の別のコピーがＰＡＩ－１の同じコピーに結合し、ＴＭＳＤによって、サプレッサーオリゴヌクレオチド１１８の別のコピーを除去し、解離するのを可能にする。そのような結合の多くのサイクル後、サプレッサーオリゴヌクレオチドの多くのコピーが、同じナノ粒子（ナノ粒子及びビオチン標識化ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１１の複合体が、それ自身が第１のプローブ１１０と考えられ得ることに留意されたい）に付着したオリゴヌクレオチド１１１の１つ以上のコピーを含むシグナル領域から除去された。

【0136】

４５分のインキュベーション期間後、第２のプローブ１２０の溶液を除去し、１０ｎＭの蛍光標識された標識プローブ１３０を含有する新たな溶液を添加した。室温で１０分のインキュベーション期間後、蛍光標識された標識プローブの溶液を除去し、４×ＰＢＳ中の酸素スカベンジャー系（プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼ、３，４－ジヒドロキシ安息香酸及びトロロクス）を含む溶液を添加した。表面結合ナノ粒子複合体の蛍光強度を、６４０ｎｍの連続波レーザーからの励起を用いる対物レンズ型全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法及び科学的金属酸化膜半導体（ｓＣＭＯＳ）カメラを使用する検出によって測定した。

【0137】

測定は、ＰＡＩ－１の存在下での実験について多くの明るい点を明らかにしたが、対応する陰性対照において行われた実験でいくつかの同じように明るい点を明らかにし（図１１Ａ～１１Ｂを参照されたい）、第１のプローブ１１０からのサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８の多くのコピー数の除去が、ＰＡＩ－１の存在下で、その非存在下よりも効率的であること、並びにＰＡＩ－１の存在及び濃度が、取得した画像における明るい点の数（すなわち、対応する陰性対照におけるナノ粒子の大部分よりもそれらを明るくするのに十分な標識を保持するナノ粒子の数）から推論することができることを示した。図１１Ｂは、２５視野からの結果の定量化を提供し、最小及び最大強度閾値を満たす粒子の数が、分析物ＰＡＩ－１の存在下で、その非存在下よりもはるかに多いことを示す。

【0138】

ＰＡＩ－１に加えて、別のタンパク質である腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）の検出を、図１０に示されるアプローチを使用して実証した。この場合において、第２のプローブは、トランス－シクロオクテン／テトラジンクリックケミストリーを使用して検出抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを含んでおり、第１の分析物結合領域（捕捉抗体）及び第２の結合パートナー（検出抗体）は、ＴＮＦ－アルファに特異的であった。しかしながら、オリゴヌクレオチド配列、金ナノ粒子及びアッセイプロトコールは、ＰＡＩ－１検出のために使用されたものと同一であった。ＰＡＩ－１のように、第２のプローブとそれに続く蛍光標識オリゴヌクレオチドとのインキュベーション後、ＴＩＲＦ顕微鏡法は、分析物ＴＮＦ－アルファの存在下（左）で、その非存在下（右）よりも多数の明るい点を明らかにし（図１１Ｃ）、このアプローチを使用して抗原ＴＮＦ－アルファを検出する能力を示した。

【0139】

［実施例５］ 追加システム及び方法の設計
本開示の別の例示的なシステムを図１２に表す。

【0140】

ビオチン改変核酸分析物を検出する代わりに、ビオチン化されていない核酸分析物は、分析物の配列の一部分に対して相補的であり、アッセイのためのシグナル領域の近くの分析物を安定に捕捉する配列を保持するビオチン化捕捉オリゴヌクレオチドを代わりに用いることによって検出することができる。

【0141】

図１２に示されるように、第１のプローブオリゴヌクレオチド１１４を含むビオチン化シグナル領域１１１を、ビオチン化固体支持体１１２ａに連結されているストレプトアビジンコーティング金ナノ粒子１１２ｂに連結することができる。第１の分析物結合領域１１２（捕捉オリゴヌクレオチド）を含むビオチン化捕捉オリゴヌクレオチドを、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、同じ金ナノ粒子に連結して、第１のプローブ１１０を形成することができる。捕捉オリゴヌクレオチドは、第２の配列１１６ｂを有し得る分析物の少なくとも第１の配列１１６ａに対して相補的である任意の配列を含むことができる。サプレッサーオリゴヌクレオチドは、第１のプローブ相補領域１１８ａ及び足場領域１１８ｂを含むことができる。その第１の配列１１６ａによって捕捉オリゴヌクレオチド１１２にハイブリダイズされた分析物の第２の配列１１６ｂとハイブリダイズする、検出オリゴヌクレオチド１２２及びサプレッサー相補領域１２４を含む第２のプローブ１２０を添加することができる。次いで、サプレッサー相補領域１２４は、ＴＭＳＤによってサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８を除去することができる。１個以上のサプレッサーが除去されると、シグナル伝達構成成分１３４及びオリゴヌクレオチド構成成分１３２を含み、第１のプローブオリゴヌクレオチドに対して相補的である、標識１３０を添加し、１個以上のサプレッサーが除去されて、シグナルを生成するシグナル領域１１１と会合することができる。Ｎと称するヌクレオチドが、任意のヌクレオチドであり得、使用される温度及び緩衝液条件で、安定な捕捉のために、捕捉オリゴヌクレオチド及び分析物の間で十分に相補的でなければならないことが理解されるべきである。第２の配列１１６ｂ及び検出オリゴヌクレオチド１２２が、検出オリゴヌクレオチド１２２が、分析物の第２の配列１１６ｂに対して相補的であり、第２の配列１１６ｂからの検出オリゴヌクレオチド１２２の解離が、分析物１１６が捕捉オリゴヌクレオチド１１２から解離する前に、分析物１１６の同じコピーへの多重の第２のプローブ１２０の結合及びそれからの解離を可能にするのに十分に迅速であるという条件で、任意の天然に存在する又は合成の核酸配列を含むことができることも理解されるべきである。

【0142】

図１３は、固体支持体及び金ナノ粒子の間、並びに金ナノ粒子及び捕捉オリゴヌクレオチドとシグナル領域両方の間のストレプトアビジン－ビオチン相互作用が、金－チオール相互作用で置き換えられている、類似のシステムを表す。多くの他の共有結合性及び非共有結合性カップリング化学を、システムの他の構成成分の機能に重大な影響なく、ストレプトアビジン－ビオチン又は金－チオール相互作用の代わりに置換することができることが理解されるべきである。

