(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-14
(54)【発明の名称】ＨＬＡ融合タンパク質を含む併用医薬
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20240806BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240806BHJP
C07K 14/74 20060101ALI20240806BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240806BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240806BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240806BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240806BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240806BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 Z
C07K19/00 ZNA
C07K14/74
C07K14/705
C07K16/28
A61K45/00
A61P35/00
A61P35/02
A61K38/17
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024507945
(86)(22)【出願日】2022-08-05
(85)【翻訳文提出日】2024-04-02
(86)【国際出願番号】 EP2022072133
(87)【国際公開番号】W WO2023012350
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】21190003.0
(32)【優先日】2021-08-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524048807
【氏名又は名称】イムノス セラピューティクス アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(74)【代理人】
【識別番号】100181906
【弁理士】
【氏名又は名称】河村 一乃
(72)【発明者】
【氏名】マロカン ベラウンザラン，オシリス
(72)【発明者】
【氏名】ガランディ，マルコ
(72)【発明者】
【氏名】ラフィエイ，アナヒタ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA02
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA41
4C084CA26
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZC411
4C084ZC412
4C085AA03
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC03
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA75
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、（ヒト白血球抗原）可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチドと、ＣＤ４７及びシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）の間の相互作用の阻害剤とを含む、がんの治療に使用するための併用薬に関する。本発明のさらなる態様は、本発明に係る可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチドを用いた治療を受けている患者に使用するための、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下を含む併用医薬：ａ．可溶性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチド、
特にＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、以下から選択される：
○ ＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン；又は
○ ＨＬＡ重鎖の前記細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、ＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインに対して少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及びそれぞれのＨＬＡ重鎖に対して類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体；及び
ｂ．ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【請求項2】
ＨＬＡ重鎖ポリペプチドが、以下を含むＨＬＡ融合タンパク質を含み、特にそれからなる、請求項１に記載の併用医薬：・ 以下から選択されるＨＬＡ重鎖ドメイン：
○ ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン、特にＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖；又は
○ ＨＬＡ重鎖の前記細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及びそれぞれのＨＬＡ重鎖に対して類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体；及び
・ 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド。
【請求項3】
ＨＬＡ重鎖ポリペプチドが、β２ｍポリペプチドと会合している、請求項１又は２に記載の併用医薬。
【請求項4】
ＨＬＡ重鎖ポリペプチドが、３：５～７：５の比、より特に４：５～６：５の比、より特に１：１の比で、β２ｍポリペプチドと非共有結合的に会合している、請求項３に記載の併用医薬。
【請求項5】
ＨＬＡ重鎖ポリペプチド、又はＨＬＡ重鎖ドメインが、ＨＬＡ－Ｂ５７の細胞外ドメインの変異体であり、及びＨＬＡ－Ｂ５７の細胞外ドメインの変異体は、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とする、
請求項１～４のいずれか１項に記載の併用医薬。
【請求項6】
ＨＬＡ重鎖ポリペプチド又はＨＬＡ重鎖ドメインは、配列番号００１の配列を含む、又は本質的にそれからなる、請求項１～５のいずれか１項に記載の併用医薬。
【請求項7】
ＨＬＡ融合タンパク質は、ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、より特に配列番号００２の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドを含み；及びペプチドリンカーはＨＬＡ重鎖ドメインをＩｇＧ Ｆｃポリペプチドへ連結する、特にペプチドリンカーは５～２０アミノ酸長である、より特にペプチドリンカーは配列番号００３の配列を有する、
請求項２～６のいずれか１項に記載の併用医薬。
【請求項8】
ＨＬＡ重鎖ドメインがＩｇ Ｆｃポリペプチドに対してＮ末端に位置する、請求項２～７のいずれか１項に記載の併用医薬。
【請求項9】
ＨＬＡ融合タンパク質が、配列番号００５と指定される配列を含む、請求項２～８のいずれか１項に記載の併用医薬。
【請求項10】
ＨＬＡ融合タンパク質が、分泌シグナルを含み、特に分泌シグナルは１６～３０アミノ酸長であり、より特に分泌シグナルは細胞から分泌される過程で切断によって除去される、なおより特に分泌シグナルは配列番号００４の配列を有する、請求項２～９のいずれか１項に記載の併用医薬。
【請求項11】
ＨＬＡ融合タンパク質は、二量体の形態であり、前記二量体は、第１のＨＬＡ単量体及び第２のＨＬＡ単量体を含む、又は本質的にそれからなる；－ 第１のＨＬＡ単量体は、請求項２～１０のいずれか１項に規定される第１のＨＬＡ融合タンパク質及び第１のβ２ｍポリペプチドから本質的になる；及び
－ 第２のＨＬＡ単量体は、請求項２～１０のいずれか１項に規定される第２のＨＬＡ融合タンパク質及び第２のβ２ｍポリペプチドから本質的になる；
特に、第１のＨＬＡ単量体及び第２のＨＬＡ単量体が同一である、
請求項２～１０のいずれか１項に記載の併用医薬。
【請求項12】
ＨＬＡ重鎖ポリペプチドが、ペプチドエピトープと会合していない、請求項１～１１のいずれか１項に記載の併用医薬。
【請求項13】
がんの治療に用いるためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤であって、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、請求項１～１２のいずれか１項に規定される可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチドに先だって、それと組み合わせて、又はそれに続いて投与され、特に可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、請求項２～１２のいずれか１項に規定されるＨＬＡ融合タンパク質として存在する、前記阻害剤。
【請求項14】
前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、１０－７Ｍ又はそれより低い解離定数（より高度な親和性）でＣＤ４７又はＳＩＲＰαに結合する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の併用医薬、又は請求項１３に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【請求項15】
前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、抗体、抗体断片又は抗体様分子を含む、又は本質的にそれである；特に抗体はＨｕ５Ｆ９－Ｇ４、ＴＩ－０６１、ＩＢＩ１８８、ＣＣ－９０００２、ｌｅｍｚｏｐａｒｌｉｍａｐ／ＴＪＣ４、ＳＬ－１７２１５４、ＩＭＣ－００２、ＧＳ－０１８９、ＡＤＵ１８０５からなる群から選択される、請求項１～１２及び１４のいずれか１項に記載の併用医薬、又は請求項１３又は１４に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【請求項16】
ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、融合タンパク質を含む、又はそれからなり、前記融合タンパク質は以下を含む：－ ＳＩＲＰαポリペプチド細胞外ドメイン；及び
－ Ｉｇ ｆｃドメイン；
特に、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、ＡＬＸ１４８、ＴＴＩ－６２２又はＴＴＩ－６２１から選択される、
請求項１～１２、１４及び１５のいずれか１項に記載の併用医薬、又は請求項１３～１５のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【請求項17】
がんの治療に使用するための請求項１～１６のいずれか１項に記載の併用医薬。
【請求項18】
がんは固形がん、特にがん腫である、請求項１７に記載の使用のための併用医薬、又は請求項１３～１６のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【請求項19】
がんは液状がん、特に白血病、リンパ腫又は骨髄腫である、請求項１７に記載の使用のための併用医薬、又は請求項１３～１６のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【請求項20】
前記可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチド、又は前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、全身投与に適した剤形で提供される、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬、又は請求項１３～１６、１８及び１９のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【請求項21】
がんは固形腫瘍、特に乳がん、より特に乳管細胞がんの一形態である、請求項１７及び１８のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬、又は請求項１３～１６、１８及び２０のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、２０２１年８月５日出願の欧州特許出願第２１１９０００３．０の優先権を主張するものであり、この全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、がん（本明細書では悪性新生物性疾患ともいう。）と診断された患者に使用する併用医薬（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）に関する。本発明に係る併用医薬は、可溶性ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）重鎖ポリペプチドと、ＣＤ４７及びシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）の間の相互作用の阻害剤とを含む。
【背景技術】
【0003】
腫瘍微小環境には多数のマクロファージが存在し、腫瘍塊の５０％を占めることもある。重要なのは、マクロファージが免疫監視を行うことである。したがって、自然免疫と腫瘍関連マクロファージとの両方が、自然免疫療法の標的として徐々に注目されるようになっている。しかし、腫瘍とマクロファージとの間には複雑な関係性があり、場合によっては実際に腫瘍の増殖又は転移を促進することがある。
【0004】
マクロファージの二重の役割は、その大きな不均一性及び可塑性に由来することが示された。マクロファージは、１型又は古典的に活性化されたもの（Ｍ１）、及び２型又は代替的に活性化されたもの（Ｍ２）という２つの広範な群に大別され得る。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、Ｍ１細胞は炎症性表現型を特徴とし、殺微生物活性を示し、腫瘍抑制をもたらすが、Ｍ２マクロファージは組織修復、マトリックスリモデリング及び血管新生支援腫瘍形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）を促進し得る。マクロファージの表現型が異なれば、貪食活性も異なる。がんの文脈では、マクロファージは、腫瘍細胞上の膜分子を素早く検出し、標的細胞と食細胞との間のレセプター－リガンド相互作用によって制御される、標的細胞の認識、細胞の飲み込み（ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ）及びリソソーム消化を含む多段階の細胞プロセスである貪食（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を通じて、腫瘍細胞を飲み込むことができる。がん細胞に存在する複数の抗貪食シグナルが同定されており、その中にはＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２が含まれる。白血球Ｉｇ様レセプターサブファミリーＢ（ＬＩＬＲＢ）は、リガンドと結合する細胞外Ｉｇ様ドメイン、及びチロシンホスファターゼＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、及びイノシトールホスファターゼＳＨＩＰをリクルートできる細胞内ＩＴＩＭを有するＩ型膜貫通糖タンパク質の群である。
【0005】
マクロファージはＬＩＬＲＢ１レセプター及びＬＩＬＲＢ２レセプターの両方を発現し、これらのレセプターの活性化は腫瘍微小環境におけるマクロファージの活性を下方制御する。免疫細胞におけるＬＩＬＲＢ１遮断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いて固形がん及び液状がんに有効であることが実証されている。例えば、ＬＩＬＲＢ１シグナリングは、単球の活性化及びマクロファージの貪食を阻害することができる（Ｃｏｌｏｎｎａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６（１）：１８０９）。ＬＩＬＲＢ２の遮断は、ＴＡＭを炎症性表現型に再プログラムし、Ｔ制御細胞の浸潤を抑制し、及び免疫チェックポイント阻害剤の有効性を促進する。さらに、ＬＩＬＲＢ２の遮断は、ＳＨＰ－１／ＳＨＰ－２のレセプター媒介活性化を阻害し、炎症性応答を増強する（Ａｌｓｉｎａ－Ｂｅａｕｃｈａｍｐ Ｄ．ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２８（１２）：５６４７）。
【0006】
ＩｍｍｕｎＯｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社は、ＬＩＬＲＢ１レセプター、ＬＩＬＲＢ２レセプター及びＫＩＲ３ＤＬ１レセプターに結合するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖に基づく分子を開発している（例えば、ＷＯ２０１７１５３４３８Ａ１参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記の技術水準に基づいて、本発明の目的は、治療用ＨＬＡ重鎖に基づく分子の抗腫瘍効果を増強する手段及び方法を提供することにある。本目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成され、本明細書の従属請求項、実施例、図及び一般的説明に記載されたさらに有利な実施形態を伴う。
【課題を解決するための手段】
【0008】
発明の概要
阻害性ＣＤ４７の相互作用は、ＳＩＲＰαと結合して貪食を阻害する。ＣＤ４７又はＳＩＲＰαのいずれかに結合するチェックポイント阻害剤の標的となることで、免疫成績が向上する可能性がある。ＬＩＬＲＢ１／２免疫チェックポイント阻害剤をブロックするＨＬＡクラスＩ重鎖融合タンパク質は、本発明者らによって以前に開発されたもので、貪食チェックポイントを調節する能力を共有する。本発明者らは、ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を阻害する薬剤が、腫瘍細胞のマクロファージ貪食に対するＨＬＡ融合タンパク質の炎症促進効果を増強できるかどうかを評価する実験を計画した（図１）。この結果は、ＨＬＡ融合タンパク質候補であるｉｏｓＨ２が、単剤でも、特に抗ＣＤ４７抗体及び抗ＳＩＲＰα抗体との併用でも、固形がん及び液状がんに対するヒトプライマリーマクロファージの貪食活性を高めることを示している。
