特表 2024-529939 候補薬剤の治療特性を評価するための方法及びモデルシステム、並びに関連するコンピュータ可読媒体及びシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-14

(54)【発明の名称】候補薬剤の治療特性を評価するための方法及びモデルシステム、並びに関連するコンピュータ可読媒体及びシステム

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20240806BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20240806BHJP

   C12N 5/09 20100101ALI20240806BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

C12N5/07

C12N5/09

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024503912

(86)(22)【出願日】2022-07-22

(85)【翻訳文提出日】2024-03-18

(86)【国際出願番号】 US2022038069

(87)【国際公開番号】W WO2023004149

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】63/225,209

(32)【優先日】2021-07-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100195257

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 一志

(72)【発明者】

【氏名】グダルジ、 ハニ

(72)【発明者】

【氏名】ユ、 ジョニー

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR62

4B063QR77

4B063QS24

4B063QS34

4B063QS39

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AC14

4B065BC18

4B065BD21

4B065CA46

(57)【要約】

本明細書では、インビトロ、インビボ、及びエクスビボモデルシステム、そのようなモデルシステムを作製する方法、並びに候補薬剤の１つ以上の治療特性を評価するか、又は新しい治療標的を同定するためにそのようなモデルシステムを使用する方法が提供される。また、例えば、本開示の方法を実践する際の使用を見出すコンピュータ可読媒体及びシステムも提供される。
【選択図】図２Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価するための方法であって、
三次元で異なる細胞型の細胞のプールを成長させることと、
前記小分子化合物を用いて前記三次元プールを処理することと、
前記処理された三次元プールの細胞を単一細胞に解離させることと、
前記解離された単一細胞及び前記小分子化合物で処理されていない対照三次元プールからの解離された単一細胞に対する単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）配列決定を実施することと、
前記単一細胞ＲＮＡ配列決定からのデータを、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームにデコンボリュートすることと、
前記分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、前記小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価することと、を含む、方法。

【請求項2】

細胞の前記プールは、細胞の成長平衡プールであり、
ａ）前記異なる細胞型の各々は、細胞の前記プール中の少なくとも１×１０^３個の生存細胞で表されるか、
ｂ）細胞の前記プール中で、前記異なる細胞型の細胞型が他の細胞型を２桁以上上回ることはないか、又は
ｃ）前記異なる細胞型の各々の細胞の総数は、細胞の前記プール中で互いに２桁以内である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

異なる細胞型の細胞の前記プールは、２～１００個の異なる細胞型を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

異なる細胞型の細胞の前記プールは、１０～５０個の異なる細胞型を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

前記異なる細胞型は、患者から得られた初代細胞、臓器系からの細胞、疾患モデルからの細胞、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

三次元で前記プールを成長させることは、前記プールから異種移植片を産生することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

三次元で前記プールを成長させることは、前記プールからオルガノイドを産生することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記１つ以上の治療特性は、薬物との併用療法について前記小分子化合物が候補であることを含み、前記方法は、処理及び細胞型によって分類された前記単一細胞トランスクリプトームに基づいて、
各条件で残っている細胞の数を計数することによって、各細胞株の薬物感受性を決定することと、
各細胞株の薬物誘導遺伝子発現変化を計算することと、
各細胞株の前記計算された薬物誘導遺伝子発現変化に基づいて、各遺伝子についての重み付けスコアを、薬物感受性に対するその予測された関連性に基づいて与えることと、
誤検出率を上回る重み付けスコアを有する前記遺伝子に基づいて、併用療法標的を予測することであって、薬物感受性と反相関する遺伝子は、薬物耐性を予測し、したがって、併用標的化のための候補標的を表す、予測することと、を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記１つ以上の治療特性は、前記小分子化合物の作用機構を含み、前記方法は、処理及び細胞型によって分類された前記単一細胞トランスクリプトームに基づいて、
各条件で残っている細胞の数を計数することによって、各細胞株の薬物感受性を決定することと、
各細胞株の薬物誘導遺伝子発現変化を決定することと、
薬物感受性細胞株にわたる前記決定された薬物誘導遺伝子発現変化を集約することと、
前記集約された計算された薬物誘導遺伝子発現変化に基づいて、各遺伝子について重み付けスコアを、薬物感受性に対するその予測された関連性に基づいて与えることと、
誤検出率を上回る重み付けスコアを有するものとして、集約された薬物感受性と相関する遺伝子を同定することと、
前記集約された薬物感受性と相関する前記遺伝子に基づいて、前記化合物の作用機構を予測することと、を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記１つ以上の治療特性は、疾患サブタイプの治療について前記小分子化合物が候補であることを含み、前記方法は、処理及び細胞型によって分類された前記単一細胞トランスクリプトームに基づいて、
各条件で残っている細胞の数を計数することによって、各細胞株の薬物感受性を決定することであって、各細胞株は、その遺伝子変異及び／又はトランスクリプトームシグネチャによって分類される、決定することと、
細胞株にわたって前記決定された薬物感受性を集約することと、
可変選択回帰アルゴリズムを使用して、集約された薬物感受性への関連性を予測する各変異及び／又はトランスクリプトームシグネチャについてスコアを与えることと、
疾患サブタイプにおける前記化合物の有効性を、誤検出率を上回るスコアを有する前記疾患サブタイプに基づいて予測することと、を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記可変選択回帰アルゴリズムは、重み付けラッソ回帰アルゴリズムである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

命令が記憶された１つ以上の非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記命令は、１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記１つ以上のプロセッサに、
単一細胞ＲＮＡ配列決定データを、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームにデコンボリュートすることであって、前記単一細胞ＲＮＡ配列決定データは、小分子化合物で処理された異なる細胞型の三次元プールからの解離された単一細胞、及び前記小分子化合物で処理されていない異なる細胞型の対照三次元プールからの解離された単一細胞に対して単一細胞ＲＮＡ配列決定を実施することによって生成される、デコンボリュートすることと、
前記分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、前記小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価することと、を行わせる、１つ以上の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項13】

前記１つ以上の治療特性は、薬物との併用療法について前記小分子化合物が候補であることを含み、前記１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記命令は、処理及び細胞型によって分類される前記単一細胞トランスクリプトームに基づいて、前記１つ以上のプロセッサに、
各細胞株の薬物誘導遺伝子発現変化を計算することと、
各細胞株の前記計算された薬物誘導遺伝子発現変化に基づいて、各遺伝子についての重み付けスコアを、薬物感受性に対するその予測された関連性に基づいて与えることと、
誤検出率を上回る重み付けスコアを有する前記遺伝子に基づいて、併用療法標的を予測することであって、薬物感受性と反相関する遺伝子は、薬物耐性を予測し、したがって、併用標的化のための候補標的を表す、予測することと、を更に行わせる、請求項１２に記載の１つ以上の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項14】

前記１つ以上の治療特性は、前記小分子化合物の作用機構を含み、前記１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記命令は、処理及び細胞型によって分類される前記単一細胞トランスクリプトームに基づいて、前記１つ以上のプロセッサに、
各細胞株の薬物誘導遺伝子発現変化を決定することと、
薬物感受性細胞株にわたる前記決定された薬物誘導遺伝子発現変化を集約することと、
前記集約された計算された薬物誘導遺伝子発現変化に基づいて、各遺伝子について重み付けスコアを、薬物感受性に対するその予測された関連性に基づいて与えることと、
誤検出率を上回る重み付けスコアを有するものとして、集約された薬物感受性と相関する遺伝子を同定することと、
前記集約された薬物感受性と相関する前記遺伝子に基づいて、前記化合物の作用機構を予測することと、を更に行わせる、請求項１２又は１３に記載の１つ以上の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項15】

前記１つ以上の治療特性は、疾患サブタイプの治療について前記小分子化合物が候補であることを含み、前記１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記命令は、処理及び細胞型によって分類される前記単一細胞トランスクリプトームに基づいて、前記１つ以上のプロセッサに、
細胞株にわたって薬物感受性を集約することであって、各条件で残っている細胞の数を計数することによって、各細胞株について薬物感受性が決定され、各細胞株は、その遺伝子変異及び／又はトランスクリプトームシグネチャによって分類される、集約することと、
可変選択回帰アルゴリズムを使用して、集約された薬物感受性への関連性を予測する各変異及び／又はトランスクリプトームシグネチャについてスコアを与えることと、
疾患サブタイプにおける前記化合物の有効性を、誤検出率を上回るスコアを有する前記疾患サブタイプに基づいて予測することと、を更に行わせる、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項16】

前記可変選択回帰アルゴリズムは、重み付けラッソ回帰アルゴリズムである、請求項１５に記載の１つ以上の非一時的コンピュータ可読媒体。

【請求項17】

小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価するためのシステムであって、
１つ以上のプロセッサと、
命令が記憶された１つ以上の非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記命令は、前記１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記１つ以上のプロセッサに、
単一細胞ＲＮＡ配列決定データを、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームにデコンボリュートすることであって、前記単一細胞ＲＮＡ配列決定データは、小分子化合物で処理された異なる細胞型の三次元プールからの解離された単一細胞、及び前記小分子化合物で処理されていない異なる細胞型の対照三次元プールからの解離された単一細胞に対して単一細胞ＲＮＡ配列決定を実施することによって生成される、デコンボリュートすることと、
前記分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、前記小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価することと、を行わせる、１つ以上の非一時的コンピュータ可読媒体と、を備える、システム。

【請求項18】

前記１つ以上の治療特性は、薬物との併用療法について前記小分子化合物が候補であることを含み、前記１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記命令は、処理及び細胞型によって分類される前記単一細胞トランスクリプトームに基づいて、前記１つ以上のプロセッサに、
各細胞株の薬物誘導遺伝子発現変化を計算することと、
各細胞株の前記計算された薬物誘導遺伝子発現変化に基づいて、各遺伝子についての重み付けスコアを、薬物感受性に対するその予測された関連性に基づいて与えることと、
誤検出率を上回る重み付けスコアを有する前記遺伝子に基づいて、併用療法標的を予測することであって、薬物感受性と反相関する遺伝子は、薬物耐性を予測し、したがって、併用標的化のための候補標的を表す、予測することと、を更に行わせる、請求項１７に記載のシステム。

【請求項19】

前記１つ以上の治療特性は、前記小分子化合物の作用機構を含み、前記１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記命令は、処理及び細胞型によって分類される前記単一細胞トランスクリプトームに基づいて、前記１つ以上のプロセッサに、
各細胞株の薬物誘導遺伝子発現変化を決定することと、
薬物感受性細胞株にわたる前記決定された薬物誘導遺伝子発現変化を集約することと、
前記集約された計算された薬物誘導遺伝子発現変化に基づいて、各遺伝子について重み付けスコアを、薬物感受性に対するその予測された関連性に基づいて与えることと、
誤検出率を上回る重み付けスコアを有するものとして、集約された薬物感受性と相関する遺伝子を同定することと、
前記集約された薬物感受性と相関する前記遺伝子に基づいて、前記化合物の作用機構を予測することと、を更に行わせる、請求項１７又は１８に記載のシステム。

【請求項20】

前記１つ以上の治療特性は、疾患サブタイプの治療について前記小分子化合物が候補であることを含み、前記１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記命令は、処理及び細胞型によって分類される前記単一細胞トランスクリプトームに基づいて、前記１つ以上のプロセッサに、
細胞株にわたって薬物感受性を集約することであって、各条件で残っている細胞の数を計数することによって、各細胞株について薬物感受性が決定され、各細胞株は、その遺伝子変異及び／又はトランスクリプトームシグネチャによって分類される、集約することと、
可変選択回帰アルゴリズムを使用して、集約された薬物感受性への関連性を予測する各変異及び／又はトランスクリプトームシグネチャについてスコアを与えることと、
疾患サブタイプにおける前記化合物の有効性を、誤検出率を上回るスコアを有する前記疾患サブタイプに基づいて予測することと、を更に行わせる、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項21】

前記可変選択回帰アルゴリズムは重み付けラッソ回帰アルゴリズムである、請求項２０に記載のシステム。

【請求項22】

ある期間の間培養された２つ以上の異なる細胞型を含む平衡細胞数培養物であって、前記２つ以上の異なる細胞型の各々は成長率を有し、前記２つ以上の異なる細胞型の各細胞型は、培養前に、前記２つ以上の異なる細胞型の前記細胞型の各々の前記成長率と逆比で組み合わされる、平衡細胞数培養物。

【請求項23】

前記期間は、６時間～４５日間、１２時間～３０日間、２４時間～２０日間、又は７２時間～１４日間である、請求項２２に記載の平衡細胞数培養物。

【請求項24】

（ｉ）前記２つの異なる細胞型の各々は、前記平衡細胞数培養物中の少なくとも１×１０^３個の生存細胞で表され、
（ｉｉ）前記平衡細胞数培養物中の前記少なくとも２つの異なる細胞型の細胞型は、他の細胞型を２桁以上上回らないか、又は
（ｉｉｉ）前記平衡細胞数培養物中、前記少なくとも２つ以上の異なる細胞型の各細胞型の総数は、互いに２桁以内である、請求項２２又は２３に記載の平衡細胞数培養物。

【請求項25】

少なくとも２つ以上の異なる細胞型を含む平衡細胞数培養物であって、前記平衡細胞数培養物の０．２体積％～１０体積％の試料は、前記異なる細胞型の各々の少なくとも５００個の細胞を含み、前記試料は、２つ以上の細胞型を組み合わせて細胞プールを作成し、培養培地に接種して、前記平衡細胞数培養物を得た後、７２時間～４５日間の期間の間、前記平衡細胞数培養物が培養された後、前記平衡細胞数培養物から採られる、平衡細胞数培養物。

【請求項26】

少なくとも２つ以上の異なる細胞型を含む平衡細胞数培養物であって、前記細胞型の各々は、前記培養物中の少なくとも１×１０^３個の細胞で表され、前記細胞型のうちの少なくとも２つは異なるがん組織に由来する、平衡細胞数培養物。

【請求項27】

少なくとも２つ以上の異なる細胞型を含む平衡細胞数培養物であって、前記細胞型の各々は、前記培養物中の少なくとも１×１０^３個の細胞で表され、前記細胞型のうちの少なくとも２つは互いに異なるがん変異を含む、平衡細胞数培養物。

【請求項28】

前記平衡細胞数培養物は、２～１００個の異なる細胞型を含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物。

【請求項29】

前記平衡細胞数培養物は、１０～５０個の異なる細胞型を含む、請求項２８に記載の平衡細胞数培養物。

【請求項30】

前記異なる細胞型は、がん変異を有する細胞、１人以上の対象からのがん細胞、１人以上の対象からの初代細胞、臓器系からの細胞、疾患モデルからの細胞、様々な細胞株からの細胞、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物。

【請求項31】

前記平衡細胞数培養物は、モデルシステムに移植される、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物。

【請求項32】

前記モデルシステムは、インビトロモデルシステム、インビボモデルシステム、又はエクスビボモデルシステムである、請求項３１に記載の平衡細胞数培養物。

【請求項33】

少なくとも２つ以上の異なる細胞型を有する平衡細胞数培養物を調製する方法であって、
（ａ）前記２つ以上の異なる細胞型の各細胞型についての成長率を決定することと、
（ｂ）細胞プールを作成するために、前記２つ以上の異なる細胞型を組み合わせることであって、前記細胞プールに添加される前記２つ以上の異なる細胞型の前記細胞型の各々の初期細胞数が、ステップ（ａ）の前記成長率に基づいて決定される、組み合わせることと、
（ｃ）前記平衡細胞数培養物を作成するために、ステップ（ｂ）の前記細胞プールをある期間にわたって培養することであって、前記平衡細胞数培養物の０．２体積％～１０体積％の試料は、前記２つ以上の異なる細胞型の各細胞型の少なくとも５００個の細胞を含む、培養することと、を含む、方法。

【請求項34】

ステップ（ｃ）の前記試料は、５，０００～２００，０００個の細胞を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記２つ以上の異なる細胞型の各細胞型の５００個以上の生存細胞が、ステップ（ｃ）の前記試料中に存在している、請求項３３又は３４に記載の方法。

【請求項36】

ステップ（ｂ）において前記細胞プールに添加した後の前記２つ以上の異なる細胞型の各細胞型からの表現は、ステップ（ａ）において決定される、その細胞型の前記細胞成長率に反比例する、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記平衡細胞数培養物は、２～１００個の異なる細胞型を含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記平衡細胞数培養物は、２～５０個の異なる細胞型を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

ステップ（ａ）の前記成長率を前記決定することは、前記２つ以上の異なる細胞型の各細胞型についての前記成長率を測定することを含む、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記異なる細胞型は、がん変異を有する細胞、１人以上の対象からのがん細胞、１人以上の対象からの初代細胞、臓器系からの細胞、疾患モデルからの細胞、様々な細胞株からの細胞、又はそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記異なる細胞型は、１つ以上の異種移植片モデルから選択される、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記異種移植片は、疾患を有する対象のうちの１人に由来する、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記疾患は、腫瘍性疾患である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記腫瘍性疾患は、頭、首、肺、皮膚、乳房、血液、リンパ、骨、軟組織、脳、眼、生殖系、循環系、消化器系、内分泌系、神経系、及び泌尿器系のがんのうちの１つ以上から選択されるがんである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記方法は、ステップ（ｂ）において、ある細胞型を、前記細胞型が１日当たり０．２倍の成長率を有するときに、除外することを更に含む、請求項３３～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

ステップ（ｃ）の前記期間は、６時間～４５日間である、請求項３３～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

ステップ（ｃ）の前記期間は、１２時間～２０日間である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

ステップ（ｃ）の前記期間は、２４時間～１４日間である、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

ステップ（ｃ）の前記期間は、７２時間である、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

ステップ（ｃ）の前記期間は、７日間である、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

ステップ（ｃ）の前記試料は、前記期間の終了時に採られる、請求項３３～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

ステップ（ｃ）の少なくとも２つ以上の試料は、前記期間中の異なる時点で採られる、請求項３３～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

ステップ（ａ）における各細胞型の前記成長率は、個別にカルセイン－ＡＭ成長アッセイ、又はＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ成長アッセイによって決定される、請求項３３～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記２つ以上の異なる細胞型の各細胞型は、ステップ（ｂ）で、前記カルセイン－ＡＭ成長アッセイによって決定される、前記細胞型の各々の前記成長率と逆の比率で組み合わされ、ｉｉ）成長のための総日数にスケーリングされる、請求項３３～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

ステップ（ｃ）の前記試料は、前記平衡細胞数培養物の０．５体積％～３体積％である、請求項３３～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

請求項３３～５５のいずれか一項に記載のステップ（ｃ）の前記試料からの細胞を、ステップ（ｃ）の前記試料からのステップ（ｂ）の前記細胞プールの前記２つ以上の細胞と相関させる方法であって、実施するステップは、
（ｉ）前記試料からの１つ以上の細胞に対して単一細胞ＲＮＡ配列決定を実施して、前記試料からの前記１つ以上の細胞における単一ヌクレオチド多型を同定することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記単一ヌクレオチド多型と、ステップ（ｂ）の前記細胞プールの前記２つ以上の細胞の単一ヌクレオチド多型とを比較し、それにより、ステップ（ｃ）の前記試料からの細胞を、ステップ（ｂ）の前記細胞プールの前記２つ以上の細胞と相関させることと、を更に含む、方法。

【請求項57】

前記試料の１つ以上の細胞に対する単一細胞トランスクリプトーム分析を更に含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

ステップ（ｃ）の一部は、インビトロで実施される、請求項３３～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

ステップ（ｃ）の一部は、インビボで実施される、請求項３３～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記平衡細胞数培養物をモデルシステムに移植することを更に含む、請求項３３～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記モデルシステムは、インビトロモデルシステム、エクスビボモデルシステム、又はインビボモデルシステムである、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

請求項３３～６１のいずれか一項に記載の方法によって調製された、平衡細胞数培養物。

【請求項63】

前記２つ以上の異なる細胞型の各細胞型の５００個以上の生存細胞が、ステップ（ｃ）の終了時に前記試料中に存在しており、ステップ（ｃ）の前記期間は、２４時間～４５日間である、請求項６２に記載の平衡細胞数培養物。

【請求項64】

ステップ（ｃ）の前記期間は、３日～２０日間である、請求項６２又は６３に記載の培養物の平衡細胞数培養物。

【請求項65】

前記異なる細胞型は、がん変異を有する細胞、１人以上の対象からのがん細胞、１人以上の対象からの初代細胞、臓器系からの細胞、疾患モデルからの細胞、様々な細胞株からの細胞、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６２～６４のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物。

【請求項66】

請求項３３～６１のいずれか一項に記載の方法によって調製された平衡細胞数培養物であって、前記平衡細胞数培養物は、２つ以上の異なる細胞型を含み、前記２つ以上の異なる細胞型の各々は、前記培養物中の少なくとも１×１０^３個の細胞で表され、前記細胞型のうちの少なくとも２つは、異なる対象から供給される、平衡細胞数培養物。

【請求項67】

請求項３３～６１のいずれか一項に記載の方法によって調製された平衡細胞数培養物であって、前記平衡細胞数培養物は、２つ以上の異なる細胞型を含み、前記２つ以上の異なる細胞型の各々は、前記培養物中の少なくとも１×１０^３個の細胞で表され、前記細胞型のうちの少なくとも３つは、異なるがん組織に由来する、平衡細胞数培養物。

【請求項68】

請求項３３～６１のいずれか一項に記載の方法によって調製された平衡細胞数培養物であって、前記平衡細胞数培養物は、２つ以上の異なる細胞型を含み、前記２つ以上の異なる細胞型の各々は、前記培養物中の少なくとも１×１０^３個の細胞で表され、前記細胞型のうちの少なくとも２つは、互いに異なるがん変異を含む、平衡細胞数培養物。

【請求項69】

請求項３３～６１のいずれか一項に記載の方法によって調製された平衡細胞数培養物であって、前記平衡細胞数培養物は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボモデルシステムに移植される、平衡細胞数培養物。

【請求項70】

請求項３３～６１のいずれか一項に記載の方法によって調製された平衡細胞数培養物であって、前記平衡細胞数培養物の細胞型が、他の細胞型を２桁以上上回ることはない、平衡細胞数培養物。

【請求項71】

請求項３３～６１のいずれか一項に記載の方法によって調製された平衡細胞数培養物であって、前記２つ以上の異なる細胞型の各細胞型の総数は、互いに２桁以内である、平衡細胞数培養物。

【請求項72】

２つ以上の細胞型に対する候補薬剤の影響を評価する方法であって、
ｉ）請求項２２～３２又は６２～７１のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物を調製することと、
ｉｉ）前記平衡細胞数培養物をモデルシステムに移植することと、
ｉｉｉ）前記モデルシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理することと、
ｉｖ）前記持続時間の終了時に前記平衡細胞数培養物を評価して、前記平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する前記候補薬剤の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的影響を決定することと、を含む、方法。

【請求項73】

前記モデルシステムは、インビトロモデルシステム、インビボモデルシステム、又はエクスビボモデルシステムである、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

インビボモデルシステムにおいて、少なくとも２つ以上の異なる細胞型を含むモザイク腫瘍を作成する方法であって、
（ｉ）請求項２２～３２又は６２～７１のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物を調製することであって、前記細胞型のうちの少なくとも２つは、異なるがん組織に由来する、調製することと、
（ｉｉ）前記平衡細胞数培養物をインビボシステムに移植することであって、前記インビボシステムは、哺乳動物である、移植することと、を含む、方法。

【請求項75】

請求項７４に記載の少なくとも２つ以上の異なる細胞型を含むモザイク腫瘍の個々の細胞に対する候補薬剤の治療有効性を評価する方法であって、
（ｉ）前記モザイク腫瘍を、ある持続時間にわたって前記候補薬剤で処理することと、
（ｉｉ）前記処理されたモザイク腫瘍の細胞を個々の細胞に解離させることと、
（ｉｉｉ）前記持続時間の終了時に前記個々の細胞を評価して、前記モザイク腫瘍の前記個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現を決定することと、
（ｉｖ）前記モザイク腫瘍の前記個々の細胞の前記表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現と、前記候補薬剤で処理されていない同一のモザイク腫瘍の個々の細胞の表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現とを比較することによって、前記候補薬剤の前記治療有効性を決定することと、を含む、方法。

【請求項76】

インビボシステムにおいて、複数の細胞型に対する候補薬剤の影響を同時に評価する方法であって、
（ｉ）請求項２２～３２又は６２～７１のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物を調製することであって、前記細胞型のうちの少なくとも２つは、互いに異なる、調製することと、
（ｉｉ）前記平衡細胞数培養物をインビボシステムに移植することであって、前記インビボシステムは、哺乳動物である、移植することと、
（ｉｉｉ）前記インビボシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理することと、
（ｉｖ）前記個々の細胞を評価して、前記持続時間の終了時に、前記複数の細胞型の各々の前記個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現を決定することと、
（ｖ）前記インビボシステムにおける前記複数の細胞型の各々の前記個々の細胞の前記表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現と、前記候補薬剤で処理されていない同一のインビボシステムの複数の細胞型の各々の個々の細胞の前記表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現とを比較することによって、前記候補薬剤の影響を決定することと、を含む、方法。

