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特表2024-529930低減されたオフターゲット効果を有する修飾低分子干渉ＲＮＡ分子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-14
(54)【発明の名称】低減されたオフターゲット効果を有する修飾低分子干渉ＲＮＡ分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240806BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240806BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240806BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20240806BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240806BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240806BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240806BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240806BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/713
A61K48/00
A61P35/00
A61P43/00 105
A61P3/00
A61P9/00
A61P37/02
A61P9/04
A61P11/00
A61P1/16
A61P13/12
A61P3/04
A61P3/10
C12N15/113 110Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503797
(86)(22)【出願日】2022-07-21
(85)【翻訳文提出日】2024-03-13
(86)【国際出願番号】 CN2022107028
(87)【国際公開番号】W WO2023001234
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/107862
(32)【優先日】2021-07-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＱＲコード
(71)【出願人】
【識別番号】523209276
【氏名又は名称】マイクロバイオ （シャンハイ） カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】チャン，イー－チュン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，チー－ファン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ホイ－ユー
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，チャ－チュン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA36
4C084ZA37
4C084ZA59
4C084ZA70
4C084ZA75
4C084ZA81
4C084ZB07
4C084ZB21
4C084ZB26
4C084ZC21
4C084ZC35
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA36
4C086ZA37
4C086ZA59
4C086ZA70
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZB07
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZC21
4C086ZC35
(57)【要約】
オフターゲット効果を低減するための、アンチセンス鎖にホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含む、修飾低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、並びにその方法及び使用。高い特異性及びサイレンシング効率で低酸素誘導因子１サブユニットアルファ（ＨＩＦ１ａ）を標的とする、ｓｉＲＮＡ。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
センス鎖及びアンチセンス鎖を含む修飾低分子干渉（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子であって、前記アンチセンス鎖が、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び／又は６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間にホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含み、前記修飾ｓｉＲＮＡが、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を有しないｓｉＲＮＡ対応物と比較して、低減されたオフターゲット効果を有する、修飾低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子。
【請求項2】
前記アンチセンス鎖が、１位のヌクレオチドと２位のヌクレオチドとの間及び／又は２位のヌクレオチドと３位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を更に含む、請求項１に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項3】
前記アンチセンス鎖が、１９～２５ヌクレオチド長のものである、請求項１又は２に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項4】
前記アンチセンス鎖が、３’末端における第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチドとの間及び／又は前記３’末端における前記第２のヌクレオチドと第３のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項5】
前記アンチセンス鎖が、２１ヌクレオチド長のものである、請求項３に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項6】
前記アンチセンス鎖が、１９位のヌクレオチドと２０位のヌクレオチドとの間及び／又は２０位のヌクレオチドと２１位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を更に含む、請求項５に記載の修飾ｓｉＲＮＡ。
【請求項7】
前記修飾ｓｉＲＮＡ分子が、任意選択で、細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、又は真菌遺伝子である、病原性遺伝子の発現をサイレンシングする、請求項１～６のいずれか一項に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項8】
前記修飾ｓｉＲＮＡ分子が、疾患遺伝子の発現をサイレンシングする、請求項１～７のいずれか一項に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項9】
前記疾患遺伝子が、がん、線維症、代謝性疾患、心血管疾患、免疫疾患、又は遺伝性障害に関与する、請求項８に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項10】
前記疾患遺伝子が、がんに関与し、任意選択で、前記疾患遺伝子が、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦ、ＥＲＥＧ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、ＳＴＡＴ３、ＣＤＨ２、ＫＩＦＬ１、ＰＩＫ３ＣＡ、Ｓｒｃ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、及びＴＰ５３からなる群から選択される、請求項９に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項11】
前記疾患遺伝子が、線維症に関与し、任意選択で、前記疾患遺伝子が、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ１Ｂ、ＨＩＦ２、ＴＧＦ－β１、及びＣＴＧＦからなる群から選択される、請求項９に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項12】
前記疾患遺伝子が、代謝性疾患又は心血管疾患に関与し、任意選択で、前記疾患遺伝子が、ＡＧＴ、ＡｐｏＣ－ＩＩＩ、及びアポＢからなる群から選択される、請求項９に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項13】
前記疾患遺伝子が、免疫疾患に関与し、任意選択で、前記疾患遺伝子が、ＧＡＴＡ－３、ＣＣＲ３、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＣＣＬ２、及びＣＣＬ１０からなる群から選択される、請求項９に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項14】
前記疾患遺伝子が、遺伝性障害に関与し、任意選択で、前記疾患遺伝子が、アポＢ又はＰＣＳＫ９である、請求項９に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項15】
前記修飾ｓｉＲＮＡ分子が、標的化部分と会合する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項17】
標的遺伝子をサイレンシングするための方法であって、請求項１～１５のいずれか一項に記載の修飾ｓｉＲＮＡ分子又は請求項１６に記載の医薬組成物を、前記標的遺伝子を発現する細胞と接触させることを含む、方法。
【請求項18】
接触させるステップが、前記修飾ｓｉＲＮＡ分子又は前記医薬組成物の投与を必要とする対象にそれを行うことによって実行される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
ヒト低酸素誘導因子１サブユニットアルファ（ＨＩＦ１α）を標的とする干渉ＲＮＡであって、前記干渉ＲＮＡが、ＨＩＦ１α ｍＲＮＡ内の標的部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記ＨＩＦ１α ｍＲＮＡ内の前記標的部位が、（ａ）ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡＵ（配列番号１）、
（ｂ）ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡＵ（配列番号２）、
（ｃ）ＣＣＧＧＵＵＧＡＡＵＣＵＵＣＡＧＡＵＡ（配列番号３）、
（ｄ）ＧＣＧＣＡＡＧＵＣＣＵＣＡＡＡＧＣＡＣ（配列番号４）、
（ｅ）ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡ（配列番号５）、又は
（ｆ）ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡ（配列番号６）のヌクレオチド配列を含む、干渉ＲＮＡ。
【請求項20】
前記干渉ＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１９に記載の干渉ＲＮＡ。
【請求項21】
前記アンチセンス鎖が、１９～２５ヌクレオチド長のものである、請求項１９に記載の干渉ＲＮＡ。
【請求項22】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ、以下のヌクレオチド配列：（ａ）５’－ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡＡ－３’（配列番号７）及び
５’－ＵＵＡＵＡＣＧＵＧＡＡＵＧＵＧＧＣＣＵＧＵ－３’（配列番号８）、又は
（ｂ）５’－ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡＡ－３’（配列番号９）及び
５’－ＵＵＡＵＡＡＵＧＧＵＡＣＵＵＣＣＵＣＡＡＵ－３’（配列番号１０）を含む、請求項２０又は２１に記載の干渉ＲＮＡ。
【請求項23】
前記アンチセンス鎖が、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び／又は６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間にホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含み、前記修飾ｓｉＲＮＡが、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を有しないｓｉＲＮＡ対応物と比較して、低減されたオフターゲット効果を有する、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の干渉ＲＮＡ。
【請求項24】
前記アンチセンス鎖が、１位のヌクレオチドと２位のヌクレオチドとの間及び／又は２位のヌクレオチドと３位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を更に含む、請求項２３に記載の干渉ＲＮＡ。
【請求項25】
前記アンチセンス鎖が、３’末端における第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチドとの間及び／又は前記３’末端における前記第２のヌクレオチドと第３のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を更に含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の干渉ＲＮＡ。
【請求項26】
前記干渉ＲＮＡが、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の干渉ＲＮＡ。
【請求項27】
前記１つ以上の修飾ヌクレオチドが、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の干渉ＲＮＡ。
【請求項28】
請求項１９～２７のいずれか一項に記載のヒトＨＩＦ１αを標的とする干渉ＲＮＡと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項29】
ヒトＨＩＦ１αの発現を抑制するための方法であって、有効量の請求項１９～２７のいずれか一項に記載の干渉ＲＮＡを、ヒトＨＩＦ１αを発現する細胞と接触させることを含む、方法。
【請求項30】
接触させるステップが、前記有効量の前記干渉ＲＮＡ又はそのようなものを含む医薬組成物を対象に投与することによって実行される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記対象が、ＨＩＦ１αに関連する疾患を有するか、又は有すると疑われたヒト患者である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記ＨＩＦ１αに関連する疾患が、がん、心疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患、肥満、又は糖尿病である、請求項３１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月２２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１０７８６２号の出願日の利益を主張し、この内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年７月２２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１０７８６２号の出願日の利益を主張し、この内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。所望の治療効果を達成するために、標的遺伝子の発現を特異的にサイレンシングするべくＲＮＡｉに影響を及ぼす能力にかなりの注意が払われる。
【0003】
ｓｉＲＮＡ治療薬が直面する課題は重大である。これは、ポリアニオン性であるなどのｓｉＲＮＡの固有の特性、ヌクレアーゼ切断に対する脆弱性が、細胞取り込み及び迅速なクリアランスが不十分であるために臨床応用を困難にするためである。加えて、有害なタンパク質結合又はｍＲＮＡの誤標的化に起因して生じるオフターゲット効果は、ｓｉＲＮＡ療法を更に制限する可能性がある。
【0004】
したがって、オフターゲット効果が大幅に低減された強力なｓｉＲＮＡを開発する必要性が増大している。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、低減されたオフターゲット効果を示す修飾低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の開発に少なくとも部分的に基づく。したがって、低減されたオフターゲット効果を有する修飾ｓｉＲＮＡ、及び標的遺伝子、例えば、疾患又は障害に関連するものをサイレンシングするためのそれらの使用が、本明細書において提供される。
【0006】
いくつかの態様では、本開示は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、修飾低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を提供する。アンチセンス鎖は、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び／又は６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間にホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含む。修飾ｓｉＲＮＡは、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を有しないｓｉＲＮＡ対応物と比較して、低減されたオフターゲット効果を有する。いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、標的化部分と会合してもよい。
【0007】
いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１位のヌクレオチドと２位のヌクレオチドとの間及び／又は２位のヌクレオチドと３位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を更に含んでもよい。代替として、又は加えて、修飾ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、３’末端における第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチドとの間及び／又は３’末端における第２のヌクレオチドと第３のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を更に含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１９～２５ヌクレオチド長のものである。例えば、修飾ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長のものである。その場合、修飾ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１９位のヌクレオチドと２０位のヌクレオチドとの間及び／又は２０位のヌクレオチドと２１位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を更に含んでもよい。
【0009】
いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、任意選択で細菌遺伝子、ウイルス遺伝子、又は真菌遺伝子である、病原性遺伝子の発現をサイレンシングする。他の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、疾患遺伝子の発現をサイレンシングする。例示的な疾患遺伝子としては、がん、線維症、代謝性疾患、心血管疾患、免疫疾患、又は遺伝性障害に関与するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0010】
いくつかの例では、疾患遺伝子は、がんに関与し得る。具体的な例としては、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦ、ＥＲＥＧ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、ＳＴＡＴ３、ＣＤＨ２、ＫＩＦＬ１、ＰＩＫ３ＣＡ、Ｓｒｃ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、及びＴＰ５３が挙げられる。いくつかの例では、疾患遺伝子は、線維症に関与し得る。具体的な例としては、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ１Ｂ、ＨＩＦ２、ＴＧＦ－β１、及びＣＴＧＦが挙げられる。いくつかの例では、疾患遺伝子は、代謝性疾患又は心血管疾患に関与し得る。具体的な例としては、ＡＧＴ、ＡｐｏＣ－ＩＩＩ、及びアポＢが挙げられる。いくつかの例では、疾患遺伝子は、免疫疾患に関与し得る。具体的な例としては、ＧＡＴＡ－３、ＣＣＲ３、ＴＧＦ－α１、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－１β、ＣＣＬ２、及びＣＣＬ１０が挙げられる。他の例では、疾患遺伝子は、遺伝性障害に関与し得る。具体的な例としては、アポＢ及びＰＣＳＫ９が挙げられる。
【0011】
他の態様では、本開示は、本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ分子のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を特徴とする。
【0012】
更に、標的遺伝子をサイレンシングするための方法であって、修飾ｓｉＲＮＡ分子、又は修飾ｓｉＲＮＡ分子と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を、標的遺伝子を発現する細胞と接触させることを含む、方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、修飾ｓｉＲＮＡ分子又は医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことによって実行することができる。
【0013】
別の態様では、ヒト低酸素誘導因子１サブユニットアルファ（ＨＩＦ１α）を標的とする干渉ＲＮＡ（抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ）が本明細書において提供される。干渉ＲＮＡは、ＨＩＦ１α ｍＲＮＡ内の標的部位に相補的なヌクレオチド配列を含む。標的部位は、
（ａ）ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡＵ（配列番号１）、
（ｂ）ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡＵ（配列番号２）、
（ｃ）ＣＣＧＧＵＵＧＡＡＵＣＵＵＣＡＧＡＵＡ（配列番号３）、
（ｄ）ＧＣＧＣＡＡＧＵＣＣＵＣＡＡＡＧＣＡＣ（配列番号４）、
（ｅ）ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡ（配列番号５）、又は
（ｆ）ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡ（配列番号６）のヌクレオチド配列を含んでもよい。
（ａ）ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡＵ（配列番号１）、
（ｂ）ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡＵ（配列番号２）、
（ｃ）ＣＣＧＧＵＵＧＡＡＵＣＵＵＣＡＧＡＵＡ（配列番号３）、
（ｄ）ＧＣＧＣＡＡＧＵＣＣＵＣＡＡＡＧＣＡＣ（配列番号４）、
（ｅ）ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡ（配列番号５）、又は
（ｆ）ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡ（配列番号６）のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【0014】
いくつかの実施形態では、ＨＩＦ１α ｍＲＮＡ内の標的部位は、ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡ（配列番号５）のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ＨＩＦ１α ｍＲＮＡ内の標的部位は、ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡ（配列番号６）のヌクレオチド配列を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである。いくつかの事例では、アンチセンス鎖は、１９～２５ヌクレオチド長であってもよい。例では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ、以下のヌクレオチド配列：５’－ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡＡ－３’（配列番号７）及び５’－ＵＵＡＵＡＣＧＵＧＡＡＵＧＵＧＧＣＣＵＧＵ－３’（配列番号８）を含む。他の例では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ、以下のヌクレオチド配列：５’－ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡＡ－３’（配列番号（９）及び５’－ＵＵＡＵＡＡＵＧＧＵＡＣＵＵＣＣＵＣ ＡＡＵ－３’（配列番号１０）を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、抗ＨＩＦ１ａ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び／又は６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間にホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含んでもよい。このような修飾ｓｉＲＮＡは、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を有しないｓｉＲＮＡ対応物と比較して、低減されたオフターゲット効果を有する。いくつかの事例では、アンチセンス鎖は、１位のヌクレオチドと２位のヌクレオチドとの間及び／又は２位のヌクレオチドと３位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を更に含む。代替として、又は加えて、アンチセンス鎖は、３’末端における第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチドとの間及び／又は３’末端における第２のヌクレオチドと第３のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を更に含む。
【0017】
本明細書に開示される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを更に含み得る。例えば、抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡは、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、又はこれらの組み合わせを含んでもよい。
【0018】
加えて、本開示は、本明細書に開示される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を特徴とする。
【0019】
更に別の態様では、本開示は、ヒトＨＩＦ１αの発現を抑制するための方法であって、有効量の本明細書に開示される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかを、ヒトＨＩＦ１αを発現する細胞と接触させることを含む、方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、本方法は、有効量の干渉ＲＮＡ又はそのようなものを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの例では、対象は、ＨＩＦ１αに関連する疾患を有するか、又は有すると疑われたヒト患者である。ＨＩＦ１αに関連する例示的な疾患としては、がん（例えば、固形腫瘍）、心疾患（例えば、虚血性心疾患、若しくはうっ血性心不全）、肺疾患（例えば、肺高血圧症、肺線維症、若しくは慢性閉塞性肺疾患）、肝疾患（例えば、急性肝不全、肝線維症、若しくは肝硬変）、腎疾患（例えば、急性腎損傷若しくは慢性腎疾患）、肥満、又は糖尿病が挙げられる。
【0020】
また、本明細書に開示される標的疾患を治療するための修飾ｓｉＲＮＡ又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかを含む医薬組成物、並びに標的疾患の治療における使用のための医薬品を製造するための修飾ｓｉＲＮＡ又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡの使用が、本開示の範囲内である。
【0021】
本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本開示の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの発明を実施するための形態から明らかであり、また、添付の特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【0022】
以下の図面は、本明細書の一部分を形成し、本開示のある態様を更に実証するために含まれ、本開示のある態様は、本明細書に提示される具体的な発明を実施するための形態と合わせて図面を参照することによって、より良好に理解され得る。
【0023】
【図1】ゲノム全体のＲＮＡ配列決定によって評価される、ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡによって引き起こされるオフターゲット事象を示すグラフである。試験されたｓｉＲＮＡは、アスタリスク（「＊」）によって示されるように、様々な位置にＰＳヌクレオチド間結合を有する。左側の数字はダウン事象を指し、右側の数字はアップ事象を指す。
【図2】示される様々な位置にホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を有するＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡのノックダウン効率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0024】
ＲＮＡ干渉又は「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が宿主細胞内に導入されたときに、ｄｓＲＮＡが遺伝子発現を遮断する、プロセスである。（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６－８１１）。ＲＮＡｉ療法に対する障害のうちの１つは、オフターゲット効果である（Ｓｅｏｋ ｅｔ ａｌ（２０１８），Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７５，７９７－８１４）。低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）は、標的遺伝子の発現を阻害するためにＲＮＡｉで一般的に使用される。
【0025】
ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖、及びセンス鎖であり、これらは、相補的な配列を含有し、二本鎖構造を形成する。アンチセンス鎖の少なくとも一部は、ＲＮＡｉを介してｍＲＮＡの発現を遮断するための標的ｍＲＮＡ内の領域に相補的である。ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、１９～２３ヌクレオチドを有し得る。いくつかの事例では、各鎖は、リン酸化５’末端及びヒドロキシル化３’末端を有し得る。いくつかの事例では、アンチセンス鎖は、カップルのオーバーハングヌクレオチド（例えば、１又は２）を有し得る。ｓｉＲＮＡは、細胞内にトランスフェクトされると、コアタンパク質アルゴノート（ＡＧＯ）を含むＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内に組み込まれる。その後、ｓｉＲＮＡは、ほどけて一本鎖ＲＮＡになる。その後、アンチセンス鎖はＡＧＯと会合したままで活性ＲＩＳＣを形成するが、センス鎖は分解される。アンチセンス鎖は標的転写物（ｍＲＮＡ）と塩基対を形成し、ＡＧＯは標的を切断してその機能（遺伝子発現）をサイレンシングする。
【0026】
オフターゲット効果は、ｓｉＲＮＡ療法に関連する１つの潜在的な問題である。したがって、オフターゲット効果が低減されたｓｉＲＮＡを開発することは、非常に強力かつ安全なＲＮＡｉ療法に対して非常に望ましい。
【0027】
本開示は、アンチセンス鎖内のある特定のヌクレオチド位置における共通のホスホジエステル骨格結合がホスホロチオエート（ＰＳ）結合（「ＰＳ結合」とも称される）で置き換えられた修飾ｓｉＲＮＡ分子の開発に少なくとも部分的に基づく。この置換では、非架橋リン酸塩酸素原子を硫黄原子で置換して、ヌクレオチド間のＰＳ結合を作製する。具体的には、ＰＳ修飾は、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖のシード領域に導入される。例えば、ＰＳ修飾は、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖内の５～８位のうちの１つ以上のヌクレオチド間に導入することができる。本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡは、実質的に低減されたオフターゲット効果を有し、また、定義された位置にＰＳ結合を有しない対応物核酸（同じヌクレオチド配列を有する）と比較して、ヌクレアーゼに対してより耐性があることが予想される。
【0028】
別段に明記されない限り、本明細書に開示される核酸鎖内のヌクレオチドの位置は、その核酸鎖の５’末端からの位置（すなわち、５’末端ヌクレオチドを１位とする）を指す。
【0029】
Ｉ．オフターゲット効果が低減された修飾ｓｉＲＮＡ分子
いくつかの態様では、本開示は、対応する修飾を有しない同じｓｉＲＮＡ分子と比較して、低減されたオフターゲット効果を有する修飾低分子干渉核酸分子（ｓｉＲＮＡ）に関する。
いくつかの態様では、本開示は、対応する修飾を有しない同じｓｉＲＮＡ分子と比較して、低減されたオフターゲット効果を有する修飾低分子干渉核酸分子（ｓｉＲＮＡ）に関する。
【0030】
（Ａ）ｓｉＲＮＡ分子：
本開示は、標的遺伝子転写産物に対するＲＮＡｉ経路を介して遺伝子サイレンシングを誘導することができ、また（非標的遺伝子転写産物に対する）低減されたオフターゲット効果を有する二本鎖ＲＮＡである、修飾ｓｉＲＮＡ分子に関する。
本開示は、標的遺伝子転写産物に対するＲＮＡｉ経路を介して遺伝子サイレンシングを誘導することができ、また（非標的遺伝子転写産物に対する）低減されたオフターゲット効果を有する二本鎖ＲＮＡである、修飾ｓｉＲＮＡ分子に関する。
【0031】
修飾ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、シード領域内に１つ以上のホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合（「ＰＳ基」又は「ＰＳ結合」とも称される）を含む（５～８位）。修飾ｓｉＲＮＡ分子は、それぞれのヌクレオチド位置にＰＳ結合を有しないｓｉＲＮＡ対応物と比較して、例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、又はそれ以上低減されたオフターゲット効果を有する。オフターゲット効果の低減は、通常の実践を介して、又は本明細書に開示される方法によって判定され得る。
【0032】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を含んでもよい。代替として、又は加えて、修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は、６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を含んでもよい。代替として、又は加えて、修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は、７位のヌクレオチドと８位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を含んでもよい。いくつかの例では、修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を含んでもよい。いくつかの例では、修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び７位のヌクレオチドと８位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を含んでもよい。いくつかの例では、修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は、６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間及び７位のヌクレオチドと８位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合を含んでもよい。
