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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-14
(54)【発明の名称】抗体薬物複合体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20240806BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240806BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20240806BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240806BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240806BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20240806BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240806BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
A61P37/02
A61P7/00
A61P7/06
A61P35/00
A61P31/14
A61K39/395 L
A61K38/48
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506901
(86)(22)【出願日】2022-08-04
(85)【翻訳文提出日】2024-04-02
(86)【国際出願番号】 FR2022051554
(87)【国際公開番号】W WO2023012437
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】2108537
(32)【優先日】2021-08-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521510899
【氏名又は名称】エムセー エスアーエフ
(71)【出願人】
【識別番号】512215048
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・トゥール
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＴＯＵＲＳ
(71)【出願人】
【識別番号】522460265
【氏名又は名称】サントル オスピタリエ レジオナル ユニヴェルシテール ドゥ トゥール
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】マルタン， カミーユ
(72)【発明者】
【氏名】フイヤートル， オフェリア
(72)【発明者】
【氏名】グリュエル， イブ
(72)【発明者】
【氏名】ロラン， ジェローム
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076CC07
4C076CC14
4C076CC27
4C076CC35
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084CA18
4C084DC02
4C084NA05
4C084ZA51
4C084ZA55
4C084ZB07
4C084ZB26
4C084ZB33
4C085AA14
4C085BB31
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC23
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA40
4H045BA51
4H045BA72
4H045DA75
4H045DA89
4H045EA20
4H045FA10
4H045FA57
(57)【要約】
本発明は、ａ）抗体または抗体断片と、ｂ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域に特異的なプロテアーゼとを含む複合体に関する。本発明はまた、この複合体を少なくとも１つ含む組成物、および、この複合体の薬物としての使用、特に自己抗体によって引き起こされる疾患の治療のための薬物としての使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）抗体または抗体断片と、ｂ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域に特異的なプロテアーゼと
を含む複合体。
【請求項2】
式（Ａ）：【化1】
の請求項１に記載の複合体。
【請求項3】
上記フックヘッドは、式（Ｉ）の化合物であり、【化2】
Ａは、フェニル残基またはピリジル残基であり；
Ｗは、－ＯＲａ、－ＣＯＲ２、－ＣＯＮＲ３Ｒ４、または－ＮＲ３ＣＯＲ４であり；
Ｒａは、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＲｂ、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒｂは、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ２は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＲｃＨ）ｒ－Ｒ５－、または－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ３は、－Ｈ、－（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、または－（ＣＨ２）ｖ－ＳＯ３Ｈであり；
Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ５は、
【化3】
各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
ｑは、１～２４の整数であり；
各ｒは、１～８の整数であり；
各ｖは、１～６の整数である、
請求項２に記載の複合体。
【請求項4】
上記スペーサーは、直接結合または－（Ｒ５－Ｒ６－Ｒ５’）ｓ－の基であり、式中、
ｓは、１～１０の整数であり；
Ｒ５およびＲ５’は、互いに異なって、各々、
【化4】
Ｒ６は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－であり；
Ｒ７は、直接結合、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－、または－ＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯ－であり；
Ｒ８は、直接結合、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－、または－ＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨ－であり；
各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
各ｑは、１～２４の整数であり；
各ｒは、１～８の整数である、
請求項２または３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項5】
上記リンカーアームは、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｔ－Ｒ９－、【化5】
ｔは、１～１０の整数であり；
Ｒ９は、－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ１０は、以下の式の基であり；
【化6】
Ｒ８は、直接結合、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－、または－ＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨ－であり；
Ｒ１１は、－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ５の定義は、請求項３に記載の通りであり；
各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
各ｑは、１～２４の整数であり；
各ｒは、１～８の整数である、
請求項２～４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項6】
Ｗは、－ＣＯＮＲ３Ｒ４であり；Ｒ３は、－Ｈ、－（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、または－（ＣＨ２）ｖ－ＳＯ３Ｈであり；
Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ５は、
【化7】
Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
ｑは、１～１２の整数であり；
ｒは、１～６の整数であり；
ｖは、１～６の整数である、
請求項３～５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項7】
上記フックヘッドは、式（Ｉｂ）または（Ｉｂ’）の化合物である【化8】
【請求項8】
式（Ｂ）または（Ｃ）：【化9】
【化10】
【請求項9】
上記フックヘッドは、式（ＩＩ）の化合物であり、【化11】
各Ａは、フェニル残基またはピリジル残基であり；
各Ｙは、直接結合、－ＣＨ２－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、または－Ｃ（＝ＮＲ１）－であり；
Ｘ１は、
【化12】
【化13】
ｍ、ｎ、およびｐは各々、互いに独立して、０～８の整数であり；
各ｑは、１～２４の整数であり；
各ｒは、１～８の整数であり；
各ｓは、０～６の整数であり；
各ｕは、１～６の整数であり；
ただし、以下の化合物：
２，６－ビス［２，６－ビス（ブロモメチル）フェニル］安息香酸、および
１，３－ビス［［３，５－ビス（ブロモメチル）フェノキシ］メチル］－５－プロプ－２－イノキシ－ベンゼンは除き；
各Ｚは、直接結合、－ＣＨ２－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、または－Ｃ（＝ＮＲ１）－であり；
Ｗは、－ＯＲａ、－ＣＯＲ２、－ＣＯＮＲ３Ｒ４、または－ＮＲ３ＣＯＲ４であり；
Ｒａは、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＲｂ、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒｂは、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ１は、－Ｈ、－ＯＨ、または－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ２は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ３は、－Ｈ、－（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、または－（ＣＨ２）ｖ－ＳＯ３Ｈであり；
Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ５は、
【化14】
各Ｒｃは、独立して、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈであり；
ｍおよびｎは各々、互いに独立して、０～３の整数であり；
ｐは、０、１、または２に等しく；
各ｑは、互いに独立して、１～２４の整数であり；
各ｒは、互いに独立して、１～８の整数であり；
ｖは、１～６の整数である、
請求項８に記載の複合体。
【請求項10】
上記スペーサーは、直接結合または－（Ｒ５－Ｒ６－Ｒ５’）ｓ－の基であり、式中、
Ｒ５およびＲ５’は、互いに異なって、各々、
【化15】
Ｒ６は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－であり；
Ｒ７は、直接結合、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－、または－ＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯ－であり；
Ｒ８は、直接結合、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－、または－ＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨ－であり；
各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
各ｑは、１～２４の整数であり；
各ｒは、１～８の整数であり；
ｓは、１～１０の整数である、
請求項８または９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項11】
上記リンカーアームは、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｔ－Ｒ９－、【化16】
式中、
ｔは、１～１０の整数であり；
Ｒ９は、－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ１０は、以下の式の基であり、
【化17】
Ｒ１１は、－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ７は、直接結合、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－、または－ＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯ－であり；
Ｒ８は、直接結合、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－、または－ＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨ－であり；
Ｒ５の定義は、請求項９に記載の通りであり；
各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
各ｑは、１～２４の整数であり；
各ｒは、１～８の整数である、
請求項８～１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項12】
各Ａは、ピリジル残基である、請求項９～１１のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項13】
各Ｙは、直接結合、－ＣＯ－、および－ＮＨ－から選択される、請求項９～１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項14】
基Ｙおよび基Ｚの一方が－ＣＯ－であり、他方が－ＮＨ－である、請求項９～１３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項15】
Ｘ１は、以下の式であり、【化18】
Ｚは、－ＣＯ－または－ＮＨ－であり；
ｍおよびｎは各々、互いに独立して、０～３の整数であり；
ｐは、０、１、または２に等しく；
Ｗは、－ＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ３は、－Ｈまたは－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ５は、
【化19】
Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
ｑは、１～１２の整数であり；
ｒは、１～６の整数である、
請求項９～１４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項16】
Ｘ１は、以下の基：【化20】
【化21】
【化22】
Ｚは、－ＣＯ－または－ＮＨ－であり；
Ｗは、－ＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
Ｒ３は、－Ｈまたは－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ４は、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ５は、
【化23】
Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
ｑは、１～１２の整数であり；
ｒは、１～６の整数である、
請求項９～１５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項17】
Ｘ１は、【化24】
【請求項18】
Ｗは、－ＣＯＮＲ３Ｒ４であり；Ｒ３は、－Ｈまたは－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
Ｒ５は、
【化25】
Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
ｍおよびｎは各々、互いに独立して、０～３の整数であり；
ｐは、０、１、または２に等しく；
ｑは、１～１２の整数であり；
ｒは、１～６の整数である、
請求項９～１７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項19】
上記フックヘッドは、式（ＩＩａ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｃ’）の化合物である【化26】
【化27】
【請求項20】
上記スペーサーと上記リンカーアームとからなる部分は、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のいずれかで表される【化28】
【請求項21】
上記抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、好ましくはＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２から選択される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項22】
上記プロテアーゼは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ１のヒンジ領域に特異的である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項23】
上記プロテアーゼは、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＥ、ＩｇｄＥ、ＳｅＭａｃ、好ましくはＩｄｅＳから選択される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項24】
式（Ｖ）または（ＶＩ）：【化29】
【請求項25】
式（Ｖ’）または（ＶＩ’）：【化30】
【請求項26】
請求項１～２５のいずれか１項に記載の複合体を１つ以上含む組成物。
【請求項27】
薬物として使用するための請求項１～２５のいずれか１項に記載の複合体または請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
自己抗体によって誘発される疾患の治療に使用するための請求項１～２５のいずれか１項に記載の複合体または請求項２６に記載の組成物。
【請求項29】
免疫グロブリンＧによって誘発される自己免疫疾患が、免疫性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー病、ヘパリン起因性血小板減少症等の薬剤性血小板減少症から選択される、請求項２８に記載の使用のための複合体。
【請求項30】
コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等の呼吸器ウイルスによって誘発される血栓性血小板減少症の治療に使用するための請求項１～２５のいずれか１項に記載の複合体または請求項２６に記載の組成物。
