特表 2024-529957 ボトリティスのＲＮＡベースの防除

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-14

(54)【発明の名称】ボトリティスのＲＮＡベースの防除

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240806BHJP

   C12N 1/14 20060101ALI20240806BHJP

   C12N 15/82 20060101ALI20240806BHJP

   C12N 5/14 20060101ALI20240806BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20240806BHJP

   C12N 15/866 20060101ALI20240806BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20240806BHJP

   A01N 63/60 20200101ALI20240806BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20240806BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N1/14 A

C12N15/82 Z

C12N5/14

A01H5/00 A

C12N15/866 Z

A01P3/00

A01N63/60

C12N15/31

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024504793

(86)(22)【出願日】2022-07-26

(85)【翻訳文提出日】2024-03-25

(86)【国際出願番号】 US2022074168

(87)【国際公開番号】W WO2023010022

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】63/225,758

(32)【優先日】2021-07-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】511152991

【氏名又は名称】グリーンライト バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮＬＩＧＨＴ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】２００ Ｂｏｓｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｓｕｉｔｅ １０００， Ｍｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ ０２１５５， Ｕ．Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】マッコークル，ケストレル

(72)【発明者】

【氏名】ローレンス，クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】デヴィセティ，ウペンドラ・クマール

(72)【発明者】

【氏名】ミシュラ，サムビット・クマール

(72)【発明者】

【氏名】カリー，デヴィッド

(72)【発明者】

【氏名】スリダラン，クリシュナクマール

(72)【発明者】

【氏名】ファン，ユフェン

【テーマコード（参考）】

4B065

4H011

【Ｆターム（参考）】

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA88X

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA53

4H011AA03

4H011BB19

4H011DH15

(57)【要約】

特に植物におけるボトリティス感染を治療または防除する剤、組成物および方法が開示される。特定の剤は、ボトリティス・シネレア真菌細胞に投与される場合にＲＮＡｉを誘導するポリヌクレオチド分子を含む。特定の実施形態では、組成物は、ボトリティス・シネレアのＤＮＡまたは標的遺伝子、または当該ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの断片に対して本質的に相補的であるか、または当該断片に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む殺菌的に有効な量のポリヌクレオチドを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ボトリティス・シネレアを防除するための組成物であって、
（ａ）配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子、または前記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの断片に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む、殺菌的に有効な量のポリヌクレオチド、または
（ｂ）ＤＮＡまたは標的遺伝子または前記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の配列同一性を有する少なくとも１つのサイレンシング要素を含む、殺菌的に有効な量の少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、前記ＤＮＡまたは標的遺伝子が、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、殺菌的に有効な量の少なくとも１つのポリヌクレオチド、または
（ｃ）配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子、または前記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの断片の少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する、少なくとも１つの断片を含む、殺菌的に有効な量の少なくとも１つのＲＮＡ、または
（ｄ）前記ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、ボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または増殖／生殖能力の低下を引き起こすＲＮＡ分子であって、前記ＲＮＡ分子が、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子または前記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの断片に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む、ＲＮＡ分子、または
（ｅ）前記ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、ボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または増殖／生殖能力の低下を引き起こす２本鎖ＲＮＡ分子であって、前記２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖が、ＤＮＡまたは標的遺伝子または前記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの断片に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含み、前記ＤＮＡまたは標的遺伝子は、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、２本鎖ＲＮＡ分子、または
（ｆ）配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む少なくとも１つの鎖を含む、殺菌的に有効な量の少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡ、または
（ｇ）配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する配列の少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む、殺菌的に有効な量のポリヌクレオチド、または
（ｈ）配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１つの断片を含む、殺菌的に有効な量の少なくとも１つのＲＮＡ、または
（ｉ）前記ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、植物上のボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または生殖／増殖能力の低下を引き起こすＲＮＡ分子であって、前記ＲＮＡ分子が、配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列の断片に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む、ＲＮＡ分子、または
（ｊ）前記ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、ヴィティス・ヴィニフェラ上のボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または生殖／増殖能力の低下を引き起こす２本鎖ＲＮＡ分子であって、前記殺菌性の２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖が、配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列の断片に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む、２本鎖ＲＮＡ分子、または
（ｋ）前記ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、植物上のボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または生殖／増殖能力の低下を引き起こす２本鎖ＲＮＡ分子であって、前記殺菌性の２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖が、配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列の断片に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する、２本鎖ＲＮＡ分子、を含む、組成物。

【請求項2】

前記組成物が、固体、液体、粉末、懸濁液、乳濁液、スプレー、カプセル化、マイクロビーズ、担体粒子、フィルム、マトリックス、種子処理、土壌ドレンチ、および埋め込み型製剤からなる群より選択される少なくとも１つの形態である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

担体剤、界面活性剤、有機シリコーン、有機シリコーン界面活性剤、ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、毒性緩和剤、および病原体成長制御剤からなる群より選択される少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項4】

前記ポリヌクレオチド、または前記ＲＮＡ、または前記ｄｓＲＮＡが、前記ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたは接触する場合に、植物上のボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または生殖能力（胞子形成）の低下を引き起こす２本鎖ＲＮＡ分子を含み、前記２本鎖ＲＮＡ分子が、配列番号２、７、９、１１および１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子、または前記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも２１個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも１つの断片を含み、前記二本鎖ＲＮＡ分子の長さが、少なくとも１００個の塩基対の長さであるか、または約１００個の塩基対から約６００個の塩基対の間の長さである、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記ポリヌクレオチド、または前記ＲＮＡ、または前記ｄｓＲＮＡが、配列番号２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含むｄｓＲＮＡを含む、請求項１、２、または３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記第１の鎖が、配列番号２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列に対して少なくとも約９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記ポリヌクレオチド、または前記ＲＮＡ、または前記ｄｓＲＮＡが、前記第１の鎖に相補的な第２の鎖をさらに含む、請求項５または６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）または（ｋ）のヌクレオチド配列が、配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記（ａ）～（ｅ）において列挙されるＤＮＡまたは標的遺伝子が、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

ボトリティス・シネレアの標的遺伝子の発現を抑制するｄｓＲＮＡであって、前記ｄｓＲＮＡの第１の鎖が、少なくとも１００個のヌクレオチドの長さを有し、配列番号１４、１９、２１、２３、および２４からなる群より選択される配列によってコードされるＲＮＡの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドに対して８５％～１００％相補的であるＲＮＡ配列を含む、ｄｓＲＮＡ。

【請求項11】

前記ｄｓＲＮＡの第２の鎖が前記第１の鎖に対して相補的である、請求項１０に記載のｄｓＲＮＡ。

【請求項12】

前記ｄｓＲＮＡの前記第１の鎖が、前記１４、１９、２１、２３、および２４からなる群より選択される配列によってコードされるＲＮＡに対して９５％～１００％相補的であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のｄｓＲＮＡ。

【請求項13】

前記ｄｓＲＮＡが、配列番号２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、及び４８からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載のｄｓＲＮＡ。

【請求項14】

前記ｄｓＲＮＡが、配列番号２６のヌクレオチド配列を含む、請求項１２または１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。

【請求項15】

ボトリティス・シネレアの標的遺伝子の発現を抑制するｄｓＲＮＡであって、前記ｄｓＲＮＡの第１の鎖が、配列番号２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列に対して少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも約９８％同一、約１００％同一、または１００％同一であるＲＮＡ配列を含む、ｄｓＲＮＡ。

【請求項16】

前記第１の鎖に相補的な第２の鎖をさらに含む、請求項１５に記載のｄｓＲＮＡ。

【請求項17】

前記ｄｓＲＮＡの前記第１の鎖が、配列番号２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列に対して少なくとも約９８％同一であるＲＮＡ配列を含む、請求項１５および１６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。

【請求項18】

前記ｄｓＲＮＡの前記第１の鎖が、配列番号２６に対して少なくとも約９８％同一であるＲＮＡ配列を含む、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。

【請求項19】

スプレー可能な溶液、乳濁液、タンクミックス、および粉末からなる群より選択される形態で適用するために製剤化された、請求項１０～１８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを含む組成物。

【請求項20】

担体剤、界面活性剤、有機シリコーン、有機シリコーン界面活性剤、ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド除草剤分子、ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺菌剤、非ポリヌクレオチド殺菌剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド殺虫剤、毒性緩和剤、および病原体成長制御剤からなる群より選択される１つ以上の追加の成分をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記（ａ）～（ｅ）、（ｇ）～（ｊ）において列挙される少なくとも１８個の連続したヌクレオチドが、少なくとも４００個の連続したヌクレオチドである、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項22】

植物のボトリティス・シネレア感染を防除するための方法であって、前記ボトリティス・シネレアを、請求項１～２１の組成物のうちのいずれかと接触させることを含む、方法。

【請求項23】

植物のボトリティス・シネレア感染を防除するための方法であって、前記植物に、請求項１～２１の組成物のいずれかを局所的に適用することを含む方法。

【請求項24】

前記局所的な適用が、前記植物の葉、茎、花、または果実に前記組成物をスプレーすることを含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記局所的な適用が、前記植物の葉に前記組成物をスプレーすることを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記植物が、結実植物、野菜、または観賞植物からなる群より選択され、任意選択で、そのような植物が、イチゴ、ブドウ、トマト、またはマメからなる群より選択される、請求項２２、２３、２４、または２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

ＲＮＡ干渉が誘導され、ボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性の低下、病原性の低下、増殖／生殖能力（胞子形成）の低下が起こる、請求項２１、２２、２３、２４、２５または２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

植物のボトリティス・シネレア感染を防除するための方法であって、
（ａ）前記ボトリティス・シネレアを、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子、または前記ＤＮＡまたは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させること、または
（ｂ）前記植物に、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子、または前記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物を局所的に適用すること、または
（ｃ）配列番号１～１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有する少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを、前記植物内に発現させること、
（ｄ）前記ボトリティス・シネレアを、少なくとも１つの鎖が配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列の少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する断片を含む殺菌的に有効な量の２本鎖ＲＮＡと接触させること、または
（ｅ）前記植物に、少なくとも１つの鎖が配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列の少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有する断片を含む殺菌的に有効な量の２本鎖ＲＮＡを局所的に適用すること、を含む、方法。

【請求項29】

前記ポリヌクレオチドが、２本鎖ＲＮＡである、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記２本鎖ＲＮＡが化学的もしくは酵素的に合成されるか、または微生物においての発現もしくは植物細胞においての発現によって生成される、請求項２８または２９に記載の方法。

【請求項31】

前記２本鎖ＲＮＡが、配列番号２６の少なくとも２１個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する鎖を含む、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記２本鎖ＲＮＡが、配列番号２６を含む鎖を含む、請求項２８、２９、または３０、３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

請求項２８（ｄ）または（ｅ）のヌクレオチド配列が配列番号２６である、請求項２８、２９、３０、３１または３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記方法が、前記植物に、配列番号２６の少なくとも１８個、１９個、２０個または２１個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物を局所的に適用することを含む、請求項２８、２９、３０、３１または３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記方法が、前記ボトリティス・シネレアを、２本鎖ＲＮＡを含む有効量の溶液と接触させることであって、前記２本鎖ＲＮＡの少なくとも１つの鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子の少なくとも１８個、１９個、２０個または２１個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、ＲＮＡ干渉が誘導され、ボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または増殖／生殖能力（胞子形成）の低下が起こる、ことを含む、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記溶液が、有機シリコーン界面活性剤、担体剤、有機シリコーン、有機シリコーン界面活性剤、ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド除草剤分子、ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド殺虫剤、毒性緩和剤、および病原体成長制御剤からなる群より選択される１つ以上の成分をさらに含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記植物が、ブドウ、トマト、イチゴ、またはマメである、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記（ａ）～（ｅ）において列挙される少なくとも１８個の連続したヌクレオチドが、少なくとも４００個の連続したヌクレオチドである、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

請求項２８～３７のいずれか一項に記載の方法によって提供される、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物、または前記植物の果実、種子もしくは増殖可能な部分。

【請求項40】

前記植物が、結実植物、野菜、または観賞植物からなる群より選択され、任意選択で、そのような植物がブドウ、イチゴ、トマト、またはマメからなる群より選択される、請求項３９に記載の植物。

【請求項41】

以下に操作可能な形で連結される異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物
（ａ）配列番号１～１２からなる群より選択される配列を有する標的遺伝子または前記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号１～１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡ、またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の同一性を有する少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ、または
（ｃ）標的遺伝子または前記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有する少なくとも１つのサイレンシング要素をコードするＤＮＡであって、前記標的遺伝子が、配列番号１～１２からなる群より選択される配列を有する、ＤＮＡ、または
（ｄ）配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有する配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ。

【請求項42】

請求項４１に記載の組換えＤＮＡ構築物を含む、植物染色体または色素体または組換え植物ウイルスベクターまたは組換えバキュロウイルスベクター。

【請求項43】

請求項４１の組換えＤＮＡ構築物をゲノムにおいて有するトランスジェニック植物細胞であって、そのような植物細胞が、結実植物、野菜、または観賞植物の細胞からなる群より選択され、任意選択で、そのような植物細胞が、イチゴ、ブドウ、トマト、またはマメの細胞からなる群より選択される、トランスジェニック植物細胞。

【請求項44】

請求項４３に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物、または前記トランスジェニック植物の果実、種子もしくは増殖可能な部分。

【請求項45】

前記（ａ）～（ｄ）において列挙される少なくとも１８個の連続したヌクレオチドが、少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドである、請求項４３または４４のいずれか一項に記載の植物。

【請求項46】

請求項１～３９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、ＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡ。

【請求項47】

前記（ａ）～（ｃ）において列挙される少なくとも１８個の連続したヌクレオチドが、少なくとも４００個の連続したヌクレオチドである、請求項４１に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項48】

前記（ａ）～（ｃ）において列挙される少なくとも１８個の連続したヌクレオチドが、少なくとも４００個の連続したヌクレオチドである、請求項４２に記載の植物染色体または色素体または組換え植物ウイルスベクターまたは組換えバキュロウイルスベクター。

【請求項49】

前記（ａ）～（ｃ）において列挙される少なくとも１８個の連続したヌクレオチドが、少なくとも４００個の連続したヌクレオチドである、請求項４３に記載のトランスジェニック植物細胞。

【請求項50】

植物上のボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子の発現を抑制する殺菌的に有効な量のポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記標的遺伝子が、Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８、ＣＤＣ４２、ＮＢＰ３５、ＳＤＨ、Ｂｃｒｒｐ１、ＸＭ＿０２４６９１７４６．１、Ｂｃｓｅｃ１５、Ｂｃｓｗｄ２、Ｂｃｍｃｍ４、Ｂｃｇｐｉ２、Ｂｃｒｐｂ５、およびＢｃｄｅｄ１からなる群より選択される、組成物。

【請求項51】

前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列の断片に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む２本鎖ＲＮＡ分子である、請求項５０に記載の組成物。

【請求項52】

前記組成物が、可溶性液体濃縮物、懸濁液、コロイド、ミセル、および乳濁液からなる群より選択される液体混合物の形態である、請求項２に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、全体が参照により本出願に組み込まれている、２０２１年７月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／２２５，７５８号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

壊死性真菌であるボトリティス・シネレアは、１，０００種を超える植物に侵入することが報告されており（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｅｌａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、これらの植物の多くは経済的に非常に重要である。野菜（例えば、キュウリ、トマト、ズッキーニ）や結実植物（例えば、イチゴ、ブドウ、ブルーベリー、ラズベリー）を含む農作物は、この病原体から最も深刻な影響を受けるもののうちのいくつかである（Ｊａｒｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９６２；Ｅｌａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ボトリティス・シネレアは、世界中で１００億ドルから１，０００億ドルの農業損失を引き起こしていると推定される。例えば、ボトリティス果実腐敗病（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｆｒｕｉｔ ｒｏｔ、ＢＦＲ）は、２００７年から２０１６年にかけてイチゴ収穫量の３６％の減少に寄与し、その結果、年間２億５，０００万ドルの純生産価値の損失をもたらした（Ｑｕｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ボトリティス・シネレアは、非常に破壊的な性質を持っているため、科学的および経済的に重要な真菌病原体のリスト上で２番目にランク付けされている（Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

ボトリティス・シネレアは死体栄養性病原体として分類されているが、これは、それが損傷組織または老化組織に侵入し、そして成長し、最終的には細胞死および組織死を引き起こす傾向があるという意味である。病気の症状が、葉、茎、花、および農産物上の灰色がかった色の、柔らかくて、どろどろした斑点として現れる。したがって、ボトリティス・シネレアに起因する様々な植物や植物部位の病気は、よく「灰色かび病」または「ボトリティス腐敗病」と呼ばれている。特に湿度が高い場合、斑点が灰色の真菌胞子のコーティングで覆われる可能性がある。果物や植物は萎びて、腐って、そしてよく黒色の、石のような菌核（高度に黒化した真菌の越冬構造）を形成する。真菌の接種材料（例えば、無性の分生子や胞子）は非常に豊富で遍在しており、通常は感染した植物組織に由来する（Ｊａｒｖｉｓ，１９６２）。ボトリティス・シネレアに起因する病気の防除または管理は、化学的殺菌剤に大きく依存している。さらに、ボトリティス・シネレアは、殺菌剤耐性菌対策委員会（Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ａｃｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＦＲＡＣ；ｗｗｗ．ｆｒａｃ．ｉｎｆｏ）によれば、殺菌剤耐性発現に関してリスクが高い病原体と考えられている。登録されたすべての灰色かび病防除用の部位特異的化学殺菌剤に耐性があるボトリティス・シネレア分離株の発見は、植物病原性真菌における耐性発現のこれまでにない例を示す（Ｌｅｒｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｏｒｔｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。さらに、この発見は、これらの耐性真菌の遺伝子型が野外個体群で優勢になった場合、部位特異的でリスクを低くした殺菌剤が最終的に病気の防除や総合的な害虫管理に役立たなくなる可能性があることを示す。さらに、化学的殺菌剤は、環境に有害である可能性があり、特異性または選択性が欠けている可能性があり、最終的に非標的効果をもたらす（例えば、非標的有益生物に影響する）可能性がある。したがって、ボトリティス・シネレア感染を防除するためのより環境に優しくて新規な病気防除戦略が長年にわたって必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0004】

これらの問題に取り組むために、本発明は、特に、結実植物、野菜、および観賞植物などの植物の葉や他の地上部分にスプレーされる場合に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のプロセスを通じてボトリティス・シネレアの成長を選択的に減らすまたは無くす局所的に適用される２本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを対象とする。

【0005】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術は内部の生物学的プロセスを通じて害虫や病原体の遺伝子発現をサイレンシングする、高度に選択的な生物学的処理であることが示されている。ＲＮＡｉを開始する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の外因性適用は、特定の植物害虫種を効果的に防除するために使用されている。本開示は、ＲＮＡｉ組成物を使用して真菌病原体であるボトリティス・シネレアを防除するアプローチを対象とする。特定の実施形態では、植物に投与される外因性ｄｓＲＮＡの適用を使用することによってボトリティス・シネレア防除を提供する方法および組成物が記載される。そのようなｄｓＲＮＡは、特定のボトリティス・シネレア標的遺伝子の発現を調節するように設計される特定のトリガー配列を含む。ＲＮＡｉ調節のための潜在的な標的遺伝子を特定するために、ボトリティス・シネレアの全ゲノム情報を分析して、ＲＮＡｉトリガーによる潜在的な標的のための遺伝子配列を特定する。トリガーは、特定の設計基準を満たすトリガー配列を作成するために、公的に入手可能なＲＮＡｉ設計ツールと組み合わせる独自の計算アルゴリズムを通じて設計される。ＲＮＡｉを介するボトリティス・シネレアの防除のためのいくつかのそのようなトリガーが本明細書に記載され特許請求されている。本明細書で特許請求されかつ表１Ａに開示される特定のトリガーによるボトリティス・シネレアの処理の後、表１Ｂに記載されかつ実施例１で説明されるように、インビトロでの真菌成長の減少が観察された。その後、表２～表１０および図１～図５に開示されかつ例２～例３で説明されるように、実験室および温室アッセイでの植物または植物部位への適用の後の特定のトリガーは、ボトリティス・シネレアに起因する灰色かび病および症状を軽減する能力を実証した。重要なことには、実施例４および図６～１０で説明されるように、本明細書に記載されかつ特許請求されている特定のトリガーおよび組成物は評価され、経済的に重要な植物に対する大規模野外現地試験においてボトリティス・シネレアに起因する病気を軽減する有効性をすでに示している。

【0006】

本明細書に記載される組成物および方法は、ボトリティス・シネレア感染を防除または予防するのに有用な、本明細書で「トリガー」と呼ばれる、１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子などの組換えポリヌクレオチド分子、またはボトリティス・シネレア感染に耐性があるトランスジェニック植物を作製するための組換えＤＮＡ構築物を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドトリガーは、ボトリティス・シネレアによる植物の感染を防除または予防するための局所的に適用された剤として提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドトリガーを発現する（種子または増殖可能な部分を含む）トランスジェニック植物などの、ボトリティス・シネレアによる感染に対して強化された耐性を有する植物が提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドトリガーを含む組成物で局所的に処理された（種子または増殖可能な部分を含む）植物（例えば、ｄｓＲＮＡ分子の溶液でスプレーされている植物）が提供される。ボトリティス・シネレア、またはボトリティス・シネレアによる感染から保護される植物、植物部位もしくは種子に局所的に適用されるポリヌクレオチド含有組成物も提供される。本明細書に記載される実施形態から特に恩恵を受ける植物としては、ブドウ、トマト、イチゴ、スナップエンドウ、ナス、唐辛子、ピーマン、トマティーロ、グランドチェリー、ケープグーズベリー、タバコ、リンゴ、ナシ、マルメロ、モモ、プラム、チェリー、アーモンド、アプリコット、ブラックベリー、ブルーベリー、ラズベリー、カーネーション、ペチュニア、およびバラが挙げられるが、これらに限定されない。

【0007】

いくつかの実施形態は、ポリヌクレオチドトリガーによるボトリティス・シネレアにおける標的遺伝子の抑制に関する。本明細書には、配列番号１～１２からなる、本明細書で「標的遺伝子配列群」または「標的遺伝子配列」と呼ばれる標的遺伝子のヌクレオチド配列が提供される。本発明の特定の実施形態は、ＲＮＡｉをもたらすこれらの標的遺伝子のＲＮＡ転写物にハイブリッド化するように設計されるポリヌクレオチドに関する。また、配列番号１３～２４、４９～５２からなる、本明細書で「トリガー配列群」または「トリガー配列」と呼ばれる、標的遺伝子を標的とするトリガーのヌクレオチド配列も提供される。さらに、配列番号２５～３６、５３～５６からなる、これらのトリガーのＲＮＡ配列、「ＲＮＡトリガー配列群」または「ＲＮＡトリガー配列」が本明細書に提供される。ＲＮＡトリガー配列群は、チミンをウラシルに置き換えることを除いて、トリガー配列群と同じである。配列番号３７～４８、５７～６０からなる、「ＲＮＡトリガー配列逆相補体群」または「ＲＮＡトリガー配列逆相補体」と呼ばれる、ＲＮＡトリガー配列群に対する逆相補体も本明細書に提供される。ＲＮＡトリガー配列逆相補体群は、５’から３’に読まれるＲＮＡトリガー配列群における配列に対する完全な相補体である。トリガー配列群およびＲＮＡトリガー配列群は、標的遺伝子配列の対応したｍＲＮＡ転写物に従って、そのような転写物上のＲＮＡｉに影響するように設計され、関連したタンパク質の翻訳を防止するかまたは減少させ、真菌の防除をもたらす。本明細書に提供される表１Ａは、様々な遺伝子標的配列を、それらの対応したトリガー配列、ＲＮＡトリガー配列、およびＲＮＡトリガー逆相補体配列とマッチする。配列番号は、本明細書とともに提出される配列番号リストに提供される配列に関する。

【0008】

一態様では、植物のボトリティス・シネレア感染を防除するための方法は、ボトリティス・シネレアを、標的遺伝子配列群からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の対応した断片に対して約９５％～約１００％の同一性を有する配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片（例えば、１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの断片が含まれる）を含むポリヌクレオチドと接触させることを含む。一実施形態では、植物のボトリティス・シネレア感染を防除するための方法は、ボトリティス・シネレアを、標的遺伝子配列群からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはいくつかの実施形態では、配列番号２、７、９、１１、１２からなる群より選択される配列を有する標的遺伝子、または当該標的遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２３～３６からなる群より選択される配列の少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに対して相補的であるか、または約９５％～約１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに対して相補性を有するように設計される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択されるか、またはより特別に配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、または４８からなる群より選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを含む組成物もしくは溶液の局所的な適用は、ポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを含む組成物もしくは溶液を、ボトリティス・シネレアに感染しているかまたは感染する可能性がある結実植物、野菜、または観賞植物の地上部分（例えば、花、茎、および／または葉）にスプレーすることによって達成される。いくつかの実施形態では、植物は、ブドウ、イチゴ、トマト、マメ、ナス、唐辛子、ピーマン、トマティーロ、グランドチェリー、ケープグーズベリー、タバコ、リンゴ、ナシ、マルメロ、モモ、プラム、チェリー、アーモンド、アプリコット、ブラックベリー、ブルーベリー、ラズベリー、カーネーション、ペチュニア、もしくはバラ、またはそれらの変種である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドとの接触は、ポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを含む組成物もしくは溶液を、直接ボトリティス・シネレアに局所的に適用するか、またはボトリティス・シネレアと接触する表面またはマトリックス（例えば、植物または土壌）に局所的に適用することによって（例えば、スプレーまたは散布または浸漬によって）達成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドとの接触は、ボトリティス・シネレア感染を防除する配列を発現するトランスジェニック植物を提供することによって達成される。

【0009】

いくつかの実施形態は、ボトリティス・シネレアを、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有する標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の対応した断片に対して約９５％～約１００％の同一性を有する配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片（例えば、１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの断片）を有するポリヌクレオチドを含む剤に曝露することによって、植物のボトリティス・シネレア感染を防除するための方法であって、上記剤は、ボトリティス・シネレアの接触または摂取（例えば、内部吸収／トランスフェクション）の後に機能し、ボトリティス・シネレアにおける生物学的機能を抑制することによって、ボトリティス・シネレア感染を防除する方法に関する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含むか、またはポリヌクレオチドは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される１つ以上のヌクレオチド配列に対して約９５％～約１００％同一である１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、米国特許第１０，８５８，３８５号または第１０，９５４，５４１号に記載されるＲＮＡの無細胞生成のプロセスのうちのいずれか１つを通じて作製される２本鎖ＲＮＡであり、上記特許の両方は参照により本明細書に組み込まれる。

【0010】

いくつかの実施形態では、剤は、
（ａ）配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子、または上記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの断片に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む、殺菌的に有効な量のポリヌクレオチド、または
（ｂ）ＤＮＡまたは標的遺伝子または上記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の配列同一性を有する少なくとも１つのサイレンシング要素を含む、殺菌的に有効な量の少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、上記ＤＮＡまたは標的遺伝子が、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、殺菌的に有効な量の少なくとも１つのポリヌクレオチド、または
（ｃ）配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子、または上記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの断片の少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する、少なくとも１つの断片を含む、殺菌的に有効な量の少なくとも１つのＲＮＡ、または
（ｄ）上記ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、ボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または増殖／生殖能力の低下を引き起こすＲＮＡ分子であって、上記ＲＮＡ分子が、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子または上記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの断片に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む、ＲＮＡ分子、または
（ｅ）上記ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、ボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または増殖／生殖能力の低下を引き起こす２本鎖ＲＮＡ分子であって、上記２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖が、ＤＮＡまたは標的遺伝子または上記ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの断片に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含み、上記ＤＮＡまたは標的遺伝子は、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、２本鎖ＲＮＡ分子、または
（ｆ）配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または上記ヌクレオチド配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む少なくとも１つの鎖を含む、殺菌的に有効な量の少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡ、または
（ｇ）配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または上記ヌクレオチド配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する配列の少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む、殺菌的に有効な量のポリヌクレオチド、または
（ｈ）配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１つの断片を含む、殺菌的に有効な量の少なくとも１つのＲＮＡ、または
（ｉ）上記ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、植物上のボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または生殖／増殖能力の低下を引き起こすＲＮＡ分子であって、上記ＲＮＡ分子が、配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列の断片に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む、ＲＮＡ分子、または
（ｊ）上記ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、ヴィティス・ヴィニフェラ上のボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または生殖／増殖能力の低下を引き起こす２本鎖ＲＮＡ分子であって、上記殺菌性の２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖が、配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列の断片に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドを含む、２本鎖ＲＮＡ分子、または
（ｋ）上記ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、植物上のボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または生殖／増殖能力の低下を引き起こす２本鎖ＲＮＡ分子であって、上記殺菌性の２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖が、配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列の断片に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または１００％の配列同一性を有する、２本鎖ＲＮＡ分子、を含む。

【0011】

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む剤は、植物の畑に適用するために例えばスプレー可能な溶液もしくは乳濁液、タンクミックス、または粉末として製剤化される。いくつかの実施形態では、剤は、例えば微生物発酵産物の形態で生物学的に生成されるか、またはトランスジェニック植物細胞において発現される。

【0012】

本明細書に記載される、標的遺伝子を標的とするＲＮＡｉ分子をコードする任意の適切なＤＮＡが、本明細書に記載される組成物および方法に使用されることができる。ＤＮＡは、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）であってよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、転写される場合に（例えば、１本鎖のままであるかもしくはＲＮＡヘアピンに折り畳まれる）１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）分子、またはアニールして２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を生成する相補的ｓｓＲＮＡ分子を生成する１つ以上のＤＮＡ発現カセット（複数可）を含む。

【0013】

いくつかの実施形態は、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の対応した断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片（例えば、１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの断片）を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物の植物への局所的な適用を含む、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法に関する。一実施形態では、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法は、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはいくつかの実施形態では、配列番号２、７、９、１１、１２からなる群より選択される配列を有する標的遺伝子、または当該標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物の植物への局所的な適用を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＲＮＡトリガー配列またはＲＮＡトリガー配列逆相補体からなる群より選択されるか、またはＲＮＡトリガー配列またはＲＮＡトリガー配列逆相補体に対して少なくとも約７５％または少なくとも約８０％または少なくとも約８５％または少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９８％または約１００％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡトリガー配列より選択される１つ以上の配列、およびＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される対応した配列を含むｄｓＲＮＡである。一実施形態では、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法は、有効量のポリヌクレオチドがボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触するように少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物の植物への局所的な適用を含み、上記ポリヌクレオチドが、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する標的遺伝子、または当該標的遺伝子から転写されたＲＮＡの一部分に相補的な少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含むか、またはＲＮＡトリガー配列もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体に対して少なくとも約７５％もしくは少なくとも約８０％もしくは少なくとも約８５％または少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡトリガー配列より選択される１つ以上の配列、およびＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される１つ以上の対応した配列を含むｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態は、植物の畑に適用するために例えば、スプレー可能な溶液もしくは乳濁液、タンクミックス、または粉末として製剤化されるポリヌクレオチドを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、植物は結実植物、野菜、または観賞植物である。いくつかの実施形態では、植物は、ブドウ、トマト、イチゴ、マメ、ナス、唐辛子、ピーマン、トマティーロ、グランドチェリー、ケープグーズベリー、タバコ、リンゴ、ナシ、マルメロ、モモ、プラム、チェリー、アーモンド、アプリコット、ブラックベリー、ブルーベリー、ラズベリー、カーネーション、ペチュニア、またはバラである。

【0014】

いくつかの実施形態は、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の対応した断片に対して本質的に同一または相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド分子を殺菌的に有効な量で含む、ボトリティス・シネレアを防除するための殺菌的な組成物に関する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはいくつかの実施形態では配列番号２、７、９、１１、１２からなる群より選択される配列を有する標的遺伝子、または当該標的遺伝子から転写されたＲＮＡの一部分に相補的な少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体トリガーより選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含むか、またはトリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択されるヌクレオチド配列に対して相補的であるかもしくは少なくとも約７５％もしくは少なくとも約８０％もしくは少なくとも約８５％もしくは少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％もしくは少なくとも約９８％もしくは約１００％もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡトリガー配列より選択される１つ以上の配列、およびＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される１つ以上の対応した配列を含むｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子は組換えポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子は２本鎖ＲＮＡである。関連した実施形態は、植物の畑に適用するために例えば、スプレー可能な溶液もしくは乳濁液、タンクミックス、または粉末として製剤化されるポリヌクレオチド分子を含み、任意選択で、担体剤、界面活性剤、有機シリコーン、有機シリコーン界面活性剤、ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド殺菌剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺菌剤、毒性緩和剤、および病原体成長制御剤などの１つ以上の追加の成分を含む殺菌的な組成物を含む。

