特表 2024-529911 細胞培養システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-14

(54)【発明の名称】細胞培養システム

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20240806BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20240806BHJP

   C12N 5/0793 20100101ALI20240806BHJP

   C12N 5/09 20100101ALI20240806BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20240806BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20240806BHJP

   C12N 5/079 20100101ALI20240806BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20240806BHJP

   C12M 1/22 20060101ALI20240806BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00 A

C12N5/071

C12N5/0793

C12N5/09

C12N5/0775

C12N5/077

C12N5/079

C12M1/00 A

C12M1/22

【審査請求】有

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024503422

(86)(22)【出願日】2022-08-24

(85)【翻訳文提出日】2024-01-18

(86)【国際出願番号】 FI2022050549

(87)【国際公開番号】W WO2023062268

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】20217156

(32)【優先日】2021-10-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519096781

【氏名又は名称】タンペレ・ユニバーシティー・ファウンデーション・エスアール

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100182730

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 浩明

(72)【発明者】

【氏名】アッリ プリーマギ

(72)【発明者】

【氏名】チアラ フェデレ

(72)【発明者】

【氏名】テーム イハライネン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA08

4B029AA21

4B029BB11

4B029CC02

4B029CC08

4B029GA01

4B029GA02

4B029GA03

4B029GB09

4B065AA91X

4B065AA93X

4B065AC12

4B065BC41

4B065CA46

(57)【要約】

本開示は、細胞培養のためのシステム（２００）、特に支持基板（２０１）、アゾベンゼン含有層（２０２）及び保護コーティング層（２０３）を含む光再構成可能なシステムに関する。 本開示は、システムのアゾベンゼン含有材料の表面に可逆的にトポグラフィーを刻むこと、システム上で細胞を培養する方法、及びその方法によって得られる細胞培養物にも関する。 また、このシステムを製造する方法も開示される。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

支持構造体（１０１、２０１）、アゾベンゼン含有中間層（１０２、２０２）、及び保護ポリマーを含む最上層（１０３、２０３）を含む、細胞培養のためのシステム（１００、２００）。

【請求項2】

前記アゾベンゼン含有層の厚さが５０ｎｍ～５μｍであり、そして前記最上層の厚さが２０ｎｍ～１００μｍ、好ましくは２０ｎｍ～２００ｎｍである、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

前記アゾベンゼン含有層の厚さが５０ｎｍ～５μｍであり、そして前記最上層の厚さが５０ｎｍ～１００μｍである、請求項１に記載のシステム。

【請求項4】

前記支持構造体が、ペトリ皿、顕微鏡カバースリップ、及びウェルプレートなどの細胞培養ディスクから選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項5】

保護ポリマーがエラストマー及びヒドロゲルから選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項6】

前記エラストマーがシロキサンである、請求項５に記載のシステム。

【請求項7】

前記シロキサンがＰＤＭＳである、請求項６に記載のシステム。

【請求項8】

前記保護ポリマーがパリレン、好ましくはパリレンＣである、請求項１～４のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項9】

前記アゾベンゼンが、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－４－（４－ニトロフェニルアゾ）アニリンである、請求項１～８のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載のシステムの製造方法であって、
a) 支持構造体を提供し、
b) 支持構造体をアゾベンゼン含有層でコーティングし、そして
ｃ）アゾベンゼン含有層を保護ポリマーを含む最上層でコーティングすることを含む方法。

【請求項11】

工程ｂ）のコーティングがスピンコーティングを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

工程ｃ）のコーティングがスピンコーティングを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

工程ｃ）のコーティングが、ポリマーがパリレン、好ましくはパリレンＣである場合、化学蒸着重合を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項14】

請求項１～９のいずれか１項に記載のシステムのアゾベンゼン含有材料上にトポグラフィーを可逆的に刻むための方法であって、光ビームを前記材料にフォーカシングさせるか、又はレーザー光の干渉パターンを材料に投影することを含む方法。

【請求項15】

前記フォーカシングが、最上層上でレーザー光を走査することを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記光の波長が４００ｎｍ～６００ｎｍ、好ましくは４３０ｎｍ～５３０ｎｍである、請求項１４又は１５に記載の方法。

【請求項17】

前記光の強度が １Ｗｃｍ^－２～５Ｗｃｍ^－２である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

２つの干渉するレーザー光の波長が４００ｎｍ～６００ｎｍ、好ましくは４３０ｎｍ～５３０ｎｍであり、そして２つの干渉するレーザー光の強度が１００ｍＷｃｍ^－２～６００ｍＷｃｍ^－２である、請求項１４に記載の方法。

【請求項19】

請求項１～９のいずれか１項に記載のシステムをパターン化する方法であって、 アゾベンゼン含有層の1 つ又は複数の領域を、レーザー、好ましくは連続波レーザーによって生成される４００ｎｍ～６００ｎｍの光にさらすことにより、システムにトポグラフィー特徴を生成することを含む方法。

【請求項20】

前記レーザーによって生成される光の強度が １Ｗｃｍ^－２～５Ｗｃｍ^－２である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

請求項１９又は２０に記載の方法によって得られるパターン化されたシステム。

【請求項22】

請求項２１に記載のパターン化されたシステムのトポグラフィー特徴を消去するための方法であって、レーザー、好ましくは連続波レーザーによって生成される、又は蛍光灯もしくはＬＥＤによって生成される４００ｎｍ～６００ｎｍの光、好ましくは４６０ｎｍ～５３０ｎｍの光にトポグラフィー特徴をさらすことを含む方法。

【請求項23】

レーザー、蛍光灯、又はＬＥＤ によって生成される光の強度が１Ｗｃｍ^－２～５Ｗｃｍ^－２である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

細胞培養プラットフォームとしての、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム又は請求項２１に記載のパターン化されたシステムの使用。

【請求項25】

請求項２１に記載のパターン化されたシステム上で細胞を培養する、細胞培養方法。

【請求項26】

以下の工程：
a) パターン化されたシステムを提供する工程、
b) パターン化されたシステムの最上層を細胞接着タンパク質でコーティングする工程、及び
c) 細胞接着タンパク質上に細胞を播種する工程を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記細胞が、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、ニューロン、間葉幹細胞、星状細胞、心筋細胞、及び癌細胞から選択される、請求項２５又は２６に記載の方法。

【請求項28】

前記細胞接着タンパク質が、コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニンから選択される、請求項２６又は２７に記載の方法。

【請求項29】

工程ｂ）の前に酸素プラズマ処理を含む、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

請求項２５～２９のいずれか１項に記載の方法により得られる細胞培養物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、細胞培養のためのシステム、特にアゾベンゼン含有層および保護コーティング層を含む二層構造を含む光再構成可能なシステムに関する。

【背景技術】

【0002】

医薬品開発では、開発された新しい分子の９０％ 以上が臨床段階の試験で失敗する。 成功率が低い主な原因は、インビトロ 研究で使用される細胞モデルである。 これらのモデル システムは、人体の自然な状態を再現することはできない。生体内では、細胞の微小環境がさまざまな細胞機能を調節している。 従って、より優れた細胞ベースのモデルが明らかに必要とされている。そのためには、細胞の微小環境を含め、インビトロ細胞培養における動的なインビボ条件を可能な限り忠実に模倣することが重要である。

【0003】

現在、細胞は、細胞の動的な生体内微小環境、細胞ニッチの適切なシミュレーションを行わずに、主に細胞培養ディスク、フラスコ、プレートで培養されている。 これらの条件における大きな欠点の1 つは、表面の特徴、つまり表面トポグラフィーが欠如していることであり、細胞が人体内で遭遇する環境を十分に反映していないことである。 さらに、私たちの体内の付着細胞は継続的に変化し、周囲と相互作用している。 この挙動は動的な細胞外環境を作り出すが、これを インビトロで再現するのは困難である。

【0004】

微細パターン化された細胞培養基質を構築するために、さまざまなマイクロエンジニアリング手法が使用されているが、それらは通常、滑らかな構造ではなく正方形のトポグラフィーを特徴とし、細胞環境には似ていない。 さらに、それらは依然として再構成可能性又は表面の動的な変更の欠如に悩まされており、従って細胞に対して静的な環境しか提供しない。

【0005】

従って、細胞培養用の再構成可能な表面が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、アゾベンゼン含有層及び保護コーティング層を含む二層構造を使用して光誘発表面特徴を作り出すことによって、表面トポグラフィーを繰り返し変更し、消去し、又は全体的に再構成できるという観察に基づいている。