【請求項31】
コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン等のワクチン起因性血栓性血小板減少症（ＶＩＴＴ）の治療に使用するための請求項１～２５のいずれか１項に記載の複合体または請求項２６に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体または抗体断片と、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域に特異的なプロテアーゼと含む複合体であって、薬物として、特に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）によって誘発される自己免疫疾患の治療における薬物として使用できる複合体に関する。
【背景技術】
【0002】
自己免疫疾患は、免疫系が異常反応を起こして、「自身」の構成要素を攻撃することを特徴とする。患者の免疫系は、次いで、病原性自己抗体（免疫グロブリンＧ）を産生し、この自己抗体が様々な免疫区画を動員および／または活性化することで、適切な生理学的機能に不可欠な正常細胞が破壊される。このような破壊は、ほとんどの場合、抗体のＦｃ部分と免疫系の各種細胞に存在するＦｃレセプター（ＦｃＲ）との相互作用が媒介する抗体のエフェクター機能の仲介を介して生じる。
【0003】
自己免疫疾患の原因は依然としてよくわかっていない。遺伝的素因、特定の薬物の服用、感染性物質への曝露、さらには環境要因など、いくつかの要因が組み合わさって生じる。
【0004】
現在利用可能な治療選択肢は以下の通りである。
‐多価免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）の静脈内注射によりＦｃＲレセプターを飽和させて、自己抗体がエフェクター機能を使用するのを防ぐ。
‐リツキシマブモノクローナル抗体等の抗ＣＤ２０抗体を用いて、抗体産生細胞であるＢリンパ球を生物体から枯渇させる。
‐リンパ球の成熟および貯蔵に関与する臓器である肝臓の切除からなる脾臓摘出術を行う。
‐多価免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）の静脈内注射によりＦｃＲレセプターを飽和させて、自己抗体がエフェクター機能を使用するのを防ぐ。
‐リツキシマブモノクローナル抗体等の抗ＣＤ２０抗体を用いて、抗体産生細胞であるＢリンパ球を生物体から枯渇させる。
‐リンパ球の成熟および貯蔵に関与する臓器である肝臓の切除からなる脾臓摘出術を行う。
【0005】
抗ＣＤ２０抗体の使用および脾臓摘出術は、慢性症例により適している。
【0006】
これらの戦略は効果的ではあるが欠点もある。具体的には、抗ＣＤ２０抗体の使用や脾臓摘出術により、アンドロゲン抗体が大幅に枯渇して、患者が感染症にかかりやすくなることがある。ＩＶＩｇの使用に関しては、供給が血漿献血に依存しているため、まだ限定的である。
【0007】
自己抗体と関連する病変を治療するための実験的治療法も試験されている。このようにして、免疫グロブリンＧをそのヒンジ領域で切断できるプロテアーゼである細菌プロテアーゼＩｄｅＳの能力を試験したところ、不適合ドナーによる移植腎の文脈で成果を収めた。ＩｄｅＳを注射すると、循環免疫グロブリンが劇的に減少し、移植片が一時的に維持された。しかし、移植片を生存させるために必要なＩｄｅＳの新たな注射により、プロテアーゼＩｄｅＳに対する免疫反応が誘発され、その効果を打ち消してしまう。また、このプロテアーゼのヒトでの半減期は数時間であるため、その作用は一時的なものにとどまる。このような同じ戦略が、ヘパリン起因性血小板減少症という特定の自己免疫疾患にも適用されており、動物モデルにおいて、循環免疫グロブリンを完全にタンパク質分解して、自己抗体の病原性作用を打ち消すことが実証されている。しかし、内因性免疫グロブリンが完全に消失することで、免疫不全が生じた。
【0008】
したがって、既知の治療法に内在する制約を克服して、病原性免疫グロブリンＧによって誘発される自己免疫疾患の効果的な治療を可能にするために、新規の標的療法を開発することが求められている。
【0009】
このような状況において、本発明者らは、抗体または抗体断片と、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域に特異的なプロテアーゼと含む複合体の形態である新規薬物を開発した。この複合体は、プロテアーゼを病原性自己抗体の作用部位において標的化することで、それらを特異的に破壊することができる。本発明者らは、特に、抗体または抗体断片と、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域に特異的なプロテアーゼとを含む複合体の調製に特に適した化学反応を開発した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、
ａ）抗体または抗体断片と、
ｂ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域に特異的なプロテアーゼと
を含む複合体に関する。
ａ）抗体または抗体断片と、
ｂ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域に特異的なプロテアーゼと
を含む複合体に関する。
【0011】
本発明はまた、薬物として、特に自己抗体によって誘発される疾患の治療における薬物として使用するための本発明に係る複合体に関する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＴＴＺ Ｆａｂおよび化合物２４による抗原ＨＥＲ２の認識動態を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
定義
本発明の文脈において、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、鎖内および鎖間ジスルフィド架橋によって共に連結された、それぞれ約５０～７０ｋＤａの重鎖（「Ｈｅａｖｙ」よりＨ鎖と呼ばれる）２本およびそれぞれ約２５ｋＤａの軽鎖（「Ｌｉｇｈｔ」よりＬ鎖と呼ばれる）２本からなるヘテロ４量体を指す。各鎖の構成としては、Ｎ末端位置に、軽鎖の場合はＶＬ、重鎖の場合はＶＨと呼ばれる可変領域またはドメインを有し、Ｃ末端位置に、軽鎖の場合はＣＬと呼ばれる単一ドメイン、重鎖の場合はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４と名づけられた３つまたは４つのドメインからなる定常領域を有する。
本発明の文脈において、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、鎖内および鎖間ジスルフィド架橋によって共に連結された、それぞれ約５０～７０ｋＤａの重鎖（「Ｈｅａｖｙ」よりＨ鎖と呼ばれる）２本およびそれぞれ約２５ｋＤａの軽鎖（「Ｌｉｇｈｔ」よりＬ鎖と呼ばれる）２本からなるヘテロ４量体を指す。各鎖の構成としては、Ｎ末端位置に、軽鎖の場合はＶＬ、重鎖の場合はＶＨと呼ばれる可変領域またはドメインを有し、Ｃ末端位置に、軽鎖の場合はＣＬと呼ばれる単一ドメイン、重鎖の場合はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４と名づけられた３つまたは４つのドメインからなる定常領域を有する。
【0014】
本発明の意味において、「抗体断片」という用語は、抗原に結合可能で、酵素消化または生物生産によって得られ、少なくとも１つのジスルフィド架橋を含む、抗体の任意の部分を意味するものとする。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびｓｃＦｖ－Ｆｃから選択される断片であってよい。
【0015】
パパインによる免疫グロブリンの酵素消化では、Ｆａｂ断片（抗原結合断片）と呼ばれる２つの同一の断片と、Ｆｃ断片（結晶化可能断片）とが生成される。ペプシンによる免疫グロブリンの酵素消化では、Ｆ（ａｂ’）２断片と、いくつかのペプチドに分割されたＦｃ断片とが生成される。Ｆ（ａｂ’）２は、鎖間ジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片から形成される。Ｆａｂ部分は可変領域とＣＨ１およびＣＬドメインとからなる。Ｆａｂ’断片はＦａｂ領域とヒンジ領域とからなる。ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）は、タンパク質工学により得られる断片であり、可変ＶＨおよび可変ＶＬドメインのみからなる。この構造は、両ドメイン間に位置するリンカーと呼ばれる短く柔軟なペプチドアームで安定化されている。２つのｓｃＦｖ断片をＦｃ断片に連結して、ｓｃＦｖ－Ｆｃを得ることができる。
【0016】
「精製された」および「単離された」という用語は、本発明に係る複合体に言及する場合、同種の他の生体高分子が実質的に存在しない状態で当該複合体が存在することを意味するものとする。本明細書中で使用する「精製された」という用語は、存在する全ての高分子に対して、複合体が、好ましくは少なくとも７５質量％、より好ましくは少なくとも８５質量％、さらに好ましくは少なくとも９５質量％、最も好ましくは少なくとも９８質量％であることを意味する。
【0017】
「医薬的に許容される」という用語は、連邦もしくは州の規制機関によって承認されていること、または米国薬局方、欧州薬局方、もしくは一般に認められた他の薬局方に収載されていることを意味し、動物および／またはヒトへの使用を意図した製品に適用される。「医薬組成物」とは、医薬的に許容される担体を含む組成物を指す。例えば、医薬的に許容される担体は、治療薬の投与に用いられる希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体であり得る。これらの担体は、水や油等の無菌液体であり得る。油としては、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等、石油／動物、植物、または合成由来のものが挙げられる。医薬組成物を静脈内投与する場合、好ましい担体は水である。生理食塩水やデキストロースおよびグリセリンの水溶液も、特に注射液の液体担体として使用できる。医薬的に許容される賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。医薬組成物が経口投与に適している場合、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の医薬的に許容される賦形剤を用いて、従来の手段により、錠剤またはソフトカプセル剤を調製することができる。錠剤は、当該分野で周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態であってよく、あるいは、使用前に水等の適当な担体で再構成される乾燥製品の形態で提供することもできる。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールのシロップ、セルロース誘導体、または水素添加食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性担体（例えば、アーモンド油、オイルエステル、エチルアルコール、または分別植物油）；および保存剤（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル、プロピル、またはソルビン酸）等の医薬的に許容される担体を用いて、従来の手段により調製することができる。医薬組成物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香料、着色料、および甘味料を含むことができる。本発明に係る組成物は、医薬組成物であることが好ましい。
【0018】
「治療する」または「治療」という用語は、病変または病理状態に対するあらゆる有益なまたは望ましい効果を包含し、病変または病理状態の測定可能マーカーのうち１つ以上の最小限の減少も含み得る。治療は、例えば、病変または病理状態の症状の軽減もしくは改善を含んでいてもよく、病変または病理状態の進行の遅延を含んでいてもよい。「治療」という用語は、必ずしも病変やそれに伴う症状の完全な根絶または治癒を意味するものではない。
【0019】
「ネイティブ質量分析」という用語は、タンパク質を変性させない条件下で実施されるため、非共有結合を保持できる質量分析法を意味するものとする。ネイティブ質量分析法は、参考文献［１］等の文献に広く記載されている。
【0020】
「プロテアーゼ」（またはペプチダーゼまたはタンパク質分解酵素）という用語は、タンパク質のペプチド結合を切断する酵素を意味するものとする。そして、これは、タンパク質分解切断またはタンパク質分解と呼ばれることもある。このプロセスには水分子が使用されるため、ヒドロラーゼに分類されることを意味する。したがって、「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域に特異的なプロテアーゼ」とは、ＩｇＧのヒンジ領域を切断するプロテアーゼである。免疫グロブリン（ＩｇＧ）ヒンジ領域に特異的ないくつかのプロテアーゼが文献に記載されており、本発明の文脈において使用することができる。
【0021】
「アリール」という用語は、フェニル基またはナフチル基を意味するものとする。
【0022】
「窒素、酸素、および硫黄から選択されるヘテロ原子を１～４個含む飽和、不飽和、もしくは部分不飽和の５～１５員複素環」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択されるヘテロ原子を１～４個、好ましくは１～３個、より好ましくは１個または２個含む単環式、二環式、または三環式の縮合していてもよい飽和、不飽和、または部分不飽和基を意味するものとする。
【0023】
不飽和単環の例としては、ピロリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、トリアゾリル基、オキサジアゾリル基、フラニル基、チエニル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、トリアジニル基、アゼピニル基、オキセピニル基、またはチエピニル基が挙げられる。
【0024】
飽和単環の例としては、ピロリジニル基、テトラヒドロフリル基、テトラヒドロチエニル基、イミダゾリジニル基、チアゾリジニル基、イソオキサゾリジニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、またはヘキサヒドロアゼピニル基が挙げられる。
【0025】
部分不飽和単環の例としては、ジヒドロ（イソ）オキサゾール基が挙げられる。
【0026】
不飽和または部分不飽和の縮合していてもよい二環または三環の例としては、以下の基：イソキノリル、キノリル、１，４－ジヒドロキノリニル、２，４－ジヒドロキノリニル、１，２，３，４－テトラヒドロキノリニル、１Ｈ－ピロロ［３，２－ｂ］ピリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラジニル、インドリル、２，３－ジヒドロインドリル、インドリニル、ベンゾフラニル、２，３－ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、３，４－ジヒドロ－１，４－ベンゾオキサジニル、２，４－ジヒドロ－１，４－ベンゾオキサジニル、１，３－ベンゾジオキソリル、２，３－ジヒドロベンゾジオキシニル、イミダアゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジニル、４，５－ジヒドロ－１，５－ベンゾオキサゼピニル、２，３－ジヒドロピリド［４，３－ｂ］［１，４］オキサジニル、３，４－ジヒドロピリド［３，２－ｂ］［１，４］オキサジニル、スピロ［ベンゾオキサジン－２，１’－シクロブタン］－イル、クロマニル、クロメニル、スピロ［クロマン－２，１’－シクロブタン］、スピロ［クロメン－２，１’－シクロブタン］、スピロ［シクロペンタン－１，３’－インドリン］－イル、スピロ［インドリン－３，３’－テトラヒドロフラン］－イル、スピロ［インドリン－３，３’－テトラヒドロピラン］－イル、ジヒドロシクロプロパ［ｂ］インドール－２－イル、ヘキサヒドロカルバゾリル、テトラヒドロカルバゾリル、ジヒドロカルバゾリル、またはテトラヒドロシクロペンタ［ｂ］インドール－４－イルが挙げられる。
【0027】
複合体
本発明の第１の目的は、
ａ）抗体または抗体断片と、
ｂ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域に特異的なプロテアーゼと
を含む複合体に関する。
本発明の第１の目的は、
ａ）抗体または抗体断片と、
ｂ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域に特異的なプロテアーゼと
を含む複合体に関する。
【0028】
当業者であれば、一般的な用語「複合体」は、一般的な表現「抗体薬物複合体」または「ＡＤＣ」に置き換えることができることが分かるであろう。
【0029】
本発明の文脈において、上記抗体は哺乳動物（例えばヒトまたはマウス）由来であってもよく、ヒト化されていてもよく、キメラでもよい。先行技術に広く記載される技術に従って、遺伝子組換え細胞による組換えによって産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。一般的なヒト化またはヒトの単一特異性または二重特異性モノクローナル抗体を含んでよい。上記抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のＩｇＧであり得る。したがって、上記抗体断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の断片等のＩｇＧ断片であり得る。
【0030】
上記プロテアーゼがＦｃ断片を含む抗体または抗体断片（例えばｓｃＦｖ－Ｆｃ）と複合化している場合、上記複合体の血中半減期は、Ｆｃ断片を含む抗体または抗体断片と複合化していないプロテアーゼよりも長くなり得る。具体的には、Ｆｃ断片は血中半減期が長いことが知られているため、本発明に係る複合体は、Ｆｃ断片の半減期から恩恵を受けることができる。
【0031】
本発明の文脈において、上記抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、好ましくはＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２から選択することができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、好ましくはＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２から選択される抗体断片は、本発明の文脈において特に有利である。
【0032】
ある実施形態において、本発明に係る複合体は、本発明に係る別の複合体のヒンジ領域を切断しない。例えば、上記抗体のアミノ酸配列をヒンジ領域等で変異させることで、本発明に係る複合体が本発明に係る別の複合体のヒンジ領域を切断しないようにする。該アミノ酸配列は、例えば、置換、欠失、または付加等の変異を少なくとも１つ含んでいてよい。このような変異は、文献［３］に広く記載されている。
【0033】
本発明の文脈において、上記プロテアーゼは、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＥ、ＩｇｄＥ、ＳｅＭａｃ、好ましくはＩｄｅＳから選択することができる。
【0034】
ある実施形態において、上記プロテアーゼは、上記抗体または抗体断片のジスルフィド架橋において結合する。
【0035】
本発明の複合体は、上記抗体または抗体断片が認識する抗原に結合することができ、ＩｇＧのヒンジ領域のプロテアーゼ活性を有する。したがって、本発明に係る複合体は、上記プロテアーゼを、抗原が位置する場所において特異的に標的化することができる。そして、上記抗体または抗体断片は、生物体内でプロテアーゼの所望の標的化に従って選択される。例えば、本発明の複合体が認識する抗原は、以下から選択できる。
‐例えばヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）やワクチン起因性血栓性血小板減少症（ＶＩＴＴ）の治療の場合、血小板第４因子（ＰＦ４）；