【0015】

いくつかの実施形態は、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の対応した断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片（例えば、１００％の同一性または相補性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの断片）を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを、植物内に発現させることを含む、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法に関する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含むか、またはＲＮＡトリガー配列またはＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される配列に対して少なくとも約７５％もしくは少なくとも約８０％もしくは少なくとも約８５％もしくは少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％もしくは少なくとも約９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡトリガー配列より選択される１つ以上の配列、およびＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される対応した配列を含むｄｓＲＮＡである。

【0016】

いくつかの実施形態は、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の対応した断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むＤＮＡ要素に操作可能な形で連結される異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物に関する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ要素はｄｓＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。関連する実施形態は、組換えＤＮＡ構築物を含むかまたは異種プロモーターを有さないＤＮＡ要素を含む、植物染色体または色素体または組換え植物ウイルスベクターまたは組換えバキュロウイルスベクターを含む。

【0017】

いくつかの実施形態は、ＲＮＡと接触するかまたはＲＮＡがトランスフェクトされるボトリティス・シネレアにおける標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡをコードする組換えＤＮＡをゲノム内に有するトランスジェニック植物細胞に関し、上記ＲＮＡは、標的遺伝子の断片に相補的な１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する少なくとも１つのサイレンシング要素を含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は標的遺伝子配列群より選択される。特定の実施形態は、標的遺伝子配列群より選択される１つ以上の標的遺伝子をサイレンシングするためのＲＮＡをコードする組換えＤＮＡをゲノムにおいて有するトランスジェニック植物細胞である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含むか、またはＲＮＡトリガー配列もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される配列に対して少なくとも約７５％もしくは少なくとも約８０％もしくは少なくとも８５％もしくは少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％もしくは少なくとも約９８％もしくは約１００％もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0018】

いくつかの実施形態は、植物上のボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合にボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の減少、または増殖／生殖能力（胞子形成）の減少を引き起こす、単離された組換えＲＮＡ分子に関し、上記組換えＲＮＡ分子は、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の対応した断片に対して本質的に相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片（例えば、１００％の相補性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの断片）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＮＡ分子は２本鎖ＲＮＡである。特定の実施形態は、配列番号１３～６０、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される配列を有する鎖を有する単離された組換え２本鎖ＲＮＡ分子を含む。別の実施形態は、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３５、配列番号３６からなる群より選択される配列を有する鎖を有する単離された組換え２本鎖ＲＮＡ分子に関する。他の実施形態は、配列番号２５～４８からなる群より選択される配列を有する鎖を有する単離された組換えｄｓＲＮＡ分子に関する。

【0019】

いくつかの実施形態は、標的遺伝子配列群より選択される標的遺伝子の対応した断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを植物に提供することを含む、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法に関する。一実施形態では、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法は、標的遺伝子または当該標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに対して同一であるかまたは相補的である少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを植物に提供することを含み、上記標的遺伝子が標的遺伝子配列群において特定された遺伝子からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含むか、またはＲＮＡトリガー配列またはＲＮＡトリガー配列逆相補体に対して少なくとも約７５％もしくは少なくとも約８０％もしくは少なくとも約８５％もしくは少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％もしくは少なくとも約９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡトリガー配列より選択される１つ以上の配列、およびＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される１つ以上の対応した配列を含む。

【0020】

いくつかの実施形態は、ボトリティス・シネレアを、標的遺伝子配列群より選択される標的遺伝子のＤＮＡ配列の一部分の同等の長さの対応した断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片（例えば、１００％の同一性または相補性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの断片）を含むポリヌクレオチドと接触させることを含む、植物のボトリティス・シネレア感染を防除するための方法に関する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、２本鎖ＲＮＡである。

【0021】

いくつかの実施形態は、本明細書に記載される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む人工組成物に関する。いくつかの実施形態では、ボトリティス・シネレア感染からの保護を必要とする植物への局所的な適用に有用な製剤が提供される。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を作製するのに有用な組換え構築物およびベクターが提供される。いくつかの実施形態では、植物、植物種子または増殖可能な部分を処理するのに有用な製剤およびコーティングが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドで処理されるかまたは当該ポリヌクレオチドを含むそのような植物、種子、または増殖可能な部分から生産される商品および食料品（特に、検出可能な量の本明細書に記載されるポリヌクレオチドを有する商品および食料品）が提供される。いくつかの実施形態は、標的遺伝子配列群より選択される配列または配列の断片によってコードされるタンパク質に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体に関する。別の態様は、トリガー配列群またはその相補体より選択される配列もしくは配列の断片によってコードされるタンパク質に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体に関する。そのような抗体は、当業者に公知の通常の方法により作成される。

【0022】

本発明の他の態様および特定の実施形態は、以下の詳細な説明に開示される。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】トリガーＧＳ３４９で処理されたものと未処理のものとの比較による、接種した植物全体におけるボトリティス・シネレアのパーセント病気重症度を示すグラフである。

【図2】ＧＳ４１３で処理されたものと未処理のものとの比較による、接種した植物全体におけるボトリティス・シネレアのパーセント病気重症度を示すグラフである。

【図3】ＧＳ６８６で処理されたものと未処理のものとの比較による、接種した植物全体におけるボトリティス・シネレアのパーセント病気重症度を示すグラフである。

【図4】ＧＳ７２８で処理されたものと未処理のものとの比較による、接種した植物全体におけるボトリティス・シネレアのパーセント病気重症度を示すグラフである。

【図5】ＧＳ７３０で処理されたものと未処理のものとの比較による、接種した植物全体におけるボトリティス・シネレアのパーセント病気重症度を示すグラフである。

【図6】野外現地試験における、ＧＳ３４９、ＧＳ７３０、化学的標準プログラム、生物学的標準プログラムで処理されたイチゴの苗と未処理の照合とのボトリティス・シネレア感染の症状進展曲線下面積として測定される病気重症度を比較するグラフである。

【図7】野外現地試験における、ＧＳ７３０、化学的標準プログラム、生物学的標準プログラムで処理されたブドウの苗と未処理の照合とのボトリティス・シネレア感染の症状進展曲線下面積として測定される病気重症度を比較するグラフである。

【図8】は、野外現地試験における、ＧＳ７３０、化学的標準プログラム、生物学的標準プログラムで処理されたブドウの苗と未処理の照合とのボトリティス・シネレア感染の症状進展曲線下面積として測定される病気重症度を比較するグラフである。

【図9】ＧＳ３４９、ＧＳ２２８０、ＧＳ２３０３、およびＧＳ２２９７、化学的標準プログラム、生物学的標準プログラムで処理されたサヤマメの苗と未処理の照合とのボトリティス・シネレア感染の症状進展曲線下面積として測定される病気重症度を比較するグラフである。

【図10】野外現地試験における、ＧＳ３４９、化学的標準プログラム、生物学的標準プログラムで処理されたイチゴの苗と未処理の照合とのボトリティス・シネレア感染の症状進展曲線下面積として測定される病気重症度を比較するグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

１６２０６－０１３ＰＣ０という配列ファイルは、９６ｋＢのｘｍｌファイルとして本明細書に提出される。また、ｘｍｌファイルに記載された配列を含む付録Ａが本明細書に提供され、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0025】

Ｉ．定義
別途定義されない限り、使用された全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。用語が単数形で記載される場合、本発明者らはまた、その用語の複数形によって説明される本発明の態様も企図する。参照によって組み込まれる参考文献で使用される用語及び定義に矛盾がある場合、本出願で使用される用語は、本明細書で与えられる定義を有するものとする。使用された他の技術用語は、技術分野専門の様々な辞書、例えば、“Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ（登録商標）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ”（Ｅｄｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ，２０１１，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ｍｉｆｆｌｉｎ Ｈａｒｃｏｕｒｔ，Ｂｏｓｔｏｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、“ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ”（６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、または“Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によって例示されているような、それらが使用される技術分野における通常の意味を有する。発明者らは、ある機構または作用様式に限定されることを意図していない。その参照は、例示的な目的のためにのみ提供される。

【0026】

特に明記しない限り、本明細書の本文中の核酸配列は、左から右に読んだ場合に５’から３’方向に与えられる。当業者であれば、所与のＤＮＡ配列は、ＤＮＡのチミン（Ｔ）ヌクレオチドのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドによる置換を除いてＤＮＡ配列と同一である、対応したＲＮＡ配列を定義すると理解されることを認識するであろう。したがって、特定のＤＮＡ配列を提供すると、正確なＲＮＡ同等物が定義されると理解される。所与の第１のポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡであろうとＲＮＡであろうと、その正確な相補配列（ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい）、すなわちワトソンクリック塩基対を形成することによって第１のポリヌクレオチドに完全にハイブリッド化する第２のポリヌクレオチドの配列をさらに定義する。ＤＮＡ：ＤＮＡ２本鎖（ハイブリッド化した鎖）の場合、塩基対はアデニン：チミンまたはグアニン：シトシンである。ＤＮＡ：ＲＮＡ２本鎖の場合、塩基対はアデニン：ウラシルまたはグアニン：シトシンである。したがって、完全にハイブリッド化した（鎖間に「１００％の相補性」がある、または鎖が「相補的」である）平滑末端２本鎖ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、１つの鎖のヌクレオチド配列を提供することによって明確に定義され、ＤＮＡとして与えられるかＲＮＡとして与えられるかに関係ない。標的遺伝子または標的遺伝子の断片に対して「本質的に同一」または「本質的に相補的」とは、ポリヌクレオチド鎖（または２本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも１つの鎖）が（一般に植物または真菌細胞において見出されるような生理学的条件下で）標的遺伝子もしくは標的遺伝子の断片かまたは標的遺伝子の転写物もしくは標的遺伝子の断片にハイブリッド化するように設計されるという意味である。当業者は、そのようなハイブリッド化が必ずしも１００％の配列同一性または相補性を必要としないことを理解するであろう。いくつかの実施形態では、トリガーは、標的遺伝子の配列に対して１００％同一ではないが、標的遺伝子またはそれから転写されるＲＮＡの配列に相補的なままであるように設計され得る。第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係がある場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と「操作可能な形で」接続または「連結」される。例えば、プロモーターがＤＮＡの転写または発現を提供する場合、プロモーター配列はＤＮＡに「操作可能な形で連結」される。一般に、操作可能な形で連結されたＤＮＡ配列は連続している。

【0027】

「ポリヌクレオチド」という用語は、一般に複数のヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指し、一般に「オリゴヌクレオチド」（１８個～２５個のヌクレオチドの長さのポリヌクレオチド分子）および２６個以上のヌクレオチドのより長いポリヌクレオチドの両方を指す。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で一般的に行われている非標準的ヌクレオチドまたは化学的に改変されたヌクレオチドを含む複数のヌクレオチドを含む分子も含む。例えば、技術マニュアル「ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ａｎｄ ＤｓｉＲＮＡｓ」，２０１１年（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）に開示されている化学的改変について参照されたい。一般に、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡであろうとＲＮＡであろうとまたはその両方であろうと、また１本鎖であろうと２本鎖であろうと、標的遺伝子のＤＮＡまたは標的遺伝子のＲＮＡ転写物の同等サイズの断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチド（または２本鎖ポリヌクレオチドの場合、少なくとも１８個の連続した塩基対）の少なくとも１つの断片を含む。本開示全体を通じて、「少なくとも１８個の連続した」とは、「間のすべての整数点を含む、約１８個から約１０，０００個まで」を意味する。したがって、本発明の実施形態は、１８個～２５個のヌクレオチド（１８‐ｍｅｒｓ、１９‐ｍｅｒｓ、２０‐ｍｅｒｓ、２１‐ｍｅｒｓ、２２‐ｍｅｒｓ、２３‐ｍｅｒｓ、２４‐ｍｅｒｓ、もしくは２５‐ｍｅｒｓ）の長さを有するオリゴヌクレオチド、または２６個以上のヌクレオチドの長さを有する中位の長さのポリヌクレオチド（２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２７０個、約２８０個、約２９０個もしくは約３００個のヌクレオチドのポリヌクレオチド）、または約３００個のヌクレオチドを超える長さを有する長いポリヌクレオチド（例えば、約５００個～約４００個のヌクレオチド、約４００個～約６００個のヌクレオチド、約５００個～約６００個のヌクレオチド、約６００個～約７００個のヌクレオチド、約７００個～約８００個のヌクレオチド、約８００個～約９００個のヌクレオチド、約９００個～約１，０００個のヌクレオチド、約３００個～約５００個のヌクレオチド、約３００個～約６００個のヌクレオチド、約３００個～約７００個のヌクレオチド、約３００個～約８００個のヌクレオチド、約３００個～約９００個のヌクレオチド、もしくは約１，０００個のヌクレオチドの長さ、もしくは約１，０００個のヌクレオチドを超える長さ（例えば、最大、標的遺伝子のコード部分もしくは非コード部分、またはそれらの両方を含む標的遺伝子の全長）のポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドが２本鎖である場合、その長さは同様に塩基対の観点から記述されることができる。

【0028】

本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、１本鎖（ｓｓ）または２本鎖（ｄｓ）であり得る。「２本鎖」とは、一般に生理学的に関連している条件下で、十分に相補的な逆平行の核酸鎖の間で生じて２本鎖核酸構造を形成する塩基対合を指す。実施形態は、ポリヌクレオチドがセンス１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、センス１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、２本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスｓｓＤＮＡ、またはアンチセンスｓｓＲＮＡからなる群より選択されるもの、およびこれらのタイプのいずれかのポリヌクレオチドの混合を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、（内因的に生成されるｓｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡなどの）天然に存在する制御性小分子ＲＮＡに典型的な長さよりも長い２本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０個の連続した塩基対の長さの２本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、約５０個～約６００個の塩基対の長さを有する２本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標準的なリボヌクレオチド以外の成分を含むことができ、例えば、一実施形態は、末端デオキシリボヌクレオチドを含むＲＮＡである。

【0029】

様々な実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡ内に存在するヌクレオチドなどの天然に存在するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組み合わせである（例えば、主にリボヌクレオチドからなるが、１つ以上の末端デオキシリボヌクレオチドもしくは１つ以上の末端ジデオキシリボヌクレオチドを有する合成ポリヌクレオチド、または主にデオキシリボヌクレオチドからなるが、１つ以上の末端ジデオキシリボヌクレオチドを有する合成ポリヌクレオチド）。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、イノシン、チオウリジン、またはプソイドウリジンなどの非標準的ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは化学的に改変されたヌクレオチドを含む。化学的に改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの例は当該技術分野でよく知られている。参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許公開第２０１１／０１７１２８７号、米国特許公開第２０１１／０１７１１７６号、米国特許公開第２０１１／０１５２３５３号、米国特許公開第２０１１／０１５２３４６号、および米国特許公開第２０１１／０１６００８２号を参照されたい。例示的な例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合改変で部分的または完全に改変されることができる、天然に存在するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンを含むが、これらに限定されず、改変されたヌクレオシド塩基または改変された糖は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド合成に使用でき、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、蛍光部分（例えば、フルオレセインまたはローダミン）または他の標識（例えば、ビオチン）で標識されることができる。

【0030】

いくつかの実施形態は、標的遺伝子配列群において特定された遺伝子（Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８，ＣＤＣ４２，ＮＢＰ３５，ＳＤＨ，Ｂｃｒｒｐ１，ＸＭ＿０２４６９１７４６．１，Ｂｃｓｅｃ１５，Ｂｃｓｗｄ２，Ｂｃｍｃｍ４，Ｂｃｇｐｉ２，Ｂｃｒｐｂ５およびＢｃｄｅｄ１）からなる群より選択される標的遺伝子、標的遺伝子配列群もしくはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡもしくは標的遺伝子、またはそのいずれかのＲＮＡ転写物、または前述のもののいずれか１つのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドの数は、少なくとも１８個、例えば、１８個～２４個、または１８個～２８個、または２０個～３０個、または２０個～５０個、または２０個～１００個、または５０個～１００個、または５０個～５００個、または１００個～２５０個、または１００個～５００個、または２００個～１，０００個、または５００個～２，０００、またはそれより多いものである。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドの数は、１８個を超える個数、例えば、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、または３０個を超える個数、例えば、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２７０個、約２８０個、約２９０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、または５００個を超える個数の連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群において特定された遺伝子からなる群より選択される標的遺伝子、標的遺伝子配列群もしくはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡもしくは標的遺伝子、またはそれらのいずれかのＲＮＡ転写物、または前述のもののいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個（全体を通じて使用される少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個への言及は、群のこれらの下限のいずれかが個別化されることができることを意味するものとする）の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群において特定された遺伝子からなる群より選択される標的遺伝子、標的遺伝子配列群もしくはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡもしくは標的遺伝子、またはそれらのいずれか１つのＲＮＡ転写物、または前述のもののいずれか１つのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む１つの鎖を有する２本鎖核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）である。塩基対として表現されるそのような２本鎖核酸は、標的遺伝子配列群において特定された遺伝子からなる群より選択される標的遺伝子、標的遺伝子配列群もしくはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡもしくは標的遺伝子、またはそのいずれかのＲＮＡ転写物、または前述のもののいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体の同等の長さの断片に対応している少なくとも１８個の連続した、完全に一致した塩基対の少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに含まれる各断片は、天然に存在する制御性小分子ＲＮＡに典型的な長さよりも長く、例えば、各断片は、少なくとも約３０個の連続したヌクレオチド（または塩基対）の長さである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの全長、またはポリヌクレオチドに含まれる各断片の長さは、ＤＮＡまたは標的遺伝子の全長より短い。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの全長は、約５０個～約６００個のヌクレオチド（１本鎖ポリヌクレオチドの場合）または塩基対（２本鎖ポリヌクレオチドの場合）である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、図面および表１Ａに開示されるｄｓＲＮＡトリガーのいずれかの長さのｄｓＲＮＡなどの、約１００個～約６００個の塩基対のｄｓＲＮＡである。

【0031】

いくつかの実施形態は、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子の調節または抑制を誘導することによって発現を調節するように設計されるポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子は、標的遺伝子配列群において特定された遺伝子（Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８，ＣＤＣ４２，ＮＢＰ３５，ＳＤＨ，Ｂｃｒｒｐ１，ＸＭ＿０２４６９１７４６．１，Ｂｃｓｅｃ１５，Ｂｃｓｗｄ２，Ｂｃｍｃｍ４，Ｂｃｇｐｉ２，Ｂｃｒｐｂ５およびＢｃｄｅｄ１）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子もしくはｃＤＮＡの断片のヌクレオチド配列（例えば、標的遺伝子配列群）、またはボトリティス・シネレアの標的遺伝子から転写されたＲＮＡの配列に対して本質的に同一であるかまたは本質的に相補的であるヌクレオチド配列を有するように設計され、上記配列はコード配列または非コード配列であってよい。発現を調節するこれらの有効なポリヌクレオチド分子は、本明細書では「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチドトリガー」、「トリガー」、または「複数のトリガー」と呼ばれる場合がある。

【0032】

任意のサイズの有効なポリヌクレオチドは、単独または組み合わせて、本明細書に記載される様々な方法および組成物に使用されることができる。いくつかの実施形態では、単一のポリヌクレオチドトリガーを使用して、組成物（例えば、局所的な適用のための組成物、またはトランスジェニック植物を作製するのに有用な組換えＤＮＡ構築物）を作製する。他の実施形態では、異なったポリヌクレオチドトリガーの混合物またはプールが使用される。そのような場合に、ポリヌクレオチドトリガーは、単一の標的遺伝子または複数の標的遺伝子に対するものであり得る。

【0033】

本明細書で使用される「単離された」という用語は、ある分子を、その本来の状態または天然の状態でそれに通常結合している他の分子から分離することを指す。したがって、「単離された」という用語は、通常は本来の状態又は自然の状態で結合している他のＤＮＡ分子（複数可）から分離されているＤＮＡ分子を指す場合がある。そのようなＤＮＡ分子は、組換えＤＮＡ分子のように、組換えられた状態で存在している場合がある。したがって、例えば組換え技術の結果として、通常は結合していない調節配列またはコード配列に融合したＤＮＡ分子は、導入遺伝子として細胞の染色体に組み込まれるかまたは他のＤＮＡ分子とともに存在している場合でも、単離されたものと見なされる。

【0034】

本明細書で使用される「標的遺伝子配列群」または「標的遺伝子配列」という用語は、配列番号１～１２を含む配列の群を指す。本明細書で使用される「トリガー配列群」または「トリガー配列」という用語は、配列番号１３～２４、４９～５２を含む配列の群を指す。本明細書で使用される「ＲＮＡトリガー配列群」または「ＲＮＡトリガー配列」という用語は、配列番号２５～３６、５３～５６を含む配列の群を指す。本明細書で使用される「ＲＮＡトリガー配列逆相補体群」または「ＲＮＡトリガー配列逆相補体」という用語は、配列番号３７～４８、５７～６０を含む配列の群を指す。

【0035】

いくつかの実施形態は、１つ以上の遺伝子（「標的遺伝子」）を抑制するように設計されるポリヌクレオチドに関する。「遺伝子」という用語は、転写物の発現を提供するかまたは転写物をコードする核酸の任意の部分を指す。「遺伝子」は、プロモーター領域、５’非翻訳領域、イントロン領域を含むことができる転写コード領域、３’非翻訳領域、またはこれらの領域の組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的遺伝子（複数可）は、コード配列もしくは非コード配列、またはそれらの両方を含むことができる。他の実施形態では、標的遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡに対して同一であるかまたは相補的である配列を有し、例えば、いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、その対応したｃＤＮＡによって表される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計され、各標的遺伝子は、標的遺伝子配列群において特定される遺伝子（Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８，ＣＤＣ４２，ＮＢＰ３５，ＳＤＨ，Ｂｃｒｒｐ１，ＸＭ＿０２４６９１７４６．１，Ｂｃｓｅｃ１５，Ｂｃｓｗｄ２，Ｂｃｍｃｍ４，Ｂｃｇｐｉ２，Ｂｃｒｐｂ５およびＢｃｄｅｄ１）からなる群より選択されるかまたは標的遺伝子配列群より選択されるＤＮＡ配列によってコードされる。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の標的遺伝子を抑制するかまたは下方制御するように設計され、各標的遺伝子は、標的遺伝子配列群において特定された遺伝子からなる群より選択されるかまたは標的遺伝子配列群より選択される配列によってコードされ、かつ複数の標的遺伝子を抑制するかまたはこれらの標的遺伝子のうちの１つ以上の異なった領域を標的とするように設計され得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群、トリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性を有する２１個の連続したヌクレオチドの複数の断片を含む。そのような場合、各断片は、サイズまたは配列において同一であってもよいし異なっていてもよく、標的遺伝子に対してセンスであってもよいしアンチセンスであってもよい。例えば、一実施形態では、ポリヌクレオチドは、タンデムまたは反復配列において複数の断片を含み、各断片は、標的遺伝子配列群において特定される遺伝子、標的遺伝子配列群もしくはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡもしくは標的遺伝子または前述のいずれかのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、断片は、標的遺伝子の異なった領域に由来することができ、例えば、断片は、標的遺伝子の異なったエクソン領域に対応することができる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子に対応していない「スペーサー」ヌクレオチドは、任意選択で、断片の間または断片に隣接して使用されることができる。

【0036】

本明細書で使用される「植物」という用語は、本文の文脈が別段に明記しない限り、ボトリティス感染、すなわちボトリティス・シネレア感染を受けやすい植物を指す。ボトリティス感染を受けやすい植物の例としては、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ）、サヤマメ、ナス、唐辛子、ピーマン、マメ、トマティーロ、グランドチェリー、ケープグーズベリー、タバコ、リンゴ、ナシ、マルメロ、モモ、プラム、チェリー、アーモンド、アプリコット、ブラックベリー、ブルーベリー、ラズベリー、および開花観賞植物（例えば、バラ、ペチュニアなど）が挙げられる。

【0037】

他の定義は、以下のセクションに提供される。

【0038】

ＩＩ．ボトリティス・シネレアの防除のためのポリヌクレオチド
本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを介した植物のボトリティス・シネレア感染の防除または予防に有用である。本開示のいくつかの態様によれば、ポリヌクレオチドは、Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８，ＣＤＣ４２，ＮＢＰ３５，ＳＤＨ，Ｂｃｒｒｐ１，ＸＭ＿０２４６９１７４６．１，Ｂｃｓｅｃ１５，Ｂｃｓｗｄ２，Ｂｃｍｃｍ４，Ｂｃｇｐｉ２，Ｂｃｒｐｂ５およびＢｃｄｅｄ１からなる群より選択される１つ以上のボトリティス・シネレアの標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを干渉するのに有効である。

【0039】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群からなる群より選択されるか、または特定の実施形態では、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体、またはそれから転写されたＲＮＡの対応した断片に対して約７５％～約１００％の同一性、約８０％～約１００％の同一性、約８５％～約１００％の同一性、約９０％～約１００％の同一性、約９５％～約１００％の同一性、約９８％～約１００％の同一性、約１００％の同一性、または正確に１００％の同一性の配列を有する１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、３０個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、１２５個以上、１５０個以上、２００個以上、２５０個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、６００個以上、７００個以上、８００個以上、９００個以上、または１０００個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群からなる群より選択されるか、または特定の実施形態では、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体、またはそれから転写されたＲＮＡの少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、または少なくとも１，０００個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的ヌクレオチド配列を含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群からなる群より選択されるか、または特定の実施形態では、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体、またはそれから転写されたＲＮＡの対応した断片に対して本質的に相補的である少なくとも２１個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体、またはそれから転写されたＲＮＡの対応した断片に対して本質的に相補的である少なくとも４００個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに対して相補性を有するように設計される。いくつかの実施形態では、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子は、Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８，ＣＤＣ４２，ＮＢＰ３５，ＳＤＨ，Ｂｃｒｒｐ１，ＸＭ＿０２４６９１７４６．１，Ｂｃｓｅｃ１５，Ｂｃｓｗｄ２，Ｂｃｍｃｍ４，Ｂｃｇｐｉ２，Ｂｃｒｐｂ５およびＢｃｄｅｄ１からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、２本鎖ＲＮＡである。また、いくつかの実施形態では、２本鎖ＲＮＡは、配列番号２５～３６、５３～５６からなる群より選択されるか、またはいくつかの実施形態では、配列番号２６、３１、３３、３５、および３６からなる群より選択される配列を含む１つの鎖、およびそれに対して相補的である第２の鎖を含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択されるか、または特定の実施形態では、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体、またはそれから転写されたＲＮＡの同等の長さの断片に対して本質的に相補的であるか、または正確に（１００％）同一である連続したヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択されるか、または特定の実施形態では、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体、またはそれから転写されたＲＮＡの同等の長さの断片に対して約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性の全体配列を有する。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドの数は、１８を超える個数、例えば、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、または３０個を超える個数、例えば、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２７０個、約２８０個、約２９０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、５００個を超える連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択されるか、または特定の実施形態では、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個（全体を通じて使用される少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個などへの言及は、群のこれらの下限のいずれかが個別化されることができることを意味するものとする）の少なくとも１つの断片を含む。

【0042】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体、またはそれから転写されたＲＮＡの対応した断片に対して本質的に相補的であるか、または１００％同一である２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたは標的遺伝子の対応した断片に対して１００％の同一性を有する２１個の連続したヌクレオチドの１つ以上の断片に加えて、１つ以上の「ニュートラル」配列（標的遺伝子に対して配列の同一性または相補性を有さない配列）を含み、したがって、ポリヌクレオチドは、全体として、ＤＮＡまたは標的遺伝子に対する全体的な相補性または配列同一性がより低い。

【0043】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群から選択されるか、または特定の実施形態では、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する１つ以上のＤＮＡまたは標的遺伝子、またはそのＤＮＡ相補体またはそれから転写されたＲＮＡの対応した断片に対して相補的であるかまたは１００％同一である２１個以上の連続したヌクレオチドの複数の断片の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子の対応した断片に対して相補的であるかまたは１００％の配列同一性を有する２１個の連続したヌクレオチドの１つ以上の断片に加えて、１つ以上の「ニュートラル」配列（標的遺伝子に対して配列同一性または相補性を有さない配列）を含み、したがって、ポリヌクレオチドは、全体として、所与の標的遺伝子に対する全体的な相補性または配列同一性がより低い。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択されるか、または特定の実施形態では、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択されるＤＮＡ配列を有する標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体、またはそれから転写されたＲＮＡの長さ全体にわたって位置的に分布される対応した断片に対して相補的であるかまたは１００％同一性を有する２１個以上の連続したヌクレオチドまたはもっと長いものの複数の断片の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子の長さ全体にわたって位置的に分布される対応した断片に対して１００％の同一性を有する２１個の連続したヌクレオチドの１つ以上の断片に加えて、１つ以上の「ニュートラル」配列（標的遺伝子に対して配列同一性または相補性を有さない配列）を含み、したがって、ポリヌクレオチドは、全体として、所与の標的遺伝子に対する全体的な相補性または配列同一性がより低い。

【0044】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡトリガー配列群またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群からなる群より選択されるか、または特定の実施形態では、配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列の少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個、または少なくとも５００個の連続したヌクレオチドに対して約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約９８％～約１００％、約１００％、または１００％同一である配列を含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列、ＲＮＡトリガー配列もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体からなる群より選択されるか、または特定の実施形態では配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７および４８からなる群より選択される配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または正確に１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３～６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２６および３１からなる群より選択される配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または正確に１００％同一である配列を含む。

【0046】

いくつかの実施形態は、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体群からなる群より選択されるか、または特定の実施形態では配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７および４８からなる群より選択される配列に対して約９５％～約１００％同一性の配列を含むポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態は、ＲＮＡトリガー配列群もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体群、または特定の実施形態では配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列の一部分に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、１８個以上の連続したヌクレオチドは、２１個以上の連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドの数は、少なくとも１８個、例えば、１８個～２４個、または１８個～２８個、または２０個～３０個、または２０個～５０個、または２０個～１００個、または５０個～１００個、または５０個～５００個、または１００個～２５０個、または１００個～５００個、または２００個～１，０００個、または５００個～２，０００、またはそれより多いものである。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドの数は、１８個を超える個数、例えば、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、または３０個を超える個数、例えば、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２７０個、約２８０個、約２９０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約６００個、または６００個を超える個数の連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、およびＲＮＡトリガー配列逆相補体群からなる群より選択されるか、または特定の実施形態では配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列内に見出される同等の長さの断片に対して１００％同一性の配列を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個（全体を通じて使用される少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個などへの言及は、群のこれらの下限のいずれかが個別化されることができることを意味するものとする）の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、およびＲＮＡトリガー配列逆相補体群からなる群から選択されるか、または特定の実施形態では配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列内に見出される同等の長さの断片に対して少なくとも８５％の同一性の配列を有する少なくとも２００個、３００個、４００個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２６に見出される同等の長さの断片に対して少なくとも８５％同一である少なくとも２００個、３００個、４００個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択されるか、または特に配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の断片に対して約９５％～１００％の同一性を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む１つの鎖を有する２本鎖核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）である。塩基対として表現されるそのような２本鎖核酸は、標的遺伝子配列群より選択されるか、または配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より特に選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対応する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続した、完全に一致した塩基対の少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに含まれる各断片は、天然に存在する制御性小分子ＲＮＡに典型的な長さよりも長く、例えば、各断片は、少なくとも約３０個の連続したヌクレオチド（または塩基対）の長さである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの全長、またはポリヌクレオチドに含まれる各断片の長さは、標的遺伝子配列群より選択されるか、または配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より特に選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子の全長より短い。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの全長は、約５０個～約６００個のヌクレオチド（１本鎖ポリヌクレオチドの場合）または塩基対（２本鎖ポリヌクレオチドの場合）である。