阻害性ＣＤ４７の相互作用は、ＳＩＲＰαと結合して貪食を阻害する。ＣＤ４７又はＳＩＲＰαのいずれかに結合するチェックポイント阻害剤の標的となることで、免疫成績が向上する可能性がある。ＬＩＬＲＢ１／２免疫チェックポイント阻害剤をブロックするＨＬＡクラスＩ重鎖融合タンパク質は、本発明者らによって以前に開発されたもので、貪食チェックポイントを調節する能力を共有する。本発明者らは、ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を阻害する薬剤が、腫瘍細胞のマクロファージ貪食に対するＨＬＡ融合タンパク質の炎症促進効果を増強できるかどうかを評価する実験を計画した（図１）。この結果は、ＨＬＡ融合タンパク質候補であるｉｏｓＨ２が、単剤でも、特に抗ＣＤ４７抗体及び抗ＳＩＲＰα抗体との併用でも、固形がん及び液状がんに対するヒトプライマリーマクロファージの貪食活性を高めることを示している。
【0009】
本発明の第１の態様は併用医薬に関し、前記併用は以下を含む：
１．可溶性ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ重鎖ポリペプチドであって、任意に、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性を向上させるポリペプチド部分との融合により安定化されたポリペプチド；及び
２．ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
１．可溶性ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ重鎖ポリペプチドであって、任意に、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性を向上させるポリペプチド部分との融合により安定化されたポリペプチド；及び
２．ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【0010】
特定の実施形態において、可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、免疫グロブリン結晶化可能性断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチドに接続したＨＬＡ重鎖ポリペプチド（ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン）を含むＨＬＡ融合タンパク質として提供される。併用医薬のより特定の実施形態において、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択される。他の特定の実施形態において、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、上記で定義されるＨＬＡ重鎖と配列が類似し、類似の生物学的活性を有する、少なくとも（≧）９５％の変異体である。
【0011】
ある特定の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質はベータ－２－ミクログロブリン（β２ｍ）ポリペプチドと会合される。
【0012】
別の態様は、がん、特に固形腫瘍（悪性腫瘍性疾患）の治療における本発明に係る併用医薬の使用に関する。
【0013】
本発明の別の態様は、本明細書において悪性新生物疾患ともよばれるがんの治療において使用するための、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤に関し、それは、本明細書において特定されるように、可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチド、任意に増強されたｉｎ ｖｉｖｏ安定性を付与するポリペプチド部分との融合によって安定化されるもの、特にＨＬＡ融合タンパク質、に先行して、それと組み合わせて、又はそれに続いて投与される。
【0014】
本発明のさらに別の態様は、本明細書で特定されるＣＤ４７及びＳＩＲＰαとの間の相互作用の阻害剤の前に、それと組み合わせて、又はそれの後に投与される場合、がん、特に固形がん（悪性新生物疾患）の治療に使用するための可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチド、任意に、増強されたｉｎ ｖｉｖｏ安定性を付与するポリペプチド部分との融合により安定化されたものに関する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１（Ａ）は、マクロファージ上のＳＩＲＰαとＬＩＬＲＢ２との相互作用が、腫瘍細胞上の天然リガンドとどのように関与し、免疫抑制シグナルをもたらすかを示す。図１（Ｂ）は、ＨＬＡ融合タンパク質候補であるｉｏｓＨ２を用いてＬＩＬＲＢ１／２をブロックすることで、マクロファージによるがん細胞殺傷のブレーキを解除することが、抗体又は天然リガンドを用いてＳＩＲＰα／ＣＤ４７軸を遮断することと組み合わされ、殺腫瘍活性を高めることができるかどうかを検証する実験デザインの概要を示す。
【図2AB】図２は、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）ＩｇＧ４融合タンパク質の優れた細胞生存率及びＨＬＡ融合タンパク質の発現特性を示す。細胞生存率（Ａ）及び発現タンパク質力価（Ｂ）に基づく、ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ（ＤＧＣ８－Ｔ３９、ＤＧＣ８－Ｔ６４及びＤＧＣ８－７３）及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（ＤＧＣ８－Ｔ５４、ＤＧＣ８－Ｔ７５及びＤＧＣ８－９１）をトランスフェクトしたクローンからの融合タンパク質発現。
【図3】図３は、ＥＬＩＳＡで測定した、ＬＩＬＲＢ２と、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７又はＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質、及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍとの結合親和性の定量的推定を示す。β２ｍフリーのＨＬＡ－Ｂ５７のＥＣ５０は２１ｎＭであり、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）のＥＣ５０は８．３ｎＭであり、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍのＥＣ５０は５．７２ｎＭであり、アミノ酸置換がＨＬＡ－Ｂ５７重鎖のＬＩＬＲＢ２への結合を低下させないことを示している。
【図4A】図４は、（Ａ）ＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫細胞を用いた液状がん、及び（Ｂ）ＢＴ４７４乳がん細胞を用いた固形がんについての、抗ＳＩＲＰα抗体又は抗ＣＤ４７抗体と組み合わせたＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（ｉｏｓＨ２）を用いた貪食作用の増加を示す。固形腫瘍及び液状腫瘍由来のがん細胞株をヒトプライマリーマクロファージと共培養し、ＩｎｃｕＣｙｔｅライブセルイメージングシステム内で３６時間貪食を測定した。生物学的に独立した少なくとも２つのサンプルを用いて実験を繰り返した。ＩｇＧ１ １０ｕｇ／ｍｌ、ＩｇＧ４ ２０ｕｇ／ｍｌ、ｉｏｓＨ２ ２０ｕｇ／ｍｌ、抗ＣＤ４７抗体 １０ｕｇ／ｍｌ、ＭＫ４８３０ １０ｕｇ／ｍｌ、抗ＳＩＲＰα抗体 １０ｕｇ／ｍｌ。エラーバーは、それぞれ２回の技術的繰り返しを含む、ｎ＝２の生物学的繰り返しのＳＥＭ。統計解析は二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを用い、その後Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック分析を行った、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図4B】図４は、（Ａ）ＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫細胞を用いた液状がん、及び（Ｂ）ＢＴ４７４乳がん細胞を用いた固形がんについての、抗ＳＩＲＰα抗体又は抗ＣＤ４７抗体と組み合わせたＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（ｉｏｓＨ２）を用いた貪食作用の増加を示す。固形腫瘍及び液状腫瘍由来のがん細胞株をヒトプライマリーマクロファージと共培養し、ＩｎｃｕＣｙｔｅライブセルイメージングシステム内で３６時間貪食を測定した。生物学的に独立した少なくとも２つのサンプルを用いて実験を繰り返した。ＩｇＧ１ １０ｕｇ／ｍｌ、ＩｇＧ４ ２０ｕｇ／ｍｌ、ｉｏｓＨ２ ２０ｕｇ／ｍｌ、抗ＣＤ４７抗体 １０ｕｇ／ｍｌ、ＭＫ４８３０ １０ｕｇ／ｍｌ、抗ＳＩＲＰα抗体 １０ｕｇ／ｍｌ。エラーバーは、それぞれ２回の技術的繰り返しを含む、ｎ＝２の生物学的繰り返しのＳＥＭ。統計解析は二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを用い、その後Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック分析を行った、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【0016】
用語及び定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた同様である。以下に定める定義が、参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合は、ここに定める定義が優先されるものとする。
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた同様である。以下に定める定義が、参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合は、ここに定める定義が優先されるものとする。
【0017】
本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び他の同様の形態、並びにそれらの文法的に同等な用語は、意味において同等であること、及びこれらの単語のいずれか１つに続く１つ又は複数の項目が、係る１つ又は複数の項目を網羅的にリストするものではない、又はリストした１つ又は複数の項目のみに限定するものではないことにおいてオープンエンドとすることを意図している。例えば、成分Ａ、Ｂ及びＣを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」品目は、成分Ａ、Ｂ及びＣからなる（すなわち、成分Ａ、Ｂ及びＣのみを含有する）こともできるし、又は成分Ａ、Ｂ及びＣのみならず、１つ又は複数の他の成分を含むこともできる。このように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及びその類似の形態、並びにその文法的同等な用語は、「本質的にそれからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「それからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の実施形態の開示を含むことが意図及び理解される。
【0018】
値の範囲が提供されている場合、文脈上明らかにそうでないと指示されない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載の範囲内の他の記載の値若しくは介在値は、記載の範囲の具体的に除外される制限を受けて本開示内に包含されると理解される。記載の範囲に限界値の一方又は両方が含まれる場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除いた範囲もまた開示に含まれる。
【0019】
本明細書において、値又はパラメータの「約（ａｂｏｕｔ）」という言及は、その値又はパラメータそれ自体に向けられる変動を含む（及び記述する）。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）Ｘ」と言及する記述には、「Ｘ」という記述も含まれる。
【0020】
添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用されるとおり、単数形「ａ」、「ｏｒ（又は）」、「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の参照語を含む。
【0021】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。標準的な手法が、分子学的、遺伝学的及び生化学的手法（一般に以下を参照。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第４編（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）第５編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）及び化学的手法に用いられる。
【0022】
本明細書の文脈における「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸がペプチド結合によって接続されている直鎖を形成する５０以上のアミノ酸からなる分子を指す。ポリペプチドのアミノ酸配列は、（生理学的に見出される）タンパク質全体又はその断片のアミノ酸配列を表すこともある。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、タンパク質及びその断片を含む。ポリペプチドは、アミノ酸残基配列として本明細書に開示される。
【0023】
アミノ酸残基の配列はアミノ末端からカルボキシル末端へ記載される。配列位置の大文字は、１文字コードのＬ－アミノ酸を指す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３編．ｐ．２１）。アミノ酸配列の位置を示す小文字は、対応するＤ－又は（２Ｒ）－アミノ酸を意味する。配列はアミノ末端からカルボキシ末端に向かって左から右に記載される。標準的な命名法に従い、アミノ酸残基の配列は、以下のように３文字又は１文字のコードのいずれかで表記される。アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
【0024】
「遺伝子発現」又は「発現」という用語、或いは「遺伝子産物」という用語は、核酸（ＲＮＡ）の生成又はペプチド若しくはポリペプチドの生成のプロセス－及びその産物－のいずれか、又は両方を指す場合があり、それぞれ転写及び翻訳ともよばれ、又は遺伝情報の処理を調節してポリペプチド産物をもたらす中間プロセスのいずれかを指す。「遺伝子発現」という用語はまた、ＲＮＡ遺伝子産物、例えば調節ＲＮＡ又は構造的（例えば、リボソーム）ＲＮＡの転写及びプロセシングにも適用される。発現ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。発現は、転写及び翻訳、すなわち、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物の両方のレベルで評価することができる。
【0025】
本明細書の文脈において、「配列同一性」、「配列類似性」及び「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、整列される２つのポリペプチド配列を位置ごとに比較することによって決定される配列比較の結果を表す１つの定量的パラメータを指す。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及び Ｗｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）、又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装により実施することができ、これらに限定されるものではないが、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含む。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）などで公開されている。
【0026】
アミノ酸配列の比較の一例として、デフォルト設定を使用するＢＬＡＳＴＰアルゴリズムがある：期待閾値：３；ワードサイズ：３；クエリ範囲内の最大マッチ： ０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１，Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；組成調整：条件付き組成スコアマトリックス調整（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）。他に記載がない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、ＢＬＡＳＴ一連のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を用いて、タンパク質について上記で特定されるデフォルトパラメータを使用して得られる値を指す。
【0027】
パーセンテージを指定しない同一配列への言及は、１００％同一配列（すなわち同じ配列）の意味を含む。
【0028】
本明細書で使用されるとおり、医薬組成物という用語は、可溶性ＨＬＡ重鎖、特にＨＬＡ融合タンパク質、及び又はＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体とともに指す。特定の実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、非経口投与、特に注射投与に適した形態で提供される。
【0029】
本明細書で使用されるとおり、「薬学的に許容される担体」という用語は、当業者に知られているように、任意の溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香料、色素など、及びその組み合わせを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ＩＳＢＮ ０８５７１１０６２４を参照）。
【0030】
