特表 2024-530154 体細胞変異と異常にメチル化された断片との同時発生

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-16

(54)【発明の名称】体細胞変異と異常にメチル化された断片との同時発生

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20240808BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALI20240808BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6886 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506251

(86)(22)【出願日】2022-08-04

(85)【翻訳文提出日】2024-03-25

(86)【国際出願番号】 US2022074523

(87)【国際公開番号】W WO2023015244

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】63/229,797

(32)【優先日】2021-08-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17/817,421

(32)【優先日】2022-08-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522105894

【氏名又は名称】グレイル エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100173794

【弁理士】

【氏名又は名称】色部 暁義

(72)【発明者】

【氏名】プラナヴ パルムジット シン

(72)【発明者】

【氏名】オリバー クロード ヴェン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR42

4B063QR55

4B063QR62

4B063QX01

(57)【要約】

変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定するためのシステム及び方法が提供される。ゲノム位置についての参照対立遺伝子及び変異対立遺伝子が同定される。ゲノム位置にマッピングされる核酸断片配列のメチル化状態及び配列が、対象の試料から取得される。核酸断片配列の配列を使用して、参照対立遺伝子を有する各核酸断片配列が参照サブセットに割り当てられ、変異対立遺伝子を有する各核酸断片配列が変異サブセットに割り当てられる。変異サブセット中の核酸断片配列全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標、及び変異サブセット中の核酸断片配列の数に対する参照サブセット中の核酸断片配列の数の指標が、訓練された二値分類器に適用される。ゲノム位置における変異対立遺伝子の体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての同定が、分類器から取得される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定する方法であって、
前記ゲノム位置における参照対立遺伝子の同定を取得することと、
前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の同定を取得することと、
前記ゲノム位置上にマッピングされる、前記試験対象から取得された液体生体試料に由来するシーケンシングデータセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のメチル化状態及びそれぞれの配列を取得することであって、前記シーケンシングデータセットは少なくとも１×１０^６個の核酸断片配列を含む、取得することと、
（ｉ）前記ゲノム位置における前記参照対立遺伝子の前記同定と、（ｉｉ）前記それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列の前記それぞれの配列とを使用して、前記それぞれの複数の核酸断片配列のうちで前記ゲノム位置に前記参照対立遺伝子を有する各核酸断片配列を参照サブセットに割り当てることと、
（ｉ）前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の前記同定と、（ｉｉ）前記それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列の前記それぞれの配列とを使用して、前記それぞれの複数の核酸断片配列のうちで前記ゲノム位置に前記変異対立遺伝子を有する各核酸断片配列を変異サブセットに割り当てることと、
訓練された二値分類器に、少なくとも、（ｉ）前記変異サブセット中の各核酸断片配列の前記メチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標、及び（ｉｉ）前記変異サブセット中の核酸断片配列の数に対する前記参照サブセット中の核酸断片配列の数の指標を適用することであって、前記訓練された二値分類器は少なくとも１０個のパラメータを含み、それによって、前記訓練された二値分類器から、前記試験対象における前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての同定を取得する、適用することと、
を含む、方法。

【請求項2】

前記方法は、
非一時的メモリに結合されたプロセッサを含むコンピュータシステムに参照ゲノムを入力することと、
前記コンピュータシステムを使用して、前記それぞれの複数の核酸断片配列中のそれぞれの核酸断片配列が、前記それぞれの核酸断片配列を前記参照ゲノムにアライメントすることによって前記ゲノム位置にマッピングされると決定することと、
を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記それぞれの複数の核酸断片配列中の第１の核酸断片配列は、複数のＣｐＧ部位を有し、
前記第１の核酸断片配列は、前記複数のＣｐＧ部位全体にわたって対応するメチル化パターンを有し、
前記第１の核酸断片配列の前記メチル化状態はｐ値であり、
前記方法は
前記第１の核酸断片配列の前記対応するメチル化パターンを、前記それぞれの複数のＣｐＧ部位を各々が有する健常な非癌コホートデータセット中のそれらの核酸断片配列のメチル化パターンの対応する分布と比較することによって、前記第１の核酸断片配列の前記ｐ値を少なくとも部分的に決定すること
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記変異対立遺伝子は、挿入、欠失、又は一塩基多型である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記訓練された分類器は、訓練されたロジスティック回帰分類器又は多層パーセプトロン分類器である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記訓練された分類器は、訓練された決定木分類器、訓練されたランダムフォレスト分類器、訓練されたサポート・ベクトル・マシン分類器、訓練されたｋ最近傍分類器、訓練された最近傍セントロイド分類器、訓練されたニューラルネットワーク分類器、又は訓練されたナイーブベイズ分類器である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子が、前記訓練された二値分類器によって生殖系列変異対立遺伝子であると判定された場合、前記方法は、
前記試験対象における前記変異対立遺伝子を使用して、前記試験対象の癌リスクを判定すること
を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子が、前記訓練された二値分類器によって生殖系列であると判定された場合、前記方法は、
前記試験対象における前記変異対立遺伝子を使用して、前記対象の民族性を予測すること
を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子が、前記訓練された二値分類器によって体細胞変異対立遺伝子であると判定された場合、前記方法は、
前記試験対象における変異対立遺伝子を使用して、前記対象の腫瘍画分を決定すること
を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ゲノム位置における前記参照対立遺伝子の前記同定は参照ゲノムから取得される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記変異サブセット全体にわたるメチル化状態の前記１つ以上の指標中の各指標は、
前記変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の中心傾向の尺度、
前記変異サブセット全体にわたる最小メチル化状態ｐ値、
前記変異サブセット全体にわたる最大メチル化状態ｐ値、又は
前記変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度
である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記変異サブセット全体にわたるメチル化状態の前記１つ以上の指標中の一指標が、前記変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の前記中心傾向の尺度であり、
前記中心傾向の尺度は、前記変異サブセット全体にわたる前記メチル化状態ｐ値の算術平均、加重平均、ミッドレンジ、ミッドヒンジ、三平均、ウィンザー化平均、平均、又は最頻値である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記変異サブセット全体にわたるメチル化状態の前記１つ以上の指標中の一指標が、前記変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度であり、
前記広がりの尺度は、前記変異サブセット全体にわたる前記メチル化状態ｐ値の標準偏差、分散、範囲、又は四分位数間範囲である、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記変異サブセット全体にわたるメチル化状態の前記１つ以上の指標は、前記変異サブセット全体にわたるメチル化状態の複数の指標であり、前記複数の指標は、
前記変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の中心傾向の尺度、
前記変異サブセット全体にわたる最小メチル化状態ｐ値、
前記変異サブセット全体にわたる最大メチル化状態ｐ値、及び
前記変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度
のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記訓練された二値分類器への前記適用は、（ｉｉｉ）前記変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標を更に適用する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記変異サブセット全体にわたる前記１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、
前記変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの中心傾向の尺度、
前記変異サブセット全体にわたる最小ＣｐＧカウント、
前記変異サブセット全体にわたる最大ＣｐＧカウント、及び
前記変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度
を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記変異サブセット全体にわたる前記１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、前記変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの前記中心傾向の尺度であり、
前記中心傾向の尺度は、前記変異サブセット全体にわたる前記ＣｐＧカウントの算術平均、加重平均、ミッドレンジ、ミッドヒンジ、三平均、ウィンザー化平均、平均、又は最頻値である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記変異サブセット全体にわたる前記１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、前記変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度であり、
前記広がりの尺度は、前記変異サブセット全体にわたる前記ＣｐＧカウントの標準偏差、分散、範囲、又は四分位数間範囲である、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記変異サブセット全体にわたる前記１つ以上のＣｐＧ部位指標は、前記変異サブセット全体にわたる複数のＣｐＧ部位指標であり、前記複数のＣｐＧ部位指標は、
前記変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの中心傾向の尺度、
前記変異サブセット全体にわたる最小ＣｐＧカウント、
前記変異サブセット全体にわたる最大ＣｐＧカウント、及び
前記変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度
のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項20】

前記訓練された二値分類器への前記適用は、前記参照サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標を更に適用する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記参照サブセット全体にわたるメチル化状態の前記１つ以上の指標中の各指標が、
前記参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の中心傾向の尺度、
前記参照サブセット全体にわたる最小メチル化状態ｐ値、
前記変異参照全体にわたる最大メチル化状態ｐ値、又は
前記参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度
である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記参照サブセット全体にわたるメチル化状態の前記１つ以上の指標中の一指標が、前記参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の前記中心傾向の尺度であり、
前記中心傾向の尺度は、前記参照サブセット全体にわたる前記メチル化状態ｐ値の算術平均、加重平均、ミッドレンジ、ミッドヒンジ、三平均、ウィンザー化平均、平均、又は最頻値である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記参照サブセット全体にわたるメチル化状態の前記１つ以上の指標中の一指標が、前記参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度であり、
前記広がりの尺度は、前記参照サブセット全体にわたる前記メチル化状態ｐ値の標準偏差、分散、範囲、又は四分位数間範囲である、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記訓練された二値分類器への前記適用は、前記参照サブセット全体にわたるメチル化状態の複数の指標を更に適用し、前記複数の指標は、
前記参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の中心傾向の尺度、
前記参照サブセット全体にわたる最小メチル化状態ｐ値、
前記参照サブセット全体にわたる最大メチル化状態ｐ値、及び
前記参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度
のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記訓練された二値分類器への前記適用は、前記参照サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標を更に適用する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記参照サブセット全体にわたる前記１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、
前記参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの中心傾向の尺度、
前記参照サブセット全体にわたる最小ＣｐＧカウント、
前記参照サブセット全体にわたる最大ＣｐＧカウント、及び
前記参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度
を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記参照サブセット全体にわたる前記１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、前記参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの前記中心傾向の尺度であり、
前記中心傾向の尺度は、前記参照サブセット全体にわたる前記ＣｐＧカウントの算術平均、加重平均、ミッドレンジ、ミッドヒンジ、三平均、ウィンザー化平均、平均、又は最頻値である、
請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記参照サブセット全体にわたる前記１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、前記参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度であり、
前記広がりの尺度は、前記変異サブセット全体にわたる前記ＣｐＧカウントの標準偏差、分散、範囲、又は四分位数間範囲である、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

前記訓練された二値分類器への前記適用は、前記参照サブセット全体にわたる複数のＣｐＧ部位指標を更に適用し、前記参照サブセット全体にわたる前記複数のＣｐＧ部位指標は、
前記参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの中心傾向の尺度、
前記参照サブセット全体にわたる最小ＣｐＧカウント、
前記参照サブセット全体にわたる最大ＣｐＧカウント、及び
前記参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度
のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記それぞれの複数の核酸断片配列中のそれぞれの核酸断片配列が、前記液体生体試料中の無細胞核酸分子の集団中のそれぞれの無細胞核酸分子の全て又は一部を表す、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記シーケンシングデータセットは、前記試験対象から取得された組織試料に更に由来し、前記それぞれの複数の核酸断片配列中のそれぞれの核酸断片配列が、前記組織試料中の核酸分子の集団中のそれぞれの核酸分子の全て又は一部を表す、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記組織試料は前記試験対象由来の腫瘍試料である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記液体生体試料は、前記試験対象の血液、全血、血漿、漿液、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹水を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記液体生体試料は、前記試験対象の血液、全血、血漿、漿液、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹水からなる、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記試験対象はヒトである、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の同定の前記取得は、前記それぞれの複数の核酸断片が前記ゲノム位置における変異対立遺伝子コールをサポートすると判定することを含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の前記同定の前記取得は、
（Ａ）前記ゲノム位置について、鎖特異的塩基カウントセットを取得することであって、前記鎖特異的塩基カウントセットは、それぞれの複数の核酸断片配列中のそれぞれの核酸断片配列中のそれぞれの塩基の（ｉ）鎖配向及び（ｉｉ）ゲノム位置におけるそれぞれの塩基の同一性を決定することによって取得される、ゲノム位置における塩基のセット（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）中の各塩基の順方向及び逆方向の鎖特異的カウントを含み、その同一性がメチル化シトシン又は非メチル化シトシンの変換によって影響され得る前記それぞれの複数の核酸断片配列中の前記ゲノム位置における塩基は、前記鎖特異的塩基カウントセットに寄与しない、取得することと、
（Ｂ）前記鎖特異的塩基カウントセット及びシーケンシング誤差推定値を使用して、前記ゲノム位置の前記候補遺伝子型セット中のそれぞれの候補遺伝子型について、それぞれの順鎖条件付き確率及びそれぞれの逆鎖条件付き確率を計算し、それによって、複数の順鎖条件付き確率及び複数の逆鎖条件付き確率を計算することと、
（Ｃ）（ｉ）前記複数の順鎖条件付き確率中の前記それぞれの候補遺伝子型の前記それぞれの順鎖条件付き確率、（ｉｉ）前記複数の逆鎖条件付き確率中の前記それぞれの候補遺伝子型の前記それぞれの逆鎖条件付き確率、及び（ｉｉｉ）前記それぞれの候補遺伝子型についての遺伝子型の事前確率の組み合わせを使用して、複数の尤度を計算することであって、前記複数の尤度中のそれぞれの尤度は、前記候補遺伝子型のセット中のそれぞれの候補遺伝子型の尤度である、計算することと、
Ｄ）前記複数の尤度を使用して、前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子を同定し、それによって、前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の前記同定を取得することと、
を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の前記同定の前記取得は、参照集団から取得された核酸データを使用して、候補遺伝子型のセット中のそれぞれの候補遺伝子型についての前記ゲノム位置における遺伝子型の事前確率を取得することを更に含み、
前記候補遺伝子型のセット中のそれぞれの候補遺伝子型の前記複数の尤度中のそれぞれの尤度についての前記複数の尤度の前記計算は、前記それぞれの候補遺伝子型についての前記遺伝子型の事前確率を更に使用する、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記参照集団は少なくとも１００個の参照対象を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記順方向はＦ１Ｒ２リード配向であり、前記逆方向はＦ２Ｒ１リード配向である、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記遺伝子型のセット中のそれぞれの候補遺伝子型がＸ／Ｙの形態であり、
Ｘは、参照ゲノムのゲノム位置における塩基のセット｛Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ｝中の塩基の同一性であり、
Ｙは、試験対象のゲノム位置における塩基のセット｛Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ｝中の塩基の同一性である、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記候補遺伝子型のセットは、セット｛Ａ／Ａ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｔ、及びＴ／Ｔ｝中の２～１０個の遺伝子型からなる、請求項３７に記載の方法。

【請求項43】

前記候補遺伝子型のセットは、セット｛Ａ／Ａ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｔ、及びＴ／Ｔ｝からなる、請求項３７に記載の方法。

【請求項44】

メチル化シーケンシングを実施して、前記それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列の前記メチル化状態及び前記それぞれの配列を取得することを更に含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記メチル化シーケンシングは全ゲノムメチル化シーケンシングである、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記メチル化シーケンシングは、複数の核酸プローブを使用する標的ＤＮＡメチル化シーケンシングである、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

前記複数の核酸プローブは１００個以上のプローブを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記メチル化シーケンシングは、前記それぞれの複数の核酸断片中のそれぞれの核酸断片における１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出する、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記メチル化シーケンシングは、前記それぞれの複数の核酸断片中の前記核酸断片における１つ以上の非メチル化シトシン又は１つ以上のメチル化シトシンの、対応する１つ以上のウラシルへの変換を含む、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記１つ以上のウラシルは、前記メチル化シーケンシングの間に１つ以上の対応するチミンとして検出される、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

１つ以上の非メチル化シトシン又は１つ以上のメチル化シトシンの前記変換は、化学変換、酵素変換、又はそれらの組み合わせを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項52】

前記メチル化シーケンシングは亜硫酸水素塩シーケンシングである、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記ゲノム位置は一塩基位置であり、前記変異は一塩基多型である、請求項１に記載の方法。

【請求項54】

前記シーケンシング誤差推定値は０．０１～０．０００１である、請求項３７に記載の方法。

【請求項55】

前記複数の尤度を使用した前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の同定は、
前記ゲノム位置の前記参照遺伝子型に対応する前記複数の尤度中の前記尤度が変異閾値を満たすかどうかを判定することであって、前記ゲノム位置が変異閾値を満たす場合、前記ゲノム位置における変異が同定されたとみなされる、判定すること
を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項56】

前記尤度は対数尤度として表され、前記変異閾値は、前記ゲノム位置の前記参照遺伝子型の前記対数尤度が－１０未満である場合に満たされる、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記尤度は対数尤度として表され、前記変異閾値は－２５～－５である、請求項５５に記載の方法。

【請求項58】

前記方法は、複数のゲノム位置中の各ゲノム位置について前記方法を繰り返し、それによって、前記試験対象の複数の変異を同定し、前記複数の変異中のそれぞれの変異について、前記それぞれの変異が体細胞変異であるか生殖系列変異であるかを同定することを更に含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記複数の変異は２００個の変異を含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

それぞれの変異が品質メトリックを満たさない場合に、前記複数の変異から前記それぞれの変異を除去することを更に含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項61】

前記品質メトリックは、前記それぞれの変異コールの前記ゲノム位置にマッピングされる、電子形態の前記それぞれの複数の核酸断片配列における最小変異対立遺伝子画分である、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記最小変異対立遺伝子画分は１０パーセントである、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記品質メトリックは、前記それぞれの変異の前記ゲノム位置にマッピングされる、電子形態の前記それぞれの複数の核酸断片配列における最大変異対立遺伝子画分である、請求項６０に記載の方法。

【請求項64】

前記最大変異対立遺伝子画分は９０パーセントである、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記品質メトリックは、前記それぞれの変異のゲノム位置にマッピングされる前記それぞれの複数の核酸断片配列の最小深度である、請求項６０に記載の方法。

【請求項66】

前記最小深度は１０である、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

コンピューティングシステムであって、
１つ以上のプロセッサと、
前記１つ以上のプロセッサによって実行される１つ以上のプログラムを記憶するメモリであって、前記１つ以上のプログラムは、
前記ゲノム位置における参照対立遺伝子の同定を取得することと、
前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の同定を取得することと、
前記ゲノム位置上にマッピングされる、前記試験対象から取得された液体生体試料に由来するシーケンシングデータセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のメチル化状態及びそれぞれの配列を取得することであって、前記シーケンシングデータセットは少なくとも１０＾６個の核酸断片配列を含む、取得することと、
（ｉ）前記ゲノム位置における前記参照対立遺伝子の前記同定と、（ｉｉ）前記それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列の前記それぞれの配列とを使用して、前記それぞれの複数の核酸断片配列のうちで前記ゲノム位置に前記参照対立遺伝子を有する各核酸断片配列を参照サブセットに割り当てることと、
（ｉ）前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の前記同定と、（ｉｉ）前記それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列の前記それぞれの配列とを使用して、前記それぞれの複数の核酸断片配列のうちで前記ゲノム位置に前記変異対立遺伝子を有する各核酸断片配列を変異サブセットに割り当てることと、
訓練された二値分類器に、少なくとも、（ｉ）前記変異サブセット中の各核酸断片配列の前記メチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標、及び（ｉｉ）前記変異サブセット中の核酸断片配列の数に対する前記参照サブセット中の核酸断片配列の数の指標を適用することであって、前記訓練された二値分類器は少なくとも１０個のパラメータを含み、それによって、前記訓練された二値分類器から、前記試験対象における前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての同定を取得する、適用することと、
を含む方法によって、試験対象のゲノム位置における変異をコールするための命令を含む、メモリと、
を備える、コンピューティングシステム。

【請求項68】

試験対象のゲノム位置における変異をコールするための１つ以上のプログラムを記憶する非一時的コンピュータ可読記憶媒体であって、前記１つ以上のプログラムは、コンピュータによって実行されるように構成され、前記１つ以上のプログラムは、
前記ゲノム位置における参照対立遺伝子の同定を取得し、
前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の同定を取得し、
前記ゲノム位置上にマッピングされる、前記試験対象から取得された液体生体試料に由来するシーケンシングデータセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のメチル化状態及びそれぞれの配列を取得し、前記シーケンシングデータセットは少なくとも１０＾６個の核酸断片配列を含み、
（ｉ）前記ゲノム位置における前記参照対立遺伝子の前記同定と、（ｉｉ）前記それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列の前記それぞれの配列とを使用して、前記それぞれの複数の核酸断片配列のうちで前記ゲノム位置に前記参照対立遺伝子を有する各核酸断片配列を参照サブセットに割り当て、
（ｉ）前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の前記同定と、（ｉｉ）前記それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列の前記それぞれの配列とを使用して、前記それぞれの複数の核酸断片配列のうちで前記ゲノム位置に前記変異対立遺伝子を有する各核酸断片配列を変異サブセットに割り当て、
訓練された二値分類器に、少なくとも、（ｉ）前記変異サブセット中の各核酸断片配列の前記メチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標、及び（ｉｉ）前記変異サブセット中の核酸断片配列の数に対する前記参照サブセット中の核酸断片配列の数の指標を適用し、前記訓練された二値分類器は少なくとも１０個のパラメータを含み、それによって、前記訓練された二値分類器から、前記試験対象における前記ゲノム位置における前記変異対立遺伝子の体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての同定を取得する、
ための命令を含む、非一時的コンピュータ可読記憶媒体。

【請求項69】

試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定するように分類器を訓練する方法であって、
Ａ）前記ゲノム位置における参照対立遺伝子の同定を取得することと、
Ｂ）複数の対象中のそれぞれの対象における複数のゲノム位置中のそれぞれのゲノム位置について、
ｉ）前記それぞれの対象の前記それぞれのゲノム位置における前記変異対立遺伝子に対する体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子の一方としての直交コールを取得することと、
ｉｉ）前記それぞれの対象の前記それぞれのゲノム位置における前記変異対立遺伝子の同定を取得することと、
ｉｉｉ）前記それぞれのゲノム位置上にマッピングされる、前記それぞれの対象から取得された液体生体試料に由来するシーケンシングデータセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のメチル化状態及びそれぞれの配列を取得することであって、前記シーケンシングデータセットは少なくとも１×１０^６個の核酸断片配列を含む、取得することと、
ｉｖ）（ａ）前記それぞれのゲノム位置における前記参照対立遺伝子の前記同定と、（ｂ）前記それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列の前記それぞれの配列とを使用して、前記それぞれの複数の核酸断片配列のうちで前記それぞれのゲノム位置に前記参照対立遺伝子を有する各核酸断片配列を参照サブセットに割り当てることと、
ｖ）（ａ）前記それぞれのゲノム位置における前記変異対立遺伝子の前記同定と、（ｂ）前記それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列の前記それぞれの配列とを使用して、前記それぞれの複数の核酸断片配列のうちで前記それぞれのゲノム位置に前記変異対立遺伝子を有する各核酸断片配列を変異サブセットに割り当てることと、
Ｃ）前記複数の対象中のそれぞれの対象における前記複数のゲノム位置中のそれぞれのゲノム位置について、少なくとも、（ｉ）前記それぞれのゲノム位置の前記それぞれの対象の前記変異サブセットにおける各核酸断片配列の前記メチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標、（ｉｉ）前記それぞれのゲノム位置の前記それぞれの対象の前記変異サブセットにおける核酸断片配列の数に対する前記参照サブセットにおける核酸断片配列の数の指標、及び（ｉｉｉ）前記それぞれの対象の前記それぞれのゲノム位置における前記変異対立遺伝子に対する体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子の一方としての前記直交コールを使用して、試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定するように前記分類器を訓練することであって、前記分類器は少なくとも１０個のパラメータを含む、訓練することと、
を含む手順を実施することと、
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が本明細書中に引用をもって援用された２０２１年８月５日出願の米国仮特許出願第６３／２２９７９７号の優先権を主張する２０２２年８月４日出願の米国非仮特許出願第１７／８１７４２１号の優先権の利益を主張する。