‐例えば免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の治療の場合、糖タンパク質ＩＩｂＩＩＩＡ（ＧＰＩＩｂＩＩＩａ）；および
‐例えばウェゲナー病の治療の場合、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）。
‐例えばヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）やワクチン起因性血栓性血小板減少症（ＶＩＴＴ）の治療の場合、血小板第４因子（ＰＦ４）；
‐例えば免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の治療の場合、糖タンパク質ＩＩｂＩＩＩＡ（ＧＰＩＩｂＩＩＩａ）；および
‐例えばウェゲナー病の治療の場合、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）。
【0036】
ある実施形態において、本発明の複合体は、抗体１Ｅ１２または抗体１Ｅ１２の断片等の抗ＰＦ４抗体または抗ＰＦ４抗体断片を含む［２］。
【0037】
本発明に係る複合体の第１の態様
第１の態様によれば、本発明に係る複合体は、式（Ａ）である。
（式中、ｕ＝１、２、３、４、５、または６である。）
第１の態様によれば、本発明に係る複合体は、式（Ａ）である。
【化1】
【0038】
ｕで表されるフック間のユニット数は、上記抗体または抗体断片に結合するユニット数によって異なる。上記抗体または抗体断片に結合するユニットの最大数は、上記抗体または抗体断片のジスルフィド架橋の数に依存する。
【0039】
いくつかの実施形態において、
‐上記抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４であり、ｕ＝１、２、３、または４、好ましくはｕ＝４である；
‐上記抗体はＩｇＧ２であり、ｕ＝１、２、３、４、５、または６、好ましくはｕ＝６である；
‐上記抗体断片はＦａｂであり、ｕ＝１である；
‐上記抗体断片はＦａｂ’であり、ｕ＝１または２、好ましくはｕ＝２である；
‐上記抗体断片はＦ（ａｂ’）２であり、ｕ＝１、２、３、または４、好ましくはｕ＝４である。
‐上記抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４であり、ｕ＝１、２、３、または４、好ましくはｕ＝４である；
‐上記抗体はＩｇＧ２であり、ｕ＝１、２、３、４、５、または６、好ましくはｕ＝６である；
‐上記抗体断片はＦａｂであり、ｕ＝１である；
‐上記抗体断片はＦａｂ’であり、ｕ＝１または２、好ましくはｕ＝２である；
‐上記抗体断片はＦ（ａｂ’）２であり、ｕ＝１、２、３、または４、好ましくはｕ＝４である。
【0040】
式（Ａ）の化合物の各種部分、すなわちフックヘッド、スペーサー、リンカーアーム、およびプロテアーゼの各々の間の結合は、アミド、エステル、エーテル、カルバメート、またはカーボネート結合を介して、あるいは、以下に説明するように、いわゆる「クリック」反応を行うことによって実現される。
【0041】
以下の実施形態は、必要に応じて互いに組み合わせることができる。
【0042】
ある実施形態において、上記フックヘッドは式（Ｉ）の化合物であり、
式中、
・Ａは、フェニル残基またはピリジル残基であり；
・Ｗは、－ＯＲａ、－ＣＯＲ２、－ＣＯＮＲ３Ｒ４、または－ＮＲ３ＣＯＲ４であり；
‐Ｒａは、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＲｂ、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒｂは、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ２は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＲｃＨ）ｒ－Ｒ５－、または－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ３は、－Ｈ、－（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、または－（ＣＨ２）ｖ－ＳＯ３Ｈであり、－Ｈまたは－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであることが好ましく；
‐Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐各Ｒ５は、
から選択され；
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐ｑは、１～２４の整数であり；
‐各ｒは、１～８の整数であり；
‐ｖは、１～６の整数である。
【化2】
・Ａは、フェニル残基またはピリジル残基であり；
・Ｗは、－ＯＲａ、－ＣＯＲ２、－ＣＯＮＲ３Ｒ４、または－ＮＲ３ＣＯＲ４であり；
‐Ｒａは、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＲｂ、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒｂは、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ２は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＲｃＨ）ｒ－Ｒ５－、または－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ３は、－Ｈ、－（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、または－（ＣＨ２）ｖ－ＳＯ３Ｈであり、－Ｈまたは－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであることが好ましく；
‐Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐各Ｒ５は、
【化3】
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐ｑは、１～２４の整数であり；
‐各ｒは、１～８の整数であり；
‐ｖは、１～６の整数である。
【0043】
ある実施形態において、上記スペーサーは、直接結合または－（Ｒ５－Ｒ６－Ｒ５’）ｓ－の基であり、
式中、
・Ｒ５の定義は、上に記載の通りであり：
・Ｒ５’は、
から選択され；
Ｒ５およびＲ’５は、同一ではあり得ないことが理解され；
・Ｒ６は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－であり；
・ｓは、１～１０の整数であり；
‐Ｒ７は、直接結合、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－、または－ＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯ－であり；
‐Ｒ８は、直接結合、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－、または－ＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨ－であり；
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐各ｑは、１～２４の整数であり；
‐各ｒは、１～８の整数である。
式中、
・Ｒ５の定義は、上に記載の通りであり：
・Ｒ５’は、
【化4】
Ｒ５およびＲ’５は、同一ではあり得ないことが理解され；
・Ｒ６は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－であり；
・ｓは、１～１０の整数であり；
‐Ｒ７は、直接結合、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－、または－ＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯ－であり；
‐Ｒ８は、直接結合、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－、または－ＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨ－であり；
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐各ｑは、１～２４の整数であり；
‐各ｒは、１～８の整数である。
【0044】
ある実施形態において、上記リンカーアームは、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｔ－Ｒ９－、
、または－ＣＨ２－Ｒ１０－であり；
・ｔは、１～１０の整数であり；
・Ｒ９は、－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
・Ｒ１０は、以下の式の基であり、
‐Ｒ１１は、－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ５、Ｒ７、およびＲ８は、上記で定義した通りであり；
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐各ｑは、１～２４の整数であり；
‐各ｒは、１～８の整数である。
【化5】
・ｔは、１～１０の整数であり；
・Ｒ９は、－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
・Ｒ１０は、以下の式の基であり、
【化6】
‐Ｒ５、Ｒ７、およびＲ８は、上記で定義した通りであり；
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐各ｑは、１～２４の整数であり；
‐各ｒは、１～８の整数である。
【0045】
ある実施形態において、Ｗは、－ＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
・Ｒ３は、先に定義した通りであり、ｖは１～６の整数であり；
・Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ５は、
から選択され；
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐ｑは、１～１２の整数であり；
‐ｒは、１～６の整数である。
・Ｒ３は、先に定義した通りであり、ｖは１～６の整数であり；
・Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ５は、
【化7】
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐ｑは、１～１２の整数であり；
‐ｒは、１～６の整数である。
【0046】
本実施形態において、Ｒ４およびＲ５は以下の通り定義されることが有利である。
・Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ５は、
から選択され、
‐ｑは、１～１２の整数であり；
‐ｒは、１～６の整数である。
・Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ５は、
【化8】
‐ｑは、１～１２の整数であり；
‐ｒは、１～６の整数である。
【0047】
ある実施形態において、上記フックヘッドは式（Ｉａ）の化合物であり、
・Ｗは、上記で定義した通りである。
【化9】
【0048】
好ましい実施形態において、上記フックヘッドは式（Ｉｂ）または（Ｉｂ’）の化合物である。
【化10】
【0049】
好ましい実施形態において、上記スペーサーと上記リンカーアームとからなる部分は、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表される。
【化11】
【0050】
ある実施形態において、上記複合体は、式（Ｖ）または（ＶＩ）である。
（式中、ｕは先に定義した通りであり、ｕ＝１、２、または４であることが好ましい。）
【化12】
【0051】
ある実施形態において、上記複合体は、式（Ｖ’）または（ＶＩ’）である。
【化13】
【0052】
実施例の化合物２４は、式（ＶＩ’）（式中、Ｆａｂはトラスツズマブ抗体の断片Ｆａｂである。）の化合物に相当する。
【0053】
本発明に係る複合体の第２の態様
第２の態様によれば、本発明に係る複合体は、式（Ｂ）または（Ｃ）である。
（式中、ｕ＝１、２、または３である。）
第２の態様によれば、本発明に係る複合体は、式（Ｂ）または（Ｃ）である。
【化14】
【0054】
ｕで表されるフック間のユニット数は、上記抗体または抗体断片に結合するユニット数によって異なる。上記抗体または抗体断片に結合するユニットの最大数は、上記抗体または抗体断片のジスルフィド架橋の数に依存する。
【0055】
いくつかの実施形態において、
‐上記抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４であり、ｕ＝１または２である；
‐上記抗体はＩｇＧ２であり、ｕ＝１、２、または３、好ましくはｕ＝１である；
‐上記抗体断片はＦａｂ’であり、ｕ＝１である；
‐上記抗体断片はＦ（ａｂ’）２であり、ｕ＝１または２である。
‐上記抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４であり、ｕ＝１または２である；
‐上記抗体はＩｇＧ２であり、ｕ＝１、２、または３、好ましくはｕ＝１である；
‐上記抗体断片はＦａｂ’であり、ｕ＝１である；
‐上記抗体断片はＦ（ａｂ’）２であり、ｕ＝１または２である。
【化15】
【0056】
以下の実施形態は、必要に応じて互いに組み合わせることができる。
【0057】
ある実施形態において、上記フックヘッドは式（ＩＩ）の化合物であり、
式中、
・各Ａは、フェニル残基またはピリジル残基であり；
・各Ｙは、直接結合、－ＣＨ２－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、または－Ｃ（＝ＮＲ１）－であり、ここで、Ｒ１は－Ｈ、－ＯＨ、または－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルから選択され；
・Ｘ１は、
から選択され；
・
は、（Ｃ３－Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６－Ｃ１０）アリール、または、窒素、酸素、および硫黄から選択されるヘテロ原子を１～４個含む飽和、不飽和、もしくは部分不飽和の５～１５員複素環であり；
‐ｍ、ｎ、およびｐは各々、互いに独立して、０～８の整数であり；
‐各ｑは、１～２４の整数であり；
‐各ｒは、１～８の整数であり；
‐各ｓは、０～６の整数であり；
‐各ｕは、１～６の整数であり；
ただし、以下の化合物：
２，６－ビス［２，６－ビス（ブロモメチル）フェニル］安息香酸、および
１，３－ビス［［３，５－ビス（ブロモメチル）フェノキシ］メチル］－５－プロプ－２－イノキシ－ベンゼンは除き；
・各Ｚは、直接結合、－ＣＨ２－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、または－Ｃ（＝ＮＲ１）－であり；
・Ｗは、式（Ａ）の複合体において定義した通りである。
【化16】
・各Ａは、フェニル残基またはピリジル残基であり；
・各Ｙは、直接結合、－ＣＨ２－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、または－Ｃ（＝ＮＲ１）－であり、ここで、Ｒ１は－Ｈ、－ＯＨ、または－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルから選択され；
・Ｘ１は、
【化17】
・
【化18】
‐ｍ、ｎ、およびｐは各々、互いに独立して、０～８の整数であり；
‐各ｑは、１～２４の整数であり；
‐各ｒは、１～８の整数であり；
‐各ｓは、０～６の整数であり；
‐各ｕは、１～６の整数であり；
ただし、以下の化合物：
２，６－ビス［２，６－ビス（ブロモメチル）フェニル］安息香酸、および
１，３－ビス［［３，５－ビス（ブロモメチル）フェノキシ］メチル］－５－プロプ－２－イノキシ－ベンゼンは除き；
・各Ｚは、直接結合、－ＣＨ２－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、または－Ｃ（＝ＮＲ１）－であり；
・Ｗは、式（Ａ）の複合体において定義した通りである。
【0058】
ある実施形態において、上記スペーサーは、直接結合または－（Ｒ５－Ｒ６－Ｒ５’）ｓ－（式中、Ｒ５、Ｒ５’、およびＲ６は式（Ａ）の複合体において定義した通りである。）の基である。
【0059】
ある実施形態において、上記リンカーアームは、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｔ－Ｒ９－、
、または－ＣＨ２－Ｒ１０－であり、
式中、
・ｔは、１～１０の整数であり；
・Ｒ９は、－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
・Ｒ１０は、以下の式の基であり、
式中、
‐Ｒ１１は、－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ７は、直接結合、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－、または－ＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯ－であり；
‐Ｒ８は、直接結合、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－、または－ＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨ－であり；
‐Ｒ５は、
から選択され；
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐各ｑは、１～２４の整数であり；
‐各ｒは、１～８の整数である。
【化19】
式中、
・ｔは、１～１０の整数であり；
・Ｒ９は、－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯ－Ｒ７－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－Ｒ８－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－；－ＮＨＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
・Ｒ１０は、以下の式の基であり、
【化20】
‐Ｒ１１は、－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－、－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ７は、直接結合、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－、または－ＮＨ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＣＯ－であり；
‐Ｒ８は、直接結合、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－、または－ＣＯ－（ＣＨＲｃ）ｒ－ＮＨ－であり；
‐Ｒ５は、
【化21】
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐各ｑは、１～２４の整数であり；
‐各ｒは、１～８の整数である。
【0060】
ある実施形態において、各Ａは、ピリジル残基である。
【0061】
ある実施形態において、各Ｙは、直接結合、－ＣＯ－、および－ＮＨ－から選択される。
【0062】
ある実施形態において、基Ｙおよび基Ｚの一方が－ＣＯ－であり、他方が－ＮＨ－である。
【0063】
ある実施形態において、Ｘ１は、以下の式の基であり、
式中：
・Ｚは、－ＣＯ－または－ＮＨ－であり；
・ｍおよびｎは各々、互いに独立して、０～３の整数であり；