【0143】

図１４に示されるように、第１のプローブ１１０及び第２のプローブ１２０を含む例示的なタンパク質アッセイシステムは、捕捉抗体（第１の分析物結合領域、１１２）にコンジュゲートされているカルボン酸改変シリカナノ粒子１１２ｂ、及びＥＤＣ－ＮＨＳカップリングを介して第１のプローブオリゴヌクレオチド１１４を含むアミン改変シグナル領域１１１を含むことができる。この実施例において、ナノ粒子は、非共有結合性相互作用を介して、表面（固体支持体、１１２ａ）に結合することができるが、アッセイ表面に共有結合的にカップリングすることもできる（例えば、アミン改変表面へのＥＤＣ－ＮＨＳカップリングを介して）。示されるように、分析物１１６の存在下で、サプレッサー相補領域１２４、並びに第２の結合パートナー１２８、例えば、抗体又はその断片を含む第２のプローブ１２０は、分析物に結合することができ、サプレッサー相補領域を介して、第１のプローブ相補領域１１８ａ及び足場領域１１８ｂを含むサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８のうち１個以上を除去することができる。その後の検出は、本明細書に記載されるようにして行うことができる。

【0144】

図１５に示されるように、例示的なタンパク質アッセイシステムは、第１の分析物結合領域及びシグナル領域を、２個の間の化学量論だけでなく、アッセイ表面から離れて溶液への他の機能的構成成分の突出の制御を用いて、互いに近接して位置させるためにＤＮＡオリガミを使用する。構成成分の溶液への突出は、ＤＮＡオリガミ上の１個、２個、又はそれよりも多くの表面テザリングリガンド又は官能基（この実施例ではビオチン）を部位特異的に位置させて、構造が、アッセイ表面に対して特定の配向で固定されるのを確実にする能力によって容易にされる。このシステムにおいて、捕捉抗体１２６（第１の結合パートナー）及びシグナル領域１１１は、ハニカム格子構成に基づくＤＮＡオリガミ構造１１２ｂに結合し、ＤＮＡオリガミ１１２ｂは、次に、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介して、表面１１２ａに結合する。ＤＮＡナノテクノロジーの当業者は、当技術分野における通常の技能内で、図１５に示される様式で、シグナル領域オリゴヌクレオチド１１１、ＤＮＡ－抗体コンジュゲート及びビオチン基又は他の親和性タグを有するＤＮＡオリガミを部位特異的に装飾することだけでなく、シグナル領域オリゴヌクレオチド及び捕捉プローブ、並びに／又は分析物の多くの他の配置を実現し、多種多様な他の二次元又は三次元構造を有するＤＮＡオリガミを作成することを認識する。上記に記載されるナノ粒子構成とは異なって、相対位置、化学量論及びアッセイ表面に対する位置は全て、このＤＮＡオリガミスキャフォールドを使用して制御することができる。図１５の例において、分析物１１６は、捕捉抗体１２６に結合し、捕捉抗体１２６は、次に、捕捉抗体に付着したオリゴヌクレオチド配列及びＤＮＡオリガミ１１２ｂにおいて表面から離れて突出するオリゴヌクレオチド配列の間の相補性によってＤＮＡオリガミにテザリングされる。第２の結合パートナー１２８及びサプレッサー相補領域１２４を含む第２のプローブ１２０は、次いで、分析物に結合し、サプレッサーオリゴヌクレオチド１１８を第１のプローブ１１０上のシグナル領域１１１から除去することができる。Ｎと称するヌクレオチドが、任意のヌクレオチドであり得、使用される温度及び緩衝液条件で、安定な捕捉のために、捕捉オリゴヌクレオチド１１２及び捕捉抗体１２６にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの間で十分に相補的でなければならないことが理解されるべきである。

【0145】

さらにまた、システムは、中間ナノ粒子の使用なしで構築することができる。例えば、１個以上のシグナル領域は、捕捉プローブ（第１の分析物結合領域）又は分析物に、共有結合的に又は非共有結合的に、直接的に結合してよい。例えば、図１６は、シグナル領域１１１が捕捉抗体１２６（第１の分析物結合領域）に直接的にコンジュゲートされ、これが、次に、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、アッセイ表面１１２ａに固定される、第１のプローブ１１０を含むシステムを図示する。共有結合性化学（例えば、ＤＢＣＯ／アジドクリックケミストリー、ＮＨＳエステル／アミン化学）又は非共有結合性化学（例えば、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用）を使用するものを含む、生物学的コンジュゲーション化学の分野における当業者に認識される、オリゴヌクレオチド又は他のカウンタープローブを抗体にコンジュゲートするための多くの手段がある。あるいは、表面との相互作用は、シグナル領域それ自身によって、又は分析物によって媒介され得る。核酸分析物の場合において、シグナル領域は、第２のプローブに結合する部位の近位の部位で分析物に直接的にハイブリダイズすることができ、この実例において、シグナル領域は、分析物と安定に相互作用する捕捉オリゴヌクレオチド配列と近接している。図１６の例において、分析物１１６は、捕捉抗体１２６に結合することができる。分析物への第２の結合パートナー１２８及びサプレッサー相補領域１２４を含む第２のプローブ１２０の結合の際に、第２のプローブは、シグナル領域１１１及び足場領域１１８ｂの第１のプローブオリゴヌクレオチド１１４に対して相補的である第１のプローブ相補領域１１８ａをそれぞれ含む、１個以上のサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８を除去することができる。第２のプローブは、ＴＭＳＤによって１個以上のサプレッサーを除去することができる。