【0007】

従って、本発明の目的は、支持構造体、アゾベンゼン含有中間層、及び保護ポリマーを含む最上層を含む細胞培養システムを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

また、本発明の目的は、細胞培養システムを製造する方法を提供することであり、ここで前記方法は、
a) 支持構造体を提供し、
b) 支持構造体をアゾベンゼン含有層でコーティングし、そして
ｃ）アゾベンゼン含有層を保護ポリマーを含む最上層でコーティングすることを含む。

【0009】

また、本発明の目的は、システムのアゾベンゼン含有材料の表面に可逆的にトポグラフィーを刻む方法を提供することであり、この方法は、光ビームを材料に集束させるか、又はレーザー光の干渉パターンを材料に投影することを含む。

【0010】

また、本発明の目的は、システムをパターン化する方法で提供することであり、この方法は、アゾベンゼン含有層の1つ又は複数の領域を、レーザー、好ましくは連続波レーザーによって生成される４００ｎｍ～６００ｎｍの光にさらすことにより、システムにトポグラフィー特徴を生成することを含む。

【0011】

また、本発明の目的は、請求項１９に記載の方法によって得られるパターン化されたシステムを提供することである。

【0012】

本発明のさらに別の目的は、パターン化されたシステムのトポグラフィー的特徴を消去するための方法を提供することであり、この方法は、レーザー、好ましくは連続波レーザーによって生成される、又は蛍光灯もしくはＬＥＤによって生成される４００ｎｍ～６００ｎｍの光、好ましくは４６０ｎｍ～５３０ｎｍの光にトポグラフィー特徴をさらすことを含む。

【0013】

本発明のさらに別の目的は、細胞培養プラットフォームとしてのシステム又はパターン化されたシステムの使用を提供することである。

【0014】

本発明のさらなる目的は、細胞がパターン化されたシステム上で培養される、細胞培養方法を提供することである。

【0015】

本発明のさらに別の目的は、パターン化されたシステム上で細胞を培養する方法によって得られる細胞培養物を提供することである。

【0016】

本発明のさらなる目的は、添付の従属請求項に記載されている。

【0017】

構造及び動作方法の両方に関する本発明の例示的且つ非限定的な実施形態は、その追加の目的及び利点と共に、添付の図面と併せて読むと、特定の例示的な実施形態についての以下の説明から最も良く理解される。

【0018】

この文書では、「含む（comprise）」及び「含む（include）」という動詞は、言及されていない機能の存在を除外したり要求したりしないオープンな制限として使用されている。 添付の従属請求項に記載された特徴は、特別な明示的な記載がない限り、相互に自由に組み合わせることができる。 さらに、この文書全体での「a」又は「an」、つまり単数形の使用は複数形を排除するものではないことを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、本発明の例示的で非限定的な実施形態によるシステムを示す。

【0020】

【図2】図２は、光により誘発されるアゾベンゼン誘導体のトランス－シス異性化反応を示す。

【0021】

【図3】図３は、本発明の例示的なシステムのアゾベンゼンによるａ）表面レリーフグラフト形成およびｂ）消去のグラフ表示を示す。

【0022】

【図4】図４は、本発明の例示的なシステムの干渉リソグラフィー、原子間力顕微鏡３Ｄ投影、平均断面プロファイル及びレーザー走査によって刻まれたトポグラフィーによって刻まれた正弦波表面レリーフ格子を示す。

【0023】

【図5】図５は、アゾベンゼンベースのフィルムを含む本発明の例示的なシステムの平らな（左）と１μｍ周期の正弦波トポグラフィー（右）上のマディン・ダービーイヌ腎臓上皮細胞との間の形態学的差異を示す。

【0024】

【図6a】図６ａは、強度 ３００ｍＷｃｍ^－２ (４８８ ｎｍ、円偏光、プローブビーム波長６３３ｎｍ) で表面レリーフ格子 (ＳＲＧ) を刻んだ際の、異なる厚さの ＰＤＭＳ での回折効率 (ＤＥ) 曲線 (各曲線の３回の測定で平均) を示している。 ＳＲＧ 表記の末尾の ＤＥ 値の標準偏差は、±７％（ＤＲ１ｇ）、０．５％（ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_５０）、±５％（ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１）、及び ± ６％（ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_０．０２）である。

【0025】

【図6b】図６ｂは、ＳＲＧ刻印後のＤＲ１ｇ－１ＰＤＭＳ_０．０２上の表面トポグラフィーのＡＦＭ画像を示す。

【0026】

【図6c】図６ｃは、ＳＲＧ刻印後のＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１上の表面トポグラフィーのＡＦＭ画像を示す。

【0027】

【図7】図７は、ａ）５００ｍＷｃｍ^-２の強度でのＳＲＧ刻印、及びｂ）５３０ｎｍのＬＥＤでのＳＲＧ消去の間の、ＰＤＭＳ層の異なる厚さの回折効率曲線；c）刻印（上）及び消去（下）後のＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１の表面トポグラフィーのＡＦＭ画像；d) 写真の刻印された（実線）及び消去された（破線）ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１のＳＲＧ変調深度の断面プロファイルを示す。

【0028】

【図8】図８は、コーティングされていない ＤＲ１ｇ (左) とパリレン C の ９０ｎｍ層でコーティングされた ＤＲ１ｇ (右) のアセトンに対する耐性を示す。

【0029】

【図9】図９は、ａ）表面変調されたＤＲ１ｇ上のポリアクリルアミドヒドロゲルコーティングのグラフ表示；及び b) ＤＲ１ｇ 光刺激によってヒドロゲル内に誘発された横方向ひずみの蛍光微粒子による ＤＩＣ 分析を示す。

【0030】

【図10】図１０は、以下を示す：ａ）細胞培養実験のためのＤＲ１ｇ-ＰＤＭＳ１サンプル調製の概略図；b) 細胞播種から ２４ 時間後の、平らなガラス基板上の ＭＤＣＫ ＩＩ 細胞とＤＲ１ｇ及び ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ１の表面パターン化されたフィルムの光学顕微鏡画像、 黒い矢印はＳＲＧのトポグラフィーの方向を示す、スケールバー: ５０ μｍ；c）異なる時点（２４時間、７２時間）での、表面パターン化されたＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ１二重層上の免疫標識ＭＤＣＫ ＩＩ細胞、 使用した標識は、ＤＡＰＩ (クロマチン)、Ｅ－カドヘリン (細胞間結合)、及び ｐＦＡＫ (成熟接着斑) であった。 接着斑の組織化は、ｐＦＡＫ 画像の高速フーリエ変換 (ＦＦＴ) によって分析され、画像内の周期性が示された (１ 次ピークで示される)。 黒い矢印は ＳＲＧ のトポグラフィーの方向を示す。 スケールバー２０μｍ。

【0031】

【図11】図１１は、以下を示す：(a) 乾燥環境、及び b) 液体環境における、青色領域 (４７０ ± ４０ ｎｍ) でフィルター処理された共焦点顕微鏡の蛍光灯による消去後の ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ１ 上の ＳＲＧ トポグラフィーの ＤＨＭ 画像を、照射時間：５分、 スケールバー: １０μｍ、c) 乾燥環境及び d) 液体環境における、消去後の ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ１上の ＳＲＧトポグラフィーの表面プロファイル 。

【発明を実施するための形態】

【0032】

１つの側面によれば、本開示は細胞培養のためのシステムに関する。 例示的なシステム１００を図１に示す。このシステムは、支持構造体１０１、アゾベンゼン含有中間層１０２、及び最上層１０３を備える。

【0033】

支持構造体は、細胞培養に使用される任意の支持構造体であり得る。 例示的な支持構造体は、ペトリ皿などの細胞培養ディスク、顕微鏡カバースリップ、及びウェルプレートである。 支持構造体は通常、プラスチック又はガラスで作られている。 ペトリ皿の形式の例は、ポリ（スチレン）及びガラス底のペトリ皿である。

【0034】

アゾベンゼンを含む材料は光で再構成可能である。 本明細書で定義されるように、光再構成可能な材料は、光にさらされるとその形状が再構成可能な材料である。 アゾベンゼン分子は置換されていても非置換であってもよい。 例示的なアゾベンゼン単位の光誘起変換を図 ２ に示す。ここで、Ｒ と Ｒ‘は異なるパラ置換基を指す。 メタ位とオルト位に異なる置換基を付加することもできる。 本技術に適したアゾベンゼンの例は、エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－４－（４－ニトロフェニルアゾ）アニリンである。

