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特表2024-530048間葉系幹細胞を培養するための方法、組成物およびそれらの実施
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-14
(54)【発明の名称】間葉系幹細胞を培養するための方法、組成物およびそれらの実施
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20240806BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20240806BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240806BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240806BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240806BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240806BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20240806BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240806BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20240806BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
A61K35/28
A61P27/02
A61K9/08
A61P1/16
A61K47/36
A61K47/38
A61K47/34
A61K47/32
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508335
(86)(22)【出願日】2022-08-11
(85)【翻訳文提出日】2024-03-26
(86)【国際出願番号】 IN2022050720
(87)【国際公開番号】W WO2023017539
(87)【国際公開日】2023-02-16
(31)【優先権主張番号】202141036331
(32)【優先日】2021-08-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522033896
【氏名又は名称】パンドラム・テクノロジーズ・プライベイト・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｐａｎｄｏｒｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｒｉｖａｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ボウミック，トゥヒン
(72)【発明者】
【氏名】チャンドル，アルン
(72)【発明者】
【氏名】トーマス，ミドゥン ベン
(72)【発明者】
【氏名】セングプタ，スマン
(72)【発明者】
【氏名】メノン，ディープティ
(72)【発明者】
【氏名】カルナカラン，ウェンソン ラジャン デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】セルバム，シバラム
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA93X
4B065AC14
4B065AC15
4B065BD25
4B065CA44
4C076AA11
4C076BB13
4C076BB24
4C076CC09
4C076CC10
4C076EE06
4C076EE23
4C076EE31
4C076EE37
4C076EE43
4C076FF11
4C076FF35
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB63
4C087CA02
4C087CA04
4C087DA32
4C087MA17
4C087MA58
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA33
4C087ZA75
(57)【要約】
本明細書には、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエキソソームの集団を生成する方法が提供される。本開示に従う方法は、培養中の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を拡大することと、培養中に１種以上のプライミング剤を投与して、ＭＳＣの集団をプライミングし、プライミングされたＭＳＣの集団を得ることと、培養中でプライミングされたＭＳＣの集団を増殖させて、プライミングされたＭＳＣ由来の馴化培地を産生することと、プライミングされたＭＳＣ馴化培地を回収することと、プライミングされたＭＳＣ馴化培地からエキソソームの集団を精製することとを含み得る。１種以上のプライミング剤は、ＭＳＣの集団と異なる幹細胞の集団に由来する馴化培地、Ｎｒｆ２活性化因子、またはそれらの組み合わせを含み得る。また、本明細書には、プライミングされたＭＳＣ馴化培地からのエキソソームの集団を用いて角膜および肝臓などの組織を処置する方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プライミングされた間葉系幹細胞由来のエキソソームの集団を生成する方法であって、（ａ）培養中の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を拡大することと、
（ｂ）ＭＳＣの集団とは異なる細胞集団に由来する細胞由来の馴化培地および少なくとも１つの規定されたプライミング剤でＭＳＣの集団をプライミングして、プライミングされたＭＳＣの集団を得ることと、
（ｃ）培養中でプライミングされたＭＳＣの集団を増殖させて、プライミングされたＭＳＣ由来の馴化培地を産生することと、
（ｄ）プライミングされたＭＳＣ馴化培地を回収することと
を含む、方法。
【請求項2】
さらに、（ｅ）プライミングされたＭＳＣ馴化培地からエキソソームを精製すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＭＳＣの集団をプライミングすることが、（１）ＭＳＣの集団を細胞由来の馴化培地と接触させることと、
（２）ＭＳＣの集団を少なくとも１つの規定されたプライミング剤と接触させることと
を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ＭＳＣの集団が、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで細胞由来の馴化培地と接触し、ＭＳＣの集団が、約６０％～約９０％のコンフルエンシーから開始して、少なくとも１つの規定されたプライミング剤と接触される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ＭＳＣの集団が、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで細胞由来の馴化培地と接触し、その後、少なくとも１つの規定されたプライミング剤と接触する、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ＭＳＣの集団が、約１２時間～約７２時間、少なくとも１つの規定されたプライミング剤と接触している、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
異なる細胞集団からの細胞由来の馴化培地が角膜間質幹細胞由来の馴化培地である、請求項１～５、６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
少なくとも１つの規定されたプライミング剤が、核因子赤血球２関連因子２（Ｎｒｆ２）活性化因子、サイレンシング情報調節因子１（ＳＩＲＴ１）活性化因子、またはオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
少なくとも１つのプライミング剤が、Ｎｒｆ２活性化因子である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
Ｎｒｆ２活性化因子が、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）またはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
ＭＳＣの集団が、骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）の集団、臍帯由来のＭＳＣ（ＵＭ－ＭＳＣ）の集団、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のＭＳＣ（ｉＰＳＣ－ＭＳＣ）の集団、またはホウォートンゼリー由来のＭＳＣ（ＷＪ－ＭＳＣ）の集団である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ＢＭ－ＭＳＣの集団がヒトＢＭ－ＭＳＣの集団である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
細胞由来の馴化培地が角膜幹細胞由来の馴化培地であり、規定されたプライミング剤がＤＭＦまたはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
角膜幹細胞由来の馴化培地が、約１０％～約３０％の濃度で存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ＤＭＦが約５０μＭ～約１００μＭの濃度で存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法で産生された、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項17】
プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、（ａ）低発現レベルの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；および
（ｂ）高発現レベルの神経成長因子（ＮＧＦ）
のうちの１つ以上を有することによって特徴付けられる、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項18】
プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームが、プライミングされていない間葉系幹細胞由来のエキソソームと比較して、（ｃ）高発現レベルの肝増殖因子（ＨＧＦ）；および
（ｄ）高発現レベルのｓＦＬＴ１
のうちの１つ以上によって特徴付けられる、請求項１７に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項19】
プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームが、プライミングされていない間葉系幹細胞由来のエキソソームと比較して、（ａ）少なくとも２倍高い発現レベルのｓＦＬＴ１；
（ｂ）プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームにおける発現の４分の１またはそれ未満である発現レベルのＶＥＧＦ；
（ｃ）少なくとも２倍高い発現レベルのＨＧＦ；および
（ｄ）少なくとも３倍高い発現のＮＧＦ
のうちの１つ以上によって特徴付けられる、請求項１７または請求項１８に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項20】
プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームが、プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、（ａ）少なくとも２倍高い発現レベルのｓＦＬＴ１；
（ｂ）プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームにおける発現の４分の１またはそれ未満である発現レベルのＶＥＧＦ；
（ｃ）少なくとも２倍高い発現レベルのＨＧＦ；および
（ｄ）少なくとも３倍高い発現のＮＧＦ
のうちの２つ以上によって特徴付けられる、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項21】
プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームが、プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、（ａ）少なくとも２倍高い発現レベルのｓＦＬＴ１；
（ｂ）プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームにおける発現の４分の１またはそれ未満である発現レベルのＶＥＧＦ；
（ｃ）少なくとも２倍高い発現レベルのＨＧＦ；および
（ｄ）少なくとも３倍高い発現のＮＧＦ
によって特徴付けられる、請求項２０に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項22】
プライミングされたＭＳＣが、（１）ＭＳＣの集団を角膜幹細胞由来の馴化培地と接触させること；および
（２）ＭＳＣの集団をＮｒｆ２活性化因子と接触させること
によって調製される、請求項１７～２１のいずれか一項に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団の組成物。
【請求項23】
Ｎｒｆ２活性化因子がＤＭＦまたはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である、請求項２２に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団の組成物。
【請求項24】
ＭＳＣの集団が、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで角膜幹細胞由来の馴化培地と接触し、ＭＳＣの集団が、約６０％～約９０％のコンフルエンシーから開始して、Ｎｒｆ２活性化因子と接触される、請求項２２～２３に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項25】
ＭＳＣの集団が、約１２時間～約７２時間、Ｎｒｆ２活性化因子と接触している、請求項２５に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項26】
角膜欠損を処置するための方法であって、角膜欠損を有する角膜表面に、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の治療用量のエキソソームの集団を投与することを含む、方法。
【請求項27】
角膜欠損が、角膜瘢痕、角膜炎、角膜潰瘍、角膜擦過傷、角膜上皮損傷、角膜間質損傷、感染に基づく角膜損傷、トラコーマ、円錐角膜、角膜穿孔、角膜輪部傷害、角膜ジストロフィー、血管形成、春季角結膜炎およびドライアイからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
角膜欠損が角膜炎である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
エキソソームの集団が、角膜表面に適用するために製剤化された眼科組成物に含まれる、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
組成物が点眼液である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
点眼液が生体適合性ポリマーを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
生体適合性ポリマーが架橋性であり、方法が、点眼液を角膜表面に投与し、架橋性ポリマーの十分な部分を架橋して、点眼液をヒドロゲルに変換することを含む、請求項３１に記載の方法。［請求項３２］
角膜表面に適用するために製剤化され、請求項１７～２５のいずれか一項に記載のエキソソームの集団を含む眼科組成物。
【請求項33】
眼科組成物が点眼液中にある、請求項２９に記載の眼科組成物。
【請求項34】
点眼液が生体適合性ポリマーを含む、請求項３３に記載の眼科組成物。
【請求項35】
眼科組成物がヒドロゲルであり、生体適合性ポリマーの少なくとも一部が架橋されている、請求項３４に記載の眼科組成物。
【請求項36】
プライミングされた間葉系幹細胞由来のエキソソームの集団を生成する方法であって、（ａ）培地中で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を培養することと、
（ｂ）ＭＳＣの集団をＮｒｆ２活性化因子でプライミングして、プライミングされたＭＳＣの集団を得ることと、
（ｃ）回収培地中でプライミングされたＭＳＣの集団を増殖させ、回収培地がプライミングされたＭＳＣによって産生されたエキソソームで濃縮されるようになり、それによって、プライミングされたＭＳＣ由来の馴化培地を産生することと、
（ｄ）プライミングされたＭＳＣ馴化培地を回収することと
を含む、方法。
【請求項37】
（ｅ）プライミングされたＭＳＣ馴化培地からエキソソームを精製することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
ＭＳＣの集団が、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで第１の培地中で増殖され、次にＮｒｆ２活性化因子と接触される、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
ＭＳＣの集団が、約１２時間～７２時間、Ｎｒｆ２活性化因子と接触している、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
Ｎｒｆ２活性化因子が、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）またはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
ＤＭＦが約５０μＭ～約１００μＭの濃度で存在する、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
ＭＳＣの集団が、骨髄ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）の集団、臍帯由来のＭＳＣ（ＵＭ－ＭＳＣ）の集団、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のＭＳＣ（ｉＰＳＣ－ＭＳＣ）の集団、またはホウォートンゼリー由来のＭＳＣ（ＷＪ－ＭＳＣ）の集団である、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
ＭＳＣの集団がＢＭ－ＭＳＣの集団である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
請求項３６～４３のいずれか一項に記載の方法で産生された、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項45】
プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、（ａ）高発現レベルの肝増殖因子（ＨＧＦ）；および
（ｂ）高発現レベルの神経増殖因子（ＮＧＦ）
のうちの１つ以上を有することによって特徴付けられる、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項46】
プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームが、プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、（ａ）高発現レベルのＨＧＦ；および
（ｂ）高発現レベルのＮＧＦ
によって特徴付けられる、請求項４５に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項47】
プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームが、プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、（ａ）ＨＧＦの少なくとも１．２倍高い発現レベルのＨＧＦ；および
（ｂ）ＮＧＦの少なくとも２倍高い発現レベルのＮＧＦ
のうちの一方または両方によって特徴付けられる、請求項４５または請求項４６に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項48】
プライミングされたＭＳＣが、（１）第１の培地中でＭＳＣの集団を増殖させること；および
（２）ＭＳＣの集団をＮｒｆ２活性化因子と接触させること
によって調製される、請求項４５～４７のいずれか一項に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項49】
Ｎｒｆ２活性化因子がＤＭＦまたはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である、請求項４８に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項50】
ＤＭＦが約５０μＭ～約１００μＭの濃度で存在する、請求項４９に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項51】
ＭＳＣが、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで第１の培地中で増殖され、次にＮｒｆ２活性化因子と接触される、請求項４８～５１のいずれか一項に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項52】
ＭＳＣの集団が、約１２時間～約７２時間、Ｎｒｆ２活性化因子と接触され、次に回収培地と交換される、請求項５１に記載のプライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団。
【請求項53】
肝臓状態を有する対象に、請求項４４～５２のいずれか一項に記載の治療量のエキソソームの集団を投与することを含む、肝臓状態を処置する方法。
【請求項54】
肝臓状態が非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
ＮＡＦＬＤが、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
ＮＡＦＬＤがＮＡＳＨである、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
エキソソームの集団が静脈内経路を介して肝臓に投与される、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の方法。［請求項５６］ 静脈内経路が肝門脈を介する、請求項５７の請求項に記載の方法。
［請求項５７］ 請求項４４～５２のいずれか一項に記載のエキソソームの集団を含む組成物。
【請求項58】
（原文に記載なし）
【請求項59】
肝臓状態の処置に使用するための、請求項４４～５２のいずれか一項に記載のエキソソーム。
【請求項60】
肝臓状態が非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、請求項５９に記載のエキソソーム。
【請求項61】
ＮＡＦＬＤが非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項６０に記載のエキソソーム。
【請求項62】
ＮＡＦＬＤがＮＡＳＨである、請求項６１に記載のエキソソーム。
【請求項63】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団によるエキソソームの分泌を増加させる方法であって、（ａ）培地中でＭＳＣの集団を培養することと、
（ｂ）ＭＳＣの集団をＮｒｆ２活性化因子でプライミングして、プライミングされたＭＳＣの集団を得ることと、
（ｃ）回収培地中でプライミングされたＭＳＣの集団を増殖させ、回収培地がプライミングされたＭＳＣによって産生されたエキソソームで濃縮されるようになることと
を含む、方法。
【請求項64】
ＭＳＣの集団が、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで第１の培地中で増殖され、次にＮｒｆ２活性化因子と接触される、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
ＭＳＣの集団が、約１２時間～７２時間、Ｎｒｆ２活性化因子と接触している、請求項６３または請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
Ｎｒｆ２活性化因子が、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）またはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である、請求項６３～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
ＤＭＦが約５０μＭ～約１００μＭの濃度で存在する、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
ＭＳＣの集団が、骨髄ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）の集団、臍帯由来のＭＳＣ（ＵＭ－ＭＳＣ）の集団、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のＭＳＣ（ｉＰＳＣ－ＭＳＣ）の集団、またはホウォートンゼリー由来のＭＳＣ（ＷＪ－ＭＳＣ）の集団である、請求項６３～６７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月１１日に出願されたインド出願第２０２１４１０３６３３１号の優先権を主張する。すべての出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年８月１１日に出願されたインド出願第２０２１４１０３６３３１号の優先権を主張する。すべての出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
線維症、炎症の処置、創傷治癒および組織再生の促進において、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および細胞由来エキソソームを用いた無細胞療法の有効性を実証するいくつかの説得力のある前臨床研究および臨床研究がある。ＭＳＣの治療効果は、エキソソームを含む細胞によって分泌されるパラクリン因子に大いに起因している。
【0003】
エキソソームを分泌するＭＳＣは、例えば、限定されないが、腫瘍などの細胞間通信のメディエーターとして機能し、腫瘍形成、血管新生、転移および細胞内コミュニケーションにおいていくつかの役割を果たす。エキソソームは、細胞間のクロストークのメディエーターとして作用するナノスケールの細胞外小胞（ＥＶ）である。ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＭＳＣ－Ｅｘｏ）は、カーゴタンパク質として、例えば、増殖因子、サイトカイン、脂質部分、ならびに核酸、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ならびにヒトにおけるエキソソームの抗線維化、抗炎症および再生促進治療効果を提供し得る他の非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を含有する。ＭＳＣ－Ｅｘｏはまた、組織再生および炎症において重要ないくつかのシグナル伝達経路（Ａｋｔ、ＥＲＫ、およびＳＴＡＴ３）を活性化するとともに、多数の増殖因子の発現を誘導することが見出されている。ＭＳＣ自体は治療剤として用いることができるが、ＭＳＣよりＭＳＣ－Ｅｘｏを用いる利点には、免疫原性が低く、拒絶反応のリスクが低く、腫瘍形成性が低いことが含まれる。ＭＳＣ－Ｅｘｏはまた、肺の初回通過作用を被る可能性が低く、これは安全とシステム全体のデリバリーの両方の実行に重要である。したがって、ＭＳＣに由来するエキソソームは、ある特定の疾患および欠陥の処置において試みられてきた。
【0004】
しかしながら、エキソソームカーゴの補体は、ＭＳＣをプライミングし、それらの活性および転写プロファイルに影響する培養中のプライミング剤によって影響される。結果として、プライミングは、良くも悪くも、予期せぬ方法で、与えられたＭＳＣ集団によって産生されたエキソソームの治療効果に劇的に影響する場合がある。
【0005】
さらに、ＭＳＣ－Ｅｘｏは、ＭＳＣ－Ｅｘｏを分泌するＭＳＣから採取される。ＭＳＣを大量に拡大することは、ＭＳＣ－Ｅｘｏベースの治療の特質のうちの１つである。しかしながら、当該技術分野において利用可能な従来の方法では、商業規模での治療的適用のためのＭＳＣおよびその分泌される産物の産生の十分なスケールアップをすることはできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、プライミング剤および関連するＭＳＣ培養方法を特定して、プライミングされたＭＳＣおよびそれによって産生されるＭＳＣ－Ｅｘｏを産生させ、それによって、高く、改善された治療効果を有するエキソソームの十分な供給を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本明細書には、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエキソソームの集団を生成する方法の実施形態が提供され、本方法は、（ａ）培養中間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を拡大することと、（ｂ）ＭＳＣの集団とは異なる細胞集団に由来する細胞由来の馴化培地および少なくとも１つの規定されたプライミング剤でＭＳＣの集団をプライミングして、プライミングされたＭＳＣの集団を得ることと、（ｃ）プライミングされたＭＳＣの集団を培養中で増殖させて、プライミングされたＭＳＣ由来の馴化培地を産生することと、（ｄ）プライミングされたＭＳＣ馴化培地を回収することとを含む。いくつかの変形形態では、本方法は、プライミングされたＭＳＣ馴化培地からエキソソームを精製することを含む。
【0008】
いくつかの変形形態では、ＭＳＣの集団のプライミングは、（１）ＭＳＣの集団を細胞由来の馴化培地と接触させることと、（２）ＭＳＣの集団を少なくとも１つの規定されたプライミング剤と接触させることとを含む。適宜、ＭＳＣの集団は、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで細胞由来の馴化培地と接触し、ＭＳＣの集団が、約６０％～約９０％のコンフルエンシーから開始して、少なくとも１つの規定されたプライミング剤と接触される。適宜、ＭＳＣの集団は、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで細胞由来の馴化培地と接触し、その後、少なくとも１つの規定されたプライミング剤と接触する。適宜、ＭＳＣの集団は、約１２時間～約７２時間、少なくとも１つの規定されたプライミング剤と接触している。
【0009】
いくつかの変形形態では、異なる細胞集団からの細胞由来の馴化培地は角膜間質幹細胞由来の馴化培地である。
【0010】
いくつかの変形形態では、少なくとも１つの規定されたプライミング剤は、核因子赤血球２関連因子２（Ｎｒｆ２）活性化因子、サイレンシング情報調節因子１（ＳＩＲＴ１）活性化因子、またはオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）である。適宜、少なくとも１つのプライミング剤は、Ｎｒｆ２活性化因子である。適宜、Ｎｒｆ２活性化因子は、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）またはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である。
【0011】
いくつかの変形形態では、ＭＳＣの集団は、骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）の集団、臍帯由来のＭＳＣ（ＵＭ－ＭＳＣ）の集団、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のＭＳＣ（ｉＰＳＣ－ＭＳＣ）の集団、またはホウォートンゼリー由来のＭＳＣ（ＷＪ－ＭＳＣ）の集団である。適宜、ＢＭ－ＭＳＣの集団はヒトＢＭ－ＭＳＣの集団である。
【0012】
いくつかの変形形態では、細胞由来の馴化培地は角膜幹細胞由来の馴化培地であり、規定されたプライミング剤はＤＭＦまたはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である。適宜、角膜幹細胞由来の馴化培地は、約１０％～約３０％の濃度で存在する。適宜、ＤＭＦは約５０μＭ～約１００μＭの濃度で存在する。
【0013】
また、本明細書には、上記方法の実施形態で産生された、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団の実施形態が提供される。
【0014】
また、本明細書には、プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、（ａ）低発現レベルの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；および（ｂ）高発現レベルの神経成長因子（ＮＧＦ）のうちの１つ以上を有することによって特徴付けられる、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団の実施形態が提供される。適宜、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームは、プライミングされていない間葉系幹細胞由来のエキソソームと比較して、（ｃ）高発現レベルの肝増殖因子（ＨＧＦ）；および（ｄ）高発現レベルのｓＦＬＴ１のうちの１つ以上によって特徴付けられる。適宜、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームは、プライミングされていない間葉系幹細胞由来のエキソソームと比較して、（ａ）少なくとも２倍高い発現レベルのｓＦＬＴ１；（ｂ）プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームにおける発現の４分の１またはそれ未満である発現レベルのＶＥＧＦ；（ｃ）少なくとも２倍高い発現レベルのＨＧＦ；および（ｄ）少なくとも３倍高い発現のＮＧＦのうちの１つ、または２つ以上の組み合わせ、３つ以上の組み合わせ、またはすべてによって特徴付けられる。いくつかの変形形態では、プライミングされたＭＳＣは、（１）ＭＳＣの集団を角膜幹細胞由来の馴化培地と接触させること；および（２）ＭＳＣの集団をＮｒｆ２活性化因子と接触させることによって調製される。適宜、Ｎｒｆ２活性化因子は、ＤＭＦまたはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である。適宜、ＭＳＣの集団は、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで角膜幹細胞由来の馴化培地と接触し、ＭＳＣの集団は、約６０％～約９０％のコンフルエンシーから開始して、Ｎｒｆ２活性化因子と接触される。適宜、ＭＳＣの集団は、約１２時間～約７２時間、Ｎｒｆ２活性化因子と接触している。
【0015】
また、本明細書では、角膜欠損を処置するための方法の実施形態が提供され、本方法は、角膜欠損を有する角膜表面に、本明細書に開示される治療用量のエキソソームの集団を投与することを含む。適宜、角膜欠損は、角膜瘢痕、角膜炎、角膜潰瘍、角膜擦過傷、角膜上皮損傷、角膜間質損傷、感染に基づく角膜損傷、トラコーマ、円錐角膜、角膜穿孔、角膜輪部傷害、角膜ジストロフィー、血管形成、春季角結膜炎およびドライアイからなる群から選択される。いくつかの変形形態では、エキソソームの集団は、角膜表面に適用するために製剤化された眼科組成物に含まれる。適宜、組成物は点眼液である。適宜、点眼液は生体適合性ポリマーを含む。適宜、生体適合性ポリマーは架橋性であり、本方法は、点眼液を角膜表面に投与し、架橋性ポリマーの十分な部分を架橋して、点眼液をヒドロゲルに変換することを含む。
【0016】
また、本明細書には、角膜表面上に適用するために製剤化され、本明細書に開示されるエキソソームの集団を含む眼科組成物の実施形態が提供される。適宜、眼科組成物は点眼液中にある。適宜、点眼液は生体適合性ポリマーを含む。適宜、眼科組成物はヒドロゲルであり、生体適合性ポリマーの少なくとも一部は架橋されている。
【0017】
また、本明細書には、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエキソソームの集団を生成する方法の実施形態が提供され、本方法は、（ａ）培地中で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を培養することと、（ｂ）ＭＳＣの集団をＮｒｆ２活性化因子でプライミングして、プライミングされたＭＳＣの集団を得ることと、（ｃ）回収培地中でプライミングされたＭＳＣの集団を増殖させ、回収培地がプライミングされたＭＳＣによって産生されたエキソソームで濃縮されるようになり、それによって、プライミングされたＭＳＣ由来の馴化培地を産生することと、（ｄ）プライミングされたＭＳＣ馴化培地を回収することとを含む。適宜、本方法は、（ｅ）プライミングされたＭＳＣ馴化培地からエキソソームを精製することをさらに含む。適宜、ＭＳＣの集団は、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで第１の培地中で増殖され、次にＮｒｆ２活性化因子と接触される。適宜、ＭＳＣの集団は、約１２時間～７２時間、Ｎｒｆ２活性化因子と接触している。適宜、Ｎｒｆ２活性化因子は、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）またはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である。適宜、ＤＭＦは約５０μＭ～約１００μＭの濃度で存在する。適宜、ＭＳＣの集団は、骨髄ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）の集団、臍帯由来のＭＳＣ（ＵＭ－ＭＳＣ）の集団、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のＭＳＣ（ｉＰＳＣ－ＭＳＣ）の集団、またはホウォートンゼリー由来のＭＳＣ（ＷＪ－ＭＳＣ）の集団である。
【0018】
また、本明細書には、上記の方法で産生された、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団の実施形態が提供される。
【0019】
また、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームの集団が提供され、プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、（ａ）高発現レベルの肝増殖因子（ＨＧＦ）；および（ｂ）高発現レベルの神経増殖因子（ＮＧＦ）のうちの１つ以上を有することによって特徴付けられる。適宜、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームは、プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、（ａ）高発現レベルのＨＧＦ；および（ｂ）高発現レベルのＮＧＦによって特徴付けられる。適宜、プライミングされたＭＳＣ由来のエキソソームは、プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、（ａ）少なくとも１．２倍高い発現レベルのＨＧＦ；および（ｂ）少なくとも２倍高い発現レベルのＮＧＦのうちの一方または両方によって特徴付けられる。
【0020】
いくつかの変形形態では、プライミングされたＭＳＣは、（１）第１の培地中でＭＳＣの集団を増殖させること；および（２）ＭＳＣの集団をＮｒｆ２活性化因子と接触させることによって調製される。適宜、Ｎｒｆ２活性化因子はＤＭＦまたはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である。適宜、ＤＭＦは約５０μＭ～約１００μＭの濃度で存在する。適宜、ＭＳＣは、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで第１の培地中で増殖され、次にＮｒｆ２活性化因子と接触される。適宜、ＭＳＣの集団は、約１２時間～約７２時間、Ｎｒｆ２活性化因子と接触され、次に回収培地と交換される。
【0021】
また、本明細書には、肝臓状態を処置する方法の実施形態が提供され、本方法は、肝臓状態を有する対象に、本明細書に提供される治療量のエキソソームの集団を投与することを含む。適宜、肝臓状態は非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。適宜、ＮＡＦＬＤは非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。適宜、エキソソームの集団は静脈内経路を介して肝臓に投与される。適宜、静脈内経路は肝門脈を介する。
【0022】
また、本明細書には、上記の本明細書に開示されるエキソソームの集団を含む組成物の実施形態が提供される。適宜、組成物は、肝臓状態の処置に使用するためのものである。適宜、肝臓状態は非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。適宜、ＮＡＦＬＤは非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。
【0023】
本明細書には、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団によるエキソソームの分泌を増加させる方法の実施形態が提供され、本方法は、（ａ）培地中でＭＳＣの集団を培養することと、（ｂ）ＭＳＣの集団をＮｒｆ２活性化因子でプライミングして、プライミングされたＭＳＣの集団を得ることと、（ｃ）回収培地中でプライミングされたＭＳＣの集団を増殖させ、回収培地がプライミングされたＭＳＣによって産生されたエキソソームで濃縮されるようになることとを含む。適宜、ＭＳＣの集団は、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで第１の培地中で増殖され、次にＮｒｆ２活性化因子と接触される。適宜、ＭＳＣの集団は、約１２時間～７２時間、Ｎｒｆ２活性化因子と接触している。適宜、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）またはイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）である。適宜、ＤＭＦは約５０μＭ～約１００μＭの濃度で存在する。適宜、ＭＳＣの集団は、骨髄ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）の集団、臍帯由来のＭＳＣ（ＵＭ－ＭＳＣ）の集団、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のＭＳＣ（ｉＰＳＣ－ＭＳＣ）の集団、またはホウォートンゼリー由来のＭＳＣ（ＷＪ－ＭＳＣ）の集団である。