【0002】

本明細書は、核酸試料のシーケンシングを使用して対象におけるゲノム変異を判定することに関する技術を記載する。

【背景技術】

【0003】

癌の分子的基礎についての知識の増加及び次世代シーケンシング技術の急速な発展によって、癌の発生及び検出に関与する初期分子変化の研究が進んでいる。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などの大規模シーケンシング技術は、百万塩基当たり１米ドル未満のコストでシーケンシングを達成する機会をもたらしており、実際には百万塩基当たり１０米ドル未満のコストが実現されている。結果として、癌に関連する特定の遺伝的変化及びエピジェネティックな変化が、血漿、漿液、及び尿などの生体試料において見出されている。そのような変化は、診断バイオマーカーとして使用することができ、例えば、メチル化状態及び他のエピジェネティック修飾を癌の存在又は分類と相関させることができる。例えば、ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たし、異常なＤＮＡメチル化は、特定の癌状態を含む多くの疾患プロセスに関与している。

【0004】

したがって、メチル化シーケンシングを使用して取得された差次的メチル化領域の特異的パターン及び／又は対立遺伝子特異的メチル化パターンは、循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を使用する非侵襲的診断のための分子マーカーとして有用であり得る。漿液、血漿、尿、及び他の体液中に見出されるｃｆＤＮＡは、例えば、突然変異、メチル化、及びコピー数変異などの特定の腫瘍関連変化を含む、生体対象における疾患の循環像を提供する。癌状態を有する対象から取得された液体生検中のｃｆＤＮＡの分析は、様々な癌をスクリーニングする非侵襲的方法の魅力的な機会を提示する。

【0005】

更に、ゲノム全体にわたる複雑な生物学的パターン及び非線形性をモデル化及び推論するために深層学習を使用するアプローチは、癌のための臨床ツール及び分析ツールの開発に使用することができる。例えば、塩基配列を使用する深層学習戦略は、Ｎｅｕ－Ｓｏｍａｔｉｃ、ＤｅｅｐＶａｒｉａｎｔ、メチル化状態予測、及びヒストンのノイズ除去を含む、癌の様々な分類、回帰、推論及びクラスタリングの目的に使用することができる。深層学習アプローチは、部分的には、新たな大規模シーケンシング技術に伴うシーケンシングデータセットの量、サイズ、及び複雑度の急速かつ実質的な増加に対処することを目的とする。例えば、大量の高忠実度核酸配列の完全ゲノムへのアセンブリ及び組織化、並びにその中の潜在的な診断指標の分析及び同定は、計算的に困難な作業である。

【0006】

深層学習を核酸シーケンシングデータに適用することには、有望性及び可能性に加えて、回避すべき多数の注意点及び危険があり、これらにはとりわけ、一般集団における癌の有病率が低いことによる大きなクラス不均衡、学習されたパラメータの数に対する訓練例の数が不十分であること、及び生物学的ノイズ又はプロセス関連ノイズに過剰適合しやすいことが含まれる。同様に、癌予測は、オートエンコーダ、リカレント、トランスフォーマ、ワイドアンドディープ、埋め込み又は畳み込みネットワークなどの様々なアーキテクチャを使用する多数のモデリング技術（例えば、クラスタリング、外れ値、ノイズ除去又は分類）を使用してアプローチすることができるが、正確な予測のために問題を最適にフレーミングし、データ不均衡、ノイズ、オーバーフィッティング及びスパース性を最小化することは、慎重な考慮を必要とする極めて重要な課題である。

【0007】

例えば、訓練データセット中の試料の質及び／又は純度は、（例えば、複数の細胞及び／又は組織起源に由来し得る液体生検由来のｃｆＤＮＡを使用する場合に）様々なタイプの試料を含めることに起因して変化し、この結果、分類器性能が不十分となる可能性がある。したがって、分類器の正確な訓練のために、目的の状態（例えば、癌、非癌及び／又は癌サブタイプ）で確実に注釈を付けることができる十分な数の質の高い訓練試料を取得することが課題となっている。

【0008】

更に、癌患者における腫瘍特異的変異を有する核酸断片の同定は、腫瘍組織に由来する核酸断片と比較して健常な組織に由来する核酸断片の割合が高いため、依然として困難である。このような問題は、特に液体生検試料から取得されたｃｆＤＮＡ断片を使用する場合に発生するが、固形腫瘍におけるクローン不均一性に起因しても生じ得る。

【0009】

上記を考慮すると、当技術分野では、ｃｆＤＮＡから取得されたデータを含む核酸シーケンシングデータから遺伝情報を分析する方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0010】

本開示は、対象から取得された生体試料から、核酸データを使用してゲノム変異を体細胞変異又は生殖系列変異として同定するためのロバストな技術を提供することによって、背景技術で指摘した欠点に対処する。メチル化データと全ゲノムシーケンシングデータ及び／又は標的ゲノムシーケンシングデータとを組み合わせることで、従来のスクリーニング方法を超える更なる診断力が提供される。

【0011】

本開示では、データセットの分析に伴う上記の問題に対処するための技術的解決策（例えば、コンピューティングシステム、方法、及び非一時的コンピュータ可読記憶媒体）が提供される。

【0012】

以下は、本発明の態様のいくつかの基本的な理解を提供するために、本発明の概要を提示する。この概要は、本発明の広範な概要ではない。本発明の主要な／重要な要素を特定すること、又は本発明の範囲を明確にすることは意図されていない。その唯一の目的は、後に提示されるより詳細な説明の前置きとして、本発明の概念のいくつかを簡略化された形式で提示することである。

【0013】

本開示の一態様は、試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定する方法を提供する。本方法は、このゲノム位置における参照対立遺伝子の同定を取得すること、このゲノム位置における変異対立遺伝子の同定を取得すること、並びにこのゲノム位置上にマッピングされる、試験対象から取得された生体試料に由来するシーケンシングデータセット（例えば、少なくとも１０＾６個の核酸断片配列を含む）におけるそれぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のメチル化状態及びそれぞれの配列を取得することを含む。

【0014】

このゲノム位置における参照対立遺伝子の同定と、それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のそれぞれの配列とを使用して、それぞれの複数の核酸断片配列のうちでこのゲノム位置に参照対立遺伝子を有する各核酸断片配列を参照サブセットに割り当てる。更に、このゲノム位置における変異対立遺伝子の同定と、それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のそれぞれの配列とを使用して、それぞれの複数の核酸断片配列のうちでこのゲノム位置に変異対立遺伝子を有する各核酸断片配列を変異サブセットに割り当てる。

【0015】

（例えば、少なくとも１０個のパラメータを含む）訓練された二値分類器に、少なくとも、（ｉ）変異サブセット中の各核酸断片配列のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標、及び（ｉｉ）変異サブセット中の核酸断片配列の数に対する参照サブセット中の核酸断片配列の数の指標を適用し、それによって、訓練された二値分類器から、試験対象におけるこのゲノム位置における変異対立遺伝子の体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての同定を取得する。

【0016】

いくつかの実施形態では、本方法は、非一時的メモリに連結されたプロセッサを含むコンピュータシステムに参照ゲノムを入力することと、コンピュータシステムを使用して、それぞれの複数の核酸断片配列中のそれぞれの核酸断片配列が、それぞれの核酸断片配列を参照ゲノムにアライメントすることによってゲノム位置にマッピングされると決定することと、を更に含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、それぞれの複数の核酸断片配列中の第１の核酸断片配列は複数のＣｐＧ部位を有し、第１の核酸断片配列は複数のＣｐＧ部位全体にわたって対応するメチル化パターンを有し、第１の核酸断片配列のメチル化状態はｐ値であり、方法は、第１の核酸断片配列の対応するメチル化パターンを、それぞれの複数のＣｐＧ部位を各々が有する健常な非癌コホートデータセット中のそれらの核酸断片配列のメチル化パターンの対応する分布と比較することによって、第１の核酸断片配列のｐ値を少なくとも部分的に決定することを更に含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子が、訓練された二値分類器によって生殖系列変異対立遺伝子であると判定された場合、本方法は、試験対象における変異対立遺伝子を使用して、試験対象の癌リスクを判定することを更に含む。いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子が、訓練された二値分類器によって生殖系列変異対立遺伝子であると判定された場合、本方法は、試験対象における変異対立遺伝子を使用して、対象の民族性を予測することを更に含む。いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子が、訓練された二値分類器によって体細胞変異対立遺伝子であると判定された場合、本方法は、試験対象における変異対立遺伝子を使用して、対象の腫瘍画分を決定することを更に含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、訓練された二値分類器への適用は、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標を更に適用する。

【0020】

いくつかの実施形態では、訓練された二値分類器への適用は、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標を更に適用する。

【0021】

いくつかの実施形態では、訓練された二値分類器への適用は、参照サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標を更に適用する。

【0022】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子の同定の取得は、ゲノム位置について、鎖特異的塩基カウントセットを取得することであって、鎖特異的塩基カウントセットは、それぞれの複数の核酸断片配列中のそれぞれの核酸断片配列中のそれぞれの塩基の（ｉ）鎖配向及び（ｉｉ）ゲノム位置におけるそれぞれの塩基の同一性を決定することによって取得される、ゲノム位置における塩基のセット（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）中の各塩基の順方向及び逆方向の鎖特異的カウントを含み、その同一性がメチル化シトシン又は非メチル化シトシンの変換によって影響され得るそれぞれの複数の核酸断片配列中のゲノム位置における塩基は、鎖特異的塩基カウントセットに寄与しない、取得することを含む。鎖特異的塩基カウントセット及びシーケンシング誤差推定値を使用して、ゲノム位置の候補遺伝子型のセット中のそれぞれの候補遺伝子型について、それぞれの順鎖条件付き確率及びそれぞれの逆鎖条件付き確率が計算され、それによって、複数の順鎖条件付き確率及び複数の逆鎖条件付き確率が計算される。複数の尤度が計算され、複数の尤度中のそれぞれの尤度は、候補遺伝子型のセット中のそれぞれの候補遺伝子型の尤度であり、計算は、（ｉ）複数の順鎖条件付き確率中のそれぞれの候補遺伝子型のそれぞれの順鎖条件付き確率、（ｉｉ）複数の逆鎖条件付き確率中のそれぞれの候補遺伝子型のそれぞれの逆鎖条件付き確率、及び（ｉｉｉ）それぞれの候補遺伝子型についての遺伝子型の事前確率の組み合わせを使用する。複数の尤度を使用して、ゲノム位置における変異対立遺伝子を同定し、それによって、ゲノム位置における変異対立遺伝子の同定を取得する。

【0023】

いくつかの実施形態では、本方法は、複数のゲノム位置中の各ゲノム位置について本方法を繰り返し、それによって、試験対象の複数の変異を同定し、複数の変異中のそれぞれの変異について、それぞれの変異が体細胞変異であるか生殖系列変異であるかを同定することを更に含む。

【0024】

本開示の別の態様は、（例えば、少なくとも１０個のパラメータを含む）分類器を、試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定するように訓練する方法を提供する。この方法は、ゲノム位置における参照対立遺伝子の同定を取得すること、及び複数の対象中のそれぞれの対象における複数のゲノム位置中のそれぞれのゲノム位置について手順を実施することを含む。

【0025】

この手順は、ｉ）それぞれの対象のそれぞれのゲノム位置における変異対立遺伝子に対する体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子の一方としての直交コールを取得することと、ｉｉ）それぞれの対象のそれぞれのゲノム位置における変異対立遺伝子の同定を取得することと、ｉｉｉ）それぞれのゲノム位置にマッピングされる、それぞれの対象から取得された生体試料に由来する（例えば、少なくとも１０＾６個の核酸断片配列を含む）シーケンシングデータセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のメチル化状態及びそれぞれの配列を取得することと、ｉｖ）（ａ）それぞれのゲノム位置における参照対立遺伝子の同定と、（ｂ）それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のそれぞれの配列とを使用して、それぞれの複数の核酸断片配列のうちでそれぞれのゲノム位置に参照対立遺伝子を有する各核酸断片配列を参照サブセットに割り当てることと、ｖ）（ａ）それぞれのゲノム位置における変異対立遺伝子の同定と、（ｂ）それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のそれぞれの配列とを使用して、それぞれの複数の核酸断片配列のうちでそれぞれのゲノム位置に変異対立遺伝子を有する各核酸断片配列を変異サブセットに割り当てることと、を含む。

【0026】

複数の対象中のそれぞれの対象における複数のゲノム位置中のそれぞれのゲノム位置について、少なくとも、（ｉ）それぞれのゲノム位置のそれぞれの対象の変異サブセットにおける各核酸断片配列のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標、（ｉｉ）それぞれのゲノム位置のそれぞれの対象の変異サブセットにおける核酸断片配列の数に対する参照サブセットにおける核酸断片配列の数の指標、及び（ｉｉｉ）それぞれの対象のそれぞれのゲノム位置における変異対立遺伝子に対する体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子の一方としての直交コールが、試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定するように分類器を訓練するために使用される。

【0027】

本開示の別の態様は、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサによって実行される１つ以上のプログラムであって、上記で開示した方法のいずれかを単独で又は組み合わせて実行するための命令を含む１つ以上のプログラムを記憶するメモリと、を備えるコンピューティングシステムを提供する。

【0028】

本開示の更に別の態様は、コンピュータによって実行されるように構成された１つ以上のプログラムであって、上記で開示した方法のいずれかを単独で又は組み合わせて実行するための命令を含む１つ以上のプログラムを記憶する非一時的コンピュータ可読記憶媒体を提供する。

【0029】

添付の特許請求の範囲内のシステム、方法、及びデバイスの様々な実施形態は各々、いくつかの態様を有するが、それらのうちのいずれの態様も、本明細書で説明する望ましい属性を単独で担うわけではない。添付の特許請求の範囲を限定することなく、いくつかの顕著な特徴が本明細書で説明される。この説明を考慮すること、特に「発明を実施するための形態」と題するセクションを読むことにより、様々な実施形態の特徴がどのように使用されるかが理解されよう。

【0030】

参照による組み込み
本明細書に記載されている全ての特許及び刊行物は、各々の独立した特許及び刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0031】

本明細書で開示される実装形態は、添付の図面の図において、限定としてではなく例として図示される。同様の参照番号は、図面のいくつかの図を通して対応する部分を指す。

【図1】本開示のいくつかの実施形態によるコンピューティングデバイスを示す例示的なブロック図を示す。

【図2A】本開示のいくつかの実施形態による、試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定する方法の例示的なフローチャートを集合的に示し、破線のボックスは任意選択の工程を表す。

【図2B】本開示のいくつかの実施形態による、試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定する方法の例示的なフローチャートを集合的に示し、破線のボックスは任意選択の工程を表す。

【図3】本開示のいくつかの実施形態による、変異対立遺伝子をコールする方法の例示的なフローチャートを示す。

【図4A】本開示のいくつかの実施形態による、メチル化パターンと体細胞変異との間の相関の分析を示す。

【図4B】本開示のいくつかの実施形態による、メチル化パターンと体細胞変異との間の相関の分析を示す。

【図5A】本開示のいくつかの実施形態による方法の例示的な性能尺度を示す。

【図5B】本開示のいくつかの実施形態による方法の例示的な性能尺度を示す。

【図6A】本開示のいくつかの実施形態による方法の例示的な性能尺度を示す。

【図6B】本開示のいくつかの実施形態による方法の例示的な性能尺度を示す。

【図7】本開示のいくつかの実施形態による、シーケンシングのための核酸試料を調製するための方法のフローチャートを示す。

【図8】本開示のいくつかの実施形態による、配列リードを取得するためのプロセスのグラフ表示である。

【図9】本開示のいくつかの実施形態による、対象におけるメチル化情報を取得するための方法の例示的なフローチャートを示す。

【図10A】本開示のいくつかの実施形態による方法の例示的な性能尺度を示す。

【図10B】本開示のいくつかの実施形態による方法の例示的な性能尺度を示す。

【図11A】本開示のいくつかの実施形態による方法の例示的な性能尺度を示す。

【図11B】本開示のいくつかの実施形態による方法の例示的な性能尺度を示す。

【発明を実施するための形態】

【0032】

序論
上記のように、核酸シーケンシングデータを分析するための従来の方法は、癌関連バイオマーカーの正確な判定を提供しない場合がある。例えば、次世代シーケンシング技術及び機械学習の最近の発展は、シーケンシングデータの分析の進歩をもたらしたが、ｃｆＤＮＡを使用した遺伝子変異の正確な判定は、健常な組織などの他の組織に由来する核酸分子の存在によって妨げられる。従来の方法は、白血球又は組織生検などの患者適合正常（例えば、健常）対照試料を取得及びシーケンシングすること、及び液体生検試料で観察されたどの突然変異が腫瘍に由来する可能性があり、どの突然変異が正常対照に由来するかを判定するために比較分析を行うことを含み得る。

【0033】

適合正常対照が存在しない場合、ゲノム変化が生殖系列変異であるか体細胞変異であるかを判定することは、特にまれな変異又は注釈のない変異については困難であり得る。しかしながら、液体生検試料とは異なり、適合正常対照は、臨床現場では日常的に取得できない場合がある。例えば、本明細書に記載されるように、体液の使用は、これらの体液が非侵襲的な又は低侵襲的な方法によって取得されることから採取が容易であるため、臨床用途を有利に促進する。これは、侵襲的外科処置を使用することの多い生検などの固形組織試料に依存する方法とは対照的であり得る。したがって、本明細書に記載の改善された方法は、核酸シーケンシングデータを分析して、ｃｆＤＮＡ中の腫瘍特異的変異などの遺伝子変異を正確に同定及び分類することを含み得る。特に、改善された方法は、変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定することを含み得る。

【0034】

有利には、本開示は、変異対立遺伝子の体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての正確な判定を提供する方法及びシステムを提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及びシステムは、液体生検試料中の核酸断片の核酸シーケンシング及びメチル化シーケンシングを使用して、対象における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定するように訓練された二値分類器に入力するための複数の特徴を取得することを含む。変異対立遺伝子のゲノム位置にマッピングされる各核酸断片は、（例えば、核酸シーケンシングから取得された）対応する配列リードが変異対立遺伝子に対するサポートを有する場合、変異サブセットにビニングされてもよく、又は対応する配列リードが参照対立遺伝子に対するサポートを有する場合、参照サブセットにビニングされる。分類器への入力として使用される特徴は、少なくとも、変異サブセット中の核酸断片のカウント、参照サブセット中の核酸断片のカウント、並びに変異サブセット及び参照サブセット中の核酸断片にそれぞれ対応する、（例えば、メチル化シーケンシングから取得された）メチル化ベクトル全体にわたって計算されたｐ値の１つ以上の分布統計を含み得る。いくつかの実施形態では、特徴は、変異サブセットに割り当てられた核酸断片中のＣｐＧ部位のカウント、及び参照サブセットに割り当てられた核酸断片中のＣｐＧ部位のカウントを更に含む。これは、訓練された二値分類器からの、対象のゲノム位置における変異対立遺伝子が体細胞変異対立遺伝子であるか生殖系列変異対立遺伝子であるかを同定する出力をもたらし得る。

【0035】

体細胞変異又は生殖系列変異としての変異の正確な同定は、とりわけ、癌の診断、癌の病期の判定、癌の進行の監視、予後の判定、治療の処方又は投与、臨床試験への登録のマッチング又は推奨、更なる合併症又はリスクの発生の経時的な監視、及び治療の有効性の評価などの臨床用途に利点を提供し得る。

【0036】

例えば、体細胞変異は、（例えば、喫煙、飲酒などの）突然変異誘発プロセスを通じて対象の生涯にわたって蓄積され、癌の発症とより密接に関連する遺伝子突然変異を反映する。体細胞変異同定の治療的使用の潜在的な可能性には、癌の種類を解釈し、最も有効な治療選択肢を選択する医師の能力の向上が含まれ得る。したがって、遺伝的変異の体細胞変異又は生殖系列変異としての正確な同定は、医療提供者が患者のための適切な治療推奨を決定する能力に影響を与え得る。癌リスク、監視、及び治療に加えて、本明細書に記載の方法を使用した体細胞変異の同定は、（例えば、適合正常対照試料を使用して取得された腫瘍遺伝子変異量計算を確認又は補足するための）腫瘍画分推定にも使用することができる。更に、体細胞変異は、不確定性のクローン造血（ＣＨＩＰ）、心血管リスク、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨ）、及び他の疾患状態を含む他の疾患タイプを示す場合がある。

【0037】

対照的に、生殖系列変異は、癌の発生に関与しない場合があり、したがって、典型的には、癌の検出及び／又は同定に関して提供する情報が体細胞変異よりも少ない。それにもかかわらず、生殖系列変異は、注釈付き癌関連生殖系列変異（例えば、ＢＲＣＡ）の同定、又は遺伝情報を使用した多遺伝子リスクスコア（ＰＲＳ）の計算のいずれかを通じて、先行癌リスクに関する情報を提供することができる。更に、生殖系列変異の正確な同定は、データセット中の体細胞変異の富化などの分析処理、又は民族性予測などの他の用途に使用することができる。

【0038】

有利には、本明細書に開示される方法は、メチル化パターンを使用して核酸シーケンシングデータにおける変異コールの質を改善することによって、正常な（例えば、健常な）対照の不在下で体細胞変異を同定する上述の困難を克服することができる。本開示の方法は、異常なメチル化シグナルと体細胞変異の富化との同時発生の可能性を、機械学習アルゴリズムと組み合わせて活用することによって、核酸シーケンシングのみを使用する従来技術の変異分類方法を改善することができる。

【0039】

具体的には、核酸断片のメチル化シーケンシングに基づくｐ値及びＣｐＧ分布統計を、訓練された二値分類器のための入力ベクトルに追加することにより、核酸配列リードを使用して取得された参照断片カウント及び変異断片カウントを含むベースライン入力と比較して、分類器の性能を改善することができる。例えば、実施例６に報告するように、メチル化断片ｐ値及びＣｐＧカウントを参照断片カウント及び変異断片カウントのベースライン入力に加えた場合、ロジスティック回帰分類器及びニューラルネットワーク分類器の性能は、曲線下面積（ＡＵＣ）、陽性予測値（精度）、及び感度（再現率）に関して改善された。図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａ、及び図６Ｂに示すように、組織由来のシーケンシングデータセットを使用した場合、並びに図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１Ａ、及び図１１Ｂに示すように、ｃｆＤＮＡ由来のシーケンシングデータセットを使用した場合の両方で改善が認められた。

【0040】

したがって、記載される方法及びシステムは、変異を体細胞変異又は生殖系列変異として同定する精度が改善されることから、治療の割り当て方法及び／又は投与方法を改善することができる。

【0041】

更なる利点
患者の癌ゲノムにおけるゲノム変化の同定は、困難で計算上の要求の厳しい問題であり得る。例えば、変異対立遺伝子の同定及び分類を含む、臨床実施に有用な種々の予後メトリックの決定は、数億個から数十億個のシーケンシングされた核酸塩基の分析を使用する。この目的のために確立された典型的なバイオインフォマティクスパイプラインの例は、少なくとも５段階の分析：生の次世代シーケンシングデータの質の評価、崩壊した核酸断片配列の生成及び参照ゲノムに対するそのような配列のアライメント、アライメントされた配列データにおける構造変異の検出、同定された変異の注釈付け、並びにデータの視覚化を含むことができる。