【0035】

最上層は、エラストマーやヒドロゲルなどの保護ポリマーで構成されている。 例示的なエラストマーは、ポリジメチルシロキサン、ＰＤＭＳなどのシロキサン含有ポリマーである。

【0036】

別の実施形態によれば、保護ポリマーはパリレン、好ましくはパリレンＣ、すなわちポリ（クロロ－パラ－キシリレン）を含む。 さまざまな置換された [２．２] パラ－シクロファンが存在し、それによってフェニル環に官能基が導入される可能性がある。 これらの官能基により、官能化されたパリレンフィルムの堆積が可能になったり、さらなる官能化を受けて生物活性分子の固定化が可能になったりする。

【0037】

ＰＤＭＳ 及びパリレンＣは、優れた機械特性及びバリア特性、疎水性、耐薬品性、生体適合性があるため、好ましいコーティング剤である。 パリレンＣ のさらなる利点は、パリレン Ｃ を蒸着してピンホールのない超薄膜を生成できることである。 さらに、パリレンＣ は半結晶質であるにもかかわらず、対象範囲の厚さでは非常に透明である。

【0038】

１つの実施形態によれば、アゾベンゼン含有層の厚さｄ_１は５０ｎｍ～５μｍであり、最上層の厚さｄ_２は２０ｎｍ～１００μｍ、好ましくは２０ｎｍ～２００ｎｍである。

【0039】

別の実施形態によれば、アゾベンゼン含有層の厚さｄ_１は５０ｎｍ～５μｍであり、最上層の厚さｄ_２は５０ｎｍ～１００μｍである。 アゾベンゼン含有層の厚さの例は５００ｎｍである。

【0040】

保護ポリマーがＰＤＭＳ又はパリレンＣである場合、最上層の厚さは９０ｎｍ未満であることが好ましい。

【0041】

保護ポリマーがヒドロゲルである場合、最上層の厚さは５０μｍ未満であることが好ましい。

【0042】

本開示はまた、細胞培養のためのシステム１００を製造する方法にも関し、この方法は以下の工程を含む。
ａ）支持構造体１０１を設ける工程、
ｂ）支持構造体をアゾベンゼン含有層１０２でコーティングする工程、及び
ｃ）アゾベンゼン含有層を、保護ポリマーを含む最上層１０３でコーティングする工程。

【0043】

支持構造体は、好ましくは、ペトリ皿、顕微鏡カバースリップ、ウェルプレートから選択される。 １つの実施形態によれば、保護ポリマーはヒドロゲル又はエラストマーを含む。 エラストマーの例はシロキサンである。 特定のシロキサンは ＰＤＭＳ である。

【0044】

別の実施形態によれば、保護ポリマーはパリレンを含む。 特定のパリレンはパリレンＣである。

【0045】

１つの実施形態によれば、工程ｂ）のコーティングはスピンコーティングを含む。

【0046】

別の実施形態によれば、工程ｃ）のコーティングはスピンコーティングを含む。 保護ポリマーがＰＤＭＳなどのシロキサンである場合には、スピンコーティングが好ましい。

【0047】

別の実施形態によれば、工程ｃ）のコーティングは化学蒸着重合を含む。 これは、保護ポリマーがパリレンＣなどのパリレンを含む場合に好ましい方法である。

【0048】

マイクロ及びサブマイクロメートルスケールのトポグラフィーは、光干渉リソグラフィー、デジタルマイクロミラーデバイス、マイクロレンズアレイにより、又は単にフィルム表面上でレーザービーム（例えば、レーザー走査型顕微鏡から）を走査することによって、アゾベンゼン含有材料の表面に可逆的に刻むことができる。集束した光ビームが存在すると、アゾベンゼンベースの薄いコーティングは光ビームの焦点体積内に蓄積したり、光線の焦点体積から漏れたりする傾向がある。 従って、光ビームの走査動作により、描画ツールと同様に任意の形状を書き込むことができる。

【0049】

本発明の例示的なシステムに対するトポグラフィー的特徴の生成及びそこからの消去の概略図を図３に示す。

【0050】

従って、システムのアゾベンゼン含有材料の表面にトポグラフィーを可逆的に刻む方法を提供することも本開示の側面である。 １つの実施形態によれば、この方法は、光ビームを前記材料に集束させる工程を含む。 特定の実施形態によれば、この方法は、アゾベンゼン含有層上でレーザービームを走査する工程を含む。

【0051】

別の実施形態によれば、システムのアゾベンゼン含有材料の表面にトポグラフィーを可逆的に刻むための方法は、干渉リソグラフィーを利用する。 この実施形態によれば、この方法は、レーザー光の干渉パターンを材料に投影することを含む。

【0052】

中間層は最上層でコーティングされるので、最上層にもトポグラフィーが形成される。

【0053】

可逆的に刻むことは、パターン化と消去を含む。パターン化及び消去に使用される光の波長は、典型的には４００ｎｍ～６００ｎｍ、好ましくは４３０ｎｍ～５３０ｎｍである。 適切な強度範囲は、使用する技術によって異なる。 たとえば、干渉リソグラフィーには １００ｍＷｃｍ^－２ ～ ６００ｍＷｃｍ^－２ で十分であるが、レーザー走査型共焦点顕微鏡でのパターン化/消去には約 １Ｗｃｍ^－２ ～ ５Ｗｃｍ^－２ が使用される。

【0054】

１つの実施形態によれば、パターン化のためには、この方法は、アゾベンゼン含有層の１つ又は複数の領域を、レーザー、好ましくは連続波レーザーによって生成される４００ｎｍ～６００ｎｍ、好ましくは４３０ｎｍ～５３０ｎｍの光に曝露し、それによってトポグラフィー的特徴をシステムに生成することを含む。 レーザーによって生成される光の例示的な強度は、好ましくは１Ｗｃｍ^－２ ～５Ｗｃｍ^－２ である。

【0055】

実施形態によれば、消去のためには、パターン化されたシステムのトポグラフィー的特徴は、レーザー、好ましくは連続波レーザーによって生成される４００ｎｍ～６００ｎｍ、好ましくは４３０ｎｍ～５３０ｎｍの光にさらされる。 レーザーによって生成される光の強度の例は、１Ｗｃｍ^－２ ～５Ｗｃｍ^－２である。

【0056】

上で開示された方法によって取得可能な本開示の例示的なシステム３００が図４に示されている。 この図は、干渉リソグラフィーによって刻まれた正弦波表面レリーフ格子、原子間力顕微鏡の３Ｄ 投影、システムのレーザー走査によって刻まれた平均断面プロファイル及びトポグラフィーも示している。

【0057】

別の態様によれば、本開示は、システムのアゾベンゼン含有層の１つ又は複数の領域を、レーザー、好ましくは連続波レーザーによって生成される４００ｎｍ～６００ｎｍ、好ましくは４３０ｎｍ～５３０ｎｍの光にさらすことによるシステムのパターン化し、これにより、システムにトポグラフィー的特徴を生成する方法に関する。光の強度は通常、１Ｗｃｍ^－２ ～５Ｗｃｍ^－２ である。 例示的な波長は４８８ｎｍであり、アゾベンゼン含有物質がエチル-Ｎ-（２-ヒドロキシエチル）-４-（４-ニトロフェニルアゾ）-アニリンである場合、これは好ましい波長である。 例示的な強度は１Ｗｃｍ^-２である。

【0058】

本開示はまた、レーザー、好ましくは連続波レーザーによって生成される４６０ｎｍ～５３０ｎｍの光をトポグラフィー的特徴にさらすことによってシステムからトポグラフィー的特徴を消去する方法にも関する。 例示的な波長は、４７０ｎｍ、４８８ｎｍ、及び５３０nmである。 別の実施形態によれば、消去は、４３０ｎｍ～５３０ｎｍの範囲でフィルタリングされた蛍光灯によって生成される光を使用することによって実行される。 レーザーによって生成される例示的な強度は、１Ｗｃｍ^－２ である。 蛍光灯によって生成される光の強度は、通常、１Ｗｃｍ^－２ ～５Ｗｃｍ^－２ である。 消去は、上記のレーザーや蛍光灯のほか、ＬＥＤを用いて行うこともできる。

