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特表2024-530030非天然核酸リガンドを有効成分として含む三重陰性乳癌の治療のための薬学的組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-14
(54)【発明の名称】非天然核酸リガンドを有効成分として含む三重陰性乳癌の治療のための薬学的組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240806BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240806BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240806BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20240806BHJP
A61K 51/04 20060101ALI20240806BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20240806BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61K48/00
A61P15/00
A61P35/00
A61P43/00 105
A61K31/7088
A61K49/00
A61K51/04 300
A61K51/04 310
C12N15/115 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024507040
(86)(22)【出願日】2022-08-05
(85)【翻訳文提出日】2024-02-19
(86)【国際出願番号】 KR2022011719
(87)【国際公開番号】W WO2023014193
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】10-2021-0104105
(32)【優先日】2021-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522435595
【氏名又は名称】インターオリゴ・コーポレイション
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＲＯＬＩＧＯ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ａ－Ｆ９０２，６６，Ｂｅｏｌｍａｌ－ｒｏ，Ｄｏｎｇａｎ－ｇｕ，Ａｎｙａｎｇ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １４０５８，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100112656
【弁理士】
【氏名又は名称】宮田 英毅
(74)【代理人】
【識別番号】100089118
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 宏明
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジュンファン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジョンウク
(72)【発明者】
【氏名】パク，ハンスル
(72)【発明者】
【氏名】イ，セナ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA12
4C084AA13
4C084AA17
4C084MA56
4C084MA59
4C084MA63
4C084MA65
4C084NA14
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC411
4C084ZC412
4C085HH01
4C085HH03
4C085KB92
4C085LL18
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA56
4C086MA59
4C086MA63
4C086MA65
4C086NA14
4C086ZA81
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZC41
(57)【要約】
本開示の一側面は、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ;ＨＳＡ）と、Ｋ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異タンパク質の両方に結合する新規の非天然核酸リガンドを有効成分として含む、三重陰性乳癌の治療のための薬学的組成物に関するものである。このような薬学的組成物は、治療が困難であった三重陰性乳癌の原発性または転移性癌に対して優れた治療効果を奏する。
一方、本開示の一側面は、ヒト血清アルブミンとＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異タンパク質の両方に結合する新規の非天然核酸リガンドと、その用途に関するものであり、このような新規核酸リガンドは、配列番号１１（ＧＮＡ６ＡＡＧ６ＣＣＧＧＡ６ＧＧＣＡＧＣ６６６Ａ６ＧＣ）[ここで、前記２番目の核酸Ｎはシスチジンまたはゲムシタビンであり、前記６と示された部分は、５-[Ｎ-（１-ナフチルメチル）カルボキサミド]-２'-デオキシウリジン（Ｎａｐ-ｄＵ）]の核酸配列を含み得る。
一方、本開示の一側面は、ヒト血清アルブミンとＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異タンパク質の両方に結合する新規の非天然核酸リガンドと、その用途に関するものであり、このような新規核酸リガンドは、配列番号１１（ＧＮＡ６ＡＡＧ６ＣＣＧＧＡ６ＧＧＣＡＧＣ６６６Ａ６ＧＣ）[ここで、前記２番目の核酸Ｎはシスチジンまたはゲムシタビンであり、前記６と示された部分は、５-[Ｎ-（１-ナフチルメチル）カルボキサミド]-２'-デオキシウリジン（Ｎａｐ-ｄＵ）]の核酸配列を含み得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄに結合する非天然核酸リガンド、またはこれの薬学的に許容可能な塩を含む三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項2】
前記非天然核酸リガンドは配列番号１１（ＧＮＡ６ＡＡＧ６ＣＣＧＧＡ６ＧＧＣＡＧＣ６６６Ａ６ＧＣ）の核酸配列を含むものである[ここで、前記２番目の核酸Ｎはシスチジンまたはゲムシタビンであり、前記６と示された部分は、５-[Ｎ-（１-ナフチルメチル）カルボキサミド]-２'-デオキシウリジン（Ｎａｐ-ｄＵ）]、請求項１に記載の三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項3】
前記組成物は一つ以上の前記非天然核酸リガンドを含む、請求項１に記載の三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項4】
前記配列番号１１の核酸配列を含む非天然核酸リガンドが配列番号１～１１から選択された核酸配列からなる、請求項２に記載の三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項5】
前記三重陰性乳癌は原発性または転移性の三重陰性乳癌である、請求項１に記載の三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項6】
前記三重陰性乳癌は癌細胞がＫ-ＲＡＳ突然変異タンパク質を有する、請求項１に記載の三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項7】
前記三重陰性乳癌は癌細胞がＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異タンパク質を有する、請求項６に記載の三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項8】
前記薬学的組成物は、これを必要とする対象体に静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻内、膣内、膀胱内、皮内、経皮内、局所、または、皮下投与される、請求項１に記載の三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項9】
前記薬学的組成物は、三重陰性乳癌組織の外科的切除後に投与される、請求項１に記載の三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項10】
前記薬学的組成物は、三重陰性乳癌組織の外科的切除後に切除部位に投与される、請求項１に記載の三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項11】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄに結合する非天然核酸リガンドであって、配列番号８～１１から選択された一つの核酸配列を含む、非天然核酸リガンド。
【請求項12】
前記非天然核酸リガンドは、配列番号８～１１から選択された一つの核酸配列からなる、請求項１１に記載の非天然核酸リガンド。
【請求項13】
請求項１１に記載の非天然核酸リガンドを含む、診断用組成物。
【請求項14】
請求項１１に記載の非天然核酸リガンドを含む、造影剤。
【請求項15】
請求項１１に記載の非天然核酸リガンドを含む、放射性医薬品。
【請求項16】
請求項１１に記載の非天然核酸リガンドを含む、癌診断のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、新規非天然核酸リガンドを有効成分として含む三重陰性乳癌（「ＴＮＢＣ」）の治療のための薬学的組成物に関するものである。また、本開示は、新規核酸リガンド及びその用途に関するものである。
【0002】
[国家支援研究開発に関する説明]
【0003】
本出願/研究は、科学技術情報通信部、産業通商資源部、保健福祉部の財源で国家新薬開発事業団の国家新薬開発事業支援によって行われたものである（課題番号:ＨＮ２２Ｃ０５８５００）。
【背景技術】
【0004】
乳癌は、米国やヨーロッパなどの先進国において、女性の癌のうち最もありふれた癌であり、４０歳～５５歳の米国女性の死亡原因第１位となっている。生涯において９人の女性のうちの１人が乳癌に罹患し、乳癌の患者数も毎年約１５%ずつ増加する傾向にある。韓国では１９９５年の女性癌患者のうち、約１１.９%を乳癌が占めており、子宮頸がんと胃癌に続き三番目に多い癌となり、胃癌、肝臓癌、子宮癌、肺癌に続き５番目に死亡率が高い癌であり、その頻度は毎年増加傾向にある。
【0005】
乳癌のうち、三重陰性乳癌（ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ；ＴＮＢＣ）は、乳癌の全証例の１０～２０%を占める。三重陰性乳癌はエストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現がなく、ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ‐２）が過発現しないか、ＨＥＲ‐２の増幅がない腫瘍と定義され、免疫組織化学を通じて診断される乳癌腫瘍の異種群である。三重陰性乳癌は、多くの化学療法薬品に対する速やかな耐性と適切な標的不足による攻撃的臨床挙動と不良予後を特徴とする。ＴＮＢＣ患者は他の類型の乳癌と比較して全般的に予後が悪く、早期に遠隔臓器で再発する確率と死亡率が高い。現在、利用可能な承認された標的療法はない。パクリタキセル及びこれの半合成誘導体などの、古典的な微小管標的化薬品（ＭＴＤ）は乳癌新生物の臨床調節において相当な成功を果たした。アントラサイクリン系及びタキサン系の化学療法は、三重陰性乳癌に対する標準療法である。しかし、結局は、ほとんどの三重陰性乳癌患者の初期療法に対する一時的反応後、薬品耐性、腫瘍の再発、及び/または転移が発生する。従って、原発性または転移性三重陰性乳癌を優れた効能で治療したり、三重陰性乳癌から他の臓器（特に肺）への転移を効果的に抑制したりする薬品を開発するのは非常に難しかった。三重陰性乳癌治療に対してより持続的な反応を達成する革新的で、より効果的な治療的アプローチ方法を至急開発する必要がある。
【0006】
一方、本発明者は、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ;ＨＳＡ）とＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異タンパク質に結合する新たな二重特異性アプタマー（核酸リガンド）を、ＳＥＬＥＸを通じて発掘し、最適化し、これを通じて作り出した非天然核酸リガンドが三重陰性乳癌に優れた標的治療効果（腹腔内投与を通した原発性癌の治療）を有することを確認した。
【0007】
また、既存の乳癌切除術では、原発性腫瘍を除去してから周辺組織の奥深くにある微小な癌や残存癌を全て完璧に除去するのは容易ではない。そして、１回目の癌手術後、患者の体力が回復するまで、１～２週間は抗癌治療や放射線治療を試みてない。この時期の残存癌あるいは微小な癌の積極的治療法は、従来は皆無であった。これにより、本発明を通じて開発された医薬品を用いてこの時期に三重陰性乳癌の積極的標的治療を行うことができる世界初の方法を提示しており、これを通じて三重陰性乳癌患者の生存率の最大化及び再発リスクの低減を期待することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
（特許文献１）韓国公開特許第２０１９－０１２６３５６号
【非特許文献】
【0009】
（非特許文献１） Ｍａｇｄａｌｅｎａ Ｍ. Ｄａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ., Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ２０１０, Ｖｏｌ.３８, Ｎｏ.１４, ｐｐ. ４８７７-４８８８
（非特許文献２） ＹＩ ZＨＡＮＧ ｅｔ ａｌ. ＯＮＣＯＬＯＧＹ ＬＥＴＴＥＲＳ, ２０１８, Ｖｏｌ.１５, Ｎｏ.５, ｐｐ. ６２３３-６２４０
（非特許文献３） Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉ. Ｔｒａｎｓｌ. Ｍｅｄ., ２０１８, Ｖｏｌ.１０, Ｎｏ.４３３, ｅａａｒ１９１６
（非特許文献４） Ｙｏｓｈｉｈｉｓａ Ｔｏｋｕｍａｒｕ ｅｔ ａｌ., Ａｍ. J. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., ２０２０, Ｖｏｌ.１０, Ｎｏ.３, ｐｐ. ８９７-９０７
（非特許文献２） ＹＩ ZＨＡＮＧ ｅｔ ａｌ. ＯＮＣＯＬＯＧＹ ＬＥＴＴＥＲＳ, ２０１８, Ｖｏｌ.１５, Ｎｏ.５, ｐｐ. ６２３３-６２４０
（非特許文献３） Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉ. Ｔｒａｎｓｌ. Ｍｅｄ., ２０１８, Ｖｏｌ.１０, Ｎｏ.４３３, ｅａａｒ１９１６
（非特許文献４） Ｙｏｓｈｉｈｉｓａ Ｔｏｋｕｍａｒｕ ｅｔ ａｌ., Ａｍ. J. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., ２０２０, Ｖｏｌ.１０, Ｎｏ.３, ｐｐ. ８９７-９０７
【発明の概要】
【技術的課題】
【0010】
本発明は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異タンパク質の両方に結合する新規の非天然核酸リガンドを有効成分として含む、三重陰性乳癌の治療のための薬学的組成物を提供することを目的とする。本発明は、体内安定性及び抗癌効果が優れた薬学的組成物を提供することを目的とする。
【0011】
本発明は、従来治療が難しかった三重陰性乳癌の原発性または転移性の治療に対して優れた効果を奏する薬学的組成物を提供することを目的とする。三重陰性乳癌は、悪性度が高くて進行速度が速いだけでなく、転移も速く進むという特性を有しており、標的治療剤開発への要求が高いが、乳癌の標的療法の代表的な標的抗原であるエストロゲン受容体、ＨＥＲ-２受容体、及びプロゲステロン受容体が陰性（正常細胞と比較して違いがない）であるという特徴を有するため、相応しい標的療法が存在しなかった。また、三重陰性乳癌の外科的切除後に現れる転移性癌の場合、従来は治療が非常に難しく、このような転移性癌を予防または治療する薬品も皆無であった。
【0012】
本発明は、ヒト血清アルブミンとＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異タンパク質の両方に結合する新規の非天然核酸リガンドを提供することを目的とする。
【0013】
一方、Ｋ-ＲＡＳ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（サイン）がＴＮＢＣと密接な関連があることが最近の文献によって知られている（Ｙｏｓｈｉｈｉｓａ Ｔｏｋｕｍａｒｕなど、Ａｍ. J. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., ２０２０, Ｖｏｌ.１０, Ｎｏ.３, ｐｐ. ８９７-９０７）。
【技術的解決方法】
【0014】
１. 本開示の一実施態様は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄに結合する非天然核酸リガンド、またはこれの薬学的に許容可能な塩を含む三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物に関するものであってもよい。
【0015】
