特表 2024-530031 ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-14

(54)【発明の名称】ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/55 20060101AFI20240806BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240806BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240806BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240806BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240806BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20240806BHJP

   C12N 15/26 20060101ALN20240806BHJP

【ＦＩ】

C07K14/55 ZNA

A61K38/20

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/04

A61K47/60

C12N15/26

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024507114

(86)(22)【出願日】2022-08-24

(85)【翻訳文提出日】2024-02-06

(86)【国際出願番号】 CN2022114421

(87)【国際公開番号】W WO2023030118

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】202111019771.1

(32)【優先日】2021-09-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524024074

【氏名又は名称】ノヴォコデックス バイオファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100166729

【弁理士】

【氏名又は名称】武田 幸子

(72)【発明者】

【氏名】リャン シュエジュン

(72)【発明者】

【氏名】イェ チェンハオ

(72)【発明者】

【氏名】シア ガン

(72)【発明者】

【氏名】チェン ロンフェイ

(72)【発明者】

【氏名】フオ ペンチャオ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ジンウェイ

(72)【発明者】

【氏名】イン ユエビン

(72)【発明者】

【氏名】ゴン ズンヤン

(72)【発明者】

【氏名】ヘン シン

(72)【発明者】

【氏名】チュー シャオユー

(72)【発明者】

【氏名】チュー リーフェイ

(72)【発明者】

【氏名】ファン ハオ

(72)【発明者】

【氏名】ディン ウェン

(72)【発明者】

【氏名】ジャオ リン

(72)【発明者】

【氏名】チュー ジンジン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA94

4C076AA95

4C076CC07

4C076CC27

4C076EE23

4C076EE59

4C076FF31

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA07

4C084BA42

4C084CA18

4C084CA53

4C084CA59

4C084DA14

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA57

4H045CA40

4H045DA04

4H045EA20

4H045FA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明では、ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート及びその使用が提供されている。ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２と、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸にカップリングされたＰＥＧと、を含有し、前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ）で表される構造を有するカルボニル末端基含有化合物又はその鏡像異性体であり、前記カルボニル末端基とヒドロキシルアミン末端基含有ＰＥＧとがオキシム結合を形成することにより、ＰＥＧが前記少なくとも１つの非天然アミノ酸にカップリングされている。ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートは、単剤で用いられてもよいし、他の抗腫瘍薬と併用されてもよく、固形腫瘍、血液腫瘍などの疾患の治療に用いられる。
【化１】

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２と、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸にカップリングされたＰＥＧと、を含有する、ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートであって、
前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ）で表される構造を有するカルボニル末端基含有化合物又はその鏡像異性体であり、前記カルボニル末端基とヒドロキシルアミン末端基含有ＰＥＧとがオキシム結合を形成することにより、ＰＥＧが前記少なくとも１つの非天然アミノ酸にカップリングされており、

【化1】

式中、Ｘ及びＺは夫々独立に、置換され若しくは置換されないＣ０～Ｃ２０の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ_２－は任意的に－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）－から選ばれた１つ又は複数に置換可能であり、Ｙは－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）－又は－ＣＨ_２－を示し、Ａは置換され若しくは置換されないＣ６～Ｃ２０のアリール基を示し、
前記Ｘ、Ｚ及びＡが夫々独立に、置換された基を示す場合、置換基は、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロ基、アリール基、ヘテロアリール基から選ばれた１つ又は複数である、
ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項2】

前記組換えヒトインターロイキン－２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるタンパク質又はその機能活性断片であり、
好ましくは、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２における、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対応するＰ３４位、Ｋ３５位、Ｔ３７位、Ｒ３８位、Ｌ４０位、Ｔ４１位、Ｆ４２位、Ｋ４３位、Ｆ４４位、Ｙ４５位、Ｅ６１位、Ｅ６２位、Ｋ６４位、Ｐ６５位、Ｅ６７位、Ｅ６８位、Ｎ７１位、Ｌ７２位、Ｙ１０７位から選ばれた１つ又は複数の部位である、
請求項１に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項3】

前記置換基は、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ基、Ｃ６～Ｃ２０アリール基、Ｃ４～Ｃ１０ヘテロアリール基から選ばれた１つ又は複数であり、
好ましくは、前記Ｘ及びＺは夫々独立にＣ０～Ｃ１０の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を示し、好ましくはＣ０～Ｃ６の直鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ_２－は任意的に－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－から選ばれた１つ又は複数に置換可能であり、より好ましくは、前記ＸとＺは同時にＣ０アルキレン基ではなく、及び／又は、
前記Ａは置換され若しくは置換されないＣ６～Ｃ１０のアリール基を示し、より好ましくは、前記Ａは置換され若しくは置換されないフェニル基又はナフチル基を示す、
請求項１又は２に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項4】

前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－１）で表される構造を有する化合物であり、

【化2】

式中、前記Ｘ、Ｚ及びＡは夫々独立に請求項１乃至３の何れか一項で定義されたものであり、
好ましくは、前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－２）で表される構造を有する化合物であり、

【化3】

式中、前記Ｘは請求項１乃至３の何れか一項で定義されたものであり、
Ｒ_１、Ｒ_２は夫々独立に、水素、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ基、Ｃ６～Ｃ２０アリール基、又はＣ４～Ｃ１０ヘテロアリール基を示す、
請求項１乃至３の何れか一項に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項5】

前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－３）、式（Ｉ－４）、式（Ｉ－５）又は式（Ｉ－６）で表される構造を有する化合物であり、

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

式中、Ｘ’はＣ０～Ｃ６の直鎖アルキレン基を示し、好ましくはＣ０～Ｃ４の直鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ_２－は任意的に－Ｏ－及び／又は－ＮＨ－に置換可能であり、
前記Ｒ_１、Ｒ_２は夫々独立に請求項４で定義されたものである、
請求項４に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項6】

前記非天然アミノ酸は、下記の何れか１つで表される構造を有する化合物であり、

【化8】

請求項５に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項7】

前記ヒドロキシルアミン末端基含有ＰＥＧの分子量は、２０～５０ ＫＤである、
請求項１乃至６の何れか一項に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項8】

前記少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２は、コドン拡張技術または化学合成法によって製造されたものである、
請求項１乃至７の何れか一項に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項9】

前記コドン拡張技術は、大腸菌中で実現されたものである、
請求項８に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項10】

請求項１乃至９の何れか一項に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートの、免疫促進用薬物、固形腫瘍及び血液腫瘍の予防及び／又は治療用薬物、及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖用薬物の製造における使用であって、
好ましくは、前記固形腫瘍は、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌であり、
好ましくは、前記血液腫瘍は、慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、高悪性度Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞幼リンパ球白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、又はリンパ腫様肉芽腫瘍である、前記の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物製薬分野に関し、具体的には、ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

インターロイキン－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２、ＩＬ－２）は、活性化されたＩ型ヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ１）から産生される重要な免疫調節因子であり、以前にＴ細胞成長因子と呼ばれ、その主要な生物学機能は、刺激と抗アポトーシスの二重方式でＴ細胞（ＣＤ４^＋とＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む）の成長、増殖、分化を促進すること、及び細胞因子の更なる分泌を促進することにある。それに加えて、インターロイキン－２はＮＫ細胞の増殖を刺激し、ＮＫ細胞殺傷活性を増強し、細胞因子を産生し、ＬＡＫ細胞の産生を誘導し、Ｂ細胞の増殖と抗体の分泌を促進することもできる。したがって、インターロイキン２は生体の免疫応答や抗ウイルス感染などに重要な役割を果たすものである（Ｇａｆｆｅｎａ Ｓ．Ｌ．， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２８：１０９ｅ１２３，２００４）。

【0003】

ＩＬ－２は、１９７６年にＭｏｒｇａｎなどによって初めて発見されて以来、臨床的に広く応用されている。１９９１年、米国Ｃｅｔｕｓ社製ｒｈＩＬ－２（製品名：Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）は、ＦＤＡによって発売が承認され、腎細胞癌、悪性メラノーマ、悪性リンパ腫などの悪性腫瘍に広く応用されており（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎの取扱書）、Ｂ型肝炎やＣ型肝炎感染の補助治療にも潜在的な効果がある（Ｔｏｍｏｖａ Ｒ．など、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９：５２４１－５２４４，２００９）。中国では現在までに１０社余りからの組換えヒトインターロイキン－２による生物製品は、製造されて販売されており、腎細胞癌、メラノーマ、乳癌、膀胱癌、肝臓癌、直腸癌、リンパ癌、肺癌などの悪性腫瘍の治療に広く応用され、癌性胸腹水の制御に用いられ、手術、放射線治療及び化学療法後の腫瘍患者の生体免疫機能の増強に用いられ、先天性や後天性免疫不全症患者の細胞免疫機能及び抗感染能力の向上に用いられ、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾燥症候群などのような多種の自己免疫病の治療に用いられ、それに加えて、あるウイルス性、桿菌性疾患、細胞内寄生菌感染症、例えばＢ型肝炎、ハンセン病、肺結核、モニリア・アルビカンス感染などに対しても一定の治療作用を持つ。

【0004】

ヒトＩＬ－２前駆体は１５３個のアミノ酸残基からなり、細胞が分泌されたと、そのシグナルペプチド（２０個のアミノ酸残基を含む）が切除されて、１３３個のアミノ酸の成熟ＩＬ－２が産生され、その相対分子量が１５．４ｋＤであった。ＩＬ－２のエフェクター細胞への活性化作用は、細胞表面のＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）と結合することにより達成された。現在では発見されたように、ＩＬ－２受容体にはＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγの３種が含まれ、三者によれば、高親和性を有するヘテロ多量体糖タンパク質の機能複合体ＩＬ－２Ｒαβγ（Ｋｄ＝１０^－１１ｍｏｌ／Ｌ）を形成することができる。ＩＬ－２ＲβとＩＬ－２Ｒγによれば、中親和性を有する受容体複合体ＩＬ－２Ｒβγ（Ｋｄ＝１０^－９ｍｏｌ／Ｌ）を形成することができ、この受容体複合体はＩＬ－２によって活性化された後に生物学的活性を有し、一方、ＩＬ－２Ｒαサブユニットは低親和性を有する受容体形態（Ｋｄ＝１０^－８ｍｏｌ／Ｌ）であり、ＩＬ－２と結合しても細胞内増殖信号を伝達することができず、ＩＬ－２ＲαとＩＬ－２Ｒβによっても高親和性を有する受容体複合体を形成することができるが、この受容体複合体は生物学的機能を有しておらず、ＩＬ－２によって活性化されることもできない。異なる細胞、同種細胞の異なる発育段階及び疾病の異なる状態では、ＩＬ－２受容体の種類の発現程度が異なり、それによって異なる受容体複合体が形成されることとなる。例えば、ＬＡＫ細胞の前駆体は高レベルのＩＬ－２Ｒβγ複合体を発現しており、ＩＬ－２によって活性化された後に癌細胞を攻撃及び分解することができ、マクロファージもＩＬ－２Ｒβγ複合体を発現しており、ＩＬ－２によって活性化されることもでき、単核細胞は大量のＩＬ－２Ｒγ及び少量のＩＬ－２Ｒβを発現しており、ＮＫ細胞は大量のＩＬ－２Ｒβ及び少量のＩＬ－２Ｒγを発現しており、それらはそれぞれ中親和性を有するＩＬ－２Ｒβγ受容体を形成でき、この受容体は高濃度ＩＬ－２と結合して三量体を形成した後に単核細胞又はＮＫ細胞を活性化する。活性化されたＴ細胞表面はＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγを発現しており、過量のＩＬ－２Ｒαは先ず最初にＩＬ－２Ｒβと重合するのに有利であり、ＩＬ－２ＲαβがＩＬ－２と結合してからＩＬ－２Ｒγと結合して高親和性受容体とＩＬ－２の複合体を形成し、さらにシグナルを伝達して細胞増殖反応を引き起こす。細胞反応後、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγが解離したため、細胞はＩＬ－２に対して敏感でなくなった。ヒト腫瘍細胞にもＩＬ－２受容体発現があり、ＩＬ－２が腫瘍細胞上の受容体複合体と結合したと腫瘍細胞の増殖を抑制することができ、異なる癌細胞がそれぞれ特殊なＩＬ－２受容体複合体を発現するため、ＩＬ－２が特異な腫瘍表面の対応する受容体のみに作用するようにその構造を改良すれば、癌細胞のみを攻撃し、正常細胞へのダメージを減少させることができる。

