特表 2024-529964 アセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチド及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-14

(54)【発明の名称】アセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチド及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 4/00 20060101AFI20240806BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240806BHJP

   A23L 33/18 20160101ALI20240806BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20240806BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20240806BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240806BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20240806BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240806BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20240806BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20240806BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240806BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20240806BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240806BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240806BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20240806BHJP

【ＦＩ】

C07K4/00

C12N15/11 Z ZNA

A23L33/18

A61K8/64

A61Q19/08

A61P43/00 111

A61K38/08

A61P25/00

A61P25/02

A61P25/04

A61P27/02

A61P13/10

A61P1/00

A61P17/00

C12P21/02 A

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024504903

(86)(22)【出願日】2022-07-27

(85)【翻訳文提出日】2024-03-12

(86)【国際出願番号】 KR2022011078

(87)【国際公開番号】W WO2023008913

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】10-2021-0098837

(32)【優先日】2021-07-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0092749

(32)【優先日】2022-07-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519456251

【氏名又は名称】スキンメドカンパニーリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保 斉

(72)【発明者】

【氏名】キム、ソン ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】パン、ジン ホ

(72)【発明者】

【氏名】イ、ズン フン

(72)【発明者】

【氏名】イ、ミン ホ

(72)【発明者】

【氏名】シン、ヨン チョル

(72)【発明者】

【氏名】チェ、ウォン イル

【テーマコード（参考）】

4B018

4B064

4C083

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B018LB10

4B018ME14

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA10

4C083AD411

4C083AD412

4C083CC04

4C083CC05

4C083CC06

4C083CC07

4C083CC12

4C083CC23

4C083DD08

4C083DD12

4C083DD21

4C083DD23

4C083DD27

4C083DD30

4C083DD31

4C083EE13

4C083FF01

4C084AA01

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA16

4C084MA52

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA08

4C084ZA20

4C084ZA33

4C084ZA66

4C084ZA81

4C084ZA89

4C084ZC01

4C084ZC42

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA10

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA53

4H045BA55

4H045BA56

4H045EA01

4H045EA15

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

アセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチド及びその用途に関し、従来のアセチルコリン受容体阻害ペプチドに比べて短縮されながらも高いアセチルコリン受容体との結合力及びアセチルコリン受容体作用抑制効果を有する本発明の最適化された短縮ペプチドを用いて、シワ改善用化粧料組成物、アセチルコリン受容体関連疾患の予防又は治療のための医薬品及び改善用健康機能食品を提供できる。
【選択図】 図１６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の化学式１：
［化学式１］
（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ｒ／Ｋ）
（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である）
で表現されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項2】

下記の化学式１－１：
［化学式１－１］
（Ｒ／Ｋ）ＸＹＺ（Ｒ／Ｋ）
（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、ＸＹＺは順次に並べられる任意のアミノ酸であり、ＸはＲ、Ｑ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｗから選択される１個のアミノ酸、ＹはＲ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙから選択される１個のアミノ酸、ＺはＲ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｙ、Ｑ、Ｔから選択される１個のアミノ酸である）
で表現されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項3】

前記ペプチドは、配列番号１～６００からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドである
請求項２に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項4】

下記の化学式１－２：
［化学式１－２］
ＸＲＲＱＲＲ
（ただし、前記Ｒはアルギニン、Ｑはグルタミン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である）
で表現されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項5】

前記ペプチドは、配列番号３６０１～３６２０からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドである
請求項４に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項6】

下記の化学式１－３：
［化学式１－３］
ＲＲＲＱＲＲＸ
（ただし、前記Ｒはアルギニン、Ｑはグルタミン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である）
で表現されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項7】

前記ペプチドは、配列番号３６２１～３６４０からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドである
請求項６に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項8】

下記の化学式２：
［化学式２］
（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ｒ／Ｋ）
（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である）
で表現されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項9】

下記の化学式２－１：
［化学式２－１］
（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）ＸＹＺ（Ｒ／Ｋ）
（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、ＸＹＺは順次に並べられる任意のアミノ酸であり、ＸはＲ、Ｑ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｗから選択される１個のアミノ酸、ＹはＲ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙから選択される１個のアミノ酸、ＺはＲ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｙ、Ｑ、Ｔから選択される１個のアミノ酸である）
で表現されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項10】

前記ペプチドは、配列番号１２０１～１８００からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドである
請求項９に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項11】

下記の化学式２－２：
［化学式２－２］
ＸＲＲＧＶＲＲ
（ただし、前記Ｒはアルギニン、Ｇはグリシン、Ｖはバリン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である）
で表現されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項12】

前記ペプチドは、配列番号３６４１～３６６０からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドである
請求項１１に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項13】

下記の化学式２－３：
［化学式２－３］
ＲＲＲＧＶＲＲＸ
（ただし、前記Ｒはアルギニン、Ｇはグリシン、Ｖはバリン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である）
で表現されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項14】

前記ペプチドは、配列番号３６６１～３６８０からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドである
請求項１３に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項15】

下記の化学式３：
［化学式３］
（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）
（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である）
で表現されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項16】

下記の化学式３－１：
［化学式３－１］
（Ｒ／Ｋ）ＸＹＺ（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）
（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、ＸＹＺは順次に並べられる任意のアミノ酸であり、ＸはＲ、Ｑ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｗから選択される１個のアミノ酸、ＹはＲ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙから選択される１個のアミノ酸、ＺはＲ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｙ、Ｑ、Ｔから選択される１個のアミノ酸である）
で表現されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項17】

前記ペプチドは、配列番号２４０１～３０００からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドである
請求項１６に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項18】

前記ペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端が修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されている
請求項１ないし１７のいずれかに記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項19】

前記ペプチドのＮ末端又はＣ末端が修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されたことは、パルミトイル化（ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、ホルミル化（ｆｏｒｍｙｌａｔｉｏｎ）又はぺギル化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）されるか、又は
２－メルカプト酢酸（２－ｍｅｒｃａｐｔｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、３－メルカプトプロピオン酸（３－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、６－メルカプトヘキサン酸（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ピログルタミン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、スクシンイミド酸（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ａｃｉｄ）、アミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）、システアミン（ｃｙｓｔｒａｍｉｎｅ）、メチルエステル（ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、エチルエステル（ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ベンジルエステル（ｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒ）などであり、脂肪酸結合、例えば、ミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄ）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）、コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅ）、６－アミノヘキサン酸（６－ａｍｉｎｏ ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）及び８－アミノオクタン酸（８－ａｍｉｎｏ ｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選ばれる１以上の結合による
請求項１８に記載のアセチルコリン受容体結合ペプチド。

【請求項20】

請求項１ないし１７のいずれかに記載のペプチドを暗号化（ｃｏｄｉｎｇ）する
ことを特徴とするポリヌクレオチド。

【請求項21】

請求項１ないし１７のいずれかに記載のペプチドを含む
ことを特徴とするシワ改善用化粧料組成物。

【請求項22】

請求項１ないし１７のいずれかに記載のペプチドを含む
ことを特徴とするアセチルコリン受容体過剰活性関連疾患予防又は治療用組成物。

【請求項23】

前記アセチルコリン受容体過剰活性関連疾患は、
頸部筋緊張異常症（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｄｙｓｔｏｎｉａ）、四肢緊張異常症（ｌｉｍｂ ｄｙｓｔｏｎｉａ）、体部筋肉緊張異常症（ｔｒｕｎｃａｌ ｄｙｓｔｏｎｉａ）、眼瞼痙攣（ｂｌｅｐｈａｒｏｓｐａｓｍ、顔震）、痙縮（ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）、片側顔面痙攣（ｈｅｍｉｆａｃｉａｌ ｓｐａｓｍ）、斜視（ｓｔｒａｂｉｓｍｕｓ）、眼震（ｎｙｓｔａｇｍｕｓ）、チック（ｔｉｃｓ）、慢性疼痛（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ）、慢性片頭痛（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｉｇｒａｉｎｅ）、神経因性膀胱（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｂｌａｄｄｅｒ）、排尿筋括約筋協調障害（ｄｅｔｒｕｓｏｒ－ｓｐｈｉｎｃｔｅｒ ｄｙｓｓｙｎｅｒｇｉａ）、食道弛緩不能症（ａｃｈａｌａｓｉａ ｃａｒｄｉａ）、多汗症（ｈｙｐｅｒｈｉｄｒｏｓｉｓ）、 神経病性疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ）、皮膚のシワ、角張った顎、及び唾液分泌過剰（ｓｉａｌｏｒｒｈｅａ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である
請求項２２に記載のアセチルコリン受容体過剰活性関連疾患予防又は治療用組成物。

【請求項24】

請求項１ないし１７のいずれかに記載のペプチドを含む
ことを特徴とするアセチルコリン受容体過剰活性関連疾患改善用健康機能食品組成物。

【請求項25】

請求項１ないし１７のいずれかに記載のペプチドを含む
ことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチドを含む医療機器用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチド及びその用途に関し、より具体的には、ペプチドの最適化のためにアセチルコリン受容体と結合してその作用を抑制する上で重要な特定アミノ酸が一定の式で表現されるアセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチド及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

アセチルコリン（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）は、動物の神経組織に存在する化学物質であり、神経の末端から分泌され、神経の刺激を筋肉に伝達する役割を担う。神経末端から分泌される伝達物質としては、運動神経及び副交感神経ではアセチルコリンが、交感神経ではエピネフリン（アドレナリン）が知られている。アセチルコリンが分泌されると、血圧降下、心臓搏動抑制、腸管収縮、骨格筋収縮などの生理作用を示す。筋肉が収縮する際には、神経が筋肉に収縮しろとの命令を下し、これに応じて筋肉が収縮するが、その命令により、神経と筋肉とが会う部分（神経－筋接合部）で神経がアセチルコリンを分泌し、この物質が筋肉のアセチルコリン受容体に接合して筋肉が収縮することになる（非特許文献１：Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ａ．，１９８５；Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９７６）。大腿部骨格筋を支配する末梢のアセチルコリン受容体を遮断すると筋肉運動の麻痺が起き、呼吸又は心臓運動を担当する平滑筋及び心臓筋のアセチルコリン受容体を遮断すると呼吸、心臓運動の麻痺が起きる。