【0024】
本主題のこれらのおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲を参照して、よりよく理解される。この概要は、簡略化された形での概念の選択を紹介するために提供されている。この概要は、請求される主題の主要な特徴または本質的特徴を特定することを意図したものではなく、請求される主題の範囲を限定するために使用されることを意図したものでもない。
【0025】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の態様をさらに例示するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、図面を参照することによってより良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】図１Ａ～１Ｅは、角膜間質幹細胞由来の馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ）でプライミングされたヒト骨髄由来のＭＳＣ（ｈＢＭ－ＭＳＣ）のセクレトームの定量化の棒グラフを示す。定量化は、ｈＢＭ－ＭＳＣを増殖させた培地またはその画分の酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいた。ｈＢＭ－ＭＳＣ細胞をＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングし（培地の２０％のうちの１０％をＣＳＳＣ－ＣＭで置換した）、本開示の実施形態に従って、プライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣ細胞のセクレトームプロファイル、特にＨＧＦ（図１Ａ）、ＶＥＧＦ（図１Ｂ）、ｓＦＬＴ１（図１Ｃ）、ＩＬ－６（図１Ｄ）、ＮＧＦ（図１Ｅ）の分泌レベルが特徴付けられた。
【図2】図２Ａ～２Ｅは、指示されたプライミングされたエキソソームの存在下でリポ多糖（ＬＰＳ）結合タンパク質で刺激されたＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞上のプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣ由来のエキソソームの抗炎症効果の定量化の棒グラフを示す。サイトカイン発現は、本開示の実施形態に従って、ＩＬ－６（図２Ａ）、ＩＬ－１β（図２Ｂ）、ＩＬ－１０（図２Ｃ）、ＴＮＦ－α（図２Ｄ）、およびＩＦＮγ（図２Ｅ）についてＥＬＩＳＡによって測定された。
【図3】図３Ａ～３Ｅは、指示されたプライミングされたエキソソーム（５億個のエキソソーム）の存在下、ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞からのサイトカイン発現の定量化の棒グラフを示す。サイトカイン発現は、それぞれＩＬ－６（図３Ａ）、ＩＬ－１β（図３Ｂ）、ＴＮＦ－α（図３Ｃ）、ＩＬ－１０（図３Ｄ）およびＩＦＮγ（図３Ｅ）について定量ＰＣＴ（ｑＰＣＲ）によって測定された。
【図4】図４Ａ～４Ｆは、ＴＧＦ－βにより処置されたヒト皮膚線維芽細胞上の異なるエキソソーム変異体の抗線維化性の特徴付けの代表的な免疫蛍光画像を示す。ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）は、２４時間、ＴＧＦ－β（図４Ｂ）および指示されたエキソソーム（図４Ｃ～４Ｆ）と同時に処置された。細胞を固定し、α－ＳＭＡ発現を免疫染色により評価した。ＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－βのみにより処置された細胞においてα－ＳＭＡ発現を誘導し、これは、本開示の実施形態に従って、ＣＳＳＣでプライミングされたＢＭ－ＭＳＣエキソソーム（図４Ｄ～４Ｅ）およびＣＳＳＣ－エキソソーム（図４Ｆ）の存在下で、および少量でナイーブｈＢＭ－ＭＳＣ－エキソソーム（図４Ｃ）によってブロックされた。
【図5】図５は、Ｎｒｆ２活性化因子（ＤＭＦまたは４－ＯＩ）によって媒介されるＢＭ－ＭＳＣのプライミングの効果を示す棒グラフを示し、異なるプライミング条件下でのセクレトームおよびエキソソームプロファイルを特徴付ける。データは３回の技術的複製±ＳＥＭを表す。ＮＲＦ２活性化因子ＤＭＦは、本開示の実施形態に従って、エキソソームのより高い収率を示す。
【図6】図６Ａ～６Ｆは、異なるプライミング条件下でプライミングされた細胞のセクレトームマーカープロファイリングの定量化の棒グラフを示す。ＨＧＦ（図６Ａ）、ＩＬ－６（図６Ｂ）、ＶＥＧＦ（図６Ｃ）、ｓＦＬＴ１（図６Ｄ）、ＮＧＦ（図６Ｅ）およびＳＤＦ－１（図６Ｆ）の分泌は、ＥＬＩＳＡによってタンパク質レベルで定量化された。ＨＧＦ（図６Ａ）の発現は、すべてのプライミングされた変異体において高かったが、一方、ＶＥＧＦおよびｓＦＬＴ１レベルは変化しなかった（図６Ｃ～６Ｄ）。クルクミンおよびＮｒｆ２活性化因子はＩＬ－６の発現を減弱させたが（図６Ｂ）、一方、ＮＧＦ分泌レベルはＮｒｆ２活性化因子４－ＯＩおよびＤＭＦによって増強された（図６Ｅ）。クルクミンによる馴化培地＋ＤＭＦの組み合わせは、本開示の実施形態に従って、いずれの読み取りに対しても顕著な効果をもたないようであった。
【図7】図７Ａ～７Ｅは、クルクミン（ＣＵＲ）およびＮｒｆ２活性化因子ＤＭおよび４－ＯＩなどの異なるプライミング剤を用いたプライミング下で、ＭＳＣによって分泌されるエキソソームのカーゴ（エキソソームタンパク質など）をプロファイリングする定量化の棒グラフを示す。定量化されたカーゴには、エキソソームＨＧＦ（図７Ａ）、エキソソームＶＥＧＦ（図７Ｂ）、エキソソームｓＦＬＴ１（図７Ｃ）、エキソソームＮＧＦ（図７Ｄ）、エキソソームＴＧＦ－β（図７Ｅ）、およびエキソソームＳＤＦ－１（図７Ｆ）が含まれる。エキソソームＨＧＦは、ナイーブＭＳＣと比較して、すべてのプライミングされた変異体において高かった。エキソソームＮＧＦの発現は、Ｎｒｆ２活性化因子プライミング（特にＤＭＦ）によって誘導された。ｓＦＬＴ１、ＴＧＦ－βおよびＳＤＦ－１レベルは変化しなかった。
【図8】図８Ａ～８Ｅは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞における、プライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣ由来エキソソーム（ｈＢＭ－ＭＳＣ－Ｅｘｏ）の抗炎症効果の定量化の棒グラフを示す。ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞は、指示されたプライミングされたエキソソーム（４億個のエキソソーム）の存在下、ＬＰＳで刺激された。サイトカイン発現は、本開示の実施形態に従って、ＩＬ－６（図８Ａ）、ＩＬ－１β（図８Ｂ）、ＩＬ－１０（図８Ｃ）、ＴＮＦ－α（図８Ｄ）、およびＩＦＮγ（図８Ｅ）についてＥＬＩＳＡによって測定された。
【図9】図９Ａ～９Ｄは、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子で組み合わせてプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームのエキソソームカーゴタンパク質の定量化の棒グラフを示す。定量化は、本開示の実施形態に従って産生された精製されたエキソソームに適用されたＥＬＩＳＡに基づいた。エキソソームＨＧＦ（図９Ａ）、エキソソームＶＥＧＦ（図９Ｂ）、エキソソームｓＦＬＴ１（図９Ｃ）、およびエキソソームＮＧＦ（図９Ｄ）をＥＬＩＳＡによってタンパク質レベルで定量化した。
【図10】図１０Ａ～１０Ｅは、Ｎｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ）を用いてＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされた異なるエキソソーム変異体の抗炎症活性の特徴付けの定量化の棒グラフを示す。ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞は、指示されたプライミングされたエキソソーム（約５億個のエキソソーム）の存在下、ＬＰＳで刺激された。サイトカイン発現は、本開示の実施形態に従って、それぞれＩＬ－６（図１０Ａ）、ＩＬ－１β（図１０Ｂ）、ＴＮＦ－α（図１０Ｃ）、ＩＬ－１０（図１０Ｄ）およびＩＦＮγ（図１０Ｅ）についてＥＬＩＳＡによって測定された。
【図11】図１１Ａ～１１Ｆは、ＴＧＦ－βにより処置されたヒト皮膚線維芽細胞上の、ＣＳＳＣ－ＣＭおよび／またはＮｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ）でプライミングされたＢＭ－ＭＳＣ由来の異なるエキソソーム変異体の抗線維化活性の特徴付けの代表的な免疫蛍光画像を示す。ヒト皮膚線維芽細胞は、２４時間、ＴＧＦ－βおよび指示されたエキソソーム変異体により処置され、α－ＳＭＡ発現についてプローブされた。ＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－βのみで処置された細胞においてα－ＳＭＡを誘導したが（図１１Ｂ）、一方、エキソソームは、上に示されたように、異なる程度までａ－ＳＭＡの誘導を阻害した。
【図12】図１２は、複数の時点にわたって観察された、ＣＳＳＣ－ＣＭおよび／またはＮｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ）でプライミングされた、異なるエキソソーム変異体、ｈＢＭ－ＭＳＣの創傷治癒活性の特徴付けの代表的な画像を示す。上皮細胞の単層上の創傷閉鎖（２Ｄスクラッチアッセイ）の時間経過を示す代表的な画像は、０時間、２４時間、４８時間、および７２時間の複数時点にわたって観察された。本開示の実施形態に従って、ＢＭ－ＭＳＣ；ＣＳＳＣ－ＣＭ（２０％）；Ｎｒｆ２活性化因子：ＤＭＦ。
【図13】図１３は、ナイーブエキソソーム、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム、Ｎｒｆ２活性化因子、またはそれらの組み合わせを含む異なるエキソソーム変異体により処置された細胞のコンフルエンスを追跡する細胞遊走／細胞増殖アッセイのグラフを示す。
【図14】図１４は、未処置対照、液体角膜生体ポリマー、ならびに液体角膜生体ポリマーとＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子、ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームとの組み合わせを含む開いた上皮創傷を有するウサギ角膜を用いた創傷治癒アッセイの代表的な画像を示す。
【図15】図１５Ａは、健常な肝スフェロイド、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイド、またはエキソソームで処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドにおいてＣＹＰ３４Ａについて染色された代表的な免疫蛍光画像を示す。 図１５Ｂは、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドおよびエキソソームで処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドを含むヒト肝スフェロイド中の分泌されたアルブミンレベルの２４時間、４８時間、および７２時間後の定量化の棒グラフを示す。 図１５Ｃは、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドおよびエキソソームで処置された肝スフェロイドにおいて、線維症マーカーであるコラーゲンについて染色された代表的な免疫蛍光画像を示す。 図１５Ｄは、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドおよびエキソソームで処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドを含むヒト肝スフェロイドにおけるコラーゲン沈着の被覆率の定量化の棒グラフを示す。 図１５Ｅは、健常な肝スフェロイド、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイド、およびエキソソームで処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドにおいて、線維症マーカーであるα－ＳＭＡについて染色された代表的な免疫蛍光画像を示す。 図１５Ｆは、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドまたはエキソソームで処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドを含むヒト肝スフェロイドにおけるα－ＳＭＡの強度の定量化の棒グラフを示す。
【図16】図１６Ａは、ＢＭ－ＭＳＣに由来するプライミングされたエキソソームにより処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの包括的遺伝子発現プロファイルの遺伝子発現ヒートマップを示す。 図１６Ｂは、プライミングされたエキソソームにより処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの差次的に発現された遺伝子を比較する主成分分析プロットを示す。
【図17】図１７Ａは、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソームにより処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドのプロファイルの肝臓特異的遺伝子の遺伝子発現ヒートマップを示す。 図１７Ｂは、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソームにより処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドのプロファイルの非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）／線維症関連遺伝子の遺伝子発現ヒートマップを示す。 図１７Ｃは、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソームにより処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドのプロファイルの星細胞特異的遺伝子の遺伝子発現ヒートマップを示す。 図１７Ｄは、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソームにより処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドのプロファイルの生体異物代謝プロセスに関連する遺伝子の遺伝子発現ヒートマップを示す。 図１７Ｅは、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソームにより処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドのプロファイルの脂肪酸代謝遺伝子の遺伝子発現ヒートマップを示す。 図１７Ｆは、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソームにより処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドのプロファイルのエポキシゲナーゼｐ４５０経路に関連する遺伝子の遺伝子発現ヒートマップを示す。 図１７Ｇは、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソームにより処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドのプロファイルの脂肪線維関連遺伝子の遺伝子発現ヒートマップを示す。
【図18】図１８Ａは、ＮＡＳＨ／線維症関連遺伝子、包括的遺伝子、および肝スフェロイド中の肝臓特異的遺伝子についてのＪａｃｃａｒｄ類似性指数に基づくプロットを示す。 図１８Ｂは、肝スフェロイドにおける神経形成、血管形成、および炎症応答遺伝子に関連する遺伝子についてのＪａｃｃａｒｄ類似性指数に基づくプロットを示す。 図１８Ｃは、肝スフェロイドにおける細胞外マトリックス、創傷治癒、および組織リモデリングに関連する遺伝子についてのＪａｃｃａｒｄ類似性指数に基づくプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外の変形および改変に供されることを認識する。本開示は、すべてのこのような変形および改変を含むことが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書において言及または指示されているすべてのこのような工程、特徴、組成物、および化合物を個別にまたは集合的に、およびこのような工程もしくは特徴のいずれかまたは複数の任意またはすべての組み合わせを含む。
【0028】
定義
便宜上、本開示のさらなる記載の前に、本明細書において採用されるある特定用語および例をここに概説する。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして読まれ、当業者によって理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、当業者に認識され、公知である意味を有するが、便宜上、完全性のために、特定の用語およびそれらの意味を以下に記載する。
便宜上、本開示のさらなる記載の前に、本明細書において採用されるある特定用語および例をここに概説する。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして読まれ、当業者によって理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、当業者に認識され、公知である意味を有するが、便宜上、完全性のために、特定の用語およびそれらの意味を以下に記載する。
【0029】
冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、物品の文法的対象物の１つまたは１を超える（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。
【0030】
用語「含む」および「含んでいる」は、包括的、開放的な意味で使用され、追加のエレメントが含まれ得ることを意味する。これは「だけからなる」と解釈されることを意図していない。
【0031】
本明細書全体を通して、文脈上別異の解釈が必要とされない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述されたエレメントもしくは工程、またはエレメントもしくは工程のグループを包含することを意味するが、任意の他のエレメントもしくは工程またはエレメントもしくは工程のグループを排除することを意味しない。
【0032】
用語「含んでいる」は、「含むがこれに限定されない」を意味するために使用される。「含んでいる」および「含むがこれに限定されない」は互換的に使用される。
【0033】
本書面の目的のために、用語「拡大されたプライミングされた間葉系幹細胞の集団」とは、培養のために最初に得られた間葉系幹細胞の集団と比較して、増加した細胞数を有する間葉系幹細胞の集団を指す。培養プロセスは細胞を分化させず、単に細胞マニホールドの数を増加させるだけである。さらに、プライミングとは、小分子プライミング剤の使用を指す。
【0034】
用語「三次元培養」または「３Ｄ培養」とは、生体細胞が、すべての三次元において、増殖し、それらの周囲と相互作用することを可能にするインビトロで細胞を培養するシステムを指す。
【0035】
用語「二次元培養」または「２Ｄ培養」とは、生体細胞がそれらの周囲と二次元的に相互作用することができる表面上の単層として細胞を培養する方法を指す。
【0036】
用語「スフェロイドベースのシステム」とは、本開示に記載される方法によるスフェロイドの形成により、三次元的に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養するプロセスを指す。
【0037】
用語「マイクロキャリアベースのシステム」とは、本開示に記載される方法に従ってアルギン酸－ゼラチン（Ａｌｇ／Ｇｅｌ）マイクロキャリアまたはマイクロビーズの形成によって、三次元的に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養するプロセスを指す。
【0038】
用語「マイクロキャリア」および「マイクロビーズ」は互換的に使用され、本開示に記載されるアルギン酸－ゼラチン（Ａｌｇ／Ｇｅｌ）マイクロキャリアまたはマイクロビーズを指す。
【0039】
用語「間葉系幹細胞由来の馴化培地」または「ＭＳＣ－ＣＭ」とは、ＭＳＣの増殖後に得られる培地を指す。このようにして得られた馴化培地は、分泌される細胞モジュレーターおよび組織再生に重要な複数の因子を含む。このようにして得られた馴化培地はまた、セクレトーム、および治療目的に適用し得る前に馴化培地から精製する必要のあるエキソソームを含む。本明細書に記載されるように、拡大されたＭＳＣを得るためのプロセスはまた、ＭＳＣ－ＣＭの形成をもたらし、したがって、単一のプロセスが、拡大されたプライミングされたＭＳＣの集団ならびにＭＳＣ－ＣＭの調達をもたらすと言える。
【0040】
用語「エキソソーム」とは、タンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡ（ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡなどの種々のタイプを含む）などのカーゴ生体分子として、一般にそれらを分泌する生体細胞から含有する、ナノスケール範囲（例えば、２０～２００ｎｍ範囲）の細胞により分泌される細胞外小胞を指す。生体分子のいくつかは、抗炎症性、抗線維化性および再生性を有することができ、臨床的に興味深いものであり得る。
【0041】
用語「マイクロ分子」または「小分子」は合成または天然に存在する、細胞挙動の化学修飾剤として定義され、治療特性を誘導する。小分子は、８００Ｄａ未満の分子量を有する。
【0042】
用語「巨大分子」は、８００Ｄａを超える分子量を有する生物学的因子である。本開示において、巨大分子は、タンパク質、脂質、核酸、増殖因子、サイトカイン、および馴化培地の成分を含む。
【0043】
本書面の目的のために、用語「角膜輪部幹細胞」とは、角膜輪部幹細胞ニッチに常在する幹細胞の集団を指す。角膜輪部幹細胞とは、主に角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）および輪部上皮幹細胞（ＬＥＳＣ）によって表される幹細胞の集団を指す。
【0044】
用語「角膜間質幹細胞由来の馴化培地」または「ＣＳＳＣ－ＣＭ」とは、角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）を増殖させる培地を指す。本明細書に記載されるＣＳＳＣ－ＣＭは、当該技術分野において公知である方法でＣＳＳＣを培養することによるか、または本明細書に開示される方法に従ってＣＳＳＣを培養することにより得られる。
【0045】
本開示に記載される用語「ゼノフリー」とは、ヒト以外の動物に由来するいずれの生成物も含まない培地を指す。ゼノフリーである本方法は、その臨床応用の妥当性のために重要な利点である。
【0046】
用語「対象」とは、治療剤、例えばエキソソームを含む組成物とともに投与され得る動物対象を指す。動物対象は、哺乳動物対象であり得る。哺乳動物対象は、本開示において言及される状態を被っているか、またはその状態と診断されたものであり得る。哺乳動物対象はヒト対象であり得る。
【0047】
用語「治療有効量」は、対象の状態を処置するために必要とされる組成物の量を指す。
【0048】
本明細書中の用語「ナイーブ細胞」とは、いかなる馴化培地でもプライミングされていない、プライミングされていない間葉系幹細胞を指す。したがって、プライミングされていないおよびナイーブという用語は、本開示において互換的に使用される。
【0049】
異なるインビトロ細胞培養法によるＭＳＣの大きな変動性にもかかわらず、臨床試験におけるＭＳＣ療法の成功を制限している従来の方法に関連する様々な制限がある。免疫媒介性、炎症性、および変性疾患の過酷な微小環境に対するＭＳＣの高い感受性は、依然としてＭＳＣベースの治療の成功に大きな障害である。不快な組織環境は移植されたＭＳＣの機能および生存を制限し得る。さらに、ＭＳＣの均質な集団の使用は、治療的適用におけるそれらの使用を制限した。また、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での過剰拡大による細胞老化、凍結保存後の機能喪失、ならびに前臨床および臨床試験間のインビボでの治療効果の不一致など、多くの他の制限がＭＳＣベースの治療を危うくしている。
【0050】
当該技術分野において直面する課題に対処するために、本開示の一態様は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の生成およびＭＳＣから精製されるエキソソームの産生のための方法を提供する。いくつかの変形形態では、本開示で提供される方法は、マーカーのシグネチャーセットを発現する種々の供給源から間葉系幹細胞の亜集団を単離することを含む。いくつかの変形形態では、間葉系幹細胞の亜集団は、前記ＭＳＣに由来する細胞および治療用エキソソームのスケーラブルであり、均一な産生を促進するために、操作されたＭＳＣ（ｅＭＳＣ）の倍加可能性を延長することができるｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を用いてさらに修飾され得る。
【0051】
本開示の方法の別の態様は、他の幹細胞集団に由来する小分子および巨大分子、ならびに／または馴化培地などの１種以上のプライミング剤でＭＳＣをプライミングすることである。本開示の方法に由来する細胞およびエキソソームは、臨床応用のために、そのようにまたは互いに組み合わせて使用することができる。いくつかの変形形態では、ナイーブＭＳＣの集団からの馴化培地を用いて、異なる組織源からのナイーブＭＳＣの異なる集団をプライミングすることができる。いくつかの変形形態では、２種以上のプライミング剤の使用、すなわち、コンビナトリアルプライミング戦略は、ＭＳＣ、および／またはＭＳＣによって分泌されるエキソソームの再生、抗炎症、および抗線維化性のうちの１つ以上を増強し得る。提示の便宜のために、ナイーブＭＳＣによって分泌されたエキソソームは、本明細書において「ナイーブエキソソーム」と呼ぶことができ、例えば、１種以上のプライミング剤および／または他の細胞からの馴化培地でプライミングされたＭＳＣによって分泌されたエキソソームは、本明細書において「プライミングされたエキソソーム」または「プライミングされたエキソソーム変異体」と呼ばれ得る。ナイーブ／プライミングされたＭＳＣに加えてナイーブまたはプライミングされたエキソソームは、治療的適用のためにそのようにまたはそれらの組み合わせで、および複数の満たされていない臨床的ニーズに対処するために、異なる細胞ベースの治療法で使用することができる。
【0052】
本開示は、臍帯血由来の間葉系幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）／ホウォートンゼリー由来のＭＳＣ（ＷＪ－ＭＳＣ）／骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）のインビトロ培養、ならびにその後の抗線維化、抗炎症／免疫調節および血管新生促進活性のうちの１つ以上に関連する濃縮された因子を有する固有の亜集団の選択を指す。前記方法を行うために、エキソソームは、定義されたＭＳＣ集団から単離され得、包括的に特徴付けられ得る。本開示は、細胞の再生、幹性および抗炎症性を増強するために、限定されないが、Ｎｒｆ２活性化因子、ＳＲＴ１活性化因子、ＡＴＲＡ、馴化培地を単独でまたはそれらを組み合わせて含む、異なるプライミング剤（いくつかの例では、臨床的に承認されたプライミング剤）を用いて、ＵＣ－ＭＳＣ、ＷＪ－ＭＳＣ、およびＢＭ－ＭＳＣなどの種々のＭＳＣ集団をプライミングするプロトコールおよび／方法論を記載する。単一プライミングまたはコンビナトリアルプライミングを用いて、特異的な／濃縮されたカーゴ装填因子を用いて異なるエキソソーム変異体を生成することができる。いくつかの変形形態では、エキソソーム変異体は、それらの機能的有効性について物理的および分子レベルの両方で特徴付けられ得る。いくつかの変形形態では、エキソソーム変異体は、肺機能不全、急性呼吸窮迫、炎症関連障害、例えば、限定されないが、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルスクラスの感染症、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、インフルエンザ、結核、全身性狼瘡、変形性関節症、ＮＡＳＨ、肝線維症、ムーレン潰瘍、神経栄養性潰瘍、心筋梗塞などの異なる炎症性および線維症関連疾患に対するそれらの機能に基づいて分類され得る。
【0053】
いくつかの変形形態では、プライミング剤は、以下のうちの１つであり得る：（ａ）Ｎｒｆ２活性化因子によるプライミング：理論に束縛されることなく、いくつかの変形形態では、Ｎｒｆ２活性化因子によるプライミングは、プライミングされたＭＳＣおよびＭＳＣによって分泌されるエキソソームの抗炎症性を増強する。プライミングされたＭＳＣによって分泌されたエキソソーム（「プライミングされたエキソソーム」）は、炎症関連障害の処置に有利なカーゴで濃縮され得る。炎症関連障害の例としては、リウマチ性関節炎、全身性若年性特発性関節炎、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルスクラスの感染、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、インフルエンザ、結核、全身性狼瘡、変形性関節症、非アルコール性脂肪肝障害（ＮＡＦＬＤ）（非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）であり得る）、肝線維症、ムーレン潰瘍、神経栄養性潰瘍、および心筋梗塞が挙げられる；（ｂ）ＳＩＲＴ１活性化因子を用いたプライミング；（ｃ）Ｎｒｆ２活性化因子＋ＳＩＲＴ１活性化因子を用いたコンビナトリアルプライミング：理論に束縛されることなく、いくつかの変形形態では、再生治療効果は、Ｎｒｆ２活性化因子と同様に、ＳＲＴ１活性化因子でＭＳＣをプライミングすることによって増強される。濃縮された治療グレードのエキソソームは、血管組織再生に適用することができる。いくつかの変形形態では、ＳＲＴ１活性化因子およびＮｒｆ２活性化因子とのコンビナトリアルプライミングは、抗炎症、抗線維化、および血管新生促進作用のうちの１つ以上を有する増強された治療カーゴ装填因子を用いてエキソソームを産生するようにＭＳＣを誘導し得る；（ｄ）Ｎｒｆ２活性化因子＋ＣＳＳＣ由来の馴化培地（ＣＣＳＣ－ＣＭ）とのコンビナトリアルプライミング：いくつかの変形形態では、理論に束縛されることなく、ＣＳＳＣ－ＣＭとのＤＭＦなどのＮｒｆ２活性化因子とのコンビナトリアルプライミングは、抗炎症因子で濃縮されるが、血管新生因子において減少させるエキソソームを産生するためのＭＳＣを誘導する。したがって、Ｎｒｆ２活性化因子およびＣＳＳＣ－ＣＭで組み合わせてプライミングされたＭＳＣ由来のプライミングされたエキソソームは、角膜などの無血管組織の再生に使用することができる；（ｅ）ＮＲＦ２活性化因子＋ＳＩＲＴ１活性化因子＋全トランスレチノイン酸＋ＣＳＳＣ－ＣＭ。さらに、プライミングプロセスにおける物理的（低酸素状態の微小環境を作り出す）または化学的（ＨＩＦ－１α）誘導因子を介した低酸素症の誘導は、プライミングされたＭＳＣの生存性および幹性を増加させる。本開示はまた、低酸素状態の存在下および非存在下で、特定のＢＭ－ＭＳＣ／ＵＣ－ＭＳＣ／ＷＪ－ＭＳＣ中のＳＲＴ１活性化因子およびＮｒｆ２活性化因子とのコンビナトリアルプライミングのプロトコールを開示し、肺、肝臓、および血管組織のバイオエンジニアリングおよび３Ｄバイオプリンティングにおける再生療法の処置のために、より有意な治療的に濃縮されたエキソソームを生成する。本開示の目的は、同数の生成物生成実行および下流の処理を維持しながら、細胞収率を有意に向上させ、より大きな患者コホートに対処することである。
【0054】
いくつかの変形形態では、ＭＳＣ集団は、細胞および治療用エキソソームのスケーラブルであり、均一な産生を促進するために、操作されたＭＳＣ（ｅＭＳＣ）の倍加可能性を延長するｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を用いて修飾され得る。ＭＳＣ、ｅＭＳＣ、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）における特異的経路を調節すること、および／または種々のコンビナトリアルプライミングプロトコールを適用することは、下流用途にカスタマイズされるエキソソームを生成するために使用され得る。
【0055】
本開示は、供給材料として、ヒト骨髄、脂肪組織、臍帯、制限されていない体性幹細胞、ホウォートンゼリー、歯髄由来のＭＳＣ、ｉＰＳＣ、操作された細胞、角膜輪部幹細胞を含む種々の供給源に由来するＭＳＣを提供する。ＭＳＣは、マーカーのシグネチャーセットを発現し、所定の条件または条件セットに対して治療的に有効であるエキソソームを産生する固有の亜集団または変異体を生成するように増殖され得、プライミングされてもよい。
【0056】
本開示の一態様は、骨髄、脂肪、臍帯などの種々の組織源に由来するＭＳＣを、無血管または血管組織の再生のための、抗炎症、抗線維症、創傷前治癒、血管新生（促進／抗）、および再神経支配因子のうちの１つまたは２つ以上の組み合わせを含む、カーゴとして濃縮された因子を有する治療用エキソソームの産生のためのある特定の経路を活性化するための誘導因子の特定の組み合わせでプライミングすることにある。
【0057】
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示に属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書に言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0058】
本開示は、例示の目的のみを意図した、本明細書に記載される特定の実施形態によって、範囲において限定されるものではない。機能的に同等な生成物、組成物、および方法は、本明細書に記載されるように、明らかに本開示の範囲内である。
【0059】
プライミングされた間葉系幹細胞由来のエキソソームを生成させるための方法
本開示の一部の実施形態では、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエキソソームの集団を生成する方法１００が提供される。図２０は、方法１００の実施形態のフローチャートを示す。本方法は、以下の工程を含み得る：工程１０１－培養中の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を拡大する工程；工程１０３－培養中に１種以上のプライミング剤を投与して、ＭＳＣの集団をプライミングし、プライミングされたＭＳＣの集団を得る工程；工程１０５－培養中でプライミングされたＭＳＣの集団を増殖させて、プライミングされたＭＳＣ由来の馴化培地を産生する工程；および工程１０７－プライミングされたＭＳＣ馴化培地を回収する工程。いくつかの変形形態では、本方法は、さらに、工程１０９－プライミングされたＭＳＣ－馴化培地からエキソソームの集団を精製する工程を含む。
本開示の一部の実施形態では、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエキソソームの集団を生成する方法１００が提供される。図２０は、方法１００の実施形態のフローチャートを示す。本方法は、以下の工程を含み得る：工程１０１－培養中の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を拡大する工程；工程１０３－培養中に１種以上のプライミング剤を投与して、ＭＳＣの集団をプライミングし、プライミングされたＭＳＣの集団を得る工程；工程１０５－培養中でプライミングされたＭＳＣの集団を増殖させて、プライミングされたＭＳＣ由来の馴化培地を産生する工程；および工程１０７－プライミングされたＭＳＣ馴化培地を回収する工程。いくつかの変形形態では、本方法は、さらに、工程１０９－プライミングされたＭＳＣ－馴化培地からエキソソームの集団を精製する工程を含む。
【0060】
ＭＳＣ集団のタイプ
いくつかの変形形態では、ＭＳＣの集団は、骨髄由来の間葉系幹細胞、脂肪由来の間葉系幹細胞、臍帯由来の間葉系幹細胞、ホウォートンゼリー由来の間葉系幹細胞、歯髄由来の間葉系幹細胞、誘導多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞、角膜輪部幹細胞、および角膜間質幹細胞からなる群から選択され得る。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、初代細胞、または操作された細胞であり得る。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、一次供給源に新鮮に由来され得るかまたは凍結保存され、次に解凍され得る。
いくつかの変形形態では、ＭＳＣの集団は、骨髄由来の間葉系幹細胞、脂肪由来の間葉系幹細胞、臍帯由来の間葉系幹細胞、ホウォートンゼリー由来の間葉系幹細胞、歯髄由来の間葉系幹細胞、誘導多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞、角膜輪部幹細胞、および角膜間質幹細胞からなる群から選択され得る。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、初代細胞、または操作された細胞であり得る。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、一次供給源に新鮮に由来され得るかまたは凍結保存され、次に解凍され得る。
【0061】
いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、ＣＤ３４－、α－ＳＭＡ－、ＣＤ４６＋、ＣＤ４７＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋／－、ＣＤ５４＋、ＣＤ５８＋、ＣＤ１０６＋、ＣＤ１４２＋／－、ＣＤ１４６＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ２７３＋、ＣＤ２７４＋、ＣＤ２７６＋、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される幹細胞マーカーを発現する幹細胞の亜集団であり得る。いくつかの変形形態では、幹細胞の亜集団は、以下の通りに単離することができる：（ａ）幹細胞の亜集団から間葉系幹細胞の第１の亜集団を選択し、間葉系幹細胞の第１の亜集団は、ＣＤ３４－、α－ＳＭＡ－、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、およびＣＤ１６６＋からなる群から選択される陽性マーカーを発現し、（ｂ）幹細胞の亜集団から間葉系幹細胞の第２の亜集団を選択し、間葉系幹細胞の第２の亜集団は、ＣＤ１４６＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ５８＋、およびＣＤ１４２＋／－からなる群から選択されるマーカーを発現する。
【0062】
いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、非ウイルス性ヒトテロメラーゼ酵素逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を含み得る。
【0063】
培地
いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、ゼノフリー培地中で拡大させることができる。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、低酸素状態の条件下で増殖され得、０．２～１０％の範囲で培地中の酸素を有してもよい。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、拡大された幹細胞を得るために、最小必須培地および５～２０ＩＵ／μｌの範囲の少なくとも１つのタイプのコラゲナーゼ酵素と培養することができ、少なくとも１つのタイプのコラゲナーゼ酵素は、コラゲナーゼ－Ｉとコラゲナーゼ－ＩＩの組み合わせである。
いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、ゼノフリー培地中で拡大させることができる。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、低酸素状態の条件下で増殖され得、０．２～１０％の範囲で培地中の酸素を有してもよい。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、拡大された幹細胞を得るために、最小必須培地および５～２０ＩＵ／μｌの範囲の少なくとも１つのタイプのコラゲナーゼ酵素と培養することができ、少なくとも１つのタイプのコラゲナーゼ酵素は、コラゲナーゼ－Ｉとコラゲナーゼ－ＩＩの組み合わせである。
【0064】
プライミング剤
一部の実施形態では、プライミング剤をＭＳＣに適用して、細胞の活性または遺伝子発現パターンを変化させ得る。プライミング剤によってＭＳＣに誘導される変化は、影響を受けたＭＳＣによって産生され、分泌されるエキソソームの、ある特定の生体分子の存在またはカーゴ中のある特定の生体分子の相対的発現などの、１つ以上の特徴の変化をもたらし得るかまたはその変化を誘導し得る。プライミング剤は、大分子または小分子などの定義された物質であり得る。大分子は、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡなど）などの生体分子である。タンパク質は、小分子であり得る。いくつかの変形形態では、プライミング剤は、Ｎｒｆ２活性化因子、ＳＩＲＴ１（サイレンシング情報調節因子１）活性化因子、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＭＬ２２８、ＭＤＬ８００、イソケルセチン、フコイダン、ルテオリン、ケルセチン、５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、５－フェニルアルコキシプソラレン（Ｐｓｏｒａ－４）、チエノピリドン（Ａ－７６９６６２）、メトホルミン、ラパマイシン、５－アザシチジン（５－Ａｚａ）、ＵＭ１７１、ＳＢ２０３５８０、フィセチン、アトルバスタチン、バルプロ酸、スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）、アスタキサンチン（ＡＴＸ）、コハク酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される群からの小分子であり得る。