【0005】

この研究理論を基礎とし、多くの研究者はＩＬ－２に対して異なる方面の改良を行い、それに結合される抗腫瘍関連エフェクター細胞表面の特異的受容体複合体（例えばＩＬ－２Ｒβγ複合体）を増強させ、腫瘍殺傷関連細胞タイプを活性化し、同時に負性免疫調節Ｔ細胞（例えばＴｒｅｇ細胞）の表面に高発現されるＩＬ－２Ｒαβγ複合体との結合をできるだけ減少させ、このようにすれば、薬効を向上させながら、薬物の副作用を低下させることができる。既存のＩＬ－２への改良としては、特異的なＩＬ－２変異タンパク質を設計し（例えば、Ａｒｏｎ Ｍ．Ｌ．など、Ｎａｔｕｒｅ，４８４（７３９５）：５２９－３３，２０１２）、空間構造がＩＬ－２Ｒαとの相互作用に不利したり、ＩＬ－２ＲβやＩＬ－２Ｒγとの相互作用を強くしたりするように、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ又はＩＬ－２Ｒγとの結合部位のアミノ酸配列を変化させること、ＩＬ－２／抗ＩＬ－２抗体（又はＩＬ－２受容体）複合体（例えば、Ｊａｒｅｄ Ｅ．Ｌ．など、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ，８（１）：ｅ０００６７３，２０２０）を設計し、抗ＩＬ－２抗体の特異性を利用してＩＬ－２Ｒとの結合部位をマスクし、ＩＬ－２機能の変化及び体内半減期の延長を実現すること、ＩＬ－２をＦｃ又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と融合発現することでＩＬ－２の体内半減期の延長を実現する（例えば、ＪｉａｎｙｏｎｇＬｅｉなど、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，８４（１）：１５４－１６０，２０１２）こと、部位特異的突然変異とＨＡＳ／Ｆｃ融合を組み合わせて機能の変化と半減期の延長を同時に実現する（例えば、ＣＮ１１２７２４２５９Ａ）こと、ＩＬ－２に対して非部位特異的なカップリングによるＰＥＧ化を行うことでＩＬ－２の半減期を延長させる（例えば、Ｄｅｂｏｒａｈ Ｈ．Ｃ．など、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２２（３）：６８０－９０，２０１６）ことが挙げられる。

【0006】

上記のＩＬ－２改良に関する研究は以下の欠点が存在する。

【0007】

１、単純なアミノ酸の部位特異的突然変異は、ＩＬ－２Ｒαとの結合能力を弱くするか、又はＩＬ－２ＲβやＩＬ－２Ｒγとの結合能力を強くすることができるが、分子の半減期を有効に延長することができず、それに加えて、その突然変異生成物は、体内で免疫源反応を発生させやすく、生成物の生物学的活性を低下させやすく、毒性リスクが大きい。

【0008】

２、単純な融合発現（例えばＦｃやＨＳＡとの融合）又はＩＬ－２への修飾は、分子の半減期を延長することができるが、実際の使用効果では未修飾ＩＬ－２に比べて明らかなメリットが発見されていない。融合発現は目的タンパク質のＮ末端やＣ末端で融合分子を修飾することしかできず、修飾部位の最適化を実現することができない。

【0009】

３、一部の部位特異的突然変異と融合発現が組み合わせられたＩＬ－２は、実際の応用では特別なメリットが発見されない（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉなど、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，８：１５３７３，２０１７）。

【0010】

４、通常の非部位特異的なカップリングによるＰＥＧ化ＩＬ－２は、実際の応用では特別なメリットが発見されておらず、ＩＬ－２Ｒα結合能力が弱ったＰＥＧ化ＩＬ－２と組み合わせたことは、段階的な成功を収めたが、非部位特異的なカップリング技術の特徴によって、その生産技術及び品質での制御が困難で、分子構造が複雑で、作用メカニズムが複雑であるなどの欠点が存在する。

【0011】

上記のＩＬ－２改良の限界性に対して、コドン拡張技術を用いてＰＥＧが部位特異的にカップリングされたＩＬ－２を開発した研究者があり（例えば、ＷＯ２０１９０２８４１９Ａ１）、所用した非天然アミノ酸はＬｙｓ－ａｚｉｄｏであり、その構造式は以下の通りであった。

【0012】

【化1】

Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏの末端にあるアジド構造（－Ｎ_３）は、アルキン含有構造（例えばＢＣＮ、即ち

【化2】

）で修飾した担体薬物（例えばＰＥＧなど）と化学的に結合してコンジュゲートを形成することができ（例えば中国特許ＣＮ１０３１５３９２７Ｂ）、高い特異的選択性を有する。しかしながら、このようなカップリング法と化学修飾法では、高コストのアルキン類構造を導入しなければならず、しかも、使用当量が大きい場合にのみ、許容可能な薬物－抗体カップリング比率が得られるので、該当する生産コストが増やし、生産プロセスも複雑で、生産条件が厳しい。

【0013】

上記のことを踏まえて、現在ではＩＬ－２の改良にまだ多くの不足があり、更なる研究が要する。

【発明の概要】

【0014】

従来の技術に存在するＩＬ－２改良での欠点を解消するために、本発明の１つの目的は、ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートを提供することにあり、具体的には、一連の新規な非天然アミノ酸の部位特異的突然変異による組換えヒトインターロイキン－２のアミノ酸配列中の１つ又は複数の天然アミノ酸を用いて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をオキシム化反応によって上記非天然アミノ酸に部位特異的にカップリングして、本発明のコンジュゲートを形成する。

【0015】

本発明の別の目的は、前記ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートの使用を提供することにあり、本発明で提供されるヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートは、悪性固形腫瘍、血液腫瘍などの病気の治療に用いられることができる。

【0016】

本発明の第一の態様では、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２と、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸にカップリングされたＰＥＧと、を含有する、ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートが提供されており、
前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ）で表される構造を有するカルボニル末端基含有化合物又はその鏡像異性体であり、前記カルボニル末端基とヒドロキシルアミン末端基（即ちアミノオキシ基）含有ＰＥＧとがオキシム結合を形成することにより、ＰＥＧが前記少なくとも１つの非天然アミノ酸にカップリングされており、

【化3】

式中、Ｘ及びＺは夫々独立に、置換され若しくは置換されないＣ０～Ｃ２０の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ_２－は任意的に－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）－から選ばれた１つ又は複数に置換可能であり、Ｙは－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）－又は－ＣＨ_２－を示し、Ａは置換され若しくは置換されないＣ６～Ｃ２０のアリール基を示し、
前記Ｘ、Ｚ及びＡが夫々独立に、置換された基を示す場合、置換基は、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基（ｓｕｌｆｏｎｙｌ）、スルフィニル基（ｓｕｌｆｉｎｙｌ）、シクロアルキル基、ヘテロシクロ基、アリール基、ヘテロアリール基から選ばれた１つ又は複数である。

【0017】

実施例９に示すように、本発明の発明者は、コストが暴騰し、生産プロセスが複雑であることに加えて、Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏの末端にあるアジド構造（－Ｎ_３）は組換えヒトインターロイキン－２に挿入された際にアミノ構造（－ＮＨ_２）に還元されやすい（式（１）に示す通り）ため、カップリング活性が失われやすく、よって、この還元反応によってカップリングタ体の製造過程中の収率が低下してしまうことを見出した。

【0018】

【化4】

本発明に係る非天然アミノ酸は、その末端に活性反応基としてカルボニル基が導入されたものであり、構造が新規で、製造が簡便であるだけでなく、カップリング条件が温和で、生産コストが低く、タンパク質に挿入された場合に構造の変化が発生しにくいため、反応活性が失われにくい。本発明に係る非天然アミノ酸は、カルボニル基に結合されたアリール基も含有したものであり、アリール基の導入によって、得られたコンジュゲートの安定性がより強くなり、低いｐＨ条件下でもコンジュゲートが分解しにくい。また、本発明に係る非天然アミノ酸は、所定の鎖長のアルキレン基も含有したものであり、化合物の柔軟性が良好で、多種のコンジュゲートを形成することがより一層容易になる。

【0019】

本発明で提供されるコンジュゲートでは、組換えヒトインターロイキン－２に含有される非天然アミノ酸はカルボニル末端基を含有したものであり、一方、所用したＰＥＧはヒドロキシルアミン末端基を含有し、式（ＩＩ）で表される構造を有する。

【0020】

【化5】

非天然アミノ酸中のカルボニル基はＰＥＧ中のヒドロキシルアミン基とのオキシム化反応が発生してオキシム結合を形成することができ、その構造は式（ＩＩＩ）の通りであり、それによってＰＥＧは非天然アミノ酸にカップリングされている。

【0021】

【化6】

式（ＩＩＩ）中、Ｄ’は本発明に係る組換えヒトインターロイキン－２から非天然アミノ酸のカルボニル基部分が除去された残基を示し、Ｄ”は「ＮＨ_２－Ｏ－」末端基が除去されたＰＥＧを示す。

【0022】

野生型ＩＬ－２または市販の組換えヒトＩＬ－２に比べ、本発明で提供されるコンジュゲートは、ＩＬ－２Ｒαとの結合能力が低下し、ＩＬ－２Ｒβγとの結合活性が維持され、ＩＬ－２Ｒβγ複合体によるＣＤ８^＋Ｔ細胞への活性化によってＣＤ８^＋ Ｔ細胞の活性化能力及び増殖能力を維持すると同時に、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を抑制することができ、体内で顕著に延長した半減期を持ち、効果的に免疫を促進し、腫瘍を抑制することができる。また、本発明で提供されるコンジュゲートは、カップリング率がより高く、安定性もより良い。

【0023】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記組換えヒトインターロイキン－２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるタンパク質又はその機能活性断片である。

【0024】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２における、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対応するＰ３４位、Ｋ３５位、Ｔ３７位、Ｒ３８位、Ｌ４０位、Ｔ４１位、Ｆ４２位、Ｋ４３位、Ｆ４４位、Ｙ４５位、Ｅ６１位、Ｅ６２位、Ｋ６４位、Ｐ６５位、Ｅ６７位、Ｅ６８位、Ｎ７１位、Ｌ７２位、Ｙ１０７位から選ばれた１つ又は複数の部位である。本発明による幾つかのより好ましい実施形態では、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２における、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対応するＫ３５位、Ｔ４１位、Ｋ４３位、Ｙ４５位、Ｅ６１位、Ｋ６４位、Ｐ６５位から選ばれた１つ又は複数の部位である。

【0025】

本発明に係る非天然アミノ酸では、「Ｃ０～Ｃｎ」はＣ０～Ｃ１、Ｃ０～Ｃ２、…Ｃ０～Ｃｎを含み、それがＣ０を示す場合、この基が存在しないことを意味しており、その両端にあるＣ原子が直接連結して結合になっている。例を挙げて説明すると、前記「Ｃ０～Ｃ６」基とは、該当する部分に０～６個の炭素原子を含有し、即ち、基が存在しなく、１個の炭素原子含有、２個の炭素原子含有、３個の炭素原子含有、４個の炭素原子含有、５個の炭素原子含有、又は６個の炭素原子含有を指す。前記「Ｃ６～Ｃ１０」基とは、該当する部分に６～１０個の炭素原子を含有し、即ち、６個の炭素原子含有、７個の炭素原子含有、８個の炭素原子含有、９個の炭素原子含有、又は１０個の炭素原子含有を指す。

【0026】

本発明に係る非天然アミノ酸では、「アリール基」とは、１個又は２個の環を含有する炭素環式芳香族系を指し、ここでかかる環は縮合様式で一緒に連結され得る。「アリール基」は、フェニル基、ナフチル基、テトラヒドロナフチル基の芳香族基などの単環式又は二環式のアリール基を含む。アリール基は、好ましくはＣ６～Ｃ１０アリール基、より好ましくはフェニル基、ナフチル基、最も好ましくはフェニル基である。

【0027】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記置換基は、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ基、Ｃ６～Ｃ２０アリール基、Ｃ４～Ｃ１０ヘテロアリール基から選ばれた１つ又は複数である。