【0042】

更に、本開示の方法は、メチル化シーケンシングを行うこと、各メチル化断片配列をそれぞれの核酸断片及びその対応する核酸配列に相関させること、複数の核酸断片を各変異位置でビニングすること、参照サポート又は代替サポートに基づいて核酸断片をファセット化すること、各変異位置でビニングされた複数の断片について、複数の特徴（参照断片カウント、代替断片カウント、メチル化状態ｐ値分布統計、及び／又はＣｐＧ部位カウント分布統計を含むが、これらに限定されない）を決定すること、並びに二値分類器に入力するための特徴ベクトルを生成することなどのプロセスを追加することができる。本開示のいくつかの態様では、本方法は、変異を体細胞変異又は生殖系列変異として同定するように、複数の訓練対象を含む訓練データセットに基づいて二値分類器を訓練することを更に含むことができる。これらの工程の各々は、それ自体の計算負荷が高い場合がある。

【0043】

例えば、単純なグローバルペアワイズ配列アライメントアルゴリズム及びローカルペアワイズ配列アライメントアルゴリズムの全体的な時間的及び空間的な計算複雑度は、本質的に二次的（すなわち、二次問題）であり得、比較される核酸配列のサイズ（ｎ及びｍ）の関数として急速に増大する。具体的には、これらの配列アライメントアルゴリズムの時間複雑度及び空間複雑度は、Ｏ（ｍｎ）として推定することができ、式中、Ｏは、アルゴリズムの漸近成長速度の上限であり、ｎは、第１の核酸配列中の塩基数であり、ｍは、第２の核酸配列中の塩基数である。ヒトゲノムが３０億個を超える塩基を含有することを考慮すると、これらのアライメントアルゴリズムは、特に、１反応当たり３０億個を超える配列リードを生成することができる次世代シーケンシング（ＮＧＳ）データを分析するために使用される場合、計算負荷が極めて高い可能性がある。

【0044】

これは、液体生体試料が多くの異なる生殖系列組織（例えば、健常組織）及び罹患組織（例えば、癌性組織）に由来する短いＤＮＡ断片の複雑な混合物を含有し得るため、液体生検アッセイの文脈で実施される場合に特に当てはまり得る。したがって、配列リードの細胞起源は未知であり得、複数のサブクローン集団を構成し得る癌性細胞に由来する配列シグナルは、対象の癌に関する関連情報を提供するために、生殖系列起源及び造血起源に由来するシグナルからコンピュータによりデコンボリューションされ得る。したがって、配列リードをヒトゲノムにアライメントするために使用される計算負荷の高いプロセスに加えて、特定の異常シグナル、例えばゲノム変化に対応する１つ以上の配列リードが、（ｉ）アーチファクトではなく、かつ（ｉｉ）対象における癌性源に由来するかどうかを判定する計算上の問題が存在し得る。これは、癌の初期病期－治療がおそらく最も有効であると共に、少量の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が生殖系列ＤＮＡ及び造血ＤＮＡによって希釈される－ではますます困難になり得る。

【0045】

有利には、本開示は、対象におけるｃｆＤＮＡからのゲノム変化（例えば、体細胞変異又は生殖細胞変異）のコンピュータによる解明を改善する様々なシステム及び方法を提供する。本明細書に記載される方法及びシステムは、例えば、変異の体細胞変異又は生殖系列変異としての同定の精度を改善することによって、コンピューティング技術における問題を解決することができる。上記で詳述したように、変異の分類は、その各々が大規模シーケンシングデータセット（例えば、少なくとも１×１０^６個の配列リード）を利用し、二次速度でシーケンシングデータセットのサイズと共に増加する時間的及び空間的な計算複雑度を伴う、バイオインフォマティクスパイプラインとして実施することができる複数のプロセスを含むことができる。処理時間及び処理空間を含む計算能力に対する大きな要件は、コンピュータ実装方法の効率を低下させる可能性がある。これらの制約を考慮すると、そのようなプロセスの改善は、変異同定のためのより効率的かつ正確な方法を提供することによって、コンピューティング技術に対する解決策を提供することができる。

【0046】

更に有利には、本開示は、より正確な変異同定のためにモデルの訓練及び使用を改善することによって、対象におけるｃｆＤＮＡからのゲノム変化（例えば、体細胞変異又は生殖系列変異）のコンピュータによる解明を改善する様々なシステム及び方法を提供する。機械学習モデルの複雑度は、時間複雑度（実行時間、又は所与の入力サイズｎのアルゴリズムの速度の尺度）、空間複雑度（空間要件、又は所与の入力サイズｎのアルゴリズムを実行するために必要とされる計算能力もしくはメモリの量）、あるいはこれらの両方を含むことができる。複雑度（及びその後の計算負荷）は、所与のモデルによる訓練及び予測の両方に適用することができる。

【0047】

いくつかの例では、計算複雑度は、実装、追加のアルゴリズムもしくは交差検証方法の組み込み、並びに／あるいは１つ以上のパラメータ（例えば、重み、及び／又はハイパーパラメータ）によって影響を受ける可能性がある。それにもかかわらず、計算複雑度は、一般に、入力サイズｎの関数として表すことができ、入力データは、インスタンスの数（例えば、訓練試料の数）、次元ｐ（例えば、特徴の数）、ツリーの数ｎ_{ｔｒｅｅｓ}（例えば、ツリーに基づく方法の場合）、サポートベクトルの数ｎ_ｓｖ（例えば、サポートベクトルに基づく方法の場合）、近傍の数ｋ（例えば、ｋ最近傍アルゴリズムの場合）、クラスの数ｃ、及び／又は層ｉにおけるニューロンの数ｎ_ｉ（例えば、ニューラルネットワークの場合）である。次に、入力サイズｎに関して、（例えば、Ｂｉｇ Ｏ表記法での）計算複雑度の近似値は、入力サイズが増加するにつれて実行時間及び／又は空間要件がどのように増加するかを示す。関数は、入力サイズの増加と比較してより遅いか又はより速い速度で複雑度を増加させることができる。計算複雑度の様々な近似値には、定数近似値（例えば、Ｏ（１））、対数近似値（例えば、Ｏ（ｌｏｇ ｎ））、線形近似値（例えば、Ｏ（ｎ））、対数線形近似値（例えば、Ｏ（ｎ ｌｏｇ ｎ））、二次近似値（例えば、Ｏ（ｎ^２）、多項式近似値（例えば、Ｏ（ｎ^ｃ）、指数関数的近似値（例えば、Ｏ（ｃ^ｎ）、及び／又は階乗近似値（例えば、Ｏ（ｎ！））が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例では、より単純な関数では、定数関数の場合のように、入力サイズが増加するにつれて、計算複雑度のレベルがより低くなるが、階乗関数などのより複雑な関数では、入力サイズのわずかな増加に応答して、複雑度が実質的に増加し得る。

【0048】

機械学習モデルの計算複雑度は、同様に、（例えば、Ｂｉｇ Ｏ表記法での）関数によって表すことができ、複雑度は、モデルのタイプ、１つ以上の入力又は次元のサイズ、用途（例えば、訓練及び／又は予測）、並びに／あるいは時間複雑度又は空間複雑度が評価されているかどうかに応じて異なり得る。例えば、決定木アルゴリズムにおける複雑度は、訓練についてはＯ（ｎ^２ｐ）として、予測についてはＯ（ｐ）として近似され、線形回帰アルゴリズムにおける複雑度は、訓練についてはＯ（ｐ^２ｎ＋ｐ^３）として、予測についてはＯ（ｐ）として近似される。ランダムフォレストアルゴリズムの場合、訓練複雑度は、Ｏ（ｎ^２ｐｎ_{ｔｒｅｅｓ}）として近似することができ、予測複雑度は、Ｏ（ｐｎ_{ｔｒｅｅｓ}）として近似される。勾配ブースティングアルゴリズムに関して、複雑度は、訓練についてはＯ（ｎｐｎ_{ｔｒｅｅｓ}）として、予測についてはＯ（ｐｎ_{ｔｒｅｅｓ}）として近似することができる。カーネル・サポート・ベクトル・マシンの場合、複雑度は、訓練についてはＯ（ｎ^２ｐ＋ｎ^３）、予測についてはＯ（ｎ_ｓｖｐ）として近似することができる。単純ベイズアルゴリズムの場合、複雑度は、訓練についてはＯ（ｎｐ）として、予測についてはＯ（ｐ）として表すことができ、ニューラルネットワークの場合、複雑度は、予測についてはＯ（ｐｎ_１＋ｎ_１ｎ_２＋．．．）として近似することができる。Ｋ最近傍アルゴリズムにおける複雑度は、時間についてはＯ（ｋｎｐ）、空間についてはＯ（ｎｐ）として近似することができる。ロジスティック回帰アルゴリズムの場合、複雑度は、時間についてはＯ（ｎｐ）、空間についてはＯ（ｐ）として近似することができる。ロジスティック回帰アルゴリズムの場合、複雑度は、時間についてはＯ（ｎｐ）、空間についてはＯ（ｐ）として近似することができる。

【0049】

上述したように、機械学習モデルの場合、計算複雑度は、入力、特徴、及び／又はクラスサイズを増加させるためのモデル（例えば、分類器）、並びにモデルアーキテクチャの変化のスケーラビリティ、したがって全体的な有効性及び有用性を規定し得る。大規模シーケンシング技術の文脈では、シーケンシングデータセット（例えば、ｃｆＤＮＡ試料から取得された核酸シーケンシングデータ及びメチル化シーケンシングデータ）に対して実行される関数の計算複雑度は、多くの既存のシステムの能力に負担をかけ得る。更に、入力特徴（例えば、参照サブセット及び代替サブセットについて層別化された、参照カウント及び代替カウント、ｐ値分布統計値（例えば、平均、最小、最大、中央値、標準偏差）、及び／又はＣｐＧ部位分布統計値（例えば、平均、最小、最大、中央値、標準偏差））の数、並びに／あるいはインスタンスの数（例えば、訓練対象、試験対象、変異対立遺伝子の数、及び／又はゲノム位置の数）が、下流の用途及び可能性の拡大と共に増加するにつれて、任意の所与の分類モデルの計算複雑度は、それぞれのシステムの仕様によって提供される時間的能力及び空間的能力を急速に圧倒し得る。

【0050】

一般に（及び本明細書で定義されるように）、パラメータ（例えば、重み及び／又はハイパーパラメータ）は、モデルの１つ以上の入力、出力、又は関数を変化させる係数である。例えば、パラメータの値を使用して、特徴などのモデルへの入力の影響をアップ重み付け又はダウン重み付けすることができる。したがって、特徴は、ロジスティック回帰モデル、ＳＶＭモデル、又はナイーブベイズモデルなどのパラメータと関連付けられ得る。パラメータの値は、代替的又は追加的に、ニューラルネットワーク内のノード（例えば、ノードが入力から出力への変換を定義する１つ以上の活性化関数を含む）、クラス、又は（例えば、試料の）インスタンスの影響をアップ重み付け又はダウン重み付けするために使用することができる。特定の入力、出力、関数、又は特徴へのパラメータの割り当ては、所与のモデルに対する任意の１つのパラダイムであり得るが、最適な性能のために任意の適切なモデルアーキテクチャにおいて使用され得る。それにもかかわらず、モデルの入力、出力、関数、又は特徴に関連付けられた係数への参照は、機械学習アルゴリズムの計算複雑度の文脈などにおいて、それらの数、性能、又は最適化の指標として同様に使用することができる。

【0051】

したがって、最小入力サイズ（例えば、少なくとも１×１０^６個の配列リード）及び／又は最小数のパラメータ（例えば、少なくとも１０個、少なくとも１００個、又は少なくとも１０００個のパラメータ）を有する機械学習モデルは、モデル内の対応する数の関連する入力、出力、関数、又は特徴を指すことができる。そのようなモデルの計算複雑度は、本開示の方法（例えば、対象におけるｃｆＤＮＡからの体細胞変異又は生殖系列変異の同定）のためのモデルが暗算では使用され得ず、方法が本質的に計算上の問題であり得るように、比例的に増加され得る。

【0052】

ここで、添付図面に実施例が示される実施形態への詳細な参照が行われる。以下の詳細な説明には、本開示の十分な理解を提供するために多くの具体的な詳細が記載されている。しかしながら、本開示がこれらの具体的な詳細なしでも実施され得ることは、当業者には明らかであろう。他の例では、周知の方法、手順、構成要素、回路、及びネットワークは、実施形態の態様を不必要に不明瞭にしないよう詳細には説明されていない。

【0053】

定義
本明細書で使用される場合、用語「約」又は「およそ」は、当業者によって測定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち測定システムの制約にある程度左右される。例えば、いくつかの実施形態では、「約」は、当技術分野の慣行に従って、１以内又は１を超える標準偏差を意味する。いくつかの実施形態では、「約」は、所与の値の±２０％、±１０％、±５％、又は±１％の範囲を意味する。いくつかの実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、ある値と同じ桁内、５倍以内、又は２倍以内を意味する。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値に対して許容可能な誤差範囲内を意味すると想定され得る。「約」という用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有し得る。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、±１０％を指す。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、±５％を指す。

【0054】

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上明確に指示されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載値又は介在値は、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従って、本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外した範囲も本発明に含まれる。例えば、本明細書で使用される場合、ある範囲で使用される「間」という用語は、列挙された端点を含むことが意図される。例えば、「ＸとＹとの間」の数は、Ｘ、Ｙ、又はＸからＹまでの任意の値であり得る。

【0055】

本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子」は、ゲノム位置における１つ以上のヌクレオチドの特定の配列を指す。一倍体生物の場合、対象は一般に、全てのゲノム位置に１つの対立遺伝子を有する。二倍体生物の場合、対象は一般に、全てのゲノム位置に２つの対立遺伝子を有する。

【0056】

本明細書で使用される場合、用語「アッセイ」は、物質、例えば核酸、タンパク質、細胞、組織、又は器官の特性を決定するための技術を指す。アッセイ（例えば、第１のアッセイ又は第２のアッセイ）は、試料中の核酸のコピー数変異、試料中の核酸のメチル化状態、試料中の核酸の断片サイズ分布、試料中の核酸の突然変異状態、又は試料中の核酸の断片化パターンを決定するための技術を含むことができる。任意のアッセイを使用して、本明細書に記載の核酸の特性のいずれかを検出することができる。核酸の特性には、配列、ゲノム同一性、コピー数、１つ以上のヌクレオチド位置におけるメチル化状態、核酸のサイズ、１つ以上のヌクレオチド位置における核酸における突然変異の有無、及び核酸の断片化パターン（例えば、核酸が断片化しているヌクレオチド位置）が含まれ得る。アッセイ又は方法は、特定の感度及び／又は特異性を有することができ、診断ツールとしてのそれらの相対的有用性は、ＲＯＣ－ＡＵＣ統計を使用して測定することができる。

【0057】

本明細書で使用される場合、用語「生体試料」又は「試料」は、対象に関連する生物学的状態を反映し得る、対象（すなわち、ヒトだけでなく、任意の種類の生物）から採取された任意の試料を指す。生体試料の例としては、対象の血液、全血、血漿、漿液、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹水が挙げられるが、これらに限定されない。生体試料は、生きている対象又は死んでいる対象に由来する任意の組織又は材料を含み得る。生体試料は、無細胞試料であり得、かつ／又は無細胞ＤＮＡを含み得る。生体試料は、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はその断片を含み得る。「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）又はそれらの任意のハイブリッドもしくは断片を指すことができる。試料中の核酸は、無細胞核酸であり得る。試料は、液体試料又は固体試料（例えば、細胞試料又は組織試料）であり得る。生体試料は、体液、例えば、血液、血漿、漿液、尿、膣液、（例えば、陰嚢の）水腫からの液体、膣洗浄流体、胸水、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液、乳頭からの排出流体、身体の異なる部分からの吸引流体（例えば、甲状腺、乳房）などであり得る。生体試料は糞便試料であり得る。様々な実施形態では、無細胞ＤＮＡが富化された生体試料（例えば、遠心分離プロトコルを介して取得された血漿試料）中のＤＮＡの大部分は、無細胞であり得る（例えば、ＤＮＡの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％超が無細胞であり得る）。生体試料は、組織又は細胞構造を物理的に破壊するように処理され得（例えば、遠心分離及び／又は細胞溶解）、したがって、分析のための試料を調製するために使用され得る酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などを更に含有し得る溶液中に、細胞内成分を放出する。生体試料は、侵襲的（例えば、外科的手段）又は非侵襲的（例えば、採血、スワブ、又は排出された試料の採取）に対象から取得することができる。

【0058】

本明細書で使用される場合、「癌」又は「腫瘍」という用語は、塊の増殖が正常組織の増殖を上回り、正常組織の増殖と協調しない異常な組織塊を指す。癌又は腫瘍は、以下の特徴に応じて「良性」又は「悪性」と定義することができる：形態及び機能性を含む細胞分化の程度、増殖速度、局所侵襲及び転移。「良性」腫瘍は、高分化型であり得、悪性腫瘍よりも特徴的に増殖が遅く、原発部位に局在したままであり得る。更に、場合によっては、良性腫瘍は、遠隔部位に浸潤、侵襲又は転移する能力を有さない。「悪性」腫瘍は、低分化型（退形成）であり得、周囲組織の進行性浸潤、侵襲及び破壊を伴う特徴的な急速な増殖を有する。更に、悪性腫瘍は、遠隔部位に転移する能力を有し得る。

【0059】

本明細書で互換的に使用される場合、「癌負荷」、「腫瘍負荷」、「癌量」、「腫瘍量」又は「腫瘍画分」という用語は、試験試料中の腫瘍由来核酸の濃度又は存在を指す。したがって、用語「癌負荷」、「腫瘍負荷」、「癌量」、「腫瘍量」、及び「腫瘍画分」は、生体試料中の細胞源画分の非限定的な例である。いくつかの実施形態では、腫瘍画分は、細胞源画分の特定のバージョンである。

【0060】

本明細書に開示される場合、「無細胞核酸」、「無細胞ＤＮＡ」、及び「ｃｆＤＮＡ」という用語は、対象の体内（例えば、血流などの体液中）を循環し、１つ以上の健常細胞及び／又は１つ以上の癌細胞に由来する核酸断片を互換的に指す。無細胞ＤＮＡは、対象の血液、全血、血漿、漿液、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹水などの体液から回収することができる。無細胞核酸は、循環核酸と互換的に使用される。無細胞核酸の例としては、ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

本明細書に開示される場合、用語「循環腫瘍ＤＮＡ」又は「ｃｔＤＮＡ」は、死につつある細胞のアポトーシス又は壊死などの生物学的プロセスの結果として対象の血流中に放出され得るか、あるいは生存腫瘍細胞によって能動的に放出され得る、腫瘍又は他の種類の癌の細胞などの異常な組織に由来する核酸断片を指す。

【0062】

本明細書で使用される場合、「分類」という用語は、試料の特定の特性に関連する任意の数又は他の文字を指す。例えば、「＋」記号（又は「陽性」という単語）は、試料が欠失又は増幅を有すると分類されることを示してもよい。別の例では、「分類」という用語は、対象及び／又は試料における腫瘍組織の量、対象及び／又は試料における腫瘍のサイズ、対象における腫瘍の病期、対象及び／又は試料における腫瘍負荷、並びに対象における腫瘍転移の存在を指す。いくつかの実施形態では、分類は、二値（例えば．、陽性又は陰性、体細胞変異又は生殖系列変異など）であるか、あるいはより多くのレベルの分類（例えば、１～１０又は０～１のスケール）を有する。いくつかの実施形態では、「カットオフ」及び「閾値」という用語は、動作で使用される所定の数を指す。一例では、カットオフサイズは、それを超えると断片が除外されるサイズを指す。いくつかの実施形態では、閾値は、特定の分類が適用される値より上又は下の値である。これらの用語のいずれも、これらの文脈のいずれにおいても使用することができる。

【0063】

本明細書で使用される場合、用語「対照試料」、「参照試料」、及び「正常試料」は、特定の状態を有さないか、そうでなければ健常対象由来の試料を指す。一例では、本明細書に開示する方法は、腫瘍を有する対象に対して実施することができ、参照試料は、対象の健常な組織から採取された試料である。参照試料は、対象から、又はデータベースから取得することができる。参照試料は、例えば、対象由来の試料のシーケンシングから取得された配列リードをマッピングするために使用される参照ゲノムであり得る。参照ゲノムは、生体試料及び構成試料からの配列リードをアライメントして比較することができる、一倍体ゲノム又は二倍体ゲノムを指すことができる。構成試料の例は、対象から取得された白血球のＤＮＡであり得る。一倍体ゲノムの場合、各遺伝子座に１つのヌクレオチドが存在し得る。二倍体ゲノムの場合、ヘテロ接合遺伝子座を同定することができ、各ヘテロ接合遺伝子座は、２つの対立遺伝子を有することができ、いずれかの対立遺伝子が遺伝子座へのアライメントのための適合を可能にすることができる。

【0064】

本明細書で使用される場合、「ゲノム位置」又は「遺伝子座」という用語は、ゲノム内の、例えば特定の染色体上の位置（例えば、部位）を指す。いくつかの実施形態では、ゲノム位置（例えば、遺伝子座）は、ゲノム内の特定の染色体上の単一のヌクレオチドの位置を指す。いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、ゲノム内のヌクレオチド位置の群を指す。いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、１つ以上のゲノム座標及び／又は（例えば、参照配列又はゲノム内の）ゲノム座標の範囲を指す。例えば、いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、ゲノム領域を示すため、又は同定するために使用される。いくつかの例では、ゲノム位置は、癌ゲノム内の連続するヌクレオチドの突然変異（例えば、置換、挿入、欠失、逆位、又は転座）によって特徴付けられる。いくつかの例では、ゲノム位置は、遺伝子、サブ遺伝子構造（例えば、調節エレメント、エクソン、イントロン、もしくはそれらの組み合わせ）、又は染色体の所定の範囲である。正常な哺乳動物細胞は二倍体ゲノムを有するので、正常な哺乳動物ゲノム（例えば、ヒトゲノム）は一般に、ゲノム中の各ゲノム位置（例えば、遺伝子座）の２つのコピー、又は常染色体上に位置する各ゲノム位置（例えば、遺伝子座）の少なくとも２つのコピー、例えば、母系常染色体上の１つのコピー及び父系常染色体上の１つのコピーを有する。

【0065】

本明細書に開示される場合、「ゲノム領域」又は「染色体領域」という用語は、ゲノムの任意の連続する又は不連続な部分を指す。ゲノム領域はまた、例えば、ビン、区分、ゲノム部分、参照ゲノムの一部、染色体の一部などと称され得る。いくつかの実施形態では、ゲノム領域は、ゲノム配列の特定の長さに基づく。例えば、いくつかの実施形態では、方法が、複数のゲノム領域に対する複数のマッピングされた配列リードの分析を含むことができる。ゲノム領域は、ほぼ同じ長さであっても、異なる長さであってもよい。いくつかの実施形態では、異なる長さのゲノム領域が調整又は重み付けされる。いくつかの実施形態は、ゲノム領域は、約３塩基対（ｂｐ）～約１００ｂｐ、約０．１キロベース（ｋｂ）～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約５００ｋｂ、約２０ｋｂ～約４００ｋｂ、約３０ｋｂ～約３００ｋｂ、約４０ｋｂ～約２００ｋｂ、及び時には約５０ｋｂ～約１００ｋｂである。いくつかの実施形態では、ゲノム領域は、約１００ｋｂ～約２００ｋｂである。ゲノム領域は、連続した一連の配列に限定されない。したがって、ゲノム領域は、連続した配列及び／又は不連続な配列から構成され得る。ゲノム領域は、単一の染色体に限定されない。いくつかの実施形態では、ゲノム領域は、１つの染色体の全てもしくは一部、又は２つ以上の染色体の全てもしくは一部を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム領域は、１つ、２つ、又はそれ以上の染色体全体にまたがっていてもよい。更に、ゲノム領域は、複数の染色体の接合部分又は分離部分にまたがっていてもよい。