一部の実施形態では、プライミング剤をＭＳＣに適用して、細胞の活性または遺伝子発現パターンを変化させ得る。プライミング剤によってＭＳＣに誘導される変化は、影響を受けたＭＳＣによって産生され、分泌されるエキソソームの、ある特定の生体分子の存在またはカーゴ中のある特定の生体分子の相対的発現などの、１つ以上の特徴の変化をもたらし得るかまたはその変化を誘導し得る。プライミング剤は、大分子または小分子などの定義された物質であり得る。大分子は、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡなど）などの生体分子である。タンパク質は、小分子であり得る。いくつかの変形形態では、プライミング剤は、Ｎｒｆ２活性化因子、ＳＩＲＴ１（サイレンシング情報調節因子１）活性化因子、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＭＬ２２８、ＭＤＬ８００、イソケルセチン、フコイダン、ルテオリン、ケルセチン、５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、５－フェニルアルコキシプソラレン（Ｐｓｏｒａ－４）、チエノピリドン（Ａ－７６９６６２）、メトホルミン、ラパマイシン、５－アザシチジン（５－Ａｚａ）、ＵＭ１７１、ＳＢ２０３５８０、フィセチン、アトルバスタチン、バルプロ酸、スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）、アスタキサンチン（ＡＴＸ）、コハク酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される群からの小分子であり得る。
【0065】
いくつかの変形形態では、Ｎｒｆ２活性化因子は、適宜１０～２５０μＭの範囲の濃度を有するフマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、適宜１０～５００μＭの範囲の濃度を有するイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）、および適宜０．１～１０μＭの範囲の濃度を有する２－シアノ－３，１２－ジオキソレアナ－１，９（１１）－ジエン－２８－オイ酸のイミダゾール誘導体（ＣＤＤＯ－Ｉｍ）、適宜１～２０μＭの範囲の濃度を有するクルクミン、および適宜０．１～１００μＭの範囲の濃度を有するベルベリンからなる群から選択され得る。
【0066】
いくつかの変形形態では、ＳＩＲＴ１活性化因子は、適宜０．０１ｎＭ～１０ｎＭの範囲の濃度を有するＳＲＴ－２１０４、適宜０．１μＭ～１０μＭの範囲の濃度を有するトランス－レスベラトロール、適宜１０～２００μＭの範囲の濃度を有するトランス－レスベラトロール、０．１～１０μＭの範囲の濃度を有するＳＲＴ－１７２０、適宜５０～２００μＭの範囲の濃度を有するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、適宜０．０８～２．２５μＭの範囲の濃度を有するニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、または１～１００００μＭ、１～１００μＭ、１００～１００００μＭ、１０～１００μＭ、または１００～１０００μＭの範囲の濃度を有するニコチンアミドリボシド（ＮＲ）からなる群から選択され得る。
【0067】
いくつかの変形形態では、少なくとも１つの定義されたプライミング剤は、適宜０．１～５００μＭの範囲の濃度を有する全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、適宜１～１０μＭの範囲の濃度を有するＭＬ２２８、適宜５～５００μＭの範囲の濃度を有するＭＤＬ８００、適宜０．０１～５０００μＭの範囲の濃度を有するイソケルセチン、適宜０．００００１～０．００１μＭの範囲の濃度を有するフコイダン、適宜１０～１００μＭの範囲の濃度を有するルテオリン、適宜０．１～１０μＭの範囲の濃度を有するケルセチン、適宜１０００～１００００μＭの範囲の濃度を有する５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、適宜０．０１～２００μＭの範囲の濃度を有する５－フェニルアルコキシプソラレン（Ｐｓｏｒａ－４）、適宜１０～２００μＭの範囲の濃度を有するチエノピリドン（Ａ－７６９６６２）、適宜１～１００００μＭの範囲の濃度を有するメトホルミン、適宜０．００１～０．１μＭの範囲の濃度を有するラパマイシン、適宜０．１～１μＭの範囲の濃度を有する５－アザシチジン（５－Ａｚａ）、適宜０．０１～０．１μＭの範囲の濃度を有するＵＭ１７１、適宜１～１０μＭの範囲の濃度を有するＳＢ２０３５８０、適宜１～５０μＭの範囲の濃度を有するフィセチン、適宜０．１～２０μＭの範囲の濃度を有するアトルバスタチン、適宜５００～５０００μＭの範囲の濃度を有するバルプロ酸、適宜０．０１～０．１μＭの範囲の濃度を有するスフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）、適宜０．０１～１００μＭの範囲の濃度を有するアスタキサンチン（ＡＴＸ）、適宜１０～５００μＭの範囲の濃度を有するコハク酸塩、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【0068】
いくつかの変形形態では、少なくとも１つのプライミング剤は、少なくとも１つのプライミング剤でプライミングされたＭＳＣの集団とは異なる、細胞の集団、適宜幹細胞の集団に由来する馴化培地を含み得る。いくつかの変形形態では、馴化培地は、角膜間質幹細胞由来の馴化培地および輪部上皮幹細胞由来の馴化培地からなる群から選択される。いくつかの変形形態では、プライミング剤として役立つように培地中に添加された馴化培地の容量パーセンテージ（濃度）は、ＭＳＣが増殖している培地に関して、５～５０％、１０～５０％、１５～４０％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、または約３０％の範囲である。
【0069】
いくつかの変形形態では、ＭＳＣの少なくとも１つのプライミング剤への曝露のための時間は、１２～７２時間、２４～７２時間、もしくは２４～４８時間の範囲、または約２４時間もしくは約４８時間であり得る。いくつかの変形形態では、ＭＳＣの少なくとも１つのプライミング剤への曝露のための時間は、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシー、約７０％～９０％のコンフルエンシー、約７０％～８０％のコンフルエンシー、約６０％のコンフルエンシー、約７０％のコンフルエンシー、または約８０％のコンフルエンシーまでであり得る。
【0070】
コンビナトリアルプライミング
いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、２種以上のプライミング剤に同時に、または部分的に重複させるかもしくは全く重複させないで連続的に曝露され得る。いくつかの変形形態では、各々または両方のプライミング剤についてプライミングのための時間は、１２～７２時間の範囲であり得る。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシー、約７０％～９０％のコンフルエンシー、約６０％のコンフルエンシー、約７０％のコンフルエンシー、または約８０％のコンフルエンシーまで第１の培地中に含まれる第１のプライミング剤に曝露され得、次に、第２のプライミング剤を含む第２の培地と交換され、適宜１２～７２時間、２４～７２時間、または２４～４８時間の範囲で第２のプライミング剤に曝露され得る。
いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、２種以上のプライミング剤に同時に、または部分的に重複させるかもしくは全く重複させないで連続的に曝露され得る。いくつかの変形形態では、各々または両方のプライミング剤についてプライミングのための時間は、１２～７２時間の範囲であり得る。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシー、約７０％～９０％のコンフルエンシー、約６０％のコンフルエンシー、約７０％のコンフルエンシー、または約８０％のコンフルエンシーまで第１の培地中に含まれる第１のプライミング剤に曝露され得、次に、第２のプライミング剤を含む第２の培地と交換され、適宜１２～７２時間、２４～７２時間、または２４～４８時間の範囲で第２のプライミング剤に曝露され得る。
【0071】
いくつかの変形形態では、ＭＳＣの集団は、少なくとも１つのＮｒｆ２活性化因子および少なくとも１つのＳＩＲＴ１活性化因子でプライミングされ得る。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、少なくとも１つのＮｒｆ２活性化因子、およびＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされ得る。いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、少なくとも１つのＮｒｆ２活性化因子、少なくとも１つのＳＩＲＴ１活性化因子、およびＡＴＲＡでプライミングされ得る。
【0072】
いくつかの変形形態では、ＭＳＣの集団は、少なくとも１つのＮｒｆ２活性化因子および少なくとも１つのＳＩＲＴ１活性化因子の組み合わせでプライミングされ得る。Ｎｒｆ２活性化因子は、適宜１０～２５０μＭの範囲の濃度を有するフマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、適宜１０～５００μＭの範囲の濃度を有するイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）、または適宜０．１～１０μＭの範囲の濃度を有する２－シアノ－３，１２－ジオキソオレアナ－１，９（１１）－ジエン－２８－オイ酸のイミダゾール誘導体（ＣＤＤＯ－Ｉｍ）からなる群から選択され得る。少なくとも１つのＳＩＲＴ１活性化因子は、適宜０．０１～１０ｎＭの範囲の濃度を有するＳＲＴ－２１０４、適宜０．１～１０μＭの範囲の濃度を有するトランス－レスベラトロール、または適宜０．１～１０μＭの範囲の濃度を有するＳＲＴ－１７２０からなる群から選択され得る。いくつかの変形形態では、Ｎｒｆ２活性化因子およびＳＩＲＴ１活性化因子は、ＭＳＣに、同時に、または部分的に重複させるかもしくは全く重複させないで連続的に投与され得、各々または両方の定義されるプライミング剤についてのプライミングのための時間は、１２～７２時間の範囲内である。
【0073】
いくつかの変形形態では、ＭＳＣの集団は、少なくとも１つのＮｒｆ２活性化因子およびＣＳＳＣ－ＣＭの組み合わせでプライミングされ得る。理論に束縛されることなく、Ｎｒｆ２活性化因子およびＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたＭＳＣによって分泌されるエキソソームは、有利には、比較可能なナイーブＭＳＣの集団からのエキソソームと比較して、比較的減少した血管新生因子を有する一方で、抗炎症因子を比較的に濃縮することができる。このように、Ｎｒｆ２活性化因子およびＣＳＳＣ－ＣＭで組み合わせてプライミングされたＭＳＣからのエキソソームは、角膜などの非血管組織における再生を処置または誘導するのに有用であり得る。Ｎｒｆ２活性化因子は、１０～２５０μＭの範囲の濃度を有するフマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、１０～５００μＭの範囲の濃度を有するイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）、または０．１～１０μＭの範囲の濃度を有する２－シアノ－３，１２－ジオキソオレアナ－１，９（１１）－ジエン－２８－オイ酸のイミダゾール誘導体（ＣＤＤＯ－Ｉｍ）からなる群から選択され得る。いくつかの変形形態では、プライミング剤として役立つように培地中に添加されるＣＳＣＣ－ＣＭの容量パーセンテージは、ＭＳＣが増殖している培地に関して、５～５０％、１０～５０％、１５～４０％の範囲、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、または約３０％であり得る。いくつかの変形形態では、ＭＳＣのプライミングは、適宜０．２～１０％の範囲の酸素を有する低酸素状態の条件下で行うことができる。いくつかの変形形態では、ＭＳＣの集団は、播種から約６０％～約９０％のコンフルエンシーまで約２０％の濃度でＣＳＳＣ－ＣＭを含む第１の培地中で増殖させ、次に、約５０μＭおよび約１００μＭの濃度でＤＭＦを含む第２の培地と交換し、２４～２８時間の範囲の時間、第２の培地中で増殖させることができる。
【0074】
培養方法
いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、中空糸ベースの方法、マイクロキャリアベースの方法およびスフェロイドベースの方法からなる群から選択される方法において、３Ｄバイオリアクターシステム中で培養され得る。
いくつかの変形形態では、ＭＳＣは、中空糸ベースの方法、マイクロキャリアベースの方法およびスフェロイドベースの方法からなる群から選択される方法において、３Ｄバイオリアクターシステム中で培養され得る。
【0075】
いくつかの変形形態では、中空糸ベースの方法は、（ｉ）中空糸バイオリアクターシステムを提供または得る工程；（ｉｉ）工程（ａ）で得られた幹細胞をゼノフリー培地中で培養して細胞の懸濁液を得る工程；（ｉｉｉ）細胞の懸濁液を中空糸バイオリアクターシステムのカートリッジ中に注入する工程；（ｉｖ）幹細胞の懸濁液を２１～３５日間の範囲の期間インキュベートして拡大された幹細胞の集団を得る工程；（ｖ）プロテアーゼ、適宜トリプシンＥＤＴＡを、拡大された幹細胞の集団を含む中空糸バイオリアクターシステムの余分な毛細管空間に添加して拡大された幹細胞を得る工程；および（ｖｉ）拡大された幹細胞を緩衝液により処置して拡大された幹細胞を得る工程を含み得る。
【0076】
いくつかの変形形態では、マイクロキャリアベースの方法は、（ｉ）培地中にマイクロキャリアを懸濁させて懸濁液を得る工程；（ｉｉ）工程（ａ）で得られたように、懸濁液を幹細胞とともに播種する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の幹細胞を培地中で培養してマイクロキャリアに付着した拡大された幹細胞集団を得る工程；ならびに（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のマイクロキャリアを塩化ナトリウムおよびクエン酸三ナトリウムを含む溶解緩衝液と接触させてマイクロキャリアを溶解して拡大された幹細胞を得る工程を含み得る。
【0077】
いくつかの変形形態では、スフェロイドベースの方法は、（ｉ）工程（ａ）で得られた幹細胞をペレット化して幹細胞ペレットを得る工程；（ｉｉ）基底培地を含む培地に幹細胞ペレットを再懸濁して幹細胞懸濁液を得る工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた幹細胞懸濁液から幹細胞スフェロイドを提供または得る工程であって、幹細胞スフェロイドが、スフェロイドあたり６００～１０，０００細胞の範囲での幹細胞の密度を有している工程；および（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の幹細胞スフェロイドを、ＭＳＣ基底培地を含む培地中で培養して拡大された幹細胞を得る工程を含み得る。
【0078】
エキソソーム精製法
プライミングされたＭＳＣ由来の馴化培地に含まれるエキソソームは、エキソソーム精製プロセスで精製することができる。
プライミングされたＭＳＣ由来の馴化培地に含まれるエキソソームは、エキソソーム精製プロセスで精製することができる。
【0079】
いくつかの変形形態では、エキソソーム精製プロセスは、（ｉ）９０，０００～１２０，０００×ｇの範囲の速度、７０～１１０分間の範囲の時間で２～６℃の範囲の温度にてプライミングされた馴化培地を遠心分離して、ペレットを得る工程；（ｉｉ）ペレットを低血清ゼノフリー培地に溶解して、粗エキソソームを得る工程；および（ｉｉｉ）粗エキソソームで密度勾配超遠心分離を行い、エキソソームの画分を得る工程；ならびに（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーによりエキソソームの画分を精製し、濃縮されたエキソソームを得る工程を含み得る。
【0080】
いくつかの変形形態では、エキソソーム精製プロセスは、（ｉ）プライミングされた馴化培地または馴化培地を、２００～４００×ｇの範囲の速度で５～２０分間の範囲の時間、第１の遠心分離に供し、続いて、２０００～４０００×ｇの範囲の速度で１０～４０分間の範囲の時間、第２の遠心分離に供して、上清を得る工程；（ｉｉ）上清を２００～４００×ｇの範囲の速度で５～２０分間の範囲の時間、遠心分離し、続いて上清を濾過してセクレトームを得る工程；（ｃ）セクレトームを遠心分離して、ペレットを得る工程；（ｄ）ペレットを低血清ゼノフリー培地に溶解して粗溶液を得る工程；（ｅ）密度勾配超遠心分離を粗溶液で行い、エキソソームを含む画分を得る工程；および（ｆ）サイズ排除クロマトグラフィーによりエキソソームを含む画分を精製して、濃縮されたエキソソームの集団を得る工程を含み得る。
【0081】
プライミングされたエキソソームの分子特徴付け
ＭＳＣのプライミングは、例えば、濃縮されたエキソソームのＥＬＩＳＡによって測定した場合、ある特定のエキソソームタンパク質の発現レベルにおける特徴的な変化を誘導する。いくつかの変形形態では、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子を用いたＢＭ－ＭＳＣのコンビナトリアルプライミングは、プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の低いエキソソーム発現レベルならびに神経成長因子（ＮＧＦ）の高い発現レベル、肝増殖因子（ＨＧＦ）の高い発現レベル、およびｓＦＬＴ１の高い発現レベルのうちの１種または２種以上の組み合わせを有することによって特徴付けられるエキソソームの産生をもたらすことができる。いくつかの変形形態では、ＨＧＦのより高い発現レベルは、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも２倍、または約２．２倍高い発現であり得る。いくつかの変形形態では、ＮＧＦのより高い発現レベルは、少なくとも２倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、または約３．２倍高い発現であり得る。いくつかの変形形態では、ｓＦＬＴ１のより高い発現レベルは、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも２倍、または約２．２倍高い発現であり得る。いくつかの変形形態では、ＶＥＧＦのより低い発現レベルは、半分もしくはそれ未満、１／３もしくはそれ未満、または１／４もしくはそれ未満の発現であり得る。
ＭＳＣのプライミングは、例えば、濃縮されたエキソソームのＥＬＩＳＡによって測定した場合、ある特定のエキソソームタンパク質の発現レベルにおける特徴的な変化を誘導する。いくつかの変形形態では、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子を用いたＢＭ－ＭＳＣのコンビナトリアルプライミングは、プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の低いエキソソーム発現レベルならびに神経成長因子（ＮＧＦ）の高い発現レベル、肝増殖因子（ＨＧＦ）の高い発現レベル、およびｓＦＬＴ１の高い発現レベルのうちの１種または２種以上の組み合わせを有することによって特徴付けられるエキソソームの産生をもたらすことができる。いくつかの変形形態では、ＨＧＦのより高い発現レベルは、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも２倍、または約２．２倍高い発現であり得る。いくつかの変形形態では、ＮＧＦのより高い発現レベルは、少なくとも２倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、または約３．２倍高い発現であり得る。いくつかの変形形態では、ｓＦＬＴ１のより高い発現レベルは、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも２倍、または約２．２倍高い発現であり得る。いくつかの変形形態では、ＶＥＧＦのより低い発現レベルは、半分もしくはそれ未満、１／３もしくはそれ未満、または１／４もしくはそれ未満の発現であり得る。
【0082】
いくつかの変形形態では、Ｎｒｆ２活性化因子（ＤＭＦまたは４－ＯＩなど）によるＢＭ－ＭＳＣのプライミングは、プライミングされていないＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、ＨＧＦのより高い発現レベルおよび／またはＮＧＦのより高い発現レベルを有することによって特徴付けられるエキソソームの産生をもたらすことができる。いくつかの変形形態では、ＮＧＦのより高い発現レベルは、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも２倍、または約２．２倍高い発現であり得る。いくつかの変形形態では、ＨＧＦのより高い発現レベルは、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも約１．３倍、または約１．４倍高い発現であり得る。
【0083】
上記の方法に基づく組成物
本開示の態様では、本明細書に記載される方法によって得られるプライミングされたＭＳＣの集団が提供される。
本開示の態様では、本明細書に記載される方法によって得られるプライミングされたＭＳＣの集団が提供される。
【0084】
本開示の態様では、本明細書に記載される方法によって得られるプライミングされた馴化培地が提供される。
【0085】
本開示の態様では、本明細書に記載される方法によって得られた馴化培地から精製されたプライミングされたエキソソームの集団が提供される。本開示の態様では、本明細書に記載される精製されたプライミングされたエキソソームを含む組成物が提供される。いくつかの変形形態では、組成物は非経口投与用の形成であり得る。いくつかの変形形態では、組成物は、角膜表面への適用のために製剤化された眼科組成物または点眼液中にあり得る。いくつかの変形形態では、点眼液または眼科組成物は、生体適合性ポリマーを含み得る。いくつかの変形形態では、眼科組成物は、生体適合性ポリマーの少なくとも一部が架橋されたヒドロゲルであり得る。いくつかの変形形態では、生体適合性ポリマーは、コラーゲン、ヒアルロン酸、セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、ゼラチン、およびアルギン酸から選択される１種のポリマーまたは２種以上のポリマーの組み合わせを含み得る。いくつかの変形形態では、生体適合性ポリマーのうちの１種以上は、例えば、チオール化またはメタクリル化を介して架橋性であるように修飾することができる。
【0086】
本開示の態様では、本明細書に記載されるプライミングされたＭＳＣを含む組成物が提供される。
【0087】
本開示の態様では、（ａ）本明細書に記載されるプライミングされた幹細胞；（ｂ）本明細書に記載されるプライミングされた馴化培地；および（ｃ）本明細書に記載される濃縮されたエキソソームからなる群から選択される少なくとも２つの成分を含む組成物が提供される。
【0088】
状態の処置に使用するための治療方法または組成物
本開示のある特定の実施形態では、対象における状態を処置するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）本明細書に記載される濃縮されたエキソソームを提供するかまたは得る工程；および（ｂ）状態を処置するためにエキソソームを対象に投与する工程を含む。いくつかの変形形態では、投与は角膜表面上にあり得る。いくつかの変形形態では、角膜表面投与は、生体適合性ポリマーを含み得る点眼剤を用いるものであり得る。生体適合性ポリマーは架橋性ポリマーであり得、そのため、液体は架橋の際にヒドロゲルとなる。いくつかの変形形態では、投与は、非経口または静脈内投与であり得る。静脈内投与は、肝門脈を介して行うことができる。
本開示のある特定の実施形態では、対象における状態を処置するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）本明細書に記載される濃縮されたエキソソームを提供するかまたは得る工程；および（ｂ）状態を処置するためにエキソソームを対象に投与する工程を含む。いくつかの変形形態では、投与は角膜表面上にあり得る。いくつかの変形形態では、角膜表面投与は、生体適合性ポリマーを含み得る点眼剤を用いるものであり得る。生体適合性ポリマーは架橋性ポリマーであり得、そのため、液体は架橋の際にヒドロゲルとなる。いくつかの変形形態では、投与は、非経口または静脈内投与であり得る。静脈内投与は、肝門脈を介して行うことができる。
【0089】
本開示のある特定の実施形態では、対象における状態を処置するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）本明細書に記載されるプライミングされた馴化培地を提供するかまたは得る工程；および（ｂ）状態を治療するために、治療有効量の馴化培地を対象に投与する工程を含む。
【0090】
本開示のある特定の実施形態では、対象における状態を処置するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）本明細書に記載されるプライミングされた幹細胞を提供するかまたは得る工程、および（ｂ）状態を処置するために、治療有効量の拡大されたプライミングされた間葉系幹細胞集団を対象に投与する工程を含む。
【0091】
本開示のある特定の実施形態では、対象における状態を処置するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）本明細書に記載される組成物、例えば、濃縮されたエキソソーム、馴化細胞培地、プライミングされた間葉系幹細胞集団を提供するかまたは得る工程；および（ｂ）状態を処置するために、治療有効量の組成物を対象に投与する工程を含む。
【0092】
ある特定の変形形態において、上述の状態は、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、肺炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルスクラスの感染症、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、インフルエンザ、結核、全身性狼瘡、心筋梗塞、変形性関節症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、ムーレン潰瘍、神経栄養性潰瘍、角膜の角膜炎（ＣＫ）、ドライアイ疾患潰瘍、ヘルペス性単純角膜炎、ＬＡＳＩＫ後拡張症、術後角膜融解、角膜プロテーゼ後融解、角膜穿孔、神経栄養性角膜炎（ＮＫ）、円錐角膜シェーグレン症候群、粘膜類天疱瘡、スティーブンス・ジョンソン症候群、化学熱傷、および熱傷からなる群から選択され得る。
【0093】
本開示のある特定の実施形態では、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、肺炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルスクラスの感染症、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、インフルエンザ、結核、全身性狼瘡、心筋梗塞、変形性関節症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、ムーレン潰瘍、神経栄養性潰瘍、角膜の角膜炎（ＣＫ）、ドライアイ疾患潰瘍、ヘルペス性単純角膜炎、ＬＡＳＩＫ後拡張症、術後角膜融解、角膜プロテーゼ後融解、角膜穿孔、神経栄養性角膜炎（ＮＫ）、円錐角膜シェーグレン症候群、粘膜類天疱瘡、スティーブンス・ジョンソン症候群、化学熱傷、および熱傷からなる群から選択される状態の処置に使用するための、本明細書に記載される濃縮されたエキソソーム、馴化細胞培地、またはプライミングされた間葉系幹細胞集団を含む組成物が提供される。
【0094】
本開示のある特定の実施形態では、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、肺炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルスクラスの感染症、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、インフルエンザ、結核、全身性狼瘡、心筋梗塞、変形性関節症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、ムーレン潰瘍、神経栄養性潰瘍、角膜の角膜炎（ＣＫ）、ドライアイ疾患潰瘍、ヘルペス性単純角膜炎、ＬＡＳＩＫ後拡張症、術後角膜融解、角膜プロテーゼ後融解、角膜穿孔、神経栄養性角膜炎（ＮＫ）、円錐角膜シェーグレン症候群、粘膜類天疱瘡、スティーブンス・ジョンソン症候群、化学熱傷、および熱傷からなる群から選択される状態の処置に使用するための、本明細書に記載されるプライミングされた幹細胞、または本明細書に記載されるプライミングされた馴化培地、または本明細書に記載される濃縮されたエキソソームが提供される。
【0095】
ある特定の実施例およびその実施を参照して主題がかなり詳細に説明されてきたが、他の実施が可能である。
【実施例】
【0096】
ここで、本開示は、本開示の動作を例示することを意図し、本開示の範囲における任意の制限を意味するように限定的に取ることを意図しない、動作実施例を用いて例示される。別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示に属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。開示された方法および組成物の実施において、本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を使用することができるが、例示的な方法、デバイスおよび材料は、本明細書に記載される。本開示は、記載される特定の方法、および実験条件に限定されるものではなく、このような方法および条件が適用され得るように理解されるべきである。
【0097】
材料および方法
幹細胞の供給源
本開示の目的のために、ヒト骨髄（ＢＭ）、角膜輪部幹細胞、臍帯（ＵＣ）、無制限体性幹細胞、ホウォートンゼリー（ＷＪ）、歯髄（ＤＰ）および脂肪組織（ＡＤ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、操作された細胞、角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）由来の馴化培地でプライミングされたＭＳＣなどの供給源に由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、本明細書に記載される方法および細胞由来の生成物に用いることができる。この文脈で言及されている操作された細胞は、ｈＴＥＲＴで不死化された細胞である。幹細胞型の選択は、標的指示され、組織特異的である。
幹細胞の供給源
本開示の目的のために、ヒト骨髄（ＢＭ）、角膜輪部幹細胞、臍帯（ＵＣ）、無制限体性幹細胞、ホウォートンゼリー（ＷＪ）、歯髄（ＤＰ）および脂肪組織（ＡＤ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、操作された細胞、角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）由来の馴化培地でプライミングされたＭＳＣなどの供給源に由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、本明細書に記載される方法および細胞由来の生成物に用いることができる。この文脈で言及されている操作された細胞は、ｈＴＥＲＴで不死化された細胞である。幹細胞型の選択は、標的指示され、組織特異的である。
【0098】
不死化された成体幹細胞株（非ウイルス不死化されたＭＳＣ細胞株）の供給源：
（１）ｈＴＥＲＴ不死化されたヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＢＭ－ＭＳＣ）：臨床的に承認されたＣＤ１０５＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋マーカーを有する初代ＢＭ－ＭＳＣ（ナイーブ）は、ナイーブエキソソーム産生に使用され、ＣＳＳＣ馴化培地でプライミングされたナイーブＢＭ－ＭＳＣは、無血管組織再生のためのプライム変異体エキソソーム産生に使用された。臨床的に承認された非ウイルス性ヒトテロメラーゼ酵素逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）誘導化された不死化ＢＭ－ＭＳＣをエキソソームの定常産生に使用した。
（１）ｈＴＥＲＴ不死化されたヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＢＭ－ＭＳＣ）：臨床的に承認されたＣＤ１０５＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋マーカーを有する初代ＢＭ－ＭＳＣ（ナイーブ）は、ナイーブエキソソーム産生に使用され、ＣＳＳＣ馴化培地でプライミングされたナイーブＢＭ－ＭＳＣは、無血管組織再生のためのプライム変異体エキソソーム産生に使用された。臨床的に承認された非ウイルス性ヒトテロメラーゼ酵素逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）誘導化された不死化ＢＭ－ＭＳＣをエキソソームの定常産生に使用した。
【0099】
（２）ｈＴＥＲＴ不死化ヒトホウォートンゼリー由来のＭＳＣ（ＷＪＭＳＣ）／臍帯由来のＭＳＣ（ＵＣ－ＭＳＣ）細胞株：臨床的に承認されたＣＤ１６６＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋－マーカーおよびＣＤ３４－、α－ＳＭＡ－マーカーを有するＵＣ－ＭＳＣを選択し、ゼノフリー培地中で増殖させ、ナイーブエキソソームは、前述のマーカーを発現する上述の細胞集団から産生された。臨床的に承認された非ウイルス性ｈＴＥＲＴ誘導化された不死化ＵＣＭＳＣを、エキソソームの定常産生に使用した。
【0100】
［実施例１］
角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）およびナイーブ細胞（ｈＢＭ－ＭＳＣ、ＵＣ－ＭＳＣおよびＷＪ－ＭＳＣ）の取得および培養
本実施例は、角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）、ｈＢＭ－ＭＳＣ、臍帯ＵＣ－ＭＳＣ、およびＷＪ－ＭＳＣなどの幹細胞を得るかまたは培養するプロセス、ならびにゼノフリー培養条件下で拡大された幹細胞集団を得るために幹細胞を濃縮するプロセスを記載する。また、本実施例は、上述のように幹細胞から馴化培地を得るプロセスを記載する。
角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）およびナイーブ細胞（ｈＢＭ－ＭＳＣ、ＵＣ－ＭＳＣおよびＷＪ－ＭＳＣ）の取得および培養
本実施例は、角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）、ｈＢＭ－ＭＳＣ、臍帯ＵＣ－ＭＳＣ、およびＷＪ－ＭＳＣなどの幹細胞を得るかまたは培養するプロセス、ならびにゼノフリー培養条件下で拡大された幹細胞集団を得るために幹細胞を濃縮するプロセスを記載する。また、本実施例は、上述のように幹細胞から馴化培地を得るプロセスを記載する。
【0101】
１．１ ＣＳＳＣをゼノフリー条件下で培養し、ＣＳＳＣから馴化培地を回収する。
１．１．１．ゼノフリー条件下でのＣＳＳＣの単離および培養
角膜保存培地に保存した角膜組織を４～５日の妥当性で入手した。「組織仕様書」に次の詳細が記載されている組織が細胞抽出および培養に使用された：（１）移植／細胞採取のための使用期限がある組織；（２）主要死因、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨｂｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）および梅毒の欠如；（３）１平方ｍｍあたりの細胞計数；（４）敗血症および瘢痕、任意の全身感染、組織が細胞採取に適さない任意の眼の病歴の欠如。
１．１．１．ゼノフリー条件下でのＣＳＳＣの単離および培養
角膜保存培地に保存した角膜組織を４～５日の妥当性で入手した。「組織仕様書」に次の詳細が記載されている組織が細胞抽出および培養に使用された：（１）移植／細胞採取のための使用期限がある組織；（２）主要死因、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨｂｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）および梅毒の欠如；（３）１平方ｍｍあたりの細胞計数；（４）敗血症および瘢痕、任意の全身感染、組織が細胞採取に適さない任意の眼の病歴の欠如。
【0102】
徹底的なスクリーニング後、ヒトドナー由来の角膜を用いて、ゼノフリー条件下でプロトコールを用いてＣＳＳＣを誘導した。ゼノフリー条件下でＣＳＳＣを培養するためのプロセスを以下に記載する。
【0103】
ヒトドナー由来の角膜を抗生物質強化された緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、ＣＳＳＣを含むリンバスを抽出した。無菌状態では、３６０°の輪状輪を手術器具を用いて切除し、緩衝生理食塩水で洗浄し、より小さな断片に細かく刻んだ。細かく刻まれた組織断片を不完全培地（ＭＥＭ培地）に回収し、組織懸濁液に０．５Ｕの濃度で２０μＬの再構成リベラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を添加することによりリベラーゼ消化に供した。
【0104】
１６時間のインキュベーション後、２％ヒト血小板溶解物（ＨＰＬ）で強化された完全培地２ｍＬを添加することにより、酵素的消化を停止した。
【0105】
消化された組織を、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した生理食塩水中で、２００×ｇで３分間、室温で遠心分離し、続いて種々のレベルの継代を行った。
【0106】
継代０（Ｐ０）：継代０中、消化した外植片を５ｍＬのゼノフリー完全培地（ＭＥＭ＋２％ＨＰＬ、１×ＩＴＳ、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ）に再懸濁し、Ｔ２５ Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤフラスコ中で１４日間培養した。３日ごとに培地を交換した。
【0107】
継代１（Ｐ１）：継代１の間、外植片から単離された細胞をＴｒｙｐｌｅ（１Ｘ、Ｇｉｂｃｏ）でトリプシン処理し、１４日の終わりに新鮮な完全培地に再懸濁した。細胞を、継代１において、Ｔ７５ ＣｅｌｌＢＩＮＤフラスコ中で８０００細胞／ｃｍ２で播種した。０．７×１０６細胞をＰ１の３つのＴ－７５フラスコに播種し、次の継代（継代２；Ｐ２）のために、細胞を２つのＴ－７５フラスコに分割し、次に継代（継代３；Ｐ３）を細胞倍加に従って４つのＴ－７５フラスコにさらに分割した。
【0108】
Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の完全な培地交換は、以下の時点で行われた。
Ｐ１－３日目：５０％培地、すなわち２．５ｍＬ培地を補給した。
５日目：５ｍＬ培地を５ｍＬ新鮮培地に交換した。
Ｐ２－３日目：５０％培地、すなわち５ｍＬを補給した。
５日目：１０ｍＬ培地を１０ｍＬ新鮮培地に交換した。
７日目：１０ｍＬ培地を１０ｍＬ新鮮培地に交換した。
Ｐ３－３日目：５０％培地、すなわち５ｍＬを補給した。
５日目：１０ｍＬ培地を１０ｍＬ新鮮培地に交換した。
７日目：１０ｍＬ培地を１０ｍＬ新鮮培地に交換した。
Ｐ１－３日目：５０％培地、すなわち２．５ｍＬ培地を補給した。
５日目：５ｍＬ培地を５ｍＬ新鮮培地に交換した。
Ｐ２－３日目：５０％培地、すなわち５ｍＬを補給した。
５日目：１０ｍＬ培地を１０ｍＬ新鮮培地に交換した。
７日目：１０ｍＬ培地を１０ｍＬ新鮮培地に交換した。
Ｐ３－３日目：５０％培地、すなわち５ｍＬを補給した。
５日目：１０ｍＬ培地を１０ｍＬ新鮮培地に交換した。
７日目：１０ｍＬ培地を１０ｍＬ新鮮培地に交換した。
【0109】
Ｐ２およびＰ３について、約１．２×１０６のＣＳＳＣを回復させ、約８０００細胞／ｃｍ２密度で細胞播種を行った。
【0110】
表１は、継代１（Ｐ１）、継代２（Ｐ２）、および継代３（Ｐ３）で回収したＣＳＳＣ使用済み培地の容量を示す。
【0111】
【表1】
【0112】
品質管理のために、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３における細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ１０５のような幹細胞マーカー、ＰＡＸ６のような角膜細胞特異的マーカー、ならびにＳＭＡ、ＣＤ３４のような陰性マーカーなどのマーカーを用いて特徴付けられた（免疫蛍光画像）。
【0113】
１．１．２．ＣＳＳＣ培養からの馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ）の回収
上述のように、継代１－２－３から、すべての培地交換には、フラスコからの使用済み／馴化培地の回収が伴った。使用済み培地をさらに、培地を３００×ｇで１０分間遠心分離することにより前処理して、上清を回収した。上清をさらに、２０分間、４℃にて３０００×ｇで遠心分離し、続いて上清を３０分間、４℃にて１３０００×ｇで再遠心分離して、さらに処理された上清を回収した。培地を０．４５ミクロンのフィルターを通して二重濾過し、さらに０．２２ミクロンのフィルターを用いて上清を回収した。
上述のように、継代１－２－３から、すべての培地交換には、フラスコからの使用済み／馴化培地の回収が伴った。使用済み培地をさらに、培地を３００×ｇで１０分間遠心分離することにより前処理して、上清を回収した。上清をさらに、２０分間、４℃にて３０００×ｇで遠心分離し、続いて上清を３０分間、４℃にて１３０００×ｇで再遠心分離して、さらに処理された上清を回収した。培地を０．４５ミクロンのフィルターを通して二重濾過し、さらに０．２２ミクロンのフィルターを用いて上清を回収した。