【0059】

本発明により、自由形状のトポグラフィーパターンを細胞培養基材上に作成することが可能になる。 さらに、細胞がすでに基板上で成長している場合でも、均一な光源 (蛍光灯、LED ライト、レーザーなど) を使用してトポグラフィーを消去し、そして培養皿に新しいパターンを作成するために書き換えることができ、 これにより、人体の動的な状態をよりよく模倣し、動的なトポグラフィーを作成することが可能になる。

【0060】

従って、上面にトポグラフィー的特徴を含むシステム上で細胞を培養するための方法を提供することが本開示のさらに１つの側面である。 トポグラフィー的特徴を含むシステムは、上に開示したように入手可能である。

【0061】

例示的な実施形態によれば、この方法は以下の工程を含む：
a) パターン化されたシステムを提供する工程、
b) パターン化されたシステムの最上層を細胞接着タンパク質でコーティングする工程、及び
c) 細胞接着タンパク質上に細胞を播種する工程。

【0062】

好ましい実施形態によれば、この方法は、工程ｂ）の前にシステムを酸素プラズマ処理にかける工程を含む。

【0063】

例示的な細胞は、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、ニューロン、間葉幹細胞、星状細胞、心筋細胞、及び癌細胞からなる群から選択される。

【0064】

この方法に適した細胞接着タンパク質の例は、コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニンからなる群から選択される。 細胞接着タンパク質の選択は、播種する細胞の種類によって異なる。

【0065】

本発明のシステムは、アゾベンゼン含有二重層を使用して光誘発表面特徴を生成することに基づいて、表面トポグラフィーの堅牢な再構成可能な制御を可能にする。 １つの実施形態によれば、細胞培養ディスクは、表面の容易な化学修飾を可能にし、生体適合性を確保し、既存のタンパク質堆積技術を完全にサポートする保護シロキサン層を提供するアゾベンゼン含有ポリマーフィルムでコーティングされる。 別の実施形態によれば、細胞培養ディスクは、表面の容易な化学修飾を可能にし、生体適合性を確保し、既存のタンパク質堆積技術を完全にサポートする保護パリレンＣ層を提供するアゾベンゼン含有ポリマーフィルムでコーティングされる。

【0066】

インビボでは、細胞と周囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との動的相互作用は、組織の形態形成、治癒、腫瘍増殖などの多くの生理学的及び病理学的プロセスの調節において重要な役割を果たしている。 本発明は、表面特徴を光で操作できるため、細胞外ニッチ、（多）細胞の空間配置、配向、及び移動のリアルタイム制御を可能にする。 このプロセスは可逆的で、遠隔制御可能で非侵襲性であり、これは、例えば、細胞分化、幹細胞表現型収集、組織再生、細胞の方向性遊走の誘発、並びにトポグラフィー的及び化学的合図の切り離しなどの時間プログラムの定義にとって重要であると考えられる。体内では、細胞は、機械伝達と呼ばれるプロセスで生化学的活動に変換できるさまざまな種類の生物物理学的手がかりにさらされる。 これらの合図は、細胞の整列や移動などの重要な共同調節因子である。 例えば、筋肉、神経細胞、及び内皮細胞は、私たちの体内で高度に整列した組織を示し、細胞の遊走は細胞環境のトポグラフィー的特徴に大きく影響される。

【0067】

光誘発パターン化の実現可能性と細胞に対するその効果を実証するために、上皮細胞を平らな表面（図５、左）及び光誘発アゾベンゼン含有材料を含むシステムの表面（図５、右）で培養した。 図からわかるように、表面トポグラフィーは細胞の整列と移動に大きな影響を与える。

【0068】

結果及び議論
ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ 二層構造におけるＳＲＧの書き込みと消去の特性評価
プラットフォームを組み立てるために、まずカバーガラスをエチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－４－（４－ニトロフェニルアゾ）－アニリンの光パターン化可能な非晶質薄層、すなわちさらに ＰＤＭＳでコーティングされたディスパースレッド1含有分子ガラス(ＤＲ１ｇ;厚さ４８０± ２０ｎｍ)でコーティングした。得られた ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ二重層構造は、ＤＲ１ｇ が光応答部分として機能する光応答性細胞培養プラットフォームとして使用された。

【0069】

ＳＲＧ 形成に対するＰＤＭＳ (ベース: 硬化剤比 １０：１) の効果を研究するために、ｎ－ヘキサン中の ３つの異なる ＰＤＭＳ プレポリマー希釈液 (０．０２、１、及び ５０ｗｔ－％) を同じスピンコーティングパラメータで試験した。 これらのサンプルは、ここでは ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳｘ と表示される。ここで、ｘ はヘキサン中の ＰＤＭＳ 濃度を表す。 ＰＤＭＳ層の厚さは、エリプソメトリー及びプロフィロメトリーによって測定された。 ０．０２ 及び １ｗｔ％ 層の正確な測定には偏光解析法が使用され、最も厚い ＰＤＭＳ 層 (５０ ｗｔ％) には表面形状計が使用された。 厚さは４．５μｍ（ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_５０）、６５ｎｍ（ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１）、２０ｎｍ（ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_０．０２）であった。ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ 二重層は、ロイズミラー構成で光干渉リソグラフィーを使用して光パターン化され、ＤＲ１ｇ 内の質量移動と ＰＤＭＳ コーティングの表面変形を誘発して ＳＲＧ を形成した。 干渉パターンの周期性は、波長とミラーとレーザー光線の間の角度によって決まった。 角度を変えることで、異なる周期性の ＳＲＧ を実現できる (およそ ３００ｎｍ ～ １０ μｍ の範囲)。ここでは、この周期が同じ材料の上皮細胞の配列を制御する際に以前に使用されていたため、周期を１μｍ に設定した。 異なる ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ 二重層内の ＳＲＧ 形成の現場 モニタリングは、回折効率 (ＤＥ) 測定によって実施された。 ＤＲ１ｇ 膜の厚さ (４８０ ± ２０ｎｍ) は、ＳＲＧ の形成が層の厚さの小さな変動に依存しないように十分な厚さになるように選択された。 従って、ＤＥ の違いはもっぱら ＰＤＭＳ 層の違いによるものであった。ＳＲの形成を確認するために、サンプルを原子間力顕微鏡 (ＡＦＭ) で画像化した。

【0070】

ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ 二重層への ＳＲＧ 書き込み中の ＤＥ 曲線を図 ６ａ に示す。 これらの画像から、ＰＤＭＳ 層の厚さが増加するにつれてＤＥ が体系的に減少することが観察できる。 ＡＦＭイメージングにより、ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_０．０２及びＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１のＳＲＧが１μｍの予想周期で形成されていることが確認された（図６ｂ、ｃ）。 表面変調深さは、ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_０．０２ では ４００ｎｍ 以上であったが、ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１では、変調深さは大幅に減少し、１６０ｎｍに達した。ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_５０では、ＡＦＭ では正弦波パターンが観察できなかったため、ＳＲＧ は ＰＤＭＳ コーティングの外表面に形成されなかった。８％ＤＥは、ＤＲ１ｇ／ＰＤＭＳインターフェースでの回折格子形成に起因すると考えられる。 アゾベンゼンを含むフィルムがガラス基板と保護コーティングの間にある場合、効率的に移動するためのより強い制約が課せられる。 ＳＲＧ の形成には材料の質量移動が必要であるため、厚い ＰＤＭＳ 層の存在により、ＳＲＧ 形成中にＤＲ１ｇが受ける複雑な応力場に対する障害が増大する。 従って、ＤＲ１ｇ薄膜上の １００ ｎｍ 未満の厚さの ＰＤＭＳ コーティングは、ＳＲＧ の形成を阻害しないが、その形成の力学を変化させる。

【0071】

ＳＲＧ の形成後、トポグラフィーはＤＲ１ｇのガラス転移温度 (７１℃) より低い温度で少なくとも １年間は安定であるが、熱又はＤＲ１ｇの吸収帯と一致する波長を持つ均一な光線で消去できる。 直接加熱は局所的に行うことができず、細胞培養条件と適合しないため、可視光（５３０ｎｍ ＬＥＤなど）でＳＲＧを消去することが好ましい。 ＳＲＧ 消去のダイナミクスを研究するために、同じ初期 ＤＥ 値 (約 ７％、図７ａ) を示すサンプルの消去中にＤＥを監視した。 消去のダイナミクスを図７ｂ に示す。全てのサンプルはプロセスの終了時に同様のＤＥ値 (約 ０．５％) に達したため、ＰＤＭＳ 層の厚さはＤＥ値の観点から消去プロセスの有効性に影響を与えないようである。 ただし、ＰＤＭＳ の厚さが異なると消去ダイナミクスに明らかな違いが観察される。 興味深いことには、ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１では他のサンプルと比較してＤ が系統的により速く減少しており、適切な厚さのＰＤＭＳ層がトポグラフィーの消去を加速することさえできることを示唆している。 ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_５０では、消去ダイナミクスは他のサンプルとは異なり、ＤＥは２段階のプロセスで比較的ゆっくりと減少した。