【0003】

アセチルコリン受容体は、ムスカリン性アセチルコリン受容体（ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｍＡｃｈＲ）とニコチン性アセチルコリン受容体（ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｎＡｃｈＲ）とに分類される。ムスカリン性アセチルコリン受容体は、ムスカリン（ｍｕｓｃａｒｉｎｅ）で活性化させ得るＧタンパク結合受容体（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であり、亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）によって異なる信号伝達機序を活性化させる。ムスカリン性アセチルコリン受容体は、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）及び末梢臓器（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｏｒｇａｎ）を含めて全身に分布しており、主に副交感神経系（ｐａｒａｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）の神経節後線維から分泌されるアセチルコリンの生理的作用を媒介する役割を担う。

【0004】

ニコチン性アセチルコリン受容体は、ニコチン（ｎｉｃｏｔｉｎｅ）による薬理作用を摸倣する受容体であり、神経伝達物質によって操作されるイオンチャネル（ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ）である。イオンチャネルの開放及び閉鎖によってナトリウム、カリウム、カルシウムイオンなどを非選択的に通過させる非選択的陽イオン通路であって、神経細胞と筋肉細胞間の電気的信号伝達（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を調節する。ニコチン性アセチルコリン受容体は、発現部位によって、筋肉型（ｍｕｓｃｌｅ ｔｙｐｅ）と神経型（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｙｐｅ）とに分類される。筋肉型ニコチン性アセチルコリン受容体は、運動神経（ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ）と骨格筋（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）とが会う神経筋肉接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に発現しており、運動神経で分泌されたアセチルコリンが骨格筋細胞膜の終板電位（ｅｎｄ ｐｌａｔｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＥＰＰ）を誘発するのに寄与する。一方、神経型ニコチン性アセチルコリン受容体は、自律神経系（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ，ＡＮＳ）の末梢神経節（ｇａｎｇｌｉａ）に発現しているので、神経節前線維（ｐｒｅｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ ｆｉｂｅｒ）から分泌されたアセチルコリンが神経節後線維（ｐｏｓｔｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ ｆｉｂｅｒ）を興奮させるのに寄与する。

【0005】

アセチルコリンの活性を妨害或いは阻害したり或いは行動を摸倣する薬物が非常に有用に用いられている。アセチルコリン受容体作用剤は、重症筋無力症とアルツハイマー病を治療するのに用いられる。重症筋無力症は、身体でニコチン性アセチルコリン受容体に対する抗体を生産し、正常のアセチルコリン信号伝達を阻害することから生じる自己免疫疾患であり、アセチルコリンエステラーゼ（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ，ＡＣｈＥ）阻害剤を用いて、神経と筋肉との間のシナプス隙間でアセチルコリンが不活性化する前に各受容体と相互作用し得る時間を増やすことで、重症筋無力症を治療することができる。

【0006】

また、アセチルコリンの分泌を妨害すると、筋肉の収縮を抑制して筋肉が麻痺しながらシワが伸びるが、これを用いたのがボトックス（ｂｏｔｏｘ）である。ボトックスは、運動神経の末端において筋肉の収縮に必須の物質であるアセチルコリンが分泌される過程を妨げる。その結果、筋肉が動けなくなり、筋肉によって誘発されたシワがなくなる。ボトックスによる筋弛緩効果は３～６週後に次第に消えるため、反復投与が必要である。

【0007】

また、アセチルコリンがアセチルコリン受容体に結合することを阻害してシワを伸ばす機序を用いて化粧品用ペプチドを開発したが、これがＤＳＭ社のシンエイク（Ｓｙｎａｋｅ）である。これは、蛇毒由来ペプチドで、シワ改善ペプチドの中で最良の臨床効果（約５２％）を保有しているもので、ペプチド化粧品原料として多く使用されている。

【0008】

そこで、本発明者らは、アセチルコリン受容体結合ペプチドを研究しながら、アセチルコリン受容体との結合力が高いペプチドをスクリーニングして確保し、このようなペプチドがアセチルコリン受容体と結合してアセチルコリン結合を防止することによってアセチルコリン受容体作用を抑制するということを確認した。しかしながら、アセチルコリン受容体結合ペプチドがペプチド断片として提供されることにより、ペプチドの長さが長くなる場合には製造単価が上昇し、化粧料として製造した時に皮膚透過能が低下する問題があった。そのため、アセチルコリン受容体との高い結合力を維持しながらも、より短縮したペプチドに対する研究が必要であった。

【0009】

従来先行技術として、本発明者の先行技術である特許文献１：韓国公開特許第１０－２０２０－００８０１７９号には、アセチルコリン受容体阻害ペプチド及びその用途が記載されているが、アセチルコリン受容体阻害ペプチドとして８ｍｅｒ、１１ｍｅｒ、１４ｍｅｒ及び１８ｍｅｒのペプチドが記載されているだけで、本発明の最適化された短縮ペプチド及びその効果は記載されていない。また、韓国登録特許第１２１６００８号には、バイオパンニングを用いて選別した、アセチルコリン受容体に結合するペプチドが記載されているが、本発明のアミノ酸配列を含むペプチド及びライブラリーは記載されていない。

【0010】

また、特許文献２：韓国公開特許第２０１８－００２８７４８号には、アセチルコリンを含む神経伝達物質放出調節ペプチド及びそのシワ改善効果が記載されているが、本発明のアミノ酸配列を含むペプチドのアセチルコリン受容体結合力及びこれによるアセチルコリン受容体作用抑制効果は記載されていない。特許文献３：韓国公開特許第２０１４－０１３９０１０号には経皮透過促進のためのペプチドが記載されているが、本発明のアセチルコリン受容体結合を用いた作用抑制ペプチドとは構成及び効果に相違がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】韓国公開特許第１０－２０２０－００８０１７９号

【特許文献2】韓国公開特許第２０１８－００２８７４８号

【特許文献3】韓国公開特許第２０１４－０１３９０１０号

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ａ．，１９８５；Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９７６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明の目的は、アセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチドを提供することにある。また、本発明の目的は、前記アセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチド最適化短縮ペプチドを提供することにある。

【0014】

本発明の他の目的は、アセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチドを含むシワ改善用化粧料組成物を提供することにある。また、本発明の目的は、アセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチドを含むアセチルコリン受容体過剰活性関連疾患予防又は治療用組成物を提供することにある。

【0015】

本発明の目的は、アセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチドを含むアセチルコリン受容体過剰活性関連疾患改善用健康機能食品組成物及び医療機器用組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0016】

上記の課題を達成するために、本発明は、アセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチドを提供する。

【0017】

本発明において、「アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」又は「任意のアミノ酸」とは、ペプチド分野において合成ペプチドを製造するために使用される天然アミノ酸及びその他アミノ酸、例えば、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、塩基配列として暗号化されていないアミノ酸などのＬ－及びＤ－異性質体のいずれをも含む。

【0018】

前記天然アミノ酸は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ，Ａｌａ，Ａ）、システイン（ｃｙｓｔｅｎｉｎ，Ｃｙｓ，Ｃ）、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ，Ａｓｐ，Ｄ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，Ｐｈｅ，Ｆ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ，Ｇｌｙ，Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｈｉｓ，Ｈ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉｌｅ，Ｉ）、リジン（ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ，Ｌｅｕ，Ｌ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍｅｔ，Ｍ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ａｓｎ，Ｎ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｐｒｏ，Ｐ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｇｌｎ，Ｑ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ，Ｒ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓｅｒ，Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，Ｔｈｒ，Ｔ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖａｌ，Ｖ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｔｒｐ，Ｗ）、及びチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｔｙｒ，Ｙ）であってよい。

【0019】

前記その他アミノ酸は、２－アミノアジピン酸（２－ａｍｉｎｏａｄｉｐｉｃ ａｃｉｄ，２－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アスパラギン（α－ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、２－アミノブタン酸（２－ａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、２－アミノカプリン酸（２－ａｍｉｎｏｃａｐｒｉｃ ａｃｉｄ，２－ａｍｉｎｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－グルタミン（α－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、α－アミノイソ酪酸（α－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，α－ｍｅｔｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）、２－アミノピメリン酸（２－ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ ａｃｉｄ，２－ａｍｉｎｏｈｅｐａｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、γ－アミノ－β－ヒドロキシベンゼンペンタン酸（γ－ａｍｉｎｏ－β－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、２－アミノスベリン酸（２－ａｍｉｎｏｓｕｂｅｒｉｃ ａｃｉｄ，２－ａｍｉｎｏｏｃｔａｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２－カルボキシアゼチジン（２－ｃａｒｂｏｘｙａｚｅｔｉｄｉｎｅ）、β－アラニン（β－ａｌａｎｉｎｅ）、β－アスパラギン酸（β－ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、３，６－ジアミノヘキサン酸（３，６－ｄｉａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ，β－ｌｙｓｉｎｅ）、ブタン酸（ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸（４－ａｍｉｎｏ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、γ－アミノ－β－ヒドロキシシクロヘキサンペンタン酸（γ－ａｍｉｎｏ－β－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３－シクロヘキシルアラニン（３－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｌａｎｉｎｅ）、Ｎ５－アミノカルボニルオルニチン（Ｎ５－ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、３－スルホアラニン（３－ｓｕｌｆｏａｌａｎｉｎｅ）、２，４－ジアミノプロパン酸（２，３－ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、２，７－ジアミノスベリン酸（２，７－ｄｉａｍｉｎｏｓｕｂｅｒｉｃ ａｃｉｄ、２，７－ｄｉａｍｉｎｏｏｃｔａｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、Ｓ－エチルチオシステイン（Ｓ－ｅｔｈｙｌｔｈｉｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）、γ－グルタミン酸（γ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、γ－カルボキシグルタミン酸（γ－ｃａｒｂｏｘｙｌｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドロキシ酢酸（ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ピログルタミン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ホモアルギニン（ｈｏｍｏｇｒｇｉｎｉｎｅ）、ホモシステイン（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ホモヒスチジン（ｈｏｍｏｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、２－ヒドロキシイソ吉草酸（２－ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ホモセリン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ）、２－ヒドロキシペンタン酸（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、５－ヒドロキシリジン（５－ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ）、４－ヒドロキシプロリン（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）、イソバリン（ｉｓｏｖａｌｉｎｅ）、２－ヒドロキシプロパン酸（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、メルカプト酢酸（ｍｅｒｃａｐｔｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、メルカプトブタン酸（ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３－ヒドロキシ－４－メチルプロリン（３－ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｌｉｎｅ）、メルカプトプロパン酸（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３－ナフチルアラニン（３－ｎａｐｈｔｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）、ノルロイシン（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）、ノルチロシン（ｎｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅ）、ノルバリン（ｎｏｒｖａｌｉｎｅ）、２－カルボキシオクタヒドロインドール（２－ｃａｒｂｏｘｙｏｃｔａｈｙｄｒｏｉｎｄｏｌｅ）、オルニチン（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、ペニシラミン（ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ、３－ｍｅｒｃａｐｔｏｖａｌｉｎｅ）、２－フェニルグリシン（２－ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、２－カルボキシピぺリジン（２－ｃａｒｂｏｘｙｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）、サルコシン（ｓａｒｃｏｓｉｎｅ，Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、１－アミノ－１－カルボキシシクロペンタン（１－ａｍｉｎｏ－１－ｃａｒｂｏｘｙｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅ）、スタチン（ｓｔａｔｉｎ，４－ａｍｉｎｏ－３－ｈｙｄｒｏｘｙ－６－ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３－チエニルアラニン（３－ｔｈｉｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、３－カルボキシイソキノリン（３－ｃａｒｂｏｘｙｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、３－メチルバリン（３－ｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ）、ε－Ｎ－トリメチルリジン（ε－Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ）、３－チアゾリルアラニン（３－ｔｈｉａｚｏｌｙｌａｌａｎｉｎｅ）、α－アミノ－２，４－ジオキソピリミジンプロパン酸（α－ａｍｉｎｏ－２，４－ｄｉｏｘｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）などであってよい。