【0114】
回収した上清（馴化培地）を４℃で短期（１～２日間）または－８０℃で長期保存した。
【0115】
１．２．ナイーブｈＢＭ－ＭＳＣの培養およびナイーブｈＢＭ－ＭＳＣからの馴化培地の回収
１．２．１．ゼノフリー条件下でのナイーブｈＢＭ－ＭＳＣの培養
ナイーブｈＢＭ－ＭＳＣを培養するために、１ＭヒトＢＭ－ＭＳＣ（ｈＢＭ－ＭＳＣ）細胞（継代２）をその推奨培地（ｈＢＭ－ＭＳＣ高性能培地キットＸＦ）とともに製造業者から入手し、ｈＢＭ－ＭＳＣ細胞を製造業者のプロトコールに従って培養した。簡単に説明すると、ブースター－ＭＳＣ－ゼノフリー１０ｍＬおよび基底－ＭＳＣを室温で解凍し、バイオセーフティキャビネット内で無菌的に移し、５００ｍＬ培地に再構成した。
１．２．１．ゼノフリー条件下でのナイーブｈＢＭ－ＭＳＣの培養
ナイーブｈＢＭ－ＭＳＣを培養するために、１ＭヒトＢＭ－ＭＳＣ（ｈＢＭ－ＭＳＣ）細胞（継代２）をその推奨培地（ｈＢＭ－ＭＳＣ高性能培地キットＸＦ）とともに製造業者から入手し、ｈＢＭ－ＭＳＣ細胞を製造業者のプロトコールに従って培養した。簡単に説明すると、ブースター－ＭＳＣ－ゼノフリー１０ｍＬおよび基底－ＭＳＣを室温で解凍し、バイオセーフティキャビネット内で無菌的に移し、５００ｍＬ培地に再構成した。
【0116】
培養の目的で、バイアルｈＢＭ－１Ｍ－ＸＦを液体窒素（ＬＮ）ボックスから取り出し、３７℃の水浴中で２～３分間解凍した。細胞バイアルを５０／１５ｍＬ遠心分離管に無菌的に移し、４ｍＬ培地を細胞に滴下した。２００×ｇで１０分間遠心分離した後に得られた細胞ペレットを、５ｍＬの完全培地に溶解し、品質管理として、細胞計数を記録した。試験管内の培地の容量を３０ｍＬ（製造業者のプロトコールにより推奨される）までにし、細胞をＣＥＬＬＢＩＮＤ Ｔ２２５ｃｍ２フラスコに２０００～３０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、培地容量を各フラスコ内で４０～４５ｍＬまで増量し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【0117】
コンフルエンス細胞のパーセンテージを決定するために、細胞を３日目以降、毎日観察した。培地は、細胞が８０％コンフルエンス、すなわち、（４３０００～５００００）細胞／ｃｍ２に達するまで交換させず、その後、細胞を採取する準備ができた。採取中、細胞をバイオセーフティキャビネットに移し、使用済み培地を除去し、１０ｍＬの使用済み培地を滅菌チューブ（１５～５０ｍＬ）に入れ、トリプシン酵素をクエンチした。培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、続いて１０ｍＬのＴｒｙｐＬＥを添加し、３７℃インキュベーター中でインキュベートした。表面からの細胞の脱着について細胞を５分毎にチェックした。ＴｒｙｐＬＥ活性を停止するために、等容量のクエンチ（新鮮培地）または使用済み培地を細胞に添加した。
【0118】
細胞懸濁液を滅菌した５０ｍＬ遠心分離管に移し、２００ｇで１０分間遠心分離を行った。上清を捨て、細胞を４～５ｍＬの新鮮な培地で再懸濁し、細胞懸濁液の総容量を測定した。懸濁液を得た後、０．１ｍＬの細胞懸濁液を細胞計数用のマイクロ遠心分離管に移し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を用いて希釈を行い、計数範囲（０．１～１）×１０６細胞／ｍＬを得、細胞を必要になるまで凍結保存した。
【0119】
１．２．２ ナイーブｈＢＭ－ＭＳＣからの馴化培地の回収
上述のように、１Ｍ ｈＢＭ－ＭＳＣ細胞バイアルを回復させ、３日目以降に観察した。３日目、４日目／５日目および６日目／７日目に位相差顕微鏡で画像を取得し、細胞密度を表２に示した。細胞を、細胞密度（４３０００～５００００細胞／ｃｍ２）に依存して、４／５日目に、２０ｍＬのＰＢＳで１～２×のいずれかで洗浄し、培地をＲｏｏｓｔｅｒ ＥＶ回収培地に交換した。４８時間のインキュベーション後、馴化培地を回収し、上記の実施例１．２．１に記載されるプロトコールに従って細胞を採取した。その後、細胞カウンターを用いて細胞を計数した。回収された馴化培地は、上記の実施例１．１．２に記載されるように、直ちに前処理工程で処理され、次に、前処理された馴化培地は、４℃（２４時間までの短期保存）または－８０℃（１ヵ月までの長期保存）で保存された。
上述のように、１Ｍ ｈＢＭ－ＭＳＣ細胞バイアルを回復させ、３日目以降に観察した。３日目、４日目／５日目および６日目／７日目に位相差顕微鏡で画像を取得し、細胞密度を表２に示した。細胞を、細胞密度（４３０００～５００００細胞／ｃｍ２）に依存して、４／５日目に、２０ｍＬのＰＢＳで１～２×のいずれかで洗浄し、培地をＲｏｏｓｔｅｒ ＥＶ回収培地に交換した。４８時間のインキュベーション後、馴化培地を回収し、上記の実施例１．２．１に記載されるプロトコールに従って細胞を採取した。その後、細胞カウンターを用いて細胞を計数した。回収された馴化培地は、上記の実施例１．１．２に記載されるように、直ちに前処理工程で処理され、次に、前処理された馴化培地は、４℃（２４時間までの短期保存）または－８０℃（１ヵ月までの長期保存）で保存された。
【0120】
表２は、３日目、４日目、６日目／７日目の細胞密度（細胞／ｃｍ２）を示す。
【0121】
【表2】
【0122】
１．３．ナイーブＵＣＭＳＣの培養およびナイーブＵＣＭＳＣからの馴化培地の回収
１．３．１．ナイーブＵＣＭＳＣの培養
ＵＣ－ＭＳＣ細胞は、製造業者から調達され、製造業者のプロトコールに従って、推奨されるゼノフリー培地中で培養した。簡単に説明すると、ＭＳＣ－ＸＦおよび基底－ＭＳＣを室温で暗所にて解凍し、１ボトル５００ｍＬの培地に再構成した。さらに、継代後に得られたバイアル－ヒト臍帯－１Ｘ－ＸＦ（ゼノフリー）（ｈＵＣ－１Ｍ－ＸＦ）を３７℃の水浴中で解凍し、細胞をバイオセーフティキャビネット内で無菌的に移した。細胞を１０ｍＬ培地容量中の１５／５０ｍＬ遠心分離管に移し、２８０×ｇで６分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを２０ｍＬの培地に溶解した。細胞懸濁液をさらに４つのＴ７５フラスコと２つのＴ２２５フラスコに分け、Ｔ７５フラスコの播種密度を２０００～３０００細胞／ｃｍ２の範囲内に維持し、Ｔ２２５の播種密度は２０００～３０００細胞／ｃｍ２の範囲内であった。
１．３．１．ナイーブＵＣＭＳＣの培養
ＵＣ－ＭＳＣ細胞は、製造業者から調達され、製造業者のプロトコールに従って、推奨されるゼノフリー培地中で培養した。簡単に説明すると、ＭＳＣ－ＸＦおよび基底－ＭＳＣを室温で暗所にて解凍し、１ボトル５００ｍＬの培地に再構成した。さらに、継代後に得られたバイアル－ヒト臍帯－１Ｘ－ＸＦ（ゼノフリー）（ｈＵＣ－１Ｍ－ＸＦ）を３７℃の水浴中で解凍し、細胞をバイオセーフティキャビネット内で無菌的に移した。細胞を１０ｍＬ培地容量中の１５／５０ｍＬ遠心分離管に移し、２８０×ｇで６分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを２０ｍＬの培地に溶解した。細胞懸濁液をさらに４つのＴ７５フラスコと２つのＴ２２５フラスコに分け、Ｔ７５フラスコの播種密度を２０００～３０００細胞／ｃｍ２の範囲内に維持し、Ｔ２２５の播種密度は２０００～３０００細胞／ｃｍ２の範囲内であった。
【0123】
Ｔ２２５フラスコおよびＴ７５フラスコについては、それぞれ４５ｍＬおよび１５ｍＬの培地容量を用い、３７℃で培地を維持した。コンフルエンスのパーセンテージを決定するために、３日目以降に細胞を顕微鏡で観察し、画像を取得し、続いてＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて細胞計数を行った。
【0124】
さらに、培養が８０％にコンフルエントである４日目および５日目に細胞を観察した（例えば、細胞は、Ｔ２２５フラスコについて６０ｋ－１００ｋ細胞／ｃｍ２の細胞密度であった）。細胞は、フラスコをバイオセーフティキャビネットに移し、使用済み培地を滅菌容器（約１０ｍＬ）に回収して、トリプシン酵素をクエンチすることにより採取された。培地を除去した後、それぞれのＴ２２５またはＴ７５フラスコに１０ｍＬまたは３ｍＬのＴｒｙｐＬＥを添加し、フラスコを３７℃のインキュベーター中でインキュベートした。細胞が表面から脱着されるか、または細胞が穏やかなタッピングによって取り除かれるまで、細胞培養物を５分毎にチェックした。ＴｒｙｐＬＥ活性を停止するために、等容量のクエンチまたは使用済み培地を細胞懸濁液に添加し、２８０×ｇで６分間遠心分離するために１５／５０ｍＬ遠心分離管に移した。上清を捨てた後、細胞を４～５ｍＬの新鮮な培地に再懸濁し、細胞懸濁液の総容量を測定した。ＤＰＢＳ／培地で希釈して（０．１～１）×１０６細胞／ｍＬの計数範囲を得た後、０．１ｍＬの細胞懸濁液を用いて細胞計数を行い、細胞はさらに使用するまで凍結保存された。
【0125】
１．３．２．ナイーブＵＣＭＳＣからの馴化培地の回収
ナイーブＵＣ－ＭＳＣから細胞外小胞（ＥＶ）を生成するために、１Ｍ細胞バイアルを上記のように回復し、細胞を３日目以降に観察して、表３に提供されるように、細胞密度を用いて３日目、４日目／５日目および６日目／７日目に位相差顕微鏡を用いて画像を取得した。４／５日目に、細胞密度（６０～１００ｋ）細胞／ｃｍ２（Ｔ２２５フラスコ）に依存して、すなわち、ほぼ８０％コンフルエンスで、細胞を２０ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、培地を細胞外小胞（ＥＶ）回収培地に交換した。４８時間のインキュベーション後、馴化培地を回収し、細胞を採取し、細胞カウンターで計数した。回収された馴化培地は、上記の実施例１．１．２に記載されるように、直ちに前処理工程で処理された。
ナイーブＵＣ－ＭＳＣから細胞外小胞（ＥＶ）を生成するために、１Ｍ細胞バイアルを上記のように回復し、細胞を３日目以降に観察して、表３に提供されるように、細胞密度を用いて３日目、４日目／５日目および６日目／７日目に位相差顕微鏡を用いて画像を取得した。４／５日目に、細胞密度（６０～１００ｋ）細胞／ｃｍ２（Ｔ２２５フラスコ）に依存して、すなわち、ほぼ８０％コンフルエンスで、細胞を２０ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、培地を細胞外小胞（ＥＶ）回収培地に交換した。４８時間のインキュベーション後、馴化培地を回収し、細胞を採取し、細胞カウンターで計数した。回収された馴化培地は、上記の実施例１．１．２に記載されるように、直ちに前処理工程で処理された。
【0126】
【表3】
【0127】
１．４．幹細胞の集団、そのサブタイプの選択のための細胞選別
本開示の重要な態様の１つは、抗炎症、抗線維症、創傷前治癒、（促進／抗）血管新生、および再神経支配性などの所望の治療効果を有するエキソソームを産生するための、マーカーのシグネチャーセットを発現するＵＣ－ＭＳＣ／ＷＪ－ＭＳＣなどの幹細胞からの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の固有の亜集団の単離である。この特徴は重要であり、従来の方法がＵＣ－ＭＳＣ細胞などの幹細胞の不均一な集団を使用するため、文献において公知である従来の方法とは異なる。一方、本開示の方法は、優れた治療活性（抗炎症、抗線維症、創傷前治癒、血管新生（促進／抗）、再神経支配）を提供するＭＳＣの固有の亜集団を配備する。
本開示の重要な態様の１つは、抗炎症、抗線維症、創傷前治癒、（促進／抗）血管新生、および再神経支配性などの所望の治療効果を有するエキソソームを産生するための、マーカーのシグネチャーセットを発現するＵＣ－ＭＳＣ／ＷＪ－ＭＳＣなどの幹細胞からの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の固有の亜集団の単離である。この特徴は重要であり、従来の方法がＵＣ－ＭＳＣ細胞などの幹細胞の不均一な集団を使用するため、文献において公知である従来の方法とは異なる。一方、本開示の方法は、優れた治療活性（抗炎症、抗線維症、創傷前治癒、血管新生（促進／抗）、再神経支配）を提供するＭＳＣの固有の亜集団を配備する。
【0128】
ＵＣＭＳＣおよびＷＪＭＳＣなどの幹細胞によって発現されるマーカーの共通のシグネチャーセットを表４に列挙する。
【0129】
【表4-1】
【表4-2】
【0130】
さらに、上の表に列挙されたマーカーとは別に、ＭＳＣにおいてより高いレベルで発現される他の細胞マーカーには、限定されないが、ＣＤ４４、ＣＤ７３、およびＣＤ９０が含まれる。
【0131】
１．４．１ ＵＣＭＳＣの亜集団の単離
第１の継代の終了時（Ｐ４）または実施例１．３．１に記載されるｈＵＣ－１Ｍ－ＸＦ細胞バイアルの拡大後、細胞は、フローサイトメトリーベースの選別プロトコールを用いて、臨床的に承認されたＭＳＣ表面マーカーＣＤ９０、ＣＤ７３、およびＣＤ１６６に基づいて選別されて、ＵＣ－ＭＳＣの２つの亜集団を得た。ＵＣ－ＭＳＣの２つの亜集団は、以下のとおりであった。
第１の継代の終了時（Ｐ４）または実施例１．３．１に記載されるｈＵＣ－１Ｍ－ＸＦ細胞バイアルの拡大後、細胞は、フローサイトメトリーベースの選別プロトコールを用いて、臨床的に承認されたＭＳＣ表面マーカーＣＤ９０、ＣＤ７３、およびＣＤ１６６に基づいて選別されて、ＵＣ－ＭＳＣの２つの亜集団を得た。ＵＣ－ＭＳＣの２つの亜集団は、以下のとおりであった。
【0132】
第１の亜集団：臨床的に承認されたＭＳＣ表面マーカー、例えば、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋およびＣＤ１６６＋を発現する幹細胞の第１の亜集団を選択した。
【0133】
第２の亜集団：ＣＤ１６６＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋陽性集団を有するＭＳＣを再選別して、２つのサブタイプの第１の亜集団（濃縮された治療的に固有のＵＣ－ＭＳＣ集団）を提供した：
（ｉ）ＣＤ１４６＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ５８＋およびＣＤ１４２＋陽性集団；
（ｉｉ）ＣＤ１４６＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ５８＋およびＣＤ１４２－（低／陰性）集団。
（ｉ）ＣＤ１４６＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ５８＋およびＣＤ１４２＋陽性集団；
（ｉｉ）ＣＤ１４６＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ５８＋およびＣＤ１４２－（低／陰性）集団。
【0134】
上記のＵＣ－ＭＳＣサブタイプは、さらに２継代（Ｐ５およびＰ６）を有するゼノフリー培地中に維持され、続いて、本開示の実施例１．１．２に記載されるように馴化培地を回収した。
【0135】
１．５．ｈＴＥＲＴ不死化されたＷＪ－ＭＳＣの培養
１．５．１ 細胞の回復およびＷＪ－ＭＳＣの拡大
培養フラスコに動物成分不含の細胞付着基質を予め被覆した後、回復させた。簡単に説明すると、基質（１：３００、１×ＰＢＳ中で希釈される）を培養フラスコに添加し、少なくとも２時間、室温でインキュベートした。過剰の基質溶液を除去し、フラスコをＰＢＳ（１×）で２回リンスした。リンス後、６ｍｌの増殖培地を２５ｃｍ２培養フラスコに添加し、インキュベーター内に少なくとも３０分間置き、培地が正常ｐＨに達するようにした。凍結細胞バイアルを液体窒素から取り出し、７０％エタノールで外側をリンスし、最後の凍結細胞片が見られるまで手で予め温めた。解凍したバイアルを、予め４℃に冷却した９ｍＬの培地を予め充填した１５ｍＬ遠心分離管に移した。
１．５．１ 細胞の回復およびＷＪ－ＭＳＣの拡大
培養フラスコに動物成分不含の細胞付着基質を予め被覆した後、回復させた。簡単に説明すると、基質（１：３００、１×ＰＢＳ中で希釈される）を培養フラスコに添加し、少なくとも２時間、室温でインキュベートした。過剰の基質溶液を除去し、フラスコをＰＢＳ（１×）で２回リンスした。リンス後、６ｍｌの増殖培地を２５ｃｍ２培養フラスコに添加し、インキュベーター内に少なくとも３０分間置き、培地が正常ｐＨに達するようにした。凍結細胞バイアルを液体窒素から取り出し、７０％エタノールで外側をリンスし、最後の凍結細胞片が見られるまで手で予め温めた。解凍したバイアルを、予め４℃に冷却した９ｍＬの培地を予め充填した１５ｍＬ遠心分離管に移した。
【0136】
細胞をさらに５分間、室温にて４００×ｇで遠心分離し、上清を捨て、続いて、予め温めた１ｍＬの培地中に細胞を再懸濁した。細胞は、調製された培養フラスコ（Ｔ２５ｃｍ２）に移され、３７℃でインキュベートされた。品質管理（ＱＣ）として、細胞を計数し、記録し、続いて、２４時間後に培地を交換し、約７０～８０％のコンフルエンシーで細胞を継代した。
【0137】
１．５．２ ＷＪＭＳＣ／ｈＴＥＲＴ不死化されたＷＪＭＳＣのサブ培養
サブ培養は、細胞密度が２８０００細胞／ｃｍ２の７０～８０％のコンフルエンシーを有する予め被覆された培養フラスコを用いて行われた。細胞を脱着させるために、ＴｒｙｐＬＥ選択酵素液（２０μＬ／ｃｍ２）を添加し、細胞をＰＢＳ（１６０μＬ／ｃｍ２）で２回洗浄した。フラスコを３７℃で約２～３分間インキュベートし、顕微鏡下で細胞脱着を観察した。増殖培地を細胞に添加し、４００×ｇで５分間遠心分離し、続いて、１ｍＬの培地に再懸濁し、トリパンブルーを用いて被覆した。細胞は、２４０μＬ／ｃｍ２の増殖培地で補充された被覆培養容器に播種され（７０００細胞／ｃｍ２）、８０％コンフルエンス（例えば、約２８０００細胞／ｃｍ２）に達した後、週に２回１：４の分割比を維持し、次に、細胞はＴｒｙｐＬＥ選択酵素を用いてトリプシン処理された。
サブ培養は、細胞密度が２８０００細胞／ｃｍ２の７０～８０％のコンフルエンシーを有する予め被覆された培養フラスコを用いて行われた。細胞を脱着させるために、ＴｒｙｐＬＥ選択酵素液（２０μＬ／ｃｍ２）を添加し、細胞をＰＢＳ（１６０μＬ／ｃｍ２）で２回洗浄した。フラスコを３７℃で約２～３分間インキュベートし、顕微鏡下で細胞脱着を観察した。増殖培地を細胞に添加し、４００×ｇで５分間遠心分離し、続いて、１ｍＬの培地に再懸濁し、トリパンブルーを用いて被覆した。細胞は、２４０μＬ／ｃｍ２の増殖培地で補充された被覆培養容器に播種され（７０００細胞／ｃｍ２）、８０％コンフルエンス（例えば、約２８０００細胞／ｃｍ２）に達した後、週に２回１：４の分割比を維持し、次に、細胞はＴｒｙｐＬＥ選択酵素を用いてトリプシン処理された。
【0138】
その後、細胞を増殖培地に再懸濁し、４００×ｇで５分間遠心分離し、細胞は、５×１０５細胞／ｍＬに対応する１ｍＬの凍結保存培地、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（ＣＳ１０）に懸濁された。１ｍＬの細胞懸濁液を予め冷却したクリオバイアル中に移し、一晩－８０℃または長期保存のために液体窒素に移した。さらなる使用のために、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ ５００Ｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２００ｐｇ／ｍＬ Ｇ４１８を補充したＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地において細胞を増殖させた。
【0139】
［実施例２］
３Ｄ培養において幹細胞を拡大させる方法
実施例１に記載されるように、種々の供給源に由来するＭＳＣ（ナイーブ／ｈＴＥＲＴ不死化）を３Ｄ培養ベースのシステム中で培養し、拡大された幹細胞を得た。異なる３Ｄ培養ベースの方法は、以下の通りである：
（ｉ）３Ｄマイクロキャリアにおける培養：３Ｄマイクロキャリア上のＭＳＣの培養は、本開示にその全体が組み込まれる出願中のＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２に詳細に記載されている。
（ｉｉ）３Ｄスフェロイドとしての培養：３Ｄマイクロキャリア上のＭＳＣの培養は、本開示にその全体が組み込まれる出願中のＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２に詳細に記載されている。
（ｉｉｉ）中空糸バイオリアクター内での培養。
３Ｄ培養において幹細胞を拡大させる方法
実施例１に記載されるように、種々の供給源に由来するＭＳＣ（ナイーブ／ｈＴＥＲＴ不死化）を３Ｄ培養ベースのシステム中で培養し、拡大された幹細胞を得た。異なる３Ｄ培養ベースの方法は、以下の通りである：
（ｉ）３Ｄマイクロキャリアにおける培養：３Ｄマイクロキャリア上のＭＳＣの培養は、本開示にその全体が組み込まれる出願中のＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２に詳細に記載されている。
（ｉｉ）３Ｄスフェロイドとしての培養：３Ｄマイクロキャリア上のＭＳＣの培養は、本開示にその全体が組み込まれる出願中のＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２に詳細に記載されている。
（ｉｉｉ）中空糸バイオリアクター内での培養。
【0140】
２．１ ＣｅｌｌＳＴＡＣＫフラスコ中のｈＭＳＣの２Ｄ培養
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を継代１～２で購入し、製造業者のプロトコールに従って拡大させて、動作細胞バンクを作製した。ｈＭＳＣの大規模な拡大、すなわち、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ培養チャンバ（１０スタック）における拡大のために、動作細胞バンクからの２，０００万個のｈＢＭ－ＭＳＣを３１４５細胞／ｃｍ２（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｃａｔ．＃３２７１）の播種密度でチャンバ内に播種した。完全培地は、製造業者のプロトコールにより推奨されるように調製され、細胞は、細胞コンフルエンシーが約８０～９０％に達するまで４日間増殖させた。
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を継代１～２で購入し、製造業者のプロトコールに従って拡大させて、動作細胞バンクを作製した。ｈＭＳＣの大規模な拡大、すなわち、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ培養チャンバ（１０スタック）における拡大のために、動作細胞バンクからの２，０００万個のｈＢＭ－ＭＳＣを３１４５細胞／ｃｍ２（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｃａｔ．＃３２７１）の播種密度でチャンバ内に播種した。完全培地は、製造業者のプロトコールにより推奨されるように調製され、細胞は、細胞コンフルエンシーが約８０～９０％に達するまで４日間増殖させた。
【0141】
ＣｅｌｌＳＴＡＣＫフラスコから細胞を採取するために、培地を除去し、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを添加した後、細胞を３７℃で６～８分間インキュベートした。さらに、トリプシン活性をクエンチするために、ＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋なし）中に調製された２００μＬの２％ＭＳＣスクリーニングされたＦＢＳを細胞に添加し、続いて、懸濁液を５０ｍＬ遠心分離管に回収し、２００×ｇで１０分間遠心分離した。懸濁液をさらに２０ｍＬの完全培地の最終容量に再懸濁し、中空糸バイオリアクターシステムに注入した。
【0142】
２．２ ＦｉｂｅｒＣｅｌｌ中空糸バイオリアクターにおけるｈＭＳＣの３Ｄ培養
細胞は、９０～２２０×１０６細胞／カートリッジ（２０ｋＤ ＭＷＣＯ、４０００ｃｍ２、ポリスルホン繊維カートリッジ）の分離中空糸バイオリアクター中に播種され、ゼノフリー完全培地中に維持され、中空糸バイオリアクターシステムは調製され、製造業者の説明書に従って使用された。すべての接種前工程は、滅菌Ｄ－ＰＢＳ－／－を用いて行われた。細胞懸濁液の注入に先立ち、培地リザーバーから培地１ｍＬを採取し、グルコースメーターを用いて総グルコース含有量、および乳酸塩アッセイキット（５０μＬの１０００倍希釈培地）を用いてＬ（＋）－乳酸塩を確認した。バイオリアクターシステムに細胞を接種するために、調製された細胞懸濁液（２０ｍＬ）を、製造業者の手順に従ってカートリッジに注入した。拍動性潅流ポンプの流速は、２８日間の細胞接種期間の最初の２～３日間、２２回／分に設定された。
細胞は、９０～２２０×１０６細胞／カートリッジ（２０ｋＤ ＭＷＣＯ、４０００ｃｍ２、ポリスルホン繊維カートリッジ）の分離中空糸バイオリアクター中に播種され、ゼノフリー完全培地中に維持され、中空糸バイオリアクターシステムは調製され、製造業者の説明書に従って使用された。すべての接種前工程は、滅菌Ｄ－ＰＢＳ－／－を用いて行われた。細胞懸濁液の注入に先立ち、培地リザーバーから培地１ｍＬを採取し、グルコースメーターを用いて総グルコース含有量、および乳酸塩アッセイキット（５０μＬの１０００倍希釈培地）を用いてＬ（＋）－乳酸塩を確認した。バイオリアクターシステムに細胞を接種するために、調製された細胞懸濁液（２０ｍＬ）を、製造業者の手順に従ってカートリッジに注入した。拍動性潅流ポンプの流速は、２８日間の細胞接種期間の最初の２～３日間、２２回／分に設定された。
【0143】
細胞外毛細血管腔内の培地容量を２５０ｍＬに維持し、２８日間の細胞接種期間の３～１７日目からバイオリアクターに２５回／分のシステム流速で循環させた。１７日後、同じ流速で培地容量を５００ｍＬに倍加した。培地リザーバーからの培地の１ｍＬアリコートを２～３日ごとに回収し、グルコース含有量およびｐＨをモニタリングした。２５日間の培養期間の終わりに、４０ｍＬのトリプシン－ＥＤＴＡ０を用いてｈＭＳＣを回収した後、馴化培地を回収した。２５％細胞を余分な毛細血管腔に注入し、１０分間、３７℃でインキュベートした。６０ｍＬの細胞懸濁液が得られるまで、ＰＢＳを用いてトリプシン処理細胞を押し出した。採取された細胞懸濁液は、ＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋を含まない）中で調製された同等容量の２％ＭＳＣスクリーニングしたＦＢＳでさらにクエンチされ、２００×ｇで１０分間遠心分離し、トリパンブルー排除キットを用いて細胞生存率計数に使用した後、下流分析のために処理した。
【0144】
［実施例３］
幹細胞のプライミング
本実施例は、本開示の重要な態様の１つを示し、実施例１に記載されるように、種々の供給源に由来する幹細胞のプライミングである。幹細胞のプライミングは、８００Ｄａ未満の分子量を有する小分子、および８００Ｄａを超える分子量を有する巨大分子などの種々のプライミング剤の存在下で行われる。幹細胞を１種以上のプライミング剤（それぞれ単独またはコンビナトリアルプライミング）でプライミングして、ＭＳＣの再生性、幹性、抗炎症性、および抗線維化性を増強する。ナイーブＭＳＣまたはプライミングされたＭＳＣは、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソーム（次の実施例に記載される方法によって得られる）として、またはそれに加えて、治療的適用のために使用することができる。
幹細胞のプライミング
本実施例は、本開示の重要な態様の１つを示し、実施例１に記載されるように、種々の供給源に由来する幹細胞のプライミングである。幹細胞のプライミングは、８００Ｄａ未満の分子量を有する小分子、および８００Ｄａを超える分子量を有する巨大分子などの種々のプライミング剤の存在下で行われる。幹細胞を１種以上のプライミング剤（それぞれ単独またはコンビナトリアルプライミング）でプライミングして、ＭＳＣの再生性、幹性、抗炎症性、および抗線維化性を増強する。ナイーブＭＳＣまたはプライミングされたＭＳＣは、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソーム（次の実施例に記載される方法によって得られる）として、またはそれに加えて、治療的適用のために使用することができる。
【0145】
３．１ 本開示において使用されるプライミング剤
３．１．１．小分子による幹細胞のプライミング
プライミングによる再生増強（インビトロおよびインビボの幹性、生存性、生着能力を増強するために認可された）は、物理的誘導因子（低酸素状態）の非存在下または存在下で、限定されないが、ＳＩＲＴ１活性化因子、Ｎｒｆ２活性化因子を含む種々の小分子（疎水性物質）を用いて行われた。これらの化合物（小分子）の大部分は本質的に疎水性であり、したがって、水溶性ではないため、それらは、最初に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、アセトンなどの無毒性有機溶媒中に高濃度で溶解され、その後、水性培地（ＰＢＳ、生理食塩水または細胞培地）中に希釈されて、ＭＳＣの処置のために動作濃度を生成するかまたはリポソームなどの脂質ベースの担体を得る。
３．１．１．小分子による幹細胞のプライミング
プライミングによる再生増強（インビトロおよびインビボの幹性、生存性、生着能力を増強するために認可された）は、物理的誘導因子（低酸素状態）の非存在下または存在下で、限定されないが、ＳＩＲＴ１活性化因子、Ｎｒｆ２活性化因子を含む種々の小分子（疎水性物質）を用いて行われた。これらの化合物（小分子）の大部分は本質的に疎水性であり、したがって、水溶性ではないため、それらは、最初に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、アセトンなどの無毒性有機溶媒中に高濃度で溶解され、その後、水性培地（ＰＢＳ、生理食塩水または細胞培地）中に希釈されて、ＭＳＣの処置のために動作濃度を生成するかまたはリポソームなどの脂質ベースの担体を得る。
【0146】
表５は、動作濃度および処置期間を有するプライミング剤（小分子）を列挙する。
【0147】
【表5-1】
【表5-2】
【0148】
サイレンシング情報調節因子１（ＳＩＲＴ１）活性化因子：一例では、小分子はサイレンシング情報調節因子１（ＳＩＲＴ１）活性化因子である。ＳＩＲＴ１はＮＡＤ依存性ヒストン脱アセチル化酵素であり、細胞代謝、細胞生存と細胞老化、ＤＮＡ修復、炎症、細胞増殖および神経変性疾患において重要な役割を有する（Zhu, Y.g., et al., Human mesenchymal stem cell microvesicles for treatment of Escherichia coli endotoxin-induced acute lung injury in mice. Stem cells, 2014. 32(1): p. 116-125）。ＳＩＲＴ１活性化因子には、限定されないが、ＳＲＴ－２１０４、ＳＲＴ－１７２０、トランス－レスベラトロールが含まれる。
【0149】
核因子赤血球２関連因子２（Ｎｒｆ２）活性化因子：核因子赤血球２関連因子２（Ｎｒｆ２）は、ほとんどの真核細胞において普遍的に発現され、酸化剤、生体異物、および過剰な栄養／代謝物供給を含む外因性および内因性ストレスに対する広範な細胞防御を誘導するように機能する。Ｎｒｆ２活性化因子は、幹細胞の休止、生存、自己再生、増殖、老化、分化の重要な調節因子として作用する。
【0150】
Ｎｒｆ２活性化因子には、限定されないが、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、２－シアノ－３，１２－ジオキソオレアナ－１，９（１１）－ジエン－２８－オイ酸のイミダゾール誘導体（ＣＤＤＯ－Ｉｍ）、およびイタコン酸４－オクチル（４－ＯＩ）が含まれる。他の活性化因子には、ファミリー：アリールシクロヘキシルピラゾール、スルホニルクマリン、１，４－ジアミノナフタレンコア含有、ベンゼンスルホニル－ピリミドン、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリンコア含有化合物が含まれる。
【0151】
本開示においてプライミング剤として用いることができるＮｒｆ２誘導ペプチド（Ｎｒｆ２／Ｋｅａｐ相互作用の遮断剤）：ＬＤＥＥＴＧＥＦＬ－ＮＨ２、（ＮＨ２－ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ－ＰＬＦＡＥＲＬＤＥＥＴＧＥＦＬＰＮＨ２）、Ａｃ－ＤＰＥＴＧＥＬ－ＯＨ、Ａｃ－ＤＥＥＴＧＥＦ－ＯＨ、ＬＱＬＤＥＥＴＧＥＦＬＰＩＱＧＫ（ＭＲ１２１）－ＯＨ、Ａｃ－ＬＤＥＥＴＧＥＦＬ－ＮＨ、ＡｃＤＰＥＴＧＥＬ－ＮＨ２、Ａｃ－ＮＰＥＴＧＥＬ－ＯＨ。
【0152】
３．１．２．低酸素状態を媒介したプライミング
低酸素状態プライミングは、インビボのＭＳＣニッチ微小環境の模倣形質であり、ＭＳＣの再生、生存および血管新生能を改善する可能性がある。低酸素状態は、ＭＳＣの拡大中の細胞代謝を調節し、酸化ストレスに対する抵抗性を提供し、虚血微小環境における生着と生存性を改善する。ＨＩＦ－１α誘導は低酸素状態プライミングにおいて検出され、ＨＩＦ－１αの過剰発現は、ＭＳＣの血管新生能力に関連するｍｉＲ－１５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－３１、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－２２１、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－４２４の誘導を示した。
低酸素状態プライミングは、インビボのＭＳＣニッチ微小環境の模倣形質であり、ＭＳＣの再生、生存および血管新生能を改善する可能性がある。低酸素状態は、ＭＳＣの拡大中の細胞代謝を調節し、酸化ストレスに対する抵抗性を提供し、虚血微小環境における生着と生存性を改善する。ＨＩＦ－１α誘導は低酸素状態プライミングにおいて検出され、ＨＩＦ－１αの過剰発現は、ＭＳＣの血管新生能力に関連するｍｉＲ－１５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－３１、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－２２１、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－４２４の誘導を示した。
【0153】
本開示では、０．２～１０％の範囲の酸素の存在下で低酸素状態を媒介したプライミングを行った。
【0154】
３．１．３ 光媒介プライミング
光媒介プライミングまたは光バイオモジュレーションは、可視および近赤外スペクトルにおける非電離形態の光源の使用を伴う別の誘導因子プラットフォームである。この非熱的プロセスは、内因性発色団の影響下、生物学的スケールで光物理的および光化学的プロセスの両方をもたらす。伴われる光源の波長は、以下の範囲（３００～６５０ｎｍおよび８００～１４００ｎｍ）であり、一方、光エネルギーは０．５～４Ｊ／ｃｍ２である。低密度および高密度でのＭＳＣの増殖はまた、単一線量または多重線量の照射のいずれかであり得る照射（５～２０ｍＷ／ｃｍ２）によって影響されることが、研究により示されている。
光媒介プライミングまたは光バイオモジュレーションは、可視および近赤外スペクトルにおける非電離形態の光源の使用を伴う別の誘導因子プラットフォームである。この非熱的プロセスは、内因性発色団の影響下、生物学的スケールで光物理的および光化学的プロセスの両方をもたらす。伴われる光源の波長は、以下の範囲（３００～６５０ｎｍおよび８００～１４００ｎｍ）であり、一方、光エネルギーは０．５～４Ｊ／ｃｍ２である。低密度および高密度でのＭＳＣの増殖はまた、単一線量または多重線量の照射のいずれかであり得る照射（５～２０ｍＷ／ｃｍ２）によって影響されることが、研究により示されている。
【0155】
３．１．４．巨大分子による幹細胞のプライミング
本開示において、巨大分子は、幹細胞をプライミングするために使用され、巨大分子は、タンパク質、脂質、核酸、増殖因子、サイトカイン、馴化培地の成分などの生物学的因子と呼ばれる。本開示の目的のために、実施例１に記載されるナイーブＭＳＣ由来の馴化培地を用いて、異なる起源に由来するナイーブＭＳＣをプライミングした。
本開示において、巨大分子は、幹細胞をプライミングするために使用され、巨大分子は、タンパク質、脂質、核酸、増殖因子、サイトカイン、馴化培地の成分などの生物学的因子と呼ばれる。本開示の目的のために、実施例１に記載されるナイーブＭＳＣ由来の馴化培地を用いて、異なる起源に由来するナイーブＭＳＣをプライミングした。
【0156】
本開示において、ナイーブＭＳＣはＡと呼ばれ、ナイーブＭＳＣ（Ａ）に由来するエキソソームはＢと呼ばれる。核因子赤血球関連因子２（Ｎｒｆ２）活性化因子、サイレンシング情報調節因子（ＳＩＲＴ１）活性化因子などの小分子および巨大分子を用いるＡのプライミングはＡ’と呼ばれ、プライミングされたＭＳＣ（Ａ’）に由来するエキソソームはＢ’と呼ばれる。単一の誘導因子分子による単一のプライミングおよび小分子または巨大分子を用いるコンビナトリアルプライミングのプロセスを以下の次の実施例に記載する。
【0157】
３．２．ＣＳＳＣ馴化培地を用いたｈＢＭ－ＭＳＣの単一プライミングプロトコール
ｈＢＭ－ＭＳＣ、継代４細胞は、実施例１．２に記載されるプロセスに従って維持された。ｈＢＭ－ＭＳＣのプライミングは、１０～２０％の範囲の容量パーセンテージを有する角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）由来の馴化培地（巨大分子）を補充した培地で行われた。ＣＳＳＣのゼノフリー培養および最終濃度２０％のプライミングするための馴化培地の回収は、ＣＳＳＣ維持の間に行われた。ｈＢＭ－ＭＳＣは、８０～８５％のコンフルエンス（すなわち、４３０００～５００００細胞／ｃｍ２）までさらに拡大され、エキソソーム産生に使用された。上記の実施例１．２および１．１．２に記載されるように、馴化培地の回収および処理を行った。
ｈＢＭ－ＭＳＣ、継代４細胞は、実施例１．２に記載されるプロセスに従って維持された。ｈＢＭ－ＭＳＣのプライミングは、１０～２０％の範囲の容量パーセンテージを有する角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）由来の馴化培地（巨大分子）を補充した培地で行われた。ＣＳＳＣのゼノフリー培養および最終濃度２０％のプライミングするための馴化培地の回収は、ＣＳＳＣ維持の間に行われた。ｈＢＭ－ＭＳＣは、８０～８５％のコンフルエンス（すなわち、４３０００～５００００細胞／ｃｍ２）までさらに拡大され、エキソソーム産生に使用された。上記の実施例１．２および１．１．２に記載されるように、馴化培地の回収および処理を行った。
【0158】
表６：ＣＳＳＣ馴化培地を用いたｈＢＭ－ＭＳＣの単一プライミングプロトコール。
【0159】
【表6】
【0160】
３．３． Ｎｒｆ２活性化因子を用いたｈＢＭ－ＭＳＣの単一プライミングプロトコール
ｈＢＭ－ＭＳＣ、継代４細胞は、上記実施例１．２に記載されるプロセスに従って維持され、細胞はＮｒｆ２活性化因子または誘導因子（ＤＭＦ、４－ＯＩ）により処置された。細胞は、一旦７０～８０％のコンフルエンスに達すると、ＰＢＳで洗浄され、ＥＶ回収に切り替える前に、２４時間、１００μＭ ＤＭＦまたは１００μＭ ４－ＯＩを有する新鮮な培地で補給され、続いて、上記の実施例１．２および１．１．２に記載されるように、馴化培地回収および処理手順を行った。
ｈＢＭ－ＭＳＣ、継代４細胞は、上記実施例１．２に記載されるプロセスに従って維持され、細胞はＮｒｆ２活性化因子または誘導因子（ＤＭＦ、４－ＯＩ）により処置された。細胞は、一旦７０～８０％のコンフルエンスに達すると、ＰＢＳで洗浄され、ＥＶ回収に切り替える前に、２４時間、１００μＭ ＤＭＦまたは１００μＭ ４－ＯＩを有する新鮮な培地で補給され、続いて、上記の実施例１．２および１．１．２に記載されるように、馴化培地回収および処理手順を行った。
【0161】
表７：Ｎｒｆ２活性化因子を用いたｈＢＭ－ＭＳＣの単一プライミングプロトコール。
【0162】
【表7】
【0163】
３．４ ＳＩＲＴ１活性化因子（ＳＲＴ２１０４またはトランス－レスベラトール）によるＵＣＭＳＣの単一プライミングプロトコール（ＥＸＯ変異体Ｂ’）
２種のＵＣ－ＭＳＣ細胞型は、ＳＩＲＴ１活性化因子（ＳＲＴ－２１０４またはトランス－レスベラトロール）の存在下で、ＳＲＴ－２１０４のＩＣ５０値よりも小さい濃度で別々に培養された。ＩＣ５０値は、ＵＣ－ＭＳＣ細胞において、ＳＲＴ－２１０４について０．０４～３．７８ｎＭまたは２４～１９６２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲を用いて、両方の亜集団について決定された。ＲＳＶの動作濃度範囲は、ＵＣ－ＭＳＣにおけるプライミングについて０．１～２．５μＭまたは２２．８５～５７１．２５μｇ／ｍＬであった。ＵＣ－ＭＳＣは、ＳＲＴ－２１０４またはＲＳＶの存在下で８０％のコンフルエンスまで培養された。その後、ＥＶ回収処置、馴化培地回収は、プライミングされたエキソソーム産生のために行われた。プライミング後、ＵＣ－ＭＳＣでプライミングされた馴化培地／セクレトームは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングされ、両方の場合についてＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０およびＨＧＦの発現を検出した。
２種のＵＣ－ＭＳＣ細胞型は、ＳＩＲＴ１活性化因子（ＳＲＴ－２１０４またはトランス－レスベラトロール）の存在下で、ＳＲＴ－２１０４のＩＣ５０値よりも小さい濃度で別々に培養された。ＩＣ５０値は、ＵＣ－ＭＳＣ細胞において、ＳＲＴ－２１０４について０．０４～３．７８ｎＭまたは２４～１９６２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲を用いて、両方の亜集団について決定された。ＲＳＶの動作濃度範囲は、ＵＣ－ＭＳＣにおけるプライミングについて０．１～２．５μＭまたは２２．８５～５７１．２５μｇ／ｍＬであった。ＵＣ－ＭＳＣは、ＳＲＴ－２１０４またはＲＳＶの存在下で８０％のコンフルエンスまで培養された。その後、ＥＶ回収処置、馴化培地回収は、プライミングされたエキソソーム産生のために行われた。プライミング後、ＵＣ－ＭＳＣでプライミングされた馴化培地／セクレトームは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングされ、両方の場合についてＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０およびＨＧＦの発現を検出した。
【0164】
プライミングされたエキソソーム変異体は、ＳＩＲＴ１、ＨＧＦ、ＩＤＯ、ＩＬ－１０、ＮＲＦ２、ＶＥＧＦ、およびＮＧＦなどのエキソソームカーゴ分子の発現レベルを検出するＥＬＩＳＡにより特徴付けられ、これらの結果に基づいて、ＳＲＴ２１０４またはＲＳＶ処置の濃度をＵＣ－ＭＳＣプライミングのために最終化した。
【0165】
３．５ Ｎｒｆ２活性化因子（ＤＭＦまたは４－ＯＩまたはＣＤＤＯ－ＩＭ）によるＵＣ－ＭＳＣの単一プライミングプロトコール－（ＥＸＯ変異体Ｂ’）