【0066】

本明細書で使用される場合、「中心傾向の尺度」という用語は、値の分布の中心値又は代表値を指す。中心傾向の尺度の非限定的な例としては、値の分布の算術平均、加重平均、ミッドレンジ、ミッドヒンジ、三平均、幾何平均、幾何中央値、ウィンザー化平均、中央値、及び最頻値が挙げられる。

【0067】

本明細書で使用される場合、「メチル化」という用語は、シトシン塩基のピリミジン環上の水素原子がメチル基に変換されて５－メチルシトシンを形成する、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の修飾を指す。特に、メチル化は、本明細書では「ＣｐＧ部位」と呼ばれるシトシン及びグアニンのジヌクレオチドで起こる傾向がある。他の例では、メチル化は、ＣｐＧ部位の一部ではないシトシンで、又はシトシンではない別のヌクレオチドで起こり得る。しかしながら、これらはよりまれにしか発生しない。本開示では、メチル化は、明確にするためにＣｐＧ部位を参照して論じられる。異常なｃｆＤＮＡメチル化は、その両方が癌状態を示し得る過剰メチル化又は低メチル化として同定することができる。当技術分野で周知のように、ＤＮＡメチル化異常（健常対照と比較して）は、癌に寄与し得る多様な影響を引き起こし得る。

【0068】

異常にメチル化されたｃｆＤＮＡ断片の同定には様々な課題が生じる。第１に、いくつかの例では、対象のｃｆＤＮＡが異常にメチル化されていると判定することは、対照対象の群と比較して重みを保持し、その結果、対照群の数が少ない場合、この小さな対照群については判定の信頼性が失われる。加えて、対照対象の群の間でメチル化状態が異なる場合があり、対象のｃｆＤＮＡが異常にメチル化されていると判定する際にこれを説明することが困難であり得る。別の点では、いくつかの例において、ＣｐＧ部位におけるシトシンのメチル化は、その後のＣｐＧ部位におけるメチル化に因果的に影響を及ぼす。

【0069】

本明細書に記載の原理は、非シトシンメチル化を含む非ＣｐＧ文脈でのメチル化の検出にも等しく適用可能である。更に、メチル化状態ベクトルは、一般的に、メチル化が生じているか又は生じていない部位のベクトルである要素を、（これらの部位が特にＣｐＧ部位でない場合であっても）含み得る。その置換により、本明細書中に記載されるプロセスの残りの部分は同じであり、したがって、本明細書中に記載される本発明の概念は、それらの他の形態のメチル化に適用可能である。

【0070】

いくつかの実施形態では、核酸断片のメチル化レベルは、ベータ値及び／又はＭ値を使用して提供され、これらは両方とも、所与の１つ以上のＣｐＧ部位における差次的メチル化の尺度を提供する。例えば、ベータ値は、（例えば、所与のＣｐＧ部位の）メチル化対立遺伝子と全ての（メチル化及び非メチル化）対立遺伝子の和との間の強度の比として定義される。強度は、メチル化アッセイ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａメチル化アッセイ）においてメチル化プローブ及び非メチル化プローブを使用して、それぞれのＣｐＧ部位を調べることによって決定することができる。ベータ値統計は、０と１との間、又は０％と１００％との間の数をもたらす。理想的な条件下では、値０は、試料中のＣｐＧ部位の全てのコピーが全くメチル化されなかった（メチル化分子が測定されなかった）ことを示し、値１は、部位の全てのコピーがメチル化されたことを示す。Ｍ値は、（例えば、所与のＣｐＧ部位の）メチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子との間の強度のｌｏｇ２比として定義される。Ｍ値推定に使用される強度は、メチル化アッセイ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａメチル化アッセイ）においてメチル化プローブ及び非メチル化プローブを使用して、それぞれのＣｐＧ部位を調べることによって決定することができる。０に近いＭ値は、メチル化プローブと非メチル化プローブとの間の強度の類似を示し、これは一般に、ＣｐＧ部位が約半分メチル化されていることを意味する。正のＭ値は一般に、より多数の断片が非メチル化よりもメチル化されていることを意味し、負のＭ値はその逆を意味する（より多数の断片がメチル化よりも非メチル化されている）。いくつかの実施形態では、強度データは、（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ又はいくつかの他の外部正規化アルゴリズムによって）ベータ値推定又はＭ値推定の前に正規化される。ベータ値及びＭ値に関する更なる詳細は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｕ他、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｂｅｔａ－ｖａｌｕｅ ａｎｄ Ｍ－ｖａｌｕｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ，」ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１０，１１：５８７に提供されている。

【0071】

本明細書で使用される場合、各ゲノム部位（例えば、ＣｐＧ部位、その５’→３’方向に沿った塩基の直鎖状配列においてシトシンヌクレオチドの後にグアニンヌクレオチドが続くＤＮＡの領域）の「メチル化指数」という用語は、その部位をカバーするリードの総数に対する、その部位でメチル化を示す配列リードの割合を指す。領域の「メチル化密度」は、メチル化を示す領域内の部位におけるリードの数を、その領域内の部位をカバーするリードの総数で割ったものであり得る。これらの部位は特定の特徴を有することができる（例えば、これらの部位はＣｐＧ部位であることができる）。領域の「ＣｐＧメチル化密度」は、ＣｐＧメチル化を示すリードの数を、領域内のＣｐＧ部位（例えば、特定のＣｐＧ部位、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧ部位、又はより大きな領域）をカバーするリードの総数で割ったものであり得る。例えば、ヒトゲノム中の各１００ｋｂビンのメチル化密度は、１００ｋｂ領域にマッピングされた配列リードによってカバーされる全てのＣｐＧ部位の割合として、ＣｐＧ部位の未変換シトシン（メチル化シトシンに対応し得る）の総数から決定され得る。いくつかの実施形態では、この分析は、他のビンサイズ、例えば、５０ｋｂ又は１Ｍｂなどに対して行われる。いくつかの実施形態では、領域は、ゲノム全体又は染色体又は染色体の一部（例えば．、染色体アーム）である。ＣｐＧ部位のメチル化指数は、領域がそのＣｐＧ部位を含む場合、その領域のメチル化密度と同じであり得る。「メチル化シトシンの割合」は、その領域におけるＣｐＧ文脈外のシトシンを含む、分析されたシトシン残基の総数にわたってメチル化されている（例えば、亜硫酸水素塩変換後に変換されていない）ことが示されているシトシン部位「Ｃ」の数を指すことができる。メチル化指数、メチル化密度及びメチル化シトシンの割合は、「メチル化レベル」の例である。

【0072】

本明細書で使用される場合、用語「メチル化パターン」又は「メチル化状態ベクトル」は、１つ以上のＣｐＧ部位のメチル化状態の配列を指す。メチル化状態には、メチル化状態（例えば、「Ｍ」で表される）及び非メチル化状態（例えば、「Ｕ」で表される）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、５つのＣｐＧ部位にまたがるメチル化パターンは、「ＭＭＭＭＭ」又は「ＵＵＵＵＵ」と表すことができ、各離散記号は、単一のＣｐＧ部位でのメチル化状態を表す。メチル化パターンは、参照ゲノム中の特定のゲノム位置及び／又は特定の１つ以上のＣｐＧ部位に対応してもしなくてもよい。

【0073】

本明細書で互換的に使用される場合、「ノード」、「ニューロン」、「ユニット」、「隠れニューロン」、「隠れユニット」などの用語は、入力を受け入れ、活性化関数及び１つ以上のパラメータ（例えば、重み及び／又はハイパーパラメータ）を介して出力を提供するニューラルネットワークのユニットを指す。例えば、ノードは、前の層から１つ以上の入力を受け入れ、後続の層のための入力として機能する出力を提供することができる。いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークは１つの出力ノードを含む。いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークは複数の出力ノードを含む。一般に、出力は、癌状態などの目的の状態の確率もしくは尤度、二値判定（例えば、存在もしくは不在、陽性結果もしくは陰性結果、体細胞変異もしくは生殖系列変異の同定など）、及び／又はラベル（例えば、分類）などの予測値である。単一クラス分類モデルの場合、出力は、条件（例えば、ラベル又はクラス）を有する（例えば、生体試料及び／又は対象の）入力データセットの尤度とすることができる。マルチクラス分類モデルの場合、複数の予測値を生成することができ、各予測値は、目的の各状態に対する入力データセットの尤度を示す。いくつかの実施形態では、ノードは、活性化関数に基づいて決定される、ニューラルネットワークの出力に寄与するパラメータに関連付けられる。いくつかの実施形態では、ノードは、任意のパラメータ（例えば、ランダム化された重み）を用いて初期化される。いくつかの代替的な実施形態では、ノードは、所定のパラメータセットで初期化される。

【0074】

本明細書で使用される場合、「正規化する」という用語は、比較目的のために、値又は値のセットを共通の基準フレームに変換することを指す。例えば、診断ｃｔＤＮＡレベルがベースラインｃｔＤＮＡレベルで「正規化」される場合、診断ｃｔＤＮＡレベルをベースラインｃｔＤＮＡレベルと比較して、診断ｃｔＤＮＡレベルがベースラインｃｔＤＮＡレベルと異なる量を決定してもよい。

【0075】

本明細書で互換的に使用される場合、「核酸」及び「核酸分子」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、リボ核酸（ＲＮＡ、例えば、メッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、胎児又は胎盤によって高度に発現されるＲＮＡなど）、並びに／あるいはＤＮＡ類似体又はＲＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体及び／又は非天然骨格などを含む）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド及びポリアミド核酸（ＰＮＡ）などの任意の組成物形態の核酸を指し、これらは全て一本鎖又は二本鎖形態であり得る。他に限定されない限り、核酸は、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含み得、そのいくつかは、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で機能し得る。核酸は、本明細書中のプロセスを実施するために有用な任意の形態であり得る（例えば、線状、環状、スーパーコイル状、一本鎖、二本鎖など）。いくつかの実施形態における核酸は、単一の染色体又はその断片に由来し得る（例えば、核酸試料は、二倍体生物から取得された試料の１つの染色体に由来し得る）。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレオソーム、ヌクレオソームの断片もしくは部分又はヌクレオソーム様構造を含む。核酸は、タンパク質（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質など）を含む場合がある。本明細書に記載のプロセスによって分析される核酸は、実質的に単離されており、タンパク質又は他の分子と実質的に会合していない場合がある。核酸はまた、一本鎖ポリヌクレオチド（「センス」又は「アンチセンス」、「プラス」鎖又は「マイナス」鎖、「順方向」リーディングフレーム又は「逆方向」リーディングフレーム）及び二本鎖ポリヌクレオチドから合成、複製又は増幅されたＲＮＡ又はＤＮＡの誘導体、変異体及び類似体を含む。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、及びデオキシチミジンが含まれる。ＲＮＡの場合、塩基シトシンはウラシルで置換され、糖２’位はヒドロキシル部分を含む。対象から取得された核酸を鋳型として用いて核酸を調製してもよい。

【0076】

本明細書で使用される場合、用語「核酸断片配列」又は「核酸断片」は、少なくとも３つの連続したヌクレオチドのポリヌクレオチド配列の全て又は一部を指す。生体試料中に見出される核酸分子のシーケンシングの文脈において、用語「核酸断片配列」は、生体試料中に見出される核酸断片（例えば、核酸分子断片）の配列又はその表現（例えば、配列の電子表現）を指す。核酸断片の配列を決定するために、固有の核酸断片（例えば、無細胞核酸分子）からのシーケンシングデータ（例えば、全ゲノムシーケンシング、標的シーケンシング、全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシング、標的メチル化シーケンシングなどからの生の又は補正された配列リード）が使用される。したがって、実際には元の核酸断片のＰＣＲ複製物のシーケンシングから取得することができるそのような配列リードは、その核酸断片配列を「表す」か又は「サポートする」。各々が生体試料中の特定の核酸断片を表すか又はサポートする複数の配列リードが存在してもよい（例えば、ＰＣＲ複製物）が、特定の核酸断片について１つの核酸断片配列が存在してもよい。いくつかの実施形態では、元の核酸断片について生成された重複配列リードは、組み合わせられるか、又は除去される（例えば、単一配列、例えば、核酸断片配列に折り畳まれる）。したがって、各々が特定の遺伝子座を包含する試料中の核酸断片の集団に関連するメトリック（例えば、遺伝子座の存在量値又は断片長の分布の特徴に基づくメトリック）を決定する場合、サポートする配列リード（例えば、集団中の核酸断片のＰＣＲ複製物から生成され得る）ではなく、核酸断片の集団の核酸断片配列を使用してメトリックを決定することができる。これは、このような実施形態では、配列の１つのコピーが、元の（例えば、固有の）核酸断片（例えば、固有の核酸分子断片）を表すために使用されるからである。核酸断片の集団の核酸断片配列は、いくつかの同一の配列を含み得、その各々は、同じ元の核酸断片の複製ではなく、異なる元の核酸断片を表すことに留意されたい。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、核酸断片と称される。

【0077】

本明細書で使用される場合、「陽性予測値」、「ＰＰＶ」、又は「精度」という用語は、出力（例えば、変異分類）が、予測アルゴリズムによって正しくコールされる尤度を指す。ＰＰＶは、（真陽性の数）／（偽陽性の数＋真陽性の数）として表すことができる。

【0078】

本明細書で使用される場合、用語「参照対立遺伝子」は、種の集団内のそのゲノム位置で表される優勢な対立遺伝子（例えば、「野生型」配列）、又は種の参照ゲノム内の事前定義された対立遺伝子のいずれかである、ゲノム位置における１つ以上のヌクレオチドの配列を指す。

【0079】

本明細書に開示される場合、「参照ゲノム」又は「ゲノム」という用語は、対象由来の同定された配列を参照するために使用され得る任意の生物又はウイルスの、部分的であるか完全であるかにかかわらず、任意の既知の、シーケンシングされた、又は特徴付けられたゲノムを指す。ヒト対象並びに多くの他の生物に使用される例示的な参照ゲノムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（「ＮＣＢＩ」）又はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（ＵＣＳＣ）によって提供されるオンラインゲノムブラウザで提供される。「ゲノム」は、核酸配列で表される、生物又はウイルスの完全な遺伝情報を指す。本明細書で使用される場合、参照配列又は参照ゲノムは、しばしば、個体又は複数の個体由来のアセンブルされたゲノム配列又は部分的にアセンブルされたゲノム配列である。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、１つ以上のヒト個体由来のアセンブルされた又は部分的にアセンブルされたゲノム配列である。参照ゲノムは、種の遺伝子セットの代表的な例とみなすことができる。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、染色体に割り当てられた配列を含む。例示的なヒト参照ゲノムとしては、ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ ３４（ＵＣＳＣ相当物：ｈｇ１６）、ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ ３５（ＵＣＳＣ相当物：ｈｇ１７）、ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ ３６．１（ＵＣＳＣ相当物：ｈｇ１８）、ＧＲＣｈ３７（ＵＣＳＣ相当物：ｈｇ１９）、及びＧＲＣｈ３８（ＵＣＳＣ相当物：ｈｇ３８）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0080】

本明細書で互換的に使用される「配列リード」又は「リード」という用語は、本明細書に記載の又は当技術分野で公知の任意のシーケンシングプロセスによって生成されるヌクレオチド配列を指す。リードは、核酸断片の一端から生成することができ（「シングルエンドリード」）、核酸の両端から生成されることもある（例えば、ペアエンドリード、ダブルエンドリード）。配列リードの長さは、特定のシーケンシング技術に関連することが多い。例えば、ハイスループット法は、サイズが数十塩基対（ｂｐ）から数百塩基対（ｂｐ）まで様々であり得る配列リードを提供する。いくつかの実施形態では、配列リードは、平均長、中央長又は平均長が約１５ｂｐ～９００ｂｐ長（例えば、約２０ｂｐ、約２５ｂｐ、約３０ｂｐ、約３５ｂｐ、約４０ｂｐ、約４５ｂｐ、約５０ｂｐ、約５５ｂｐ、約６０ｂｐ、約６５ｂｐ、約７０ｂｐ、約７５ｂｐ、約８０ｂｐ、約８５ｂｐ、約９０ｂｐ、約９５ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０ｂｐ、約１２０ｂｐ、約１３０ｂｐ、約１４０ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、又は約５００ｂｐ）である。いくつかの実施形態では、配列リードは、平均長、中央長又は平均長が約１０００ｂｐ以上である。例えば、ナノポアシーケンシングは、サイズが数十塩基対、数百塩基対から数千塩基対まで様々である配列リードを提供することができる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ並列シーケンシングは、ばらつきの程度がより少ない（例えば、ほとんどの配列リードの長さが約２００ｂｐ以下である）配列リードを提供することができる。配列リード（又はシーケンシングリード）は、核酸分子（例えば、一連のヌクレオチド）に対応する配列情報を指すことができる。例えば、配列リードは、核酸断片の一部からの一連のヌクレオチド（例えば、約２０～約１５０）に対応してもよく、核酸断片の一端もしくは両端の一連のヌクレオチドに対応してもよく、又は核酸断片全体のヌクレオチドに対応してもよい。配列リードは、様々な方法で、例えば、シーケンシング技術を使用して、又は（例えばハイブリダイゼーションアレイもしくは捕捉プローブにおいて）プローブを使用して、あるいは、単一プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは線形増幅又は等温増幅などの増幅技術を使用して取得することができる。

【0081】

本明細書に開示される場合、用語「シーケンシング」、「配列決定」などは、一般に、核酸又はタンパク質などの生体高分子の順序を決定するために使用され得るあらゆる生化学的プロセスを指す。例えば、シーケンシングデータは、ＤＮＡ断片などの核酸分子中のヌクレオチド塩基の全て又は一部を含み得る。

【0082】

本明細書で使用される場合、「感度」、「再現率」、又は「真陽性率」（ＴＰＲ）という用語は、真陽性の数を真陽性の数と偽陰性の数との和で割ったものを指す。感度は、真に状態を有する集団の割合を正確に同定するアッセイ又は方法の能力を特徴付けることができる。例えば、感度は、癌を有する集団内の対象の数を正確に同定する方法の能力を特徴付けることができる。別の例では、感度は、癌を示す１つ以上のマーカーを正確に同定する方法の能力を特徴付けることができる。

【0083】

本明細書で使用される場合、「特異性」又は「真陰性率」（ＴＮＲ）という用語は、真陰性の数を真陰性の数と偽陽性の数との和で割ったものを指す。特異性は、真に状態を有さない集団の割合を正確に同定するアッセイ又は方法の能力を特徴付けることができる。例えば、特異性は、癌を有さない集団内の対象の数を正確に同定する方法の能力を特徴付けることができる。別の例では、特異性は、癌を示す１つ以上のマーカーを正確に同定する方法の能力を特徴付ける。

【0084】

本明細書に開示される場合、「対象」、「参照対象」、「訓練対象」又は「試験対象」という用語は、ヒト（例えば、男性、女性、胎児、妊婦、子供など）、非ヒト動物、植物、細菌、真菌又は原生生物を含むがこれらに限定されない任意の生きている又は生きていない生物を指す。哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄動物、反芻動物、ウシ科動物（（例えば、牛）、ウマ科動物（（例えば、馬）、ヤギ科動物（及びヒツジ科動物（（例えば、羊、山羊）、ブタ科動物（（例えば、豚）、ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ）、サル、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー）、クマ科動物（例えば、熊）、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚類、イルカ、クジラ、及びサメを含むがこれらに限定されない任意のヒト又は非ヒト動物が対象として役立ち得る。用語「対象」及び「患者」は、本明細書では互換的に使用され、例えば癌などの医学的状態又は障害を有することが知られているか、又は潜在的に有するヒト又は非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、任意の世代の雄又は雌（例えば、男性、女性、又は子供）である。

【0085】

本明細書に記載の方法もしくは組成物のいずれかによって試料が採取されるか又は治療される対象は、任意の年齢であってよく、成人であっても、乳児であっても、又は小児であってもよい。場合により、対象、例えば患者は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９歳、又はその範囲内である（例えば、約２歳～約２０歳、約２０歳～約４０歳、又は約４０歳～約９０歳）。特定のクラスの対象、例えば、本開示の方法から利益を得ることができる患者は、対象、例えば、４０歳を超える患者である。

【0086】

別の特定のクラスの対象、例えば、本開示の方法から利益を得ることができる患者は、慢性心疾患のリスクがより高い可能性がある小児患者である。更に、対象、例えば、本明細書に記載の方法又は組成物のいずれかによって試料が採取されるか又は治療される患者は、雄であっても雌であってもよい。

【0087】

本明細書で使用される場合、用語「組織」は、機能単位として一緒にグループ化される細胞の群に対応する。１つより多くの型の細胞が、単一の組織において見出され得る。異なる型の組織は、異なる種類の細胞（例えば、肝細胞、肺胞細胞又は血液細胞）からなり得るが、異なる生物由来の組織（母親対胎児）又は健常細胞対腫瘍細胞に対応することもできる。「組織」という用語は、一般に、人体に見出される任意の細胞群（例えば、心臓組織、肺組織、腎臓組織、鼻咽頭組織、口腔咽頭組織）を指すことができる。いくつかの態様では、「組織」又は「組織タイプ」という用語は、無細胞核酸が由来する組織を指すために使用することができる。一例では、ウイルス核酸断片は血液組織に由来し得る。別の例では、ウイルス核酸断片は腫瘍組織に由来し得る。

【0088】

本明細書で使用される場合、「腫瘍遺伝子変異量」（ＴＭＢ）という用語は、患者のゲノムの単位当たりの癌における突然変異の尺度（例えば、腫瘍細胞が保有する突然変異の測定値）を指す。例えば、腫瘍遺伝子変異量は、ゲノム中の１００万塩基対当たりの体細胞変異の数の中心傾向の尺度（例えば、平均）として表すことができる。いくつかの実施形態では、腫瘍遺伝子変異量は、１つ以上の型の可能性のある突然変異、例えば、ＳＮＶ、ＭＮＶ、インデル、又はゲノム再編成のうちの１つ以上の尺度を指す。いくつかの実施形態では、腫瘍遺伝子変異量は、非同義突然変異（例えば、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させる突然変異）などの１つ以上の型の可能性のある突然変異のサブセットを指す。他の実施形態では、例えば、腫瘍遺伝子変異量は、タンパク質コード配列に生じる１つ以上の型の突然変異の数を指す（例えば、コードされたタンパク質のアミノ酸配列をそれらが変化させるかどうかにかかわらず）。一例として、いくつかの実施形態では、腫瘍遺伝子変異量は、シーケンシングデータにおいて同定された突然変異（例えば、全ての変異及び／又は非同義変異）の数を、標的シーケンシングに使用される捕捉プローブパネルのサイズ（例えば、電子ファイルのメガベースでのサイズ）で割ることによって計算される。液体生検試料及び／又は固体組織試料における腫瘍遺伝子変異量を計算するための他の方法は、当技術分野で公知である。

【0089】

本明細書で使用される場合、「腫瘍画分」という用語は、非癌性組織（例えば、生殖系列又は造血組織）からではなく、対象の癌性組織に由来する試料中の核酸分子の画分を指す。腫瘍画分は、固形組織試料又は液体生検試料を用いて測定することができる。例えば、本明細書で使用される場合、「循環腫瘍画分」という用語は、非癌性組織ではなく対象の癌性組織に由来する液体生検試料中の無細胞核酸分子の画分を指す。しかしながら、液体生検試料からの腫瘍画分の推定は、そのような試料が一般に固形腫瘍試料と比較してより低い腫瘍画分を有し、かつ液体生検シーケンシングに使用される標的パネルが典型的には小さいため、困難であり得る。