【0146】

アッセイシステムは、核酸を含まないが、代わりにタンパク質、ペプチド、他のバイオポリマー又は他の化学基を含むシグナル領域及び／又はサプレッサーを使用して構築することもできる。生化学及び生物工学の分野における当業者は、多種多様な天然に存在する及び操作された酵素及び酵素基質の両方が存在すること、並びにそれらの基質に対するこれらの酵素の特異性が、多くの場合に、生化学アッセイ又はバイオマーカーアッセイにおいて有用であるのに十分に高いことを認識する。当業者は、ペプチド及び他の有機ポリマーを、部位特異的な様式で、他の構成成分のその後の付着に使用することができるモノマー単位の特異的配列及び／又は部位特異的化学官能基を保持するように操作することができる（例えば、固相合成及び／又は酵素改変のような方法を介して）ことも認識する。したがって、本アプローチの一部の実施形態が、核酸を含まない、第１のプローブ、サプレッサー及び／又は第２のプローブを利用することが期待される。図１７は、酵素がコンジュゲートされた第２のプローブ２２０、並びに酵素のための基質としての役割を果たすことができ、シグナル領域２１１の長さに沿って分布する反応性化学基（例えば、Ｎ_３）を覆い隠すサプレッサー２１８として嵩高いポリマー置換基を保持するシグナル領域２１１を用いるそのような一実施形態の例を図示する。分析物２１６は、固体支持体２２１ａ、この場合においてストレプトアビジン－ビオチン相互作用に結合する、次に、金ナノ粒子２１２ｂに結合する第１の結合パートナー２２６（第１の分析物結合領域）に結合することができる。この実施形態において、第２の結合パートナー２２８（第２の分析物結合領域）及びサプレッサー相互作用領域（酵素、２２４）を含む第２のプローブ２２０の結合は、酵素２２４をシグナル領域２１１に近接して位置させ、酵素によるサプレッサー２１８の分解及び／又は除去を加速させる。サプレッサーが除去されると、１個以上の反応性化学基（この場合においてアジド官能性）が露出する。第２のプローブの結合及び解離の多くのサイクル後、多重のサプレッサーが、分解及び／又は除去され、反応性基の多くのコピーが露出する。反応性基は、次いで、対応する反応性基（標識プローブ、２３０）（この場合において、銅不含クリックケミストリーのための、ジベンゾシクロオクチン基、ＤＢＣＯ）及び検出可能な標識、例えば、フルオロフォアの両方を保持する試薬と反応し得、カウンタープローブ上の露出した部位への多くの標識の結合をもたらし、強いシグナルを生じる。これらの実施形態では、標識を保持する試薬は、サプレッサーによって覆い隠される部位と相対的に非反応性でなければならず、例えば、標識は、サプレッサーがシグナル領域上の隣接部位に存在する場合に、シグナル領域上の対応する反応性基と反応する反応性基について、立体障害がそれを不可能にする（又は非常に遅くする）嵩高いポリマーを含んでいてよい。各酵素について、解離する前に、限定的な数（例えば、１個又は２個）のサプレッサーをプロセシングすることができることも好ましい。これは、シングルターンオーバー酵素、第２のプローブが標的から解離するよりもゆっくりとそのプロセシングされた基質から解離する酵素、又は酵素によってプロセシングされる際に酵素を不活性化するいわゆる「自殺基質」のいずれかを使用することによって成し遂げられてよい。各第２のプローブの結合事象による制御された限定的なプロセシングを確実にするために、単一の部位特異的プロセシング部位を有するサプレッサー、例えば、特異的プロテアーゼ基質配列を保持するペプチド又はヌクレアーゼ基質配列を保持する核酸を使用することも有益である。

【0147】

除去される多重のサプレッサープローブを有する第１のプローブを感度良く検出するために（例えば、蛍光顕微鏡法によって）安定なアンカリング点としてアッセイ表面を用いることが有益であることが多いが、これは、ここに開示される方法及びシステムのために必要ではない。例えば、第１のプローブからのサプレッサーの喪失、及び／又は第１のプローブへの多重の標識のその後の結合は、溶液又はコロイド懸濁液を生じさせることができ、次いで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）、質量分析、フローサイトメトリー、側方流動アッセイ、あるいは多重のサプレッサーの喪失又は多重のサプレッサーの喪失から生じるシグナル若しくは親和性基の獲得に感受性である他の方法などの方法によって検出することができる（図１８）。一部の実施形態において、標識は、電気泳動アッセイにおいて大きな移動度シフトをもたらす高分子量の構成成分を含む。図１８に示されるように、第１のプローブは、分析物１１６に結合する第１の分析物結合領域として作用することができる捕捉オリゴヌクレオチド１１２を含むことができる。捕捉オリゴヌクレオチドは足場領域１１８ｂ及び第１のプローブ相補領域１１８ａを含み得るサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８に対して相補的である第１のプローブオリゴヌクレオチドを有し得るシグナル領域１１１に連結され得る。第１のプローブに結合した分析物に結合し得る第２のプローブ１２０を添加する際に、第２のプローブ１２０は、１個以上のサプレッサー１１８を除去することができる。いくつかのサプレッサーの除去後、サプレッサーの除去は、非顕微鏡法、例えば、電気泳動、フローサイトメトリー、側方流動アッセイなどによって測定することができる。あるいは、非顕微鏡法、例えば、電気泳動、フローサイトメトリー、側方流動アッセイなどによって、又は第１のプローブを表面に結合させ、蛍光顕微鏡法などの可視化法を介して検出することによって同様に検出され得る、サプレッサー１１８が除去されたシグナル領域１１１に結合する標識プローブ１３０を添加することができる。

【0148】

一部の実施形態において、標識は、サプレッサーの除去後に添加されない。代わりに、第１のプローブそれ自身からの多重のサプレッサーの除去は、分析物が、シグナル領域と会合する、又は会合していたシグナルとしての役割を果たす。例えば、多重のサプレッサーの除去は、質量の変化、及び／又は例えば、電気泳動移動度の変化として検出することができる流体力学半径をもたらす。あるいは、シグナル領域は、例えば、蛍光消光剤を保持する隣接サプレッサーの除去の際に検出可能になる、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）を保持し得る。多重のサプレッサーの除去の際に、カウンタープローブの多重のフルオロフォアは、発光し、明るい蛍光シグナルをもたらす（図１９）。図１９に示されるように、第１のプローブは、結合した標識、この場合ではフルオロフォア（Ｆ）を有するシグナル領域３１１を含むことができるが、サプレッサー３１８は、サプレッサーが第１のプローブ３１０のシグナル領域３１１に結合されると、フルオロフォアの蛍光をブロックする消光剤（Ｑ）を含むことができる。この例において、分析物３１６は、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用によって表面３１２ａに付着することができる金ナノ粒子３１２ｂ上のストレプトアビジンに結合することができるビオチン化オリゴヌクレオチドであり、サプレッサー３１８は、第１のプローブ相補領域３１８ａ及び足場領域１１８ｂを含む。検出オリゴヌクレオチド３２２（第２の分析物結合領域）及びサプレッサー相補領域３２４を含む第２のプローブ３２０は、次いで、分析物３１６に結合し、この場合ではＴＭＳＤによって、サプレッサー３１８のうち１個以上を除去することができる。１個以上のサプレッサーが除去されると、フルオロフォアからのシグナルは、消光剤がもはやフルオロフォアに近接していないので、検出することができる。