【0072】

サンプルをＡＦＭで画像化したところ、図 ７ｃ に示すように、トポグラフィーが ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１ の初期値の８５％まで減少していることが確認された。 図 ７ｄ の表面プロファイルは、消去されたトポグラフィーと消去されていないトポグラフィーの違いをさらに強調している。 変調深さの減少は、ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_０．０２ では ７０％ であった。 ＤＥ 値が同様の値に達したとしても、ＡＦＭ は、ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１ では、消去されたトポグラフィーがより低い変調深度に達したことを示している。 これは、細胞培養研究のために ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１を選択する動機となった。 格子が深い場合、均一なレーザービームによる消去は、より低い ＳＲＧ と比較して効果が低くなる。従って、このサンプルで観察されたより高い残存格子から判断されるように、トポグラフィーの完全な消去は、ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_０．０２ 表面で達成するのがより困難である可能性がある。ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１では、格子の深さが高速消去プロセスに有利であり、残留トポグラフィーが低くなり、細胞増殖実験中に必要な照射時間が制限される。 格子はまた、整列の点で細胞応答を誘発するのに十分な深さであった。 より厚い ＰＤＭＳ 層は、ＤＲ１ｇ層を細胞から分離するためのより優れた保護層として機能する可能性がある。

【0073】

ＤＲ１ｇ 層は、化学蒸着重合 (ＣＶＤ) によってパリレンＣ (つまり、ポリ(クロロ－パラ－キシリレン) でコーティングされた。パリレンＣ のＣＶＤ は、各蒸着実行ごとにメイン蒸着チャンバーに挿入された４つの二次チャンバーによって仲介された。 このような二次チャンバーには上部に小さなオリフィスがあり、その機能は反応性モノマーの堆積速度を制御し、堆積される層の厚さを微調整することであった。 一般的に、蒸着されたパリレン膜の厚さは、機械に装填されたダイマーの質量に直接比例する。しかし、極薄膜（＜１００ ｎｍ）の場合、ダイマー質量の減少は、（非常に短く不安定な圧力のため）制御性と信頼性の低い堆積プロセスにつながる。 パリレンモノマーの平均自由行程よりも小さいサイズ（クヌーセン数が １より大きい）の穴を通したパリレン分子の流出を利用することにより、 堆積された層の厚さは、反応性モノマーの正確な部分のみを二次チャンバーに入れることによって確実に得ることができる。

【0074】

準備された基板は触針形状測定法によって特性評価され、１３ｎｍ～４１５ｎｍ の範囲の厚さを示した。 次いで、ＰＤＭＳでコーティングされたサンプルについて上述したように、ＳＲＧの形成を試験した。 サンプルは、厚さが９０ｎｍ 未満の全てのサンプルで ＳＲＧ の形成を示した。 パリレンC層のバリア特性も試験された；透過性試験は、サンプルの表面にさまざまな有機溶媒 (アセトン、エタノール、イソプロパノール) と水を１μｌ 滴下することによって実行された。 数秒から３分以内に、溶媒滴は ＤＲ１ｇ層の一部を溶解するか、最終的に蒸発するまでサンプルの表面上にそのまま残る。５５ｎｍを超えるサンプルは、予想通り、水の浸透に対して耐性があったが、有機溶媒 (特にエタノールとイソプロパノール) に対しても最適な保護を提供した。試験された最も強力な溶媒はアセトンで、これはパリレン層の厚さの上限を定義するために使用され、その上にＳＲＧを形成することができ、同時にアセトンの浸透に対する一貫した信頼性の高い保護を示した (図 ８)。

【0075】

ポリアクリルアミドヒドロゲル層も ＤＲ１ｇ 基板のコーティングに使用された (図 ９ａ、ｂ)。 ポリアクリルアミドには、赤色光 (６０７ｎｍ) を発する蛍光微粒子が充填されている。 ヒドロゲルの厚さは １００ μｍ と推定された。 次に、ユーザー定義の関心領域 (ＲＯＩ) において、レーザー走査型共焦点顕微鏡 (ＬＳＭ ７８０、Ｚｅｉｓｓ) で ４８８ ｎｍ レーザーによって ＤＲ１ｇ を光刺激した。 これらのＲＯＩでは、タイムラプス顕微鏡で捕捉され、デジタル画像相関 （ＤＩＣ）で分析された蛍光微粒子によって示されるように、感光性材料の流れがヒドロゲル内で対応する変形を引き起こした。試験したヒドロゲル (２．８ｋＰａ) では、ひずみはヒドロゲルの内部に少なくとも ５０ μｍ の深さまで伝わった。 この実験は、原理的には、ＤＲ１ｇ の光誘起表面変形を使用して、ヒドロゲルなどの柔らかい材料を局所的かつ機械的に刺激できることを実証した。 このようなヒドロゲルには細胞を充填することができ、または細胞をヒドロゲル表面で培養することができる。

【0076】

ＳＲＧ ガイドによる細胞アライメント
細胞は環境の物理的特性と機械的力をその表面で感知するが、これらの力は細胞の奥深く、さらには核にまで伝達される。 完治の主な部位は細胞とＥＣＭの接触で、主に細胞膜の多タンパク質複合体である接着斑である。 細胞とＥＣＭの界面での接着斑の形成は、細胞の付着、整列、移動を調節する。 カルシウム依存性膜貫通タンパク質である Ｅ－カドヘリンは、細胞間接触部位で見られる分子の 1 つである。 Ｅ－カドヘリンは特に接着結合に存在し、緊密で分極した上皮の形成中に細胞間界面で重要な役割を果たす。

【0077】

ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１ 二重層上の微細トポグラフィーが集合的な細胞のアライメントを誘導できるかどうかを研究するために、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ イヌ腎臓ＩＩ 型 (ＭＤＣＫＩＩ) 上皮細胞をＳＲＧ 上に播種し、その下のマイクロトポグラフィーとのアライメントを研究した。 この細胞株は、細胞の集団行動を研究するための優れたモデルを提供する。 マイクロトポグラフィー上の単一細胞の機械的伝達は主に研究されているが、細胞間の接触が完全に破壊されることなく協調運動が起こる細胞集合体については、そのような挙動はまだ完全には特徴付けられていない。 図１０ａは、サンプル前処理の概略図を示している。 簡単に説明すると、続いてＤＲ１ｇとＰＤＭＳ をスピンコートして二重層構造を形成し、前述のようにＳＲＧを刻み込んだ。 パターン化の後、表面へのタンパク質の付着を改善するために、酸素プラズマ処理で表面を親水性にした。次に、表面への細胞接着を改善するために表面をコラーゲンＩでコーティングし、ＭＤＣＫＩＩ 細胞をサンプル上に播種し、最大７２ 時間培養した。 マイクロトポグラフィーに沿った細胞の移動をタイムラプス顕微鏡で追跡した。 細胞は、ＤＲ１－ＰＤＭＳ_１ への播種後最初の ２４時間の間にすでに微細トポグラフィーに沿って整列した。２４時間後、細胞は小さなコロニーを形成し、裸のＤＲ１ｇと ＤＲ１ｇ－ＰＤＭＳ_１ の両方でパターン方向に沿って伸びており、ＰＤＭＳ 層が細胞の下のトポグラフィーの感知を阻害していないことを示している (図 １０ｂ)。 細胞は、７２時間の時点で集密的な細胞単層を形成した。