・ｐは、０、１、または２に等しく；
・Ｗは、－ＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
‐Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ５は、
から選択され；
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐Ｒ３は、－Ｈ、－（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、または－（ＣＨ２）ｖ－ＳＯ３Ｈであり、－Ｈまたは－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであることが好ましく；
‐ｑは、１～１２の整数であり；
‐ｒは、１～６の整数であり；
‐ｖは、１～６の整数である。
【化22】
・Ｚは、－ＣＯ－または－ＮＨ－であり；
・ｍおよびｎは各々、互いに独立して、０～３の整数であり；
・ｐは、０、１、または２に等しく；
・Ｗは、－ＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
‐Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ５は、
【化23】
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐Ｒ３は、－Ｈ、－（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、または－（ＣＨ２）ｖ－ＳＯ３Ｈであり、－Ｈまたは－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであることが好ましく；
‐ｑは、１～１２の整数であり；
‐ｒは、１～６の整数であり；
‐ｖは、１～６の整数である。
【0064】
好ましい実施形態において、Ｘ１は、
の基であって、
から選択され；
・Ｚは、－ＣＯ－または－ＮＨ－であり；
・Ｗは、－ＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
‐Ｒ３は、－Ｈまたは－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり；
‐Ｒ４は、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ５は、
から選択され；
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐ｑは、１～１２の整数であり；
‐ｒは、１～６の整数である。
【化24】
【化25】
【化26】
・Ｚは、－ＣＯ－または－ＮＨ－であり；
・Ｗは、－ＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
‐Ｒ３は、－Ｈまたは－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり；
‐Ｒ４は、－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ５は、
【化27】
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐ｑは、１～１２の整数であり；
‐ｒは、１～６の整数である。
【0065】
特に好ましい実施形態において、Ｘ１は、
から選択され、これらの式中、ＷおよびＺは先に定義した通りである。
【化28】
【0066】
ある実施形態において、Ｗは、－ＣＯＮＲ３Ｒ４であり；
・Ｒ３は、－Ｈまたは－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり；
・Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ５は、
から選択され；
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐ｍおよびｎは各々、互いに独立して、０～３の整数であり；
‐ｐは、０、１、または２に等しく；
‐ｑは、１～１２の整数であり；
‐ｒは、１～６の整数である。
・Ｒ３は、－Ｈまたは－（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり；
・Ｒ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ－Ｒ５－または－（ＣＨＲｃ）ｒ－Ｒ５－であり；
‐Ｒ５は、
【化29】
‐各Ｒｃは、－Ｈ、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、または－ＳＯ３Ｈから選択され；
‐ｍおよびｎは各々、互いに独立して、０～３の整数であり；
‐ｐは、０、１、または２に等しく；
‐ｑは、１～１２の整数であり；
‐ｒは、１～６の整数である。
【0067】
ある実施形態において、上記フックヘッドは式（ＩＩａ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｃ’）の化合物である。
【化30】
【化31】
【0068】
好ましい実施形態において、上記スペーサーと上記リンカーアームとからなる部分は、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表される。
【化32】
【0069】
ある実施形態において、上記複合体は、式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）である。
（式中、ｕ＝１または２である。）
【化33】
【0070】
ある実施形態において、上記複合体は、式（ＶＩＩ’）または（ＶＩＩＩＩ’）である。
（式中、ｕ＝１または２である。）
【化34】
【0071】
ある実施形態において、上記複合体は、式（ＩＸ）または（Ｘ）である。
【化35】
【0072】
複合体の組成物
ある実施形態において、本発明に係る複合体は「精製」または「単離」されている。本発明に係る複合体は、組成物に配合することもできる。
ある実施形態において、本発明に係る複合体は「精製」または「単離」されている。本発明に係る複合体は、組成物に配合することもできる。
【0073】
したがって、本発明の第２の目的は、上記で定義した複合体を１つ以上含む組成物に関する。上記組成物は、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤および／または担体を含む医薬組成物であり得る。
【0074】
治療適応
本発明の第３の目的は、薬物として使用するための本発明に係る複合体、または本発明に係る複合体を１つ以上含む組成物に関する。
本発明の第３の目的は、薬物として使用するための本発明に係る複合体、または本発明に係る複合体を１つ以上含む組成物に関する。
【0075】
本発明の第３の目的は、自己抗体によって誘発される疾患の治療に使用するための本発明に係る複合体、または本発明に係る複合体を１つ以上含む組成物に関する。
【0076】
ある実施形態において、上記自己抗体はＩｇＧである。したがって、上記自己抗体によって誘発される疾患は、ＩｇＧによって誘発される自己免疫疾患等のＩｇＧによって誘発される疾患であり得る。具体的には、本発明に係る複合体は、ＩｇＧヒンジ領域に特異的なプロテアーゼを、自己免疫疾患を誘発する病原性ＩｇＧの作用部位において標的化できる。したがって、そのような標的化複合体は、病原性ＩｇＧのヒンジ領域を切断して不活性化できることで、疾患を治療する。
【0077】
ある実施形態において、上記ＩｇＧによって誘発される自己免疫疾患は、ビアマー貧血、自己免疫性溶血性貧血、原発性硬化性胆管炎、Ｉ型糖尿病、表皮水疱症、（橋本）甲状腺機能低下症、全身性エリテマトーデス、セリアック病、バセドウ甲状腺機能低下症、クローン病、重症筋無力症、水疱性類天疱瘡、深部天疱瘡、多発性筋炎、免疫性血小板減少性紫斑病、出血性結腸大腸炎、スティッフマン症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、グジェロー・シェーグレン症候群、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、乾癬、リウマチ性多発性関節炎、抗リン脂質抗体症候群、ホートン病、急性播種性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー病、チャーグ・ストラウス症候群、モルヴァン症候群、全身性強皮症、白斑、ベーチェット病、ヘパリン起因性血小板減少症、呼吸器ウイルス起因性血栓性血小板減少症、ワクチン起因性血栓性血小板減少症から選択される。
【0078】
上記自己免疫疾患は、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、またはウェゲナー病、ヘパリン起因性血小板減少症等の薬剤性血小板減少症から選択されることが有利である。
【0079】
本発明の別の目的は、コロナウイルス、好ましくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等の呼吸器ウイルスによって誘発される血栓性血小板減少症の治療に使用するための本発明に係る複合体、または本発明に係る複合体を１つ以上含む組成物に関する。
【0080】
本発明の別の目的は、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン等のワクチン起因性血栓性血小板減少症（ＶＩＴＴ）の治療に使用するための本発明に係る複合体、または本発明に係る複合体を１つ以上含む組成物に関する。
【0081】
本発明に係る複合体または組成物は、血管内投与（静脈内投与または動脈内投与）、腹腔内投与、または筋肉内投与等の非経口投与のために製剤化されることが好ましい。本明細書で使用する「非経口投与」という用語は、一般的に注射による、経腸および局所投与以外の投与経路を指し、限定するものではないが、注射による血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、および腹腔内投与、経気管、皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内注入を含む。本発明の文脈では、静脈内注入等による静脈内投与が好ましい。
【0082】
必要とする被験者に投与される複合体の用量は、その制限、投与経路、治療する病変の種類および重症度、患者の状態、患者の肥満度、患者の年齢等のいくつかの要因によって異なる。当業者であれば、当分野の知識に基づいて、これらおよび他の要因に基づく必要な投与量の範囲を容易に決定することができる。適切な用量は、動物モデルや臨床試験により決定することもできる。投与は１回でもよく、より一般的には複数回でもよい。投与計画には、初期の低用量の後に、毎週、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、またはそれよりも長い間隔等で維持用量を投与することが含まれていてもよい。治療期間は、被験者において治療される病変によって異なり得る。
【0083】
本発明に係る複合体または組成物は、単剤療法で、または考慮される病変について治療的利益が認知されている薬物と組み合わせて使用できる。
【0084】
複合体の調製方法
式（Ａ）の複合体
式（Ａ）の複合体は、式（ａ１）または（ａ２）の化合物：
と式（ａ３）の化合物：
との反応によって調製できる。
式（Ａ）の複合体
式（Ａ）の複合体は、式（ａ１）または（ａ２）の化合物：
【化36】
【化37】
【0085】
式（ａ１）および（ａ２）中、ｕは、式（Ａ）の複合体で定義した通りである。
【0086】
式（ａ２）の化合物は、抗体または抗体断片を式（Ｉｂｉｓ）の化合物：
（式中、Ｘはハロゲンであり、Ｂｒであることが好ましく、ＡおよびＷは先に定義した通りである。）
と複合化させることで調製できる。
【化38】
と複合化させることで調製できる。
【0087】
式（ａ１）の化合物は、式（ａ２）の化合物をスペーサーと反応させることで調製する。
【0088】
式（Ａ）の複合体はまた、先に定義した式（ａ２）の化合物と式（ａ４）の化合物：
との反応によっても調製できる。
【化39】
【0089】
式（Ｂ）の複合体
式（Ｂ）の複合体は、式（ｂ１）または（ｂ２）の化合物：
と、先に定義した式（ａ３）の化合物との反応によって調製できる。式（ｂ１）および（ｂ２）中、ｕは、式（Ｂ）の複合体で定義した通りである。
式（Ｂ）の複合体は、式（ｂ１）または（ｂ２）の化合物：
【化40】
【0090】
式（ｂ２）の化合物は、抗体またはＦ（ａｂ’）２もしくはＦａｂ’を、式（ＩＩｂｉｓ）の化合物：
（式中、Ｘはハロゲンであり、Ｂｒであることが好ましく、Ａ、Ｙ、およびＸ１は先に定義した通りである。）
と複合化させることで調製できる。
【化41】
と複合化させることで調製できる。
【0091】
式（ｂ１）の化合物は、式（ｂ２）の化合物とスペーサーとの反応によって調製される。
【0092】
式（Ｂ）の複合体はまた、先に定義した式（ｂ２）の化合物と式（ａ４）の化合物との反応によっても調製できる。
【0093】
式（Ｃ）の複合体
式（Ｃ）の複合体は、式（ｃ１）または（ｃ２）の化合物：
と、先に定義した式（ａ３）の化合物との反応によって調製できる。
式（Ｃ）の複合体は、式（ｃ１）または（ｃ２）の化合物：
【化42】
【0094】
式（ｃ２）の化合物は、２つの抗体断片を、先に定義した式（ＩＩｂｉｓ）の化合物と複合化させることで調製できる。
【0095】
式（ｃ１）の化合物は、式（ｃ２）の化合物とスペーサーとの反応によって調製される。
【0096】
式（Ｃ）の複合体はまた、先に定義した式（ｃ２）の化合物と式（ａ４）の化合物との反応によっても調製できる。
【0097】
上記の反応において、抗体、抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、フックヘッド、スペーサー（存在してもしなくてもよい）、リンカーアーム、およびプロテアーゼは、次の例外を除き、先に定義した通りである。
【0098】
（１）化合物が、スペーサーにもリンカーアームにも結合していないフックヘッドを含み（化合物（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２））、およびそのフックヘッドが置換基Ｒ５を含む場合、この後者は以下の式のいずれかに対応する。
（複合体（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）について示されたＲ５の定義ではフック点が３つであるのに対して、上記の各構造では１つである。ここでのＲ５への言及は用語の濫用であるが、この場合は簡潔にするために正当化されるものとする。）
【化43】
【0099】
（２）スペーサーがフックヘッドと結合している場合（化合物（ａ１）、（ｂ１）、（ｃ１））、Ｒ５は複合体（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）で定義した通りであり、Ｒ’５は以下の式のいずれかに対応する。
（複合体（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）について示されたＲ’５の定義ではフック点が３つであるのに対して、上記の各構造では１つである。上記のように、ここでのＲ’５への言及は用語の濫用であるが、この場合は簡潔にするために正当化されるものとする。）
【化44】
【0100】
化合物（ａ１）、（ｂ１）、および（ｃ１）の調製は、フックヘッドとスペーサーとの反応を含む。これら２つの要素は、いわゆる「クリック」反応を行うことで互いに反応する。正確には、フックヘッドとスペーサーとのクリック反応は、ジエン（例えばアジドまたはジアゾ）とジエノフィル（例えばアルケンまたはアルキン）との間で起こり、これらの官能基はそれぞれ、フックヘッドのＲ５基およびスペーサーのＲ５基によってもたらされる。したがって、クリック反応は、フックヘッドのＲ５基が有するジエンとスペーサーのＲ５基が有するジエノフィルとの間で、あるいはフックヘッドのＲ５基が有するジエノフィルとスペーサーのＲ５基が有するジエンとの間でも行うことができる。
【0101】
化合物（ａ３）の調製は、通常の方法、例えばプロテアーゼとリンカーアームとの間のペプチド結合により行われる。
【0102】
化合物（ａ４）の調製は、式（ａ３）の化合物とスペーサーとをクリック反応によって反応させることで行うことができる。これは、スペーサーのＲ５基が有するジエンとリンカーアームのＲ５基が有するジエノフィルとの間で、あるいはスペーサーのＲ５基が有するジエノフィルとリンカーアームのＲ５基が有するジエンとの間でも行われる。
【0103】
また、化合物（ａ４）は、まず、スペーサーとリンカーアームとを上述のようにクリック反応によって反応させ、次いで、得られた化合物をプロテアーゼと通常の方法（例えば、リンカーアームのＣＯ基とプロテアーゼのＮＨ基との間のペプチド結合）で反応させることによっても調製できる。
【0104】
化合物（ａ１）または（ａ２）と化合物（ａ３）との反応は、化合物（ａ１）のスペーサーまたは化合物（ａ２）のフックヘッドが有するＲ５基（ジエンまたはジエノフィル）と、化合物（ａ３）のリンカーアームが有するＲ５基（ジエノフィルまたはジエン）とのクリック反応により行われる。
【0105】
化合物（ｂ１）または（ｂ２）と化合物（ａ３）との反応は、化合物（ｂ１）のスペーサーまたは化合物（ｂ２）のフックヘッドが有するＲ５基（ジエンまたはジエノフィル）と、化合物（ａ３）のリンカーアームが有するＲ５基（ジエノフィルまたはジエン）とのクリック反応により行われる。
【0106】
化合物（ｃ１）または（ｃ２）と化合物（ｃ３）との反応は、化合物（ｃ１）のスペーサーまたは化合物（ｃ２）のフックヘッドが有するＲ５基（ジエンまたはジエノフィル）と、化合物（ｃ３）のリンカーアームが有するＲ５基（ジエノフィルまたはジエン）とのクリック反応により行われる。
【0107】
化合物（ａ２）と化合物（ａ４）との反応は、化合物（ａ２）のフックヘッドが有するＲ５基（ジエンまたはジエノフィル）と、化合物（ａ４）のスペーサーが有するＲ５基（ジエノフィルまたはジエン）とのクリック反応により行われる。
【0108】
化合物（ｂ２）と化合物（ａ４）との反応は、化合物（ｂ２）のフックヘッドが有するＲ５基（ジエンまたはジエノフィル）と、化合物（ａ４）のスペーサーが有するＲ５基（ジエノフィルまたはジエン）とのクリック反応により行われる。
【0109】
化合物（ｃ２）と化合物（ａ４）との反応は、化合物（ｃ２）のフックヘッドが有するＲ５基（ジエンまたはジエノフィル）と、化合物（ａ４）のスペーサーが有するＲ５基（ジエノフィルまたはジエン）とのクリック反応により行われる。
【0110】
クリック反応は当業者に周知であり、例えばジエノフィルとジエンとの環化付加反応が含まれる。クリック反応の例を以下の図に示す。
【化45】
【0111】
これらの例において、反応による単一の位置異性体が示されているが、環化付加反応では複数の位置異性体が生成され得ることが理解される。
【0112】
ある実施形態において、クリック反応は以下の式の各化合物の間で行われる。
【0113】
【表1】
【0114】
本実施形態において、抗体または抗体断片は、式（Ｉｂｉｓ）または式（ＩＩｂｉｓ）中の置換基Ｘで表される脱離基の置換によってフックヘッドに結合する。この結果、鎖間ジスルフィド架橋が還元された後、抗体または抗体断片が再構築される。例えば、本発明の文脈において、全抗体の再構築とは、全ＬＨＨＬ抗体の大部分を得ることと定義される。全ＬＨＨＬ抗体および他の種（ＬＨＨ、ＨＨ、ＬＨ、Ｈ、Ｌ）の割合は、変性還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析により測定した光学濃度を用いて求める。例えば、ＬＨＨＬの割合が５０％を超えると、全抗体が良好に再構築されている。
【0115】