【0149】

当業者は、分析物捕捉の安定性及び／若しくは特異性を増加又は減少させるために、あるいは、ヌクレアーゼ及び他の潜在的に干渉するマトリックス基質に対する耐性を付与するために、捕捉オリゴヌクレオチドに追加することができる多くの改変並びに特性が存在することを認識する。これらの可能性がある改変としては、限定されるものではないが、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、アンロックド（ＵＮＡ）ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオチド、２’－フルオロ－ＲＮＡヌクレオチド及びホスホロチオエート改変が挙げられる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブ中のいくつかのＤＮＡヌクレオチドのＬＮＡ残基による置き換えが、分析物とのハイブリダイゼーションの安定性、及び分析物から競合する核酸を取り換えるプローブの能力を増加させることができることが本分野において十分に認識される。

【0150】

さらに、システムは、捕捉プローブ、捕捉抗体及び／又は第１のプローブが、多くの他の種類の共有結合性及び非共有結合性相互作用を介して、互いに直接的に又はナノ粒子に接合され得るので、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を含むことを必要としない。例えば、図１３に示されるシステムは、ナノ粒子を捕捉オリゴヌクレオチド及び１個以上のシグナル領域に、並びにアッセイ表面に結合する、金－チオール相互作用を用いる。

【0151】

［実施例６］ ナノ粒子なしのシステム及び方法
アッセイを、ビオチン－ＰＥＧコーティングガラスカバースリップ１１２ａの表面上に固定化されたストレプトアビジン結合シグナル領域１１１を使用して、ビオチン化オリゴヌクレオチド分析物を検出するために設計した（図２０）。このシステムにおいて、ストレプトアビジン１１２、シグナル領域１１１及びサプレッサーオリゴヌクレオチド１１８の複合体は、第１のプローブの役割を果たし、第１の配列１１６ａ及び第２の配列１１６ｂを含む分析物１１６は、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用によって第１のプローブに結合し、第２のプローブ１２０は、サプレッサー相補領域１２４に連結された検出オリゴヌクレオチド１２２を含む。

【0152】

最初に、相補的サプレッサーＤＮＡオリゴヌクレオチド１１８のための９当量の結合部位を含むビオチン標識化シグナル領域１１１を、１×ＰＢＳ緩衝液中の２０倍モル過剰のサプレッサー１１８と混ぜ合わせ、７０℃に加熱すること及び次いで５分間室温に冷却することによって、熱的にアニールした。シグナル領域１１１及びサプレッサー１１８の複合体を、次いで、ＰＢＳ中の１当量（シグナル領域１１１の濃度に関して）の濃度のストレプトアビジン、及びＰＢＳ中の１当量の濃度のビオチン標識化分析物ＤＮＡオリゴヌクレオチド１１６又はブランクＰＢＳ緩衝溶液のいずれかと混ぜ合わせた。これらの条件下、大部分のストレプトアビジン分子は、ストレプトアビジン複合体あたり９又は１８個のサプレッサー部位に対応するシグナル領域１１１の１又は２コピーのいずれかに結合すると予想される。１０分間インキュベーションした後、試料を、ＰＢＳ緩衝液中で１００ｐＭ（ストレプトアビジンに関して）に希釈し、ビオチン－ＰＥＧコーティングカバースリップの表面に添加し、１０分間インキュベートした。溶液を除去し、第２のプローブ１２０を、４×ＰＢＳ中の２５ナノモル濃度（ｎＭ）の表面に添加し、およそ２２℃の温度で３０分間インキュベートした。インキュベーション期間後、第２のプローブ１２０の溶液を除去し、１００ｎＭの蛍光標識されたプローブオリゴヌクレオチド１３０を含有する新たな溶液を添加した。標識プローブ１３０は、サプレッサー１１８のための結合部位に対して相補的なＤＮＡ配列を含み、したがって、サプレッサー１１８のコピーが除去されたそれらの部位に結合する。室温で７分のインキュベーション期間後、標識プローブ１３０の溶液を除去し、４×ＰＢＳ中の酸素スカベンジャー系（プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼ、３，４－ジヒドロキシ安息香酸及びトロロクス）を含む溶液を添加した。表面結合ストレプトアビジン複合体の蛍光強度を、６４０ｎｍの連続波レーザーからの励起を用いる対物レンズ型全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法及び科学的相補型金属酸化膜半導体（ｓＣＭＯＳ）カメラを使用する検出によって測定した。測定は、分析物の存在下での実験について多くの明るい点を明らかにしたが、分析物の非存在下で行われた実験で同じように明るい点の欠如を明らかにし（図２１）、単一ストレプトアビジン分子に結合したシグナル領域からのサプレッサーの多くのコピー数の除去が、分析物の存在下で、その非存在下よりも効率的であることを示した。並行して、同じ実験を、混合物中のシグナル領域及びサプレッサーの量を一定に保ちながら、０．１：１及び０．０１：１を含む分析物のストレプトアビジンに対する比の減少を使用して行った。より低い分析物の濃度は、分析物の濃度が減少するにつれてより少ない明るい点の数を生じたが、分析物の非存在下よりも多くの明るい点を生じ、本技法が、分析物を定量化するための方法としての役割を果たすことができることを示唆した。