【0048】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、図面および表に開示されるＲＮＡトリガー配列のいずれかの長さのｄｓＲＮＡなどの、約１００個～約６００個の塩基対のｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７および４８からなる群より選択される配列を含む１つの鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、およびＲＮＡトリガー配列逆相補体群からなる群より選択されるか、または特定の実施形態では配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列内に見出される同等の長さの断片に対して少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９８％または１００％の同一性の配列を有する少なくとも２００個、３００個、４００個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む１つの鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６に見出される同等の長さの断片に対して少なくとも８５％同一である少なくとも２００個、３００個、４００個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む１つの鎖を含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに対して相補性を有するように設計される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、標的遺伝子配列群において特定された遺伝子（Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８，ＣＤＣ４２，ＮＢＰ３５，ＳＤＨ，Ｂｃｒｒｐ１，ＸＭ＿０２４６９１７４６．１，Ｂｃｓｅｃ１５，Ｂｃｓｗｄ２，Ｂｃｍｃｍ４，Ｂｃｇｐｉ２，Ｂｃｒｐｂ５およびＢｃｄｅｄ１）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに結合する（例えば、本質的に相補的である）第１の鎖と、第１の鎖に相補的な第２の鎖とを含む。ｄｓＲＮＡは、同じ長さまたは異なった長さのＲＮＡ鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、第２の鎖（例えば、センス鎖）と同じ長さの第１の鎖（例えば、アンチセンス鎖）を含む。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、第２の鎖（例えば、センス鎖）とは異なった長さの第１の鎖（例えば、アンチセンス鎖）を含む。第１の鎖は、第２の鎖よりも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、または２０％超長くてよい。第１の鎖は、第２の鎖よりも１個～５個、２個～５個、２個～１０個、５個～１０個、５個～１５個、１０個～２０個、１５個～２０個、または２０個超のヌクレオチド長くてよい。ｄｓＲＮＡ分子は、ステムループ構造の単一のオリゴヌクレオチド、ならびに２つ以上のループ構造と、自己相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むステムとを有する環状１本鎖ＲＮＡから組み立てることもでき、上記ＲＮＡ分子の自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカー（複数可）によって連結され、上記環状ＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介できる活性なＲＮＡｉ分子を生成するために、インビボまたはインビトロで処理することができる。ＲＮＡｉ分子は分子の一端に３’オーバーハングを含んでよく、もう一方の端は平滑末端であるか、またはオーバーハング（５’または３’）を持っていてよい。ＲＮＡｉ分子が分子の両端にオーバーハングを含む場合、オーバーハングの長さは同じであってもよいし異なっていてもよい。

【0050】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群において特定された遺伝子（Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８，ＣＤＣ４２，ＮＢＰ３５，ＳＤＨ，Ｂｃｒｒｐ１，ＸＭ＿０２４６９１７４６．１，Ｂｃｓｅｃ１５，Ｂｃｓｗｄ２，Ｂｃｍｃｍ４，Ｂｃｇｐｉ２，Ｂｃｒｐｂ５およびＢｃｄｅｄ１）からなる群より選択されるボトリティス・シネレアの標的遺伝子のタンパク質産物の発現を調節するように設計される。

【0051】

いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡトリガー配列またはＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または正確に１００％同一である１つ以上のヌクレオチド配列を含む１つの鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡトリガー配列群またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択されるか、または特定の実施形態では配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列の一部分に対して約９５％～約１００％の同一性を有する１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、５５０個、５７５個、または６００個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列の一部分に対して９５％の配列同一性を有する２１個の連続したヌクレオチドの配列を含む。そのようなｄｓＲＮＡは、第１の鎖に相補的な第２の鎖をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡトリガー配列より選択されるヌクレオチド配列を含む第１の鎖と、対応したＲＮＡトリガー配列逆相補体または第１の鎖の配列に相補的な別の配列より選択される第２の鎖とを含む。特定の実施形態は、ポリヌクレオチドが、配列番号２６、３１、３３、３５、および３６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含むｄｓＲＮＡであるものを含む。

【0052】

ＩＩＩ．ポリヌクレオチドの長さ
本明細書で提供される標的遺伝子を標的とするＲＮＡｉ分子は、長さが異なり得る。いくつかの実施形態では、長いＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ）分子が殺菌剤として（例えば、植物に）適用されるが、細胞に入った後、ｄｓＲＮＡはダイサー酵素によって、例えば、１５個～２５個のヌクレオチドの長さを有するより短い２本鎖ＲＮＡ断片に切断されることを理解するべきである。したがって、本開示のＲＮＡｉ分子は、例えば１５個～２５個のヌクレオチド断片として送達されてもよく、またはより長い２本鎖核酸（例えば少なくとも１００個のヌクレオチド）として送達されてもよい。

【0053】

本発明のポリヌクレオチドの全長は、１８個の連続したヌクレオチドよりも長いかまたはそれに等しくてよく、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体またはそれから転写されたＲＮＡの同等の長さの断片に対して約７５％～約１００％の同一性の配列を有する連続したヌクレオチドに加えてヌクレオチドを含んでよい。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群からなる群より選択される配列の１８個以上の連続したヌクレオチドに対して約７５％～約１００％同一である１つ以上の配列を含んでよく、また追加の無関係な配列を含んでよい。言い換えれば、ポリヌクレオチドの全長は、１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計されるポリヌクレオチドのセクションまたは断片の長さよりも長くてよい。

【0054】

例えば、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子を抑制する「活性」断片（例えば、「活性」断片は、標的遺伝子またはそれから転写されたｍＲＮＡの断片に対して本質的に相補的な配列であってもよく、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される配列であってもよい）に隣接するヌクレオチドを有することができるか、または活性断片間に「スペーサー」ヌクレオチドを含むか、または５’末端または３’末端または５’末端と３’末端の両方に追加のヌクレオチドを有することができる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ボトリティス・シネレアの防除のために本明細書に開示される配列に特に関連していない（相補的または同一ではない配列を有する）追加のヌクレオチドを含むことができる。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、安定化二次構造を提供するヌクレオチドを含んでもよく、クローニングもしくは製造の利便性のためにヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、活性断片のすぐ隣に位置する追加のヌクレオチドを含むことができる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つのそのような断片を含み、当該断片に隣接する追加の５’Ｇまたは追加の３’Ｃまたはそれらの両方を有する。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のオーバーハングを形成するために追加のヌクレオチドを含む２本鎖ＲＮＡ、例えば、３’オーバーハングを形成するために２つのデオキシリボヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に列挙される１つ以上の活性断片、ならびにボトリティス・シネレアの他の標的遺伝子に活性な追加の断片、または別の真菌もしくは害虫に活性な追加の断片を含んでよい。

【0055】

したがって、様々な実施形態では、ポリヌクレオチド全体のヌクレオチド配列は、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群に対して１００％同一または相補的ではなく、標的遺伝子における連続したヌクレオチドの配列に対して１００％同一または相補的ではない。例えば、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも２つの断片を含み、（１）少なくとも２つの断片は、１つ以上のスペーサーヌクレオチドによって分離されるか、または（２）少なくとも２つの断片は、対応した断片が標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の内に存在する順序とは異なる順序で配置されている。

【0056】

いくつかの実施形態は、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子の下方制御または抑制を誘導することによって発現を調節するように設計されるポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子もしくはｃＤＮＡ（例えば、標的遺伝子配列群）のヌクレオチド配列、またはボトリティス・シネレアの標的遺伝子から転写されたＲＮＡの配列に対して本質的に同一であるか、または本質的に相補的であるヌクレオチド配列を有するように設計され、上記配列はコード配列または非コード配列であってよい。発現を調節するこれらの有効なポリヌクレオチド分子は、本明細書では「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチドトリガー」、「トリガー」、または「複数のトリガー」と呼ばれる場合がある。そのような実施形態の例は、ＲＮＡトリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される１つ以上の配列を含むポリヌクレオチドを含む。さらなる例は、ＲＮＡトリガー配列群またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される配列の一部分に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むポリヌクレオチドを含む。

【0057】

任意のサイズの有効なポリヌクレオチドは、単独または組み合わせて、本明細書に記載される様々な方法および組成物に使用されることができる。いくつかの実施形態では、単一のポリヌクレオチドトリガーを使用して、組成物（例えば、局所的な適用のための組成物、またはトランスジェニック植物を作製するのに有用な組換えＤＮＡ構築物）を作製する。他の実施形態では、異なるポリヌクレオチドトリガーの混合物またはプールが使用される。このような場合、ポリヌクレオチドトリガーは、単一の標的遺伝子または複数の標的遺伝子に対するものであり得る。

【0058】

ＩＶ．許容されたミスマッチ
本明細書で使用される「本質的に同一」または「本質的に相補的」とは、ポリヌクレオチド（または２本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも１つの鎖）が、標的遺伝子の発現を抑制する（例えば、標的遺伝子転写物および／またはコードされたタンパク質のレベルまたは活性の低下に影響する）ために、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、転写物）に対して十分な同一性または相補性を有することを意味する。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を抑制する（例えば、標的遺伝子転写物またはコードされたタンパク質のレベルまたは活性の低下に影響するか、またはボトリティス・シネレアの防除を提供する）ために、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡに対して１００％の同一性または相補性を有する必要はない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその一部分は、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡのいずれかにおける少なくとも１８個または１９個の連続したヌクレオチドの配列と本質的に同一であるか、または本質的に相補的であるように設計される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその一部は、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡにおける２１個の連続したヌクレオチドの１つ以上の配列に対して１００％同一であるか、または１００％相補的であるように設計される。特定の実施形態では、「本質的に同一の」ポリヌクレオチドは、内因性標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡの１８個以上の連続したヌクレオチドの配列と比較する場合、１００％の配列同一性、または少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、「本質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡの１８個以上の連続したヌクレオチドの配列と比較する場合、１００％の配列相補性、または少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相補性を有する。

【0059】

配列同一性：２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、本明細書に使用される、文脈における「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定された比較ウィンドウにわたって最大の対応のために整列される場合、同じである２つの分子の配列における残基を指す。

【0060】

パーセント同一性は、両方の配列において同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で除し、そして結果に１００を乗じて配列同一性のパーセントを得ることによって計算される。参照配列と比較してすべての位置において同一である配列は、参照配列に対して１００％同一であると言われ、その逆も同様である。２つのヌクレオチド配列のパーセント同一性は、比較ウィンドウにわたって分子の２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列またはポリペプチド配列）を比較することによって決定されることができ、比較ウィンドウにおける配列の部分は、２つの配列の最適な整列のための参照配列（追加又は削除を含まない）と比較して追加又は削除（すなわちギャップ）を含む場合がある。２つ以上の配列を比較する最適な整列は、利用可能な様々なコンピュータープログラムによるローカルまたはグローバル整列を使用して実行されることができる。Ｔｈｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｏｆ Ｓｍｉｔｈ Ｔ．Ｆ．ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ｍ．Ｓ．（１９８１），Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７（１）：１９５－，ＰｕｂＭｅｄ：７２６５２３８ ＤＯＩ：１０．１０１６／００２２－２８３６（８１）９００８７－５は、適切なローカル整列戦略であり、ＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／）などのツールで利用される。Ｔｈｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｏｆ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｃ．Ｄ．（１９７０），Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（３）：４４３－５３，ＰｕｂＭｅｄ：５４２０３２５，ＤＯＩ：１０．１０１６／００２２－２８３６（７０）９００５７－４は、適切なグローバル整列戦略であり、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）などのツールで利用される。比較される配列と関連したパラメーターに応じて、ローカルまたはグローバル整列戦略は最適な整列を見出す可能性が高いが、両方の戦略を利用して最も正確なパーセント同一性を与える最適な整列を確認することができる。

【0061】

配列長さの数値に関する「約」という用語は、最大１～５％の＋／－の分散を有する記載された値を意味する。例えば、約３０個の連続したヌクレオチドは、２７個～３３個の連続したヌクレオチドの範囲、またはその間の任意の範囲を意味する。配列同一性のパーセントの数値に関する「約」という用語は、最も近い整数に四捨五入した最大１～３％の＋／－の分散を有する記載されたパーセント値を意味する。例えば、約９０％の配列同一性は、８７％～９３％の範囲を意味する。ただし、配列同一性のパーセントは１００％を超えることはできない。したがって、約９８％の配列同一性は、９５％～１００％の範囲を意味する。

【0062】

標的遺伝子または転写物に対するミスマッチを含むポリヌクレオチドは、本明細書に記載される組成物および方法の特定の実施形態では使用されることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異体は、所与の変異に対してほぼ等しい確率で選択される４つのヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）を有するランダムに配置された変異を含む。いくつかの実施形態では、これらの変異は、配列の小さな領域にわたって分布されるか、または配列の長さ全体にわたって広く分布される可能性がある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子または標的遺伝子の転写物における同等の長さの断片に対して本質的に同一であるか、または本質的に相補的である少なくとも１８個または少なくとも１９個または少なくとも２１個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的遺伝子または標的遺伝子の転写物における同等の長さの断片に対して本質的に同一であるかまたは本質的に相補的である１８個、１９個、２０個、または２１個以上の連続したヌクレオチドのポリヌクレオチドは、標的遺伝子または転写物に対して１つまたは２つのミスマッチ（すなわち、ポリヌクレオチドの２１個の連続したヌクレオチドと、標的遺伝子または標的遺伝子の転写物における同等の長さの断片との間の１つまたは２つのミスマッチ）を有し得る。特定の実施形態では、標的遺伝子または標的遺伝子の転写物における同等の長さの断片に対する同一性または相補性の連続した１８個、１９個、２０個、もしくは２１個以上のヌクレオチドスパンを含む約５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドは、標的遺伝子または転写物に対して１つまたは２つ以上のミスマッチを有する可能性がある。

【0063】

内因性標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡに対してミスマッチを有するポリヌクレオチドを設計される際に、許容される可能性が高い特定のタイプの、および特定の位置におけるミスマッチは使用されることができる。特定の実施形態では、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３：１６７１－１６７７によって記載されているように、アデニンとシトシン、またはグアノシンとウラシル残基の間に形成されるミスマッチを使用する。（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３：１６７１－１６７７．いくつかの実施形態では、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３：１６７１－１６７７によって記載されているように、１９の塩基対重複領域におけるミスマッチは、低許容位置５、７、８または１１（１９－ヌクレオチド標的の５’末端から）に、中許容位置３、４、および１２～１７（１９－ヌクレオチド標的の５’末端から）に、および／または相補性の領域のいずれかの末端、すなわち位置１、２、１８、および１９（１９－ヌクレオチド標的の５’末端から）の高許容位置にある。（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３：１６７１－１６７７．許容されるミスマッチは、通常のアッセイにより経験的に決定できる。

【0064】

Ｖ．ニュートラル配列におけるサイレンシング要素の埋め込み
いくつかの実施形態では、標的遺伝子に対応した配列を含み、かつ観察された標的遺伝子の抑制に関与するサイレンシング要素は、「ニュートラル」配列に埋め込まれる、すなわち、標的遺伝子に対して配列同一性または相補性を有さない追加のヌクレオチドに挿入される。ニュートラル配列は、例えば、ポリヌクレオチドの全長を増加させるため、またはサイレンシング複合体への増加された結合などの望ましい特性を付与するために、望ましい場合がある。例えば、製造における安定性、費用対効果、またはサイレンシング効率などの有効な生物学的活性の理由から、ポリヌクレオチドは特定のサイズであることが望ましい場合がある。いくつかの実施態様では、ニュートラル配列はまた、ヘアピントリガーにおいてループなどの好ましい二次構造を形成するのに有用であり、又はトリガー領域間のスペーサーとして有用である。

【0065】

したがって、一実施形態では、標的遺伝子配列群における標的遺伝子の同等の長さの断片に対応し、かつボトリティス・シネレア感染の防除を提供することが判明される２１塩基対のｄｓＲＮＡサイレンシング要素は、追加の３９個の塩基対のニュートラル配列に埋め込まれ、それにより約６０個の塩基対のポリヌクレオチドを形成する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡトリガーは、約６０個～約６００個の塩基対、または１００個～約５００個の塩基対のニュートラル配列を含み、その中には、標的遺伝子配列群より選択される配列を有する標的遺伝子の同等の長さの断片に対して１００％の同一性または１００％の相補性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片が埋め込まれる。別の実施形態では、標的遺伝子の同等の長さの断片に対して１００％の同一性または１００％の相補性の配列を有する単一の２１塩基対サイレンシング要素は、ニュートラル配列のより大きなセクションに埋め込まれた場合に（例えば、総ポリヌクレオチド長さは約６０個の塩基対から約３００個の塩基対である場合に）有効であることが判明される。ポリヌクレオチドがニュートラル配列の領域を含む実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子と比較して比較的に低い全体的な配列同一性を有する。例えば、ニュートラル配列の追加の１８９個の塩基対に埋め込まれた（標的遺伝子の２１－ヌクレオチド断片に対して１００％の同一性または相補性の）単一の２１塩基対トリガーを含む、２１０個の塩基対の全長を有するｄｓＲＮＡは、標的遺伝子に対して約１０％の全体的な配列同一性を有する。

【0066】

ＶＩ．関連技術
本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよび核酸分子の実施形態は、プロモーター、初期転写配列、転写開始要素、転写伸長要素、転写停止要素、小分子ＲＮＡ認識部位、アプタマーまたはリボザイム、（例えば、殺菌タンパク質または選択可能なマーカーなどの導入遺伝子を発現する）コード配列または（例えば、追加の抑制要素を発現する）非コード配列を発現するための追加の発現カセットなどの追加の要素を含んでよい。例えば、本発明の一態様は、標的遺伝子配列群の相補体より選択される配列を有するＤＮＡの同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むＤＮＡに操作可能な形で連結される転写開始配列を有する異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。本発明の別の態様は、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群から選択される群より選択される配列または配列の断片を有するアンチセンス領域を有するＲＮＡヘアピンをコードするＤＮＡに操作可能な形で連結される転写開始配列を有する異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。別の実施形態では、（ａ）標的遺伝子配列群より選択される標的遺伝子を抑制するためのＲＮＡサイレンシング要素、および（ｂ）アプタマーをコードするＤＮＡに操作可能な形で連結されるプロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物は、ＲＮＡアプタマーを含むＲＮＡ転写物及びＲＮＡサイレンシング要素が植物の細胞において発現される場所から、植物のゲノムに安定的に組み込まれ、上記アプタマーは、ＲＮＡサイレンシング要素を細胞中の所望の位置に導く役割を果たす。別の実施態様では、小分子ＲＮＡによる（例えば、特定の細胞または組織にのみ発現されるｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡによる）結合および切断のための１つ以上の認識部位を含めることによって、植物におけるより正確な発現パターンが可能になり、小分子ＲＮＡが発現される場所で組換えＤＮＡ構築物の発現が抑制される。
そのような追加の要素は以下に説明される。

【0067】

ＶＩＩ．ポリヌクレオチドとの接触によるボトリティス・シネレア感染の防除
本明細書では、植物のボトリティス・シネレア感染を防除する方法が提供される。そのような方法は、ボトリティス・シネレアを、本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよび他の組成物のいずれかと接触させることを含む。いくつかの実施形態は、植物を、上記セクションＩＩまたは本明細書における他の場所で記載されるポリヌクレオチドのいずれかと接触させることによって、植物のボトリティス・シネレア感染を防除する方法に関する。いくつかの実施形態は、ボトリティス・シネレアを、Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８，ＣＤＣ４２，ＮＢＰ３５，ＳＤＨ，Ｂｃｒｒｐ１，ＸＭ＿０２４６９１７４６．１，Ｂｃｓｅｃ１５，Ｂｃｓｗｄ２，Ｂｃｍｃｍ４，Ｂｃｇｐｉ２，Ｂｃｒｐｂ５およびＢｃｄｅｄ１からなる群より選択されるボトリティス・シネレアの標的遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドと接触させることに関する。いくつかの実施形態は、ボトリティス・シネレアを、標的遺伝子配列群からなる群より選択されるＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の対応した断片に対して約９５％～約１００％の同一性または相補性を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むポリヌクレオチドと接触させることによって、植物のボトリティス・シネレア感染を防除する方法に関する。一実施形態では、植物のボトリティス・シネレア感染を防除する方法は、ボトリティス・シネレアを、配列番号１～１２からなる群より選択されるＤＮＡ配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の対応した断片に対して１００％の同一性を有する少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと接触させることを含む。他の実施形態では、植物のボトリティス・シネレア感染を防除する方法は、配列番号２、７、９、１１、および１２からなる群より選択されるＤＮＡ配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の対応した断片に対して１００％の同一性を有する少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、２本鎖ＲＮＡ）は、化学的もしくは酵素的に合成されるか、または微生物における発現もしくは植物細胞における発現によって生成される。実施形態は、ポリヌクレオチドがトリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される配列を有する鎖を含むｄｓＲＮＡであるものを含む。実施形態は、ポリヌクレオチドがＲＮＡトリガー配列群またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される配列の一部分に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むものをさらに含む。この方法で使用するポリヌクレオチドを、複数の標的遺伝子向けに設計することができる。本発明の関連した態様は、この方法で使用する単離されたポリヌクレオチド、およびこの方法によって提供される改善されたボトリティス・シネレア耐性を有する植物を含む。特定の実施形態は、ポリヌクレオチドが配列番号２６、３１、３３、３５、３６からなる群より選択される配列を含むｄｓＲＮＡまたはその相補体であるものを含む。

【0068】

いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性の配列を有する。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して正確に（１００％）同一である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性の全体配列を有する。

【0069】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１～１２からなる群より選択されるＤＮＡ配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の対応した断片に対して１００％の同一性を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたは標的遺伝子の対応した断片に対して１００％の同一性を有する２１個の連続したヌクレオチドの１つ以上の断片に加えて、「ニュートラル」配列（標的遺伝子に対して配列同一性または相補性を有さない配列）を含み、したがって、ポリヌクレオチドは、全体として、標的遺伝子に対する全体的な配列同一性がより低い。

【0070】

いくつかの実施形態では、この方法で使用されるポリヌクレオチドは、単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ断片として提供される。いくつかの実施形態では、この方法で使用されるポリヌクレオチドは、発現構築物の一部分ではなく、プロモーターまたはターミネーター配列などの追加の要素を欠いている）。そのようなポリヌクレオチドは、約１８個～約５００個または約５０個～約６００個のヌクレオチド（１本鎖ポリヌクレオチドの場合）または約１８個～約５００個または約５０個～約６００個の塩基対（２本鎖ポリヌクレオチドの場合）の１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチドなどの、比較的に短いものであってよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３～６０のｄｓＲＮＡトリガーのいずれかの長さのｄｓＲＮＡなどの、約１００個～約６００個の塩基対のｄｓＲＮＡである。あるいは、ポリヌクレオチドは、より複雑な構築物で提供され、例えば、組換え発現構築物の一部分として提供されるか、または組換えベクター、例えば組換え植物ウイルスベクターもしくは組換えバキュロウイルスベクターに含まれることができる。いくつかの実施形態では、そのような組換え発現構築物またはベクターは、対象となる遺伝子（例えば、殺菌性タンパク質）を発現するための発現カセットなどの追加の要素を含むように設計される。

【0071】

いくつかの実施形態は、ボトリティス・シネレアを、標的遺伝子配列群で同定された遺伝子からなる群より選択される標的遺伝子のＤＮＡの同等の長さの断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むポリヌクレオチドと接触させることを含む、植物のボトリティス・シネレア感染を防除する方法に関する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列群からなる群より選択される配列を有する鎖を有するｄｓＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ボトリティス・シネレアを、ＲＮＡトリガー配列群より選択される配列を含む鎖を有する２本鎖ＲＮＡを含む有効量の溶液と接触させることを含む植物のボトリティス・シネレア感染を防除する方法を提供し、上記溶液は、当技術分野で周知のオルガノシリコーン界面活性剤および／または他の農業用製剤成分をさらに含む。

【0072】

この方法の様々な実施形態では、接触は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む適切な組成物（例えば、セクションＩＩに記載のポリヌクレオチド、セクションＶＩＩＩに記載のｄｓＲＮＡ、またはセクションＩＸに記載の組成物）の、ボトリティス・シネレアに感染しているかまたは感染する可能性がある植物の表面への適用を含む。そのような組成物は、例えば、固体、（可溶性液体濃縮物などの均質混合物、および懸濁液、コロイド、ミセル、および乳濁液などの不均質混合物を含む）液体、粉末、懸濁液、乳濁液、スプレー、カプセル化またはマイクロカプセル化製剤として、マイクロビーズまたは他の担体粒子の中または上に、フィルムまたはコーティング内に、またはマトリックス上もしくはマトリックス内に、または葉、種子、根、もしくは茎の処理として提供されることができる。一実施形態では、表面は植物の葉、花、または果実である。そのような実施形態では、適用は、植物の葉、花、または果実にスプレーすることによって達成されることができる。接触は、種子処理の形態であってもよい。殺虫剤の製剤化および種子処理の当業者に知られているように、適切な結合剤、不活性担体、界面活性剤などは、任意に組成物に含まれることができる。いくつかの実施形態では、接触は、１つ以上の担体剤および／または１つ以上の界面活性剤（例えば、有機シリコーン、有機シリコーン界面活性剤）、非ポリヌクレオチド殺菌剤、ポリヌクレオチド除草剤分子、ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、毒性緩和剤、および病原体成長制御剤をさらに含む組成物内にポリヌクレオチドを提供することを含む。一実施形態では、接触は、植物上のボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそうでなければそれによって内部的に吸収されることができる組成物内にポリヌクレオチドを提供することを含む。

【0073】

ＶＩＩＩ．殺菌性２本鎖ＲＮＡ分子
本発明の別の態様は、ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、ボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または増殖／生殖能力（胞子形成）の低下を引き起こす殺菌性２本鎖ＲＮＡ分子を提供し、殺菌性２本鎖ＲＮＡは、上記セクションＩＩまたは本明細書の他の場所に記載されるポリヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド配列を含む。本発明の特定の実施形態は、ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかまたはそれと接触する場合に、植物上のボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、または増殖／生殖能力（胞子形成）の低下を引き起こす殺菌性２本鎖ＲＮＡ分子を提供し、殺菌性２本鎖ＲＮＡ分子は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有する標的遺伝子またはＤＮＡの同等の長さの断片に対して本質的に同一であるかまたは本質的に相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡは、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される１つ以上の配列を含む第１の鎖を含む。いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡは、配列番号１３～６０からなる群より選択されるか、または配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列の少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも５５０個、少なくとも５７５個、または少なくとも６００個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、９５％～約１００％、約９８％～約１００％、約１００％、または１００％同一である配列を含む第１の鎖を含む。いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡトリガー配列群またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群からなる群より選択されるか、または配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列の一部分に対して約９５％～約１００％の同一性を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、１８個以上の連続したヌクレオチドは、２１個の連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡトリガー配列またはＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または正確に１００％同一である配列を含む第１の鎖を含む。いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡは、配列番号１３～６０からなる群より選択されるか、または配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡは、第１の鎖に相補的な第２の鎖をさらに含む。いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡトリガー配列より選択されるヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、対応したＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される配列を含む第２鎖をさらに含む。いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡは、配列番号２６、３１、３３、３５、および３６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、配列番号３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される対応した相補的な配列より選択される配列を含む第２の鎖をさらに含む。

【0074】

殺菌性ｄｓＲＮＡの１つの鎖の全長は、１８個の連続したヌクレオチドより長いかまたはそれに等しくてよく、ＲＮＡトリガー配列群もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択されるか、または配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列の一部分に対して約９５％～約１００％の配列を有する連続したヌクレオチドに加えて、ヌクレオチドを含んでよい。ＲＮＡトリガー配列群およびＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択されるヌクレオチド配列を含む殺菌性ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡトリガー配列群およびＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される配列のヌクレオチドに加えて、ヌクレオチドを含んでよい。言い換えれば、ｄｓＲＮＡ鎖の全長は、ＲＮＡトリガー配列群またはＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される配列または配列の一部分の長さよりも長くてよい。例えば、ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子を抑制する「活性」断片に隣接するヌクレオチドを有してよいか、または活性断片の間に「スペーサー」ヌクレオチドを含んでよいか、または５’末端にもしくは３’末端にもしくは５’末端と３’末端の両方に追加のヌクレオチドを有してよい。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、所与のトリガーによって標的とされる標的遺伝子に特に関連していない（相補的または同一ではない配列を有する）追加のヌクレオチド、例えば、安定化している二次構造を提供するか、またはクローニングもしくは製造における利便性を提供するヌクレオチドを含んでよい。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡトリガー配列群またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される配列または配列の一部分にすぐ隣に位置する追加のヌクレオチドを含んでよい。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、断片に隣接する追加の５’Ｇまたは追加の３’Ｃまたはその両方を有する１つのそのような断片を含む。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、オーバーハングを形成するために追加のヌクレオチドをさらに含み、例えば、ｄｓＲＮＡは、３’オーバーハングを形成するために２つのデオキシリボヌクレオチドを含む。したがって、様々な実施形態では、ｄｓＲＮＡ全体のヌクレオチド配列は、ＲＮＡトリガー配列またはＲＮＡトリガー配列逆相補体に対して１００％同一または相補的ではない。例えば、いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡトリガー配列またはＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択される配列の一部分に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも２つの断片を含み、（１）上記少なくとも２つの断片は、１つ以上のスペーサーヌクレオチドによって分離され、または（２）上記少なくとも２つの断片は、対応した断片が標的遺伝子内に存在する順序とは異なる順序で配置される。

【0075】

いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡ分子は、長さが約５０個～約６００個の塩基対である。いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡ分子は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有する標的遺伝子またはＤＮＡの同等の長さの断片に対して本質的に同一であるか、または本質的に相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの複数の断片を含み、上記断片は、標的遺伝子の異なった領域に由来する（例えば、断片は、標的遺伝子の異なったエクソン領域に対応することができ、標的遺伝子に対応していない「スペーサー」ヌクレオチドは、断片間にまたは断片に隣接して任意に使用されることができる）か、または異なった標的遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡ分子は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有する標的遺伝子またはＤＮＡの同等の長さの断片に対して本質的に同一であるか、または本質的に相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの複数の断片を含み、上記断片は、標的遺伝子の異なった領域に由来し、断片が標的遺伝子内に自然に存在する順序とは異なる順序で殺菌性ｄｓＲＮＡ分子内に配置される。いくつかの実施形態では、殺菌性ｄｓＲＮＡ分子は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有する標的遺伝子またはＤＮＡの同等の長さの断片に対して１００％の同一性または１００％相補的である配列を有する１８個の連続したヌクレオチドの複数の断片を含み、上記断片は、標的遺伝子の異なった領域に由来し、断片が標的遺伝子内に自然に存在する順序とは異なる順序で殺菌性２本鎖ＲＮＡ分子内に配置される。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡ分子は、トリガー配列群からなる群より選択される配列を含む１つの鎖、またはその相補体を含む。

【0076】

殺菌性ｄｓＲＮＡ分子は、ボトリティス・シネレアによる感染を防除または予防するために、植物に局所的に適用されることができる。殺菌性ｄｓＲＮＡ分子は、トランスフェクションまたはボトリティス・シネレアによる直接接触に適した形態、例えばスプレーまたは粉末の形態で提供されることができる。殺菌性ｄｓＲＮＡ分子を提供するための他の方法および適切な組成物は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるものと同様である。

【0077】

いくつかの実施形態は、１つ以上の殺菌性ポリヌクレオチドと、水または他の溶剤と、任意選択で有機シリコーン界面活性剤とを含むタンクミックスに関する。実施形態は、ポリヌクレオチドのタンクミックス製剤と、場任意選択で少なくとも１つの殺虫剤とを含む。そのような組成物の実施形態は、１つ以上の殺菌性ポリヌクレオチドが、細菌もしくは真菌もしくは酵母細胞などの生きているもしくは死んだ微生物内に提供されるか、または微生物発酵産物として提供されるか、または生きているもしくは死んだ植物細胞内に提供されるか、または合成の組換えポリヌクレオチドとして提供されるものを含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるように、ポリヌクレオチドを含む微生物の非病原性株を含む。上記微生物の摂取は、ボトリティス・シネレアの成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、増殖／生殖能力（胞子形成）の低下、または死亡を引き起こす。適切な微生物の非限定的な例は、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．，Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｓｐｐ．，Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｓｐｐ．，Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａおよび関連したＳｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ．，Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ，Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ，Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ，Ｂ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓおよび他のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、または他の胞子形成性グラム陽性の細菌を含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるように、ポリヌクレオチドを含む植物ウイルスベクターを含む。ボトリティス・シネレアに感染した植物に対する、植物ウイルスベクターによる処理は、ボトリティス・シネレアの抑制された成長、死亡、または増殖／生殖能力（胞子形成）の低下を引き起こす。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるように、ポリヌクレオチドを含むバキュロウイルスベクターを含む。当該ベクターの摂取は、ボトリティス・シネレアの抑制された成長、死亡、または毒性もしくは病原性の低下、または増殖／生殖能力（胞子形成）の低下を引き起こす。一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ポリマーなどの合成のマトリックスにカプセル化されるか、または微粒子に付着され植物の表面に局所的に適用される。ボトリティス・シネレアに感染した植物に対する局所的な処理は、ボトリティス・シネレアの抑制された成長、死亡、または毒性もしくは病原性の低下、または増殖／生殖能力（胞子形成）の低下を引き起こす。一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドを発現する植物細胞（例えば、本発明のトランスジェニック植物細胞）の形態で提供される。ボトリティス・シネレア感染に対する植物細胞またはこの植物細胞の内容物は、植物上のボトリティス・シネレアの抑制、死亡、または毒性もしくは病原性の低下、または増殖／生殖能力（胞子形成）の低下を引き起こす。