【0028】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記Ｘ及びＺは夫々独立に、Ｃ０～Ｃ１０の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ_２－は任意的に－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－から選ばれた１つ又は複数に置換可能である。本発明による幾つかのより好ましい実施形態では、前記Ｘ及びＺは夫々独立に、Ｃ０～Ｃ６の直鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ_２－は任意的に－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－から選ばれた１つ又は複数に置換可能である。本発明による幾つかのより好ましい実施形態では、前記ＸとＺは同時にＣ０アルキレン基ではなく、言い換えれば、Ｘ基とＺ基は共に存在しないことが許可されない。

【0029】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記Ａは置換され若しくは置換されないＣ６～Ｃ１０のアリール基を示し、より好ましくは、前記Ａは置換され若しくは置換されないフェニル基又はナフチル基を示す。

【0030】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－１）で表される構造を有する化合物であり、

【化7】

式中、前記Ｘ、Ｚ及びＡは夫々独立に上記した技術案のうちの何れか１項で定義されたものである。

【0031】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－２）で表される構造を有する化合物であり、

【化8】

式中、前記Ｘは上記した技術案のうちの何れか１項で定義されたものであり、
Ｒ_１、Ｒ_２は夫々独立に、水素、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ基、Ｃ６～Ｃ２０アリール基、又はＣ４～Ｃ１０ヘテロアリール基を示す。

【0032】

本発明による幾つかの比較的好ましい実施形態では、前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－３）、式（Ｉ－４）、式（Ｉ－５）、又は式（Ｉ－６）で表される構造を有する化合物であり、

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

式中、Ｘ’はＣ０～Ｃ６の直鎖アルキレン基を示し、より好ましくはＣ０～Ｃ４の直鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ_２－は任意的に－Ｏ－及び／又は－ＮＨ－に置換可能であり、
前記Ｒ_１、Ｒ_２は夫々独立に上記した技術案のうちの何れか１項で定義されたものである。

【0033】

本発明に係る非天然アミノ酸は、光学的に純粋な鏡像異性体及びラセミ体を含む。

【0034】

本発明による幾つかのより好ましい実施形態では、本発明に係る非天然アミノ酸は、下記の何れか１つで表される構造を有する化合物であり、

【化13】

【0035】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係るヒドロキシルアミン（「ＮＨ_２－Ｏ－」）末端基含有ＰＥＧの分子量は、１０～１００ＫＤであり、約１０ＫＤ、約２０ＫＤ、約３０ＫＤ、約４０ＫＤ、約５０ＫＤ、約６０ＫＤ、約７０ＫＤ、約８０ＫＤ、約９０ＫＤ、約１００ＫＤなどの分子量値又は任意に組み合わせた分子量範囲を含むが、これらに限定されるものではない。本発明による幾つかのより好ましい実施形態では、「ＮＨ_２－Ｏ－」末端基含有ＰＥＧの分子量は２０～５０ＫＤである。

【0036】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２は、コドン拡張技術または化学合成法によって製造されたものである。本発明による幾つかのより好ましい実施形態では、本発明に係る少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２は、コドン拡張技術によって製造されたものであり、ここで、コドン拡張技術は、大腸菌中で実現されたものである。

【0037】

本発明に係るコドン拡張技術は具体的に以下の工程を含む：突然変異型組換えヒトインターロイキン－２の核酸分子を組換えヒトインターロイキン－２をコードする核酸分子に比べ、突然変異後の核酸分子の相違点は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対応するＰ３４位、Ｋ３５位、Ｔ３７位、Ｒ３８位、Ｌ４０位、Ｔ４１位、Ｆ４２位、Ｋ４３位、Ｆ４４位、Ｙ４５位、Ｅ６１位、Ｅ６２位、Ｋ６４位、Ｐ６５位、Ｅ６７位、Ｅ６８位、Ｎ７１位、Ｌ７２位及びＹ１０７位のうちの少なくとも１つの部位でのアミノ酸のコドンがアンバーコドンＵＡＧに突然変異した点、突然変異後の核酸分子を大腸菌中で発現させながら、直交化ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対によって、本発明に係るカルボニル基含有リジン類似体（例えばＮＢＯＫ）を、発現される組換えヒトインターロイキン－２に組み込んだ点、にある。上記のコドン拡張システムの作動原理は下記にある：ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは宿主細胞のリシルｔＲＮＡ酵素を利用できず、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ ＲＳによってアシル化されるしかできず、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ ＲＳはｔＲＮＡ^Ｐｙｌしかアシル化できず、他のｔＲＮＡをアシル化できず、つまり、ｔＲＮＡ^ＰｙｌとｔＲＮＡ^Ｐｙｌ ＲＳとの間には直交性があり、該当する非天然アミノ酸をこのような直交化ｔＲＮＡにアシル化できるのはｔＲＮＡ^Ｐｙｌ ＲＳしかなく、しかも、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ ＲＳはこのようなｔＲＮＡしかアシル化できず、他のｔＲＮＡをアシル化できない。当該コドン拡張システムによれば、カルボニル基含有リジン類似体をアンバーコドンＵＡＧに対応させることができ（つまり、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ対応コドンはＵＡＧである）、それによってカルボニル基含有リジン類似体をＩＬ－２に部位特異的に導入することができる。

【0038】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記突然変異した組換えヒトインターロイキン－２を大腸菌中で発現する工程の後、タンパク質変性工程、タンパク質再生工程、限外ろ過工程をさらに含む。

【0039】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、組換えヒトインターロイキン－２中の非天然アミノ酸とヒドロキシルアミン基含有ＰＥＧとのオキシム化反応は、以下の過程を含む：オキシム化反応前、突然変異した組換えヒトインターロイキン－２溶液のｐＨを約３．５～４．５に調節し（例えば、２Ｍの酢酸溶液を用いてｐＨを約４．０に調節した）、タンパク質濃度を０．５～１．５ｍｇ／ｍｌに調節し（例えば、２０ｍＭ、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム緩衝液を使用した）、所定のモル比（例えば、タンパク質：ＰＥＧ＝１：１５）で投入し、十分に溶解させ、密封し、恒温振とう台で揺動しながら反応させた（例えば、３０～６０時間反応させた）。反応後、通常の測定方法（例えば、ＲＰ－ＨＰＬＣ）によってカップリング状況を分析することができる。

【0040】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、オキシム化反応（即ちカップリング反応）後の反応溶液には、一部の未反応ＩＬ－２、不純タンパク質、未反応ＰＥＧが含まれているので、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製することもできる。例えば、精製の過程は以下の通りであった：クロマトグラフィー媒質をＣａｐｔｏ ＭＭＣ、平衡緩衝液を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝３．０）、溶離緩衝液を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液－１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．８）とし、カップリング反応液を平衡緩衝液でｐＨ ３．０±０．２に調節し、電気伝導率≦５ｍｓ／ｃｍになるように調節し、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣにサンプルローディングし、溶離緩衝液を用いてリニア溶離（０～１００％の溶離液、２０ＣＶ）を行い、目的タンパク質成分を収集した。この精製過程によって、純度が約９５％の目的タンパク質サンプルを獲得することができる。

【0041】

本発明の第二の態様では、上記した技術案のうちの何れか一項に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートの、免疫促進用薬物、固形腫瘍（特に悪性固形腫瘍）及び血液腫瘍の予防及び／又は治療用薬物、及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖用薬物の製造における使用が提供されている。

【0042】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記固形腫瘍は、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌である。

【0043】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記血液腫瘍は、慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、高悪性度Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞幼リンパ球白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、又はリンパ腫様肉芽腫瘍である。

【0044】

本発明の第三の態様では、上記した技術案のうちの何れか一項に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートを含む試薬キットが提供されている。

【0045】

本発明の第四の態様では、上記した技術案のうちの何れか一項に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートを必要とされる患者に治療上有効な量で投与する工程を含む、固形腫瘍（特に悪性固形腫瘍）又は血液腫瘍の予防及び／又は治療方法が提供されている。

【0046】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記固形腫瘍は、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌である。

【0047】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記血液腫瘍は、慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、高悪性度Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞幼リンパ球白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、又はリンパ腫様肉芽腫瘍である。

【0048】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートは、単独で投与されても良いし、他の１つ又は複数の抗腫瘍薬と併用されても良い。

【0049】

本発明の第五の態様では、上記した技術案のうちの何れか一項に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートを必要とされる患者に有効な量で投与する工程を含む、免疫機能促進方法が提供されている。

【0050】

本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記免疫機能促進は、ヒトインターロイキン－２の免疫機能を促進することである。

【0051】

本発明の第六の態様では、上記した技術案のうちの何れか一項に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートを必要とされる患者に有効な量で投与する工程を含む、ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖方法が提供されている。

【0052】

本発明で提供される技術案は、下記の利点を有する。

【0053】

（１）コドン拡張技術により本発明に係る新規な非天然アミノ酸を指定部位に導入することができ、それによってＰＥＧとインターロイキン－２との精確な部位特異的カップリングが実現され、従来のランダムカップリングでは精確にカップリングできないという欠点が克服され、しかも生成物の均一性が高い。

【0054】

（２）本発明に係る非天然アミノ酸は、その構造にカルボニル末端基及びアリール基を含有するリジン類似体であり、一般的なアジド基含有リジン類似体（例えばＬｙｓ－ａｚｉｄｏ）に比べ、製造がより簡便で、安全性がより良好で、タンパク質に挿入された時に失活しにくく、ＰＥＧとの結合率がより高く、得られたコンジュゲートの安定性もより良好であり、組換えタンパク質封入体の変性・再生後であっても９５％を超えるカップリング効率を有する。

【0055】

（３）突然変異部位の設計及びスクリーニングにより、本発明では、ＩＬ－２Ｒα結合活性を低減させながら、ＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγ結合活性が相対的に不変であるように維持することができるインターロイキン－２の突然変異部位が得られ、それによって、この部位特異的に修飾されたヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートは、腫瘍微小環境下でＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を特異的に促進する一方、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖に顕著な作用がないため、腫瘍の免疫治療には有利である。

【0056】

（４）本発明のコンジュゲートは、ＰＥＧとのカップリングによりＩＬ－２の体内半減期の延長を達成したため、患者への投与頻度を低下させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】発現プラスミドＮＢ１Ｓ３－ＷＴの模式図である。

【図2】ヘルパープラスミドＮＢ１Ｗの模式図である。

【図3】実施例２で獲得した、突然変異部位の異なるｒｈＩＬ－２発現菌株に非天然アミノ酸ＮＢＯＫが添加されて得られた発酵生成物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり（矢印は目的生成物ストリップ位置を示す）、図中の各レーンはそれぞれ下記のことを示す：レーン１：ＮＢＯＫが投与されたｒｈＩＬ２－Ｋ３５－ＢＬ２１菌体が破砕、遠心分離後の沈殿物、レーン２：ＮＢＯＫが投与されたｒｈＩＬ２－Ｔ４１－ＢＬ２１菌体が破砕、遠心分離後の沈殿物、レーン３：ＮＢＯＫが投与されたｒｈＩＬ２－Ｋ４３－ＢＬ２１菌体が破砕、遠心分離後の沈殿物、レーン４：ＮＢＯＫが投与されたｒｈＩＬ２－Ｙ４５－ＢＬ２１菌体が破砕、遠心分離後の沈殿物、レーン５：ＮＢＯＫが投与されたｒｈＩＬ２－Ｅ６１－ＢＬ２１菌体が破砕、遠心分離後の沈殿物、レーン６：ＮＢＯＫが投与されたｒｈＩＬ２－Ｋ６４－ＢＬ２１菌体が破砕、遠心分離後の沈殿物、レーン７：ＮＢＯＫが投与されたｒｈＩＬ２－Ｐ６５－ＢＬ２１菌体が破砕、遠心分離後の沈殿物、レーン８：ＮＢＯＫが投与されたｒｈＩＬ２－Ｙ４５－ＢＬ２１菌体の沈殿物が洗浄されて得られた封入体。

【図4A】図４は、それぞれ、実施例３における突然変異型ｒｈＩＬ－２とＰＥＧとのカップリング反応前後のＲＰ－ＨＰＬＣスペクトルを示し、図４Ａではカップリング反応前の各突然変異型ｒｈＩＬ－２が示され、図中、約２２．５分を示すところが目的タンパク質の主ピークである。