【0020】

本発明において、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、アミド結合又はペプチド結合で連結された２個以上のアミノ酸からなるポリマーを意味する。

【0021】

本発明において、「アセチルコリン受容体（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡｃｈＲ）」は、神経の末端から分泌されるアセチルコリンが結合する受容体で、アセチルコリンによる神経の刺激を伝達する通路として働く。例えば、筋肉の収縮が必要な場合に、神経が筋肉に収縮しろとの命令を下せば、神経と筋肉とが出会う部分で神経がアセチルコリンを分泌し、分泌されたアセチルコリンが筋肉のアセチルコリン受容体に結合することで筋肉が収縮する。

【0022】

本発明のアセチルコリン受容体は、ムスカリン性アセチルコリン受容体とニコチン性アセチルコリン受容体とに分類され、本発明のアセチルコリン受容体は、ニコチン性アセチルコリン受容体が好ましい。

【0023】

本発明は、下記の化学式１で表現されるアミノ酸配列からなるアセチルコリン受容体結合ペプチドを提供する。

【0024】

［化学式１］

【0025】

（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ｒ／Ｋ）

【0026】

（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である。）

【0027】

前記ペプチドは５個のアミノ酸配列からなり、１番目及び5番目アミノ酸はそれぞれアルギニン又はリジンであり、２、３及び４番目の配列は、任意のアミノ酸であるペプチドである。

【0028】

前記アセチルコリン受容体結合ペプチドは、上記の［化学式１］で表現される５個のアミノ酸配列からなり、１番目及び５番目のアミノ酸であるＫ又はＲがアセチルコリン受容体結合において重要な部位であってよい。上記の［化学式１］で表現されるアミノ酸配列であって、２番目、３番目及び４番目のアミノ酸が任意のアミノ酸であってよく、これは、１番目及び５番目のアミノ酸がＫ又はＲであれば、２番目、３番目及び４番目のアミノ酸の種類が変わっても一定以上のアセチルコリン受容体結合能力を示し得ることを意味する。

【0029】

本発明は、下記の化学式１－１で表現されるアミノ酸配列からなるアセチルコリン受容体結合ペプチドを提供する。

【0030】

［化学式１－１］

【0031】

（Ｒ／Ｋ）ＸＹＺ（Ｒ／Ｋ）

【0032】

（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、ＸＹＺは順次に並べられる任意のアミノ酸であり、ＸはＲ、Ｑ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｗから選択される１個のアミノ酸、ＹはＲ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙから選択される１個のアミノ酸、ＺはＲ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｙ、Ｑ、Ｔから選択される１個のアミノ酸である。）

【0033】

また、上記の化学式１－１で表現されるアミノ酸配列のペプチドは、配列番号１～６００からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドであってよい。

【0034】

本発明は、下記の化学式１－２で表現されるアミノ酸配列からなるアセチルコリン受容体結合ペプチドを提供する。

【0035】

［化学式１－２］

【0036】

ＸＲＲＱＲＲ

【0037】

（ただし、前記Ｒはアルギニン、Ｑはグルタミン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である。）

【0038】

上記の化学式１－２で表現されるアミノ酸配列のペプチドは、配列番号３６０１～３６２０からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドであってよい。

【0039】

本発明は、下記の化学式１－３で表現されるアミノ酸配列からなるアセチルコリン受容体結合ペプチドを提供する。

【0040】

［化学式１－３］

【0041】

ＲＲＱＲＲＸ

【0042】

（ただし、前記Ｒはアルギニン、Ｑはグルタミン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である。）

【0043】

上記の化学式１－３で表現されるアミノ酸配列のペプチドは、配列番号３６２１～３６４０からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドであってよい。

【0044】

本発明は、下記の［化学式２］で表現されるアミノ酸配列からなるアセチルコリン受容体結合ペプチドを提供する。

【0045】

［化学式２］

【0046】

（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ｒ／Ｋ）

【0047】

（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である。）

【0048】

前記アセチルコリン受容体結合ペプチドは、上記の［化学式２］で表現される６個のアミノ酸配列からなり、１番目、２番目及び６番目のアミノ酸であるＫ又はＲが、アセチルコリン受容体結合において重要な部位であってよい。上記の［化学式２］で表現されるアミノ酸配列であって、３番目、４番目及び５番目のアミノ酸が任意のアミノ酸であって、これは、１番目、２番目及び６番目のアミノ酸がＫ又はＲであれば、３番目、４番目及び５番目のアミノ酸の種類が変わっても一定以上のアセチルコリン受容体結合能力を示し得ることを意味する。

【0049】

本発明は、下記の化学式２－１で表現されるアミノ酸配列からなるアセチルコリン受容体結合ペプチドを提供する。

【0050】

［化学式２－１］

【0051】

（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）ＸＹＺ（Ｒ／Ｋ）

【0052】

（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、ＸＹＺは順次に並べられる任意のアミノ酸であり、ＸはＲ、Ｑ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｗから選択される１個のアミノ酸、ＹはＲ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙから選択される１個のアミノ酸、ＺはＲ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｙ、Ｑ、Ｔから選択される１個のアミノ酸である。）

【0053】

上記の化学式２－１で表現されるアミノ酸配列のペプチドは、配列番号１２０１～１８００からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドであってよい。

【0054】

本発明は、下記の化学式２－２で表現されるアミノ酸配列からなるアセチルコリン受容体結合ペプチドを提供する。

【0055】

［化学式２－２］

【0056】

ＸＲＲＧＶＲＲ

【0057】

（ただし、前記Ｒはアルギニン、Ｇはグリシン、Ｖはバリン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である。）

【0058】

上記の化学式２－２で表現されるアミノ酸配列のペプチドは、配列番号３６４１～３６６０からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドであってよい。

【0059】

本発明は、下記の化学式２－３で表現されるアミノ酸配列からなるアセチルコリン受容体結合ペプチドを提供する。

【0060】

［化学式２－３］

【0061】

ＲＲＧＶＲＲＸ

【0062】

（ただし、前記Ｒはアルギニン、Ｇはグリシン、Ｖはバリン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である。）

【0063】

上記の化学式２－３で表現されるアミノ酸配列のペプチドは、配列番号３６６１～３６８０からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドであってよい。

【0064】

本発明は、下記の［化学式３］で表現されるアミノ酸配列からなるアセチルコリン受容体結合ペプチドを提供する。

【0065】

［化学式３］

【0066】

（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）

【0067】

（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、Ｘは１個の任意のアミノ酸である。）

【0068】

前記アセチルコリン受容体結合ペプチドは、上記の［化学式３］で表現される６個のアミノ酸配列からなり、１番目、５番目及び６番目のアミノ酸であるＫ又はＲがアセチルコリン受容体結合において重要な部位であってよい。上記の［化学式３］で表現されるアミノ酸配列であって、２番目、３番目及び４番目のアミノ酸が任意のアミノ酸であってよく、これは、１番目、５番目及び６番目のアミノ酸がＫ又はＲであれば、２番目、３番目及び４番目のアミノ酸の種類が変わっても一定以上のアセチルコリン受容体結合能力を示し得ることを意味する。

【0069】

本発明は、下記の化学式３－１で表現されるアミノ酸配列からなるアセチルコリン受容体結合ペプチドを提供する。

【0070】

［化学式３－１］

【0071】

（Ｒ／Ｋ）ＸＹＺ（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）

【0072】

（ただし、前記Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジン、ＸＹＺは順次に並べられる任意のアミノ酸であり、ＸはＲ、Ｑ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｗから選択される１個のアミノ酸、ＹはＲ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙから選択される１個のアミノ酸、ＺはＲ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｙ、Ｑ、Ｔから選択される１個のアミノ酸である。）

【0073】

上記の化学式３－１で表現されるアミノ酸配列のペプチドは、配列番号２４０１～３０００からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列のペプチドであってよい。

【0074】

前記アセチルコリン受容体結合ペプチドのアミノ酸配列は、本発明の先行特許である大韓民国公開特許第１０－２０２０－００８０１７９号に記載されたアミノ酸配列を除外する。前記大韓民国公開特許第１０－２０２０－００８０１７９号に記載されたアミノ酸配列はＲＫＳＬＬＲを含む。

【0075】

本発明は、前記ペプチドのＮ末端又はＣ末端が修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されたことを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチドに関する。