【請求項77】

エクスビボシステムにおいて、複数の細胞型に対する候補薬剤の影響を同時に評価する方法であって、
（ｉ）請求項２２～３２又は６２～７１のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物を調製することであって、前記細胞型のうちの少なくとも２つは、互いに異なる、調製することと、
（ｉｉ）前記平衡細胞数培養物をエクスビボシステムに移植することであって、前記エクスビボシステムは、オルガノイドである、移植することと、
（ｉｉｉ）前記エクスビボシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理することと、
（ｉｖ）前記個々の細胞を評価して、前記持続時間の終了時に、前記エクスビボシステムにおける前記複数の細胞型の各々の前記個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現を決定することと、
（ｖ）前記エクスビボシステムにおける前記複数の細胞型の各々の前記個々の細胞の前記表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現と、前記候補薬剤で処理されていない同一のエクスビボシステムの複数の細胞型の各々の個々の細胞の前記表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現とを比較することによって、前記候補薬剤の影響を決定することと、を含む、方法。

【請求項78】

インビトロシステムにおいて、複数の細胞型に対する候補薬剤の影響を同時に評価する方法であって、
（ｉ）請求項２２～３２又は６２～７１のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物を調製することであって、前記細胞型のうちの少なくとも２つは、互いに異なる、調製することと、
（ｉｉ）前記平衡細胞数培養物をインビトロシステムに移植することであって、前記インビトロシステムは、２Ｄ又は３Ｄインビトロモデルシステムである、移植することと、
（ｉｉｉ）前記インビトロシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理することと、
（ｉｖ）前記個々の細胞を評価して、前記持続時間の終了時に、前記インビトロシステムにおける前記複数の細胞型の各々の前記個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現を決定することと、
（ｖ）前記インビトロシステムにおける前記複数の細胞型の各々の前記個々の細胞の前記表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現と、前記候補薬剤で処理されていない同一のインビトロシステムの複数の細胞型の各々の個々の細胞の前記表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現とを比較することによって、前記候補薬剤の影響を決定することと、を含む、方法。

【請求項79】

併用療法における２つ以上の候補薬剤の影響を評価することを含む、請求項７２～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

第１の候補薬剤と第２の候補薬剤との組み合わせの影響を評価することを含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記方法は、前記第１の候補薬剤と前記第２の候補薬剤との薬物相乗効果を評価する、請求項７９又は８０に記載の方法。

【請求項82】

前記方法は、腫瘍成長を抑制する際の前記第１の候補薬剤と前記第２の候補薬剤との前記組み合わせの有効性を評価する、請求項８０又は８１に記載の方法。

【請求項83】

候補薬剤に感受性のある対象亜集団を同定する方法であって、
（ｉ）複数の細胞型を含む、請求項２２～３２又は６２～７１のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物を作成することであって、前記複数の細胞型は、少なくとも２つの異なる対象からの細胞を含む、作成することと、
（ｉｉ）前記平衡細胞数培養物をモデルシステムに移植することと、
（ｉｉｉ）前記モデルシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理することと、
（ｉｖ）前記持続時間の終了時に前記平衡細胞数培養物を評価して、前記平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する前記候補薬剤の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的影響を決定することと、
（ｖ）ステップｉｖ）の前記評価に基づいて、前記候補薬剤に感受性のある前記対象亜集団を同定することと、を含む、方法。

【請求項84】

生物学的経路における候補薬剤標的を同定する方法であって、
（ｉ）請求項２２～３２又は６２～７１のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物を調製することと、
（ｉｉ）前記平衡細胞数培養物をモデルシステムに移植することと、
（ｉｉｉ）前記モデルシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理することと、
（ｉｖ）前記持続時間の終了時に前記平衡細胞数培養物を評価して、前記平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する前記候補薬剤の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的影響を決定することと、
（ｖ）ステップｉｖ）の前記評価に基づいて、前記生物学的経路における前記候補薬剤標的を同定することと、を含む、方法。

【請求項85】

疾患を処置するための候補薬剤の治療有効性を同定する方法であって、
（ｉ）請求項３２～５６のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物を調製することであって、前記異なる細胞型は、疾患を有する２人以上の対象からの細胞を含む、調製することと、
（ｉｉ）前記平衡細胞数培養物をモデルシステムに移植することと、
（ｉｉｉ）前記モデルシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理することと、
（ｉｖ）前記持続時間の終了時に前記平衡細胞数培養物を評価して、前記平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する前記候補薬剤の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的影響を決定することと、
（ｖ）ステップｉｖ）の前記評価に基づいて、前記疾患を処置するための前記候補薬剤の前記治療有効性を決定することと、を含む、方法。

【請求項86】

前記得られた平衡細胞数培養物を評価して、前記平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する前記候補薬剤の遺伝的及びトランスクリプトーム的影響を決定することは、
（ｉ）前記得られた平衡細胞数培養物の細胞を単一細胞に解離させることと、
（ｉｉ）前記得られた平衡細胞数培養物を残す２つ以上の異なる細胞型の各々の細胞の数を計数することと、
（ｉｉｉ）各細胞型の候補薬剤が誘導した１つ以上の遺伝子発現変化を決定することと、
（ｉｖ）各個々の細胞の前記計算された候補薬剤が誘導した遺伝子発現変化に基づいて、各遺伝子についての重み付けスコアを、候補薬剤感受性に対するその予測された関連性に基づいて与えることと、
（ｖ）ステップｉｖ）の前記重み付けスコアに基づいて、前記平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する前記候補薬剤の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的影響を決定することと、を含む、請求項７２、７３、又は７５～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記候補薬剤は、治療的摂動を引き起こす薬剤である、請求項７２、７３、又は７５～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記候補薬剤は、小分子、抗体、ペプチド、遺伝子エディタ、又は核酸アプタマーから選択される薬剤である、請求項７２、７３、又は７５～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的影響を決定することは、請求項２２～３１又は６１～６９のいずれか一項に記載の平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する、又は請求項３２～６０のいずれか一項に記載の方法によって調製される平衡細胞数培養物に対する前記候補薬剤の効果を評価することを含む、請求項７２、７３、又は７９～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する前記候補薬剤の前記効果は、前記候補薬剤によって処理された前記平衡細胞数培養物の個々の細胞の遺伝子発現を計算することによって評価され、前記遺伝子発現を、前記候補薬剤によって処理されていない同一の平衡細胞数培養物の個々の細胞の前記遺伝子発現と比較する、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

前記平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する前記候補薬剤の前記効果は、前記候補薬剤によって処理された前記平衡細胞数培養物の個々の細胞のトランスクリプトーム的発現を決定することによって評価され、前記トランスクリプトーム的発現を、前記候補薬剤によって処理されていない同一の平衡細胞数培養物の個々の細胞の前記遺伝子発現と比較する、請求項８９又は９０に記載の方法。

【請求項92】

前記平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する前記候補薬剤の前記効果は、前記候補薬剤によって処理された前記平衡細胞数培養物中の前記２つ以上の異なる細胞型の前記細胞型の各々の生存可能な個々の細胞の数を計数し、前記候補薬剤によって処理されていない同一の平衡細胞数培養物中の前記２つ以上の異なる細胞型の前記細胞型の各々の生存可能な個々の細胞の数を比較することによって評価される、請求項８９～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

遺伝的影響を評価することは、前記持続時間の終了時に、前記平衡細胞数培養物中の細胞の単一細胞ＲＮＡ配列決定を含む、請求項７２、７３、又は７９～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

表現型の変化を評価することは、前記持続時間の終了時に、前記２つ以上の異なる細胞型の前記細胞型の各々の生存可能な個々の細胞の数を計数することを含む、請求項７２、７３、又は７９～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

トランスクリプトーム的影響を評価することは、前記持続時間の終了時に、前記平衡細胞数培養物中の細胞の単一細胞トランスクリプトームプロファイルを決定することを含む、請求項７２、７３、又は７９～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記持続時間は、６時間～４５日間、１２時間～３０日間、２４時間～２０日間、又は７２時間～１４日間である、請求項７２、７３、又は７４～９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記持続時間が、少なくとも２４時間である、請求項７２、７３、又は７４～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記持続時間は、１４日間である、請求項７２、７３、又は７４～９７のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／２２５，２０９号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

政府支援の言明
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された助成金番号Ｒ００ ＣＡ１９４０７７の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に特定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

創薬コストの上昇及び治療分子の発見におけるリターンの減少の最近の現象は、創薬科学の基礎に起因する可能性がある。具体的には、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、新しい分子発見のためのゴールドスタンダードであり続けている。しかしながら、ＨＴＳの主要な制限は、その人工的な性質であり、インビトロ生化学的又は細胞ベースのアッセイでのみ可能である。インビトロ生化学的又は細胞ベースのアッセイは、前臨床インビボ研究が後に続き、インビボでの治療薬候補パフォーマンスを予測するための十分な薬理学的及び毒性データ又は信頼性の高い予測能力を提供することができず、薬物開発プロセスを高価かつ非効率的にする。本開示は、インビボ及びエクスビボモデルシステム、並びにスケーラブルなＨＴＳスクリーニングを実施するためのそのようなシステムを作成する方法を提供する。

【発明の概要】

【0004】

平衡細胞数培養物、及びそれを作成する方法、候補薬剤の１つ以上の治療特性を評価するための方法が提供される。方法は、三次元で異なる細胞型の細胞の不均一プールを成長させることと、小分子化合物で三次元プールを処理することと、処理された三次元プールの細胞を、単一細胞ＲＮＡ配列決定に好適な細胞型の等しい表現を有する単一細胞懸濁液に解離させることと、を含む。方法は、解離された単一細胞及び小分子化合物で処理されていない対照三次元プールからの解離された単一細胞に対して単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）配列決定を実施することと、単一細胞ＲＮＡ配列決定からのデータを、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームにデコンボリュートすることと、分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価することと、を更に含む。また、例えば、本開示の方法を実践する際の使用を見出すコンピュータ可読媒体及びシステムも提供される。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1】図１Ａ～１Ｇは、非ＧＥＮＥＶＡ細胞プールとＧＥＮＥＶＡ細胞プールとの細胞組成の比較を実証する。図１Ａは、単一細胞ＲＮＡ配列決定採取に基づく、非ＧＥＮＥＶＡ細胞プール（プール１）からの細胞表現の分布を実証する。棒は、各細胞型についてのｓｃＲＮＡｓｅｑデータセット内の細胞の数を示す。図１Ｂは、ＵＭＡＰクラスタリング視覚化アルゴリズムを使用して二次元トランスクリプトーム空間にプロットされた図１Ａからのデータセットを示す。図１Ｃは、データセット内の各細胞株の正確な捕捉を可能にする、ＧＥＮＥＶＡ細胞プール（プール２）からの単一細胞ＲＮＡ配列決定採取時の細胞表現の分布を示す。図１Ｄは、ＧＥＮＥＶＡプール２のＵＭＡＰプロットとしてプロットされた単一細胞ＲＮＡ配列決定データを示す。図１Ｅは、データセット内の各細胞株の正確な捕捉を可能にする、ＧＥＮＥＶＡ細胞プール（プール３）からの単一細胞ＲＮＡ配列決定採取時の細胞表現の分布を示す。図１Ｆは、ＧＥＮＥＶＡプール３のＵＭＡＰプロットとしてプロットされた単一細胞ＲＮＡ配列決定データを示す。図１Ｇは、プール１～３の外挿を示す。単一細胞ＲＮＡ配列決定に必要とされる細胞の総数は、プール２及びプール３と比較して、プール１において有意に高い。

【図2】図２Ａ～Ｆは、複数のインビボ及びエクスビボモデルシステムにおけるＧＥＮＥＶＡの利用を実証する。図２Ａは、数回の用量のＡＲＳ１６２０（０．４ｕＭ、１．６ｕＭ、２５．０ｕＭ）又はＤＭＳＯ（ビヒクル）で処理した４つの異なるヒトＰＤＸ腫瘍をインプットとして用いて、エクスビボのオルガノイドとして成長したＧＥＮＥＶＡプールを実証する。図２Ａは、ＵＭＡＰクラスタリング視覚化アルゴリズムを使用して、二次元トランスクリプトーム空間にプロットされる。図２Ｂは、薬物処理条件及び起源の遺伝子型（ＰＤＸ）によって分類された表として、図２Ａからのデータセットを示す。表内の細胞は、各カテゴリーについて単一細胞ＲＮＡ配列決定によって得られた細胞数である。図２Ｃは、ＡＲＳ１６２０（１００ｍｇ／ｋｇ）又はＤＭＳＯ（ビヒクル）のいずれかで処理した４つの異なるヒトＰＤＸ腫瘍をインプットとして用いて、インビボで脇腹異種移植片として成長したＧＥＮＥＶＡプールを実証する。図２Ｃは、ＵＭＡＰクラスタリング視覚化アルゴリズムを使用して、二次元トランスクリプトーム空間にプロットされる。図２Ｄは、薬物処理条件及び起源の遺伝子型（ＰＤＸ）によって分類された表として、図２Ｃからのデータセットを示す。表内の細胞は、各カテゴリーについて単一細胞ＲＮＡ配列決定によって得られた細胞数である。図２Ｅは、ＡＲＳ１６２０（１００ｍｇ／ｋｇ）又はＤＭＳＯ（ビヒクル）のいずれかで処理した８つのサブの異なるヒトがん細胞株をインプットとして用いて、インビボで脇腹異種移植片として成長したＧＥＮＥＶＡプールを実証する。図２Ｅは、ＵＭＡＰクラスタリング視覚化アルゴリズムを使用して、二次元トランスクリプトーム空間にプロットされる。図２Ｆは、薬物処理条件及び起源の遺伝子型（ＰＤＸ）によって分類された表として、図２Ｅからのデータセットを示す。表内の細胞は、各カテゴリーについて単一細胞ＲＮＡ配列決定によって得られた細胞数である。

【図3】図３Ａ～Ｅは、薬物化合物、遺伝的ドライバー、及びＩＣ５０曲線再構築に対する相対的な表現型の発見のためのＧＥＮＥＶＡの利用を実証する。図３Ａは、ベムラフィニブ又はＡＲＳ１６２０で処理したＧＥＮＥＶＡプールから細胞数に対する薬物処理前／後から計算された個々の細胞型の相対感受性を実証する。ベムラフィニブ処理プールにおける最も感受性の高い細胞株は、ＢＲＡＦ．Ｖ６００Ｅ変異体保有である。最も感受性の高い細胞株ＡＲＳ１６２０処理プールは、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ変異体保有である。図３Ｂは、ラッソ回帰モデルを使用して、ＧＥＮＥＶＡプールにおける相対薬物感受性の変化に関与する原因となるドライバー変異の発見を実証する。ＢＲＡＦ．Ｖ６００Ｅは、ラッソアルゴリズムによって、ベムラフィ二ブに対する薬物感受性を引き起こす原因となる変異として予測される。ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃは、ラッソアルゴリズムによって、ＡＲＳ１６２０に対する薬物感受性を引き起こす原因となる変異として予測される。図３Ｃは、ＡＲＳ１６２０の有無にかかわらず処理後のＧＥＮＥＶＡ細胞プールデータからのＩＣ５０曲線の再構築を、相対生存率のスケーリングされた尺度に適合させた細胞数及び補間されたＩＣ５０ロジスティック回帰曲線で実証する。ＩＣ５０曲線は、個々の細胞株から構築され、非ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ細胞株は、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ細胞株よりもＡＲＳ１６２０に対する有意に高い生存率を示す。図３Ｄは、ＧＥＮＥＶＡプール内の異なる細胞株からの相対的な薬物感受性測定値を実証し、それによって、ＡＲＳ１６２０の感作変異標的としてのＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃの発見を再現する。図３Ｅは、プールされたオルガノイドとして成長したＰＤＸで実施されたＧＥＮＥＶＡからの細胞周期阻害率の計算を実証する。この再構築方法は、表現型の測定値として周期状態推論を使用した細胞計数の代替方法によって、ＡＲＳ－１６２０処理に対するＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ特異的薬物感受性を再現する。

【図4】図４Ａ～Ｄは、併用療法及び薬物耐性機構の予測のためのＧＥＮＥＶＡの利用を実証する。図４Ａは、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ特異的に、ＡＲＳ１６２０で処理したＧＥＮＥＶＡプールにおける細胞生存機構を示すいくつかの薬物耐性標的の上方制御をＧＥＮＥＶＡが発見することを実証する。図４Ｂは、ｉ）３つのＡＲＳ１６２０阻害剤、及びｉｉ）特定の薬物耐性経路を標的とする化合物と組み合わせて薬物標的を投与することによる、予測される薬物標的の検証を実証する。ブリス薬物相乗効果がプロットされ、いくつかの化合物は、複数のＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ阻害剤との有意な薬物相乗効果を示す。図４Ｃは、Ｈ１３７３ ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ変異株（条件ごとにｎ＝４～５匹のマウス）を使用したマルチアーム併用療法におけるＡＲＳ１６２０及びＩＮＫ１２８のインビボマウス研究からの相対腫瘍体積を実証する。図４Ｄは、ＩＮＫ１２８及びＡＲＳ１６２０の非依存性又は薬物相乗効果なしのヌルモデルと比較して、ＩＮＫ１２８及びＡＲＳ１６２０がインビボで相乗的に腫瘍成長を低下させることを実証する。

【図5】図５Ａ～Ｃは、内皮－間葉系遷移（ＥＭＴ）経路を介した薬物耐性のインビボ特異的機構の予測のためのＧＥＮＥＶＡの利用を実証する。図５Ａは、細胞プール内のＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ細胞株のＡＲＳ１６２０処理の対のインビボ及びインビトロＧＥＮＥＶＡ実験において、ＥＭＴ遺伝子セットがインビトロではなくインビボで薬物処理後に上方制御されたことを実証する。図５Ｂは、Ｈ１３７３ ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ変異株（条件ごとにｎ＝４～５匹のマウス）を使用したマルチアーム併用療法における、ＡＲＳ１６２０及びＥＭＴ阻害剤であるガルニセルチブのインビボマウス研究からの相対腫瘍体積を実証する。図５Ｃは、ガルニセルチブ及びＡＲＳ１６２０の非依存性又は薬物相乗効果なしのヌルモデルと比較して、ガルニセルチブ及びＡＲＳ１６２０がインビボで相乗的に腫瘍成長を低下させることを実証する。

【図6】図６Ａ～Ｅは、ミトコンドリア遺伝子に対する化合物の作用の分子機構の発見のためのＧＥＮＥＶＡの利用を実証する。図６Ａは、ＡＲＳ１６２０処理後の非ミトコンドリア遺伝子転写物の遺伝子発現と比較して、ミトコンドリア的にコードされ、ゲノム的にコードされたミトコンドリア標的化転写物のＧＥＮＥＶＡプールにおけるＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ株にわたる集約された遺伝子発現をプロットする。ミトコンドリア的にコードされた遺伝子及びゲノム的にコードされたミトコンドリア常駐遺伝子は、ＡＲＳ１６２０処理後に生存する細胞において有意に下方制御される。図６Ｂは、ＧＥＮＥＶＡ細胞プール内の各個々のＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ細胞株についてのＡＲＳ１６２０処理後のｍｉｔｏコードされた転写産物の遺伝子発現をプロットする。図６Ｃは、Ｈ２０３０（ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ）からの長期ＡＲＳ１６２０寛容細胞株（３０日処理、１０ｕＭ）の生成及びプロファイリングを実証する。Ｈ２０３０薬物持続性細胞株と元の親細胞株との間の蛍光ミトコンドリア染色（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ）を用いたミトコンドリア含有量のアッセイは、ＡＲＳ１６２０による長期薬物処理後のミトコンドリア含有量の減少を示す。図６Ｄは、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ阻害剤ＡＭＧ５１０が、ＡＭＧ５１０処理後（２時間）のＨ２０３０（ＫＲＡＳ．Ｇ１２ｃ）細胞の酸素消費量を測定するシーホースアッセイを使用して、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ阻害の新規の致死性機構として、ミトコンドリア呼吸及び電子伝達鎖活性を増加させることを実証する。図６Ｅは、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ細胞株の亜集団構造が、ＡＲＳ１６２０による後処理後のミトコンドリアリードの数が少ない細胞型の選択を示すことを実証する。

【図7】図７Ａ～Ｇは、フェロトーシス遺伝子に対する化合物の作用の分子機構の発見のためのＧＥＮＥＶＡの利用を実証する。図７Ａは、ＡＲＳ１６２０を薬物投与されたＧＥＮＥＶＡプールからの複数のＧ１２Ｃ株にわたって集約されたＺスコア差を示す火山プロットをプロットし、抗フェロトーシス遺伝子の共有上方制御を実証する。図７Ｂは、ＡＲＳ１６２０投与量の増加に応答して、各細胞株の抗フェロトーシス遺伝子の遺伝子発現をプロットする。図７Ｃは、蛍光脂質過酸化センサを使用したフェロトーシスの実験的調査を利用して、ＡＲＳ１６２０投与量（４８時間）に対する脂質過酸化細胞の用量応答を実証する。図７Ｄ、Ｅ、Ｆは、図７ＦのＡＲＳ１６２０と比較して、図７Ｄの既知の強誘導体剤アルトレタミン、図７Ｅのエラスチンにわたる生存及び脂質過酸化動態を実証する。脂質過酸化及び生存動態は、ＡＲＳ１６２０がフェロトーシス誘導剤として実施することを示す全ての化合物において、ＩＣ５０付近で交差する。図７Ｇは、複数のＫＲＡＳ阻害剤が、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ細胞株Ｈ２０３０において脂質過酸化を特異的に誘導するが、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｖ細胞株Ｈ４４１においてそれほど多くは誘導しないことを実証する。

【図8】図８Ａ～Ｄは、インビボでの細胞プールに複数の共投与化合物を組み込んだ併用療法のＧＥＮＥＶＡ試験を実証する。図８Ａは、ＵＭＡＰクラスタリング視覚化アルゴリズムを使用して二次元トランスクリプトーム空間にプロットされた、起源細胞株及び薬物処理条件によって分類されたＫＲＡＳ．Ｇ１２変異株におけるＣＬＸプールを使用したＧＥＮＥＶＡ併用療法研究を実証する。処理条件としては、アンチマイシン、ＡＲＳ１６２０、ガルニセルチブ、ＩＮＫ１２８、ＤＭＳＯ、ＡＲＳ１６２０＋アンチマイシン、ＡＲＳ１６２０＋ガルニセルチブ、ＡＲＳ１６２０＋ＩＮＫ１２８が挙げられる。図８Ｂは、各薬物条件における細胞周期状態について単独で、及び薬物条件にわたるＧ１２Ｃ株について推定された組み合わせで実施された相乗効果計算のために、図８ＡからのＧＥＮＥＶＡデータを利用する。図８Ｃ～Ｄは、遺伝子レベルの相乗効果を推定する多因子線形モデルを使用して、ＡＲＳ１６２０と組み合わせたガルニセルチブ（図８Ｃ）及びＩＮＫ１２８（図８Ｄ）の相乗薬物効果を駆動する遺伝子の同定を実証し、相乗薬物効果を駆動するミトコンドリア転写物を明らかにする。

【図9】図９Ａ～Ｂは、遺伝子逆多重化改善アルゴリズム及びＧＥＮＥＶＡ法によるＡＲＳ１６２０に応答する患者の新規遺伝子型の同定を実証する。図９Ａは、Ｔｏｔａｌｓｅｑ標識された単一細胞ＲＮＡ配列決定データセットからのパーセント表現の標準方法に対する、遺伝子逆多重化脱ノイズアルゴリズム比較による細胞付与信頼性の改善を実証する。信頼度の高いメトリックは、点線、又はノイズ補正アルゴリズムの結果に記載されている。図９Ｂは、ＡＲＳ１６２０の有無にかかわらず薬剤化されたＧＥＮＥＶＡプールが、最も薬物感受性の高い腫瘍型としてＥＭＬ４－ＡＬＫの感受性を実証したことをプロットしており、各棒は、ＡＲＳ１６２０の処理又はビヒクル下でのその遺伝子型の相対生存率である。

【発明を実施するための形態】

【0006】

本開示の方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムがより詳細に記載される前に、方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムは、記載された特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら変え得ることを理解されたい。また、方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムの範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定することが意図されるものではないことも理解されるべきである。

【0007】

値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各中間値、及びこの記載の範囲内の任意の他の記載される値又は中間値が、方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムに包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、個別により小さい範囲に含まれてもよく、記載の範囲において任意の具体的に除外された限界に従って、同様に方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムに包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も、同様に方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムに含まれる。