【0078】

細胞－物質及び細胞－細胞相互作用の観点から、マイクロトポグラフィーに対する細胞応答を、さまざまな時点でＭＤＣＫＩＩ細胞を免疫標識することによってさらに調査した。 単一細胞を区別するために、核をＤＡＰＩで染色した。 細胞間相互作用は、Ｅ－カドヘリンの細胞内局在を検出することによって研究された。 細胞播種から２４時間後、細胞核は円形であったが、Ｅ－カドヘリンの局在化から観察されるように、細胞は表面の微細トポグラフィーに沿って細長い形態を持っていた（図１０ｃ）。 さらに、E－カドヘリンは細胞質に蓄積しており、細胞はまだ成熟した細胞間接合を形成していなかった。７２時間の時点では、細胞の形態は２４時間の時点よりもあまり伸長していなかった。 ７２ 時間後、細胞は均一な細胞層を形成し、E－カドヘリンは細胞間界面に局在し、二重層表面で強い細胞間相互作用を示した。Ｅ－カドヘリンの喪失は代わりに、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を示しており、上皮細胞は表現型の特徴を失い、より運動性が高く浸潤性の高い非分極間葉細胞に変化する。 Ｅ－カドヘリンは細胞間界面に局在しているため、二重層表面の細胞は７２時間後に緊密な上皮層を形成していた。

【0079】

接着斑キナーゼ (ＦＡＫ) は接着斑の発生に最初に存在する分子の 1 つであり、そのリン酸化は成熟した接着斑の形成を示す。 従って、接着斑の形態学的パラメーターは、リン酸化 ＦＡＫ（ｐＦＡＫ）を免疫標識することによって研究された。 播種から ２４ 時間後に基底面の細胞端で接着斑が観察され、高速フーリエ変換 (ＦＦＴ) を使用してその分布をさらに分析した。ＦＦＴは空間画像情報を周波数空間に変換し、周期的な特徴が強調されて特定の周波数パターンが生成される。分析により、細胞播種から２４時間後に １次周波数ピークが検出できることが示され(図 ９ｃ、ｐＦＡＫ 画像のＦＦＴ)、これは画像特徴 (ｐＦＡＫ) の周期的な分布を示している。 ７２ 時間後、ｐＦＡＫ は依然として細胞端で観察されたが、均一な細胞層を形成した後、細胞の移動はより制限された。 接着斑チャネルの ＦＦＴ では、一次周波数ピークがまだ見えており、接着斑が周期的に分布しており、細胞が依然としてトポグラフィー的手がかりからの情報を認識していることを示している。

【0080】

生細胞による ＳＲＧ トポグラフィーの消去。 ＬＥＤを使用する代わりに、共焦点顕微鏡の蛍光灯（可視スペクトルの青色領域でフィルタリング）を使用して微細トポグラフィーを消去することで、測定直後の生細胞の観察が可能になった。 ほとんどの顕微鏡には生細胞培養に適した環境制御機能を装備できるため、このセットアップは生物学的環境にとって実用的であると考えられた。 消去パラメーターを設定するために、まず細胞を使用せずに室温で乾燥した液体環境で消去を実行した。明視野画像とデジタルホログラフィック顕微鏡（ＤＨＭ）画像からわかるように、蛍光灯で照明すると、乾燥環境と水性環境の両方で明確に区別できる円形の領域が得られ、表面プロファイルに関する定量的な結果が得られる（図１１ａ、ｂ）。 ＤＨＭ を使用して表面を監視することで、ＡＦＭ と比較してより広い領域にわたる表面トポグラフィーの迅速かつ定量的な特性評価が可能になった。 ＤＨＭ 画像は、照射後５分以内に変調深度が再現可能に減少することを示￥した。 乾燥条件では、変調深さは初期値から ７５％ 減少しまし(図 １１c)、これは、表面粗さが５６ｎｍ から１４ｎｍ に減少したことで示されている。 液体環境では、消去領域の変調深度は ５０％ 減少し (図１１ｄ)、さらに (部分的に) 消去された表面は著しく粗くなり、丸い表面特徴を示した。

【0081】

ＭＤＣＫＩＩ 細胞をＳＲＧトポグラフィー上に播種し、消去前に２４時間培養して、マイクロトポグラフィーに沿った細胞の配向を可能にした。 湿潤雰囲気中、３７℃で培地を上に置き、共焦点顕微鏡の蛍光灯でサンプルを５分間照射し、消去から２時間後に固定し、免疫標識した。 部分的な光消去は、トリプシン処理による細胞除去後、ＤＨＭ によって確認された。ＰＤＭＳ層の存在下では、裸のＤＲ１ｇと比較して消去はより均一になり、上記の丸い表面の特徴の数が大幅に減少した。 細胞に対する光毒性の可能性も研究された。 この実験では、カバーガラスの底面にＤＲ１ｇをスピンコートし、ガラス基板が細胞と材料の界面にあるサンプル上に細胞を播種した。このような対照サンプルでは、消去プロセスと同様の光強度が細胞の平面に到達することが保証されたが、細胞接着部位にトポグラフィー的変化は生じなかった。 対照サンプルを蛍光灯で５ 分間照射し、３時間の消去後に生死生存率 / 細胞毒性アッセイを実行した。 消去されていない領域と同様に、消去された領域では死んだ細胞が見られなかったため、細胞生存率に対する重大な急性光毒性影響は観察されなかった。 細胞形態に対する光毒性の影響を研究する場合、同様の接着特性を確保するために、ＰＤＭＳ を対照サンプルの反対側の細胞と材料の界面にスピンコートした。 照射から２時間以内では、細胞形態に有意な違いは観察されなかった。

【0082】

細胞グループは、消去後の形態の広がりが少なく、サイズが小さくなっていた。これは、トポグラフィーの変化後に基板付着が部分的に失われたことを示している可能性がある。 さらに、消去後、ｐＦＡＫ は細胞の端よりも細胞の中心に集中していることが観察された。 微細トポグラフィーが均一な上皮細胞層の下で消去された場合、顕著な形態変化は観察されなかった。 この観察は、強力な細胞間結合が形成された場合、少なくとも消去後２時間以内には、誘導表面トポグラフィーの喪失に応答して単層の上皮細胞がすぐには再配置されないことを示唆している。 接着斑配向の定量化は、上記と同様に実施した。 配向データは、小さな細胞グループで消去した後、接着斑がよりランダムに配向していることを示した。ただし、集密的な細胞層の場合には違いは観察されなかった。 これは、より小さな細胞グループが光誘起のトポグラフィー的変化を感知し、それに応じて接着斑の向きを変えることができることを示している。 消去は焦点の伸長と面積に影響を与えないようであった。 たとえ液体の存在下で共焦点顕微鏡のランプを使用してトポグラフィーの消去が部分的であったとしても、マイクロトポグラフィーと表面の粗さは変化する可能性がある。 トポグラフィーの変化は、小さな細胞グループの形態と接着斑の配向に影響を与えた。 しかし、少なくとも２時間の期間中は、集団的な形態学的反応や接着斑の配向は観察されなかった。 細胞は照射後も消去された表面に付着し、生存したままであった。

【0083】

結論
ここで紹介するプラットフォームは、光応答性アゾベンゼンを含むフィルムと薄い ＰＤＭＳ 又はパリレンＣコーティングで構成されており、光応答性と細胞培養環境における材料の安定性を独立して制御できる。 これらの層は一緒になって二層構造を形成し、アゾベンゼン含有フィルムの光誘導運動による表面トポグラフィーの変更が可能になった。 ＳＲＧトポグラフィーは、ＰＤＭＳ 及びパリレンＣ 層の存在下で効率的に光書き込み及び消去されました。 ＭＤＣＫＩＩ上皮細胞を光パターン化システムに播種すると、ＳＲＧ トポグラフィーは、均一な上皮層の形成後も表面トポグラフィーに沿って局所接着配向を導くことができた。表面トポグラフィーは、生細胞の存在下で共焦点顕微鏡の蛍光灯を使用して変更でき、表面トポグラフィーの非侵襲的制御が可能になる。 ＳＲＧトポグラフィーの消去は部分的であったにもかかわらず、細胞剥離や細胞死を引き起こすことなくトポグラフィーを変更することができた。 従って、光媒介消去は、従来の顕微鏡セットアップで実行できるリアルタイム細胞実験のために材料のトポグラフィーを動的に制御する戦略である。 このプラットフォームはタンパク質でさらにパターン化することができ、トポグラフィー的及び生化学的手がかりを個別に制御し、さまざまな用途に合わせてさらに機能化することが可能になる。