【0153】

当業者は、ストレプトアビジン－ビオチン及び金－チオール相互作用に加えて、さまざまなクリックケミストリー試薬の対（例えば、アジド＋アルキン又はトランス－シクロオクテン＋テトラジン）、カルボン酸及びアミンの間のＥＤＣ－ＮＨＳカップリング、チオール－マレイミドカップリング、アミン－ＮＨＳエステルカップリング、静電相互作用、核酸二重鎖の同軸スタッキング、水素結合相互作用などを含む、同じカップリングを成し遂げることができる多くの代替が存在することを認識する。

【0154】

［実施例７］ 多価捕捉プローブを使用する溶液に基づくアッセイ
図２４は、多価標識相互作用プローブを用いることによる、固体支持体に対する第１のプローブのシグナル領域の多価捕捉の使用を記載する。実験を実施して、実施例６に記載されるストレプトアビジン架橋によって接続されたＤＮＡ分析物１１６（ＤＮＡ標的）及びシグナル領域１１１を使用するこのアプローチを実証した。しかしながら、実施例６と異なって、サプレッサーオリゴヌクレオチドの除去及び標識プローブの結合を含むインキュベーションステップを、溶液中で行った。これらの実験（図２５、パネルＡ）における標識プローブは、フルオロフォア（Ｆ、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）、及び多価標識相互作用プローブ（ＭＰ）において相補配列と相互作用する５ヌクレオチドモチーフ（ＣＴＴＧＧ）を含む親和性構成成分を含んでいた。個々の親和性構成成分とＭＰの相互作用は、周囲条件（およそ２５℃、およそ１５０～６００ｍＭのＮａ^＋）下で安定な複合体を生じるのに十分に強くないが、単一シグナル領域上の多重のＬＡプローブの存在は、周囲条件下で安定であるＭＰとの多価相互作用を生じ、蛍光顕微鏡法による検出のために、固体支持体（例えば、ビオチン化、ストレプトアビジン改変ガラスカバースリップ）へのシグナル領域の固定化を可能にした。

【0155】

最初に、ビオチン－ＰＥＧコーティングカバースリップを、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジンで１０分間コーティングし、１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、１００ｎＭの多価標識相互作用プローブ（ＭＰ）で３０分間コーティングし、１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。これにより、シグナル領域の多価捕捉のためのＭＰでコーティングされた固体支持体を与えた。相補的サプレッサーオリゴヌクレオチド１１８のための９当量の結合部位を含むビオチン標識化シグナル領域１１１を、１×ＰＢＳ緩衝液中の２０倍モル過剰のサプレッサー１１８と混ぜ合わせ、７０℃に加熱すること及び次いで５分間室温に冷却することによって、熱的にアニールした。シグナル領域１１１及びサプレッサー１１８の複合体を、次いで、ＰＢＳ中の３倍低い（シグナル領域１１１の濃度に関して）モル濃度のストレプトアビジンと混ぜ合わせ、１０分間インキュベートし、次いで、２００ｐＭのビオチン標識化分析物オリゴヌクレオチド１１６を含有する又は任意のオリゴヌクレオチドを含有しない（ブランク）４×ＰＢＳ中で１ｎＭ（ストレプトアビジンに関して）に希釈した。次に、シグナル領域、サプレッサー、分析物の複合体を含有する溶液又はブランク溶液、及びストレプトアビジンを、４×ＰＢＳ中の等体積の５０ｎＭの第２のプローブ１２０と混ぜ合わせ、２５ｎＭの第２のプローブ、０．５ｎＭのストレプトアビジン複合体及び１００又は０ｎＭの分析物オリゴヌクレオチドの濃度を得た。これらの溶液を、およそ２５℃で２時間インキュベートした。インキュベーション期間後、各溶液を、１×ＰＢＳ中の５０ｎＭの親和性構成成分（ＬＡ）を有する蛍光標識されたプローブオリゴヌクレオチドを含有する等体積の別の溶液と混ぜ合わせた（すなわち、ＬＡは１２０に対して２倍モル過剰で存在する）。各溶液を、ＭＰでコーティングされたカバースリップが露出した別々のチャンバーに添加し、室温で３０分間インキュベートし、光から保護して、ＬＡの多重のコピーを保持する複合体の多価捕捉を可能にした。溶液を除去し、４×ＰＢＳ中の酸素スカベンジャー系（プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼ、３，４－ジヒドロキシ安息香酸及びトロロクス）を含む溶液によって置き換えた。表面結合ストレプトアビジン複合体の蛍光強度を、６４０ｎｍの連続波レーザーからの励起を用いる対物レンズ型全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法及び科学的相補型金属酸化膜半導体（ｓＣＭＯＳ）カメラを使用する検出によって測定した。測定は、ＤＮＡ分析物を含有する反応における多くの明るい点を明らかにしたが、分析物なしのブランクＰＢＳ溶液を含有する反応においていくつかの明るい点又は明るい点がないことを明らかにした（図２５、パネルＢ）。そのため、溶液中で第２のプローブとの反応を行うことによる分析物の検出とそれに続くイメージング表面での多価捕捉は実現可能である。

【0156】

［実施例８］ １８個の標識プローブ部位を有する分岐状シグナル領域は、９個の標識プローブ部位を有する線状シグナル領域よりも明るい陽性シグナルを提供する
実験を実施して、線状構造ではなく分岐状核酸構造を含むシグナル領域の有用性を実証した。すなわち、サプレッサーオリゴヌクレオチド結合部位の線形配置の代わりに、第１のプローブは、サプレッサーオリゴヌクレオチド結合部位が構造の異なる分岐の間に分布している核酸の分岐状構造を含み得る。例示的な一実験を、一部の測定において、線状シグナル領域１１１を、図２６に示されるように分岐状構造Ｂで置き換えたことを除いて、実施例６と同じように行った。分岐状構造の使用は、サプレッサー部位を比較的近くに、かつ分析物又は分析物結合部位にアクセス可能に保ちながら、各標的（分析物）分子が、複数の第２のプローブとのその相互作用を介して、線状の第１のプローブ（最大で９）の場合におけるよりも多数のサプレッサーオリゴヌクレオチド（最大で１８）を除去する機会を提供する。分岐状の第１のプローブＢの使用は、分析物オリゴヌクレオチド１１６の存在下で実施された実験において、線状シグナル領域１１１（図２６、パネルＣ）と比較して、蛍光点の平均明るさのおよそ１．５倍の増加（図２６、パネルＤ）をもたらしたが、ブランク溶液の存在下での点の明るさは十分に増加しなかった。