２. 一実施態様において、前記非天然核酸リガンドは、配列番号１１（ＧＮＡ６ＡＡＧ６ＣＣＧＧＡ６ＧＧＣＡＧＣ６６６Ａ６ＧＣ）の核酸配列を含むものである[ここで、前記２番目の核酸Ｎはシスチジンまたはゲムシタビンで、前記６と示された部分は、５-[Ｎ-（１-ナフチルメチル）カルボキサミド]-２'-デオキシウリジン（Ｎａｐ-ｄＵ）]、三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物に関するものであってもよい。
【0016】
３. 一実施態様において、前記組成物は、一つ以上の前記非天然核酸リガンドを含む、三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物に関するものであってもよい。
【0017】
４. 一実施態様において、前記配列番号１１の核酸配列を含む非天然核酸リガンドは、配列番号１～１１から選択された核酸配列からなる、三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物に関するものであってもよい。
【0018】
５. 一実施態様において、前記三重陰性乳癌は、原発性または転移性の三重陰性乳癌である、三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物に関するものであってもよい。
【0019】
６. 一実施態様において、前記三重陰性乳癌は、癌細胞がＫ-ＲＡＳ突然変異タンパク質を有する、三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物に関するものであってもよい。
【0020】
７. 一実施態様において、前記三重陰性乳癌は、癌細胞がＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異タンパク質を有する、三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物に関するものであってもよい。
【0021】
８. 一実施態様において、対象体に静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻内、膣内、膀胱内、皮内、経皮内、局所、または、皮下投与される、三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物に関するものであってもよい。
【0022】
９. 一実施態様において、三重陰性乳癌組織の外科的切除後に投与される、三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物に関するものであってもよい。
【0023】
１０. 一実施態様において、三重陰性乳癌組織の外科的切除後に切除部位に投与される、三重陰性乳癌の予防または治療のための薬学的組成物に関するものであってもよい。
【0024】
１１. 本開示の一実施態様は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄに結合する非天然核酸リガンドであり、配列番号８～１１から選択された一つの核酸配列を含む、非天然核酸リガンドに関するものであってもよい。
【0025】
１２. 一実施態様において、配列番号８～１１から選択された一つの核酸配列からなる、非天然核酸リガンドに関するものであってもよい。
【0026】
１３. 本開示の一実施態様は、本開示の一実施態様による非天然核酸リガンドを含む診断用組成物に関するものであってもよい。
【0027】
１４. 本開示の一実施態様は、本開示の一実施態様による非天然核酸リガンドを含む造影剤に関するものであってもよい。
【0028】
１５. 本開示の一実施態様は、本開示の一実施態様による非天然核酸リガンドを含む放射性医薬品に関するものであってもよい。
【0029】
１６. 本開示の一実施態様は、本開示の一実施態様による非天然核酸リガンドを含む、癌診断のための組成物に関するものであってもよい。
【0030】
１７. 本開示の一実施態様は、本開示の一実施態様によるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄに結合する非天然核酸リガンド、またはこれの薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を対象体に投与する段階を含む、三重陰性乳癌の予防または治療方法に関するものであってもよい。
【発明の効果】
【0031】
本発明の薬学的組成物は、互いに異なる２個以上のターゲットに対する特異的結合親和性を有する核酸リガンドを含み、原発性または転移性の三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）に対して効果的かつ優れた予防または治療をすることができる。
【0032】
本発明の薬学的組成物として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異タンパク質に対する特異的結合親和性を有する核酸リガンドを含む薬学的組成物は、ＴＮＢＣ腫瘍の成長を効果的に抑制することができる。
【0033】
本発明の薬学的組成物は、ＴＮＢＣの外科的切除後、転移性癌または腫瘍を抑制したり、癌または腫瘍の転移を効果的に抑制したりすることができる。
【0034】
本発明の核酸リガンドは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異タンパク質に対する特異的結合親和性を有し、ＴＮＢＣ腫瘍組織及び／または細胞を効果的にターゲティングすることができる。
【0035】
本発明の核酸リガンドは、癌細胞の成長を抑制したり、癌細胞を死滅させたりすることができる。
【0036】
本発明の核酸リガンドは、特定の配列のオリゴヌクレオチドに変形ヌクレオチドを結合させることで、体内の酵素による分解速度を低下させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図3】図３は、１次ＳＥＬＥＸを通じて得られた核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の血漿タンパク質（ヒト血清アルブミン）に対する結合力を分析した、ビーズベースのＥＬＩＳＡ結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）の結果を示す。
【図4】図４は、１次ＳＥＬＥＸを通じて得られた核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の血漿タンパク質（アルブミン）に対する結合力を分析した、フィルタ結合アッセイ（ｆｉｌｔｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）の結果を示す。
【図7】図７ａ～図７ｃは、一実施態様によるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄターゲット核酸リガンドのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質に対するＤｎａｓｅ安定性実験の結果、及び各核酸リガンドの２Ｄ構造予測を示す。Ｄｎａｓｅ安定性実験の結果において、（-）はターゲットタンパク質と核酸分解酵素を添加していない陰性対照群、（+）は核酸分解酵素のみを添加した陽性対照群、１はヒト血清アルブミンと核酸分解酵素を添加した実験群、２はＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質と核酸分解酵素を添加した実験群の結果を示す。
【図9】図９は、一実施態様による核酸リガンドの精製後の質量分析結果を示す。具体的には、図９ａは、核酸リガンドＡＤ００５、図９ｂは、核酸リガンドＡＤ０８９、図９ｃは、核酸リガンドＡＤ２１０、図９ｄは、核酸リガンドＡＤ２１１、図９ｅは、核酸リガンドＡＤ２１２の質量分析結果を示す。
【図11】図１１は、三重陰性乳癌モデル（４Ｔ１ＴＮＢＣマウスモデル）の一実施態様による核酸リガンドＡＤ００５を含む薬学組成物の抗癌効能を確認するために用量別に投与した後、腫瘍の大きさを測定した実験結果を示す。
【図14】図１４は、三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の核酸リガンドＡＤ００５（３００μｇまたは６００μｇ）及びＡＤ００８９（３００μｇまたは６００μｇ）を含む薬学組成物の転移、及び再発抑制効果を確認する実験の概括を図式化した図面である。
【図15】図１５は、三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の核酸リガンドＡＤ００５（３００μｇまたは６００μｇ）及びＡＤ００８９（３００μｇまたは６００μｇ）を含む薬学組成物の転移及び再発抑制効果を確認した実験結果を示す。
【図16】図１６は、三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の核酸リガンドＡＤ００５（３００μｇまたは６００μｇ）、及びＡＤ００８９（３００μｇまたは６００μｇ）を含む薬学組成物の転移及び再発抑制効果を確認した実験結果を生存グラフで示したものである。図１６Ａは、核酸リガンドＡＤ００５（３００μｇまたは６００μｇ）投与時の生存グラフを示し、図１６Ｂは、ＡＤ００８９（３００μｇまたは６００μｇ）投与時の生存グラフを示す。一方、これは手術時完全に除去されず、原発性腫瘍（ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ）が残っている個体は除いたデータである。
【発明の実施のための最善の形態】
【0038】
本文書に記載された多様な実施様態または実施例は、本開示の技術的思想を明確に説明するための目的で例示されたものであり、これを特定の実施形態で限定するためのものではない。本開示の技術的思想は、本文書に記載された各実施様態または実施例の多様な変更（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、均等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）、代替物（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ）及び各実施様態または実施例の全部または一部から選択的に組み合わせられた実施様態または実施例を含む。また、本開示の技術的思想の権利範囲は以下に提示される多様な実施様態または実施例や、これに関する具体的説明に限定されない。
【0039】
技術的または科学的な用語を含む本文書で用いられる用語は、異なって定義されない限り、本開示が属する技術分野で通常の知識を有する者に一般に理解される意味を有し得る。一般に用いられる辞書に定義されているような用語は、関連技術の文脈上有する意味と一致する意味を有すると解釈されるべきで、本開示で明白に定義しない限り、理想的または過度に形式的な意味とは解釈されない。
【0040】
本文書で用いられる単数形の表現は、文脈上異なって意味しない限り複数型の意味を含み得、これは請求項に記載された単数形の表現にも同様に適用される。
【0041】
本文書で用いられる「第１」、「第２」、または「最初」、「二番目」などの表現は、文脈上異なって意味しない限り、複数の対象を指すときに、ある対象を他の対象と区分するために用いられ、当該対象間の順序または重要度を限定するものではない。
【0042】
本文書で用いられる「Ａ、Ｂ、及びＣ」、「Ａ、Ｂ、またはＣ」、「Ａ、Ｂ、及び/またはＣ」、または「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも一つ」、「Ａ、Ｂ、または、Ｃの少なくとも一つ」、「Ａ、Ｂ、及び/またはＣの少なくとも一つ」、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちから選択された少なくとも一つ」、「Ａ、Ｂ、または、Ｃのうちから選択された少なくとも一つ」、「Ａ、Ｂ、及び/またはＣのうちから選択された少なくとも一つ」などの表現は、それぞれ羅列された項目、または羅列された項目の可能な限り全ての組み合わせを意味し得る。例えば、「Ａ及びＢのうちから選択された少なくとも一つ」は、（１） Ａ、（２） Ａの少なくとも一つ、（３） Ｂ、（４） Ｂの少なくとも一つ、（５） Ａの少なくとも一つ及びＢの少なくとも一つ、（６） Ａの少なくとも一つ及びＢ、（７） Ｂの少なくとも一つ及びＡ、（８） Ａ及びＢをいずれも指すことができる。
【0043】
本開示で用いられる用語「略」、または「概ね」は、技術分野の熟練した技術者に広く知られているとおり、それぞれの値に対する通常の誤差範囲を示し得る。これは本明細書に記載された数値または範囲の脈絡で、一実施様態で言及されるか、または請求された数値または範囲の±２０%、±１５%、±１０%、±９%、±８%、±７%、±６%、±５%、±４%、±３%、±２%、または±１%であることを意味し得る。
【0044】
本開示で用いられる用語「ＳＥＬＥＸ」、「ＳＥＬＥＸ技術」、「ＳＥＬＥＸ法」、「ＳＥＬＥＸ工程」は相互交換的に用いられ得、望ましい方法（例：タンパク質に結合）によってターゲットと相互作用する核酸を選別する過程と、選別された核酸を増幅する過程を組み合わせた方法を意味し得る。このようなＳＥＬＥＸ法は、標的分子に高い特異性で結合することができる核酸分子を選別するための試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法であり、米国特許第５、４７５、０９６号（「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」）と米国特許第５、２７０、１６３号（ＷＯ ９１/１９８１３号、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」）に記載されている。
【0045】
本開示は、前述した核酸リガンドまたはこれの薬学的に許容可能な塩を含む三重陰性乳癌の治療のための薬学的組成物を提供する。
【0046】
本開示は一実態様において、従来は存在不可能であるとされていた新たな部類（ｃｌａｓｓ）の核酸化合物である、新規非天然核酸リガンドに関するものである。
【0047】
本開示で用いられる用語「新規核酸リガンド」、「核酸リガンド」、「非天然核酸リガンド」、「新規非天然核酸リガンド」は互いに相互交換的に用いられ得る。
これは互いに異なる２個以上のターゲットに対して特異的結合親和性を有する核酸分子を意味し得る。
これは互いに異なる２個以上のターゲットに対して特異的結合親和性を有する核酸分子を意味し得る。
【0048】
本開示で用いられる用語「非天然（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃまたはｕｎｎａｔｕｒａｌ）」は、自然界では発生しないことを意味し、このような側面から本開示の一実施例による新規核酸リガンドは、標的に結合される公知の生理学的機能を有する核酸でなくてもよい。
【0049】
一実施態様において、新規核酸リガンドは、互いに異なる２個以上のターゲットに対して特異的結合親和性を有し得る。例えば、新規核酸リガンドは互いに異なる２個、３個、４個、５個、６個、または、それ以上のターゲットに対して特異的結合親和性を有し得る。
【0050】
一実施態様において、新規核酸リガンドは、互いに異なる２個のターゲットに対して特異的結合親和性を有し得る。
【0051】
本開示で用いられる用語「特異的結合親和性」は、核酸リガンドが混合物またはサンプル内に存在するターゲットではない他の構成要素、または成分に結合することより、一般にはるかに高い親和度でそのターゲットに結合することを意味し得る。
一実施態様において、複数の核酸リガンド候補配列は、互いに異なる２個以上のターゲットに特異的結合親和性を有する核酸ライブラリー、または核酸混合物から選別されたものであってもよく、一実施態様による新規核酸リガンドは、このように選別された複数の核酸リガンドの候補配列のうち、互いに異なる２個以上のターゲットに特異的結合親和性を有すると確認されて選別されたものであってもよい。
一実施態様において、複数の核酸リガンド候補配列は、互いに異なる２個以上のターゲットに特異的結合親和性を有する核酸ライブラリー、または核酸混合物から選別されたものであってもよく、一実施態様による新規核酸リガンドは、このように選別された複数の核酸リガンドの候補配列のうち、互いに異なる２個以上のターゲットに特異的結合親和性を有すると確認されて選別されたものであってもよい。
【0052】
一実施態様において、ターゲットは３次元構造を有するものであってもよい。一実施態様において、ターゲットはワトソン‐クリック型塩基対形成または三重らせん結合（ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ ｂｉｎｄｉｎｇ）に主に依存するメカニズムを通じて核酸と結合するポリヌクレオチドは含まない。
【0053】
一実態様において、新規核酸リガンドは、ターゲットと３次元的に結合したり、ターゲットの３次元的構造を認識したり、または、自ら３次元的構造を形成してターゲットと相互作用したりすることができる。新規核酸リガンドは、ターゲットと結合したり、ターゲットの３次元的構造を認識したり、または、ターゲットと相互作用してそれぞれのターゲットの特性を調節したりすることができる。例えば一実施例による新規核酸リガンドは、ターゲットタンパク質に結合してタンパク質の活性を阻害したり、シグナル伝達経路を遮断したり、シグナル伝達経路の下流のタンパク質の活性を抑制したりすることができる。
【0054】
本開示で用いられる、用語「結合」、または「相互作用」は、生理条件下で、例えば、パイスタッキング（ｐｉ‐ｓｔａｃｋｉｎｇ）、静電気的相互作用、疎水性相互作用、イオン性相互作用、及び/または水素結合相互作用などによる、二つの分子間の会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を意味し得る（例：核酸リガンドとターゲット間の安定した会合）。
【0055】