【0076】

前記Ｎ末端又はＣ末端が修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されたものは、パルミトイル化（ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、ホルミル化（ｆｏｒｍｙｌａｔｉｏｎ）又はぺギル化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）されるか、又は２－メルカプト酢酸（２－ｍｅｒｃａｐｔｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、３－メルカプトプロピオン酸（３－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、６－メルカプトヘキサン酸（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ピログルタミン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、スクシンイミド酸（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ａｃｉｄ）、アミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）、システアミン（ｃｙｓｔｒａｍｉｎｅ）、メチルエステル（ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、エチルエステル（ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ベンジルエステル（ｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒ）などであり、脂肪酸結合、例えば、ミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄ）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）、コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅ）、６－アミノヘキサン酸（６－ａｍｉｎｏ ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）及び８－アミノオクタン酸（８－ａｍｉｎｏ ｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選ばれる１以上の結合によることを特徴とするアセチルコリン受容体結合ペプチドであってよい。

【0077】

本発明のペプチドは、当分野に広く公知された方法で得ることができる。具体的には、遺伝子組換えとタンパク質発現システムを用いて製造したり、或いはペプチド合成のような化学的合成方法によって試験管内で合成する方法及び無細胞タンパク質合成法などで製造することができる。より具体的には、当分野でよく知らされた方法、例えば、自動ペプチド合成器で合成でき、遺伝子操作技術で生産できるが、これに制限されるものではない。例えば、遺伝子操作によって融合パートナーと本発明のペプチドからなる融合タンパク質を暗号化する遺伝子を製造し、製造された遺伝子を宿主微生物に形質転換させた後、宿主微生物において融合タンパク質の形態で発現させ、タンパク質分解酵素又は化合物を用いて融合タンパク質から本発明のペプチドを切断、分離し、所望のペプチドを生産することができる。

【0078】

本発明のペプチドは、塩の形態で存在してもよい。本発明に利用可能な塩の形態は、化合物の最終分離及び精製中に又はアミノ基を適切な酸と反応させることによって作られるものであってよい。例えば、酸付加塩として、アセテート、アジフェート、アルジネート、シトレート、アスパルテート、ベンゾエート、ベンゼンスルホネート、ビサルフェート、ブチレート、カンフォレート、カンフォスルホネート、ジグルコネート、グリセロホスフェート、ヘミサルフェート、ヘプタノエート、ヘキサノエート、ホルメート、フマレート、ヒドロクロリド、ヒドロブロミド、ヒドロヨージド、２－ヒドロキシエタンスルホネート、ラクテート、マレエート、メシチレンスルホネート、メタンスルホネート、ナフチレンスルホネート、ニコチネート、２－ナフタレンスルホネート、オキサレート、パモエート、ペクチネート、ペルサルフェート、３－フェニルプロピオネート、ピクレート、ピバレート、プロピオネート、サクシネート、タルトレート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ホスフェート、グルタメート、ビカーボネート、パラ－トルエンスルホネート及びウンデカノエートであってよいが、これに限定されるものではない。また、酸付加塩を形成するために使用可能な酸の例には、塩酸、ブロム化水素酸、硫酸及びリン酸のような無機酸、並びにシュウ酸、マレ酸、コハク酸及びクエン酸のような有機酸であってよいが、これに限定されるものではない。

【0079】

前記ペプチドは、標的化配列、タグ（ｔａｇ）、標識された残基、半減期又はペプチドの安定性を増加させるための目的で考案されたアミノ酸配列の追加、標的化、効能増加又は安定性を増加させるための抗体又は抗体切片、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などとの結合又はペプチドのＮ末端又はＣ末端を修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）させることができる。

【0080】

前記「抗体」は、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。好ましくは、前記抗体は、特定タンパク質又はその免疫原性断片に対して特異的に結合する抗体を意味し、単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｍＡｂ）、多クローン抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｐＡｂ）及び組換え抗体のいずれをも含むことができる。前記抗体は、当業界に広く公知された技術を用いて容易に製造することができる。

【0081】

前記抗体は、２本の全長軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）及び２本の全長重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を有する完全な形態の他に、抗体分子の機能的な断片も含むことができる。抗体分子の機能的断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖなどがある。

【0082】

前記ペプチドは、特定組織への伝達又は安定性確保のために、ナノ粒子、マイクロ粒子、金属粒子、セラミック粒子、ヒドロゲルなどに内包又は固定化できるが、これに限定されない。

【0083】

前記ナノ粒子、マイクロ粒子、金属粒子、セラミック粒子、ハイドロゲルなどは生体適合的であり、毒性のないものであってよい。

【0084】

前記アセチルコリン受容体結合ペプチドはアセチルコリン受容体に結合し、アセチルコリンが受容体に結合することを防止してアセチルコリン受容体作用を抑制させることができる。好ましくは、筋肉の収縮を抑制してシワ改善、正常でない筋肉収縮抑制効果を呈し、手術時に筋肉の弛緩を促進して手術の便宜性を確保することができる。

【0085】

また、本発明は、前記アセチルコリン受容体結合ペプチドを暗号化するポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を提供する。前記アセチルコリン受容体に対して結合活性を示し得るペプチドを暗号化できる限り、前記ポリヌクレオチドをなしている塩基配列と相同性を示す塩基配列を含むポリヌクレオチドも、本発明で提供するポリヌクレオチドの範ちゅうに含まれ得る。好ましくは、８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、より好ましくは、９０％以上の相同性を示す塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、最も好ましくは、９５％以上の相同性を示す塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

【0086】

本発明は、また、前記アセチルコリン受容体結合ペプチドを含むシワ改善用化粧料組成物を提供する。

【0087】

前記アセチルコリン受容体結合ペプチドは、アセチルコリン受容体作用を抑制して筋肉の収縮が起きることを防止し、シワを改善することができる。

【0088】

前記化粧料組成物は、前記アセチルコリン受容体結合ペプチド及び化粧料分野で通常用いられる補助剤、例えば、親水性又は親油性ゲル化剤、親水性又は親油性活性剤、保存剤、抗酸化剤、溶媒、芳香剤、充填剤、遮断剤、顔料、吸臭剤又は染料を含有できる。

【0089】

前記補助剤の量は、当該分野で通常使用される量であり、いずれの場合においても、補助剤及びその比率は、本発明に係る化粧料組成物の好ましい性質に悪影響を及ぼさないように選択できる。

【0090】

前記シワ改善用化粧料組成物は、追加の添加剤を含んで製造することができる。

【0091】

前記添加剤は、保湿剤（ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｅｒ）、機能性原料、増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ）、柔軟剤、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、界面活性剤及びｐＨ調節剤などであってよい。

【0092】

前記保湿剤には、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）及びセラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）成分などであってよいが、これに限定されない。

【0093】

前記増粘剤としては、ポリマー、キサンタンガム、グアーガムであってよいが、これに限定されない。

【0094】

前記柔軟剤としては、ミネラルオイル、シアバター（ｓｈｅａ ｂｕｔｔｅｒ）、パラフィンであってよいが、これに限定されない。

【0095】

前記乳化剤としては、ジメチコン、ビーズワックスなどであってよい。

【0096】

前記シワ改善用化粧料組成物は、シワ改善効果のある原料と混合して使用することができる。

【0097】

前記シワ改善効果のある原料は、ビタミンＡ、ビタミンＡ誘導体（パルミチン酸レチニル、酢酸レチニルなど）、アデノシン、ポリエトキシル化レチンアミドであってよいが、これに限定されない。

【0098】

前記化粧料組成物は、ローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、クリーム、ファンデーション、エッセンス、パック、マスクパック、石鹸、ボディークレンザー、クレンジングフォーム、ボディーオイル及びボディーローションからなる群から選ばれる一つ以上の剤形であってよいが、これに制限されない。

【0099】

前記化粧料組成物は毎日使用してもよく、また、定められていない期間に使用してもよく、好ましくは、使用者の年齢、皮膚状態又は皮膚タイプによって使用量、使用回数及び期間を調節することができる。

【0100】

また、本発明は、前記アセチルコリン受容体結合ペプチドを含むアセチルコリン受容体過剰活性関連疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供する。

【0101】

前記薬学組成物は、アセチルコリン受容体と結合してアセチルコリン受容体活性化を抑制することにより、前記アセチルコリン受容体過剰活性関連疾患を予防又は治療できる。

【0102】

前記アセチルコリン受容体過剰活性関連疾患は、筋肉が非正常に過剰収縮する現象がある疾患であり、頸部筋緊張異常症（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｄｙｓｔｏｎｉａ）、四肢緊張異常症（ｌｉｍｂ ｄｙｓｔｏｎｉａ）、体部筋肉緊張異常症（ｔｒｕｎｃａｌ ｄｙｓｔｏｎｉａ）、眼瞼痙攣（ｂｌｅｐｈａｒｏｓｐａｓｍ、顔震）、痙縮（ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）、片側顔面痙攣（ｈｅｍｉｆａｃｉａｌ ｓｐａｓｍ）、斜視（ｓｔｒａｂｉｓｍｕｓ）、眼震（ｎｙｓｔａｇｍｕｓ）、チック（ｔｉｃｓ）、慢性疼痛（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ）、慢性片頭痛（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｉｇｒａｉｎｅ）、神経因性膀胱（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｂｌａｄｄｅｒ）、排尿筋括約筋協調障害（ｄｅｔｒｕｓｏｒ－ｓｐｈｉｎｃｔｅｒ ｄｙｓｓｙｎｅｒｇｉａ）、食道弛緩不能症（ａｃｈａｌａｓｉａ ｃａｒｄｉａ）、多汗症（ｈｙｐｅｒｈｉｄｒｏｓｉｓ）、 神経病性疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ）、皮膚のシワ、角張った顎、唾液分泌過剰（ｓｉａｌｏｒｒｈｅａ）、小児脳性麻痺、脳卒中後筋肉強直、腰痛、前立腺肥大症、尿失禁、声帯結節及び矯正、痔疾、痔裂などであってよい。

【0103】

また、前記薬学組成物は、手術時に筋肉の弛緩を促進して手術の便宜性を確保するために使用でき、ニコチン中毒による疾患の治療剤又は補助剤、シワ除去、角張った顎又はふくらはぎ矯正のために使用できるが、これに限定されない。

【0104】

前記薬学組成物は、前記アセチルコリン受容体結合ペプチド及び薬学的に許容可能な賦形剤を含むことができる。

【0105】

前記薬学組成物はそれぞれ、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用できる。前記薬学組成物に含有可能な担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、通常の充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記アセチルコリン受容体結合ペプチドに少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤には懸濁剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、一般に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他にも様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。