本明細書で使用されるとおり、任意の疾患又は障害（例えば、がん）の「治療する」又は「治療」という用語は、一実施形態では、疾患又は障害を緩和すること（例えば、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発症を遅らせるか、阻止するか、又は軽減すること、例えば、腫瘍成長を遅らせること、又は減少すること）を指す。別の実施形態では、「治療する」又は「治療」とは、患者が識別できない可能性のあるものも含めて、少なくとも１つの身体的パラメータを緩和又は改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療する」又は「治療」とは、身体的（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的（例えば、身体的パラメーターの安定化）、又はその両方のいずれかで、疾患又は障害を調節することを指す。疾患の治療及び／又は予防を評価する方法は、以下の本明細書で特に説明しない限り、当技術分野で一般的に知られている。
【0031】
「がん」及び「悪性新生物疾患」という用語は、本明細書では同義に用いられる。本明細書に開示された態様及び実施形態のいずれかの特定の代替物は、固形腫瘍の治療における本発明の組み合わせの使用に向けられる。本明細書に開示される態様及び実施形態のいずれかの他の代替物は、骨髄性白血病又は顆粒球性白血病、特にＡＭＬ、リンパ性白血病、リンパ球性白血病、又はリンパ芽球性白血病及びリンパ腫、真性多血症又は赤血球減少症などの液体がんの治療における本発明の組み合わせの使用に向けられる。
【0032】
本明細書の文脈において、「ペプチドリンカー」又は「アミノ酸リンカー」という用語は、一本鎖のポリペプチドを生成するために２つのポリペプチドを接続するために使用される可変長のポリペプチドを意味する。本明細書で規定する本発明の実施に有用なリンカーの例示的な実施形態は、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０又は５０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド鎖である。アミノ酸リンカーの非限定的な例は、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドを安定化ペプチドと連結するポリペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号００３）であり、例えば、ＨＬＡ融合タンパク質においてＨＬＡ－Ｂ５７とＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドとを連結する。
【0033】
本明細書の文脈において、「ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖」、「ＨＬＡ重鎖」という用語は、ＭＨＣクラスＩ組織適合抗原遺伝子によってコードされるタンパク質、特に古典的な、ＭＨＣクラス１ａ重鎖に関する。ヒトでは、ＨＬＡ重鎖は単量体であるか、又はβ２ｍ軽鎖と非共有結合した３つの細胞外ドメイン（α１、α２及びα３）を有する重鎖を含む二量体構造の一部を形成するか、又は任意に、ペプチド結合クレフト（ｃｌｅｆｔ）に低分子ペプチドが結合した三量体構造を形成する。全長ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、α１、α２、及びα３ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。
【0034】
本発明のこの態様に係る用語の実施形態と考えられる天然に存在するＨＬＡ重鎖のリストを表１に示す。
表１：ＨＬＡ重鎖アレルのリスト
表１：ＨＬＡ重鎖アレルのリスト
【0035】
【表1】
【0036】
本明細書の文脈における「変異体」という用語は、天然に存在するポリペプチド配列とは異なる少なくとも１つのアミノ酸残基を有するＨＬＡ重鎖ポリペプチド配列に関する。例えば、変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、由来する本来の天然に存在するＨＬＡ重鎖ポリペプチド配列とは異なるように、１個又は複数個のアミノ酸置換が導入されている。変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、由来するＨＬＡ重鎖の整列した天然に存在する細胞外ドメインと比較して、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性を特徴とする。加えて、変化したアミノ酸は、変異型ＨＬＡ重鎖がそのリガンドと相互作用する能力を阻害しないので、変異型は、それが由来する本来の配列と同様の生物学的活性を有する。
【0037】
変異型ＨＬＡ重鎖ペプチドの生物学的活性は、本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質への組み込みの文脈において、特にリガンドＬＩＬＲＢ２への結合能を測定することによって、評価することができる。変異体の同様の生物学的活性とは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法で測定した、ＨＬＡ融合タンパク質に使用される変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチドのＬＩＬＲＢ２への結合能力が、同等の非変異体配列と比較して、少なくとも６５％、特に８５％、又は９５％であることと定義される。これはＥＣ５０を計算することによって評価することができる。すなわち、半最大応答を与える融合タンパク質の濃度であり、この場合はビオチン化ＬＩＬＲＢ２分子への最大結合の半分である。例えば、実施例（図３）で評価した変異型ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖－ＩｇＧ４融合タンパク質については、同等の非変異型野生型ＨＬＡ－Ｂ５７に基づく構造は、ＬＩＬＲＢ２結合のＥＣ５０が約２１ｎＭ（ナノモル／Ｌ）である。したがって、ＥＬＩＳＡによって測定される、生物学的機能が約６５％である適切な変異体のＥＣ５０の閾値は約３２ｎＭであり、８５％のものは約２９ｎＭであり、９５％のものは約２２ｎＭである。
【0038】
本発明に係るＬＩＬＲＢ２結合のＥＣ５０を決定するために、ストレプトアビジンでコーティングした高結合能９６ウェルプレートに、ＰＢＳバッファー中で最終濃度が５μｇ／ｍｌであるｃ末端ビオチン化ＬＩＬＲＢ２（例えば、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１００３３５から入手）５０μｌでコーティングする。陰性コントロールとしてＰＢＳ及びＩｇＧアイソタイプを使用することができる。ＨＬＡ融合タンパク質の連続希釈を漸増連続で行う（例えば、８つの濃度ポイント：１０、２．５、１、０．２５、０．１、０．０２５、０．０１、０．００２５μｇ／ｍｌ）、好ましくは５０μｌの繰り返し（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で適用する。次いで、融合タンパク質を検出できる標識抗体（例えば、融合タンパク質がＩｇＧ Ｆｃを含む場合、ＡＰＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－１３５－０９８、ＴＢＳ ５０μｌ中１：１００希釈）を適用して、ＨＬＡ融合タンパク質結合を検出することができる。最後に、５０μｌのＴＢＳを各ウェルに加え、適切な波長で蛍光励起及び蛍光発光（例えば、それぞれ６５０ｎｍ及び６６０ｎｍ）を測定する。ＬＩＬＲＢ２に結合するＨＬＡ融合タンパク質のＥＣ５０を決定するには、３つのパラメータに基づくｌｏｇ（アゴニスト）モデルが一つの適切な手段である。
【0039】
本明細書においてＨＬＡ重鎖、又はＨＬＡ重鎖の変異体に適用される「細胞外ドメイン」という用語は、ＨＬＡ重鎖タンパク質（又は天然に存在するＨＬＡ重鎖タンパク質配列にアミノ酸置換が導入されている変異タンパク質）の細胞外部分を指す。ＨＬＡクラス１ａポリペプチドの細胞外部分は、アルファ（α）１ドメイン、及びα２ドメイン、及びα３ドメインを含み、これらは、本発明に係る使用のための医薬組成物中のＨＬＡ融合タンパク質の免疫調節効果を媒介するレセプターリガンド相互作用に必須である。細胞外ドメインは膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを除く。
【0040】
本明細書の文脈において、「ＨＬＡ融合タンパク質」という用語は、ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインを、安定化ドメインと、特に安定化免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃと、任意にペプチドリンカーによって、結合してなる組換えポリペプチドを指す。本発明の文脈において使用するための特定の融合タンパク質は、ＷＯ２０１６／１２４６６１Ａ１として公開されたＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５２３１７；ＷＯ２０１７／１５３４３８Ａ１として公開されたＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５５３７３；及びＷＯ２０１８／０２９２８４Ａ１として公開されたＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７０２５５に開示されており、これらはすべて、参照により本明細書に包含される。「ＨＬＡ融合タンパク質」という用語は、哺乳動物細胞培養から分泌されるβ２－ミクログロブリンポリペプチドと複合体化したＨＬＡ融合タンパク質、及びβ２－ミクログロブリンと会合していない精製ＨＬＡ融合タンパク質を包含する。「ＨＬＡ融合タンパク質」という用語は、単一の安定化免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインに結合した単一のＨＬＡポリペプチドを含む単量体、又は第１のＨＬＡ融合タンパク質単量体、及び第２のＨＬＡ融合タンパク質単量体の、特に安定化ＩｇＦｃドメインを介して結合される、会合によって形成される二量体を指し得る。
【0041】
本明細書の文脈において、「β２－ミクログロブリン（β２ｍ、Ｂ２ｍ、Ｂ２Ｍ）」、「Ｂ２ｍポリペプチド」、又は「β２ｍポリペプチド」という用語は、ＭＨＣクラスＩヘテロダイマーのベータ（β）鎖を指し、ＨＬＡ軽鎖としても知られる。「β２－ミクログロブリン」という用語は、まず、分泌シグナル、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ６１７６９の配列、又は配列番号００６の配列を含む処理前のβ２－ミクログロブリン、特に、分泌プロセス中の切断によってタンパク質の分泌シグナル部分が除去されている、タンパク質の分泌後形態を包含する。
【0042】
本明細書の文脈において、「分泌シグナル」、「分泌シグナルペプチド」又は「シグナル配列」という用語は、ポリペプチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を開始するＮ末端リーダー配列を指し、通常、約６～３０アミノ酸長である。まれに、分泌シグナルがポリペプチドのＣ末端に配置されることがある。分泌シグナルは、標的化シグナル、局在化シグナル、トランジットペプチド、リーダー配列、又はリーダーペプチドとよばれることもある。細胞からのポリペプチドの効率的な分泌を可能にする分泌シグナルは当技術分野でよく知られており、細胞に基づくポリペプチド製造システムにおいてポリペプチドの上清への排出を促進し、細胞上清からポリペプチドを精製できるようにするために、組換えタンパク質のＯＲＦに含めることができる。分泌シグナルをコードするｍＲＮＡが翻訳されると、ｍＲＮＡ－リボソーム複合体の小胞体（ＥＲ）内のチャネルタンパク質への移行を媒介する細胞質タンパク質によって認識される。分泌シグナルペプチドを含む新しく合成されたポリペプチドは、チャネルタンパク質を介して小胞体内腔に移行し、細胞の分泌経路に入る。本発明に係る特有の使用のシグナル配列は、例えば、配列番号００４のように、翻訳後に最終ポリペプチド産物から切断されるものである。
【0043】
結合；結合剤 リガンド 抗体：
本発明の文脈における「特異的結合」という用語は、リガンドの特性を指し、リガンドは、ある親和性及び標的特異性でその標的に結合するものである。このようなリガンドの親和性は、リガンドの解離定数によって示される。特異的反応性リガンドは、標的との結合時の解離定数が≦１０－７ｍｏｌ／Ｌであるが、標的と化学組成がほぼ同じであるが立体構造が異なる分子との相互作用では、少なくとも３桁高い解離定数を有する。
本発明の文脈における「特異的結合」という用語は、リガンドの特性を指し、リガンドは、ある親和性及び標的特異性でその標的に結合するものである。このようなリガンドの親和性は、リガンドの解離定数によって示される。特異的反応性リガンドは、標的との結合時の解離定数が≦１０－７ｍｏｌ／Ｌであるが、標的と化学組成がほぼ同じであるが立体構造が異なる分子との相互作用では、少なくとも３桁高い解離定数を有する。
【0044】
本明細書の文脈において、「解離定数（ＫＤ）」という用語は、化学及び物理の技術分野で知られている意味で使用される：［主に２つの］異なる成分からなる複合体が、可逆的にその（２つの）構成成分に解離する傾向を測定する、平衡定数を意味する。この複合体は、例えば、抗体Ａｂと抗原Ａｇからなる抗体抗原複合体ＡｂＡｇとすることができる。ＫＤは、モル濃度［ｍｏｌ／ｌ］で表され、［Ａｇ］の結合部位の半分が占有される［Ａｂ］の濃度に相当し、言い換えれば、未結合の［Ａｂ］の濃度が［ＡｂＡｇ］複合体の濃度と等しいことに相当する。解離定数は、以下の式により算出することができる：
【0045】
【数1】
【0046】
［Ａｂ］：抗体の濃度、［Ａｇ］：抗原の濃度、［ＡｂＡｇ］：抗体－抗原複合体の濃度
【0047】
本明細書の文脈において、「オフレート（解離速度）（Ｋｏｆｆ；［１／秒］）」及び「オンレート（結合速度）（Ｋｏｎ；［Ｌ／（秒＊ｍｏｌ］）」という用語は、化学及び物理の技術分野で知られている意味で使用される：これらは、抗体とその標的抗原との解離（Ｋｏｆｆ）又は会合（Ｋｏｎ）を測定する速度定数を指す。Ｋｏｆｆ及びＫｏｎは、当技術分野で十分に確立された方法を用いて実験的に決定することができる。抗体のＫｏｆｆとＫｏｎとを測定する方法には、表面プラズモン共鳴が採用される。これは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）又はＰｒｏｔｅＯｎ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムにおける原理となっている。これらはまた、以下の式を用いて解離定数ＫＤを求めるために使用することができる：
【0048】
【数2】
【0049】
オンレートＫｏｎの自然の上限は、１０９Ｌ／（秒＊ｍｏｌ）である。
【0050】
本明細書の文脈では、「抗体」という用語は、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）又はＭ型（ＩｇＭ）、その任意の抗原－結合断片又は単鎖、及び関連若しくは由来構築物を含むがこれに限定されない全抗体に関する。全抗体とは、ジスルフィド結合で相互に連結された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）及び２本の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。ＩｇＧの重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインで構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記）と軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬから構成されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分を含み、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。同様に、この用語は、いわゆるナノボディ又は単一のドメイン抗体、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を包含する。
【0051】
本明細書の文脈での「抗体様分子」という用語は、別の分子又は標的に高い親和性／Ｋｄ≦１０Ｅ－８ｍｏｌ／ｌで特異的に結合できる分子を指す。抗体様分子は、抗体の特異的な結合と同様にその標的に結合する。「抗体様分子」という用語には、リピートタンパク質を包含し、例えば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｚｕｒｉｃｈ）、高特異性及び高親和性の標的タンパク質結合を示す改変抗体模倣タンパク質（米国特許出願公開第２０１２１４２６１１、米国特許出願公開第２０１６２５０３４１、米国特許出願公開第２０１６０７５７６７及び米国特許出願公開第２０１５３６８３０２を参照。これらすべては参照により本書に組み込まれる）などがある。抗体様分子という用語は、さらに、アルマジロリピートタンパク質由来のポリペプチド、ロイシンリッチリピートタンパク質由来のポリペプチド、及びテトラトリコペプチドリピートタンパク質由来のポリペプチドを包含するが、これらに限定されない。抗体様分子という用語は、さらに、プロテインＡドメイン、フィブロネクチンドメインＦＮ３、コンセンサスフィブロネクチンドメイン、リポカリン（Ｓｋｅｒｒａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２０００，１４８２（１－２）：３３７－５０参照）、ジンクフィンガータンパク質由来のポリペプチド（Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２００３，１１（７）：８０３－８１３参照）、Ｓｒｃホモロジードメイン２（ＳＨ２）若しくはＳｒｃホモロジードメイン３（ＳＨ３）、ＰＤＺドメイン、ガンマクリスタリン、ユビキチン、システインノットポリペプチド若しくはノッティン、シスタチン、Ｓａｃ７ｄ、三重らせんコイルドコイル（アルファ体としても知られている）、クニッツドメイン若しくはクニッツ型プロテアーゼ阻害剤、及び糖結合モジュール３２－２に由来する、特異的結合性ポリペプチドを包含する。
【0052】
「プロテインＡドメイン由来ポリペプチド」という用語は、プロテインＡの誘導体であり、免疫グロブリンのＦｃ領域とＦａｂ領域とを特異的に結合することができる分子を指す。
【0053】
「アルマジロリピートタンパク質」という用語は、少なくとも１つのアルマジロリピートを含むポリペプチドを指し、アルマジロリピートは、ヘアピン構造を形成する一対のアルファヘリックスによって特徴付けられるものである。
【0054】