【0033】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は、５’末端領域に、例えば、１位のヌクレオチドと２位のヌクレオチドとの間及び／又は２位のヌクレオチドと３位のヌクレオチドとの間に１つ以上のＰＳヌクレオチド間結合を更に含んでもよい。代替として、又は加えて、本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は、３；末端領域に、例えば、３’末端における第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチドとの間及び／又は３’末端における第２のヌクレオチドと第３のヌクレオチドとの間に１つ以上のＰＳヌクレオチド間結合を更に含んでもよい。例えば、アンチセンス鎖が２１ヌクレオチドを含む場合、３；末端領域におけるＰＳヌクレオチド間結合は、１９位のヌクレオチドと２０位のヌクレオチドとの間及び／又は２０位のヌクレオチドと２１位のヌクレオチドとの間にあり得る。
【0034】
いくつかの例では、本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は、シード領域内、例えば、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間、並びに５’末端（例えば、１若しくは２）及び／又は３’末端（例えば、１若しくは２）に、ＰＳヌクレオチド間結合を含有し得る。１つの具体的な例では、アンチセンス鎖は、（ａ）５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間及び６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合、（ｂ）５’末端に２つのＰＳヌクレオチド間結合、並びに（ｃ）３’末端に２つのＰＳヌクレオチド間結合を含有する。
【0035】
いくつかの例では、本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は、シード領域内、例えば、５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間、６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間、及び７位のヌクレオチドと８位のヌクレオチドとの間、並びに５’末端（例えば、１若しくは２）及び／又は３’末端（例えば、１若しくは２）に、ＰＳヌクレオチド間結合を含有し得る。１つの特定の例では、アンチセンス鎖は、（ａ）５位のヌクレオチドと６位のヌクレオチドとの間６位のヌクレオチドと７位のヌクレオチドとの間、及び７位のヌクレオチドと８位のヌクレオチドとの間にＰＳヌクレオチド間結合、（ｂ）５’末端に２つのＰＳヌクレオチド間結合、並びに（ｃ）３’末端に２つのＰＳヌクレオチド間結合を含有する。
【0036】
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ分子のいずれにおいても、アンチセンス鎖は、１５～３０ヌクレオチド長、例えば、１８～２５又は１９～２３ｎｔ長を含有し得る。一例では、アンチセンス鎖は、２１ｎｔ長を含む。別の例では、アンチセンス鎖は、２３ｎｔ長を含む。センス鎖又はその一部分は、アンチセンス鎖又はその一部分に（完全に又は部分的に）相補的である。いくつかの事例では、センス鎖は、アンチセンス鎖と同じ長さを有する。他の事例では、センス鎖は、アンチセンス鎖よりも短い（例えば、１～５ｎｔ（１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、又は５ｎｔなど））。その場合、アンチセンス鎖は、５’末端及び／又は３’末端にオーバーハング（例えば、１～５ｎｔ）を有し得る。
【0037】
１つの具体的な例では、修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は、２１ｎｔ長であり、修飾ｓｉＲＮＡ中のセンス鎖は、１６ｎｔ長である。アンチセンス鎖内の５ｎｔのオーバーハングは、その３’末端に位置することができる。別の具体的な例では、修飾ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖の長さは２１ｎｔであり、修飾ｓｉＲＮＡ中のセンス鎖の長さは１９ｎｔである。アンチセンス鎖内の２ｎｔのオーバーハングは、その３’末端に位置することができる。
【0038】
表１は、シード領域、並びに５’末端及び／又は３’末端に例示的なＰＳヌクレオチド間結合を有する例示的なｓｉＲＮＡを列挙している。表１に列挙されている例示的なｓｉＲＮＡにおいて示されている位置にＰＳヌクレオチド間結合を有するｓｉＲＮＡは、本開示の範囲内である。
【0039】
（Ｂ）他の修飾
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるＰＳヌクレオチド間結合修飾に加えて、修飾ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖、センス鎖、又は両方は、糖修飾、核酸塩基修飾、骨格修飾、又はこれらの組み合わせなどの他の修飾を更に含み得る。このような修飾は、１つ以上の所望の特性、例えば、増強された細胞取り込み、標的核酸への改善された親和性、増加したインビボ安定性を付与し、インビボ安定性（例えば、ヌクレアーゼ分解への耐性）を増強し、かつ／又は免疫原性を低減し得る。
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるＰＳヌクレオチド間結合修飾に加えて、修飾ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖、センス鎖、又は両方は、糖修飾、核酸塩基修飾、骨格修飾、又はこれらの組み合わせなどの他の修飾を更に含み得る。このような修飾は、１つ以上の所望の特性、例えば、増強された細胞取り込み、標的核酸への改善された親和性、増加したインビボ安定性を付与し、インビボ安定性（例えば、ヌクレアーゼ分解への耐性）を増強し、かつ／又は免疫原性を低減し得る。
【0040】
一例では、（例えば、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖内の）本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡは、ＰＳヌクレオチド間結合とは異なる位置に修飾骨格を有し得、修飾骨格は、リン原子を保持するもの（例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、及び同第５，６２５，０５０号を参照されたい）、及びリン原子を有しないもの（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、及び同第５，７９２，６０８号を参照されたい）を含む。リン含有修飾骨格の例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル－ホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホトリエステル、セレノホスフェート、並びに３’－５’結合又は２’－５’結合を有するボラノホスフェートが挙げられるが、これらに限定されない。このような骨格はまた、逆極性を有するもの、すなわち、３’から３’、５’から５’、又は２’から２’結合を有するものを含む。リン原子を含まない修飾骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されている。このような骨格は、（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）モルホリノ結合を有するもの、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成成分部分を有する他の骨格を含む。いくつかの例では、本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡは、本明細書に開示されるＰＳヌクレオチド間結合を除いて、いかなる骨格修飾も含まない。
【0041】
別の例では、（例えば、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖内の）本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡは、１つ以上の置換糖部分を含む。このような置換糖部分は、以下の基のうちの１つを、置換糖部分の２’位において含むことができる。ＯＨ、Ｆ、Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル、Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル、Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル、及びＯ－アルキル－Ｏ－アルキル。これらの基において、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル又はＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであることができる。置換糖部分はまた、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基を、置換糖部分の２’位において含み得る。好ましい置換糖部分は、２’－メトキシエトキシ、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシを有するものを含む。Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４を参照されたい。
【0042】
代替として、又は加えて、（例えば、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖内の）本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡは、１つ以上の修飾天然核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）を含む。修飾核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に記載されているものを含む。これらの核酸塩基のうちのある核酸塩基は、干渉ＲＮＡ分子の標的部位への干渉ＲＮＡ分子の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらは、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、及びＮ－２、Ｎ－６、及びＯ－６置換プリン（例えば、２－アミノプロピル－アデニン、５－プロピニルウラシル、及び５－プロピニルシトシン）を含む。Ｓａｎｇｈｖｉ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８を参照されたい）。
【0043】
代替として、又は加えて、（例えば、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖内の）本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡは、１つ以上のロック核酸（ＬＮＡ）を含み得る。アクセス制限ＲＮＡとしばしば称されるＬＮＡは、修飾ＲＮＡヌクレオチドであり、修飾ＲＮＡヌクレオチド内で、リボース部分が、２’酸素と４’炭素とを接続する余分なブリッジで修飾されている。このブリッジは、Ａ型二本鎖においてしばしば見出される３’－エンド（ノース）コンフォメーションのリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオチドは、本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡのうちのいずれかにおいて使用され得る。いくつかの例では、干渉ＲＮＡ内のヌクレオチドの最大５０％（例えば、４０％、３０％、２０％、又は１０％）が、ＬＮＡである。
【0044】
いくつかの態様では、本明細書に記載される修飾ｓｉＲＮＡ分子のうちのいずれかは、リガンド（標的化部分）にコンジュゲートされてもよく、又は小胞中に封入されてもよく、これは、修飾ｓｉＲＮＡの所望の細胞／組織への送達を容易にすることができ、かつ／又は細胞取り込みを容易にすることができる。好適なリガンドは、炭水化物、ペプチド、抗体、ポリマー、低分子、コレステロール、及びアプタマーを含むが、これらに限定されない。例えば、１つ以上のＧａｌＮＡｃ部分（例えば、トリ－ＧａｌＮＡｃ部分）は、修飾ｓｉＲＮＡを肝臓細胞に送達するための標的化部分として使用されてもよい。
【0045】
（Ｃ）標的遺伝子
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制するための使用のためのものであり、標的遺伝子の転写物（ｍＲＮＡ）は、修飾ｓｉＲＮＡ内のアンチセンス鎖に相補的な領域を含む。したがって、アンチセンス鎖及びセンス鎖の配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に基づいて設計され得る。いくつかの事例では、アンチセンス鎖は、標的遺伝子のｍＲＮＡ内の標的領域に完全に相補的であり得る。他の事例では、相補性のレベルが、当業者の知識の範囲内である標的領域との塩基対合に十分である限り、アンチセンス鎖は、標的遺伝子のｍＲＮＡ内の標的領域に部分的に相補的であり得る（例えば、１つ以上のミスマッチ又はギャップを含有する）。
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制するための使用のためのものであり、標的遺伝子の転写物（ｍＲＮＡ）は、修飾ｓｉＲＮＡ内のアンチセンス鎖に相補的な領域を含む。したがって、アンチセンス鎖及びセンス鎖の配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に基づいて設計され得る。いくつかの事例では、アンチセンス鎖は、標的遺伝子のｍＲＮＡ内の標的領域に完全に相補的であり得る。他の事例では、相補性のレベルが、当業者の知識の範囲内である標的領域との塩基対合に十分である限り、アンチセンス鎖は、標的遺伝子のｍＲＮＡ内の標的領域に部分的に相補的であり得る（例えば、１つ以上のミスマッチ又はギャップを含有する）。
【0046】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡの標的遺伝子は、病原性遺伝子である。例えば、標的遺伝子は、病原体、例えば、ウイルス、細菌、又は真菌の遺伝子であってもよい。他の例では、標的遺伝子は、疾患又は障害、例えば、がん、免疫障害（例えば、自己免疫疾患）、代謝性障害又は疾患、心血管障害又は疾患、及び他の遺伝性障害又は疾患に関与している。
【0047】
いくつかの例では、修飾ｓｉＲＮＡは、がんに関与する標的遺伝子の発現をサイレンシングする。例示的ながん関連標的遺伝子としては、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦ、ＥＲＥＧ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、ＳＴＡＴ３、ＣＤＨ２、ＫＩＦＬ１、ＰＩＫ３ＣＡ、Ｓｒｃ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、及びＴＰ５３が挙げられるが、これらに限定されない。
【0048】
いくつかの例では、修飾ｓｉＲＮＡは、線維症に関与する標的ゲーン（ｇｅｅｎ）の発現をサイレンシングする。例示的な線維症関連標的遺伝子としては、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ１Ｂ、ＨＩＦ２、ＴＧＦ－β１、及びＣＴＧＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【0049】
いくつかの例では、修飾ｓｉＲＮＡは、代謝性疾患に関与する標的遺伝子の発現をサイレンシングする。例示的な代謝関連標的遺伝子としては、ＡＧＴ、ＡｐｏＣ－ＩＩＩ、及びアポＢが挙げられるが、これらに限定されない。
【0050】
いくつかの例では、修飾ｓｉＲＮＡは、免疫疾患（例えば、自己免疫疾患）に関与する標的遺伝子の発現をサイレンシングする。例示的な免疫疾患関連標的遺伝子としては、ＧＡＴＡ－３、ＣＣＲ３、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＣＣＬ２、及びＣＣＬ１０が挙げられるが、これらに限定されない。
【0051】
ＩＩ．ヒト低酸素誘導因子１サブユニットアルファ（ＨＩＦ１ａ）を標的とする干渉ＲＮＡ
低酸素誘導因子－１Ａ（ＨＩＦ－１Ａ）は、低酸素に対する細胞応答を調節する上で重要な役割を有する主要な転写因子である。Ｌｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １９９８，１２，１４９－１６２。正常酸素条件下では、ＨＩＦ－１ａサブユニットは、ユビキチンプロテアソーム系によって連続的に合成及び分解される。低酸素条件下では、ＨＩＦ－１Ａは様々ながんにおいて過剰発現し、腫瘍成長、血管新生、化学療法耐性、浸潤及び転移に関与する様々な遺伝子を調節する。Ｆａｖａｒｏ ｅｔ ａｌＧｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．２０１１，３：１－１２及びＧｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１８，１５，２１－３２。ＨＩＦ－１Ａは、肝細胞がんにおいて上方調節され、肝被膜浸潤性（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｐｓｕｌａｒ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ）及び門脈転移と関連付けられた。Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０１８，２３，２６、及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１４，４４（２）：１５９－６７。また、膀胱尿路上皮がん、乳房侵襲性、結腸腺がん、肝細胞がん、肺腺がん、膵腺がん、直腸腺がん、胃腺がん、甲状腺がんを含む様々な固形腫瘍でも過剰発現される。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｏｎｃｏｌ．２０２０，４３：８７７－８８。