【図4B】図４Ｂではカップリング反応後の各突然変異型ｒｈＩＬ－２が示され（ＰＥＧは共に３０ＫＤ ＰＥＧである）、図中、約２１分を示すところが目的タンパク質の主ピークである。

【図5】実施例４におけるコンジュゲート３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５のカラムクロマトグラフィーが実施される前後のＲＰ－ＨＰＬＣスペクトルである。

【図6】実施例９におけるｒｈＧＨ－Ｖ９１の質量スペクトルを示す図である。

【図7】実施例１０で獲得した異なる非天然アミノ酸を含有する組換えＩＬ－２菌体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。

【図8】実施例１０で獲得した異なる非天然アミノ酸を含有する突然変異型ＩＬ－２粗タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。

【図9A】図９は、それぞれ、実施例１１における突然変異型ｒｈＩＬ－２（ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫ）とＰＥＧとのカップリング反応前後のＲＰ－ＨＰＬＣスペクトルを示し、図９Ａではカップリング反応前の突然変異型ｒｈＩＬ－２が示され、図中、約２２．３８０分を示すところが目的タンパク質の主ピークである。

【図9B】図９Ｂではカップリング反応後の突然変異型ｒｈＩＬ－２が示され（ＰＥＧは３０ＫＤ ＰＥＧである）、図中、約２１．１７５分を示すところが目的タンパク質の主ピークである。

【図10】実施例１２における精製済みコンジュゲートのＲＰ－ＨＰＬＣスペクトルである。

【図11A】実施例１３における異なる濃度の参照ｒｈＩＬ２が３７℃で１０分間刺激された場合におけるＣＴＬＬ２細胞のｐＳＴＡＴ５及びβ－ａｃｔｉｎタンパク質のウェスタンブロット実験結果を示す図、及びグレースケール結果に基づいてフィッティングされたＥＣ５０グラフである。

【図11B】実施例１３における異なる濃度のＴ４１ＮＰＡＫ突然変異型ＩＬ－２（即ちｒｈＩＬ２－Ｔ４１ ＮＰＡＫ）及び３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫが３７℃で１０分間刺激された場合におけるＣＴＬＬ２細胞のｐＳＴＡＴ５及びβ－ａｃｔｉｎタンパク質のウェスタンブロット実験結果を示す図、及びグレースケール結果に基づいてフィッティングされたＥＣ５０グラフである。

【図11C】実施例１３における異なる濃度の参照ｒｈＩＬ２が３７℃で１０分間刺激された場合におけるＹＴ細胞のｐＳＴＡＴ５及びβ－ａｃｔｉｎタンパク質のウェスタンブロット実験結果を示す図、及びグレースケール結果に基づいてフィッティングされたＥＣ５０グラフである。

【図11D】実施例１３における異なる濃度のＴ４１ＮＰＡＫ突然変異型ＩＬ－２（即ちｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫ）及び３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫが３７℃で１０分間刺激された場合におけるＹＴ細胞のｐＳＴＡＴ５及びβ－ａｃｔｉｎタンパク質のウェスタンブロット実験結果を示す図、及びグレースケール結果に基づいてフィッティングされたＥＣ５０グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0058】

以下、本発明の技術案について具体的な実施例を用いてさらに詳細に説明する。

【0059】

本発明の製造例及び実施例で使用される試薬又は原料は、特に説明しない限り、市販品であり、本発明に使用される実験方法は、特に説明しない限り、本分野における通常の方法である。

【0060】

ヒトＹＴ細胞は、文献「Ｙｏｄｏｉ，Ｊ．など．（１９８５）．ＴＣＧＦ（ＩＬ２）－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ｓ）．Ｉ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ （ＹＴ ｃｅｌｌｓ）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３４（３），１６２３－１６３０」に披露されたものであり、公衆が浙江新碼生物医薬有限公司から入手できる。

【0061】

製造例１：非天然アミノ酸ＮＢＯＫの製造
ＮＢＯＫの構造式は、以下に示す通りであった。

【化14】

【0062】

反応過程は、以下に示す通りであった。

【化15】

【0063】

製造過程は、次の工程を含む。

【0064】

ａ）反応フラスコに、ｐ－メチルアセトフェノン（４．０ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（５０．０ｍＬ）を加え、ＮＢＳ（６．４１ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）及びＢＰＯ（０．０５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を８０℃で２４時間還流した後、容器を氷水に入れて冷却し、固体を析出させ、固体をろ過除去し、飽和Ｎａ_２ＣＯ_３で３回洗浄し、ＤＣＭで３回抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、粗生成物１－１（５．４６ｇ、収率８５％）を獲得し、粗生成物１－１を精製せずそのまま次の工程に使用した。

【0065】

ｂ）反応フラスコに、生成物１－１（２．７３ｇ、１２．８０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ジオキサン（４０ｍＬ）及び水（４０ｍＬ）を加え、さらに炭酸カルシウム（７．６８ｇ、７６．８ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を１０５℃で２４時間還流した後、室温に冷却させ、固体をろ過除去し、ＤＣＭで３回抽出し、有機相を合併し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝３：１）により精製した後、生成物１－２（１．８０ｇ、収率９４％）を獲得した。

【0066】

ｃ）二口型反応フラスコに、ｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（２．９０ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（１０．０ｍＬ）を加え、０℃に降温し、生成物１－２（１．８０ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）及びピリジン（１．２ｍＬ、１４．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌した後、反応液に飽和炭酸ナトリウム溶液（１０ｍＬ）を加え、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で３回抽出し、有機相を合併し、水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝５：１）により精製した後、生成物１－３（３．１４ｇ、収率８３％）を獲得した。

【0067】

ｄ）反応フラスコに、生成物１－３（１．２６ｇ、４．０ｍｍｏｌ）及びＦｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（１．４０ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ジオキサン（１５ｍＬ）及び水（５ｍＬ）を加え、さらにトリエチルアミン（１．２ｍＬ、８．３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で２４時間反応させた後、１Ｍ ＨＣｌ溶液を適量で加え、ＤＣＭで抽出し、減圧濃縮した後、粗生成物１－４を獲得し、粗生成物１－４を精製せずそのまま次の工程に使用した。

【0068】

ｅ）反応フラスコ中で、生成物１－４（１．１０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させ、ジエチルアミン（５．０ｍＬ）を加え、室温で６時間反応させ、生成物を析出させ、ろ過後にＤＣＭで３回叩解したと、目的生成物１－５（８１７ｍｇ、２段階収率６３％）を獲得した。

【0069】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ８．０４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），５．２１（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），１．９５－１．８３（ｍ，２Ｈ），１．６２－１．５２（ｍ，２Ｈ），１．４７－１．３５（ｍ，２Ｈ）．

【0070】

製造例２：非天然アミノ酸ＮＰＡＫの製造
ＮＰＡＫの構造式は、以下に示す通りであった。

【化16】

【0071】

反応過程は、以下に示す通りであった。

【化17】

【0072】

製造過程は、次の工程を含む。

【0073】

ａ）反応フラスコに、ｐ－クロロアセトフェノン（１．００ｇ、６．４７ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、マロン酸ジエチル（６．８４ｇ、４７．７０ｍｍｏｌ）、ＫＨＣＯ_３（０．９７ｇ、９．７０ｍｍｏｌ）及びＫ_２ＣＯ_３（１．３４ｇ、９．７０ｍｍｏｌ）を加え、さらにＰｄ（ｄｂａ）_２（０．０１９ｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）及びＰ（ｔ－Ｂｕ）_３ＨＢＦ_４（０．０２１ｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）を加え、加えが完了した後、窒素保護を置換し、１６０℃に昇温して４０時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、反応液に水（３０ｍＬ）を加え、ＥＡで３回抽出し、有機相を合併し、水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、０～５℃で減圧濃縮し、無色透明液体を獲得し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝１０：１）により精製した後、生成物２－１（０．８０ｇ、収率６０％）を獲得した。

【0074】

ｂ）反応フラスコに、ＬｉＯＨ（０．３０ｇ、１１．６４ｍｍｏｌ）及び水（５．０ｍＬ）を加え、エタノール（１０ｍＬ）を加え、生成物２－１（０．８０ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した後、ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、反応液に２Ｍ ＨＣｌ溶液を加えてｐＨを１～２に調節し、ＥＡで３回抽出し、有機相を合併し、水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、生成物２－２（０．５ｇ、収率７２％）を獲得した。

【0075】

ｃ）反応フラスコに、生成物２－２（０．２０ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ、０．１９ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．０７ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（２．０ｍＬ）をこの順に加えた。０～５℃に降温した後、ＤＣＣ（０．２３ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）とＤＣＭ（２．０ｍＬ）の溶液を加え、２時間保温しながら反応させた。室温に昇温して一晩撹拌した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、ろ過し、ＤＣＭで洗浄し、母液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝５：１）により精製した後、生成物２－３（０．１９ ｇ、収率６２％）を獲得した。

【0076】

ｄ）反応フラスコに、生成物２－３（０．１０ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加え、トリエチルアミン（０．０４ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（０．１３ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、ジオキサン（２．０ｍＬ）及び水（２．０ｍＬ）をこの順に加え、室温で１８時間撹拌しながら反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、減圧濃縮し、ＥＡで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１５：１）により精製した後、油状の液体生成物２－４（０．０３ｇ、収率６１％）を獲得した。

【0077】

ｅ）反応フラスコに、生成物２－４（０．０８ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）及びピペリジン（０．０４ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、減圧濃縮し、石油エーテル（５ｍＬ）で１時間叩解し、ろ過し、得られたろ過ケーキを石油エーテル（５ｍＬ）で１時間叩解し、ろ過し、得られたろ過ケーキをエタノールで４回繰り返し叩解して残留ピペリジンを除去し、最終的にオフホワイト固体２－５（０．０２ｇ、収率４３％）を獲得した。

【0078】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ７．８５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），３．９４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），３．５６（ｓ，２Ｈ），３．１２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），１．８０－１．７０（ｍ，２Ｈ），１．５４－１．４５（ｍ，２Ｈ），１．４０－１．２２４（ｍ，２Ｈ）．

【0079】

製造例３：非天然アミノ酸ＮＢＰＫの製造
ＮＢＰＫの構造式は、以下に示す通りであった。

【化18】

【0080】

反応過程は、以下に示す通りであった。

【化19】

【0081】

製造過程は、次の工程を含む。

【0082】

ａ）反応フラスコに、ｐ－メチルアセトフェノン（４．０ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（５０．０ｍＬ）を加え、ＮＢＳ（６．４１ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）及びＢＰＯ（０．０５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を８０℃で２４時間還流した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、容器を氷水に入れて冷却し、固体を析出させ、固体をろ過除去し、飽和Ｎａ_２ＣＯ_３で３回洗浄し、ＤＣＭで３回抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、粗生成物３－１（５．４６ｇ、収率８５％）を獲得し、粗生成物３－１を精製せずそのまま次の工程に使用した。

【0083】

ｂ）反応フラスコに、ＮａＨ（０．５８ｇ、１４．６４ｍｍｏｌ、６０％）を加え、乾燥溶媒ＴＨＦ（２０ｍＬ）を加え、氷浴冷却下、エチレングリコール（６．７ｍＬ、１２２．０ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、室温条件下で１時間撹拌した。次いで、生成物３－１（２．６０ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で４８時間加熱還流して完全に反応させた。氷浴冷却下、飽和ＮＨ_４Ｃｌをゆっくり滴下してＮａＨをクエンチし、水で洗浄し、ＥｔＯＡｃで３回抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝２：１）により精製した後、生成物３－２（１．３９ｇ、収率５９％）を獲得した。

【0084】

ｃ）反応フラスコに、生成物３－２（１．３９ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（１０ｍＬ）を加え、氷浴冷却下、ｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（１．７４ｇ、８．６４ｍｍｏｌ）及びピリジン（０．７ｍＬ、８．６４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、水を加えて洗浄し、ＥｔＯＡｃで３回抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝３：１）により精製した後、生成物３－３（２．２７ｇ、収率８８％）を獲得した。