本開示で用いられる、用語「調節」は、ターゲットの機能的特性、生物学的活性、及び/または生物学的機作（または経路）を変化させることを意味し得る。例えば、ターゲットの特性、活性、及び/または機作を上方調節したり（例：活性化または刺激させる場合）、下方調節したり（例：阻害または抑制する場合）、または、それ以外に変化させたりすることもできる。例えば、ターゲットが細胞の場合、調節される細胞の特性は、細胞生存率、細胞増殖、遺伝子の発現、細胞形態学、細胞活性化、リン酸化、カルシウム動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、脱顆粒化、細胞移動、及び/または細胞分化であり得る。
【0056】
一実施態様において、新規核酸リガンドは一つの特定ターゲットにのみ結合する既存のアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）ではなく、また、互いに異なる個別の複数のアプタマーを互いに連結または結合させたものである二重特異性アプタマー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｐｔａｍｅｒ）ではない。
【0057】
一実施態様において、新規核酸リガンドは複数のアプタマーの連結体ではない（ｎｏｎ-ｃｏｕｐｌｉｎｇ）。
【0058】
本開示で用いられる用語「連結体」は、２個以上の個別のアプタマーを互いに結びつけるか、融合させるか、結合させるか、接合させたものを意味し得る。例えば、連結体は任意の単量体アプタマーの二量体、三量体、四量体、または、それ以上の多量体を意味してもよく、互いに異なる２個以上のアプタマーを連結または結合させた二重特異性アプタマーを意味してもよく、その他の複数のアプタマーからなる複合体/接合体/結合体を意味してもよい。
【0059】
一実施態様において、新規核酸リガンドは一つのターゲットに対する結合部位を形成する核酸配列の全て、または一部が異なるターゲットに対する結合部位を形成する核酸配列の全て、または一部を形成するものであってもよい。一実施態様において、ターゲットに対する結合部位を形成する核酸配列は、核酸リガンドの増幅のための５'または３'プライマーの配列、またはその一部を含み得る。
【0060】
一実施態様において、前記ターゲットに対する結合部位を形成する核酸配列の一部は、核酸リガンド全体配列の約１%～約９９%、約５%～約９５%、約１０%～約９０%、約２０%～約８０%、約３０%～約７０%、または、約４０%～約６０%であってもよいが、これに制限されない。一実施態様において、前記ターゲットに対する結合部位を形成する核酸配列の一部は、核酸リガンドを構成する一つ以上のヌクレオチドを含み得、これに制限されない。
【0061】
一実施態様において、新規核酸リガンドは、核酸リガンド中の２個以上のターゲットに対する結合部位が互いに個別に分離されて存在しないものであってもよい。例えば、ターゲットに対する結合部位が互いに個別に分離されて存在するものは、アプタマー多量体、二重特異性アプタマー、またはその他の複数のアプタマーからなる複合体/接合体/結合体を意味し得る。
【0062】
一実施態様において、新規核酸リガンドは２個以上のターゲットに対する結合部位が一つの単一核酸リガンドで形成されるか、または一つの単一核酸リガンドから形成されるものであってもよい。これは、ターゲットと結合するために形成される核酸リガンドの三次構造が互いに個別の配列でそれぞれ形成されるか、個別の配列でそれぞれ形成されたものを結合させて形成されるのではなく、一つの核酸リガンドまたは単一核酸リガンドの配列で形成されることを意味し得る。これにより、新規核酸リガンドは、二重特異性アプタマーとは互いに異なり、区別される物質に該当する。
【0063】
一実施態様において、新規核酸リガンドは、約１００個以下のヌクレオチドからなってもよい。具体的には、新規核酸リガンドは、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、または、４０個以下のヌクレオチドからなるものであってもよい。一実施態様において、新規核酸リガンドは１０個～１０５個、１５個～１００個、２０個～９５個、２５個～９０個、３０個～８５個、３５個～８０個、４０個～７５個、４５個～７０個、５０個～６５個、または、５５個～６０個のヌクレオチドからなるものであってもよい。
【0064】
一実態様において、ヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、これらの変形したヌクレオチド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよい。
【0065】
本発明のオリゴヌクレオチドは、癌細胞にさらに選択的に結合することができ、細胞内での様々なメカニズムを通じて癌細胞の成長を妨げることができる。
【0066】
本発明のオリゴヌクレオチドに１個以上の変形ヌクレオチドを結合させ、変形ヌクレオチドを安定化させたり、体内で変形ヌクレオチドの非活性化を防止したりすることができる。
【0067】
さらに、オリゴヌクレオチド配列のうち、任意の位置に変形ヌクレオチドが挿入されるか、置換、または結合され得、該変形ヌクレオチドは抗癌効果を奏する変形ヌクレオチド（例えば、ゲムシタビン）を意味し得、変形ヌクレオチドは化学的に変形されたヌクレオシドまたはヌクレオチドであり得る。
【0068】
変形したヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５'方向、３'方向、またはオリゴヌクレオチド配列内に位置する任意のヌクレオチドの少なくとも一つに連結され得、好ましくはオリゴヌクレオチドの５'方向に連結される。
【0069】
本開示で用いられる「変形したヌクレオチド」は、天然発生ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及びＣ）の類似体、置換体またはエステルを意味し得、通常の技術者が容易に用いることができる変形ヌクレオチドを包括する広範囲な概念を意味し得る。例えば、変形したヌクレオチドはＣ‐５位での置換を有するか（例：Ｃ‐５変形したピリミジン）ヌクレオチドを構成する糖類（リボースまたはデオキシリボース）が変形するか、または、このような変形をいずれも有するヌクレオチドを意味し得る。
【0070】
一実態様において、Ｃ‐５変形したピリミジンは、Ｃ‐５変形したアミノカルボニルピリミジンを意味し得、例えば、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｂｚ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（ｉＢｕ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐フェネチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｐｅ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐チオフェニルメチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｔｈ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３-イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｔｒｐ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐[１‐（３‐トリメチルアンモニウム）プロピル]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジンクロリド、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）、５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン）、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（Ｂｚ‐ｄＣ）、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（ｉＢｕ‐ｄＣ）、５‐（Ｎ‐フェネチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（Ｐｅ‐ｄＣ）、５‐（Ｎ‐チオフェニルメチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（Ｔｈ‐ｄＣ）、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３-イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（Ｔｒｐ‐ｄＣ）、５‐（Ｎ‐[１‐（３‐トリメチルアンモニウム）プロピル]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジンクロリド、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジン（Ｎａｐ‐ｄＣ）、及び/または５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐デオキシシチジンを含み得るが、これに制限されない。
【0071】
一実態様において、リボース糖（Ｒｉｂｏｓｅ ｓｕｇａｒ）の２'位変形を有する変形したヌクレオチドは、２'‐デオキシ‐２'‐フルオロウリジン（Ｕｆ）、２'‐デオキシ‐２'‐フルオロシチジン（Ｃｆ）、２'‐ヒドロキシアデノシン（Ａｒ）、２'‐メトキシアデノシン（Ａｍ）、２'‐メトキシグアノシン（Ｇｍ）を含み得るが、これに制限されない。
【0072】
一実態様において、Ｃ‐５変形及びリボース糖（Ｒｉｂｏｓｅ ｓｕｇａｒ）の２'位変形をいずれも有する変形したヌクレオチドは、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルウリジン、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロウリジン、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルウリジン、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロウリジン、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３-イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルウリジン、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３-イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐フルオロウリジン、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルウリジン、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロウリジン、５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルウリジン、及び/または５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐フルオロウリジンを含み得るが、これに制限されない。
【0073】
一実態様において、Ｃ‐５変形及びリボース糖（Ｒｉｂｏｓｅ ｓｕｇａｒ）の２'位変形をいずれも有する変形したヌクレオチドは、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルシチジン、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロシチジン、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルシチジン、５‐（Ｎ‐イソブチルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロシチジン、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３-イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルシチジン、５‐（Ｎ‐[２‐（１Ｈ‐インドール‐３-イル）エチル]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐フルオロシチジン、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルシチジン、５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐フルオロシチジン、５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐メチルシチジン、及び/または５‐（Ｎ‐[１‐（２、３‐ジヒドロキシプロピル）]カルボキシアミド）‐２'‐Ｏ‐フルオロシチジンを含み得るが、これに制限されない。
【0074】
一実態様において、変形したヌクレオチドは、５‐（Ｎ‐ベンジルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｂｚ‐ｄＵ）、または５‐（Ｎ‐ナフチルメチルカルボキシアミド）‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）であってもよく、これにより新規核酸リガンドをなすヌクレオチドの少なくとも一つはこのような変形したヌクレオチドであり得る。
【0075】
変形ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’方向に連結される場合、変形ヌクレオチドの３'方向にｉｄＴ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＥＧまたは２'ＯＭｅＮｕ（２'-Ｍｅｔｈｏｘｙ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）をさらに結合させることができる。
【0076】
変形ヌクレオチドの３'方向にｉｄＴ、ＬＮＡ、ＰＥＧまたは２'ＯＭｅＮｕをさらに結合させることによって、ヌクレアーゼの攻撃からオリゴヌクレオチドの３'末端を保護することができ、これによってオリゴヌクレオチドが体内で分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）されるスピードを下げ、変形ヌクレオチドがより長い間オリゴヌクレオチドに結合されるようにし、変形ヌクレオチドの抗癌効能を増加させることができるはずである。
【0077】
一実態様において、新規核酸リガンドは、配列番号１～配列番号８からなる群から選択された、一つの核酸配列を有するものであってもよい。
【0078】
一実態様において、新規核酸リガンドは、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡからなる群から選択されたものであってもよい。
【0079】
一実態様において、新規核酸リガンドは必要に応じて５'末端前方または３'末端後方にビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を結合して用いられてもよい。
【0080】
一実態様において、新規核酸リガンドは必要に応じて５'末端前方または３'末端後方に蛍光物質（例：ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＢＨＱ‐１、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ｒｏｄａｍｉｎｅ、またはＴｅＸａｓ Ｒｅｄなど）を結合して用いられてもよい。
【0081】
本開示は一実施態様において、一実施態様による方法を含む方法で製造された非天然核酸リガンドに関するものであってもよい。
【0082】
オリゴヌクレオチドと変形ヌクレオチドを連結するための一方法は、前述したオリゴヌクレオチドの配列の任意の位置に前述した変形ヌクレオチドを挿入、置換、または結合させる段階、またはオリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端の少なくとも一つに、前述した変形ヌクレオチドを結合させる段階を含み得る。
【0083】
本開示のオリゴヌクレオチド配列に含まれたそれぞれの核酸ヌクレオチドは、変形核酸または変形ヌクレオチドに置換され得、オリゴヌクレオチド配列はその配列内に１個以上の変形核酸または変形ヌクレオチドを含み得る。
【0084】
本開示のオリゴヌクレオチドは、互いに異なる２個以上のターゲットに対する特異的結合親和性を有する核酸リガンドであり得る。このような核酸リガンドは、本出願人の韓国特許出願第１０-２０２１-００５９６０７号に具体的に記載されている。本開示の核酸リガンドは、表１に示されたものであってもよい。表１の核酸塩基配列の６と示された部分は、５‐[Ｎ‐（１‐ナフチルメチル）カルボキサミド‐２'‐デオキシウリジン（Ｎａｐ‐ｄＵ）を意味し、９と示された部分はゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）を意味し、Ｎはシスチジンまたはゲムシタビンである。また、下記の核酸リガンドはＤＮＡで構成され、デオキシリボース基盤の核酸からなり、具体的に、Ｇは２'‐デオキシグアノシン（２'‐ｄｅｏｘｙＧｕａｎｏｓｉｎｅ）、Ｃは２'‐デオキシシチジン（２'‐ｄｅｏｘｙＣｙｔｉｄｉｎｅ）、Ａは２'‐デオキシアデノシン（２'‐ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、及びＴはチミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を意味する。
【0085】
【表1】
【0086】