【0078】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のポリヌクレオチドは、効率的な葉の被覆に必要な適切な粘着剤および湿潤剤、ならびにｄｓＲＮＡなどのポリヌクレオチドをＵＶ損傷から保護するためのＵＶ保護剤とともに提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のポリヌクレオチドは、担体剤、界面活性剤、有機シリコーン、有機シリコーン界面活性剤、非ポリヌクレオチド殺菌剤、ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド殺虫剤、毒性緩和剤、および病原体成長制御剤とともにさらに提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの殺虫剤または殺菌剤をさらに含む。

【0079】

そのような組成物は、任意の便利な方法によって、例えば、直接ボトリティス・シネレアにスプレーもしくは散布するか、またはボトリティス・シネレアによる感染の予防もしくは防除が望まれる植物（例えば、植物の葉、茎、および／または花を含める）もしくは環境にスプレーもしくは散布するか、または植物の表面にコーティングを塗布するか、または種子の植え付けに備えて種子にコーティングを塗布するか、またはボトリティス・シネレアによる感染の予防もしくは防除が望まれる植物の根の周りに土壌ドレンチを施用することによって適用される。

【0080】

本明細書に記載されるポリヌクレオチドの有効量は、（例えば、ボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性、増殖もしくは生殖の抑制や減少を引き起こすことによって）ボトリティス・シネレアの防除を提供するか、またはボトリティス・シネレアによる感染を予防するのに十分な量である。ポリヌクレオチドの有効量の決定は、通常のアッセイにより行われる。本明細書で提供される方法および組成物において有用であり得る殺菌性ポリヌクレオチドの濃度および用量に上限はないが、効率および経済性のために、より低い有効濃度および用量が一般的に求められる。有効量のポリヌクレオチドの非限定的な実施態様は、１本の植物にスプレーされる液体形態の、１ミリリットルあたり約１０ナノグラム～約１００マイクログラムの範囲のポリヌクレオチド、または植物の畑に適用される、１エーカーあたり約１０ミリグラム～約１００グラムのポリヌクレオチドを含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチドが植物に局所的に適用される場合、濃度は、植物の葉または花びら、茎、果実、葯、花粉、葉、根、もしくは種などの他の植物部位の表面に適用されるスプレーまたは処理の量を考慮して調節できる。一実施形態では、本明細書に記載される、２５－ｍｅｒのポリヌクレオチドを使用する草本植物のための有用な処理は、植物１本あたり約１ナノモル（ｎｍｏｌ）のポリヌクレオチド、例えば、植物１本あたり約０．０５～１ｎｍｏｌのポリヌクレオチドである。草本植物の他の実施形態は、植物１本あたり約０．０５～約１００ｎｍｏｌ、または約０．１～約２０ｎｍｏｌ、または約１ｎｍｏｌ～約１０ｎｍｏｌのポリヌクレオチドの有用な範囲を含む。特定の実施形態では、約４０～約５０ｎｍｏｌのｓｓＤＮＡポリヌクレオチドが適用される。特定の実施形態では、約０．５ｎｍｏｌ～約２ｎｍｏｌのｄｓＲＮＡが適用される。特定の実施形態では、１ミリリットルあたり約０．５～約２．０ミリグラム、または１ミリリットルあたり約０．１４ミリグラムのｄｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ（２１－ｍｅｒ）を含む組成物が適用される。特定の実施形態では、１ミリリットルあたり約０．５～約１．５ミリグラムの約５０個～約２００個以上のヌクレオチドの本発明のｄｓＲＮＡポリヌクレオチドの組成物が適用される。特定の実施形態では、約１ｎｍｏｌ～約５ｎｍｏｌの本発明のｄｓＲＮＡが植物に適用される。特定の実施形態では、植物に局所的に適用されるポリヌクレオチド組成物は、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドを、１ミリリットルあたり約０．０１～約１０ミリグラム、または１ミリリットルあたり約０．０５～約２ミリグラム、または１ミリリットルあたり約０．１～約２ミリグラムの濃度で含む。いくつかの実施形態では、１ヘクタールあたり約５ｇ～約１００ｇの濃度のポリヌクレオチド活性成分が適用される。非常に大きな植物、木、または蔓は、それに応じてより大量のポリヌクレオチドを必要とする場合がある。複数のオリゴヌクレオチド（例えば、本発明の単一の組換えＤＮＡ分子によってコードされる複数のトリガー）に加工されることができる本発明の長いｄｓＲＮＡ分子を使用する場合、より低い濃度を使用することができる。有効なポリヌクレオチド治療計画の非限定的な例は、１植物あたり約０．１～約１ｎｍｏｌのポリヌクレオチド分子、または１植物あたり約１ｎｍｏｌ～約１０ｎｍｏｌのポリヌクレオチド分子、または１植物あたり約１０ｎｍｏｌ～約１００ｎｍｏｌのポリヌクレオチド分子の治療を含む。

【0081】

いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、局所的に適用されたポリヌクレオチドが生物の細胞に入ることを可能にする剤である「導入剤」とともに提供される。そのような導入剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む組成物の一部分として組み込むか、またはポリヌクレオチドの適用前後もしくは適用と同時に適用することができる。いくつかの実施形態では、導入剤は、ボトリティス・シネレアによる本発明のポリヌクレオチドの取り込みを改善する剤である。いくつかの実施形態では、導入剤は、ポリヌクレオチドによる植物細胞への透過に対して、植物組織、例えば、種子、葉、茎、根、花、または果実の表面をコンディショニングする剤である。いくつかの実施形態では、導入剤は、ポリヌクレオチドが表皮ワックス障壁、気孔、および／または細胞壁もしくは膜障壁を通過して植物細胞に入る経路を可能にする。

【0082】

適切な導入剤は、生物の外部の透過性を増加させるか、またはポリヌクレオチドに対する生物の細胞の透過性を増加させる剤を含む。適切な導入剤は、化学剤、物理剤、またはそれらの組み合わせを含む。コンディショニングまたは移動のための化学薬品は、（ａ）界面活性剤、（ｂ）有機溶剤または水溶液または有機溶剤の水性混合物、（ｃ）酸化剤、（ｄ）酸、（ｅ）塩基、（ｆ）油、（ｇ）酵素、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドおよび導入剤の適用は、任意選択で、インキュベーションステップ、（例えば、酸、塩基もしくは酸化剤を中和するか、または酵素を不活性化する）中和ステップ、水洗ステップ、またはそれらの組み合わせを含む。適切な導入剤は、乳濁液、逆相乳濁液、リポソーム、もしくは他のミセル様組成物の形態であってよいか、またはポリヌクレオチドに乳濁液、逆相乳濁液、リポソームもしくは他のミセル様組成物の形態をとらせてよい。導入剤の実施形態は、核酸分子と結合することが知られているカウンターイオンまたは他の分子、例えば、無機アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、リチウムイオン、スペルミン、スペルミジンまたはプトレシンなどのポリアミン、および他の陽イオンを含む。導入剤の実施形態は、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ピリジン、Ｎ－ピロリジン、ヘキサメチルホスホルアミド、アセトニトリル、ジオキサン、ポリプロピレングリコールなどの有機溶剤、または水と混和可能な、もしくは非水系においてホスホヌクレオチドを溶解する他の溶剤（例えば合成反応で使用されるもの）を含む。導入剤の実施形態は、界面活性剤または乳化剤を含むかまたは含まない天然由来の油または合成油、例えば、植物由来の油、作物油（例えば、ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ．ａｄｊｕｖａｎｔｓ．ｃｏｍからオンラインで公的に利用可能な９ｔｈ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓにリストされるもの）、パラフィン油、ポリオール脂肪酸エステル、またはポリエチレンイミンまたはＮ－ピロリジンなどのアミドまたはポリアミンで改変された短鎖分子を有する油を含む。

【0083】

導入剤の実施形態は、有機シリコーン製剤を含む。例えば、適切な導入剤は、ＣＡＳ番号２７３０６－７８－１およびＥＰＡ番号：ＣＡＬ．ＲＥＧ．ＮＯ．５９０５－５００７３－ＡＡを有するＳＩＬＷＥＴ Ｌ－７７（登録商標）ブランドの界面活性剤として市販されており、現在Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ａｌｂａｎｙ，Ｎ．Ｙ．から入手可能である、有機シリコーン製剤である。ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ ２４０ブランドのポリエーテル改変ポリシロキサン（ＣＡＳＲＮ独自）界面活性剤、現在Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｅｗｅｌｌ，ＶＡから入手可能である。ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ ２７９のエンドキャップされたポリエーテルトリシロキサン界面活性剤、その成分が次の既存化学物質リストに列挙される。ＥＩＮＥＣＳ，ＴＳＣＡ，ＥＮＣＳ，ＡＩＣＳ，ＥＣＬ，ＰＩＣＣＳ ＣＨＩＮＡ，ＮＤＳＬ。ＩＮＤＵＣＥブランドのアジュバントＮＭＦＣアイテム４２６５２、クラス６０、現在Ｈｅｌｅｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｏｌｌｉｅｒｖｉｌｌｅ，ＴＮから入手可能である。ＣＡ ＲＥＧ Ｎｏ．３４７０４－５００６５を有する、ＦＲＡＮＣＨＩＳＥ（登録商標）ｗｉｔｈ ＬＥＣＩ－ＴＥＣＨ（登録商標）ブランドの界面活性剤、現在Ｌｏｖｅｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ｇｒｅｅｌｙ，ＣＯから入手可能である。一実施形態は、ポリヌクレオチドとＢＲＥＡＫ－ｔｈｒｕ ３０１とを含む組成物を含む。一実施形態は、ポリヌクレオチドと、約０．０１５～約２重量パーセント（ｗｔ％）（例えば、約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．５ｗｔ％）の範囲のＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７，Ｂｒｅａｋ－ｔｈｒｕ Ｓ２４０，Ｂｒｅａｋ－ｔｈｒｕ Ｓ２７９，ＩｎｄｕｃｅまたはＦｒａｎｃｈｉｓｅなどの有機シリコーン製剤を含む導入剤を含む組成物を含む。一実施形態は、本発明のポリヌクレオチドと、約０．３～約１重量パーセント（ｗｔ％）または約０．５～約１重量パーセント（ｗｔ％）の範囲のＳＩＬＷＥＴ Ｌ－７７（登録商標），ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ２４０，ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ２７９，ＩｎｄｕｃｅまたはＦｒａｎｃｈｉｓｅブランドの界面活性剤を含む導入剤とを含む組成物を含む。

【0084】

本発明で使用する導入剤として有用な有機シリコーン化合物は、（ａ）共有結合で連結されるトリシロキサン先端基、（ｂ）共有結合で連結されるｎ－プロピルリンカーを含むが、これに限定されないアルキルリンカー、（ｃ）共有結合で連結されるポリグリコール鎖、（ｄ）末端基、を含む化合物を含むが、これらに限定されない。そのような有機シリコーン化合物のトリシロキサン先端基は、ヘプタメチルトリシロキサンを含むが、これに限定されない。アルキルリンカーは、ｎ－プロピルリンカーを含み得るが、これに限定されない。ポリグリコール鎖は、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含むが、これらに限定されない。ポリグリコール鎖は、約「７．５」の平均鎖長「ｎ」を提供する混合物を含み得る。特定の実施形態では、平均鎖長「ｎ」は、約５から約１４まで変化し得る。末端基は、メチル基などのアルキル基を含み得るが、これらに限定されない。導入剤として有用な有機シリコーン化合物は、トリシロキサンエトキシレート界面活性剤またはポリアルキレンオキシド改変ヘプタメチルトリシロキサンを含むが、これらに限定されない。本発明で使用する導入剤の例は、化合物Ｉ

【化1】

（化合物Ｉ：ポリアルキレンオキシドヘプタメチルトリシロキサン、平均ｎ＝７．５）である。

【0085】

導入剤として有用な有機シリコーン化合物は、例えば、約０．０１５～約２重量パーセント（ｗｔ％）の範囲（例えば、約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．５ｗｔ％）の新たに作製された濃度で使用される。

【0086】

導入剤の実施形態は、ポリヌクレオチドを含む組成物において提供されるか、またはそれとともに使用される、塩化アンモニウム、臭化テトラブチルホスホニウム、および硫酸アンモニウムなどの１つ以上の塩を含む。いくつかの実施形態では、塩化アンモニウム、臭化テトラブチルホスホニウム、および／または硫酸アンモニウムは、約０．５％～約５％（ｗ／ｖ）、または約１％～約３％（ｗ／ｖ）、または約２％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物は、３００ミリモル以上の濃度のアンモニウム塩を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物は、約０．０１５～約２重量パーセント（ｗｔ％）の濃度のオルガノシリコーン導入剤、および約８０～約１２００ｍＭまたは約１５０ｍＭ～約６００ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムを含む。

【0087】

導入剤の実施形態は、リン酸塩を含む。ポリヌクレオチドを含む組成物において有用なリン酸塩は、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはナトリウムのリン酸塩を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物は、少なくとも約５ミリモル、少なくとも約１０ミリモル、または少なくとも約２０ミリモルの濃度でリン酸塩を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物は、約１ｍＭ～約２５ｍＭの範囲または約５ｍＭ～約２５ｍＭの範囲のリン酸塩を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物は、少なくとも約５ミリモル、少なくとも約１０ミリモル、または少なくとも約２０ミリモルの濃度でリン酸ナトリウムを含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物は、約５ミリモル、約１０ミリモル、または約２０ミリモルの濃度のリン酸ナトリウムを含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物は、約１ｍＭ～約２５ｍＭの範囲または約５ｍＭ～約２５ｍＭの範囲のリン酸ナトリウム塩を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物は、約１０ｍＭ～約１６０ｍＭの範囲または約２０ｍＭ～約４０ｍＭの範囲のリン酸ナトリウム塩を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物は、ｐＨ約６．８のリン酸ナトリウム緩衝液を含む。

【0088】

導入剤の実施形態は、界面活性剤および／またはそれに含まれる有効な分子を含む。界面活性剤および／またはそれに含まれる有効な分子は、脂肪酸のナトリウム塩またはリチウム塩（獣脂または獣脂アミンまたはリン脂質など）および有機シリコーン界面活性剤を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物は、核酸分子と結合することが知られているカウンターイオンまたは他の分子とともに製剤化される。非限定的な例は、テトラアルキルアンモニウムイオン、トリアルキルアンモニウムイオン、スルホニウムイオン、リチウムイオン、およびポリエチレンイミン、スペルミン、スペルミジンまたはプトレシンなどのポリアミンを含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含む組成物は、非ポリヌクレオチド除草剤、例えば、グリホサート、ジカンバ、クロランベン、およびＴＢＡを含むオーキシン様安息香酸除草剤、グルホシネート、フェノキシカルボン酸除草剤を含むオーキシン様除草剤、ピリジンカルボン酸除草剤、キノリンカルボン酸除草剤、ピリミジンカルボン酸除草剤、およびベナゾリンエチル除草剤、スルホニル尿素、イミダゾリノン類、ブロモキシニル、ダラポン、シクロヘザンジオン、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤、および４－ヒドロキシフェニル－ピルビン酸－ジオキシゲナーゼ阻害除草剤とともに製剤化される。

【0089】

ＩＸ．ボトリティス・シネレア感染を防除するための殺菌性組成物
本発明の別の態様は、殺菌的に有効な量の少なくとも１つのＲＮＡを含む、ボトリティス・シネレアを防除するための殺菌性組成物を提供する。そのようなＲＮＡは、セクションＩＩまたは本明細書の他の場所に記載されるＲＮＡのいずれかであってよい。一実施形態では、ＲＮＡは、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体またはそれから転写されたＲＮＡの対応した断片に対して約１００％の同一性、約７５％～約１００％の同一性、約８０％～約１００％の同一性、約８５％～約１００％の同一性、約９０％～約１００％の同一性、約９５％～約１００％の同一性、約９８％～約１００％の同一性、約１００％の同一性、または正確に１００％の同一性の１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、３０個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、１２５個以上、１５０個以上、２００個以上、２５０個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、６００個以上、７００個以上、８００個以上、９００個以上、または１，０００個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。一実施形態では、ＲＮＡは、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体またはそのような標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、または少なくとも１，０００個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号１３～６０からなる群より選択されるか、または配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列の少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも５５０個、少なくとも５７５個、または少なくとも６００個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるか、または約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、９５％～約１００％、約９８％～約１００％、約１００％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡトリガー配列もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体より選択されるか、または配列番号２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択される配列に対して本質的に相補的であるか、または少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約１００％、または正確に１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３～６０からなる群より選択されるか、または配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７、および４８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0091】

この文脈において、「防除」は、死亡の増加、成長の抑制、毒性および／もしくは病原性の低下、または増殖／生殖能力（胞子形成）の低下などのボトリティス・シネレアにおける生物学的変化の誘発を含むが、これらに限定されない。「殺菌的に有効な量」または「殺菌性」とは、死亡の増加、成長の抑制、毒性および／もしくは病原性の低下、および増殖／生殖能力の低下が挙げられるがこれらに限定されない、ボトリティス・シネレアにおける生物学的変化を誘発するのに有効な剤の量を意味する。いくつかの実施形態では、殺菌的に有効な量のＲＮＡの植物への適用は、ボトリティス・シネレア感染に対する植物の耐性を改善する。ＲＮＡは、それに含まれる１つ以上の断片よりも長い場合がある（すなわち、ＲＮＡは上記断片の追加のヌクレオチド３’および／または５’を含む場合がある）が、標的遺伝子の各断片と対応した断片は同等の長さである。この方法で使用するＲＮＡは、複数の標的遺伝子のために設計されることができる。実施形態は、殺菌性組成物が、標的遺伝子配列群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡもしくは標的遺伝子もしくはそれから転写されたＲＮＡの一部分に対して相補的である少なくとも１８個、１９個、２０個、もしくは２１個の連続したヌクレオチドを含む殺菌的に有効な量のポリヌクレオチド、またはＤＮＡもしくは標的遺伝子もしくはそれから転写されたＲＮＡの少なくとも２１個の連続したヌクレオチドに対して本質的に相補的であるかもしくは本質的に同一である少なくとも１つのサイレンシング要素を含む殺菌的に有効な量の少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、上記ＤＮＡもしくは標的遺伝子が標的遺伝子配列群より選択されるヌクレオチド配列を有する、殺菌的に有効な量の少なくとも１つのポリヌクレオチド、または配列番号１～１２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡもしくは標的遺伝子もしくは当該ＤＮＡもしくは標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個、１９個、２０個、もしくは２１個の連続したヌクレオチドに対して同一もしくは相補的である少なくとも１つの断片を含む、殺菌的に有効な量の少なくとも１つのＲＮＡ、またはボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかもしくはそれと接触する場合に、ボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、もしくは増殖／生殖能力（胞子形成）の低下を引き起こすＲＮＡ分子であって、上記ＲＮＡ分子が、配列番号１～１２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡもしくは標的遺伝子もしくは当該標的遺伝子から転写されたＲＮＡに対して相補的である少なくとも１８個、１９個、２０個、もしくは２１個の連続したヌクレオチドを含む、ＲＮＡ分子、またはボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるかもしくはそれと接触する場合に、ボトリティス・シネレアの死亡、成長の抑制、毒性もしくは病原性の低下、もしくは増殖／生殖能力（胞子形成）の低下を引き起こす殺菌性２本鎖ＲＮＡ分子であって、上記殺菌性２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、ＤＮＡもしくは標的遺伝子もしくはそれから転写されたＲＮＡの断片もしくは同等の長さに対して相補的である２１個の連続したヌクレオチドを含み、上記ＤＮＡもしくは標的遺伝子は、配列番号１～１２からなる群より選択される配列を有する、殺菌性２本鎖ＲＮＡ分子、またはＲＮＡトリガー配列群もしくはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択される配列を含む、殺菌的に有効な量の少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡ、を含むものを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、２本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、化学的もしくは酵素的に合成されるか、または微生物における発現もしくは植物細胞における発現によって生成される。実施形態は、トリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列群、ＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択されるか、または配列番号１４、１９、２１、２３、２４、２６、３１、３３、３５、３６、３８、４３、４５、４７もしくは４８からなる群より選択されるか、またはより具体的な実施形態では配列番号１９の配列の２１個以上の連続したヌクレオチドに対して同一である配列を含むｄｓＲＮＡまたはその相補体を含む殺菌性組成物を含む。

【0092】

様々な実施形態では、ボトリティス・シネレアを防除するための殺菌性組成物は、固体、（可溶性液体濃縮物などの均質混合物、および懸濁液、コロイド、ミセル、および乳濁液などの非均質混合物を含む）液体、粉末、懸濁液、乳濁液、エアロゾル、カプセル化もしくはマイクロカプセル化製剤からなる群より選択される少なくとも１つの形態、マイクロビーズもしくは他の担体粒子の中もしくは上、フィルムもしくはコーティングの中、またはマトリックスの上もしくは内、または葉、種子、根、もしくは茎の処理としてのものである。殺菌剤の製剤化および種子、茎、果実、もしくは葉の処理に関して当業者に知られているように、適切な結合剤、不活性担体、界面活性剤などは、ポリヌクレオチド含有組成物に任意に含むことができる。防除対象となるボトリティス・シネレアは、一般に植物に侵入する病原体である。いくつかの実施形態では、植物は、ブドウ、トマト、イチゴ、スナップインゲン、ナス、唐辛子、ピーマン、トマティーロ、グランドチェリー、ケープグーズベリー、タバコ、リンゴ、ナシ、マルメロ、モモ、プラム、チェリー、アーモンド、アプリコット、ブラックベリー、ブルーベリー、ラズベリー、カーネーション、ペチュニア、またはバラである。いくつかの実施形態では、殺菌性組成物は、植物に埋め込まれる粒子、ペレット、またはカプセルからなる群より選択される少なくとも１つの埋め込み型製剤である。そのような実施形態では、方法は、埋め込み型製剤を植物に埋め込むことを含む。一実施形態では、殺菌性組成物は、ボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるか、またはそうでなければそれによって内部的に吸収されることができる。いくつかの実施形態では、殺菌性組成物は、担体剤、界面活性剤、有機シリコーン、有機シリコーン界面活性剤、非ポリヌクレオチド殺菌剤、ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド殺虫剤、および毒性緩和剤、病原体成長制御剤からなる群より選択される１つ以上の成分をさらに含む。一実施形態では、殺菌性組成物は、ＳＩＬＷＥＴ（登録商標）ブランドの界面活性剤、例えば、ＣＡＳ番号２７３０６－７８－１およびＥＰＡ番号：ＣＡＬ．ＲＥＧ．ＮＯ．５９０５－５００７３－ＡＡを有し、現在Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ａｌｂａｎｙ，Ｎ．Ｙ．から入手可能であるＳＩＬＷＥＴ Ｌ－７７（登録商標）ブランドの界面活性剤などの非イオン性有機シリコーン界面活性剤をさらに含む。一実施形態は、ＢＲＥＡＫ－ｔｈｒｕ ３０１をさらに含む殺菌性組成物を含む。他の界面活性剤としては、例えば、現在Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｅｗｅｌｌ，ＶＡから入手可能であるＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ ２４０ブランドのポリエーテル改変ポリシロキサン（ＣＡＳＲＮ独自）界面活性剤、成分がＥＩＮＥＣＳ，ＴＳＣＡ，ＥＮＣＳ，ＡＩＣＳ，ＥＣＬ，ＰＩＣＣＳ ＣＨＩＮＡ，ＮＤＳＬの既存化学物質リストに列挙されるＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ ２７９のエンドキャップされたポリエーテルトリシロキサン界面活性剤、現在Ｈｅｌｅｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｏｌｌｉｅｒｖｉｌｌｅ，ＴＮから入手可能であるＩＮＤＵＣＥブランドのアジュバントＮＭＦＣアイテム４２６５２，クラス６０が挙げられる。ＣＡ ＲＥＧ Ｎｏ．３４７０４－５００６５を有する、ＦＲＡＮＣＨＩＳＥ（登録商標）ｗｉｔｈ ＬＥＣＩ－ＴＥＣＨ（登録商標）ブランドの界面活性剤は、現在Ｌｏｖｅｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ｇｒｅｅｌｙ，ＣＯから入手可能である。あるいは、植物は、殺菌性組成物の効力を改善する物質の別個の（先行の、後の、または同時の）適用とともに、殺菌性組成物で局所的に処理される。例えば、ＳＩＬＷＥＴ Ｌ－７７（登録商標）を例にとったＳＩＬＷＥＴ（登録商標）ブランドの界面活性剤、ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ２４、ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ２７９、ＩＮＤＵＣＥまたはＦＲＡＮＣＡＨＩＳＥブランドの界面活性剤などの非イオン性有機シリコーン界面活性剤を含む溶液の最初の局所的な適用によって植物にスプレーした後、殺菌性組成物の２度目の局所的な適用を行うことができ、またはその逆も同様である。

【0093】

この方法で使用する特定のＲＮＡ（例えば、実施例に記載されるｄｓＲＮＡトリガー）と１つ以上の非ポリヌクレオチド殺菌剤との組み合わせは、ＲＮＡ単独または非ポリヌクレオチド殺菌剤単独で得られる効果と比較して、ボトリティス・シネレア感染に対する予防または防除効果を高めることが予想される。

【0094】

様々な実施形態では、殺菌性組成物は微生物細胞を含むか、または微生物において生成される。例えば、殺菌性組成物は、細菌または酵母細胞を含むか、または細菌または酵母細胞において生成されることができる。同様の実施形態では、殺菌性組成物は、トランスジェニック植物細胞を含むか、または植物細胞（例えば、ポリヌクレオチドを一時的に発現する植物細胞）において生成される。そのような植物細胞は、植物における細胞、または組織培養物もしくは細胞懸濁液において増殖する細胞であり得る。

【0095】

一実施形態では、殺菌性組成物は、ボトリティス・シネレアによる感染を受けやすい任意の植物の形態で提供され、上記植物の内または上にＲＮＡを含む。そのような植物は、ＲＮＡを発現する安定したトランスジェニック植物、またはＲＮＡを一時的に発現するか、または例えばスプレーまたはコーティングすることによってＲＮＡで処理された非トランスジェニック植物であり得る。安定したトランスジェニック植物は、一般に、それらのゲノムに組み込まれたＲＮＡをコードする組換え構築物を含む。

【0096】

殺菌性組成物において有用なＲＮＡは、１本鎖（ｓｓ）または２本鎖（ｄｓ）であり得る。実施形態は、ＲＮＡがセンス１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、アンチセンス１本鎖（ｓｓＲＮＡ）、または２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）からなる群より選択される少なくとも１つであるものを含み、これらのタイプのうちの任意のタイプのＲＮＡの混合物は使用されることができる。一実施形態では、２本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが使用される。ＲＮＡは、標準的なリボヌクレオチド以外の成分を含むことができ、例えば、一実施形態は、末端デオキシリボヌクレオチドを含むＲＮＡである。

【0097】

殺菌性組成物におけるＲＮＡは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有する標的遺伝子またはＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する。一実施形態では、ＲＮＡは、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して本質的に同一または相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドは、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性の配列を有する。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドは、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性の全体配列を有する。

【0098】

殺菌性組成物におけるＲＮＡは、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１８個以上、例えば、１８個～２４個、または１８個～２８個、または２０個～３０個、または２０個～５０個、または２０個～１００個、または５０個～１００個、または５０個～５００個、または１００個～２５０個、または１００個～６００個、または２００個～１０００個、または５００個～２０００個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、断片は、１８個を超える連続したヌクレオチド、例えば、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、または３０個を超える個数、例えば、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２７０個、約２８０個、約２９０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約５７５個、約６００個、または６００個を超える連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡは、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのいずれかのＲＮＡ転写物または前述のもののいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡは、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのいずれかのＲＮＡ転写物または前述のもののいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む１つの鎖を有する２本鎖核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）である。塩基対として表現されるそのような２本鎖核酸は、遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのいずれかのＲＮＡ転写物または前述のもののいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体の同等の長さの断片に対応する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続した、完全に一致した塩基対の少なくとも１つの断片を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡに含まれる各断片は、天然に存在する制御性小分子ＲＮＡに典型的な長さよりも長く、例えば、各断片は、少なくとも約３０個の連続したヌクレオチド（または塩基対）の長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの全長、またはＲＮＡに含まれる各断片の長さは、対象となる配列（標的遺伝子配列群またはトリガー配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子）の全長より短い。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの全長は、約５０個～約６００個のヌクレオチド（１本鎖ＲＮＡの場合）または塩基対（２本鎖ＲＮＡの場合）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、長さが約５０個～約６００個のヌクレオチドの少なくとも１つのＲＮＡ鎖を含む。

【0099】

殺菌性組成物におけるＲＮＡは、一般に、１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計される。そのような標的遺伝子は、コード配列または非コード配列またはその両方を含み得る。特定の実施形態では、ＲＮＡは、Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８，ＣＤＣ４２，ＮＢＰ３５，ＳＤＨ，Ｂｃｒｒｐ１，ＸＭ＿０２４６９１７４６．１，Ｂｃｓｅｃ１５，Ｂｃｓｗｄ２，Ｂｃｍｃｍ４，Ｂｃｇｐｉ２，Ｂｃｒｐｂ５，Ｂｃｄｅｄ１からなる群より選択される１つ以上のボトリティス・シネレアの標的遺伝子を抑制するように設計され、これらの遺伝子の１つ以上の異なった領域を標的とするように設計されることができる。様々な実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の遺伝子を抑制するように設計され、各遺伝子は、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有し、この群からの複数の遺伝子を抑制するか、またはこれらの遺伝子の１つ以上の異なった領域を標的とするように設計されることができる。一実施形態では、ＲＮＡは、複数のセクションまたは断片を含み、上記複数のセクションまたは断片のそれぞれが、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのいずれかのＲＮＡ転写物または前述のもののいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。そのような場合、各セクションはサイズまたは配列において同一であっても異なっていてもよく、標的遺伝子に対してセンスであってもアンチセンスであってもよい。例えば、一実施形態では、ＲＮＡは、タンデムまたは反復配列において複数のセクションを含み、各セクションは、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのいずれかのＲＮＡ転写物または前述のもののいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。上記断片は、標的遺伝子の異なった領域に由来することができ、例えば、断片は、標的遺伝子の異なったエクソン領域に対応することができ、標的遺伝子に対応していない「スペーサー」ヌクレオチドは、任意選択で、断片の間にまたは断片に隣接して使用されることができる。

【0100】

殺菌性組成物におけるＲＮＡの全長は、１８個の連続したヌクレオチドを超えることができ、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する連続したヌクレオチドに加えてヌクレオチドを含むことができる。言い換えれば、ＲＮＡの全長は、１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計されるＲＮＡのセクションまたは断片の長さを超えることができ、各標的遺伝子は、標的遺伝子配列群からなる群より選択されるＤＮＡ配列またはその相補体を有する。例えば、ＲＮＡは、標的遺伝子を抑制する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片の「活性」断片に隣接するヌクレオチドを有するか、または活性断片の間に「スペーサー」ヌクレオチドを含むか、または５’末端にもしくは３’末端にもしくは５’末端と３’末端の両方に追加のヌクレオチドを有することができる。一実施形態では、ＲＮＡは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体に特に関連していない（相補的または同一ではない配列を有する）追加のヌクレオチド、例えば、安定化している二次構造を提供するか、またはクローニングや製造における利便性を提供するヌクレオチドを含む。一実施形態では、ＲＮＡは、標的遺伝子配列群もしくはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子または前述のもののいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性または相補性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの１つ以上の断片のすぐ隣に位置する追加のヌクレオチドを含む。一実施形態では、ＲＮＡは、１つのそのような断片を含み、その断片に隣接する追加の５’Ｇまたは追加の３’Ｃまたはその両方を有する。別の実施形態では、ＲＮＡは、オーバーハングを形成するために追加のヌクレオチドを含む２本鎖ＲＮＡ、例えば、３’オーバーハングを形成するために２つのデオキシリボヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡである。したがって、様々な実施形態では、ＲＮＡ全体のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子における連続したヌクレオチドの断片に対して１００％同一または相補的ではない。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも２つの断片を含み、（１）少なくとも２つの断片は、１つ以上のスペーサーヌクレオチドによって分離されている、または（２）少なくとも２つの断片は、対応した断片が標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体において存在する順序とは異なる順序で配置されている。