【0085】

ｄ）反応フラスコに、生成物３－３（２．２７ｇ、６．３２ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ジオキサン（１６ｍＬ）及び水（４ｍＬ）を加え、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（２．１３ｇ、５．２７ｍｍｏｌ）を加え、さらにトリエチルアミン（１．８５ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌して完全に反応させた。１Ｍ ＨＣｌを適量で加えてｐＨを２程度に調節し、酢酸エチルで抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、粗生成物３－４を獲得し、粗生成物３－４をそのまま次の工程に使用した。

【0086】

ｅ）反応フラスコ中で、前の工程で獲得した生成物３－４をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させ、ジエチルアミン（５ｍＬ）を加え、室温で６時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝４０：１０：１）により精製した後、白色固体生成物３－５（０．９５ｇ、２段階収率４９％）を獲得した。

【0087】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ８．０４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ），４．２５（ｓ，２Ｈ），３．８１（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１６－３．０８（ｍ，２Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），１．９７－１．７９（ｍ，２Ｈ），１．６０－１．４８（ｍ，２Ｈ），１．４８－１．３５（ｍ，２Ｈ）．

【0088】

製造例４：非天然アミノ酸ＮＰＯＫの製造
ＮＰＯＫの構造式は、以下に示す通りであった。

【化20】

【0089】

反応過程は、以下に示す通りであった。

【化21】

【0090】

製造過程は、次の工程を含む。

【0091】

ａ）反応フラスコに、トリホスゲン（Ｔｒｉｐｈｏｓｇｅｎｅ）（ＢＴＣ、２．１８ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＴＨＦ（１０．０ｍＬ）を加え、氷浴冷却下、ｐ－ヒドロキシアセトフェノン（２．０ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）及びピリジン（１．５ｍＬ、１７．６４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で２４時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、水を適量で加え、ＥｔＯＡｃで３回抽出し、有機相を合併した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、粗生成物４－１（１．２０ｇ）を獲得し、粗生成物４－１をそのまま次の工程に使用した。

【0092】

ｂ）反応フラスコに、Ｂｏｃ－リジン（１．１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（１０．０ｍＬ）を加え、生成物４－１（１．２０ｇ）及びトリエチルアミン（２ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２４時間撹拌し、ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、１Ｍ ＨＣｌを適量で加えてｐＨを弱酸性に調節し、ＤＣＭで３回抽出し、有機相を合併した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１）により、生成物４－２（１．７０ｇ、収率８４％）を獲得した。

【0093】

ｃ）反応フラスコに、生成物４－２（１．７０ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（５ｍＬ）を加え、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を加え、得られた混合物を室温で１時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、そのまま減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝４０：１０：１）により、生成物４－３（１．１９ｇ、収率９２％）を獲得した。

【0094】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ８．０９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．２７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），１．９８－１．８７（ｍ，２Ｈ），１．７２－１．６０（ｍ，２Ｈ），１．５５－１．４３（ｍ，２Ｈ）．

【0095】

製造例５：非天然アミノ酸ＮＢＧＫの製造
ＮＢＧＫの構造式は、以下に示す通りであった。

【化22】

【0096】

反応過程は、以下に示す通りであった。

【化23】

【0097】

製造過程は、次の工程を含む。

【0098】

ａ）反応フラスコに、ｐ－メチルアセトフェノン（８．０ｍＬ、６０．０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（８０．０ｍＬ）を加え、ＮＢＳ（１２．８２ｇ、７２．０ｍｍｏｌ）及びＢＰＯ（１４５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を９０℃で２４時間還流した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、容器を氷水に入れて冷却し、固体を析出させ、固体をろ過除去し、飽和Ｎａ_２ＣＯ_３で３回洗浄し、ＤＣＭで３回抽出し、有機相を合併した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、粗生成物５－１（１１．１２ｇ、収率８７％）を獲得し、粗生成物５－１を精製せずそのまま次の工程に使用した。

【0099】

ｂ）反応フラスコ中で、４ÅのＭＳ（１４ｇ）及びＬｉＯＨ（１．４５ｇ、３４．５４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７０ｍＬ）で溶解させ、室温で２０分間撹拌した後、グリシンメチルエステル塩酸塩（２．０ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）を加え、さらに４５分間撹拌した後、生成物５－１（４．０ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、固体をろ過除去し、得られたろ過ケーキをＥＡで洗浄し、得られた濾液を水で２回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した後に、粗生成物５－２を獲得し、そのまま次の工程に使用した。

【0100】

ｃ）反応フラスコ中で、前の工程で獲得した生成物５－２をジオキサン（２０ｍＬ）に溶解させ、１Ｍ ＮａＯＨをゆっくり滴下し、２時間反応させた後、ＴＬＣ検査で加水分解反応が完了して生成物５－３が得られた。飽和ＮａＨＣＯ_３を２０ｍＬ加えた後、ジオキサン（１０ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ－ＯＳｕをゆっくり加え、室温で一晩撹拌し、ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、１Ｍ ＨＣｌで弱酸性に調節し、ＥＡで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）により、生成物５－４（３．６０ｇ、収率８９％）を獲得した。

【0101】

ｄ）反応フラスコに、生成物５－３（３．６０ｇ、８．０ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（１．１０ ｇ、９．６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（１．８５ｇ、９．６ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（５０ｍＬ）を加え、得られた混合物を室温で１８時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、水で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した後、生成物５－５（３．２０ｇ、収率７５％）を獲得した。

【0102】

ｅ）反応フラスコに、生成物５－５（３．２０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ジオキサン（４０ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）を加え、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（３．０ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を加え、さらにトリエチルアミン（２．０ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌して完全に反応させた。１Ｍ ＨＣｌを適量で加えてｐＨを２程度に調節し、ＥＡで抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ＝２０：１：０．５）により、生成物５－５（３．５０ｇ、収率７５％）を獲得した。

【0103】

ｆ）反応フラスコ中で、生成物５－５をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解させ、ジエチルアミン（２０ｍＬ）を加え、室温で６時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝３０：１０：１）により、最終生成物として白色粉末５－７（０．５５ｇ、収率３７％）を獲得した。

【0104】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ７．９８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，１Ｈ），３．３１（ｓ，２Ｈ），３．１７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），１．９７－１．７３（ｍ，２Ｈ），１．５８－１．４５（ｍ，２Ｈ），１．４４－１．２７（ｍ，２Ｈ）．

【0105】

製造例６：非天然アミノ酸ＮＰＯＫ－２の製造
ＮＰＯＫ－２の構造式は、以下に示す通りであった。

【化24】

【0106】

反応過程は、以下に示す通りであった。

【化25】

【0107】

製造過程は、次の工程を含む。

【0108】

ａ）反応フラスコに、ｐ－アセチルフェノール（２．０５ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）及びブロモ酢酸（２．５０ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）を加え、さらにＮａＯＨ（１．２０ｇ、３０ｍｍｏｌ）の水溶液（６ｍＬ）を加えた。得られた混合物を１００℃で２４時間還流して完全に反応させた。反応を室温に冷却し、１Ｍ塩酸を加えて酸性に調整し、固体を析出させ、ろ過した後、白色粗生成物６－１（３．３２ｇ、収率１１３％）を獲得し、粗生成物６－１を精製せずそのまま次の工程に使用した。

【0109】

ｂ）反応フラスコ中で、前の工程で獲得した粗生成物６－１（３．３２ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解させ、ＮＨＳ（２．３５ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（３．９０ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を常温で１８時間撹拌して完全に反応させた。ＤＣＭで抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。さらにカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ＝２０：１：０．５）により精製した後、生成物６－２（１．６７ｇ、収率３８％）を獲得した。

【0110】

ｃ）反応フラスコに、生成物６－２（１．６７ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ジオキサン（２０ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）を加え、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（１．９ｇ、４．８ｍｍｏｌ）を加え、さらにトリエチルアミン（１．７ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌して完全に反応させ、１Ｍ ＨＣｌを適量で加えてｐＨを２程度に調節し、ＥＡで抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。得られた粗生成物６－３をＤＣＭ（１０ｍＬ）に直接溶解させ、ジエチルアミン（５ｍＬ）を加えた。得られた混合物を常温で１８時間撹拌して完全に反応させた。減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝４０：１０：１）により精製した後、最終生成物６－４（７０９ｍｇ、２段階収率３９％）を獲得した。

【0111】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ７．９１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），３．５９（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．５２（ｓ，３Ｈ），１．８７－１．６５（ｍ，２Ｈ），１．５６－１．４０（ｍ，２Ｈ），１．３５－１．１５（ｍ，２Ｈ）．

【0112】

製造例７：非天然アミノ酸ＮＢＧＫ－２の製造
ＮＢＧＫ－２の構造式は、以下に示す通りであった。

【化26】

【0113】

反応過程は、以下に示す通りであった。

【化27】

【0114】

製造過程は、次の工程を含む。

【0115】

ａ）反応フラスコに、ブロモ酢酸（２．１０ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）とＮａＯＨ（０．８０ｇ、２０ｍｍｏｌ）の水溶液（１０ｍＬ）を加え、１０分間撹拌した。次いで、ｐ－アセトアニリド（１．４０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を１００℃で１８時間還流して完全に反応させた。反応を室温に冷却し、ろ過し、水で洗浄し、白色粗生成物７－１（１．３０ｇ、収率６７％）を獲得し、粗生成物７－１を精製せずそのまま次の工程に使用した。

【0116】

ｂ）反応フラスコに、生成物７－１（１．３０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）とＮａＨＣＯ_３（１．７０ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）の水溶液（２０ｍＬ）を加えた。さらにＦｍｏｃ－ＯＳｕ（２．８０ｇ、８．１ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（２０ｍＬ）を加えた。得られた混合物を６０℃で１８時間撹拌して完全に反応させた。室温に冷却し、ＥＡで抽出した。１Ｍ塩酸で残留水相のｐＨを２程度に調節してから、ＥＡで抽出し、有機相を獲得した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。生成物７－２を獲得し、粗生成物７－２を精製せずそのまま次の工程に使用した。

【0117】

ｃ）反応フラスコに、前の工程で獲得した生成物７－２（約６．７ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（０．９０ｇ、８．０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（１．５０ｇ、８．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を室温で２４時間撹拌して完全に反応させた。水を加え、ＤＣＭで抽出し、有機相を獲得した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。生成物７－３を獲得し、粗生成物７－３を精製せずそのまま次の工程に使用した。

【0118】

ｄ）反応フラスコに、前の工程で獲得した生成物７－３（約６．７ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（２．３０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．０ｍＬ、１４．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌して完全に反応させた。続いて、１Ｍ塩酸でｐＨを２程度に調節し、ＥＡで抽出した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。生成物７－４を獲得し、粗生成物７－４を精製せずそのまま次の工程に使用した。

【0119】

ｅ）反応フラスコに、前の工程で獲得した生成物７－４を加えた。溶媒ＤＣＭ（２０ｍＬ）及びジエチルアミン（１０ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌して完全に反応させた。先ず減圧濃縮し、アセトニトリル（５０ｍＬ）を加えて再び溶解させ、その後に減圧濃縮し、操作を３回繰り返して余分なジエチルアミンを除去した。ＤＣＭを加えて２回叩解した後、最終生成物７－５（１．６５ｇ、総収率５１％）を獲得した。

【0120】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ７．７１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．５１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｓ，２Ｈ），３．５３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），１．７３－１．６０（ｍ，２Ｈ），１．４２－１．３３（ｍ，２Ｈ），１．２５－１．１４（ｍ，２Ｈ）．