本開示の一実施例による薬学的組成物において、新規核酸リガンドは、エンドサイトーシスなどの経路によって治療的ターゲットが存在する癌細胞内に伝達され得る。ここで前記新規核酸リガンドは、薬学的組成物が投与される対象体の体内に存在する血漿タンパク質に結合し得る。これにより、新規核酸リガンドを含む薬学的組成物は、優れた生体内安定性及び緩やかな腎クリアランス（優れた体内残留時間）を示すことができ、新規核酸リガンドは癌組織に到達した後、前記エンドサイトーシスなどの経路によって癌細胞内に入ることができる。
【0087】
本開示で用いられる用語「対象体」は、ターゲットまたはその作用により誘発される疾患、または病気を有したり疾患または病気を発症したりし得るヒトを含む馬、羊、豚、ヤギ、犬などの哺乳類などを意味するが、好ましくはヒトを意味する。
【0088】
本開示で用いられる用語「エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ；内包作用）」は、細胞が細胞膜外部の物質を細胞膜内部に運ぶ細胞作用を指す。エンドサイトーシスは、外部物質を細胞膜で取り囲んで細胞内へ入れた後、細胞内に小胞を形成して取り込んだ物質を分解した後、再利用したり、外部に排出したりすることができる。エンドサイトーシスは活性化方法や関与するタンパク質の種類によって、マクロピノサイトーシス、クラスリン（ｃｌａｔｈｒｉｎ）タンパク質が関与する受容体媒介内包作用、カベオラ（ｃａｖｅｏｌａｅ）内包作用などに区分され得る。
【0089】
一実態様において、薬学的組成物は血漿タンパク質をさらに含み得る。この場合、薬学的組成物は血漿タンパク質と新規核酸リガンドが結合された形態や新規核酸リガンド単独の形態であってもよく、前記血漿タンパク質は治療対象の体外に存在するタンパク質であってもよい。
【0090】
本開示の一実施例による薬学的組成物において新規核酸リガンドは、マクロピノサイトーシス経路によって治療的ターゲットが存在する癌細胞内に伝達され得る。
【0091】
本開示で用いられる用語「マクロピノサイトーシス（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）」は、エンドサイトーシスのうちの一種であり、細胞骨格タンパク質であるアクチンによって細胞膜が細胞外部に突出して再び収縮する過程中に小袋が形成され得、形成された小袋が細胞内に入って分離され、約０.２μｍの～５μｍの直径を有する小胞（マクロピノソーム）を形成し得る。
【0092】
マクロピノサイトーシスは、最近注目されている腫瘍代謝の一翼を担う。マクロピノサイトーシスを通じて腫瘍細胞の速やかな成長に必要な栄養分（例えば、グルタミン、アルブミンなど）を癌細胞内に供給して代謝に用いることができる。即ち、マクロピノサイトーシスによって形成された小胞内には細胞外液、細胞外分子などが含まれ得る。マクロピノサイトーシスは、癌細胞の腫瘍遺伝子、またはタンパク質の突然変異によって活性化されたものであってもよい。例えば、腫瘍遺伝子は、ＳＲＣ遺伝子またはＫ-ＲＡＳ遺伝子であり得る。例えば、マクロピノサイトーシスは、癌細胞のＫ-ＲＡＳ遺伝子またはタンパク質の突然変異によって活性化されたものであってもよい。Ｋ-ＲＡＳタンパク質の突然変異は野生型Ｋ-ＲＡＳタンパク質の１２番目、１３番目、６１番目のアミノ酸に突然変異が生じたものであってもよく、例えば、Ｋ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、Ｋ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、Ｋ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｋ-ＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｋ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｓ、Ｋ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、Ｋ-ＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、またはＫ-ＲＡＳ Ｑ６１Ｈであってもよい。
【0093】
一実態様において、核酸リガンドは、血漿タンパク質と結合することによって、マクロピノサイトーシスによって細胞内に伝達される効率が高くなり得る。即ち、血漿タンパク質と結合された核酸リガンドは、血漿タンパク質と結合していない核酸リガンドと比べて細胞内に伝達される効果が優れ得る。
【0094】
本開示の一実施例による核酸リガンドは、エンドサイトーシスの多様なメカニズムを通じて細胞質内に伝達され得る。癌細胞の急激な増殖に必要な必須栄養分を供給する主な経路として注目されているマクロピノサイトーシスだけでなく、その他のエンドサイトーシス経路が核酸リガンドの伝達に関与し得る。細胞質内部に伝達された核酸リガンドは、治療標的タンパク質と結合してシグナル伝達経路をかく乱させ、癌細胞の増殖を抑制することができる。
【0095】
一実施態様において、細胞内部に伝達された核酸リガンドは、癌細胞内部のＫ-ＲＡＳ突然変異タンパク質（例えば、Ｋ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ）に結合し、Ｋ-ＲＡＳシグナル伝達経路の下流にあるタンパク質（ＥＲＫなど）のリン酸化を抑制することによって、過度な細胞成長、増殖、分裂などを抑制することができる。従って、本開示の一実施態様による核酸リガンドは、Ｋ-ＲＡＳ突然変異タンパク質を発現する癌（例えば、肺癌、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膀胱癌、胆嚢癌、皮膚癌、胃癌、脳腫瘍、腎臓癌、または、急性骨髄性白血病など）の予防または治療効果を示すことができる。
【0096】
本開示で用いられる用語「治療」は、病気が発生した対象の症状が好転またはよくなる全ての行為を意味し得る。
【0097】
本開示で用いられる用語「予防」は、病気を抑制または遅延させる全ての行為を意味し得る。
【0098】
一実施態様において、新規核酸リガンドは薬学的に有効な量で投与され得る。
【0099】
一実施態様において、新規核酸リガンドは、約１μｇ～約１００μｇ、約５μｇ～約８０μｇ、約１０μｇ～約７０μｇ、約１５μｇ～約６０μｇ、約２０μｇ～約５０μｇ、または、約３０μｇ～約４０μｇの用量で投与され、前記投与は１日に１回、または数回に分けて投与され得る。
【0100】
本開示で用いられる用語「投与」は、ある適切な方法で対象体に一実施例による薬学的組成物を導入することを意味する。投与経路は目的組織に到達できる限り、いかなる一般的な経路を通じて経口または非経口投与されてもよい。具体的には、本開示の一実施例による薬学的組成物は、任意の経路によって、経口、直腸、舌下、及び非経口投与で投与され得、非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻内、膣内、膀胱内、皮内、経皮内、局所、または、皮下投与が含まれる。また、本開示の範囲内で薬品の全身または局所放出が後で生じるように制御された製剤として、薬品を対象体の身体に注入することが考慮される。例えば、薬学的組成物は循環系への制御された放出を通じて、または腫瘍成長の局所部位への放出のために局所化され得る。
【0101】
一実施態様において、薬学的組成物は吸入によって鼻内、気道内、または、気管支内に投与され得る。吸入投与は核酸リガンドを含有する呼吸可能な粒子または液滴を含み、気道、鼻腔などを通じて吸入可能な薬学的製剤を用いた投与であってもよいが、これに制限されるわけではない。例えば、吸入投与には乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、または加圧定量噴霧式吸入器（ｐｒｅｓｓｕｒｉｚｅｄ ｍｅｔｅｒｅｄ ｄｏｓｅ ｉｎｈａｌｅｒ、ｐＭＤＩ）などが用いられるが、これに制限されるわけではない。
【0102】
本開示で用いられる用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なメリット/リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効な用量の水準は患者の体重、性別、年齢、健康状態、重症度、適応症、薬品の活性、薬品に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比、治療期間、同時に用いられる薬品を含む要素、及びその他の医学分野で周知の要素によって決定され得る。
【0103】
本開示は一実態様において、一実態様による新規リガンドを、これを必要とする対象体に薬学的に有効な量で投与する段階を含む、癌を予防または治療する方法に関するものであってもよい。
【0104】
また、本開示は、一実施態様において、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異体に結合する核酸リガンドに関するものであってもよい。核酸リガンドは上述した通りであり得る。
【0105】
一実施態様において、核酸リガンドは配列番号８～１１のうちのいずれか一つの核酸配列を含むか有するものであってもよい。本開示は、一実施態様において、癌を予防または治療するための薬剤の製造のための一実施例による新規核酸リガンドの用途に関するものであってもよい。
【0106】
本開示は、一実施態様において、癌の予防または治療に用いるための一実施例による新規核酸リガンドの用途に関するものであってもよい。
【0107】
本開示は、一実施態様において、一実施例による新規核酸リガンドを含む癌診断のための組成物に関するものであってもよい。
【0108】
本開示は、一実施態様において、一実施例による新規核酸リガンドを含む癌診断用キットに関するものであってもよい。
【0109】
本開示は、一実施態様において、一実施例による新規核酸リガンドを、これを必要とする対象体に投与する段階を含む、癌を診断する方法に関するものであってもよい。
【0110】
本開示は、一実施態様において、三重陰性乳癌を診断するための薬剤製造のための一実施例による新規核酸リガンドの用途に関するものであってもよい。
【0111】
本開示は、一実施態様において、三重陰性乳癌を診断するのに用いるための一実施例による新規核酸リガンドに関するものであってもよい。
【0112】
本開示は、一実施態様において、一実施例による新規核酸リガンドを含む診断用組成物に関するものであってもよい。
【0113】
本開示は、一実施態様において、一実施例による新規核酸リガンドは診断試薬、分析試薬、有害物質検出などに用いられる。一実施例による新規核酸リガンドを用いてサンプルでターゲットを検出する方法として、（ａ）前記サンプルからのターゲットを、一実施例による新規核酸リガンドと接触させる段階を含む方法に関するものであってもよい。一実施態様において、前記検出方法は、段階（ａ）の後に（ｂ）前記標的と核酸リガンドの結合が形成されるかどうかを決定してサンプル内の標的の存否を検出する段階をさらに含み得る。
【0114】
本開示は、一実施態様において、一実施例による新規核酸リガンドを含む造影剤または診断用の放射性医薬品に関するものであってもよい。ここで、新規核酸リガンドは、造影剤または診断用の放射性医薬品として作用するために通常用いられる物質と結合され得、例えば、ラジオアイソトープと結合され得る。
【0115】
本開示の薬剤学的組成物、用途、治療方法に記載された事項は、互いに矛盾しない限り同一に適用され得る。
【0116】
本開示は、前述した実施様態及び後述する実施例を通じてより一層明確になるはずである。以下では、本開示の添付の表を参照して記述される実施例を通じ、該業界の通常の技術者が容易に理解して実現することができるように詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本開示を例示的に説明するためのものであり、本開示の範囲はこれら実施例に限定されない。
【0117】
図１に示されたように、本開示の一実態様による核酸リガンドを得るために下記の実施例を行った。
【0118】
実施例１. 新規核酸リガンドの選別
ＳＥＬＥＸ技術を用いて、核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）から第１ターゲットへの結合力を有する核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を選別した後（１次ＳＥＬＥＸ）、選別された核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を用いてすぐに第２ターゲットに対する２次ＳＥＬＥＸを行い、最終的に複数のターゲットに結合できる核酸リガンドを得た（図２参照）。具体的な新規核酸リガンドの選別方法は下記に記載した。
ＳＥＬＥＸ技術を用いて、核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）から第１ターゲットへの結合力を有する核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を選別した後（１次ＳＥＬＥＸ）、選別された核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を用いてすぐに第２ターゲットに対する２次ＳＥＬＥＸを行い、最終的に複数のターゲットに結合できる核酸リガンドを得た（図２参照）。具体的な新規核酸リガンドの選別方法は下記に記載した。
【0119】
１. ＳＥＬＥＸのための変形ヌクレオチドを含むライブラリーの製作
中央部に４０個の連続的な任意の配列、前記任意の配列の５'末端と３'末端のそれぞれに、核酸増幅のためのプライマーの結合部位、そして５'末端のプライマー結合部位の前にはビオチンが結合された一本鎖核酸のライブラリーの鋳型[Ｂｉｏｔｉｎ-ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ-Ｎ（４０）-ＣＡＧＧＣＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＴＣＡ（配列番号:１２）]を準備した。準備された核酸ライブラリーの鋳型は、理論上１ｘ１０２４個の互いに異なる塩基配列を有するＤＮＡの混合物である。このような一本鎖核酸のライブラリーの鋳型は、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成し、ＰＡＧＥ精製後に実験に用いた（トライリンク、米国）。
中央部に４０個の連続的な任意の配列、前記任意の配列の５'末端と３'末端のそれぞれに、核酸増幅のためのプライマーの結合部位、そして５'末端のプライマー結合部位の前にはビオチンが結合された一本鎖核酸のライブラリーの鋳型[Ｂｉｏｔｉｎ-ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ-Ｎ（４０）-ＣＡＧＧＣＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＴＣＡ（配列番号:１２）]を準備した。準備された核酸ライブラリーの鋳型は、理論上１ｘ１０２４個の互いに異なる塩基配列を有するＤＮＡの混合物である。このような一本鎖核酸のライブラリーの鋳型は、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成し、ＰＡＧＥ精製後に実験に用いた（トライリンク、米国）。
【0120】
変形核酸５-（Ｎ-ベンジルカルボキサミド）-２'-デオキシウリジン（５-（Ｎ-ｂｅｎｚｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）-２'-ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ;Ｂｚ-ｄＵ）、または５-[Ｎ-（１-ナフチルメチル）カルボキサミド]-２'-デオキシウリジン（５-[Ｎ-（１-ｎａｐｈｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ]-２'-ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ;Ｎａｐ-ｄＵ）が含まれた核酸ライブラリーを製作するために、前記のビオチンと結合されているライブラリーの鋳型をストレプトアビジンで表面改質されたレジンに固定した。具体的には、５Ｍ ＮａＣｌ溶液にライブラリーの鋳型と５００μＬのレジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）を混ぜて室温で１時間反応して固定化した。ＮａＣｌで洗浄したレジンに２０μＭの５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ（配列番号:１３））と、０.５ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、Ｎａｐ-ｄＵＴＰまたはＢｚ-ｄＵＴＰ）、０.２５Ｕ/μＬのＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ、米国）、１２０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌをｐＨ ７.８で、１Ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｅｒｃｋ、米国）を添加し、７０℃で２時間酵素反応を行って変形ヌクレオチドが含まれた二本鎖ＤＮＡを製造した。ここに２０ｍＭのＮａＯＨを用いて二本鎖ＤＮＡを変成させてレジンと一本鎖ＤＮＡを分離した後、分離した上澄液をＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（７００ｍＭのＨＣｌ、１８０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.４５%（ｖ/ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０）溶液で中和した。分離が終わったライブラリーはＡｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ-１５（メルクミリポア、米国）を用いて濃縮した後、ＵＶ分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で定量し、最終的に変形核酸が含まれた一本鎖ライブラリーを製作した。