【0101】

様々な実施形態では、殺菌性組成物におけるＲＮＡは、天然に存在するリボヌクレオチドからなる。実施形態は、例えば、完全にリボヌクレオチドからなる合成ＲＮＡ、または主にリボヌクレオチドからなるが、１つ以上の末端デオキシリボヌクレオチドまたは１つ以上の末端デオキシリボヌクレオチドを有する合成ＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡは、イノシン、チウリジンまたはプソイドウリジンなどの非標準的ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡは化学的に改変されたヌクレオチドを含む。殺菌性組成物におけるＲＮＡは、当業者に知られている適切な手段によって提供される。実施形態は、ＲＮＡが（例えば、Ｔ７ポリメラーゼまたは他のポリメラーゼを使用する転写などのインビトロ転写によって）化学的または酵素的に合成されるか、または微生物または細胞培養物（例えば、培養物中で増殖する植物細胞または真菌細胞）における発現によって生成されるか、または微生物発酵によって生成されるものを含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、発現構築物の一部分ではない単離されたＲＮＡとして提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、プロモーター配列またはターミネーター配列などの追加の要素が欠けている単離されたＲＮＡとして提供される。そのようなＲＮＡは、比較的に短くてよく、例えば、約１８個～約３００個もしくは約５０個～約６００個のヌクレオチド（１本鎖ＲＮＡの場合）または約１８個～約３００個もしくは約５０個～約６００個の塩基対（２本鎖ＲＮＡの場合）の１本鎖または２本鎖ＲＮＡである。あるいは、ＲＮＡは、より複雑な構築物で、例えば組換え発現構築物の一部分として、または組換えベクター、例えば組換え植物ウイルスベクターもしくは組換えバキュロウイルスベクターに含まれて、提供されることができる。いくつかの実施形態では、そのような組換え発現構築物またはベクターは、アプタマーもしくはリボザイムをコードする追加のＲＮＡ、または対象となる遺伝子（例えば、殺菌性タンパク質）を発現するための発現カセットなどの追加の要素を含むように設計される。

【0103】

Ｘ．ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法、ならびにそのようにして提供される植物、植物部位、および種子
いくつかの実施形態は、標的遺伝子配列群において特定される遺伝子からなる群より選択される標的遺伝子または当該標的遺伝子から転写されたＲＮＡの断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを植物に提供することを含む、ボトリティス・シネレア感染／コロニー形成に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法に関する。これらの標的遺伝子の実施形態は、表１Ａにおける名前によって特定され、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有する遺伝子、および関連植物病原菌からのオルソログを含む関連遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、２本鎖ＲＮＡ）は、化学的もしくは酵素的に合成されるか、または微生物における発現／生成もしくは植物細胞における発現によって生成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列群より選択される配列を有する鎖を有するｄｓＲＮＡまたはその相補体である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリガー配列群より選択される配列を有する鎖を有するｄｓＲＮＡを含む。

【0104】

関連態様において、本発明は、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を対象とし、上記耐性は、標的遺伝子配列群において特定される遺伝子からなる群より選択される標的遺伝子の同等の長さの断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを植物内に発現させることによって提供され、それにより得られる植物は、ポリヌクレオチドの発現しない対照植物と比較して、ボトリティス・シネレア感染に対してより強い耐性を有する。関連態様では、本発明は、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を対象とし、上記耐性は、標的遺伝子配列群において特定される遺伝子からなる群より選択される標的遺伝子の断片に対して約９５％～約１００％の同一性または相補性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを植物内に発現させることによって提供され、それにより得られる植物は、ポリヌクレオチドが発現しない対照植物と比較して、ボトリティス・シネレア感染に対する改善された耐性を有する。

【0105】

さらに別の態様では、本発明は、この方法によって提供される、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物によって生成される種子または増殖可能な部位（特に、トランスジェニック子孫種子または増殖可能な部位）を対象とする。この方法によって提供される、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物によって生産される製品、およびそのような植物のトランスジェニック子孫種子または増殖可能な部位から生産される製品も企図される。

【0106】

本発明の別の態様は、ポリヌクレオチド含有組成物で処理された植物が、未処理の植物と比較してボトリティス・シネレア感染に対するより強い耐性を示すように、標的遺伝子配列群より選択される配列を有する標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物の植物への局所的な適用を含む、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法を提供する。一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して本質的に同一である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。ポリヌクレオチドは、それに含まれる１つ以上の断片よりも長い場合があるが、各断片と標的遺伝子の対応した断片は同等の長さである。一実施形態では、本発明は、配列番号１～１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する標的遺伝子または当該標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドに対して相補的であるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物の植物への局所的な適用を含む、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、有効量のポリヌクレオチドが植物の内または上のボトリティス・シネレアにトランスフェクトされるように、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物を植物に局所的に適用することを含む、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法を提供し、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１～１２のヌクレオチド配列を有する標的遺伝子または当該標的遺伝子から転写されたＲＮＡの領域に対して相補的である少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含む。

【0107】

この方法で使用するポリヌクレオチドは、複数の標的遺伝子のために設計されることができる。実施形態は、組成物がトリガー配列群からなる群より選択される配列を有する鎖を有するｄｓＲＮＡを含むものを含む。本発明の関連態様は、局所的な適用のための組成物、およびこの方法で使用する単離されたポリヌクレオチド、およびこの方法によって提供される強化されたボトリティス・シネレア耐性を有する植物を含む。

【0108】

本明細書全体で使用される「局所的な適用」とは、例えば葉、茎、花、果実、新芽、根、茎、種子、花、葯、もしくは花粉などの植物部位の表面への適用、または植物全体、または植物の地上部もしくは地下部への適用などの、植物の表面または外部などの対象の表面または外部への適用を意味する。局所的な適用は、土壌への適用、またはボトリティス・シネレアがポリヌクレオチドに遭遇できる表面もしくはマトリックスへの適用など、非生物表面上で行われることができる。この方法の様々な実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば固体、液体（可溶性液体濃縮物などの均質混合物、および例えば可溶性液体濃縮物などの不均質混合物を含む）、懸濁液、コロイド、ミセル、および乳濁液）、粉末、懸濁液、乳濁液、スプレー、カプセル化またはマイクロカプセル化製剤、マイクロビーズまたは他の担体粒子中または上、フィルムまたはコーティング中、またはマトリックス上またはマトリックス内、あるいはマトリックスとして葉、種子、根、茎の処理などの適切な形態で植物に局所的に適用される。この方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド含有組成物は、植物の地上部分に局所的に適用され、例えば、植物の葉、茎、および開花部分にスプレーまたは散布される。

【0109】

この方法の実施形態は、葉面スプレー（例えば、液体ポリヌクレオチド含有組成物を植物の葉にスプレーする）または葉面散布（例えば、植物に粉末の形態または担体粒子上の組成物を含むポリヌクレオチド含有組成物を散布する）の局所的な適用を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチド含有組成物は、例えば土壌ドレンチによって、根などの植物の地下部分に局所的に適用される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド含有組成物は、植物に成長する種子に局所的に適用される。局所的な適用は、植物の果実または植物の果実からの種子の局所的な処理の形態であり得る。殺菌剤の配合および種子または茎の処理の当業者に知られているように、適切な結合剤、不活性担体、界面活性剤などをポリヌクレオチド含有組成物に任意に含めることができる。

【0110】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド含有組成物は、植物に局所的に埋め込まれる微粒子、ペレット、またはカプセル化からなる群より選択される少なくとも１つの局所埋め込み型製剤である。そのような実施形態では、この方法は、局所埋め込み型製剤を植物に局所的に埋め込むことを含む。一実施形態では、ポリヌクレオチド含有組成物は、ボトリティス・シネレアによってトランスフェクトされ得るか、またはそうでなければ内部的に吸収され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド含有組成物は、担体剤および／または界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤）をさらに含む。非イオン性有機シリコーン界面活性剤の例は、ＳＩＬＷＥＴ（登録商標）ブランドの界面活性剤、ＢＲＥＡＫ ＴＨＲＵ Ｓ２４０、ＢＲＥＡＫ ＴＨＲＵ Ｓ２７９、ＢＲＥＡＫ ＴＨＲＵ ３０１、Ｉｎｄｕｃｅ および Ｆｒａｎｃｈｉｓｅ、例えば、ＳＩＬＷＥＴ Ｌ－７７（登録商標）ブランドの界面活性剤を含む。界面活性剤の最初の局所的な適用の後にポリヌクレオチド含有組成物の第２の局所的な適用が続いてもよく、またはその逆でもよい。いくつかの実施形態では、植物は、ポリヌクレオチド含有組成物による局所的な処理に加えて、その前後もしくは同時にポリヌクレオチド含有組成物の効能を強化する物質を適用することにより処理される。例えば、ＳＩＬＷＥＴ（登録商標）ブランドの界面活性剤ＢＲＥＡＫ ＴＨＲＵ Ｓ２４０、ＢＲＥＡＫ ＴＨＲＵ Ｓ２７９、ＢＲＥＡＫ ＴＨＲＵ ３０１、ＩｎｄｕｃｅおよびＦｒａｎｃｈｉｓｅ、例えばＳＩＬＷＥＴ Ｌ－７７（登録商標）などの非イオン性有機シリコーン界面活性剤を含有する溶液の最初の局所的な適用を植物にスプレーすることができる。その後、ポリヌクレオチド含有組成物の２回目の局所的な適用を行ってもよいし、あるいはその逆も可である。

【0111】

ポリヌクレオチド含有組成物において有用な特定のポリヌクレオチド（例えば、実施例に記載されるポリヌクレオチドトリガー）と１つ以上の非ポリヌクレオチド殺虫剤との組み合わせは、ポリヌクレオチド単独または非ポリヌクレオチド殺虫剤単独で得られる効果と比較してボトリティス・シネレア感染の予防または防除効果の改善をもたらすことが予想される。

【0112】

ポリヌクレオチド含有組成物において有用なポリヌクレオチドは、当業者に知られている適切な手段によって提供される。実施形態は、ポリヌクレオチドが化学的または酵素的に合成され（例えば、Ｔ７ポリメラーゼまたは他のポリメラーゼを使用する転写などのインビトロ転写によって）、微生物または細胞培養物（例えば、植物細胞、微生物細胞、または病原体細胞（培養物で増殖）、植物細胞での発現によって生成されるか、微生物発酵によって生成される。

【0113】

多くの実施形態では、ポリヌクレオチド含有組成物において有用なポリヌクレオチドは、単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ断片として提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド含有組成物において有用なポリヌクレオチドは、発現構築物の一部分ではなく、プロモーターまたはターミネーター配列などの追加の要素を欠いている。そのようなポリヌクレオチドは、約１８個～約５００個または約５０個～約６００個のヌクレオチド（１本鎖ポリヌクレオチドの場合）または約１８個～約５００個または約５０個～約６００個の塩基対（２本鎖ポリヌクレオチドの場合）の１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチドなどの、比較的に短いものであってよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、図および表１Ａに開示されるｄｓＲＮＡトリガーのいずれかの長さのｄｓＲＮＡなど、約１００個～約６００個の塩基対のｄｓＲＮＡである。あるいは、ポリヌクレオチドは、より複雑な構築物で提供され、例えば、組換え発現構築物の一部分として提供されるか、または組換えベクター、例えば組換え植物ウイルスベクターもしくは組換えバキュロウイルスベクターに含まれることができる。そのような組換え発現構築物またはベクターは、対象となる遺伝子（例えば、殺菌性タンパク質）を発現させるための発現カセットなどの追加要素を含むように設計されることができる。

【0114】

ポリヌクレオチド含有組成物において有用なポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡの同等の長さの断片に対して本質的に同一または相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドは、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡの断片に対して約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性の配列を有する。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドは、標的遺伝子からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して正確に（１００％）同一である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性の全体配列を有する。

【0115】

ポリヌクレオチド含有組成物において有用なポリヌクレオチドは、１８個以上（例えば１８個～２４個、または１８個～２８個、または２０個～３０個、または２０個～５０個、または２０個～１００個、または５０個～１００個、または５０個～５００個、または１００個～２５０個、または１００個～６００個、または２００個～１０００個、または５００個～２０００個以上）の連続したヌクレオチドの断片を含む。いくつかの実施形態では、断片は、１８個を超える個数、例えば、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、または３０個を超える個数、例えば、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２７０個、約２８０個、約２９０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約５７５個、約６００個、または６００個を超える個数の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％同一性の配列を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つの鎖が標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％同一性の配列を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む２本鎖核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）である。塩基対として表現されるそのような２本鎖核酸は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対応する少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個の連続した完全に一致した塩基対の少なくとも１つの断片を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドに含まれる各断片は、天然に存在する制御性小分子ＲＮＡに典型的な長さよりも長く、例えば、各断片は、少なくとも約３０個の連続したヌクレオチド（または塩基対）の長さである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの全長、またはポリヌクレオチドに含まれる各断片の長さは、対象となる配列（標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体）の全長より短い。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの全長は、約５０個～約６００個のヌクレオチド（１本鎖ポリヌクレオチドの場合）または塩基対（２本鎖ポリヌクレオチドの場合）である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表１Ａに開示されるｄｓＲＮＡトリガーのいずれかの長さのｄｓＲＮＡなどの、約１００個～約６００個の塩基対のｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、１９、２１、２３、および２４からなる群より選択される配列によってコードされるｄｓＲＮＡである。

【0116】

局所的に適用されるポリヌクレオチドは、一般に、ＲＮＡｉを介して１つ以上の遺伝子（「標的遺伝子」）を抑制するように設計される。そのような標的遺伝子は、コード配列または非コード配列またはその両方を含み得る。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計され、各標的遺伝子は、標的遺伝子配列群からなる群より選択されるＤＮＡ配列を有する。様々な実施形態では、局所的に適用されるポリヌクレオチドは、１つ以上の遺伝子を抑制するように設計され、各遺伝子は、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有し、この群からの複数の遺伝子を抑制するか、またはこれらの遺伝子の１つ以上の異なった領域を標的とするように設計されることができる。一実施形態では、局所的に適用されるポリヌクレオチドは、それぞれが標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む複数のセクションまたは断片を含む。そのような場合、各セクションはサイズまたは配列において同一であっても異なっていてもよく、標的遺伝子に対してセンスであってもアンチセンスであってもよい。例えば、一実施形態では、局所的に適用されるポリヌクレオチドは、タンデムまたは反復配列において複数のセクションを含むことができ、各セクションは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡの同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。

【0117】

局所的に適用されるポリヌクレオチドの全長は、１８個の連続したヌクレオチドを超えることができ、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する連続したヌクレオチドに加えてヌクレオチドを含むことができる。言い換えれば、局所的に適用されるポリヌクレオチドの全長は、１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計されるポリヌクレオチドのセクションまたは断片の長さよりも長くてもよく、各標的遺伝子は、標的遺伝子配列群からなる群より選択されるＤＮＡ配列を有する。例えば、局所的に適用されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子を抑制する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片の「活性」断片に隣接するヌクレオチドを有することができるか、または活性断片間に「スペーサー」ヌクレオチドを含むことができるか、または５’末端にもしくは３’末端にもしくは５’末端と３’末端の両方に追加のヌクレオチドを有することができる。一実施形態では、局所的に適用されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体に特に関連していない（相補的または同一ではない配列を有する）追加のヌクレオチド（例えば、二次構造を安定化するため、またはクローニングや製造の利便性のために提供されるヌクレオチド）を含む。

【0118】

一実施形態では、局所的に適用されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性または相補性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの１つ以上の断片のすぐ隣に位置する追加のヌクレオチドを含む。一実施形態では、局所的に適用されるポリヌクレオチドは、その断片に隣接して追加の５’Ｇまたは追加の３’Ｃまたはその両方を有する１つのそのような断片を含む。別の実施形態では、局所的に適用されるポリヌクレオチドは、オーバーハングを形成する追加のヌクレオチドを含む２本鎖ＲＮＡ、例えば、３’オーバーハングを形成する２つのデオキシリボヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡである。したがって、様々な実施形態では、局所的に適用されたポリヌクレオチド全体のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子における連続したヌクレオチドの断片に対して１００％同一または相補的ではない。例えば、いくつかの実施形態では、局所的に適用されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはＤＮＡ相補体の断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも２つの断片を含み、ここで（１）少なくとも２つの断片は、１つ以上のスペーサーヌクレオチドによって分離されている、または（２）少なくとも２つの断片は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体において対応した断片が存在する順序とは異なる順序で配置されている。

【0119】

関連態様では、本発明は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡの同等の長さの断片またはそのＤＮＡ相補体に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物を、植物に局所的に適用することを含む方法によって提供されるボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を対象とし、上記方法によってポリヌクレオチド組成物で処理された植物は、未処理の植物と比較して、ボトリティス・シネレア感染に対するより強い耐性を示す。

【0120】

一実施形態は、トリガー配列群より選択される配列を有するｄｓＲＮＡトリガーまたはその相補体または配列番号１３～２４、４９～５２の配列によってコードされるｄｓＲＮＡトリガーを、植物または植物に成長する種子に局所的に適用することによって提供される、対照植物と比較してボトリティス・シネレア感染に対してより強い耐性を有する植物である。さらに別の態様では、本発明は、この方法によって提供される、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物によって生成される種子（特にトランスジェニック子孫種子）を対象とする。この方法によって提供される、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物によって生産される製品、およびそのような植物のトランスジェニック子孫種子または茎／苗条から生産される製品も企図される。

【0121】

ＸＩ．ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有するトランスジェニック植物を提供する方法、およびそのようにして提供される植物および種子
本発明の別の態様は、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有する標的遺伝子またはＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体（またはその両方）の断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを、植物において発現させることを含む、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法を対象とし、このような方法によって得られる植物は、ポリヌクレオチドが発現しない対照植物と比較して、ボトリティス・シネレア感染に対してより強い耐性を有する。一実施形態では、この方法は、標的遺伝子配列群もしくはトリガー配列群より選択される配列を有する標的遺伝子またはＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを植物において発現することを含む。一実施形態では、本発明は、配列番号１～１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡの少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドに対して同一であるかまたは相補的である少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを、植物において発現することを含む、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供する方法を提供する。「植物においてポリヌクレオチドを発現する」とは、一般に、「植物においてＲＮＡ転写物を発現する」こと、例えば、標的遺伝子配列群より選択される配列を有する標的遺伝子またはＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の少なくとも１つの断片に対してアンチセンスであるかまたは本質的に相補的であるリボヌクレオチド配列を含むＲＮＡを、植物において発現することを意味する。実施形態は、植物において発現されるポリヌクレオチドが、トリガー配列群より選択される配列を有する少なくとも１つの断片を含むＲＮＡまたはその相補体であるものを含む。しかし、植物において発現されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（例えば、ゲノム複製中に植物において生成されるＤＮＡ）、またはそのようなＤＮＡによってコードされるＲＮＡであってもよい。本発明の関連した態様は、この方法で使用する単離されたポリヌクレオチド、およびこの方法によって提供される改善されたボトリティス・シネレア耐性を有する植物を含む。

【0122】

この方法は、植物において少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させることを含み、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列より選択される配列を有する標的遺伝子またはＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態で（例えば、単離されたＤＮＡ分子の形態で、または発現構築物として、または形質転換ベクターとして）植物に提供され、植物において発現されるポリヌクレオチドは、植物における第２のポリヌクレオチド（例えば、第１のポリヌクレオチドのＲＮＡ転写物）である。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、トランスジェニック発現によって、すなわち、ポリヌクレオチドを、植物の１つまたは複数の細胞において発現できる場所から植物のゲノムに安定に組み込むことによって、植物において発現される。一実施形態では、第１のポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子配列群より選択される標的遺伝子またはＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むＤＮＡに操作可能な形で連結されたプロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物）は、二次的に生成されるポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子配列群より選択される標的遺伝子またはＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの断片の転写物を含むＲＮＡ転写物）が植物の１つまたは複数の細胞において発現される場所から、植物のゲノムに安定に組み込まれる。安定に形質転換された植物を提供する方法については、「トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物の生成と利用」のセクションで論じる。

【0123】

別の実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、一時的な発現（すなわち、配列の植物ゲノムへの安定的な組み込みに起因しない発現）によって発現される。そのような実施形態では、方法は、当技術分野で知られている通常の技術によって植物にポリヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡ）を導入するステップを含むことができる。例えば、一時的な発現は、無針注射器を使用して植物の葉または茎にポリヌクレオチド溶液を浸透させることによって達成され得る。

【0124】

植物において発現されるポリヌクレオチドが一時的な発現によって発現されるいくつかの実施態様では、第１のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡの両方の形態で植物に提供され、かつ二次的に生成された第２のポリヌクレオチドは、植物において一時的に発現される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、（ａ）１本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓＲＮＡ）、（ｂ）自己ハイブリッド化して２本鎖ＲＮＡ分子を形成する１本鎖ＲＮＡ分子、（ｃ）２本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）、（ｄ）１本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡ）、ユーロ自己ハイブリッド化して２本鎖ＤＮＡ分子を形成する１本鎖ＤＮＡ分子、（ｆ）ＲＮＡ分子に転写される改変Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子を含む１本鎖ＤＮＡ分子、（ｇ）２本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）、（ｈ）ＲＮＡ分子に転写される改変Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子を含む２本鎖ＤＮＡ分子、および（ｉ）２本鎖の、ハイブリッド化したＲＮＡ／ＤＮＡ分子、またはそれらの組み合わせより選択される１つ以上である。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、適切な形態での、例えば、固体、液体（可溶性液体濃縮物などの均質混合物、および懸濁液、コロイド、ミセル、および乳濁液などの非均質混合物）、粉末、懸濁液、乳濁液、スプレー、カプセル化またはマイクロカプセル化製剤としての、マイクロビーズもしくは他の担体粒子の中もしくは上の、フィルムもしくはコーティングの中の、またはマトリックスの上もしくは中における、または植物の葉、種子、根、もしくは茎の処理の形態でのポリヌクレオチド含有組成物の植物への局所的な適用によって、植物に導入される。殺虫剤の製剤化および種子処理の当業者に知られているように、適切な結合剤、不活性担体、界面活性剤などは、任意に組成物に含まれることができる。そのような実施形態では、ポリヌクレオチド含有組成物は、担体剤、界面活性剤、有機シリコーン、有機シリコーン界面活性剤、非ポリヌクレオチド殺菌剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド殺虫剤、毒性緩和剤、および病原体成長制御剤。一実施形態では、組成物は、ＣＡＳ番号２７３０６－７８－１およびＥＰＡ番号：ＣＡＬ．ＲＥＧ．ＮＯ．５９０５－５００７３－ＡＡを有する、現在Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ａｌｂａｎｙ，Ｎ．Ｙ．から入手可能なＳＩＬＷＥＴ Ｌ－７７（登録商標）ブランドの界面活性剤を例にとったＳＩＬＷＥＴ（登録商標）ブランドの界面活性剤などの非イオン性有機シリコーン界面活性剤をさらに含むことができる。ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ ２４０ブランドは、現在Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｅｗｅｌｌ，ＶＡから入手可能なポリエーテル改変ポリシロキサン（ＣＡＳＲＮ独自）界面活性剤である。ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ ２７９はエンドキャップされたポリエーテルトリシロキサン界面活性剤であり、その成分は次の既存化学物質リストに列挙される：ＥＩＮＥＣＳ、ＴＳＣＡ、ＥＮＣＳ、ＡＩＣＳ、ＥＣＬ、ＰＩＣＣＳ ＣＨＩＮＡ、ＮＤＳＬ。ＩＮＤＵＣＥブランドのアジュバントＮＭＦＣアイテム４２６５２、クラス６０、現在Ｈｅｌｅｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｏｌｌｉｅｒｖｉｌｌｅ，ＴＮから入手可能である。ＣＡ ＲＥＧ Ｎｏ．３４７０４－５００６５を有する、ＦＲＡＮＣＨＩＳＥ（登録商標） ｗｉｔｈ ＬＥＣＩ－ＴＥＣＨ（登録商標）ブランドの界面活性剤、現在Ｌｏｖｅｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ｇｒｅｅｌｙ，ＣＯから入手可能である。あるいは、そのような追加の成分または殺虫剤は、例えば、別個の局所的な適用によって、または植物におけるトランスジェニック発現によって、別個に提供され得る。あるいは、植物は、ポリヌクレオチド含有組成物による処理に加えて、その前後もしくは同時にポリヌクレオチド含有組成物の効能を強化する別の物質で局所的に処理することもできる。例えば、ＳＩＬＷＥＴ Ｌ－７７（登録商標）を例にとったＳＩＬＷＥＴ（登録商標）ブランドの界面活性剤、ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ２４、ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ２７９、ＩＮＤＵＣＥまたはＦＲＡＮＣＡＨＩＳＥブランドの界面活性剤などの非イオン性有機シリコーン界面活性剤を含有する溶液の最初の局所的な適用を植物にスプレーした後、ポリヌクレオチド含有組成物に対して２回目の局所的な適用をすることができ、またはその逆も可である。一実施形態は、ＢＲＥＡＫ－ｔｈｒｕ ３０１をさらに含む組成物を含む。

【0125】

ポリヌクレオチド単独または非ポリヌクレオチド殺菌剤単独で得られる効果と比較して、この方法で使用する特定のポリヌクレオチド（例えば、実施例に記載されるポリヌクレオチドトリガー）と１つ以上の非ポリヌクレオチド殺菌剤との組み合わせは、ボトリティス・シネレア感染に対する予防または防除効果の改善をもたらすことが予想される。

【0126】

植物において発現されるポリヌクレオチドが一時的な発現によって発現されるいくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方の形態で植物に提供され、かつ二次的に生成される第２のポリヌクレオチドは植物において一時的に発現される。第１のポリヌクレオチドの適用の部位は、第２のポリヌクレオチドが一時的に発現される部位と同じである必要はない。例えば、第１のポリヌクレオチドは、葉への局所的な適用、種子処理、根のドレンチによって、または茎への注入によって植物に提供されることができ、第２のポリヌクレオチドは、植物の他の場所、例えば、根においてまたは植物にわたって一時的に発現されることができる。この方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物を、植物の地上部分に局所的に適用される（例えば、植物の葉、茎、および開花部分にスプレーまたは散布される）。他の実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば土壌ドレンチによって、根などの植物の地下部分に局所的に適用される。他の実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物は、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物に成長する種子に局所的に適用される。いくつかの実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、１本鎖（ｓｓ）ＲＮＡまたは２本鎖（ｄｓ）ＲＮＡまたはその両方の組み合わせであり得るＲＮＡである。

【0127】

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその両方）が植物に提供され、第１のポリヌクレオチドに対応する（同一または相補的な）配列を有する第２のポリヌクレオチドがその後、植物において発現される。そのような実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡまたはその両方の組み合わせであり得るＲＮＡ転写物である。ポリヌクレオチドが一時的な発現によって発現されるいくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方の形態で植物に提供され、二次的に生成される第２のポリヌクレオチドは植物において一時的に発現される。そのような実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、（ａ）１本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓＲＮＡ）、（ｂ）自己ハイブリッド化して２本鎖ＲＮＡ分子を形成する１本鎖ＲＮＡ分子、（ｃ）２本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）、（ｄ）１本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡ）、（ｅ）自己ハイブリッド化して２本鎖ＤＮＡ分子を形成する１本鎖ＤＮＡ分子、（ｆ）ＲＮＡ分子に転写される改変Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子を含む１本鎖ＤＮＡ分子、（ｇ）２本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）、（ｈ）ＲＮＡ分子に転写される改変Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子を含む２本鎖ＤＮＡ分子、および（ｉ）２本鎖の、ハイブリッド化したＲＮＡ／ＤＮＡ分子、またはそれらの組み合わせより選択される１つ以上である。ポリヌクレオチドが一時的な発現によって発現されるそのような実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡ内において存在するものなどの天然に存在するヌクレオチドから構成され得る。ポリヌクレオチドが一時的な発現によって発現されるそのような実施形態では、第１のポリヌクレオチドは化学的に改変され得るか、または化学的に改変されたヌクレオチドを含む。第１のポリヌクレオチドは、当業者に知られている適切な手段によって提供される。第１のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ断片として提供され得る。あるいは、第１のポリヌクレオチドは、より複雑な構築物で提供され、例えば組換え発現構築物の一部分として提供され、または組換えベクターに、例えば組換え植物ウイルスベクターにまたは組換えバキュロウイルスベクターに含まれて提供されることができる。そのような組換え発現構築物またはベクターは、対象となる遺伝子（例えば、殺菌性タンパク質）を発現させるための発現カセットなどの追加要素を含むように設計されることができる。

【0128】

いくつかの実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドはＲＮＡ分子であり、約１８個～約３００個もしくは約５０個～約６００個のヌクレオチド（１本鎖ＲＮＡの場合）、または約１８個～約３００個もしくは約５０個～約６００個の塩基対（２本鎖ＲＮＡの場合）の１本鎖または２本鎖ＲＮＡのように、比較的に短くてよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、より複雑な構築物で提供され、例えば、組換え発現構築物の一部分として提供されるか、または組換えベクター、例えば組換え植物ウイルスベクターもしくは組換えバキュロウイルスベクターに含まれることができる。いくつかの実施形態では、そのような組換え発現構築物またはベクターは、対象となる遺伝子（例えば、殺菌性タンパク質）を発現するための発現カセットなどの追加の要素を含むように設計される。

【0129】

植物において発現されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群、トリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する。一実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドは、標的遺伝子配列群、トリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性の配列を有する。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドは、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して正確に（１００％）同一である。いくつかの実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群、トリガー配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性の全体配列を有する。

【0130】

植物において発現されるポリヌクレオチドは、一般に１つ以上の遺伝子（「標的遺伝子」）を抑制するように設計される。そのような標的遺伝子は、コード配列または非コード配列またはその両方を含み得る。特定の実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計され、各標的遺伝子は、標的遺伝子配列群からなる群より選択されるＤＮＡ配列を有する。様々な実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、１つ以上の遺伝子を抑制するように設計され、各遺伝子は、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有し、この群からの複数の遺伝子を抑制するか、またはこれらの遺伝子の１つ以上の異なる領域を標的とするように設計されることができる。一実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、複数のセクションまたは断片を含み、上記セクションまたは断片のそれぞれが、標的遺伝子配列群、トリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。そのような場合、各セクションはサイズまたは配列において同一であっても異なっていてもよく、標的遺伝子に対してセンスであってもアンチセンスであってもよい。例えば、一実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、タンデムまたは反復配列において複数のセクションを含むことができ、各セクションは、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。断片は、標的遺伝子の異なる領域に由来することができ、例えば、断片は、標的遺伝子の異なるエクソン領域に対応することができ、標的遺伝子に対応していない「スペーサー」ヌクレオチドを、必要に応じて、断片の間にまたは断片に隣接して使用されることができる。

【0131】

植物において発現されるポリヌクレオチドの全長は、１８個の連続したヌクレオチドを超えることができ、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～１００％の同一性の配列を有する連続したヌクレオチドに加えて、ヌクレオチドを含むことができる。言い換えれば、植物において発現されるポリヌクレオチドの全長は、１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計されるポリヌクレオチドのセクションまたは断片の長さを超えることができ、各断片は標的遺伝子配列群からなる群より選択されるＤＮＡ配列を有する。例えば、植物において発現されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子を抑制する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片の「活性」断片に隣接するヌクレオチドを有するか、または活性断片間に「スペーサー」ヌクレオチドを含むか、または５’末端にまたは３’末端にまたは５’末端と３’末端の両方に追加のヌクレオチドを有することができる。一実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補配列に特に関連していない（すなわち、相補的または同一ではない配列を有する）追加のヌクレオチド（例えば、安定している二次構造を提供するヌクレオチド、またはクローニングまたは製造の利便性のためのヌクレオチド）を含む。一実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性または相補性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの１つ以上の断片のすぐ隣に位置する追加のヌクレオチドを含む。一実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、そのような断片を１つ含み、その断片に隣接して、追加の５’Ｇまたは追加の３’Ｃまたはその両方を有する。別の実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、オーバーハングを形成する追加のヌクレオチドを含む２本鎖ＲＮＡ、例えば、３’オーバーハングを形成する２つのデオキシリボヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡである。したがって、様々な実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチド全体のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子における連続したヌクレオチドの断片に対して１００％同一または相補的ではない。例えば、いくつかの実施形態では、植物において発現されるポリヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも２つの断片を含み、ここで（１）少なくとも２つの断片は、１つ以上のスペーサーヌクレオチドによって分離されている、または（２）少なくとも２つの断片は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体において対応した断片が存在する順序とは異なる順序で配置されている。