ある実施形態において、上述の方法を実施することにより、抗体／抗体断片あたりのプロテアーゼ比率が約０．５０～約５．０の範囲にある組成物を得ることができる。ある実施形態において、抗体が平均４．００±１．００（すなわち、３．００～５．００の範囲の任意の値、例えば３．００；３．０１；．．．；４．９９；５．００）分子、好ましくは４．００±０．５０のプロテアーゼと複合化している。ある実施形態において、抗体が平均２．００±０．５０（すなわち、１．５０～２．５０の範囲の任意の値、例えば１．５０；１．５１；．．．；２．４９；２．５０）分子、好ましくは２．００±０．３０のプロテアーゼと複合化している。ある実施形態において、抗体が平均１．００±０．５０（すなわち、０．５０～１．５０の範囲の任意の値、例えば０．５０；０．５１；．．．；１．４９；１．５０）分子、好ましくは１．００±０．３０のプロテアーゼと複合化している。ある実施形態において、Ｆａｂ抗体断片が平均１．００±０．３０（すなわち、０．７０～１．３０の範囲の任意の値、例えば０．７０；０．７１；．．．；１．２９；１．３０）分子、好ましくは１．００±０．１０のプロテアーゼと複合化している。
【0116】
ある実施形態において、Ｆａｂ’抗体断片が平均２．００±０．５０（すなわち、１．５０～２．５０の範囲の任意の値、例えば１．５０；１．５１；．．．；２．４９；２．５０）分子、好ましくは２．００±０．３０のプロテアーゼと複合化している。ある実施形態において、Ｆａｂ’抗体断片が平均１．００±０．５０（すなわち、０．５０～１．５０の範囲の任意の値、例えば０．５０；０．５１；．．．；１．４９；１．５０）分子、好ましくは１．００±０．３０のプロテアーゼと複合化している。
【0117】
ある実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片が平均２．００±０．５０（すなわち、１．５０～２．５０の範囲の任意の値、例えば１．５０；１．５１；．．．；２．４９；２．５０）分子、好ましくは２．００±０．３０のプロテアーゼと複合化している。ある実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片が平均１．００±０．５０（すなわち、０．５０～１．５０の範囲の任意の値、例えば０．５０；０．５１；．．．；１．４９；１．５０）分子、好ましくは１．００±０．３０のプロテアーゼと複合化している。ある実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片が平均４．００±１．００（すなわち、３．００～５．００の範囲の任意の値、例えば３．００；３．０１；．．．；４．９９；５．００）分子、好ましくは４．００±０．５０のプロテアーゼと複合化している。
【0118】
式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（ａ１）、（ａ２）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｃ１）、および（ｃ２）の化合物は、例えば還元剤の存在下で、文献に記載された技術に従って調製できる。ある実施形態において、抗体または抗体断片は緩衝液に溶解している。ある実施形態において、還元剤は、抗体または抗体断片に複合化される化合物よりも前に添加される。別の実施形態では、還元剤は、抗体または抗体断片に複合化される化合物と同時に添加される。
【0119】
本発明を以下の実施例によって説明するが、これらの実施例は例示に過ぎない。これらの実施例では、以下の略語を使用する。
【0120】
ＡＤＣ＝抗体薬物複合体
ＢＣＮ＝ビシクロノニン
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＤＢＣＯ＝ジベンジルシクロオクチン
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸
ＥＥＤＱ＝Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン
ｅｑ＝当量
ＨＡＴＵ＝ヘキサフルオロリン酸アザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム
ｍ／ｍ＝質量／質量比
ｍ／ｚ＝質量／電荷比
ＭＡＲ＝分子対抗体比
ＡＣＮ＝アセトニトリル
ＭｅＯＨ＝メタノール
ＭｅＯＤ＝重水素化メタノール
ＭＰＲ＝分子対プロテアーゼ比
ＭｇＳＯ４＝硫酸マグネシウム
ＮａＣｌ＝塩化ナトリウム
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
Ｐｄ／Ｃ＝パラジウム炭素
ＮＭＲ＝核磁気共鳴
ＨＲＭＳ＝高分解能質量分析
ＡＴ＝周囲温度（特に断りのない限り２０℃）
ＴＣＯ＝トランス－シクロオクテン
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ｔＲ＝保持時間
ｖ／ｖ＝体積／体積比
ＢＣＮ＝ビシクロノニン
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＤＢＣＯ＝ジベンジルシクロオクチン
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸
ＥＥＤＱ＝Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン
ｅｑ＝当量
ＨＡＴＵ＝ヘキサフルオロリン酸アザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム
ｍ／ｍ＝質量／質量比
ｍ／ｚ＝質量／電荷比
ＭＡＲ＝分子対抗体比
ＡＣＮ＝アセトニトリル
ＭｅＯＨ＝メタノール
ＭｅＯＤ＝重水素化メタノール
ＭＰＲ＝分子対プロテアーゼ比
ＭｇＳＯ４＝硫酸マグネシウム
ＮａＣｌ＝塩化ナトリウム
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
Ｐｄ／Ｃ＝パラジウム炭素
ＮＭＲ＝核磁気共鳴
ＨＲＭＳ＝高分解能質量分析
ＡＴ＝周囲温度（特に断りのない限り２０℃）
ＴＣＯ＝トランス－シクロオクテン
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ｔＲ＝保持時間
ｖ／ｖ＝体積／体積比
【0121】
分析方法
質量分析
質量分析（ＭＳ）による分析は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓシステム（英国ウィルムズロー）と接続したＶｉｏｎ ＩＭＳ Ｑｔｏｆ質量分析計、またはＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステムと接続したＢｒｕｋｅｒ ｍａＸｉｓ質量分析計を用いて行った。
質量分析
質量分析（ＭＳ）による分析は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓシステム（英国ウィルムズロー）と接続したＶｉｏｎ ＩＭＳ Ｑｔｏｆ質量分析計、またはＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステムと接続したＢｒｕｋｅｒ ｍａＸｉｓ質量分析計を用いて行った。
【0122】
Ｖｉｏｎ ＩＭＳ Ｑｔｏｆ質量分析計では、ＭＳ分析の前に、サンプル（２０μｇ）をＢＥＨ ＳＥＣ（２．１×１５０ｍｍ ３００Å）脱塩カラムでアイソクラティック勾配（５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５）により４０μＬ／分で脱塩した。バイパスバルブをプログラムして、溶媒が６．５分から９．５分の間のみ分析計に入るようにした。ＭＳデータは、１Ｈｚにおいて５００～８０００ｍ／ｚの範囲でＥＳＩ源を用いてポジティブモードで取得し、ＵＮＩＦＩ１．９ソフトウェアおよびデコンボリューション用ＭａｘＥｎｔアルゴリズムを使用して分析した。
【0123】
Ｂｒｕｋｅｒ ｍａＸｉｓ質量分析計では、ＭＳ分析の前に、溶媒Ａとして０．１％ギ酸水溶液、溶媒Ｂとして０．１％ギ酸のＡＣＮ溶液を用いて、８０℃に加熱したＭａｓｓＰＲＥＰ脱塩カラム（２．１×１０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）でサンプル（５μｇ）を５００μＬ／分で脱塩した。１分後、１．５分間でＢの５％から９０％のリニア勾配をかけた。ＭＳデータは、１Ｈｚにおいて９００～５０００ｍ／ｚの範囲でＥＳＩ源を用いてポジティブモードで取得し、ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ ４．４ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）およびデコンボリューション用ＭａｘＥｎｔアルゴリズムを使用して分析した。
‐プロテアーゼあたりのリンカーアームまたはリンカーアーム－スペーサーの数（ＭＰＲ）、
‐抗体または抗体断片あたりのフックヘッドまたはフックヘッド－スペーサーの数（ＭＡＲ）、
‐抗体または抗体断片あたりのプロテアーゼの数
は、観測されたピークの強度を用いて求めた。
‐プロテアーゼあたりのリンカーアームまたはリンカーアーム－スペーサーの数（ＭＰＲ）、
‐抗体または抗体断片あたりのフックヘッドまたはフックヘッド－スペーサーの数（ＭＡＲ）、
‐抗体または抗体断片あたりのプロテアーゼの数
は、観測されたピークの強度を用いて求めた。
【0124】
ＥＥＤＱを用いたペプチドカップリング
不活性雰囲気下、酸を無水ＡＣＮに溶解させてから、遮光しながらＥＥＤＱを加えた。遮光しながら媒体を２５℃で撹拌した。無水ＤＩＰＥＡの存在下で無水ＤＭＦにＴＦＡ塩形態の遊離アミンを溶解させた溶液を、遮光しながら加えた。この反応が完了するまで、媒体を２５℃で撹拌した。反応粗生成物をセミ分取ＨＰＬＣ（Ｇｉｌｓｏｎ ＰＬＣ ２０５０［ＡＲＭＥＮ Ｖ２システム（ポンプ）およびＥＣＯＭ ＴＯＹＤＡＤ６００（ＵＶ検出器）］２５４ｎｍ、２５℃でＵＶ検出；Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅＴＭＣ－１８カラム；５μｍ（２５０ｍｍ×１９．００ｍｍ）；０．１％ＴＦＡ（体積％）水溶液（溶媒Ａ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）で溶出；１７．１ｍＬ／分で、Ｂ２０％からＢ１００％を３７分間、その後Ｂ１００％を６分間の勾配）で精製し、濃縮および凍結乾燥後、カップリング生成物を得た。
不活性雰囲気下、酸を無水ＡＣＮに溶解させてから、遮光しながらＥＥＤＱを加えた。遮光しながら媒体を２５℃で撹拌した。無水ＤＩＰＥＡの存在下で無水ＤＭＦにＴＦＡ塩形態の遊離アミンを溶解させた溶液を、遮光しながら加えた。この反応が完了するまで、媒体を２５℃で撹拌した。反応粗生成物をセミ分取ＨＰＬＣ（Ｇｉｌｓｏｎ ＰＬＣ ２０５０［ＡＲＭＥＮ Ｖ２システム（ポンプ）およびＥＣＯＭ ＴＯＹＤＡＤ６００（ＵＶ検出器）］２５４ｎｍ、２５℃でＵＶ検出；Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅＴＭＣ－１８カラム；５μｍ（２５０ｍｍ×１９．００ｍｍ）；０．１％ＴＦＡ（体積％）水溶液（溶媒Ａ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）で溶出；１７．１ｍＬ／分で、Ｂ２０％からＢ１００％を３７分間、その後Ｂ１００％を６分間の勾配）で精製し、濃縮および凍結乾燥後、カップリング生成物を得た。
【0125】
生体共役反応
生体共役反応緩衝液：リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジン－エタンスルホン酸等の１×生理食塩水緩衝液であって、ｐＨ範囲が６～９、最終ＮａＣｌ濃度が５０～３００ｍＭ、最終ＥＤＴＡ濃度が０．１～１０ｍＭであるもの。例えば、ｐＨが８．３、最終ＮａＣｌ濃度が１８０ｍＭ、最終ＥＤＴＡ濃度が１ｍＭの１×リン酸緩衝液。
生体共役反応緩衝液：リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジン－エタンスルホン酸等の１×生理食塩水緩衝液であって、ｐＨ範囲が６～９、最終ＮａＣｌ濃度が５０～３００ｍＭ、最終ＥＤＴＡ濃度が０．１～１０ｍＭであるもの。例えば、ｐＨが８．３、最終ＮａＣｌ濃度が１８０ｍＭ、最終ＥＤＴＡ濃度が１ｍＭの１×リン酸緩衝液。
【0126】
還元剤：ジチオスレイトール、β－メルカプトエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィンから選択される還元剤を０．１～１０ｍＭの濃度で生体共役反応溶液に溶解させた溶液。例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を生体共役反応緩衝液に溶解させた１ｍＭ溶液。
【0127】
化合物：ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＴＨＦ、ＡＣＮ、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジオキサンから選択される有機溶媒の混合液に化合物３、４、６、および７を０．１～１０ｍＭの濃度で溶解させた溶液。例えば、２０％ＤＭＦと８０％ＭｅＯＨとから構成される有機溶媒の混合液に溶解させた１ｍＭ溶液。
【0128】
精製：緩衝液ＰＢＳ ＧｉｂｃｏＴＭ（１×、ｐＨ７．４）を用いてＳｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ）Ｇ－２５またはＰＤ－１０で反応混合物を立体排除によって精製して残留化学試薬を除去した。
【0129】
必要に応じて、精製したタンパク質を、１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心濃縮器を用いて遠心分離（１０，０００Ｇ）により＋４℃で濃縮した。
【0130】
プロテアーゼの官能基化
官能基化緩衝液：リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸等の生理食塩水緩衝液であって、濃度が２ｍＭ～２Ｍ、ｐＨ範囲が６～９、最終ＮａＣｌ濃度が０～３Ｍであるもの。例えば、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ緩衝液。
官能基化緩衝液：リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸等の生理食塩水緩衝液であって、濃度が２ｍＭ～２Ｍ、ｐＨ範囲が６～９、最終ＮａＣｌ濃度が０～３Ｍであるもの。例えば、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ緩衝液。
【0131】
ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＴＨＦ、ＡＣＮ、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジオキサンから選択される有機溶媒（混合溶媒または単一溶媒）に化合物１６または１８を１～１０００ｍＭの濃度で溶解させた溶液。例えば、アセトニトリルに溶解させた１００ｍＭ溶液。
【0132】
精製：緩衝液ＰＢＳ ＧｉｂｃｏＴＭ（１Ｘ ｐＨ７．４）を用いてＰＤ－１０（Ｃｙｔｉｖａ）で反応混合物を立体排除によって精製して残留化学試薬を除去した。
【0133】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、濃縮部分のアクリルアミド濃度が４％、泳動部分のアクリルアミド濃度が６％となるよう調製した。Ｌａｅｍｍｌｉ ４×緩衝液（０．３ｍＭブロモフェノールブルー、２Ｍグリセリン、２０ｍＭ ＴｒｉｓＢａｓｅ、０．０４％ドデシル硫酸ナトリウム）をサンプル（１．２μｇ）に加え、次いでサンプルを９５℃で１０分間インキュベートした。大振幅分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｅｅＢｌｕｅ（Ｒ）Ｐｌｕｓ２ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用してタンパク質の分子量を推定した。ゲルは、ＮｕＰＡＧＥ泳動緩衝液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ；５０ｍＭ ＴｒｉｓＢａｓｅ；０．１％ＳＤＳ（ｖ／ｖ）；１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）中、１００Ｖで１０分間、次いで１４０Ｖで３５分間泳動するように設定した。水で洗浄後、ゲルをクマシーブルー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＩｍｐｅｒｉａｌＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ）で染色した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてデンシトメトリー解析を行い、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） Ｖａｎｉｌｌａフィルターを適用して白黒での解析を行った。
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、濃縮部分のアクリルアミド濃度が４％、泳動部分のアクリルアミド濃度が６％となるよう調製した。Ｌａｅｍｍｌｉ ４×緩衝液（０．３ｍＭブロモフェノールブルー、２Ｍグリセリン、２０ｍＭ ＴｒｉｓＢａｓｅ、０．０４％ドデシル硫酸ナトリウム）をサンプル（１．２μｇ）に加え、次いでサンプルを９５℃で１０分間インキュベートした。大振幅分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｅｅＢｌｕｅ（Ｒ）Ｐｌｕｓ２ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用してタンパク質の分子量を推定した。ゲルは、ＮｕＰＡＧＥ泳動緩衝液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ；５０ｍＭ ＴｒｉｓＢａｓｅ；０．１％ＳＤＳ（ｖ／ｖ）；１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）中、１００Ｖで１０分間、次いで１４０Ｖで３５分間泳動するように設定した。水で洗浄後、ゲルをクマシーブルー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＩｍｐｅｒｉａｌＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ）で染色した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてデンシトメトリー解析を行い、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） Ｖａｎｉｌｌａフィルターを適用して白黒での解析を行った。
【実施例】
【0134】
実施例１：ＤＢＣＯ２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ２－エチル－カルバメート（３）
【化46】
【0135】
ステップ１：２，６－ビス（ヒドロキシメチル）イソニコチン酸１の調製
２，６－ビス（ヒドロキシメチル）イソニコチン酸ベンジル（１３３０ｍｇ；４．８６７ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に溶解させ、次いで溶液をアルゴンで１５分間脱気した。１０質量％のＰｄ／Ｃ（１３３ｍｇ；１０％ｍ／ｍ）を加え、混合物を２０℃の水素雰囲気下で４時間３０分撹拌した。反応媒体をＤｉｃａｌｉｔｅＴＭでろ過した（ＭｅＯＨ洗浄）。ろ液を減圧下で濃縮して、２，６－ビス（ヒドロキシメチル）イソニコチン酸１（８７４ｍｇ；９８％）をオフホワイト色固体として得た。
２，６－ビス（ヒドロキシメチル）イソニコチン酸ベンジル（１３３０ｍｇ；４．８６７ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に溶解させ、次いで溶液をアルゴンで１５分間脱気した。１０質量％のＰｄ／Ｃ（１３３ｍｇ；１０％ｍ／ｍ）を加え、混合物を２０℃の水素雰囲気下で４時間３０分撹拌した。反応媒体をＤｉｃａｌｉｔｅＴＭでろ過した（ＭｅＯＨ洗浄）。ろ液を減圧下で濃縮して、２，６－ビス（ヒドロキシメチル）イソニコチン酸１（８７４ｍｇ；９８％）をオフホワイト色固体として得た。
【0136】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.78 (s; 2H); 5.54 (br s; 2H); 4.59 (s; 4H).