【0121】

実施例１：非天然アミノ酸が部位特異的に挿入された組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）を発現する発現菌株の構築
１、野生型組換えヒトＩＬ－２の発現プラスミドＮＢ１Ｓ３－ＷＴの獲得
米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すようなホモ・サピエンスＩＬ－２の前駆体タンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＣＡＡ２５２９２．１）を獲得した。この前駆体配列のＮ末端には２０個のアミノ酸からなるシグナルペプチド配列が含まれており、ＩＬ－２タンパク質分子が加工されて成熟していく過程中で切除され、このシグナルペプチド配列が切除された後、成熟したホモ・サピエンスＩＬ－２のタンパク質配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）が得られた。文献報道（Ｌｉａｎｇ Ｓ．Ｍなど． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６１（１）：３３４－３３７，１９８６）により、成熟したホモ・サピエンスＩＬ－２のタンパク質配列には３個のシステインＣｙｓが含まれ、そのうち５８位と１０５位の２個のＣｙｓによってジスルフィド結合が形成され、それらはホモ・サピエンスＩＬ－２の生物活性に非常に重要である。１２５位のＣｙｓはジスルフィド結合の形成に関与しないばかりでなく、かえって組換えホモ・サピエンスＩＬ－２のタンパク質封入体の再生過程における正常なジスルフィド結合の形成を障害するため、１２５位のＣｙｓをセリンＳｅｒに突然変異させることで、その活性に顕著な影響を与えずに再生の効率を向上させることができる。それと同時に、大腸菌中で組換えタンパク質を発現するために、タンパク質配列のＮ末端に開始タンパク質を翻訳するためのメチオニンＭｅｔを添加する必要があり、それによって成熟した組換えヒトＩＬ－２のタンパク質配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が得られる。アミノ酸とコドンの逆翻訳過程及びコドンの最適化によって、組換えヒトＩＬ－２をコードする遺伝子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が得られ、全遺伝子合成によってこの組換えヒトＩＬ－２のコード遺伝子が得られる。次いで、サブクローニングによってそれをＮＢ１Ｓ３発現ベクターに連結して（この発現ベクターは市販ベクターｐＥＴ－２１ａから改造されたものであり、そのアンピシリン耐性遺伝子スクリーニングマーカーは市販ベクターｐＣＤＦ－ｄｕｅｔ１からＰＣＲにより増幅したスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換された）、野生型組換えヒトＩＬ－２の発現プラスミドＮＢ１Ｓ３－ＷＴ（図１を参照）が得られ、その配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示す通りであった。

【0122】

【化28(1)】

【化28(2)】

【化28(3)】

【0123】

２、部位特異的突然変異部位の選択
特定の部位としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＰ３４位、Ｋ３５位、Ｔ３７位、Ｒ３８位、Ｌ４０位、Ｔ４１位、Ｆ４２位、Ｋ４３位、Ｆ４４位、Ｙ４５位、Ｅ６１位、Ｅ６２位、Ｋ６４位、Ｐ６５位、Ｅ６７位、Ｅ６８位、Ｎ７１位、Ｌ７２位、及びＹ１０７位を選択して点突然変異を行い、この突然変異型ＩＬ－２を原料として部位特異的修飾を行った。

【0124】

３、部位特異的突然変異のプライマー設計及び突然変異ベクターの構築
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の下記の部位：Ｐ３４位、Ｋ３５位、Ｔ３７位、Ｒ３８位、Ｌ４０位、Ｔ４１位、Ｆ４２位、Ｋ４３位、Ｆ４４位、Ｙ４５位、Ｅ６１位、Ｅ６２位、Ｋ６４位、Ｐ６５位、Ｅ６７位、Ｅ６８位、Ｎ７１位、Ｌ７２位、及びＹ１０７位のそれぞれに対して、前記アミノ酸をコードするコドンをアンバーコドンに突然変異させることのできるプライマーを設計し、具体的なプライマーを表１に示した。

【0125】

【表1(1)】

【表1(2)】

【0126】

ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩとＸｈｏＩの両酵素でプラスミドＮＢ１Ｓ３－ＷＴを切断して得られた線形化ＤＮＡプラスミドをテンプレートとし、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社より購入、品番Ｒ０４５Ａ）を利用し、表１のプライマーＸｂａＩ－Ｆで各部位のプライマーＲとペアリングし、表１のプライマーＸｈｏＩ－Ｒで各部位のプライマーＦとペアリングし、ＰＣＲ増幅とオーバーラップＰＣＲ法によって、ＩＬ－２の下記部位：Ｋ３５、Ｔ４１、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｋ６４、及びＰ６５のアミノ酸コドンがアンバー終止コドンに突然変異した突然変異遺伝子を獲得し（例えば、線形化プラスミドＮＢ１Ｓ３－ＷＴをテンプレートとし、ＸｂａＩ－ＦとＴ４１－ＲをプライマーペアとしてＰＣＲ増幅を行うことで、部位Ｔ４１が突然変異した上流断片を獲得し、線形化プラスミドＮＢ１Ｓ３－ＷＴをテンプレートとし、ＸｈｏＩ－ＲとＴ４１－ＦをプライマーペアとしてＰＣＲ増幅を行うことで、部位Ｔ４１が突然変異した下流断片を獲得し、続いて、上記のように獲得した部位Ｔ４１が突然変異した上流断片及び部位Ｔ４１が突然変異した下流断片をテンプレートとし、ＸｂａＩ－ＦとＸｈｏＩ－ＲをプライマーペアとしてオーバーラップＰＣＲ増幅を行うことで、部位Ｔ４１が突然変異した全長遺伝子を獲得した）、さらに高忠実度ＤＮＡ組み込み型クローン試薬キット（ＮＥＢ社より購入、品番Ｅ５５２０Ｓ）を利用し、その取扱書に従って、獲得した突然変異遺伝子でプラスミドＮＢ１Ｓ３－ＷＴのＸｂａＩとＸｈｏＩとの２つの酵素切断部位間の断片のそれぞれを置き換えることで、７種の発現プラスミドＮＢ１Ｓ３－Ｋ３５、ＮＢ１Ｓ３－Ｔ４１、ＮＢ１Ｓ３－Ｋ４３、ＮＢ１Ｓ３－Ｙ４５、ＮＢ１Ｓ３－Ｅ６１、ＮＢ１Ｓ３－Ｋ６４、及びＮＢ１Ｓ３－Ｐ６５を構築し、配列を測定した結果、突然変異に成功したことが判明した。

【0127】

４、部位特異的に突然変異したｒｈＩＬ－２発現株の構築
文献（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ａ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２（１０），１８２８－１８３７，２０１３）に記載されたプラスミドｐＵｌｔｒａの構造を参考にし、遺伝子全合成によって、本発明の式（Ｉ）で表れる構造のようなカルボニル末端基含有リジン類似体を特異的に識別するｔＲＮＡとｔＲＮＡ合成酵素のコード遺伝子（野生型メタン古細菌ピロリシン合成酵素とそれに対応するｔＲＮＡのコード遺伝子）とクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）を獲得し、ＰＣＲ増幅法によって市販ベクターｐＣＤＦ－ｄｕｅｔ１からＣｌｏＤＦ１３複製開始部位を含むＤＮＡ断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）を増幅し、高忠実度ＤＮＡ組み込み型クローン試薬キットによるサブクローンによって２つのＤＮＡ断片を連結し、それによってヘルパープラスミドＮＢ１Ｗ（図２を参照でき、以下、このプラスミドをヘルパープラスミドと略称する）が得られ、このプラスミドのスクリーニングマーカーがクロラムフェニコール耐性であった。ヘルパープラスミドと工程３で得られた発現プラスミド（スペクチノマイシン耐性）をそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に同時形質転換し、スペクチノマイシン耐性とクロラムフェニコール耐性プレートに通過させて二重陽性菌株（二重陽性菌株はスペクチノマイシン耐性とクロラムフェニコール耐性を同時に獲得した菌株を示す）：ｒｈＩＬ２－Ｋ３５－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｔ４１－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｋ４３－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｙ４５－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｅ６１－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｋ６４－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｐ６５－ＢＬ２１を獲得した。

【0128】

野生型メタン古細菌ピロリシン合成酵素のコード遺伝子、それに対応するｔＲＮＡのコード遺伝子、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）は、以下に示す通りであった。

【0129】

【化29(1)】

【化29(2)】

【0130】

ＣｌｏＤＦ１３複製開始部位を含むＤＮＡ断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）は、以下に示す通りであった。

【0131】

【化30】

【0132】

実施例２：部位特異的突然変異によって非天然アミノ酸が挿入されたｒｈＩＬ－２の発現及び精製
１、突然変異型ｒｈＩＬ－２への非天然アミノ酸の組み込み発現
実施例１で獲得した７種の発現菌株ｒｈＩＬ２－Ｋ３５－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｔ４１－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｋ４３－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｙ４５－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｅ６１－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｋ６４－ＢＬ２１、ｒｈＩＬ２－Ｐ６５－ＢＬ２１のそれぞれを、ＬＢ培地（５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン及び３７．５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するもの）に接種し、３７℃で５～８時間培養した後、菌液のＯＤ_６００が２．０±０．２に達するまで二次拡種を行って（培地の組成は上記と同じである）、二次種液を獲得した。

【0133】

上記の二次種液を発酵培地に接種して発酵培養を行い、５Ｌ発酵タンク中で実施し、培養体積を２Ｌ、培地を２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）、接種量を５％（ｖ／ｖ）、培養温度を３７℃とし、ｐＨを６．９０±０．０５に制御し、必要に応じてアンモニア水又はＨ_３ＰＯ_４を自動的に流動添加し、ＤＯ関連回転速度を設定して、ＤＯを３０％に制御した。菌液のＯＤ_６００が２０．０±２．０に達した場合、ＩＰＴＧ及び製造例１で獲得した非天然アミノ酸ＮＢＯＫを添加し、終濃度を共に１ｍＭとし、それと同時に０．６±０．１ｍＬ／ｍｉｎの補給速度で５０％グリセリンの補給を開始し、５～６時間誘導発現後に菌体を収集した。各菌株のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を図３に示した。

【0134】

２、突然変異型ｒｈＩＬ－２の分離抽出
上記のように収集した菌体のそれぞれを、緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、６ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０）で再懸濁させ、１％ＤＮＡ酵素（１ｍｇ／ｍＬ）、０．５％ＰＭＳＦを加え、均一に混合し、超高圧ホモジナイザを用いて５０～８０ＭＰａ圧力でホモジェネート処理を３回行った。ホモジェネート液を１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、下層にある封入体粗体を収集した。

【0135】

獲得した封入体粗体を洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ｐＨ８．０）で２回洗浄した後、超純水で１回洗浄して精製済み封入体を獲得した。

【0136】

精製済み封入体を変性緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ塩酸グアニジン、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０）で溶解させ、３０分間経過後に１０，０００ｒｐｍで遠心分離して収集した上清は即ち変性タンパク質溶液であった。４倍体積の再生緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を、収集した変性タンパク質溶液に加え、十分に撹拌した後に１２時間静置し、１０，０００ ｒｐｍで遠心分離して収集した上清は即ち再生タンパク質溶液であった。

【0137】

再生タンパク質溶液を、分画分子量５ｋＤａの限外ろ過膜バッグ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｂｉｏｍａｘ－５）で原体積の１／４に濃縮させ、電気伝導率が約２ｍｓ／ｃｍに達するまで置換緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて液交換し、さらにタンパク質濃度が約０．５～１ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮させ、１０，０００ｒｐｍで遠心分離して収集した上清は即ち突然変異型ｒｈＩＬ－２粗タンパク質：ｒｈＩＬ２－Ｋ３５、ｒｈＩＬ２－Ｔ４１、ｒｈＩＬ２－Ｋ４３、ｒｈＩＬ２－Ｙ４５、ｒｈＩＬ２－Ｅ６１、ｒｈＩＬ２－Ｋ６４、ｒｈＩＬ２－Ｐ６５であり、それらはそのままで以降のＰＥＧカップリングに使用できる。

【0138】

実施例３：ＰＥＧと部位特異的突然変異によって非天然アミノ酸ＮＢＯＫが挿入されたｒｈＩＬ－２との部位特異的なカップリング

【化31】

ＰＥＧと部位特異的突然変異によって非天然アミノ酸が挿入されたｒｈＩＬ－２との部位特異的なカップリングの合成ルートは、式２に示す通りであった（但し、Ｐ_１からＰ_２への方向はアミノ酸配列のＮ末端からＣ末端への方向である）。