【0132】

関連態様において、本発明は、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して本質的に同一であるかまたは相補的である１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを、植物において発現させることによって提供される、ボトリティス・シネレア感染に対する強化された耐性を有する植物を対象とし、それによって得られる植物は、ポリヌクレオチドが発現しない対照植物と比較して、ボトリティス・シネレア感染に対してより強い耐性を有する。関連態様において、本発明は、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを植物において発現させることによって提供される、ボトリティス・シネレア感染に対する強化された耐性を有する植物を対象とし、それによって得られる植物は、ポリヌクレオチドが発現しない対照植物と比較して、ボトリティス・シネレア感染に対してより強い耐性を有する。一実施形態は、トリガー配列群より選択される配列を有するＲＮＡまたはその相補体を植物において発現させることによって提供される、対照植物と比較してボトリティス・シネレア感染に対してより強い耐性を有する植物である。さらに別の態様では、本発明は、この方法によって提供される、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物によって生成される種子または茎の挿し木（特に、トランスジェニック子孫の種子またはクローン化された茎）を対象とする。この方法によって提供される、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物によって生産される製品、およびそのような植物のトランスジェニック子孫種子から生産される製品も企図される。

【0133】

ＸＩＩ．ボトリティス・シネレア感染を防除するための組換えＤＮＡ構築物
本発明の別の態様は、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むＤＮＡ要素に操作可能な形で連結された異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は：（ａ）配列番号１～１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそれから転写されたＲＮＡの同等の長さの断片の少なくとも１８個、１９個、２０個または２１個の連続したヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、または（ｂ）配列番号１～１２からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性を有する１８個、１９個、２０個、または２１個以上の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ、または（ｃ）配列番号１～１２からなる群より選択される配列を有する標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも１つのサイレンシング要素をコードするＤＮＡ、または（ｄ）標的遺伝子配列群における遺伝子より選択される標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡの一部分に相補的な少なくとも１８個、１９個、２０個または２１個の連続したヌクレオチドを含む少なくとも１つのサイレンシング要素をコードするＤＮＡ、またはユーロ（ｅ）トリガー配列群より選択されるヌクレオチド配列、またはボトリティス・シネレアに由来するオーソロガスヌクレオチド配列に相補的な少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドを含むＲＮＡをコードするＤＮＡであって、上記オーソロガスヌクレオチド配列は、トリガー配列群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、上記配列同一性パーセントは同じ長さにわたって計算される、ＤＮＡ、または（ｆ）その少なくとも１つの鎖がトリガー配列群より選択されるヌクレオチド配列またはその相補体またはボトリティス・シネレアに由来するオーソロガスヌクレオチド配列に相補的な少なくとも１８個、１９個、２０個または２１個の連続したヌクレオチドを含む少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡをコードするＤＮＡであって、上記オーソロガスヌクレオチド配列は、トリガー配列群からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、上記配列同一性パーセントは同じ長さにわたって計算される、ＤＮＡ、または（ｇ）ＲＮＡトリガー配列群またはＲＮＡトリガー配列逆相補体群より選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ、に操作可能な形で連結された異種プロモーターを含む。実施形態は、配列番号２５～４８、５３～６０からなる群より選択される配列またはその組み合わせまたはその相補体を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ要素に操作可能な形で連結された異種プロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物を含む。

【0134】

実施形態は、トリガー配列群からなる群より選択される配列を有する鎖を有するｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡに操作可能な形で連結された異種または同種の植物由来のプロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物を含む。組換えＤＮＡ構築物は、例えば、そのような組換えＤＮＡ構築物の転写物を植物において発現させることによって、ボトリティス・シネレア感染に対して強化された耐性を有する植物を提供するのに有用である。組換えＤＮＡ構築物は、ボトリティス・シネレア感染からの保護が必要な植物、種子、増殖可能な植物部位、土壌もしくは畑、または表面に適用できる組成物の作製に有用なポリヌクレオチドの製造にも有用である。本発明の関連態様は、組換えＤＮＡ構築物を含む組成物、組換えＤＮＡ構築物を含む植物染色体または色素体または組換え植物ウイルスベクターまたは組換えバキュロウイルスベクター、ゲノムにおいて組換えＤＮＡ構築物を有するトランスジェニック植物細胞、およびそのようなトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の果実、種子もしくは増殖可能な部分、および組換えＤＮＡ構築物もしくはその中にコードされるＲＮＡの発現または処理によって提供されるボトリティス・シネレアおよび害虫に対する強化された耐性を有する植物を含む。

【0135】

組換えＤＮＡ構築物は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むＤＮＡに操作可能な形で連結された異種プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、１８個以上の連続したヌクレオチドの断片は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して正確に（１００％）同一である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体に対して約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性の全体配列を有する。

【0136】

したがって、組換えＤＮＡ構築物は、標的遺伝子配列群またはそのＤＮＡ相補体より選択される配列を有する標的遺伝子の発現を抑制するように設計される１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むＤＮＡに操作可能な形で連結された異種プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子は、Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８，ＣＤＣ４２，ＮＢＰ３５，ＳＤＨ，Ｂｃｒｒｐ１，ＸＭ＿０２４６９１７４６．１，Ｂｃｓｅｃ１５，Ｂｃｓｗｄ２，Ｂｃｍｃｍ４，Ｂｃｇｐｉ２，Ｂｃｒｐｂ５およびＢｃｄｅｄ１からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、１８個以上、例えば、１８個～２４個、または１８個～２８個、または２０個～３０個、または２０個～５０個、または２０個～１００個、または５０個～１００個、または５０個～５００個、または１００個～２５０個、または１００個～６００個、または２００個～１０００個、または５００個～２０００個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。いくつかの実施形態では、断片は、１８個を超える連続したヌクレオチド、例えば、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、または３０個を超える個数、例えば、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２７０個、約２８０個、約２９０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約５７５個、約６００個、または６００個を超える連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＤＮＡは、標的遺伝子配列群またはそのＤＮＡ相補体より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むＲＮＡをコードする。特定の実施形態では、ＤＮＡは、１つの鎖が標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む２本鎖核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）をコードする、塩基対として表現されるそのような２本鎖核酸は、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対応する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続した完全に一致した塩基対の少なくとも１つの断片を含む。特定の実施形態では、ＤＮＡに含まれる各断片は、天然に存在する制御性小分子ＲＮＡに典型的な長さよりも長い。いくつかの実施形態では、各断片は、長さが少なくとも約３０個の連続したヌクレオチド（または塩基対）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの全長、またはポリヌクレオチドに含まれる各断片の長さは、対象となる配列（標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子）の全長より短い。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの全長は約５０個～約６００個である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、配列番号１３～２４、４９～５２からなる群より選択される配列またはそれらの組み合わせまたはそれらの相補体を有するＲＮＡをコードする。

【0137】

組換えＤＮＡ構築物は、一般に１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計されるＲＮＡをコードするＤＮＡに操作可能な形で連結された異種プロモーターを含む。そのような標的遺伝子は、コード配列または非コード配列またはその両方を含み得る。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、Ｓｅｃ１８／Ｃｄｃ４８，ＣＤＣ４２，ＮＢＰ３５，ＳＤＨ，Ｂｃｒｒｐ１，ＸＭ＿０２４６９１７４６．１，Ｂｃｓｅｃ１５，Ｂｃｓｗｄ２，Ｂｃｍｃｍ４，Ｂｃｇｐｉ２，Ｂｃｒｐｂ５，およびＢｃｄｅｄ１からなる群より選択されるボトリティス・シネレアの１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計される。様々な実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、１つ以上の遺伝子を抑制するように設計され、各遺伝子は、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有し、この群からの複数の遺伝子を抑制するか、またはこれらの遺伝子の１つ以上の異なる領域を標的とするように設計されることができる。一実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、それぞれが標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む複数のセクションまたは断片に操作可能な形で連結された異種プロモーターを含む。そのような場合、各セクションはサイズまたは配列において同一であっても異なっていてもよく、標的遺伝子に対してセンスであってもアンチセンスであってもよい。例えば、一実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、タンデムまたは反復配列において複数のセクションに操作可能な形で連結された異種プロモーターを含むことができ、各セクションは標的遺伝子配列より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。断片は、標的遺伝子の異なる領域に由来することができ、例えば、断片は、標的遺伝子の異なるエクソン領域に対応することができ、標的遺伝子に対応していない「スペーサー」ヌクレオチドを、必要に応じて、断片の間にまたは断片に隣接して使用されることができる。

【0138】

組換えＤＮＡ構築物は、１８個の連続したヌクレオチドを超える全長を有し得、かつ標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片の断片に加えてヌクレオチドを含み得るＤＮＡに操作可能な形で連結された異種プロモーターを含む。言い換えれば、ＤＮＡの全長は、１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計されるＤＮＡの断片の長さよりも長くてよく、各標的遺伝子は、標的遺伝子配列群からなる群より選択されるＤＮＡ配列を有する。例えば、ＤＮＡは、標的遺伝子を抑制する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片の「活性」断片に隣接するヌクレオチドを有するか、または活性断片の間に「スペーサー」ヌクレオチドを含むか、または５’末端にもしくは３’末端にもしくは５’末端と３’末端の両方に追加のヌクレオチドを有することができる。一実施形態では、異種プロモーターは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体に特に関連していない（相補的または同一ではない配列を有する）追加のヌクレオチド（例えば、安定している二次構造を提供するヌクレオチド、またはクローニングまたは製造の利便性のためのヌクレオチド）を含むＤＮＡに操作可能な形で連結される。一実施形態では、異種プロモーターは、標的遺伝子配列より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の同一性または相補性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの１つ以上の断片のすぐ隣に位置する追加のヌクレオチドを含むＤＮＡに操作可能な形で連結される。一実施形態では、異種プロモーターは、そのような断片を１つ含み、その断片に隣接して、追加の５’Ｇまたは追加の３’Ｃまたはその両方を有するＤＮＡに操作可能な形で連結される。別の実施形態では、異種プロモーターは、オーバーハングを形成する追加のヌクレオチドを含む２本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡに操作可能な形で連結される。したがって、様々な実施形態では、異種プロモーターに操作可能な形で連結されたＤＮＡ全体のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列群からなる群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子における連続したヌクレオチドの断片に対して１００％同一または相補的ではない。例えば、いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の断片に対して１００％の同一性の配列を有する２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも２つの断片を含むＤＮＡに操作可能な形で連結され、ここで（１）少なくとも２つの断片が１つ以上のスペーサーヌクレオチドによって分離されている、または（２）少なくとも２つの断片が、標的遺伝子配列群より選択される配列を有するＤＮＡもしくはそのＤＮＡ相補体において対応した断片が存在する順序とは異なる順序で配置されている。

【0139】

組換えＤＮＡ構築物では、異種プロモーターは、１本鎖（ｓｓ）または２本鎖（ｄｓ）、または両方の組み合わせであり得る転写物をコードするＤＮＡに操作可能な形で連結される。この方法の実施形態は、ＤＮＡがセンス１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、アンチセンスｓｓＲＮＡ、もしくは２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、もしくはこれらのいずれかの組み合わせを含む転写物をコードするものを含む。

【0140】

組換えＤＮＡ構築物は、当業者に知られている適切な手段によって提供される。実施形態は、組換えＤＮＡ構築物がインビトロで合成され、微生物または細胞培養物（培養物において増殖する植物細胞など）における発現によって生成されるか、植物細胞における発現によって生成されるか、または微生物発酵物によって生成されるものを含む。

【0141】

組換えＤＮＡ構築物で使用する異種プロモーターは、植物において機能するプロモーター、原核生物において機能するプロモーター、真菌細胞で機能するプロモーター、およびバキュロウイルスプロモーターからなる群より選択される。プロモーターの非限定的な例は、「プロモーター」という見出しのセクションに記載されている。

【0142】

いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、同様にＤＮＡに操作可能な形で連結された第２のプロモーターを含む。例えば、１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むＤＮＡは、プロモーターが反対方向かつ収束様式で転写し、相補的であって互いにハイブリッド化して２本鎖ＲＮＡを形成することができるＤＮＡの逆鎖転写物を生成するように配置される２つのプロモーターに隣接することができる。一実施形態では、ＤＮＡは２つの根特異的プロモーターの間に位置し、これによりＤＮＡの反対方向での転写が可能となり、結果としてｄｓＲＮＡが形成される。

【0143】

いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むＤＮＡに操作可能な形で連結された異種プロモーターに加えて、他のＤＮＡ要素を含む。そのようなＤＮＡ要素は当技術分野で公知であり、イントロン、リコンビナーゼ認識部位、アプタマーまたはリボザイム、およびコード配列を発現するための（例えば、殺菌性タンパク質もしくは選択可能なマーカーなどの導入遺伝子を発現するための）、または非コード配列を発現するための（例えば、追加の抑制要素を発現するための）追加の発現カセットを含むが、これらに限定されない。小分子ＲＮＡ（例えば、特定の細胞または組織にしか発現しないｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）による結合および切断のための１つ以上の認識部位を含めることによって、植物におけるより正確な発現パターンが可能になり、組換えＤＮＡ構築物の発現は、小分子ＲＮＡが発現される場所で抑制される。

【0144】

いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は組換えベクターにおいて提供される。「組換えベクター」とは、ある細胞から別の細胞に遺伝情報を伝達するために使用される組換えポリヌクレオチド分子を意味する。本発明に適した実施形態は、組換えプラスミド、組換えコスミド、人工染色体、および組換え植物ウイルスベクターおよび組換えバキュロウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。代替の実施形態は、組換えプラスミド、組換えコスミド、人工染色体、および異種プロモーターを含まないＤＮＡ要素を含む組換え植物ウイルスベクターおよび組換えバキュロウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターを含む。

【0145】

いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、植物染色体または色素体において、例えば、トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物において提供される。したがって、ゲノムにおいて組換えＤＮＡ構築物を有するトランスジェニック植物細胞、ならびにそのようなトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物または部分的トランスジェニック植物も本発明に包含される。部分的トランスジェニック植物は、例えば、トランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック台木に接ぎ木される非トランスジェニック接ぎ穂を含む。実施形態には、トランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニックトマト台木を含む。植物は、ボトリティス・シネレアによる感染を受けやすい任意の植物でよい。実施形態は、植物が未発芽植物種子、栄養段階の植物、または生殖段階の植物であるものを含む。さらに別の態様では、本発明は、ゲノムにおいて本明細書に記載される組換えＤＮＡ構築物を有するトランスジェニック植物によって生成される種子（特にトランスジェニック子孫種子）を対象とする。そのようなトランスジェニック植物によって生成される製品、およびそのようなトランスジェニック植物のトランスジェニック子孫種子から生成される製品も企図される。

【0146】

組換えＤＮＡ構築物は、植物または植物の種子、根、もしくは茎の表面への局所的な適用のため、またはボトリティス・シネレア感染からの保護を必要とする任意の基質への局所的な適用のための組成物において提供されることができる。同様に、組換えＤＮＡ構築物は、ボトリティス・シネレアへの局所的な適用のための組成物において、またはボトリティス・シネレアによる内部吸収（例えば、トランスフェクション）のための組成物において提供され得る。様々な実施形態では、組換えＤＮＡ構築物を含むそのような組成物は、固体、（溶液などの均質混合物、および懸濁液、コロイド、ミセル、および乳濁液などの非均質混合物を含む）液体、粉末、懸濁液、乳濁液、スプレー、カプセル化またはマイクロカプセル化製剤、マイクロビーズまたは他の担体粒子の中もしくは上、フィルムまたはコーティングの中、またはマトリックスの上または内、または葉、種子、根、または幹の処理からなる群より選択される少なくとも１つの形態で提供される。局所的な適用は、植物の果実または植物の果実からの種子の局所的な処理の形態であり得る。殺虫剤の製剤化および種子処理における当業者に知られているように、適切な結合剤、不活性担体、界面活性剤などは、組換えＤＮＡ構築物を含む組成物に含まれることができる。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物を含む局所的な適用のための組成物は、植物に局所的に埋め込まれる微粒子、ペレット、またはカプセルからなる群より選択される少なくとも１つの局所埋め込み型製剤である。そのような実施形態では、この方法は、局所埋め込み型製剤を植物に局所的に埋め込むことを含む。一実施形態では、組換えＤＮＡ構築物を含む局所的な適用のための組成物は、ボトリティス・シネレアによって内部吸収（例えば、トランスフェクション）され得る。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物を含む組成物は、担体剤、界面活性剤（参照により本明細書に組み込まれる）、有機シリコーン、有機シリコーン界面活性剤、非ポリヌクレオチド殺菌剤、ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド除草剤分子、非ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、ポリヌクレオチド殺虫剤、非ポリヌクレオチド殺虫剤、毒性緩和剤、および病原体成長制御剤より選択される１つ以上の成分をさらに含む。一実施形態では、組換えＤＮＡ構築物を含有する組成物は、ＣＡＳ番号２７３０６－７８－１およびＥＰＡ番号：ＣＡＬ．ＲＥＧ．ＮＯ．を有するＳＩＬＷＥＴ Ｌ－７７（登録商標）ブランドの界面活性剤を例に取ったＳＩＬＷＥＴ（登録商標）ブランドの界面活性剤などの非イオン性有機シリコーン界面活性剤をさらに含む。５９０５－５００７３－ＡＡを有し、現在Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ａｌｂａｎｙ，Ｎ．Ｙ．から入手可能であるＳＩＬＷＥＴ Ｌ－７７（登録商標）ブランドの界面活性剤などの非イオン性有機シリコーン界面活性剤をさらに含む。ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ ２４０ブランドは、現在Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｅｗｅｌｌ，ＶＡから入手可能なポリエーテル改変ポリシロキサン（ｃａＳＲＮ独自）界面活性剤である。ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ Ｓ ２７９のエンドキャップされたポリエーテルトリシロキサン界面活性剤であり、その成分が次の既存化学物質リストに列挙される：ＥＩＮＥＣＳ，ＴＳＣＡ，ＥＮＣＳ，ＡＩＣＳ，ＥＣＬ，ＰＩＣＣＳ ＣＨＩＮＡ，ＮＤＳＬ。ＩＮＤＵＣＥブランドのアジュバントＮＭＦＣアイテム４２６５２、クラス６０、現在Ｈｅｌｅｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｏｌｌｉｅｒｖｉｌｌｅ，ＴＮから入手可能である。ＣＡ ＲＥＧ Ｎｏ．３４７０４－５００６５を有する、ＦＲＡＮＣＨＩＳＥ（登録商標） ｗｉｔｈ ＬＥＣＩ－ＴＥＣＨ（登録商標）ブランドの界面活性剤は、現在Ｌｏｖｅｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ｇｒｅｅｌｙ，ＣＯから入手可能である。一実施形態は、ＢＲＥＡＫ－ｔｈｒｕ ３０１をさらに含む殺菌性組成物を含む。

【0147】

本明細書に記載される特定の組換えＤＮＡ構築物（例えば、実施例に記載されるポリヌクレオチドトリガーを含む組換えＤＮＡ構築物）と１つ以上の非ポリヌクレオチド殺虫剤との組み合わせは、遺伝子導入的に発現されるか局所的に適用されるかにかかわらず、組換えＤＮＡ構築物単独または非ポリヌクレオチド殺虫剤単独の場合と比較して、ボトリティス・シネレア感染および害虫侵入に対する予防と防除効果の改善をもたらすことが予想される。一実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチド、ならびに非ポリヌクレオチド殺虫剤をコードする１つ以上の遺伝子を発現するための組換えＤＮＡ構築物は、組換えＤＮＡ構築物を発現する植物においてボトリティス・シネレア感染および害虫侵入に対する強化された耐性を提供することが見出される。一実施形態は、トリガー配列群より選択される配列、および非ポリヌクレオチド殺虫剤をコードする１つ以上の遺伝子を有する断片を含むＲＮＡを発現するための組換えＤＮＡ構築物に関する。

【0148】

様々な実施形態では、組換えＤＮＡ構築物を含む組成物は微生物細胞を含むか、または微生物において生成される。例えば、組換えＤＮＡ構築物を含有するための組成物は、細菌または酵母細胞を含むことができ、または細菌または酵母細胞において生成することができる。同様の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物を含む組成物は、トランスジェニック植物細胞を含むか、または植物細胞（例えば、組換えＤＮＡ構築物を一時的に発現する植物細胞）において生成される。そのような植物細胞は、植物における細胞、または組織培養もしくは細胞懸濁液中で増殖させた細胞であり得る。

【0149】

ＸＩＩＩ．トランスジェニック植物細胞
いくつかの実施形態は、ボトリティス・シネレアにおける標的遺伝子の発現を抑制するため、またはボトリティス・シネレア感染を防除するための、本明細書に記載される方法において有用なポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック植物細胞に関する。一態様では、本発明は、標的遺伝子配列群、トリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡの断片に対して約９５％～約１００％の同一性の配列を有する１８個以上の連続したヌクレオチド、又はそのＤＮＡ相補体の少なくとも１つのセグメントを含むＲＮＡをコードする組換えＤＮＡを、そのゲノム中に有するトランスジェニック植物細胞を提供する。一態様では、本発明は、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子配列の断片に対して本質的に同一または本質的に相補的な少なくとも１つのサイレンシング要素を含むＲＮＡをコードする組換えＤＮＡをゲノムにおいて有するトランスジェニック植物細胞を提供し、ここで、標的遺伝子配列は、標的遺伝子配列群またはそのＤＮＡ相補体より選択される。一態様では、本発明は、ＲＮＡと接触または内部で吸収されるボトリティス・シネレアにおける標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡをコードする組換えＤＮＡをそのゲノムにおいて有するトランスジェニック植物細胞を提供し、ここでＲＮＡは少なくとも標的遺伝子の断片に相補的な１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する１つのサイレンシング要素であって、標的遺伝子は、標的遺伝子配列群における遺伝子からなる群より選択される。特定の実施形態は、ＲＮＡと接触するかまたはそれを内部的に吸収するボトリティス・シネレアにおける標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡをコードする組換えＤＮＡをゲノムにおいて有するトランスジェニック植物細胞であって、ＲＮＡが１つ以上の標的遺伝子配列群の断片に相補的な１８個以上の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する少なくとも１つのサイレンシング要素を含む、トランスジェニック植物細胞である。一態様において、本発明は、トリガー配列群より選択される配列を有するＲＮＡをコードする組換えＤＮＡをそのゲノムにおいて有するトランスジェニック植物細胞を提供する。そのようなトランスジェニック植物細胞は、そのような植物細胞を欠いている対照植物と比較して、ボトリティス・シネレア感染に対する強化された耐性を有するトランスジェニック植物を提供するのに有用である。トランスジェニック植物細胞は、単離されたトランスジェニック植物細胞、培養下で増殖させたトランスジェニック植物細胞、またはボトリティス・シネレアによる感染を受ける任意のトランスジェニック植物のトランスジェニック細胞であり得る。

【0150】

一実施形態では、組換えＤＮＡはトランスジェニック植物のゲノムに安定に組み込まれ、そこからトランスジェニック植物の１つ又は複数の細胞において発現することができる。安定に形質転換された植物を提供する方法については、「トランスジェニック植物細胞とトランスジェニック植物の生成と利用」のセクションで論じる。

【0151】

いくつかの実施形態は、ＲＮＡと接触するかまたはそれを内部的に吸収するボトリティス・シネレアにおける標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡをコードする組換えＤＮＡをそのゲノムにおいて有するトランスジェニック植物細胞に関し、上記ＲＮＡが標的遺伝子に相補的な少なくとも１つのサイレンシング要素を含み、上記標的遺伝子配列は標的遺伝子配列群またはその相補体より選択される。いくつかの実施形態では、サイレンシング要素は、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して約９５％～約１００％の相補性の配列を有する少なくとも１８個以上の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、サイレンシング要素は、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に、インビボでハイブリッド化するか、または生理的条件下（例えば、ボトリティス・シネレアの細胞において通常見出される生理的条件など）でハイブリッド化することができる、少なくとも１８個以上の連続したヌクレオチドを含む。連続したヌクレオチドの数は少なくとも１８個、例えば１８個～２４個、または１８個～２８個、または２０個～３０個、または２０個～５０個、または２０個～１００個、または５０個～１００個、または５０個～５００個、または１００個～２５０個、または１００個～５００個、または２００個～１０００個、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチドの数は、１８を超える個数、例えば、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、または３０個を超える個数、例えば、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２７０個、約２８０個、約２９０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約５７５個、約６００個、または６００個を超える連続したヌクレオチドである。特定の実施形態では、サイレンシング要素は、標的遺伝子配列群、トリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡは、１つの鎖が標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対して１００％の同一性の配列を有する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む２本鎖核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）である。塩基対として表現されるそのような２本鎖核酸は、標的遺伝子配列群またはトリガー配列群より選択される配列を有するＤＮＡまたは標的遺伝子またはそのＤＮＡ相補体の同等の長さの断片に対応する少なくとも１８個、１９個、２０個、または２１個の連続した完全に一致した塩基対の少なくとも１つの断片を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡに含まれる各サイレンシング要素は、天然に存在する制御性小分子ＲＮＡに典型的な長さよりも長い。いくつかの実施形態では、各断片は、長さが少なくとも約３０個の連続したヌクレオチド（または塩基対）である。特定の実施形態では、ＲＮＡの長さは約５０個～約６００個のヌクレオチドである。特定の実施形態では、ＲＮＡは、トリガー配列群より選択される配列を有する。

【0152】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物細胞はさらに、追加の異種ＤＮＡ配列を発現することができる。特定の実施形態では、トランスジェニック植物細胞は、（ｉ）トリガー配列群より選択される配列を有する少なくとも１つのＲＮＡをコードする組換えＤＮＡ、および（ｉｉ）少なくとも１つの殺真菌剤をコードするＤＮＡをそのゲノムに安定に組み込んでいる。

【0153】

関連態様において、本発明は、トランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物、トランスジェニック植物およびトランスジェニック植物のトランスジェニック子孫植物種子またはトランスジェニック増殖可能な部位を含むトランスジェニック植物から生産される製品を対象とする。また、トランスジェニック植物によって生産される製品、およびそのようなトランスジェニック植物のトランスジェニック子孫種子から生産される製品も企図される。

【0154】

ＸＩＶ．ＲＮＡｉ用のポリヌクレオチドを生成する方法
特許請求される方法および組成物のポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって生成することができる。本開示のＲＮＡ分子を生成する方法の例は、（Ｔ７ポリメラーゼまたは他のポリメラーゼを使用する転写などの）インビトロ転写（ＩＶＴ）、化学合成、（植物または微生物などの）生物においての発現、または（植物細胞培養物などの）細胞培養物での発現、および微生物発酵を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡは、米国特許第１０，８５８，３８５号または米国特許第１０，９５４，５４１号に記載のＲＮＡの無細胞生成プロセスのいずれか１つを通じて作製され、その両方が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれるＷＩＰＯ特許出願公開第ＷＯ２０２１／１１３７７４号に記載されているように、ｄｓＲＮＡの発現を増強するための組換えプラスミドの使用を通じて作製される。

【0155】

ＸＶ．プロモーター
本発明で使用されるプロモーターは、構築物が転写されることが意図される細胞において機能する。一般に、これらのプロモーターは、組換え構築物において使用される異種プロモーターであり、すなわち、それらは、本明細書に記載される構築物において使用される他の核要素に操作可能な形で連結されることが自然に見出されない。様々な実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、空間特異的プロモーター、時間的特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択される。多くの実施形態では、プロモーターは、植物において機能するプロモーター、例えば、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＶプロモーター、またはｐｏｌ Ｖプロモーターである。

【0156】

本発明の組換えＤＮＡ構築物との使用に適した非構成的プロモーターは、空間特異的プロモーター、時間特異的プロモーター、および誘導性プロモーターを含む。空間特異的プロモーターは、オルガネラ特異的、細胞特異的、組織特異的、または器官特異的プロモーター（例えば、それぞれ色素体、根、花粉、または種子における発現のための色素体特異的、根特異的、花粉特異的、または種子特異的プロモーター）を含み得る。多くの場合、種子特異的、胚特異的、アロイロン特異的、または胚乳特異的プロモーターが特に有用である。時間的に特異的なプロモーターは、植物の成長サイクルにおける特定の発育段階中、または昼夜の異なる時間帯、または一年の異なる季節に発現を促進する傾向があるプロモーターを含み得る。誘導性プロモーターは、化学物質、または生物的または非生物的ストレス（例えば、水不足または干ばつ、熱、寒さ、高いまたは低い栄養素または塩分レベル、高いまたは低い光レベル、または害虫または病原体感染）などの環境条件によって誘導されるプロモーターを含むが、これらに限定されない。マイクロＲＮＡプロモーターは、特に時間的に特異的、空間的に特異的、または誘導可能な発現パターンを持つプロモーターとして有用である。ｍｉＲＮＡプロモーター、ならびに特定の発現パターンを有するｍｉＲＮＡプロモーターを同定する方法の例は、米国特許出願公開第２００６／０２００８７８号、第２００７／０１９９０９５号、および第２００７／０３００３２９号に提供されており、これらは特に参照により本明細書に組み込まれる。発現特異的プロモーターはまた、一般に「強いプロモーター」または「弱いプロモーター」とみなされるプロモーターを含む、構成的に発現されるが発現の程度または「強度」が異なるプロモーターを含み得る。

【0157】

具体的な対象となるプロモーターは、次の例を含む。アグロバクテリウムのＴ－ＤＮＡから単離されたオパリンシンターゼプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、強化されたプロモーター要素、またはエンハンサー要素（Ｚｅａ ｍａｙｓの熱ショックタンパク質７０からのイントロン）に連結された強化されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなどのキメラプロモーター要素、根特異的プロモーター、例えば、米国特許第５，８３７，８４８号、第６，４３７，２１７号および第６，４２６，４４６号に開示されるもの、米国特許第６，４３３，２５２号に開示されるトウモロコシＬ３オレオシンプロモーター、米国特許出願公開第２００４／０２１６１８９号に開示される、色素体局在アルドラーゼをコードする植物核遺伝子のプロモーター、米国特許第６，０８４，０８９号に開示される寒冷誘導性プロモーター、米国特許第６，１４０，０７８号に開示される塩誘導性プロモーター、米国特許第６，２９４，７１４号に開示される光誘導性プロモーター、米国特許第６，２５２，１３８号に開示される病原体誘導性プロモーター、および米国特許出願公開第２００４／０１２３３４７Ａ１号に開示される水分不足誘導性プロモーター。プロモーターおよびそれらの使用、特に植物において機能する組換えＤＮＡ構築物における使用を開示する上記の特許および特許刊行物のすべては、参照により本明細書に組み込まれる。

【0158】

対象となる植物の維管束特異的プロモーターまたは師部特異的プロモーターは、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのｒｏｌＣ又はｒｏｌＡプロモーター、腫瘍原性アグロバクテリウム Ｔ－ＤＮＡ遺伝子５のプロモーター、イネスクロースシンターゼＲＳｓ１遺伝子プロモーター、Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ黄斑バドナウイルスプロモーター、ヤシ葉腐朽ウイルスプロモーター、イネツグロ桿菌ウイルスプロモーター、エンドウ豆グルタミンシンターゼＧＳ３Ａ遺伝子のプロモーター、ジャガイモインベルターゼ遺伝子のｉｎｖＣＤ１１１及びｉｎｖＣＤ１４１プロモーター、Ｋｅｒｔｂｕｎｄｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８：５２１２－５２１６によりタバコにおいて師部特異的発現を有することが示されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから単離されたプロモーター、ＶＡＨＯＸ１プロモーター領域、エンドウ豆細胞壁インベルターゼ遺伝子プロモーター、ニンジン由来の酸インベルターゼ遺伝子プロモーター、硫酸トランスポーター遺伝子Ｓｕｌｔｒ１のプロモーター、植物スクロースシンターゼ遺伝子のプロモーター、および植物スクローストランスポーター遺伝子のプロモーターを含む。