【0008】

本明細書では、数値の前に「約」という用語が付けられて、特定の範囲が提示される。本明細書では、「約」という用語は、それが先行する正確な数、及びその用語が先行する数に近い、又は近似する数について文字どおりの支持を提供するために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近いか、又は近似するかどうかを決定するとき、その近い又は近似する列挙されない数は、それが提示されている文脈において、具体的に列挙されている数の実質的な等価物を提供する数であり得る。

【0009】

別段の定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムが属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムも、方法、コンピュータ可読媒体、及びシステム、代表的な例示的な方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムの実施又は試験に使用され得る。

【0010】

本明細書で引用される全ての刊行物及び特許は、あたかも各個々の刊行物又は特許が参照によって組み込まれるように具体的かつ個々に示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれ、参照によって本明細書に組み込まれることによって、それらの刊行物が引用される関連した材料及び／又は方法を開示及び記載する。任意の刊行物の引用は、出願日以前のその開示についてのものであり、提示された刊行物の日付が、別個に確認される必要があり得る実際の刊行日と異なる場合があるため、本方法、コンピュータ可読媒体及びシステムがそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。

【0011】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、あらゆる任意選択的な要素を排除するように設計され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「単独で」、「のみ」などのそのような排他的な用語の使用、又は「否定的」限定の使用の先行詞として機能することが意図される。

【0012】

別個の実施形態の文脈で記載されるものである方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムの特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されるものである方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムの様々な特徴はまた、別々に又は任意の好適な下位組み合わせで提供され得る。実施形態の全ての組み合わせが本開示によって具体的に包含され、そのような組み合わせが操作可能なプロセス及び／又は組成物を包含する限り、各々及び全ての組み合わせが個別に明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、そのような変数を記載する実施形態に列挙された全ての下位組み合わせはまた、本方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムによって具体的に包含され、各々及び全てのそのような下位組み合わせが個別に及び明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。

【0013】

本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載及び例証される別個の実施形態の各々は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、又はこれらと組み合わされ得る別個の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。

【0014】

方法
一態様において、本開示は、平衡細胞数培養物及び平衡細胞数培養物を作成する方法を提供する。一態様では、本開示は、候補薬剤、例えば、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価するための方法を提供する。方法は、三次元で異なる細胞型の細胞の不均一なプールを成長させることと、小分子化合物で三次元プールを処理することと、異なる細胞型からの細胞の等しい表現を可能にする方法で、処理された三次元プールの細胞を単一細胞に解離させることと、を含む。方法は、解離された単一細胞及び小分子化合物で処理されていない対照三次元プールからの解離された単一細胞に対して単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）配列決定を実施することと、単一細胞ＲＮＡ配列決定からのデータを、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームにデコンボリュートすることと、分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価することと、を更に含む。

【0015】

本方法は、細胞を一緒に混合し、それらを一緒に薬剤化し、次いで、単一細胞ＲＮＡ配列決定を使用して薬物処理後細胞株を読み出すことによって、これに対処する。このようにして、観察単位を単一細胞に減らし、細胞株を一緒に混合／多重化することによって、本方法は、多数の小分子に対する多数の表現型／遺伝子型の異なる細胞株のアッセイを可能にする。得られた単一細胞ＲＮＡ配列決定データを、異なるモデルを使用して分析して、生物学的標的、有効な相乗的併用療法標的、疾患サブタイプの層別化などを発見する。

【0016】

本開示の方法の実施形態は、単一細胞ＲＮＡ配列決定結果として図２に提供される。この例では、異なる患者、臓器系、及び／又は疾患モデル／サブタイプからの細胞型の大きなパネルを一緒に混合して、プールを作成する。次いで、プールを、インビボ（例えば、動物モデル、例えば、マウスで異種移植片を産生する）又はエクスビボ（例えば、オルガノイドを産生する）で三次元で成長させる。次いで、三次元プールを、化合物が三次元プールのメンバー（細胞）に作用するのに好適な条件下で、目的の研究用小分子化合物で処理する。薬物送達方法は、三次元プールのタイプ、例えば、三次元プールがインビボ異種移植片である場合の全身注射などに応じて変化する。次に、処理された三次元プールを採取し、単一細胞に解離させ、次いで単一細胞ＲＮＡ配列決定に供する。表現型の変化は、各細胞型についての個々の生存細胞の数を計数し、それを、目的の研究用小分子化合物で処理されていない同一の三次元プールからの各細胞型についての生存細胞の数と比較することによって留意される。次いで、単一細胞配列決定データをモデリング及び／又はトランスクリプトーム分析に供して、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価し、その非限定的な例としては、作用機構（ＭＯＡ）、併用療法（臨床併用療法として有効であろう薬物）、及びサブタイプ層別化（異なる患者群又はサブタイプにおける有効性）が挙げられる。

【0017】

上記に要約されるように、本開示の方法は、三次元で異なる細胞型の細胞のプールを成長させることを含む。ある特定の実施形態では、異なる細胞型の細胞のプールは、１０００個以下、５００個以下、２５０個以下、又は１００個以下であるが、２つ以上、５つ以上、１０個以上（例えば、１０～５０個）、２０個以上、３０個以上、４０個以上、又は５０個以上の異なる細胞型を含む。

【0018】

異なる細胞型の細胞は、目的の任意の細胞型から選択され得、どの細胞型であるかは、目的の特定の小分子化合物、評価される小分子の１つ以上の治療特性などに応じて異なり得る。いくつかの実施形態によれば、異なる細胞型の細胞のプールは、患者から得られた初代細胞、臓器系からの細胞、疾患モデルからの細胞、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

【0019】

患者から得られた細胞には、患者から得られた生検組織からの細胞が含まれるが、これらに限定されない。生検組織は、健康な組織、又は、例えばがん組織を含む病変組織から得られ得る。がんの種類及び／又は実施される生検の種類に応じて、細胞は、固形組織生検又は液体生検からであり得る。いくつかの例では、細胞は、外科生検から調製され得る。例えば、切除生検、切開生検、ワイヤ局在化生検などを含むが、これらに限定されない、本明細書に記載の方法で使用される細胞の収集のために、外科的生検のための任意の便利で適切な技術を利用してもよい。いくつかの例では、外科的生検は、例えば、腫瘍切除、乳房切除、リンパ節手術、腋窩リンパ節解離、センチネルリンパ節手術などを含むが、これらに限定されない、試料を得ること以外の主要な目的を有する外科的処理の一部として得ることができる。

【0020】

様々な他の生検技術を用いて、生検組織を得ることができ、次に、本開示の方法で用いられる細胞を得ることができる。非限定的な例として、試料は、針生検によって得ることができる。例えば、細針吸引（ＦＮＡ）、コア針生検、定位コア生検、真空支援生検などを含むが、これらに限定されない、針生検のための任意の便利で適切な技術を、試料の収集に利用することができる。

【0021】

臓器系からの細胞としては、皮膚、脳、心臓、腎臓、肝臓、胃、大腸、肺などから選択される臓器系からの細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、臓器系からの細胞には、副腎、肛門、虫垂、膀胱（泌尿器）、骨、骨髄、脳、気管支、横隔膜、耳、食道、目、卵管、胆嚢、生殖器、心臓、視床下部、関節、腎臓、大腸、喉頭、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、腸間膜、口、鼻腔、鼻、卵巣、膵臓、松果体、副甲状腺、咽頭、下垂体、前立腺、直腸、唾液腺、骨格筋、平滑筋、皮膚、小腸、脊髄、脾臓、胃、歯、胸腺、甲状腺、気管、舌、尿管、尿道、靭帯、腱、髪の毛、前庭系、胎盤、精巣、精管、精嚢、尿道球腺、副甲状腺、胸管、動脈、静脈、毛細血管、リンパ管、扁桃腺、ニューロン、皮下組織、嗅上皮（鼻）、小脳、及びそれらの任意の組み合わせから選択される臓器系からの細胞が含まれ得る。

【0022】

疾患モデルからの細胞としては、がん（例えば、１つ以上の異なるがん細胞株からの細胞）、心血管疾患、脳血管疾患（例えば、脳卒中、一過性虚血発作、くも膜下出血、血管性認知症など）、呼吸器疾患、感染症、神経変性疾患、認知症、アルツハイマー病、糖尿病、腎臓病、肝臓病（例えば、肝硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、及びそれらの任意の組み合わせから選択される疾患をモデル化する細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0023】

いくつかの実施形態によれば、異なる細胞型の細胞は、１つ以上のがん細胞株からの細胞を含む。「がん細胞」とは、腫瘍性細胞表現型を示す細胞を意味し、これは、例えば、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、密度依存性成長阻害の喪失、固定非依存性成長可能性、免疫不全の非ヒト動物モデルにおける腫瘍成長及び／又は発達を促進する能力、並びに／又は細胞形質転換の任意の適切な指標のうちの１つ以上を特徴とし得る。「がん細胞」は、本明細書では「腫瘍細胞」、「悪性細胞」、又は「がん性細胞」と互換的に使用することができ、固形腫瘍、半固形腫瘍、血液悪性腫瘍（例えば、白血病細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞など）、原発腫瘍、転移性腫瘍などのがん細胞を包含する。

【0024】

異なる細胞型の細胞が１つ以上のがん細胞株からの細胞を含む場合、１つ以上のがん細胞株は、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、胆管がん、膀胱がん、肝臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝臓がん、様々な種類の頭頸部がんなどから独立して選択されるがんに由来し得る。ある特定の実施形態では、１つ以上のがん細胞株は、固形腫瘍、多形性再発性膠芽腫（ＧＢＭ）、非小細胞肺がん、転移性黒色腫、黒色腫、腹膜がん、上皮性卵巣がん、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、転移性結腸直腸がん、結腸直腸がん、膵管腺がん、扁平上皮がん、食道がん、胃がん、神経芽腫、卵管がん、膀胱がん、転移性乳がん、膵臓がん、軟組織肉腫、再発性頭頸部がん扁平上皮がん、頭頸部がん、未分化星状細胞腫、悪性胸膜中皮腫、乳がん、扁平非小細胞肺がん、横紋筋肉腫、転移性腎細胞がん、基底細胞がん腫（基底細胞上皮腫）、及び神経膠肉腫から独立して選択されるがんに由来し得る。ある特定の実施形態では、１つ以上のがん細胞株は、黒色腫、ホジキンリンパ腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、膀胱がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、及び頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）から独立して選択されるがんに由来し得る。いくつかの実施形態によれば、異なる細胞型の細胞は、ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅで入手可能なＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）に記載されている１つ以上のがん細胞株からの細胞を含む。

【0025】

いくつかの実施形態によれば、異なる細胞型の細胞は、１つ以上の異なる型の幹細胞からの細胞を含む。異なる細胞型の細胞の中に含まれ得る幹細胞の非限定的な例としては、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0026】

上記に要約されるように、本開示の方法は、三次元で異なる細胞型の細胞のプールを成長させることを含む。ある特定の実施形態では、異なる細胞型の細胞のプールは、少なくとも部分的にインビボで三次元で成長させる。１つの非限定的な例によれば、プールを三次元で成長させることは、プールから異種移植片を産生することを含む。本明細書で使用される場合、「異種移植片」は、異なる種のレシピエントに移植された１つの種からの組織（細胞移植片、例えば、細胞株移植片を含む）である。ある特定の実施形態では、ドナー種は、ヒトであり、レシピエント動物は、マウス、ラット、ブタなどである。レシピエント動物は、免疫不全（例えば、無胸腺ヌードマウス、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス、非肥満（ＮＯＤ）－ｓｃｉｄマウス、組換え－活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）－ノックアウトマウスなど）であり得る。レシピエント動物が齧歯類（例えば、マウス又はラット）であるとき、異種移植片の産生は、例えば、尾静脈注射による、レシピエント齧歯類への異なる細胞型の細胞のプールの非経口注射を含み得る。いくつかの実施形態によれば、異種移植片は、細胞株由来異種移植片（ＣＤＸ）、例えば、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、又は２５個以上）の異なる細胞株由来の細胞を含む異種移植片であり、その非検定的な例としては、腫瘍細胞株が挙げられる。ある特定の実施形態では、異種移植片は、患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）、例えば、１人以上の異なる患者、例えば、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、又は２５人以上の異なる患者からの初代細胞（例えば、原発腫瘍細胞）を含む異種移植片である。初代細胞は、いくつかの例では、本明細書の他の場所に記載されているような生検を介して得ることができる。

【0027】

ある特定の実施形態では、異なる細胞型の細胞のプールは、少なくとも部分的にエクスビボで三次元に成長させる。「エクスビボ」という用語は、生体から得られた試料（例えば、組織又は細胞など）内又はその上で行われる処理、実験、及び／又は測定を指すために使用され、この処理、実験、及び／又は測定は、生体の外部の環境で行われる。したがって、細胞に適用される「エクスビボ操作」という用語は、細胞を培養すること、細胞に１つ以上の遺伝子改変を行うこと、及び／又は細胞を１つ以上の薬剤に曝露することを含むが、これらに限定されない、生物の外部の細胞の任意の処理を指す。したがって、エクスビボ操作は、本明細書では、動物の外で実施される細胞の、例えば、そのような細胞が動物又はその臓器から得られた後の処理を指すために使用され得る。「エクスビボ」とは対照的に、「インビボ」という用語は、本明細書で使用される場合、動物、例えば、齧歯類（例えば、マウス又はラット）、ブタなどの中にある細胞を指す。

【0028】

ある特定の実施形態では、異なる細胞型の細胞のプールは、少なくとも部分的にインビトロで三次元で成長させる。いくつかの実施形態によれば、三次元で成長した異なる細胞型の細胞のプールは、インビトロでオルガノイドに成長される。「オルガノイド」とは、対応するインビボ臓器を模倣し得る三次元（３Ｄ）多細胞インビトロ又はエクスビボ組織構築物を意味する。オルガノイドは、３Ｄバイオプリントされた足場、臓器チップ、マイクロ流体工学ベースの３Ｄ細胞培養モデルなどを含むが、これらに限定されない、様々な種類の利用可能な３Ｄ細胞培養システムを介して作成され得る。いくつかの実施形態によれば、三次元で成長した異なる細胞型の細胞のプールは、インビトロでスフェロイドに成長される。オルガノイドは、腸、胃、腎臓、肝臓、膵臓、乳腺、前立腺、上下気道、甲状腺、網膜、及び脳を含むが、これらに限定されない、生検試料から直接供給される組織常駐成体幹細胞（ＡＳＣ）、又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）若しくは誘導ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）からのいずれかの、増加する多様な臓器のために確立することができる。ある特定の実施形態では、三次元で成長した異なる細胞型の細胞のプールは、例えば、１つ以上（例えば、２つ以上）の異なる生検試料から組織由来のオルガノイドに成長する。幹細胞由来及び組織由来オルガノイドを産生するためのアプローチは、例えば、Ｈｏｆｅｒ＆Ｌｕｔｏｌｆ（２０２１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ６：４０２～４２０に既知であり、記載されている。

【0029】

異なる細胞型の細胞のプールが三次元で成長すると、三次元プールは小分子化合物で処理される。「小分子」化合物とは、１０００原子質量単位（ａｍｕ）以下の分子量を有する化合物（例えば、有機化合物）を意味する。いくつかの実施形態では、小分子は、９００ａｍｕ以下、７５０ａｍｕ以下、５００ａｍｕ以下、４００ａｍｕ以下、３００ａｍｕ以下、又は２００ａｍｕ以下である。ある特定の態様では、小分子は、ポリマーに存在するような繰り返し分子単位から作られていない。いくるかの実施形態によれば、小分子化合物は、既知の治療剤である。「治療剤」又は「薬物」とは、哺乳動物又はヒトなどの動物の標的部位で所望の生物学的効果を生み出すことができる生理学的又は薬理学的に活性な物質を意味する。治療剤は、任意の無機又は有機化合物であり得る。治療剤は、哺乳動物又はヒトなどの動物における疾患、障害、又は細胞増殖の発症又は進行を低下、抑制、減弱化、減少、停止、又は安定化させることができる。いくつかの実施形態では、小分子化合物は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）及び／又は欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって、本明細書の他の箇所に記載される疾患、例えば、がん、心血管疾患、脳血管疾患、呼吸器疾患、感染症、神経変性疾患、認知症、アルツハイマー病、糖尿病、腎臓病、肝臓病などのいずれかを含むがこれらに限定されない１つ以上の疾患を処置する際の治療剤として使用するために承認されたものである。

【0030】

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、三次元プールを、小分子化合物のライブラリからの小分子化合物で処理することを含む。例えば、小分子化合物は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（ＦＤＡ及び／又はＥＭＡによって承認された１２８０の構造的に多様な生体活性の細胞透過性の化合物のコレクション、又はいくつかの臨床段階にある、又はこれまでにあった１６００の構造的に多様な薬学的に活性の細胞透過性の化合物のコレクション）、ＣｈｅｍＤｉｖのマスターＰＰＩライブラリ（天然生成物ベースの、３Ｄ模倣物、大環状分子、ヘリックスターン模倣物、トリペプチド模倣物、３Ｄ多様性天然生成物のような、及びＢｅｙｏｎｄ平地を含む７つのサブセットを含む２０，０００の多様な計算的に選択された分子）、ＭａｙＢｒｉｄｇｅコレクション（１３，０００の化学的に多様な化合物のセット）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＤＩＶＥＲＳｅｔ－ＣＬ（治療開発の可能性が高められた５０，０００の小分子のコレクション）、ＴａｒｇｅｔＭｏｌ（ＮＵ－ＨＴＡの既存のＦＤＡ承認及び臨床コレクションを拡大及び補完するために選択された３２００の構造的に多様な薬学的に活性の細胞透過性のある化合物のコレクション）、及び／又は目的の任意の他の小分子化合物ライブラリを含むが、これらに限定されないライブラリからであり得る。

【0031】

三次元プールが小分子化合物で処理される方法は、三次元プールの文脈に応じて異なる。異なる細胞型の細胞を含む異種移植片である三次元プールの文脈では、三次元プールを処理することは、レシピエント動物（例えば、マウス、ラット、ブタなど）に小分子化合物を投与することを含み得る。小分子化合物は、経口（例えば、錠剤形態、カプセル形態、液体形態などで）、非経口（例えば、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、又は硬膜外注射によって）、局所、鼻腔内、又は異種移植片内投与から選択される投与経路を介して投与され得る。エクスビボ又はインビトロで維持及び／又は成長したオルガノイド、スフェロイド、又は他の３Ｄ多細胞構造である三次元プールの文脈では、三次元プールを処理することは、三次元プールが存在する細胞培養培地に小分子化合物を添加することを含み得る。プールを小分子化合物で処理する前、その間、及び／又はその後に、三次元プールを成長及び／又は維持するための好適な条件は変化し得る。このような条件は、好適な温度（例えば、３２℃～４２℃、例えば、３７℃）及びｐＨ（例えば、ｐＨ７．０～７．７、例えば、ｐＨ７．４）で、好適な割合のＣＯ_２、例えば、３％～１０％、例えば、５％を有する環境において、好適な容器（例えば、細胞培養プレート又はそのウェル）中、好適な培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２などの細胞培養培地）中で、三次元プールを成長させる及び／又は維持することを含み得る。

【0032】

小分子化合物で三次元プールを処理した後、この方法は、処理された三次元プールの細胞を単一細胞に解離させることを含む。処理された三次元プールの細胞を単一細胞に解離させるための様々な好適なアプローチを用いることができる。例えば、三次元プールが、エクスビボ又はインビトロで維持及び／又は成長したオルガノイド、スフェロイド、又は他の３Ｄ多細胞構造である場合、細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ベース培地中のＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）酵素ブレンド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して三次元プールを消化し、３７℃で回転しながら１時間消化することによって、単一細胞に解離され得る。三次元プールが異種移植片である場合、異種移植片（例えば、腫瘍異種移植片）は、犠牲死させた動物から（例えば、マウスの脇腹から）解剖され、メスを使用して細かく切断され、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ベース培地１０Ｕ／ｕＬのＤＮＡｓｅ Ｉ １ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ中の１Ｘ Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）酵素ブレンドに再懸濁され、３７℃で回転しながら１時間消化され得る。

【0033】

本開示の方法は、解離された単一細胞と小分子化合物で処理されていない対照三次元プールからの解離された単一細胞に対して、単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）配列決定（「単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ」又は「ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ」と称されることもある）を実施することを更に含む。ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）は、生体試料中のメッセンジャーＲＮＡ分子の検出及び定量的分析のためのゲノム的アプローチであり、細胞応答を研究するために有用である。プロテオームを研究するための代用として、いくつかの研究は、その発現が細胞形質及び細胞状態の変化とよく相関する、タンパク質コード、ｍＲＮＡ分子（「トランスクリプトーム」と総称される）に目を向けている。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑは、個々の細胞のトランスクリプトームの比較を可能にする。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのための様々な好適なアプローチが利用可能であり、その非限定的な例としては、Ｃ１（ＳＭＡＲＴｅｒ）（例えば、Ｐｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：１０５３～８を参照）、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２（例えば、Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：１０９６～８を参照）、ＭＡＴＱ－ｓｅｑ（例えば、Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：２６７～７０を参照）、ＭＡＲＳ－ｓｅｑ（例えば、Ｊａｉｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：７７６～９を参照）、ＣＥＬ－ｓｅｑ（例えば、Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２：６６６～７３を参照）、Ｄｒｏｐ－ｓｅｑ（例えば、Ｍａｃｏｓｋｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６１：１２０２～１４を参照）、ＩｎＤｒｏｐ（例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６１：１１８７～２０１を参照）、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．８：１４０４９を参照）、ＳＥＱ－ｗｅｌｌ（例えば、Ｇｉｅｒａｈｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：３９５～８を参照）、ＳＰＬＩＴ－ｓｅｑ（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ Ａｌ．（２０１７）ＢｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１０５１６３を参照）などが挙げられる。単一細胞ＲＮＡ配列決定に関する更なる詳細は、例えば、Ｈａｑｕｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ ９，７５に見出すことができる。

【0034】

ある特定の実施形態では、解離された単一細胞に対してｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを実施することは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＴｏｔａｌＳｅｑ（商標）－Ａプロトコル（ｗｗｗ．ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ．ｃｏｍ／ｅｎ－ｕｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｔｏｔａｌｓｅｑ－ａ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ａｎｄ－ｃｅｌｌ－ｈａｓｈｉｎｇ－ｗｉｔｈ－１０ｘ－ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－３－ｒｅａｇｅｎｔ－ｋｉｔ－ｖ３－３－１－プロトコル）に従って細胞を標識することと、１０×３’クロム単一細胞ＲＮＡ配列決定プロトコル（ｓｕｐｐｏｒｔ．１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－ｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／ｌｉｂｒａｒｙ－ｐｒｅｐ／ｄｏｃ／ｕｓｅｒ－ｇｕｉｄｅ－ｃｈｒｏｍｉｕｍ－ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－３－ｒｅａｇｅｎｔ－ｋｉｔｓ－ｕｓｅｒ－ｇｕｉｄｅ－ｖ３１－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を実施することと、１０×ライブラリ当たり約３００～４００Ｍのリード、及びＢｉｏｌｅｇｅｎｄ ＴｏｔａｌＳｅｑ（商標）ライブラリ当たり約２５Ｍのリードで配列決定することと、を含む。単一細胞ＲＮＡ配列決定からのデータは、例えば、バーコード配列情報を使用して、処理（小分子化合物で処理されたもの対処理されていないもの）及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームにデコンボリュートされ得る。

【0035】

分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、方法は、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価することを更に含む。本開示の方法は、小分子化合物の多種多様な治療特性を評価するのに使用される。そのような治療特性の非限定的な例としては、薬物との併用療法について小分子化合物が候補であること（併用療法）、小分子化合物の作用機構（ＭｏＡ）、疾患サブタイプの治療について小分子化合物が候補であること（例えば、がん／腫瘍サブタイプの新規処理を含む精密腫瘍学のための）、小分子化合物の毒性、耐性／寛容の機構、臨床で以前に試験されていない新しい適応症のための薬物再利用などが挙げられる。

【0036】

いくつかの実施形態によれば、１つ以上の治療特性は、薬物との併用療法について小分子化合物が候補であることを含み、そのような方法は、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、各条件で残る細胞の数を計数することによって各細胞株の薬物感受性を決定することと、各細胞株の薬物誘導遺伝子発現変化を計算することと、を含む。そのような方法は、各細胞株の計算された薬物誘導遺伝子発現変化に基づいて、各遺伝子について重み付けスコアを、薬物感受性に対するその予測された関連性に基づいて与えることを更に含む。そのような方法は、誤検出率を上回る重み付けスコアを有する遺伝子に基づいて、併用療法標的を予測することを更に含み、薬物感受性と反相関する遺伝子は、薬物耐性を予測し、したがって、併用標的化のための候補標的を表す。