【0139】

３０ＫＤのアミノオキシＰＥＧ（即ちヒドロキシアミンＰＥＧ）がオキシム化反応によってカップリングされたｒｈＩＬ－２を例とすると、カップリング反応の操作は以下の通りであった：カップリング反応前、２Ｍ酢酸溶液で上記のように獲得した目的タンパク質をｐＨ４．０に調節し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）でタンパク質濃度が約１ｍｇ／ｍｌになるように調節し、１：１５（タンパク質とアミノオキシＰＥＧのモル比）で３０ＫＤのアミノオキシＰＥＧ固体（北京鍵凱科技有限公司より購入）を加え、十分に揺動して溶解させ、澄明な透明溶液を獲得し、さらに反応液を密封し、恒温振とう台（２５℃、１００ｒｐｍ）で揺動しながら反応させた。４８時間経過後にＲＰ－ＨＰＬＣによってカップリング状況を分析し、図４Ａ及び図４Ｂを参照できる。その結果から明らかなように、図４Ｂでは微小なｒｈＩＬ－２ピークしか見られないため、７種の目的タンパク質の何れにもＰＥＧがカップリングされたことが判明し、なお、カップリング率（１００％－カップリング終了後に残ったｒｈＩＬ－２濃度／カップリング反応ゼロ時間のときのｒｈＩＬ－２濃度×１００％）が共に９５％を超えたため、上記の非天然アミノ酸ＮＢＯＫが目的タンパク質に挿入されたことがさらに判明した。

【0140】

ＰＥＧがカップリングされた突然変異型ｒｈＩＬ－２タンパク質のそれぞれを、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｋ３５、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｋ４３、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５、３０ ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｅ６１、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｋ６４、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｐ６５と記する。

【0141】

ＲＰ－ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りであった。

【0142】

移動相Ａ（０．１％ ＴＦＡ－Ｈ_２Ｏ）、
移動相Ｂ（０．１％ ＴＦＡ－ＡＣＮ）。

【0143】

【表2】

【0144】

実施例４：部位特異的に修飾された３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２の精製
クロマトグラフィー媒質をＣａｐｔｏ ＭＭＣ、平衡緩衝液を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝３．０）、溶離緩衝液を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液－１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．８）とした。

【0145】

精製の過程は具体的に以下のことを含む：実施例３で獲得した３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｋ３５、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｋ４３、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｅ６１、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｋ６４、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｐ６５のカップリング反応液のそれぞれを、平衡緩衝液でｐＨ３．０±０．２、電気伝導率≦５ｍｓ／ｃｍになるように調節し、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣにサンプルローディングし、溶離緩衝液を用いてリニア溶離（０～１００％の溶離液、２０ＣＶ）を行い、目的タンパク質成分を収集し、このようにずれば、純度が約９５％の目的タンパク質サンプルが得られた。３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５を例とすると、精製済みコンジュゲートである３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５及びカップリング反応前のｒｈＩＬ２－Ｙ４５の典型的なＲＰ－ＨＰＬＣスペクトルを図５に示した。他のタンパク質サンプルの精製結果はこれと類似している。

【0146】

実施例５：部位特異的に修飾された３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２の体外活性の評価（ＳＴＡＴ５リン酸化実験）
本方法では２種の細胞株が用いられており、マウスＣＴＬＬ－２細胞はＩＬ－２Ｒαβγを含有する細胞株、ヒトＹＴ細胞はＩＬ－２Ｒβγを含有する細胞株であり、ｒｈＩＬ－２は細胞表面のＩＬ－２Ｒと結合して、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ信号経路を活性化させた。各サンプルは、修飾された部位が異なり、２種の細胞への相対活性が異なり、ＹＴ細胞／ＣＴＬＬ－２細胞のＥＣ５０比の変化率（パーセント）が低いほど、サンプルによる免疫機能促進効果が高くなり、逆にならば、免疫機能抑制効果が高くなる。

【0147】

具体的な過程は以下の通りであった：マウスＣＴＬＬ－２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）とヒトＹＴ細胞を、それぞれの培地（ＣＴＬＬ－２細胞培地：ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＢＳ＋４００ ＩＵ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム；ＹＴ細胞培地：ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＢＳ＋１ｍＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ社より購入、カタログ番号１１１４００５０））で３７°Ｃ、５％ ＣＯ_２条件下で十分な量まで培養し、測定前に４時間飢餓させ、続いて、細胞密度を１×１０^６細胞／ｍＬに調整してスタンドバイ状態に進んだ。３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｋ３５、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｅ６１、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｐ６５、カップリング反応前のｒｈＩＬ２－Ｋ３５、ｒｈＩＬ２－Ｔ４１、ｒｈＩＬ２－Ｙ４５、ｒｈＩＬ２－Ｅ６１、ｒｈＩＬ２－Ｐ６５サンプル、及び参照ｒｈＩＬ－２（北京索莱宝科学技術有限公司より購入、品番Ｐ０００２０）のそれぞれに対して勾配希釈を行い、各サンプルごとに合計６段階の濃度が設定され（ＣＴＬＬ－２細胞実験では、参照は濃度範囲が０．００４～４ｎｇ／ｍＬで、４倍勾配希釈され、一方、ＹＴ細胞実験では、参照は濃度範囲が２．１～５１０ｎｇ／ｍＬで、３倍勾配希釈され、他のサンプルの濃度範囲は予備実験でスクリーニングして得られ、表２中の該当するＥＣ５０値に対応する）、３７°Ｃで細胞を１０分間刺激した後、細胞を溶解し、ウェスタンブロット実験を行い、ｐＳＴＡＴ５抗体（ＣＳＴ社より購入、カタログ番号９３５９Ｌ）とβ－ａｃｔｉｎ（ＣＳＴ社より購入、カタログ番号８４５７Ｓ）をハイブリダイゼーションさせ、細胞溶解液中のｐＳＴＡＴ５とβ－ａｃｔｉｎタンパク量を測定し、ｐＳＴＡＴ５／β－ａｃｔｉｎのグレースケール結果及びサンプル濃度に基づいてＥＣ５０を算出した。その結果を表２に示した。その結果から明らかなように、部位Ｋ３５、Ｔ４１、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｐ６５に非天然アミノ酸ＮＢＯＫが挿入されたとともに、３０ＫＤ ＰＥＧがカップリングされたｒｈＩＬ２は共に、最初の設計要求に達したものであった（参照を対照とすると、ＥＣ５０比の変化率は参照よりも低くなった）。

【0148】

【表3】

【0149】

実施例６：マウス体内での薬物動態学研究
実験では、雌性Ｃ５７マウス（ＳＰＦ級、浙江維通利華実験動物技術有限公司より購入）が用いられており、泉奇ｒｈＩＬ－２（山東泉港薬業有限公司より購入）を陽性対照薬物とし、被験物３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５のマウス体内での代謝状況を考察した。３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５と泉奇ｒｈＩＬ－２のそれぞれを１ｍｇ／ｋｇで単回静脈注射投与し、それぞれ以下の採血時刻：投与前、投与後の０．０８３３時間、０．５時間、１時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間で採血し、各時刻ごとに０．５ｍＬ（ｎ＝５）を採血し、なお、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５については上記よりも５個多い採血時刻：４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間を設定した。血液サンプルを室温で１５分間置き、６８００ｇ／ｍｉｎで６分間遠心分離して血清を獲得した。血清に対して以下の方法によって薬物血中濃度の分析を行った。

【0150】

（１）コーティング：高吸着９６ウェルプレートに、１μｇ／ｍＬのＡｎｔｉ－ＩＬ－２抗体（ａｂｃａｍ社より購入、カタログ番号ａｂ９６１８）作動液を１ウェル当たり５０μＬ加え、２～８℃で一晩培養した。（２）洗浄：ウェル内の液体を捨て、１×ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を利用して３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。（３）封止：カゼイン封止液（Ｔｈｅｒｍｏ社より購入、カタログ番号３７５２８）を２００ μＬ／ウェルで加え、室温条件下で９０分間静置した。（４）洗浄：ウェル内の液体を捨て、１×ＰＢＳＴを利用して３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。（５）サンプル添加：泉奇ｒｈＩＬ－２、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５、測定対象血清サンプルに対してマウス血清で勾配希釈を行い、５０μＬ／ウェルでマイクロウェルプレートに移し、室温で１２０分間静置した。（６）洗浄：ウェル内の液体を捨て、１×ＰＢＳＴを利用して３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。（７）一次抗体：０．２５μｇ／ｍＬのＩＬ－２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＧ５）とＢｉｏｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入、カタログ番号Ｍ６００Ｂ）作動液を１ウェル当たり５０μＬ加え、室温で６０分間静置した。（８）洗浄：ウェル内の液体を捨て、１×ＰＢＳＴを利用して３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。（９）二次抗体：Ｐｉｅｒｃｅ^ＴＭ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ社より購入、カタログ番号２１１３０）をカゼイン封止液で４０００倍希釈させたものを、１ウェル当たり５０μＬ加え、室温で６０分間静置した。（１０）洗浄：ウェル内の液体を捨て、１×ＰＢＳＴを利用して３００μＬ／ウェルで４回洗浄した。（１１）基質：１－Ｓｔｅｐ^ＴＭ Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社より購入、カタログ番号３４０２２）を１ウェル当たり５０μＬ加えた。（１２）停止・値読み取り：２５分間経過後、２Ｍ硫酸停止液を加え、酵素標識器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社より購入、型番ＥｎＳｉｇｈｔ）の４５０ｎｍと６５０ｎｍでの吸光値を読み取った。（１３）分析：Ｄａｚｄａｑ Ｌｔｄ． ＷｏｒｋＯｕｔ １．５分析ソフトウェアにより４パラメータフィッティングを行い、泉奇ｒｈＩＬ－２と３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５に対応する濃度と単位を入力し、両者のそれぞれについて１本の曲線をフィッティングし、測定対象血清の薬物血中濃度を算出した。ＤＡＳソフトウェアの非房室モデル（統計モーメントパラメータ）から算出した泉奇ｒｈＩＬ－２と３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５の平均半減期ｔ_１／２はそれぞれ０．８３時間と１９．８３時間であった。泉奇ｒｈＩＬ－２と３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５の薬物動態学的パラメータを表３に示した。

【0151】

【表4】

【0152】

実施例７：マウス体内での薬効学的研究－抗腫瘍活性
実験では、雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＳＰＦ級、浙江維通利華実験動物技術有限公司より購入）が用いられており、ＣＴ２６．ＷＴ（ＡＴＣＣより購入、カタログ番号ＣＲＬ－２６３８）細胞懸濁液を２×１０^５／０．１ｍＬ／マウス、Ｈ２２（ＣＣＴＣＣより購入、カタログ番号ＧＤＣ００９１）細胞懸濁液を４×１０^５／０．１ｍＬ／マウスでマウス右背部皮下に接種し、腫瘍体積が５０ｍｍ^３程度に達した時、１グループ７匹のマウスでランダムにグループ化し、溶媒（１×ＰＢＳ）、０．７ｍｇ／ｋｇの３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１、５．０ｍｇ／ｋｇの３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１、０．７ｍｇ／ｋｇの３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５、５．０ｍｇ／ｋｇの３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５をそれぞれ投与した（投与体積は共に１０ｍＬ／ｋｇである）。実験中に動物体重及び腫瘍体積を週３回測定し、投与方法及び実験結果を表４に示した。相対抑制率ＴＧＩ_ＴＷ（％）の計算式は（Ｔ_ＷＣ－Ｔ_ＷＴ）／Ｔ_ＷＣ×１００％で、式中、Ｔ_ＷＣは溶媒対照群の平均腫瘍重量、Ｔ_ＷＴは治療群の平均腫瘍重量であった。

【0153】

その結果から明らかなように、溶媒群に比べ、２種の被験物の高、低用量群は共に、マウス結腸癌ＣＴ２６．ＷＴ及びマウス肝癌Ｈ２２の同種移植腫瘍に対して顕著な抑制作用を奏した。

【0154】

【表5】

【0155】

実施例８：マウス体内での薬効学的研究－免疫細胞群の発現
実験では、雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＳＰＦ級、浙江維通利華実験動物技術有限公司より購入）が用いられており、ＣＴ２６．ＷＴ細胞懸濁液を２×１０^５／０．１ｍＬ／マウスでマウス右背部皮下に接種し、腫瘍体積が１００ｍｍ^３程度に達した時、１グループ３匹のマウスでランダムにグループ化し、表５に従って各被験物（その泉奇（登録商標）は市販の組換えヒトＩＬ－２注射剤である）のそれぞれを１０ｍＬ／ｋｇの投与体積で投与した。５日目に各群の腫瘍組織サンプルを取ってＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ４^＋ Ｔｒｅｇ細胞群の割合の変化をフロー検出で獲得し、その結果を表５に示した。