【0090】

腫瘍画分を計算するためのソフトウェアパッケージとしては、例えば、固形腫瘍試料の標的ショートリードシーケンシングデータから腫瘍純度を推定するように設計されたＰｕｒｅＣＮ、及び固形腫瘍試料のシーケンシングデータから腫瘍画分を推定するように設計されたＦＡＣＥＴＳが挙げられる。加えて、ｉｃｈｏｒＣＮＡパッケージは、無細胞ＤＮＡの超低域全ゲノムシーケンシングデータからの正規化されたリードカバレッジに確率モデルを適用して、液体生検試料中の腫瘍画分を推定する。腫瘍画分はまた、試料中の対立遺伝子のコピー数及び対照試料のペア中の変異対立遺伝子頻度に基づく最大尤度モデルを使用して決定することもできる。

【0091】

腫瘍画分及び腫瘍遺伝子変異量を決定するための方法は、各々の全体が全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年２月２５日出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｌｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ」と題する米国特許出願第１７／１８５８８５号、及び２０２１年２月出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｌｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ」と題するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１９７４６号に更に詳細に記載されている。

【0092】

本明細書で使用される場合、「訓練されていない分類器」という用語は、標的データセットに対して訓練されていない分類器を指す。例えば、以下に説明するメチル化状態ベクトルの第１のカノニカルセット及びメチル化状態ベクトルの第２のカノニカルセットの場合を考える。メチル化状態ベクトルのそれぞれのカノニカルセットは、メチル化状態ベクトルの第１のカノニカルセット（以下、「主訓練データセット」）によって表されるそれぞれの参照対象の細胞源と併せて、訓練されていない分類器への集合的入力として適用されて、細胞源に対して訓練されていない分類器を訓練し、それによって訓練された分類器を取得する。更に、「訓練されていない分類器」という用語は、訓練されていない分類器のそのような訓練において転移学習技術が使用される可能性を排除しないことが理解されよう。転移学習が使用される場合、上述の訓練されていない分類器には、主訓練データセットのデータに加えて追加のデータが提供される。すなわち、転移学習の実施形態の非限定的な例では、訓練されていない分類器は、（ｉ）メチル化状態ベクトルのカノニカルセット及びメチル化状態ベクトルのカノニカルセットによって表される参照対象の各々の細胞源ラベル（「主訓練データセット」）、並びに（ｉｉ）追加データを受け取る。典型的には、この追加データは、別の補助訓練データセットから学習された係数（例えば、回帰係数）の形態である。更に、単一の補助訓練データセットの説明が開示されているが、本開示において訓練されていない分類器を訓練する際に主訓練データセットを補完するために使用され得る補助訓練データセットの数に制限がないことが理解されよう。例えば、いくつかの実施形態では、２つ以上の補助訓練データセット、３つ以上の補助訓練データセット、４つ以上の補助訓練データセット、又は５つ以上の補助訓練データセットが、転移学習を通して主訓練データセットを補完するために使用され、そのような各補助データセットは、主訓練データセットとは異なる。そのような実施形態では、任意の方法の転移学習を使用することができる。例えば、主訓練データセットに加えて、第１の補助訓練データセット及び第２の補助訓練データセットがある場合を考える。（回帰などの分類器を第１の補助訓練データセットに適用することによって）第１の補助訓練データセットから学習された係数を、転移学習技術（例えば、上記の二次元行列乗算）を使用して第２の補助訓練データセットに適用することができ、その結果、その係数が主訓練データセットに適用され、これが主訓練データセット自体と共に、訓練されていない分類器に適用される訓練された中間分類器をもたらすことができる。代替的に、（回帰などの分類器を第１の補助訓練データセットに適用することによって）第１の補助訓練データセットから学習された係数の第１のセットと、（回帰などの分類器を第２の補助訓練データセットに適用することによって）第２の補助訓練データセットから学習された係数の第２のセットとを、各々個別に（例えば．、別個の独立した行列乗算によって）、主訓練データセットの別個のインスタンスに適用してもよく、主訓練データセットの別個のインスタンスへのこれらの係数のそのような適用の両方が、次いで、主訓練データセット自体（又は、主訓練セットから学習された主成分又は回帰係数などの主訓練データセットの何らかの縮小形態）と共に、訓練されていない分類器を訓練するために訓練されていない分類器に適用されてもよい。いずれの例においても、第１及び第２の補助訓練データセットから導出された細胞源に関する知識（例えば、癌の種類など）が、細胞源でラベル付けされた主訓練データセットと併せて使用されて、訓練されていない分類器を訓練する。

【0093】

本明細書で使用される場合、用語「変異」又は「突然変異」は、１つ以上の細胞の遺伝物質の検出可能な変化を指す。変異又は突然変異は、単一のヌクレオチド又は複数のヌクレオチドの位置における一次ゲノム配列の変化、例えば、一塩基変異（single nucleotide variant、ＳＮＶ）、多塩基変異（multi-nucleotide variant、ＭＮＶ）、インデル（例えば、ヌクレオチドの挿入又は欠失）、ＤＮＡ再編成（例えば、染色体の一部又は染色体の逆位又は転座）、遺伝子座（例えば、エクソン、遺伝子又は染色体のラージスパン）のコピー数の変異（ＣＮＶ）、細胞の倍数性の部分的又は完全な変化、及び／あるいは、ＤＮＡメチル化パターンの変化などのゲノムのエピジェネティック情報の変化を含む、細胞の遺伝物質の様々なタイプの変化を指すことができる。例えば、一塩基変異又は「ＳＮＶ」は、ヌクレオチド配列、例えば、個体から読み取られた配列の位置（例えば、部位）における１つのヌクレオチドの異なるヌクレオチドへの置換を指す。第１の核酸塩基Ｘから第２の核酸塩基Ｙへの置換は、「Ｘ＞Ｙ」と表され得る。例えば、シトシンからチミンへのＳＮＶは、「Ｃ＞Ｔ」と表され得る。いくつかの実施形態では、変異は、特定の参照ゲノム又は対象の種の集団に見られる１つ以上の「正常」もしくは「参照」対立遺伝子に対する細胞の遺伝情報の変化である。いくつかの実施形態では、変異は、対象の「正常な」又は「健常な」組織などの参照細胞又は組織と比較した、細胞の遺伝情報の変化である。いくつかの実施形態では、変異は、生殖系列突然変異又は体細胞突然変異である。

【0094】

いくつかの例では、変異は、核酸シーケンシングデータから導出される癌メトリックを指す。いくつかの例では、変異は、腫瘍遺伝子変異量、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）状態、倍数性、又は腫瘍画分を指す。いくつかの例では、変異は、融合、増幅、及び／又はアイソフォームを指す。

【0095】

本明細書で使用される場合、用語「変異対立遺伝子」は、種の集団内のそのゲノム位置で表される優勢な対立遺伝子ではない（例えば、「野生型」配列ではない）、又は種の参照ゲノム内の事前定義された対立遺伝子ではない、ゲノム位置における１つ以上のヌクレオチドの配列を指す。

【0096】

本明細書で使用される場合、「パラメータ」という用語は、モデル、分類器、又はアルゴリズムの１つ以上の入力、出力、及び／又は関数に影響を及ぼす（例えば、修正する、適合させる、及び／又は調整する）ことができる、モデル、分類器、又はアルゴリズムの内部要素又は外部要素の任意の係数、又は同様に任意の値（例えば、重み及び／又はハイパーパラメータ）を指す。例えば、いくつかの実施形態では、パラメータは、モデルの挙動、学習、及び／又は性能を制御する、修正する、適合させる、及び／又は調整するために使用され得る、任意の係数、重み、及び／又はハイパーパラメータを指す。いくつかの実施形態では、パラメータは固定値を有する。いくつかの実施形態では、パラメータの値は、手動で及び／又は自動的に調整可能である。いくつかの実施形態では、パラメータの値は、分類器検証及び／又は訓練プロセスによって（例えば、本明細書の他の箇所で説明されるように、誤差最小化及び／又は逆伝搬法によって）修正される。

【0097】

いくつかの態様を、説明のための例示的な適用例を参照して以下に記載する。本明細書に記載の特徴の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細、関係、及び方法が述べられていることを理解されたい。しかしながら、当業者であれば、本明細書で説明される特徴は、１つ以上の具体的な詳細がなくても、又は他の方法を用いても実践できることを容易に認識するであろう。本明細書に記載の特徴は、いくつかの動作が異なる順序で、及び／又は他の動作もしくは事象と同時に起こり得るため、動作又は事象の図示された順序に限定されない。更に、本明細書に記載の特徴に従って方法を実施するために、図示された全ての動作又は事象が使用されるわけではない。

【0098】

例示的なシステムの実施形態
ここで、例示的なシステムの詳細を図１に関連して説明する。図１は、いくつかの実装形態によるシステム１００を示すブロック図である。いくつかの実装形態におけるシステム１００は、１つ以上の処理ユニットＣＰＵ１０２（プロセッサ又は処理コアとも呼ばれる）、１つ以上のネットワークインターフェース１０４、ユーザインターフェース１０６、非永続メモリ１１１、永続メモリ１１２、及びこれらの構成要素を相互接続する１つ以上の通信バス１１４を含む。１つ以上の通信バス１１４は、システム構成要素間の通信を相互接続及び制御する回路（チップセットと呼ばれることもある）を任意選択的に含む。非永続メモリ１１１は、典型的には、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＤＲ ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリなどの高速ランダムアクセスメモリを含み、一方、永続メモリ１１２は、典型的には、ＣＤ－ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）又は他の光学記憶デバイス、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶デバイス又は他の磁気記憶デバイス、磁気ディスク記憶デバイス、光ディスク記憶デバイス、フラッシュメモリデバイス、又は他の不揮発性ソリッドステート記憶デバイスを含む。永続メモリ１１２は、ＣＰＵ１０２から遠隔に位置する１つ以上の記憶デバイスを任意選択的に含む。永続メモリ１１２、及び非永続メモリ１１２内の不揮発性メモリデバイスは、非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含む。いくつかの実装形態では、非永続メモリ１１１又は代替的に非一時的コンピュータ可読記憶媒体は、場合によっては永続メモリ１１２と共に、以下のプログラム、モジュール及びデータ構造、又はそれらのサブセットを記憶する：
様々な基本システムサービスを処理し、ハードウェア依存タスクを実行するための手順を含む、任意選択のオペレーティングシステム１１６に関連付けられた任意選択の命令、プログラム、データ、又は情報；
システム１００を他のデバイス又は通信ネットワークに接続するための任意選択のネットワーク通信モジュール（又は命令）１１８に関連付けられた命令、プログラム、データ、又は情報；
ゲノム位置１２４（任意選択的に、複数のゲノム位置１２４－１．．．１２４－Ｙ中のそれぞれのゲノム位置）の参照対立遺伝子１２６（例えば、１２６－１－１）の同定及び変異対立遺伝子１２８（例えば、１２８－１－１）の同定を記憶する、対立遺伝子セット１２２に関連付けられた命令、プログラム、データ、又は情報；
ゲノム位置１３２上にマッピングされる核酸断片のそれぞれのセット（任意選択的に、複数のゲノム位置１３２－１．．．１３２－Ｙ中の各ゲノム位置のそれぞれの断片セット）と、核酸断片のセット中の各核酸断片１３４（例えば、１３４－１－１．．．１３４－１－Ｎ）のそれぞれのメチル化状態１３６（例えば、１３６－１－１）及び核酸断片１３８のそれぞれの配列（例えば、１３８－１－１）とを含む、試験対象から取得された生体試料（例えば、液体生体試料に由来するシーケンシングデータセット１３０）；
ゲノム位置１２４に参照対立遺伝子を有する核酸断片１３４のそれぞれのセット中の各核酸断片１３２を含む参照サブセット１４０であって、それぞれの核酸断片が、このゲノム位置における参照対立遺伝子１２６の同定及び核酸断片のそれぞれの配列１３８を使用して参照サブセットに割り当てられる、参照サブセット１４０；
ゲノム位置１２４に変異対立遺伝子を有する核酸断片１３２のそれぞれのセット中の各核酸断片１３４を含む変異サブセット１４２であって、それぞれの核酸断片が、このゲノム位置における変異対立遺伝子１２８の同定及び核酸断片のそれぞれの配列１３８を使用して変異サブセットに割り当てられる、変異サブセット１４２；
訓練された二値分類器に、少なくとも（ｉ）変異サブセット中の各核酸断片配列のメチル化状態１３６全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標、及び（ｉｉ）変異サブセット１４２中の核酸断片配列の数に対する参照サブセット１４０中の核酸断片配列の数の指標を適用し、それによって、訓練された二値分類器から、試験対象におけるこのゲノム位置における変異対立遺伝子の体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての同定を取得するための分類モジュール１４４；並びに
任意選択的に、このゲノム位置における変異対立遺伝子の同定のために使用される二値分類器を訓練するための分類器訓練モジュール１４６。

【0099】

いくつかの実装形態では、上記の要素のうちの１つ以上は、前述のメモリデバイスのうちの１つ以上に記憶され、上述の機能を実行するための命令のセットに対応する。上記のモジュール、データ、又はプログラム（例えば、命令のセット）は、別個のソフトウェアプログラム、手順、データセット、又はモジュールとして実施されなくてもよく、したがって様々な実装形態では、これらのモジュール及びデータの様々なサブセットは、組み合わされるか、又は他の形で再構成されてもよい。いくつかの実装形態では、非永続メモリ１１１は、上記のモジュール及びデータ構造のサブセットを任意選択的に記憶する。更に、いくつかの実施形態では、メモリは、上記で説明されていない追加のモジュール及びデータ構造を記憶する。いくつかの実施形態では、上記の要素のうちの１つ以上は、視覚化システム１００がそのようなデータの全て又は一部を取り出すことができるように、視覚化システム１００によってアドレス可能な、視覚化システム１００のコンピュータシステム以外のコンピュータシステム内に記憶される。

【0100】

図１は「システム１００」を示しているが、この図は、本明細書に記載の実装形態の構造概略図としてよりも、コンピュータシステム内に存在し得る様々な特徴の機能的説明として意図されている。実際には、別々に示されている項目は組み合わされてもよく、いくつかの項目は別個であってもよい。更に、図１は、非永続メモリ１１１内のいくつかのデータ及びモジュールを示しているが、これらのデータ及びモジュールの一部又は全てが永続メモリ１１２内にあってもよい。

【0101】

図１を参照して本開示によるシステムを開示してきたが、ここで図２Ａ、図２Ｂ及び図３を参照して本開示による方法を詳述する。本開示の方法のいずれも、試験対象における癌状態又は対象が癌状態を有する尤度を決定するために、各々が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月２５日に出願された米国特許出願第１５／７９３８３０号、及び／又は「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０１８／０８１１３０号に開示されているアッセイ又はアルゴリズムのいずれかを利用することができる。例えば、本開示の方法のいずれも、２０１７年１０月２５日に出願された米国特許出願第１５／７９３８３０号、及び／又は「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０１８／０８１１３０号に開示されている方法又はアルゴリズムのいずれかと連携して機能することができる。

【0102】

変異対立遺伝子の同定
図２Ａ及び図２Ｂを参照すると、本明細書では、試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定する方法２００が提供される。

【0103】

対象及び試料
いくつかの実施形態では、試験対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、試験対象はヒトである。いくつかの実施形態では、試験対象は、癌を有する患者である。

【0104】

いくつかの実施形態では、本方法は、試験対象から生体試料を取得することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、試験対象から取得された複数の生体試料（例えば、適合腫瘍試料及び適合正常試料を含む複数の複製物及び／又は複数の試料）のうちの１つである。いくつかの実施形態では、複数の生体試料が、試験対象から同時に、又はある期間にわたって間隔をおいて（例えば連続分析のために）取得される。例えば、いくつかのそのような実施形態では、試験対象からの生体試料の取得間の期間は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１年である。

【0105】

いくつかの実施形態では、生体試料は、対象からの任意の組織、器官又は体液から取得される。

【0106】

いくつかの実施形態では、生体試料は、液体生体試料（例えば、液体生検試料）である。いくつかの実施形態では、液体生体試料は、試験対象の血液、全血、血漿、漿液、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹水を含む。いくつかの実施形態では、液体生体試料は、試験対象の血液、全血、血漿、漿液、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹水からなる。

【0107】

いくつかの実施形態では、生体試料は組織試料である。いくつかの実施形態では、組織試料は、試験対象由来の腫瘍試料である。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、同種腫瘍の腫瘍試料である。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、異種腫瘍の腫瘍試料である。

【0108】

いくつかの実施形態では、生体試料は、それぞれの複数の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの複数の核酸断片は、無細胞核酸断片（例えば、ｃｆＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの複数の核酸断片は、無細胞核酸断片（例えば、ｃｆＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸断片中の核酸断片は、本明細書に開示される核酸についての実施形態のいずれかを含む（例えば、定義：核酸を参照のこと）。

【0109】

いくつかの実施形態では、生体試料は、罹患細胞に由来する核酸分子と健常細胞に由来する核酸分子との混合物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、生体試料は、腫瘍細胞に由来するｃｆＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）、正常細胞由来のｃｆＤＮＡ、及び／又は正常細胞（例えば、白血球）を含む血液試料である。

【0110】

いくつかの実施形態では、生体試料は、シーケンシング分析に備えて核酸を抽出するために処理される。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、無細胞核酸断片は、対象からＫ２ ＥＤＴＡチューブに採取された液体生体試料（例えば、血液試料）から抽出される。生体試料が血液である場合、非限定的な例として、試料は、採取の２時間以内に、最初に生体試料の１０００ｇで１０分間の二重スピン、次いで取得された血漿の２０００ｇで１０分間のスピンによって処理される。次いで、血漿を－８０℃で１ｍＬアリコートで保存する。このようにして、無細胞核酸抽出の目的で、適切な量の血漿（例えば、１～５ｍＬ）が生体試料から調製される。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出され、ＤＮＡ懸濁緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中に溶出される。いくつかの実施形態では、精製された無細胞核酸は、使用するまで－２０℃で保存される。

【0111】

他の同等の方法を使用して、シーケンシングの目的で生体試料から核酸断片（例えば、無細胞核酸断片）を調製及び／又は抽出することができ、そのような方法は全て本開示の範囲内である。

【0112】

いくつかの実施形態では、試験対象由来のそれぞれの複数の核酸断片（例えば、無細胞核酸断片）は、１００個以上の核酸断片、１，０００個以上の核酸断片、１０，０００個以上の核酸断片、２０，０００個以上の核酸断片、５０，０００個以上の核酸断片、１００，０００個以上の核酸断片、２００，０００個以上の核酸断片、５００，０００個以上の核酸断片、１，０００，０００個以上の核酸断片、２，０００，０００個以上の核酸断片、５，０００，０００個以上の核酸断片、１０，０００，０００個以上の核酸断片、又は５０，０００，０００個以上の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、試験対象由来の核酸断片（例えば、無細胞核酸断片）は、５０，０００，０００個以下、１０，０００，０００個以下、５，０００，０００個以下、２，０００，０００個以下、１，０００，０００個以下、５００，０００個以下、２００，０００個以下、１００，０００個以下、５０，０００個以下、２０，０００個以下、１０，０００個以下、又は１，０００個以下の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、試験対象由来の核酸断片（例えば、無細胞核酸断片）は、１００～１，０００個、１，０００～１０，０００個、１０，０００～１００，０００個、１００，０００～１，０００，０００個、１，０００，０００～１０，０００，０００個、又は１０，０００，０００～５０，０００，０００個の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、試験対象由来の核酸断片（例えば、無細胞核酸断片）は、１００個以上の核酸断片から始まり、５０，０００，０００個以下の核酸断片で終わる別の範囲内にある。

【0113】

いくつかの実施形態では、生体試料から取得される核酸断片は、腫瘍細胞に由来する無細胞核酸（例えば、ｃｔＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、生体試料から取得される核酸断片は、正常細胞に由来する無細胞核酸である。いくつかの実施形態では、生体試料から取得される核酸断片は、腫瘍細胞（例えば、固形腫瘍生検）から直接取得される。いくつかの実施形態では、生体試料から取得される核酸断片は、正常細胞（例えば、健常組織及び／又は白血球）から直接取得される。

【0114】

いくつかの実施形態では、生体試料から取得される核酸断片は、本開示で定義される核酸の任意の形態（例えば、無細胞核酸断片）、又はそれらの組み合わせである（例えば、定義：核酸を参照のこと）。例えば、いくつかの実施形態では、生体試料から取得される核酸は、ＲＮＡ及びＤＮＡの混合物（例えば、無細胞ＲＮＡ及び／又は無細胞ＤＮＡ）である。

【0115】

いくつかの実施形態では、本方法は、試験対象から取得された生体試料中のそれぞれの複数の核酸分子をシーケンシングすることによってそれぞれの複数の核酸断片配列を取得することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、生体試料は液体生体試料であり、それぞれの複数の核酸断片配列中のそれぞれの核酸断片配列が、液体生体試料中の無細胞核酸分子の集団中のそれぞれの無細胞核酸分子の全て又は一部を表す。いくつかの実施形態では、代替的に又は追加的に、生体試料は組織試料であり、それぞれの複数の核酸断片配列中のそれぞれの核酸断片配列が、組織試料中の核酸分子の集団中のそれぞれの核酸分子の全て又は一部を表す。核酸断片配列を取得するための方法の非限定的な実施形態は、以下のセクションで詳述される（「核酸断片配列の取得」を参照のこと）。

【0116】

参照対立遺伝子及び変異対立遺伝子
ブロック２０２及びブロック２０４を参照すると、本方法は、ゲノム位置における参照対立遺伝子の同定を取得すること、及びゲノム位置における変異対立遺伝子の同定を取得することを更に含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、変異対立遺伝子は、挿入、欠失、一塩基変異（ＳＮＶ）又は一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、変異対立遺伝子は、本明細書で定義される任意の変異又は突然変異である（定義：変異を参照のこと）。

【0118】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、本明細書で定義される任意のゲノム位置又は遺伝子座である（定義：ゲノム位置を参照のこと）。例えば、いくつかの実施形態では、ゲノム位置は一塩基位置であり、変異は一塩基変異（ＳＮＶ）又は一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、ゲノム位置は２つ以上の塩基位置であり、変異は挿入又は欠失である。いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、参照ゲノムの一部又は領域である。

【0119】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、臨床的に実用可能な変異と関連している。例えば、いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、重症度の増加、進行の尤度、及び／又は癌の種類の指標（例えば、肺癌におけるＫＲＡＳ変異）などの癌状態のリスクの増加に関連するゲノム変異を示す。いくつかのそのような実施形態では、それぞれのゲノム変異の存在及び／又は同定は、治療推奨、臨床試験登録、及び他の医師の行動などの臨床意思決定に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、臨床的に実用可能な変異は、体細胞変異又は生殖系列変異である。いくつかの実施形態では、臨床的に実用可能な変異は、遺伝子に関連する。

【0120】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、遺伝子の全てもしくは一部を含むか、又は遺伝子における突然変異によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、例えば、遺伝子の機能不全が癌に関連する癌遺伝子である。機能不全の非限定的な例としては、ゲノム変化（例えば、突然変異及び／又は変異対立遺伝子）、調節不全、活性の変化、発現の変化、及び／又はメチル化などのエピジェネティック修飾の変化が挙げられる。いくつかの実施形態では、癌遺伝子は、既知の癌遺伝子、候補癌遺伝子、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、及び／又は組織特異的遺伝子（例えば、特定の癌型に関連する遺伝子）を含む。いくつかの実施形態では、癌遺伝子は、シーケンシングスクリーニングからの注釈、専門家による手動キュレーション、及び／又は実験データに基づいて取得される。いくつかの実施形態では、癌遺伝子は、Ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｓ（ＮＣＧ）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＣＧＣ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）、ＣＯＳＭＩＣ、ＤｏＣＭ、ＤｒｉｖｅｒＤＢ、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｅｒ、ＯｎｃｏＫＢ、ｃＢＩＯＰｏｒｔａｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｃｅｎｓｕｓ（ＣＧＣ）、ＯＮＧｅｎｅ、ＴＳＧｅｎｅ、及び／又はＣｏＲｅＣＧなどのデータベースから取得される。