ＵＣ－ＭＳＣは、実施例１．３に記載されるように、プロセスに従って培養された。５～６継代ステージまで継代された細胞は、プライミングされたエキソソーム産生に使用された。（Ｂ’）。ＵＣ－ＭＳＣは、ＤＭＦ（（１．４４～３６ｍｇ／ｍＬ）または（１０～２５０μＭ））、４ＯＩ（（０．００２４～０．０６０）ｍｇ／ｍＬまたは（１０～２５０））μＭ、ＣＤＤＯ－Ｉｍ（（２．５６～１２８μｇ／ｍＬ）または（０．２～１））μＭなどの範囲の動作濃度を有するＮｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ、４－ＯＩまたはＣＤＤＯ－ＩＭ）により処置された。
ＵＣ－ＭＳＣは、実施例１．３に記載されるように、プロセスに従って培養された。５～６継代ステージまで継代された細胞は、プライミングされたエキソソーム産生に使用された。（Ｂ’）。ＵＣ－ＭＳＣは、ＤＭＦ（（１．４４～３６ｍｇ／ｍＬ）または（１０～２５０μＭ））、４ＯＩ（（０．００２４～０．０６０）ｍｇ／ｍＬまたは（１０～２５０））μＭ、ＣＤＤＯ－Ｉｍ（（２．５６～１２８μｇ／ｍＬ）または（０．２～１））μＭなどの範囲の動作濃度を有するＮｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ、４－ＯＩまたはＣＤＤＯ－ＩＭ）により処置された。
【0166】
プライミング後、ＵＣ－ＭＳＣでプライミングされた馴化培地／セクレトームをＥＬＩＳＡアッセイキットを用いてスクリーニングし、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、およびＨＧＦの発現レベルを検出した。プライミングされたエキソソーム変異体は、Ｎｒｆ２、ＩＬ－１０、ＨＧＦ、およびＶＥＧＦなどのエキソソームカーゴ分子の発現レベルを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイによって特徴付けられ、ＤＭＦまたは４－ＯＩまたはＣＤＤＯ－Ｉｍの濃度をＵＣ－ＭＳＣプライミングのために最終化した。
【0167】
３．６ ＣＳＳＣ由来の馴化培地およびＮｒｆ２活性化因子によるｈＢＭ－ＭＳＣのコンビナトリアルプライミング－（ＥＸＯ変異体Ｂ’）
ｈＢＭ－ＭＳＣのプライミングは、ＣＳＳＣ由来の馴化培地（１０～２０％の範囲の容量パーセンテージ）を補充した培地で行われた。角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）のゼノフリー培養および最終濃度２０％のプライミングのための馴化培地の回収は、ＣＳＳＣ維持の間に行われた。ｈＢＭ－ＭＳＣ細胞を解凍し、Ｔ２２５ｃｍ２フラスコ中で２０００～３０００細胞／ｃｍ２で播種し、培地は１０～２０％ＣＳＳＣ由来の馴化培地で補充された。一旦ｈＢＭ－ＭＳＣが約７０～８０％コンフルエンシーに達すると、細胞はＰＢＳ中で洗浄され、次に、細胞外小胞（ＥＶ）回収培地に切り替える前に、Ｎｒｆ２活性化因子（例えば、１００μＭ ＤＭＦまたは１００μＭ ４－ＯＩ）で２４～７２時間、補給された。
ｈＢＭ－ＭＳＣのプライミングは、ＣＳＳＣ由来の馴化培地（１０～２０％の範囲の容量パーセンテージ）を補充した培地で行われた。角膜間質幹細胞（ＣＳＳＣ）のゼノフリー培養および最終濃度２０％のプライミングのための馴化培地の回収は、ＣＳＳＣ維持の間に行われた。ｈＢＭ－ＭＳＣ細胞を解凍し、Ｔ２２５ｃｍ２フラスコ中で２０００～３０００細胞／ｃｍ２で播種し、培地は１０～２０％ＣＳＳＣ由来の馴化培地で補充された。一旦ｈＢＭ－ＭＳＣが約７０～８０％コンフルエンシーに達すると、細胞はＰＢＳ中で洗浄され、次に、細胞外小胞（ＥＶ）回収培地に切り替える前に、Ｎｒｆ２活性化因子（例えば、１００μＭ ＤＭＦまたは１００μＭ ４－ＯＩ）で２４～７２時間、補給された。
【0168】
表８は、ＣＳＳＣ馴化培地およびＮｒｆ２活性化因子を用いたｈＢＭ－ＭＳＣのコンビナトリアルプライミングのプロトコールを示す－（Ｅｘｏ変異体Ｂ’）。
【0169】
【表8】
【0170】
３．７ 低酸素状態の非存在下でのＳＩＲＴ１活性化因子およびＮｒｆ２活性化因子によるＵＣ－ＭＳＣのコンビナトリアルプライミング－（ＥＸＯ変異体Ｂ’）
ＵＣ－ＭＳＣおよびＵＣ－ＭＳＣの選択された亜集団は、実施例１．３に記載されるプロトコールに従って培養され、続いて、ＵＣ－ＭＳＣ幹細胞の拡大された集団をプライミングし、それは、ＳＲＴ－２１０４（０．００００１－０．０１Ｍ）またはトランス－レスベラトール（ＲＳＶ）（０．１～１０Ｍ）などのＳＩＲＴ１活性化因子の存在下における亜集団であり、８０％のコンフルエンス（例えば、６０－１００Ｋ細胞／ｃｍ２の細胞密度）に達し、続いて、１０～２５０μｍの範囲のＤＭＦ、または１０～２５０μｍの範囲の４－ＯＩなどのＮｒｆ２活性化因子を用いて２４～７２時間、細胞を処置した。馴化培地をさらにスクリーニングして、ＥＬＩＳＡを用いて抗炎症分子発現を検出した。さらに、ＵＣ－ＭＳＣでプライミングされたエキソソーム変異体（Ｂ’）をコンビナトリアルプライミングセット（低酸素状態の非存在下でのＳＩＲＴ１活性化因子およびＮｒｆ２活性化因子）から単離した。次に、エキソソームのプライミングされた変異体は、カーゴ分子を検出するＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。
ＵＣ－ＭＳＣおよびＵＣ－ＭＳＣの選択された亜集団は、実施例１．３に記載されるプロトコールに従って培養され、続いて、ＵＣ－ＭＳＣ幹細胞の拡大された集団をプライミングし、それは、ＳＲＴ－２１０４（０．００００１－０．０１Ｍ）またはトランス－レスベラトール（ＲＳＶ）（０．１～１０Ｍ）などのＳＩＲＴ１活性化因子の存在下における亜集団であり、８０％のコンフルエンス（例えば、６０－１００Ｋ細胞／ｃｍ２の細胞密度）に達し、続いて、１０～２５０μｍの範囲のＤＭＦ、または１０～２５０μｍの範囲の４－ＯＩなどのＮｒｆ２活性化因子を用いて２４～７２時間、細胞を処置した。馴化培地をさらにスクリーニングして、ＥＬＩＳＡを用いて抗炎症分子発現を検出した。さらに、ＵＣ－ＭＳＣでプライミングされたエキソソーム変異体（Ｂ’）をコンビナトリアルプライミングセット（低酸素状態の非存在下でのＳＩＲＴ１活性化因子およびＮｒｆ２活性化因子）から単離した。次に、エキソソームのプライミングされた変異体は、カーゴ分子を検出するＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。
【0171】
３．８ ＵＳ－ＭＳＣを低酸素状態の存在下でのＳＩＲＴ１活性化因子およびＮＲＦ２活性化因子によるコンビナトリアルプライミング－（ＥＸＯ変異体Ｂ’）
ＵＣ－ＭＳＣは、実施例１．３に記載されるプロトコールに従って培養され、続いて０．００００１～０．０１μＭの範囲のＳＲＴ－２１０４または０．１～１０μＭの範囲のトランス－レスベラトール（ＲＳＶ）でプライミングした。低酸素状態／正常酸素状態のサイクル（３０～９０分間隔で８～２０サイクル）で低酸素症を生じさせた。低酸素状態では酸素濃度は０．５～１０％であり、正常酸素状態では酸素濃度は１４～２２％であった。次に、細胞は、Ｎｒｆ２活性化因子である、１０～２５０μｍの範囲のＤＭＦ、もしくは１０～２５０ｍの範囲の４－ＯＩにより処置され、またはそれらが８０％コンフルエンスに達した２４～７２時間後に処置された。ＥＶ回収曝露、馴化培地回収は、上記実施例１．２および１．１．２に記載されるように行われた。馴化培地をさらにスクリーニングして、ＥＬＩＳＡを用いて抗炎症分子発現を検出した。ＵＣ－ＭＳＣでプライミングされたエキソソーム変異体をコンビナトリアルプライミングセット（低酸素状態の存在下でのＳＲＴ１活性化因子およびＮｒｆ２活性化因子）から単離し、エキソソームのプライミングされた変異体は、種々のカーゴ分子を検出するためにＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。
ＵＣ－ＭＳＣは、実施例１．３に記載されるプロトコールに従って培養され、続いて０．００００１～０．０１μＭの範囲のＳＲＴ－２１０４または０．１～１０μＭの範囲のトランス－レスベラトール（ＲＳＶ）でプライミングした。低酸素状態／正常酸素状態のサイクル（３０～９０分間隔で８～２０サイクル）で低酸素症を生じさせた。低酸素状態では酸素濃度は０．５～１０％であり、正常酸素状態では酸素濃度は１４～２２％であった。次に、細胞は、Ｎｒｆ２活性化因子である、１０～２５０μｍの範囲のＤＭＦ、もしくは１０～２５０ｍの範囲の４－ＯＩにより処置され、またはそれらが８０％コンフルエンスに達した２４～７２時間後に処置された。ＥＶ回収曝露、馴化培地回収は、上記実施例１．２および１．１．２に記載されるように行われた。馴化培地をさらにスクリーニングして、ＥＬＩＳＡを用いて抗炎症分子発現を検出した。ＵＣ－ＭＳＣでプライミングされたエキソソーム変異体をコンビナトリアルプライミングセット（低酸素状態の存在下でのＳＲＴ１活性化因子およびＮｒｆ２活性化因子）から単離し、エキソソームのプライミングされた変異体は、種々のカーゴ分子を検出するためにＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。
【0172】
３．９．低酸素状態の存在下でのＳＩＲＴ１活性化因子（ＳＲＴ－２１０４またはトランス－レスベラトロール）によるＵＣ－ＭＳＣのコンビナトリアルプライミングプロトコール（ＥＸＯ変異体Ｂ’）
ＵＣ－ＭＳＣを、実施例１．３に記載されるプロトコールに従って継代５～６まで培養し、低酸素状態／正常酸素状態のサイクル（３０～９０分間隔で８～２０サイクル）で低酸素症を生じさせた。低酸素濃度は０．５～１０％であり、正常酸素状態では、酸素濃度はトリガスチャンバーインキュベーターセットアップを用いると１４～２２％であった。一旦ＵＣ－ＭＳＣが低酸素状態処置において８０％コンフルエンスに達すると、細胞生存性、ＨＩＦ－１α、ＨＧＦ、ＶＥＧＦおよびＴＮＦ－α発現をセクレトームおよび誘導性エキソソーム変異体においてチェックした。セクレトームおよびエキソソームプロファイルは、正常酸素状態の条件で細胞を維持したＵＣ－ＭＳＣ由来のエキソソームと比較された。さらに、０．００００１～０．０１μＭの範囲のＳＲＴ－２１０４、または０．１～１０μＭの範囲のトランス－レスベラトール（ＲＳＶ）を用いて、代替の低酸素状態／正常酸素状態サイクルの存在下でＵＣ－ＭＳＣプライミングを誘導した。上記実施例１．２および１．１．２に記載されるように、ＥＶ回収曝露、馴化培地回収を行った。
ＵＣ－ＭＳＣを、実施例１．３に記載されるプロトコールに従って継代５～６まで培養し、低酸素状態／正常酸素状態のサイクル（３０～９０分間隔で８～２０サイクル）で低酸素症を生じさせた。低酸素濃度は０．５～１０％であり、正常酸素状態では、酸素濃度はトリガスチャンバーインキュベーターセットアップを用いると１４～２２％であった。一旦ＵＣ－ＭＳＣが低酸素状態処置において８０％コンフルエンスに達すると、細胞生存性、ＨＩＦ－１α、ＨＧＦ、ＶＥＧＦおよびＴＮＦ－α発現をセクレトームおよび誘導性エキソソーム変異体においてチェックした。セクレトームおよびエキソソームプロファイルは、正常酸素状態の条件で細胞を維持したＵＣ－ＭＳＣ由来のエキソソームと比較された。さらに、０．００００１～０．０１μＭの範囲のＳＲＴ－２１０４、または０．１～１０μＭの範囲のトランス－レスベラトール（ＲＳＶ）を用いて、代替の低酸素状態／正常酸素状態サイクルの存在下でＵＣ－ＭＳＣプライミングを誘導した。上記実施例１．２および１．１．２に記載されるように、ＥＶ回収曝露、馴化培地回収を行った。
【0173】
３．１０ Ｎｒｆ２活性化因子（低酸素状態下のＤＭＦまたは４－ＯＩ）を用いたＵＣ－ＭＳＣのコンビナトリアルプライミングプロトコール（ＥＸＯ変異体Ｂ’）
ＵＣ－ＭＳＣを継代まで培養し、上記実施例３．８に記載されるように低酸素症を生じさせた。ＥＶ回収にシフトする前に、ＵＣ－ＭＳＣをＮｒｆ２活性化因子である、１０～２５０μｍの範囲のＤＭＦ、または１０～２５０μｍの範囲の４－ＯＩで２４～７２時間処置した。上記実施例１．２および１．１．２に記載されるプロトコールに従って、ＥＶ回収曝露、馴化培地回収を行った。セクレトームは、ＥＬＩＳＡによってＮｒｆ２、ＨＩＦ－１α、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｓＦＬＴ１のレベルを検出することにより特徴付けられたが、プライミングされたエキソソーム変異体（Ｂ’）は、Ｎｒｆ２、ＨＩＦ－１α、ＶＥＧＦ、ｓＦＬＴ１、ＩＬ－１０、ＳＩＲＴ１などのエキソソームカーゴ分子発現のレベルを検出するＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。
ＵＣ－ＭＳＣを継代まで培養し、上記実施例３．８に記載されるように低酸素症を生じさせた。ＥＶ回収にシフトする前に、ＵＣ－ＭＳＣをＮｒｆ２活性化因子である、１０～２５０μｍの範囲のＤＭＦ、または１０～２５０μｍの範囲の４－ＯＩで２４～７２時間処置した。上記実施例１．２および１．１．２に記載されるプロトコールに従って、ＥＶ回収曝露、馴化培地回収を行った。セクレトームは、ＥＬＩＳＡによってＮｒｆ２、ＨＩＦ－１α、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｓＦＬＴ１のレベルを検出することにより特徴付けられたが、プライミングされたエキソソーム変異体（Ｂ’）は、Ｎｒｆ２、ＨＩＦ－１α、ＶＥＧＦ、ｓＦＬＴ１、ＩＬ－１０、ＳＩＲＴ１などのエキソソームカーゴ分子発現のレベルを検出するＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。
【0174】
３．１１ オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）による幹細胞の単一プライミングプロトコール
ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣを上記のプロトコールに従って培養した。継代５～６をプライミングされたエキソソーム産生に使用し、ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣを、ＥＶ回収にシフトする２４～７２時間前に、一定範囲の動作濃度（０．１～５００）μＭを有するＡＴＲＡ誘導因子により処置した。Ｒｏｏｓｔｅｒ ＥＶ回収インキュベーション、馴化培地回収を上記のように行った。プライミング後、ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣでプライミングされた馴化培地／セクレトームをＥＬＩＳＡアッセイキットでスクリーニングし、ＣＯＸ－２、ＨＩＦ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ－２およびＡｎｇ－４の発現レベルを検出した。次に、プライミングされたエキソソーム変異体は、ＣＯＸ－２、ＨＩＦ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ－２およびＡｎｇ－４などのエキソソームカーゴ分子の発現レベルを検出するためにＥＬＩＳＡアッセイによって特徴付けられた。得られた結果に基づき、ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣプライミングのために濃度ＡＴＲＡを最終化した。
ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣを上記のプロトコールに従って培養した。継代５～６をプライミングされたエキソソーム産生に使用し、ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣを、ＥＶ回収にシフトする２４～７２時間前に、一定範囲の動作濃度（０．１～５００）μＭを有するＡＴＲＡ誘導因子により処置した。Ｒｏｏｓｔｅｒ ＥＶ回収インキュベーション、馴化培地回収を上記のように行った。プライミング後、ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣでプライミングされた馴化培地／セクレトームをＥＬＩＳＡアッセイキットでスクリーニングし、ＣＯＸ－２、ＨＩＦ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ－２およびＡｎｇ－４の発現レベルを検出した。次に、プライミングされたエキソソーム変異体は、ＣＯＸ－２、ＨＩＦ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ－２およびＡｎｇ－４などのエキソソームカーゴ分子の発現レベルを検出するためにＥＬＩＳＡアッセイによって特徴付けられた。得られた結果に基づき、ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣプライミングのために濃度ＡＴＲＡを最終化した。
【0175】
ＡＴＲＡはＭＳＣの生存率を増加させることが見出されている。これは、ＭＳＣを種々の濃度のＡＴＲＡ（０．１μＭ～５００μＭ）で２４時間および４８時間処置し、それらの生存率をＭＴＴアッセイにより調べたときに確認された。ＭＳＣ生存率は、０．１μｍｏｌ／Ｌ ＡＴＲＡを除くすべての処置されたＭＳＣにおいて有意に高かった。ＡＴＲＡはＰＧＥ２レベルを上昇させた。様々な濃度のＡＴＲＡ（１、１０、１００μｍｏｌ／Ｌ）によるＭＳＣの前処置は、ＭＳＣにおいて用量依存的にＰＧＥ２レベルを有意に増加させた。ＡＴＲＡは、ＭＳＣの生存、遊走および血管新生に関与する遺伝子の発現を増加させた。ＣＯＸ－２、ＨＩＦ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ－２およびＡｎｇ－４のｍＲＮＡレベルは、定量的リアルタイムＰＣＲにより推定され、ＭＳＣをＡＴＲＡ（１、１０、１００μｍｏｌ／Ｌ）により処置した場合、用量依存的に上昇した。
【0176】
３．１２．低酸素状態の存在下でＮｒｆ２活性化因子、ＳＩＲＴ１活性化因子、ＡＴＲＡを用いた幹細胞のコンビナトリアルプライミングプロトコール（ＥＸＯ変異体Ｂ’）
ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣを継代（５－６）まで上記のように培養し、低酸素症を本明細書に記載されるように生じさせた。ＥＶ回収にシフトする前に、ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣをＮｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ、４－ＯＩ）で２４～７２時間処置した。ＥＶ回収曝露、馴化培地回収は、上述のように行われた。
ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣを継代（５－６）まで上記のように培養し、低酸素症を本明細書に記載されるように生じさせた。ＥＶ回収にシフトする前に、ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣをＮｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ、４－ＯＩ）で２４～７２時間処置した。ＥＶ回収曝露、馴化培地回収は、上述のように行われた。
【0177】
セクレトームは、ＥＬＩＳＡによりＮｒｆ２、ＨＩＦ－１α、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｓＦＬＴ１のレベルを検出することによって特徴付けられた。
【0178】
プライミングされたエキソソーム変異体は、Ｎｒｆ２、ＨＩＦ－１α、ＶＥＧＦ、ｓＦＬＴ１、ＩＬ－１０、ＳＩＲＴ１などのエキソソームカーゴ分子発現のレベルを検出するＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。
【0179】
３．１３．低酸素状態の存在下におけるＡＴＲＡ誘導因子を用いたＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣのコンビナトリアルプライミングプロトコール（Ｅｘｏ変異体Ｂ’）
ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣを上記のように継代まで培養し（５－６）、記載されるように低酸素症を生じさせた。ＥＶ回収にシフトする前に、ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣをＡＴＲＡ誘導因子（０．１～５００）μＭで２４～７２時間処置した。Ｒｏｏｓｔｅｒ ＥＶ回収曝露、馴化培地回収を上記のように行った。セクレトームは、さらに、ＥＬＩＳＡによりＣＯＸ－２、ＨＩＦ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ－２およびＡｎｇ－４のレベルを検出することによって特徴付けられた。
ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣを上記のように継代まで培養し（５－６）、記載されるように低酸素症を生じさせた。ＥＶ回収にシフトする前に、ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣをＡＴＲＡ誘導因子（０．１～５００）μＭで２４～７２時間処置した。Ｒｏｏｓｔｅｒ ＥＶ回収曝露、馴化培地回収を上記のように行った。セクレトームは、さらに、ＥＬＩＳＡによりＣＯＸ－２、ＨＩＦ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ－２およびＡｎｇ－４のレベルを検出することによって特徴付けられた。
【0180】
プライミングされたエキソソーム変異体は、ＣＯＸ－２、ＨＩＦ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ－２およびＡｎｇ－４などのエキソソームカーゴ分子発現のレベルを検出するＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。
【0181】
３．１４．低酸素状態の存在下でのＳＩＲＴ１誘導因子およびＡＴＲＡによるＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣのコンビナトリアルプライミング（Ｅｘｏ変異体Ｂ’）
ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣは、ＳＲＴ２１０４活性化因子またはＲＳＶ誘導化プライミング後に上記のように培養された。低酸素状態／正常酸素状態のサイクル（３０～９０分間隔で８～２０サイクル）で低酸素症を生じさせた。低酸素状態では酸素濃度を０．５～１０％に保持し、正常酸素状態では酸素濃度を１４～２２％に保持した。細胞が８０％コンフルエンスに達した後、２４～７２時間、ＡＴＲＡ誘導因子（０．１～５００）μＭにより処置した。上述のように、Ｒｏｏｓｔｅｒ ＥＶ曝露、馴化培地回収を行った。
ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣは、ＳＲＴ２１０４活性化因子またはＲＳＶ誘導化プライミング後に上記のように培養された。低酸素状態／正常酸素状態のサイクル（３０～９０分間隔で８～２０サイクル）で低酸素症を生じさせた。低酸素状態では酸素濃度を０．５～１０％に保持し、正常酸素状態では酸素濃度を１４～２２％に保持した。細胞が８０％コンフルエンスに達した後、２４～７２時間、ＡＴＲＡ誘導因子（０．１～５００）μＭにより処置した。上述のように、Ｒｏｏｓｔｅｒ ＥＶ曝露、馴化培地回収を行った。
【0182】
馴化培地をスクリーニングして、ＥＬＩＳＡを用いてＣＯＸ－２、ＨＩＦ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ－２およびＡｎｇ－４発現を検出した。
【0183】
最適化されたエキソソーム単離プロトコールに従って、ＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣでプライミングされたエキソソーム変異体は、コンビナトリアルプライミングセット（低酸素状態の存在下でのＳＲＴ１活性化因子およびＡＴＲＡ誘導因子）から単離された。エキソソームのプライミングされた変異体は、種々のカーゴ分子を検出するためのＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。
【0184】
エキソソームの異なるＵＣ－ＭＳＣ／ｈＢＭ－ＭＳＣプライミングされた変異体は、質量分光分析により徹底的に特徴付けられ、タンパク質プロファイリングおよびＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析などの技術を介したｍｉＲＮＡプロファイリングを検出した。各エキソソーム変異体の機能的有効性は、２Ｄスクラッチアッセイ、抗炎症アッセイ、抗線維症、促進／抗血管新生および再神経支配アッセイなどのインビトロアッセイを用いて試験された。異なる変異体の機能的有効性に基づき、最もスコアが高いエキソソーム変異体を選択し、抗炎症性疾患モデルのインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）前臨床試験のために継続する。ＬＰＳ誘導されたＡＲＤＳ誘導およびブレオマイシン処置された肺傷害モデルは、最もスコアが高いエキソソームのインビボ有効性試験に使用される。
【0185】
［実施例４］
エキソソームの単離および精製
馴化培地は、それぞれ実施例１．２．２および１．３．２に記載されるプロセスに従って、ｈＢＭ－ＭＳＣおよびＵＣ－ＭＳＣから回収された。
エキソソームの単離および精製
馴化培地は、それぞれ実施例１．２．２および１．３．２に記載されるプロセスに従って、ｈＢＭ－ＭＳＣおよびＵＣ－ＭＳＣから回収された。
【0186】
得られた馴化培地をセクレトームとして直接使用するか、またはエキソソームを単離するために超遠心分離に供した。馴化培地／セクレトームからのエキソソームの単離は、３つの方法：（ｉ）単一工程の超遠心分離；（ｉｉ）スクロースベースのクッション密度超遠心分離、および（ｉｉｉ）イオジキサノール密度勾配超遠心分離を用いて行われた。
【0187】
馴化培地／セクレトームからのエキソソームの単離は、以下の３つの方法によって行われた。
【0188】
４．１ スクロースベースのクッション密度超遠心分離
次の工程に従い、スクロースベースのクッション密度遠心分離を用いてエキソソームを精製した。
次の工程に従い、スクロースベースのクッション密度遠心分離を用いてエキソソームを精製した。
【0189】
（ｉ）細胞が８０％コンフルエンシーに達した後、培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳ（２０ｍＬ）中で洗浄し、続いて、２６０ｍＬのＥＶ回収培地をフラスコに添加し、次に、フラスコを７２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【0190】
（ｉｉ）上清を回収し、下記のように前処理工程に進んだ：
ａ．培地を３００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｂ．上清を３０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｃ．上清を１３０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｄ．培地を０．４５ミクロンのフィルターで濾過した。
ｅ．次に、培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過した。
ａ．培地を３００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｂ．上清を３０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｃ．上清を１３０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｄ．培地を０．４５ミクロンのフィルターで濾過した。
ｅ．次に、培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過した。
【0191】
（ｉｉｉ）馴化培地は、４℃で短期保存（２４時間）または－８０℃で長期保存（１ヵ月）で保存した。しかしながら、培地を直ちに処理した場合、または凍結した場合は、馴化培地を４℃にし、以下に記載するプロトコールに従った：
ａ．馴化培地を１００，０００×ｇで９０分間、４℃にて遠心分離した。
ｂ．上清を慎重に除去した。チューブの底部に透明なペレットを観察した。
ｃ．濃縮されたエキソソームを３０％スクロース（１Ｍ）含有超遠心分離管上に、記載されるように移した。
ｄ．速度は１０００００ｇで２時間、４℃に設定し、加減速はゼロに設定した。
ｅ．上清を慎重に除去し、エキソソームを滅菌した１×ＰＢＳに再懸濁した。
ｆ．エキソソームを分注し、－８０℃で保存した。
ａ．馴化培地を１００，０００×ｇで９０分間、４℃にて遠心分離した。
ｂ．上清を慎重に除去した。チューブの底部に透明なペレットを観察した。
ｃ．濃縮されたエキソソームを３０％スクロース（１Ｍ）含有超遠心分離管上に、記載されるように移した。
ｄ．速度は１０００００ｇで２時間、４℃に設定し、加減速はゼロに設定した。
ｅ．上清を慎重に除去し、エキソソームを滅菌した１×ＰＢＳに再懸濁した。
ｆ．エキソソームを分注し、－８０℃で保存した。
【0192】
４．２ 単一工程の超遠心分離：
以下の工程に従い、単一工程の遠心分離を用いてエキソソームを精製した。
（ｉ）細胞を８０％コンフルエントにした後、培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳ（２０ｍＬ）中で洗浄した。ＰＢＳを廃棄し、４０～４５ｍＬ／フラスコのＥＶ回収培地をフラスコに添加し、次に７２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。上清を回収し、次のように前処理工程を進めた：
ａ．培地を３００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｂ．上清を３０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｃ．上清を１３０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｄ．培地を０．４５ミクロンのフィルターで濾過した。
ｅ．次に、培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過した。
以下の工程に従い、単一工程の遠心分離を用いてエキソソームを精製した。
（ｉ）細胞を８０％コンフルエントにした後、培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳ（２０ｍＬ）中で洗浄した。ＰＢＳを廃棄し、４０～４５ｍＬ／フラスコのＥＶ回収培地をフラスコに添加し、次に７２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。上清を回収し、次のように前処理工程を進めた：
ａ．培地を３００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｂ．上清を３０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｃ．上清を１３０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｄ．培地を０．４５ミクロンのフィルターで濾過した。
ｅ．次に、培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過した。
【0193】
馴化培地は、４℃で短期保存（２４時間）または－８０℃で長期保存（１ヵ月）で保存したが、処理直後または解凍した試料を用いた場合は、以下のプロトコールを用いた：
ａ．馴化培地を、１００，０００×ｇで９０分間、４℃にて遠心分離した。
ｂ．上清を慎重に除去した。チューブの底部に透明なペレットを観察した。
ｃ．ペレットをＰＢＳ／生理食塩水に溶解した。０．５ｍＬの粗エキソソームをＱＣのために－８０℃で保存した。
ａ．馴化培地を、１００，０００×ｇで９０分間、４℃にて遠心分離した。
ｂ．上清を慎重に除去した。チューブの底部に透明なペレットを観察した。
ｃ．ペレットをＰＢＳ／生理食塩水に溶解した。０．５ｍＬの粗エキソソームをＱＣのために－８０℃で保存した。
【0194】
４．３．イオジキサノール密度勾配超遠心分離
細胞が８０％コンフルエント（例えば、４３０００～５００００細胞／ｃｍ２）に達した後、培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳ（２０ｍＬ）中で洗浄し、続いて、４０～４５ｍＬ／フラスコのＥＶ回収培地をフラスコに加え、７２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。上清を回収し、直ちに下記のように前処理工程に進んだ：
ａ．培地を３００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｂ．上清を３０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｃ．上清を１３０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｄ．培地を０．４５ミクロンのフィルターで濾過した。
ｅ．次に、培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過した。
細胞が８０％コンフルエント（例えば、４３０００～５００００細胞／ｃｍ２）に達した後、培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳ（２０ｍＬ）中で洗浄し、続いて、４０～４５ｍＬ／フラスコのＥＶ回収培地をフラスコに加え、７２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。上清を回収し、直ちに下記のように前処理工程に進んだ：
ａ．培地を３００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｂ．上清を３０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｃ．上清を１３０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離し、上清を回収した。
ｄ．培地を０．４５ミクロンのフィルターで濾過した。
ｅ．次に、培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過した。
【0195】
馴化培地は４℃で短期保存（２４時間）または－８０℃で長期保存（１ヵ月）で保存した。直ちにまたは凍結試料を用いて処理するために、以下のプロトコールに従った：
１．馴化培地を、１００，０００×ｇで９０分間、４℃にて遠心分離した。
２．上清を慎重に除去した。チューブの底部に透明なペレットを観察した。
３．ペレットを３６ｍＬのＥＶ回収培地（開始馴化培地３００ｍＬあたり３６ｍＬ）に溶解した。０．５ｍＬの粗エキソソームをＱＣのために－８０℃で保存した。
１．馴化培地を、１００，０００×ｇで９０分間、４℃にて遠心分離した。
２．上清を慎重に除去した。チューブの底部に透明なペレットを観察した。
３．ペレットを３６ｍＬのＥＶ回収培地（開始馴化培地３００ｍＬあたり３６ｍＬ）に溶解した。０．５ｍＬの粗エキソソームをＱＣのために－８０℃で保存した。
【0196】
密度勾配超遠心分離（ＤＧＵＣ）：
ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）および２５ｍＭ Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含有する３ｍＬの１０％ｗ／ｖ ＩＤＸ溶液（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ１５５６）を３ｍＬの５５％ｗ／ｖ ＩＤＸ溶液に浮遊させて、イオジキサノール（ＩＤＸ）勾配を調製した。濃縮された馴化培地（６ｍＬ）をＩＤＸクッションの上部に浮遊させ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＳＷ ４０ Ｔｉローターを用いて４．５時間、１００，０００×ｇ（４℃）で超遠心分離した。氷上の勾配の上部から１２画分（各１ｍＬ）を回収し、予め冷却した１．５ｍＬチューブに各画分を回収した。画分－９を新鮮な超遠心分離管に移し、１１ｍＬのＰＢＳを１ｍＬ画分に添加した。超遠心分離を１００，０００×ｇで４時間、４℃でＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＳＷ ４０ Ｔｉローターを用いるＯｐｔｉｍａ ＸＰＮ－１００超遠心分離機中で繰り返した。上清を廃棄し、エキソソームを１ｍＬ ＰＢＳ中に再懸濁した。５０～１００μＬの異なるアリコートを調製し、４℃で短期（２～３日間）および－８０℃で長期保存で保存した。
ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）および２５ｍＭ Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含有する３ｍＬの１０％ｗ／ｖ ＩＤＸ溶液（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ１５５６）を３ｍＬの５５％ｗ／ｖ ＩＤＸ溶液に浮遊させて、イオジキサノール（ＩＤＸ）勾配を調製した。濃縮された馴化培地（６ｍＬ）をＩＤＸクッションの上部に浮遊させ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＳＷ ４０ Ｔｉローターを用いて４．５時間、１００，０００×ｇ（４℃）で超遠心分離した。氷上の勾配の上部から１２画分（各１ｍＬ）を回収し、予め冷却した１．５ｍＬチューブに各画分を回収した。画分－９を新鮮な超遠心分離管に移し、１１ｍＬのＰＢＳを１ｍＬ画分に添加した。超遠心分離を１００，０００×ｇで４時間、４℃でＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＳＷ ４０ Ｔｉローターを用いるＯｐｔｉｍａ ＸＰＮ－１００超遠心分離機中で繰り返した。上清を廃棄し、エキソソームを１ｍＬ ＰＢＳ中に再懸濁した。５０～１００μＬの異なるアリコートを調製し、４℃で短期（２～３日間）および－８０℃で長期保存で保存した。
【0197】
上記の３つの方法のすべてに続いて、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏｃｏｒｅ ７００カラムを用いる）を使用して第２ラウンドの精製を行った。エキソソーム精製のプロセスは、出願中のＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２、ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３、ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６５３に詳細に記載されており、本開示にそれらの全体が組み込まれる。本実施例は、ｈＢＭ－ＭＳＣおよびＵＣ－ＭＳＣから回収された馴化培地からのエキソソームの単離および精製を示すが、しかしながら、当業者は、限定されないが、ＣＳＳＣ、ＷＪＭＳＣを含む幹細胞から回収された馴化培地からエキソソームを得ることができると考え得る。本明細書に記載の幹細胞は、ナイーブ幹細胞または実施例３に記載される異なるプライミング剤でプライミングされた幹細胞であり得、ナイーブ幹細胞（Ａ）／プライミングされた幹細胞（Ａ’）は、本実施例に記載されるプロトコールに従うことによって、それぞれナイーブエキソソーム（Ｂ）／プライミングされたエキソソーム（Ｂ’）を得るために用いることができる馴化をさらに回収するために使用される。
【0198】
［実施例５］
エキソソームの特徴付け
実施例４に記載されるように、採取または精製したエキソソームは、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、ウエスタンブロッティング、質量分析、ならびにリアルタイムＰＣＲおよびＲＮＡｓｅｑによるＲＮＡ含有量の分析などの方法によって特徴付けられた。特徴付けられたエキソソーム変異体は、ナイーブエキソソーム（Ｂ）またはプライミングされたエキソソーム（Ｂ’）である。
エキソソームの特徴付け
実施例４に記載されるように、採取または精製したエキソソームは、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、ウエスタンブロッティング、質量分析、ならびにリアルタイムＰＣＲおよびＲＮＡｓｅｑによるＲＮＡ含有量の分析などの方法によって特徴付けられた。特徴付けられたエキソソーム変異体は、ナイーブエキソソーム（Ｂ）またはプライミングされたエキソソーム（Ｂ’）である。
【0199】
５．１ ＮＴＡ分析
精製したエキソソームを滅菌ＰＢＳに溶解し、別のアリコート（２０～５０μｌ）のエキソソーム画分を－８０℃で保存した。オートクレーブしたミリＱを０．２２μｍシリンジフィルター／ヌクレアーゼ不含水で濾過し、試料希釈に用いる。エキソソーム試料の１：５００希釈をＮＴＡデータ獲得のために使用した。ピペッティングにより混合した後、２μｌのエキソソーム試料をアリコートから取り出した。これを１．５ｍｌマイクロ遠心分離管中の９９８μｌのミリＱに添加し、１ｍｌピペットと複数回混合した。計器情報およびデータ獲得設定は、以下の設定：カメラレベル１６、利得３および３回の実行、各３０秒の実行および閾値を用いて、データ獲得のためにＭａｌｖｅｒｎからのＮａｎｏｓｉｇｈｔ ＬＭ１０を使用することによって行われた。
精製したエキソソームを滅菌ＰＢＳに溶解し、別のアリコート（２０～５０μｌ）のエキソソーム画分を－８０℃で保存した。オートクレーブしたミリＱを０．２２μｍシリンジフィルター／ヌクレアーゼ不含水で濾過し、試料希釈に用いる。エキソソーム試料の１：５００希釈をＮＴＡデータ獲得のために使用した。ピペッティングにより混合した後、２μｌのエキソソーム試料をアリコートから取り出した。これを１．５ｍｌマイクロ遠心分離管中の９９８μｌのミリＱに添加し、１ｍｌピペットと複数回混合した。計器情報およびデータ獲得設定は、以下の設定：カメラレベル１６、利得３および３回の実行、各３０秒の実行および閾値を用いて、データ獲得のためにＭａｌｖｅｒｎからのＮａｎｏｓｉｇｈｔ ＬＭ１０を使用することによって行われた。
【0200】
５．２ エキソソームの透過型電子顕微鏡画像
エキソソームペレットを０．１Ｍカコジル酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の１ｍＬの２．５％グルタールアルデヒドで１時間、４℃にて固定した。固定液を除去し、ペレットを室温で１ｍＬの０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液でリンスした。これを３回繰り返し、各サイクルを１０分間持続させた。試料を１ｍＬの２％四酸化オスミウムを用いて１時間、４℃で固定した。固定液を除去し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液で１０分ごとに３回リンスした。試料を、段階的アセトンシリーズ（それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％）を用いて、シェーカー上で１０分間インキュベートした。アセトンを除去し、３：１のアセトン：低粘度包埋混合物の溶液を３０分間インキュベートして、エキソソームペレットを得た。さらに、１：１のアセトン：低粘度包埋混合培地を再度添加し、３０分間インキュベートした。培地を除去し、１：３のアセトン：低粘度包埋混合培地を添加し、続いて３０分間インキュベートした。さらに、培地を除去し、１００％低粘度包埋混合物を添加し、一晩、室温でインキュベートした。