【0106】

また、剤形に特に制限はないが、軟膏剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、クリーム剤、ゲル剤及びジェルから選択される１種の剤形を有する皮膚外用剤として使用されてよい。経皮吸収を増加させる製剤、例えば、非限定的に、特にジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤、アルコール、アセトン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールを含むことができる。塗布頻度は、治療する対象の年齢、性別、体重、治療する特定疾患又は病理状態、疾患又は病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断によって相当異なってよく、塗布頻度は、毎月又は一日に１０回、好ましくは毎週又は一日に４回、より好ましくは１週に３回又は１日に３回、さらに好ましくは１日１回～２回で適用できる。

【0107】

本発明の薬学組成物は、ネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与されてよい。いかなる投与方式も考えられてよいが、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、皮膚、子宮内、硬膜又は脳血管内注射によって投与されてよい。好ましくは皮膚投与である。

【0108】

本発明は、また、前記アセチルコリン受容体結合ペプチドを含むアセチルコリン受容体過剰活性関連疾患改善用健康機能食品組成物に関する。

【0109】

前記健康機能食品組成物は、前記アセチルコリン受容体結合ペプチド及び食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含むことができる。

【0110】

本発明の健康機能食品組成物は、錠剤、カプセル剤、丸剤又は液剤などの形態を含み、本発明の アセチルコリン受容体結合ペプチドを添加できる食品には、例えば、各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。

【0111】

本発明のさらに他の態様は、前記アセチルコリン受容体結合ペプチドを含む医療機器用組成物を提供する。

【0112】

前記医療機器用組成物はフィラーであってよいが、これに限定されない。

【0113】

本発明において、「フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）」とは、皮膚組織を補充できる物質であり、顔のはりの復元、フェースライン改善、シワ緩和のために注入されて埋めることを目的とする。

【0114】

前記医療機器用組成物は、アセチルコリン受容体結合ペプチドによって筋肉の収縮を抑制してシワを緩和でき、フェースライン改善効果も得ることができ、前記アセチルコリン受容体結合ペプチドが固定された生体適合的なマイクロ粒子、ナノ粒子、ヒドロゲルなどを注入して組織を詰めることができる。

【発明の効果】

【0115】

本発明は、アセチルコリン受容体結合最適化短縮ペプチド及びその用途に関し、より具体的には、両末端にアルギニン又はリジンを含み、中央に一定アミノ酸ＸＹＺの配列を有するペンタマー及びそのＮ又はＣ末端にアルギニン又はリジンをさらに含むヘキサマーは、既存の長いペプチド又は既存のペンタマー、ヘキサマーと比較して、アセチルコリン受容体結合力に非常に優れており、皮膚透過能が向上していることを確認することによって、シワ改善用化粧料組成物、アセチルコリン受容体関連疾患の予防又は治療のための医薬品及び改善用健康機能食品として開発できることが期待される。

【図面の簡単な説明】

【0116】

【図1】先行ペプチドである１１ｍｅｒ、８ｍｅｒ及びその短縮ペプチドである６ｍｅｒのアセチルコリン受容体親和力をそれぞれシンエイクと比較した結果である。

【図2】エスペプ２の短縮ペプチドである６ｍｅｒ及び５ｍｅｒの重要シーケンスを確認するためのアラニンスキャニング結果である。

【図3】エスペプ２から得た短縮ペプチド６ｍｅｒ及び５ｍｅｒのアセチルコリン受容体に対する結合力を確認した結果である。

【図4】最適化短縮ライブラリー６ｍｅｒ－１、６ｍｅｒ－２及び５ｍｅｒのアセチルコリン受容体に対するバイオパンニングによってスクリーニングされたファージのアセチルコリン受容体結合特異性を示すグラフである。

【図5】５ｍｅｒライブラリーにおいてＸＹＺ上位反復アミノ酸組合せ及びＸＹＺ下位反復アミノ酸組合せの結合力であるＲＵ値を比較したグラフである。

【図6】６ｍｅｒ－１ライブラリーにおいてＸＹＺ上位反復アミノ酸組合せ及びＸＹＺ下位反復アミノ酸組合せの結合力であるＲＵ値を比較したグラフである。

【図7】６ｍｅｒ－２ライブラリーにおいてＸＹＺ上位反復アミノ酸組合せ及びＸＹＺ下位反復アミノ酸組合せの結合力であるＲＵ値を比較したグラフである。

【図8】エスペプ２から得た単純５ｍｅｒ（５ｍｅｒ－ＮＤ）及び６ｍｅｒ（エスペプ２－６ｍｅｒ）、及び対照群であるシンエイク（Ｓｙｎａｋｅ）と本発明に係る最適化ペプチド５ｍｅｒ（５ｍｅｒ－７３、５ｍｅｒ－３１１）及び６ｍｅｒ（６ｍｅｒ－１－４３、６ｍｅｒ－１－２１０、６ｍｅｒ－２－２３３、６ｍｅｒ－２－１３６）のアセチルコリン受容体に対する結合力を比較した結果である。

【図9】本発明に係る６ｍｅｒ－１－４３ペプチドのアセチルコリン受容体に対する濃度別親和力を確認した結果である。

【図10】シンエイク（Ｓｙｎａｋｅ）のアセチルコリン受容体に対する阻害能結果である。

【図11】本発明に係る６ｍｅｒ－１－４３及び６ｍｅｒ－１－２１０ペプチドのアセチルコリン受容体に対する阻害能結果である。

【図12】本発明に係る６ｍｅｒ－２－１３６、６ｍｅｒ－２－２３３ペプチドのアセチルコリン受容体に対する阻害能結果である。

【図13】本発明に係る５ｍｅｒ－７３、５ｍｅｒ－３１１ペプチドのアセチルコリン受容体に対する阻害能結果である。

【図14】本発明に係る６ｍｅｒ－１－４３ペプチドにパルミトイルが結合したペプチド（Ｐａｌ－６ｍｅｒ－１－４３）のアセチルコリン受容体に対する阻害能結果である。

【図15】本発明に係る５ｍｅｒ－７３ペプチドにパルミトイルが結合したペプチド（Ｐａｌ－５ｍｅｒ－７３）のアセチルコリン受容体に対する阻害能結果である。

【図16】本発明に係る各ペプチドのアセチルコリン受容体に対する阻害能をシンエイク（Ｓｙｎａｋｅ）と比較した結果である。

【図17】本発明に係る代表ペプチドの細胞毒性を評価した結果である。

【図18】対照群である１１ｍｅｒ（Ｐａｌ－エスペプ２）と本発明に係る５ｍｅｒ（Ｐａｌ－５ｍｅｒ－７３）の皮膚透過能を評価した結果である。

【図19】本発明に係る最適化短縮ペプチド（５ｍｅｒ－７３，ＲＲＱＲＲ）の目尻の皮膚シワに対する臨床効能を評価した結果である。

【図20】本発明に係る最適化短縮ペプチド（５ｍｅｒ－７３，ＲＲＱＲＲ）の皮膚弾力に対する臨床効能を評価した結果である。

【図21】本発明に係る最適化短縮ペプチド（５ｍｅｒ－７３，ＲＲＱＲＲ）の額シワの改善に対する臨床効能を評価した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0117】

本発明の発明者らは、先行特許（韓国公開特許第１０－２０２０－００８０１７９号）においてアセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ）と結合力及び特異性が高いＡｃｈＲ特異的なペプチドを選別した。それらのペプチドは、ＷＴＷＫＧＲＫＳＬＬＲからなるエスペプ－２ペプチドに基づいてペプチドのアセチルコリン受容体結合に重要な配列部位を確認し、アセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ）との親和力が増加した８ｍｅｒ、１１ｍｅｒ及び１４ｍｅｒの最適化ペプチドを発掘したものである。これらのペプチドは、多回のバイオパンニングによってＡｃｈＲとの選択的結合力が高かったが、ペプチドの長さが８～１４ｍｅｒで構成される点で、ペプチド生産単価が高く、高皮膚透過がし難いという問題があった。特に、ペプチドの長さが長くなる場合に、生産単価が増加するだけでなく、皮膚透過にも不利に作用してしまう。

【0118】

本発明者らは、前記の問題点を解決するために、ＡｃｈＲとの選択的結合力に優れながらも、より短縮したペプチドを発掘する過程で本発明を案出することになった。特に、エスペプ２を６ｍｅｒと５ｍｅｒに単純に短縮させたＲＫＳＬＬＲ及びＫＳＬＬＲペプチドは、それ自体でもシンエイクペプチドに比べて結合力に優れることを確認し、エスペプ２構造に基づいて６ｍｅｒ及び５ｍｅｒの最適ペプチド構造をサーチした。前記最適化短縮ペプチドを決定するために、６ｍｅｒと５ｍｅｒの無作為ライブラリーを作製してスクリーニングしてペプチド配列を分析した結果、一定の位置に所定のアミノ酸配列を有するペプチドは、既存のエスペプ２（１１ｍｅｒ）、６ｍｅｒ、５ｍｅｒに比べて高いアセチルコリン受容体結合力を示すことを確認した。

【0119】

以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。ただし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、他の形態として具体化されてもよい。むしろ、ここで紹介される内容が徹底且つ完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供されるものである。

【0120】

＜実施例１．最適化短縮ライブラリーを作製するためにサイズを短縮させたペプチドの親和力測定＞

【0121】

先行エスペプ２ペプチドの最適化短縮ライブラリーを作るために、Ｎ末端とＣ末端でシーケンスを一つずつを段階的に除去したペプチドの親和力を確認した。まず、バイオセンサーチップを用いて表面プラズマ共鳴実験（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）を行った（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。選択されたアセチルコリン受容体タンパク質をＥＤＣ／ＮＨＳを用いてＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定し、最大５００秒まで結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）及び解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを）を観察した。観察条件は、ランニングバッファー２０ｍＭトリス（ｐＨ ７．４）、速度３０ｕｌ／分、濃度２０μＭ（ペプチド）の条件で行い、その結果を図１に示した。

【0122】

図１に示すように、Ｎ末端とＣ末端でアミノ酸を除去してサイズを短縮させた誘導体の親和力は、１１ｍｅｒ（エスペプ２－１１ｍｅｒ、ＷＴＷＫＧＲＫＳＬＬＲ）１．２μＭ、８ｍｅｒ（エスペプ２－８ｍｅｒ、ＫＧＲＫＳＬＬＲ）３．１μＭ、及び６ｍｅｒ（エスペプ２－６ｍｅｒ、ＲＫＳＬＬＲ）５７μＭであり、シンエイクに比べて１１ｍｅｒは１９１６倍、８ｍｅｒは７４０倍、６ｍｅｒは４０倍の高いアセチルコリン受容体親和力を示した。