【0121】

いくつかの実施形態では、癌遺伝子は、Ａ１ＣＦ、ＡＢＩ１、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＫＲ３、ＡＣＳＬ３、ＡＣＳＬ６、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＦＤＮ、ＡＦＦ１、ＡＦＦ３、ＡＦＦ４、ＡＫＡＰ９、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＤＨ２、ＡＬＫ、ＡＭＥＲ１、ＡＮＫ１、ＡＰＣ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＲ、ＡＲＡＦ、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＡＲＨＧＡＰ５、ＡＲＨＧＥＦ１０、ＡＲＨＧＥＦ１０Ｌ、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＮＴ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、ＡＴＦ１、ＡＴＩＣ、ＡＴＭ、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＲ、ＡＴＲＸ、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ２、Ｂ２Ｍ、ＢＡＰ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＸ、ＢＡＺ１Ａ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ７Ａ、ＢＣＬ９、ＢＣＬ９Ｌ、ＢＣＬＡＦ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＢＣＲ、ＢＩＲＣ３、ＢＩＲＣ６、ＢＬＭ、ＢＭＰ５、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＩＰ１、ＢＴＧ１、ＢＴＫ、ＢＵＢ１Ｂ、Ｃ１５ｏｒｆ６５、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＣＡＬＲ、ＣＡＭＴＡ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＲＳ、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＢＦＢ、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＤＣ６、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＣＮＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＤ２０９、ＣＤ２７４、ＣＤ２８、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１１、ＣＤＨ１７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＸ２、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＰ８９、ＣＨＣＨＤ７、ＣＨＤ２、ＣＨＤ４、ＣＨＥＫ２、ＣＨＩＣ２、ＣＨＳＴ１１、ＣＩＣ、ＣＩＩＴＡ、ＣＬＩＰ１、ＣＬＰ１、ＣＬＴＣ、ＣＬＴＣＬ１、ＣＮＢＤ１、ＣＮＢＰ、ＣＮＯＴ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＮＴＲＬ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＰＥＢ３、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＬＦ２、ＣＲＮＫＬ１、ＣＲＴＣ１、ＣＲＴＣ３、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＳＭＤ３、ＣＴＣＦ、ＣＴＮＮＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＣＴＮＮＤ１、ＣＴＮＮＤ２、ＣＵＬ３、ＣＵＸ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＬＤ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＳＬＴＲ２、ＤＡＸＸ、ＤＣＡＦ１２Ｌ２、ＤＣＣ、ＤＣＴＮ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＲ２、ＤＤＸ１０、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ５、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＤＧＣＲ８、ＤＩＣＥＲ１、ＤＮＡＪＢ１、ＤＮＭ２、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲＯＳＨＡ、ＥＢＦ１、ＥＣＴ２Ｌ、ＥＥＤ、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ１ＡＸ、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ４Ａ２、ＥＬＦ３、ＥＬＦ４、ＥＬＫ４、ＥＬＬ、ＥＬＮ、ＥＭＬ４、ＥＰ３００、ＥＰＡＳ１、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ７、ＥＰＳ１５、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＴＮＫ１、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＺＨ２、ＥＺＲ、ＦＡＭ１３１Ｂ、ＦＡＭ１３５Ｂ、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＡＭ４７Ｃ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＳ、ＦＡＴ１、ＦＡＴ３、ＦＡＴ４、ＦＢＬＮ２、ＦＢＸＯ１１、ＦＢＸＷ７、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＲＬ４、ＦＥＮ１、ＦＥＳ、ＦＥＶ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＨ、ＦＨＩＴ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ９、ＦＬＣＮ、ＦＬＩ１、ＦＬＮＡ、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＮＢＰ１、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＲ１、ＦＳＴＬ３、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＧＡＳ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＬＩ１、ＧＭＰＳ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＰＣ、ＧＰＣ３、ＧＰＣ５、ＧＰＨＮ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＭ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＨＥＲＰＵＤ１、ＨＥＹ１、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＰ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＦ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＯＯＫ３、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１３、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＤ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＫＢＫＢ、ＩＫＺＦ１、ＩＬ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＳ４、ＩＳＸ、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＡＺＦ１、ＪＵＮ、ＫＡＴ６Ａ、ＫＡＴ６Ｂ、ＫＡＴ７、ＫＣＮＪ５、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＤＳＲ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ１５４９、ＫＩＦ５Ｂ、ＫＩＴ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ６、ＫＬＫ２、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＮＬ１、ＫＮＳＴＲＮ、ＫＲＡＳ、ＫＴＮ１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＬＡＳＰ１、ＬＣＫ、ＬＣＰ１、ＬＥＦ１、ＬＥＰＲＯＴＬ１、ＬＨＦＰＬ６、ＬＩＦＲ、ＬＭＮＡ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＬＰＰ、ＬＲＩＧ３、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＳＭ１４Ａ、ＬＹＬ１、ＬＺＴＲ１、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＬＴ１、ＭＡＭＬ２、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＸ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＤＳ２、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＤ１２、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＧＭＴ、ＭＩＴＦ、ＭＫＬ１、ＭＬＦ１、ＭＬＨ１、ＭＬＬＴ１、ＭＬＬＴ１０、ＭＬＬＴ１１、ＭＬＬＴ３、ＭＬＬＴ６、ＭＮ１、ＭＮＸ１、ＭＰＬ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＳＩ２、ＭＳＮ、ＭＴＣＰ１、ＭＴＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ４、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＨ１１、ＭＹＨ９、ＭＹＯ５Ａ、ＭＹＯＤ１、Ｎ４ＢＰ２、ＮＡＢ２、ＮＡＣＡ、ＮＢＥＡ、ＮＢＮ、ＮＣＫＩＰＳＤ、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ４、ＮＣＯＲ１、ＮＣＯＲ２、ＮＤＲＧ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＢ、ＮＦＫＢ２、ＮＦＫＢＩＥ、ＮＩＮ、ＮＫＸ２－１、ＮＯＮＯ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＮＴ５Ｃ２、ＮＴＨＬ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＮＵＭＡ１、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＮＵＴＭ１、ＮＵＴＭ２Ａ、ＮＵＴＭ２Ｂ、ＯＬＩＧ２、ＯＭＤ、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＢＰＣ１、ＰＡＦＡＨ１Ｂ２、ＰＡＬＢ２、ＰＡＴＺ１、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＡＸ７、ＰＡＸ８、ＰＢＲＭ１、ＰＢＸ１、ＰＣＢＰ１、ＰＣＭ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＲ１、ＰＨＦ６、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＬＣＧ１、ＰＭＬ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＧ、ＰＯＬＱ、ＰＯＴ１、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＯＵ５Ｆ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＦＩＢＰ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＰＰ６Ｃ、ＰＲＣＣ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１６、ＰＲＤＭ２、ＰＲＥＸ２、ＰＲＦ１、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＰＲＲＸ１、ＰＳＩＰ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＫ６、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＮ１３、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＲＢ、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＫ、ＰＴＰＲＴ、ＰＷＷＰ２Ａ、ＱＫＩ、ＲＡＢＥＰ１、ＲＡＣ１、ＲＡＤ１７、ＲＡＤ２１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＦ１、ＲＡＬＧＤＳ、ＲＡＮＢＰ２、ＲＡＰ１ＧＤＳ１、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ１５、ＲＥＣＱＬ４、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＦＷＤ３、ＲＧＰＤ３、ＲＧＳ７、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＨ、ＲＭＩ２、ＲＮＦ２１３、ＲＮＦ４３、ＲＯＢＯ２、ＲＯＳ１、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ５、ＲＰＮ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、Ｓ１００Ａ７、ＳＡＬＬ４、ＳＢＤＳ、ＳＤＣ４、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＡＦ２、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＥＰＴ５、ＳＥＰＴ６、ＳＥＰＴ９、ＳＥＴ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ２、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＦＲＰ４、ＳＧＫ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ３ＧＬ１、ＳＨＴＮ１、ＳＩＲＰＡ、ＳＩＸ１、ＳＩＸ２、ＳＫＩ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＤ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＣ１Ａ、ＳＭＯ、ＳＮＤ１、ＳＮＸ２９、ＳＯＣＳ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ２１、ＳＯＸ９、ＳＰＥＣＣ１、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＲＣ、ＳＲＧＡＰ３、ＳＲＳＦ２、ＳＲＳＦ３、ＳＳ１８、ＳＳ１８Ｌ１、ＳＳＸ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＳＴＡＧ１、ＳＴＡＧ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＩＬ、ＳＴＫ１１、ＳＴＲＮ、ＳＵＦＵ、ＳＵＺ１２、ＳＹＫ、ＴＡＦ１５、ＴＡＬ１、ＴＡＬ２、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＴＢＸ３、ＴＣＥＡ１、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＣ、ＴＥＲＴ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＦＧ、ＴＦＰＴ、ＴＦＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＲＡＰ３、ＴＬＸ１、ＴＬＸ３、ＴＭＥＭ１２７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＣ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰＭ３、ＴＰＭ４、ＴＰＲ、ＴＲＡＦ７、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＰ１１、ＴＲＲＡＰ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＲ５、ＵＳＰ４４、ＵＳＰ６、ＵＳＰ８、ＶＡＶ１、ＶＨＬ、ＶＴＩ１Ａ、ＷＡＳ、ＷＤＣＰ、ＷＩＦ１、ＷＮＫ２、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＷＷＴＲ１、ＸＰＡ、ＸＰＣ、ＸＰＯ１、ＹＷＨＡＥ、ＺＢＴＢ１６、ＺＣＣＨＣ８、ＺＥＢ１、ＺＦＨＸ３、ＺＭＹＭ２、ＺＭＹＭ３、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ３８４、ＺＮＦ４２９、ＺＮＦ４７９、ＺＮＦ５２１、ＺＮＲＦ３、及びＺＲＳＲ２から選択される。

【0122】

癌遺伝子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｐａｎａら、２０１９年、「Ｔｈｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｓ（ＮＣＧ）：ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｋｎｏｗｎ ａｎｄ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｃａｎｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎｓ」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０：１、ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１８－１６１２－０に更に詳述されている。

【0123】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、複数のゲノム位置から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるシステム及び方法は、対応する複数のゲノム位置における複数の変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、複数のゲノム位置は、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１０，０００個、又は少なくとも２０，０００個のゲノム位置を含む。いくつかの実施形態では、複数のゲノム位置は、２０，０００個以下、１０，０００個以下、５０００個以下、４０００個以下、３０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、９００個以下、８００個以下、７００個以下、６００個以下、５００個以下、４００個以下、３００個以下、２００個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、又は２０個以下のゲノム位置を含む。いくつかの実施形態では、複数のゲノム位置は、１０～５０個、５０～１００個、１００～５００個、５００～１０００個、１０００～５０００個、５０００～１０，０００個、又は１０，０００～２０，０００個のゲノム位置である。いくつかの実施形態では、複数のゲノム位置は、１０個以上のゲノム位置から始まり、２０，０００個以下のゲノム位置で終わる別の範囲内にある。

【0124】

いくつかの実施形態では、複数のゲノム位置中のそれぞれのゲノム位置は、それぞれの臨床的に実用可能な変異（例えば、癌遺伝子）と関連する。いくつかの実施形態では、複数のゲノム位置中のそれぞれのゲノム位置は、それぞれの臨床的に実用可能な変異（例えば、癌遺伝子）と関連する。いくつかの実施形態では、複数のゲノム位置は、臨床的に実用可能な変異（例えば、目的の癌遺伝子）のパネルである。

【0125】

変異コール
再びブロック２０２及び２０４を参照すると、いくつかの実施形態では、ゲノム位置における参照対立遺伝子の同定は、参照ゲノムから取得される。参照ゲノムは、本明細書に開示される実施形態のいずれかを含むことができる（定義：参照ゲノムを参照のこと）。

【0126】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子の同定の取得は、それぞれの複数の核酸断片がゲノム位置における変異対立遺伝子コールをサポートすると判定することを含む。

【0127】

例えば、いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子の同定の取得は、複数の核酸断片から、ゲノム位置が複数の候補遺伝子型中の各遺伝子型を有する尤度を決定する方法によって行われる。複数の候補遺伝子型からのそれぞれの遺伝子型の選択は、計算された尤度の比較に基づいて（例えば、対応する尤度によって遺伝子型をランク付けすることによって、及び／又は推定された尤度に尤度閾値を適用することによって）決定することができる。一般に、変異対立遺伝子は、参照遺伝子型（例えば、参照ゲノムから取得された参照対立遺伝子）ではない尤度が最も高い候補遺伝子型として同定することができる。いくつかの実施形態では、ゲノム位置の参照遺伝子型は、ホモ接合性（例えば、Ａ／Ａ、Ｔ／Ｔ、Ｇ／Ｇ、Ｃ／Ｃ）である。

【0128】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子の同定の取得は、ベイズ尤度モデル（例えば、変異コール）を使用して行われる。試験対象における変異コールのための例示的な方法３２０を、図３を参照して説明することができる。

【0129】

ブロック３２８を参照すると、いくつかの実施形態では、変異コールのための方法３２０は、参照集団（例えば、所与の種（例えば、ヒト）の複数の参照対象の集団）から取得された核酸データを使用して、候補遺伝子型のセット中のそれぞれの候補遺伝子型についてのゲノム位置におけるそれぞれの遺伝子型の事前確率（例えば、電子フォーマット）を導出することによって実行される。いくつかの実施形態では、参照集団は、少なくとも１００個の参照対象を含む。いくつかの実施形態では、参照集団は、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、又は少なくとも１０００個の参照対象を含む。

【0130】

いくつかの実施形態では、遺伝子型のセット中のそれぞれの候補遺伝子型がＸ／Ｙの形態であり、Ｘは、参照ゲノムのゲノム位置における塩基のセット｛Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ｝中の塩基の同一性であり、Ｙは、試験対象のゲノム位置における塩基のセット｛Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ｝中の塩基の同一性である。換言すれば、いくつかの実施形態では、遺伝子型のセット中の各候補遺伝子型は、それぞれの二倍体遺伝子型を表し、ゲノム位置における父系対立遺伝子及び母系対立遺伝子は、それぞれＸ及びＹで示される。

【0131】

単一ヌクレオチドレベルでは、いくつかの実施形態では、可能性のある遺伝子型が各常染色体位置ごとに１０個存在する。いくつかの実施形態では、候補遺伝子型のセットは、セット｛Ａ／Ａ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｔ、及びＴ／Ｔ｝中の２～１０個の遺伝子型からなる。いくつかの実施形態では、候補遺伝子型のセットは、セット｛Ａ／Ａ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｔ、及びＴ／Ｔ｝中の少なくとも２個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個の遺伝子型を含む。いくつかの実施形態では、候補遺伝子型のセットは、セット全体｛Ａ／Ａ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｔ、及びＴ／Ｔ｝からなる。

【0132】

ブロック３３４を参照すると、いくつかの実施形態では、変異コールのための方法３２０は、ゲノム位置について、ゲノム位置にマッピングされるそれぞれの複数の核酸断片配列中のそれぞれの核酸断片配列におけるゲノム位置でのそれぞれの塩基の（ｉ）鎖配向、及び（ｉｉ）同一性の判定に基づく、ゲノム位置での｛Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ｝のセット中の各塩基のそれぞれの順鎖塩基カウント及びそれぞれの逆鎖塩基カウントを含む順方向及び逆方向の鎖特異的塩基カウントセットを取得することによって継続する。例えば、いくつかの実施形態では、それぞれの複数の核酸断片配列は、核酸シーケンシング及び／又はメチル化シーケンシングによって、試験対象の液体生体試料中の複数の核酸分子から取得される。それぞれの複数の核酸断片配列の取得、及び核酸断片配列のゲノム位置へのマッピングに関する詳細は、以下、例えば、「核酸断片配列の取得」と題するセクションにおいて更に開示される。いくつかの実施形態では、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、５０個以上、又は１００個以上の核酸断片配列がゲノム位置にマッピングされ、鎖特異的塩基カウントに含まれる。いくつかの実施形態では、その同一性がメチル化又は非メチル化シトシンの変換によって影響され得るそれぞれの複数の核酸断片配列中のゲノム位置の塩基は、鎖特異的塩基カウントセットに寄与しない。

【0133】

いくつかの実施形態では、順方向はＦ１Ｒ２リード（センス）配向であり、逆方向はＦ２Ｒ１（アンチセンス）リード配向である。配向の対は、それぞれの核酸断片配列が、所与のゲノム位置の断片の５’鎖に由来するのか、又は３’鎖に由来するのかを指すことができる。例えば、Ｆ１Ｒ２リード配向は、核酸断片の正（センス）鎖に由来する配列リードを指し、Ｆ２Ｒ１リード配向は、核酸断片の負（アンチセンス）鎖に由来する配列リードを指す。いくつかの実施形態では、順方向はＦ１Ｒ２又はＲ２Ｆ１リード（センス）配向であり、逆方向はＦ２Ｒ１又はＲ１Ｆ２（アンチセンス）リード配向である。

【0134】

いくつかの実施形態では、亜硫酸水素塩変換を説明するために、鎖特異的塩基カウントセットが使用される。メチル化シーケンシングは、ゲノム位置におけるＣ対立遺伝子及びＴ対立遺伝子の検出に影響を及ぼす鎖特異的化学を本質的にもたらし得る。例えば、亜硫酸水素塩変換は、核酸断片の順鎖上のＣからＴへの変換及び、対応する逆鎖上のＡからＧへの変換をもたらす。Ａ対立遺伝子及びＧ対立遺伝子は、亜硫酸水素塩変換によって直接影響されないので、正鎖上の対立遺伝子カウントを分解することができ、正鎖上のＣ対立遺伝子及びＴ対立遺伝子は、負鎖上のＡ対立遺伝子及びＧ対立遺伝子によって同定される。検証として、Ｃ対立遺伝子カウントとＴ対立遺伝子カウントとの和は、亜硫酸水素塩変換によって影響され得ない。

【0135】

ブロック３４０を参照すると、いくつかの実施形態では、変異コールのための方法３２０は、鎖特異的塩基カウントセット及びシーケンシング誤差推定値を使用して、ゲノム位置の候補遺伝子型のセット中のそれぞれの候補遺伝子型について、それぞれの順鎖条件付き確率及びそれぞれの逆鎖条件付き確率を計算し、それによって、ゲノム位置の複数の順鎖条件付き確率及び複数の逆鎖条件付き確率を計算することを更に含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、シーケンシング誤差推定値は、０．０１～０．０００１である。いくつかの実施形態では、シーケンシング誤差推定値は、０．０１未満、０．００９未満、０．００８未満、０．００７未満、０．００６未満、０．００５未満、０．００４未満、０．００３未満、０．００２未満、０．００１未満、０．０００７５未満、０．０００５未満、又は０．００７５未満である。いくつかの実施形態では、候補遺伝子型のセット中の各候補遺伝子型について、それぞれのシーケンシング誤差推定値が使用される。いくつかの実施形態では、候補遺伝子型のセット中の各候補遺伝子型について、同じシーケンシング誤差推定値が使用される。いくつかの実施形態では、候補遺伝子型のうちの１つ以上は、候補遺伝子型のセット中の残りの候補遺伝子型について使用されるシーケンシング誤差推定値とは異なる、対応するシーケンシング誤差推定値を有する。いくつかの実施形態では、対称誤差推定値が各遺伝子型について想定される。いくつかの実施形態では、シーケンシング誤差は、不変又は可変である。

【0137】

ブロック３４４を参照すると、いくつかの実施形態では、変異コールのための方法３２０は、ゲノム位置の複数の尤度を計算することを更に含む。複数の尤度中のそれぞれの尤度は、候補遺伝子型のセット中のそれぞれの候補遺伝子型の尤度である。いくつかの実施形態では、複数の尤度は、（ｉ）複数の順鎖条件付き確率中のそれぞれの候補遺伝子型のそれぞれの順鎖条件付き確率、（ｉｉ）複数の逆鎖条件付き確率中のそれぞれの候補遺伝子型のそれぞれの逆鎖条件付き確率、及び（ｉｉｉ）それぞれの候補遺伝子型についての遺伝子型の事前確率の組み合わせを用いて計算される。

【0138】

いくつかの実施形態では、ベイズの定理を使用して、それぞれの遺伝子型を観察する尤度を計算する。いくつかの実施形態では、それぞれの遺伝子型の事前尤度は、観察された対立遺伝子頻度を使用して計算される。いくつかの実施形態では、ゲノム位置の候補遺伝子型のセット中の各候補遺伝子型は、それぞれのベイズ確率の順にランク付けされる。

【0139】

いくつかの実施形態では、候補遺伝子型のセット中のそれぞれの候補遺伝子型のそれぞれの尤度は、以下の形態を有する：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｇ）
式中、Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）は、それぞれの候補遺伝子型のそれぞれの順鎖条件付き確率であり、Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）は、それぞれの候補遺伝子型のそれぞれの逆鎖条件付き確率であり、Ｐｒ（Ｇ）は、それぞれの候補遺伝子型についてのゲノム位置における遺伝子型の事前確率であり、εは、シーケンシング誤差推定値であり、ｇｅｎｏｔｙｐｅは、それぞれの候補遺伝子型であり、Ｆ_Ａは、鎖特異的塩基カウントセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列全体にわたるゲノム位置における塩基Ａの順方向塩基カウントであり、Ｆ_Ｇは、鎖特異的塩基カウントセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列全体にわたるゲノム位置における塩基Ｇの順方向塩基カウントであり、Ｆ_ＣＴは、鎖特異的塩基カウントセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列全体にわたるゲノム位置における（ｉ）塩基Ｃの順方向塩基カウントと（ｉｉ）塩基Ｔの順方向塩基カウントとの和であり、Ｒ_Ｃは、鎖特異的塩基カウントセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列全体にわたるゲノム位置における塩基Ｃの逆方向塩基カウントであり、Ｒ_Ｔは、鎖特異的塩基カウントセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列全体にわたるゲノム位置における塩基Ｔの逆方向塩基カウントであり、Ｒ_ＡＧは、鎖特異的塩基カウントセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列全体にわたるゲノム位置における（ｉ）塩基Ａの逆方向塩基カウントと（ｉｉ）塩基Ｇの逆方向塩基カウントとの和である。

【0140】

いくつかの実施形態では、この乗算は、各候補ゲノムの対称シーケンシング誤差推定値の想定に依存する。いくつかの実施形態では、尤度は対数尤度であり、対数尤度は、上で定義した式の対数をとることによって求められる。

【0141】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＡ／Ａであり、Ａ／Ａのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ａ／Ａ）
を計算することは、以下を計算することを含む：

【0142】

【数1】

【0143】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＡ／Ａであり、Ａ／Ａのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ａ／Ａ）
を計算することは、以下の対数尤度を計算することを含む：

【0144】

【数2】

【0145】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＡ／Ｃであり、Ａ／Ｃのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ａ／Ｃ）
を計算することは、以下を計算することを含む：

【0146】

【数3】

【0147】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＡ／Ｃであり、Ａ／Ｃのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ａ／Ｃ）
を計算することは、以下の対数尤度を計算することを含む：