【0121】
２. 第１ターゲットタンパク質（血漿タンパク質）に特異的な核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の選抜
２-１. 血漿タンパク質に特異的な核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の選抜（１次ＳＥＬＥＸ）
ＳＥＬＥＸ用のターゲットタンパク質は、組換えタンパク質のうちヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ-ｔａｇ）が含まれたタンパク質を用いた。コバルトに表面改質されてタンパク質のＨｉｓ-ｔａｇと結合する磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ）のＤｙｎａｂｅａｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）を用いてターゲットタンパク質をビーズに固定した。具体的には、バッファＳＢ１８（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０.０５%（ｖ/ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０;以下同一）に溶けているターゲットタンパク質と、５０μｌのＨｉｓ-ｔａｇ磁性ビーズをサーモミキサー（ＴｈｅｒｍｏｍｉＸｅｒ;エッペンドルフ、ドイツ）で２５℃、１２００ｒｐｍ、３０分間反応させた後、磁石を用いてバッファＳＢ１８で３回洗浄し、ビーズに固定された第１ターゲットタンパク質を準備した。ここで、第１ターゲットタンパク質は、血漿タンパク質に該当するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ;Ａｂｃａｍ、英国、製品名:Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ ｔａｇ）、カタログナンバー:ａｂ２１７８１７）である。以下の実施例では、いずれも前記血漿タンパク質を用いた。
２-１. 血漿タンパク質に特異的な核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の選抜（１次ＳＥＬＥＸ）
ＳＥＬＥＸ用のターゲットタンパク質は、組換えタンパク質のうちヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ-ｔａｇ）が含まれたタンパク質を用いた。コバルトに表面改質されてタンパク質のＨｉｓ-ｔａｇと結合する磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ）のＤｙｎａｂｅａｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）を用いてターゲットタンパク質をビーズに固定した。具体的には、バッファＳＢ１８（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０.０５%（ｖ/ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０;以下同一）に溶けているターゲットタンパク質と、５０μｌのＨｉｓ-ｔａｇ磁性ビーズをサーモミキサー（ＴｈｅｒｍｏｍｉＸｅｒ;エッペンドルフ、ドイツ）で２５℃、１２００ｒｐｍ、３０分間反応させた後、磁石を用いてバッファＳＢ１８で３回洗浄し、ビーズに固定された第１ターゲットタンパク質を準備した。ここで、第１ターゲットタンパク質は、血漿タンパク質に該当するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ;Ａｂｃａｍ、英国、製品名:Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ ｔａｇ）、カタログナンバー:ａｂ２１７８１７）である。以下の実施例では、いずれも前記血漿タンパク質を用いた。
【0122】
合成された核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）をバッファＳＢ１８に入れて９５℃から３７℃まで１℃ごとに１０秒ずつ反応させつつ徐々に温度を下げ、核酸ライブラリーの三次構造の形成を誘導した。非特異的陰性選別のために前記反応液にタンパク質競争緩衝液（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（１μＭのプロトロンビン、１μＭのカゼイン）を混合した後、磁性ビーズ１０μｇに添加してサーモミキサーを用いて３７℃、１２００ｒｐｍ、１０分間反応させた後、上澄液を血漿タンパク質が固定されたＤｙｎａｂｅａｄに移して血漿タンパク質と結合する核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の選抜を実施した。具体的には、非特異的陰性選別を終えた変形核酸ライブラリーを、血漿タンパク質が固定された磁性ビーズとサーモミキサーで３７℃、１２００ｒｐｍ、１時間反応させた。バッファＳＢ１８で核酸ライブラリーとターゲットタンパク質-磁性ビーズ結合体を５回洗浄した後、２ｍＭのＮａＯＨ溶液を添加してターゲットタンパク質に結合した核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を回収した後、８ｍＭのＨＣｌ溶液で中和した。
【0123】
血漿タンパク質に結合したライブラリーを次のラウンドのＳＥＬＥＸに用いるために、ＱＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ、ＣＦＸ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ;バイオ・ラッド、米国）を用いて増幅した。前記ＳＥＬＥＸ過程で回収した核酸ライブラリーにＱＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ[５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ（配列番号:１３））、３'プライマー（Ｂｉｏｔｉｎ-ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ（配列番号:１４））、１Ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ、ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１ｍＭのｄＮＴＰ]を混合して、９６℃で１５秒、５５℃で１０秒、及び６８℃で３０分の条件で１サイクル（ｃｙｃｌｅ）、そして９６℃で１５秒、及び７２℃で１分の条件で３０サイクル繰り返し、血漿タンパク質に結合された核酸ライブラリーを増幅した二本鎖オリゴＤＮＡを製造した。
【0124】
ＱＰＣＲを通じて作られた二本鎖オリゴＤＮＡを２５μｌのＭｙｏｎｅＴＭストレプトアビジン磁性ビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国;以下同一）と常温で１０分間混合して固定し、２０ｍＭのＮａＯＨ溶液を添加してａｎｔｉ-ｓｅｎｓｅ鎖を除去した後、前記変形ヌクレオチドを含むライブラリー製造と同一の方法で変形された核酸を含む核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を、酵素を用いて合成し、次のラウンドに用いた。前記ＳＥＬＥＸラウンドは計８回繰り返し行った。
【0125】
４回目～８回目のＳＥＬＥＸラウンドの場合、核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）と標的タンパク質を結合させた後、１０ｍＭのデキストランサルフェート（ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）と反応させる動的誘発（ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を行い、その後の過程は、１回目のラウンドのｑＰＣＲ増幅過程、及びａｎｔｉ-ｓｅｎｓｅ回収過程と同一である。
【0126】
２-２. １次ＳＥＬＥＸの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の血漿タンパク質に対する結合力測定
２-２-１. ビーズ基盤ＥＬＩＳＡ結合アッセイ（Ｂｅａｄ ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）:アルブミン
ＳＥＬＥＸラウンドが行われた核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の血漿タンパク質に対する結合力を確認するために、ビーズ基盤ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。
２-２-１. ビーズ基盤ＥＬＩＳＡ結合アッセイ（Ｂｅａｄ ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）:アルブミン
ＳＥＬＥＸラウンドが行われた核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の血漿タンパク質に対する結合力を確認するために、ビーズ基盤ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。
【0127】
まず行われた５回目～７回目のラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を増幅した。各ラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）にｂｕｆｆｅｒ[（５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ（配列番号:１３））、３'プライマー（Ｂｉｏｔｉｎ-ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ（配列番号:１４））、１Ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ、ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０.２ｍＭのｄＮＴＰ]を混合し、９６℃で１５秒、及び７２℃で１分の条件で２０サイクル繰り返して核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を増幅し、二本鎖オリゴＤＮＡを製造した。二本鎖オリゴＤＮＡを２５μｌのＭｙｏｎｅＴＭストレプトアビジン磁性ビーズと常温で１０分間混合して固定し、２０ｍＭのＮａＯＨ溶液を添加して溶液中のｓｅｎｓｅ鎖を除去した後、磁性ビーズ-ａｎｔｉ-ｓｅｎｓｅ結合体をバッファＳＢ１７（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０.０５％（ｖ/ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０;以下同一）を用いて２回洗浄した後、１６ｍＭのＮａＣｌを用いて追加洗浄した。洗浄が完了した磁性ビーズ-ａｎｔｉ ｓｅｎｓｅ結合体に２.５μＭの５'プライマー（Ｂｉｏｔｉｎ-ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ（配列番号:１５））と０.５ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、Ｎａｐ-ｄＵＴＰまたはＢｚ-ｄＵＴＰ）、０.２５Ｕ/μｌのＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１２０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、１Ｘ ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒを添加して６８℃で１時間酵素反応を行って変形ヌクレオチドとビオチンが含まれた核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を製造した。磁石を用いて上澄み液を除去して、バッファＳＢ１７で３回洗浄した。新たに合成されたｂｉｏｔｉｎ-ａｎｔｉ-ｓｅｎｓｅ鎖を回収するために２０ｍＭのＮａＯＨを添加して、その後８０ｍＭのＨＣｌで中和した。
【0128】
準備した１ ｐｍｏｌｅのビオチン結合核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）をバッファＳＢ１８に入れて９５℃から３７℃まで１℃ごとに１０秒ずつ反応させ、徐々に温度を下げてＤＮＡの三次構造の形成を誘導した。血漿タンパク質（ＨＳＡ）を２００ｎＭから４倍ずつ薄めて準備し、構造が安定化した核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）と３７℃で３０分間結合させた後、１０μｌのヒスチジンプルダウンビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）を入れて３０分間２５℃で結合させた。磁石を用いてバッファＳＢ１８でビオチン核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）-血漿タンパク質-ビーズ複合体を３回洗浄後、１:３,０００に薄めた１００μｌのストレプトアビジン‐ホースラディッシュ酸化酵素（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ- ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ;ＨＲＰ）の試薬をサンプルに添加し、２５℃で３０分間反応させた。再びＨＲＰ-核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）-血漿タンパク質-ビーズ複合体をバッファＳＢ１８で３回洗浄した後、１００μｌの化学発光溶液（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加して磁石を用いて上澄み液のみ分離した。上澄み液は白のプレートに移してＧｌｏＭａｘプレート測定機（プロメガ、米国）のルミネッセンスプロトコル（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて蛍光値を測定した後、各実験群の結果値からタンパク質のない陰性対照群の値を差し引いた後、グラフを描いて結果を分析した（図３参照）。
【0129】
図３は、第１ターゲットタンパク質であるアルブミンに対し、Ｂｚ-ｄＵ（図面の上段）及びＮａｐ-ｄＵ（図面の下段）をそれぞれ含む核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ;５Ｒ、６Ｒ、７Ｒは、それぞれ５回目、６回目、７回目のラウンドの核酸ライブラリープール）から得られたターゲット結合力の結果である。図３によると、ライブラリー製作に用いた変形核酸の種類や、ターゲットタンパク質の種類に関係なく、すべての１次ＳＥＬＥＸの段階で、ターゲットタンパク質への結合力を示す核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の存在が確認された。
【0130】
２-２-２. フィルタ結合アッセイ（Ｆｉｌｔｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）:ヒト血清アルブミン
【0131】
ターゲットタンパク質とＳＥＬＥＸラウンドが行われた核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の結合力を測定する、また他の方法として、フィルタ結合アッセイを行った。
【0132】
先に行われた６回目のラウンドと８回目のラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の末端を、α-３２Ｐ ＡＴＰ（パーキンエルマー、米国）とＴｄＴ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ;Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）で標識した。
【0133】