【0123】

シンエイク（Ｓｙｎａｋｅ）は蛇毒由来ペプチドで、アセチルコリンがアセチルコリン受容体に結合することを阻害してシワ改善に利用されているペプチドである。図１に見られるように、エスペプ－２短縮ペプチド（１１ｍｅｒ、８ｍｅｒ、６ｍｅｒ）のアセチルコリン受容体タンパク質との高い親和力はシンエイクに比べて優れているので、シワ改善を含む化粧料組成物だけでなく、アセチルコリン受容体を抑制することによってアセチルコリン受容体過剰活性と関連した疾患の予防又は治療にも利用可能であることを確認した。

【0124】

従来、アセチルコリン受容体過剰活性による様々な筋肉痙攣及び筋肉過活動に起因する疾病を治療するために使われてきたボツリヌス毒素は、優れた医学的用途にもかかわらず、１ｇだけで約１００万人を死亡に至らせ得る猛毒性を有し、生物武器協約規制対象物質であることに照らせば、短いペプチドを用いて高いアセチルコリン受容体抑制剤効能を達成できることを確認したものである。

【0125】

＜実施例２．核心シーケンス確認のためのアラニンスキャニング及び短縮ペプチドの親和力測定＞

【0126】

前記短縮ペプチドの重要シーケンスを確認するためにアラニンスキャニングを行った。エスペプ２－６ｍｅｒ（ＲＫＳＬＬＲ）とエスペプ２－５ｍｅｒ（ＫＳＬＬＲ）を野生（ＷＴ）とし、それぞれのペプチドのアミノ酸配列を順次にアラニン（ａｌａｎｉｎｅ，Ａｌａ，Ａ）で置換したペプチドを合成した後、実施例１で用いた同じ方法で親和力を測定してそれをＷＴを基準にして正規化し、図２に示した。

【0127】

図２に見られるように、ＮとＣ末端付近の陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ）アミノ酸が結合に重要であることを確認した。

【0128】

また、ＲＫＳＬＬＲ配列の６個アミノ酸のうち、ＮとＣ末端のＲシーケンスが重要であることを確認した。このような結果に基づいて、前記６ｍｅｒを基準にしてＮ末端とＣ末端の両端の１個シーケンスを除去した５ｍｅｒ－ＮＤ（ＫＳＬＬＲ）、５ｍｅｒ－ＣＤ（ＲＫＳＬＬ）ペプチドを作製し、それらの各親和力を測定して図３に示した。

【0129】

図３に見られるように、エスペプ２６ｍｅｒは、ＲＵ値が１７７で、シンエイクに比べて親和力が高かったし、これよりも短縮した５ｍｅｒ－ＮＤは、シンエイクに比べて高い結合力を示した。５ｍｅｒ－ＣＤは、シンエイクと比較して多少低い結合力を示した。これにより、５ｍｅｒの短縮ペプチドは、両末端にリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）を含む構造がアセチルコリン受容体結合に有利であることを確認した。

【0130】

＜実施例３．６ｍｅｒ－１、６ｍｅｒ－２、５ｍｅｒ－ＮＤの短縮ライブラリー作製＞

【0131】

前記実施例２のアラニンスキャニングによって確認した重要シーケンスに基づいて、６ｍｅｒ－１；（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）ＸＸＸ（Ｋ／Ｒ）、６ｍｅｒ－２；（Ｋ／Ｒ）ＸＸＸ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）、５ｍｅｒ－ＮＤ；（Ｋ／Ｒ）ＸＸＸ（Ｋ／Ｒ）［（Ｋ／Ｒ）は、Ｋ又はＲのいずれか一方、Ｘはランダムアミノ酸］最適化ライブラリーを作製した。

【0132】

実施例３－１．最適化短縮ライブラリーベクター作製

【0133】

６ｍｅｒ最適化ペプチドライブラリーを作るために、６ｍｅｒ－１－Ｆ（ＳｆｉＩ＿ＡＲＡＡＲＡＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＲＡ＿ＮｏｔＩ）、６ｍｅｒ－２－Ｆ（ＳｆｉＩ＿ＡＲＡＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＲＡＡＲＡ＿ＮｏｔＩ）、５ｍｅｒ－ＮＤ－Ｆ（ＳｆｉＩ＿ＡＲＡＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＲＡ＿ＮｏｔＩ）、Ｂａｃｋ（ＡＡＣＡＧＴＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣ）（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ又はＣ；ＫはＧ又はＴ；ＭはＣ又はＡ）を合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）。合成した表１のＤＮＡライブラリーを鋳型にして５ｍｅｒ、６ｍｅｒインサート（Ｉｎｓｅｒｔ）をＰＣＲ反応（９４℃で５分、６０回：４０℃で３０秒、７２℃で３０秒、及び７２℃で７分）をして二本鎖にした後、精製して（ＰＣＲ精製キット、ＧｅｎｅＡｌｌ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）ライブラリー遺伝子を得た。これをファージミドベクター（ｐＩＧＴ）に挿入するために、ファージミドベクターとインサートＤＮＡを制限酵素で処理した。約１０μｇのインサートＤＮＡをＳｆｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ）及びＮｏｔＩ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ）で８時間反応させた後、ＰＣＲ精製キットを用いて精製ＤＮＡを得た。また、約１０μｇのファージミドベクターをＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで８時間処理し、ＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ）を入れて１時間反応させた後、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）を用いてインサートＤＮＡをファージミドベクターと１８℃で１５時間連結した後、エタノールで沈殿させ、ＴＥバッファー１００μｌでＤＮＡを溶解させた。

【0134】

［表１］

【0135】

実施例３－２．電気穿孔

【0136】

ファージミドベクター１０μｇと６ｍｅｒ又は５ｍｅｒランダムインサートＤＮＡ３μｇを連結反応させた１００μｌを１０個に分注して電気穿孔を行った。コンピテント細胞を氷の上で溶かし、２００μｌのコンピテント細胞を連結反応させた溶液４μｌと混合して冷却させた後、用意した０．２ｃｍのキュベットに入れて１分間氷の上に置いた。電気穿孔機（ＢｉｏＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を２００Ωで２５ｕＦ及び２．５ｋＶの条件にプログラムし、用意したキュベットの水気を除去して電気穿孔機に位置させた後、パルスをかけた。このとき、時間定数は４．５～５ｍｓｅｃであった。その後、直ちに、３７℃として準備した２０ｍＭのグルコースが含まれた１ｍｌのＬＢ液体培地に入れ、得られた総２５ｍｌの細胞を１００ｍｌ試験管に移した。その後、１時間、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら培養した後、それから１０μｌを取って、ライブラリーの個数を測定するためにアンピシリン寒天培地に希釈、塗抹した。残された細胞を、１ＬのＬＢに２０ｍＭグルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを入れて３０℃で１日培養した。その後、４℃で４，０００ｇで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞以外の上澄液を全て除去し、４０ｍｌのＬＢで再懸濁させた後、グリセロールを最終濃度２０％以上入れて－８０℃に保管した。

【0137】

実施例３－３．最適化ペプチドライブラリーで組換えファージ生産

【0138】

－８０℃に保存された６ｍｅｒ、５ｍｅｒ最適化ペプチドライブラリーで組換えファージを生産した。３０ｍｌ ＳＢ液体培地に、－８０℃に保管されたライブラリー１ｍｌを追加して２０分間３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合して培養した。ここに、ヘルパーファージ（１０^１０ｐｆｕ）とアンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を入れてさらに１時間、同一条件で培養した。そして、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）が含まれたＳＢ液体培地３０ｍｌに移し、同一条件で１６時間以上培養して組換えファージを生産した。前記培養液を４℃で５，０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離して得た上澄液にＰＥＧ／ＮａＣｌを５：１の比率に混合して氷に１時間放置させた後、４℃で２０分間１３，０００ｒｐｍの速度で遠心分離して上澄液は注意して除去し、１ｍｌのＰＢＳでペレットを再懸濁させた。

【0139】

可能な全てのアミノ酸配列を確率的にライブラリー内に含めるために、５ｍｅｒの場合、完成されたライブラリー数は、５ｍｅｒ最適化ライブラリーの場合の数２×２×２０×２０×２０＝３．２×１０^４以上でなければならない。したがって、本研究では、５ｍｅｒライブラリーの数を１．９５×１０^６にした。また、６ｍｅｒ最適化ライブラリーの場合の数は、２×２×２×２０×２０×２０＝６．４×１０^４以上でなければならず、本研究では、作製の結果、６ｍｅｒ－１と６ｍｅｒ－２のライブラリー数が１．２３×１０^６、１．５３×１０^６が得られ、成功的にライブラリーが開発されたことを確認した。これを下表２に示す。また、各ライブラリーの一部シーケンシングによって、指定配列において誤りがないことを確認した。その結果を表３に示す。

【0140】

［表２］

【0141】

［表３］

【0142】

＜実施例４．短縮ペプチドライブラリーのバイオパンニング及びスクリーニング＞

【0143】

実施例４－１．バイオパンニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）方法

【0144】

抗体を表面発現するファージライブラリーを固定化された抗原に処理し、抗原に結合する抗体候補を選別する過程を、バイオパンニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）といい、結合／洗浄／遊離（ｂｉｎｄ／ｗａｓｈ／ｅｌｕｔｉｏｎ）の３段階で構成される。洗浄過程中に、結合力の弱い抗体を有するファージは除去され、結果的に結合力の高い抗体を発現しているファージのみが残るが、このような過程を反復することにより、抗原結合力と特異度に優れた抗体候補を発掘することができる。そこで、本発明のアセチルコリン受容体に対する結合力と特異度に優れたアセチルコリン受容体結合ペプチドをスクリーニングするためにバイオパンニング方法を利用した。