【0148】

【数4】

【0149】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＡ／Ｇであり、Ａ／Ｇのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ａ／Ｇ）
を計算することは、以下を計算することを含む：

【0150】

【数5】

【0151】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＡ／Ｇであり、Ａ／Ｇのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ａ／Ｇ）
を計算することは、以下の対数尤度を計算することを含む：

【0152】

【数6】

【0153】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＡ／Ｔであり、Ａ／Ｔのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ａ／Ｔ）
を計算することは、以下を計算することを含む：

【0154】

【数7】

【0155】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＡ／Ｔであり、Ａ／Ｔのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ａ／Ｔ）
を計算することは、以下の対数尤度を計算することを含む：

【0156】

【数8】

【0157】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＣ／Ｃであり、Ｃ／Ｃのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｃ／Ｃ）
を計算することは、以下を計算することを含む：

【0158】

【数9】

【0159】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＣ／Ｃであり、Ｃ／Ｃのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｃ／Ｃ）
を計算することは、以下の対数尤度を計算することを含む：

【0160】

【数10】

【0161】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＣ／Ｇであり、Ｃ／Ｇのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｃ／Ｇ）
を計算することは、以下を計算することを含む：

【0162】

【数11】

【0163】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＣ／Ｇであり、Ｃ／Ｇのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｃ／Ｇ）
を計算することは、以下の対数尤度を計算することを含む：

【0164】

【数12】

【0165】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＣ／Ｔであり、Ｃ／Ｔのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｃ／Ｔ）
を計算することは、以下を計算することを含む：

【0166】

【数13】

【0167】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＣ／Ｔであり、Ｃ／Ｔのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｃ／Ｔ）
を計算することは、以下の対数尤度を計算することを含む：

【0168】

【数14】

【0169】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＧ／Ｇであり、Ｇ／Ｇのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｇ／Ｇ）
を計算することは、以下を計算することを含む：

【0170】

【数15】

【0171】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＧ／Ｇであり、Ｇ／Ｇのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｇ／Ｇ）
を計算することは、以下の対数尤度を計算することを含む：

【0172】

【数16】

【0173】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＧ／Ｔであり、Ｇ／Ｔのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｇ／Ｔ）
を計算することは、以下を計算することを含む：

【0174】

【数17】

【0175】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＧ／Ｔであり、Ｇ／Ｔのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｇ／Ｔ）
を計算することは、以下の対数尤度を計算することを含む：

【0176】

【数18】

【0177】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＴ／Ｔであり、Ｔ／Ｔのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｔ／Ｔ）
を計算することは、以下を計算することを含む：

【0178】

【数19】

【0179】

いくつかの実施形態では、それぞれの候補遺伝子型ＧはＴ／Ｔであり、Ｔ／Ｔのそれぞれの尤度：
Ｐｒ（Ｆ_Ａ，Ｆ_Ｇ，Ｆ_ＣＴ│Ｆ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｒ_ＡＧ，Ｒ_Ｃ，Ｒ_Ｔ│Ｒ_ＡＣＧＴ，ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ε）^＊Ｐｒ（Ｔ／Ｔ）
を計算することは、以下の対数尤度を計算することを含む：

【0180】

【数20】

【0181】

いくつかの実施形態では、１つ以上のそれぞれの尤度計算は、対応する順鎖及び逆鎖上のＣのカウント間の見かけの不一致を説明する前に、対応する亜硫酸水素塩変換率を更に含む。例えば、より多数のＣ塩基が順鎖上に観察される場合、これは、Ｔ／Ｔが最終的にＣ／Ｃ遺伝子型のＣ／Ｔよりも可能性が低いことを示唆する。亜硫酸水素塩変換率、塩基品質スコア、及び他のシーケンシング情報を説明する尤度計算の例は、当技術分野で公知である。

【0182】

ブロック３４６を参照すると、いくつかの実施形態では、変異コールのための方法３２０は、（例えば、ブロック３４４で計算された）複数の尤度がゲノム位置における変異コールをサポートするかどうかを判定することを更に含む。いくつかの実施形態では、これは、ゲノム位置の（例えば、参照遺伝子型を含む）提案された遺伝子型のいずれかの複数の尤度中の任意の尤度が変異閾値を満たすかどうかを判定することを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム位置の（例えば、参照遺伝子型を含む）提案された遺伝子型のいずれかの尤度が変異閾値を満たす場合、ゲノム位置における変異が同定されたとみなされる。したがって、複数の異なる変異対立遺伝子に対応する複数の尤度のうちで、ある変異対立遺伝子の尤度が閾値を満たす場合、複数の異なる変異対立遺伝子のうちでその変異対立遺伝子がコールされる。３つ以上の変異対立遺伝子が閾値を満たす場合、閾値を満たす尤度が最も高い変異対立遺伝子がコールされる。変異対立遺伝子のいずれも閾値を満たさない場合、変異対立遺伝子はコールされない。

【0183】

いくつかの実施形態では、尤度は、対数尤度（例えば、非正規化尤度）として表され、変異閾値は、ゲノム位置の参照遺伝子型の対数尤度が－１０未満である場合に満たされる。いくつかの実施形態では、変異閾値は、ゲノム位置の参照遺伝子型の対数尤度が－１未満、－５未満、－１０未満、－２５未満、－５０未満、又は－１００未満である場合に満たされる。いくつかの実施形態では、尤度は対数尤度として表され、変異閾値は、ゲノム位置の参照遺伝子型の対数尤度が－２５～－５である場合に満たされる。いくつかの実施形態では、尤度は対数尤度として表され、変異閾値は、ゲノム位置の参照遺伝子型の対数尤度が－１０～－１、－１０～－５、－２５～－１、－２５～－１０、－２５～－１５、－５０～－１、－５０～－５、－５０～－１０、又は－５０～－２５である場合に満たされる。

【0184】

いくつかの実施形態では、方法３２０は、ゲノム位置における変異がコールされると、ゲノム位置の候補遺伝子型のセットのうちで、複数の尤度中の最良の尤度を有する候補遺伝子型を変異として選択することによって、変異の同一性を判定することを更に含む。いくつかの実施形態では、この判定は、候補遺伝子型をそれらの対応する尤度又は対数尤度によってランク付けすることができる。いくつかの実施形態では、変異について最も高くランク付けされた遺伝子型を選択することによって、変異の単一の同一性がコールされる。いくつかの実施形態では、変異の上位２つ、上位３つ、又は上位４つのランクの遺伝子型をそれぞれ選択することによって、変異の少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの同一性がコールされる。

【0185】

いくつかの実施形態では、方法３２０は、試験対象の複数のゲノム位置中の各ゲノム位置について方法を繰り返すこと（例えば、それによって、試験対象に対する複数の変異コールを取得すること）を更に含む。

【0186】

いくつかの実施形態では、複数の変異コールは、２００個の変異コールを含む。いくつかの実施形態では、複数の変異コールは、試験対象の生体試料から取得されたシーケンシングデータを使用する試験対象に対する少なくとも１０個の変異コール、少なくとも２０個の変異コール、少なくとも３０個の変異コール、少なくとも４０個の変異コール、少なくとも５０個の変異コール、少なくとも６０個の変異コール、少なくとも７０個の変異コール、少なくとも８０個の変異コール、少なくとも９０個の変異コール、少なくとも１００個の変異コール、少なくとも２００個の変異コール、少なくとも３００個の変異コール、少なくとも４００個の変異コール、少なくとも５００個の変異コール、少なくとも６００個の変異コール、少なくとも７００個の変異コール、少なくとも８００個の変異コール、少なくとも９００個の変異コール、少なくとも１０００個の変異コール、少なくとも２０００個の変異コール、少なくとも３０００個の変異コール、少なくとも４０００個の変異コール、１０～１０，０００個の変異コール、５０～５０００個の変異コール、又は１００～４５００個の変異コールを含む。いくつかの実施形態では、複数の変異コールにおいて取得される変異コールの数は、複数のゲノム位置中のゲノム位置の数に対応する。

【0187】

いくつかの実施形態では、複数の変異コールはフィルタリングされる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかを使用して取得された変異コールは、１つ以上のフィルタリング基準を満たさず、更なる分析のため（例えば、変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖細胞変異対立遺伝子として同定するため）に保持されない。

【0188】

いくつかの実施形態では、変異コールは、試験対象由来の適合生殖系列試料から取得されたシーケンシングデータセットを使用して生殖系列変異コールであると判定された場合、更なる分析から除去される。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、試験対象の第２の生体試料中の第２の複数の核酸断片のシーケンシングから取得された電子形態の第２の複数の核酸断片配列を使用して第２の複数の変異コールを取得することであって、第２の生体試料は対象由来の適合生殖系列試料（例えば、正常組織試料）である、取得することと、複数の変異コールから、第２の複数の変異コール中にもあるそれぞれの変異コールを除去すること（例えば、生殖系列変異コールを除去すること）とを更に含む。いくつかの実施形態では、（例えば、試料適合シーケンシングアッセイを使用する試験対象について）ＦｒｅｅＢａｙｅｓ、ＶａｒＤｉｃｔ、ＭｕＴｅｃｔ、ＭｕＴｅｃｔ２、ＭｕＳＥ、ＦｒｅｅＢａｙｅｓ、ＶａｒＤｉｃｔ、及び／又はＭｕＴｅｃｔなどの変異コールアルゴリズムが、変異を生殖系列変異として同定する場合、変異対立遺伝子は生殖系列変異として同定される。

【0189】

いくつかの実施形態では、変異コールは、既知の生殖系列変異のリスト（例えば、ｇｎｏｍａｄ、ｄｂＳＮＰ）から取得された生殖系列変異コールである場合、更なる分析から除去される。ＧｎｏｍＡＤ及びｄｂＳＮＰは、既知の生殖系列変異の参照データベースを指す。いくつかの実施形態では、任意の他の既知の生殖系列変異が、第１の複数の変異コールから除去される。

【0190】

いくつかの実施形態では、変異コールは、試験対象以外の対象の組織試料（例えば、再発性変異組織ブラックリスト）中に見出された場合、更なる分析から除去される。例えば、いくつかの実施形態では、参照ゲノムのいくつかの部分は、より高い情報価値を有する（例えば、変異の特定又は下流分析においてより高い情報価値を有する）と判定される。

【0191】

いくつかの実施形態では、変異コールは、品質メトリック（例えば、最小対立遺伝子画分、最大対立遺伝子画分、塩基コールの品質（例えば、Ｐｈｒｅｄスコア）、最小深度など）を満たさない場合、更なる分析から除去される。

【0192】

いくつかの実施形態では、品質メトリックは、それぞれの変異コールのゲノム位置にマッピングされる、電子形態のそれぞれの複数の核酸断片配列における最小変異対立遺伝子画分である。いくつかの実施形態では、最小変異対立遺伝子画分は１０パーセントである。いくつかの実施形態では、最小変異対立遺伝子画分は、１パーセント未満、２パーセント未満、３パーセント未満、４パーセント未満、５パーセント未満、６パーセント未満、７パーセント未満、８パーセント未満、９パーセント未満、１０パーセント未満、１５パーセント未満、又は２０パーセント未満である。

【0193】

いくつかの実施形態では、品質メトリックは、それぞれの変異コールのゲノム位置にマッピングされる、電子形態のそれぞれの複数の核酸断片配列における最大変異対立遺伝子画分である。いくつかの実施形態では、最大変異対立遺伝子画分は９０パーセントである。いくつかの実施形態では、最大変異対立遺伝子画分は、少なくとも５５パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、又は少なくとも９９パーセントである。

【0194】

いくつかの実施形態では、品質メトリックは、それぞれの変異コールのゲノム位置にマッピングされる、電子形態のそれぞれの複数の核酸断片配列の最小深度である。いくつかの実施形態では、最小深度は１０である。いくつかの実施形態では、最小深度は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、又は少なくとも２００である。

【0195】

いくつかの実施形態では、変異コールは、既知のノイズの多いゲノム位置のブラックリストに列挙されている場合、更なる分析から除去される。いくつかの実施形態では、そのような部位は、以下の実施例５に記載するＣＣＧＡ－１法からの６４２個の試料のセットに基づく。いくつかの実施形態では、ブラックリストは、ＥＮＣＯＤＥブラックリストの全て又は一部である。

【0196】

いくつかの実施形態では、変異コールは、適合正常対照試料を使用して（例えば、液体生体試料及び患者適合正常組織試料由来のｃｆＤＮＡを使用して）実施される。いくつかの実施形態では、変異コールは、適合正常対照試料なしで（例えば、液体生体試料由来のｃｆＤＮＡを使用して）実施される。

【0197】

変異コールのための代替の方法が企図され得る。適切な変異コール方法としては、ＳＮＶ及びインデルをコールするための方法（例えば、ＦｒｅｅＢａｙｅｓ、ＧＡＴＫ ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ、Ｐｌａｔｙｐｕｓ、Ｓａｍｔｏｏｌｓ／ＢＣＦｔｏｏｌｓなど）、体細胞突然変異をコールするための方法（例えば、ｄｅｅｐＳＮＶ、ＭｕＳＥ、ＭｕＴｅｃｔ２、ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒ、Ｓｔｒｅｌｋａ２、ＶａｒＤｉｃｔ、ＶａｒＳｃａｎ２など）、コピー数変異をコールするための方法（例えば、ｃｎ．ＭＯＰＳ、ＣＯＮＴＲＡ、ＣｏＮＶＥＸ、ＥｘｏｍｅＣＮＶ、ＥｘｏｍｅＤｅｐｔｈ、ＸＨＭＭなど）、構造変異をコールするための方法（例えば、ＤＥＬＬＹ、Ｌｕｍｐｙ、Ｍａｎｔａ、Ｐｉｎｄｅｌ、ＳＶＭｅｒｇｅなど）、及び／又は遺伝子融合（ＲＮＡ－ｓｅｑ）をコールするための方法（例えば、ｆｕｓｉｏｎＣａｔｃｈｅｒ、ｆｕｓｉｏｎＭａｐ、ｍａｐＳｐｌｉｃｅ、ＳＯＡＰｆｕｓｅ、ＳＴＡＲ－Ｆｕｓｉｏｎ、ＴｏｐＨａｔ－Ｆｕｓｉｏｎなど）が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異コールは、本明細書に開示する方法のいずれか、又はそれらの任意の置換、修飾、付加、欠失、及び／もしくは組み合わせを使用して行われる。

【0198】

変異コールのための方法は、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年２月２５日出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｌｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ」と題する米国特許出願第１７／１８５８８５号、及び２０２１年２月出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｌｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ」と題するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１９７４６号により詳細に記載されている。

【0199】

核酸断片配列の取得
図２Ａのブロック２０６を参照すると、本方法は、このゲノム位置上にマッピングされる、試験対象から取得された生体試料（例えば、液体生体試料）に由来するシーケンシングデータセット（例えば、少なくとも１×１０^６個、少なくとも２×１０^６個、少なくとも３×１０^６個、少なくとも４×１０^６個、少なくとも５×１０^６個、少なくとも６×１０^６個、少なくとも７×１０^６個、少なくとも８×１０^６個、少なくとも９×１０^６個、少なくとも１×１０^７個、又は少なくとも１×１０^８個の核酸断片配列を含む）におけるそれぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のメチル化状態及びそれぞれの配列を取得することを更に含む。

【0200】

いくつかの実施形態では、生体試料は、任意の適切な方法を使用してシーケンシングのために調製される（上記の「対象及び試料」を参照のこと）。いくつかの実施形態では、生体試料の調製は、試験対象のためのそれぞれの複数の核酸断片（例えば、核酸分子）を取得することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料から取得されるそれぞれの複数の核酸断片は、無細胞核酸断片である。

【0201】

生体試料から複数の核酸断片を取得した後、いくつかの実施形態では、核酸断片をシーケンシングする。いくつかの実施形態では、シーケンシングはメチル化シーケンシングである。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、全ゲノムメチル化シーケンシングである。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、複数の核酸プローブを使用する標的ＤＮＡメチル化シーケンシングである。いくつかの実施形態では、複数の核酸プローブは、１００個以上のプローブを含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸プローブは、１００個以上、２００個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、６００個以上、７００個以上、８００個以上、９００個以上、１０００個以上、２０００個以上、３０００個以上、４０００個以上、５０００個以上、６０００個以上、７０００個以上、８０００個以上、９０００個以上、１０，０００個以上、２５，０００個以上、又は５０，０００個以上のプローブを含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸プローブは、５０，０００個以下、２５０，０００個以下、１０，０００個以下、９０００個以下、８０００個以下、７０００個以下、６０００個以下、５０００個以下、４０００個以下、３０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、９００個以下、８００個以下、７００個以下、６００個以下、又は５００個以下のプローブを含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸プローブは、１００～５００個、５００～１０００個、１０００～２０００個、１０００～５０００個、１００～５０００個、５０００～１０，０００個、又は１０，０００～５０，０００個のプローブを含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸プローブは、１００個以上のプローブから始まり、５０，０００個以下のプローブで終わる別の範囲内にある。いくつかの実施形態では、プローブの一部又は全ては、その中で参照される配列表を含めて、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｒ Ｏｒｉｇｉｎ，ｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｙｐｅ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０２０１５４６８２Ａ３号に記載されているゲノム領域に一意的にマッピングされる。いくつかの実施形態は、プローブの一部又は全ては、その中で参照される配列表を含めて、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１号に記載されているゲノム領域に一意的にマッピングされる。いくつかの実施形態は、プローブの一部又は全ては、その中で参照される配列表を含めて、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌｓ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２号に記載されているゲノム領域に一意的にマッピングされる。

【0202】

いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、それぞれの複数の核酸断片中のそれぞれの核酸断片における１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出する。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、それぞれの複数の核酸断片中の核酸断片における１つ以上の非メチル化シトシン又は１つ以上のメチル化シトシンの、対応する１つ以上のウラシルへの変換を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウラシルは増幅中に変換され、メチル化シーケンシングの間に１つ以上の対応するチミンとして検出される。いくつかの実施形態では、１つ以上の非メチル化シトシン又は１つ以上のメチル化シトシンの変換は、化学変換、酵素変換、又はそれらの組み合わせを含む。

【0203】

いくつかの実施形態では、シーケンシングの前に、複数の核酸断片を処理して、非メチル化シトシンをウラシルに変換する。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、亜硫酸水素塩シーケンシングである。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、メチル化シトシンを変換することなく非メチル化シトシンをウラシルに変換するＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）の亜硫酸水素塩処理を使用する。例えば、いくつかの実施形態では、例えばＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）－Ｇｏｌｄ、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）－Ｄｉｒｅｃｔ、又はＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から入手可能）などの市販のキットを亜硫酸水素塩変換に使用する。いくつかの実施形態では、非メチル化シトシンのウラシルへの変換は、酵素反応を使用して達成される。例えば、変換は、ＡＰＯＢＥＣ－Ｓｅｑ（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）などの非メチル化シトシンのウラシルへの変換のための市販のキットを使用することができる。

【0204】

いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシングである。いくつかの実施形態では、全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシングアッセイは、ゲノム中のメチル化パターンの変異を探す。「Ａｎｏｍａｌｏｕｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願公開第ＵＳ ２０１９－０２８７６５２ Ａ１号を参照されたい。

【0205】

変換された無細胞核酸断片から、シーケンシングライブラリーを調製する。必要に応じて、シーケンシングライブラリーは、複数のハイブリダイゼーションプローブ、例えば各々が参照により本明細書に組み込まれる、「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｒ Ｏｒｉｇｉｎ，ｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｙｐｅ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０２０１５４６８２Ａ３号、「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１号、及び／又は「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌｓ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２号に開示されている領域の任意の組み合わせを使用して、細胞起源についての高い情報価値を有する無細胞核酸断片又はゲノム領域が富化される。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、特に指定された無細胞核酸断片又は標的領域にハイブリダイズし、例えば各々が参照により本明細書に組み込まれる、「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｒ Ｏｒｉｇｉｎ，ｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｙｐｅ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０２０１５４６８２Ａ３号、「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１号、及び／又は「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌｓ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２号に開示されているように、その後のシーケンシング及び分析のためにそれらの断片又は領域が富化された短いオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブを使用して、細胞起源についての高い情報価値を有する特定のＣｐＧ部位のセットの標的化された高深度分析を行う。シーケンシングライブラリー又はその一部は、一旦調製されると、複数の配列リード（例えば、核酸断片配列）を取得するためにシーケンシングされ得る。

【0206】

いくつかの実施形態では、任意の形態のシーケンシングを使用して、試験対象の生体試料に由来する複数の核酸断片から配列リード（例えば、核酸断片配列）を取得することができる。シーケンシング方法の例としては、ハイスループットシーケンシングシステム、例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４プラットフォーム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＯＬＩＤプラットフォーム、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡシーケンシング技術、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．のハイブリダイゼーションによるシーケンシングプラットフォーム、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）技術、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの合成によるシーケンシングプラットフォーム、並びにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのライゲーションによるシーケンシングプラットフォームが挙げられるが、これらに限定されない。Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ技術及びナノポアシーケンシングを使用して、生体試料から取得された複数の核酸断片から配列リードを取得することもできる。

【0207】

いくつかの実施形態では、合成によるシーケンシング及び可逆的ターミネーターベースのシーケンシング（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ；ＨＩＳＥＱ ２０００；ＨＩＳＥＱ ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ））を使用して、生体試料由来の複数の核酸断片（例えば、無細胞核酸断片）から配列リードを取得する。いくつかのそのような実施形態では、何百万もの核酸断片（例えば、ｃｆＤＮＡ断片）が並行してシーケンシングされる。このタイプのシーケンシング技術の一例では、表面上にオリゴヌクレオチドアンカー（例えば、アダプタープライマー）が結合している８つの個々のレーンを有する光学的に透明なスライドを含むフローセルが使用される。フローセルは、多くの場合、結合された分析物上に試薬溶液を保持し、かつ／又は試薬溶液の規則正しい通過を可能にするように構成された固体支持体である。いくつかの例では、フローセルは、平面形状であり、光学的に透明であり、一般にはミリメートル又はサブミリメートルスケールであり、分析物／試薬相互作用が生じるチャネル又はレーンを有することが多い。いくつかの実施形態では、複数の核酸断片（例えば、ｃｆＤＮＡ断片）を含む試料は、検出を容易にするシグナル又はタグを含むことができる。いくつかのそのような実施形態では、核酸断片からの配列リードの取得は、例えば、フローサイトメトリー、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、遺伝子チップ分析、マイクロアレイ、質量分析、細胞蛍光測定分析、蛍光顕微鏡法、共焦点レーザー走査顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、アフィニティークロマトグラフィー、手動バッチモード分離、電場懸濁、シーケンシング、及びそれらの組み合わせなどの様々な技術を介してシグナル又はタグの定量情報を取得することを含む。

【0208】

いくつかの実施形態では、シーケンシングは、全ゲノムメチル化シーケンシング（例えば、全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシング（whole genome bisulfite sequencing、ＷＧＢＳ））及び／又は全ゲノムシーケンシング（例えば、全ゲノムシーケンシング（whole genome sequencing、ＷＧＳ）又は全エクソームシーケンシング（whole exome sequencing、ＷＥＳ））を含み、シーケンシングは、試験対象のゲノムの少なくとも一部をシーケンシングするために使用される。いくつかの実施形態では、ゲノムの部分は、ゲノム（例えば、ヒト参照ゲノム）の少なくとも１０パーセント、２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９９パーセント、９９．９パーセント又は全てである。いくつかの実施形態では、シーケンシングは、全ゲノムメチル化シーケンシング及び／又は全ゲノムシーケンシングを含み、シーケンシングは、ゲノムのシーケンシングされた部分全体にわたって、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍のゲノムの部分のシーケンシングカバレッジ（例えば、シーケンシング深度）を取得する。いくつかの実施形態では、シーケンシングは、ゲノム全体にわたって、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍のシーケンシングカバレッジを取得する。