具体的に、ＳＥＬＥＸ過程を通じて得た核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を、前記２-２-１と同一の方法で増幅した後、ｓｅｎｓｅ一本鎖核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を製造した。そして核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を１ｐｍｏｌｅ、０.２５μｌのα-３２Ｐ ＡＴＰ、０.２５μｌのＴｄＴ、及びＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）を混合した後、３７℃で３０分間反応させ、７０℃で１０分間処理してＴｄＴ酵素を不活性化させた。標識された核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）はＭｉｃｒｏ ｓｐｉｎ Ｇ５０ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア、米国）を用いて精製した後、ベータカウンター機を用いて定量した。核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）２０,０００ｃｐｍを１００μＬのバッファＳＢ１８に入れ、９５℃から３７℃まで１℃ごとに１０秒ずつ反応させて徐々に温度を下げ、核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の三次構造の形成を誘導した。バッファＳＢ１８を用いてターゲットタンパク質を段階希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）した後、構造を安定化させた標識された核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を３０μＬそれぞれ添加し、３７℃で３０分間反応させた。核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）とターゲットタンパク質の混合物にゾルバックスレジン（ｚｏｒｂａｘ ｒｅｓｉｎ；アジレント、米国）を５.５μＬ添加して５分間さらに反応させた。反応が終了したサンプルを予めバッファＳＢ１８ ５０μＬで濡らしておいたＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ-ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ（メルクミリポア、米国）に移した後、真空で溶液を除去し、メンブレンフィルターを１００μＬのバッファＳＢ１８で洗浄した。フィルタープレート（Ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ）をイメージプレート（ｉｍａｇｅ ｐｌａｔｅ）に１６時間露出させた後、ＦＬＡ-５１００（富士フイルム、日本）でイメージを定量化した。結合親和力は、フィルタ結合アッセイを通じて得られた値をシグマプロット１１という分析ソフトウェア（シスタット・ソフトウエア、米国）を用いて求め、ＢｍａＸはインプット（ｉｎｐｕｔ）対比結合したオリゴＤＮＡの比率を示したものであり、Ｋｄ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）は親和力を示し、Ｎａｐ ｌｉｂはＳＥＬＥＸを行っていない核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を意味するものであり、陰性対照群として用いた（図４参照）。
【0134】
また別の第１ターゲットタンパク質であるＨＳＡに特異的に結合する核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を選抜するためのＳＥＬＥＸを行った後、６回目及び８回目のラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）のターゲット結合力を前記フィルタ結合アッセイ法で測定して図４に示した。図４によると、両ラウンドいずれにおいても、アルブミンタンパク質への結合力を示す核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の存在が確認された。一方ＳＥＬＥＸを行っていない核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）では、アルブミンタンパク質への結合力が示されなかった。
【0135】
３. 第２ターゲットタンパク質（治療標的タンパク質）に特異的な核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の選抜
前述した１次ＳＥＬＥＸと結合アッセイを通じて血漿タンパク質への結合力が確認されたラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を用い、治療標的タンパク質を対象に２次ＳＥＬＥＸを実施した。２次ＳＥＬＥＸ法は１次ＳＥＬＥＸ法と同一であるが、治療標的タンパク質の結合特異性の増加に必要な場合、カウント選別（ｃｏｕｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）過程を追加した。
前述した１次ＳＥＬＥＸと結合アッセイを通じて血漿タンパク質への結合力が確認されたラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を用い、治療標的タンパク質を対象に２次ＳＥＬＥＸを実施した。２次ＳＥＬＥＸ法は１次ＳＥＬＥＸ法と同一であるが、治療標的タンパク質の結合特異性の増加に必要な場合、カウント選別（ｃｏｕｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）過程を追加した。
【0136】
以下の実施例で用いた治療標的タンパク質は、Ｋ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質（Ｓｉｇｎａｌ ｃｈｅｍ社、製品名:Ｋ-ＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒ０６-３２ＢＨ）、カタログナンバー:Ｒ０６-３２ＢＨ）である。
【0137】
２次ＳＥＬＥＸを行うためには、結合力が確認された特定のラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）に対する十分な量が必要なので、これを、ｑＰＣＲを用いて増幅した。ｑＰＣＲ以降の過程は１次ＳＥＬＥＸと同一である。治療的ターゲットであるＫ-ＲＡＳ突然変異タンパク質に結合する核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を選別する場合、Ｋ-ＲＡＳ野生型タンパク質に対してカウント選別を行った。具体的には、Ｋ-ＲＡＳ野生型タンパク質を磁性ビーズ２０μｇに添加してサーモミキサーを用いて３７℃、１２００ｒｐｍ、１０分間反応させた後、磁石とバッファＳＢ１８を用いて野生型タンパク質-磁性ビーズ複合体を３回洗浄した。このように準備した複合体に、準備された核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）とタンパク質競争緩衝液（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）の混合液を添加して３７℃、１２００ｒｐｍ、１０分間反応させた後、野生型タンパク質に結合していない上澄液の核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を突然変異型ターゲットタンパク質が固定されたビーズに移し、治療標的タンパク質と結合する核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）を選抜した。治療標的タンパク質に対する２次ＳＥＬＥＸも同一の方法で５～８ラウンド実施し、デキストランサルフェートを用いた動的誘発は行わなかった。
【0138】
前述したＥＬＩＳＡ結合アッセイ方法と同一に、各ラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）サンプルを用いて治療標的タンパク質に対する結合力を確認した（図５参照）。
【0139】
例えば、第２ターゲットタンパク質としてＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄを用いた。これに対する結果を図５に示した。図５によれば、第１ターゲットタンパク質の種類及び第２ターゲットタンパク質の種類に関係なく、第２ターゲットタンパク質に対する結合力を示す核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の存在が確認された。
【0140】
４. ＳＥＬＥＸ核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）の塩基配列の分析
結合力が確認されたＳＥＬＥＸラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）サンプルを、５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ（配列番号:１３））と３'プライマー（ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ（配列番号１６））を用いてＰＣＲ過程を通じて増幅した後、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）を用いてクローニングし、Ｅ.ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞に形質転換させた。寒天培地で育った単一コロニーのプラスミド核酸をＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）キット（エンジノミクス、韓国）を用いて増幅し、クローニングしたＰＣＲ産物の挿入有無を確認した後、単一配列が挿入されたクローンのＲＣＡサンプルを用いてＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）と毛細血管電気泳動法で塩基配列分析（ソルジェント、韓国）を実施した。例えば、各サンプル当たり最少で略５０個の程度のクローン配列分析を実施して、ＳＥＬＥＸを通じて選抜された核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）に存在するそれぞれの核酸配列を最終確認した。
結合力が確認されたＳＥＬＥＸラウンドの核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）サンプルを、５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ（配列番号:１３））と３'プライマー（ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ（配列番号１６））を用いてＰＣＲ過程を通じて増幅した後、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）を用いてクローニングし、Ｅ.ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞に形質転換させた。寒天培地で育った単一コロニーのプラスミド核酸をＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）キット（エンジノミクス、韓国）を用いて増幅し、クローニングしたＰＣＲ産物の挿入有無を確認した後、単一配列が挿入されたクローンのＲＣＡサンプルを用いてＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）と毛細血管電気泳動法で塩基配列分析（ソルジェント、韓国）を実施した。例えば、各サンプル当たり最少で略５０個の程度のクローン配列分析を実施して、ＳＥＬＥＸを通じて選抜された核酸ライブラリープール（ｐｏｏｌ）に存在するそれぞれの核酸配列を最終確認した。
【0141】
分析が完了した核酸配列をＭｕｌｔａｌｉｎのウェブサイトまたは当社製作ソフトウェアを用いて分析し、発現頻度が最も多い配列（例:略５個～略１０個）を選抜した。
【0142】
５. ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を利用したクローン核酸リガンドの合成及び結合力測定
前記で選抜された核酸配列に対し、塩基配列分析に用いられた二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ（配列番号:１３））、ビオチン結合の３'プライマー（Ｂｉｏｔｉｎ-ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ（配列番号:１４））及び、ＤＮＡポリメラーゼを用いて合成した。これはクローン核酸リガンドに該当する。前述した実施例１の項目２-２-１.のビーズ基盤ＥＬＩＳＡ結合アッセイと同一の方法でクローン核酸リガンドのターゲットタンパク質に対する結合力を測定した（例：図６ａ及び図６ｂ参照）。
前記で選抜された核酸配列に対し、塩基配列分析に用いられた二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、５'プライマー（ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧ（配列番号:１３））、ビオチン結合の３'プライマー（Ｂｉｏｔｉｎ-ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ（配列番号:１４））及び、ＤＮＡポリメラーゼを用いて合成した。これはクローン核酸リガンドに該当する。前述した実施例１の項目２-２-１.のビーズ基盤ＥＬＩＳＡ結合アッセイと同一の方法でクローン核酸リガンドのターゲットタンパク質に対する結合力を測定した（例：図６ａ及び図６ｂ参照）。
【0143】
即ち、核酸リガンドのＨＳＡタンパク質とＫ-ＲＡＳタンパク質に対する結合親和度をそれぞれ分析した結果、結合力が確認されたＳ０１６-Ｅ２の#１クローンを選抜した。このようなクローンを用いて配列番号１の核酸リガンドを合成し、以下の実施例で用いた（図６ａ及び図６ｂ参照）。
【0144】
このように、第１ターゲットタンパク質及び第２ターゲットタンパク質に対する結合親和度が確認された配列を選抜し、このように選抜された全長核酸リガンドを、ＤＮＡ自動合成機を用いて変形核酸が含まれた形態に合成し、以下の実施例において全長核酸リガンドとして用いた。
【0145】
例えば、実施例１の方法で選別された全長核酸リガンドは、表２に記載された核酸リガンドＡＤ００３である。
【0146】
実施例１の方法で選別した全長核酸リガンドＡＤ００３を、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ１５０（Ｗａｔｅｒｓ、米国）とＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ-Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ ＰＬＵＳ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）に逆相のＣ１８カラムで分析して精製した。また、精製された核酸リガンドの質量分析をＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２-ＸＳ Ｑ-ＴＯＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）で行った。質量分析結果は表３に記載した。
【0147】
以下の表に記載された核酸塩基配列の６と示された部分は、５-[Ｎ-（１-ナフチルメチル）カルボキサミド]-２'-デオキシウリジン（Ｎａｐ-ｄＵ）を意味する。
【0148】
【表2】
【0149】
実施例２. 全長核酸リガンドの最適化（Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）及び製造
実施例１の方法で選別された全長核酸リガンドを用いて最適化のための切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）過程を行った。
実施例１の方法で選別された全長核酸リガンドを用いて最適化のための切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）過程を行った。
【0150】
最適化のためにＭｆｏｌｄウェブサーバー（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｕｎａｆｏｌｄ.ｏｒｇ/ｍｆｏｌｄ/ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ/ｄｎａ-ｆｏｌｄｉｎｇ-ｆｏｒｍ.ｐｈｐ）を用いて全長核酸リガンドの２Ｄ構造を予測し、これに基づいて選抜された全長核酸リガンドの両末端から長さを縮め、最小の長さでクローン配列（母体になる全長核酸リガンド）と類似の最適化核酸リガンド候補を合成した。例えば、核酸リガンドＡＤ００３～ＡＤ００８の２Ｄ予測構造を図７ａ～図７ｃに示した。
【0151】
核酸リガンドはＭｅｒｍａｄｅ １２またはＭｅｒｍａｄｅ ４８（バイオオートメーション、米国）を用いて一般的なＤＮＡ自動合成法で合成した。[Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ→Ｃｏｕｐｌｉｎｇ→Ｃａｐｐｉｎｇ→Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ]の４段階工程を１サイクルとして１ｍｅｒずつ（１個のヌクレオチドずつ）３'末端から５'末端に順次合成した。必要に応じて核酸リガンドの５'末端の前方にビオチンや蛍光物質（ＦＡＭまたはＣｙ５）を結合した。ビオチンとＦＡＭは自動合成機で合成し、Ｃｙ５は５'-アミン核酸リガンド合成後、アミンカップリング（Ａｍｉｄｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を行って合成した。合成された核酸リガンドまたはビオチンか蛍光物質（ＦＡＭまたはＣｙ５）が結合された核酸リガンドは、ＨＰＬＣ精製を経て以下の実施例で用いた。
【0152】
実施例２により製造された核酸リガンドを、全長核酸リガンドＡＤ００３（太字及び下線で表示）とともに下の表３に記載した。該表３の最適化核酸リガンドはいずれも同一の全長核酸リガンドＡＤ００３を用いたものである。
【0153】
このように製造された核酸リガンドをＷａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ１５０（Ｗａｔｅｒｓ、米国）とＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ-Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ ＰＬＵＳ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）に逆像Ｃ１８カラムで分析して精製した。また精製された核酸リガンドの質量分析をＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２-ＸＳ Ｑ-ＴＯＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）で行った。質量分析の結果は表３に記載した。