低酸素誘導因子－１Ａ（ＨＩＦ－１Ａ）は、低酸素に対する細胞応答を調節する上で重要な役割を有する主要な転写因子である。Ｌｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １９９８，１２，１４９－１６２。正常酸素条件下では、ＨＩＦ－１ａサブユニットは、ユビキチンプロテアソーム系によって連続的に合成及び分解される。低酸素条件下では、ＨＩＦ－１Ａは様々ながんにおいて過剰発現し、腫瘍成長、血管新生、化学療法耐性、浸潤及び転移に関与する様々な遺伝子を調節する。Ｆａｖａｒｏ ｅｔ ａｌＧｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．２０１１，３：１－１２及びＧｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１８，１５，２１－３２。ＨＩＦ－１Ａは、肝細胞がんにおいて上方調節され、肝被膜浸潤性（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｐｓｕｌａｒ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ）及び門脈転移と関連付けられた。Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０１８，２３，２６、及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１４，４４（２）：１５９－６７。また、膀胱尿路上皮がん、乳房侵襲性、結腸腺がん、肝細胞がん、肺腺がん、膵腺がん、直腸腺がん、胃腺がん、甲状腺がんを含む様々な固形腫瘍でも過剰発現される。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｏｎｃｏｌ．２０２０，４３：８７７－８８。
【0052】
多くの報告が、ＨＩＦ－１Ａが代謝性疾患を活性化させるか、又は阻害することを示唆している。Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１８，１５，２１－３２、及びＨａｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００９，１６：４４６７－８３。肥満は、脂肪組織及び小腸に慢性低酸素状態を引き起こし、ＨＩＦ－１Ａシグナル伝達を促進し、インスリン抵抗性及び肝線維症を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患を含む有害な代謝作用をもたらす。Ｎｏｒｏｕｚｉｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｉｄ Ｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｅｖ．２０１７，２０１７：５３５０２６７。Ｅ３ユビキチンリガーゼであるフォンヒッペル・リンダウタンパク質の過剰発現、又はＨＩＦ－１Ａのサイレンシングによる低酸素シグナル伝達の阻害は、ＣＣｌ４及び胆管ライゲーションの両方によって誘導される肝線維症を有意に低減することができる。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７，７：４１０３８。
【0053】
ヒトＨＩＦ１ａのｍＲＮＡを標的とする干渉ＲＮＡ分子（抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ）が、本明細書に記載される。かかる抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉プロセスを介してＨＩＦ１ａ発現を抑制することができ、それによって、ＨＩＦ１ａに関連する疾患、例えば、本明細書で論じられる疾患の治療に利益をもたらす。本明細書で使用される場合、「干渉ＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子の阻害において使用され得るいずれかのＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ干渉に直接関与する成熟ＲＮＡ分子（例えば、本明細書に開示される２１～２３ｎｔのｄｓＲＮＡ）又は成熟ＲＮＡ分子を産生する前駆体分子の両方を含む、ＲＮＡ分子を指す。
【0054】
抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡは、ＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡ内の標的部位に（完全に又は部分的に）相補的である断片を含む。断片は、標的部位に１００％相補的であり得る。代替として、断片は、部分的に相補的であり得、例えば、１つ以上のミスマッチ又はギャップを含むが、二本鎖を標的部位において形成してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分に相補的であり得る。
【0055】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される干渉ＲＮＡは、ヌクレオチド配列：
（１）ＡＵＧＡＡＧＵＧＵＡＣＣＣＵＡＡＣＵＡ（配列番号１１）、
（２）ＡＡＧＵＣＵＧＣＡＡＣＡＵＧＧＡＡＧＧＵＡ（配列番号１２）、
（３）ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡＵ（配列番号１）、
（４）ＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡＵＧ（配列番号１３）、
（５）ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡＵ（配列番号２）、
（６）ＡＡＧＵＵＣＡＣＣＵＧＡＧＣＣＵＡＡＵＡＧ（配列番号１４）、
（７）ＡＣＵＵＵＣＵＵＧＧＡＡＡＣＧＵＧＵＡＡ（配列番号１５）、
（８）ＣＣＧＧＵＵＧＡＡＵＣＵＵＣＡＧＡＵＡ（配列番号３）、
（９）ＧＣＧＣＡＡＧＵＣＣＵＣＡＡＡＧＣＡＣ（配列番号４）、
（１０）ＧＵＣＧＧＡＣＡＧＣＣＵＣＡＣＣＡＡＡ（配列番号１６）、及び
（１１）ＡＧＣＧＣＡＡＧＵＣＣＵＣＡＡＡＧＣＡＣ（配列番号１７）のうちの１つを有するＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡ部位を標的とする。
（１）ＡＵＧＡＡＧＵＧＵＡＣＣＣＵＡＡＣＵＡ（配列番号１１）、
（２）ＡＡＧＵＣＵＧＣＡＡＣＡＵＧＧＡＡＧＧＵＡ（配列番号１２）、
（３）ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡＵ（配列番号１）、
（４）ＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡＵＧ（配列番号１３）、
（５）ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡＵ（配列番号２）、
（６）ＡＡＧＵＵＣＡＣＣＵＧＡＧＣＣＵＡＡＵＡＧ（配列番号１４）、
（７）ＡＣＵＵＵＣＵＵＧＧＡＡＡＣＧＵＧＵＡＡ（配列番号１５）、
（８）ＣＣＧＧＵＵＧＡＡＵＣＵＵＣＡＧＡＵＡ（配列番号３）、
（９）ＧＣＧＣＡＡＧＵＣＣＵＣＡＡＡＧＣＡＣ（配列番号４）、
（１０）ＧＵＣＧＧＡＣＡＧＣＣＵＣＡＣＣＡＡＡ（配列番号１６）、及び
（１１）ＡＧＣＧＣＡＡＧＵＣＣＵＣＡＡＡＧＣＡＣ（配列番号１７）のうちの１つを有するＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡ部位を標的とする。
【0056】
いくつかの例では、本明細書に開示される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡは、ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡＵ（配列番号１）のヌクレオチド配列を有するＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡ部位を標的とする。いくつかの例では、本明細書に開示される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡは、ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡＵ（配列番号２）のヌクレオチド配列を有するＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡ部位を標的とする。他の例では、本明細書に開示される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡは、ＣＣＧＧＵＵＧＡＡＵＣＵＵＣＡＧＡＵＡ（配列番号３）のヌクレオチド配列を有するＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡ部位を標的とする。例示的な抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡを、以下の表３及び４に提供する。
【0057】
いくつかの実施形態では、干渉ＲＮＡは、本明細書に開示し、ｓｉＲＮＡ、すなわち、２つの別個の相補的ＲＮＡ鎖を含有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり得る。このようなｓｉＲＮＡは、標的ＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡ部位に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖、及びセンス鎖（及び標的部位）に相補的なアンチセンス鎖を含み得る。センス鎖及び／又はアンチセンス鎖が、完全に同じである又は標的部位に相補的である必要はないことが、当業者には既知である。ｓｉＲＮＡが、ｍＲＮＡ部位を、塩基対形成を介して依然として標的として、ＲＮＡ干渉プロセスを媒介することができる限り、１つ以上のミスマッチが許容される。いくつかの事例では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖（全センス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖、又はセンス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖の一部分）は、完全に同じである又は標的部位に相補的である。ＨＩＦ１ａを標的とする例示的なｓｉＲＮＡは、以下の表３及び４に見出すことができる。
【0058】
他の例では、干渉ＲＮＡは、ここに開示する 低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であることができ、ｓｈＲＮＡは、タイトヘアピン構造を形成するＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの両方は、本明細書に開示されるＨＩＦ１ａの標的ｍＲＮＡ部位の配列に基づいて設計され得る。
【0059】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ分子、例えば、以下の表３及び表４に列挙されるｓｉＲＮＡ分子であることができる。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、表４に列挙されるｓｉＲＮＡ、例えば、ＡＩ３－ＵＭ４及びＡＴ９－ＵＭ４のうちの１つである。
【0060】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＡＧＧＣＣＡＣＡＵＵＣＡＣＧＵＡＵＡＡ－３’（配列番号７）を含むセンス鎖、及び５’－ＵＵＡＵＡＣＧＵＧＡＡＵＧＵＧＧＣＣＵＧＵ－３’（配列番号８）を含むアンチセンス鎖を含み得る。いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＵＧＡＧＧＡＡＧＵＡＣＣＡＵＵＡＵＡＡ－３’（配列番号９）を含むセンス鎖、及び５’－ＵＵＡＵＡＡＵＧＧＵＡＣＵＵＣＣＵＣＡＡＵ－３’（配列番号１０）を含むアンチセンス鎖を含み得る。
【0061】
いくつかの事例では、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、ＡＩ３－ＵＭ４又はＡＴ９－ＵＭ４と同じセンス鎖及び／又は同じアンチセンス鎖を含み得る。他の事例では、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、ＡＩ３－ＵＭ４のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるセンス鎖を含み得、かつ／又はＡＩ３－ＵＭ４のアンチセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるアンチセンス鎖を含み得る。他の事例では、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、ＡＴ９－ＵＭ４のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるセンス鎖を含み得、かつ／又はＡＴ９－ＵＭ４のアンチセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるアンチセンス鎖を含み得る。
【0062】
２つの核酸の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３のように修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを使用して判定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長－１２で実行され得る。ギャップが２つの配列間に存在する場合、ギャップドＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されているように使用され得る。ＢＬＡＳＴ及びギャップドＢＬＡＳＴプログラムを使用するときに、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。
【0063】
他の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＩＦ１ａ ｓｉＲＮＡは、参照ｓｉＲＮＡ、例えば、表３又は表４に列挙されるもの（例えば、ＡＩ３－ＵＭ４又はＡＴ９－ＵＭ４）のセンス鎖及びアンチセンス鎖（合わせて又は別個に）と比較して、最大６つ（例えば、最大６、５、４、３、又は２つ）までのヌクレオチド変異を含有し得る。
【0064】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ（例えば、ＡＩ３－ＵＭ４又はＡＴ９－ＵＭ４などのｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかは、非自然発生の核酸塩基、糖、又は共有結合性ヌクレオシド間結合（骨格）を含有し得る。このような修飾オリゴヌクレオチドは、所望の特性、例えば、増強された細胞取り込み、標的核酸への改善された親和性、増加したインビボ安定性を付与し、インビボ安定性（例えば、ヌクレアーゼ分解への耐性）を増強し、かつ／又は免疫原性を低減する。
【0065】
一例では、本明細書に記載される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ（例えば、ＡＩ３－ＵＭ４又はＡＴ９－ＵＭ４などのｓｉＲＮＡ）は、修飾骨格を有し、修飾骨格は、リン原子を保持するもの（例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、及び同第５，６２５，０５０号を参照されたい）、及びリン原子を有しないもの（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、及び同第５，７９２，６０８号を参照されたい）を含む。リン含有修飾骨格の例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル－ホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホトリエステル、セレノホスフェート、並びに３’－５’結合又は２’－５’結合を有するボラノホスフェートが挙げられるが、これらに限定されない。このような骨格はまた、逆極性を有するもの、すなわち、３’から３’、５’から５’、又は２’から２’結合を有するものを含む。リン原子を含まない修飾骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されている。このような骨格は、（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）モルホリノ結合を有するもの、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成成分部分を有する他の骨格を含む。
【0066】
いくつかの例では、本明細書に記載される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ（例えば、ＡＩ３－ＵＭ４又はＡＴ９－ＵＭ４などのｓｉＲＮＡ）は、本明細書に開示される位置（例えば、シード領域内の５～８位、例えば、５～６及び／又は６～７間の位置）にＰＳヌクレオチド間結合を含有し得る。代替として、又は加えて、本明細書に記載される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ（例えば、ＡＩ３－ＵＭ４又はＡＴ９－ＵＭ４などのｓｉＲＮＡ）はまた、本明細書に開示されるものを含む、修飾糖、修飾塩基、修飾ヌクレオチドなどの１つ以上の追加の修飾を含有し得る。抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡはまた、標的化部分、例えば、本明細書に開示されるものにコンジュゲートされてもよい。例えば、抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡは、リガンド（標的化部分）にコンジュゲートされてもよく、又は小胞中に封入されてもよく、これは、所望の細胞／組織へのｓｉＲＮＡの送達を容易にすることができ、かつ／又は細胞取り込みを容易にすることができる。好適なリガンドとしては、炭水化物、ペプチド、抗体、ポリマー、低分子、及びコレステロールが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、１つ以上のＧａｌＮＡｃ部分（例えば、トリ－ＧａｌＮＡｃ部分）は、抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡを肝臓細胞に送達するための標的化部分として使用してもよい。
【0067】
明示的に指摘されない限り（例えば、記号「＊」によって示されるＰＳ結合）、本明細書において提供される非修飾ヌクレオチド配列は、任意の好適な修飾を有する非修飾ＲＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方を包含することが意図されている。
【0068】