エキソソームペレットを０．１Ｍカコジル酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の１ｍＬの２．５％グルタールアルデヒドで１時間、４℃にて固定した。固定液を除去し、ペレットを室温で１ｍＬの０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液でリンスした。これを３回繰り返し、各サイクルを１０分間持続させた。試料を１ｍＬの２％四酸化オスミウムを用いて１時間、４℃で固定した。固定液を除去し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液で１０分ごとに３回リンスした。試料を、段階的アセトンシリーズ（それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％）を用いて、シェーカー上で１０分間インキュベートした。アセトンを除去し、３：１のアセトン：低粘度包埋混合物の溶液を３０分間インキュベートして、エキソソームペレットを得た。さらに、１：１のアセトン：低粘度包埋混合培地を再度添加し、３０分間インキュベートした。培地を除去し、１：３のアセトン：低粘度包埋混合培地を添加し、続いて３０分間インキュベートした。さらに、培地を除去し、１００％低粘度包埋混合物を添加し、一晩、室温でインキュベートした。
【0201】
試料を包埋用鋳型を用いて純粋な低粘度包埋混合物に包埋し、２４時間、６５℃で焼成した。厚さ６０ｎｍの切片を超ミクロトームを用いて得、２％酢酸ウラニルで２０分間、二重染色し、クエン酸鉛で１０分間、二重染色し、８０ｋＶで透過型電子顕微鏡下でグリッドを観察した。
【0202】
５．３：ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティングは、以下に記載される２つのプロセスに従って行われた。
ウエスタンブロッティングは、以下に記載される２つのプロセスに従って行われた。
【0203】
５．３．１：プロトコール１
２億個の粒子に相当する２０μｌのエキソソーム溶解物を、２０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（ＣＤ６３、ＣＤ９およびＣＤ８１のためのβメルカプトエタノールを含まない）と混合した。９５℃で１０分間加熱し、ボルテックス後、ゲルに装填した（１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。ＡｌｉｘおよびＴＳＧ１０１については、βメルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（例えば、還元条件下）を抗体データシート試料調製に従って使用した。
２億個の粒子に相当する２０μｌのエキソソーム溶解物を、２０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（ＣＤ６３、ＣＤ９およびＣＤ８１のためのβメルカプトエタノールを含まない）と混合した。９５℃で１０分間加熱し、ボルテックス後、ゲルに装填した（１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。ＡｌｉｘおよびＴＳＧ１０１については、βメルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（例えば、還元条件下）を抗体データシート試料調製に従って使用した。
【0204】
５．３．２ プロトコール２
約０．４ ２ｎのエキソソームを凍結乾燥し、その後、２０μｌのヌクレアーゼ不含水を凍結乾燥したエキソソームに添加した。これに続いて、２０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を添加し、それを９５℃で１０分間加熱した。ボルテックス後、ゲルに装填した（１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。
約０．４ ２ｎのエキソソームを凍結乾燥し、その後、２０μｌのヌクレアーゼ不含水を凍結乾燥したエキソソームに添加した。これに続いて、２０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を添加し、それを９５℃で１０分間加熱した。ボルテックス後、ゲルに装填した（１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。
【0205】
ＰＶＤＦ膜は、それが埋め込まれた２層の紙とともに適切なサイズに切断された。鉗子の手助けで白色膜を分離し、膜の活性化のために５０ｍＬのメタノールに浸漬した。１分間保存し、蒸留水でリンスした。次に、活性化された膜を５０ｍＬの１×転写緩衝液に移した。転写装置カセットを洗浄し、約３０ｍｌの１×転写緩衝液中で吸収紙を湿潤させた。１ブロットの吸収性ろ紙をカセットに入れ、次に膜、ゲルおよび濾紙を入れた。ブロットローラーを使用して、ブロットとゲルの間で気泡が除去されたことを確認した。転写は２５Ｖおよび２．５Ａで６０分間設定した。
【0206】
転写完了後、ＰＶＤＦ膜を鉗子を用いて慎重に除去し、ブロッキング溶液（５０ｍＬの１×ＴＢＳＴ中の５％無脂肪乳溶液）中で１時間、振とう器上で室温にてインキュベートした。次に、ＰＶＤＦ膜を鉗子を用いてブロッキング溶液から除去し、１０分間、振とう器上で室温にて１×ＴＢＳＴ洗浄を与えた。清潔な鉗子を用いて、タンパク質の大きさに従って、膜を慎重にストライプに切断した。
【0207】
ＰＶＤＦストライプを、目的とするタンパク質に関して、それぞれの一次抗体（１×ＴＢＳ中の０．１％ＢＳＡ中で希釈される）中で、振とう器上で一晩、４０℃にてインキュベートした。ＰＶＤＦ膜を翌日に一次抗体から除去し、１×ＴＢＳＴ緩衝液中で６回リンスした（各リンスを５分間）。一次抗体を－２０℃で保存することにより再使用した。膜を、振とう器上で２時間、室温にてＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体（１×ＴＢＳ中の０．１％ＢＳＡで希釈される）とインキュベートした。膜を１×ＴＢＳＴ緩衝液で６回洗浄し（各リンスを５分間）、最後の洗浄後、膜を発色に先立って転写緩衝液中に保持した。ブロットは、暗所でＥＣＬ化学発光試薬を用いて発色させた（活性試薬は製造業者のガイドラインに従って調製した）。
【0208】
５．４ 質量分析
５．４．１ 試料の調製：
試料を２～８℃で解凍し、２５μＬの試料を２５μｌの溶解緩衝液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、１００ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０）と混合し、続いて１時間、室温でインキュベートし、短時間超音波処理した。得られた試料を、予めキャストされたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰａｇｅ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ勾配ゲル）上の３つの異なるレーンに装填した。短時間（１０分未満）の電気泳動を一定電圧で行い、タンパク質試料から界面活性剤を除去した。ゲルコードブルー染色を用いて、タンパク質バンドを可視化した。システイン残基の還元およびアルキル化を含むゲル内トリプシンタンパク質消化法を利用してタンパク質を消化した。得られたトリプシンペプチドをプールし、Ｃ１８ ｚｉｐ－チップを用いて清澄化した。Ｚｉｐ－チップ溶出液を乾燥に近いように濃縮し、８μＬの０．１％ＦＡに溶解した。タンパク質の同定のため、各々２μＬの３回の反復注入を行った。
５．４．１ 試料の調製：
試料を２～８℃で解凍し、２５μＬの試料を２５μｌの溶解緩衝液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、１００ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０）と混合し、続いて１時間、室温でインキュベートし、短時間超音波処理した。得られた試料を、予めキャストされたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰａｇｅ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ勾配ゲル）上の３つの異なるレーンに装填した。短時間（１０分未満）の電気泳動を一定電圧で行い、タンパク質試料から界面活性剤を除去した。ゲルコードブルー染色を用いて、タンパク質バンドを可視化した。システイン残基の還元およびアルキル化を含むゲル内トリプシンタンパク質消化法を利用してタンパク質を消化した。得られたトリプシンペプチドをプールし、Ｃ１８ ｚｉｐ－チップを用いて清澄化した。Ｚｉｐ－チップ溶出液を乾燥に近いように濃縮し、８μＬの０．１％ＦＡに溶解した。タンパク質の同定のため、各々２μＬの３回の反復注入を行った。
【0209】
５．４．２ 質量分析に基づくタンパク質の同定
ナノフローセットアップを用いて、０．１％ギ酸（ＦＡ）の直線勾配を通して逆相液体クロマトグラフィーカラム上でトリプシンペプチドを分離し、１１０分間（総実行時間１４０分）かけて展開した。データは、データ依存モードで良好に最適化された条件で回収された。最適化条件標準では、２μｇ負荷でのＨｅ－Ｌａ細胞トリプシン消化により、６０００個のタンパク質の同定が提供された。試験試料の獲得されたＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータは、Ｍａｘｑｕａｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてヒトプロテオームデータベースに対して検索された。タンパク質の同定は、以下の基準で行われた：（ａ）４回の切断を許容しないトリプシン消化ペプチド、（ｂ）ペプチド耐性＜１０ｐｐｍ、（ｃ）≧１個の固有のペプチド、（ｄ）ＦＤＲ＜１％、（ｅ）固定修飾－システインのカルバミドメチル化および可変修飾－メチオニンの酸化。
ナノフローセットアップを用いて、０．１％ギ酸（ＦＡ）の直線勾配を通して逆相液体クロマトグラフィーカラム上でトリプシンペプチドを分離し、１１０分間（総実行時間１４０分）かけて展開した。データは、データ依存モードで良好に最適化された条件で回収された。最適化条件標準では、２μｇ負荷でのＨｅ－Ｌａ細胞トリプシン消化により、６０００個のタンパク質の同定が提供された。試験試料の獲得されたＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータは、Ｍａｘｑｕａｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてヒトプロテオームデータベースに対して検索された。タンパク質の同定は、以下の基準で行われた：（ａ）４回の切断を許容しないトリプシン消化ペプチド、（ｂ）ペプチド耐性＜１０ｐｐｍ、（ｃ）≧１個の固有のペプチド、（ｄ）ＦＤＲ＜１％、（ｅ）固定修飾－システインのカルバミドメチル化および可変修飾－メチオニンの酸化。
【0210】
表９は、プライミングされたエキソソーム変異体中にカーゴとして存在することができ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、または質量分析などのタンパク質検出の１つ以上の標準方法を用いて検出することができるタンパク質バイオマーカーのリストを示す。
【0211】
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【表9-4】
【表9-5】
【表9-6】
【表9-7】
【0212】
５．５ エキソソームＲＮＡ単離
５．５．１ エキソソームＲＮＡ単離プロトコール
製造業者のプロトコールに従って、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを用いて、ナイーブＢＭ－ＭＳＣ由来エキソソームからＲＮＡ抽出を行った。５０億個のエキソソームがエキソソームＲＮＡを単離すると考えられた。ＲＮＡ定量化は、ＮａｎｏｄｏｐｒｏｐおよびＱｕｂｉｔで行い、ＱｕｂｉｔマイクロＲＮＡアッセイを用いてｍｉＲＮＡ／低分子ＲＮＡ分子の存在をチェックした。
５．５．１ エキソソームＲＮＡ単離プロトコール
製造業者のプロトコールに従って、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを用いて、ナイーブＢＭ－ＭＳＣ由来エキソソームからＲＮＡ抽出を行った。５０億個のエキソソームがエキソソームＲＮＡを単離すると考えられた。ＲＮＡ定量化は、ＮａｎｏｄｏｐｒｏｐおよびＱｕｂｉｔで行い、ＱｕｂｉｔマイクロＲＮＡアッセイを用いてｍｉＲＮＡ／低分子ＲＮＡ分子の存在をチェックした。
【0213】
５．５．２ １００億個の凍結乾燥したエキソソームからのエキソソームＲＮＡの単離
ｍｉＲＶａｎａ ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｃａｔ＃：ＡＭ１５６０）を用いてＲＮＡ抽出を行い、４つの溶出をそれぞれ２５μｌ、２５μｌ、５０μｌ、および５０μｌの容量で行った。ＲＮＡ定量化はＮａｎｏｄｏｐｒｏｐおよびＱｕｂｉｔで行い、ＱｕｂｉｔマイクロＲＮＡアッセイを用いてｍｉＲＮＡ／低分子ＲＮＡ分子の存在をチェックした。
ｍｉＲＶａｎａ ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｃａｔ＃：ＡＭ１５６０）を用いてＲＮＡ抽出を行い、４つの溶出をそれぞれ２５μｌ、２５μｌ、５０μｌ、および５０μｌの容量で行った。ＲＮＡ定量化はＮａｎｏｄｏｐｒｏｐおよびＱｕｂｉｔで行い、ＱｕｂｉｔマイクロＲＮＡアッセイを用いてｍｉＲＮＡ／低分子ＲＮＡ分子の存在をチェックした。
【0214】
５．５．３ エキソソームｍｉＲＮＡプロファイリング
抽出したエキソソームＲＮＡの種々の溶出物を、バイオアナライザーで実行して、低分子ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの存在をチェックした。溶出物を一緒にプールし、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームを用いてｍｉＲＮＡプロファイリングを行うために調製した。すべてのプロセスは、製造業者の説明書に基づいて行われた。
抽出したエキソソームＲＮＡの種々の溶出物を、バイオアナライザーで実行して、低分子ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの存在をチェックした。溶出物を一緒にプールし、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームを用いてｍｉＲＮＡプロファイリングを行うために調製した。すべてのプロセスは、製造業者の説明書に基づいて行われた。
【0215】
表１０は、プライミングされたエキソソーム変異体において分析されたｍｉＲＮＡのリストを示す。
【0216】
【表10-1】
【表10-2】
【表10-3】
【表10-4】
【0217】
表１１は、プライミングされたエキソソーム変異体において分析されたｍＲＮＡのリストを示す。
【0218】
【表11-1】
【表11-2】
【0219】
５．６ リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡｅａｓｙおよびｍｉｒＶａｎａＴＭ（ｎ＝３）を用いて単離された全ＲＮＡは、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＤＮａｓｅ処置された。ｍｉＲＣＵＲＹＴＭ ＬＮＡＴＭマイクロ－ＰＣＲシステムを用いて、製造業者のプロトコールに従い、最初の鎖ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲを行った。簡単に説明すると、各ｃＤＮＡ合成は、固定容量の総ＲＮＡ、ｍｉＲ－４５１特異的リバースプライマー（遺伝子ＩＤ：５７４４１１）、および第１鎖ｃＤＮＡ合成キット試薬を用いて二重に行って、３０分間、５０℃でインキュベートし、続いて１０分間、８５℃でインキュベートした。次に、各ｃＤＮＡ試料を１：１０に希釈し、ｍｉＲＣＵＲＹＴＭ ＬＮＡＴＭ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎマスターミックス、ユニバーサルプライマーおよびＬＮＡＴＭ ＰＣＲ ｍｉＲ－４５１特異的プライマーを用いて二重にして使用した。ＰＣＲを９５℃で１０分間；９５℃で１０秒間＋６０℃で５秒間を４０サイクル行い、融解曲線により５秒で各０．５℃について最終化した。対照試料を並行して実行した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、ｃＤＮＡとリアルタイムＰＣＲ反応の両方に利用した。
ＲＮＡｅａｓｙおよびｍｉｒＶａｎａＴＭ（ｎ＝３）を用いて単離された全ＲＮＡは、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＤＮａｓｅ処置された。ｍｉＲＣＵＲＹＴＭ ＬＮＡＴＭマイクロ－ＰＣＲシステムを用いて、製造業者のプロトコールに従い、最初の鎖ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲを行った。簡単に説明すると、各ｃＤＮＡ合成は、固定容量の総ＲＮＡ、ｍｉＲ－４５１特異的リバースプライマー（遺伝子ＩＤ：５７４４１１）、および第１鎖ｃＤＮＡ合成キット試薬を用いて二重に行って、３０分間、５０℃でインキュベートし、続いて１０分間、８５℃でインキュベートした。次に、各ｃＤＮＡ試料を１：１０に希釈し、ｍｉＲＣＵＲＹＴＭ ＬＮＡＴＭ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎマスターミックス、ユニバーサルプライマーおよびＬＮＡＴＭ ＰＣＲ ｍｉＲ－４５１特異的プライマーを用いて二重にして使用した。ＰＣＲを９５℃で１０分間；９５℃で１０秒間＋６０℃で５秒間を４０サイクル行い、融解曲線により５秒で各０．５℃について最終化した。対照試料を並行して実行した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、ｃＤＮＡとリアルタイムＰＣＲ反応の両方に利用した。
【0220】
［実施例６］
エキソソームの機能的特徴付け
エキソソームは、以下のアッセイ：ａ）スクラッチアッセイ（創傷治癒能力）；ｂ）抗炎症アッセイ；ｃ）抗線維症アッセイ；ｄ）再神経支配アッセイ；ｅ）血管新生（抗／促進）アッセイを評価することによって機能的に特徴付けられた。
エキソソームの機能的特徴付け
エキソソームは、以下のアッセイ：ａ）スクラッチアッセイ（創傷治癒能力）；ｂ）抗炎症アッセイ；ｃ）抗線維症アッセイ；ｄ）再神経支配アッセイ；ｅ）血管新生（抗／促進）アッセイを評価することによって機能的に特徴付けられた。
【0221】
６．１ スクラッチアッセイ
不死化されたヒト角膜上皮細胞（ｈＴＣＥＰＩ）を２Ｄスクラッチアッセイに使用した。ｈＴＥＣＰＩ細胞は、無血清培地中の５０００細胞／ｃｍ２の密度で組織培養処置された培養ディッシュに播種され、細胞は、ウェルの中心を横切るスクラッチを作製する前に、コンフルエントになるまで増殖させた。培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄して浮遊細胞を除去し、続いて、（１～２０）×１０８エキソソーム／ｍＬを含有する培地を各ウェルに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、完全閉鎖まで６時間毎にスクラッチ閉鎖を評価した。細胞の画像を異なる時点（６時間毎）で取得し、創幅をＩｍａｇｅＪを用いて定量化した。採用された対照は、培地のみ（エキソソームなし）かまたはエキソソーム枯渇対照／培地のいずれかとした。
不死化されたヒト角膜上皮細胞（ｈＴＣＥＰＩ）を２Ｄスクラッチアッセイに使用した。ｈＴＥＣＰＩ細胞は、無血清培地中の５０００細胞／ｃｍ２の密度で組織培養処置された培養ディッシュに播種され、細胞は、ウェルの中心を横切るスクラッチを作製する前に、コンフルエントになるまで増殖させた。培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄して浮遊細胞を除去し、続いて、（１～２０）×１０８エキソソーム／ｍＬを含有する培地を各ウェルに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、完全閉鎖まで６時間毎にスクラッチ閉鎖を評価した。細胞の画像を異なる時点（６時間毎）で取得し、創幅をＩｍａｇｅＪを用いて定量化した。採用された対照は、培地のみ（エキソソームなし）かまたはエキソソーム枯渇対照／培地のいずれかとした。
【0222】
６．２ 抗炎症アッセイ
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を、完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）中で５０００細胞／ｃｍ２の密度で組織培養ディッシュに播種し、細胞を８０％コンフルエントまで増殖させた。無血清培地中で細胞を１６時間飢餓状態にし、培地中に補充した（１～２０）×１０８エキソソーム／ｍＬの存在下または非存在下、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）で４時間刺激した。培地を処置後に回収し、分泌されたサイトカインレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。さらに、細胞を溶解し、分泌されたタンパク質レベルを補足するために、サイトカインの転写レベルをｑＰＣＲにより測定した。採用された対照は、培地のみ（エキソソームなし）かまたはエキソソーム枯渇対照／培地のいずれかとした。
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を、完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）中で５０００細胞／ｃｍ２の密度で組織培養ディッシュに播種し、細胞を８０％コンフルエントまで増殖させた。無血清培地中で細胞を１６時間飢餓状態にし、培地中に補充した（１～２０）×１０８エキソソーム／ｍＬの存在下または非存在下、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）で４時間刺激した。培地を処置後に回収し、分泌されたサイトカインレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。さらに、細胞を溶解し、分泌されたタンパク質レベルを補足するために、サイトカインの転写レベルをｑＰＣＲにより測定した。採用された対照は、培地のみ（エキソソームなし）かまたはエキソソーム枯渇対照／培地のいずれかとした。
【0223】
６．３ 抗線維症アッセイ
ヒト角膜上皮細胞は、無血清培地中で５０００細胞／ｃｍ２の密度で組織培養処置された培養ディッシュに播種され、細胞を８０％コンフルエントまで増殖させた。培地に補充された（１～２０）×１０８エキソソーム／ｍＬの存在下または非存在下で、細胞をＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処置した。Ｉ型コラーゲン、アルファ－平滑筋アクチン、およびフィブロネクチンの発現を免疫蛍光法により特徴付けることにより、線維症の誘導の程度を評価した。採用された対照は、培地のみ（エキソソームなし）かまたはエキソソーム枯渇対照／培地のいずれかとした。
ヒト角膜上皮細胞は、無血清培地中で５０００細胞／ｃｍ２の密度で組織培養処置された培養ディッシュに播種され、細胞を８０％コンフルエントまで増殖させた。培地に補充された（１～２０）×１０８エキソソーム／ｍＬの存在下または非存在下で、細胞をＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処置した。Ｉ型コラーゲン、アルファ－平滑筋アクチン、およびフィブロネクチンの発現を免疫蛍光法により特徴付けることにより、線維症の誘導の程度を評価した。採用された対照は、培地のみ（エキソソームなし）かまたはエキソソーム枯渇対照／培地のいずれかとした。
【0224】
６．４ 再神経支配アッセイ
ＰＣ１２細胞を５０００細胞／ｃｍ２の播種密度でコラーゲン被覆したプレート上に播種し、培地を、細胞播種の２４時間後に、（１～２０）×１０８エキソソーム／ｍＬの処置で無血清培地に置き換えた。画像は、３～５日まで２４時間間隔で取得された。採用された対照は、培地のみ（エキソソームなし）かまたは陰性対照としてエキソソーム枯渇対照／培地のいずれかとし、一方、ＮＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を陽性対照とした。
ＰＣ１２細胞を５０００細胞／ｃｍ２の播種密度でコラーゲン被覆したプレート上に播種し、培地を、細胞播種の２４時間後に、（１～２０）×１０８エキソソーム／ｍＬの処置で無血清培地に置き換えた。画像は、３～５日まで２４時間間隔で取得された。採用された対照は、培地のみ（エキソソームなし）かまたは陰性対照としてエキソソーム枯渇対照／培地のいずれかとし、一方、ＮＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を陽性対照とした。
【0225】
６．５ 血管新生（抗／促進）アッセイ
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）または冠動脈内皮細胞（ＣＡＥＣ）をアッセイに使用した。ＨＵＶＥＣは、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で２４時間増殖された。アッセイの１日前に、ＨＵＶＥＣ細胞は、以下のように血清飢餓状態にした：細胞からの培地を吸引し、０．２％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭの血清を減少させた培地を添加し、細胞をさらに２４時間増殖させた。この工程後、３００μＬのマトリゲル（増殖因子の減少）を２４ウェルプレートに添加し、３７℃で３０分間凝固させた。無血清培地中のＨＵＶＥＣ（２×１０４／ウェル）をエキソソーム（１～２０）×１０８の存在下または非存在下でＶＥＧＦを補充した培地（濃縮）に２４時間懸濁した。細胞を製造業者の説明書に従ってＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色し、免疫蛍光染色を用いてチューブ形成を検出した。
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）または冠動脈内皮細胞（ＣＡＥＣ）をアッセイに使用した。ＨＵＶＥＣは、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で２４時間増殖された。アッセイの１日前に、ＨＵＶＥＣ細胞は、以下のように血清飢餓状態にした：細胞からの培地を吸引し、０．２％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭの血清を減少させた培地を添加し、細胞をさらに２４時間増殖させた。この工程後、３００μＬのマトリゲル（増殖因子の減少）を２４ウェルプレートに添加し、３７℃で３０分間凝固させた。無血清培地中のＨＵＶＥＣ（２×１０４／ウェル）をエキソソーム（１～２０）×１０８の存在下または非存在下でＶＥＧＦを補充した培地（濃縮）に２４時間懸濁した。細胞を製造業者の説明書に従ってＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色し、免疫蛍光染色を用いてチューブ形成を検出した。
【0226】
６．６．細胞形質転換アッセイ
３ｇ／ｌのＤ－グルコース、５％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ－１２中のマウス３Ｔ３細胞を細胞形質転換アッセイに使用した。３Ｔ３細胞（５０００細胞／ウェル）をＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）６ウェルプレートに播種し、標準条件下（３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度）で４２日間培養した。播種２４時間後に細胞を試料により処置し、培地を処置３日後に交換した。さらに、腫瘍プロモーターＴＰＡ（１２－Ｏ－テトラデカノイル－ホルボール－１３－アセテート、０．３μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ＃７９３４６）を８日目、１１日目、１５日目、１８日目に、２１日目まで添加した。４２日後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ／メタノール（５０：５０）で３分間固定し、１００％氷冷メタノールで１０分間洗浄し、最後にメタノールで２回洗浄した。
３ｇ／ｌのＤ－グルコース、５％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ－１２中のマウス３Ｔ３細胞を細胞形質転換アッセイに使用した。３Ｔ３細胞（５０００細胞／ウェル）をＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）６ウェルプレートに播種し、標準条件下（３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度）で４２日間培養した。播種２４時間後に細胞を試料により処置し、培地を処置３日後に交換した。さらに、腫瘍プロモーターＴＰＡ（１２－Ｏ－テトラデカノイル－ホルボール－１３－アセテート、０．３μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ＃７９３４６）を８日目、１１日目、１５日目、１８日目に、２１日目まで添加した。４２日後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ／メタノール（５０：５０）で３分間固定し、１００％氷冷メタノールで１０分間洗浄し、最後にメタノールで２回洗浄した。
【0227】
本開示の目的のために採用された対照：（ｉ）培地のみ（エキソソームなし）；（ｉｉ）陰性対照としてエキソソーム枯渇対照／培地；（ｉｉｉ）陽性対照としてＶＥＧＦを採用した。
【0228】
［実施例７］
前臨床試験におけるエキソソームの有効性の調査
実施例８に記載されるように、異なる変異体の機能的有効性に基づいて、最もスコアが高いエキソソーム変異体を選択し、抗炎症性疾患モデルについてのインビボ前臨床試験のために継続し、選択されたエキソソーム変異体の適用は、特定の組織、すなわち、無血管および血管組織の再生のために使用された。
前臨床試験におけるエキソソームの有効性の調査
実施例８に記載されるように、異なる変異体の機能的有効性に基づいて、最もスコアが高いエキソソーム変異体を選択し、抗炎症性疾患モデルについてのインビボ前臨床試験のために継続し、選択されたエキソソーム変異体の適用は、特定の組織、すなわち、無血管および血管組織の再生のために使用された。
【0229】
７．１ インビボ有効性研究
以下に記載されるように、複数のインビボ急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）モデルにおいて、前臨床的有効性試験を行った。ＭＳＣ由来のエキソソームをＣＯＶＩＤ－１９関連ＡＲＤＳの１つ以上のｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおいて使用した：
・ＬＰＳ誘導した肺傷害モデル、または
・ブレオマイシン誘導した肺線維症モデル
以下に記載されるように、複数のインビボ急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）モデルにおいて、前臨床的有効性試験を行った。ＭＳＣ由来のエキソソームをＣＯＶＩＤ－１９関連ＡＲＤＳの１つ以上のｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおいて使用した：
・ＬＰＳ誘導した肺傷害モデル、または
・ブレオマイシン誘導した肺線維症モデル
【0230】
７．２ 動物モデル
マウスモデル（８～１０週齢）をインビボ研究の目的のために使用した。使用したマウスの系統はＣ５７ＢＬ／６系統であった。
マウスモデル（８～１０週齢）をインビボ研究の目的のために使用した。使用したマウスの系統はＣ５７ＢＬ／６系統であった。
【0231】
７．３ 投与モード
エキソソームを静脈内モード（ｉ．ｖ）グループ：グループ１：生理食塩水対照；グループ２：ＵＣ－ＭＳＣ－Ｅｘｏ（ナイーブ／プライミングされた）を介して投与した。
エキソソームを静脈内モード（ｉ．ｖ）グループ：グループ１：生理食塩水対照；グループ２：ＵＣ－ＭＳＣ－Ｅｘｏ（ナイーブ／プライミングされた）を介して投与した。
【0232】
７．４ 投薬量の計算
エキソソームの用量は、治療的適用のためのＵＣ－ＭＳＣおよびエキソソームの使用に関する利用可能な臨床データおよび前臨床データの評価に基づいて決定された。
エキソソームの用量は、治療的適用のためのＵＣ－ＭＳＣおよびエキソソームの使用に関する利用可能な臨床データおよび前臨床データの評価に基づいて決定された。
【0233】
７．５ 前臨床研究投薬量（マウスモデル）
体重および表面積の違いに基づいて、ヒトと動物の用量等価式を計算した。
（ｉ）マウス用量（ｋｇ体重あたり）＝ヒトの用量（ｋｇ体重あたり）×１２．３
（ｉｉ）ヒト用量：エキソソームを８００～１，６００億個の用量で投与した（平均体重７０ｋｇに対して１３～２６億個／ｋｇ体重）。
体重および表面積の違いに基づいて、ヒトと動物の用量等価式を計算した。
（ｉ）マウス用量（ｋｇ体重あたり）＝ヒトの用量（ｋｇ体重あたり）×１２．３
（ｉｉ）ヒト用量：エキソソームを８００～１，６００億個の用量で投与した（平均体重７０ｋｇに対して１３～２６億個／ｋｇ体重）。
【0234】
エキソソームは１６０～３２０億個のエキソソーム／ｋｇ体重の高用量で投与された。
【0235】
７．６ ＬＰＳ用量（ＬＰＳ誘導した肺傷害モデル）
作業の本体が利用可能であることを考慮すると、本研究が亜致死および致死濃度の用量をカバーすることを保証するために、１０ｍｇと１００～１２５ｍｇとの間の用量が適切であると考えられた。１００ｍｇの用量は、ＬＰＳ投与後の４８～７２時間で死亡を誘導することが予想された。
作業の本体が利用可能であることを考慮すると、本研究が亜致死および致死濃度の用量をカバーすることを保証するために、１０ｍｇと１００～１２５ｍｇとの間の用量が適切であると考えられた。１００ｍｇの用量は、ＬＰＳ投与後の４８～７２時間で死亡を誘導することが予想された。
【0236】
７．７ ブレオマイシン用量（ブレオマイシン誘導した肺線維症モデル）
ブレオマイシン（５０μＬ、３Ｕ／ｋｇ（２ｍｇ／ｋｇ））の単回気管内投与を決定した。
ブレオマイシン（５０μＬ、３Ｕ／ｋｇ（２ｍｇ／ｋｇ））の単回気管内投与を決定した。
【0237】
７．８ インビボ読み出し：
端末読み出し：
・生存率
・組織学：ＨａｎｄＥ、マッソントリクロームまたはシリウスレッド
・総血球計数と差分血球計数の評価：自動分析装置
・線維化と炎症マーカーの特徴付け
・血清およびＢＡＬ試料における炎症性サイトカインプロファイリング
・炎症細胞型および亜集団分析
端末読み出し：
・生存率
・組織学：ＨａｎｄＥ、マッソントリクロームまたはシリウスレッド
・総血球計数と差分血球計数の評価：自動分析装置
・線維化と炎症マーカーの特徴付け
・血清およびＢＡＬ試料における炎症性サイトカインプロファイリング
・炎症細胞型および亜集団分析
【0238】
時間的読み出し：
・総血球計数および差分血球計数の評価：自動分析装置
・血清試料中の炎症性サイトカインプロファイリング。
・総血球計数および差分血球計数の評価：自動分析装置
・血清試料中の炎症性サイトカインプロファイリング。
【0239】
［実施例８］
無血管組織（角膜）再生のためのプライミングされたＢＭ－ＭＳＣ由来の治療的に濃縮されたエキソソームの生成
タンパク質発現およびより高い再生ポテンシャルｖ／ｓカーゴタンパク質、またはバイオマーカーとの相関に基づいて、最も高いスコアのエキソソームを無血管組織再生に使用した。本実施例は、無血管組織、すなわち、巨大分子（ＣＳＳＣ由来の馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ））を媒介した骨髄由来の間葉系幹細胞（ｈＢＭ－ＭＳＣ）のプライミングを用いた濃縮されたエキソソームによる角膜再生を示す。
無血管組織（角膜）再生のためのプライミングされたＢＭ－ＭＳＣ由来の治療的に濃縮されたエキソソームの生成
タンパク質発現およびより高い再生ポテンシャルｖ／ｓカーゴタンパク質、またはバイオマーカーとの相関に基づいて、最も高いスコアのエキソソームを無血管組織再生に使用した。本実施例は、無血管組織、すなわち、巨大分子（ＣＳＳＣ由来の馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ））を媒介した骨髄由来の間葉系幹細胞（ｈＢＭ－ＭＳＣ）のプライミングを用いた濃縮されたエキソソームによる角膜再生を示す。
【0240】
８．１ ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム
８．１．１ ＣＳＳＣ馴化培地によるｈＢＭ－ＭＳＣのプライミングの誘導
ｈＢＭ－ＭＳＣは、ＣＳＳＣ由来の馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ）の１０％および２０％を置換するとともに、ゼノフリー培地中で培養され、８０～９０％のコンフルエンスに達した。次に、その後、培地を２４～７２時間、ＥＶ回収にシフトし、プライミングした馴化培地を回収し（実施例１．１および１．２に記載される）、イオジキサノール密度勾配法（実施例４．４に記載される）によりエキソソーム単離を行い、濃縮されたエキソソームを得た。均一画分Ｆ９は、さらなる機能分析のために考慮された。セクレトーム分析は、ＥＬＩＳＡを用いて行われ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｓＦＬＴ１、ＩＬ－６、ＮＧＦのレベルを検出した。
８．１．１ ＣＳＳＣ馴化培地によるｈＢＭ－ＭＳＣのプライミングの誘導
ｈＢＭ－ＭＳＣは、ＣＳＳＣ由来の馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ）の１０％および２０％を置換するとともに、ゼノフリー培地中で培養され、８０～９０％のコンフルエンスに達した。次に、その後、培地を２４～７２時間、ＥＶ回収にシフトし、プライミングした馴化培地を回収し（実施例１．１および１．２に記載される）、イオジキサノール密度勾配法（実施例４．４に記載される）によりエキソソーム単離を行い、濃縮されたエキソソームを得た。均一画分Ｆ９は、さらなる機能分析のために考慮された。セクレトーム分析は、ＥＬＩＳＡを用いて行われ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｓＦＬＴ１、ＩＬ－６、ＮＧＦのレベルを検出した。
【0241】
図１Ａ～１Ｅは、ＣＳＳＣ由来の馴化培地でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来する濃縮されたエキソソームのセクレトームプロファイルを示す（実施例３．２を参照されたい）。図１Ａは、対照エキソソームと比較して、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームからの分泌された肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のレベルの増加を示す棒グラフを示す。同様に、図１Ｃ～１Ｅは、それぞれ、対照エキソソームと比較して、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームからの分泌されたｓＦＬＴ１、ＩＬ－６、および神経成長因子（ＮＧＦ）の増加したレベルを示す。図１Ｂは、対照エキソソームと比較して、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームからの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の有意に低いレベルを示す。これらの結果は、ｈＢＭ－ＭＳＣをＣＳＳＣ馴化培地でプライミングして、治療的に濃縮されたエキソソームを生成することができることを示す。
【0242】
８．１．２ 異なるＣＳＳＣ馴化培地でプライミングされたエキソソーム変異体の抗炎症活性の特徴付け
ＣＳＳＣ馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ）でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来する異なるエキソソーム変異体を、ＲＡＷ２６４．７細胞を用いてそれらの抗炎症活性を検出するために試験した。ＲＡＷ２６４．７細胞をリポ多糖（ＬＰＳ）結合タンパク質により処置して、エキソソームの存在下で炎症を誘導し、炎症におけるエキソソームの予防／予防効果をチェックした。図２Ａ～２Ｂおよび２Ｄ～２Ｅに示されるように、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム変異体は、ＬＰＳにより処置されたＲＡＷ２６４．７細胞において、重要な炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ）の炎症性サイトカインタンパク質発現を減少させた。さらに、全体的な炎症性サイトカイン遺伝子発現は、ＬＰＳで刺激したＲＡＷ２６４．７細胞においても減少し、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム変異体により処置した。図２Ａ～３Ｅは、ｈＢＭ－ＭＳＣに由来し、ＣＳＳＣ培地で馴化されたエキソソーム変異体が、炎症性サイトカイン発現および重要な炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ）の炎症性サイトカイン遺伝子発現を減少させることによる抗炎症活性を有することを示す。さらに、図３Ａ～３Ｅから、ＣＳＳＣ－ＣＭとＮｒｆ２活性化因子ＤＭＦの両方でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム（実施例３．６を参照されたい）は、ＬＰＳにより処置されたＲＡＷ２６４．７細胞において、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の発現レベルの増加、およびＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＬ－１βのレベルの減少を示すことが推測され得る。