【0159】

本発明の組換えＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドでの使用に適したプロモーターは、ポリメラーゼＩＩ（「ｐｏｌ ＩＩ」）プロモーターおよびポリメラーゼＩＩＩ（「ｐｏｌ ＩＩＩ」）プロモーターを含み得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、通常長さが４００ヌクレオチドよりも短い構造ＲＮＡまたは触媒ＲＮＡを転写し、単純なＴ残基の連続を終結シグナルとして認識する。それは、ｓｉＲＮＡ２本鎖を転写するために使用される（例えば、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３２：ｅ１７１を参照されたい）。したがって、短いＲＮＡ転写物が本発明の組換えＤＮＡ構築物から生成される特定の実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターが使用される。一実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、自己切断リボザイム配列（例えば、自己切断ハンマーヘッドリボザイム）が隣接するＲＮＡ転写物を発現するｐｏｌ ＩＩプロモーターを含み、その結果、規定された５’末端と３’末端を有し、潜在的に干渉する隣接配列がないボトリティス・シネレアの標的遺伝子の転写物に結合する１本鎖ＲＮＡなどのプロセシングされたＲＮＡをもたらす。別のアプローチは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを使用して、比較的に規定された５’および３’末端を有する転写物を生成し、つまり、最小限の５’および３’隣接配列を有するＲＮＡを転写する。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６またはＨ１プロモーター）は、転写されたＲＮＡに２塩基対のオーバーハング（ＵＵ）をもたらす短いＡＴリッチ転写終結部位を追加するためのものである。これは、例えばｓｉＲＮＡタイプの構築物の発現に役立つ。ｓｉＲＮＡ構築物の発現を駆動するためのｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの使用が報告されている。ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｔｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．，４：６０９－６１５，ａｎｄ Ｔｕｓｃｈｌ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：４４６－４４８を参照されたい。バキュロウイルスポリヘドリンおよびｐ１０プロモーターなどのバキュロウイルスプロモーターは当技術分野で知られており、市販されている。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＥＶＳ）ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，２００２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）および Ｆ．Ｊ．Ｈａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”，日付な（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）．

【0160】

プロモーター要素は、天然に存在するプロモーターまたはプロモーター要素またはその相同体ではないが、遺伝子の発現を調節できる核酸配列を含み得る。そのような「遺伝子非依存性」調節配列の例は、リガンド結合領域またはアプタマー（以下の「アプタマー」を参照されたい）および（シス作用性であり得る）調節性領域を含む、天然に存在するまたは人工的に設計された核酸配列を含む。例えば、Ｉｓａａｃｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：８４１－８４７，Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｓｍｏｌｋｅ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：３３７－３４３，Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５：４５１－４６３，Ｄａｖｉｄｓｏｎ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：１０９－１１２，Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１９：９５２－９５６，Ｓｕｄａｒｓａｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＲＮＡ，９：６４４－６４７，ａｎｄ Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：２９－３５を参照されたい。そのような「リボレギュレーター」は、特定の空間的または時間的特異性のために選択または設計されることができ、例えば、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子を、所定の濃度の適切なリガンド存在下（または非存在下）でのみ抑制するサイレンシング要素をコードするＤＮＡの翻訳を調節することができる。一例は、本質的に生体調節的であり、ストレス（例えば、水、温度、栄養ストレスなどの非生物的ストレス、または害虫や病原体による付着などの生物的ストレス）下にあるときに植物によって生成される内因性リガンド（例えば、ジャスモン酸またはサリチル酸）に応答する。ストレス下では、内因性リガンドのレベルは、生体調節因子がボトリティス・シネレアの標的遺伝子を抑制するサイレンシング要素をコードするＤＮＡの転写を開始するのに十分なレベルまで増加する。

【0161】

ＸＶＩ．リコンビナーゼ部位
いくつかの実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドは、１つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識部位をコードするＤＮＡを含む。一実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、少なくとも一対のｌｏｘＰ部位を含み、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される。ｌｏｘＰ部位の位置および相対的な配向は、望ましい組換えを達成するために選択される。例えば、ｌｏｘＰサイトが同じ方向にある場合、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡは環状に切除される。別の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、１つのｌｏｘＰ部位をコードするＤＮＡを含む。ＣｒｅリコンビナーゼおよびｌｏｘＰ部位を持つ別のＤＮＡの存在下では、２つのＤＮＡが組み換えられる。

【0162】

ＸＶＩＩ．導入遺伝子転写ユニット
いくつかの実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドは、導入遺伝子転写ユニットを含む。導入遺伝子転写ユニットは、関心対象となる遺伝子、例えば天然タンパク質または異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。関心対象となる遺伝子は、任意の種（細菌、ウイルスなどの非真核生物、真菌、原生生物、植物、無脊椎動物、および脊椎動物を含むがこれらに限定されない）に由来する任意のコード配列または非コード配列であり得る。導入遺伝子転写単位は、導入遺伝子の転写に必要な５’配列または３’配列または両方をさらに含むことができる。

【0163】

ＸＶＩＩＩ．イントロン
いくつかの実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドは、スプライシング可能なイントロンをコードするＤＮＡを含む。「イントロン」とは、一般に、エクソン（ＤＮＡまたは対応する転写されたＲＮＡのタンパク質をコードする断片）の間に位置するＤＮＡの断片（またはそのような断片から転写されたＲＮＡ）を意味し、メッセンジャーＲＮＡの成熟中に、存在するイントロンは、真核生物の核において起こる切断／連結プロセスによって、酵素的にＲＮＡ鎖から「スプライスアウト」または除去される。「イントロン」という用語は、成熟ＲＮＡ転写物からスプライスアウトできるＲＮＡ断片に転写される非コードＤＮＡ配列にも適用されるが、タンパク質をコードするエクソンの間に見出されるイントロンではない。これらの一例は、植物（場合によっては、特に単子葉植物）における下流コード配列の発現を増強する能力を有するスプライス可能な配列である。これらのスプライシング可能な配列は、一部分の植物遺伝子の５’非翻訳領域、およびいくつかのウイルス遺伝子（例えば、ＧａｌｌｉｅおよびＷａｌｂｏｔ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：４６３１－４６３８）によって植物遺伝子の発現を増強すると記載されるタバコモザイクウイルスの５’リーダー配列または「ｏｍｅｇａ」リーダー）の５’非翻訳領域に自然に位置している。これらのスプライシング可能な配列または「発現増強イントロン」は、植物遺伝子のプロモーターとタンパク質コードエクソンの間の５’非翻訳領域に人工的に挿入されることができる。そのような発現増強イントロンの例は、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｚｍ－Ａｄｈ１）、トウモロコシＢｒｏｎｚｅ－１発現増強イントロン、イネアクチン１（Ｏｓ－Ａｃｔ１）イントロン、Ｓｈｒｕｎｋｅｎ－１（Ｓｈ－１）イントロン、トウモロコシスクロースシンターゼイントロン、熱ショックタンパク質１８（ｈｓｐ１８）イントロン、および８２キロダルトンの熱ショックタンパク質（ｈｓｐ８２）イントロンを含むが、これらに限定されない。米国特許第５，５９３，８７４号および第５，８５９，３４７号（特に参照により本明細書に組み込まれる）には、遺伝子プロモーターから３’及び第一のタンパク質をコードするエクソンから５’の位置にある非翻訳リーダーにおける、７０キロダルトンのトウモロコシ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）に由来する発現増強イントロンを含むことによって、植物で使用するための組換えＤＮＡ構築物を改良する方法が記載される。

【0164】

ＸＩＸ．リボザイム
いくつかの実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドは、１つ以上のリボザイムをコードするＤＮＡを含む。具体的な関心対象となるリボザイムは、自己切断リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、またはヘアピンリボザイムを含む。一実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、転写されたＲＮＡを切断してボトリティス・シネレアの標的遺伝子を抑制するためのサイレンシング要素などのＲＮＡの規定された断片を提供するように機能する１つ以上のリボザイムをコードするＤＮＡを含む。

【0165】

ＸＸ．遺伝子抑制要素
いくつかの実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドは、ボトリティス・シネレア標的遺伝子以外の標的遺伝子を抑制するための追加の遺伝子抑制要素をコードするＤＮＡを含む。抑制される標的遺伝子は、コード配列または非コード配列、またはその両方を含み得る。

【0166】

適切な遺伝子抑制要素は、米国特許出願公開第２００６／０２００８７８号に詳細に記載され、その開示は特に参照により本明細書に組み込まれるものであり、以下の１つ以上を含む。
○（ａ）抑制対象となる遺伝子の少なくとも１つの断片に対してアンチセンスである少なくとも１つのアンチセンスＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、
○（ｂ）抑制対象となる遺伝子の少なくとも１つの断片に対してアンチセンスである少なくとも１つのアンチセンスＤＮＡ断片の複数のコピーを含むＤＮＡ、
○（ｃ）抑制対象となる遺伝子の少なくとも１つの断片である少なくとも１つのセンスＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、
○（ｄ）抑制対象となる遺伝子の少なくとも１つの断片である少なくとも１つのセンスＤＮＡ断片の複数のコピーを含むＤＮＡ、
○（ｅ）２本鎖ＲＮＡを形成することによって抑制対象となる遺伝子を抑制するためのＲＮＡに転写し、抑制対象となる遺伝子の少なくとも１つの断片に対してアンチセンスである少なくとも１つのアンチセンスＤＮＡ断片と、抑制対象となる遺伝子の少なくとも１つの断片である少なくとも１つのセンスＤＮＡ断片とを含むＤＮＡ、
○（ｆ）単一の２本鎖ＲＮＡを形成することによって抑制対象となる遺伝子を抑制するためのＲＮＡに転写し、抑制対象となる遺伝子の少なくとも１つの断片に対してアンチセンスである複数のシリアルアンチセンスＤＮＡ断片と、抑制対象となる遺伝子の少なくとも１つの断片である複数のシリアルセンスＤＮＡ断片とを含むＤＮＡ、
○（ｇ）ＲＮＡの複数の２本鎖を形成することによって抑制対象となる遺伝子を抑制するためのＲＮＡに転写し、抑制対象となる遺伝子の少なくとも１つの断片に対してアンチセンスである複数のアンチセンスＤＮＡ断片と、抑制対象となる遺伝子の少なくとも１つの断片である複数のセンスＤＮＡ断片とを含むＤＮＡであって、複数のアンチセンスＤＮＡ断片および複数のセンスＤＮＡ断片は一連の逆方向反復で配置される、ＤＮＡ、
○（ｈ）植物ｍｉＲＮＡ由来のヌクレオチドを含むＤＮＡ、
○（ｉ）ｓｉＲＮＡのヌクレオチドを含むＤＮＡ、
○（ｊ）リガンドに結合可能なＲＮＡアプタマーに転写するＤＮＡ、および
○（ｋ）リガンドに結合し得るＲＮＡアプタマーに転写するＤＮＡ、及び抑制対象となる遺伝子の発現を制御し得る制御ＲＮＡに転写するＤＮＡであって、該制御が該制御ＲＮＡの立体構造に依存し、制御性ＲＮＡの立体構造は、ＲＮＡアプタマーの結合状態によってアロステリックに影響される、ＤＮＡ。

【0167】

いくつかの実施形態では、イントロンを使用して、いずれのタンパク質をコードするエクソン（コード配列）の非存在下で遺伝子抑制要素を送達する。一例では、発現増強イントロンなどのイントロンは、イントロン内に遺伝子抑制要素を埋め込むことによって中断され、転写時に遺伝子抑制要素がイントロンから切除される。したがって、タンパク質をコードするエクソンは、本明細書に開示される組換えＤＮＡ構築物の遺伝子抑制機能を提供する必要はない。

【0168】

ＸＸＩ．転写調節要素
いくつかの実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドは、転写調節要素をコードするＤＮＡを含む。転写調節要素は、本発明の組換えＤＮＡ構築物の発現レベルを（そのような調節要素の非存在下での発現に対して）調節する要素を含む。適切な転写調節要素の例は、特に参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２００８７８号に詳細に記載されるように、リボスイッチ（シス作用性またはトランス作用性）、転写物安定化配列、転写開始部位、転写伸長配列、転写停止要素、およびｍｉＲＮＡ認識部位を含む。

【0169】

ＸＸＩＩ．トランスジェニック植物細胞とトランスジェニック植物の作製と使用
植物の形質転換は、いくつかの周知の方法および組成物のいずれかを含み得る。植物の形質転換に適した方法は、ＤＮＡを細胞に導入できる実質的にあらゆる方法を含む。植物の形質転換の１つの方法は、例えば、米国特許第５，０１５，５８０号（大豆）、米国特許第５，５３８，８８０号（トウモロコシ）、米国特許第５，５５０，３１８号（トウモロコシ）、米国特許第５，９１４，４５１号（大豆）、米国特許第６，１５３，８１２号（小麦）、米国特許第６，１６０，２０８号（トウモロコシ）、米国特許第６，２８８，３１２号（米）、米国特許第６，３６５，８０７号（米）、および米国特許第６，３９９，８６１号（トウモロコシ）、および米国特許第６，４０３，８６５号（トウモロコシ）に示される微粒子銃の照射であり、このいずれもトランスジェニック植物の生成を可能にするために参照として組み込まれる。

【0170】

植物の形質転換の別の有用な方法は、２成分Ｔｉプラスミドシステムを含むアグロバクテリウムによるアグロバクテリウムが媒介する形質転換であり、アグロバクテリウムは第１のＴｉプラスミド（多くの場合に解除されている）、野生型Ｔｉプラスミドの少なくとも１つのＴ－ＤＮＡ境界を含有する第２のキメラのプラスミド、形質転換された植物細胞中で機能し、本発明のポリヌクレオチド又は組換えＤＮＡ構築物に操作可能な形で連結されるプロモーターを保持する。参照により組み込まれる米国特許第５，１５９，１３５号に記載される２成分系を参照されたい。またＤｅ Ｆｒａｍｏｎｄ（１９８３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：２６２－２６９；およびＨｏｅｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ，３０３：１７９を参照されたい。そのような二元系では、１つ又は複数のＴ－ＤＮＡの境界を含有する、より小さなプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの適切な代替宿主中で好都合に構成および操作することができ、その後アグロバクテリウムに移動する。

【0171】

植物、特に作物植物の、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが媒介する形質転換の詳細な手順は、米国特許第５，００４，８６３号、第５，１５９，１３５号、および第５，５１８，９０８号（綿）、米国特許第第５，４１６，０１１号、第５，５６９，８３４号、第５，８２４，８７７号および第６，３８４，３０１号（大豆）、米国特許第５，５９１，６１６号および第５，９８１，８４０号（トウモロコシ）、第５，４６３，１７４号（キャノーラを含むアブラナ）、第７，０２６，５２８号（小麦）、及び第６，３２９，５７１号（イネ）、及び米国特許出願公開第２００４／０２４４０７５（トウモロコシ）及び第２００１／００４２２５７Ａ１号（テンサイ）に開示される手順を含み、これらはすべて、トランスジェニック植物の生成を可能にするために参照により具体的に組み込まれる。米国特許出願公開第２０１１／０２９６５５５号は、実施例５に形質転換ベクター（ベクター配列を含む）及びトウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、サトウキビを形質転換するための詳細なプロトコルを開示し、トランスジェニック植物の生成を可能にするために参照により具体的に組み込まれる。同様な方法は、多くの植物種、双子葉植物と単子葉植物の両方で報告されており、他に、ピーナッツ（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，１５：６５３）、アスパラガス（Ｂｙｔｅｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４：５３４５）、オオムギ（Ｗａｎ ａｎｄ Ｌｅｍａｕｘ（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４：３７）、イネ（Ｔｏｒｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１０；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，７：３７９）、小麦（Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６６７；Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ．，５：２９９），アルファルファ（Ｍａｓｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎ．Ｒｅｓ．，５：３１３）、およびトマト（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４７：４２６－４３１）．参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１６７５３７Ａ１号において、転写因子がＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって構成的に発現される、形質転換されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ植物のベクター、形質転換方法、及び生成に関する説明も参照されたい。ボトリティス感染を受けやすい植物に特に有用な形質転換方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、公的に記載されるトマトの形質転換法を参照されたい（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．，３４：４２３－４３３），ナス（Ａｒｐａｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９５：３２９－３３４），ジャガイモ（Ｂａｎｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，１７０：７３２－７３８；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｏｔａｔｏ Ｒｅｓ．，８４：３０１－３１１；Ｓ．Ｍｉｌｌａｍ“Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ．”Ｃｈａｐｔｅｒ１９（ｐｐ．２５７－２７０），“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｃｒｏｐｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｉａｎ Ｓ．Ｃｕｒｔｉｓ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００４），およびトウガラシ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２１：７８５－７８８）．安定したトランスジェニックジャガイモ、トマト、およびナスが様々な地域で商業的に導入されており、例えば、Ｋ．Ｒｅｄｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．“Ｓａｆｅｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｒｕｉｔｓ ａｎｄ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ：Ａ Ｃａｓｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ＦＬＡＶＲ ＳＡＶＲ Ｔｏｍａｔｏ”，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９２を参照されたい、および広範囲な公的に利用可能なＧＭ作物データーベースにおける商業的なトランスジェニック作物に関する文章については、ＣＥＲＡ．（２０１２）．ＧＭ Ｃｒｏｐ Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｒｉｓｋ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＣＥＲＡ），ＩＬＳＩ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，電子的に利用可能なものはｃｅｒａ－ｇｍｃ．ｏｒｇ／？ａｃｔｉｏｎ＝ｇｍ＿ｃｒｏｐ＿ｄａｔａｂａｓｅを参照されたい。他の植物種の形質転換の様々な方法は、当技術分野で公知であり、例えば、百科事典の参考文献である“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｃｒｏｐ Ｐｌａｎｔｓ”，Ｃｈｉｔｔａｒａｎｊａｎ Ｋｏｌｅ及びＴｉｍｏｔｈｙ Ｃ．Ｈａｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｔｄ．，２００８；ＩＳＢＮ ９７８－１－４０５－１６９２４－０（ｍｒｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｅｍｒｗ／９７８１４０５１８１０９９／ｈｐｔ／ｔｏｃで電子的に入手可能）には、穀類及び飼料用草（イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、エンバク、モロコシ、トウジンビエ、シコクビエ、冷期の飼料用草、及びバヒアグラス）、油料種子作物（ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ピーナッツ、亜麻、ゴマ、ベニバナ）、マメ科穀物及び飼料（インゲンマメ、ササゲ、エンドウ、ソラマメ、レンズ豆、テパリービーン、アジアマメ、キマメ、ベッチ、ヒヨコマメ、ハウチワマメ、アルファルファ、及びクローバー）、温帯果実及びナッツ（リンゴ、ナシ、モモ、プラム、ベリー類、サクランボ、ブドウ、オリーブ、アーモンド、ペルシャクルミ）、熱帯および亜熱帯果実及びナッツ（柑橘類、グレープフルーツ、バナナ・プランテン、パイナップル、パパイヤ、マンゴー、アボカド、キウイフルーツ、パッションフルーツ、及び柿）、野菜作物（トマト、ナス、ピーマン、野菜のアブラナ、大根、ニンジン、ウリ、ネギ、アスパラガス、及び葉物野菜）、砂糖、塊茎、及び繊維作物（サトウキビ、テンサイ、ステビア、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、及びワタ）、プランテーション作物、観賞植物、及び芝草（タバコ、コーヒー、ココア、茶、ゴムノキ、薬用植物、観賞用植物、及び芝草）、及び森林樹種のための形質転換手順が記載されている。

【0172】

安定的に組み込まれた組換えＤＮＡを含むトランスジェニック植物細胞及びトランスジェニック植物を提供する形質転換方法は、好ましくは培地上の組織培養及び制御された環境において実施される。「培地」は、細胞をインビトロ、つまり無傷の生体外で増殖させるために使用される多数の栄養混合物を指す。レシピエント細胞の標的は、分裂組織細胞、カルス、未成熟胚又は胚の一部分、及び小胞子、花粉、精子、卵細胞などの配偶子細胞を含むが、これらに限定されない。生殖可能な植物を再生できるいずれの細胞も、本発明の実施に有用なレシピエント細胞であることが意図される。カルスは、未成熟胚又は胚の一部、苗の先端分裂組織、小胞子などを含むが、これらに限定されない様々な組織源から開始することができる。カルスとして増殖することが可能であるこれらの細胞は、遺伝的形質転換のためのレシピエント細胞として機能することができる。本発明のトランスジェニック植物（例えば、様々な培地及びレシピエントの標的細胞、未成熟胚の形質転換、及びその後の稔性トランスジェニック植物の再生）を作製するための実用的な形質転換方法及び材料は、例えば、参照によって具体的に組み込まれている米国特許第６，１９４，６３６号及び米国特許出願公開第２００４／０２１６１８９号に開示されている。

【0173】

一般的な形質転換の実施において、ＤＮＡは、１回の形質転換実験のいずれにおいても、低パーセントの標的細胞にしか導入されない。一般的に、マーカー遺伝子は、トランスジェニックＤＮＡ構築物を受け取ること及びゲノムに組み込むことによって安定的に形質転換される細胞を特定するための効率的なシステムを提供するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、抗生物質又は除草導入剤などの選択的導入剤に耐性を付与する選択的マーカーを提供する。植物細胞がそれに対して耐性を有する抗生物質又は除草導入剤のいずれも、選択に対して有用な薬導入剤となり得る。形質転換された可能性のある細胞は、マーカーに対応している選択的な導入剤に曝露される。生存細胞の集団では、一般的に、耐性付与遺伝子（選択的マーカー）が細胞の生存を可能にするのに十分なレベルで組み込まれかつ発現する細胞が対象となる。細胞はさらに試験されて、組換えＤＮＡの安定した組み込みを確認することができる。一般的に使用される選択的マーカー遺伝子は、カナマイシン又はパロモマイシン（ｎｐｔｌｌ）、ハイグロマイシンＢ（ａｐｈＩＶ）、及びゲンタマイシン（ａａｃ３及びａａｃＣ４）などの抗生物質に対する耐性、又はグルホシネート（ｂａｒ又はｐａｔ）及びグリホサート（ＥＰＳＰＳ）などの除草導入剤に対する耐性を付与するものを含む。有用な選択的マーカー遺伝子及び選択導入剤の例は、すべてが参照によって具体的に組み込まれる米国特許第５，５５０，３１８号、第５，６３３，４３５号、第５，７８０，７０８号、第６，１１８，０４７号に示される。形質転換体を視覚的に識別する能力を提供するマーカーなどの、スクリーニング可能なマーカーまたはレポーターも使用されることができる。有用なスクリーニング可能なマーカーの例は、例えば、発色基質（例えば、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（ｕｉｄＡ）又はルシフェラーゼ（ｌｕｃ））に作用することによって検出可能な色を生成するか、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ｇｆｐ）又は免疫原性分子などのそれ自体が検出可能であるタンパク質を発現する遺伝子を含む。当業者は、他の多くの有用なマーカー又はレポーターが使用可能であることを認識するであろう。

【0174】

トランスジェニック植物細胞における組換えＤＮＡ構築物の転写を検出することまたは測定することは、タンパク質検出法（例えば、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、および他の免疫化学的方法）、酵素活性の測定、又は核酸検出法（例えば、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、蛍光インサイチュハイブリッド化法）を含むいずれかの適切な方法によって達成することができる。

【0175】

ボトリティス・シネレアの標的遺伝子を標的とする本発明の組換えポリヌクレオチドの植物細胞における転写を検出又は測定するのに適した他の方法は、例えば、ボトリティス・シネレアの成長速度、死滅率、繁殖率、又は補充率など、組換えポリヌクレオチドが存在しない場合に観察される発現レベルと比較して、ボトリティス・シネレアにおける標的遺伝子の発現レベルを直接的又は代理的に示す他の形質を測定すること、又は、ボトリティス・シネレアによって侵入された植物又は植物の畑における傷害（例えば、根の損傷）又は収量損失を測定することを含む。一般に、関心対象となる組換えポリヌクレオチドの植物細胞における転写を検出又は測定するための適切な方法は、例えば、肉眼的又は顕微鏡的な形態学的形質、成長速度、収量、繁殖率又は補充率、害虫又は病原体に対する耐性、又は生物的又は非生物的ストレス（例えば、水不足ストレス、塩分ストレス、栄養ストレス、暑さ又は寒さのストレス）に対する耐性を含む。そのような方法は、表現型形質の直接測定又は代理的アッセイ（例えば、植物では、これらのアッセイは、非生物的ストレスの耐性を決定するための葉や根のアッセイなどの植物部位アッセイを含む）を使用することができる。そのような方法は、ボトリティス・シネレアに対する耐性の直接測定（例えば、植物組織への損傷）または代用アッセイ（例えば、植物収量アッセイ、またはバイオアッセイ）を含む。

【0176】

本発明の組換えＤＮＡ構築物は、例えば、他の遺伝子を発現又は抑制することによって、追加の形質（例えば、形質転換された植物の場合、除草剤耐性、害虫耐性、低温発芽耐性、水不足耐性などを含む形質）を付与するために、他の組換えＤＮＡと積み重ねることができる。遺伝子発現の調整された減少及び増加のための構築物は、具体的に参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００４／０１２６８４５Ａ１号に開示されている。

【0177】

稔性トランスジェニック植物の種子は、収穫され、そのゲノムにおいて組換えＤＮＡ構築物を含む本発明のトランスジェニック植物のハイブリッド世代を含む子孫世代を成長させるために使用されることができる。したがって、本発明の組換えＤＮＡ構築物を有する植物の直接形質転換に加えて、組換えＤＮＡを有する第１の植物と、構築物を欠いている第２の植物とを交配することによって、本発明のトランスジェニック植物を調製することができる。例えば、組換えＤＮＡは、形質転換に適した植物系統に導入して、トランスジェニック植物を生成させ、これを第２の植物系統と交配させて、得られた子孫に組換えＤＮＡを遺伝子移入することができる。本発明のトランスジェニック植物は、１つ以上の追加の形質（例えば、除草剤耐性、病気又は害虫耐性、環境ストレス耐性、改変された栄養素含有量、及び収量の改善を含むが、これらに限定されない）を付与する他の組換えＤＮＡを有する植物系統と交配して、所与の標的配列発現行動及び追加の形質の両方を付与する組換えＤＮＡを有する子孫植物を生成することができる。

【0178】

そのような形質を組み合わせた育種では、追加の形質を供与するトランスジェニック植物を雄系統（受粉者）とし、基本形質を保持するトランスジェニック植物を雌系統とすることができる。この交雑の子孫は、ある植物が両方の親の形質のＤＮＡを保持し、ある植物が一方の親の形質のＤＮＡを保持するように分離する、そのような植物は、親の組換えＤＮＡに関連するマーカーによって特定することができ、両方の親の形質のＤＮＡを保持する子孫植物は、例えば通常６世代から８世代のような複数回の雌親系統に戻して交配して、一方の元のトランスジェニック親系統と実質的に同じ遺伝子型およびもう一方のトランスジェニック親系統の組換えＤＮＡを有するホモ接合型の子孫植物を生成することができる。
○本発明のさらに別の態様は、本発明のトランスジェニック種子から成長させたトランスジェニック植物である。本発明は、組換えＤＮＡを含むトランスジェニック種子から直接成長させたトランスジェニック植物、並びに同じトランスジェニック種子から成長させなかった第２の植物にトランスジェニック種子から直接成長させたトランスジェニック植物を交配させることによって作成される近交系又はハイブリッド系を含む子孫世代の植物を意図する。交配は、例えば、次のステップ（ａ）第１の親植物（例えば、非トランスジェニック又はトランスジェニック）と本発明に従ったトランスジェニックである第２の親植物の種子または茎の挿し木を植えるステップ、
○（ｂ）第１及び第２の親植物の種子または茎の挿し木を、花をつける植物に成長させるステップ、
○（ｃ）第１の親からの花に第２の親の花粉を用いて受粉させるステップ、及び
○（ｄ）受粉した花を有する親植物に実った種子を収穫するステップを含むことができる。

【0179】

組換えＤＮＡをエリート品種に、例えば戻し交配によって遺伝子移入して、あるソースからの特定の望ましい形質を、その形質を欠く近交系又は他の植物に移すことは、しばしば望ましいことである。これは、例えば、課題の形質に適した遺伝子（本発明に従って調製された構築物）を保持するドナー近交系（「Ｂ」）（非反復親）に対して、第一の優れた近交系（「Ａ」）（反復親）を交配することによって達成されることができる。まずこの交配の子孫は、反復しない親「Ｂ」から伝達される所望の形質のために、得られた子孫中で選択され、そして選択された子孫は、上位の反復する親「Ａ」に戻し交配される。所望の形質のための選択を用いた戻し交配を５世代以上行った後、子孫は、伝達される形質を制御する遺伝子座について本質的に半接合体であるが、他のほとんど又はほとんどすべての遺伝子について上位の親のようになる。最後の戻し交配世代は、例えば１つ以上の形質転換イベントのように、伝達される遺伝子（複数可）の純粋な繁殖である子孫を与えるために自殖される（自殖が許可される）。

【0180】

一連の育種操作を通じて、選択されたＤＮＡ構築物は、さらなる組み換え操作を必要とせずに、ある系統から全く異なった系統に移動させることができる。したがって、１つ以上のＤＮＡ構築物の真の育種である近交系植物を生成することができる。異なった近交系の植物を交配することによって、ＤＮＡ構築物の様々な組み合わせを有する多数の異なったハイブリッドを生成することができる。このようにして、ハイブリッドによく関連付けられた望ましい農業特性（「ハイブリッド活力」）、および１つ以上のＤＮＡ構築物によって付与される望ましい特性を有する植物を生成することができる。

【0181】

本発明の特定のトランスジェニック植物細胞及びトランスジェニック植物では、時には、ボトリティス・シネレアの標的遺伝子の発現も調節しながら、対象となる遺伝子を発現させることが望ましい。したがって、いくつかの実施態様では、トランスジェニック植物は、関心対象となる少なくとも１つの遺伝子を発現させるための遺伝子発現要素をさらに含む組換えＤＮＡを含有し、かつ本発明の組換えＤＮＡ構築物の転写は、遺伝子発現要素の同時転写で影響される。

【0182】

本発明はまた、本発明のトランスジェニック植物細胞、植物、又は種子から生産される製品を提供し、収穫された葉、根、苗条、茎、果実、種子、又は植物の他の部分、油、抽出物、発酵物又は消化生成物、又は本発明のトランスジェニック植物細胞、植物、又は種子から生産されるそのような製品を含む任意の食品又は非食品製品を含むが、これらに限定されない。本明細書で意図される１つ以上の商品又は製品において、本発明の組換えＤＮＡ構築物の１つ以上の核酸配列の検出は、商品又は製品が、本発明のトランスジェニック植物細胞、植物、又は種子を含有するか、又は由来することの事実上の証拠である。

【0183】

一般的に、本発明の組換えＤＮＡ構築物またはその一部分を有するトランスジェニック植物のゲノムは、ボトリティス・シネレア感染に対する強化された耐性を示す。様々な実施態様では、例えば、トランスジェニック植物が、追加の形質を付与するために他の組換えＤＮＡと積み重ねられた本発明の組換えＤＮＡ構築物を発現する場合、トランスジェニック植物は、組換えＤＮＡ構築物を欠いている植物と比較して、以下、
（ａ）強化された非生物的ストレス耐性、
（ｂ）強化された生物的ストレス耐性、
（ｃ）改変された一次代謝産物組成、
（ｄ）改変された二次代謝産物組成、
（ｅ）改変された微量要素、カロテノイド、又はビタミン組成、
（ｆ）強化された収量、
（ｇ）強化された窒素、リン酸、その他の栄養素を使用する能力、
（ｈ）改変された農業特性、
（ｉ）改変された成長又は繁殖特性、及び
（ｊ）強化された収穫、貯蔵又は加工品質
からなる形質の群より選択される、少なくとも１つの追加の改変された形質を有する。