【0037】

併用療法の発見は、どの細胞型が化合物に感受性であることを決定することと、それらの細胞型内で処理前後の遺伝子発現の変化を決定することと、を含み得る。単一細胞ＲＮＡ配列決定は、細胞ハッシュを用いて実施され得、その後、その単一ヌクレオチド多型を使用して各個々の細胞を逆多重化して、参照ＳＮＰを決定するために使用される別個の参照ＲＮＡ配列決定データセットへの付与後に細胞株同一性を与える。化合物に感受性のある細胞型は、各細胞株の各条件（薬物、非薬物）に残っている細胞の数を計数することによって決定され得る。次いで、各細胞株について、遺伝子発現の差は、薬物処理の前後に計算され得、本明細書では「単一株デルタ」と称されることもある。感受性のある細胞株についての集約された単一株デルタを、感受性のない細胞株についての集約された単一株デルタと比較して、どの遺伝子が感受性細胞において最も上方制御されているかを決定し得る。次に、これらの集約された遺伝子発現変化をオンラインデータベースにマッピングし、文献検索を使用して、これらの遺伝子のうちのどの遺伝子が薬剤化可能であるかを決定し得る。感受性のある株の全て又は大部分にわたって化合物に応答して上方制御される遺伝子は、候補併用療法標的として同定される。

【0038】

ある特定の実施形態では、１つ以上の治療特性は、小分子化合物の作用機構を含み、そのような方法は、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、各条件で残る細胞の数を計数することによって各細胞株の薬物感受性を決定することと、各細胞株の薬物誘導遺伝子発現の変化を決定することと、薬物感受性のある細胞株にわたって決定された薬物誘導遺伝子発現の変化を集約することと、を含む。そのような方法は、集約された計算された薬物誘導遺伝子発現変化に基づいて、各遺伝子についての重み付けスコアを、薬物感受性に対するその予測された関連性に基づいて与えることと、集約された薬物感受性と相関する遺伝子を、誤検出率を上回る重み付けスコアを有するものとして同定することと、集約された薬物感受性と相関する遺伝子に基づいて、化合物の作用機構を予測することと、を更に含む。

【0039】

作用発見の機構は、小分子化合物濃度の連続希釈を使用して細胞のプールを実験的に投与することと、どの細胞型が化合物に感受性であるかを決定することと、それらの細胞型内で、処理前後の遺伝子発現の変化を決定することと、小分子化合物濃度の関数として、感受性対非感受性細胞株における遺伝子発現の変化をモデル化することと、を含み得る。第一に、細胞のプールは、実験的に、小分子化合物濃度範囲の連続希釈に供され得る。次いで、細胞ハッシュを用いた単一の細胞ＲＮＡ配列決定の後、各個々の細胞は、その単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を使用して逆多重化されて、参照ＳＮＰを決定するために使用される別個の参照ＲＮＡ配列決定データセットへの付与後に細胞株同一性を与え得る。化合物に感受性のある細胞型は、各細胞株の各条件（薬物、非薬物）に残っている細胞の数を計数することによって決定され得る。次いで、各細胞株について、遺伝子発現の差は、薬物処理の前後に計算され得、本明細書では「単一株デルタ」と称されることもある。感受性のある細胞株についての集約された単一株デルタを、感受性のない細胞株についての集約された単一株デルタと比較して、どの遺伝子が感受性細胞において最も上方制御されているかを決定し得る。次いで、遺伝子発現変化は、薬物濃度の直接的な関数としてどの遺伝子が変化するかを決定するために使用される化合物濃度の関数としてモデル化され得る。次に、これらの濃度依存性遺伝子発現変化を参照遺伝子セットデータベースにマッピングして、これらの遺伝子が当てはまる経路を同定し得る。このモデルでは、薬物濃度の関数としての負の相関遺伝子は、薬物の作用機構を示す。

【0040】

いくつかの実施形態によれば、１つ以上の治療特性は、疾患サブタイプの治療について小分子化合物が候補であることを含み、そのような方法は、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、各条件で残る細胞の数を計数することによって各細胞株の薬物感受性を決定することを含み、各細胞株は、その遺伝子変異及び／又はトランスクリプトームシグネチャによって分類される。そのような方法は、細胞株にわたって決定された薬物感受性を集約することと、可変選択回帰アルゴリズムを使用して、集約された薬物感受性との関連性を予測するスコアを各変異及び／又はトランスクリプトームシグネチャについて与えることと、誤検出率を上回るスコアを有する疾患サブタイプに基づいて、疾患サブタイプにおける化合物の有効性を予測することと、を更に含む。ある特定の実施形態では、可変選択回帰アルゴリズムは、重み付けラッソ回帰アルゴリズムである。

【0041】

近年、タンパク質の特定の遺伝的バリアントを標的とするための治療法が開発されている。これらの特定の遺伝的バリアント、又は遺伝的サブタイプは、患者が受けるべき薬物を決定するためにしばしば使用される。しかしながら、特定の遺伝的サブタイプのために開発された薬物が別のサブタイプに対して有効に使用できるかどうかを評価するための単純で高スループットの方法は現在存在していない。本明細書に記載の方法は、１つの実験において、インビボＰＤＸ（患者由来異種移植片）、インビトロ及びエクスビボオルガノイドモデルシステムにおける様々な遺伝的サブタイプに対する分子の相対感受性を同時に決定することができる。本方法は、複数の遺伝的サブタイプから細胞をプールすることを含む。次いで、これらの混合された遺伝的サブタイププールは、小分子を使用して薬剤化される。単一細胞ＲＮＡ配列決定は、細胞ハッシュを用いて実施され得、その後、その単一ヌクレオチド多型を使用して各個々の細胞を逆多重化して、参照ＳＮＰを決定するために使用される別個の参照ＲＮＡ配列決定データセットへの付与後に細胞株同一性を与える。化合物に感受性のある細胞型は、各細胞株の各条件（薬物、非薬物）に残っている細胞の数を計数することによって決定され得る。次いで、細胞株は、それらの遺伝的サブタイプによって集約され、サブタイプによって分類された異なるグループの株の共通の感受性又は耐性があるかどうかについて評価され得る。回帰モデル（例えば、ラッソ回帰モデル）は、各細胞型の変異についてトレーニングされて、どの遺伝子変異が、単一細胞ＲＮＡ配列決定デコンボリュートされたデータから計算された感受性を予測するかを決定し得る。データから導出される感受性係数を効果的に予測する変異は、潜在的な標的を示し、その変異の回帰（例えば、ラッソ回帰）におけるモデル変数の係数の符号に基づいて、その変異が耐性（陽性）又は感作（陰性）変異であるかを決定することが可能である。本発明者らは、このアッセイ及びモデリングを用いて、既知の遺伝的サブタイプの層別化を予測することと、並びに異なる遺伝的サブタイプに対して開発された分子に感受性である新規の遺伝的サブタイプを発見することができることを実証することに成功している。どの遺伝的サブタイプが小分子に対する感受性又は耐性を誘導するかをランク付けし、定量的に推定する能力として定義され得るサブタイプ層別化は、この方法を使用して１つのプールされた実験で達成することができる。

【0042】

一態様では、本開示は、ある期間の間培養された２つ以上の異なる細胞型を含む平衡細胞数培養物であって、少なくとも２つの異なる細胞型の各々が成長率を有し、２つ以上の異なる細胞型の各細胞型が、培養前に、２つ以上の異なる細胞型の細胞型の各々の成長率と逆の比率で組み合わされる、平衡細胞数培養物を提供する。

【0043】

一態様では、本開示は、少なくとも２つ以上の異なる細胞型を含む平衡細胞数培養物であって、平衡細胞数培養物の０．２体積％～１０体積％の試料が、異なる細胞型の各々の少なくとも５００個の細胞を含み、試料は、２つ以上の細胞型を組み合わせて細胞プールを作成し、培養培地に接種して、平衡細胞数培養物を得た後、７２時間～４５日間の期間の間、平衡細胞数培養物が培養された後、平衡細胞数培養物から採られる、平衡細胞数培養物を提供する。

【0044】

一態様では、本開示は、少なくとも２つ以上の異なる細胞型を含む平衡細胞数培養物であって、細胞型の各々は、培養物中の少なくとも１×１０^３個の細胞で表され、細胞型のうちの少なくとも２つは異なるがん組織に由来する、平衡細胞数培養物が提供される。

【0045】

一態様では、本開示は、少なくとも２つ以上の異なる細胞型を含む平衡細胞数培養物であって、細胞型の各々は、培養物中の少なくとも１×１０^３個の細胞で表され、細胞型のうちの少なくとも２つは互いに異なるがん変異を含む、平衡細胞数培養物を提供する。

【0046】

一態様では、本開示は、少なくとも２つ以上の異なる細胞型を含む平衡細胞数培養物であって、細胞型の各々は、培養物中の少なくとも１×１０^３個の細胞で表され、細胞型のうちの少なくとも２つは互いに異なるがん変異を含む、平衡細胞数培養物が提供される。

【0047】

いくつかの実施形態では、２つの異なる細胞型の各々は、平衡細胞数培養物中の少なくとも１×１０^３個の生存細胞で表される。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物中の少なくとも２つの異なる細胞型の細胞型は、他の細胞型を２桁以上上回らない。いくつかの実施形態では、少なくとも２つ以上の異なる細胞型の各細胞型の総数は、平衡細胞数培養物中で互いに２桁以内である。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、２～５００個の異なる細胞型を含む。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、２～５００個、５～４００個、６～３００個、８～２００個、１０～１００個、１０～５０個、２～３０個、２～２５個、又は１０～３０個の異なる細胞型を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞型を含む平衡細胞数培養物における各細胞型の表現を決定することは、ＵＭＡＰ分析を含む。いくつかの実施形態では、ＵＭＡＰ分析は、平衡細胞数培養物における異なる細胞型の表現を１つ以上のクラスターとして提供する。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、２つ以上、少なくとも２つ以上、少なくとも３つ以上、少なくとも４つ以上、少なくとも５つ以上、少なくとも６つ以上、少なくとも７つ以上、少なくとも８つ以上、少なくとも９つ以上、少なくとも１０個以上、少なくとも１１個以上、少なくとも１２個以上、少なくとも１３個以上、少なくとも１４個以上、少なくとも１５個以上、少なくとも１６個以上、少なくとも１７個以上、少なくとも１８個以上、少なくとも１９個以上、少なくとも２０個以上の異なる細胞型を含む。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、１００個の異なる細胞型を含む。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、６時間～４５日間、１２時間～４０日間、２４時間～３５日間、７２時間～３０日間、９６時間～２０日間、１２０時間～１５日間の期間の間培養される。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、７２時間の期間の間培養される。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、１４日の期間の間培養される。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なる細胞型の各細胞型は、ステップ（ｂ）で、成長率決定アッセイによって決定される、細胞型の各々の成長率と逆の比率で組み合わされ、ｉｉ）成長のための総日数にスケーリングされる。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、成長平衡培養物（例えば、ＧＥＮＥＶＡプール）である。平衡細胞数培養物、成長平衡培養物、ＧＥＮＥＶＡプール、及びＧＥＮＥＶＡ培養物という用語は、明細書で互換的に使用されている。いくつかの実施形態では、成長率決定アッセイは、カルセイン－ＡＭ成長アッセイ又はＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ成長アッセイである。いくつかの実施形態では、成長率は、カルセイン－ＡＭ成長アッセイ及びＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ成長アッセイの組み合わせによって決定される。いくつかの実施形態では、成長率は、式（標的細胞数／オイラー定数＾（成長率＊成長日数））／細胞数によって決定される。いくつかの実施形態では、成長率は、細胞数の倍増によって決定される。いくつかの実施形態では、倍増は、Ｎｆ／Ｎ０で表され、Ｎｆは、培養期間の終了時の細胞数であり、Ｎ０は、培養期間の開始時の細胞数である。いくつかの実施形態では、成長率は、ｒ＝ｌｎ（Ｎｆ／Ｎ０）／ｔによって決定され、ここで、「ｒ」は成長率を表し、「ｔ」はアッセイの時間を表し、ｌｎは自然対数を表す。いくつかの実施形態では、平衡細胞培養物に含まれる細胞は、０．０１～０．８、０．０５～０．８、０．０７～０．７、０．９～０．５、又は０．１～０．４の成長率を有する。いくつかの実施形態では、各細胞型からの細胞は、各細胞型からの表現がそれらの細胞成長率に反比例するような比率で含まれる。いくつかの実施形態では、成長率は、標的細胞数が１０００万個、２０００万個、３０００万個、４０００万個、５０００万個、６０００万個、７０００万個、８０００万個、９０００万個、又は１億個に等しいときに測定される。いくつかの実施形態では、成長率は、標的細胞数が１億に等しいときに測定される。

【0048】

いくつかの実施形態では、成長率は、細胞成長アッセイによって決定された実施された測定値から採られ、成長日数は１日に等しい。いくつかの実施形態では、成長率は、細胞成長アッセイによって決定された実施された測定値から採られ、成長日数は２日に等しい。いくつかの実施形態では、成長率は、細胞成長アッセイによって決定された実施された測定値から採られ、成長日数は３日に等しい。いくつかの実施形態では、成長率は、細胞成長アッセイによって決定された実施された測定値から採られ、成長日数は４日に等しい。いくつかために実施形態では、成長率は、細胞成長アッセイによって決定された実施された測定値から採られ、成長日数は５日に等しい。いくつかの実施形態では、成長率は、細胞成長アッセイによって決定された実施された測定値から採られ、成長日数は６日に等しい。いくつかの実施形態では、成長率は、細胞成長アッセイによって決定された実施された測定値から採られ、成長日数は７日に等しい。いくつかために実施形態では、成長率は、細胞成長アッセイによって決定された実施された測定値から採られ、成長日数は１０日に等しい。いくつかの実施形態では、異なる細胞型は、がん変異を有する細胞、１人以上の対象からのがん細胞、１人以上の対象からの初代細胞、臓器系からの細胞、疾患モデルからの細胞、様々な細胞株からの細胞、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞型は、疾患を有する対象からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞型は、疾患を有する１人以上の対象からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞型は、疾患モデル、例えば、オルガノイド、例えば、異種移植片、例えば、患者由来の異種移植片からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、疾患は、腫瘍性疾患、例えば、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、頭、首、肺、皮膚、乳房、血液、リンパ、骨、軟組織、脳、眼、生殖器系、循環器系、消化器系、内分泌系、神経系、及び泌尿器系のがんのうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞株は、がん細胞株である。いくつかの実施形態では、がん細胞株には、Ｈ３５８、ＮＣＩ－Ｈ２３、Ｈ２１２２、Ｈ２０３０、ＳＷ１５７３、ＳＫ－ＬＵ－１、Ｈ４４１、ＣＡＬＵ－１、Ｈ１７９２、Ｈ１３７３、Ｈ２３、Ｈ３５８、Ｈ１２９９、Ｈ１９７５、ＳＫＭＥＬ２、ＭＥＷＯ、ＳＫＭＥＬ２８、ＨＴＴ１４４、Ａ３７５、ＭＩＡＰＡＣＡ２、又はＡ５４のうちの１つ以上が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0049】

いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、モデルシステム、例えば、インビトロモデルシステム、インビボモデルシステム、又はエクスビボモデルシステムに移植される。いくつかの実施形態では、モデルシステムは、２Ｄインビトロシステムである。いくつかの実施形態では、モデルシステムは、３Ｄインビトロモデルシステムである。いくつかの実施形態では、モデルシステムは、３Ｄ足場システムである。いくつかの実施形態では、モデルシステムは、エクスビボモデルシステム、例えば、オルガノイドである。いくつかの実施形態では、モデルシステムは、インビボモデルシステム、例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウスである。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、単一のマウスに移植される。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物の移植は、インビボシステムにおいてモザイク腫瘍を作成する。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物の移植は、マウスにモザイク腫瘍を作成する。実施形態では、本開示は、平衡細胞数培養物を含むモデルシステムであって、平衡細胞数培養物は複数の細胞型を含む、モデルシステムを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、複数の細胞型を含むモザイク腫瘍を含むモデルシステムを提供する。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、異なる生理学的起源の細胞、異なる対象からの細胞、異なる生物からの細胞、同じ生物の異なる組織からの細胞、同じ組織からであるが異なる生物からの細胞、異なる対象からの異なる組織又は臓器からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、異なる型の細胞は、互いに少なくとも１つの異なる単一ヌクレオチド多型を含む。いくつかの実施形態では、異なる型の細胞は、がん変異を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、同一のがん変異を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、異なるがん変異を含み得る。いくつかの実施形態では、変異は、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＴＨ２１、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＶＨＬ、ＫＲＡＳ、ＭＬＬ３、ＭＬＬ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＰＢＲＭ１、ＮＡＶ３、ＥＧＦＲ、ＮＦ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＧＡＴＡ３、ＲＢ１、ＮＯＴＣＨ１、ＦＢＸＷ７、ＣＴＮＮＢ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＦＬＴ３、ＭＡＬＡＴ１、ＴＳＨＺ３、ＫＥＡＰ１、ＣＤＨ１、ＡＲＨＧＡＰ３５、ＣＴＣＦ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＳＥＴＢＰ１、ＢＡＰ１、ＮＰＭ１、ＲＵＮＸ１、ＮＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＴＢＸ３、ＭＡＰ２Ｋ４、ＲＰＬ２２、ＳＴＫ１１、ＣＲＩＰＡＫ、ＣＥＢＰＡ、ＫＤＭ６Ａ、ＥＰＨＡ３、ＡＫＴ１、ＳＴＡＧ２、ＢＲＡＦ、ＡＲ、ＡＪＵＢＡ、ＥＰＰＫ１、ＴＳＨＺ２、ＰＩＫ３ＣＧ、ＳＯＸ９、ＡＴＭ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＷＴ１、ＨＧＦ、ＫＤＭ５Ｃ、ＰＲＸ、ＥＲＢＢ４、ＭＴＯＲ、ＴＬＲ４、Ｕ２ＡＦ１、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＴＥＴ２、ＡＴＲＸ、ＭＬＬ４、ＥＬＦ３、ＢＲＣＡ１、ＬＲＲＫ２、ＰＯＬＱ、ＦＯＸＡ１、ＩＤＨ２、ＣＨＥＫ２、ＫＩＴ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ、ＳＥＴＤ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＰ３００、ＦＧＦＲ２、ＣＣＮＤ１、ＥＰＨＢ６、ＳＭＡＤ４、ＦＯＸＡ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＢＲＣＡ２、ＮＦＥ２Ｌ３、ＦＧＦＲ３、ＡＳＸＬ１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＯＸ１７、ＣＤＫＮ１Ａ、Ｂ４ＧＡＬＴ３、ＳＦ３Ｂ１、ＴＡＦ１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＣＢＦＢ、ＡＴＲ、ＳＩＮ３Ａ、ＶＥＺＦ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＥＩＦ４Ａ２、ＣＤＫ１２、ＰＨＦ６、ＳＭＣ１Ａ、ＰＴＰＮ１１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＭＡＰＫ８ＩＰ１、Ｈ３Ｆ３Ｃ、ＮＳＤ１、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＥＧＲ３、ＡＣＶＲ２Ａ、ＭＥＣＯＭ、ＬＩＦＲ、ＳＭＣ３、ＮＣＯＲ１、ＲＰＬ５、ＳＭＡＤ２、ＳＰＯＰ、ＡＸＩＮ２、ＭＩＲ１４２、ＲＡＤ２１、ＥＲＣＣ２、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＥＺＨ２、ＰＣＢＰ１変異のうちの１つ以上を含む。

【0050】

一態様では、本開示は、少なくとも２つ以上の異なる細胞型を有する平衡細胞数培養物を調製する方法を提供し、本方法は、
（ａ）２つ以上の異なる細胞型の各細胞型についての成長率を決定することと、
（ｂ）細胞プールを作成するために、２つ以上の異なる細胞型を組み合わせることであって、細胞プールに添加される２つ以上の異なる細胞型の細胞型の各々の初期細胞数が、ステップ（ａ）の成長率に基づいて決定される、組み合わせることと、
（ｃ）平衡細胞数培養物を作成するために、ステップ（ｂ）の細胞プールをある期間にわたって培養することであって、平衡細胞数培養物の０．２体積％～１０体積％の試料は、２つ以上の異なる細胞型の各細胞型の少なくとも５００個の細胞を含む、培養することと、を含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の試料は、５，０００～２００，０００個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の試料は、２００，０００個未満、１７５，０００個未満、１５０，０００個未満、１４０，０００個未満、１３０，０００個未満、１２０，０００個未満、１１０，０００個未満、又は１００，０００個未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の試料は、２つ以上の異なる細胞型の各細胞型の５００個以上の生存細胞を含む。異なる細胞型は、がん変異を有する細胞、１人以上の対象からのがん細胞、１人以上の対象からの初代細胞、臓器系からの細胞、疾患モデルからの細胞、様々な細胞株からの細胞、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞型は、疾患を有する対象からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞型は、疾患を有する１人以上の対象からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞型は、疾患モデル、例えば、オルガノイド、例えば、異種移植片、例えば、患者由来の異種移植片からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、疾患は、腫瘍性疾患、例えば、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、頭、首、肺、皮膚、乳房、血液、リンパ、骨、軟組織、脳、眼、生殖器系、循環器系、消化器系、内分泌系、神経系、及び泌尿器系のがんのうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の試料は、期間の終了時に採られる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の少なくとも２つ以上の試料は、期間中の異なる時点で採られる。いくつかの実施形態では、本開示は、請求項３３～５５のいずれか一項に記載のステップ（ｃ）の試料からの細胞を、ステップ（ｃ）の試料からのステップ（ｂ）の細胞プールの２つ以上の細胞と相関させる方法を提供し、実施するステップは、
（ｉ）試料からの１つ以上の細胞に対して単一細胞ＲＮＡ配列決定を実施して、試料からの１つ以上の細胞における単一ヌクレオチド多型を同定することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の単一ヌクレオチド多型と、ステップ（ｂ）の細胞プールの２つ以上の細胞の単一ヌクレオチド多型とを比較し、それにより、ステップ（ｃ）の試料からの細胞を、ステップ（ｂ）の細胞プールの２つ以上の細胞と相関させることと、を更に含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、２つの異なる細胞型の各々は、平衡細胞数培養物中の少なくとも１×１０^３個の生存細胞で表される。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物中の少なくとも２つの異なる細胞型の細胞型は、他の細胞型を２桁以上上回らない。いくつかの実施形態では、少なくとも２つ以上の異なる細胞型の各細胞型の総数は、平衡細胞数培養物中で互いに２桁以内である。

【0053】

いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、２～５００個の異なる細胞型を含む。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、２～５００個、５～４００個、６～３００個、８～２００個、１０～１００個、１０～５０個、２～３０個、２～２５個、又は１０～３０個の異なる細胞型を含む。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、２つ以上、少なくとも２つ以上、少なくとも３つ以上、少なくとも４つ以上、少なくとも５つ以上、少なくとも６つ以上、少なくとも７つ以上、少なくとも８つ以上、少なくとも９つ以上、少なくとも１０個以上、少なくとも１１個以上、少なくとも１２個以上、少なくとも１３個以上、少なくとも１４個以上、少なくとも１５個以上、少なくとも１６個以上、少なくとも１７個以上、少なくとも１８個以上、少なくとも１９個以上、少なくとも２０個以上の異なる細胞型を含む。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、１００個の異なる細胞型を含む。

【0054】

いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、６時間～４５日間、１２時間～４０日間、２４時間～３５日間、７２時間～３０日間、９６時間～２０日間、１２０時間～１５日間の期間の間培養される。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、７２時間の期間の間培養される。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、１４日間の期間の間培養される。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、２つ以上の異なる細胞型を含み、２つ以上の異なる細胞型の各々は、培養物中の少なくとも１×１０^３個の細胞で表され、細胞型のうちの少なくとも２つは互いに異なるがん変異を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、インビボモデルシステムにおいて、少なくとも２つ以上の異なる細胞型を含むモザイク腫瘍を作成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、モザイク腫瘍は、がん細胞株、がん組織、及び／又はがんを有する対象由来の２つ以上の細胞を含む平衡細胞数培養物を移植し、平衡細胞数培養物をインビボモデルシステムに移植することによって作成される。いくつかの実施形態では、インビボモデルシステムは、動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウスである。

【0055】

いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物は、モデルシステム、例えば、インビトロモデルシステム、インビボモデルシステム、又はエクスビボモデルシステムに移植される。

【0056】

一態様では、本開示は、２つ以上の細胞型に対する候補薬剤の影響を評価する方法を提供する。この方法は、平衡細胞数培養物を調整することと、
平衡細胞数培養物をモデルシステムに移植することと、モデルシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理することと、持続時間の終了時に平衡細胞数培養物を評価して、平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する候補薬剤の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的影響を決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、モザイク腫瘍の個々の細胞に対する候補薬剤の治療有効性を評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、候補薬剤の治療有効性は、候補薬剤によってモザイク腫瘍をある持続時間の間処理し、個々の細胞を評価して、持続時間の終了時にモザイク腫瘍の個々の細胞の表現型、遺伝的、及び転写組成学的発現を決定し、モザイク腫瘍の個々の細胞の表現型、ゲノム的、及び転写組成学的発現を、候補薬剤で処理されていない同一のモザイク腫瘍の個々の細胞の表現型、ゲノム的、及び転写組成学的発現と比較することによって、候補薬剤の治療有効性を決定することによって測定される。