ＣＳＳＣ馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ）でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来する異なるエキソソーム変異体を、ＲＡＷ２６４．７細胞を用いてそれらの抗炎症活性を検出するために試験した。ＲＡＷ２６４．７細胞をリポ多糖（ＬＰＳ）結合タンパク質により処置して、エキソソームの存在下で炎症を誘導し、炎症におけるエキソソームの予防／予防効果をチェックした。図２Ａ～２Ｂおよび２Ｄ～２Ｅに示されるように、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム変異体は、ＬＰＳにより処置されたＲＡＷ２６４．７細胞において、重要な炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ）の炎症性サイトカインタンパク質発現を減少させた。さらに、全体的な炎症性サイトカイン遺伝子発現は、ＬＰＳで刺激したＲＡＷ２６４．７細胞においても減少し、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム変異体により処置した。図２Ａ～３Ｅは、ｈＢＭ－ＭＳＣに由来し、ＣＳＳＣ培地で馴化されたエキソソーム変異体が、炎症性サイトカイン発現および重要な炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ）の炎症性サイトカイン遺伝子発現を減少させることによる抗炎症活性を有することを示す。さらに、図３Ａ～３Ｅから、ＣＳＳＣ－ＣＭとＮｒｆ２活性化因子ＤＭＦの両方でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム（実施例３．６を参照されたい）は、ＬＰＳにより処置されたＲＡＷ２６４．７細胞において、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の発現レベルの増加、およびＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＬ－１βのレベルの減少を示すことが推測され得る。
【0243】
８．１．３ ＣＳＳＣ馴化培地でプライミングされた異なるエキソソーム変異体の抗線維化性の特徴付け
ＣＳＳＣ馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ）でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来する異なるエキソソーム変異体（実施例３．２を参照されたい）を、プライミングされたエキソソームの抗線維化活性を検出するために試験した。エキソソーム変異体の抗線維化活性を試験するために、ヒト皮膚線維芽細胞をＴＧＦ－β（図４Ｂ）で２４時間処置するか、またはＴＧＦ－βと指示されたエキソソーム（図４Ｃ～４Ｆ）を用いて同時処置し、線維化を誘導した（実施例６．３に類似する）。α－ＳＭＡ発現を線維症マーカーとしてモニタリングし、エキソソーム変異体の有効性をチェックした。図４Ｄ～４Ｅを参照すると、２０％および１０％のＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、線維芽細胞におけるＴＧＦ－β誘導したα－ＳＭＡ発現を阻害することができることが観察され得る。ｈＢＭ－ＭＳＣに由来するナイーブエキソソームにより処置された細胞は、プライミングされたエキソソーム（図４Ｄ～４Ｅ）と比較して、α－ＳＭＡを少量発現した（図４Ｃ）。２０％および１０％のＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、対照およびナイーブエキソソーム処置と比較して、線維芽細胞における線維化を効率的に阻害することができた。
ＣＳＳＣ馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ）でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来する異なるエキソソーム変異体（実施例３．２を参照されたい）を、プライミングされたエキソソームの抗線維化活性を検出するために試験した。エキソソーム変異体の抗線維化活性を試験するために、ヒト皮膚線維芽細胞をＴＧＦ－β（図４Ｂ）で２４時間処置するか、またはＴＧＦ－βと指示されたエキソソーム（図４Ｃ～４Ｆ）を用いて同時処置し、線維化を誘導した（実施例６．３に類似する）。α－ＳＭＡ発現を線維症マーカーとしてモニタリングし、エキソソーム変異体の有効性をチェックした。図４Ｄ～４Ｅを参照すると、２０％および１０％のＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、線維芽細胞におけるＴＧＦ－β誘導したα－ＳＭＡ発現を阻害することができることが観察され得る。ｈＢＭ－ＭＳＣに由来するナイーブエキソソームにより処置された細胞は、プライミングされたエキソソーム（図４Ｄ～４Ｅ）と比較して、α－ＳＭＡを少量発現した（図４Ｃ）。２０％および１０％のＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、対照およびナイーブエキソソーム処置と比較して、線維芽細胞における線維化を効率的に阻害することができた。
【0244】
８．２ Ｎｒｆ２活性化因子（ＤＭＦまたは４－ＯＩ）でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム
８．２．１ ＮＲＦ２活性化因子（ＤＭＦまたは４－ＯＩ）が媒介するｈＢＭ－ＭＳＣ細胞のプライミングならびにセクレトームおよびエキソソームプロファイルの特徴付け
ｈＢＭ－ＭＳＣは、製造業者が推奨するゼノフリー培地で培養した。ｈＢＭ－ＭＳＣ細胞を（８０～９０）％のコンフルエンシーに達するように増殖させ、Ｎｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ－１００μＭ）で２４時間処置した後、ＥＶ回収培地中で細胞を２４～７２時間シフトさせ、維持した（実施例３．３を参照されたい）。７２時間後、馴化培地を回収し、イオジキサノール密度勾配プロトコール（実施例４．４に記載される）を用いてエキソソーム単離を行った。
８．２．１ ＮＲＦ２活性化因子（ＤＭＦまたは４－ＯＩ）が媒介するｈＢＭ－ＭＳＣ細胞のプライミングならびにセクレトームおよびエキソソームプロファイルの特徴付け
ｈＢＭ－ＭＳＣは、製造業者が推奨するゼノフリー培地で培養した。ｈＢＭ－ＭＳＣ細胞を（８０～９０）％のコンフルエンシーに達するように増殖させ、Ｎｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ－１００μＭ）で２４時間処置した後、ＥＶ回収培地中で細胞を２４～７２時間シフトさせ、維持した（実施例３．３を参照されたい）。７２時間後、馴化培地を回収し、イオジキサノール密度勾配プロトコール（実施例４．４に記載される）を用いてエキソソーム単離を行った。
【0245】
図５は、ナイーブなエキソソーム、種々のＮｒｆ２活性化因子（例えば、ＤＭＦまたは４－ＯＩ）でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム、およびクルクミンなどの他のプライミング剤でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームの収率を定量化する棒グラフを示す。図５から、ｈＢＭ－ＭＳｃＣに由来し、Ｎｒｆ２活性化因子ＤＭＦまたは４－ＯＩでプライミングされたエキソソームは、各々、未処置（ナイーブ）エキソソームおよび他のプライミング剤（例えば、クルクミンまたはクルクミンとＤＭＦの組み合わせ）でプライミングされたエキソソームと比較して、より高い収率のエキソソームを産生したことが観察され得る。あるいは、図５はまた、Ｎｒｆ２活性化因子が細胞のエキソソーム分泌において阻害効果を持たず、それらを良好なプライミング剤とすることを示唆する。
【0246】
８．２．２ プライミング剤を用いたプライミングされた細胞のセクレトームマーカープロファイリング
ｈＢＭ－ＭＳＣを種々のプライミング剤（小分子）でプライミングし、セクレトームを回収した（実施例３．２～３．６を参照されたい）。セクレトーム分析はＥＬＩＳＡを用いて行われ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＩＬ－６、ｓＦＬＴ１、ＳＤＦ１のレベルを検出した。図６Ａ～６Ｆは、クルクミン、４－ＯＩ、ＤＭＦ、またはクルクミン馴化培地とＤＭＦの組み合わせでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣからのＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＩＬ－６、ｓＦＬＴ１、およびＳＤＦ－１の分泌されたタンパク質レベルの定量化の棒グラフを示す。
ｈＢＭ－ＭＳＣを種々のプライミング剤（小分子）でプライミングし、セクレトームを回収した（実施例３．２～３．６を参照されたい）。セクレトーム分析はＥＬＩＳＡを用いて行われ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＩＬ－６、ｓＦＬＴ１、ＳＤＦ１のレベルを検出した。図６Ａ～６Ｆは、クルクミン、４－ＯＩ、ＤＭＦ、またはクルクミン馴化培地とＤＭＦの組み合わせでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣからのＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＩＬ－６、ｓＦＬＴ１、およびＳＤＦ－１の分泌されたタンパク質レベルの定量化の棒グラフを示す。
【0247】
Ｎｒｆ２活性化因子、４－ＯＩおよびＤＭＦは、各々、他のプライミングされた変異体および未処置対照と比較して、ＨＧＦ分泌の有意な増加を生じさせた（図６Ａ）。ＶＥＧＦ分泌レベルは、使用されたプライミング剤に関係なく変化しなかった（図６Ｃ）。ＤＭＦによるプライミングは、ｓＦＬＴ１（図６Ｄ）、ＮＧＦ（図６Ｅ）、およびＳＤＦ（図６Ｆ）の分泌の増加をもたらした。さらに、図６Ｂを参照すると、クルクミンおよびＮｒｆ２活性化因子（４－ＯＩおよびＤＭＦ）は、各々、ＩＬ－６の分泌を減弱させることが観察され得る。ＮＧＦ分泌レベルがＮｒｆ２活性化因子（４－ＯＩおよびＤＭＦ）の各々によって増強されたことに留意することが適切である（図６Ｅ）。また、図６Ａ～６Ｆから、クルクミン馴化培地＋ＤＭＦの組み合わせは、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＩＬ－６、ｓＦＬＴ１、ＳＤＦ１のレベルに顕著な影響を及ぼさないようであることが観察された。
【0248】
８．２．３．種々のプライミング剤でプライミングされた細胞に由来するエキソソームからのエキソソームカーゴのプロファイリング
図７Ａ～７Ｆを参照する。ｈＢＭ－ＭＳＣを指示されたプライミング剤でプライミングし、セクレトームを回収し、Ｐａｎｄｏｒｕｍの最適化イオジキサノール密度勾配法（実施例４．３を参照されたい）を用いてエキソソーム単離を行い、ＨＧＦ（図７Ａ）、ＶＥＧＦ（図７Ｂ）、ｓＦＬＴ１（図７Ｃ）、ＮＧＦ（図７Ｄ）、ＴＧＦ－β（図７Ｅ）、およびＳＤＦ１（図７Ｆ）のレベルをＥＬＩＳＡを用いて精製された画分９において検出した。図７Ｄに示されるように、ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、ナイーブエキソソーム、または４－ＯＩ、クルクミン（ＣＵＲ）もしくは合わせたクルクミンとＤＭＦ（ＣＵＲ／ＤＭＦ）などの他のプライミング剤でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームと比較して、有意に高いレベルのエキソソームＮＧＦを含有する。同様に、ＤＭＦによるｈＢＭ－ＭＳＣのプライミングは、ナイーブエキソソーム、クルクミンでプライミングされた、または４－ＯＩでプライミングされたエキソソームと比較して、エキソソームＴＧＦ－βの増加をもたらした。
図７Ａ～７Ｆを参照する。ｈＢＭ－ＭＳＣを指示されたプライミング剤でプライミングし、セクレトームを回収し、Ｐａｎｄｏｒｕｍの最適化イオジキサノール密度勾配法（実施例４．３を参照されたい）を用いてエキソソーム単離を行い、ＨＧＦ（図７Ａ）、ＶＥＧＦ（図７Ｂ）、ｓＦＬＴ１（図７Ｃ）、ＮＧＦ（図７Ｄ）、ＴＧＦ－β（図７Ｅ）、およびＳＤＦ１（図７Ｆ）のレベルをＥＬＩＳＡを用いて精製された画分９において検出した。図７Ｄに示されるように、ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、ナイーブエキソソーム、または４－ＯＩ、クルクミン（ＣＵＲ）もしくは合わせたクルクミンとＤＭＦ（ＣＵＲ／ＤＭＦ）などの他のプライミング剤でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームと比較して、有意に高いレベルのエキソソームＮＧＦを含有する。同様に、ＤＭＦによるｈＢＭ－ＭＳＣのプライミングは、ナイーブエキソソーム、クルクミンでプライミングされた、または４－ＯＩでプライミングされたエキソソームと比較して、エキソソームＴＧＦ－βの増加をもたらした。
【0249】
８．２．４．プライミングされたＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームの抗炎症活性
Ｎｒｆ２活性化因子ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム変異体（実施例６．２を参照されたい）は、ＲＡＷ２６４．７細胞を用いてそれらの抗炎症活性を検出するために試験された。ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳにより処置して、プライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームの存在下および非存在下で炎症を誘導し、主要な炎症性サイトカインをＥＬＩＳＡにより測定して、炎症におけるエキソソームの予防効果を決定した。図８Ａ～８Ｅに示されるように、ＤＭＦまたはクルクミンでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、タンパク質レベルでのＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ発現の減少を示した。さらに、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０は、ＤＭＦまたはクルクミンでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームにおいて有意に増加し、ＤＭＦおよびクルクミンでプライミングされたエキソソームが一般的な炎症性サイトカインを減少させるだけでなく、抗炎症作用も有することを示した。
Ｎｒｆ２活性化因子ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム変異体（実施例６．２を参照されたい）は、ＲＡＷ２６４．７細胞を用いてそれらの抗炎症活性を検出するために試験された。ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳにより処置して、プライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームの存在下および非存在下で炎症を誘導し、主要な炎症性サイトカインをＥＬＩＳＡにより測定して、炎症におけるエキソソームの予防効果を決定した。図８Ａ～８Ｅに示されるように、ＤＭＦまたはクルクミンでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、タンパク質レベルでのＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ発現の減少を示した。さらに、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０は、ＤＭＦまたはクルクミンでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームにおいて有意に増加し、ＤＭＦおよびクルクミンでプライミングされたエキソソームが一般的な炎症性サイトカインを減少させるだけでなく、抗炎症作用も有することを示した。
【0250】
８．３ ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム
８．３．１ ＣＳＳＣ馴化培地、Ｎｒｆ２活性化因子またはその両方でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームからのエキソソームカーゴのプロファイリング
ｈＢＭ－ＭＳＣは、製造業者が推奨するゼノフリー培地で培養された。ｈＢＭ－ＭＳＣは、細胞が８０～９０％のコンフルエンシーに達するまで、ＣＳＳＣ－ＣＭの存在下で、２０％の総培地容量の濃度で増殖された。次に、培地を交換して、ｈＢＭ－ＭＳＣをＮｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ－１００μＭ）で２４時間処置した後、ＥＶ回収培地中の細胞をシフトさせ、ＥＶ回収培地中で７２時間維持した。７２時間後、馴化培地を回収し、イオジキサノール密度勾配プロトコール（実施例４．４に記載される）を用いてエキソソーム単離（精製）を行った。ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｓＦＬＴ１およびＮＧＦのレベルは、ＥＬＩＳＡを用いて、異なるコンビナトリアルプライミングされたエキソソーム変異体において検出された（図９Ａ～９Ｄ）。単一にプライミングされた（Ｎｒｆ２活性化因子またはＣＳＳＣ馴化培地）エキソソームは、エキソソームＨＧＦ、ｓＦＬＴ１およびＮＧＦの増加を示したが、コンビナトリアルプライミングされた（ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦ）エキソソームは、エキソソームＨＧＦ、ｓＦＬＴ１およびＮＧＦの最高レベルを示した。
８．３．１ ＣＳＳＣ馴化培地、Ｎｒｆ２活性化因子またはその両方でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームからのエキソソームカーゴのプロファイリング
ｈＢＭ－ＭＳＣは、製造業者が推奨するゼノフリー培地で培養された。ｈＢＭ－ＭＳＣは、細胞が８０～９０％のコンフルエンシーに達するまで、ＣＳＳＣ－ＣＭの存在下で、２０％の総培地容量の濃度で増殖された。次に、培地を交換して、ｈＢＭ－ＭＳＣをＮｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ－１００μＭ）で２４時間処置した後、ＥＶ回収培地中の細胞をシフトさせ、ＥＶ回収培地中で７２時間維持した。７２時間後、馴化培地を回収し、イオジキサノール密度勾配プロトコール（実施例４．４に記載される）を用いてエキソソーム単離（精製）を行った。ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｓＦＬＴ１およびＮＧＦのレベルは、ＥＬＩＳＡを用いて、異なるコンビナトリアルプライミングされたエキソソーム変異体において検出された（図９Ａ～９Ｄ）。単一にプライミングされた（Ｎｒｆ２活性化因子またはＣＳＳＣ馴化培地）エキソソームは、エキソソームＨＧＦ、ｓＦＬＴ１およびＮＧＦの増加を示したが、コンビナトリアルプライミングされた（ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦ）エキソソームは、エキソソームＨＧＦ、ｓＦＬＴ１およびＮＧＦの最高レベルを示した。
【0251】
ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたエキソソームとＤＭＦでプライミングされたエキソソームの両方は、エキソソームＨＧＦの増加を示した。ＤＭＦでプライミングされたエキソソームにおけるエキソソームＨＧＦの発現レベルは、ナイーブエキソソームの約１．２倍（１．２×）であり、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたエキソソームにおけるエキソソームＨＧＦの発現レベルは、ナイーブエキソソームの約２倍（２×）であった。そうは言っても、コンビナトリアルプライミングされた（ＣＳＳＣ－ＣＭ＋ＤＭＦ）は、エキソソームＨＧＦにおいて最も高い増加を示し、ナイーブエキソソームと比較してエキソソームＨＧＦの発現レベルは２倍（２×）超または約３倍（３×）であり、ＤＭＦのみのプライミングと比較してエキソソームＨＧＦの発現レベルは約２倍であった（図９Ａ）。さらに、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたエキソソームおよび組み合わせてプライミングされた（ＣＳＳＣ－ＣＭ＋ＤＭＦ）エキソソームは、ナイーブエキソソームまたはＤＭＦでプライミングされたエキソソームと比較して、エキソソームＶＥＧＦ発現がいずれも実質的に減少し、ＶＥＧＦ発現の４分の１（１／４または２５％）未満であった（図９Ｂ）。
【0252】
単一にプライミングされた（ＣＳＳＣ－ＣＭまたはＤＭＦ）エキソソームは、エキソソームｓＦＬＴ１およびＮＧＦの増加を示した（図９Ｃ～９Ｄ）。ＤＭＦでプライミングされたエキソソームにおけるエキソソームＮＧＦの発現レベルは、ナイーブエキソソームの２倍（２×）超または約３倍（３×）であり、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたエキソソームにおけるエキソソームＮＧＦの発現レベルはナイーブエキソソームの約２倍（２×）であった。しかしながら、コンビナトリアルプライミング（ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦ）されたエキソソームは、最も高いエキソソームｓＦＬＴ１およびＮＧＦを有し、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦによるコンビナトリアルプライミングが、エキソソームまたはナイーブエキソソームの単一プライミングと比較して、より望ましいエキソソームカーゴをもたらす可能性があることを示した。コンビナトリアルプライミング（ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦ）されたエキソソームのエキソソームｓＦＬＴ発現レベルは、ナイーブエキソソームの２倍超であり、ＤＭＦでプライミングされたエキソソームの約２倍であった。コンビナトリアルプライミング（ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦ）されたエキソソームのエキソソームＮＧＦ発現レベルは、ナイーブエキソソームの３倍（３×）超であり、ＤＭＦでプライミングされたエキソソームの約１．５倍（１．５×）であった。
【0253】
８．３．２ ＣＳＳＣ馴化培地およびＮＲＦ２活性化因子（ＤＭＦ）でプライミングされた異なるエキソソーム変異体の抗炎症活性の特徴付け
ＣＳＳＣ馴化培地、Ｎｒｆ２活性化因子ＤＭＦ、またはそれらの組み合わせのいずれかでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、ＬＰＳにより処置されたＲＡＷ２６４．７細胞を用いて試験され、プライミングされたエキソソームの抗炎症活性を検出した。炎症性および抗炎症性サイトカインをＥＬＩＳＡにより測定した。図１０Ａ～１０Ｅに示されるように、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ）で組み合わせてプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、タンパク質レベルでのＩＬ－６（図１０Ａ）、ＩＬ－１β（図１０Ｂ）、ＴＮＦ－α（図１０Ｃ）、およびＩＦＮ－γ（図１０Ｅ）発現を減少させることによって炎症を減少させることができた。さらに、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の発現は、単一にプライミングされたエキソソーム（ＣＳＳＣ－ＣＭまたはＤＭＦ）の処置により増加した。さらに、ＩＬ－１０発現の最大の増加は、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦによるｈＢＭ－ＭＳＣのコンビナトリアルプライミングに由来するエキソソームで達成された。
ＣＳＳＣ馴化培地、Ｎｒｆ２活性化因子ＤＭＦ、またはそれらの組み合わせのいずれかでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、ＬＰＳにより処置されたＲＡＷ２６４．７細胞を用いて試験され、プライミングされたエキソソームの抗炎症活性を検出した。炎症性および抗炎症性サイトカインをＥＬＩＳＡにより測定した。図１０Ａ～１０Ｅに示されるように、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ）で組み合わせてプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、タンパク質レベルでのＩＬ－６（図１０Ａ）、ＩＬ－１β（図１０Ｂ）、ＴＮＦ－α（図１０Ｃ）、およびＩＦＮ－γ（図１０Ｅ）発現を減少させることによって炎症を減少させることができた。さらに、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の発現は、単一にプライミングされたエキソソーム（ＣＳＳＣ－ＣＭまたはＤＭＦ）の処置により増加した。さらに、ＩＬ－１０発現の最大の増加は、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦによるｈＢＭ－ＭＳＣのコンビナトリアルプライミングに由来するエキソソームで達成された。
【0254】
これらのデータは、ＣＳＳＣ－ＣＭとＤＭＦの両方でプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームが、抗炎症性サイトカインの発現を増加させながら炎症性サイトカインの発現を効果的に減少させたことを示す。
【0255】
８．３．３ ＣＳＳＣ馴化培地＋ＮＲＦ２活性化因子（ＤＭＦ）で組み合わせてプライミングされた細胞に由来するエキソソームの抗線維化活性の特徴付け
ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、それらの抗線維化活性を検出するために試験された。ヒト皮膚線維芽細胞をＴＧＦ－βにより処置して線維症を誘導させた（実施例６．３を参照されたい）。線維芽細胞をプライミングされたエキソソームにより処置して、エキソソームの抗線維化活性を試験した。線維症マーカーであるα－ＳＭＡ発現を免疫蛍光法を用いてモニタリングし、処置後のエキソソームの抗線維化活性の有効性をチェックした。図１１Ａ～１１Ｆに示される代表的な免疫蛍光画像は、単一にプライミングされたエキソソーム（ＣＳＳＣ－ＣＭまたはＤＭＦ）でさえも線維症を減少させたことを示す（図１１Ｄおよび１１Ｅ）。しかしながら、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦの組み合わせでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、線維症の最大の減少を示した（図１１Ｆ）。
ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、それらの抗線維化活性を検出するために試験された。ヒト皮膚線維芽細胞をＴＧＦ－βにより処置して線維症を誘導させた（実施例６．３を参照されたい）。線維芽細胞をプライミングされたエキソソームにより処置して、エキソソームの抗線維化活性を試験した。線維症マーカーであるα－ＳＭＡ発現を免疫蛍光法を用いてモニタリングし、処置後のエキソソームの抗線維化活性の有効性をチェックした。図１１Ａ～１１Ｆに示される代表的な免疫蛍光画像は、単一にプライミングされたエキソソーム（ＣＳＳＣ－ＣＭまたはＤＭＦ）でさえも線維症を減少させたことを示す（図１１Ｄおよび１１Ｅ）。しかしながら、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦの組み合わせでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、線維症の最大の減少を示した（図１１Ｆ）。
【0256】
８．３．４ ＣＳＳＣ馴化培地、Ｎｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ）、またはそれらの組み合わせでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームの創傷治癒活性の特徴付け
図１２を参照する。ＣＳＳＣ－ＣＭ、Ｎｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ）またはそれらの組み合わせでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、２Ｄスクラッチアッセイ（実施例６．２を参照されたい）においてそれらの効果を検出するために試験された。不死化されたヒト角膜上皮細胞（ｈＴＣＥＰｉ）を緑色蛍光色素（ＣＭＦＤＡ）で標識し、ｈＴＣＥＰｉ細胞を介してスクラッチを生成した。ｈＴＣＥＰｉ細胞は、ナイーブエキソソーム（ナイーブＢＭ－ＭＳＣ）、単一にプライミングされたエキソソーム（ＣＳＳＣ－ＣＭもしくはＤＭＦ）またはそれらの組み合わせにより処置され、創傷閉鎖は、蛍光顕微鏡を用いて、以下の時点０、２４時間、４８時間、および７２時間で観察された。単一にプライミングされたエキソソーム処置およびその組み合わせは、７２時間までに創傷閉鎖をもたらし、プライミングされたエキソソーム処置が有意な方向性細胞遊走をもたらしたことを示している。同様に、図１３に示されるように、エキソソーム処置後の角膜細胞遊走および増殖の定量アッセイを行った。ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームにより処置された角膜細胞は、ほぼすべての時点で最も高い細胞増殖を示したが、一方、ＤＭＦでプライミングされたエキソソームにより処置された角膜細胞は、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたエキソソームまたはナイーブエキソソームのみにより処置された角膜細胞と比較して、後の時点で細胞増殖が増加した。
図１２を参照する。ＣＳＳＣ－ＣＭ、Ｎｒｆ２活性化因子（ＤＭＦ）またはそれらの組み合わせでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、２Ｄスクラッチアッセイ（実施例６．２を参照されたい）においてそれらの効果を検出するために試験された。不死化されたヒト角膜上皮細胞（ｈＴＣＥＰｉ）を緑色蛍光色素（ＣＭＦＤＡ）で標識し、ｈＴＣＥＰｉ細胞を介してスクラッチを生成した。ｈＴＣＥＰｉ細胞は、ナイーブエキソソーム（ナイーブＢＭ－ＭＳＣ）、単一にプライミングされたエキソソーム（ＣＳＳＣ－ＣＭもしくはＤＭＦ）またはそれらの組み合わせにより処置され、創傷閉鎖は、蛍光顕微鏡を用いて、以下の時点０、２４時間、４８時間、および７２時間で観察された。単一にプライミングされたエキソソーム処置およびその組み合わせは、７２時間までに創傷閉鎖をもたらし、プライミングされたエキソソーム処置が有意な方向性細胞遊走をもたらしたことを示している。同様に、図１３に示されるように、エキソソーム処置後の角膜細胞遊走および増殖の定量アッセイを行った。ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームにより処置された角膜細胞は、ほぼすべての時点で最も高い細胞増殖を示したが、一方、ＤＭＦでプライミングされたエキソソームにより処置された角膜細胞は、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたエキソソームまたはナイーブエキソソームのみにより処置された角膜細胞と比較して、後の時点で細胞増殖が増加した。
【0257】
８．３．５ ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームのウサギ角膜における創傷治癒活性の特徴付け
図１４は、手術後１日目、７日目、および１４日目の後に開いた上皮創傷を有するウサギ角膜の代表的な顕微鏡画像を示す。３Ｄモデルにおいて創傷治癒を効果的に誘導するｈＢＭ－ＭＳＣに由来するプライミングされたエキソソームの能力を試験するために、傷害されたウサギ角膜を、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームと組み合わせた液体角膜生体ポリマー、液体角膜生体ポリマー単独、または未処置対照により処置した。術後７日目に、液体角膜生体ポリマーとＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームとの組み合わせは、液体角膜生体ポリマー単独または未処置対照と比較して有意な創傷治癒を示した。１４日目に、液体角膜生体ポリマーとＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームとの組み合わせは、ウサギ角膜の完全であり、安定した上皮化を示した。液体角膜生体ポリマー単独による処置は、１４日目にいくつかの破壊パッチを伴うほぼ完全な上皮化を示したが、一方、未処置対照は上皮化の欠陥を示した。図１２、１３、および１４をまとめると、ＣＳＳＣ－ＣＭとＤＭＦの両方を組み合わせてプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、２Ｄスクラッチアッセイならびに角膜細胞遊走および増殖分析に基づいて優れた創傷治癒活性を示し、インビボでウサギ角膜において堅固な創傷治癒を示した。
図１４は、手術後１日目、７日目、および１４日目の後に開いた上皮創傷を有するウサギ角膜の代表的な顕微鏡画像を示す。３Ｄモデルにおいて創傷治癒を効果的に誘導するｈＢＭ－ＭＳＣに由来するプライミングされたエキソソームの能力を試験するために、傷害されたウサギ角膜を、ＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームと組み合わせた液体角膜生体ポリマー、液体角膜生体ポリマー単独、または未処置対照により処置した。術後７日目に、液体角膜生体ポリマーとＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームとの組み合わせは、液体角膜生体ポリマー単独または未処置対照と比較して有意な創傷治癒を示した。１４日目に、液体角膜生体ポリマーとＣＳＳＣ－ＣＭおよびＮｒｆ２活性化因子ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームとの組み合わせは、ウサギ角膜の完全であり、安定した上皮化を示した。液体角膜生体ポリマー単独による処置は、１４日目にいくつかの破壊パッチを伴うほぼ完全な上皮化を示したが、一方、未処置対照は上皮化の欠陥を示した。図１２、１３、および１４をまとめると、ＣＳＳＣ－ＣＭとＤＭＦの両方を組み合わせてプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームは、２Ｄスクラッチアッセイならびに角膜細胞遊走および増殖分析に基づいて優れた創傷治癒活性を示し、インビボでウサギ角膜において堅固な創傷治癒を示した。
【0258】
［実施例９］
血管多組織再生（肝臓、肺）のためのプライミングされたＵＣ－ＭＳＣ／ＷＪ－ＭＳＣ由来の治療的に濃縮されたエキソソームの生成
本実施例は、臍帯血由来の間葉系幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）／ホウォートンゼリー由来のＭＳＣ（ＷＪ－ＭＳＣ）のインビトロ培養を示す。ＵＣ－ＭＳＣおよびＷＪ－ＭＳＣを培養するためのプロトコールは、実施例１．５に記載されている。さらに、幹細胞の固有の亜集団（ＵＣ－ＭＳＣおよびＷＪ－ＭＳＣ）は、実施例１．４に記載される方法に基づいて選択された。次に、幹細胞の拡大された集団を得て、異なるプライミング剤：（ａ）ＤＭＦまたは４－ＯＩ、またはＣＤＤＯ－ＩｍなどのＮｒｆ２活性化因子；および（ｂ）ＳＲＴ１活性化因子：ＳＲＴ－２１０４、またはレスベラトールを単独でまたはそれらの組み合わせでプライミングした。幹細胞のプライミングは、低酸素状態の非存在下または存在下で可能である。本明細書にで言及されるプライミング剤で幹細胞をプライミングすることにより、増強された再生性、幹性および抗炎症性を有するプライミングされた幹細胞およびプライミングされた馴化培地を提供または得ることができる。Ｎｒｆ２活性化因子またはＳＩＲＴ１活性化因子などの単一のプライミング剤、またはＮｒｆ２活性化因子＋ＳＩＲＴ１活性化因子などのプライミング剤の組み合わせでプライミングされたＭＳＣは、特異的な／濃縮されたカーゴ装填因子を有する異なるエキソソーム変異体産生の供給源として使用された。次に、エキソソーム変異体は、それらの機能的有効性について物理的および分子レベルの両方で特徴付けられた。特徴付けられたエキソソーム変異体は、肺機能不全、急性呼吸窮迫、炎症関連障害、例えば、限定されないが、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルスクラスの感染症、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、インフルエンザ、結核、全身性狼瘡、変形性関節症、ＮＡＳＨ、肝線維症、ムーレン潰瘍、神経栄養性潰瘍、心筋梗塞などの異なる炎症性および線維症関連疾患に対するそれらの機能に基づいて分類された。
血管多組織再生（肝臓、肺）のためのプライミングされたＵＣ－ＭＳＣ／ＷＪ－ＭＳＣ由来の治療的に濃縮されたエキソソームの生成
本実施例は、臍帯血由来の間葉系幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）／ホウォートンゼリー由来のＭＳＣ（ＷＪ－ＭＳＣ）のインビトロ培養を示す。ＵＣ－ＭＳＣおよびＷＪ－ＭＳＣを培養するためのプロトコールは、実施例１．５に記載されている。さらに、幹細胞の固有の亜集団（ＵＣ－ＭＳＣおよびＷＪ－ＭＳＣ）は、実施例１．４に記載される方法に基づいて選択された。次に、幹細胞の拡大された集団を得て、異なるプライミング剤：（ａ）ＤＭＦまたは４－ＯＩ、またはＣＤＤＯ－ＩｍなどのＮｒｆ２活性化因子；および（ｂ）ＳＲＴ１活性化因子：ＳＲＴ－２１０４、またはレスベラトールを単独でまたはそれらの組み合わせでプライミングした。幹細胞のプライミングは、低酸素状態の非存在下または存在下で可能である。本明細書にで言及されるプライミング剤で幹細胞をプライミングすることにより、増強された再生性、幹性および抗炎症性を有するプライミングされた幹細胞およびプライミングされた馴化培地を提供または得ることができる。Ｎｒｆ２活性化因子またはＳＩＲＴ１活性化因子などの単一のプライミング剤、またはＮｒｆ２活性化因子＋ＳＩＲＴ１活性化因子などのプライミング剤の組み合わせでプライミングされたＭＳＣは、特異的な／濃縮されたカーゴ装填因子を有する異なるエキソソーム変異体産生の供給源として使用された。次に、エキソソーム変異体は、それらの機能的有効性について物理的および分子レベルの両方で特徴付けられた。特徴付けられたエキソソーム変異体は、肺機能不全、急性呼吸窮迫、炎症関連障害、例えば、限定されないが、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルスクラスの感染症、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、インフルエンザ、結核、全身性狼瘡、変形性関節症、ＮＡＳＨ、肝線維症、ムーレン潰瘍、神経栄養性潰瘍、心筋梗塞などの異なる炎症性および線維症関連疾患に対するそれらの機能に基づいて分類された。
【0259】
全体として、本開示は、プライミングされた幹細胞、およびプライミングされた馴化培地を提供または得る方法を提供する。本方法は、ＵＣ－ＭＳＣなどの間葉系幹細胞の集団、およびマーカーのシグネチャーセットを発現するＷＪ－ＭＳＣを単離する工程を伴う。次に、ＭＳＣの選択された集団を、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を用いて修飾し、ｈＴＥＲＴは、細胞のスケーラブルであり、均一な集団を促進するのに役立つＭＳＣの倍化ポテンシャルを拡大する。幹細胞は、さらに、３Ｄ培養システム（マイクロキャリアベースのシステム、またはスフェロイドベースのシステム、または中空糸バイオリアクター）中で培養され、幹細胞の拡大された集団を得る。幹細胞の拡大された集団は、さらに、異なるプライミング剤（小分子および巨大分子）でプライミングされる。プライミング剤（小分子およ巨大分子）の存在は、開示された濃度範囲とともに、細胞上のプライミング剤の処置期間は、プライミングされた幹細胞およびプライミングされた馴化培地を提供または得るために重要であり得る。単独またはそれらの組み合わせで使用される異なるプライミング剤を用いたナイーブ幹細胞のプライミングは、細胞の再生性、幹性および抗炎症性を増強するのに役立つ。プライミングされた幹細胞は、抗炎症因子、抗線維化因子、血管新生促進因子により濃縮される異なるエキソソーム変異体の供給源としてさらに使用される。次に、濃縮された治療グレードのエキソソームを、血管組織再生（肺または肝臓）、または無血管組織再生（角膜）のためにさらに適用する。本開示の開示された方法、高収率の濃縮されたプライミングされた幹細胞、またはプライミングされたエキソソームにより、限定されないが、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、肺炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルスクラスの感染症、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、インフルエンザ、結核、全身性狼瘡、心筋梗塞、変形性関節症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＳＨ）、肝線維症、ムーレン潰瘍、神経栄養性潰瘍、角膜の角膜炎（ＣＫ）、ドライアイ疾患潰瘍、ヘルペス性単純角膜炎、ＬＡＳＩＫ後拡張症、術後角膜融解、角膜プロテーゼ後融解、角膜穿孔、神経栄養性角膜炎（ＮＫ）、円錐角膜シェーグレン症候群、粘膜類天疱瘡、スティーブンス・ジョンソン症候群、化学熱傷、および熱傷を含む疾患を被る大多数の患者が処置され得る。
【0260】
［実施例１０］
プライミングされたエキソソームによる非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）誘導性肝スフェロイドの処置
本実施例は、標準条件下で増殖させたナイーブｈＢＭ－ＭＳＣ（ナイーブエキソソーム）由来のエキソソーム、またはＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム（プライミングされたエキソソーム）を用いた、ヒト肝スフェロイドにおける誘導性非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）表現型のインビトロ処置を示す。ｈＢＭ－ＭＳＣの培養およびプライミング、ならびにプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣからのエキソソームの獲得のためのプロトコールは、実施例３および４、ならびに実施例８に記載される。特に、本実施例におけるＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの処置に使用されるＤＭＦでプライミングされたＭＳＣ由来エキソソームを産生させるためのプロトコールは、実施例８の８．２．１節に記載される。
プライミングされたエキソソームによる非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）誘導性肝スフェロイドの処置