【0184】

いくつかの実施態様では、トランスジェニック植物は、非生物的ストレス（例えば、水不足や干ばつへの耐性、暑さ、寒さ、最適でない栄養素又は塩分レベル、最適でない光レベル）又は生物的ストレス（例えば、密集、アレロパシー、又は負傷）により、改善された耐性一次代謝産物（例えば、脂肪酸、油、アミノ酸、タンパク質、糖、炭水化物）組成により、改変された二次代謝産物（例えば、アルカロイド、テルペノイド、ポリケチド、非リボソームペプチド、及び混合生合成由来の二次代謝産物）の組成、改変された微量元素（例えば、鉄、亜鉛）、カロテノイド（例えば、β－カロテン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、又はその他のカロテノイド及びキサントフィル）、又はビタミン（例えば、トコフェロール）組成、改善された収量（例えば、非ストレス条件下での改善された収量又は生物的又は非生物的ストレス下での改善された収量）、窒素、リン酸、その他の栄養素の改善された使用能力、改変された農業特性（例えば追熟の遅れ、遅発性老化、早晩満期、改変されたシェード許容値、根又は茎の改善された耐倒伏性、茎の「グリーンスナップ」に対する改善された耐性、改変された光周期応答）、改変された成長又は繁殖特性（例えば、意図的矮小化、意図的な雄性不稔、例えば、ハイブリッド化の手順における改善された有用性、改善された栄養成長速度、改善された発芽、改善された雌雄繁殖能力）、改善された収穫、貯蔵、又は加工品質（例えば、貯蔵期間中の害虫に対するより強い耐性、傷つきにくさ、消費者向けアピールの強化など）、又はこれらの性質の組み合わせにより特徴づけられる。

【0185】

別の実施態様では、トランスジェニック種子、又はトランスジェニック植物によって生成された種子は、改変された一次代謝産物（例えば、脂肪酸、油、アミノ酸、タンパク質、糖、炭水化物）の組成、改変された二次代謝産物組成、改変された微量元素、カロテノイド、又はビタミン組成、改変された収穫、貯蔵、又は加工品質、又はこれらの組み合わせを有する。別の実施態様では、例えば、アレルゲン性タンパク質又は糖タンパク質のレベル又は毒性代謝物のレベルを減少させるために、トランスジェニック植物又はトランスジェニック植物の種子の天然成分のレベルを変更することが望ましい場合がある。

【0186】

一般的に、トランスジェニック植物細胞から再生されたトランスジェニック植物の集団のスクリーニングは、所望の形質を有するトランスジェニック植物に成長するトランスジェニック植物細胞を特定するために実施される。トランスジェニック植物は、増強された形質、例えば、増強された水使用効率、増強された耐寒性、増加された収量、増強された窒素使用効率、増強された種子タンパク質、増強された病気耐性、及び増強された種子油を検出するためにアッセイされる。スクリーニング方法は、温室又は野外試験での形質の直接スクリーニング、又は代替形質のスクリーニングを含む。そのような分析は、植物の化学組成、バイオマス、生理的特性、又は形態の変化を検出することを目的としている。化学組成の変化は、種子の組成、タンパク質、遊離アミノ酸、油、遊離脂肪酸、デンプン、トコフェロール、または他の栄養素の含有量を分析することによって検出されることができる。成長又はバイオマス特性の変化は、植物の高さ、茎の直径、節間の長さ、根及び苗条の乾燥重量を測定することによって検出される。生理学的特性の変化は、ストレス条件に対する反応を評価する（例えば、水分不足、窒素またはリン酸塩の欠乏、寒冷または高温の生育条件、病原体または昆虫の攻撃、光不足、または植物密度の増加などの課せられたストレス条件下でのアッセイ）ことによって特定される。その他の選抜的特性は、開花までの日数、花粉の飛散までの日数、果実の成熟までの日数、果実の品質又は生産量、葉の伸長速度、葉緑素含有量、葉の温度、林分、苗の活力、節間長、草丈、葉数、葉面積、分げつ、支柱根、緑色保持、茎の倒伏、根の倒伏、植物の健康、繁殖力、グリーンスナップ、及び害虫耐性を含む。さらに、収穫された果実または種子の表現型特性を評価することができ、例えば、植物の場合、これは、収穫された果物の総数もしくは重量、またはそのような果物の色、酸味、糖度、または風味を含むことができる。

【0187】

以下の実施例は、例示の目的のために提示されるものであって、限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0188】

概要
本実施例は、トマト、イチゴ、ブドウ、およびサヤマメを含む様々な結実植物および野菜の上のボトリティス・シネレアを防除するｄｓＲＮＡの外部からの適用の展開および有効性を強調することを目的とする。

【0189】

実施例１ インビトロ液体ベースのアッセイ
真菌培養
ボトリティス・シネレアを毎週平板培養し、培養物を、４℃で保管されるシリカ上での長期保管から、麦芽エキス寒天（ＭＥＡ）上に加えた。３つのシリカペレットをＭＥＡ寒天平板の中心に加え、使用前にパラフィルム／テープシールなしで室温で１０～１４日間増殖させた。通常、１２日間経過した培養物を使用した。

【0190】

胞子と培地の準備
ボトリティス・シネレアの純粋培養物を０．０１％のＴｒｉｔｏｎ ｘ－１００溶液で満たし、滅菌ホッケースティックで分生子をこすり落とした。懸濁液を２本の１．５ｍＬの遠心管に移し、８，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化した胞子を滅菌水で２回洗浄し、滅菌水に再懸濁した。血球計を使用して分生子を定量し、最終濃度が５，０００分生子／ｍＬストックになるまで希釈した。アッセイ設定のために、以下の成分を使用して１．２５Ｘ最少培地の原液を調製した。原液を作成すると、ＮａＯＨまたはＫＯＨを使用してｐＨを６．０に調整し、次に０．２ｕｍのフィルタータワーと真空ポンプを通過して濾過滅菌し、４℃で保管した。Ｋａｏ＆Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ Ｖｉｔａｍｉｎｓ（１００Ｘ）はフィルター滅菌原液である。Ｋａｏ＆Ｍｉｃｈａｙｌｕｋが説明されるように、原液はビタミンとアミノ酸を含む。フィルター滅菌後、１００ｍｌの溶液中の２０ｍｇの４－アミノ安息香酸を加えた。

【0191】

最少培地（ＭＭ）配合
８００ｍＬの１．２５Ｘ ＭＭを調製した。

【表1】

【0192】

硝酸塩の原液を作製するために、以下に説明される２つの部分を別々に調製し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理し、冷却してから混合した。

【0193】

２０Ｘ硝酸塩
２５０ｍＬの２０Ｘ硝酸塩を、２つの部分で調製した。

【0194】

第１部分２００ｍＬ

【表2】

【0195】

第２部分５０ｍＬ

【表3】

【0196】

実験設定
スクリーニングアッセイを、真菌バイオマスを測定する前に処理液（対照およびｄｓＲＮＡ）とともに３日間共インキュベートされている分生子を含む９６ウェルプレートに準備した。各処理を単一のプレートにおいて８回繰り返した。各ウェルは、１２．５μｌの分生子懸濁液、２５μｌの処理液、１２．５μｌの滅菌脱イオン水、および２００μｌの最少培地から構成された。各プレートをブレスライトフィルムで覆い、２４時間照明を備えた１２０ＲＰＭに設定された振盪台上の２３℃のパーシバル増殖チャンバー内に置いた。プレートに７２時間インキュベートされた後、真菌の増殖を測定した。

【0197】

アッセイプレートの読み取り
Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５機械でプレートを読み取ることによって真菌バイオマスを決定した。バイオマスを測定するために、２．５Ｘレンズを備えた明視野顕微鏡下でウェルごとに８枚の写真スライスを編集するようにプログラムを設定した。

【0198】

データ分析
分析をＣｙｔａｔｉｏｎ５で自動的に実行して、最終的なバイオマスを決定した。

【0199】

結果を表１Ｂに示し、上記の数回の実行にわたる試験された配列の対照に対するバイオマスの平均減少を表す。

【0200】

実施例２ 剥離葉アッセイ

【0201】

植物組織
ブランディワイン品種のトマトの苗を、アッセイ用の最初の本葉を収穫する前に温室で３週間育てた。収穫にノード２～４を優先させ、側尖のみをアッセイに使用した。ほぼ同じサイズの小葉を毎週使用し、処理間でランダム化した。剥離された小葉を処理のためにすぐに実験室に持ち込み、収穫後４時間以内に使用した。剥離された小葉を、処理されるまで４℃で保管し、インキュベーションのために１％水寒天培地上に置いた。

【0202】

真菌培養
ボトリティス・シネレア分離株（Ｂ０５．１０）を、長期保管のためにシリカ上に保存し、栄養培地での増殖のために４℃で保管されたこれらのチューブから抽出した。３つのシリカペレットを麦芽エキス寒天（ＭＥＡ）寒天プレートの中心に加え、パラフィルム／テープシールなしで室温で約１４日間、または使用前に豊富な分生子が形成されるまで増殖させた。

【0203】

小葉の処理
接種の２４時間前に小葉を処理し、アトマイザーを使用して小葉を完全に覆う小さな液滴の細かい霧を得た。Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７を展着剤として使用し、最終濃度が０．０３％となるように加えた（Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７ ｂｒａｎｄ Ｐｈｙｔｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓ７７７７ Ｌｏｔ＃１４Ｄ７７７７００１Ｆ）。接種された対照に、殺菌剤またはその他の実験材料のない状態で、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７を含む同じ体積の滅菌脱イオン水をスプレーした。小葉をペーパータオルの上に置き、アトマイザーを小葉から約６インチ離して適用することによって、小葉をスプレー処理した。処理された葉を１％水寒天（１Ｌの脱イオン水に１０ｇのＢａｃｔｏ Ａｇａｒ，Ｄｉｆｃｏを溶かし、１２１℃で３０分間滅菌し、５５℃の温度に達すると１００×２０ｍｍのペトリ皿に注ぐ）上に置き、翌日の接種前に湿度を維持するためにペトリ皿をビニール袋の下に置く前にペトリ皿の蓋を元に戻した。処理された小葉のペトリ皿を、翌日まで実験室のカウンターに放置した。各処理を１０回繰り返し、各繰り返しは、葉の中央脈の各側に１つずつ、２つの接種部位を有する単一の処理された小葉とした。

【0204】

接種
分生子懸濁液は、７％白ブドウジュース溶液を培養プレート上に注ぎ、滅菌スパチュラでプレートをこすり落として胞子および菌糸体を取り除くことによって調製した。ブドウジュース溶液を、Ｗｅｌｃｈ’ｓブランドの有機白ブドウジュースを滅菌脱イオン水に混合することによって調製した。培養物の胞子と菌糸体を取り除いた後、懸濁液を２層のチーズクロスを経由して注ぐことによって、真菌の菌糸体を除去し、清潔な５０ｍＬのコニカルチューブにおける分生子懸濁液を捕捉した。約３μＬのＴＷＥＥＮ ２０を分生子懸濁液に加えて、コニカルチューブへの付着を防止した。Ｎｅｕｂａｕｅｒ改良型血球計数器を使用して胞子濃度を測定し、胞子濃度が１ｘ１０^５分生子／ｍＬに達するまで、接種材料をさらに７％ブドウジュースで希釈した。接種材料を使用して、調製から２時間以内に宿主組織に接種した。各トマト小葉に対して２回接種し、接種部位を小葉の中脈の片側に１つずつ配置した。リピーターピペットを使用して、１０μＬ体積の胞子懸濁液を各接種部位に配置した。処理間の汚染を避けるために、小葉表面先端に触れないよう特別な注意を払った。

【0205】

インキュベーション
ペトリ皿を６枚の高さでランチトレイに置き、インキュベーターに移した。インキュベーターに対して湿度管理し、相対湿度を約７５％に保った。インキュベーターを１２／１２の明るい日／暗い日で保管し、温度を２３℃に設定した。

【0206】

評価
接種（ＤＰＩ）後５日目に測定を行った。病変の直径を決定するのに役立つために、発生した各病変を、電子ノギスを使用して互いに直角な２つの方向で測定した。

【0207】

データ分析
ＳＡＳ ＪＭＰ統計プログラム（バージョン１３．２．１）を使用してデータを分析し、未処理の接種された対照との比較をした。接種された対照の平均病変直径が１６ｍｍ未満である場合、アッセイを「失敗した」と見なし、より強い病害性とより一貫した病変の発生を得るためにアッセイを繰り返した。

【0208】

結果を表２に示し、上記の数回の実行にわたるテストされた配列の対照に対する病変サイズの平均減少パーセントを表す。

【0209】

実施例３．温室（全植物アッセイ）
植物組織
「Ｌａｎａｉ」品種のトマトの苗を植えた後、１８セルのトレイにおいて１ポットあたり１本の苗を残して間引きした。発芽後３週間の苗を使用して、ｄｓＲＮＡ処理を評価した。２３℃／１７℃の昼／夜温度で、２４時間ごとに１０時間の光に当てて植物を育てた。ＲＨは周囲のＲＨであり、水のみを与えた日曜日を除いて毎日、植物に肥料を１日２回与えた。実験全体にわたって、Ｆａｆａｒｄブランドの培地（７０～８０％のミズゴケピートモス、パーライト、バーミキュライト、ドロマイト石灰岩および散水剤）を使用して植物を育てた。

【0210】

真菌培養
ボトリティス・シネレアＢ０５．１０分離株を維持し、接種材料の調製にブドウジュース添加物を使用しなかったことを除き、剥離葉アッセイについて前述のものと同じように胞子を収穫した。

【0211】

植物の処理
スプレーブースを使用して、接種の約２４時間前にトマトの苗全体を処理した。０．０７％のＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７溶液を展着剤として使用し、水における最終体積が０．０７％となるように加えた（Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７ ｂｒａｎｄ Ｐｈｙｔｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓ７７７７ Ｌｏｔ＃１４Ｄ７７７７００１Ｆ）。スプレーブースのデッキを苗の冠部から２０インチ上に設置し、１００メッシュのフィルターを備えたツインジェット８００２ＥＶＳノズルをスプレー機構内に配置した。１０秒で１３３ｍＬ（＋／－６ｍＬ）の捕集量を得るために、スプレーブームを処理適用前に次のような仕様で校正した。５０ＧＰＡのレート、１．２５ＭＰＨの速度、６’のスプレー長さ、シングルパス、および４５ｐｓｉ。実験１回ごとに、これらの処理を１０回ずつ繰り返した。

【0212】

接種手動
ポンピングによって加圧されるｍｉｓｔ－ｏ－ｍａｔｉｃアプリケーターを使用して、植物への接種を行った。ＧＨ空間における接種の直前に、接種材料懸濁液をｍｉｓｔ－ｏ－ｍａｔｉｃに注いだ。容器を半分までしか満たさず、接種材料を均一の被覆で、すべての葉の表面に均一に適用した。

【0213】

インキュベーション
ＰＶＣパイプで支えられ、３Ｍ半透明プラスチックで覆われる、高さ４０インチの湿度チャンバーにおいて植物をインキュベートした。加湿器はチャンバー内にあり、低くて連続した湿度に設定された（水道水で満たされた）。温度はＤ：２４～２０℃／Ｎ：２０～１８℃、照明時間は１５時間であり、そのうちの９時間は補助照明を有した。ＲＨは周囲のＲＨであり、水やりを地下灌漑によって毎日行い、ベンチは排水前に１０分間浸水された。

【0214】

評価
２週間の実験において、トマトの苗を３回評価し、接種の４日後に評価を始め、最初の評価日から３～４日ごとに行った。病変の数と、壊死性病変、病原体胞子形成、および白化を含める症状を示す植物のパーセントである病気重症度とについて植物を評価した。

【0215】

データ分析
各配列について示されたデータは、温室においての、２回の生物学的実行（処理ごとに１０回の繰り返し）の平均である。パーセント病気重症度（％ＤＳ）は、病変、白化、壊死、および萎れを含める症状を有するトマトの葉のパーセント面積によって決定された。病気重症度は、１２日間の試験期間中の３つの日付（評価番号）に評価された。処理されたものを、未処理の接種された対照、および化学標準品と比較した。ＳＡＳ ＪＭＰバージョン１３．２．１を使用して、統計的分析を行い、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ ａｎｄ ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ Ｔ ｔｅｓｔｓを使用して、処理されたものを未処理の接種された対照および化学標準品と比較した。

【0216】

結果を表３～表１４および図１～図５に示す。

【0217】

実施例４ 野外現地試験
実施例４．１ ＧＳ３４９およびＧＳ７３０組成物によるイチゴにおけるボトリティス感染の防除
それぞれが本明細書に記載されるトリガー配列（ＧＳ３４９またはＧＳ７３０）を含むｄｓＲＮＡを含むＲＮＡｉ組成物を、野外現地試験でのイチゴにおけるボトリティス防除する能力について評価された。製剤化されていない（水に溶解した）ＧＳ３４９およびＧＳ７３０を、それぞれ水および標準アジュバントＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７ ０．１％ｖ／ｖとタンクで混合した。ＧＳ３４９はヘクタールあたり２５グラムの有効成分の濃度（ｇ ａｉ／ｈａ）および５０ｇ ａｉ／ｈａで試験し、ＧＳ７３０は１００ｇ ａｉ／ｈａの濃度で試験した。標準的な生物学的殺菌剤であるＳｅｒｅｎａｄｅ ＡＳＯ，８５ｇ ａｉ／ｈａを陽性対照として使用した。第２の陽性対照群は、化学標準品Ｔｅｌｄｏｒ Ｐｌｕｓ７５０ｇ ａｉ／ｈａ、Ｓｉｇｎｕｍ６００ｇ ａｉ／ｈａ、およびＳｗｉｔｃｈ５００ｇ ａｉ／ｈａの交互の適用により処理した。この試験はまた、未処理群を陰性対照として含む。

【0218】

イチゴの苗に、試験組成物および陽性対照を１２回の適用でスプレーした。最初の適用から１４日後から苗を観察し、病気の進行は、病気の影響を受けた果実の表面積のパーセント（％病気重症度）を測定することによって評価した。病気重症度は、試験観察期間全体にわたってプロットされ、症状進展曲線下面積（ＡＵＤＰＣ）は、複数の評価にわたる様々な処理の累積的な効果を測定するために、計算された。平均値は、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＬＳＤ，ａｌｐｈａ（ｐ）≦０．０５に従って分離された。

【0219】

結果を図６に示した。統計的有意性は、各バーにおける文字によって示された。両方の濃度でのＧＳ３４９およびＧＳ７３０は、未処理の対照に対する、ボトリティスの有意な防除を示した。ＧＳ３４９ ２５ｇ ａｉ／ｈａおよびＧＳ７３０ １００ｇ ａｉ／ｈａは、生物学的標準品であるＳｅｒｅｎａｄｅと有意な差がなかった。５０ｇ／ｈ ａｉでのＧＳ３４９は、生物学的標準品に対して大幅に改善された防除を示し、化学標準品と有意な差がなかった。

【0220】

実施例４．２ ＧＳ７３０組成物によるブドウにおけるボトリティス感染の防除
それぞれが本明細書に記載されるトリガー配列（ＧＳ７３０）を含むｄｓＲＮＡを含むＲＮＡｉ組成物を、野外現地試験でのブドウにおけるボトリティスを防除する能力について評価した。未製剤化組成物および製剤化組成物を試験した。未製剤化組成物は、水およびＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７ ０．１％ｖ／ｖとタンクで混合した。製剤化サンプルは、ＲＯ水、プロピレングリコール、直鎖アルコールエトキシレート、リグノスルファネート、クエン酸ナトリウム二水和物、ポリアクリル酸ポリマー、２つの殺生物組成物、無水クエン酸、および消泡剤で製剤化されており、これらのすべては市場から容易に入手できる。未製剤化および製剤化されたＧＳ７３０を、それぞれ５０ｇ ａｉ／ｈａおよび１００ｇ ａｉ／ｈａの濃度で試験した。ＪＭＳ Ｓｙｌｅｔ Ｏｉｌ１％ｖ／ｖと交互するＳｅｒｅｎａｄｅ９．４ｌ／ｈａの標準的な生物学的プログラムは、陽性対照として使用された。化学標準品であるＭｉｒａｖｉｓ Ｐｒｉｍｅ３９２ｇ ａｉ／ｈａ ａｉおよびＳｗｉｔｃｈ６１０ｇ ａｉ／ｈａは、交互の適用において第２の陽性対照群に適用された。未処理群を、陰性対照として使用した。

【0221】

陽性対照を、開花時に、房閉鎖時に、ベレゾン時に、および収穫の７～１０日前に、ブドウの苗に適用した。試験適用は陽性対照と同じタイミングで行われ、開花、房閉鎖、ベレゾンの７日後に、および収穫の７～１０日前に追加の適用を行った。症状を、最後の適用から２日後（スライド３）、または最後の適用の１８日前から、３～４週間にわたって評価した。パーセント病気重症度は評価され、ＡＵＤＰＣは実施例４．１に記載されるものと同じ方法で計算された。

【0222】

２つの異なった試験の結果を図７および図８に示した。統計的有意性は、各バーにおける文字によって示された。両方の試験において、両方の濃度での未製剤化ＧＳ７３０および１００ｇ ａｉ／ｈａでの製剤化ＧＳ７３０は、未処理の照合と比較してボトリティス病害の有意な減少を示し、Ｓｅｒｅｎａｄｅ及びＪＭＳ Ｓｔｙｌｅｔ Ｏｉｌの生物学的標準プログラムと統計的な差がなかった。２番目の試験では、両方の濃度での未製剤化ＧＳ７３０および１００ｇ ａｉ／ｈａでの製剤化ＧＳ７３０は、Ｍｉｒａｖｉｓ ＰｒｉｍｅおよびＳｗｉｔｃｈの化学プログラムに相当する結果を示した。

【0223】

実施例４．３ ＧＳ３４９、ＧＳ２２８０、ＧＳ２３０３、およびＧＳ２２９７組成物によるサヤマメにおけるボトリティス感染の防除
それぞれが本明細書に記載されるトリガー配列（ＧＳ３４９、ＧＳ２２８０、ＧＳ２３０３、またはＧＳ２２９７）を含むｄｓＲＮＡを含むＲＮＡｉ組成物を、野外現地試験でのサヤマメにおけるボトリティス防除する能力について評価した。すべての試験サンプルは、ＲＯ水、プロピレングリコール、直鎖アルコールエトキシレート、リグノスルファネート、クエン酸ナトリウム二水和物、ポリアクリル酸ポリマー、２つの殺生物組成物、無水クエン酸、および消泡剤で製剤化されており、これらのすべては市場から容易に入手できる。製剤サンプルは、標準的なアジュバントで非イオン性界面活性剤であるＡｃｔｉｖａｔｏｒ ９０ ０．１２５％ｖ／ｖとタンクで混合された。組成物は、１０ｇ ａｉ／ｈａ、２０ｇ ａｉ／ｈａ、および４０ｇ ａｉ／ｈａの濃度で試験した。陽性対照は、化学標準品であるＳｗｉｔｃｈ５２５ｇ ａｉ／ｈａおよび生物学的標準品であるＤｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ ＬＣ９．４ｌ／ｈａであり、両方ともＡｃｔｉｖａｔｏｒ ９０ ０．１２５％ｖ／ｖとタンクで混合された。上記のように、未処理の照合を、陰性対照として使用した。

【0224】

組成物を、エーカーあたり５０ガロンの水を送達する小区画スプレーヤーを使用して、サヤマメの苗物に適用した。各サンプルおよび各陽性対照に対して合計３回の適用を行った。症状は、最初の適用の８日後から、３回目および最後の適用の３７日後まで評価された。パーセント病気重症度は評価され、ＡＵＤＰＣは実施例４．１に記載されるものと同じ方法で計算された。

【0225】

結果を図９に示す。統計的有意性は、各バーにおける文字によって示された。すべての試験された濃度でのすべての配列は、陰性対照と比較して、ボトリティス・シネレア病害を大幅に軽減し、生物学的標準品であるＤｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌと有意差がなかった。２０ｇ ａｉ／ｈａおよび４０ｇ ａｉ／ｈａでのＧＳ３４９、１０ｇ ａｉ／ｈａおよび４０ｇ ａｉ／ｈａでのＧＳ２２８０、試験されたすべての濃度でのＧＳ２３０３、および２０ｇ ａｉ／ｈａでのＧＳ２２９７は、化学標準品での処理と比較して症状に有意差がないことをさらに示した。

【0226】

実施例４．４ ＧＳ３４９組成物によるイチゴにおけるボトリティス感染の防除
それぞれが本明細書に記載されるトリガー配列（ＧＳ３４９）を含むｄｓＲＮＡを含むＲＮＡｉ組成物を、野外現地試験でのイチゴにおけるボトリティス防除する能力について評価した。全ての試験サンプルは、実施例４．３に記載されるように製剤化され、標準的なアジュバントであるＡｃｔｉｖａｔｏｒ ９０ ０．２５％ｖ／ｖとタンクで混合された。組成物は、１０ｇ ａｉ／ｈａ、２０ｇ ａｉ／ｈａ、３０ｇ ａｉ／ｈａ、および４０ｇ ａｉ／ｈａの濃度で試験された。Ｒｅｇａｌｉａ４７０ｇ ａｉ／ｈａおよびＳｔｙｌｅｔ Ｏｉｌ６８００ｇ ａｉ／ｈａの生物学的標準プログラムは、陽性対照として使用された。Ｃａｐｔａｎ２２４０ｇ ａｉ／ｈａおよびＳｗｉｔｃｈ５２５ｇ ａｉ／ｈａの化学標準プログラムは、第２の陽性対照として使用された。未処理の照合群は、陰性対照として使用された。

【0227】

組成物は、エーカーあたり５０ガロンの水を送達する小区画スプレーヤーを使用して、イチゴの苗に適用された。５回の適用は、週１回の間隔で行われた。症状は、最初の適用の６日後から、５回目および最後の適用の１２日後まで評価された。パーセント病気重症度は評価され、ＡＵＤＰＣは実施例４．１に記載されるものと同じ方法で計算された。

【0228】

結果を図１０に示す。統計的有意性は、各バーにおける文字によって示された。すべての試験された濃度でのＧＳ３４９は、ボトリティス・シネレア病害を大幅に軽減し、化学的または生物学的標準プログラムとの有意差を示さなかった。

【0229】

表１Ａ．この研究で使用される例示的なトリガー配列のユニバーサルＩＤ番号とＳＥＱ識別

【表4】

【0230】

表１Ｂ．インビトロ液体ベースのアッセイ結果
活性は、処理後のバイオマスを未処理対照と比較してバイオマスの減少パーセントを決定することによって確認された。２つの濃度のｄｓＲＮＡは、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５機械を使用してバイオマスを測定する前に、ボトリティス・シネレア分生子とともに３日間共インキュベートされた。平均バイオマス減少は数回の生物学的実行の平均値として、それぞれにおいて各処理を８回ずつ繰り返した。

【表5】

【0231】

表２．剥離葉のアッセイ結果
活性は、２つの異なった濃度での各処理の平均病変サイズを未処理の接種された対照と比較することにより確認した。病変サイズの平均減少率は、各ｄｓＲＮＡ配列に対する２回以上の生物学的実行の平均を取ることによって計算した。

【表6】

【0232】

表３～表１４ 温室、全植物のアッセイ結果

【0233】

表３
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ３４９に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。２回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後３週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった。

【表7】

【0234】

表４
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ４１３に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。２回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後３週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった。

【表8】

【0235】

表５
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ６８６に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。２回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後３週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった。

【表9】

【0236】

表６
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ７２８に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。２回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後３週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった。

【表10】

【0237】

表７
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ７３０に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。２回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後３週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった。

【表11】

【0238】

表８
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ２２８０に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。３回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後４週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった

【表12】

【0239】

表９
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ２２９７に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。３回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後４週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった。

【表13】

【0240】

表１０
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ２３０３に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。３回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後４週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった。

【表14】

【0241】

表１１
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ２４５に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。３回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後４週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった。

【表15】

【0242】

表１２
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ６５９に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。３回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後４週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった。

【表16】

【0243】

表１３
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ７９３に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。３回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後４週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった。

【表17】

【0244】

表１４
最終評価日（評価＃３）におけるＧＳ２２９１に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析を使用する処理の平均分離率、および未処理の接種された処理と比較する対照平均パーセント。３回の実行からのデータが結合され、各実行は１０回の繰り返しを含み、それぞれの回で発芽後４週間の「Ｌａｎａｉ」トマトの苗を評価した。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ分析のｐ値は０．０５未満であった。

【表18】

【0245】

参考文献：
Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｂ．，Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ Ｂ．，Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ Ｐ．，Ｖａｎ Ｋａｎ Ｊ．Ａ．Ｌ．Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ：Ｔｈｅ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｇｒｅｙ ｍｏｕｌｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．２００７；８：５６１-５８０．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６４－３７０３．２００７．００４１７．ｘ．
Ｊａｒｖｉｓ Ｗ．Ｒ．Ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ａｎｄ ｒａｓｐｂｅｒｒｙ ｆｒｕｉｔｓ ｂｙ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｆｒ．Ａｎｎ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｌ．１９６２；５０：５６９-５７５．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１７４４－７３４８．１９６２．ｔｂ０６０４９．ｘ．
Ｗｅｉｂｅｒｇ Ａ．，Ｗａｎｇ Ｍ．，Ｌｉｎ Ｆ．－Ｍ．，Ｚｈａｏ Ｈ．，Ｚｈａｎｇ Ｚ．，Ｋａｌｏｓｈｉａｎ Ｉ．，Ｈｕａｎｇ Ｈ．－Ｄ．，Ｊｉｎ Ｈ．Ｆｕｎｇａｌ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｐｌａｎｔ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｈｉｊａｃｋｉｎｇ Ｈｏｓｔ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３；３４２：１１８-１２３．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３９７０５．
Ｑｕｓｈｉｍ Ｂ．，Ｗｕ Ｆ．，Ｇｕａｎ Ｚ．，Ｐｅｒｅｓ Ｎ．Ｔｈｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｆｒｕｉｔ ｒｏｔ ｏｎ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ２０１８ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ；Ｊａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＦＬ，ＵＳＡ．２-６ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１８．
Ｄｅａｎ Ｒ．，Ｖａｎ Ｋａｎ Ｊ．Ａ．Ｌ．，Ｐｒｅｔｏｒｉｕｓ Ｚ．Ａ．，Ｈａｍｍｏｎｄ－Ｋｏｓａｃｋ Ｋ．Ｅ．，Ｄｉ Ｐｉｅｔｒｏ Ａ．，Ｓｐａｎｕ Ｐ．Ｄ．，Ｒｕｄｄ Ｊ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｍａｎ Ｍ．，Ｋａｈｍａｎｎ Ｒ．，Ｅｌｌｉｓ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｔｏｐ １０ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．２０１２；１３：４１４-４３０．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６４－３７０３．２０１１．００７８３．ｘ．
Ｅｌａｄ，Ｙ．，Ｐｅｒｔｏｔ，Ｉ．，Ｃｏｔｅｓ Ｐｒａｄｏ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．（２０１６）Ｐｌａｎｔ Ｈｏｓｔｓ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ Ｉｎ：Ｂｏｔｒｙｔｉｓ-Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｕｓ，ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，（Ｆｉｌｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．ａｎｄ Ｅｌａｄ，Ｙ．，ｅｄｓ），ｐｐ．４１３-４８６．Ｃｈａｍ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；１０．１００７／９７８－３－３１９－２３３７１－０＿２０．
Ｌｅｒｏｃｈ，Ｍ．，Ｐｌｅｓｋｅｎ，Ｃ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｒ．Ｗ．Ｓ．，Ｋａｕｆｆ，Ｆ．，Ｓｃａｌｌｉｅｔ，Ｇ．，ａｎｄ Ｈａｈｎ，Ｍ．２０１３．Ｇｒａｙ ｍｏｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｒｍａｎ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｆｉｅｌｄｓ ｓｈｏｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ａｒｅ ｄｏｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｌａｄｅ ｃｌｏｓｅ ｔｏ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９：１５９－１６７．
Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｏｒｔｕｎｏ，Ｄ．，Ｇｒａｂｋｅ，Ａ．，Ｌｉ，Ｘ．，ａｎｄ Ｓｃｈｎａｂｌｅ，Ｇ．，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２０１５．Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｓｅｖｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ａｐｒ；１０５（４）：４２４－３２．ｄｏｉ：１０．１０９４／ＰＨＹＴＯ－０６－１４－０１６１－Ｒ．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

2024529957000001.xml

【国際調査報告】