【0157】

［実施例９］ ≧９９．９９％の特異性での単一ヌクレオチド置換の検出
アッセイを、単一のアデノシン－チミン（ＡからＴ）置換を除いて標的配列と同一である非標的配列の存在下で標的ＤＮＡ配列を検出するために設計した。標的配列Ｔ１（配列番号１７）は、図２０に開示される分析物１１６（５’ビオチン－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧ）と同一であり、非標的配列Ｔ２は、５’ビオチン－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＡＧ（配列番号３５）であり、ここで、単一ヌクレオチド置換の位置は、両配列において、太字及び下線付きで示される。実験を、下記で論じられる相違を除いて実施例６と同じように実施した。

【0158】

標的ＤＮＡ Ｔ１及び非ＤＮＡ対照条件（ブランク、標的ＤＮＡが除外される場合）に加えて、反復測定を行い、ここで、標的ＤＮＡは、非標的ＤＮＡ Ｔ２によって置き換えられた。Ｔ１及びＴ２を、それらの個々の試料中で同じ濃度（２００ピコモル濃度）で使用し、これらの２オリゴヌクレオチドを含有する試料の測定間の直接比較を可能にした。

【0159】

一部の反復において、Ｔ２の一部分に対して完全に相補的であるが、Ｔ１の対応する部分との単一ヌクレオチドミスマッチを有するように設計された競合用配列Ｃ（５’－ＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣ）（配列番号３６）を、２５ナノモル濃度の第２のプローブ１２０とのインキュベーションステップの間に、およそ１００ナノモル濃度の濃度で添加した。

【0160】

図２７に示されるように、蛍光顕微鏡法によって観察された蛍光点の強度のヒストグラムは、予想される結果と一致する：すなわち、Ｔ２の存在下又はブランク試料で観察された点よりも非常に（およそ４～１０倍）明るかった点の集団が、Ｔ１の存在下で観察され、競合因子Ｃの添加は、Ｔ２の存在下で点の平均強度をさらに低減し、その結果、ヒストグラムは、ブランク試料に非常に近く似ていた。この強度の相違は、閾値（図２７における垂直の破線）を使用して、Ｔ１の存在下でＴ１の検出事象として大部分の明るいスポットをカウントしながら（又は許容しながら）、ブランク及びＴ２データセットにおけるほぼ全てのスポットを除くのに十分に大きかった。競合因子の存在下で、Ｔ１の存在下でその強度が閾値を超える点（視野、ＦＯＶあたりおよそ５０００）のＴ２の存在下でその強度が閾値を超える点（ＦＦＯＶあたりおよそ０．３）に対する比は、９９．９９％超の単一ヌクレオチド選択性を示唆する。

【0161】

［実施例１０］ シグナル領域が分析物配列への直接ハイブリダイゼーションによって分析物と会合している標的核酸分析物のアッセイ
アッセイを、分析物に直接的にハイブリダイズされたシグナル領域を使用してビオチン化オリゴヌクレオチド分析物を検出するために設計し（図２８）、ここで、シグナル領域及び分析物の複合体は、ストレプトアビジンコーティングガラスカバースリップの表面上に固定化された。最初に、ビオチン－ＰＥＧコーティングカバースリップを、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジンとともに１０分間インキュベートし、次いで、１×ＰＢＳで３回洗浄して、カバースリップをストレプトアビジンでコーティングした。次に、１×ＰＢＳ中の０～１０００フェムトモル濃度（ｆＭ）の分析物、１０ｎＭの２個のシグナル領域オリゴヌクレオチド配列のそれぞれ（図２８）及び１００ｎＭのサプレッサーオリゴヌクレオチド（図２８）を含有する溶液を、７０℃に１分間加熱し、次いで室温（約２２℃）に１０分間置いた。０～１０００ｆＭの分析物の溶液を、ストレプトアビジンコーティングカバースリップと接触させて、２５℃でおよそ３０分間、別々のチャンバー中でインキュベートして、カバースリップ表面での分析物複合体の捕捉を可能にした。次に、分析物溶液を除去し、４×ＰＢＳ中の２５ｎＭの第２のプローブを含有する溶液によって置き換え、カバースリップアセンブリーを、２５℃で１時間３０分間インキュベートした。第２のプローブ溶液を除去し、４×ＰＢＳ中の１００ｎＭの標識プローブ１３０を含有する溶液によって置き換え、およそ２２℃で５分間インキュベートした。標識プローブ溶液を除去し、４×ＰＢＳ中の酸素スカベンジャー系（プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼ、３，４－ジヒドロキシ安息香酸及びトロロクス）を含む溶液によって置き換えた。表面結合シグナル領域複合体の蛍光強度を、６４０ｎｍの連続波レーザーからの励起を用いる対物レンズ型全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法及び科学的相補型金属酸化膜半導体（ｓＣＭＯＳ）カメラを使用する検出によって測定した。ブランクにおいて最小カウントの偽陽性であるが分析物の存在下で最大カウントの真陽性を選択する閾値である、１０，０００ＡＵ～５０，０００ＡＵの蛍光強度での顕微鏡の視野あたりの点の数を、０～１０００ｆＭの分析物の範囲の各条件について定量化した。これらのＦＯＶあたりの強度閾値（許容されるカウント）を通過したスポットの数を、濃度の関数としてプロットした（図２８）。ブランクシグナルに等しい～３標準偏差上回る許容されるカウントの数を与えると予測される濃度として決定されるこのアッセイの検出限界は、２ｆＭであった。そのため、アッセイは、核酸分析物の検出について、少なくとも低フェムトモル濃度の感度を与える。