【0057】

一態様では、本開示は、２つ以上の細胞型に対する候補薬剤の影響を評価する方法を提供する。この方法は、平衡細胞数培養物を調整することと、
平衡細胞数培養物をモデルシステムに移植することと、モデルシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理することと、持続時間の終了時に平衡細胞数培養物を評価して、平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する候補薬剤の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的影響を決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、インビボシステムにおいて、複数の細胞型に対する候補薬剤の影響を同時に評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、インビトロシステムにおいて、複数の細胞型に対する候補薬剤の影響を同時に評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、エクスビボシステムにおいて、複数の細胞型に対する候補薬剤の影響を同時に評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、平衡細胞数培養物を調製することと、平衡細胞数培養物をモデルシステムに移植することと、モデルシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理し、個々の細胞を評価して、持続時間の終了時に、複数の細胞型の各々の個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現を決定することと、モデルシステムにおける複数の細胞型の各々の個々の細胞の表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現を、候補薬剤で処理されていない同一のモデルシステムの複数の細胞型の各々の個々の細胞の表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現と比較することによって、候補薬剤の影響を決定することと、を含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、本開示は、生物学的経路における候補薬剤標的を同定する方法を提供する。方法は、平衡細胞数培養物を調製することと、平衡細胞数培養物をモデルシステムに移植することと、モデルシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理し、個々の細胞を評価して、持続時間の終了時に、複数の細胞型の各々の個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現を決定することと、モデルシステムにおける複数の細胞型の各々の個々の細胞の表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現を、候補薬剤で処理されていない同一のモデルシステムの複数の細胞型の各々の個々の細胞の表現型、ゲノム的、及びトランスクリプトーム的発現と比較することによって、候補薬剤標的を同定することと、を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、候補薬剤に感受性のある対象亜集団を同定する方法を提供する。方法は、平衡細胞数培養物を調製することと、平衡細胞数培養物をモデルシステムに移植することと、モデルシステムを、ある持続時間にわたって候補薬剤で処理し、個々の細胞を評価して、持続時間の終了時に、複数の細胞型の各々の個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現を決定することと、平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する候補薬剤の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的影響の評価に基づいて、候補薬剤に感受性のある対象亜集団を同定することと、を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の方法を使用して、対象からの個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現を決定することによって、対象亜集団が薬物に対して耐性になる時点を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の方法を使用して、対象からの個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現を決定することによって、対象亜集団が候補薬剤による治療的処理に対して になる時点を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の方法を使用して、対象からの個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現に対する１つ以上の治療剤の効果を決定し、対象からの個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現に基づいて処理レジメンを決定することによって、対象集団からの個別化された処理レジメンを決定する方法を提供する。

【0059】

いくつかの実施形態では、本開示は、平衡細胞数培養物を調製し、平衡細胞数培養物をモデルシステムに移植し、モデルシステムを、ある持続時間にわたって２つ以上の候補薬剤を組み合わせて処理し、持続時間の終了時に、複数の細胞型の各々の個々の細胞の表現型、遺伝的、及びトランスクリプトーム的発現を決定するために個々の細胞を評価し、個々の細胞に対する併用処理の効果によって併用処理の有効性を同定することによって、併用療法の有効性を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の候補薬剤で処理することと、第２の候補薬剤で処理することと、を含む。いくつかの実施形態では、第１の候補薬剤及び第２の候補薬剤による処理は、連続的である。いくつかの実施形態では、第１の候補薬剤及び第２の候補薬剤による処理は、継続的である。いくつかの実施形態では、方法は、任意選択的に、第３の候補薬剤で処理することを含む。

【0060】

いくつかの実施形態では、モデルシステムは、インビトロモデルシステム、インビボモデルシステム、又はエクスビボモデルシステムである。いくつかの実施形態では、モデルシステムは、２Ｄインビトロシステムである。いくつかの実施形態では、モデルシステムは、３Ｄインビトロモデルシステムである。いくつかの実施形態では、モデルシステムは、３Ｄ足場システムである。いくつかの実施形態では、モデルシステムは、エクスビボモデルシステム、例えば、オルガノイドである。いくつかの実施形態では、モデルシステムは、インビボモデルシステム、例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウスである。

【0061】

いくつかの実施形態では、持続時間は、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約１０時間、約１６時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、約９６時間、約１２０時間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約２０日間、約２４日間、約２５日間、約３０日間、約３５日間、約４０日間、又は約４５日間である。いくつかの実施形態では、処理は断続的である。いくつかの実施形態では、処理は連続的である。

【0062】

いくつかの実施形態では、候補薬剤は、治療的摂動を引き起こすことができる薬剤である。いくつかの実施形態では、候補薬剤は、小分子、抗体、ペプチド、遺伝子エディタ、又は核酸アプタマーから選択される。いくつかの実施形態では、小分子は、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ阻害剤、例えば、ＡＲＳ－１６２０、ＡＭＧ５１０、又はＭＲＴＸ８４９である。いくつかの実施形態では、候補薬剤は、生物学的経路の阻害剤である。いくつかの実施形態では、候補薬剤は、生物学的経路の活性化剤である。実施形態では、候補薬剤は、ＡＲＳ－１６２０、ＡＭＧ５１０、ガルニセルチブ、ＭＲＴＸ８４９、ＩＮＫ１２８、及びアンチマイシンのうちの１つ以上から選択される。

【0063】

いくつかの実施形態では、表現型の変化を評価することは、持続時間の終了時に、２つ以上の異なる細胞型の細胞型の各々の生存可能な個々の細胞の数を計数することを含む。いくつかの実施形態では、トランスクリプトーム的影響を評価することは、持続時間の終了時に、平衡細胞数培養物中の細胞の単一細胞トランスクリプトームプロファイルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝的影響を評価することは、持続時間の終了時に、平衡細胞数培養物中の細胞の単一細胞ＲＮＡ配列決定を含む。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する候補薬剤の効果は、候補薬剤によって処理された平衡細胞数培養物の個々の細胞の遺伝子発現を計算することによって評価され、遺伝子発現を、候補薬剤によって処理されていない同一の平衡細胞数培養物の個々の細胞の遺伝子発現と比較する。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する候補薬剤の効果は、候補薬剤によって処理された平衡細胞数培養物の個々の細胞のトランスクリプトーム的発現を決定することによって評価され、トランスクリプトーム的発現を、候補薬剤によって処理されていない同一の平衡細胞数培養物の個々の細胞の遺伝子発現と比較する。いくつかの実施形態では、平衡細胞数培養物の個々の細胞に対する候補薬剤の効果は、候補薬剤によって処理された平衡細胞数培養物中の２つ以上の異なる細胞型の細胞型の各々の生存可能な個々の細胞の数を計数し、候補薬剤によって処理されていない同一の平衡細胞数培養物中の２つ以上の異なる細胞型の細胞型の各々の生存可能な個々の細胞の数を比較することによって評価される。いくつかの実施形態では、評価は、遺伝的影響、表現型影響、及びトランスクリプトーム的影響のうちの１つ以上の決定を含む。

【0064】

コンピュータ可読媒体及びシステム
本開示の態様は、コンピュータ可読媒体及びシステムも含む。コンピュータ可読媒体及びシステムは、本開示の方法を実践する際を含むが、これに限定されない、様々な文脈での使用を見出す。

【0065】

ある特定の態様では、命令が記憶された１つ以上の非一時的コンピュータ可読媒体が提供される。１つ以上のプロセッサによって実行されると、命令は、１つ以上のプロセッサに、単一細胞ＲＮＡ配列決定データを、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームにデコンボリュートさせる。単一細胞ＲＮＡ配列決定データは、小分子化合物で処理された異なる細胞型の三次元プールからの解離された単一細胞（例えば、異種移植片、オルガノイドなど）、及び小分子化合物で処理されていない異なる細胞型の対照三次元プールからの解離された単一細胞に対して単一細胞ＲＮＡ配列決定を実施することによって生成された。１つ以上のプロセッサによって実行されると、命令は更に、１つ以上のプロセッサに、分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価させる。

【0066】

ある特定の実施形態では、命令は、１つ以上のプロセッサに、分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価させ、１つ以上の治療特性は、薬物との併用療法について小分子化合物が候補であることを含む。いくつかの実施形態によれば、命令は、１つ以上のプロセッサに、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、各細胞株の薬物誘導遺伝子発現変化を計算させ、各細胞株の計算された薬物誘導遺伝子発現変化に基づいて、各遺伝子についての重み付けスコアを、薬物感受性に対するその予測された関連性に基づいて与えさせ、誤検出率を上回る重み付けスコアを有する遺伝子に基づいて、併用療法標的を予測させ、薬物感受性と反相関する遺伝子は、薬物耐性を予測し、したがって、併用標的化のための候補標的を表す。

【0067】

いくつかの実施形態では、命令は、１つ以上のプロセッサに、分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価させ、１つ以上の治療特性は、小分子化合物の作用機構を含む。ある特定の実施形態では、命令は、１つ以上のプロセッサに、処理及び細胞型によって分類される単一細胞トランスクリプトームに基づいて、各細胞株についての薬物誘導遺伝子発現の変化を決定させ、薬物感受性細胞株にわたる決定された薬物誘導遺伝子発現変化を集約させ、集約された計算された薬物誘導遺伝子発現変化に基づいて、各遺伝子に付いての重み付けスコアを、薬物感受性に対するその予測された関連性に基づいて与えさせ、誤検出率を上回る重み付けスコアを有するものとして、集約された薬物感受性と相関する遺伝子を同定させ、集約された薬物感受性と相関する遺伝子に基づいて、化合物の作用機構を予測させる。

【0068】

ある特定の実施形態では、命令は、１つ以上のプロセッサに、分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価させ、１つ以上の治療特性は、疾病サブタイプの治療について小分子化合物が候補であることを含む。いくつかの実施形態によれば、命令は、１つ以上のプロセッサに、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、細胞株にわたって薬物感受性を集約させ、薬物感受性は、各条件で残っている細胞の数を計数することによって各細胞株について決定され、各細胞株は、その遺伝子変異及び／又はトランスクリプトームシグネチャによって分類される。命令は、１つ以上のプロセッサに、可変選択回帰アルゴリズムを使用して、集約された薬物感受性への関連性を予測する各変異及び／又はトランスクリプトームシグネチャについてスコアを与えさせ、誤検出率を上回るスコアを有する疾患サブタイプに基づいて、疾患サブタイプにおける化合物の有効性を予測させる。ある特定の実施形態では、可変選択回帰アルゴリズムは、重み付けラッソ回帰アルゴリズムである。

【0069】

ある特定の態様では、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価するためのシステムが提供される。そのようなシステムは、１つ以上のプロセッサと、命令が記憶された１つ以上の非一時的コンピュータ可読媒体と、を備える。１つ以上のプロセッサによって実行されると、命令は、１つ以上のプロセッサに、単一細胞ＲＮＡ配列決定データを、処理及び細胞型によって分類された単一細胞トランスクリプトームにデコンボリュートさせる。単一細胞ＲＮＡ配列決定データは、小分子化合物で処理された異なる細胞型の三次元プールからの解離された単一細胞（例えば、異種移植片、オルガノイドなど）、及び小分子化合物で処理されていない異なる細胞型の対照三次元プールからの解離された単一細胞に対して単一細胞ＲＮＡ配列決定を実施することによって生成された。１つ以上のプロセッサによって実行されると、命令は更に、１つ以上のプロセッサに、分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価させる。

【0070】

ある特定の実施形態では、本開示のシステムの１つ以上のコンピュータ可読媒体の命令は、１つ以上のプロセッサに、分類された単一細胞トランスクリプトームに基づいて、小分子化合物の１つ以上の治療特性を評価させ、１つ以上の治療特性は、薬物との併用療法について小分子化合物が候補であること、小分子化合物の作用機構、疾患サブタイプの治療について小分子化合物が候補であること、又はそれらの任意の組み合わせを含む。これら及び他の種類の評価を実施するためのそのような非一時的コンピュータ可読媒体の命令の例は、本明細書に記載されており、簡潔さのために本明細書に繰り返されない。

【0071】

本開示の実施形態を実装するために、様々なプロセッサベースのシステムを使用することができる。そのようなシステムは、システムの構成要素がバスを使用して互いに電気的に通信しているシステムアーキテクチャを含み得る。システムアーキテクチャは、システムバスに様々に結合された処理ユニット（ＣＰＵ又はプロセッサ）、並びにキャッシュを含むことができる。バスは、システムメモリ（例えば、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）及びランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含む様々なシステム構成要素をプロセッサに結合する。

【0072】

システムアーキテクチャは、プロセッサに直接接続された、プロセッサに近接した、又はプロセッサの一部として統合された高速メモリのキャッシュを含むことができる。システムアーキテクチャは、プロセッサによる迅速なアクセスのために、メモリ及び／又は記憶デバイスからキャッシュにデータをコピーすることができる。このようにして、キャッシュは、データを待つ間のプロセッサ遅延を回避するパフォーマンスの向上を提供することができる。これら及び他のモジュールは、様々なアクションを実施するようにプロセッサを制御するか、又はプロセッサを制御するように構成することができる。他のシステムメモリも使用可能であり得る。メモリは、異なるパフォーマンス特性を有する複数の異なる種類のメモリを含み得る。プロセッサは、任意の汎用プロセッサ、並びにプロセッサを制御するように構成された、記憶デバイスに記憶された第１、第２、及び第３のモジュールなどのハードウェアモジュール又はソフトウェアモジュール、並びにソフトウェア命令が実際のプロセッサ設計に組み込まれる特殊目的プロセッサを含むことができる。プロセッサは、本質的に、複数のコア又はプロセッサ、バス、メモリコントローラ、キャッシュなどを含む、完全に自己完結型のコンピューティングシステムであり得る。マルチコアプロセッサは、対称又は非対称であり得る。

【0073】

コンピューティングシステムアーキテクチャとのユーザ相互作用を可能にするために、入力デバイスは、音声用のマイクロフォン、ジェスチャ又はグラフィカル入力用のタッチ感知スクリーン、キーボード、マウス、動き入力、音声などの任意の数の入力機構を表すことができる。出力デバイスはまた、いくつかの出力機構のうちの１つ以上であり得る。いくつかの例では、マルチモーダルシステムは、ユーザがコンピューティングシステムアーキテクチャと通信するために複数のタイプの入力を提供することを可能にすることができる。通信インターフェースは、一般に、ユーザ入力及びシステム出力を制御及び管理することができる。任意の特定のハードウェア配置上で動作することに制限はなく、したがって、本明細書の基本的な特徴は、それらが開発されるにつれて、改善されたハードウェア又はファームウェア配置に容易に置き換えられ得る。

【0074】

記憶デバイスは、典型的には不揮発性メモリであり、磁気カセット、フラッシュメモリカード、ソリッドステートメモリデバイス、デジタル多用途ディスク、カートリッジ、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、及びそれらのハイブリッドなど、コンピュータによってアクセス可能なデータを記憶することができるハードディスク又は他のタイプのコンピュータ可読媒体であり得る。

【0075】

記憶デバイスは、プロセッサを制御するためのソフトウェアモジュールを含むことができる。他のハードウェア又はソフトウェアモジュールが企図される。記憶デバイスは、システムバスに接続することができる。一態様では、特定の機能を実施するハードウェアモジュールは、開示された技術の様々な機能を実行するために、プロセッサ、バス、出力デバイスなどの必要なハードウェア構成要素に関連してコンピュータ可読媒体に記憶されたソフトウェア構成要素を含むことができる。

【0076】

本開示の範囲内の実施形態はまた、コンピュータ実行可能命令若しくはデータ構造を担持するための、又はコンピュータ実行可能命令若しくはデータ構造を記憶した有形の及び／又は非一時的コンピュータ可読記憶媒体又はデバイスを含み得る。そのような有形のコンピュータ可読記憶デバイスは、上記のような任意の特殊目的プロセッサの機能設計を含む、汎用コンピュータ又は特殊目的コンピュータによってアクセスされ得る任意の利用可能なデバイスであり得る。限定ではなく例として、そのような有形のコンピュータ可読デバイスは、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ－ＲＯＭ若しくは他の光ディスク記憶装置、磁気ディスク記憶装置若しくは他の磁気記憶デバイス、又はコンピュータ実行可能命令、データ構造、若しくはプロセッサチップ設計の形態で所望のプログラムコードを担持若しくは記憶するために使用され得る任意の他のデバイスを含み得る。情報又は命令がネットワーク又は別の通信接続（ハードワイヤード、無線、又はそれらの組み合わせのいずれか）を介してコンピュータに提供されるとき、コンピュータは、接続をコンピュータ可読媒体として適切に見る。したがって、任意のそのような接続は、コンピュータ可読媒体と適切に称される。上記の組み合わせも、コンピュータ可読記憶デバイスの範囲内に含まれるべきである。

【0077】

コンピュータ実行可能命令は、例えば、汎用コンピュータ、特殊目的コンピュータ、又は特殊目的処理デバイスに特定の機能又は機能のグループを実施させる命令及びデータを含む。コンピュータ実行可能命令はまた、スタンドアロン環境又はネットワーク環境においてコンピュータによって実行されるプログラムモジュールを含む。一般に、プログラムモジュールは、タスクを実施する、又は抽象的なデータ型を実装する、ルーチン、プログラム、構成要素、データ構造、オブジェクト、及び特殊目的プロセッサの設計に固有の機能などを含む。コンピュータ実行可能命令、関連するデータ構造、及びプログラムモジュールは、本明細書に開示される方法のステップを実行するためのプログラムコード手段の例を表す。かかる実行可能命令又は関連するデータ構造の特定のシーケンスは、かかるステップで説明される機能を実装するための対応する動作の例を表す。

【0078】

本開示の他の実施形態は、パーソナルコンピュータ、ハンドヘルドデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベース又はプログラマブルコンシューマエレクトロニクス、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータなどを含む多くの種類のコンピュータシステム構成を有するネットワークコンピューティング環境で実施され得る。実施形態はまた、通信ネットワークを介して（ハードワイヤードリンク、無線リンク、又はそれらの組み合わせのいずれかによって）リンクされるローカル及びリモート処理デバイスによってタスクが実施される分散コンピューティング環境で実施され得る。分散型コンピューティング環境では、プログラムモジュールは、ローカル及びリモートメモリ記憶デバイスの両方に位置し得る。

【実施例】

【0079】

以下の実施例は、例示として提示されるものであって、限定として提示されるものではない。

【0080】

実験
実施例１－３Ｄ不均一細胞プールの作成
この実施例は、３Ｄ不均一細胞プールの作成を対象としている。長時間の成長後に採取時に同等の数の細胞を産生する不均一な細胞株のプールを作成するために、異なる人々からの１１のヒト細胞株のプールを利用した。プーリングの時点での細胞の数が各株について同等であったプールを作成した。次いで、細胞を、細胞培養物中で７日間の成長の経過に供した。７日後、プールを採取し、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォーム上で単一細胞ＲＮＡ配列決定を実施し、単一細胞ＲＮＡ配列決定Ｉｌｌｕｍｉｎａ断片ライブラリを得た。ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ機器上で配列決定し、リードを整列して単一細胞遺伝子発現プロファイルを得た。次いで、逆多重化ソフトウェアを使用して、単一細胞データパッケージを起源の患者に分解した（ｄｅｍｕｘｌｅｔ、ｆｒｅｅｍｕｘｌｅｔ）。９０％を超える単一細胞が細胞株Ａ３７５からであり、一方で、他の１０個の細胞株が、１０％未満の残りの細胞数を占めることが決定された。細胞、具体的にはＨ３５８、Ｈ１９７５、Ａ５４９、Ｈ１２９９、ＳＫＭＥＬ２、及びＳＫＭＥＬ２８の数が少ない／限られていたために、いくつかの細胞株について、正確なトランスクリプトーム状態を得ることができなかった（図１Ａ～Ｂ）。

【0081】

実施例２－成長率平衡３Ｄ不均一細胞プール（ＧＥＮＥＶＡ）の作成
この実施例は、成長率平衡３Ｄ不均一細胞プールの作成を対象としている。プールを構成する細胞株の成長率を、各細胞株の細胞をプールに添加する前に、細胞成長率アッセイを使用して個別に測定した（Ｈ２３、Ｈ３５８、Ｈ１２９９、Ｈ１９７５、ＳＫＭＥＬ２、ＭＥＷＯ、ＳＫＭＥＬ２８、ＨＴＴ１４４、Ａ３７５、ＭＩＡＰＡＣＡ２、Ａ５４９）。次いで、これらの成長率を使用して、細胞数を、プーリング時に、ｉ）成長アッセイによって決定された細胞株の成長率と逆の比率で平衡にし、ｉｉ）縦成長のために日数にスケーリングした。プーリング、成長、採取、並びに単一細胞ＲＮＡ配列決定及び分析の後、このようにして平衡にされた細胞株のプールは、異なる細胞株間で細胞型のより均等な分布を産生し、実施例１で得られたプールと比較して、プールに含まれる全ての細胞株からの正確な単一細胞トランスクリプトームプロファイルを可能にした（図２Ａ～Ｂ）。成長率を逆に平衡にさせることによって作成されたプールが、より均等に平衡にされたプールを産生することができることを検証するために、時間に基づく逆成長率平衡の方法論を保持しながら、プールを構成する異なる細胞株を用いて実験を実施した（Ｈ３５８、ＮＣＩ－Ｈ２３、Ｈ２１２２、Ｈ２０３０、ＳＷ１５７３、ＳＫ－ＬＵ－１、Ｈ４４１、ＣＡＬＵ－１、Ｈ１７９２、Ｈ１３７３）。この第３のプールはまた、異なる細胞株にわたってより均等に分布する数の細胞を産生することができ、長期間のプールされた成長後の発現プロファイルの正確な転写推論を可能にすることが見出された（図３Ａ～Ｂ）。

【0082】

逆成長率及び時間平衡を用いたこれらの実験は、成長率を測定し、厳密な平衡アプローチに従って、定義された採取時に成長し、均等に表すことができる細胞プールを産生することが不可欠であることを実証した。これらのプールからの少量の試料のサンプリング（１００，０００個未満の細胞試料）は、起源の全ての細胞株からの代表を含み、一方、成長率逆平衡によって作成されなかったプールについては、起源の全ての細胞株からの代表を含むために、１００万個の細胞試料が必要であった（図１Ｇ）。

【0083】

ＧＥＮＥＶＡ包含基準の決定のための成長率測定
付着細胞株を、解凍後の２回の継代のために、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ中で増殖させた。次いで、細胞株をトリプシン（０．２５％）を使用して単一細胞懸濁液に解離させた。次いで、細胞数を電子細胞計数器具を使用して取得し、各細胞株の５，０００個の細胞を、２つの同一の９６ウェルプレートのウェルに個別に播種した。播種の２時間後、１つのプレートを、２時間でＰｒｏｍｅｇａからのｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ－ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）試薬を使用して細胞生存率についてアッセイした。簡潔に述べると、９６ウェルアッセイプレート中の培地をデカンティングによって除去し、５０μＬのＣＴＧ試薬を細胞を含有するプレートに直接添加した。３７Ｃで３０分間インキュベーションした後、９６ウェル互換性ルミノメータで１００Ｖでプレートを読み取り、細胞生存率を測定した。ＲＰＭＩ １０％ＦＢＳ中での７２時間の成長後、培地をデカンティングによって除去し、５０μＬのＣＴＧ試薬を、細胞を含有するプレートに直接添加した。３７℃で３０分間インキュベーションした後、９６ウェル互換性ルミノメータで１００Ｖでプレートを読み取り、細胞生存率を測定した。成長率を測定するために、７２時間の生の発光シグナルを、２時間の発光シグナルで割った。この比は、細胞数の倍増であると推定された。以後、Ｎｆ／Ｎ０と称する。次いで、式：ｒ＝ｌｎ（Ｎｆ／Ｎ０）／ｔを使用して、各細胞株の成長率を計算した。
式中、「ｒ」は成長率を表し、「ｔ」はアッセイの時間を表し、ｌｎは自然対数を表す。プールを構成する全ての細胞株の成長率は、このやり方で決定され、成長率が０．１を超え、０．４未満の細胞のみが、ＧＥＮＥＶＡプールに含めるための生存可能な候補であると決定された。これらのパラメータ外の成長率を有する細胞株は、ＧＥＮＥＶＡプールでの更なる検討から省略された。