本明細書の文脈における「ヒト化ラクダ抗体」という用語は、重鎖又は重鎖の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）のみからなり、かつそのアミノ酸配列はヒトで自然に産生される抗体との類似性が増大するように改変され、その結果、ヒトに投与した場合に免疫原性の低下を示す抗体を指す。ラクダ抗体をヒト化するための一般的な戦略は、以下に示されている：Ｖｉｎｃｋｅら、「Ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｈｕｍａｎｉｚｅ ａ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｎａｎｏｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９年１月３０日；２８４（５）：３２７３－３２８４、及び米国特許出願公開第２０１１１６５６２１。
【0055】
本明細書の文脈において、「免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｆｃ）領域」又は「Ｉｇ Ｆｃ」という用語は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる抗体若しくは免疫グロブリン（Ｉｇ）の画分を指す。Ｉｇ Ｆｃは、単量体、又はジスルフィド結合によって共有結合した２つのＩｇ Ｆｃからなる二量体の両方を含む。本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質の文脈において、ジスルフィド結合は、それぞれがＩｇ Ｆｃドメインを含む２つのＨＬＡ融合タンパク質分子を結合し得る。ＨＬＡ融合タンパク質にＩｇ Ｆｃが存在することで、溶解度、安定性、アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）、半減期を向上し、技術的な観点からは、哺乳動物系でのコスト効率の良い生産及び精製（プロテインＡ又はＧ精製）が容易になる。
【0056】
本明細書の文脈において、「ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤」という用語は、食細胞の活性化を制限するＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の阻害性シグナル伝達カスケードを破壊することができる任意の薬剤を包含する。これには、ＣＤ４７又はＳＩＲＰαのいずれかに特異的に結合できる抗体、抗体断片及び抗体様分子が含まれる。また、ＣＤ４７又はＳＩＲＰαの細胞外リガンド結合ドメインを包含する可溶性組換えタンパク質も含まれる。
【0057】
「シグナル調節タンパク質アルファ」（ＳＩＲＰα、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ７８３２４）という用語は、ＣＤ４７（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０８７２２）の免疫グロブリン様表面レセプターを指す。ＣＤ４７及びＳＩＲＰαのライゲーションは貪食の負の制御を媒介する。
【0058】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は併用医薬に関し、特にがんの治療に使用するための併用医薬に関する。併用医薬は以下を含む：
１．可溶性ＨＬＡ重鎖分子、任意にＨＬＡ融合タンパク質として安定化されたもの、及び
２．ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
本発明の第１の態様は併用医薬に関し、特にがんの治療に使用するための併用医薬に関する。併用医薬は以下を含む：
１．可溶性ＨＬＡ重鎖分子、任意にＨＬＡ融合タンパク質として安定化されたもの、及び
２．ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【0059】
幾つかの実施形態では、これら２つの薬剤は単一の医薬組成物中に存在する。他の実施形態において、可溶性ＨＬＡ重鎖分子（特に、ＨＬＡ融合タンパク質として提供されるもの）は、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の前記阻害剤を含む医薬を投与されている患者における使用のために提供される。言い換えれば、ＨＬＡ融合タンパク質は、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤を以降の数週間若しくは月間に投与する予定のがん患者に、又はＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤を現在数週間若しくは月前に投与しているがん患者に使用するために提供される。或いは、２つの薬剤は重複した投与レジームで投与され得る。
【0060】
本発明に係る併用医薬に関する本明細書での言及は、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤と組み合わせて投与される、指定されるとおりの使用のためのＨＬＡ重鎖又はＨＬＡ融合タンパク質に向けられた、同じ限定を有する特定の請求項、項目、態様又は実施形態の改質（ｒｅ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を包含する。
【0061】
ＨＬＡ融合タンパク質
本発明に係る使用のための併用医薬のＨＬＡ融合タンパク質成分、又は本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインであるＨＬＡ重鎖ポリペプチドを含む。医薬品用途について、ＨＬＡ重鎖は、医薬品の製造性及び安定性を向上し、血漿中半減期を延長する、タンパク質部分との融合によって安定化される。特に有利な実施形態において、本発明者らは、ＨＬＡ重鎖を免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチドと結合させることにより、これらの利点が得られることを見出した。本発明は、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有するこのような融合タンパク質の観点からさらに説明されるが、当業者は、同様の利点を与えるために、安定化の他の様式が利用可能であろうことを認識する。
本発明に係る使用のための併用医薬のＨＬＡ融合タンパク質成分、又は本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインであるＨＬＡ重鎖ポリペプチドを含む。医薬品用途について、ＨＬＡ重鎖は、医薬品の製造性及び安定性を向上し、血漿中半減期を延長する、タンパク質部分との融合によって安定化される。特に有利な実施形態において、本発明者らは、ＨＬＡ重鎖を免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチドと結合させることにより、これらの利点が得られることを見出した。本発明は、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有するこのような融合タンパク質の観点からさらに説明されるが、当業者は、同様の利点を与えるために、安定化の他の様式が利用可能であろうことを認識する。
【0062】
コグネート（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンド相互作用に必要とされないＨＬＡ重鎖タンパク質の特定のドメインは、本発明に係る使用のための併用医薬に含まれるＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡポリペプチド部分には必ずしも含まれない。特定の実施形態では、細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインは、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドには存在しない。
【0063】
本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質若しくは単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造する方法の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質中に含まれるＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド変異体は、天然に存在するＨＬＡ重鎖タンパク質のアルファ１、２及び３ドメインを含み、これらの領域は、本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質の免疫調節効果を媒介するレセプターリガンド相互作用に必須である。
【0064】
本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質若しくは単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造する方法のより特定の実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドタンパク質変異体は、天然に存在するＨＬＡ重鎖タンパク質のアルファ１、２及び３ドメインであるが、Ｃ末端イソロイシン－バリンジペプチドを除き、それより細胞外ドメインのスレオニン－バリン－プロリン残基が先行し、それは時々「連結ペプチド」と注釈又は参照される膜貫通ドメインを先行するＨＬＡ－Ｂ５７領域内にある。
【0065】
ＨＬＡ重鎖は、キラー免疫グロブリン様レセプター（ＫＩＲ）及び白血球免疫グロブリン様レセプター（ＬＩＬＲ）といったリガンドと、膜貫通領域から離れた領域を介して相互作用することが構造データから示唆されている。膜に近いアミノ酸は、一般的にレセプターと相互作用しない。さらに、本発明者らは、天然に存在するＨＬＡ重鎖配列の細胞外ドメインの５Ｃ末端アミノ内に疎水性アミノ酸が多く含まれることが、タンパク質の凝集傾向といった望ましくない性質を組換えタンパク質に導入する可能性が高く、その結果、下流の生産工程における生産、精製、安定性及び毒性に影響を及ぼす可能性があると推測している。
【0066】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質成分のＨＬＡ重鎖細胞外ドメインポリペプチドは、アルファ１、２及び３ドメインを含むＨＬＡ重鎖タンパク質配列の細胞外部分のコア構造を含み、この部分は標的細胞上の表面分子と相互作用する能力をＨＬＡ融合タンパク質に付与する。
【0067】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖ポリペプチド部分は、表１に列挙した天然に存在するＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインのポリペプチド配列を有する。特定の実施形態において、ＨＬＡ重鎖細胞外ドメインは、自然免疫細胞及び適応免疫細胞の機能を変化させる制御性ＫＩＲ３ＤＬ１、ＬＩＬＲＡ及びＬＩＬＲＢ１／２細胞表面タンパク質への特異的結合といった免疫調節資質を有する天然に存在するＨＬＡ重鎖のものである。
【0068】
特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｂ５８の細胞外ドメインに由来する。特定の実施形態において、併用医薬は、配列番号０１０と指定される配列を有するＨＬＡ－Ｂ５８融合タンパク質ポリペプチドである可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチドを含む。
【0069】
特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ａ３０の細胞外ドメインに由来する。特定の実施形態において、併用医薬は、配列番号０１１と指定される配列を有するＨＬＡ－Ｂ５８融合タンパク質ポリペプチドである可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチドを含む。
【0070】
特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｂ２７の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。
【0071】
特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｂ４４の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。
【0072】
特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｂ８１の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。
【0073】
特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｃ０８の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。特定の実施形態において、併用医薬は、配列番号００９と指定される配列を有するＨＬＡ－Ｃ０８融合タンパク質ポリペプチドである可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチドを含む。
【0074】
特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｃ１２の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。
【0075】
特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｂ５７の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。
【0076】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬のさらなる実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、ＨＬＡ重鎖細胞外ドメインポリペプチド変異体を含む。前記ＨＬＡ重鎖ポリペプチド変異体は、ＨＬＡ重鎖の非変異細胞外ドメインに対して少なくとも（≧）９５％の配列類似性（タンパク質レベルで）を特徴とし、及び類似の生物学的活性（「類似の生物学的活性」という用語の下で定義される）を有する。特定の実施形態において、ＨＬＡ重鎖変異体は、それが由来する天然に存在するＨＬＡ重鎖細胞外ドメインと≧９８％で類似する。
【0077】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、ベータ－２－ミクログロブリン（β２ｍ）ポリペプチドと会合する。β２ｍ会合ＨＬＡ融合タンパク質を用いると、β２ｍ解離工程で生じるタンパク質の損失がないため、免疫調節ＨＬＡ融合タンパク質の収量が増加するという利点がある（図２）。本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の幾つかの実施形態において、β２ｍポリペプチドは、ＨＬＡ融合タンパク質と、ペプチドリンカーによって連結される。本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、β２ｍポリペプチドは、前記ＨＬＡ融合タンパク質と非共有結合的に会合される。特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、３：５～７：５の間のモル比でβ２ｍ分子と会合される。より特定の実施形態では、該比率は４：５～６：５である。換言すれば、ＨＬＡ融合タンパク質及びβ２ｍポリペプチドは、１：１の比率、又はそれに近い比率で存在する。
【0078】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、天然に存在するＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチドのポリペプチド配列とは異なる少なくとも１個又は２個のアミノ酸置換を特徴とする、ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖細胞外ドメインポリペプチド変異体を含む。ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖遺伝子ファミリーは、現在、２２１個の既知の変異体を包含し、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１～ＨＬＡ－Ｂ＊５７：１４１で番号付けした特有の核酸配列を有し、数十の特有のタンパク質配列をコードする。該タンパク質配列は既知であり、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｄａｔａｂａｓｅ，（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：Ｄ１２３４，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ａｌｌｅｌｅ．ｈｔｍｌ）が提供するＭＧＴ／ＨＬＡ Ａｌｌｅｌｅ Ｑｕｅｒｙ Ｆｏｒｍに検索語「Ｂ＊５７」を入力することで検索することができる。より特定の実施形態において、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチド配列の天然に存在する細胞外ドメインの変異体であり、１個又は２個のアミノ酸置換が、４６位のＥ、及び９７位のＲ（細胞外ドメインの開始を示すＧ、Ｓ、Ｈモチーフから割り当てられた番号）を特徴とするように行われている。すなわち、Ｅ以外のアミノ酸が４６位のＥで置換され、及び／又はＲ以外のアミノ酸が９７位のＲで置換されている。これらのアミノ酸の番号付けは、分泌シグナルを欠く分泌型ＨＬＡ－Ｂ５７部分の細胞外ドメインを開始するＧ、Ｓ、Ｈモチーフから始まる整数を１、２及び３と順次割り当てたものである。本発明者らは、これらの置換が、野生型配列と比較して、得られる変異体に基づくＨＬＡ融合タンパク質の高い収率と相関することを見出す（図２）。
【0079】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質と会合するβ２ｍポリペプチドは、配列番号００６と指定される配列を有する。
【0080】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬のより特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖ポリペプチド部分は、配列番号００１と指定されるＨＬＡ－Ｂ５７変異体を含む。さらにより特定の実施形態では、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、本質的に配列番号００１と指定される配列から本質的になる。