【0145】

５μｇ／ｍｌのＡｃｈＲ α１を９６ウェルプレートの８個ウェルにウェルにつき５０μｌずつ入れ、４℃で一晩放置した。翌日、２００μｌトリス（２０ｍＭ ｐＨ ７）で１回洗浄後に、２％ ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）２００μｌを入れて常温で２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させた後に溶液を全て捨て、２００μｌトリス（２０ｍＭ ｐＨ ７）で３回洗浄した。前記実施例３－３のＰＢＳで懸濁したランダムペプチド組換えファージ（投入ファージ、ｉｎｐｕｔ ｐｈａｇｅ）４００μｌ及び２％ ＢＳＡ ４００μｌを混合してウェルにつき１００μｌずつ入れて３０℃で１時間放置した。ウェルの溶液を全て除去し、トリス（２０ｍＭ ｐＨ ７）で３回洗浄した後、０．２Ｍグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）（ｐＨ ２．２）をウェルにつき１００μｌずつ入れて２０分間ファージを遊離させた後、１本のチューブに全て集め、１Ｍトリス（ｐＨ ９．０）２００μｌを入れて算出ファージ（ｏｕｔｐｕｔ ｐｈａｇｅ）を得た。

【0146】

バイオパンニングを反復するために、遊離されたファージ５００μｌを５ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と混ぜて３７℃で２００ｒｐｍで３０分間培養した後、１×１０^１０ｐｆｕヘルパーファージと最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加して３０分間さらに培養した。その後、前記培養液を５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンが含まれたＳＢ液体培地に移し、同一条件で一晩培養してランダムペプチド組換えファージを再生産した。再生産されたランダムペプチド組換えファージを４℃で５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を得、上澄液にＰＥＧ／ＮａＣｌを５：１［ｖ：ｖ］で混合して氷に１時間放置した後、４℃、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄液を除去し、１ｍｌのＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で沈殿物を懸濁した後、２次バイオパンニングに使用した。

【0147】

各バイオパンニング段階ごとに洗浄過程を段階別にそれぞれ３、３、４、４、５、６回（０．０５％ ＰＢＳＴ）増加させる以外は、前記と同じ方法でランダム組換えファージを再生産し、バイオパンニングを行った。

【0148】

各バイオパンニングごとに投入ファージ（ｉｎｐｕｔ ｐｈａｇｅ）及び算出ファージ（ｏｕｔｐｕｔ ｐｈａｇｅ）数を測定するために、６００ｎｍでの吸光度が０．７（ＯＤ６００＝０．７）である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に混ぜ、アンピシリンが含まれた寒天培地（ａｇａｒ ｐｌａｔｅ）に塗抹し、その結果を下記表４～表６に示した。

【0149】

［表４］

【0150】

［表５］

【0151】

［表６］

【0152】

実施例４－２．ランダムペプチドライブラリー投入組換えファージ（ｉｎｐｕｔ ｐｈａｇｅ）を用いたＥＬＩＳＡ（ｅｎｙｚｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）方法

【0153】

前記実施例４－１のバイオパンニングの各回次別投入ファージを用いてＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）及びＡｃｈＲに対してＥＬＩＳＡを行った。

【0154】

９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、１０μｇ／ｍｌのＡｃｈＲ又はＢＳＡを各ウェルにつき５０μｌずつ入れて、４℃で一晩放置し、翌日、トリス（２０ｍＭ ｐＨ ７）で３回洗浄し、ＰＢＳで希釈した２％ ＢＳＡを入れて常温で２時間ブロッキングさせた後、溶液を全て捨て、トリス（２０ｍＭ ｐＨ ７）で３回洗浄した。その後、前記実施例４－１の表４－６での各回次（１ｓｔ、２ｎｄ、３ｒｄ、４ｔｈ、５ｔｈ及び６ｔｈ）の投入ファージ８００μｌを、１０％ ＢＳＡ２００μｌを混合してウェルにつき１００μｌずつ入れて３０℃で１時間放置した。ウェルの溶液を全て除去し、トリス（２０ｍＭ ｐＨ ７）で３回洗浄した後、１：１，０００に希釈したＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）結合抗Ｍ１３抗体（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－Ｍ１３Ａｂ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を各ウェルにつき１００μｌずつ入れて３０℃で１時間反応させた。その後、トリス（２０ｍＭ ｐＨ ７）で３回洗浄した後、各ウェルにＨＲＰの基質であるテトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＴＭＢ）溶液を１００μｌずつ入れて発色反応を誘導した後、１００μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加して反応を中止させ、４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。その結果を図４に示した。図４に見られるように、各回次のバイオパンニングが進行されるほど、アセチルコリン／ＢＳＡのＯＤ値が高くなっており、これは、アセチルコリン受容体に対する特異性が高いファージが成功的にスクリーニングされたことを意味する。

【0155】

＜実施例５．各ライブラリーペプチドのＸアミノ酸分析＞

【0156】

バイオパンニング後に、各ライブラリーのペプチド配列のうち中間部位の無作為配列ＸＸＸと関連して、特にアセチルコリン受容体と高い結合力を有するアミノ酸が特定され得るかを確認した。前記実施例４のライブラリーのうち、特異性の高い各バイオパンニング６回次のファージの配列を分析した結果、５ｍｅｒ及び６ｍｅｒの両方で特定アミノ酸の反復回数が高いことを確認した。前記ＸＸＸ部分を順にＸＹＺとし、反復回数の高いペプチドのＸ、Ｙ及びＺの位置で個別アミノ酸出現回数を表７に示した。

【0157】

［表７］

【0158】

特異にも、前記Ｘ位置はＲ、Ｑ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｗと７個、Ｙ位置はＲ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙと７個、Ｚ位置はＲ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｑ、Ｔ、Ｙと７個、のアミノ酸が、他のアミノ酸に比べて出現回数が遥かに多かった。

【0159】

＜実施例６．ＸＹＺの反復配列のうち上位７個アミノ酸を組み合わせたペプチドの結合力分析＞

【0160】

前記実施例５の表７によって、出現回数が多い上位７個アミノ酸を組み合わせたペプチド（上位組合せ）、及び出現回数が少ない下位１３個アミノ酸を組み合わせたペプチド（下位組合せ）を、５ｍｅｒ、６ｍｅｒ－１及び６ｍｅｒ－２シリーズとしてそれぞれ６００個ずつ合成し、各配列のアセチルコリン受容体結合力を測定した。表面プラスモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）分析方法を用いてＡｃｈＲとの結合力（Ｒｕ；Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔｓ）を測定し、その結果を表８～１３に示した。このとき、ペプチドは、１０μＭの濃度条件で行った。また、各シリーズの上位組合せ及び下位組合せの平均結合力を図５～図７に示した。

【0161】

［表８］

【0162】

［表９］

【0163】

［表１０］

【0164】

［表１１］

【0165】

［表１２］

【0166】

［表１３］

【0167】

上記の表８の５ｍｅｒのうち、配列番号７３５ｍｅｒ－７３のＲＲＱＲＲ配列のアセチルコリン受容体結合力は、他の５ｍｅｒに比べて非常に高く現れた（結合力１７９）。これにより、配列番号７３の拡張された６ｍｅｒ配列ＸＲＲＱＲＲ及びＲＲＱＲＲＸ配列を作製してそれのアセチルコリン受容体結合力を確認し、その結果を、ＲＲＱＲＲ配列の相対値として表１４に示した。

【0168】

［表１４］

【0169】

上記の表１４に見られるように、ＲＲＱＲＲの拡張配列ＸＲＲＱＲＲ及びＲＲＱＲＲＸ配列は、大部分の配列において非常に高いアセチルコリン受容体結合力を示した。

【0170】

また、上記の表９の６ｍｅｒのうち、配列番号１４１０ ６ｍｅｒ－１－２１０のＲＲＧＶＲＲ配列のアセチルコリン受容体結合力は、他の６ｍｅｒに比べて非常に高く現れた（結合力１８４）。これにより、配列番号１４１０の拡張された７ｍｅｒ配列ＸＲＲＧＶＲＲ及びＲＲＧＶＲＲＸ配列を作製してそれのアセチルコリン受容体結合力を確認し、その結果をＲＲＧＶＲＲの相対値として表１５に示した

【0171】

［表１５］

【0172】

上記の表１５に見られるように、ＲＲＧＶＲＲの拡張配列ＸＲＲＧＶＲＲ及びＲＲＧＶＲＲＸ配列は、大部分の配列において非常に高いアセチルコリン受容体結合力を示した。

【0173】

＜実施例７．各ライブラリーにおいて結合力の高いペプチド２個と陽性対照群の結合力比較＞

【0174】

前記実施例６から確認された各ライブラリーの代表ペプチドを、それぞれ２個ずつ５ｍｅｒ（７３，３１１）、６ｍｅｒ－１（４３，２１０）、６ｍｅｒ－２（１３６，２３３）を選別し、最適化前６ｍｅｒ、５ｍｅｒ－ＮＤ、シンエイクと結合力を比較した。その結果を表１６及び図８に示した。表１６及び図８に見られるように、前記実施例６において、ＸＹＺ限定された５ｍｅｒ及び６ｍｅｒの最適化された短縮ペプチドは、シンエイクだけでなく最適化前のエスペプ－２短縮ペプチドに比べも、セチルコリン受容体との結合力に優れていた。
前記最適化された短縮ペプチドのうち６ｍｅｒ－１－４３ペプチドに対して親和力を測定し、その結果を図９に示した。本発明に係る６ｍｅｒ－１－４３ペプチドのアセチルコリン受容体に対する親和力は、６０９ｎＭであった。

【0175】

［表１６］

【0176】

＜実施例８．結合力の高い６のペプチドのアセチルコリン受容体作用抑制確認＞

【0177】

前記実施例５でＡｃｈＲに対する結合力に優れるものと確認された５ｍｅｒ（７３，３１１）、６ｍｅｒ－１（４３，２１０）、６ｍｅｒ－２（１３６，２３３）ペプチドのＡｃｈＲ作用抑制効果を確認した。

【0178】

アセチルコリン受容体が過発現しているＴＥ６７１細胞を、１０％ ＦＢＳと１％ Ｐ／Ｓが含まれたＤＭＥＭ培地に、３７℃、ＣＯ_２ ５％で培養した。約４日間、前記ＴＥ６７１細胞が十分に育つと、１２ウェル細胞培養プレートに１８ｍｍカバースリップ（ｃｏｖｅｒ－ｓｌｉｐ）を敷き、培養されている細胞をトリプシンで剥がした後、ウェル当たりに２×１０^４／ｃｅｌｌｓとなるように１ｍｌずつ分注して４日間培養した。