本明細書に記載される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ分子（及び修飾ｓｉＲＮＡ分子）のうちのいずれかは、従来の方法、例えば、化学合成又はインビトロ転写によって調製され得る。本明細書に記載される、意図された生物活性は、例えば、以下の実施例に記載されるものによって検証され得る。いくつかの事例では、本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ分子又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡは、標的遺伝子の発現を少なくとも５０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上抑制することができる。
【0069】
抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかを発現するためのベクターもまた、本開示の範囲内にある。発現ベクターは、抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメント（プロモーター／エンハンサー）を含み得る。典型的には、これらの配列は、抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方をコードすることができる。
【0070】
ＩＩＩ．医薬組成物
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ分子又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかは、好適な医薬組成物に製剤化され得る。本明細書に記載される医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で更に含むことができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ。このような担体、賦形剤、又は安定剤は、本明細書に記載される組成物中の活性成分の１つ以上の特性、例えば、生物活性、安定性、生物学的利用能、並びに他の薬物動態及び／又は生物活性を増強し得る。
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ分子又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかは、好適な医薬組成物に製剤化され得る。本明細書に記載される医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で更に含むことができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ。このような担体、賦形剤、又は安定剤は、本明細書に記載される組成物中の活性成分の１つ以上の特性、例えば、生物活性、安定性、生物学的利用能、並びに他の薬物動態及び／又は生物活性を増強し得る。
【0071】
許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される投与量及び濃度で、レシピエントに無毒であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、ベンゾエート、ソルベート、及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、セリン、アラニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストランを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）（ポリソルベート）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（非イオン性界面活性剤）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。
【0072】
いくつかの例では、本明細書に記載される医薬組成物は、トリクロロモノ－フルオロメタン、ジクロロ－ジフルオロメタン、ジクロロ－テトラフルオロエタン、クロロペンタ－フルオロエタン、モノクロロ－ジフルオロエタン、ジフルオロエタン、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロプロパン、オクタフルオロ－シクロブタン、精製水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、及びＰＥＧ１０００）、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、レシチン、オレイン酸、ポリソルベート８０、ステアリン酸マグネシウム及びラウリル硫酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、チモール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、水酸化ナトリウム、トロメタミン、アンモニア、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、クエン酸、ＣａＣｌ２、ＣａＣＯ３、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ二ナトリウム、サッカリン、メントール、アスコルビン酸、グリシン、リジン、ゼラチン、ポビドンＫ２５、二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化亜鉛、ラクトース、ラクトース一水和物、ラクトース無水物、マンニトール、並びにデキストロースを含むことができるが、これらに限定されない賦形剤を含む。
【0073】
他の例では、本明細書に記載される医薬組成物は、持続的放出形式で製剤化され得る。持続的放出調製物の好適な例としては、成形品の形態である、固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス、例えば、フィルム又はマイクロカプセルが挙げられる。持続的放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸と７エチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成された注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、イソ酪酸酢酸スクロース、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【0074】
インビボ投与のために使用される医薬組成物は、滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成される。治療組成物は、概して、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ若しくはバイアル、又は手動でアクセスされる密封容器内に置かれる。
【0075】
本明細書に記載される医薬組成物は、吸入又は吹送による投与、髄腔内、肺内、又は脳内経路、経口、非経口、又は直腸投与のための単位剤形、例えば、固体、溶液若しくは懸濁液、又は坐剤であり得る。
【0076】
固体組成物を調製するために、主活性成分は、医薬担体、例えば、従来の錠剤化成分、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、又はガム、及び他の医薬希釈剤、例えば、水と混合されて、本開示の化合物又は無毒の薬学的に許容されるその塩の均質の混合物を含有する固体予備製剤組成物を形成することができる。これらの予備製剤組成物を均質と言及するときに、これは、活性成分が、組成物全体にわたって均等に分散されており、このため、組成物が、等しく有効な単位剤形、例えば、粉末収集物、錠剤、丸剤、及びカプセル剤に容易に細分され得ることを意味する。次いで、この固体予備製剤組成物は、好適な量の活性成分を組成物中に含有する上記のタイプの単位剤形に細分される。
【0077】
好適な表面活性剤は、特に、非イオン性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、４０、６０、８０、又は８５）、及び他のソルビタン（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）２０、４０、６０、８０、又は８５）を含む。表面活性剤を有する組成物は、好都合には、０．０５～５％の表面活性剤を含み、０．１～２．５％であり得る。他の成分、例えば、マンニトール又は他の薬学的に許容されるビヒクルが、必要に応じて添加されてもよいことが理解されよう。
【0078】
好適なエマルジョンは、市販の脂肪エマルジョン、例えば、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（商標）、ＩＮＦＯＮＵＴＲＯＬ（商標）、ＬＩＰＯＦＵＮＤＩＮ（商標）、及びＬＩＰＩＰＨＹＳＡＮ（商標）を使用して調製され得る。活性成分は、予め混合されたエマルジョン組成物中に溶解させてもよく、又は代替として、活性成分は、油（例えば、ダイズ油、サフラワー油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、又はアーモンド油）中に溶解させてもよく、リン脂質（例えば、卵リン脂質、ダイズリン脂質、又はダイズレシチン）及び水と混合されると形成されるエマルジョン中に溶解させてもよい。他の成分、例えば、グリセロール又はグルコースが、エマルジョンの浸透圧を調節するために添加されてもよいことが理解されよう。好適なエマルジョンは、典型的には、最大２０％の油、例えば、５～２０％の油を含有する。
【0079】
吸入又は吹送のための医薬組成物は、薬学的に許容される水性若しくは有機溶媒又はこれらの混合物中の溶液及び懸濁液、並びに粉末を含む。液体又は固体組成物は、上記の好適な薬学的に許容される賦形剤を含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、局所又は全身効果のための経口又は鼻呼吸器経路によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、１０ｎｍ～１００ｍｍのサイズの粒子から構成されている。
【0080】
好ましくは滅菌である薬学的に許容される溶媒中の組成物は、ガスの使用によって噴霧され得る。噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接呼吸されてもよく、又は噴霧デバイスは、フェイスマスク、テント、気管内チューブ、及び／若しくは間欠的陽圧呼吸器（換気装置）に取り付けられてもよい。溶液、懸濁液、又は粉末組成物は、製剤を適切な様式で送達するデバイスから、好ましくは、経口又は経鼻投与され得る。
【0081】
いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかは、リポソームに封入されるか、又は付着させてもよく、これは、当該技術分野において既知の方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）、並びに米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されている方法によって調製され得る。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、逆相蒸発法によって、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物で生成され得る。リポソームは、一定の孔径のフィルタを介して押し出されて、所望の直径を有するリポソームが得られる。
【0082】
いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかはまた、例えば、コアセルベーション技法によって若しくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入されてもよく、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に封入されてもよく、又はマクロエマルジョン中に封入されてもよい。このような技法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）を参照されたい。
【0083】
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ分子を含む医薬組成物のうちのいずれかは、エンドソーム及び／又はリソソームから細胞質への組成物の輸送を増強する構成成分を更に含んでもよい。例としては、ｐＨ感受性薬剤（例えば、ｐＨ感受性ペプチド）が挙げられる。
【0084】
いくつかの実施形態では、本明細書の医薬組成物のうちのいずれかは、組成物の意図された治療的使用に基づいて、第２の治療剤を更に含み得る。
【0085】
ＩＶ．標的遺伝子発現の抑制
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ分子又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ分子のうちのいずれかは、インビボ又はインビトロのいずれかで、標的遺伝子（例えば、ＨＩＦ１ａ）の発現を抑制するために使用され得る。
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ分子又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ分子のうちのいずれかは、インビボ又はインビトロのいずれかで、標的遺伝子（例えば、ＨＩＦ１ａ）の発現を抑制するために使用され得る。
【0086】
本明細書に開示される方法を実施するために、有効量の、修飾ｓｉＲＮＡ分子を含む本明細書に記載される医薬組成物は、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に、好適な経路、例えば、静脈内投与を介して、例えば、ボーラスとして、又は筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、気管内、腫瘍内、経口、吸入、若しくは局所経路によるある期間にわたる連続注入によって投与され得る。ジェットネブライザ及び超音波ネブライザを含む、液体製剤のための市販のネブライザは、投与に有用である。液体製剤は、直接噴霧され得、凍結乾燥粉末は、再構成後に噴霧され得る。
【0087】
本明細書で使用される場合、「有効量」とは、単独又は１つ以上の他の活性剤との組み合わせのいずれかで治療効果を対象に付与するために必要とされる各々の活性剤の量を指す。有効量は、当業者によって認識されるように、治療されている特定の状態、状態の重症度、年齢、健康状態、サイズ、性別、及び体重を含む個々の患者のパラメータ、治療の持続期間、（存在する場合）同時療法の性質、特定の投与経路、並びに医療従事者の知識及び専門知識内の同様の因子に依存して変動する。これらの因子は、当業者に周知であり、通例の実験法のみで扱われ得る。概して、最大用量の個々の構成成分又はこれらの組み合わせ、すなわち、健全な医学的判断による最高安全用量が使用されることが好ましい。
【0088】
半減期などの経験的考慮事項は、概して、投与量の判定に寄与する。投与頻度は、療法の経過にわたって判定及び調節され得、概して、治療及び／又は抑制及び／又は寛解及び／又は標的疾患／障害の遅延に基づくが、必ずしもそうではない。代替として、修飾ｓｉＲＮＡ又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡの持続的連続放出製剤が、適切であり得る。持続的放出を達成するための様々な製剤及びデバイスは、当該技術分野において既知である。
【0089】
概して、修飾ｓｉＲＮＡ分子のうちのいずれか、又は本明細書に記載される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかの投与について、初期候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇであることができる。本開示の目的で、典型的な１日投与量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ～３μｇ／ｋｇ～３０μｇ／ｋｇ～３００μｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上のうちのいずれかの範囲であり得る。数日以上にわたる反復投与について、状態に依存して、治療は、症状の所望の抑制が発生するまで、あるいは十分な治療レベルが達成されて標的疾患若しくは障害又はその症状を緩和するまで持続される。例示的な投与計画は、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量、続いて、約１ｍｇ／ｋｇの週１回の維持用量の抗ｓｉＲＮＡ、又は続いて、隔週の約１ｍｇ／ｋｇの維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が、従事者が達成することを望む薬物動態学的減衰のパターンに依存して有用であり得る。例えば、週１～４回の投与が企図される。いくつかの実施形態では、約３μｇ／ｍｇ～約２ｍｇ／ｋｇ（例えば、約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、及び約２ｍｇ／ｋｇ）の範囲の投与が使用され得る。いくつかの実施形態では、投与頻度は、毎週１回、２週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、若しくは１０週間毎、又は毎月１回、２ヶ月毎、若しくは３ヶ月毎以上である。この療法の進行は、従来の技法及びアッセイによって容易に監視される。投与計画は、経時的に変動し得る。
【0090】
いくつかの実施形態では、標準体重の成人患者について、約０．３～５．００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が投与され得る。特定の投与計画、すなわち、用量、タイミング、及び反復は、特定の個体及びこの個体の病歴、並びに個々の薬剤の特性（例えば、薬剤の半減期、及び当該技術分野において周知の他の考慮事項）に依存する。
【0091】
本開示の目的で、本明細書に記載される修飾ｓｉＲＮＡ又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ分子の適切な投与量は、疾患／障害のタイプ及び重症度、修飾ｓｉＲＮＡ又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡが防止目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の療法、患者の臨床歴及び拮抗剤に対する患者の応答、並びに主治医の裁量に依存する。臨床医は、修飾ｓｉＲＮＡ分子又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡを、所望の結果を達成する投与量に達するまで投与してもよい。いくつかの実施形態では、所望の結果は、腫瘍負荷の減少、がん細胞の減少、又は免疫活性の増加である。
【0092】