【0081】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬のさらなる特定の実施形態において、ＨＬＡ重鎖ポリペプチド及びＨＬＡ融合タンパク質のＩｇ Ｆｃポリペプチドは、ペプチドリンカーにより連結される。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、５～２０の間のアミノ酸長である。より特定の実施形態において、この結合性ペプチドリンカーは、配列番号００３の配列を有する。
【0082】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００５と指定される配列を有するポリペプチドを含む。他の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００５の配列の上流に分泌シグナルをさらに含む。特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質ポリペプチドの上流の分泌シグナルは配列番号００４である。他の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００４の分泌シグナルが配列番号００５と指定されるポリペプチドに結合したものから本質的になる。
【0083】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬のより特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、ＨＬＡ融合タンパク質は、本質的に配列番号００５（ＩｇＧ４ Ｆｃに融合したＨＬＡ－Ｂ５７の変異型細胞外ドメインを含む）で指定される配列がβ２ｍポリペプチドと会合したものから本質的になる。
【0084】
ヒト細胞の小胞体で発現する天然ＨＬＡ分子は、細胞表面への輸送及び表示を受ける前に、ペプチドエピトープと会合する。ペプチドがＨＬＡクラス分子に結合すると、そのコンフォメーションが変化し、ＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２といった結合パートナーとの相互作用に影響を及ぼす可能性があると考えられている。β２ｍポリペプチドと会合したＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの結合親和性及び免疫調節効果は、実施例の図４に示される。本発明に係る医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡポリペプチドは、ペプチドエピトープと会合しない。すなわち、ＨＬＡポリペプチドのアルファ１ドメイン及びアルファ２ドメインによって形成される抗原結合溝、又は抗原結合クレフトには、小さな抗原性ペプチドは結合しない。
【0085】
ＨＬＡ融合タンパク質の安定化及び連結ペプチド
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬のＨＬＡ融合部分は、発現及び精製の間の安定性を付与するポリペプチドをさらに含む。ＨＬＡ融合タンパク質の安定化部分の存在は、ＨＬＡ融合タンパク質の分解及びオリゴマー化を減少させ、融合タンパク質を発現する細胞の生存率を増加させることにより、収率及び溶解度を増加させる。
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬のＨＬＡ融合部分は、発現及び精製の間の安定性を付与するポリペプチドをさらに含む。ＨＬＡ融合タンパク質の安定化部分の存在は、ＨＬＡ融合タンパク質の分解及びオリゴマー化を減少させ、融合タンパク質を発現する細胞の生存率を増加させることにより、収率及び溶解度を増加させる。
【0086】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質の安定化ポリペプチドは、ヒトＩｇ Ｆｃポリペプチドである。また、Ｉｇ Ｆｃ部分は、リサイクルレセプターに結合することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長する可能性がある。
【0087】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態において、安定化ポリペプチドは、アイソタイプＩｇＧ Ｆｃである。ＩｇＧ Ｆｃ安定化ペプチドドメインは、ＨＬＡ融合タンパク質の精製時にさらなる利点をもたらし、プロテインＡ又はＧでコーティングした表面への吸収を可能にする。本発明者らは、Ｉｇ Ｆｃの代わりに機能性ＨＬＡポリペプチドに結合させれば、同様の利点をもたらす可能性のある代替物はウシ血清アルブミンであり得ると考えている。本発明者らのこれまでの研究により、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン分子もまた安定化ポリペプチドとして機能し得ることが確立されている。また、ＰＥＧ化によって循環中のタンパク質の半減期が延び得ることも知られているので、これも別の実現可能な安定化ペプチドである。
【0088】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質はＩｇＧ４ポリペプチドを含み、これは細胞毒性が低いために治療用融合タンパク質において望ましいアイソタイプである。本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬のなおさらに特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００２の配列を有するＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ．ｄｋ分子変化物を含む。これはＩｇＧ４のヒンジ領域の変異を特徴とし、本来のＩｇＧ４抗体の２２８位のプロリン（Ｐ）がセリン（Ｓ）に置換されており、及びｄＫは本来のＩｇＧ４配列上の最後のアミノ酸であるリジン（Ｋ）の欠失を示す。これらの変更により、ＩｇＧ４フォーマットは安定化し、異種性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が少なくなる。どちらの変化もよく確立されており、及び多様なＦｃコンストラクトにおいて一般的に使用される。
【0089】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質は、ペプチドリンカーによって単一のポリペプチド鎖の一部としてＩｇＧポリペプチドと連結したＨＬＡポリペプチドを含み、該リンカーは長さが５、１０、１５又は２０残基のアミノ酸の短い配列である。特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、セリン残基及びグリシン残基に富む配列などの非免疫原性配列である。より特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号００３の配列を有する。
【0090】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質は二量体の形式である。前記二量体は、第１の単量体と第２の単量体とを含み、及び各単量体は、他の単量体とは独立に、ＨＬＡ融合タンパク質、Ｉｇ Ｆｃ部分に融合したＨＬＡ重鎖細胞外ドメインポリペプチドを含み、後者はジスルフィド結合を介して会合し得る。本発明に係る各単量体は、さらに、β２ｍポリペプチドと会合していてもよい。特定の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ成分のいずれもペプチドエピトープと関連しない。
【0091】
ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤
前臨床試験及び臨床試験で報告されているＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、貪食細胞の活性化を制限するＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の阻害性シグナル伝達カスケードを破壊できる様々な薬剤を包含する（Ｚｈａｎｇ Ｗ．ｅｔ ａｌ．２０２０，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（１９）ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２０．０００１８）。これには、ＣＤ４７又はＳＩＲＰαに結合してリガンドとの相互作用を阻害することができる抗体、抗体断片、抗体様分子又は天然リガンドレセプター、或いはＣＤ４７又はＳＩＲＰαの細胞外リガンド結合ドメインを組み込んだ組換えタンパク質が挙げられる。
前臨床試験及び臨床試験で報告されているＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、貪食細胞の活性化を制限するＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の阻害性シグナル伝達カスケードを破壊できる様々な薬剤を包含する（Ｚｈａｎｇ Ｗ．ｅｔ ａｌ．２０２０，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（１９）ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２０．０００１８）。これには、ＣＤ４７又はＳＩＲＰαに結合してリガンドとの相互作用を阻害することができる抗体、抗体断片、抗体様分子又は天然リガンドレセプター、或いはＣＤ４７又はＳＩＲＰαの細胞外リガンド結合ドメインを組み込んだ組換えタンパク質が挙げられる。
【0092】
当技術分野で公知のＣＤ４７及びＳＩＲＰαの相互作用の阻害剤としては、ＡＬＸ１４８（ＡＬＸ ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＴＩ－６６２又はＴＴＩ－６２１（Ｔｒｉｌｌｉｕｍ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ４７）、ＴＩ－０６１（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＳＲＦ２３１（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＳＨＲ－１６０３（Ｈｅｎｇｒｕｉ）、ＮＩ－１７０１、ＮＩ－１８０１（Ｎｏｖｉｍｍｕｎｅ ＴＧ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＩＢＩ１８８（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＣＣ－９０００２（Ｃｅｌｇｅｎｅ Ｉｎｉｂｒｘ）、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ｌｅｍｚｏｐａｒｌｉｍａｐ／ＴＪＣ４（Ｉ－ＭＡＢ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、ＳＹ１０２（Ｓａｌｙｕａｎ）、ＳＬ－１７２１５４（Ｓｈａｔｔｕｃｋ Ｌａｂｓ）、ＰＳＴｘ－２３（Ｐａｒａｄｉｇｍ Ｓｈｉｆｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＰＤＬ１／ＣＤ４７ＢｓＡｂ（Ｈａｎｍｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＢＴ－００１（Ｍｏｒｐｈｉｅｘ）、ＬＹＮ００３０１（Ｌｙｎｋｃｅｌｌ）、ＩＭＭ２５０４、ＩＭＭ２５０２、ＩＭＭ０３（ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、及びＩＭＣ－００２（ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｉａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。
【0093】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態では、前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、少なくとも１０－７Ｍの解離定数（Ｋｄ）でＣＤ４７又はＳＩＲＰαの細胞外ドメインに結合する。さらなる特定の実施形態では、この相互作用のＫｄは、少なくとも１０－８Ｍ、又は１０－９Ｍである。
【0094】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬のいくつかの実施形態では、前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体様分子を含む。他の特定の実施形態では、前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、本質的に、抗体、抗体断片、又は抗体様分子である。
【0095】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態では、前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、抗体を含む。特定の実施形態では、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、ＣＤ４７に特異的に結合することを特徴とする抗体である。より特定の実施形態では、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、ＷＯ２０２０／０６８７５２Ａ１に開示されるＣＤ４７に特異的に結合することを特徴とする抗体であり、特にＣＣ－９０００２（Ｃｅｌｇｅｎｅ）である。ある特定の実施形態では、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、ＳＩＲＰαに特異的に結合することを特徴とする抗体である。
【0096】
抗体断片は、抗体のＦａｂドメイン又は可変断片（Ｆｖ）ドメインであってもよいし、或いは抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域をペプチドリンカーで連結した融合タンパク質である単鎖抗体断片であってもよい。抗体は、重鎖又は軽鎖からの単離された可変ドメインからなる、単一ドメイン抗体であってもよい。さらに、抗体は、ラクダ科動物に見られる抗体のように、重鎖のみからなる重鎖抗体であってもよい。抗体様分子は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｚｕｒｉｃｈ）などのリピートタンパク質であってもよい。
【0097】
すべての断片は、本発明に従って機能するために、ＣＤ４７又はＳＩＲＰαのいずれかに特異的に結合することを特徴とする抗原結合部分を保持していなければならない。他の特定の実施形態では、阻害剤は、ＣＤ４７に特異的に結合することを特徴とする抗原結合部分を含む抗体フラグメントである。他の特定の実施形態では、阻害剤は、ＳＩＲＰαに特異的に結合することを特徴とする抗原結合部分を含む抗体断片である。本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の他の特定の実施形態では、前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、ＣＤ４７若しくはＳＩＲＰαのリガンド結合細胞外ドメイン又はＣＤ４７若しくはＳＩＲＰαのリガンド結合細胞外ドメインの変異体をＩｇ Ｆｃに融合した融合タンパク質を含み、或いは本質的にそれである。特定の実施形態では、阻害性融合タンパク質は、本質的に、ＳＩＲＰαポリペプチド細胞外ドメインであり、及びＩｇ ｆｃドメインである。特定の実施形態では、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、ＡＬＸ１４８、ＴＴＩ－６２２又はＴＴＩ－６２１から選択される。ＡＬＸ１４８は、修飾ＳＩＲＰαＤ１ドメインと不活性ヒトＩｇＧ１ Ｆｃの融合体であり、１Ｅ－９ＭのＫｄでＣＤ４７に結合する（Ｋａｕｄｅｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０１８，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ １３（８）：ｅ０２０１８３２）。ＴＴＩ－６６２及びＴＴＩ－６２１は、それぞれＩｇＧ４又はＩｇＧ１ Ｆｃと融合したヒトＳＩＲＰαの細胞外結合ドメインである（Ｔｒｉｌｌｉｕｍ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）。
【0098】
ＳＩＲＰα阻害剤として有用な抗ＳＩＲＰα抗体にはさらに、例えば、ＫＷＡＲ２３（Ｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１４（４９）：Ｅ１０５７８－Ｅ１０５８５）、ＣＣ－９５２５１（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、Ｂｌ ７６５０６３（ＯＳＥ－１７２としても知られる；ＯＳＥ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が含まれる。抗ＳＩＲＰα抗体のさらなる例は、ＷＯ２０１９／０２３３４７、ＷＯ２０１３／０５６３５２及びＷＯ２０１８／１９０７１９に記載されている。
【0099】
他のそのような抗体には、ＧＳ－０１８９（Ｇｉｌｅａｄ、以前はＦＳＩ－１８９）、ＥＳ－００４、ＡＤＵ１８０５（Ｖｏｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．２０１９ Ｄｅｃ ４；７（１）：３４０）が含まれるが、これらに限定されない。
【0100】
特定の実施形態において、ＳＩＲＰα阻害剤は、例えば、ＵＳ２０１０／０２３９５７９に記載されているような可溶性ＣＤ４７ポリペプチドである。特定の実施形態において、可溶性ＣＤ４７ポリペプチドは、シグナルペプチド（ＷＯ２０１６／１１８７５４の配列番号２）を含むＣＤ４７の細胞外ドメインを含み、ＣＤ４７の細胞外部分は、典型的には１４２アミノ酸長であり、及びＷＯ２０１６／１１８７５４の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する。本明細書に記載の可溶性ＣＤ４７ポリペプチドはまた、少なくとも６５％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、又は９５％～９９％（又は６５％～１００％の間で特に列挙されない任意のパーセント同一性）のアミノ酸配列を含むＣＤ４７細胞外ドメイン変異体も含み、これらの変異体は、ＳＩＲＰαシグナル伝達を刺激することなくＳＩＲＰαに結合する能力を保持する。
【0101】