【0162】

［実施例１１］ ストレプトアビジンコーティングマイクロ粒子が捕捉表面として使用されるアッセイにおけるビオチン化核酸分析物の検出及び単一ヌクレオチドの区別
アッセイを、非標的オリゴヌクレオチド（非標的）ではなく、ビオチン化標的オリゴヌクレオチド（標的）を検出するために設計し、ここで、標的及び非標的は、単一ヌクレオチド置換によって異なり（図２９における下線付きヌクレオチド）、すなわち、標的及び非標的は、単一ヌクレオチドバリアント又は互いの点突然変異体であり、ここで、標的及び／又は非標的は、顕微鏡カバースリップではなく、ストレプトアビジンコーティングマイクロ粒子の表面で固定化される。アッセイは、実施例１０におけるように、同じシグナル領域、サプレッサー及び第２のプローブオリゴヌクレオチドを使用し（図２８）、標的オリゴヌクレオチドは、実施例１０における分析物と同じである（図２８）。加えて、競合用オリゴヌクレオチドＣ（５’－ＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣ）（配列番号３６）を使用した。最初に、１×ＰＢＳ中の０～１０００フェムトモル濃度（ｆＭ）の標的及び／又は非標的、１０ｎＭの２個のシグナル領域オリゴヌクレオチド配列のそれぞれ（図２８）及び１００ｎＭのサプレッサーオリゴヌクレオチド（図２８）を含有する溶液を、７０℃に１分間加熱し、次いで室温（約２２℃）に１０分間置いた。次に、試料を、ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｔ１磁気ストレプトアビジンコーティングビーズ（マイクロ粒子）の懸濁液に添加して、１時間３０分間、ビオチン化オリゴヌクレオチドを、ビーズに結合させた。管を、磁気ラック上において、磁気ビーズをプルダウンし、上清を各管から除去し、ビーズを管に残した。ビーズを、４×ＰＢＳ中の２５ｎＭの第２のプローブを含有する溶液に再懸濁し、２５℃で１時間３０分間インキュベートした。ビーズを、磁気管ラック上でプルダウンした。第２のプローブ溶液を除去し、ビーズを４×ＰＢＳ中の１００ｎＭの標識プローブ１３０を含有する溶液に再懸濁し、次いで、およそ２２℃で１０分間インキュベートした。ビーズを、磁気管ラック上でプルダウンした。標識プローブ溶液を除去し、ビーズを４×ＰＢＳ中の酸素スカベンジャー系（プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼ、３，４－ジヒドロキシ安息香酸及びトロロクス）を含む溶液に再懸濁した。ビーズの懸濁液を、ビオチン－ＰＥＧコーティングカバースリップ上の磁石を介してプルダウンし、これにより、非占有ストレプトアビジン部位を介してビーズを固定化した。表面結合ビーズを、６４０ｎｍの連続波レーザーからの励起を用いる対物レンズ型薄層斜光照明（ＨＩＬＯ）顕微鏡法及び科学的相補型金属酸化膜半導体（ｓＣＭＯＳ）カメラを使用する検出によって画像化した。ビーズの各セットも、明視野顕微鏡法を使用して画像化して、蛍光強度から独立して、ビーズの位置を決定した。各ビーズの蛍光強度を、ＩｍａｇｅＪにおいて２０ピクセルのローリングボール半径を使用して任意のバックグラウンド蛍光を減算した後、ビーズ領域全体にわたって蛍光を合計することによって決定し、各視野内の平均ビーズ強度を算出した。図２９に示されるように、蛍光シグナルは、１０ｆＭ程度の少ない標的を含有する試料において検出可能であったが、１０～１０００ｆＭの非標的を含有する試料において、バックグラウンドを上回るわずかなシグナルが検出され、又はシグナルは検出されなかった。加えて、１０ｆＭの標的は、１０００ｆＭの非標的も含有する溶液中で容易に検出可能であった。ブランクシグナルを３標準偏差上回るシグナルを生じると予想される標的の濃度として検出される検出限界は、およそ１ｆＭであった。したがって、低フェムトモル濃度の標的核酸の検出、及び高い特異性で単一ヌクレオチドバリアント又は突然変異体間を識別する能力を、ビーズに基づくアッセイを使用して実証した。

【0163】

［実施例１２］ ２５％の血清中のビオチン化オリゴヌクレオチドの検出
アッセイを、２５％の血清中でビオチン化標的オリゴヌクレオチド（分析物）を検出するために設計した。アッセイは、第２のプローブとのインキュベーションを、２５％のウマ血清あり又はなしの２×ＴＢＳ中で行った以外は、実施例６のものと同一であった。ここに図３０を参照して、アッセイは、２５％の血清の存在下（＋分析物：１１９８＋／－１６、ブランク：０．８＋／－０．３、エラーバー＝１ｓ．ｄ．）及び非存在下（＋分析物：１２０２＋／－２１、ブランク：０．５＋／－０．３、エラーバー＝１ｓ．ｄ．）で、２０，０００ＡＵの閾値を超える明るい蛍光点の統計学的に区別できない数を与え、すなわち、結果は、血清の存在下及び非存在下で１標準偏差以内であり、アッセイが複雑な生物学的マトリックスに対してロバストであることを示した。