【0179】

新しい１２ウェル細胞培養プレートに、細胞が培養されたカバースリップを移し、ＨＢＳＳバッファー９９７ｕｌとＦｕｒａ－２－ＡＭ ３μｌを分注して徐々に混ぜた後、３７℃、ＣＯ_２ ５％で１５分間培養した。培養後にＨＢＳＳバッファー１ｍｌで３～４回洗浄し、残っているＦｕｒａ－２－ＡＭを除去し、さらに１ｍｌ分注した。チャンバーに、細胞の育っているカバースリップを嵌めた後、ＨＢＳＳバッファー５００μｌを分注した。そして、最終濃度が４００μＭとなるようにニコチン濃度を合わせ、それぞれカルシウムイメージング反応を確認した。その後、ニコチン濃度は固定させておき、サンプルの濃度を調節することで、阻害される濃度を探した。対照群としてシンエイクを共に処理し、その結果を図１０～図１３に示した

【0180】

図１０～図１３に見られるように、シンエイクは５００μＭにおいて、先行ペプチドである１１ｍｅｒは５μＭにおいてアセチルコリン受容体が阻害された。一方、本発明に係る最適化短縮ペプチド５ｍｅｒ（７３，３１１）、６ｍｅｒ－１（４３，２１０）、６ｍｅｒ－２（１３６，２３３）は、１０ｕＭにおいて阻害されることを確認した。このように新しく発掘した６ｍｅｒペプチドは、先行ペプチド１１ｍｅｒに類似する阻害能を示しながら、平均シンエイク（Ｓｙｎａｋｅ）に比べて約１００倍も優れているし、５ｍｅｒペプチドは、約３３倍優れた阻害能を示すことを確認した。

【0181】

＜実施例９．ペプチド末端の修飾を用いてアセチルコリン受容体に対する阻害能評価＞

【0182】

本発明に係る最適化された短縮ペプチドの末端をパルミテート（Ｐａｌｍｉｔａｔｅ）で修飾させ、アセチルコリン受容体に対する阻害能を評価した。前記実施例６と同じ方法でＰａｌｍｉｔａｔｅ－６ｍｅｒ－１－４３とＰａｌｍｉｔａｔｅ－５ｍｅｒ－７３ペプチドのアセチルコリン受容体に対する阻害能を確認した。その結果、１μＭにおいて１００％阻害されることを確認したし、その結果を、図１４及び図１５に示した。また、本発明に係る最適化された短縮ペプチドとパルミテートを結合させて修飾させたペプチドのアセチルコリン受容体に対する阻害能（ＩＣ_５０）をシンエイクと比較して図１６に示した。図１４～図１６に見られるように、本発明に係る最適化された短縮ペプチドの末端をパルミテートで修飾させた場合に、修飾されていない短縮ペプチドに比べてアセチルコリン受容体に対する阻害能が顕著に増加していることを確認した。

【0183】

＜実施例１０．最適化された短縮ペプチドの細胞毒性評価＞

【0184】

本発明に係る最適化された短縮ペプチドの細胞毒性を評価した。ヒトの皮膚から分離した真皮細胞である線維芽細胞（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）を用いてＭＴＴ［（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ］法で細胞毒性を評価した。前培養した細胞を２４ウェルプレート１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でシードし、１８時間培養した。その後、培地を除去し、ＦＢＳが添加されていない培地に、希釈した試料を添加して２４時間培養させた後、培地を除去し、ＭＴＴ溶液を１μｇ／ｍｌの濃度で加えて３時間反応させた。未反応したＭＴＴを除去し、ＤＭＳＯ １００μｌを加えて形成された反応物（ｆｏｒｍａｚａｎｅ）を溶解させ、ＥＬＩＳＡリーダーで５４０ｎｍでの吸光度を測定して評価した。

【0185】

図１７に見られるように、６ｍｅｒ－１－４３（６ｍｅｒペプチド）と５ｍｅｒ－７３（５ｍｅｒペプチド）、Ｐａｌ－６ｍｅｒ－１－４３、Ｐａｌ－５ｍｅｒ－７３ペプチドの皮膚の真皮細胞に及ぼす毒性程度をＭＴＴ法で測定した結果、１００ｎＭ～１００ｕＭの濃度で両ペプチドとも細胞毒性がないものと評価された。

【0186】

＜実施例１１．ペプチド長さによる皮膚透過率分析＞

【0187】

フランツ拡散セルシステムを用いて、先行ペプチドである１１ｍｅｒと本発明の最適化された短縮ペプチドの皮膚透過率を比較した。

【0188】

フランツ拡散セルシステムのレセプターチャンバーにはＰＢＳ（０．０５％ポリソルベート８０含有、ｐＨ ７．４）を５ｍｌを入れた後、レセプターチャンバーとドナーチャンバーとの間に、人工皮膚であるセルロースアセテート膜（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を１枚又は２枚入れて固定させ、フランツセルのドナーチャンバーに各既存１１ｍｅｒと最適化された５ｍｅｒ－７３（ＲＲＱＲＲ）ペプチドを添加した。レセプターチャンバーの条件は、３７℃、６００ｒｐｍに調節したし、０．５、１、２、４、８、１２、１８、２４時間に試料を５００μｌずつ回収し、時間別に皮膚を透過して出た薬物の量をＨＰＬＣで測定し、その結果を図１８に示した。図１８に見られるように、本発明に係る最適化短縮ペプチド５ｍｅｒの皮膚透過率は、８時間後に６６．８７％が透過されたが、１１ｍｅｒは全く透過されていないことを確認した。

【0189】

上記のように、本発明の最適化短縮ペプチド５ｍｅｒのアセチルコリン受容体短縮ペプチドは、先行研究において優れたアセチルコリン受容体阻害効果を示した１１ｍｅｒペプチドと類似のアセチルコリン受容体抑制活性を示しながらも、ペプチド長さを半分に短縮させることにより、皮膚透過率を劇的に高め、生産コストを画期的に低減させることができる。

【0190】

＜実施例１２．ペプチド化粧品剤形の目尻のシワの臨床効能評価＞

【0191】

本発明に係る最適化短縮ペプチドの目尻の皮膚シワに対する臨床効能を評価した。本発明に係る最適化短縮ペプチドが含まれた試験製品及び対照群を、下記の表１７のように製造し、人体適用試験を行った。選定条件を満たし、選定除外条件に該当しない被験者２１人を募集したし、１人が試験参加同意撤回によって脱落し、最終２０人で試験を行った。全ての測定は、空気の移動と直射光線がない恒温恒湿条件（２２±２℃、５０±１０％ ＲＨ）で、被験者が少なくとも３０分以上安定を取った後に実施した。選定された被験者は、製品使用前（０週）に臨床機関を訪問し、目尻のキメ（シワ）を測定し、人口学的調査を行った。６週間１日２回（朝、夕方）、試験製品を塗布したし、製品使用後３週目、６週目にもう一度臨床機関を訪問し、製品使用前（０週）と同一に評価を受けた。

【0192】

［表１７］

【0193】

評価項目として、シワの全般的サイズ（Ｏｖｅｒａｌｌ ｓｉｚｅ）、シワ深さ（Ｄｅｐｔｈ）、及び最大シワ深さ（Ｍａｘｉｍｕｍ ｄｅｐｔｈ）を測定したし、ＡＮＴＥＲＡ ３Ｄ^（Ｒ） ＣＳ（Ｍｉｒａｖｅｘ，Ｉｒｅｌａｎｄ）で撮影して目尻の皮膚シワを分析し、その結果を０週目と比較し、表１８及び図１９に示した。対照群の場合、評価項目のいずれにおいても有意の差は見られなかった。

【0194】

［表１８］

【0195】

上記の表１８及び図１９に示すように、目尻のシワの全般的サイズ（Ｏｖｅｒａｌｌ ｓｉｚｅ）は、製品使用前に比べて使用３週目に１９．１％減少（ｐ＜０．００１）、６週目に３１．５％減少（ｐ＜０．００１）したし、深さ（Ｄｅｐｔｈ）は、製品使用前に比べて、使用３週目に２１．０％減少（ｐ＜０．００１）、６週目に３０．１％減少（ｐ＜０．００１）したし、最大深さ（Ｍａｘｉｍｕｍ ｄｅｐｔｈ）は、製品使用前に比べて、使用３週目に１４．２％減少（ｐ＜０．００１）、６週目に２７．９％減少（ｐ＜０．００１）した。

【0196】

＜実施例１３．ペプチド化粧品剤形の弾力臨床効能評価＞

【0197】

前記実施例１２と同じ方法で皮膚弾力（Ｕｒ／Ｕｅ）に対して臨床効能を評価した。真皮緻密度は、超音波機器であるＤＵＢ^（Ｒ） Ｓｋｉｎｓｃａｎｎｅｒ（ｔｐｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。製品使用前（０週）、製品使用後３週目、６週目に、被験者の頬部位の真皮緻密度を測定し、前後比較してその結果を図２０に示した。

【0198】

図２０に見られるように、皮膚弾力（Ｕｒ／Ｕｅ）は、製品使用前に比べて、使用３週目に６．９％増加（ｐ＜０．００１）、６週目に１７．８％増加（ｐ＜０．００１）したし、真皮緻密度は製品使用前に比べて、製品使用３週目に１８．９％増加（ｐ＜０．００１）、６週目に２８．５％増加（ｐ＜０．００１）した。

【0199】

＜実施例１４．ペプチド化粧品剤形の額シワ臨床効能評価＞

【0200】

本発明に係る最適化短縮ペプチド化粧品剤形の額シワに対して臨床効能を評価した。製品使用前に、額シワの部位をアンテラ３Ｄ（Ａｎｔｅｒａ ３Ｄ）及びＤＳＬＲで撮影した。その後、前記表１７の試験製品及び対照群を吸収させたガーゼ（５ｃｍ×５ｃｍ）を額シワ部位に８時間貼布した後、ガーゼ除去後に、４０分、及び２時間４０分が経過した時点に、額シワ部位をアンテラ３Ｄ（Ａｎｔｅｒａ ３Ｄ）及びＤＳＬＲで撮影し、その結果を図２１に示した。

【0201】

図２１に見られるように、製品除去前と比較して、後に額シワの改善効果が顕著に現れたし、２時間以上経過後にも、シワ改善効果が維持されることを確認した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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【国際調査報告】