【0084】

逆成長率及び時間比によるＧＥＮＥＶＡ細胞プールの作成
次いで、各細胞型からの表現がそれらの細胞成長率に反比例するように、各細胞型からの細胞を含めることによってプールを作成した。細胞数を採り、以下の計算を実施して、ＧＥＮＥＶＡプールに播種する細胞懸濁液の体積を決定した。
（標的細胞数／オイラー定数＾（成長率＊成長日数））／細胞数
ここで、標的細胞数は１億に等しく、成長率は、細胞成長アッセイによって決定された実施された測定値から採られ、成長日数は７日に等しかった。この式を使用して、ＧＥＮＥＶＡ細胞プールに添加される細胞の数を計算し、細胞を単一の懸濁液にまとめた。次いで、細胞を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ中の細胞培養物中で７日間成長させた。細胞を、０．２５％トリプシンでの解離によって単一細胞懸濁液に採取した。細胞生存率の推定及び細胞の２０００細胞／μＬへの希釈に続いて、単一細胞に、「１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ ｖ３．０」プロトコル」に指定されている「ＧＥＭ生成試薬」を装填した。１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ法に記載されているように、単一細胞懸濁液の更なる処理を実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定を実施して、細胞当たり２５，０００リードを得た。

【0085】

単一細胞から起源の患者へのデコンボリューションのための単一ヌクレオチド参照パネルの生成
上から続いて、ＧＥＮＥＶＡプールについて生存可能であると決定された細胞株を、次のように成長のために６ウェル細胞培養プレートに個別に播種した。細胞株をトリプシン（０．２５％）を使用して単一細胞懸濁液に解離させた。次いで、電子細胞計数器を使用して細胞数を取得し、各細胞株の２００，０００個の細胞を、６ウェル細胞培養プレートのウェルに個別に播種した。次いで、２ｍＬの培地を添加して、成長培地として機能させた。２日間の成長後、次いで、培地をデカントし、４００ｕＬのＴｒｉｚｏｌ ＲＮＡ抽出試薬を細胞に直接添加することによって、６ウェルプレートをＲＮＡ抽出のために採取した。ＲＮＡの抽出は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｔｒｉｚｏｌ ＲＮＡ抽出法を使用した。次いで、この手順を使用して抽出されたＲＮＡを、ＲＮＡｓｅフリーの微小遠心チューブに移し、２ｕＬのＲＮＡ溶液をナノドロップ器具上にアリコートすることによって純度をアッセイした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ互換性ＤＮＡライブラリを、Ｌｅｘｏｇｅｎの「Ｑｕａｎｔｓｅｑ」キットを使用して調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ機器上で配列決定した。

【0086】

ＧＥＮＥＶＡに適した細胞株からのプールされた遺伝的シグネチャデータ生成
次いで、ＧＥＮＥＶＡプールについて生存可能であると決定された細胞株を、ＧＥＮＥＶＡプールされた遺伝的シグネチャデータ生成のための細胞株の均等に分布したプール混合物に調製した。細胞株をトリプシン（０．２５％）を使用して単一細胞懸濁液に解離させた。次いで、細胞数を電子細胞計数器を使用して採取し、各細胞株の５００，０００個の細胞を、４℃（４Ｃ）で５ｍＬの１倍のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含有する１つの５０ｍＬの円錐形チューブに個別に播種した。全ての細胞株をプールされたＧＥＮＥＶＡ細胞株のチューブに添加した後、４００ｇで１０分間、４Ｃで遠心分離を実施した。上清をデカントし、細胞ペレットを５ｍＬの１倍のＰＢＳで再懸濁した。細胞を４００ｇで１０分間、４Ｃで再び回転させ、上清をデカントし、ペレットを２．５ｍＬの１倍のＰＢＳで再懸濁した。細胞を４００ｇで１０分間、４Ｃで再び回転させ、上清をデカントし、ペレットを０．５ｍＬの１倍のＰＢＳで再懸濁し、得られた溶液を４５ミクロンフィルタチューブを通して濾過して、汚染トリプシン及びウシ胎児血清を含まないプールされた細胞株の単一細胞懸濁液を得た。次いで、この溶液を自動細胞計数器を使用して計数し、２０００細胞／μＬに希釈した。また、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ、１倍のＰＢＳ：ＧＥＮＥＶＡプール、１倍のＰＢＳを１：１で計数で得ることによって、生細胞の推定を実施した。８５％を超える場合のプールの生存率を、単一細胞ＲＮＡ配列決定調製のために進行させた。細胞生存率の推定及び細胞の２０００細胞／μＬへの希釈に続いて、単一細胞に、「１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ ｖ３．０」プロトコルで指定される「ＧＥＭ生成試薬」を充填し、得られたＩｌｌｕｍｉｎａライブラリを、細胞当たり２５，０００リードの深度まで配列決定した。

【0087】

ｉ）個々の細胞株遺伝的シグネチャデータセットと、ｉｉ）プールされたＧＥＮＥＶＡ遺伝的シグネチャデータセットとの統合による、ＧＥＮＥＶＡ関連単一ヌクレオチド多型リストの作成
単一ヌクレオチド参照パネルからの配列決定データを最初に計算的に分解して、ＲＮＡ配列決定データからきれいな単一ヌクレオチド多型呼び出しを得た。配列決定ファイル（ｆａｓｔｑフォーマット）をリードごとにトリミングして、ポリ－アデニル化及びＴｒｕｓｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプター汚染を除去し、「ｂｗａ」全ゲノム整列ツールを使用して整列させ、「ｓａｍｔｏｏｌｓ」ツールを使用してソート及びフォーマットし、「ｕｍｉ＿ｔｏｏｌｓ」ツールを使用して一意の分子識別子によって重複除外した。配列アーチファクトをクリーニングし、ゲノム位置に完全に整列した個々のリードを、次いで、ツール「ｓａｍｔｏｏｌｓ ｍｐｉｌｅｕｐ」を使用して位置ごとにスタックし、次いで、「ｂｃｆｔｏｏｌｓ」及び「ｖｃｆ－ｍｅｒｇｅ」ツールを使用して、ｂｃｆ及び最終的に単一のマージされたｖｃｆデータ構造フォーマットに変換した。セクション１．ｄ（上記）からの配列決定データを計算的に分解して、単一細胞トランスクリプトームから完全なゲノム整列データを得た。配列決定ファイル（ｆａｓｔｑフォーマット）を、として１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓからの「ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ」ツールを使用して、整列させた「．ｂａｍ」フォーマットに処理した。次いで、得られた「．ｂａｍ」ファイルを、個々の細胞株ｖｃｆファイルと併せて下流データ統合に使用した。個々の細胞株からの全ての検出されたＳＮＰ変異（セクション１．ｄ．ｉ）を含むマージされた「．ｖｃｆ」ファイルと、単一細胞ＲＮＡ配列決定方法を使用して生成されたそれらの同じ株から作成されたＧＥＮＥＶＡプールからの全てのＳＮＰ変異を含む「．ｂａｍ」ファイルとを、ＳＮＰによる下流ＧＥＮＥＶＡ逆多重化に使用される関連のＳＮＰの選択及びフィルタリングのためのデータ統合のための入力として使用した。データ統合は、ＧＥＮＥＶＡプールからの単一細胞のそれらの起源の細胞株に戻す正確な遺伝子型決定を妨げる、計算的に無情報のＳＮＰを除去することを目的として実施した。マージされた「．ｖｃｆ」ファイルは、遺伝子座当たり２５０超のリードのフィルタリング基準で「．ｂａｍ」ファイルと交差して、「ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ」ツールを使用して両方のデータセット間の信頼性の高いリードマッピングのみを可能にした。次いで、これらのＳＮＰを、ｖｃｆアルゴリズムの改善を測定する方法としてツール「ｄｅｍｕｘｌｅｔ」を統合する再帰的アルゴリズムを使用して更にフィルタリングした。アルゴリズムは、マージされたｖｃｆファイルから各ＳＮＰを個別に削除して、テスト対象としてデータが差し引かれた「．ｖｃｆ」ファイルを生成した。次いで、このデータが差し引かれた「．ｖｃｆ」ファイルを「．ｂａｍ」ファイルと併せて使用して、ＳＮＰ忠実度による逆多重化の尺度である相対シングレット比を提供するｄｅｍｕｘｌｅｔを実行した。ＳＮＰ忠実度による全体的な逆多重化に対する単一ＳＮＰの個々の寄与を反復的にテストすることによって、高品質ＳＮＰの限られたリストに到達し、この特定のＧＥＮＥＶＡプールを使用した下流逆多重化及び更なるＧＥＮＥＶＡ実験のための高品質参照ＳＮＰとして使用した。

【0088】

実施例３－非成長平衡及び成長平衡３Ｄ不均一細胞プールに対して長時間プール成長及び薬物処理を実施する能力の比較
この実施例は、細胞への長期的な薬物の影響を理解することを可能にするために、薬物化合物で処理しながら、７２時間を超えてプールを成長させることを対象としている。

【0089】

１４日間の長期の処理持続時間を使用して、プールは、以下の式で「成長日数」変数を１４に設定することによって、実施例２に記載されるように平衡にされた。
（標的細胞密度／オイラー定数＾（成長率＊成長日数））／細胞数

【0090】

様々なモデルシステムに移植された不均一細胞プールを作成した。処理されたプールの少量の試料（総細胞の約１％）は、１４日間の処理にわたってその細胞株に対する薬物の影響を正確に評価するのに十分な起源の全ての細胞からの細胞を含有していた（図１Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）。対照的に、非成長平衡不均一３Ｄ細胞プール内の細胞の９０％は、１つの細胞型からのものであった（図１Ａ、Ｂ）。

【0091】

実施例４－ＧＥＮＥＶＡ細胞プールを使用したインビボ又はエクスビボ３Ｄモデルシステムの作成
この実施例は、インビボマウスモデル及びインビトロ３Ｄモデルシステムなどの複雑なモデルシステムに対する、薬物治療を使用した長期処理の影響を評価することを対象としている。

【0092】

長期間の薬物処理のために調整された成長率平衡不均一細胞プールを使用して、４つのヒト患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルからプールを作成し、脇腹異種移植片マウスモデルにプールされた腫瘍として移植した。プールされた腫瘍を、分子ＡＲＳ－１６２０を用いて１４日間強制的に経口投与することによってマウスに薬物を与えた。治療間隔の後、腫瘍をマウスから採取し、単一細胞ＲＮＡ配列決定、遺伝子逆多重化（実施例２に示すように）、及びバーコード化抗体を使用した試料ハッシュを実施した。トランスクリプトームへの薬物表現型及び薬物変化の推論のために、各ＰＤＸ遺伝的背景及び薬物処理条件（図２Ｃ、Ｄ）から十分な数の細胞を観察した。４つのＰＤＸモデルからのプールを、３Ｄオルガノイドモデルシステムにおける１４日間の薬物処理のための移植のために作成した。細胞プールを、３つの増加用量のＡＲＳ－１６２０（０．４ｕＭ、１．６ｕＭ、２５．０ｕＭ）及び１つのビヒクル条件で１４日間処理した。処理間隔の後、３Ｄオルガノイドから腫瘍を採取し、単一細胞ＲＮＡ配列決定、遺伝子逆多重化、及び試料ハッシュを実施した。オルガノイドモデルにおいて、各ＰＤＸ遺伝的背景及び薬物処理条件（図２Ａ、Ｂ）から十分な数の細胞を観察した。上記の方法を使用して、インビボ脇腹異種移植片マウスモデルに移植するためにヒト細胞株を使用してプールを更に作成した。

【0093】

３ＤオルガノイドＧＥＮＥＶＡモデルの移植、薬剤投与、及び採取
５ｍＬのマトリゲル基底膜試薬を、５Ｍ／ｍＬの最終濃度の成長率平衡によって調製したＧＥＮＥＶＡプールに添加した。５０マイクロリットルのこの溶液を６ウェルプレートに移し、３７Ｃで３０分間インキュベートした。オルガノイド培地（高度なＤＭＥＭ／Ｆ１２バース、１×Ｎ－２、１×Ｂ－２７、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１×Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、１％のＦＢＳ）を、一晩の回収のために細胞に添加した。１６時間後、オルガノイドに、オルガノイド培地中で希釈した薬物化合物で薬剤化した。オルガノイドを、新鮮な薬物化合物培地を７２時間ごとに添加した薬物培地中で１４日間成長させた。１４日目に、オルガノイドを手動解離によって採取し、１：１のＤＭＥＭ：Ｆ１２細胞培地、ＤＮＡｓｅ Ｉ（１０Ｕ／ｕＬ）中の１０ｍｇ／ｍＬのリベラーゼＴＭ細胞解離試薬中に再懸濁した。オルガノイドを、酵素解離のために、６００ＲＰＭで４５分間振盪しながら３７Ｃインキュベーター内でインキュベートし、次いで、４Ｃで８００ｇで５分間スピンダウンした。解離したオルガノイドを１００μＬの１倍のＰＢＳ中に再懸濁させた。

【0094】

インビボＧＥＮＥＶＡモデルの移植、薬剤化、及び採取
２ｍＬのマトリゲル基底膜試薬を、２０Ｍ／ｍＬの最終濃度の成長率平衡によって調製したＧＥＮＥＶＡプールに添加した。１００マイクロリットルのこの溶液を、脇腹異種移植片注射でＮＳＧマウスに注射した。２４時間後、ＧＥＮＥＶＡ腫瘍を有するマウスに、５％のＤＭＳＯ、９５％のラブラソルのビヒクル溶液中で薬物化合物で薬剤化した。マウスに１４日間の経口強制投与を行い、５日間投与し、２日間投与を中止した。１４日目に、マウスを犠牲にし、外科用せん断による均質化によって腫瘍を採取し、１：１のＤＭＥＭ：Ｆ１２細胞培地、ＤＮＡｓｅ Ｉ（１０Ｕ／μＬ）中の５ｍｇ／ｍＬのＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）細胞解離試薬中に再懸濁した。腫瘍を、酵素解離のために６００ＲＰＭで４５分間振盪しながら３７℃のインキュベーター内でインキュベートし、次いで４℃で８００ｇで５分間スピンダウンさせた。解離した腫瘍を１００μＬの１倍のＰＢＳに再懸濁させた。

【0095】

実施例５－単一ＲＮＡ配列決定及びトランスクリプトーム解析による細胞起源の同定
この実施例は、患者又は起源の細胞株への単一細胞の付与を対象としている。ＧＥＮＥＶＡ実験からのデータを使用して、ＧＥＮＥＶＡプールされたｍＲＮＡライブラリに対応するｆａｓｔｑ配列決定ファイル及び既知の遺伝子型を有する個々の生成された参照ＶＣＦファイルを得た。ＧＥＮＥＶＡ ｍＲＮＡライブラリを、ツールｆｒｅｅｍｕｘｌｅｔ及びｄｅｍｕｘｌｅｔ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｔａｔｇｅｎ／ｐｏｐｓｃｌｅ）を使用してデコンボリュートした。コンセンサスアプローチを採用して、ｄｅｍｕｘｌｅｔアプローチからのｆｒｅｅｍｕｘｌｅｔ及び既知の集団によってユニーク個体と呼ばれるクラスターをマッチングした。次いで、この遺伝子単独のアプローチをトランスクリプトーム情報と統合した。ＧＥＮＥＶＡ ｍＲＮＡライブラリデータを使用して細胞をクラスター化し、１０以上のライデン稀少性因子を有するクラスターを呼び出した。次いで、各転写的に定義されたライデンクラスターと各遺伝子単独集団との間に最大尤度マッチを与えて、各トランスクリプトームクラスターのパーセント頻度表現を得た。７０％超のカットオフを実装して、トランスクリプトームと遺伝子との間で高い精度を有し、この閾値未満のクラスターを除去したクラスターを取得した。

【0096】

遺伝学によるデコンボリューション
単一細胞を、単一細胞ＲＮＡに基づく単一ヌクレオチド多型呼び出しに基づいてデコンボリュートした。ｆｒｅｅｍｕｘｌｅｔを、実験への入力として使用される細胞型の数で固定されたクラスター番号で実行した。ｆｒｅｅｍｕｘｌｅｔによって決定されるように、遺伝的に異なる細胞の各群に与えられたＳＮＰを表すＶＣＦファイルを得た。次いで、単一株遺伝子型決定から生成された参照ＶＣＦを使用して、ｄｅｍｕｘｌｅｔを実行した。次いで、最大尤度アプローチを使用して、デマクレットに使用されるＶＣＦファイルとＶＣＦファイルとの間でＳＮＰを交差させ、各未知のｆｒｅｅｍｕｘｌｅｔクラスターをｄｅｍｕｘｌｅｔ ＶＣＦファイルから既知の参照細胞株に与えて、遺伝子型による最終的なクラスター付与を取得した。

【0097】

遺伝学によるデコンボリューションによるトランスクリプトーム情報の統合
ｍＲＮＡリードからの単一細胞ＲＮＡ配列決定フォーマットされた遺伝子数マトリックスデータを、遺伝学によるデコンボリューションによって与えられた単一細胞遺伝子型呼び出しと重ねた。これらの単一細胞遺伝子型呼び出しの知識がない場合、オーバークラスタリングが、１０を超えるライデン稀少性因子で、又はライデン因子の付与によって行われ、以下の式に従ってクラスターの総数をもたらした。
ｃｌｕｓｔｅｒｓ＿ｎｕｍｂｅｒ＝１０＊ｎｕｍｂｅｒ＿ｏｆ＿ｃｅｌｌｔｙｐｅｓ＿ｉｎ＿ｐｏｏｌ

【0098】

トランスクリプトームベース及び遺伝子ベースの呼び出しのカスタム統合機能を使用して、両方のデータソースに基づいて与えられた細胞型の最終リストに到達した。各ライデンクラスターについて、特定のＳＮＰ決定遺伝子型に属するそのクラスター内の細胞の割合を計算した。そのクラスター由来の細胞が７０％を超える１つのＳＮＰ決定遺伝子型に属する場合、このクラスターは、遺伝子及びトランスクリプトーム方法の両方によって高い信頼性としてマークされ、そのクラスターに対する遺伝子型割り当ては、全ての細胞の７０％を超える集団に変更された。７０％未満の信頼性を有する他の全てのクラスターは、遺伝学的付与及びトランスクリプトーム的付与の両方の間で調和していない低信頼性データポイントとして欠失のためにマークされた。

【0099】

実施例５の代表的なコード：
ｆｏｒｍａｔ＿ｆｒｅｅｍｕｘｖｃｆ：
＃＃＃試料を一意に区別するもののみをサブセットする
ｆｒｅｅｍｕｘ＿ｕｎｉｑ＝ｆｒｅｅｍｕｘ＿ｆｕｌｌ．ａｐｐｌｙ（ｌａｍｂｄａ ｒｏｗ：ｉｓ＿ｕｎｉｑ（ｒｏｗ），ａｘｉｓ＝１）
ｆｏｒｍａｔ＿ｄｅｍｕｘｌｅｔｖｃｆ：
＃＃＃試料を一意に区別するもののみをサブセットする
ｄｅｍｕｘ＿ｕｎｉｑ＝ｄｅｍｕｘ＿ｆｕｌｌ［ｄｅｍｕｘ＿ｆｕｌｌ．ｉｎｄｅｘ．ｉｓｉｎ（ｆｒｅｅｍｕｘ＿ｕｎｉｑ．ｉｎｄｅｘ）］
ｍａｔｃｈ＿ｄｅｍｕｘ＿ｆｒｅｅｍｕｘ（ｄｅｍｕｘ＿ｕｎｉｑ，ｆｒｅｅｍｕｘ＿ｕｎｉｑ）：
＃＃＃＃＃＃ｆｒｅｅｍｕｘとｄｅｍｕｘとの間で２つのｓｎｐを比較する
ｓｎｐｓｕｍ＝
ｃｏｍｐａｒｅ＿ｓｎｐｓ（ｄｅｍｕｘ＿ｕｎｉｑ．ｌｏｃ［ｓｎｐｉｄ］，ｆｒｅｅｍｕｘ＿ｕｎｉｑ．ｌｏｃ［ｓｎｐｉｄ］）
＃＃＃＃＃＃比較の可能な総数を得る
ｓｎｐｔｏｔａｌｓ＝ｇｅｔ＿ｓｎｐｔｏｔａｌｓ（ｄｅｍｕｘ＿ｕｎｉｑ）
＃＃＃＃＃＃比較の可能な総数によって除算する
ｔｍｐ＿ｒｏｗ＝［ｘ／ｓｎｐｔｏｔａｌｓ［ｉ］ｆｏｒ ｘ ｉｎ ｔｍｐ＿ｒｏｗ］
ｐｒｉｎｔ（ｓｎｐｔｏｔａｌｓ［ｉ］，ｔｍｐ＿ｒｏｗ）
ｓｕｍｓ＿ｍａｔｒｉｘ．ａｐｐｅｎｄ（ｔｍｐ＿ｒｏｗ）＼
＃＃＃＃＃＃最終の付与辞書を得る
ａｓｓｉｇｎ＿ｄｉｃｔ＝ｇｅｔ＿ａｓｓｉｇｎｄｉｃｔ（ｓｕｍｓ＿ｍａｔｒｉｘ）
＃＃＃＃＃＃単一細胞データへのｄｅｍｕｘｌｅｔ付与
ｃｏｒｒｅｃｔ＿ｄｅｍｕｘｌｅｔ（ａｄａｔａ，ｃｕｔｏｆｆ＝０．７，ｌａｂｅｌ＝’ｃｅｌｌ＿ｔｙｐｅ’）：
＃＃＃＃＃この機能は、トランスクリプトーム空間における各クラスターに細胞型を与えることによってｄｅｍｕｘｌｅｔ及びトランスクリプトーム呼び出しを補正する統合する。最大細胞型の割合を参照するパラメータ内に定義されたカットオフを使用する。＃＃＃＃＃＃
ｃｅｌｌｄｉｃｔ＝｛｝
＃＃＃
セット内のクラストについて（ａｄａｔａ．ｏｂｓ．ｌｅｉｄｅｎ）：
＃＃最初にクラスターのみを得る
ｃｌｕｓｔｄｆ＝ａｄａｔａ［ａｄａｔａ．ｏｂｓ．ｌｅｉｄｅｎ＝＝ｃｌｕｓｔ］．ｏｂｓ
＃＃割合を計算する
ｐｒｏｐｓ＝ｃｌｕｓｔｄｆ．ｇｒｏｕｐｂｙ（ｌａｂｅｌ）．ｃｏｕｎｔ（）［’ｂａｒｃｏｄｅ’］／（ｌｅｎ（ｃｌｕｓｔｄｆ））
＃＃カットオフに基づいて過半数があるかどうかを見る
ｍａｊｏｒｃｅｌｌ＝ｐｒｏｐｓ［ｐｒｏｐｓ＞ｃｕｔｏｆｆ］．ｉｎｄｅｘ．ｔｏｌｉｓｔ（）
＃＃全てのｃｅｌｌ＿ｔｙｐｅ値を最も豊富な値に変える
ｃｅｌｌｓ＝ｃｌｕｓｔｄｆ．ｉｎｄｅｘ．ｔｏｌｉｓｔ（）
ｉｆ ｌｅｎ（ｍａｊｏｒｃｅｌｌ）＝＝１：
＃＃辞書に加える
ｃｅｌｌｄｉｃｔ［ｃｌｕｓｔ］＝ｍａｊｏｒｃｅｌｌ［０］
ｅｌｓｅ：
ｃｅｌｌｄｉｃｔ［ｃｌｕｓｔ］＝’ｄｅｌｅｔｅ’
＃＃＃細胞型呼び出しを置き替える
ａｄａｔａ．ｏｂｓ［ｌａｂｅｌ］＝ａｄａｔａ．ｏｂｓ．ａｐｐｌｙ（ｌａｍｂｄａ ｒｏｗ：
ｒｅｐｌａｃｅ＿ｃｅｌｌｔｙｐｅｓ（ｃｅｌｌｄｉｃｔ，ｒｏｗ，ｌａｂｅｌ），ａｘｉｓ＝１）
＃＃＃信頼のない呼び出し（推定ダブレット）としてフラグされた細胞を除去する
ａｄａｔａ＝ａｄａｔａ［ａｄａｔａ．ｏｂｓ［ｌａｂｅｌ］！＝’ｄｅｌｅｔｅ’］

【0100】

実施例６－試料ハッシュ抗体のノイズ補正されたアルゴリズムを使用した実験試料起源の同定
この実施例は、ノイズ補正された試料ハッシュアルゴリズムを使用して、単一細胞をそれらの起源の試料に与えることを対象としている。カスタムベースラインリード調整されたアルゴリズムを使用して、抗体標識（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのＴｏｔａｌｓｅｑ）サブライブラリデータに従って単一細胞を逆多重化した。各細胞を、その起源の細胞プールにマッピングした（又は等価に、それが処理された薬物にマッピングした）。各細胞の付与に関連付けられた信頼度メトリックを開発し、試料起源同定の精度を９０％を超えるまで改善し、精度は、最大リード付与の標準的な方法よりも増加した（図９Ａ）。