本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、併用は、第一に、配列番号００５の二量体２ポリペプチドからなるＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質であって、各ＨＬＡ重鎖部分がβ２ｍポリペプチドと会合することを特徴とし、ペプチドエピトープとの会合を欠く、ＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質と、第二に、ＳＩＲＰαＩｇ融合タンパク質ＡＬＸ１４８とを含む。
【0102】
本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、併用は、第一に、配列番号００５の二量体の２ポリペプチドからなるＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質であって、各ＨＬＡ重鎖部分がβ２ｍポリペプチドと会合することを特徴とし、ペプチドエピトープとの会合を欠く、ＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質と、第二に、ＳＩＲＰαＩｇ融合タンパク質ＴＴＩ－６６２とを含む。
【0103】
本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、併用は、第一に、配列番号００５の二量体の２ポリペプチドからなるＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質であって、各ＨＬＡ重鎖部分がβ２ｍポリペプチドと会合することを特徴とし、ペプチドエピトープとの会合を欠く、ＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質と、第二に、ＳＩＲＰαＩｇ融合タンパク質ＴＴＩ－６２１とを含む。
【0104】
本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、併用は、第一に、配列番号００５の二量体の２ポリペプチドからなるＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質であって、各ＨＬＡ重鎖部分がβ２ｍポリペプチドと会合することを特徴とし、ペプチドエピトープとの会合を欠く、ＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質と、第二に、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４とを含む。
【0105】
本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、併用は、第一に、配列番号００５の二量体の２ポリペプチドからなるＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質であって、各ＨＬＡ重鎖部分がβ２ｍポリペプチドと会合することを特徴とし、ペプチドエピトープとの会合を欠く、ＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質と、第二に、抗ＣＤ４７抗体ＴＩ－０６１とを含む。
【0106】
本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、併用は、第一に、配列番号００５の二量体の２ポリペプチドからなるＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質であって、各ＨＬＡ重鎖部分がβ２ｍポリペプチドと会合することを特徴とし、ペプチドエピトープとの会合を欠く、ＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質と、第二に、抗ＣＤ４７抗体ＩＢＩ１８８とを含む。
【0107】
本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、併用は、第一に、配列番号００５の二量体の２ポリペプチドからなるＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質であって、各ＨＬＡ重鎖部分がβ２ｍポリペプチドと会合することを特徴とし、ペプチドエピトープとの会合を欠く、ＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質と、第二に、抗ＣＤ４７抗体ＣＣ－９０００２とを含む。
【0108】
本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、併用は、第一に、配列番号００５の二量体の２ポリペプチドからなるＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質であって、各ＨＬＡ重鎖部分がβ２ｍポリペプチドと会合することを特徴とし、ペプチドエピトープとの会合を欠く、ＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質と、第二に、抗ＣＤ４７抗体ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）とを含む。
【0109】
本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、併用は、第一に、配列番号００５の二量体の２ポリペプチドからなるＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質であって、各ＨＬＡ重鎖部分がβ２ｍポリペプチドと会合することを特徴とし、ペプチドエピトープとの会合を欠く、ＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質と、第二に、抗ＣＤ４７抗体ｌｅｍｚｏｐａｒｌｉｍａｐ／ＴＪＣ４（Ｉ－ＭＡＢ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）とを含む。
【0110】
本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、併用は、第一に、配列番号００５の二量体の２ポリペプチドからなるＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質であって、各ＨＬＡ重鎖部分がβ２ｍポリペプチドと会合することを特徴とし、ペプチドエピトープとの会合を欠く、ＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質と、第二に、抗ＣＤ４７抗体ＳＬ－１７２１５４（Ｓｈａｔｔｕｃｋ Ｌａｂｓ）とを含む。
【0111】
本発明に係る併用医薬の特定の実施形態において、併用は、第一に、配列番号００５の二量体の２ポリペプチドからなるＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質であって、各ＨＬＡ重鎖部分がβ２ｍポリペプチドと会合することを特徴とし、ペプチドエピトープとの会合を欠く、ＨＬＡ－Ｂ５７クラスＩ融合タンパク質と、第二に、抗ＣＤ４７抗体ＩＭＣ－００２（ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｉａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）とを含む。
【0112】
いくつかの実施形態では、本発明で使用されるＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、ＣＤ４７又はＳＩＲＰαに結合すると、その結合パートナーとの相互作用を立体的にブロックすることができる。他の実施形態では、この相互作用は非アゴニスト相互作用である。
【0113】
ＨＬＡ融合タンパク質医薬組成物の用量及び用法
本発明のさらなる態様は、医薬組成物に関し、特に、がん又は悪性新生物疾患の形態を処置するのに使用するためのものであって、前記組成物は、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤による治療を受けている患者に使用するための、ＨＬＡ融合タンパク質の項で規定されるＨＬＡ融合タンパク質を含む。
本発明のさらなる態様は、医薬組成物に関し、特に、がん又は悪性新生物疾患の形態を処置するのに使用するためのものであって、前記組成物は、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤による治療を受けている患者に使用するための、ＨＬＡ融合タンパク質の項で規定されるＨＬＡ融合タンパク質を含む。
【0114】
本発明に係る医薬組成物、特にがんの治療に使用するための医薬組成物は、β２ｍポリペプチドと会合したＨＬＡ融合タンパク質を含み、及び典型的には、薬剤の制御が容易な投与量を提供し、患者に洗練された取り扱いが容易な製品を与える、医薬剤形に製剤化される。前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。さらなる実施形態において、組成物は、少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。
【0115】
本発明の医薬品組成物の投与レジメンは、特定の薬剤の薬力学的特性及びその投与様式及び投与経路；レシピエントの種、年齢、性別、健康状態、病状、及び体重；症状の性質及び程度；同時治療の種類；治療の頻度；投与経路、患者の腎機能及び肝機能、並びに所望の効果などの既知の因子によって変化する。特定の実施形態において、本発明の医薬品組成物は、１日１回投与してもよいし、１日の総投与量を１日に２回、３回、又は４回の用量に分けて投与してもよい。特定の実施形態では、併用薬は１、２又は３週間ごとに投与される。
【0116】
医薬組成物を調製するための多くの手順及び方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎら，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第４編，２０１３（ＩＳＢＮ ８１２３９２２８９２）を参照されたい。
【0117】
併用投与は、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤と、ＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物との同時投与又は別個の製剤での同時投与、又は第１の物質を、第２の物質の投与の直前、例えば、その１週間前、又は少なくともその１ヶ月前、又は直後、例えば、その１週間後、又は最大でもその１ヶ月後に投与することの両方を包含する。
【0118】
本発明の別の態様は、がんの治療に使用するための、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤であって、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤が、ＨＬＡ融合タンパク質の前に、それと組み合わせて、又はそれに続いて投与される、前記阻害剤である。
【0119】
異なる剤形
ある実施形態において、併用療法は、２つの異なる剤形を含み、例えば、ＨＬＡ融合タンパク質を含む前記医薬組成物が、腫瘍内送達、又は腫瘍近傍の局所送達、例えば、皮下注射若しくは固形腫瘍への腫瘍内注射によるもののための剤形として提供され、前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤が、全身送達、特に静脈注射によるもののための剤形として提供される。しかし、この２つの薬剤は、２つの同様の投与形態で投与することもできる。
ある実施形態において、併用療法は、２つの異なる剤形を含み、例えば、ＨＬＡ融合タンパク質を含む前記医薬組成物が、腫瘍内送達、又は腫瘍近傍の局所送達、例えば、皮下注射若しくは固形腫瘍への腫瘍内注射によるもののための剤形として提供され、前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤が、全身送達、特に静脈注射によるもののための剤形として提供される。しかし、この２つの薬剤は、２つの同様の投与形態で投与することもできる。
【0120】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態では、前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、全身投与に適した剤形で提供される。
【0121】
本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬の特定の実施形態では、前記ＨＬＡ融合タンパク質は、全身送達に適した剤形で提供される。
【0122】
ある一般的な剤形
本発明はまた、可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチド、任意に、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増強するポリペプチド部分との融合により安定化されたもの、及びＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤を単一の剤形として投与することを包含する。
本発明はまた、可溶性ＨＬＡ重鎖ポリペプチド、任意に、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増強するポリペプチド部分との融合により安定化されたもの、及びＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤を単一の剤形として投与することを包含する。
【0123】
医療及び製造方法
本発明に係る併用薬、又はＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、様々な形態のがんの治療に使用するために提供される。同様のＬＩＬＢＲ２指向性抗悪性腫瘍療法の他の形態に関する前臨床研究では、腎がん及び卵巣がんにおける有効性が実証されている。ＬＩＬＲＢ２標的抗体ＭＫ－４８３０の安全性及び忍容性は、現在、幅広い固形臓器がん（中皮腫、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、肺がん、神経膠芽腫、膵臓がん、胃がん）を対象とした臨床試験において、化学療法と併用して、検討中である（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０３５６４６９１）。これらの各適応症（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）は、本発明に係るＬＩＬＲＢ２結合ＨＬＡ融合タンパク質併用医薬品で治療することが可能であるかもしれない。
本発明に係る併用薬、又はＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、様々な形態のがんの治療に使用するために提供される。同様のＬＩＬＢＲ２指向性抗悪性腫瘍療法の他の形態に関する前臨床研究では、腎がん及び卵巣がんにおける有効性が実証されている。ＬＩＬＲＢ２標的抗体ＭＫ－４８３０の安全性及び忍容性は、現在、幅広い固形臓器がん（中皮腫、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、肺がん、神経膠芽腫、膵臓がん、胃がん）を対象とした臨床試験において、化学療法と併用して、検討中である（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０３５６４６９１）。これらの各適応症（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）は、本発明に係るＬＩＬＲＢ２結合ＨＬＡ融合タンパク質併用医薬品で治療することが可能であるかもしれない。
【0124】
本発明に係る併用薬、又はＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤の特定の実施形態では、血液がんを治療する使用のために提供される。本発明者らは、本発明に係る医薬組成物によって誘導される特徴的なＴ細胞の排出、及び血液がん細胞をＴ細胞へ循環するアクセス性、及びマクロファージの活性化は、この併用が有効である可能性が高いことを意味すると考えている。特にこのような実施形態では、ＲＰＭＩ－８２２６細胞株（図４）によってモデル化されるとおりの、多発性骨髄腫と診断された患者に使用するための併用薬が提供される。
【0125】
他の特定の実施形態では、本発明に係る使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬は、固形がん、又は固形がんの転移と診断された患者に使用するために提供される。他の特定の実施形態では、併用は、乳がんの一種と診断された患者に使用するために提供される。より特定の実施形態では、がんはエストロゲンレセプター陽性である。他の特定の実施形態では、がんはプロゲステロンレセプター陽性である。他の特定の実施形態では、がんはヒト上皮成長因子レセプター２陽性である。
【0126】
同様に、本発明の範囲内には、本発明に係るＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤又は併用医薬を、患者に投与することを含む、がん患者の治療方法がある。本発明は、さらなる代替態様として、がんの治療又は予防のための医薬の製造方法における使用のための、上記で詳細に規定したとおりの、併用医薬の成分の使用をさらに包含する。
【0127】
剤形は、皮下注射、静脈注射、肝内注射、筋肉内注射などの非経口投与であってもよい。任意に、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。
【0128】
本発明は、さらに以下の項目を包含する：
項目１．悪性腫瘍性疾患の治療に使用するための併用医薬品であって、以下を含む：
ａ．ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）融合タンパク質であって、以下を含む
・ＨＬＡ重鎖ポリペプチドであって、以下から選択される：
○ ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン、特にＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖；又は
○ ＨＬＡ重鎖の前記細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体；及び
・免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド；及び
ａ．ＣＤ４７及びアルファ（ＳＩＲＰα）の間の相互作用の阻害剤。
項目１．悪性腫瘍性疾患の治療に使用するための併用医薬品であって、以下を含む：
ａ．ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）融合タンパク質であって、以下を含む
・ＨＬＡ重鎖ポリペプチドであって、以下から選択される：
○ ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン、特にＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖；又は