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 166.7 (1C); 162.5 (2C); 139.4 (1C); 117.3 (2C); 64.0 (2C).
HRMS (ESI): m/z calculated for C8H9NO4 [M] = 183.0532; observed [M] = 183.0526.
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 166.7 (1C); 162.5 (2C); 139.4 (1C); 117.3 (2C); 64.0 (2C).
HRMS (ESI): m/z calculated for C8H9NO4 [M] = 183.0532; observed [M] = 183.0526.
【0137】
ステップ２：２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコチン酸２の調製
不活性雰囲気下で、２，６－ビス（ヒドロキシメチル）イソニコチン酸１（１７０ｍｇ；０．９２８ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させた。溶液を０℃に冷却し、三臭化リン（３５２μＬ；３．７１２ｍｍｏｌ；４．０ｅｑ）を加えた。媒体を２５℃に戻し、完全に変換されるまで撹拌および冷却した（４時間）。粗媒体を０℃に冷却し、水を加えて加水分解した。形成された沈殿物をろ過し、冷水で数回すすいで、２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコチン酸２（２４０ｍｇ；８４％）をベージュ色固体として得た。
不活性雰囲気下で、２，６－ビス（ヒドロキシメチル）イソニコチン酸１（１７０ｍｇ；０．９２８ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させた。溶液を０℃に冷却し、三臭化リン（３５２μＬ；３．７１２ｍｍｏｌ；４．０ｅｑ）を加えた。媒体を２５℃に戻し、完全に変換されるまで撹拌および冷却した（４時間）。粗媒体を０℃に冷却し、水を加えて加水分解した。形成された沈殿物をろ過し、冷水で数回すすいで、２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコチン酸２（２４０ｍｇ；８４％）をベージュ色固体として得た。
【0138】
1H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.98 (s; 2H); 4.68 (s; 4H).
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 166.9 (1C); 159.7 (2C); 142.4 (1C); 123.5 (2C); 33.2 (2C).
HRMS (ESI): m/z calculated for C8H8Br2NO2 [M+H]+ = 307.8916; observed [M+H]+ = 307.8920.
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 166.9 (1C); 159.7 (2C); 142.4 (1C); 123.5 (2C); 33.2 (2C).
HRMS (ESI): m/z calculated for C8H8Br2NO2 [M+H]+ = 307.8916; observed [M+H]+ = 307.8920.
【0139】
ステップ３：ＤＢＣＯ２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ２－エチル－カルバメート３の調製
ＥＥＤＱでカップリングするための一般的なプロトコルに従って、２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコチン酸（６．３ｍｇ；２０．４μｍｏｌ；２．２ｅｑ）を無水ＡＣＮ（１０２０μＬ）に溶解させ、次いでＥＥＤＱ（３８．４ｍｇ；１５５．３μｍｏｌ；１６．４ｅｑ）を遮光しながら加えた。遮光しながら媒体を２５℃で３０分間撹拌した。無水ＤＩＰＥＡ（１６．６４μＬ；９５．５μｍｏｌ；１０．１ｅｑ）の存在下で無水ＤＭＦ（８６５μＬ）にアミノ－ＰＥＧ２－ＤＢＣＯのＴＦＡ塩（５．２ｍｇ；９．５μｍｏｌ；１．０ｅｑ）を溶解させた溶液を、遮光しながら加えた。媒体を２５℃で１時間撹拌した。反応粗生成物をセミ分取ＨＰＬＣ（ｔＲ＝２５分）によって精製し、濃縮および凍結乾燥後、ＤＢＣＯ２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ２－エチル－カルバメート３を淡黄色ラッカーとして得た（３．２ｍｇ；４７％）。
ＥＥＤＱでカップリングするための一般的なプロトコルに従って、２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコチン酸（６．３ｍｇ；２０．４μｍｏｌ；２．２ｅｑ）を無水ＡＣＮ（１０２０μＬ）に溶解させ、次いでＥＥＤＱ（３８．４ｍｇ；１５５．３μｍｏｌ；１６．４ｅｑ）を遮光しながら加えた。遮光しながら媒体を２５℃で３０分間撹拌した。無水ＤＩＰＥＡ（１６．６４μＬ；９５．５μｍｏｌ；１０．１ｅｑ）の存在下で無水ＤＭＦ（８６５μＬ）にアミノ－ＰＥＧ２－ＤＢＣＯのＴＦＡ塩（５．２ｍｇ；９．５μｍｏｌ；１．０ｅｑ）を溶解させた溶液を、遮光しながら加えた。媒体を２５℃で１時間撹拌した。反応粗生成物をセミ分取ＨＰＬＣ（ｔＲ＝２５分）によって精製し、濃縮および凍結乾燥後、ＤＢＣＯ２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ２－エチル－カルバメート３を淡黄色ラッカーとして得た（３．２ｍｇ；４７％）。
【0140】
1H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.79 (s; 2H); 7.65 ‐ 7.55 (m; 2H); 7.48 ‐ 7.42 (m; 3H); 7.40 ‐ 7.26 (m; 2H); 7.25 ‐ 7.19 (m; 1H); 5,12 (d; J = 14.0 Hz; 1H); 4.62 (s; 4H); 3.70 (d; J = 14.0 Hz; 2H); 3.67 ‐ 3.53 (m; 8H); 3.48 ‐ 3.40 (m; 2H); 3.26 ‐ 3.18 (m; 2H); 2.79 ‐ 2.60 (m; 1H); 2.39 ‐ 2.27 (m; 1H); 2.24 ‐ 2.09 (m; 1H); 2.05 ‐ 1.90 (m; 1H).
HRMS (ESI): m/z calculated for C33H35Br2N4O5 [M+H]+ = 725.0969; observed [M+H]+ = 725.0959.
Analytical HPLC: tR = 5.592 minutes; 93%.
HRMS (ESI): m/z calculated for C33H35Br2N4O5 [M+H]+ = 725.0969; observed [M+H]+ = 725.0959.
Analytical HPLC: tR = 5.592 minutes; 93%.
【0141】
実施例２：ＤＢＣＯ２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ４－エチル－カルバメート４
【化47】
【0142】
ＥＥＤＱでカップリングするための一般的なプロトコルに従って、２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコチン酸２（４．１ｍｇ；１３．３μｍｏｌ；１．７ｅｑ）を無水ＡＣＮ（８８０μＬ）に溶解させ、次いでＥＥＤＱ（２５．１ｍｇ；１０１．４μｍｏｌ；１３．０ｅｑ）を遮光しながら加えた。遮光しながら媒体を２５℃で４５分間撹拌した。無水ＤＩＰＥＡ（１０．８μＬ；６２．４μｍｏｌ；８．０ｅｑ）の存在下で無水ＤＭＦ（７４５μＬ）にＤＢＣＯアミノ－ＰＥＧ４－エチル－カルバメートのＴＦＡ塩（５．０ｍｇ；７．８μｍｏｌ；１．０ｅｑ）を溶解させた溶液を、遮光しながら加えた。媒体を２５℃で１時間撹拌した。反応粗生成物をセミ分取ＨＰＬＣ（ｔＲ＝２５分）によって精製し、濃縮および凍結乾燥後、ＤＢＣＯ２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ４－エチル－カルバメート４を淡黄色固体として得た（１．７ｍｇ；２７％）。
【0143】
1H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.82 (s; 2H); 7.65 ‐ 7.57 (m; 2H); 7.48 ‐ 7.43 (m; 3H); 7.38 ‐ 7.28 (m; 2H); 7.26 ‐ 7.22 (m; 1H); 5.35 (m; 1H); 5.12 (d; J = 13.9 Hz; 1H); 4.65 ‐ 4.63 (m; 6H); 3.70 (d; J = 13.9 Hz; 1H); 3.68 ‐ 3.51 (m; 14H); 3.40 ‐ 3.37 (m; 2H); 3.21 (t; J = 5.8 Hz; 2H); 2.74 ‐ 2.64 (m; 1H); 2.41 ‐ 2.31 (m; 1H); 2.22 ‐ 2.12 (m; 1H); 2.08 ‐ 1.96 (m; 1H).
HRMS (ESI): m/z calculated for C37H43Br2N4O7 [M+H]+ = 813.1493; observed [M+H]+ = 813.1480.
analytical HPLC: tR = 5.575 minutes; 88%.
HRMS (ESI): m/z calculated for C37H43Br2N4O7 [M+H]+ = 813.1493; observed [M+H]+ = 813.1480.
analytical HPLC: tR = 5.575 minutes; 88%.
【0144】
実施例３：２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ４－ＢＣＮ６
【化48】
【0145】
ステップ１：ＢＣＮ アミノ－ＰＥＧ４－エチル－カルバメート５の調製
ＢＣＮ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（２０ｍｇ；６８．７μｍｏｌ；１．０ｅｑ）を無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、次いでアミノ－ＰＥＧ４－エチレンアミノフルオレニルメトキシカルボニルクロリド（３４ｍｇ；６８．７μｍｏｌ；１．０ｅｑ）および無水ＤＩＰＥＡ（３５．９μＬ；２０６．１μｍｏｌ；３．０ｅｑ）を加えた。反応媒体を完全に変換されるまで２８℃で撹拌した（１時間４５分）。ピペリジンを加え（１００μＬ；１０％ｖ／ｖ）、媒体を２５℃で３０分間撹拌した。移動相に酸を使用しないセミ分取ＨＰＬＣ（ｔＲ＝３３分）によって反応粗生成物を精製し、濃縮および凍結乾燥後、ＢＣＮ アミノ－ＰＥＧ４－エチル－カルバメート５を無色オイルとして得た（１２．５ｍｇ；４５％）。
ＢＣＮ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（２０ｍｇ；６８．７μｍｏｌ；１．０ｅｑ）を無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、次いでアミノ－ＰＥＧ４－エチレンアミノフルオレニルメトキシカルボニルクロリド（３４ｍｇ；６８．７μｍｏｌ；１．０ｅｑ）および無水ＤＩＰＥＡ（３５．９μＬ；２０６．１μｍｏｌ；３．０ｅｑ）を加えた。反応媒体を完全に変換されるまで２８℃で撹拌した（１時間４５分）。ピペリジンを加え（１００μＬ；１０％ｖ／ｖ）、媒体を２５℃で３０分間撹拌した。移動相に酸を使用しないセミ分取ＨＰＬＣ（ｔＲ＝３３分）によって反応粗生成物を精製し、濃縮および凍結乾燥後、ＢＣＮ アミノ－ＰＥＧ４－エチル－カルバメート５を無色オイルとして得た（１２．５ｍｇ；４５％）。
【0146】
1H NMR (300 MHz, MeOD) δ 4.17 (d; J = 8,2 Hz; 2H); 3.70 ‐ 3.62 (m; 12H); 3.58 ‐ 3.53 (m; 4H); 3.30 (t; J = 5.0 Hz; 2H); 2.84 (t; J = 5 Hz; 2H); 2.33 ‐ 2.14 (m; 6H); 1.70 ‐ 1.58 (m; 2H); 1.41 (q; J = 8,5 Hz; 1H); 1.03 ‐ 0.93 (m; 2H).
13C NMR (75 MHz, MeOD) δ 159.3 (1C); 99.5 (1C); 73.0 ‐ 71.1 (8C); 63.7 (1C); 42.0 (1C); 41.7 (1C); 30.2 (2C); 21.9 (2C); 21.4 (2C); 19.0 (1C).
HRMS (ESI): m/z calculated for C21H36N2O6 [M] = 412.2573; observed [M] = 412.2583.
13C NMR (75 MHz, MeOD) δ 159.3 (1C); 99.5 (1C); 73.0 ‐ 71.1 (8C); 63.7 (1C); 42.0 (1C); 41.7 (1C); 30.2 (2C); 21.9 (2C); 21.4 (2C); 19.0 (1C).
HRMS (ESI): m/z calculated for C21H36N2O6 [M] = 412.2573; observed [M] = 412.2583.
【0147】
ステップ２：２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ４－ＢＣＮ６の調製
不活性雰囲気下、２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコチン酸２（１５．９ｍｇ；５１．５μｍｏｌ；１．７ｅｑ）を無水ＡＣＮ（１．７ｍＬ）に溶解させ、次いでＥＥＤＱ（９７．４ｍｇ；３９３．９μｍｏｌ；１３．０ｅｑ）を遮光しながら加えた。遮光しながら媒体を２５℃で４５分間撹拌した。無水ＤＩＰＥＡ（４２μＬ；２４２．４μｍｏｌ；８．０ｅｑ）の存在下で無水ＤＭＦ（１．４ｍＬ）にＢＣＮ アミノ－ＰＥＧ４－エチルカルバメート５（１２．５ｍｇ；３０．３μｍｏｌ；１．０ｅｑ）を溶解させた溶液を、遮光しながら加えた。媒体を２５℃で１０分間撹拌した。移動相に酸を使用しないセミ分取ＨＰＬＣ（ｔＲ＝３３．５分）によって反応粗生成物を精製し、濃縮および凍結乾燥後、２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ４－ＢＣＮ６を淡黄色ラッカーとして得た（２．１ｍｇ；１０％）。
不活性雰囲気下、２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコチン酸２（１５．９ｍｇ；５１．５μｍｏｌ；１．７ｅｑ）を無水ＡＣＮ（１．７ｍＬ）に溶解させ、次いでＥＥＤＱ（９７．４ｍｇ；３９３．９μｍｏｌ；１３．０ｅｑ）を遮光しながら加えた。遮光しながら媒体を２５℃で４５分間撹拌した。無水ＤＩＰＥＡ（４２μＬ；２４２．４μｍｏｌ；８．０ｅｑ）の存在下で無水ＤＭＦ（１．４ｍＬ）にＢＣＮ アミノ－ＰＥＧ４－エチルカルバメート５（１２．５ｍｇ；３０．３μｍｏｌ；１．０ｅｑ）を溶解させた溶液を、遮光しながら加えた。媒体を２５℃で１０分間撹拌した。移動相に酸を使用しないセミ分取ＨＰＬＣ（ｔＲ＝３３．５分）によって反応粗生成物を精製し、濃縮および凍結乾燥後、２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ４－ＢＣＮ６を淡黄色ラッカーとして得た（２．１ｍｇ；１０％）。
【0148】
1H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.84 (s; 2H); 4.65 (s; 4H); 4.13 (d; J = 8,1 Hz; 2H); 3.70 ‐ 3.55 (m; 20H); 3.50 (t; J = 5.5 Hz; 2H); 3.28 ‐ 3.23 (m; 2H); 2.29 ‐ 2.11 (m; 6H); 1.66 ‐ 1.55 (m; 2H); 1.41 ‐ 1.35 (m; 1H); 0.96 ‐ 0.87 (m; 2H).