【0154】
【0155】
【表3-1】
【表3-2】
【0156】
*前記表３の質量分析では５'末端にビオチンが結合された核酸リガンドを用いた。以下では実施例１～２により製造された核酸リガンドを対象に、実際の薬品で用いたときに効能を発揮できる核酸リガンドを選別するための過程を行った。
【0157】
実施例３. 選別された全長核酸リガンドの複数のターゲットに対するＤｎａｓｅ安定性実験
血清には種々の核酸分解酵素が存在するところ、オリゴ核酸物質を血清と反応させると数時間内にオリゴ核酸分子が分解されることは十分に知られている。しかし、アルブミンのような血漿タンパク質と結合した核酸リガンドは、核酸分解酵素の分解作用に抵抗性を示して分解されないと報告されている。また、核酸リガンドは、血漿タンパク質以外の他のターゲットタンパク質と結合した場合にも核酸分解酵素の分解作用に抵抗性を示し得る。従って、選抜された全長核酸リガンドを核酸分解酵素に露出させる条件下で反応させ、核酸リガンドの分解程度を把握して第１及び第２ターゲットタンパク質との結合有無を評価し、さらに血清内で核酸リガンドの安定性を評価した。このような評価によって、血液内のターゲットタンパク質に対する結合により、ターゲットに結合して所望の効果を奏する核酸リガンドの構造、または核酸リガンドのターゲットに対する結合部位が維持されて有効な効能を示し得る核酸リガンドなのかどうかを予め確認することができる。
血清には種々の核酸分解酵素が存在するところ、オリゴ核酸物質を血清と反応させると数時間内にオリゴ核酸分子が分解されることは十分に知られている。しかし、アルブミンのような血漿タンパク質と結合した核酸リガンドは、核酸分解酵素の分解作用に抵抗性を示して分解されないと報告されている。また、核酸リガンドは、血漿タンパク質以外の他のターゲットタンパク質と結合した場合にも核酸分解酵素の分解作用に抵抗性を示し得る。従って、選抜された全長核酸リガンドを核酸分解酵素に露出させる条件下で反応させ、核酸リガンドの分解程度を把握して第１及び第２ターゲットタンパク質との結合有無を評価し、さらに血清内で核酸リガンドの安定性を評価した。このような評価によって、血液内のターゲットタンパク質に対する結合により、ターゲットに結合して所望の効果を奏する核酸リガンドの構造、または核酸リガンドのターゲットに対する結合部位が維持されて有効な効能を示し得る核酸リガンドなのかどうかを予め確認することができる。
【0158】
まずバッファＳＢ１８に溶かした０.５ｐｍｏｌｅの核酸リガンド（実施例１及び２の方法で選別）、ＤＭＥＭ培地、核酸分解酵素反応用緩衝溶液（ＤＮａｓｅＩ ＲＮａｓｅ-ｆｒｅｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）及び滅菌ＤＷを混合する。このように製造した核酸リガンド混合物を９５℃から３７℃まで１℃ごとに１０秒ずつ反応させながら、徐々に温度を下げて核酸リガンドの三次構造の形成を誘導した。安定化した核酸リガンドに第１ターゲットタンパク質（血漿タンパク質）、または第２ターゲットタンパク質（治療標的タンパク質）を２０ｐｍｏｌｅ添加した後、４℃で３０分間反応させて核酸リガンドとターゲットタンパク質を結合させた。この時、陽性対照群及び陰性対照群にはターゲットタンパク質を添加しなかった。この反応液に核酸分解酵素（ＤＮａｓｅＩ、サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）１ユニット（ｕｎｉｔ）を添加して３７℃で１６時間、核酸分解酵素作用を活性化した。この時、陰性対照群には核酸分解酵素を添加しなかった。反応の１６時間後に８５℃で加熱して核酸分解酵素を不活性化させ、１０%の尿素-ポリアクリルアミドゲル（Ｕｒｅａ-Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で電気泳動を実施した。各対照群と各実験群のバンド強度（ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を比較して核酸分解酵素に対する核酸リガンドの安定性を確認した。このような結果から核酸リガンドがターゲットタンパク質に効果的に結合するかどうかを確認でき、核酸分解酵素に対する優れた安定性を示す核酸リガンド候補を選別することができる。
【0159】
実施例１の方法で選別した全長核酸リガンドを用いて前記実験を行った。バンド強度が血漿タンパク質及び治療標的タンパク質のいずれに対しても有意味な核酸リガンドは、血漿タンパク質及び治療標的タンパク質にいずれも優れるように結合する特性を有するだろう。電気泳動結果で核酸分解酵素を添加していない陰性対照群のバンドと比較して、バンド強度が１０%を以上の場合を各ターゲットタンパク質と有意味に結合することで評価した。血漿タンパク質及び治療標的タンパク質いずれに対しても結合する結果を示す全長核酸リガンドを表４に記載した。ただし、全長核酸リガンドに対するＤｎａｓｅ電気泳動結果が有意味でなくても、これの最適化配列では電気泳動結果が有意味に出て、結合力（Ｋｄ）が確認される場合が存在し得る。
【0160】
【0161】
各ターゲットタンパク質に結合する結果を示す、核酸リガンドのターゲットに対する結合親和度を追加で確認するために結合力（Ｋｄ）を測定した。
【0162】
実施例４. 全長核酸リガンドの複数のターゲットに対する結合力（Ｋｄ）の測定
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法を用いて核酸リガンドの結合力を測定した。まず５'ビオチンが結合された核酸リガンドをバッファＳＢ１８内で９５℃から３７℃まで１℃ごとに１０秒ずつ反応させて徐々に温度を下げ、核酸リガンドの三次構造の形成を誘導した。
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法を用いて核酸リガンドの結合力を測定した。まず５'ビオチンが結合された核酸リガンドをバッファＳＢ１８内で９５℃から３７℃まで１℃ごとに１０秒ずつ反応させて徐々に温度を下げ、核酸リガンドの三次構造の形成を誘導した。
【0163】
実験方法は次のような段階で行われる。
【0164】
１）マイクロプレートにターゲットタンパク質を低温で１６時間コーティングする。
【0165】
２）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ-Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）を用いて常温で１時間反応してマイクロプレート表面をブロックさせる。
【0166】
３）マイクロプレートに核酸リガンドを処理して３７℃で１時間反応させる。
【0167】
４）酵素接合（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のためにＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ-Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）を処理して常温で１時間反応させる。
【0168】
５）ＴＭＢ（ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）基質を処理して常温で３０分反応させる。
【0169】
６）反応終結液（２Ｍの硫酸）を処理する。
【0170】
７）ＧｌｏＭａＸプレート測定機（プロメガ、米国）を用いて４５０ｎｍで吸光を測定する。
【0171】
ターゲットタンパク質は５００ｎＭ、核酸リガンドは５００ｎＭから４倍ずつ薄めて用いた。測定された核酸リガンドの各ターゲットタンパク質に対する結合親和度を表４に示した。ターゲットタンパク質にいずれも結合する電気泳動結果を示す核酸リガンドは、各ターゲットタンパク質に対する結合親和度を示すことを確認することができる。
【0172】
実施例５. 全長核酸リガンドの血清内の半減期の実験
まず、バッファＳＢ１８に溶かした２ｐｍｏｌｅの核酸リガンドを９５℃から３７℃まで、１℃ごとに１０秒ずつ反応させながら徐々に温度を下げ、核酸リガンドの三次構造の形成を誘導した。安定化した核酸リガンドを９６%ヒト血清に添加した後、３７℃で０、３、６、９、１２、１５、１８時間反応させて核酸リガンドの分解を誘導した。各反応時間が終わった後に８５℃で加熱して核酸分解酵素を不活性化させ、１０%尿素-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を実施した。ヒト血清を添加していない対照群をローディングコントロール（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）に含んで対照群と実験群のバンド強度を測定した。測定された値を用いて時間別の強度傾向線を確認し、傾向式に強度値を代入して半減期を確認した。傾向線を逸脱する場合、０、２４、４８、７２、９６時間の条件で追加実験を行った。
まず、バッファＳＢ１８に溶かした２ｐｍｏｌｅの核酸リガンドを９５℃から３７℃まで、１℃ごとに１０秒ずつ反応させながら徐々に温度を下げ、核酸リガンドの三次構造の形成を誘導した。安定化した核酸リガンドを９６%ヒト血清に添加した後、３７℃で０、３、６、９、１２、１５、１８時間反応させて核酸リガンドの分解を誘導した。各反応時間が終わった後に８５℃で加熱して核酸分解酵素を不活性化させ、１０%尿素-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を実施した。ヒト血清を添加していない対照群をローディングコントロール（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）に含んで対照群と実験群のバンド強度を測定した。測定された値を用いて時間別の強度傾向線を確認し、傾向式に強度値を代入して半減期を確認した。傾向線を逸脱する場合、０、２４、４８、７２、９６時間の条件で追加実験を行った。
【0173】
例えば、ＡＤ００３～ＡＤ００８核酸リガンドに対する時間に応じた電気泳動結果（血清安定性実験結果）を図７ａ～図７ｃに示した。また、このように測定した各ターゲットタンパク質に対する血清半減期（ｈｒ）を表４に示した。表４によれば、本開示の一実施態様による核酸リガンドは血清中半減期が高く示されるのが確認でき、これは本開示の一実施態様による核酸リガンドが血漿タンパク質に対して優れた結合力を有し、これにより優れた体内安定性を示し得ることを意味する。
【0174】
実施例６. 最適化核酸リガンドの結合力（Ｋｄ）、血清中半減期、及びＤｎａｓｅ安定性の実験
実施例２から製造された最適化された核酸リガンドのうちの一部に対して実施例３と同一の方法でターゲットタンパク質に対するＤｎａｓｅ安定性実験を行った。代表的な最適化された核酸リガンドの結果を表４に記載した。
実施例２から製造された最適化された核酸リガンドのうちの一部に対して実施例３と同一の方法でターゲットタンパク質に対するＤｎａｓｅ安定性実験を行った。代表的な最適化された核酸リガンドの結果を表４に記載した。
【0175】
Ｄｎａｓｅ安定性実験によりターゲットタンパク質に対する結合が確認された最適化核酸リガンドに対し、実施例４と同一の方法でターゲットタンパク質に対する結合親和度（Ｋｄ）を測定し、実施例５と同一の方法で血清中半減期を確認した。このように得られた結果を表４に示した。
【0176】
表４に記載された太字及び下線で示された核酸リガンドは、最適化の基礎となったオリジナル全長核酸リガンド（Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり、その下の核酸リガンドは最適化された切断核酸リガンド（Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に該当する。
【0177】
【表4】
【0178】
*表４に記載された実験では、５'末端にビオチンが結合された核酸リガンドを用いた。その後、前記のように製造した配列番号１～１０の核酸リガンドのうち、最適化されたＡＤ００５（配列番号３）、ＡＤ００８９（配列番号７）、ＡＤ２１０（配列番号８）、ＡＤ２１１（配列番号９）、及びＡＤ２１２（配列番号１０）を用いて核酸リガンドの三重陰性乳癌に対する抗癌効能を確認した。
【0179】
実施例７. ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄターゲット核酸リガンドの三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（Ｔｒｉｐｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｄｅｌ）における抗癌効能の評価
三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）に対する抗癌効能を評価するにあたっては、どのようなｉｎ-ｖｉｖｏ実験モデルを選択して用いるかが重要である。人体内の免疫学的及び生理学的作用は複雑に作用するので、動物における非臨床実験の結果がヒトへの抗癌効能として信頼を有するためにはヒトの体内環境と類似のモデルを用いることが必要なためである。特にＴＮＢＣの場合、侵襲性、転移性及び再発性があり、早期に遠隔臓器で再発する確率と死亡率が高いので、モデルの選定がより一層重要となり得る。
三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）に対する抗癌効能を評価するにあたっては、どのようなｉｎ-ｖｉｖｏ実験モデルを選択して用いるかが重要である。人体内の免疫学的及び生理学的作用は複雑に作用するので、動物における非臨床実験の結果がヒトへの抗癌効能として信頼を有するためにはヒトの体内環境と類似のモデルを用いることが必要なためである。特にＴＮＢＣの場合、侵襲性、転移性及び再発性があり、早期に遠隔臓器で再発する確率と死亡率が高いので、モデルの選定がより一層重要となり得る。
【0180】
現在利用可能な前臨床自発転移性ＴＮＢＣの同所マウスモデル（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ＴＮＢＣ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ）には、免疫不全ヒトＭＤＡ‐モデルＭＢ‐２３１と、免疫適格マウスのモデル４Ｔ１が存在する。ここで、ヒト由来の癌細胞である、細胞株ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１の場合、マウスに対する移植は異種移植に該当するため、ＮＯＤ/ＳＣＩＤ（Ｎｏｎ Ｏｂｅｓｅ Ｄｉａｂｅｔｉｃ‐Ｓｅｖｅｒｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）マウス、またはヌード（ｎｕｄｅ）マウスを用いらなければならないという限界がある。このような点で、異種移植された癌細胞（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ）は宿主がヒトではないので、基本的にマウス実験のように侵襲的または攻撃的ではない。従って、一般に異種移植を行う際はマトリゲルを用いるが、これはヒト由来の癌細胞がマウス体内で十分に生着がなされないためである。ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１モデルはヒトの細胞株をマウスに移植する異種移植モデルなので、４Ｔ１、ＣＴ２６、ＭＣ３８、Ｂ１６Ｆ１０等のマウス細胞のように、マウス内で早く育たない。侵襲性/攻撃性（Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）が相対的に低いので、マウスモデルでも転移があまり発生せず、異種移植で用いなければならないＮＯＤ/ＳＣＩＤマウス、またはヌードマウスの場合、免疫細胞が一部または全て存在しないため、免疫体系が除去されるか正しく作動しないので、ヒトへの抗癌効能として信頼するには限界があり得、特にＴＮＢＣのような侵襲性及び転移性癌の場合、癌発生と抗癌機作を十分に実現して評価できないため限界が存在し得る。また、癌転移のメカニズムで免疫細胞が寄与する部分もあるので、免疫不全マウスを用いらざるを得ないＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１モデルは、４Ｔ１モデルと比べてＴＮＢＣに対する効能を評価するのに限界があるため、正しい評価結果を導き出すのが難しい。これに対し、本実験では、４Ｔ１のマウスモデルを用いて原発性ＴＮＢＣと転移性ＴＮＢＣ（即ち、他の臓器への癌の転移、または外科的手術除去後にも他の臓器で発生する転移性癌）に対する本発明の核酸リガンドの予防または治療効果を評価しようとした。即ち、モデル４Ｔ１はマウスの脂肪パッド（４ｔｈ Ｆａｔ ｐａｄ）に４Ｔ１腫瘍細胞を注入した後に育った原発腫瘍を標的治療するための原発性ＴＮＢＣモデルであるのみならず、転移性乳癌モデルであり、前記のように育った原発腫瘍を外科的に完全に除去すれば、残存する腫瘍細胞が異なる臓器、特に肺に自発的転移され、乳癌の自発的転移モデルが生まれる。このとき、４Ｔ１細胞にルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）がタグ（ｔａｇｇｉｎｇ）された細胞を用いると、注入した腫瘍細胞をルシフェリン（Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）及び生物発光イメージングシステム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ; ＩＶＩＳ）を用いて多様な視点からイメージングできるので、抗癌剤による原発腫瘍の治療効果及び乳癌の転移の治療効果を観察できる有用なモデルである。
【0181】
細胞培養