○ ＨＬＡ重鎖の前記細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体；及び
・免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド；及び
ａ．ＣＤ４７及びアルファ（ＳＩＲＰα）の間の相互作用の阻害剤。
【0129】
項目２．ＨＬＡ融合タンパク質が、β２ｍポリペプチドと会合している、項目１に記載の使用のための併用医薬。
【0130】
項目３．ＨＬＡ融合タンパク質が、３：５～７：５の比、より特に４：５～６：５の比、より特に１：１の比で、β２ｍポリペプチドと非共有結合的に会合している、項目１又は２に記載の使用のための併用医薬。
【0131】
項目４．ＨＬＡ重鎖ポリペプチドが、ＨＬＡ－Ｂ５７の細胞外ドメインの変異体であり、及び
ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とする、項目３に記載の使用のための併用医薬。
ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とする、項目３に記載の使用のための併用医薬。
【0132】
項目５．ＨＬＡ重鎖ポリペプチドが、配列番号００１の配列を含む、又は本質的にそれからなる、項目１～４のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬。
【0133】
項目６．項目１～５のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬であって、ＨＬＡ融合タンパク質は、以下を含む：
ａ．項目１～５のいずれか１項で特定されるＨＬＡ重鎖ポリペプチド；
ｂ．ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、より特に配列番号００２の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド；及び／又は
ｃ．ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー；
ａ．項目１～５のいずれか１項で特定されるＨＬＡ重鎖ポリペプチド；
ｂ．ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、より特に配列番号００２の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド；及び／又は
ｃ．ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー；
【0134】
項目７．ＨＬＡ融合タンパク質が、配列番号００５と指定される配列を含む、又は本質的にそれからなる、項目１～６のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬。
【0135】
項目８．ＨＬＡ融合タンパク質が、分泌シグナルを含み、特に分泌シグナルは１６～３０アミノ酸長であり、より特に分泌シグナルは細胞から分泌される過程で切断によって除去される、なおより特に分泌シグナルは配列番号００４の配列を有する、項目１～７のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬。
【0136】
項目９．項目１～８のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬であって、ＨＬＡ融合タンパク質は、二量体の形態であり、前記二量体は、第１のＨＬＡ単量体及び第２のＨＬＡ単量体を含む、又は本質的にそれからなる；
－ 第１のＨＬＡ単量体は、項目１～８のいずれか１項に規定される第１のＨＬＡ融合タンパク質、及び第１のβ２ｍポリペプチドから本質的になる；及び
－ 第２のＨＬＡ単量体は、項目１～８のいずれか１項に規定される第２のＨＬＡ融合タンパク質、及び第２のβ２ｍポリペプチドから本質的になる；
特に、第１のＨＬＡ単量体及び第２のＨＬＡ単量体が同一である。
－ 第１のＨＬＡ単量体は、項目１～８のいずれか１項に規定される第１のＨＬＡ融合タンパク質、及び第１のβ２ｍポリペプチドから本質的になる；及び
－ 第２のＨＬＡ単量体は、項目１～８のいずれか１項に規定される第２のＨＬＡ融合タンパク質、及び第２のβ２ｍポリペプチドから本質的になる；
特に、第１のＨＬＡ単量体及び第２のＨＬＡ単量体が同一である。
【0137】
項目１０．悪性新生物疾患の治療における使用のための、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤であって、悪性新生物疾患の治療における使用のための、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、項目１～９のいずれか１項に特定されるＨＬＡ融合タンパク質の前に、それと組み合わせて、又はそれに続いて投与される、前記阻害剤。
【0138】
項目１１．前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、少なくとも１０－７Ｍの解離定数でＣＤ４７又はＳＩＲＰαに結合する、項目１～８のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬、又は項目１０に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【0139】
項目１２．前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、抗体、抗体断片又は抗体様分子を含む、又は本質的にそれである、項目１～８及び１１のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬、又は項目１０又は１１に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【0140】
項目１３．ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、融合タンパク質を含む、又はそれからなる、項目１～８、１１及び１２のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬、又は項目１０～１２のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤であって、前記融合タンパク質は以下を含む：
－ ＳＩＲＰαポリペプチド細胞外ドメイン；及び
－ Ｉｇ ｆｃドメイン；
特に、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、ＡＬＸ１４８、ＴＴＩ－６２２又はＴＴＩ－６２１から選択される。
－ ＳＩＲＰαポリペプチド細胞外ドメイン；及び
－ Ｉｇ ｆｃドメイン；
特に、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、ＡＬＸ１４８、ＴＴＩ－６２２又はＴＴＩ－６２１から選択される。
【0141】
項目１４．前記ＨＬＡ融合タンパク質、又は前記ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤は、全身投与に適した剤形で提供される、項目１～８及び１１～１３のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬、又は項目１０～１３のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤。
【0142】
項目１５．項目１～８及び１１～１４のいずれか１項に記載の使用のための併用医薬、又は項目１０～１４のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ４７及びＳＩＲＰαの間の相互作用の阻害剤であって、悪性新生物疾患は
ａ．血球由来のがん、骨髄腫、又は
ｂ．固形腫瘍、特に乳がん、より特に乳管細胞がんの一種である。
ａ．血球由来のがん、骨髄腫、又は
ｂ．固形腫瘍、特に乳がん、より特に乳管細胞がんの一種である。
【0143】
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を導き出すことができる。これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0144】
実施例１：ＨＬＡ融合タンパク質の生産
本発明者らによる以前の研究において、ＨＬＡ融合タンパク質（ｉｏｓＨ１）は、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１：０１ポリペプチドの重鎖細胞外ドメインをＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド（配列番号００２）に連結することによって設計された。このＨＬＡ融合タンパク質の収率を増加させるために、天然のＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインアミノ酸配列内で同定された阻害性アミノ酸を、４６位のアラニン（Ａ）残基をグルタミン（Ｅ）へ、９７位のバリン（Ｖ）をアルギニン（Ｒ）へ置換することによって改変し、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド変異体（配列番号００１）を提供した。これを、連結ペプチド（配列番号００３）を介してＩｇＧ４ポリペプチドへ融合し、ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質変異体（配列番号００５、ＩｏｓＨ２）を提供した。２つの変異を欠如する天然のＨＬＡ－Ｂ５７由来融合タンパク質コントロール及び組換えＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、分泌シグナルをコードする核酸配列（配列番号００４）の下流に市販の発現ベクター（Ｐｒｏｂｉｏｇｅｎ）内にクローニングした。ＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃを発現するベクターコンストラクトを、β２ｍタンパク質（配列番号００６）をコードする核酸を含むプラスミドとともに、ＮＥＯＮ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＭＰＫ１００９６）を用いたマイクロポレーション（ＭＰ）によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内にコトランスフェクトした。ＣＨＯ－ＤＧ４４スターター細胞を、ＨＬＡ融合タンパク質とβ２ｍプラスミドとの比率を変えてトランスフェクトした（４：１、２：１、１：１、１：２）。選択したクローンプールは、標準シェーカーフラスコで、ピューロマイシン及びメトトレキセートを含むＰＢＧ－ＣＤ－Ｃ４添加培地１２５ｍＬ中に、４Ｅ５ｖｃ／ｍＬの細胞播種密度で培養された。抗生物質で調整された選択圧の後、個々のクローンプールが分析のために選択された。生存率及び生存細胞密度の測定は、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲシステム及びトリパンブルー細胞排除法を用いて行った。力価の定量は、プロテインＡバイオセンサーを備えたＯｃｔｅｔ ＲＥＤ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いて、異なる時点（日数）で測定した。
本発明者らによる以前の研究において、ＨＬＡ融合タンパク質（ｉｏｓＨ１）は、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１：０１ポリペプチドの重鎖細胞外ドメインをＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド（配列番号００２）に連結することによって設計された。このＨＬＡ融合タンパク質の収率を増加させるために、天然のＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインアミノ酸配列内で同定された阻害性アミノ酸を、４６位のアラニン（Ａ）残基をグルタミン（Ｅ）へ、９７位のバリン（Ｖ）をアルギニン（Ｒ）へ置換することによって改変し、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド変異体（配列番号００１）を提供した。これを、連結ペプチド（配列番号００３）を介してＩｇＧ４ポリペプチドへ融合し、ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質変異体（配列番号００５、ＩｏｓＨ２）を提供した。２つの変異を欠如する天然のＨＬＡ－Ｂ５７由来融合タンパク質コントロール及び組換えＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、分泌シグナルをコードする核酸配列（配列番号００４）の下流に市販の発現ベクター（Ｐｒｏｂｉｏｇｅｎ）内にクローニングした。ＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃを発現するベクターコンストラクトを、β２ｍタンパク質（配列番号００６）をコードする核酸を含むプラスミドとともに、ＮＥＯＮ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＭＰＫ１００９６）を用いたマイクロポレーション（ＭＰ）によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内にコトランスフェクトした。ＣＨＯ－ＤＧ４４スターター細胞を、ＨＬＡ融合タンパク質とβ２ｍプラスミドとの比率を変えてトランスフェクトした（４：１、２：１、１：１、１：２）。選択したクローンプールは、標準シェーカーフラスコで、ピューロマイシン及びメトトレキセートを含むＰＢＧ－ＣＤ－Ｃ４添加培地１２５ｍＬ中に、４Ｅ５ｖｃ／ｍＬの細胞播種密度で培養された。抗生物質で調整された選択圧の後、個々のクローンプールが分析のために選択された。生存率及び生存細胞密度の測定は、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲシステム及びトリパンブルー細胞排除法を用いて行った。力価の定量は、プロテインＡバイオセンサーを備えたＯｃｔｅｔ ＲＥＤ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いて、異なる時点（日数）で測定した。
【0145】
ＨＬＡ－Ｂ５７又は変異型融合タンパク質を発現するクローンを分析した結果、野生型ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ細胞の生存率及び力価は、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍより有意に低いことが示された（図２Ａ及びＢ）。β２ｍに対する天然型ＨＬＡ－Ｂ５７又は改変型ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の等モルＲＮＡ量が、選択されたクローン細胞で確認され（図２Ｃ及びＤ）、アミノ酸改変が発現を増加させたことが示唆された。
【0146】
ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ複合体は、アフィニティーカラム精製によって、ろ過したＣＨＯ細胞上清から単離された。酸性条件下でのタンパク質の精製及びβ２ｍの除去は、２段階の精製プロトコールとして行われた。第１段階として、上清からβ２ｍと会合したＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）を捕捉するために、プロテインＧセファロース［（４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）Ｓｉｇｍａ，＃ＧＥ－１７－０６１８－０１）］ビーズを使用した。ロッカーにおいて４℃で一晩インキュベートした後、回収したビーズをＰＢＳで洗浄し、及び次いで、各ＨＬＡポリペプチドがまだβ２ｍと会合しているＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質を、標準ＩｇＧ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ２．８）（ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ ＃２１００４）を用いて溶出した。サイズ排除クロマトグラフィーに基づく精製の第二段階として、酸性条件下でＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）をβ２ｍと分離し、非β２ｍ会合ＨＬＡ融合タンパク質を得た。分離には、クエン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ３．０）であらかじめ平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ １０／３００ゲルろ過カラムを使用した。２．０ｍｇ／ｍｌ濃度のタンパク質を０．５ｍｌ注入して、目的のＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）タンパク質のピークは１２．７ｍｌで溶出し、β２ｍのピークは２２．０ｍｌで溶出した。
【0147】
実施例２．非β２ｍ会合又はβ２ｍ会合ＨＬＡ融合タンパク質とＬＩＬＲＢ２との相互作用の定量