HRMS (ESI): m/z calculated for C29H42Br2N3O7 [M+H]+ = 702.1384; observed [M+H]+ = 702.1372.
Analytical HPLC: tR = 5.067 minutes; 91%.
HRMS (ESI): m/z calculated for C29H42Br2N3O7 [M+H]+ = 702.1384; observed [M+H]+ = 702.1372.
Analytical HPLC: tR = 5.067 minutes; 91%.
【0149】
実施例４：２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ２－ＴＣＯ７
【化49】
【0150】
ＥＥＤＱでカップリングするための一般的なプロトコルに従って、２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコチン酸２（２１．６ｍｇ；６９．９μｍｏｌ；２．１ｅｑ）を無水ＡＣＮ（１．０ｍＬ）に溶解させ、次いでＥＥＤＱ（４１．２ｍｇ；１６６．５μｍｏｌ；５．０ｅｑ）を遮光しながら加えた。遮光しながら媒体を２５℃で３０分間撹拌した。無水ＤＩＰＥＡ（２３．２μＬ；１３３．２μｍｏｌ；４．０ｅｑ）の存在下で無水ＤＭＦ（２５０μＬ）にＴＣＯアミノ－ＰＥＧ２－エチルカルバメート（１０．０ｍｇ；３３．３μｍｏｌ；１．０ｅｑ）を溶解させた溶液を、遮光しながら加えた。媒体を２５℃で１０分間撹拌した。反応粗生成物をセミ分取ＨＰＬＣ（ｔＲ＝２７．８分）によって精製し、濃縮および凍結乾燥後、２，６－ビス（ブロモメチル）イソニコタミド－ＰＥＧ２－ＴＣＯ７を淡黄色ラッカーとして得た（７．５ｍｇ；３８％）。
【0151】
1H NMR (300 MHz, MeOD) δ 8,85 (m; 1H); 7.84 (s, 2H); 5.68 ‐ 5.40 (m; 2H); 4.65 (s; 4H); 4.32 ‐ 4.25 (m; 1H); 3.70 ‐ 3.57 (m; 8H); 3.54 ‐ 3.49 (m; 2H); 3.27 ‐ 3.22 (m; 2H); 2.35 ‐ 2.26 (m; 2H); 2.00 ‐ 1.85 (m; 4H); 1.77 ‐ 1.50 (m; 4H).
HRMS (ESI): m/z calculated for C23H34Br2N3O5 [M+H]+ = 590.0860; observed [M+H]+ = 590.0860.
HRMS (ESI): m/z calculated for C23H34Br2N3O5 [M+H]+ = 590.0860; observed [M+H]+ = 590.0860.
【0152】
実施例５：ＤＢＣＯメチルテトラジン－ＰＥＧ４－アミド－ＰＥＧ２－エチルカルバメート８
【化50】
【0153】
メチルテトラジン－ＰＥＧ４－エチル酸（１１．０ｍｇ；２５．３μｍｏｌ；１．４ｅｑ）をＤＭＦ（２３０μＬ）に溶解させ、次いでＨＡＴＵ（１７．５ｍｇ；４６．０μｍｏｌ；２．０ｅｑ）および２，６－ルチジン（１０．６６μＬ；９２．０μｍｏｌ；４．０ｅｑ）を加えた。媒体を２２℃で１０分間撹拌した後、ＤＭＦ（２３０μＬ）にＴＦＡ塩形態のＤＢＣＯアミノ－ＰＥＧ２－エチルカルバメート（１０．０ｍｇ；１８．２μｍｏｌ；１．０ｅｑ）を溶解させた溶液を加えた。媒体を２２℃で１４時間撹拌した。反応粗生成物をセミ分取ＨＰＬＣ（ｔＲ＝２５．０分）によって精製し、濃縮および凍結乾燥後、ＤＢＣＯメチルテトラジン－ＰＥＧ４－アミド－ＰＥＧ２－エチルカルバメート８をピンク色ラッカーとして得た（１３．７ｍｇ；８８％）。
【0154】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,52 (dt; J = 9.5; 2.0 Hz; 2H); 7.65 (dd; J = 6.7; 1.6 Hz; 1H); 7.53 ‐ 7.47 (m; 1H); 7.40 ‐ 7.28 (m; 5H); 7.25 ‐ 7.22 (m; 1H); 7.08 (dt; J = 9.5; 2.0 Hz; 2H); 6.83 ‐ 6.79 (m; 1H); 6.32 ‐ 6.28 (m; 1H); 5.14 (d; J = 14.3 Hz; 1H); 4.22 (t; J = 5.4 Hz; 2H); 3.89 (t, J = 4.8 Hz; 2H); 3.75 ‐ 3.51 (m; 24H); 3.47‐ 3.48 (m; 4H); 3.35 ‐ 3.30 (m; 2H); 3.05 (s; 3H) under water; 2.86 ‐ 2.75 (m; 1H); 2.53 ‐ 2.39 (m; 3H); 2.18 (dt; J = 15.1; 6.0 Hz; 1H); 1.94 (dt; J = 19.9; 6.0 Hz; 1H).
HRMS (ESI): m/z calculated for C45H56N7O10 [M+H]+ = 854.4083; observed [M+H]+ = 854.4091.
Analytical HPLC: tR = 5.458 min; 94%.
HRMS (ESI): m/z calculated for C45H56N7O10 [M+H]+ = 854.4083; observed [M+H]+ = 854.4091.
Analytical HPLC: tR = 5.458 min; 94%.
【0155】
実施例６：トラスツズマブＦａｂ（ＴＴＺ Ｆａｂ）の生体共役反応
トラスツズマブＩｇＧをＩｇｄＥまたはパパインで消化することにより、トラスツズマブＦａｂを得た。質量はそれぞれ４７，４９９Ｄａおよび４７，６３７Ｄａであった。
トラスツズマブＩｇＧをＩｇｄＥまたはパパインで消化することにより、トラスツズマブＦａｂを得た。質量はそれぞれ４７，４９９Ｄａおよび４７，６３７Ｄａであった。
【0156】
トラスツズマブＦａｂは、生体共役反応緩衝液中で０．１０ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの濃度、例えば０．６７ｍｇ／ｍＬで使用した。
【0157】
不活性雰囲気下、生体共役反応緩衝液中のトラスツズマブＦａｂ（５～５０００μｇ、例えば３３．５μｇ；１ｅｑ）に還元剤（４～１００ｅｑ、例えば８ｅｑ）を加え、反応媒体を１５～４０℃、例えば３７℃で０．２５～５時間、例えば２時間インキュベートした。次いで、化合物３、４、６、または７（４～１００ｅｑ、例えば８ｅｑ）の溶液を不活性雰囲気下で加え、反応媒体を１５～４０℃、例えば３７℃で０．５～１５時間、例えば２．５時間撹拌し、最終生成物を立体排除により精製し、必要に応じて濃縮する。
【0158】
化合物９：ＴＴＺ Ｆａｂ－化合物３複合体
【0159】
変性ＭＳ分析
【表2】
【0160】
化合物１０：ＴＴＺ Ｆａｂ－化合物４複合体
【0161】
変性ＭＳ分析
【表3】
【0162】
化合物１１：ＴＴＺ Ｆａｂ－化合物６複合体
【0163】
変性ＭＳ分析
【表4】
【0164】
化合物１２：ＴＴＺ Ｆａｂ－化合物７複合体
【0165】
変性ＭＳ分析
【表5】
【0166】
実施例７：Ｆａｂ １Ｅ１２の生体共役反応
ＩｇＧ １Ｅ１２をＩｇｄＥで消化して１Ｅ１２ Ｆａｂを得た。
ＩｇＧ １Ｅ１２をＩｇｄＥで消化して１Ｅ１２ Ｆａｂを得た。
【0167】
１Ｅ１２ Ｆａｂは、生体共役反応緩衝液中で０．１０ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの濃度、例えば０．３４ｍｇ／ｍＬで使用した。
【0168】
不活性雰囲気下、生体共役反応緩衝液中の１Ｅ１２ Ｆａｂ（５～５０００μｇ、例えば１７．０μｇ；１ｅｑ）に還元剤（４～１００ｅｑ、例えば８ｅｑ）を加え、反応媒体を１５～４０℃、例えば３７℃で０．２５～５時間、例えば２時間インキュベートした。次いで、化合物３、４、または６の溶液（４～１００ｅｑ、例えば８ｅｑ）を不活性雰囲気下で加え、反応媒体を１５～４０℃、例えば３７℃で０．５～１５時間、例えば２．５時間撹拌し、最終生成物を立体排除により精製し、必要に応じて濃縮する。
【0169】
化合物１３：１Ｅ１２ Ｆａｂ－化合物３複合体
【0170】
変性ＭＳ分析
【表6】
【0171】
化合物１４：１Ｅ１２ Ｆａｂ－化合物４複合体
【0172】
変性ＭＳ分析
【表7】
【0173】
化合物１５：１Ｅ１２ Ｆａｂ－化合物６複合体
【0174】
変性ＭＳ分析
【表8】
【0175】
実施例８：反応中間体の合成
２－アジド酢酸４－メトキシフェニル１６の調製
２－アジド酢酸４－メトキシフェニル１６の調製
【化51】
【0176】
４－メトキシフェノール（９８．４ｍｇ；０．７９ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＤＣＭ（２．５ｍＬ）に溶解させ、４－ジメチルアミノピリジン（９．８ｍｇ；０．０８ｍｍｏｌ；０．１ｅｑ）を反応媒体に加えた。並行して、２－アジド酢酸（７１．２μＬ；０．９５ｍｍｏｌ；１．２ｅｑ）をＤＣＭ（２．５ｍＬ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（１４７．３μＬ；０．９５ｍｍｏｌ；１．２ｅｑ）をこの第２の溶液に加えた。両溶液を２２℃で１５分間撹拌した。第２の溶液を第１の溶液に徐々に加え、次いで反応媒体を２２℃で１６時間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ１２ｇ、ＤＣＭ１００％）で精製して、２－アジド酢酸４－メトキシフェニル１６（９７．４ｍｇ；５９％）を黄色オイルとして得た。
【0177】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.08 ‐ 7.03 (m; 2H); 6.93 ‐ 6.88 (m; 2H); 4.12 (s; 2H); 3.81 (s; 3H).
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 167.34 (1C); 157.80 (1C); 143.74 (1C); 122.11 (2C); 114.74 (2C); 55.77 (1C); 50.59 (1C).
HRMS (ESI): m/z calculated for C9H9N3O3Na [M+Na]+ = 230.0541; observed [M+Na]+ = 230.0536.
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 167.34 (1C); 157.80 (1C); 143.74 (1C); 122.11 (2C); 114.74 (2C); 55.77 (1C); 50.59 (1C).
HRMS (ESI): m/z calculated for C9H9N3O3Na [M+Na]+ = 230.0541; observed [M+Na]+ = 230.0536.
【0178】
４－メトキシフェニル１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘキサデカン－１６－オエート１８の調製
【化52】
【0179】
ａ）１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘキサデカン－１６－オイック酸１７の調製
１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン（７４．１ｍｇ；０．３４ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）を無水ジオキサン（１．５ｍＬ）に溶解させ、無水コハク酸（３４．０ｍｇ；０．３４ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）を反応媒体に加えた。反応媒体を８０℃で３時間撹拌した。ＡＴに戻し、酢酸エチルで希釈した後、有機相を水（３×１０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ溶液（１×１０ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。溶液を減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ４ｇ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９０：１０）で精製して、１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘキサデカン－１６－オイック酸１７（３０．０ｍｇ；２８％）を黄色オイルとして得た。
１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン（７４．１ｍｇ；０．３４ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）を無水ジオキサン（１．５ｍＬ）に溶解させ、無水コハク酸（３４．０ｍｇ；０．３４ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）を反応媒体に加えた。反応媒体を８０℃で３時間撹拌した。ＡＴに戻し、酢酸エチルで希釈した後、有機相を水（３×１０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ溶液（１×１０ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。溶液を減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ４ｇ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９０：１０）で精製して、１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘキサデカン－１６－オイック酸１７（３０．０ｍｇ；２８％）を黄色オイルとして得た。
【0180】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6.64 (m; 1H); 3.68 ‐ 3.60 (m; 10H); 3.56 ‐ 3.53 (m; 2H); 3.46 ‐ 3.37 (m; 4H); 2.69 ‐ 2.63 (m; 2H); 2.53 ‐ 2.49 (m; 2H).
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 175.64 (1C); 172.58 (1C); 70.75 (1C); 70.69 (1C); 70.56 (1C); 70.27 (1C); 70.07 (1C); 69.71 (1C); 50.76 (1C); 39.57 (1C); 31.00 (1C); 30.12 (1C).
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 175.64 (1C); 172.58 (1C); 70.75 (1C); 70.69 (1C); 70.56 (1C); 70.27 (1C); 70.07 (1C); 69.71 (1C); 50.76 (1C); 39.57 (1C); 31.00 (1C); 30.12 (1C).
【0181】
ｂ）４－メトキシフェニル１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘキサデカン－１６－オエート１８の調製
４－メトキシフェノール（９．７ｍｇ；０．０８ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解させ、４－ジメチルアミノピリジン（１．１ｍｇ；０．００９ｍｍｏｌ；０．１ｅｑ）を反応媒体に加えた。並行して、１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘキサデカン－１６－オイック酸１７（３０．０ｍｇ；０．０９ｍｍｏｌ；１．２ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（１４．６μＬ；０．０９ｍｍｏｌ；１．２ｅｑ）をこの第２の溶液に加えた。両溶液を２２℃で１５分間撹拌した。第２の溶液を第１の溶液に注意深く加え、次いで反応媒体を２２℃で１６時間撹拌した。水中で回収した後、水相をＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出し、次いで有機相を水（１×１０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ溶液（１×１０ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ１２ｇ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９０：１０）で精製して、４－メトキシフェニル１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘキサデカン－１６－オエート１８を黄色オイルとして得た。
４－メトキシフェノール（９．７ｍｇ；０．０８ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解させ、４－ジメチルアミノピリジン（１．１ｍｇ；０．００９ｍｍｏｌ；０．１ｅｑ）を反応媒体に加えた。並行して、１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘキサデカン－１６－オイック酸１７（３０．０ｍｇ；０．０９ｍｍｏｌ；１．２ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（１４．６μＬ；０．０９ｍｍｏｌ；１．２ｅｑ）をこの第２の溶液に加えた。両溶液を２２℃で１５分間撹拌した。第２の溶液を第１の溶液に注意深く加え、次いで反応媒体を２２℃で１６時間撹拌した。水中で回収した後、水相をＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出し、次いで有機相を水（１×１０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ溶液（１×１０ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ１２ｇ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９０：１０）で精製して、４－メトキシフェニル１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘキサデカン－１６－オエート１８を黄色オイルとして得た。
【0182】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.04 ‐ 6.99 (m; 2H); 6.90 ‐ 6.86 (m; 2H); 6.33 (bs; 1H); 3.80 (s; 3H); 3.71 ‐ 3.61 (m; 10H); 3.58 ‐ 3.55 (m; 2H); 3.50 ‐ 3.47 (m; 2H); 3.41 ‐ 3.38 (m; 2H); 2.91 (t; J = 6.9 Hz; 2H); 2.60 (t; J = 6.9 Hz; 2H).