【0101】

カスタムベースラインリード調整アルゴリズム
ここに記載されるステップは、カスタムベースラインリード調整アルゴリズムの動作を概説する。１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ Ｐｉｐｅｌｉｎｅからのホワイトリストとしての単一細胞ＲＮＡ配列決定バーコード識別子が得られた。抗体ハッシュ配列及びそれらのハッシュに関連付けられた対応する試料をリストする表を生成した。生のｆａｓｔｑデータをリードし、生のリードから定数配列を取り除き、ｓｃＲＮＡｓｅｑバーコード領域のみ及び抗体標識バーコード領域のみを単離した。バーコードを、１のハミング距離内でｓｃＲＮＡｓｅｑバーコードリードから単一細胞ホワイトリストに修正した。バーコードを、１のハミング距離内の抗体ハッシュ配列への抗体標識バーコードリードから修正した。リードは、両方のホワイトリストと絶対一致するように修正されたバーコードをポストハミングすることによってフィルタリングした。次いで、バーコードを中央値ベースラインリード調整アルゴリズムによって与えた。各抗体ハッシュについて、減算するバックグラウンドノイズは、以下の式に従って計算した：
ｍｅｄｉａｎ＿ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ＿ｆａｃｔｏｒ＊ｍｅｄｉａｎ＿ｒｅａｄｓ＿ｐｅｒ＿ａｎｔｉｂｏｄｙ
ここで、ｍｅｄｉａｎ＿ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ＿ｆａｃｔｏｒは、通常、最高のパフォーマンスのために約１．６である。各細胞について、その特異的抗体ハッシュのバックグラウンドとして計算されたリード数を差し引いて、生リードのカスタム抗体当たりのノイズ除去データセットを取得した。各細胞について、各抗体ハッシュからのリードの割合を計算した。単一細胞バーコードの最終リスト、及びそれらの対応する最高確率抗体ハッシュ、及び対応する信頼区間値を返した。信頼区間は、最良の識別子からのリードの割合を取り、２番目の最良の識別子からのリードの割合を差し引いて計算した。各細胞からの最もスコアリングされた抗体ハッシュを最良の識別子として与えた。信頼区間が０．４以下の細胞を除去した。

【0102】

実施例６の代表的なコード
ｄｅｆ ｃｏｒｒｅｃｔ＿ｍｅｄｉａｎ（ｒｅａｄｍａｔｒｉｘｍｅｄ＿ｆａｃｔｏｒ＝１．４）：
＃＃＃＃＃各バーコードの係数を掛けた中央値を引く（つまり、背景を除去する）
ｔｅｓｔｍｅｄ＝ｐｉｖｏｔ．ｔｒａｎｓｐｏｓｅ（）－ｍｅｄ＿ｆａｃｔｏｒ＊（ｐｉｖｏｔ．ｔｒａｎｓｐｏｓｅ（）．ａｐｐｌｙ（ｎｐ．ｍｅｄｉａｎ））
＃＃＃＃＃負数をゼロに設定する
ｔｅｓｔｍｅｄ［ｔｅｓｔｍｅｄ＜０］＝０
＃＃＃細胞ごとにｐｃｔを計算する
ｔｅｓｔｍｅｄ＝ｔｅｓｔｍｅｄ／ｔｅｓｔｍｅｄ．ｓｕｍ（）
＃＃＃＃有意値を得て細胞を呼び出す
ｎｅｗ＝ｔｅｓｔ．ｃｏｐｙ（）
ｎｅｗ［’ｃａｌｌ’］＝ｔｅｓｔ．ａｐｐｌｙ（ｌａｍｂｄａ ｒｏｗ：ｇｅｔ＿ｓｉｇ（ｌｉｓｔ（ｒｏｗ），ｌｉｓｔ（ｔｅｓｔ．ｃｏｌｕｍｎｓ）），ａｘｉｓ＝１）
ｐｙｍｕｌｔｉ（Ｒ１，Ｒ２，ｂｃｓ１０ｘ，ｌｅｎ＿１０ｘ＝１６，ｌｅｎ＿ｕｍｉ＝１２，ｌｅｎ＿ｍｕｌｔｉ＝８，ｍｅｄ＿ｆａｃｔｏｒ＝１．６，ｇｂｃ＿ｔｈｒｅｓｈ＝Ｎｏｎｅ，ｓａｍｐｎａｍｅ＝’ｐｙｍｕｌｔｉ＿’，ｓｐｌｉｔ＝Ｔｒｕｅ，ｐｌｏｔｓ＝Ｔｒｕｅ，ｈａｍｍｉｎｇ＝Ｆａｌｓｅ，ｔｈｒｅｓｈ＝Ｆａｌｓｅ，ｐｃｔ＿ｏｎｌｙ＝Ｆａｌｓｅ，ｍｅｄｉａｎ＿ｏｎｌｙ＝Ｆａｌｓｅ，ｈｕｇｅ＝Ｆａｌｓｅ，ｂｃｓｍｕｌｔｉ＝Ｎｏｎｅ，ｒｅａｄｓ＝Ｎｏｎｅ，ｔｈｒｅｓｈ＿ｄｉｃｔ＝｛｝）：
”””ｍａｉｎ ｌｏｏｐ，ｓｐｌｉｔｓ ｆｒｏｍ ｆａｓｔｑｓ ａｎｄ ｒｕｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｅｌｌ ｃａｌｌｓ
Ｒ１＝ｍｕｌｔｉｓｅｑ／ハッシュ分数のＲｅａｄ１ ｆａｓｔｑ
Ｒ２＝ｍｕｌｔｉｓｅｑ／ハッシュ分数のＲｅａｄ２ ｆａｓｔｑ
ｂｃｓｍｕｌｔｉ＝既知のｍｕｌｔｉｓｅｑ／ハッシュバーコードのホワイトリスト
ｂｃｓ１０ｘ＝既知の細胞識別子のホワイトリスト
ｌｅｎ１０ｘ＝１０ｘバーコードの長さ
ｌｅｎ＿ｕｍｉ＝リードの各対のｕｍｉの長さ
ｌｅｎ＿ｍｕｌｔｉ＝パッケージが分割するｍｕｌｔｉｓｅｑバーコード配列の長さ
ｍｅｄ＿ｆａｃｔｏｒ＝中央値補正を行う場合、これは、バーコード当たりの背景リードの量を推定するために中央値によって掛けられる係数である
ｓａｍｐｎａｍｅ＝これは、中間ファイルが保存されるハンドルである
ｓｐｌｉｔ＝まだｆａｓｔｑからこれを分割していない場合はＴｒｕｅであり、既にこれを分割しおり、処理を戻したい場合はＦａｌｓｅである。これは時間を節約する。
ｈａｍｍｉｎｇ＝ｍｕｌｔｉｓｅｑ／ハッシュホワイトリストに対して１のハミング距離内で一致ｍｕｌｔｉｓｅｑハーコードを使用したい場合はＴｒｕｅである
ｔｈｒｅｓｈ＝リード、異なる補正方法をゲートするために閾値を使用したい場合はＴｒｕｅである
ｐｃｔ＿ｏｎｌｙ＝リードの生の割合のみを使用してバーコードを呼び出したい場合はＴｒｕｅである
ｍｅｄｉａｎ＿ｏｎｌｙ＝中央値補正方法を使用したい場合はＴｒｕｅである
ｈｕｇｅ＝ファイルが巨大な場合にＴｒｕｅであり、この場合、ピクリングではなくｈ５ファイルとして保存される
ｔｈｒｅｓｈ＿ｄｉｃｔ＝バーコードの辞書：試料のリードをゲートするために使用される閾値
”””
＃＃＃
ｉｆ ｈｕｇｅ＝＝Ｔｒｕｅ：ｐｒｉｎｔ（「巨大なｆａｓｔｑｓを想定する」）
＃＃＃ｆａｓｔｑｓとピックルとを分割
ｏｓ．ｓｙｓｔｅｍ（’ｍｋｄｉｒ ｐｙｍｕｌｔｉ’）
ｉｆ ｓｐｌｉｔ＝＝Ｔｒｕｅ：ｒｅａｄｓ＝
ｓｐｌｉｔ＿ｒａｗｄａｔａ（Ｒ１，Ｒ２，ｌｅｎ＿１０ｘ，ｌｅｎ＿ｕｍｉ，ｌｅｎ＿ｍｕｌｔｉ，ｓａｍｐｎａｍｅ，ｈｕｇｅ＝ｈｕｇｅ）
＃＃＃古いピックルデータをリードする
ｒｅａｄｔａｂｌｅ＝ｒｅａｄ＿ｐｉｃｋｌｅ（ｓａｍｐｎａｍｅ，ｒｅａｄｓ＝ｒｅａｄｓ，ｈｕｇｅ＝ｈｕｇｅ）
＃＃＃＃＃マルチレート及び１０倍レートの重複をチェックする
ｍｕｌｔｉｒａｔｅ＝ｃｈｅｃｋ＿ｓｔａｔｓ（ｒｅａｄｔａｂｌｅ，ｂｃｓｍｕｌｔｉ，ｂｃｓ１０ｘ）
＃＃＃＃ハミング距離で一致する
ｉｆ ｈａｍｍｉｎｇ＝＝Ｔｒｕｅ：
ｒｅａｄｔａｂｌｅ．ｄｒｏｐ＿ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ（ｉｎｐｌａｃｅ＝Ｔｒｕｅ）
ｍａｔｃｈｂｙ＿ｈａｍｄｉｓｔ（ｒｅａｄｔａｂｌｅ，ｂｃｓｍｕｌｔｉ，ｂｃｓ１０ｘ）
＃＃＃＃＃マルチレート及び１０倍レートの重複をチェックする
ｍｕｌｔｉｒａｔｅ＝ｃｈｅｃｋ＿ｓｔａｔｓ（ｒｅａｄｔａｂｌｅ，ｂｃｓｍｕｌｔｉ，ｂｃｓ１０ｘ）
＃＃＃＃フィルターリード表
ｆｉｌｔｄ＝ｆｉｌｔｅｒ＿ｒｅａｄｔａｂｌｅ（ｒｅａｄｔａｂｌｅ，ｂｃｓｍｕｌｔｉ，ｂｃｓ１０ｘ，ｇｂｃ＿ｔｈｒｅｓｈ）
＃＃＃＃分布ｚｓｃｏｒｅｓ内でのｍｕｌｔｉｓｅｑ補正を実装する
ｉｆ ｍｅｄｉａｎ＿ｏｎｌｙ＝＝Ｔｒｕｅ：
ｃｏｒｒｅｃｔ＿ｍｅｄｉａｎ（ｆｉｌｔｄ，ｓａｍｐｎａｍｅ，ｍｅｄ＿ｆａｃｔｏｒ，ｐｌｏｔｓ）
ｅｌｓｅ：
ｃｏｒｒｅｃｔ＿ｓｉｍｐｌｅ（ｆｉｌｔｄ，ｓａｍｐｎａｍｅ，ｐｌｏｔｓ，ｔｈｒｅｓｈ，ｐｃｔ＿ｏｎｌｙ，ｔｈｒｅｓｈ＿ｄｉｃｔ）
ｒｅｔｕｒｎ（ｆｉｌｔｄ）

【0103】

実施例７－ＧＥＮＥＶＡを使用した候補薬剤に対する感受性の遺伝的ドライバーの決定
この実施例は、ＧＥＮＥＶＡ細胞プールからの表現型の同時推論による、薬物化合物に対する感受性の遺伝的ドライバーの発見を対象としている。長期間の成長平衡細胞プールを作成し、薬物処理に供した。実施例５に記載の方法を使用した遺伝子逆多重化及び実施例６に記載の試料ハッシュ逆多重化を使用した起源の患者及び薬物処理状態への付与の後、図２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆに示されるように、各薬物処理条件における別個の数の細胞を有するデータセットを得た。各細胞型について、各薬物処理条件で残っている生存細胞の相対数を計数し、この薬物感受性情報を線形モデルの応答変数として使用した。全ての細胞株についての完全なエクソーム遺伝子変異データを取得し、これらの特徴を線形モデル回帰の説明変数として使用した。ラッソ特徴選択モデルを適用して、どの遺伝子変異が異なる化合物に対する薬物感受性に関与したかを決定した。特定の遺伝子突然変異を有する細胞株を標的とする既知の化合物、具体的には、ＢＲＡＦ．Ｖ６００Ｅ突然変異を有する細胞を標的とするベムラフィニブ（ＶＥＭ）、又はＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ突然変異を有する細胞を標的とするＡＲＳ－１６２０（ＡＲＳ）を概念実験の実証に使用した。ラッソモデルを使用した回帰は、これらの化合物に関する事前の知識に沿って、ベムラフィニブ及びＡＲＳ－１６２０の両方について、化合物に対する感受性を誘発する変異を正しく予測した（図３Ｂ、３Ｃ）。いくつかの用量のＡＲＳ１６２０を使用して、同時にＩＣ５０測定に相当する複数の細胞型（図３Ｄ）の生存曲線を生成するのに十分な情報を１つのプールされた実験で生成した。これらの相対的感受性を、細胞株にわたって比較して、ＡＲＳ１６２０に対して多かれ少なかれ感受性であった細胞株をランク付けした（図３Ｅ）。

【0104】

薬物表現型の決定に、ＧＥＮＥＶＡアッセイからのトランスクリプトーム的データも使用した。インビボ及びエクスビボシステムの両方でＡＲＳ－１６２０を使用した薬物処理後、既知のＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ変異を有する患者由来の異種移植片は、細胞周期阻害率の推定によって、化合物（患者８７７及び２３３）に感受性であることが示された（図３Ｆ）。このＰＤＸの文脈では、データセットはまた、感受性のあるドライバー変異（ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ）を推測することを可能にした。

【0105】

薬物に対する細胞型の適応度の計算
各薬物条件における細胞の数を、起源細胞型に従って計数した。次いで、これらの生の数値を、薬物処理条件間の総細胞数の差を調整し、以下の式に従って、各細胞型について調整された適応度計算を返す正規化ベースの関数の入力として使用した。

【0106】

各細胞型について、Ｃｉは、各薬物及びビヒクル対について、それぞれ、Ｄｘ及びＤ０、並びに以下のデータ構造を有する細胞数の行列を与えられる：

【表1】

比例表現に基づいて、薬物Ｄｘに対する細胞型Ｃｉの適応度を以下のように計算した：
Ｆ（Ｃｉ，Ｄｘ）＝（（＃ｃｅｌｌｓ Ｄｘ，Ｃｉ）／ＳＵＭ（＃ｃｅｌｌｓ Ｄｘ））／（＃ｃｅｌｌｓ Ｄ０，Ｃｉ）／ＳＵＭ（＃ｃｅｌｌｓ Ｄ０））

【0107】

試料はまた、比例計算を逃れる可能性のある総細胞数の差異を考慮して調整係数を計算することによって、相対的な試料正規化に従って、データセットサイズに基づいて調整した。

【0108】

各薬物又はビヒクルＤｘについて、各条件での細胞の総数を計数し、総細胞数の幾何平均を計算し、各条件での細胞の総数を細胞数の幾何平均で割って、正規化比率を得た。以下の行列を各条件Ｄｘの対応する正規化で割って、幾何平均比ベースの補正に従ってデータセットサイズに対して調整された細胞数の最終補正行列を得た。

【表2】

【0109】

これらの適応度計算の各々について、相対適応度は次のように計算された：
細胞株の適応度Ｙ＝
（細胞株Ｙの適応度）／（プール内の全ての細胞株間の最大適応度）

【0110】

薬物感受性の遺伝子型ドライバーの発見のためのラッソ回帰
各細胞型についての全エクソームデータ配列決定データに由来する変異をダウンロードし、少なくとも２つの異なる細胞型にわたる交差のために分類した。次いで、これらを、特徴選択のためのラッソ回帰アルゴリズムへの入力に適した従属変数の表にフォーマットした。対になった方法で、各細胞株の適応度も計算され、ラッソアルゴリズムの応答変数としてフォーマットされた。次に、ラッソ回帰を、０．０５～０．３０の間のアルファで、５０の間隔ステップで実行して、ＧＥＮＥＶＡ細胞応答を予測する最も関連性の高い変異を見出した。最高スコアの説明変数遺伝子変異は、それらの共変量によってランク付けされ、薬物感受性のドライバーとして指定された。

【0111】

ＡＲＳ－１６２０複数用量曲線にわたるＧＥＮＥＶＡ表現型に基づく再構築されたＩＣ５０曲線
細胞数を、異なる薬物処理条件にわたって、具体的には、異なる濃度の薬物にわたって得た。採取時点で、これらの数値に注釈を付け、各細胞型の細胞の絶対数を計算するために使用した。式は以下のとおりとした。
薬物条件Ｄｘにおける細胞型Ｃｙの細胞の絶対数＝
（ＤｘにおけるＣｙの計数された細胞数）／
（Ｄｘでの計数された細胞の総数）＊
採取時の注釈から計数された細胞の数

【0112】

次いで、これらの数値をロジスティック回帰適合への入力として使用し、ＩＣ５０曲線を複数の投与細胞数から補間した。

【0113】

表現型リードアウトとしての細胞計数の代替プロキシとしての細胞周期阻害率の決定
細胞周期は、異なる細胞周期状態に関連する目的の特定の遺伝子に従って、全トランスクリプトームのリードアウト及び重み付けを回帰させることによって計算した。細胞をＧ１、Ｓ、及びＧ２／Ｍに与えた。次いで、細胞周期比を、集団当たりの細胞の割合として計算した。
（Ｇ２Ｍの＃ｃｅｌｌｓ）／（合計＃ｃｅｌｌｓ）

【0114】

次いで、これらの比率を、それらが供される受ける実験用量レジメンにわたる線形関数としてプロットした。この場合、ＡＲＳ－１６２０（ｕＭ）の用量曲線である。この関数の、
ｘ＝ＡＲＳ－１６２０（ｕＭ）
ｙ＝（Ｇ２Ｍの＃ｃｅｌｌｓ）／（合計＃ｃｅｌｌｓ） との線形適合は、
傾きが細胞周期阻害率として決定された関数をもたらし、長い経過にわたるトランスクリプトーム薬物摂動データのみに由来する表現型を測定するための別の方法を反映した。

【0115】

実施例７の代表的なコード
＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃
薬物に対する細胞型の適応度の計算
＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃
＃＃＃＃各処理データセットの長さを得る
ｓｉｚｅｄｉｃｔ＝｛｝
セット内の薬物（ａｄａｔａ．ｏｂｓ［ｔｒｅａｔｍｅｎｔ］）：
ｏｎｅｄｆ＝ａｄａｔａ［ａｄａｔａ．ｏｂｓ［ｔｒｅａｔｍｅｎｔ］＝＝ｄｒｕｇ］．ｏｂｓ
ｓｉｚｅｄｉｃｔ［ｄｒｕｇ］＝ｌｅｎ（ｏｎｅｄｆ）
＃＃＃＃ｄｅｓｅｑ ｎｏｒｍａｌｉｚｅ
ｄｅｓｅｑ＿ｎｏｒｍ＝＝Ｔｒｕｅの場合：
＃＃型別に細胞を計数する
セット内の細胞型について（ａｄａｔａ．ｏｂｓ［ｌａｂｅｌ］）：
＃＃＃＃計数する
ｏｎｅｄｆ＝ａｄａｔａ［ａｄａｔａ．ｏｂｓ［ｌａｂｅｌ］＝＝ｃｅｌｌｔｙｐｅ］
ｐｒｏｐｓ＝ｐｄ．ＤａｔａＦｒａｍｅ（ｏｎｅｄｆ．ｇｒｏｕｐｂｙ（［ｔｒｅａｔｍｅｎｔ］）．ｃｏｕｎｔ（）［’ｂａｒｃｏｄｅ’］）
ｒｅｓｕｌｔｓ［ｃｅｌｌｔｙｐｅ］＝ｐｒｏｐｓ［’ｂａｒｃｏｄｅ’］
＃＃＃＃＃疑似参照を作成しｄｅｓｅｑを実行する
ｐｓｅｕｄｏ＝ｒｅｓｕｌｔｓ／ｇｍｅａｎ（ｒｅｓｕｌｔｓ．ｉｌｏｃ［：，：］，ａｘｉｓ＝０）
＃＃＃＃＃補正する
ｒｅｓｕｌｔｓ＝ｒｅｓｕｌｔｓ．ｔｒａｎｓｐｏｓｅ（）／ｒａｔｉｏ．ｔｏｌｉｓｔ（）
＃＃＃＃＃全てをビヒクルで割る
ｒｅｓｕｌｔｓ＝ｒｅｓｕｌｔｓ．ｄｉｖ（ｒｅｓｕｌｔｓ［ｖｅｈｉｃｌｅ］，ａｘｉｓ＝０）
＃＃＃＃定期的な正規化
ｅｌｓｅ：
＃＃＃＃ビヒクルに対する適応度を得るために、細胞株ごとに相対的な割合を計算する
＃＃データを結果に保存する
セット内の細胞型について（ａｄａｔａ．ｏｂｓ［ｌａｂｅｌ］）：
＃＃＃＃計数する
ｏｎｅｄｆ＝ａｄａｔａ［ａｄａｔａ．ｏｂｓ［ｌａｂｅｌ］＝＝ｃｅｌｌｔｙｐｅ］．ｏｂｓ
ｐｒｏｐｓ＝ｐｄ．ＤａｔａＦｒａｍｅ（ｏｎｅｄｆ．ｇｒｏｕｐｂｙ（［ｔｒｅａｔｍｅｎｔ］）．ｃｏｕｎｔ（）［’ｂａｒｃｏｄｅ’］）
ｐｒｏｐｓ＝ｐｄ．ＤａｔａＦｒａｍｅ（ｐｒｏｐｓ．ａｐｐｌｙ（ｌａｍｂｄａ ｒｏｗ：ｒｏｗ［’ｂａｒｃｏｄｅ’］／ｓｉｚｅｄｉｃｔ［ｒｏｗ．ｎａｍｅ］，ａｘｉｓ＝１））
＃＃＃全てをビヒクルで割る
ｒｅｓｕｌｔｓ＝ｒｅｓｕｌｔｓ．ｄｉｖ（ｒｅｓｕｌｔｓ［ｖｅｈｉｃｌｅ］，ａｘｉｓ＝０）
＃＃＃全てを最大にスケーリングする
ｒｅｓｕｌｔｓ＝ｒｅｓｕｌｔｓ／ｒｅｓｕｌｔｓ．ｍａｘ（）
＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃
薬物感受性の遺伝子型ドライバーの発見のためのラッソ回帰
＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃
＃＃＃＃＃＃＃２つ以上に存在する変異のみを得る
ｕｎｉｑ＝ｐｄ．ＤａｔａＦｒａｍｅ（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ＿ｔａｂｌｅ．ｓｕｍ（ａｘｉｓ＝０））
ｕｎｉｑ＝ｕｎｉｑ［ｕｎｉｑ［０］！＝１］
ｕｎｉｑ＝ｕｎｉｑ．ｉｎｄｅｘ．ｔｏｌｉｓｔ（）
ｔａｂｌｅ＝ｔａｂｌｅ［ｕｎｉｑ］
＃＃＃＃＃応答変数をインポートする
ｖｅｍ＝ｆｉｔｎｅｓｓ［’ＶＥＭ’］
ａｒｓ＝ｆｉｔｎｅｓｓ［’ＡＲＳ１６２０’］
＃＃＃＃＃＃＃＃応答変数を遺伝子発現データに入れる
ｖｅｍ＿ｘ［’ｙ’］＝ｖｅｍ＿ｘ．ａｐｐｌｙ（ｌａｍｂｄａ ｒｏｗ：ｖｅｍｕｒａｆｉｎｉｂ＿ｄｉｃｔ［ｒｏｗ．ｎａｍｅ］，ａｘｉｓ＝１）
＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃検索するアルファ範囲を定義する
ａｌｐｈａｓ＝ｎｐ．ｌｉｎｓｐａｃｅ（０．０５，０．３，５０）
ａｌｐｈａｓ＝ａｌｐｈａｓ［：：－１］
ｃｏｅｆｓ＝［］
＃＃＃＃＃＃＃＃アルファを計算する
アルファにおけるアルファ：
ｒｅｇ＝ｌｉｎｅａｒ＿ｍｏｄｅｌ．Ｌａｓｓｏ （ａｌｐｈａ＝ａｌｐｈａ）
ｒｅｇ．ｆｉｔ（ｖｅｍ＿ｘ，ｖｅｍ＿ｙ）
ｃｏｅｆｓ．ａｐｐｅｎｄ（ｒｅｇ．ｃｏｅｆ＿）
＃＃＃＃＃＃＃＃全ての遺伝子変異の係数を視覚化する
ｌｏｇ＿ａｌｐｈａｓ＝－ｎｐ．ｌｏｇ１０（ａｌｐｈａｓ）
ｃｏｅｆｓ＝ｎｐ．ｔｒａｎｓｐｏｓｅ（ｃｏｅｆｓ）
ｃｏｅｆ，ｃ ｉｎ ｚｉｐ（ｃｏｅｆｓ，ｃｏｌｏｒｓ）：
ｐｌｔ．ｐｌｏｔ（ｌｏｇ＿ａｌｐｈａｓ，ｃｏｅｆ，ｃ＝ｎｐ．ｒａｎｄｏｍ．ｒａｎｄ（３，），ｌｉｎｅｗｉｄｔｈ＝３．０）
＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃
ＡＲＳ－１６２０複数用量曲線にわたるＧＥＮＥＶＡ表現型に基づく再構築されたＩＣ５０曲線
＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃
＃＃＃＃細胞型及び薬物にわたって細胞の数をスケーリングする
ｔｍｐ＝ｉｎｖｉｔｒｏ＿ｃｌｅａｎ．ｏｂｓ［［’ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ’，’ｓａｍｐｌｅ’］］
ｔｍｐ＝ｐｄ．ｐｉｖｏｔ＿ｔａｂｌｅ（ｔｍｐ，ｖａｌｕｅｓ＝’ｉｎｄｅｘ’，ｉｎｄｅｘ＝［’ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ’］，ｃｏｌｕｍｎｓ＝［’ｓａｍｐｌｅ’］，
ａｇｇｆｕｎｃ＝ｌａｍｂｄａ ｘ：ｌｅｎ（ｘ．ｕｎｉｑｕｅ（）））
＃＃＃＃用量レジメンを定義する
ｃｏｎｃ＿ｄｉｃｔ＝｛
’Ｃ０＿１’：０．００，
’Ｃ０＿２’：０．００，
’Ｃ１＿１’：０．４，
’Ｃ１＿２’：０．４，
’Ｃ２＿１’：１．６，
’Ｃ２＿２’：１．６，
’Ｃ３＿２’：６．３，
’Ｃ４＿１’：２５．０，
’Ｃ４＿２’：２５．０
｝
＃＃＃＃＃採取時の注釈からの細胞数を掛ける
ｔｍｐ＝ｔｍｐ＊［ａｎｎｏｔａｔｅｄ＿ａｃｔｕａｌ＿ｃｅｌｌ＿ｃｏｕｎｔｓ］
＃＃＃＃ロジスティック回帰
ｓｎｓ．ｌｍｐｌｏｔ（ｄａｔａ＝ｔｍｐ，ｘ＝”ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｕＭ）”，ｙ＝”％ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｌｏｇｉｓｔｉｃ＝Ｔｒｕｅ）