４Ｔ１-Ｌｕｃ２三重陰性乳癌細胞株はＡＴＣＣ（米国）から分譲を受けて実験に用い、１０%のＦＢＳと１%の抗生剤が含まれた培地を用いて、３７℃、５%ＣＯ２条件のインキュベーターで培養した。継代培養は細胞が培養容器の８０%以上増殖した際に行った。その方法は次のとおりである。ＰＢＳで洗浄した細胞に０.０５%のトリプシン-ＥＤＴＡを添加して３分間反応させ、新たな培地を添加してトリプシンを不活性化させる。遠心分離機を用いて細胞を得た後、新しい培養容器に１:５の比率で薄めて培養した。すべての細胞はマイコプラズマの汚染の有無を、ｋｉｔ（バイオマックス、韓国）を用いてＰＣＲ方法で確認し、汚染が検出されていない細胞のみを用いて実験を進めた。
４Ｔ１-Ｌｕｃ２三重陰性乳癌細胞株はＡＴＣＣ（米国）から分譲を受けて実験に用い、１０%のＦＢＳと１%の抗生剤が含まれた培地を用いて、３７℃、５%ＣＯ２条件のインキュベーターで培養した。継代培養は細胞が培養容器の８０%以上増殖した際に行った。その方法は次のとおりである。ＰＢＳで洗浄した細胞に０.０５%のトリプシン-ＥＤＴＡを添加して３分間反応させ、新たな培地を添加してトリプシンを不活性化させる。遠心分離機を用いて細胞を得た後、新しい培養容器に１:５の比率で薄めて培養した。すべての細胞はマイコプラズマの汚染の有無を、ｋｉｔ（バイオマックス、韓国）を用いてＰＣＲ方法で確認し、汚染が検出されていない細胞のみを用いて実験を進めた。
【0182】
動物の準備
雌マウスのＢａｌｂ/ｃ（７週齢）は、ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（ソンナム、韓国）から購入し、すべての動物実験は成均館大学動物実験倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）の規定に従って行われた。
雌マウスのＢａｌｂ/ｃ（７週齢）は、ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（ソンナム、韓国）から購入し、すべての動物実験は成均館大学動物実験倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）の規定に従って行われた。
【0183】
実施例７-１. ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄターゲット核酸リガンドの三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍未切除モデル）の抗癌効能の評価
７-１-１. 三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍未切除モデル）の製作、及び試験物質の投与（図１０参考）
７-１-１. 三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍未切除モデル）の製作、及び試験物質の投与（図１０参考）
【0184】
前記記載した方法で培養された細胞株４Ｔ１-Ｌｕｃ２（５Ｘ１０５ｃｅｌｌ）を１Ｘ ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）溶液３０μｌに薄め（一匹当たり５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ/３０μｌ）、準備された雌マウスＢａｌｂ/ｃの脂肪パッド（４ｔｈ ｆａｔ ｐａｄ）に同所移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。細胞注入から（平均６０ｍｍ３サイズの腫瘍形成時点）６日目、対照群薬品及び試験物質を腹腔内注射（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＩＰ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して腫瘍の抑制効能を比較した。
【0185】
各実験群の動物数は５匹であった。陽性対照群薬品であるゲムシタビン（１ｍｇ）及び試験薬品であるＡＬ００５（３０μｇ、１００μｇ、３００μｇ）を２日に１回ずつ、計６回腹腔内注射した。
【0186】
７-１-２. 試験物質投与後、マウス観察及び結果の測定
約３０日ほどはマウスの生存率及び重さの変化を観察し、腫瘍の体積測定は方程式[腫瘍の長軸Ｘ（腫瘍の短軸）２Ｘ０.５]を用いて２日ごとに測定した。
約３０日ほどはマウスの生存率及び重さの変化を観察し、腫瘍の体積測定は方程式[腫瘍の長軸Ｘ（腫瘍の短軸）２Ｘ０.５]を用いて２日ごとに測定した。
【0187】
７-１-３. 実験結果
腫瘍未切除実験における腫瘍抑制効能の確認結果は図１１のとおりである。
腫瘍未切除実験における腫瘍抑制効能の確認結果は図１１のとおりである。
【0188】
薬品未処理群は時間が経過するほど腫瘍の大きさが急激に増加した。一方、本発明の核酸リガンドを投与した場合、腫瘍の大きさの増加が大幅に減少するのを確認でき、薬品未処理群と比較して試験物質ＡＤ００５は投与用量が増加するほど優れた腫瘍抑制効果を奏した。特に、ＡＤ００５の３００μｇ処理群は陽性対照群薬品であるゲムシタビン処理群より投与用量が約３分の１ほど少なかったにもかかわらず、陽性対照群と類似の腫瘍抑制効能を確認した（図１１）。
【0189】
実施例７-２. ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄターゲット核酸リガンドの三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）における抗癌効能の評価
７-２-１. 三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の製作及び試験物質の投与（図１２参考）
前記に記載した方法で培養された４Ｔ１-Ｌｕｃ２細胞株（５Ｘ１０５ｃｅｌｌ）を１Ｘ ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）溶液３０μｌに薄めて（一匹当たり５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ/３０μｌ、準備されたＢａｌｂ/ｃ雌マウスの脂肪パッド（４ｔｈ ｆａｔ ｐａｄ）に同所移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。細胞注入から（平均６０ｍｍ３サイズの腫瘍が形成された時点）１０日目に腫瘍を手術的に除去した後、試験物質を腹腔内注射して腫瘍の転移抑制効能を比較した。
７-２-１. 三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の製作及び試験物質の投与（図１２参考）
前記に記載した方法で培養された４Ｔ１-Ｌｕｃ２細胞株（５Ｘ１０５ｃｅｌｌ）を１Ｘ ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）溶液３０μｌに薄めて（一匹当たり５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ/３０μｌ、準備されたＢａｌｂ/ｃ雌マウスの脂肪パッド（４ｔｈ ｆａｔ ｐａｄ）に同所移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。細胞注入から（平均６０ｍｍ３サイズの腫瘍が形成された時点）１０日目に腫瘍を手術的に除去した後、試験物質を腹腔内注射して腫瘍の転移抑制効能を比較した。
【0190】
試験群の構成は表５のとおりである。試験物質であるＡＤ００５を３０μｇ、２日に一回ずつ計６回（Ｄａｙ０、２、４、６、８、１０）腹腔内注射し、各試験群の転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）状態をＩＶＩＳ（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で確認した。
【0191】
【表5】
【0192】
７-２-２. 試験物質投与後、マウス観察及び結果測定
薬品の腹腔内投与後、約７日間隔で５０日が経過するまでＩＶＩＳ（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）撮影した。マウス一匹当たり１５０ｍｇ/ｋｇの濃度でルシフェリンを注射し、１０分の反応後、ＩＶＩＳ撮影した。
薬品の腹腔内投与後、約７日間隔で５０日が経過するまでＩＶＩＳ（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）撮影した。マウス一匹当たり１５０ｍｇ/ｋｇの濃度でルシフェリンを注射し、１０分の反応後、ＩＶＩＳ撮影した。
【0193】
７-２-３. 試験結果
腫瘍切除モデル実験における転移及び再発抑制効果の結果は図１３のとおりである。薬品未処理群は腫瘍切除後３２日目、４匹のうち２匹が斃死し、５０%の生存率を示したが、試験物質ＡＤ００５を３０μｇ投与した実験群は３２日目に７匹のうち２匹のみ斃死して約７０%の生存率を示した。
腫瘍切除モデル実験における転移及び再発抑制効果の結果は図１３のとおりである。薬品未処理群は腫瘍切除後３２日目、４匹のうち２匹が斃死し、５０%の生存率を示したが、試験物質ＡＤ００５を３０μｇ投与した実験群は３２日目に７匹のうち２匹のみ斃死して約７０%の生存率を示した。
【0194】
実施例７-３. ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄターゲット核酸リガンド、及びその切断核酸リガンド（ＡＤ００５ Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）における抗癌効能の評価
７-３-１. 三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の製作及び試験物質の投与
三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の製作方法及び試験物質の投与経路は７-２-１.で記載した内容と同一である。
７-３-１. 三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の製作及び試験物質の投与
三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の製作方法及び試験物質の投与経路は７-２-１.で記載した内容と同一である。
【0195】
試験群の構成は表６のとおりである。陽性対照群薬品であるゲムシタビン（１ｍｇ）、陰性対照群薬品（ＥＲＢＢ２標的核酸リガンド）のＣｏｎｔｒｏｌ ａｐｔａｍｅｒ（配列番号１７）（３００μｇ）及び試験物質であるＡＤ００５（３００μｇ、６００μｇ）、ＡＤ０８９（３００μｇ、６００μｇ）を２日に一回ずつ１５回（Ｄａｙ０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８）腹腔内注射し、各試験群の転移状態をＩＶＩＳ（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で確認した。本実験の計画概括は図１４に示したとおりである。
【0196】
【表6】
【0197】
７-３-２. 試験物質投与後、マウス観察及び結果測定
薬品の腹腔内投与後、約７日間隔で５９日が経過するまでＩＶＩＳ（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）撮影した。マウス一匹当たり１５０ｍｇ/ｋｇの濃度でルシフェリンを注射し、１０分反応後、ＩＶＩＳ撮影した。
薬品の腹腔内投与後、約７日間隔で５９日が経過するまでＩＶＩＳ（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）撮影した。マウス一匹当たり１５０ｍｇ/ｋｇの濃度でルシフェリンを注射し、１０分反応後、ＩＶＩＳ撮影した。
【0198】
約６０日程度までマウス生存率及び重さの変化を観察し、腫瘍の体積測定は方程式[腫瘍の長軸Ｘ（腫瘍の短軸）２Ｘ０.５]を用いた。
【0199】
７-３-３. 試験結果
腫瘍切除モデル実験における転移及び再発抑制効果の結果は図１５及び１６のとおりである。薬品未処理群は腫瘍切除から３５日が経過するまで全て斃死し、陽性対照群薬品であるゲムシタビン投与群と陰性対照群薬品（ＨＥＲ２標的核酸リガンド）のＣｏｎｔｒｏｌ ａｐｔａｍｅｒ投与群は、４２日以前に全て転移によって斃死したが、試験物質であるＡＤ００５及びＡＤ０８９投与群は５９日が経過するまで一部の個体が生存した。
腫瘍切除モデル実験における転移及び再発抑制効果の結果は図１５及び１６のとおりである。薬品未処理群は腫瘍切除から３５日が経過するまで全て斃死し、陽性対照群薬品であるゲムシタビン投与群と陰性対照群薬品（ＨＥＲ２標的核酸リガンド）のＣｏｎｔｒｏｌ ａｐｔａｍｅｒ投与群は、４２日以前に全て転移によって斃死したが、試験物質であるＡＤ００５及びＡＤ０８９投与群は５９日が経過するまで一部の個体が生存した。
【0200】
５９日経過するまでＡＤ００５ ３００μｇ投与群は５匹のうち４匹が斃死して２０%の生存率を、ＡＤ００５ ６００μｇ投与群は４匹のうち１匹が斃死して７５%の生存率を示した。また、ＡＤ０８９ ３００μｇ投与群は４匹のうち３匹が斃死して２５%の生存率を、ＡＤ０８９ ６００μｇ投与群は４匹のうちの２匹が斃死して５０%の生存率を示した。
【0201】
薬品未処理軍及び対照群と比較して試験物質ＡＤ００５及びＡＤ０８９は、投与用量が増加するほど優れた腫瘍の転移及び再発抑制効果を奏した。
【0202】
実施例７-４. 薬品結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄターゲット核酸リガンド内の任意の位置にゲムシタビン結合、または置換した新規物質の三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）における抗癌効能の評価
７-４-１. 三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の製作及び試験物質の投与
三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の製作方法は、７-２-１.で記載した内容と同一である。
７-４-１. 三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の製作及び試験物質の投与
三重陰性乳癌の同所移植動物モデル（腫瘍切除モデル）の製作方法は、７-２-１.で記載した内容と同一である。
【0203】
各実験群の動物数は５匹であった。陽性対照群薬品であるゲムシタビン（１ｍｇ）を２日に一回ずつ１０回（Ｄａｙ０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８）静脈注射（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＩＶ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、試験物質であるＡＤ２１０（１００μｇ）、ＡＤ２１１（１００μｇ）及びＡＤ２１２（１００μｇ）を２日に一回ずつ１５回（Ｄａｙ０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８）腹腔内注射した。各試験群の転移状態はＩＶＩＳ（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で確認した。本実験の計画概括は図１７に図式化した通りである。
【0204】
７-４-２. 試験物質投与後、マウス観察及び結果測定
腹腔内投与後、約７日間隔で４０日が経過するまでＩＶＩＳ（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）撮影した。マウス一匹当たり１５０ｍｇ/ｋｇの濃度でルシフェリンを注射し、１０分反応後、ＩＶＩＳ撮影した。
腹腔内投与後、約７日間隔で４０日が経過するまでＩＶＩＳ（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）撮影した。マウス一匹当たり１５０ｍｇ/ｋｇの濃度でルシフェリンを注射し、１０分反応後、ＩＶＩＳ撮影した。
【0205】
７-４-３. 試験結果
腫瘍切除モデル実験における転移及び再発抑制効果の結果は図１８のとおりである。薬品未処理群は腫瘍切除後３５日が経過する前に全て斃死し、陽性対照群薬品であるゲムシタビン投与群は４２日以前に全て転移によって斃死した。
腫瘍切除モデル実験における転移及び再発抑制効果の結果は図１８のとおりである。薬品未処理群は腫瘍切除後３５日が経過する前に全て斃死し、陽性対照群薬品であるゲムシタビン投与群は４２日以前に全て転移によって斃死した。
【0206】
試験物質であるＡＤ２１０、ＡＤ２１１及びＡＤ０２１２は、本発明のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＫ-ＲＡＳ Ｇ１２Ｄターゲット核酸リガンド配列にゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）結合または核酸リガンド配列のうちの一部をゲムシタビンに置換したものであり、それぞれの投与群は４２日が経過するまで一部の個体が生存した。
【0207】
腫瘍切除後４２日が経過するまで、ＡＤ２１０ １００μｇ投与群は、５匹のうち３匹が斃死して４０%の生存率を、ＡＤ２１１ １００μｇ投与群とＡＤ２１１ １００μｇ投与群は５匹のうち４匹が斃死して２０%の生存率を示した。
【0208】
特に、腫瘍切除後４２日目の基準で、ＡＤ２１０ １００μｇ投与群は７-３-３. 試験結果のＡＤ００５ ３００μｇ処理群より投与用量が約３分の１ほど少なかったにもかかわらず、優れた腫瘍の転移及び再発抑制効果が確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図9e】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0003】
本出願/研究は、科学技術情報通信部、産業通商資源部、保健福祉部の財源で国家新薬開発事業団の国家新薬開発事業支援によって行われたものである（課題番号:ＲＳ-２０２２-ＤＤ１２８９０３）。
【国際調査報告】