【0156】

【表6】

【0157】

泉奇対照に比べ、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１と３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｙ４５では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合が顕著に増加し、ＣＤ４^＋ Ｔｒｅｇ細胞の割合が顕著に減少し、ＣＤ８^＋Ｔ／ＣＤ４^＋ Ｔｒｅｇの比率が顕著に増加し、優れた免疫増強薬効が発見された。

【0158】

実施例９：Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏの活性基還元現象
実施例１における方法を参考にして、９１位のアミノ酸（バリン）コドンがアンバーコドンに突然変異したｒｈＩＬ－２（略称：ｒｈＧＨ－Ｖ９１）発現菌株を構築し、構築過程で用いたプライマーを以下に示した。

【0159】

Ｖ９１－Ｆ：５’－ＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＴＡＧＡＴＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、
Ｖ９１－Ｒ：５’－ＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＡＧＴＴＧＡＴＡＴＴＧＧＡＡＡＴＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）。

【0160】

実施例２を参考にし、上記のｒｈＧＨ－Ｖ９１発現菌株を用いて、発酵過程中にＬｙｓ－ａｚｉｄｏを添加することで、９１位がＬｙｓ－ａｚｉｄｏに突然変異したｒｈＧＨ－２を発現し、そして実施例２における精製手段によって精製を行った。このような９１位がＬｙｓ－ａｚｉｄｏに突然変異したｒｈＧＨ－２について、図６に示すように、液体クロマトグラフィーと質量分析法（高分解能質量分析計：ＸｅｖｏＧ２－ＸＳ Ｑ－Ｔｏｆ、Ｗａｔｅｒｓ社製；超高速液体クロマトグラフィー：ＵＰＬＣ（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｉ－Ｃｌａｓｓ）、Ｗａｔｅｒｓ社製）によって完全な分子量の分析を行った。その結果から明らかなように、サンプルには理論分子量（１５６７２．７５ Ｄａ）よりも約２６ Ｄａ小さい成分が現れ、この成分は推断によりＬｙｓ－ａｚｉｄｏの末端にあるアジド構造（－Ｎ_３）が（－ＮＨ_２）に還元された生成物であった。

【0161】

Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏの還元により、Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏに突然変異したｒｈＩＬ－２がＢＣＮ－ＰＥＧとカップリングできなくなるため、カップリング率が低下してしまった。本発明の非天然アミノ酸を含有するｒｈＩＬ－２がＰＥＧとカップリングした場合、カップリング効率が明らかに向上したため、反応効率が著しく向上した。

【0162】

実施例１０：部位特異的突然変異によって異なる非天然アミノ酸が挿入されたｒｈＩＬ－２の発現及び精製
１、突然変異型ｒｈＩＬ－２への非天然アミノ酸の組み込み発現
実施例１で獲得した発現菌株ｒｈＩＬ２－Ｔ４１－ＢＬ２１を、ＬＢ培地（５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含有するもの）に接種し、３７℃で４～６時間培養した後、菌液のＯＤ_６００が２．０±０．２に達するまで二次拡種を行って（培地はＬＢ培地である）、二次種液を獲得した。

【0163】

上記の二次種液を発酵培地に接種して発酵培養を行い、３ Ｌの４連発酵タンク中で実施し、培養体積を１Ｌ、培地を２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）、接種量を５％（ｖ／ｖ）、培養温度を３７℃とし、ｐＨを６．９０±０．０５に制御し、必要に応じてアンモニア水又はＨ_３ＰＯ_４を自動的に流動添加し、ＤＯ関連回転速度を設定して、ＤＯを３０％に制御した。菌液のＯＤ_６００が２０．０±２．０に達した場合、ＩＰＴＧと製造例２（ＮＰＡＫ）、製造例３（ＮＢＰＫ）、製造例４（ＮＰＯＫ）、製造例５（ＮＢＧＫ）、製造例６（ＮＰＯＫ－２）、製造例７（ＮＢＧＫ－２）で獲得した非天然アミノ酸をそれぞれ添加し、終濃度を共に１ｍＭとし、それと同時に０．５±０．１ｍＬ／ｍｉｎの補給速度で５０％グリセリンの補給を開始し、５～６時間誘導発現後に菌体を収集した。異なる非天然アミノ酸が組み込まれた組換えＩＬ－２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を図７に示した。

【0164】

２、突然変異型ｒｈＩＬ－２の分離抽出
上記のように収集した菌体のそれぞれについて実施例２に記載された分離抽出方法により分離抽出を行うことで獲得した、異なる非天然アミノ酸が組み込まれた突然変異型ｒｈＩＬ－２粗タンパク質（図８を参照）をそれぞれ、ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫ、ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＢＰＫ、ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＯＫ、ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＢＧＫ、ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＯＫ－２、ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＢＧＫ－２と命名し、それらはそのままで以降のＰＥＧカップリングに使用できる。

【0165】

実施例１１：ＰＥＧと部位特異的突然変異によって非天然アミノ酸ＮＰＡＫが挿入されたｒｈＩＬ－２との部位特異的なカップリング

【化32】

ＰＥＧと部位特異的突然変異によってＮＰＡＫが挿入されたｒｈＩＬ－２（ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫ）との部位特異的なカップリングの合成ルートは、式３に示す通りであった（但し、Ｐ_１からＰ_２への方向はアミノ酸配列のＮ末端からＣ末端への方向である）。

【0166】

３０ＫＤのアミノオキシＰＥＧ（即ちヒドロキシアミンＰＥＧ）がオキシム化反応によってカップリングされたｒｈＩＬ－２を例とすると、カップリング反応の操作は実施例３と同じであった。カップリング反応後にＲＰ－ＨＰＬＣを用いてカップリング状況を分析し、そのＲＰ－ＨＰＬＣ分析条件は実施例３と同じとし、その分析結果は図９Ａ及び図９Ｂに示す通りであった。その結果から明らかなように、図９ＢではｒｈＩＬ－２ピークが反応前に比べ大幅に低下し、それに応じて生成物ピーク（２１．１７５分のところ）が大幅に上昇したため、目的タンパク質にはＰＥＧがカップリングされたことが判明し、なお、カップリング率（１００％－カップリング終了後に残ったｒｈＩＬ－２濃度／カップリング反応ゼロ時間のときのｒｈＩＬ－２濃度×１００％）が８０％に近い。

【0167】

ＰＥＧがカップリングされた突然変異型ｒｈＩＬ－２タンパク質を、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫと命名した。

【0168】

実施例１２：部位特異的に修飾された３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫの精製
実施例１１で獲得した３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫを実施例４に記載された精製方法によって精製した後、純度が約９５％の目的タンパク質サンプルを獲得した。精製済みコンジュゲートの典型的なＲＰ－ＨＰＬＣスペクトルを図１０に示した。

【0169】

実施例１３：部位特異的に修飾された３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫの体外活性の評価（ＳＴＡＴ５リン酸化実験）
実施例１２で獲得した３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫに対して実施例５に記載された評価方法によって体外活性の評価を行い、実施例５の評価方法に比べ、ＹＴ細胞実験では参照の濃度範囲が６．３～１５３０ｎｇ／ｍＬである点のみで違った。

【0170】

その結果を図１１Ａ～図１１Ｄ及び表６に示した。その結果から分かるように、３０ＫＤ ＰＥＧ－ｒｈＩＬ２－Ｔ４１ＮＰＡＫは、最初の設計要求に達したものであった（参照を対照とすると、ＥＣ５０比の変化率は参照よりも低くなった）。

【0171】

【表7】

【0172】

特に限定されない限り、本発明で使用される用語は何れも、当業者が一般的に理解する意味を持つものである。

【0173】

本発明で記述される実施形態は、例示的なものに過ぎず、本発明の保護範囲を制限するものではなく、当業者であれば、本発明の範囲内で種々の他の代替、変更、改良を行うことができ、それ故、本発明は上記の実施形態に限定されるものではなく、請求項のみによって限定されるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-02-06

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２と、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸にカップリングされたＰＥＧと、を含有する、ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートであって、
前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ）で表される構造を有するカルボニル末端基含有化合物又はその鏡像異性体であり、前記カルボニル末端基とヒドロキシルアミン末端基含有ＰＥＧとがオキシム結合を形成することにより、ＰＥＧが前記少なくとも１つの非天然アミノ酸にカップリングされており、

【化1】

式中、Ｘ及びＺは夫々独立に、置換され若しくは置換されないＣ０～Ｃ２０の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ_２－は任意的に－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）－から選ばれた１つ又は複数に置換可能であり、Ｙは－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）－又は－ＣＨ_２－を示し、Ａは置換され若しくは置換されないＣ６～Ｃ２０のアリール基を示し、
前記Ｘ、Ｚ及びＡが夫々独立に、置換された基を示す場合、置換基は、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロ基、アリール基、ヘテロアリール基から選ばれた１つ又は複数である、
ヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項2】

前記組換えヒトインターロイキン－２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるタンパク質又はその機能活性断片であり、
好ましくは、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２における、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対応するＰ３４位、Ｋ３５位、Ｔ３７位、Ｒ３８位、Ｌ４０位、Ｔ４１位、Ｆ４２位、Ｋ４３位、Ｆ４４位、Ｙ４５位、Ｅ６１位、Ｅ６２位、Ｋ６４位、Ｐ６５位、Ｅ６７位、Ｅ６８位、Ｎ７１位、Ｌ７２位、Ｙ１０７位から選ばれた１つ又は複数の部位である、
請求項１に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項3】

前記置換基は、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ基、Ｃ６～Ｃ２０アリール基、Ｃ４～Ｃ１０ヘテロアリール基から選ばれた１つ又は複数であり、
好ましくは、前記Ｘ及びＺは夫々独立にＣ０～Ｃ１０の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を示し、好ましくはＣ０～Ｃ６の直鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ_２－は任意的に－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－から選ばれた１つ又は複数に置換可能であり、より好ましくは、前記ＸとＺは同時にＣ０アルキレン基ではなく、及び／又は、
前記Ａは置換され若しくは置換されないＣ６～Ｃ１０のアリール基を示し、より好ましくは、前記Ａは置換され若しくは置換されないフェニル基又はナフチル基を示す、
請求項１又は２に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項4】

前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－１）で表される構造を有する化合物であり、

【化2】

式中、前記Ｘ、Ｚ及びＡは夫々独立に請求項１で定義されたものであり、
好ましくは、前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－２）で表される構造を有する化合物であり、

【化3】

式中、前記Ｘは請求項１で定義されたものであり、
Ｒ_１、Ｒ_２は夫々独立に、水素、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ基、Ｃ６～Ｃ２０アリール基、又はＣ４～Ｃ１０ヘテロアリール基を示す、
請求項１に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項5】

前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－３）、式（Ｉ－４）、式（Ｉ－５）又は式（Ｉ－６）で表される構造を有する化合物であり、

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

式中、Ｘ’はＣ０～Ｃ６の直鎖アルキレン基を示し、好ましくはＣ０～Ｃ４の直鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ_２－は任意的に－Ｏ－及び／又は－ＮＨ－に置換可能であり、
前記Ｒ_１、Ｒ_２は夫々独立に請求項４で定義されたものである、
請求項４に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項6】

前記非天然アミノ酸は、下記の何れか１つで表される構造を有する化合物であり、

【化8】

請求項５に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項7】

前記ヒドロキシルアミン末端基含有ＰＥＧの分子量は、２０～５０ ＫＤである、
請求項１に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項8】

前記少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する組換えヒトインターロイキン－２は、コドン拡張技術または化学合成法によって製造されたものである、
請求項１に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項9】

前記コドン拡張技術は、大腸菌中で実現されたものである、
請求項８に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲート。

【請求項10】

請求項１に記載のヒトインターロイキン－２とポリエチレングリコールのコンジュゲートの、免疫促進用薬物、固形腫瘍及び血液腫瘍の予防及び／又は治療用薬物、及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖用薬物の製造における使用であって、
好ましくは、前記固形腫瘍は、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌であり、
好ましくは、前記血液腫瘍は、慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、高悪性度Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞幼リンパ球白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、又はリンパ腫様肉芽腫瘍である、使用。

【国際調査報告】