本実施例は、標準条件下で増殖させたナイーブｈＢＭ－ＭＳＣ（ナイーブエキソソーム）由来のエキソソーム、またはＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソーム（プライミングされたエキソソーム）を用いた、ヒト肝スフェロイドにおける誘導性非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）表現型のインビトロ処置を示す。ｈＢＭ－ＭＳＣの培養およびプライミング、ならびにプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣからのエキソソームの獲得のためのプロトコールは、実施例３および４、ならびに実施例８に記載される。特に、本実施例におけるＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの処置に使用されるＤＭＦでプライミングされたＭＳＣ由来エキソソームを産生させるためのプロトコールは、実施例８の８．２．１節に記載される。
【0261】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、対象のアルコール消費とは無関係に、対象の肝臓に脂肪が蓄積する状態である。この疾患はいくつかの段階に分けられる。肝臓の脂肪が過剰になっても炎症または線維化が起こらない場合は、脂肪肝または非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と呼ばれ得る。いったん疾患がさらに進行し、肝組織が炎症および線維化を発症すると、この疾患は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれる。
【0262】
本研究では、ヒト肝スフェロイドを生成し、ヒト肝スフェロイドにＮＡＳＨ表現型を誘導するためのプロトコールは、以下の通りであった：初代肝細胞とヒトドナー由来の肝星細胞の混合物を７０：３０の比率（７０肝細胞対３０肝星細胞）で共培養した。細胞混合物を超低付着プレート上に播種し、培養して生存可能な肝スフェロイドを形成した。いったん生存可能な肝スフェロイドが得られると、脂肪症を誘導するために遊離脂肪酸、続く線維症を誘導するためにＴＧＦ－βの連続的処置を通して、ＮＡＳＨ表現型が肝スフェロイドにおいて誘導され、そのため、肝スフェロイドが脂肪線維症肝の態様を示した。ＮＡＳＨ誘導プロトコールは、播種後７日目に、スフェロイドをオレイン酸とパルミチン酸からなる６００μＭ遊離脂肪酸（ＦＦＡ）混合物で重量比２：１で６日間処置し、培地交換を隔日に行った。ＦＦＡ処置の６日後（播種後の１３日目）、ＦＦＡ含有培地に２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１を添加し、さらに２日間、ＦＦＡおよびＴＧＦβ１処置を組み合わせた。播種１５日後（ＦＦＡ処置の８日後、および組み合わせたＦＦＡとＴＧＦβ１の処置の２日後）、培地をＴＧＦβ１単独処置に変更し、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１を含み、ＦＦＡ混合は含まない。２日後、播種後１７日目に、スフェロイドをＮＡＳＨ誘導性（すなわち、脂肪線維症の態様を示す）と指定し、ＦＦＡまたはＴＧＦβ１を用いない治療的処置（例えば、ナイーブまたはプライミングされたエキソソーム、ＨＧＦ、または媒体対照を用いる）に供した。２日後、播種後１９日目に、スフェロイドおよび馴化培地を採取し、特徴付けした。上記のＮＡＳＨ誘導性プロトコールは、以下：
０日目：初代肝細胞の播種
７日目：６００μＭのＦＦＡ混合物（オレイン酸とパルミチン酸の２：１混合物）による処置
１３日目：組み合わせたＦＦＡとＴＧＦβ１処置にＴＧＦβ１を追加
１５日目：ＴＧＦβ１のみの処置
１７日目：治療的処置（ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソーム、ＨＧＦ、または媒体対照）
１９日目：分析のために採取
に要約され得る。
０日目：初代肝細胞の播種
７日目：６００μＭのＦＦＡ混合物（オレイン酸とパルミチン酸の２：１混合物）による処置
１３日目：組み合わせたＦＦＡとＴＧＦβ１処置にＴＧＦβ１を追加
１５日目：ＴＧＦβ１のみの処置
１７日目：治療的処置（ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソーム、ＨＧＦ、または媒体対照）
１９日目：分析のために採取
に要約され得る。
【0263】
遊離脂肪酸混合物、続くＴＧＦ－βによる連続処置を伴うＮＡＳＨ誘導後、肝スフェロイドは、スフェロイドサイズの減少、コラーゲン沈着の増加、およびアルブミン分泌の低下を含むＮＡＳＨ様表現型を示した。次に、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドをナイーブまたはプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣからのエキソソームの投与に供し、本明細書において以下に説明するさらなるアッセイに使用した。
【0264】
図１５Ａは、４つの条件下：（１）健常（ＮＡＳＨ誘導なし）；（２）、ＮＡＳＨ誘導化（罹病／反転対照」）；（３）ＮＡＳＨ誘導化、続くナイーブエキソソームによる処置（「ナイーブ－Ｅｘｏ」）；および（４）ＮＡＳＨ誘導化、続くプライミングされたエキソソームによる処置（「プライミングされたＥｘｏ」）で肝スフェロイド中のＣＹＰ３Ａ４およびＤＡＰＩについて染色した代表的な免疫蛍光画像を示す。ＤＡＰＩは核マーカーであり、ＣＹＰ３Ａ４は健常な肝組織を示すために使用されるマーカーであり、そのため、ＣＹＰ３Ａ４染色の減少は肝組織の健常の低下を示し、ＣＹＰ３Ａ４染色の増加は肝組織の健常の改善を示す。実施例６．３に記載したのと同じように、肝スフェロイドを画像化した。
【0265】
ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドは、ＮＡＳＨ誘導に供されなかった健常肝スフェロイドと比較してＣＹＰ３Ａ４染色の減少を示し、ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣからのプライミングされたエキソソーム（「プライミング－Ｅｘｏ」）で処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの処置は、ＣＹＰ３Ａ４染色の部分的回復を示し、エキソソーム処置がＮＡＳＨ誘導性スフェロイドの健常を少なくとも部分的に回復するのに有効であることを示すことが見出された。対照的に、ナイーブエキソソーム（「ナイーブｅｘｏ」）による処置は、ナイーブなエキソソーム処置と比較して、回復したＣＹｐ３Ａ４染色を示さなかった。
【0266】
分泌されたアルブミンレベルは肝臓の健常を示すもう別のマーカーである。図１５Ｂは、異なる条件下：（１）Ｄ１９での健常（ＮＡＳＨ誘導なし）；（２）Ｄ１９でＮＡＳＨ誘導化（「罹病／逆対照」）；（３）Ｄ１７－Ｄ１９でＮＡＳＨ誘導化、続く４０ｎｇ／ｍｌの肝成長ホルモンによる処置（「ＨＧＦ」）；（４）Ｄ１７－Ｄ１９でＮＡＳＨ誘導化、続くナイーブエキソソームによる処置（「ナイーブ－Ｅｘｏ」）；および（４）Ｄ１７－Ｄ１９でＮＡＳＨ誘導化、続くＤＭＦでプライミングされたエキソソームによる処置（「プライミングされたＥｘｏ」）で肝スフェロイドによる培地に分泌されたアルブミンレベルを示す棒グラフを示す。培地中に分泌されたアルブミンをＥＬＩＳＡ測定に基づいて定量化した。処置後２４時間、４８時間、および７２時間（または健常およびＮＡＳＨ誘導化条件で同等の時間枠）に、それぞれの培地試料から測定を行った。ＤＭＦでプライミングされたエキソソームにより処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドは、上方制御されたアルブミン分泌を示し、スフェロイド健常の改善を示したことが見出された。対照的に、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドをＨＧＦまたはナイーブエキソソームにより処置しても、スフェロイドによるアルブミン分泌は増加しなかった。
【0267】
コラーゲンは、肝スフェロイドを含む肝組織における線維症のマーカーとして役立ち得る。図１５Ｃは、以下の３つの条件下：（１）Ｄ１７－Ｄ１９でＮＡＳＨ誘導化および媒体対照による処置（「媒体対照」）；（２）Ｄ１７－Ｄ１９でＮＡＳＨ誘導化、続くナイーブエキソソームによる処置；および（３）Ｄ１７－Ｄ１９でＮＡＳＨ誘導化、続くＤＭＦでプライミングされたエキソソームによる処置（「プライミングされたＥｘｏ」）で、肝スフェロイド中のコラーゲン１について染色した代表的な免疫蛍光画像を示す。実施例６．３に記載したのと同じように、肝スフェロイドを画像化した。ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドをプライミングされたエキソソームにより処置すると、媒体対照またはナイーブエキソソームによる処置と比較して、細胞表面コラーゲンタンパク質発現が減少した。
【0268】
図１５Ｄは、以下の条件下での肝スフェロイドにおけるコラーゲン沈着の被覆率の定量化の棒グラフを示す。
【0269】
健常なＤ１９は、反転群、媒体処置（罹病－Ｄ１９）の健常対照として機能し、一方、右側の健常対照はＤ１７疾患誘導群に対応し、ＦＦＡおよびＦＦＡ＋ＴＧＦｂ１処置の対照として機能する。
【0270】
（１）Ｄ１９におけるＮＡＳＨ誘導前（「健常」）；
（２）ＮＡＳＨを誘導し、Ｄ１７－Ｄ１９で媒体対照により処置し、Ｄ１９で採取した（「媒体処置」）。
（３）Ｄ１７－Ｄ１９でのＨＧＦ処置、Ｄ１９「Ｔ１による反転」で採取；
（４）Ｄ１３－Ｄ１７におけるＴＧＦβ１による線維症誘導中のナイーブエキソソームによる同時処置（「同時ナイーブエキソソーム処置」）；
（５）Ｄ１３－Ｄ１７におけるＴＧＦβ１による線維症誘導中のプライミングされたエキソソームによる同時処置（「同時プライミングされたエキソソーム処置」）；
（６）ＮＡＳＨ誘導後のＤ１７－Ｄ１９でのナイーブエキソソームによる処置（「ナイーブエキソソーム処置」）；
（７）ＮＡＳＨ誘導後のＤ１７－Ｄ１９でのプライミングされたエキソソームによる処置（「プライミングされたエキソソーム処置」）；
（８）ＮＡＳＨ誘導に供されず、Ｄ１７で採取した（「健常対照」）。
（９）脂肪症誘導－ＴＧＦβ１を含まないＦＦＡ混合のみにより処置し、Ｄ１５で採取した；
（１０）ＦＦＡおよびＴＧＦβ１による連続処置を伴う脂肪線維症誘導、Ｄ１９で採取した（図１５Ｇ；「脂肪線維症」を参照されたい）。
「健常対照」と「脂肪線維症」を比較すると、ＦＦＡおよびＴＧＦβ１によるＮＡＳＨの誘導は、肝スフェロイドにおいて線維症を誘導したが、ＦＦＡ処置のみによる脂肪症の誘導はないことを示す。コラーゲン１染色のみに基づくと、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソームのいずれかを添加すると、ＴＧＦβ１誘導性線維症が妨げられるようであった。また、コラーゲン１染色に基づいて、ＴＧＦβ１処置の停止および２日間の媒体によるその後の処置は、ＴＧＦβ１誘導性線維症を反転させるのに十分であったようである。しかしながら、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドをナイーブエキソソームおよびプライミングされたエキソソームにより処置すると、両方とも媒体処置のみと比較して線維症の減少に媒体よりも効果的であることが見出された。
（２）ＮＡＳＨを誘導し、Ｄ１７－Ｄ１９で媒体対照により処置し、Ｄ１９で採取した（「媒体処置」）。
（３）Ｄ１７－Ｄ１９でのＨＧＦ処置、Ｄ１９「Ｔ１による反転」で採取；
（４）Ｄ１３－Ｄ１７におけるＴＧＦβ１による線維症誘導中のナイーブエキソソームによる同時処置（「同時ナイーブエキソソーム処置」）；
（５）Ｄ１３－Ｄ１７におけるＴＧＦβ１による線維症誘導中のプライミングされたエキソソームによる同時処置（「同時プライミングされたエキソソーム処置」）；
（６）ＮＡＳＨ誘導後のＤ１７－Ｄ１９でのナイーブエキソソームによる処置（「ナイーブエキソソーム処置」）；
（７）ＮＡＳＨ誘導後のＤ１７－Ｄ１９でのプライミングされたエキソソームによる処置（「プライミングされたエキソソーム処置」）；
（８）ＮＡＳＨ誘導に供されず、Ｄ１７で採取した（「健常対照」）。
（９）脂肪症誘導－ＴＧＦβ１を含まないＦＦＡ混合のみにより処置し、Ｄ１５で採取した；
（１０）ＦＦＡおよびＴＧＦβ１による連続処置を伴う脂肪線維症誘導、Ｄ１９で採取した（図１５Ｇ；「脂肪線維症」を参照されたい）。
「健常対照」と「脂肪線維症」を比較すると、ＦＦＡおよびＴＧＦβ１によるＮＡＳＨの誘導は、肝スフェロイドにおいて線維症を誘導したが、ＦＦＡ処置のみによる脂肪症の誘導はないことを示す。コラーゲン１染色のみに基づくと、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソームのいずれかを添加すると、ＴＧＦβ１誘導性線維症が妨げられるようであった。また、コラーゲン１染色に基づいて、ＴＧＦβ１処置の停止および２日間の媒体によるその後の処置は、ＴＧＦβ１誘導性線維症を反転させるのに十分であったようである。しかしながら、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドをナイーブエキソソームおよびプライミングされたエキソソームにより処置すると、両方とも媒体処置のみと比較して線維症の減少に媒体よりも効果的であることが見出された。
【0271】
図１５Ｅは、図１５Ｃにおけるコラーゲン染色に関して示されるように、肝スフェロイドについての同じ条件セットを用いて、別の線維症マーカーであるα－ＳＭＡについて染色されたエキソソームで処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドを含むＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの代表的な免疫蛍光画像を示す。図１５Ｆは、図１５Ｄにおけるコラーゲン染色に関して示されるように、肝スフェロイドについての同じ条件セットを用いて、健常細胞と比較したα－ＳＭＡ陽性細胞の相対強度の棒グラフを示す。α－ＳＭＡ染色のみに基づくと、ＦＦＡ混合物とＴＧＦβ１によるＮＡＳＨ誘導、ならびにＦＦＡ混合物のみによる脂肪症誘導は、いずれも線維症を誘導するようである。また、α－ＳＭＡ染色のみに基づくと、ナイーブエキソソームおよびプライミングされたエキソソームのいずれも、ＮＡＳＨ誘導性線維症を減少させるのに媒体よりも効果的であったようである。さらに、α－ＳＭＡ染色のみに基づくと、プライミングされたエキソソームによる同時処置は、ナイーブエキソソームではなく、α－ＳＭＡのＮＡＳＨ誘導に基づく増加を妨げたようである。
【0272】
本明細書で上述され、図１５Ａ～１５Ｆに示されるように、ＦＦＡ混合物またはＴＧＦβ１などの疾患状態誘導剤、および／またはエキソソームなどの治療剤による処置の肝スフェロイドにおける効果は、免疫染色およびＥＬＩＳＡなどの技術を用いて一度に１つのマーカー（または新しいマーカー）をアッセイすることができる。しかしながら、マイクロアレイまたは次世代シークエンシング（ＮＧＳ）などのハイスループット技術を用いて、はるかに大きい計数のマーカー（数十、数百、数千）を同時にアッセイすることができる。図１６Ａは、マイクロアレイハイブリダイゼーションデータに基づく肝スフェロイドの遺伝子発現の変化のヒートマップを示す。マイクロアレイハイブリダイゼーションデータを以下のように獲得した：肝スフェロイド試料の増殖ならびにＮＡＳＨ誘導剤および／または上述の治療剤による処置後、肝スフェロイドを単離し、溶解し、ｍＲＮＡを単離し、次に相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の配列に変換した。次に、ｃＤＮＡ試料をＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）マイクロアレイに適用し、マイクロアレイリーダーで読み取った。マイクロアレイ分析は、標準方法を用いて、２２，４７３個の遺伝子（マイクロアレイに含まれる）の所定のトランスクリプトームセットについて、標準化された発現値を得るために行われた。マイクロアレイ分析は、以下の条件（「肝スフェロイド状態」）下で肝スフェロイド試料を用いて行われた。
（１）ＮＡＳＨ誘導後のＤ１７－Ｄ１９での４０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦによる処置（「ＨＧＦ」）；
（２）ＮＡＳＨ誘導後のＤ１７－Ｄ１９でのナイーブエキソソームによる処置（「ナイーブエキソソーム処置」）；
（３）Ｄ１９でのＮＡＳＨ誘導化（「罹病」）；
（４）Ｄ１９でのＮＡＳＨ誘導に供されなかった（「健常」）；
（５）ＮＡＳＨ誘導後、Ｄ１７－Ｄ１９でのプライミングされたエキソソームによる処置（「プライミングされたエキソソーム処置」）；
（６）Ｄ１３－Ｄ１７でのＴＧＦβ１による線維症誘導中のナイーブエキソソームによる同時処置（「ナイーブエキソソーム同時」）；ならびに
（７）Ｄ１３－Ｄ１７でのＴＧＦβ１による線維症誘導中のプライミングされたエキソソームによる同時処置（「プライミングされたエキソソーム同時」）。
各条件は、３０個のスフェロイドのプールに基づいており、ヒートマップは、プールされた試料からの発現プロファイルデータに基づいて作成された。
（１）ＮＡＳＨ誘導後のＤ１７－Ｄ１９での４０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦによる処置（「ＨＧＦ」）；
（２）ＮＡＳＨ誘導後のＤ１７－Ｄ１９でのナイーブエキソソームによる処置（「ナイーブエキソソーム処置」）；
（３）Ｄ１９でのＮＡＳＨ誘導化（「罹病」）；
（４）Ｄ１９でのＮＡＳＨ誘導に供されなかった（「健常」）；
（５）ＮＡＳＨ誘導後、Ｄ１７－Ｄ１９でのプライミングされたエキソソームによる処置（「プライミングされたエキソソーム処置」）；
（６）Ｄ１３－Ｄ１７でのＴＧＦβ１による線維症誘導中のナイーブエキソソームによる同時処置（「ナイーブエキソソーム同時」）；ならびに
（７）Ｄ１３－Ｄ１７でのＴＧＦβ１による線維症誘導中のプライミングされたエキソソームによる同時処置（「プライミングされたエキソソーム同時」）。
各条件は、３０個のスフェロイドのプールに基づいており、ヒートマップは、プールされた試料からの発現プロファイルデータに基づいて作成された。
【0273】
ヒートマップでは、各行は遺伝子を表し、各列は肝スフェロイド状態を表す。列は、肝スフェロイド状態の各々における遺伝子発現パターンの階層的クラスター分析に基づいて配置される。それぞれの遺伝子発現パターンに関して互いに近くにクラスターを形成する肝スフェロイド状態の対は隣接する列として配置され、列を接続する括弧は、異なる肝スフェロイド状態のそれぞれの遺伝子発現パターン間の類似性の程度を反映している。図１６Ａに示されるように、肝スフェロイド状態の遺伝子発現プロファイルのクラスター分析は、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドが潜在的な治療的処置に供された肝スフェロイド状態１、２、および５～７のうち、プライミングされたエキソソームで処置された肝スフェロイド状態の遺伝子発現プロファイルが、健常な肝スフェロイド状態の遺伝子発現プロファイルに最も密接に類似していることを示した。対照的に、ナイーブエキソソームで処置された肝スフェロイド状態の遺伝子発現プロファイルは、罹病肝スフェロイド状態の遺伝子発現プロファイルに最も密接に類似しており、プライミングされたエキソソームはＮＡＳＨ誘導を少なくとも部分的に反転させ、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの健常を改善するのに有効であったが、ナイーブエキソソームはこのような結果を達成するのに無効であったことを示した。
【0274】
異なる肝スフェロイド状態の各々における肝スフェロイドの遺伝子発現レベルはまた、特徴ベクター（「スフェロイド状態特徴ベクター」）としてそれぞれ表し、および保存し、所定のスフェロイド状態特徴ベクターの各エレメントはマイクロアレイにおいてアッセイされた遺伝子の１つの発現レベルであった。異なる状態間の遺伝子発現プロファイルの類似性（または類似性の欠如）は、ｎ次元空間における特徴ベクターの対間の距離の尺度に基づいて決定した。ｎは、特徴ベクターの各々において表される遺伝子の数である。同様にこの距離分析に基づき、他の処置条件（すなわち、ナイーブエキソソーム同時条件、プライミングされたエキソソーム同時条件、およびナイーブエキソソーム処置条件）と比較して、プライミングされたエキソソーム処置条件（ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドをＤＭＦでプライミングされたエキソソームにより誘導後に処置された）を表すスフェロイド状態特徴ベクターが、健常な肝スフェロイド（ＮＡＳＨ誘導に供されなかった）を表すスフェロイド特徴ベクターまでのユークリッド距離が最も短いことが見出されたことが見出された。言い換えると、ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣからのエキソソームによる処置は、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの遺伝子発現プロファイルを健常な肝スフェロイドのそれに戻す際に試験された処置の中で最も効果的な処置であることが示された。
【0275】
図１６Ｂは、健常対照肝スフェロイド、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイド、およびエキソソームで処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドにおいて差次的に発現された遺伝子の主成分分析に基づくプロットを示す。図は、図１６Ａに関して記載される同じ７つの肝スフェロイド条件：ＨＧＦ、ナイーブエキソソーム処置、罹病、健常、プライミングされたエキソソーム処置、ナイーブエキソソーム同時、およびプライミングされたエキソソーム同時を表す種々のスフェロイド状態特徴ベクターを含むｎ次元空間の二次元投影を示す。二次元投影は主成分分析に基づく。肝スフェロイドにおけるＮＡＳＨ表現型の誘導は、健常対照遺伝子プロファイルと比較して、遺伝子プロファイルを下方および左方にシフトさせる差次的に発現された遺伝子を生成した。二次元投影で可視化されたマイクロアレイベースのトランスクリプトーム分析に基づいて、ナイーブエキソソームまたは４０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦによる処置はＮＡＳＨ誘導性肝臓の処置に有効ではないことは容易に明らかであり、図に示されるように、ナイーブエキソソームまたはＨＧＦにより処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの遺伝子発現プロファイルは、未処置のＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドから実質的に変化しなかった。対照的に、Ｎｒｆ２活性化因子ＤＭＦでプライミングされたｈＢＭ－ＭＳＣに由来するエキソソームによるＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの処置により、健常対照肝スフェロイドに近い、上方および右にシフトバックした遺伝子発現プロファイルを有する処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドが生じ、プライミングされたエキソソーム処置は、肝スフェロイドにおけるＮＡＳＨ誘導性遺伝的変化を反転させ、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの遺伝子発現プロファイルを健常肝スフェロイドのそれに非常に類似するように変化させる上で、他の評価した処置（ナイーブエキソソームおよびＨＧＦ）が実質的により効果的であることが示された。
【0276】
ＮＡＳＨ誘導性スフェロイドにおけるエキソソーム処置の予防効果を検討するにあたり、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの処置に同時のエキソソーム（プライミングされたおよびナイーブ）を使用した。ナイーブであろうとプライミングであろうと同時にエキソソームを用いた処置は、罹病対照と比較して、差次的に発現された遺伝子の遺伝子プロファイルを有意に右にシフトさせ、同時エキソソームを伴うＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドにおける線維症進行の抑制に関連するいくつかの予防効果があることが示された。ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドにおけるナイーブ同時エキソソーム処置と、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドにおけるプライミングされた同時エキソソーム処置との間には、差次的に発現された遺伝子にいくつかの顕著な違いがあった。そうは言っても、ナイーブエキソソームまたはプライミングされたエキソソームのいずれかによる同時エキソソーム処置は、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの遺伝子発現プロファイルを健常な肝スフェロイドのそれに非常によく似たものに変化させる点で、プライミングされたエキソソームによる一連の非同時処置よりも実質的に効果が低かった。
【0277】
図１７Ａは、図１６Ａに関して上述したマイクロアレイ研究においてアッセイされた遺伝子のサブセットである、ヒートマップ２８７個の肝臓特異的遺伝子を示す。図１７Ａに示されるように、図１６Ａに示されるのと同じセットの肝スフェロイド状態の遺伝子発現プロファイルのクラスター分析は、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドが潜在的に治療的処置に供された肝スフェロイド状態のうち、プライミングされたエキソソームで処置された肝スフェロイド状態の遺伝子発現プロファイルが、健常な肝スフェロイド状態の遺伝子発現プロファイルに最もよく似ていることを示した。対照的に、ＨＧＦ処置された肝スフェロイドの遺伝子発現プロファイルは、罹病肝スフェロイド状態の遺伝子発現プロファイルに最もよく似ており、続いてナイーブエキソソーム処置肝スフェロイド状態であった。
【0278】
図１７Ｂを参照すると、異なる遺伝子のサブセットを用いて分析を繰り返すことにより、ＤＭＦでプライミングされたエキソソーム処置が、ＮＡＳＨ病理を反転させるのに一貫して最も効果的であることが示された。図１７Ｂ～１７Ｇは、以下の遺伝子サブセットについてのクラスター分析を伴うヒートマップを示す。
図１７Ｂ：１８４個のＮＡＳＨ／線維症関連遺伝子（Hoang et al., Gene Expression Predicts Histological Severity and Reveals Distinct Molecular Profiles of Nonalcoholic Fatty Liver Disease, Scientific Reports 9 (12541) 2019, Govaere et al. Transcriptomic profiling across the nonalcoholic fatty liver disease spectrum reveals gene signatures for steatohepatitis and fibrosis, Science Translational Medicine 12(572), Dec 2020 およびGu C et al., Identification of Common Genes and Pathways in Eight Fibrosis Diseases, Frontiers in Genetics, January 2021に基づく選択）。
図１７Ｃ：２９４個の肝星細胞特異的遺伝子（Payen et al., Single-cell RNA sequencing of human liver reveals hepatic stellate cell heterogeneity, JHEP Reports 3(3) June 2021に基づく選択）。
図１７Ｄ：生体異物代謝プロセスに関連する７５個の遺伝子（遺伝子オントロジー参照文献ＧＯ：０００６８０５に基づく選択）。
図１７Ｅ：脂肪酸代謝に関連する５０個の遺伝子（遺伝子オントロジー参照文献ＧＯ：０００６６３１に基づく選択）。
図１７Ｆ：エポキシゲナーゼＰ４５０経路に関連する１５個の遺伝子（遺伝子オントロジー参照文献ＧＯ：００１９３７３に基づく選択）。
図１７Ｇ：脂肪線維症に関連する２４個の遺伝子であって、２つの患者の独立したコホートにおける組織学的に定義されたＮＡＦＬＤ重症度の脂肪繊維症および線維症への悪化に関連する罹病組織における発現（Govaere et al. Transcriptomic profiling across the nonalcoholic fatty liver disease spectrum reveals gene signatures for steatohepatitis and fibrosis, Science Translational Medicine 12(572), Dec 2020に基づく遺伝子の選択）。
図１７Ｂ：１８４個のＮＡＳＨ／線維症関連遺伝子（Hoang et al., Gene Expression Predicts Histological Severity and Reveals Distinct Molecular Profiles of Nonalcoholic Fatty Liver Disease, Scientific Reports 9 (12541) 2019, Govaere et al. Transcriptomic profiling across the nonalcoholic fatty liver disease spectrum reveals gene signatures for steatohepatitis and fibrosis, Science Translational Medicine 12(572), Dec 2020 およびGu C et al., Identification of Common Genes and Pathways in Eight Fibrosis Diseases, Frontiers in Genetics, January 2021に基づく選択）。
図１７Ｃ：２９４個の肝星細胞特異的遺伝子（Payen et al., Single-cell RNA sequencing of human liver reveals hepatic stellate cell heterogeneity, JHEP Reports 3(3) June 2021に基づく選択）。
図１７Ｄ：生体異物代謝プロセスに関連する７５個の遺伝子（遺伝子オントロジー参照文献ＧＯ：０００６８０５に基づく選択）。
図１７Ｅ：脂肪酸代謝に関連する５０個の遺伝子（遺伝子オントロジー参照文献ＧＯ：０００６６３１に基づく選択）。
図１７Ｆ：エポキシゲナーゼＰ４５０経路に関連する１５個の遺伝子（遺伝子オントロジー参照文献ＧＯ：００１９３７３に基づく選択）。
図１７Ｇ：脂肪線維症に関連する２４個の遺伝子であって、２つの患者の独立したコホートにおける組織学的に定義されたＮＡＦＬＤ重症度の脂肪繊維症および線維症への悪化に関連する罹病組織における発現（Govaere et al. Transcriptomic profiling across the nonalcoholic fatty liver disease spectrum reveals gene signatures for steatohepatitis and fibrosis, Science Translational Medicine 12(572), Dec 2020に基づく遺伝子の選択）。
【0279】
図１８Ａ～Ｃは、エキソソーム処置前後の肝スフェロイドの状態、包括的遺伝子、肝臓特異的遺伝子、ならびにＸ、ＹおよびＺ軸上のＮＡＳＨ／線維症関連遺伝子をそれぞれ含む状態のグラフを示す。図１８Ａ～１８Ｃの各々は、以下の肝臓スフェロイド状態：健常（Ｈｅａｔｈｙ）、罹病（ＮＡＳＨ誘導）、ＨＧＦ処置、ナイーブエキソソーム処置、およびプライミングされたエキソソーム処置を表すスフェロイド状態特徴ベクトルを含む、それぞれのｎ次元空間を示す３次元投影図である。図１８Ａ～１８Ｃの各々は、３つの２次元投影の組み合わせである図１８Ａ～１８Ｃの各々に示される三次元空間を示し、Ｘ、Ｙ、およびＺ軸の各々は、本明細書の上記に記載されたマイクロアレイ研究における遺伝子アッセイのサブセットのＪａｃｃａｒｄ類似性指数スコアのマトリックスの主成分分析（ＰＣＡ）に基づいている（対象の一部は図１７Ａ～１７Ｇに示される）。図１８Ａにおいて、Ｘ軸は、１８，９３６個の遺伝子を有する包括的遺伝子のセットに基づいており、Ｙ軸は、２８７個の肝臓特異的遺伝子のセット（図１７Ａにおいてヒートマップとして示される）に基づいており、Ｚ軸は、１８４個のＮＡＳＨ／線維症遺伝子のセット（図１７Ｂにおいてヒートマップとして示される）に基づいている。図１８Ｂにおいて、Ｘ軸は、ＧＯ：０００６９５４に基づく４７６個の炎症応答遺伝子のセットに基づいており、Ｙ軸は、ＧＯ：０００１５２５に基づく３８６個の血管新生遺伝子のセットに基づいており、Ｚ軸は、ＧＯ：００２２００８に基づく９３７個の神経新生遺伝子のセットに基づいている。図１８Ｃにおいて、Ｘ軸は、ＧＯ：００４２０６０に基づく３１５個の創傷治癒遺伝子のセットに基づいており、Ｙ軸は、１２７個の組織リモデリング遺伝子のセット（ＧＯ：００４８７７１に基づく）に基づいており、Ｚ軸は、ＧＯ：００３１０１２に基づく４０５個の細胞外マトリックス遺伝子のセットに基づいている。図１８Ａ～１８Ｃに示される３次元空間の一側である各２次元投影は、それぞれの３次元空間に提供される３軸のうち２軸を使用する。
【0280】
各投影において、健常肝スフェロイド状態は［１，１］の座標が割り当てられ、残りの状態の座標はＪａｃｃａｒｄ類似性指数に基づいて決定される。図１８Ａ～１８Ｃの各々に示されるように、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドのＤＭＦでプライミングされたエキソソーム処置は、遺伝子発現パターンに基づいて、ＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドの部分的回復を誘導し健常状態に戻す：ＤＭＦでプライミングされたエキソソーム処置状態の座標値は、Ｚ軸上で前方に、Ｘ軸上で右に、Ｙ上で上方に、罹病スフェロイドの座標値から離れて、健常状態の座標値に向かってシフトされる。対照的に、ナイーブエキソソームで処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイド、ならびにＨＧＦで処置されたＮＡＳＨ誘導性肝スフェロイドは、ＤＭＦでプライミングされたエキソソーム処置状態または健常状態よりも罹病状態に実質的に類似した３軸すべてにおいて座標値を有した。
【0281】
上記の結果に基づいて、治療的に有効な用量のＤＭＦでプライミングされたエキソソームのＮＡＳＨを有するヒト対象への投与は、対象におけるＮＡＳＨを処置することが期待される。また、ＤＭＦでプライミングされたエキソソームはＮＡＦＬＤおよびＮＡＦＬの処置に効果的であることが期待される。さらに、ＤＭＦでプライミングされたエキソソームは肝線維症の処置に効果的であることが期待される。
【0282】
図１９は、罹病状態に類似した発現レベルから、ＤＭＦでプライミングされたエキソソームによる処置後の健常状態の発現レベルに類似した発現レベルまで、その発現レベルが最も堅固に反転した、８７個の遺伝子のショートリストされた選択のヒートマップを示す。これらの遺伝子は、肝スフェロイドだけでなく、インビボでの肝組織における健常状態またはＮＡＳＨ誘導を決定するためのマーカーとして用いることができる。これらの８７個の遺伝子は、分泌（ＧＬ：００４６９０３）、細胞ホメオスタシス（ＧＯ：００１９７２５）、創傷治癒（ＧＯ：００４２０５０）、脂質生合成（ＧＯ：０００８６１０）などの、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ疾患進行と同様に肝機能に関連する種々のシグナル伝達経路に代表される遺伝子を含む。このように、ＮＡＳＨ誘導中の肝スフェロイドの遺伝子発現パターンおよび本明細書に記載されるＤＭＦでプライミングされたエキソソームによるその処置は、インビボでのＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの臨床発現、ならびにこれらの状態からの回復に機構的に連結していることが示される。
【0283】
８７個の遺伝子のうち、以下の遺伝子は、ＤＭＦでプライミングされたエキソソーム：ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、ＭＭＰ１０、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧ、ＡＴＰ１Ｂ、およびＩＣＡＭ２を用いた処置により、肝スフェロイドにおける肝臓の健常のためのマーカーとして、ならびに前記健常の回復のためのマーカーとして、特に堅固で有用であることが決定された。
【0284】
表１２は、これら９個の遺伝子のＬｏｇ２における遺伝子発現の正常化値を示す。
【0285】
【表12】
【0286】
本開示の利点
本開示は、組織の無血管および血管再生のための、抗炎症、抗線維症、創傷前治癒、血管新生（促進／抗）、および再神経支配因子を含む、濃縮された因子を伴う治療用エキソソームの産生のためのある特定の経路を活性化するための誘導因子の特定の組み合わせで、骨髄、脂肪、臍帯などの種々の組織源に由来するＭＳＣをプライミングする方法を開示する。ＭＳＣのプライミングは、種々のプライミング剤（小分子および巨大分子）を用いて行われる。
本開示の利点は、以下のとおりである。
本開示は、組織の無血管および血管再生のための、抗炎症、抗線維症、創傷前治癒、血管新生（促進／抗）、および再神経支配因子を含む、濃縮された因子を伴う治療用エキソソームの産生のためのある特定の経路を活性化するための誘導因子の特定の組み合わせで、骨髄、脂肪、臍帯などの種々の組織源に由来するＭＳＣをプライミングする方法を開示する。ＭＳＣのプライミングは、種々のプライミング剤（小分子および巨大分子）を用いて行われる。
本開示の利点は、以下のとおりである。
【0287】
１．本開示は、所望の治療効果、例えば、抗炎症、抗線維症、創傷前治癒、血管新生（促進／抗）、および再神経支配性を有するエキソソームを産生するためのマーカーのシグネチャーセット発現に基づいて、ＵＣ－ＭＳＣ／ＷＪ－ＭＳＣなどの幹細胞の固有集団の選択を提供する。
【0288】
２．本開示はまた、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を用いて、細胞および治療用エキソソームのスケーラブルであり、均一な産生を促進するためのＭＳＣ（ｅＭＳＣ）の倍加可能性を延長する、ヒトＭＳＣの不死化／操作を提供する。
【0289】
３．本開示は、Ｎｒｆ２活性化因子、ＳＩＲＴ１活性化因子、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＣＳＳＣ由来の馴化培地などのプライミング剤を伴う方法を提供し、これらは単独でまたはそれらの組み合わせで使用することができる。プライミング剤を配備する方法は、再生治療効力において実質的に増強された濃縮された治療グレードのエキソソームを得るのに役立つ。
【0290】
４．本開示はまた、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、肺炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルスクラスの感染症、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、インフルエンザ、結核、全身性狼瘡、心筋梗塞、変形性関節症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＳＨ）、肝線維症、ムーレン潰瘍、神経栄養性潰瘍、角膜の角膜炎（ＣＫ）、ドライアイ疾患潰瘍、ヘルペス性単純角膜炎、ＬＡＳＩＫ後拡張症、術後角膜融解、角膜プロテーゼ後融解、角膜穿孔、神経栄養性角膜炎（ＮＫ）、円錐角膜シェーグレン症候群、粘膜類天疱瘡、スティーブンス・ジョンソン症候群、化学熱傷、および熱傷を含む炎症関連障害を処置するための誘導性および活性化エキソソームを提供する。
【0291】
５．本開示はまた、動物モデルにおいて治療効果を有するのに必要なＭＳＣの細胞由来産物の量が約５０μｇのタンパク質または１００億個近い粒子であるため、費用対効果の高い方法を提供する。物理的、分子的およびトランスクリプトーム分析を行うために、スケールアップ戦略は、次に、関与するコストを著しく減少させる前進の方法である。
【0292】
６．全体として、本開示は、プライミングされたＭＳＣおよびプライミングされた馴化培地を得るために、異なるプライミング剤を用いてＭＳＣを培養、拡大、およびプライミングするプロセスを開示する。したがって、本明細書に記載されるプロセスのスケーラビリティは、プロセスがゼノフリープロセスであるという事実とともに、商業的要件を満たすためのスケーラビリティの実施可能なオプションを与え、プライミングされたＭＳＣ、プライミングされた馴化培地に関して臨床グレードの最終製品を提供する。馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ）またはプライミングされた馴化培地をさらに処理して、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、肺炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＯＶＩＤ－１９、コロナウイルスクラスの感染症、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、インフルエンザ、結核、全身性狼瘡、心筋梗塞、変形性関節症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＳＨ）、肝線維症、ムーレン潰瘍、神経栄養性潰瘍、角膜の角膜炎（ＣＫ）、ドライアイ疾患潰瘍、ヘルペス性単純角膜炎、ＬＡＳＩＫ後拡張症、術後角膜融解、角膜プロテーゼ後融解、角膜穿孔、神経栄養性角膜炎（ＮＫ）、円錐角膜シェーグレン症候群、粘膜類天疱瘡、スティーブンス・ジョンソン症候群、化学熱傷、および熱傷からなる群から選択される状態を処置するために使用することができる臨床グレードのエキソソーム、セクレトーム、および他のセロ由来製品を得る。本開示によるエキソソーム収率は、生産コストに影響を与えることなくスケーラブルである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図15F】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図17E】
【図17F】
【図17G】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19】
【図20】
【国際調査報告】