【0116】

実施例８－ＧＥＮＥＶＡを使用した長期薬物処理における候補薬剤のミトコンドリア作用機構の同定
この実施例は、ＧＥＮＥＶＡを使用したミトコンドリア遺伝子下方制御による化合物ＡＲＳ１６２０の作用の分子機構の同定を対象としている。

【0117】

長期間のＧＥＮＥＶＡプールは、ＡＲＳ１６２０がヒト細胞内で持続的な腫瘍退縮をどのように達成したかを理解するために作成された。７日間の薬物処理レジメンを行い、生存細胞のトランスクリプトーム変化を分析した。ミトコンドリアにコードされた遺伝子を下方制御し、ミトコンドリアに対するＡＲＳ１６２０の効果を示した（図６Ａ～Ｂ）。検証として、ＡＲＳ１６２０下で長期処理を行った実験株の生成は、ミトコンドリアが長期ＡＲＳ１６２０処理後に有意に除去されることを示した（図６Ｃ）。細胞呼吸のアッセイを使用して、ミトコンドリアの部位での機能的酸素消費量の有意差も、ＡＲＳ１６２０処理の結果として検出された（図６Ｄ）。ＧＥＮＥＶＡプールを構成する各細胞株内の細胞の亜集団組成物の分析は、ＡＲＳ１６２０による薬物処理後、生存した細胞は、全体的なリードと比較して、有意に低いミトコンドリアリードの割合を示したことを明らかにし、ミトコンドリア遺伝子発現が下方制御された細胞の集団レベル選択圧を示した（図６Ｅ）。

【0118】

因果遺伝子セット発見のための薬物条件と非薬物条件との間の各細胞株の差異的発現
各細胞株について、単一細胞データセットを、ビヒクル処理されたものと薬物処理されたものとの２つのサブデータセットに分割した。差異的発現は、２試料ｔ検定を使用して２つの単一細胞データセット間で計算した。２試料ｔ検定出力から各遺伝子の差異的発現スコアを得た。全ての細胞株を完了するまで繰り返し、遺伝子の全ての差異的発現スコアを、細胞株ごとに集約された差異的発現表に保存した。細胞を、試験した化合物に対する表現型感受性に従ってグループ化した。試験した化合物については、本明細書に先に記載したように、化合物感受性の遺伝的ドライバーを発見した。遺伝的ドライバーを使用して、細胞株は、ドライバーの存在又は非存在によって、感受性と非感受性の２つのカテゴリーに分類された。差異的発現行列を、感受性及び非感受性細胞株にグループ化した。各細胞株内の遺伝子のｚスコアを計算し、遺伝子を、科学文献からキュレーションされた生物学的遺伝子セットデータベースからの遺伝子セットによってグループ化し、グループ化されたｚスコアを有する２つの試料Ｔ検定を実施した。第一に、全ての差異的発現スコアを、各細胞株内のｚスコアによって同じスケールに正規化した。差異的発現行列内の全ての遺伝子について、ｍＳＩＧＤＢデータベースの各々から取り出されたグループ化の辞書を作成した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｓｅａ－ｍｓｉｇｄｂ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／）。ｍＳＩＧＤＢからの遺伝子の各グループ化について、２つの試料Ｔ検定を、全ての「感受性」及び「非感受性」細胞株を複製物として個別に取り扱う各遺伝子セットについて実施した。各遺伝子検査からの要約統計を保存し、ｚスコア差を計算した。目的の分子の生物学的作用機構は、各遺伝子セットからのｚスコア結果の中央値を順位付けして、化合物に応答して遺伝子セットの相対的な上方制御又は下方制御を決定することによって決定した。

【0119】

実施例８の代表的なコード
＃＃＃＃デスコア行列
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ
＃＃＃＃ｍｓｉｇｄｂフルデータベース
ｍｓｉｇｄｂ
＃＃＃＃
ｄｅ＿ｚｓｃｏｒｅｄ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ＝ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ．ａｐｐｌｙ（ｚｓｃｏｒｅ， ａｘｉｓ＝０）
ｇｅｎｅｓｅｔｓ＿ｚｓｃｏｒｅｄ＝ｄｅ＿ｚｓｃｏｒｅｄ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ．ｇｒｏｕｐｂｙ（ｂｙ＝ｍｓｉｇｄｂ）
ｔｔｅｓｔ＿ｒｅｓｕｌｔｓ＝ｇｅｎｅｓｅｔｓ＿ｚｓｃｏｒｅｄ．ａｐｐｌｙ（ｌａｍｂｄａ ｒｏｗ：ｓｔａｔｓ．ｔｔｅｓｔ＿ｉｎｄ（ｒｏｗ［’ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ’］，ｒｏｗ［‘ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ’］），ａｘｉｓ＝１）
ｍｅｄｉａｎ＿ｚｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓｕｌｔｓ＝ｇｅｎｅｓｅｔｓ＿ｚｓｃｏｒｅｄ．ａｐｐｌｙ（ｌａｍｂｄａ ｒｏｗ：ｎｐ．ｍｅｄｉａｎ（ｒｏｗ［’ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ’］）－ｎｐ．ｍｅｄｉａｎ（ｒｏｗ［‘ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ’］），ａｘｉｓ＝１）
＃＃＃＃これらは、遺伝的ドライバーによって分類された、感受性の高い、感受性の低い株の同一性である
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ＿ｌｉｎｅｓ
ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ＿ｌｉｎｅｓ
＃＃＃＃デスコア行列
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ
＃＃＃＃
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓのｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅの場合：
ｉｆ ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ ｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ＿ｌｉｎｅｓ：
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ［ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ］．ｉｎｄｅｘ．ｒｅｐｌａｃｅ（“ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ”）
ｉｆ ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ ｉｎ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ＿ｌｉｎｅｓ：
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ［ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ］．ｉｎｄｅｘ．ｒｅｐｌａｃｅ（“ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ”）
＃＃＃ｓｃｄａｔａには、全ての単一細胞データがａｎｎｄａｔａデータ構造フォーマットで含まれている
＃＃＃ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓには、このセクションからの最終出力が含まれている
ｓｃａｎｐｙをｓｃとしてインポートする
ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓのｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅの場合：
ｖｅｈｉｃｌｅ＿ｄａｔａ＝ｓｃｄａｔａ［ｓｃｄａｔａ．ｏｂｓ．ｄｒｕｇ＝＝‘ｖｅｈｉｃｌｅ’］
ｄｒｕｇ＿ｄａｔａ＝ｓｃｄａｔａ［ｓｃｄａｔａ．ｏｂｓ．ｄｒｕｇ＝＝‘ｄｒｕｇ’］
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ＿ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＝ｓｃ．ｔｌ．ｒａｎｋ＿ｇｅｎｅｓ＿ｇｒｏｕｐｓ（ｖｅｈｉｃｌｅ＿ｄａｔａ，ｄｒｕｇ＿ｄａｔａ，ｍｅｔｈｏｄ＝’ｔ－ｔｅｓｔ’）
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＝ｓｃｄａｔａ．ｕｎｓ［‘ｔ－ｔｅｓｔ’］［‘ｓｃｏｒｅｓ’］
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ．ａｐｐｅｎｄ（ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ）

【0120】

実施例９－ＧＥＮＥＶＡを使用してフェロトーシスを誘導する際の候補薬剤の作用機構の同定
この実施例は、ＧＥＮＥＶＡ細胞プールを使用したフェリチン遺伝子の上方制御による化合物ＡＲＳ１６２０の作用の分子機構の同定を対象としている。

【0121】

上方制御された遺伝子を、長期のＡＲＳ１６２０処理を生存する細胞の細胞プール内のＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ株にわたって分析した。細胞株にわたって一貫して上方制御された遺伝子は、抗フェロトーシス応答機構に関与することが見出された（図７Ａ、Ｂ）。この遺伝子群の中には、不安定な遊離鉄の隔離に関与するフェリチン錯体の２つの構成要素であるＦＴＨ１及びＦＴＬがあった。脂質過酸化生細胞プローブを使用して、脂質過酸化－フェロトーシスの特徴的な表現型のうちの１つ－を、ＡＲＳ－１６２０処理に応答して測定した。用量曲線は、ＡＲＳ－１６２０が用量依存的に脂質過酸化を誘導したことを実証した（図７Ｃ）。更に、細胞生存及び脂質過酸化動態をフェロトーシスの既知の誘導因子（エラスチン及びアルトレタミン）と比較すると、ＡＲＳ－１６２０は、これらのフェロトーシス誘導因子とそのフェロトーシス／生存動態において同様に挙動することが示された（図７Ｄ）。生存及び正規化された脂質過酸化曲線は、同様の薬力学を実証する３つの化合物全てにおいて、ＩＣ５０生存値の周りで交差した。ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ株（Ｈ２０３０）において、３つのＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ阻害剤ＭＲＴＸ８４９、ＡＭＧ５１０、及びＡＲＳ１６２０は全て、脂質過酸化を増加させたが、非ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ株（Ｈ４４１）において、この効果は有意にミュートされた（図７Ｅ）。

【0122】

実施例１０－ＧＥＮＥＶＡを使用した薬剤耐性機構の同定
この実施例は、ＧＥＮＥＶＡ細胞プールにおける長期薬物処理から、複数の標的化可能な薬物耐性機構を同定することを対象としている。

【0123】

薬物耐性が発生した１４日間の薬物処理タイムラインにおけるＡＲＳ－１６２０のＧＥＮＥＶＡデータセットを使用して、耐性機構の遺伝子発現指標を得た（図４Ａ）。これらの標的の阻害剤を得て、３つのＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ阻害剤、ＡＲＳ１６２０、ＡＭＧ５１０、及びＭＲＴＸ８４９と組み合わせて薬物相乗効果を試験した。ここで、薬物相乗効果は、薬物の組み合わせの合計が、個々の化合物単独の加法モデルを上回るものとして定義される。いくつかのＧＥＮＥＶＡ予測された薬物標的は、高いブリス相乗効果スコアを実証した（０を超えるスコアは、有意な薬物相乗効果を示した、図４Ｂ）。最も強いＧＥＮＥＶＡ予測、ｍＴＯＲ耐性は、マルチアームインビボマウス研究で試験され、有意なインビボブリス薬物相乗効果及び経時的な腫瘍縮小が見出された（図４Ｃ、Ｄ）。

【0124】

薬物耐性経路の同定のための薬物条件と非薬物条件との間の各細胞株の差異的発現
各細胞株について、単一細胞データセットを、ビヒクル処理されたものと薬物処理されたものとの２つのサブデータセットに分割した。差異的発現は、２試料ｔ検定を使用して２つの単一細胞データセット間で計算した。２試料ｔ検定出力から各遺伝子の差異的発現スコアを得た。これを完了するまで全ての細胞株で繰り返し、遺伝子の全ての差異的発現スコアを細胞型によって集約された差異的発現表に保存した。各細胞株内の遺伝子についてｚスコアを計算し、グループ化されたｚスコアを用いて２つの試料Ｔ検定を実施した。第一に、全ての差異的発現スコアを、各細胞株内のｚスコアによって同じスケールに正規化した。次いで、２つの試料Ｔ検定を、全ての「感受性」及び「非感受性」細胞株を複製物として個別に取り扱う各遺伝子について実施した。各遺伝子検査から要約統計を保存し、ｚスコア差を計算した。遺伝子は、遺伝子産物の要約統計及び薬剤化可能性によってサブセットされた。ｐ値が０．０１以下の遺伝子を選択することによって、各遺伝子についてｐ値でサブセットされたｔ検定結果を使用する。ｚスコアによってサブセットされた中央値の結果を使用すると、遺伝子スコアの上位８０パーセンタイルよりも大きいｚスコア値を有する遺伝子を選択することによって、各遺伝子の感受性株及び非感受性株間のデルタが変化する。ＤＧＩＤＢ．ｏｒｇを使用して、薬剤化可能な標的のリソースとして、ＤＧＩＤＢ．ｏｒｇからの薬剤化可能な標的との要約統計から得られた相互参照された遺伝子を得て、目的の化合物によって誘導された薬剤耐性標的の最終的な標的リストを得る。

【0125】

実施例１０の代表的なコード
＃＃＃ｓｃｄａｔａには、全ての単一細胞データがａｎｎｄａｔａデータ構造フォーマットで含まれている
＃＃＃ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓには、このセクションからの最終出力が含まれている
ｓｃａｎｐｙをｓｃとしてインポートする
ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓのｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅの場合：
ｖｅｈｉｃｌｅ＿ｄａｔａ＝ｓｃｄａｔａ［ｓｃｄａｔａ．ｏｂｓ．ｄｒｕｇ＝＝‘ｖｅｈｉｃｌｅ’］
ｄｒｕｇ＿ｄａｔａ＝ｓｃｄａｔａ［ｓｃｄａｔａ．ｏｂｓ．ｄｒｕｇ＝＝‘ｄｒｕｇ’］
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ＿ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＝ｓｃ．ｔｌ．ｒａｎｋ＿ｇｅｎｅｓ＿ｇｒｏｕｐｓ（ｖｅｈｉｃｌｅ＿ｄａｔａ，ｄｒｕｇ＿ｄａｔａ，ｍｅｔｈｏｄ＝’ｔ－ｔｅｓｔ’）
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＝ｓｃｄａｔａ．ｕｎｓ［‘ｔ－ｔｅｓｔ’］［‘ｓｃｏｒｅｓ’］
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ．ａｐｐｅｎｄ（ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ）
＃＃＃＃デスコア行列
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ
＃＃＃＃
ｄｅ＿ｚｓｃｏｒｅｄ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ＝ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ．ａｐｐｌｙ（ｚｓｃｏｒｅ， ａｘｉｓ＝０）
ｔｔｅｓｔ＿ｒｅｓｕｌｔｓ＝ｄｅ＿ｚｓｃｏｒｅｄ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ．ａｐｐｌｙ（ｌａｍｂｄａ ｒｏｗ：ｓｔａｔｓ．ｔｔｅｓｔ＿ｉｎｄ（ｒｏｗ［’ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ’］，ｒｏｗ［‘ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ’］），ａｘｉｓ＝１）
ｍｅｄｉａｎ＿ｚｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓｕｌｔｓ＝ｄｅ＿ｚｓｃｏｒｅｄ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ．ａｐｐｌｙ（ｌａｍｂｄａ ｒｏｗ：ｎｐ．ｍｅｄｉａｎ（ｒｏｗ［’ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ’］）－ｎｐ．ｍｅｄｉａｎ（ｒｏｗ［‘ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ’］），ａｘｉｓ＝１）
＃＃＃＃これらは、遺伝的ドライバーによって分類された、感受性の高い、感受性の低い株の同一性である
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ＿ｌｉｎｅｓ
ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ＿ｌｉｎｅｓ
＃＃＃＃デスコア行列
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ
＃＃＃＃
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓのｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅの場合：
ｉｆ ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ ｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ＿ｌｉｎｅｓ：
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ［ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ］．ｉｎｄｅｘ．ｒｅｐｌａｃｅ（“ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ”）
ｉｆ ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ ｉｎ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ＿ｌｉｎｅｓ：
ｄｅ＿ｓｃｏｒｅ＿ａｌｌ＿ｌｉｎｅｓ［ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ］．ｉｎｄｅｘ．ｒｅｐｌａｃｅ（“ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ”）
ｔｔｅｓｔ＿ｒｅｓｕｌｔｓ
ｍｅｄｉａｎ＿ｚｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓｕｌｔｓ
＃＃＃＃
ｔｔｅｓｔ＿ｆｉｌｔｅｒｅｄ＝ｔｔｅｓｔ＿ｒｅｓｕｌｔｓ［ｔｔｅｓｔ＿ｒｅｓｕｌｔｓ［‘ｐｖａｌｕｅ’］＜＝０．０１］
ｍｅｄｉａｎ＿ｚｓｃｏｒｅ＿ｆｉｌｔｅｒｅｄ＝ｍｅｄｉａｎ＿ｚｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓｕｌｔｓ［ｍｅｄｉａｎ＿ｚｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓｕｌｔｓ［‘ｚｓｃｏｒｅ’］＞＝ｎｐ．ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ（ｍｅｄｉａｎ＿ｚｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓｕｌｔｓ［‘ｚｓｃｏｒｅ’］，８０）］
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ＿ｇｅｎｅｌｉｓｔ＝ｓｅｔ（ｔｔｅｓｔ＿ｆｉｌｔｅｒｅｄ［’ｇｅｎｅｓ］）．ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ（ｓｅｔ（ｍｅｄｉａｎ＿ｚｓｃｏｒｅ＿ｆｉｌｔｅｒｅｄ［‘ｇｅｎｅｓ’］））
＃＃＃＃最終リストとＤＧＩＤＢを交差させる
ＤＧＩＤＢ＿ｇｅｎｅｌｉｓｔ
ｆｉｎａｌ＿ｇｅｎｅｌｉｓｔ＝ｓｅｔ（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ＿ｇｅｎｅｌｉｓｔ）．ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ（ｓｅｔ（ＤＧＩＤＢ＿ｇｅｎｅｌｉｓｔ））

【0126】

実施例１１－ＧＥＮＥＶＡを使用したインビボ特異的薬物耐性機構の同定
この実施例は、ＧＥＮＥＶＡを使用したＡＲＳ１６２０に対する腫瘍耐性のインビボ特異的機構としての内皮－間葉系遷移の誘導の同定を対象としている。

【0127】

インビトロ及びインビボの両方で行われたＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ阻害剤ＡＲＳ１６２０でＧＥＮＥＶＡプールに薬剤化したＧＥＮＥＶＡデータセットを比較した。具体的には、インビトロデータをインビボデータと比較して、使用されるモデルシステムの文脈に起因する差異及び類似性を探した。薬物に応答して最も上方制御された遺伝子セットのうちの１つは、インビボ文脈に特異的であり、インビトロで差異を示さなかった（図５Ａ）。内皮－間葉系遷移特徴遺伝子発現シグネチャは、インビボで増加し、ＡＲＳ１６２０ ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ阻害に対する薬物適応性機構の可能性を示した。検証研究として、併用療法マルチアームインビボマウス研究は、ＡＲＳ１６２０と組み合わせたＥＭＴ阻害剤、ガルニセルチブの有効性を試験するように設計された。併用療法は、腫瘍増殖を抑制するのに非常に有効であることが見出され（図５Ｂ）、ＡＲＳ１６２０とともに作用して成長を相乗的に減少させた（図５Ｃ）。

【0128】

インビボモデルシステムに特異的な因果遺伝子セットの発見
インビボデータセット及びインビトロデータセットについて、実施例８及びｔ検定結果でそれぞれ決定されたｚスコアの中央値結果を組み合わせ、遺伝子セット単位で対になった遺伝子セットで組み合わせた。次いで、インビボ及びインビトロの両方からの組み合わされたｚスコア結果表を使用して、以下のように「インビボ特異性スコア」を計算した。
各遺伝子セットについて、「インビボ特異性スコア」＝
［（インビボ中央値ｚスコア）－（インビトロ中央値ｚスコア）］／
平均（［ｌｏｇ１０（インビボｐ値）、ｌｏｇ１０（インビトロｐ値）］

【0129】

次いで、順序付けられた遺伝子セットをインビボ特異性スコアによってランク付けして、ＡＲＳ１６２０に応答してインビボで特異的に有意に上方制御又は下方制御された遺伝子セットに到達させた。

【0130】

実施例１２－ＧＥＮＥＶＡを使用した併用療法の有効性の試験
この実施例は、ＧＥＮＥＶＡ細胞プールにおける最適な併用療法を同定するために併用療法を試験することを対象としている。

【0131】

異種移植片としてインビボでプールされたＧ１２Ｃ及び非Ｇ１２Ｃ株のパネルを利用して、合計８つの異なる処理条件について、ＡＲＳ１６２０の、ガルニセルチブ、ＩＮＫ１２８、及びアンチマイシンの有無を比較した併用療法研究を行った。これらの化合物は、併用療法の発見及びＡＲＳ１６２０のミトコンドリア作用の機械的理解から得た（図８Ａ）。各薬物条件における細胞周期活性／不活性割合を使用して、各薬物についていくつかの細胞株にわたって薬物相乗効果を計算した。Ｉｎｋ１２８及びガルニセルチブは、インビボ相乗効果を実証する以前の検証実験と一致する相対的なインビボ相乗効果を示したが、アンチマイシンは、ミトコンドリア致死性表現型の拮抗と一致するＡＲＳ１６２０の相対的なレスキューを実証する拮抗効果を示した（図８Ｂ）。相乗的な薬物表現型を駆動した遺伝子を発見するために、遺伝子発現及び薬物処理＋起源細胞株を中心に構築された線形モデルは、ガルニセルチブ及びＩＮＫ１２８が一緒になって、単独で観察されたミトコンドリアに対するＡＲＳ１６２０一般的な効果と一致するミトコンドリアリードの相乗的減少を更に増加させることができたことを明らかにした（図８Ｃ）。

【0132】

実施例１３－ＧＥＮＥＶＡを使用した、候補薬剤に感受性のある患者亜集団の同定
この実施例は、ＰＤＸモデルにおける候補薬剤（ＡＲＳ１６２０）に感受性のある新規の患者亜集団の検出を対象としている。

【0133】

ＰＤＸモデルのＧＥＮＥＶＡプールは、長期薬物処理アッセイのために作成した。腫瘍をインビボ及びオルガノイドに移植し、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、及びＴＨ２１肺がん患者の腫瘍をＧＥＮＥＶＡプールに薬剤化した。ＥＭＬ４－ＡＬＫ患者において、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ変異型腫瘍の感受性よりも高い有意な薬物感受性が見られ、ＥＭＬ４－ＡＬＫ患者腫瘍が、ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｃ阻害剤に応答することを示した（図９Ｂ）。

【0134】

したがって、上記の説明は単に本開示の原理を例示するに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載又は図示していないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨及び範囲内に含まれる様々な構成を考案できることが理解されよう。更に、本明細書に列挙された全ての例及び条件的文言は、主として本発明の原理及び発明者らにより当該技術の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に列挙された例及び条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、及び実施形態、並びにその具体的な例を列挙する本明細書における全ての記述は、その構造的及び機能的等価物の両方を包含することを意図している。加えて、かかる等価物は、現在既知の等価物及び将来開発される等価物の両方、すなわち、構造に関係なく、同じ機能を実施する開発される任意の要素を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示及び記載の例示的な実施形態に限定されることを意図していない。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D-F】

【図7G】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A】

【図9B】

【国際調査報告】