投与量が所望の結果をもたらしたかを判定する方法は、当業者には明らかである。１つ以上の修飾ｓｉＲＮＡ分子又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡの投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療であるか予防であるか、及び熟練した従事者に既知の他の因子に依存して、連続的又は間欠的であり得る。修飾ｓｉＲＮＡ分子又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡの投与は、事前選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、又は一連の間隔をおいた用量、例えば、標的疾患又は障害の発症前、中、又は後のいずれかでにあってもよい。
【0093】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、標的疾患若しくは障害、疾患／障害の症状、又は疾患／障害の素因を有する対象に、障害、疾患の症状、又は疾患若しくは障害の素因を治癒させる、治す、緩和する、軽減する、変化させる、療治する、寛解させる、改善する、又はこれらに影響する目的で、１つ以上の活性剤を含む組成物を適用又は投与することを指す。
【0094】
標的疾患／障害を緩和することは、疾患の発症若しくは進行を遅延させること、又は疾患重症度を低減することを含む。疾患を緩和することは、必ずしも治癒結果を必要とするわけではない。本明細書で使用される場合、標的疾患又は障害の発症を「遅延させる」とは、疾患の進行を延期する、妨げる、遅くする、遅らせる、安定させる、かつ／又は延ばすことを意味する。この遅延は、疾患歴及び／又は治療されている個人に依存して、様々な時間長さの遅延であることができる。疾患の発症を「遅延させる」若しくは緩和する、又は疾患の発病を遅延させる方法は、方法を使用しない場合と比較されたときに、疾患の１つ以上の症状を発症する確率を所与の時間枠内で低減し、かつ／又は症状の程度を所与の時間枠内で低減する方法である。このような比較は、典型的には、統計的に有意な結果を得るのに十分な数の対象を使用する臨床研究に基づく。
【0095】
疾患の「発症」又は「進行」とは、疾患の初期徴候及び／又はその後の進行を意味する。疾患の発症は、当技術分野において周知の標準的な臨床技法を使用して、検出可能であることができ、評価され得る。しかしながら、発症とは、検出不可能であり得る進行も指す。本開示の目的で、発症又は進行とは、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生、再発、及び発病を含む。本明細書で使用される場合、標的疾患又は障害の「発病」又は「発生」は、初期発病及び／又は再発を含む。
【0096】
医学分野の当業者に既知の従来の方法が、治療される疾患のタイプ又は疾患の部位に依存して、対象に、医薬組成物を投与するために使用され得る。この組成物はまた、他の従来の経路を介して投与され得、例えば、経口、非経口投与されてもよく、吸入スプレーによって投与されてもよく、局所、直腸、経鼻、頬側、膣内投与されてもよく、又は埋め込み型リザーバを介して投与されてもよい。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、腫瘍内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内、及び頭蓋内注射又は注入技法を含む。加えて、組成物は、対象に、注射可能デポ投与経路を介して、例えば、１、３、又は６ヶ月デポ注射可能又は生分解性材料及び方法を使用して投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、鼻経路を介して、例えば、鼻腔内スプレー、鼻スプレー、又は点鼻を介して投与され得る。
【0097】
注射可能組成物は、様々な担体、例えば、植物油、ジメチルアクタミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、及びポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）を含有し得る。静脈内注射の場合、修飾ｓｉＲＮＡは、点滴法によって投与することができ、それによって、干渉ＲＮＡ及び生理学的に許容される賦形剤を含有する医薬製剤が注入される。生理学的に許容される賦形剤は、例えば、５％のデキストロース、０．９％の生理食塩水、リンガー溶液、又は他の好適な賦形剤を含み得る。筋肉内調製物、例えば、本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡの好適な可溶性塩形態の滅菌製剤は、医薬賦形剤、例えば、注射用水、０．９％の生理食塩水、又は５％のグルコース溶液中に溶解させて投与され得る。
【0098】
一実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、部位特異的又は標的局所送達技法によって投与することができる。部位特異的又は標的局所送達技法の例としては、治療用ＲＮＡ分子の様々な埋め込み型デポソース、又は局所送達カテーテル、例えば、注入カテーテル、留置カテーテル、若しくは針カテーテル、合成グラフト、外膜ラップ、シャント及びステント、若しくは他の埋め込み型デバイス、部位特異的担体、直接注射、又は直接適用が挙げられる。例えば、国際公開第００／５３２１１号及び米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
【0099】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、又はサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療組成物の標的送達もまた、使用され得る。受容体媒介性ＤＮＡ送達技法は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２、Ｃｈｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，ｅｄ．）（１９９４）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２、Ｚｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：３６５５、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載されている。
【0100】
いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子のうちのいずれか、抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれか、又はそのようなものを含む医薬組成物は、肺送達システムによって投与され得、すなわち、活性医薬成分は、肺内に投与される。肺送達システムは、吸入器システムであることができる。いくつかの実施形態では、吸入器システムは、加圧定量噴霧式吸入器、乾燥粉末吸入器、又はネブライザである。いくつかの実施形態では、吸入器システムは、スペーサー付きである。
【0101】
いくつかの実施形態では、加圧定量噴霧式吸入器は、噴射剤、共溶媒、及び／又は界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、噴射剤は、フッ素化炭化水素、例えば、トリクロロモノ－フルオロメタン、ジクロロ－ジフルオロメタン、ジクロロ－テトラフルオロエタン、クロロペンタ－フルオロエタン、モノクロロ－ジフルオロエタン、ジフルオロエタン、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロプロパン、オクタフルオロ－シクロブタンを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、共溶媒は、精製水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、及びＰＥＧ１０００を含む群から選択される。いくつかの実施形態では、界面活性剤又は潤滑剤は、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、レシチン、オレイン酸、ポリソルベート８０、ステアリン酸マグネシウム、及びラウリル硫酸ナトリウムを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、保存剤又は酸化防止剤は、メチルパラベン、プロピパラベン、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、チモール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、ＥＤＴＡを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ｐＨ調節又は浸透圧調節は、酸化ナトリウム、トロメタミン、アンモニア、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、クエン酸、ＣａＣｌ２、ＣａＣＯ３を含む群から選択される。
【0102】
いくつかの実施形態では、乾燥粉末吸入器は、分散剤を含む。いくつかの実施形態では、分散剤又は担体粒子は、ラクトース、ラクトース一水和物、ラクトース無水物、マンニトール、デキストロースを含む群から選択され、これらの粒子サイズは、約１～１００μｍである。
【0103】
いくつかの実施形態では、ネブライザは、共溶媒、界面活性剤、潤滑剤、保存剤、及び／又は酸化防止剤を含み得る。いくつかの実施形態では、共溶媒は、精製水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、及び／又はＰＥＧ１０００）を含む群から選択される。いくつかの例では、界面活性剤又は潤滑剤は、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、レシチン、オレイン酸、ステアリン酸マグネシウム、及びラウリル硫酸ナトリウムを含む群から選択される。いくつかの例では、保存剤又は酸化防止剤は、メチルパラベン、プロピパラベン、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、チモール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、ＥＤＴＡを含む群から選択される。いくつかの例では、ネブライザは、酸化ナトリウム、トロメタミン、アンモニア、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、クエン酸、ＣａＣｌ２、ＣａＣＯ３を含む群から選択されるｐＨ調節又は浸透圧調節を更に含む。
【0104】
いくつかの実施形態では、抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡを産生することができるＤＮＡ分子、又はそのようなものを含む医薬組成物は、ＨＩＦ１ａ発現をサイレンシングするために使用されてもよい。そのようなＤＮＡ分子（例えば、ベクター）を含む医薬組成物は、遺伝子療法プロトコルにおける局所投与のために、治療を必要としている対象に、約１００ｎｇ～約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与され得る。いくつかの実施形態では、約５００ｎｇ～約５０ｍｇ、約１μｇ～約２ｍｇ、約５μｇ～約５００μｇ、及び約２０μｇ～約１００μｇ以上のＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子療法プロトコル中に使用され得る。
【0105】
本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって判定された場合の、特定の値についての許容誤差範囲内を意味し、これは、どのように値が測定又は判定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野における実施に従って、許容標準偏差以内を意味することができる。代替として、「約」とは、所与の値の最大±２０％、好ましくは、最大±１０％、より好ましくは、最大±５％、より好ましくは、更には、最大±１％までの範囲を意味することができる。代替として、特に、生物学的系又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは、２倍以内を意味することができる。特定の値が本明細書及び特許請求の範囲に記載される場合、別途記載されない限り、「約」の用語は、暗示的であり、この文脈において、特定の値についての許容誤差範囲内を意味する。
【0106】
修飾ｓｉＲＮＡ分子又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかによって治療される対象は、標的遺伝子に関連する疾患を有するか、又は有すると疑われ得、その抑制は、修飾ｓｉＲＮＡ分子（上記に開示された「標的遺伝子」を参照されたい）又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ（ＨＩＦ１ａ）によって達成され得る。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、治療のために評価されているかつ／又は治療されている哺乳動物を指す。対象は、ヒトであり得るが、他の哺乳動物、特に、ヒト疾患についての実験モデルとして有用な哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルなども含む。治療を必要とするヒト対象は、腫瘍などの標的疾患／障害を有する、これらのリスクがある、又はこれらを有すると疑われたヒト患者であり得る。
【0107】
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ分子のうちのいずれかは、標的遺伝子に関連する疾患又は障害を治療するために使用され得る。例示的な疾患としては、がん、線維症、代謝性疾患、心血管疾患、免疫疾患、又は遺伝性障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【0108】
本明細書に開示される抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかは、ＨＩＦ１ａに関連する疾患又は障害を治療するために使用され得る。例としては、固形腫瘍、がん、虚血性心疾患、うっ血性心不全、急性肺損傷、肺高血圧症、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、急性肝不全、肝線維症及び肝硬変、急性腎損傷、慢性腎疾患、肥満、並びに糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
【0109】
本明細書に開示される修飾ｓｉＲＮＡ又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかは、標的疾患を治療するための１つ以上の追加の治療剤との併用療法において使用され得る。本明細書で使用される場合、「併用療法」という用語は、これらの薬剤（例えば、修飾ｓｉＲＮＡ分子、抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ、及び追加の治療剤）が逐次的な様式で投与されること、すなわち、それぞれの治療剤が異なる時間に投与されること、及びこれらの治療剤、又は薬剤のうちの少なくとも２つが実質的に同時の様式で投与されることを包含する。それぞれの薬剤が逐次的に又は実質的に同時に投与されることは、任意の適切な経路によって影響され得、適切な経路は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、腫瘍内経路、皮下経路、粘膜組織を介する直接吸収、及び肺送達経路を含むが、これらに限定されない。薬剤は、同じ経路によって又は異なる経路によって投与され得る。例えば、第１の薬剤は、肺送達経路によって投与され得、第２の薬剤は、静脈内投与され得る。
【0110】
本明細書で使用される場合、「逐次的な」という用語は、別途指定されない限り、規則的な順序又は順番によって特徴付けられ、例えば、投与計画が組成物及び抗ウイルス剤の投与を含む場合、逐次的な投与計画は、組成物を、抗ウイルス剤の投与前に、同時に、実質的に同時に、又は後に投与することを含み得るが、両方の薬剤は、規則的な順序又は順番で投与されることを意味する。「離す」という用語は、別途指定されない限り、互いに間隔を保つことを意味する。「同時に」という用語は、別途指定されない限り、同時に起こる又は行われること、すなわち、本発明の薬剤が、同時に投与されることを意味する。「実質的に同時に」という用語は、薬剤が、互いに数分以内に（例えば、互いに１０分以内に）投与され、共同投与及び継続的投与を包含することを意図するが、投与が継続的である場合、投与は、短期間（例えば、医療従事者が２つの化合物を別個に投与する時間）のみ時間的に離れていることを意味する。本明細書で使用される場合、同時投与及び実質的に同時投与は、互換的に使用される。逐次的な投与とは、本明細書に記載される薬剤の時間的に離れた投与を指す。
【0111】
併用療法はまた、本明細書に記載される薬剤を、他の生物学的活性成分及び非薬物療法と更に組み合わせて投与することを包含することができる。本明細書に記載される組成物と第２の治療剤とのいずれかの組み合わせは、標的疾患を治療するためのいずれかの順序で使用され得ることを理解されたい。
【0112】
標的疾患／障害のための治療効力は、当該技術分野において周知の方法によって評価され得る。
【0113】
いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡのうちのいずれかは、インビトロで標的遺伝子の発現を抑制するために使用され得る。このような方法を実行するために、修飾ｓｉＲＮＡ又は抗ＨＩＦ１ａ干渉ＲＮＡ（例えば、ベクターなどのコード核酸を介して）は、インビトロで培養された細胞と、例えば、疾患機構の研究及び／又は薬物候補検証などの研究目的で接触していてもよい。
【0114】
Ｖ．キット
本開示は、単独で、又は試料及び／又は対象を試験するためのｓｉＲＮＡのインビトロ又はインビボ導入を行うのに必要な試薬のうちの少なくとも１つを有するキットの構成要素として使用され得る。
本開示は、単独で、又は試料及び／又は対象を試験するためのｓｉＲＮＡのインビトロ又はインビボ導入を行うのに必要な試薬のうちの少なくとも１つを有するキットの構成要素として使用され得る。
【0115】
例えば、キットの好ましい構成要素としては、本開示の修飾ｓｉＲＮＡ分子、及び本明細書に記載される目的の細胞へのｓｉＲＮＡの導入を促進するビヒクルが挙げられる（例えば、当該技術分野で知られている脂質及び他のトランスフェクション方法を使用して、例えば、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，３９５，７１３号を参照されたい）。
【0116】
本キットはまた、遺伝子機能及び／若しくは活性の判定、又は薬物最適化、並びに創薬などにおける標的検証のために使用され得る（例えば、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，の米国出願第６０／４０２，９９６号を参照されたい）。そのようなキットはまた、キットの使用者が本開示を実践することを可能にする説明書を含み得る。そのようなキットは、任意選択で、本明細書にまた記載される第２の治療剤のうちの１つ以上を含むことができる。