【実施例】

【0084】

実験セクション
サンプル調製
ポリマーはＰＤＭＳである。 アゾベンゼン含有ディスパース レッド 1 分子ガラス (ＤＲ１ｇ、Ｓｏｌａｒｉｓ Ｃｈｅｍ Ｉｎｃ．) とポリジメチルシロキサン (ＰＤＭＳ、ＳＹＬＧＡＲＤ １８４、Ｄｏｗ) の二重層を、スピン コーティング (Ｌａｕｒｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ) によって正方形のカバーガラス上に調製した。 まず、カバーガラスをアセトン中で １０ 分間２回超音波処理した。 濃度９％（ｗ／ｖ）のＤＲ１ｇのクロロホルム溶液を調製した。 溶液 (３５ μｌ) をカバーガラス (２２ｘ２２ｍｍ^２) 上に １５００ｒｐｍ で ３０ 秒間堆積させた。 ＰＤＭＳ は、プレポリマー シリコーン エラストマー ベースと硬化剤を １０：１ の比率で混合することによって調製された。 未硬化の ＰＤＭＳ を ｎ－ヘキサンで希釈して、５０、１、及び ０．０２ｗｔ％ の溶液を作成した。溶液を薄い ＤＲ１ｇ フィルム上に６０００ｒｐｍ で１５０秒間塗布し、５５℃で１．５ 時間硬化させた。 まず、上述のようにシリコン基板上にＰＤＭＳ溶液をスピンコーティングすることによって、厚さ測定用のサンプルを調製した。 生成された ＰＤＭＳ フィルムの厚さは、反射エリプソメトリー (Ｊ．Ａ、Ｗｏｏｌｌａｍ ＶＡＳＥ) で測定された。 ５０重量％ＰＤＭＳ溶液はエリプソメトリー測定するには厚すぎる膜を形成したため、厚さを触針式表面計（Ｖｅｅｃｏ Ｄｅｋｔａｋ １５０）で測定した。 どちらの技術でも、解像度の限界はサブナノメートルの範囲にある。

【0085】

サンプル調製
ポリマーはパリレンＣである。アゾベンゼンを含む ディスパース レッド 1分子ガラス (ＤＲ１ｇ、Ｓｏｌａｒｉｓ Ｃｈｅｍ Ｉｎｃ．) とパリレン Ｃ (Ｇａｌｅｎｔｉｓ Ｌｔｄ．) の二重層を、上に示したように ディスパース レッド 1 をスピン コーティングし、続いて、他の場所で説明されている浸出ベースの方法を使用して、パリレン Ｃ を化学蒸着 (Ｐａｒａ Ｔｅｃｈ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｉｎｃ．)することによって正方形のカバーガラス上に調製した。 各二次堆積チャンバーの内部をより大きな主機械チャンバーと接続するオリフィスは、横方向のサイズが ２００ μｍ ～ ８０００ μｍ の範囲の正方形の穴であった。フィルムの最終的な厚さは、触針式粗面計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄｅｋｔａｋ ＸＴ）を使用して推定された。 各堆積実行ごとに、２ｇのジクロロ－ｐ－シクロファン二量体を、内部表面積１９２１０ｍｍ ^２ の４つの円筒形二次チャンバーとして機能する堆積システムに装填した。

【0086】

サンプル調製
ポリマーはポリアクリルアミドヒドロゲルである。円形のガラス製カバーガラス (１３ｍｍ) を超音波浴中で ２％ Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ 溶液で ３０ 分間洗浄し、豊富な脱イオン水で洗浄し、注意深く乾燥させた。 ガラスカバースリップの不動態化は、ＰＬＬ－ＰＥＧ をグラフトすることで達成された。 ０．１ｍｇ／ｍｌ ＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧ の ＰＢＳ 溶液を １ 滴 (１０ ～ ３０ μｌ) カバースリップ上に滴下し、３０ 分間反応させた。 次いで、基板を多量の脱イオン水で洗浄した。試薬溶液は次のように調製した：アクリルアミド (１０ｗｔ％)、ビス－アクリルアミド (０．０３ｗｔ％)、蛍光微粒子 (０．０４ｗｔ％)、Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’－テトラメチル エチレンジアミン (ＴＥＭＥＤ、０．０２ｖｏｌ％)、及び過硫酸アンモニウム (０．１ｗｔ％) をＰＢＳに溶解した。次に、ゲル化溶液をＤＲ１－ｇでコーティングされたカバーガラス上にピペットで移し、不動態化されたカバーガラスで １５ 分間覆った。 ヒドロゲルの予想弾性率は２．８ｋＰａ、厚さは １００ μｍ である。

【0087】

表面レリーフ格子の書き込みと消去。二層構造は、ロイドミラー構成で干渉リソグラフィーを使用して光パターン化された。 表面レリーフ格子 (ＳＲＧ) の書き込みは、円偏光、強度 ５００ｍＷｃｍ^－２、面積 ０．５０ｃｍ^２の ４８８ｎｍ 連続波レーザー (Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＣＸ４８８－２０００) を使用して行われた。 マイクロトポグラフィ周期 Λ は １ 又は １．５ μｍ に設定され、Λ ＝ λ/2sinθ によって決定され、ここで、λ はレーザーの波長、θ はミラーとレーザー ビーム間の角度である。ＳＲＧ の消去は ５３０ｎｍのＬＥＤ で行われ、ビームは １００ｍＷｃｍ^－２ の強度で ＳＲＧ トポグラフィーに直接集束された。 ＳＲＧ の書き込みと消去は、低出力 (１ｍＷ) ６３３ｎｍのＨｅ－Ｎｅ レーザーで監視され、1 次の回折ビームの回折効率が測定された。

【0088】

細胞培養。 この研究には、上皮Madin-Darbyイヌ腎臓II型（ＭＤＣＫＩＩ）細胞が使用された。 ウシ胎児血清 (１０％) 及びペニシリン/ストレプトマイシン (１％) を補充した ＭＥＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ） からなる培地中、５％ＣＯ_２ の加湿雰囲気下、３７ ℃で培養した。 細胞を播種する前に、サンプルを ＵＶ 光下で ４０ 分間滅菌した。 サンプルを、０．０２Ｎ酢酸中の５０μｇ ｍｌ-１モノマーラット尾Ｉ型コラーゲン溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４０分間コーティングした。

【0089】

免疫標識。 細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、透過化緩衝液(ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ１００)で１０分間透過化し、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミンを使用して1時間ブロックした。 サンプルをウサギ抗 ｐＦＡＫ (１：２００、Ａｂｃａｍ、♯ab８１２９８) 及びラット抗ウボモルリン/E－カドヘリン (１：１００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ) で標識した。 使用した二次抗体は、抗ラット Ａｌｅｘａ５６８ (１：２００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃Ａ１１００７７) 及び抗ウサギ Ａｌｅｘａ ６４７ (１：２００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃Ａ２１２４４) であった。アクチン細胞骨格は、４８８－ファロイジン (１：５０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃４９ ４０９) を使用して標識された。 サンプルは、細胞核を染色する ４‘，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール (ＤＡＰＩ) (Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｐ３６９３５) を含む ＰｒｏＬｏｎｇ Diamond 退色防止封入剤で封入した。

【0090】

光学イメージング。 サンプルは光学 (Ｚｅｉｓｓ) 及び共焦点顕微鏡 (Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ レーザー走査型共焦点顕微鏡、Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＢＶ) で画像化された。 共焦点顕微鏡では、使用したレーザーラインは ４０５、４８８、５６１、及び ６３３ｎｍ であった。 各画像について、光退色を避けるためにレーザー強度が調整され、画像の明るさが最適化されるように検出器の感度が調整された。 ６０ｘ／１．４ Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ油浸対物レンズと ２０ｘ／０．８ Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ 空気浸対物レンズを使用して、１０２４ ｘ １０２４ ピクセルの画像を得た。 データは ３Ｄ Ｚ スタックの形式であり、それぞれ １５０ ～ ２５０ｎｍ 間隔の ３０ ～ ４０ のスライスが含まれていた。 タイムラプス顕微鏡検査はＥＶＯＳ ＦＬ ａｕｔｏ(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を使用して実行された。

【0091】

共焦点顕微鏡によるトポグラフィー消去。ＳＲＧトポグラフィーは、ＬＳＭ７８０ レーザー走査型共焦点顕微鏡 (Ｚｅｉｓｓ) で消去された。 消去時には Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ２０／１．４ 水浸対物レンズを使用した。 照射中、サンプルは乾燥環境、液体培養環境、又は細胞培養環境のいずれかにあった。 サンプルは、強度１．５Ｗｃｍ^－２の青色領域 (４７０±４０ｎｍ) でフィルターされた蛍光灯で５分間照射された。 消去の前後にトポグラフィーの明視野画像が撮影された。ＭＤＣＫＩＩ細胞の場合、サンプルは蛍光灯で照射され、その後表面特性評価のためにトリプシンで細胞がサンプルから剥離されるか、免疫標識のために２ 時間後に固定された。