本発明者らは、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）フォーマットと関連する腫瘍免疫に最も関連する免疫学的特性を詳細に分析したところ、それらはすべて融合タンパク質のＨＬＡクラスＩドメインのペプチド結合溝に関連するペプチドエピトープとの会合を欠如していた。β２ｍを欠如する野生型ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質（二量体）、β２ｍを欠如するＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質（二量体）、及びβ２ｍに結合したままのＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質二量体とＬＩＬＲＢ２との相互作用の親和性を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて測定した。平底のＰｉｅｒｃｅＴＭ ストレプトアビジンでコーティングした高結合能９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ ＃１５５００）に、ＰＢＳバッファー中の最終濃度５μｇ／ｍｌで固定化したｃ末端ビオチン化抗原分子（ＬＩＬＲＢ２、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１００３３５）を５０μｌでコーティングした。陰性コントロールとしてＰＢＳ及びＩｇＧアイソタイプを使用した。ＨＬＡ－Ｂ５７、又はβ２ｍを欠如したＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）、及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍの連続希釈液（８濃度点：１０、２．５、１、０．２５、０．１、０．０２５、０．０１、０．００２５μｇ／ｍｌ）を繰り返して適用した（５０μｌ）。検出には、ＴＢＳ（５０μｌ）で１：１００に希釈したＡＰＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－１３５－０９８）を用いた。最後に、各ウェルに５０μｌのＴＢＳを加え、及びＡＰＣの励起波長６５０ｎｍ及び発光波長６６０ｎｍで蛍光スキャンを行った。相互作用のＥＣ５０を決定するために、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ９．１．２及び３パラメータベースのｌｏｇ（アゴニスト）対応答モデルを使用した。変異型ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質のＬＩＬＲＢ２への結合は、β２ｍとの会合を欠くＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）としても、及び特にβ２ｍと会合した場合のいずれでも、改善されることが観察され、この変異型が高い免疫調節能を有することが示唆された（図３）。
本発明者らは、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）フォーマットと関連する腫瘍免疫に最も関連する免疫学的特性を詳細に分析したところ、それらはすべて融合タンパク質のＨＬＡクラスＩドメインのペプチド結合溝に関連するペプチドエピトープとの会合を欠如していた。β２ｍを欠如する野生型ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質（二量体）、β２ｍを欠如するＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質（二量体）、及びβ２ｍに結合したままのＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質二量体とＬＩＬＲＢ２との相互作用の親和性を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて測定した。平底のＰｉｅｒｃｅＴＭ ストレプトアビジンでコーティングした高結合能９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ ＃１５５００）に、ＰＢＳバッファー中の最終濃度５μｇ／ｍｌで固定化したｃ末端ビオチン化抗原分子（ＬＩＬＲＢ２、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１００３３５）を５０μｌでコーティングした。陰性コントロールとしてＰＢＳ及びＩｇＧアイソタイプを使用した。ＨＬＡ－Ｂ５７、又はβ２ｍを欠如したＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）、及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍの連続希釈液（８濃度点：１０、２．５、１、０．２５、０．１、０．０２５、０．０１、０．００２５μｇ／ｍｌ）を繰り返して適用した（５０μｌ）。検出には、ＴＢＳ（５０μｌ）で１：１００に希釈したＡＰＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－１３５－０９８）を用いた。最後に、各ウェルに５０μｌのＴＢＳを加え、及びＡＰＣの励起波長６５０ｎｍ及び発光波長６６０ｎｍで蛍光スキャンを行った。相互作用のＥＣ５０を決定するために、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ９．１．２及び３パラメータベースのｌｏｇ（アゴニスト）対応答モデルを使用した。変異型ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質のＬＩＬＲＢ２への結合は、β２ｍとの会合を欠くＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）としても、及び特にβ２ｍと会合した場合のいずれでも、改善されることが観察され、この変異型が高い免疫調節能を有することが示唆された（図３）。
【0148】
実施例３ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞の殺傷力の増加
次に、β２ｍに会合するＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（ｉｏｓＨ２とよぶ）のヒトプライマリーマクロファージによる腫瘍細胞の貪食を誘導する能力を、液体がん細胞（ＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫、ＤＳＭＺ Ｃａｔ．＃ＡＣＣ４０２）及び固形がん細胞（ＢＴ４７４乳管がん、ＤＳＭＺ Ｃａｔ．＃ＡＣＣ６４）に対して、ＰＢＳ、ＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；Ｃａｔ．＃４０３５０２）及びＩｇＧ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；Ｃａｔ．＃４０３７０２）アイソタイプコントロール、並びにベンチマーク抗ＬＩＬＲＢ２抗体（ＭＫ４８３０）（ＵＳ２０１８／０２９８０９６Ａ１の配列に基づいて社内作製）と比較して評価した。さらに、食細胞の活性化を調節する２つの経路を複合的に阻害することで、ｉｏｓＨ２の効果が増強され得るかどうかを調べるために（図１）、抗ＣＤ４７抗体（ＬｕｂｉｏＳｃｉｅｎｃｅ；Ｃａｔ．＃ＢＥ００１９－１）又は抗ＳＩＲＰα抗体（ＷＯ２０２００６８７５２Ａ１における配列に基づいて社内作成、配列番号００７の重鎖及び配列番号００８の軽鎖）のいずれかを用いた同時処理を評価した。
次に、β２ｍに会合するＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（ｉｏｓＨ２とよぶ）のヒトプライマリーマクロファージによる腫瘍細胞の貪食を誘導する能力を、液体がん細胞（ＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫、ＤＳＭＺ Ｃａｔ．＃ＡＣＣ４０２）及び固形がん細胞（ＢＴ４７４乳管がん、ＤＳＭＺ Ｃａｔ．＃ＡＣＣ６４）に対して、ＰＢＳ、ＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；Ｃａｔ．＃４０３５０２）及びＩｇＧ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；Ｃａｔ．＃４０３７０２）アイソタイプコントロール、並びにベンチマーク抗ＬＩＬＲＢ２抗体（ＭＫ４８３０）（ＵＳ２０１８／０２９８０９６Ａ１の配列に基づいて社内作製）と比較して評価した。さらに、食細胞の活性化を調節する２つの経路を複合的に阻害することで、ｉｏｓＨ２の効果が増強され得るかどうかを調べるために（図１）、抗ＣＤ４７抗体（ＬｕｂｉｏＳｃｉｅｎｃｅ；Ｃａｔ．＃ＢＥ００１９－１）又は抗ＳＩＲＰα抗体（ＷＯ２０２００６８７５２Ａ１における配列に基づいて社内作成、配列番号００７の重鎖及び配列番号００８の軽鎖）のいずれかを用いた同時処理を評価した。
【0149】
示された液状腫瘍及び固形腫瘍由来のがん細胞株をヒトプライマリーマクロファージと共培養し、及び腫瘍細胞の貪食作用を、ＩｎｃｕＣｙｔｅインキュベーター及びライブセルイメージングシステム（Ｖｉｔａｒｉｓ ＡＧ、ＭＣＯ－２３０ＡＩＣＵＶＨ－ＰＥ）を用いて、製造者の指示に従って３６時間モニターした。がん細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅＴＭ ＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で製造者の指示に従って染色し、次いで１０００細胞／ウェルを１０００－５０００個のプライマリーＴ細胞とともに平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）内に播種した。培地には２５０ｎＭのＣｙｔｏｔｏｘ Ｒｅｄ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を含んだ。ライブセルイメージングはＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３ Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて行った。ＩｎｃｕＣｙｔｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２０２０Ｃを用いて、１ウェルあたり４枚の非隣接画像を解析した。ＣＦＳＥシグナルは緑色のオブジェクトで区分され、及びすべてのオブジェクトががん細胞としてカウントされた。死細胞はＣｙｔｏｔｏｘシグナルで識別され、赤いオブジェクトで区分された。がん細胞死は、緑色及び赤色のオブジェクトの共局在によって検出された。
【0150】
図４の結果は、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ， Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（ｉｏｓＨ２）が、共培養の３時間後にはすでにマクロファージの貪食を有意かつ急速に増加させたことを示している。貪食の速度及び動態は細胞株によって異なったが、ｉｏｓＨ２の効果はがん細胞の種類には依存しなかった。ＩｏｓＨ２刺激はまた、ベンチマーク抗ＬＩＬＲＢ２抗体ＭＫ４８３０によって誘発された効果よりも優れていた。ＭＫ４８３０は乳がんの遅延貪食を誘発したが、骨髄腫細胞には効果がなかった。抗ＣＤ４７抗体又は抗ＳＩＲＰα抗体は、単剤では骨髄腫の貪食率に影響を与えなかった；しかしながら、ｉｏｓＨ２と抗ＣＤ４７抗体との併用は、骨髄腫の貪食率を上昇させたが、これは抗ＣＤ４７抗体とＭＫ４８３０との併用では観察されなかった。乳がん細胞株ＢＴ４７４では、抗ＣＤ４７抗体もＩｏｓＨ２が誘導する貪食作用を増強したが、単独ではほとんど効果がなかった。抗ＳＩＲＰα抗体とｉｏｓＨ２との併用治療は、乳がんにおいて試験したすべての単剤治療及び併用治療と比較して最も高い貪食率を示したが、骨髄腫細胞株を治療することには効果がなかった。
【0151】
配列
配列番号００１ 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７：０１ 細胞外ドメイン Ａ４６Ｅ Ｖ９７Ｒ（人工）
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS
配列番号００１ 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７：０１ 細胞外ドメイン Ａ４６Ｅ Ｖ９７Ｒ（人工）
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【0152】
配列番号００２ 最適化ＩｇＧ４ Ｆｃ（人工）
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
【0153】
配列番号００３ ペプチドリンカー（人工）
GGGGSGGGGS
GGGGSGGGGS
【0154】
配列番号００４ 分泌シグナル（人工）
AAAMNFGLRLIFLVLTLKGVQC
AAAMNFGLRLIFLVLTLKGVQC
【0155】
配列番号００５ 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７：０１ 細胞外ドメイン Ａ４６Ｅ Ｖ９７Ｒ ＩｇＧ４融合タンパク質（人工）
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
変異型ＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメイン、ペプチドリンカー（下線）、ＩｇＧ４ Ｆｃ（イタリック体）
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
変異型ＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメイン、ペプチドリンカー（下線）、ＩｇＧ４ Ｆｃ（イタリック体）
【0156】
配列番号００６ β－２－ミクログロブリン（ホモサピエンス）
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
【0157】
配列番号００７ 抗ＳＩＲＰアルファ抗体重鎖（人工）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFRGYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYGGETNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREAGSSWYDFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFRGYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYGGETNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREAGSSWYDFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【0158】
配列番号００８ 抗ＳＩＲＰアルファ抗体軽鎖（人工）
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGASFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGASFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【0159】
配列番号００９ ＨＬＡ－ＣＷ０８０２融合タンパク質（人工）
CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVQFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYNQFAYDGKDYIALNEDLRSWTAADKAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKKTLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWGPSSQPGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＨＬＡ－ＣＷ０８０２細胞外ドメイン、ペプチドリンカー（下線）、ＩｇＧ４ Ｆｃ（イタリア体）
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ＨＬＡ－ＣＷ０８０２細胞外ドメイン、ペプチドリンカー（下線）、ＩｇＧ４ Ｆｃ（イタリア体）
【0160】
配列番号０１０ ＨＬＡ－Ｂ５８融合タンパク質（人工）
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＨＬＡ－Ｂ５８：０１ 細胞外ドメイン、ペプチドリンカー（下線）、ＩｇＧ４ Ｆｃ（イタリア体）
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ＨＬＡ－Ｂ５８：０１ 細胞外ドメイン、ペプチドリンカー（下線）、ＩｇＧ４ Ｆｃ（イタリア体）
【0161】
配列番号０１１ ＨＬＡ－Ａ３０：０１融合タンパク質（人工）
GSHSMRYFSTSVSRPGSGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQERPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQIMYGCDVGSDGRFLRGYEQHAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARWAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＨＬＡ－Ａ３０：０１細胞外ドメイン、ペプチドリンカー（下線）、ＩｇＧ４ Ｆｃ（イタリアン体）
GSHSMRYFSTSVSRPGSGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQERPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQIMYGCDVGSDGRFLRGYEQHAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARWAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＨＬＡ－Ａ３０：０１細胞外ドメイン、ペプチドリンカー（下線）、ＩｇＧ４ Ｆｃ（イタリアン体）
【0162】
引用文献：
Colonna M. et al. 1997 J. Exp. Med. 186(1):1809
Ring et al., 2017, Proc Natl Acad Sci 114(49):E10578-E10585),
WO 2017153438 A1; WO2016124661A1; WO2018 029284 A1; WO 2019/023347; WO 2013/056352; WO 2018/190719; US 2010/0239579
本明細書中で引用されているすべての科学刊行物及び特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
Colonna M. et al. 1997 J. Exp. Med. 186(1):1809
Ring et al., 2017, Proc Natl Acad Sci 114(49):E10578-E10585),
WO 2017153438 A1; WO2016124661A1; WO2018 029284 A1; WO 2019/023347; WO 2013/056352; WO 2018/190719; US 2010/0239579
本明細書中で引用されているすべての科学刊行物及び特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2AB】
【図2B】
【図2CD】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【配列表】
【国際調査報告】