【0117】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによる使用のための説明書を含むことができる。キットは、治療に好適な個体を、この個体が疾患を有する又は疾患のリスクがあるかを同定することに基づいて選択する説明を更に含み得る。
【0118】
意図された治療効果を達成するための修飾ｓｉＲＮＡ分子の使用に関する説明書は、概して、意図された治療のための投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）、又はサブ単位用量であり得る。本開示のキット内に供給される説明書は、典型的には、標識又は添付文書上の書面説明書（例えば、キット内に含まれる紙シート）であるが、機械可読説明書（例えば、磁気若しくは光学記憶ディスク又はＱＲコード上に保持された説明書）もまた、許容される。
【0119】
標識又は添付文書は、組成物が意図された治療的有用性のために使用されることを示し得る。本明細書に記載される方法のうちのいずれかを実施するための説明書が提供され得る。
【0120】
本開示のキットは、好適な包装内にある。好適な包装は、チャンバ、バイアル、ボトル、ジャー、及び軟包装（例えば、密封Ｍｙｌａｒ又はプラスチックバッグ）などを含むが、これらに限定されない。また、特定のデバイス、例えば、吸入器、ネブライザ、換気装置、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザ）、又は注入デバイス、例えば、ミニポンプと組み合わせて使用するためのパッケージが企図される。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。容器はまた、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。
【0121】
キットは、任意選択で、緩衝液及び解釈情報などの追加の構成要素を提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上若しくは容器に伴う標識又は添付文書と、を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記のキットの内容物を含む製造物品を提供する。
【0122】
一般的な技法
本開示の実施は、別途示されない限り、（組換え技法を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技法を使用し、これらは、当業者の技量の範囲内である。このような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５
、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４
、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６
、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６
、及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献に完全に説明されている。
本開示の実施は、別途示されない限り、（組換え技法を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技法を使用し、これらは、当業者の技量の範囲内である。このような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５
【数1】
【数2】
【数3】
【数4】
【0123】
更なる詳細なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本開示を最大限に使用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、本開示の残りの部分をなんら限定しない。本明細書に記載される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的で又は主題のために、参照により組み込まれる。
【実施例】
【0124】
実施例１：修飾ｓｉＲＮＡ分子のオフターゲット効果の調査
表１に列挙される７つのｓｉＲＮＡ候補を、合成し、トランスクリプトーム全体のオフターゲット効果の評価のためにスクリーニングした。酵素分解に抵抗するためにアンチセンス鎖の５’及び／又は３’末端に導入されたＰＳ結合に加えて、表１に示されるように、ＰＳ結合もアンチセンス鎖のシード領域に組み込んだ。
表１に列挙される７つのｓｉＲＮＡ候補を、合成し、トランスクリプトーム全体のオフターゲット効果の評価のためにスクリーニングした。酵素分解に抵抗するためにアンチセンス鎖の５’及び／又は３’末端に導入されたＰＳ結合に加えて、表１に示されるように、ＰＳ結合もアンチセンス鎖のシード領域に組み込んだ。
【表1】
【0125】
ヒト肝細胞ＨＬ－７７０２細胞を、１０％のウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。ヒト肝細胞がん（ＨｅｐＧ２）細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。
【0126】
簡潔には、表１に列挙されるｓｉＲＮＡ候補を、ヒト肝細胞がんＨｅｐＧ２細胞株又はヒト肝細胞ＨＬ－７７０２細胞株にトランスフェクトして、これらのｓｉＲＮＡによって引き起こされるオフターゲット効果を比較した。ＨｅｐＧ２細胞を、２４ウェル培養プレート内に播種し、これらの細胞にｓｉＲＮＡ候補を２４時間トランスフェクトした。２４時間のトランスフェクション後に、全ＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ－トランスフェクション細胞から単離して、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して、ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡのノックダウン効率を評価した。
【0127】
オフターゲット分析のために、ＨＬ－７７０２細胞を６ウェル培養プレート内に播種し、これらの細胞にｓｉＲＮＡを２４時間トランスフェクトした。次いで、全ＲＮＡを単離し、ゲノム全体のＲＮＡ配列決定を実行して、トランスクリプトーム全体のオフターゲット効果を評価した。
【0128】
ＲＮＡ－ｓｅｑ実験について、ＨＬ－７７０２細胞を、２×１０５細胞／ウェルで６ウェル培養プレート内に播種し、１８時間インキュベートした。次いで、各ｓｉＲＮＡ候補（１０ｎＭ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（９ｕｌ／ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、ＨＬ－７７０２細胞にトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクション後に、細胞を、１×ｄＰＢＳで２回洗浄し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で可溶化した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って抽出した。全ＲＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡ混入を回避するためにデオキシリボヌクレアーゼで処理した。
【0129】
抽出されたＲＮＡの純度（Ａ２６０／Ａ２８０とＡ２６０／Ａ２３０との比）及び質（ＲＩＮ≧８．０）を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＡｇｉｌｅｎｔ バイオアナライザ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して判定した。全ての抽出されたＲＮＡ試料の質は、Ａ２６０／Ａ２８０≧１．９、Ａ２６０／Ａ２３０≧２、及びＲＩＮ＝１０．０であった。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、Ｔｒｕｓｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｇｏｌｄ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して調製し、ＮｏｖａＳｅｑ６０００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において、製造業者の説明書に従って配列決定した。１試料当たり平均８４５０万リードを、２×１５０ｂｐのペアエンド配列決定から得た。生ＲＮＡリードを、ＳｅｑＰｒｅｐ及びＳｉｃｋｌｅを使用して、２０の最小平均質スコアで選別した。選別されたリードを、ＨＩＳＡＴ２を使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ．３８．ｐ１３）にアライメントし、次いで、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅを使用してアセンブルした。遺伝子発現レベルを、ＲＳＥＭによって認定し、１００万個のマッピングされたリード当たりの１キロベース当たりの断片（ＦＰＫＭ）によって正規化した。差次的遺伝子発現分析を、ＤＥＧｓｅｑによって実行した。偽発見率（ＦＤＲ）≦０．００１及び倍率変化≧２を有する遺伝子を、差次的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）として同定した。
【0130】
非ｓｉＲＮＡ処置（未処置）細胞とＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡ処置細胞を比較したゲノム全体のＲＮＡ配列決定を実行して、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の５～８位におけるＰＳ結合がオフターゲット事象になんらかの主要な効果を有していたかどうかを判定した。
【0131】
図１に示されるように、３４～７４個の下方調節された遺伝子が、処置細胞と未処置細胞との間で観察された。ＡＩ３－Ａ－ＰＳ６（３４個の遺伝子）によって引き起こされる下方調節された遺伝子の数は、アンチセンス鎖の５～８位にＰＳ結合を含有しないＡＩ３－Ａ－ＰＳ１（６４個の遺伝子）によって引き起こされるものと比較して４７％減少した。
【0132】
実施例２：ＲＴ－ｑＰＣＲによる標的遺伝子ノックダウン効率の調査
表１に列挙されるｓｉＲＮＡ候補のノックダウン効率を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって判定した。簡潔には、ＨｅｐＧ２細胞を、５×１０５細胞／ウェルで、２４ウェル培養プレート内に播種した。次いで、各ｓｉＲＮＡ候補（１０ｎＭ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（３ｕｌ／ウェル）を使用して、ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクション後、製造業者のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。
表１に列挙されるｓｉＲＮＡ候補のノックダウン効率を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって判定した。簡潔には、ＨｅｐＧ２細胞を、５×１０５細胞／ウェルで、２４ウェル培養プレート内に播種した。次いで、各ｓｉＲＮＡ候補（１０ｎＭ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（３ｕｌ／ウェル）を使用して、ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクション後、製造業者のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。
【0133】
ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡレベルを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上で実行したｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓワンステップキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いたワンステップリアルタイム定量ＰＣＲを使用して定量した。ＨＩＦ１Ａのプライマー及びプローブは、予め設計されたＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ｑＰＣＲアッセイ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からのものであった。それぞれの試料を、３回アッセイして、平均閾値サイクル（Ｃｔ）値を判定した。遺伝子発現倍率変化を、ΔΔＣｔ法を使用して計算した。ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡを、図２に示されるように、構成的に発現されたＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに正規化した。
【0134】
図２に示すように、ｓｉＲＮＡ ＡＩ３－Ａ－ＰＳ２のｓｉＲＮＡ ＡＩ３－Ａ－ＰＳ７に対するノックダウン効率は、ｓｉＲＮＡ ＡＩ３－Ａ－ＰＳ１処置細胞で正規化した後で類似していた。ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の５～８位のＰＳ結合は、ｓｉＲＮＡのノックダウン効率に影響を与えない。
【0135】
実施例３：高いノックダウン効率を有する抗ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡの開発
この実施例は、ＨＩＦ１Ａ発現を干渉する効率が高い抗ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡの同定を報告する。
この実施例は、ＨＩＦ１Ａ発現を干渉する効率が高い抗ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡの同定を報告する。
【0136】
候補抗ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡの設計
ヒトＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１５３０．４）を標的とするｓｉＲＮＡ候補（抗ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡ）を設計し、次いで以下に基づいて低いオフターゲット可能性を有するものを選択した：（１）ヒトｍＲＮＡデータベースに対する低い交差反応性、及び（２）低い数の、ｓｉＲＮＡ候補によって標的とされると予測される必須遺伝子。第１のセットのｓｉＲＮＡを合成し、以下の表３に示されるように二重鎖に形成した。第１セットのＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡ（以下の表３）を、ＨｅｐＧ２細胞におけるＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡ抑制についてスクリーニングした。ＨｅｐＧ２細胞を、これらのｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクトした。次いで、リアルタイムｑＰＣＲを使用して、ＨＩＦ１Ａ発現を測定した。
ヒトＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１５３０．４）を標的とするｓｉＲＮＡ候補（抗ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡ）を設計し、次いで以下に基づいて低いオフターゲット可能性を有するものを選択した：（１）ヒトｍＲＮＡデータベースに対する低い交差反応性、及び（２）低い数の、ｓｉＲＮＡ候補によって標的とされると予測される必須遺伝子。第１のセットのｓｉＲＮＡを合成し、以下の表３に示されるように二重鎖に形成した。第１セットのＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡ（以下の表３）を、ＨｅｐＧ２細胞におけるＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡ抑制についてスクリーニングした。ＨｅｐＧ２細胞を、これらのｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクトした。次いで、リアルタイムｑＰＣＲを使用して、ＨＩＦ１Ａ発現を測定した。
【0137】
ＨｅｐＧ２細胞の培養
ヒト肝細胞がん（ＨｅｐＧ２）細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）、２００ユニット／ｍＬのペニシリン＋２００ユニット／ｍＬのストレプトマイシンを含む最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
ヒト肝細胞がん（ＨｅｐＧ２）細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）、２００ユニット／ｍＬのペニシリン＋２００ユニット／ｍＬのストレプトマイシンを含む最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【0138】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ＨｅｐＧ２細胞を、２４ウェル培養プレート内に、５×１０５細胞／ウェルで播種した。１８時間のインキュベーション後、培地を５００μｌの新鮮な成長培地に置き換えた。各ウェルのｓｉＲＮＡ及びＲＮＡｉＭａｘの複合体組成物を、以下のように調製した：（１）１ｕｌのｓｉＲＮＡを５０ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加し、（２）１．５ｕｌのＲＮＡｉＭａｘを５０ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加し、（３）（１）及び（２）を穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートした。各ウェルに１００ｕｌのｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉＭａｘ複合体を添加することによって、トランスフェクションを行った。次いで、細胞を、ＲＮＡ精製の前に２４時間インキュベートした。