【0164】

［実施例１３］ 天然のＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を持つ標的オリゴヌクレオチドの検出
アッセイを、がんのためのバイオマーカーである天然に存在するＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む標的オリゴヌクレオチド分析物を検出するために設計した。アッセイを、図３１に示されるオリゴヌクレオチド配列の異なるセットを用いるが、実施例１０に類似する様式で行った。加えて、ビオチン標識を介して標的オリゴヌクレオチド配列を捕捉する代わりに、分析物配列は、いくつかのロックド核酸（ＬＮＡ）改変（Ｃａｐにおける下線付きのオリゴヌクレオチド、図３１）を含むビオチン化捕捉オリゴヌクレオチド（Ｃａｐ）を使用して捕捉される。最初に、ビオチン－ＰＥＧコーティングカバースリップを、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジンとともに１０分間インキュベートし、次いで、１×ＰＢＳで３回洗浄して、カバースリップをストレプトアビジンでコーティングした。ストレプトアビジン改変表面を、１×ＰＢＳ中の１００ｎＭのＣａｐの溶液とともに３０分間インキュベートし、それに続いて１×ＰＢＳ中で３回洗浄することによって、Ｃａｐでさらにコーティングした。次に、１×ＰＢＳ中の０又は１０ｐＭの分析物（Ｔ７９０Ｍ）のいずれか、１０ｎＭの２個のシグナル領域オリゴヌクレオチド配列のそれぞれ（実施例１０及び図２８を参照されたい）及び１００ｎＭのサプレッサーオリゴヌクレオチド（実施例１０及び図２８を参照されたい）を含有する溶液を、７０℃に１分間加熱し、次いで室温（約２２℃）に１０分間置いた。０又は１０ｐＭの分析物の溶液を、Ｃａｐコーティングカバースリップと接触させて、２５℃でおよそ３０分間、別々のチャンバー中でインキュベートして、カバースリップ表面での分析物複合体の捕捉を可能にした。次に、分析物溶液を除去し、４×ＰＢＳ中の２５ｎＭの第２のプローブを含有する溶液によって置き換え、カバースリップアセンブリーを、２５℃で１時間３０分間インキュベートした。第２のプローブ溶液を除去し、４×ＰＢＳ中の１００ｎＭの標識プローブ（５’－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＡＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧ－３’）（配列番号３８）を含有する溶液によって置き換え、およそ２２℃で１０分間インキュベートした。標識プローブ溶液を除去し、４×ＰＢＳ中の酸素スカベンジャー系（プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼ、３，４－ジヒドロキシ安息香酸及びトロロクス）を含む溶液によって置き換えた。表面結合シグナル領域複合体の蛍光強度を、６４０ｎｍの連続波レーザーからの励起を用いる対物レンズ型全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法及び科学的相補型金属酸化膜半導体（ｓＣＭＯＳ）カメラを使用する検出によって測定した。ここに図３１を参照して、視野あたり数百の明るい点が、１０ｐＭの分析物の存在下で目に見えたが、分析物を欠くブランク測定において、明るい点ほとんど又は全く明らかでなかった。したがって、アッセイは、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む配列を検出することができる。

【0165】

［実施例１４］ 捕捉抗体を含む第１のプローブ並びにストレプトアビジン－ビオチン及び平面によって接合されたシグナル領域を使用する標的タンパク質分析物（抗原）の検出
アッセイを、ＴＮＦ－アルファに対する親和性を有するビオチン化捕捉抗体、ビオチン化された分岐状シグナル領域、並びに捕捉抗体及びシグナル領域に連結されたビオチン化されたストレプトアビジンコーティング表面を含む第１のプローブを使用して、標的タンパク質分析物（抗原、Ａ）であるＴＮＦ－アルファを検出するために設計した（図３２）。第２のプローブは、サプレッサー相補領域を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた検出抗体を含む。最初に、ビオチン－ＰＥＧコーティングカバースリップを、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジンとともに１０分間インキュベートし、次いで、１×ＰＢＳで３回洗浄して、カバースリップをストレプトアビジンでコーティングした。次に、カバースリップを、ビオチン化捕捉抗体のビオチン化シグナル領域に対する１：１０、１：１００、１：１０００又は１：１０，０００モル比を含有する混合物とともにインキュベートし、各溶液は、およそ１００ナノモル濃度のビオチン化捕捉抗体を含む。３０分のインキュベーション後、溶液を除去し、表面を１×ＰＢＳで３回洗浄した。次に、１０ｍｇ／ｍＬ及び１×ＰＢＳ中の１０又は０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－アルファのいずれかを含有する溶液を、表面に添加し、２５℃で１時間インキュベートした。これらの溶液を除去し、１×ＴＢＳ（１×Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、ｐＨ８．０）中の２５ナノモル濃度の第２のプローブを含有する溶液によって置き換え、湿潤環境下、２５℃で１時間３０分間インキュベートした。第２のプローブ溶液を除去し、４×ＰＢＳ緩衝液中の１００ナノモル濃度の標識プローブ１３０を含有する溶液によって置き換え、およそ２２℃で１０分間インキュベートした。標識プローブ溶液を除去し、４×ＰＢＳ中の酸素スカベンジャー系（プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼ、３，４－ジヒドロキシ安息香酸及びトロロクス）を含む溶液によって置き換えた。表面結合シグナル領域複合体の蛍光強度を、６４０ｎｍの連続波レーザーからの励起を用いる対物レンズ型全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法及び科学的相補型金属酸化膜半導体（ｓＣＭＯＳ）カメラを使用する検出によって測定した。数百の明るい点が、ＴＮＦ－アルファの存在下で行われたアッセイについて各視野内で観察されたが、分析物の非存在下では、同じように明るい点はほとんど又は全く観察されず（図３２）、この第１のプローブ配置を使用して分析物を検出する実現可能性を実証した。

【0166】

したがって、本発明は、挙げられた目的及び利点、並びにそれらに固有であるものを実現するために十分に適応される。多数の変更が当業者によって行われ得るが、そのような変更は、一部分では、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の精神内に包含される。

【0167】

本開示の具体的な実施形態の前述の記載は、説明及び記載の目的のために提示された。例示的な実施形態は、本開示の原理及びその実際の適用を最も良く説明し、それによって、当業者が、主題を最も良く利用することを可能にするために選択及び記載され、さまざまな改変を有するさまざまな実施形態は、企図される特定の使用に適している。本開示内のさまざまな実施形態の異なる特性及び開示は、本開示の範囲内で組み合わされてよい。

【0168】

開示される第１のプローブが、１個以上のシグナル領域及び１個以上の第１の分析物結合領域を有することができることが、この開示全体を通して理解されるべきである。例として、限定されるものではないが、ナノ粒子は、多重のシグナル領域及び／又は多重の第１の分析物結合領域に結合され得る。さらにまた、第１の分析物結合領域及びシグナル領域は、共通分子の部分であり得、又は第１の分析物結合領域及び第２の分析物結合領域の両方が分析物と会合している、第２のプローブと第１のプローブに結合したサプレッサーとの会合を可能にするのに十分に近接している別々の分子であり得る。

【0169】

上記に記載及び説明された実施形態は、共有される材料からさまざまなシステムを構築する利便性及び経済性に起因して共通の要素を用いたが、本明細書に記載されるアプローチは、これらの特定の材料を用いる必要はない。

【0170】

【表1】

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図19-1】

【図19-2】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23-1】

【図23-2】

【図23-3】

【図23-4】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図27】

【図28-1】

【図28-2】

【図29】

【図30】

【図31-1】

【図31-2】

【図32A】

【図32B】

【配列表】

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【国際調査報告】