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 172.03 (1C); 171.23 (1C); 157.34 (1C); 144.32 (1C); 122.40 (2C); 114.52 (2C); 70.80 (1C); 70.72 (1C); 70.66 (1C); 70.38 (1C); 70.14 (1C); 69.91 (1C); 55.69 (1C); 50.79 (1C); 39.48 (1C); 30.95 (1C); 29.72 (1C).
HRMS (ESI): m/z calculated for C19H29N4O7 [M+H]+ = 425.2035; observed [M+H]+ = 425.2031.
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 172.03 (1C); 171.23 (1C); 157.34 (1C); 144.32 (1C); 122.40 (2C); 114.52 (2C); 70.80 (1C); 70.72 (1C); 70.66 (1C); 70.38 (1C); 70.14 (1C); 69.91 (1C); 55.69 (1C); 50.79 (1C); 39.48 (1C); 30.95 (1C); 29.72 (1C).
HRMS (ESI): m/z calculated for C19H29N4O7 [M+H]+ = 425.2035; observed [M+H]+ = 425.2031.
【0183】
実施例９：プロテアーゼの官能基化
プロテアーゼ（ＩｄｅＳ－ＴＡＧ Ｈｉｓ（ＧＳＳＨＨＨＨＨＨ）またはＩｄｅＳ）をＨＥＰＥＳ緩衝液中で０．５～１０ｍｇ／ｍＬの濃度、例えば１ｍｇ／ｍＬで使用した。
プロテアーゼ（ＩｄｅＳ－ＴＡＧ Ｈｉｓ（ＧＳＳＨＨＨＨＨＨ）またはＩｄｅＳ）をＨＥＰＥＳ緩衝液中で０．５～１０ｍｇ／ｍＬの濃度、例えば１ｍｇ／ｍＬで使用した。
【0184】
ＨＥＰＥＳ緩衝液中のプロテアーゼＩｄｅＳまたはＩｄｅＳ－ＴＡＧ Ｈｉｓ（ＧＳＳＨＨＨＨＨＨ）（２５～５０００、例えば５００μｇ、１ｅｑ）に、化合物１６または１８（５０～５００ｅｑ、例えば２２２ｅｑ）の溶液を加えた。反応媒体を０～３７℃、例えば４℃で１～４８時間、例えば１６時間撹拌するか、または撹拌することなく、生成物を立体排除により精製した。
【0185】
化合物１９：化合物１６－プロテアーゼＩｄｅＳ－ＴＡＧ Ｈｉｓ（ＧＳＳＨＨＨＨＨＨ）
【0186】
変性ＭＳ分析
【表9】
【0187】
化合物２０：化合物１６－プロテアーゼＩｄｅＳ
【0188】
変性ＭＳ分析
【表10】
【0189】
化合物２１：化合物１８－プロテアーゼＩｄｅｓ－ＴＡＧ Ｈｉｓ（ＧＳＳＨＨＨＨＨＨ）
【0190】
変性ＭＳ分析
【表11】
【0191】
化合物２２：化合物８－化合物１６－プロテアーゼＩｄｅｓ－ＴＡＧ Ｈｉｓ（ＧＳＳＨＨＨＨＨＨ）
化合物１９（１００．０μｇ；１ｅｑ）を化合物８（１～１０ｅｑ、例えば８ｅｑ）の存在下で反応させた。反応混合物を４～４０℃、例えば２５℃で１～９６時間、例えば１６時間撹拌して、化合物２２を得た。
化合物１９（１００．０μｇ；１ｅｑ）を化合物８（１～１０ｅｑ、例えば８ｅｑ）の存在下で反応させた。反応混合物を４～４０℃、例えば２５℃で１～９６時間、例えば１６時間撹拌して、化合物２２を得た。
【0192】
変性ＭＳ分析
【表12】
【0193】
実施例１０：クリック反応
１９または２２と、９、１０、１１、１３、１４、または１５との２つのクリックパートナーを使用。
各クリックパートナーを以下のいずれかで濃縮した。
‐ＩｄｅＳ化合物に対しては、ＶｉｖａｓｐｉｎＴＭ１０ｋＤａ遠心濃縮器を用いて遠心分離（５０００Ｇ）により濃度を０．５～１０ｍｇ／ｍＬ、例えば１ｍｇ／ｍＬとした。
‐Ｆａｂ化合物に対しては、Ａｍｉｃｏｎ（Ｒ）Ｕｌｔｒａ １０ｋＤａ遠心濃縮器を用いて遠心分離（１０，０００Ｇ）により濃度を０．２～１０ｍｇ／ｍＬ、例えば０．４ｍｇ／ｍＬとした。
１９または２２と、９、１０、１１、１３、１４、または１５との２つのクリックパートナーを使用。
各クリックパートナーを以下のいずれかで濃縮した。
‐ＩｄｅＳ化合物に対しては、ＶｉｖａｓｐｉｎＴＭ１０ｋＤａ遠心濃縮器を用いて遠心分離（５０００Ｇ）により濃度を０．５～１０ｍｇ／ｍＬ、例えば１ｍｇ／ｍＬとした。
‐Ｆａｂ化合物に対しては、Ａｍｉｃｏｎ（Ｒ）Ｕｌｔｒａ １０ｋＤａ遠心濃縮器を用いて遠心分離（１０，０００Ｇ）により濃度を０．２～１０ｍｇ／ｍＬ、例えば０．４ｍｇ／ｍＬとした。
【0194】
【表13】
【0195】
プロテアーゼパートナー（１～１０ｅｑ、例えば２ｅｑ）を断片パートナー（１～１０ｅｑ、例えば１ｅｑ）の存在下で反応させた。反応混合物を４～４０℃、例えば４℃で１～９６時間、例えば１６時間撹拌した。
【0196】
化合物２３
化合物９（１０μＬ‐８．３２μＭ‐０．４ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（６．２４μＬ‐２６．７μＭ‐１ｍｇ／ｍＬ‐２ｅｑ）。
変性ＭＳ分析
化合物９（１０μＬ‐８．３２μＭ‐０．４ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（６．２４μＬ‐２６．７μＭ‐１ｍｇ／ｍＬ‐２ｅｑ）。
変性ＭＳ分析
【表14】
【0197】
化合物２４
化合物１０（１０μＬ‐０．７４ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（２．６ｍｇ／ｍＬ‐２ｅｑ）。
化合物１０（１０μＬ‐０．７４ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（２．６ｍｇ／ｍＬ‐２ｅｑ）。
【0198】
変性ＭＳ分析
【表15】
【0199】
化合物２５
化合物１１（１５μＬ‐０．４０ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（３．１ｍｇ／ｍＬ‐４ｅｑ。
化合物１１（１５μＬ‐０．４０ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（３．１ｍｇ／ｍＬ‐４ｅｑ。
【0200】
変性ＭＳ分析
【表16】
【0201】
化合物２６
化合物１３（１５μＬ‐０．３０ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（３．１ｍｇ／ｍＬ‐４ｅｑ）。
化合物１３（１５μＬ‐０．３０ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（３．１ｍｇ／ｍＬ‐４ｅｑ）。
【0202】
変性ＭＳ分析
【表17】
【0203】
化合物２７
化合物１４（１５μＬ‐０．３０ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（３．１ｍｇ／ｍＬ‐４ｅｑ）。
化合物１４（１５μＬ‐０．３０ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（３．１ｍｇ／ｍＬ‐４ｅｑ）。
【0204】
変性ＭＳ分析
【表18】
【0205】
化合物２８
化合物１５（１５μＬ‐０．３０ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（３．１ｍｇ／ｍＬ‐４ｅｑ）。
化合物１５（１５μＬ‐０．３０ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物１９（３．１ｍｇ／ｍＬ‐４ｅｑ）。
【0206】
変性ＭＳ分析
【表19】
【0207】
化合物２９
化合物１１（１５μＬ‐０．６０ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物２２（０．５６ｍｇ／ｍＬ‐４ｅｑ）。
化合物１１（１５μＬ‐０．６０ｍｇ／ｍＬ‐１ｅｑ）－化合物２２（０．５６ｍｇ／ｍＬ‐４ｅｑ）。
【0208】
変性ＭＳ分析
【表20】
【0209】
実施例１１：化合物２４のタンパク質分解活性
ａ）化合物２４の精製
静止空気による２５℃の恒温オーブン内に設置された、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＳＥＣ－５カラム（５μＭ；１５０Å；７．８×３００ｍｍ）を使用し、クォータナリポンプを備えるＵＨＰＬＣ ＶａｎｑｕｉｓｈＴＭＦｌｅｘシステムで、立体排除クロマトグラフィーにより、化合物２４を精製した。溶出は、ＰＢＳ緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４ １ｍＭ、ＮａＣｌ ２０５ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ ３ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて流速０．５ｍＬ／分で行った。各画分は２８０ｎｍで検出する（ＨＬ ＶａｎｑｕｉｓｈＴＭダイオードアレイ検出器）。化合物２４に対応する画分（ｔＲ＝１３．３分）を合わせ、ＶｉｖａｓｐｉｎＴＭで濃縮して、約０．２ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。
ａ）化合物２４の精製
静止空気による２５℃の恒温オーブン内に設置された、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＳＥＣ－５カラム（５μＭ；１５０Å；７．８×３００ｍｍ）を使用し、クォータナリポンプを備えるＵＨＰＬＣ ＶａｎｑｕｉｓｈＴＭＦｌｅｘシステムで、立体排除クロマトグラフィーにより、化合物２４を精製した。溶出は、ＰＢＳ緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４ １ｍＭ、ＮａＣｌ ２０５ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ ３ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて流速０．５ｍＬ／分で行った。各画分は２８０ｎｍで検出する（ＨＬ ＶａｎｑｕｉｓｈＴＭダイオードアレイ検出器）。化合物２４に対応する画分（ｔＲ＝１３．３分）を合わせ、ＶｉｖａｓｐｉｎＴＭで濃縮して、約０．２ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。
【0210】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびデンシトメトリー解析により、化合物２４の純度を求めた。
【0211】
【表21】
【0212】
ｂ）タンパク質分解活性の評価
化学修飾を行わないこと以外は化合物２４と同じ条件に供したＩｄｅＳサンプルを対照（コントロール）として使用した。
化学修飾を行わないこと以外は化合物２４と同じ条件に供したＩｄｅＳサンプルを対照（コントロール）として使用した。
【0213】
３．３３ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ５６．３μＬに、ＰＢＳ Ｇｉｂｃｏ（Ｒ）中０．２７μＭのコントロールまたは化合物２４を２．５μＬ加えた。反応媒体を３７℃で１５分間インキュベートした後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびデンシトメトリーで解析した。
【0214】
【表22】
【0215】
化合物２４はコントロールと同様なタンパク質分解活性を有する。
【0216】
ｃ）抗原認識の評価
各種サンプル（ＴＴＺ Ｆａｂおよび化合物２４）をＰＢＳ Ｇｉｂｃｏ １×緩衝液で１μＭの濃度に希釈した。抗原ＨＥＲ２（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）を９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１μｇ／ｍＬの濃度にて４℃で一晩固定化した（１ウェルあたり１００μＬ）。その後、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液（１ウェルあたり３００μＬ）でウェルを３７℃で１時間飽和させた。１００ｎＭから０．００１ｎＭまで濃度を下げながらサンプルをウェルに入れ（１ウェルあたり１００μＬ）、次いで３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳで４回連続洗浄した後、タンパク質Ｌ－ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、０．２５μｇ／μＬを１／８００に希釈）をウェルに入れ（１００μＬ）、３７℃で１時間インキュベートした。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（１ウェルあたり１００μＬ）を加え、数分間反応させた。最後に、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４（１ウェルあたり５０μＬ）を加えて反応を停止させ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎシステム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とｉＥＭＳ Ｒｅａｄｅｒ ＭＦ用ＥＬＩＳＡ Ａｓｃｅｎｔソフトウェアを使用して、９６ウェルプレートの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
各種サンプル（ＴＴＺ Ｆａｂおよび化合物２４）をＰＢＳ Ｇｉｂｃｏ １×緩衝液で１μＭの濃度に希釈した。抗原ＨＥＲ２（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）を９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１μｇ／ｍＬの濃度にて４℃で一晩固定化した（１ウェルあたり１００μＬ）。その後、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液（１ウェルあたり３００μＬ）でウェルを３７℃で１時間飽和させた。１００ｎＭから０．００１ｎＭまで濃度を下げながらサンプルをウェルに入れ（１ウェルあたり１００μＬ）、次いで３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳで４回連続洗浄した後、タンパク質Ｌ－ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、０．２５μｇ／μＬを１／８００に希釈）をウェルに入れ（１００μＬ）、３７℃で１時間インキュベートした。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（１ウェルあたり１００μＬ）を加え、数分間反応させた。最後に、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４（１ウェルあたり５０μＬ）を加えて反応を停止させ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎシステム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とｉＥＭＳ Ｒｅａｄｅｒ ＭＦ用ＥＬＩＳＡ Ａｓｃｅｎｔソフトウェアを使用して、９６ウェルプレートの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【0217】
ＴＴＺ Ｆａｂおよび化合物２４による抗原ＨＥＲ２の認識動態を図１に示す。これらのデータにより、ＴＴＺ Ｆａｂおよび化合物２４の親和定数を求めることができた。
【0218】
【表23】
【0219】
本発明に係る化合物２４は、化合物ＴＴＺ Ｆａｂと同様にして抗原ＨＥＲ２を認識する。
【0220】
参考文献
［１］Ｂａｒｒａｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＥｕＰＡ Ｏｐｅｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１１，２３－２７，２０１６
［２］Ｖａｙｎｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１２１（０３），３２２－３３１，２０２１
［３］Ｋｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２８８，ｎｏ．４３，ｐｐ．３０８４３－３０８５４，２０１３
［１］Ｂａｒｒａｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＥｕＰＡ Ｏｐｅｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１１，２３－２７，２０１６
［２］Ｖａｙｎｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１２１（０３），３２２－３３１，２０２１
［３］Ｋｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２８８，ｎｏ．４３，ｐｐ．３０８４３－３０８５４，２０１３
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】