ＨｅｐＧ２細胞を、２４ウェル培養プレート内に、５×１０５細胞／ウェルで播種した。１８時間のインキュベーション後、培地を５００μｌの新鮮な成長培地に置き換えた。各ウェルのｓｉＲＮＡ及びＲＮＡｉＭａｘの複合体組成物を、以下のように調製した：（１）１ｕｌのｓｉＲＮＡを５０ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加し、（２）１．５ｕｌのＲＮＡｉＭａｘを５０ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加し、（３）（１）及び（２）を穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートした。各ウェルに１００ｕｌのｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉＭａｘ複合体を添加することによって、トランスフェクションを行った。次いで、細胞を、ＲＮＡ精製の前に２４時間インキュベートした。
【0139】
ＲＴ－ｑＰＣＲ
製造業者のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡレベルを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上で実行したｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓワンステップキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いたワンステップリアルタイム定量ＰＣＲを使用して定量した。ＲＴ－ｑＰＣＲを、３８４ウェルプレート中で、５０ｎｇの全ＲＮＡ、５００ｎＭのそれぞれのフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブ、０．２５ｕｌの逆転写酵素、並びに２×ｉＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘで、１０ｕｌの全容積で、３連で実行した。ＨＩＦ１Ａ及びＧＡＰＤＨのプライマー及びプローブ（表２）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから合成した。サイクル条件は、製造業者の推奨サイクルパラメータ：５０℃で１０分間、９５℃で２分間、並びに９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルに従った。遺伝子発現倍率変化を、ΔΔＣｔ法を使用して計算した。ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡを、構成的に発現されたＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに正規化した。
製造業者のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡレベルを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上で実行したｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓワンステップキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いたワンステップリアルタイム定量ＰＣＲを使用して定量した。ＲＴ－ｑＰＣＲを、３８４ウェルプレート中で、５０ｎｇの全ＲＮＡ、５００ｎＭのそれぞれのフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブ、０．２５ｕｌの逆転写酵素、並びに２×ｉＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘで、１０ｕｌの全容積で、３連で実行した。ＨＩＦ１Ａ及びＧＡＰＤＨのプライマー及びプローブ（表２）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから合成した。サイクル条件は、製造業者の推奨サイクルパラメータ：５０℃で１０分間、９５℃で２分間、並びに９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルに従った。遺伝子発現倍率変化を、ΔΔＣｔ法を使用して計算した。ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡを、構成的に発現されたＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに正規化した。
【表2】
【0140】
結果
第１ラウンドのスクリーニングでは、ＨｅｐＧ２細胞を３０ｎＭのＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡで処置した。結果を、表３に示す。ｓｉＲＮＡで処置したＨｅｐＧ２細胞におけるＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの相対発現率は、ＲＮＡｉＭａｘのみで処置し、ｓｉＲＮＡでは処置していない対照と比較して、％ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡとして表す。
第１ラウンドのスクリーニングでは、ＨｅｐＧ２細胞を３０ｎＭのＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡで処置した。結果を、表３に示す。ｓｉＲＮＡで処置したＨｅｐＧ２細胞におけるＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの相対発現率は、ＲＮＡｉＭａｘのみで処置し、ｓｉＲＮＡでは処置していない対照と比較して、％ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡとして表す。
【表3】
【0141】
二本鎖番号３、７、及び１０を、表４に列挙されるように更に修飾した。第２ラウンドのスクリーニングを、１ｎＭ ｓｉＲＮＡで処置したＨｅｐＧ２細胞で行った。ｓｉＲＮＡトランスフェクション及びＲＴ－ｑＰＣＲは、前述のように実行した。各ｓｉＲＮＡ二本鎖によって引き起こされるＨＩＦ１Ａ発現レベルを表４に示す。
【表4】
【0142】
実施例４：ヒトＨｅｐＧ２異種移植マウスにおける抗ｓｉＲＮＡの効果
例示的な抗ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡ（ＡＩ３－ＵＭ４、別名、ＡＩ３）の、異種移植動物モデルにおけるノックダウン効果を、以下のように調査した。ＨｅｐＧ２細胞を、４週齢の雌性Ｍ－ＮＳＧマウスに皮下接種した。腫瘍が５０ｍｍ３の平均体積に達したとき、マウスは、腫瘍サイズ（各群においてｎ＝３）に従って２つの群に無作為に分けられ、次いで、１日目、３日目、７日目及び１４日目に、ＰＢＳ（ビヒクル）又はＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／Ｋｇ）を皮下注射した。ＡＩ３－ＵＭ４（ＡＩ３）を例として本研究で使用した。
例示的な抗ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡ（ＡＩ３－ＵＭ４、別名、ＡＩ３）の、異種移植動物モデルにおけるノックダウン効果を、以下のように調査した。ＨｅｐＧ２細胞を、４週齢の雌性Ｍ－ＮＳＧマウスに皮下接種した。腫瘍が５０ｍｍ３の平均体積に達したとき、マウスは、腫瘍サイズ（各群においてｎ＝３）に従って２つの群に無作為に分けられ、次いで、１日目、３日目、７日目及び１４日目に、ＰＢＳ（ビヒクル）又はＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／Ｋｇ）を皮下注射した。ＡＩ３－ＵＭ４（ＡＩ３）を例として本研究で使用した。
【0143】
２１日後、マウスを屠殺し、製造業者のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、腫瘍異種移植片から全ＲＮＡを抽出した。ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの相対発現を、前述のようにＲＴ－ｑＰＣＲによって定量した。ヒトＨｅｐＧ２腫瘍異種移植片におけるＨＩＦ１Ａの発現レベルを図３Ａに提示する。対照で正規化した後（ビヒクルで処理した後）、ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／Ｋｇ ＡＩ３）で処理したＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡレベルは、ヒト肝細胞がん細胞において５２％減少した。
【0144】
更に、例示的な抗ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡの抗腫瘍成長効果を異種移植マウスモデルにおいて調査した。ＨｅｐＧ２腫瘍（約５０ｍｍ３）を有する雌性Ｍ－ＮＳＧマウスを調製し、前述のように２つの群に分けた。ビヒクル及びＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡを、１日目、３日目、７日目及び１４日目にマウスに皮下注射した。各マウスにおける腫瘍の長さ及び幅を、週に２回、３週間測定した。腫瘍体積は、Ｌ×Ｗ２×０．５として計算した。相対腫瘍体積（％）は、各時点での腫瘍体積対各マウスの初期腫瘍体積（投与の初期時点で）のパーセンテージとして定義される。図３Ｂに示されるＡには、ＨＩＦ１Ａ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／Ｋｇ ＡＩ３）の投与により、ヒト肝細胞がん細胞における腫瘍体積が４９％有意に減少した。
【0145】
他の実施形態
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に開示される各々の特徴は、同じ、均等な、又は同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、別途明白に記載されない限り、開示される各々の特徴は、全般的な一連の均等な又は同様の機能の例のみである。
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に開示される各々の特徴は、同じ、均等な、又は同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、別途明白に記載されない限り、開示される各々の特徴は、全般的な一連の均等な又は同様の機能の例のみである。
【0146】
上記の説明から、当業者は、本開示の必須の特徴を容易に確認することができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本開示の様々な変更及び修正をなして、本発明を様々な使用及び条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲内である。
【0147】
均等物
いくつかの発明実施形態が、本明細書に記載及び例示されているが、本明細書に記載される機能を実行し、かつ／又は本明細書に記載される結果及び／若しくは利点のうちの１つ以上を得るための様々な他の手段及び／又は構造が、当業者には容易に想到され、このような変形及び／又は修正の各々は、本明細書に記載される発明実施形態の範囲内であることが意図されている。概して、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成は、例示的であることが意図されていること、並びに実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、発明教示が使用される具体的な用途又は複数の用途に依存することが、当業者には容易に理解されよう。当業者は、通例の実験法のみを使用して、本明細書に記載される具体的な発明実施形態の多くの均等物を認識するか又は確認することができる。したがって、上記の実施形態は、例としてのみ提示されること、並びに添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、発明実施形態は、具体的に記載及び特許請求されるものとは別法で実施されてもよいことが、理解される。本開示の発明実施形態は、本明細書に記載される各々の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法のいずれの組み合わせも、このような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、本開示の発明範囲内に含まれる。
いくつかの発明実施形態が、本明細書に記載及び例示されているが、本明細書に記載される機能を実行し、かつ／又は本明細書に記載される結果及び／若しくは利点のうちの１つ以上を得るための様々な他の手段及び／又は構造が、当業者には容易に想到され、このような変形及び／又は修正の各々は、本明細書に記載される発明実施形態の範囲内であることが意図されている。概して、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成は、例示的であることが意図されていること、並びに実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、発明教示が使用される具体的な用途又は複数の用途に依存することが、当業者には容易に理解されよう。当業者は、通例の実験法のみを使用して、本明細書に記載される具体的な発明実施形態の多くの均等物を認識するか又は確認することができる。したがって、上記の実施形態は、例としてのみ提示されること、並びに添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、発明実施形態は、具体的に記載及び特許請求されるものとは別法で実施されてもよいことが、理解される。本開示の発明実施形態は、本明細書に記載される各々の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法のいずれの組み合わせも、このような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、本開示の発明範囲内に含まれる。
【0148】
本明細書で定義及び使用される場合、全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、及び／又は定義される用語の通常の意味よりも優先されると理解されるべきである。
【0149】
本明細書に開示される全ての参照文献、特許、及び特許出願は、これらの各々が引用される主題、いくつかの場合では、これらの文書全体を包含し得る主題に関して、参照により組み込まれる。
【0150】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、明白に反して示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【0151】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「及び／又は」という語句は、このように等位接続された要素の「いずれか又は両方」、すなわち、要素は、いくつかの場合では、接続的に存在し、他の場合には、非接続的に存在することを意味すると理解されるべきである。「及び／又は」で列挙される複数の要素は、同じ様式で、すなわち、要素のうちの「１つ以上」が、このように等位接続されていると解釈されるべきである。「及び／又は」という句によって具体的に同定される要素以外の他の要素が、具体的に同定されるこれらの要素に関連するか又は関連しないかにかかわらず、任意選択で存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などの非限定的な言語と合わせて使用されたときに、一実施形態では、（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）Ａのみ、別の実施形態では、（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）Ｂのみ、更に別の実施形態では、（任意選択で、他の要素を含む）Ａ及びＢの両方、などを指すことができる。
【0152】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「又は」は、上記で定義される「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するときに、「又は」又は「及び／又は」は、包括的である、すなわち、いくつかの要素又は要素のリストのうちの少なくとも１つを含むが、これらのうちの２つ以上も含み、任意選択で、列挙されない追加の項目を含むとして解釈される。明白に反して示される用語のみ、例えば、「のうちの１つのみ」、又は「のうちの正確に１つ」、又は特許請求の範囲で使用されたときに、「からなる」とは、いくつかの要素又は要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。概して、本明細書で使用される場合、「又は」という用語は、排他性の用語、例えば、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、又は「のうちの正確に１つ」が前にあるときに、排他的な選択肢（すなわち、「一方又は他方であるが、両方ではない」）を示すとしてのみ解釈される。特許請求の範囲内で使用されたときに、「から本質的になる」は、特許法の分野で使用される場合のこの通常の意味を有する。
【0153】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに言及して、「少なくとも１つの」という語句は、要素のリスト内の要素のうちのいずれかの１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも、要素のリスト内に具体的に列挙される各々全ての要素のうちの少なくとも１つを含むとは限られず、要素のリスト内の要素のいずれの組み合わせも除外しないと理解されるべきである。この定義はまた、要素のリスト内で具体的に同定され「少なくとも１つ」という語句が指す要素以外の要素が、具体的に同定される要素に関連するか又は関連しないかにかかわらず、任意選択で存在してもよいことを可能にする。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は均等に、「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は均等に、「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）とは、一実施形態では、少なくとも１つ、任意選択で、２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）こと、別の実施形態では、少なくとも１つ、任意選択で、２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）こと、更に別の実施形態では、少なくとも１つ、任意選択で、２つ以上のＡを含み、少なくとも１つ、任意選択で、２つ以上のＢを含む（任意選択で、他の要素を含む）ことなどを指すことができる。
【0154】
また、明白に反して示されない限り、２つ以上のステップ又は行為を含む、本明細書で特許請求されるいずれの方法においても、方法のステップ又は行為の順序は、必ずしも、方法のステップ又は行為が列挙される順序に限定されるとは限らないことが理解されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【配列表】
【国際調査報告】