【0092】

生死生存率アッセイ。 ＭＤＣＫＩＩ細胞を光パターン化二重層上に播種し、サンプルの上で ２４ 時間培養した。 トポグラフィーは上記のように消去された。消去から ３ 時間後、細胞を ＰＢＳ で洗浄し、哺乳類細胞用^＊生死 生存率/細胞毒性キット^＊(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ) を使用して、ＰＢＳ中、０．５０μｌ／ｍｌのカルセインＡＭ及び２μｌ／ｍｌのエチジウムモノダイマー－１を含む、６００ μｌ 生死 試薬溶液を各サンプルに加えて染色した。サンプルは、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気下、３７ ℃で ３０ 分間インキュベートされた。インキュベーション後、試薬溶液を吸引し、細胞の乾燥を防ぐために６００μｌのＰＢＳを添加した。 サンプルは、４８８ｎｍ及び５６１ｎｍ のレーザーラインを使用して共焦点顕微鏡 (Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒレーザー走査型共焦点顕微鏡) で画像化された。 ２０ｘ／０．８ Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ 空気浸対物レンズを使用して、１０２４ｘ１０２４ ピクセル画像を得た。

【0093】

画像及び統計分析。 接着斑の分布は、ＩｍａｇｅＪ の ＦＦＴ プラグインを使用して接着斑チャネルの高速フーリエ変換で分析された。 ＦＦＴ 画像を生成する前に、９００ ピクセルの円形領域が切り取られ、この領域からＦＦＴ画像が生成された。 ＩｍａｇｅＪ を使用して、接着斑の伸び、面積、配向を測定した。 接着斑の伸びと配向のさらなる分析は、ＭｏｍｅｎｔＭａｃｒｏＪ ｖ１．４Ｂ スクリプト (https://www.hopkinsmedicine.org/fae/mmacro.html) を使用して行われた。 図３ｄ ～ｆのグラフは、１０ 枚の個別の画像から定量化された １００ 個の接着斑の平均を表している。 図 ５ｃ、ｄ及び図 ７ｃ では、グラフは ２ つの別個の画像から定量化された ３０ 個の接着斑の平均を表している。分析の前に、接着斑画像を処理してピクセルノイズを除去した。 主慣性モーメント (最大値と最小値) を測定し、細胞の伸びをこれらの値の比 (最大値/最小値) として定義した。 値が高いほど、接着斑がより長く伸びていることを示す。 接着斑の方向は、表面パターンの方向と最大軸の間の角度として定義された。 統計分析は、Ｏｒｉｇｉｎ バージョン ２０１９ｂ (ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ) 及び ＭＡＴＬＡＢ（登録商標） を使用して行われた。 定量化された接着斑が １０ 万件未満の実験について、テストの統計的検出力を推定した。実際の電力値が ７５％ を超える場合、統計的な差異は有意であると推定された。 データは非正規分布であることが判明したため、ボンフェローニによるノンパラメトリック クラスカル-ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ-Ｗａｌｌｉｓ）検定とダン-シダック（Ｄｕｎｎ－Ｓｉｄａｋ）事後検定を使用して統計的有意性を評価した。

【0094】

上記の説明で提供された特定の例は、添付の特許請求の範囲及び／又は適用可能性を限定するものとして解釈されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【手続補正書】

【提出日】2024-02-09

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0007】

従って、本発明の目的は、請求項１に記載のパターン化された細胞培養システムを提供することである。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】削除

【補正の内容】

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】削除

【補正の内容】

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】削除

【補正の内容】

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0012】

本発明のさらに別の目的は、パターン化されたシステムのトポグラフィー的特徴を消去するための方法を提供することであり、この方法は、レーザー、好ましくは連続波レーザーによって生成される、又は蛍光灯もしくはＬＥＤによって生成される４３０ｎｍ～６００ｎｍの光、好ましくは４６０ｎｍ～５３０ｎｍの光にトポグラフィー特徴をさらすことを含む。

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１４

【補正方法】削除

【補正の内容】

【手続補正7】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

支持構造体（１０１、２０１）、アゾベンゼン含有中間層（１０２、２０２）、及びエラストマー、ヒドロゲル及びパリレン、好ましくはパリレンＣから選択される保護ポリマーを含む最上層（１０３、２０３）を含むシステムのアゾベンゼン含有中間層の１か所以上の領域を、レーザー、好ましくは連続波レーザーによって生成される光にさらすことにより取得される、細胞培養のためのパターン化されたシステム（１００、２００）であって、前記光の波長が、４３０ｎｍ～５３０ｎｍであり、前記光の強度が１Ｗｃｍ ^－２ ～５Ｗｃｍ ^－２ であることにより、前記システムにトポグラフィー的特徴を生じる、パターン化されたシステム。

【請求項2】

前記アゾベンゼン含有層の厚さが５０ｎｍ～５μｍであり、そして前記最上層の厚さが２０ｎｍ～１００μｍ、好ましくは２０ｎｍ～２００ｎｍである、請求項１に記載のパターン化されたシステム。

【請求項3】

前記アゾベンゼン含有層の厚さが５０ｎｍ～５μｍであり、そして前記最上層の厚さが５０ｎｍ～１００μｍである、請求項１に記載のパターン化されたシステム。

【請求項4】

前記支持構造体が、ペトリ皿、顕微鏡カバースリップ、及びウェルプレートなどの細胞培養ディスクから選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載のパターン化されたシステム。

【請求項5】

前記エラストマーがシロキサンである、請求項１～４のいずれか１項に記載のパターン化されたシステム。

【請求項6】

前記シロキサンがＰＤＭＳである、請求項５に記載のパターン化されたシステム。

【請求項7】

前記アゾベンゼンが、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－４－（４－ニトロフェニルアゾ）アニリンである、請求項１～６のいずれか１項に記載のパターン化されたシステム。

【請求項8】

支持構造体（１０１、２０１）、アゾベンゼン含有中間層（１０２、２０２）、及びエラストマー、ヒドロゲル及びパリレン、好ましくはパリレンＣから選択される保護ポリマーを含む最上層（１０３、２０３）を含むシステムのアゾベンゼン含有材料上にトポグラフィーを可逆的に刻むための方法であって、以下の工程：
前記最上層上でレーザー光を走査すること、ここで前記光の波長が４００ｎｍ～６００ｎｍ、好ましくは４３０ｎｍ～５３０ｎｍであり、前記光の強度が１Ｗｃｍ ^－２ ～５Ｗｃｍ ^－２ である；又は
レーザー光の干渉パターンを材料に投影すること、ここで２つの干渉するレーザー光の波長が４００ｎｍ～６００ｎｍ、好ましくは４３０ｎｍ～５３０ｎｍであり、そして２つの干渉するレーザー光の強度が１００ｍＷｃｍ ^－２ ～６００ｍＷｃｍ ^－２ である；
を含む方法。

【請求項9】

請求項１～７のいずれか１項に記載のパターン化されたシステムのトポグラフィー特徴を消去するための方法であって、レーザー、好ましくは連続波レーザーによって生成される、又は蛍光灯もしくはＬＥＤによって生成される４００ｎｍ～６００ｎｍの光、好ましくは４６０ｎｍ～５３０ｎｍの光にトポグラフィー特徴をさらすことを含む方法。

【請求項10】

レーザー、蛍光灯、又はＬＥＤ によって生成される光の強度が１Ｗｃｍ^－２～５Ｗｃｍ^－２である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

細胞培養プラットフォームとしての、請求項１～７のいずれか１項に記載のパターン化されたシステムの使用。

【請求項12】

請求項１～７のいずれか１項に記載のパターン化されたシステム上で細胞を培養する、細胞培養方法。

【請求項13】

以下の工程：
a) パターン化されたシステムを提供する工程、
b) パターン化されたシステムの最上層を細胞接着タンパク質でコーティングする工程、及び
c) 細胞接着タンパク質上に細胞を播種する工程を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記細胞が、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、ニューロン、間葉幹細胞、星状細胞、心筋細胞、及び癌細胞から選択される、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

前記細胞接着タンパク質が、コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニンから選択される、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

工程ｂ）の前に酸素プラズマ処理を含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。

【国際調査報告】