【0209】

いくつかの実施形態では、シーケンシングは、標的シーケンシング（例えば、標的メチル化シーケンシング）であり、標的シーケンシングは、試験対象（例えば、１つ以上のプローブがマッピングされる遺伝子のパネル）のゲノムの標的部分の少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍のシーケンシングカバレッジ（例えば、シーケンシング深度）を取得する。いくつかの実施形態では、標的シーケンシングは、ゲノムの標的領域全体にわたって、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも２，０００倍、少なくとも３，０００倍、少なくとも４，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも１５，０００倍、少なくとも２０，０００倍、少なくとも２５，０００倍、少なくとも３０，０００倍、少なくとも４０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも６０，０００倍、又は少なくとも７０，０００倍のシーケンシングカバレッジを取得する。

【0210】

いくつかの実施形態では、生体試料のシーケンシングから取得された複数の配列リード例えば、核酸断片配列は、シーケンシングデータセット中の少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも６０００個、少なくとも７０００個、少なくとも８０００個、少なくとも９０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも５００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、少なくとも２，０００，０００個、少なくとも３，０００，０００個、少なくとも４，０００，０００個、少なくとも５，０００，０００個、少なくとも６，０００，０００個、少なくとも７，０００，０００個、少なくとも８，０００，０００個、少なくとも９，０００，０００個、又はそれ以上の配列リードを含む。いくつかの実施形態では、複数の配列リードは、シーケンシングデータセット中の少なくとも１×１０^７個、少なくとも２×１０^７個、少なくとも３×１０^７個、少なくとも４×１０^７個、少なくとも５×１０^７個、少なくとも６×１０^７個、少なくとも７×１０^７個、少なくとも８×１０^７個、少なくとも９×１０^７個、少なくとも１×１０^８個、少なくとも２×１０^８個、少なくとも３×１０^８個、少なくとも４×１０^８個、少なくとも５×１０^８個、少なくとも６×１０^８個、少なくとも７×１０^８個、少なくとも８×１０^８個、少なくとも９×１０^８個、少なくとも１×１０^９個、又はそれ以上の配列リードを含む。いくつかの実施形態では、複数の配列リードは、シーケンシングデータセット中の５×１０^７個以下、１×１０^７個以下、５×１０^６個以下、４×１０^６個以下、３×１０^６個以下、２×１０^６個以下、１×１０^６個以下、５００，０００個以下、１００，０００個以下、５０，０００個以下、３０，０００個以下、２０，０００個以下、１０，０００個以下、９０００個以下、８０００個以下、７０００個以下、６０００個以下、５０００個以下、４０００個以下、３０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、又はそれ未満の配列リードを含む。いくつかの実施形態では、複数の配列リードは、シーケンシングデータセット中の１０００～５０００個、１０００～１０，０００個、２０００～２０，０００個、５０００～５０，０００個、１０，０００～１００，０００個、１００，０００～５００，０００個、１０，０００～５００，０００個、５００，０００～１，０００，０００個、１，０００，０００～３０，０００，０００個、３０，０００，０００～８０，０００，０００個、又は１０，０００，０００～５００，０００，０００個の配列リードを含む。いくつかの実施形態では、複数の配列リードは、１０００個以上の配列リードから始まり、１×１０^９個以下の配列リードで終わる別の範囲内にある。

【0211】

いくつかの実施形態では、複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のそれぞれの配列を取得することは、シーケンシングデータセット中の各核酸断片配列を参照配列（例えば、ヒト参照ゲノム）にマッピングすることを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の核酸断片配列を含むシーケンシングデータセットの全て又は一部を参照配列にマッピングすることを含む。

【0212】

例えば、それぞれのゲノム位置について、いくつかの実施形態では、本方法は、非一時的メモリに連結されたプロセッサを含むコンピュータシステムに参照ゲノム（例えば、ヒト参照ゲノム）を入力することと、コンピュータシステムを使用して、それぞれの複数の核酸断片配列中のそれぞれの核酸断片配列が、それぞれの核酸断片配列を参照ゲノムにアライメントすることによってゲノム位置にマッピングされると決定することと、を更に含む。

【0213】

いくつかの実施形態では、マッピングは、例えば、Ａｒｉｏｃで実施されるようなＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎギャップ付きアライメント、又は例えば、Ｂｏｗｔｉｅで実施されるようなＢｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換を使用して行われる。他の適切なアライメントプログラムとしては、ＢａｒｒａＣＵＤＡ、ＢＢＭａｐ、ＢＦＡＳＴ、ＢｉｇＢＷＡ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＴ、ＢＷＡ、ＢＷＡ－ＰＳＳＭ、ＣＡＳＨＸを挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、マッピングはミスマッチを許容する。いくつかの実施形態では、マッピングは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１０個超のミスマッチを含む。配列リードを参照配列にマッピングする他の方法を使用することができる。

【0214】

いくつかの実施形態では、シーケンシングデータセット中の核酸断片配列を参照配列にマッピングすることは、ＣｐＧインデックスを使用することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣｐＧインデックスは、参照配列（例えば、ヒト参照ゲノム）中の複数のＣｐＧ部位（例えば、ＣｐＧ １、ＣｐＧ ２、ＣｐＧ ３など）中の各ＣｐＧ部位のリストを含む。ＣｐＧインデックスは、ＣｐＧインデックス中のそれぞれのＣｐＧ部位について、対応する参照配列中の対応するゲノム位置を更に含み得る。したがって、それぞれの核酸配列断片中の各ＣｐＧ部位は、ＣｐＧインデックスを使用して決定することができるそれぞれの参照配列中の特定の位置にインデックス付けすることができる。いくつかの実施形態では、参照配列は、電子フォーマットで取得される。

【0215】

いくつかの実施形態では、それぞれのゲノム位置について、本方法は、複数の核酸断片配列を含むシーケンシングデータセットの全て又は一部を、ゲノム位置を含む参照配列の少なくとも一部にマッピングすることを含む。

【0216】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置にマッピングされる複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列は、マッピングによって、ゲノム位置の全て又は一部と重複すると判定される。

【0217】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置にマッピングされる複数の核酸断片配列は、ゲノム位置にマッピングされる少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも２０，０００個、又は少なくとも３０，０００個の核酸断片配列を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム位置にマッピングされる複数の核酸断片配列は、ゲノム位置にマッピングされる７０，０００個以下、５０，０００個以下、３０，０００個以下、１０，０００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、９００個以下、８００個以下、７００個以下、６００個以下、５００個以下、４００個以下、３００個以下、２００個以下、１００個以下、５０個以下、又は３０個以下の核酸断片配列を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム位置にマッピングされる複数の核酸断片配列は、ゲノム位置にマッピングされる５～２０個、２０～５０個、５０～１００個、１００～５００個、５００～１０００個、５００～５０００個、２０００～１０，０００個、又は１０，０００～７０，０００個の核酸断片配列を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム位置にマッピングされる複数の核酸断片配列は、１０個以上の核酸断片配列から始まり、７０，０００個以下の核酸断片配列で終わる別の範囲内にある。いくつかの実施形態では、ゲノム位置にマッピングされる複数の核酸断片配列は、使用されるシーケンシング方法のシーケンシングカバレッジ（例えば、シーケンシング深度）に少なくとも部分的に基づいて決定される。

【0218】

いくつかの実施形態では、本方法が複数のゲノム位置の各々に対して行われる場合、マッピングは、複数の核酸断片配列を、少なくともこれら複数のゲノム位置を含む参照配列（例えば、参照ゲノム）の領域にマッピングすることを含む。

【0219】

いくつかの実施形態では、シーケンシングデータセット中のそれぞれの核酸断片配列のメチル化状態を取得することは、それぞれの核酸断片配列中のそれぞれのＣｐＧ部位の対応するメチル化状態を判定することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、それぞれの核酸断片配列は、１つ以上のＣｐＧ部位を有することができ、核酸断片配列中のそれぞれのＣｐＧ部位は、メチル化シーケンシングによって、対応するメチル化状態を有すると判定される。

【0220】

いくつかの実施形態では、それぞれの核酸断片配列中の対応する１つ以上のＣｐＧ部位中のそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態は、それぞれのＣｐＧ部位がメチル化シーケンシングによってメチル化されていると判定された場合はメチル化されており、それぞれのＣｐＧ部位がメチル化シーケンシングによってメチル化されていないと判定された場合は非メチル化されている。いくつかの実施形態では、メチル化状態は「Ｍ」と表され、非メチル化状態は「Ｕ」と表される。

【0221】

他のメチル化状態の可能性もあり得る。例えば、いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングがそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態をメチル化又は非メチル化としてコールすることができない場合、メチル化状態は「その他」である。いくつかの実施形態では、可能性のあるメチル化状態には、多義的なメチル化状態（例えば、基礎となるＣｐＧが複数の断片配列中のいずれの断片配列によってもカバーされないことを意味する）、変異メチル化状態（例えば、断片配列が、参照配列に基づいてその予想される位置に存在するＣｐＧと一致せず、その部位での実際の変異又は配列エラーによって引き起こされ得ることを意味する）、又は競合状態（例えば、２つ以上の断片配列が両方ともＣｐＧ部位と重複するが、一貫性のないメチル化状態を有する場合）が更に含まれるが、これらに限定されない。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１２月１３日に出願された「Ｃａｎｃｅｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐａｔｃｈ ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ」と題する米国仮特許出願第６２／９４８，１２９号を参照されたい。

【0222】

いくつかの実施形態では、シーケンシングデータセット中のそれぞれの核酸断片配列のメチル化状態を取得することは、核酸断片配列のメチル化状態ベクトルを判定することを含む。いくつかの実施形態では、メチル化状態ベクトルは、それぞれの核酸断片に含まれる全てのＣｐＧ部位のメチル化状態を示すメチル化状態の配列である。メチル化状態ベクトルは、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年３月１３日に出願された「Ａｎｏｍａｌｏｕｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願第１６／３５２６０２号に、又は２０１９年５月１３日に出願された「Ｍｏｄｅｌ－Ｂａｓｅｄ Ｆｅａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国仮特許出願第６２／８４７２２３号に開示された技術のいずれかに従って更に記載されている。

【0223】

生体試料の処理、生体試料からの核酸断片の抽出、メチル化シーケンシングのための核酸断片の処理、シーケンシングライブラリーの調製、標的核酸の富化、ハイブリダイゼーションプローブ、配列リードの取得、断片配列の参照配列へのマッピング、及び／又はメチル化状態ベクトルの生成を含む、試験対象の生体試料から取得された核酸断片のシーケンシング方法は、図７、図８、及び図９を参照して、以下の実施例１、実施例２、及び実施例４に更に詳細に記載される。生体試料の処理、生体試料からの核酸断片の抽出、メチル化シーケンシングのための核酸断片の処理、シーケンシングライブラリーの調製、標的核酸の富化、ハイブリダイゼーションプローブ、配列リードの取得、断片配列の参照配列へのマッピング、及び／又はメチル化状態ベクトルの生成を含む、核酸断片配列を取得するための他の方法が企図される。

【0224】

サブセットの割り当て
ブロック２０８を参照すると、本方法は、（ｉ）ゲノム位置における参照対立遺伝子の同定と、（ｉｉ）それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のそれぞれの配列とを使用して、それぞれの複数の核酸断片配列のうちでゲノム位置に参照対立遺伝子を有する各核酸断片配列を参照サブセットに割り当てることを更に含む。本方法はまた、（ｉ）ゲノム位置における変異対立遺伝子の同定と、（ｉｉ）それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のそれぞれの配列とを使用して、それぞれの複数の核酸断片配列のうちでゲノム位置に変異対立遺伝子を有する各核酸断片配列を変異サブセットに割り当てることを含む。

【0225】

いくつかの実施形態では、各核酸断片配列の参照サブセットへの割り当ては、シーケンシングデータセット中のそれぞれの核酸断片シーケンシングごとに、それぞれの核酸断片配列がゲノム位置に参照対立遺伝子を有するかどうかを、シーケンシングによって取得された核酸断片配列と参照対立遺伝子の核酸配列（ブロック２０２を参照して上述したように同定される；「参照対立遺伝子及び変異対立遺伝子」を参照されたい）との比較に基づいて判定することを含む。いくつかの実施形態では、比較はルックアップテーブルを使用して実行される。

【0226】

いくつかの実施形態では、各核酸断片配列の変異サブセットへの割り当ては、シーケンシングデータセット中のそれぞれの核酸断片シーケンシングごとに、それぞれの核酸断片配列がゲノム位置に変異対立遺伝子を有するかどうかを、シーケンシングによって取得された核酸断片配列と変異対立遺伝子の核酸配列（ブロック２０４を参照して上述したように同定される；「参照対立遺伝子及び変異対立遺伝子」を参照されたい）との比較に基づいて判定することを含む。

【0227】

いくつかの実施形態では、本方法は、参照サブセットに割り当てられた核酸断片配列の数のカウントを取得することを含む。

【0228】

いくつかの実施形態では、本方法は、変異サブセットに割り当てられた核酸断片配列の数のカウントを取得することを含む。

【0229】

いくつかの実施形態では、シーケンシングデータセット中の複数の核酸断片配列は、１つ以上のフィルタを使用してフィルタリングされる。いくつかの実施形態では、フィルタリングは、参照サブセット及び変異サブセットへの核酸断片配列の割り当ての前に行われる。いくつかの実施形態では、フィルタリングは、参照サブセット及び変異サブセットへの核酸断片配列の割り当ての後に行われる。いくつかの実施形態では、フィルタリングは、参照サブセット及び変異サブセットに割り当てられた核酸断片配列のカウントを使用して行われる。いくつかの実施形態では、フィルタリングは、それぞれのゲノム位置のそれぞれの複数の核酸断片配列から、フィルタリング基準を満たさない１つ以上の核酸断片配列を除去することを含む。いくつかの実施形態では、方法が複数のゲノム位置に対して行われる場合、フィルタリングは、複数のゲノム位置からフィルタリング基準を満たさない１つ以上のゲノム位置を除去することを含む。いくつかの実施形態では、本方法が複数のゲノム位置に対して行われる場合、フィルタリングは、それぞれのゲノム位置にマッピングされる少なくとも閾値量の核酸断片配列がフィルタリング基準を満たさない場合、複数のゲノム位置からゲノム位置を除去することを含む。

【0230】

例えば、いくつかの実施形態では、シーケンシングデータセット中の複数の核酸断片配列は、ゲノム位置に参照対立遺伝子を含む断片に対する変異対立遺伝子を含む断片の比に基づいてフィルタリングされる。いくつかの実施形態では、方法が複数のゲノム位置に対して行われる場合、フィルタリングは、参照対立遺伝子断片に対する変異対立遺伝子断片の比が閾値比未満であるゲノム位置を除去することを含む。いくつかの実施形態では、方法が複数のゲノム位置に対して行われ場合、フィルタリングは、変異サブセット中の変異対立遺伝子断片のカウントが閾値カウント未満であるゲノム位置を除去することを含む。

【0231】

いくつかの実施形態では、変異サブセット中の変異対立遺伝子断片の閾値カウントは、変異対立遺伝子のゲノム領域にマッピングされ、変異対立遺伝子を有する試験対象由来の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、又は少なくとも１０００個の核酸断片である。

【0232】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタは、最小変異対立遺伝子頻度、最大変異対立遺伝子頻度、それぞれの対立遺伝子の最小シーケンシング深度、試験対象由来の（例えば、ｆｒｅｅｂａｙｅｓによってマークされた）生殖系列変異のブラックリスト、カスタムデータベースのブラックリスト（例えば、再発性組織ブラックリスト）、又は参照データベース由来（例えば、ｇｎｏｍａｄ及び／もしくはｄｂＳＮＰデータベース由来）の生殖系列変異のブラックリストを含む。

【0233】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタは、最小変異対立遺伝子頻度（最小ＶＡＦ）である。いくつかのそのような実施形態では、最小対立遺伝子頻度は、試験対象由来の核酸断片の少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％である。

【0234】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタは、最大変異対立遺伝子頻度（最大ＶＡＦ）である。いくつかの実施形態では、最大対立遺伝子頻度は、試験対象由来の核酸断片の９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、又は５０％以下である。

【0235】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタは、（例えば、参照サブセット及び変異サブセットを含む、ゲノム位置における全ての核酸断片配列の）最小シーケンシング深度である。いくつかの実施形態では、最小シーケンシング深度は、ゲノム位置にマッピングされる試験対象由来の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、又は少なくとも１０００個の核酸断片である。

【0236】

他のフィルタも企図され得る。例えば、いくつかの実施形態では、複数の核酸断片配列は、例えば、深度、最小マッピング品質（ＭＡＰＱ）、重複断片、コールされていない断片、変換されていない断片、多義的なコール、変異コール、競合コール、最小もしくは最大断片長、塩基対の最小数もしくは最大数、最小もしくは最大ＣｐＧカウント、及び／又はｐ値（以下でより詳細に説明する）についてフィルタリングされる。

【0237】

更に、いくつかの実施形態では、シーケンシングデータセットは、バイオインフォマティクスパイプラインなどの任意の適切な方法によって更に処理される。例えば、いくつかの実施形態では、複数の核酸断片配列は、例えば、プルダウン、増幅、バックグラウンドコピー数（例えば、重複）、及び／又はシーケンシングバイアス（例えば、マッピング可能性、ＧＣバイアスなど）を説明するために更に正規化される。

【0238】

指標の入力
ブロック２１０を参照すると、本方法は、（例えば、少なくとも１０個のパラメータを含む）訓練された二値分類器に、少なくとも、（ｉ）変異サブセット中の各核酸断片配列のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標、及び（ｉｉ）変異サブセット中の核酸断片配列の数に対する参照サブセット中の核酸断片配列の数の指標を適用し、それによって、訓練された二値分類器から、試験対象におけるゲノム位置における変異対立遺伝子の体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての同定を取得することを更に含む。

【0239】

いくつかの実施形態では、（ｉ）変異サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、ｐ値である。いくつかの実施形態では、ｐ値は、それぞれの核酸断片が健常参照と比較して異常にメチル化されているかどうかを示す。

【0240】

したがって、図２Ｂのブロック２１２を参照すると、例示的な実施形態では、それぞれの複数の核酸断片配列中の第１の核酸断片配列は複数のＣｐＧ部位を有し、第１の核酸断片配列は複数のＣｐＧ部位全体にわたって対応するメチル化パターンを有し、第１の核酸断片配列のメチル化状態はｐ値であり、方法は、第１の核酸断片配列の対応するメチル化パターンを、それぞれの複数のＣｐＧ部位を各々が有する健常な非癌コホートデータセット中のそれらの核酸断片配列のメチル化パターンの対応する分布と比較することによって、第１の核酸断片配列のｐ値を少なくとも部分的に決定することを更に含む。

【0241】

Ｐ値決定は、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年５月２２日に出願された「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｗｈｅｔｈｅｒ ａ Ｓｕｂｊｅｃｔ ｈａｓ ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｌｅａｒｎｉｎｇ」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３４３１７号の実施例５、及び２０１９年３月１３日に出願され、米国特許出願公開第２０１９／０２８７６５２号として現在公開されている「Ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願第１６／３５２，６０２号に更に記載されている。ｐ値決定の目標は、核酸断片配列における異常メチル化を、それらの対応するメチル化状態ベクトルに基づいて測定することであり得る。例えば、生体試料中の各核酸断片について、予想されるメチル化状態ベクトル（例えば、予測されるメチル化状態ベクトルが、健常対象のコホート（複数）の配列分析から決定される）と比較して、断片が異常にメチル化されているか否かが、断片に対応するメチル化状態ベクトルを使用して、（例えば、断片に由来する配列リードの分析を介して）判定される。このような核酸断片（例えば、無細胞核酸断片）のメチル化状態ベクトルの生成は、上記及び、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１９／０２８７６５２号に開示されている。

【0242】

いくつかの実施形態では、健常コホートは、少なくとも２０個の対象を含み、複数の核酸断片配列は、少なくとも１０，０００個の異なる対応するメチル化パターンを含む。いくつかの実施形態では、健常コホートは、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、又は少なくとも１００個の対象を含む。いくつかの実施形態では、健常コホートは、１～１０個、１０～５０個、５０～１００個、１００～５００個、５００～１０００個、又は１０００個超の対象を含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸断片配列は、１～１０００個、１０００～２０００個、２０００～４０００個、４０００～６０００個、６０００～８０００個、８０００～１０，０００個、１０，０００～２０，０００個、２０，０００～５０，０００個、又は５０，０００個を超える異なる対応するメチル化パターンを含む。

【0243】

いくつかの実施形態では、異常断片は、閾値数を超えるＣｐＧ部位を有し、閾値パーセンテージを超えてメチル化されている（高メチル化）ＣｐＧ部位か、又は閾値パーセンテージを超えて非メチル化されている（低メチル化）ＣｐＧ部位断片のいずれかを有する断片として同定される。いくつかの実施形態では、メチル化ＣｐＧ部位及び／又は非メチル化ＣｐＧ部位の閾値パーセンテージは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、メチル化ＣｐＧ部位及び／又は非メチル化ＣｐＧ部位の閾値パーセンテージは、５０％～１００％である。

【0244】

いくつかの実施形態は、それぞれの核酸断片配列のメチル化パターン中の各状態について、配列中の次の状態を観察する尤度を決定する確率のセットを考慮して、それぞれの核酸断片配列ごとに（例えば、メチル化されている「Ｍ」及び／又はメチル化されていない「Ｕ」を含む）一連のメチル化状態が観察され得る確率を決定するために、マルコフモデル（例えば、隠れマルコフモデル「ＨＭＭ」）が使用される。いくつかの実施形態では、確率のセットは、ＨＭＭを訓練することによって取得される。いくつかの実施形態では、そのような訓練は、非癌対象のコホートから取得された観察されたメチル化状態配列（例えば、メチル化パターン）の初期訓練データセットを考慮して、統計値（例えば、第１の状態が第２の状態に遷移する確率（遷移確率）及び／又は所与のメチル化状態がそれぞれのＣｐＧ部位について観察される確率（出力確率））を計算することを含む。いくつかの実施形態では、ＨＭＭは、教師あり訓練を使用して（例えば、基礎となる配列及び観察された状態が既知である試料を使用して）訓練される。いくつかの代替的な実施形態では、ＨＭＭは、教師なし訓練（例えば、Ｖｉｔｅｒｂｉ学習、最尤推定、期待値最大化訓練、及び／又はＢａｕｍ－Ｗｅｌｃｈ訓練）を使用して訓練される。例えば、Ｂａｕｍ－Ｗｅｌｃｈアルゴリズムなどの期待値最大化アルゴリズムは、観察された試料配列から遷移確率及び出力確率を推定し、観察された配列を最もよく説明するパラメータ化された確率モデルを生成する。そのようなアルゴリズムは、正しく予測された状態の予想数が最大化されるまで、尤度関数の計算を繰り返す。

【0245】

いくつかの実施形態では、それぞれの核酸断片配列のｐ値は、マルコフモデル又は隠れマルコフモデル以外の方法によって決定される。いくつかの実施形態では、それぞれの核酸断片配列のｐ値は、混合モデルを使用して決定される。例えば、混合モデルは、同じ長さ及び同じ対応するゲノム位置における可能性のあるメチル化状態ベクトルの数に基づいて、それぞれの核酸メチル化断片のメチル化状態ベクトル（例えば、メチル化パターン）の尤度を決定することによって、核酸断片配列における異常なメチル化パターンを検出することができる。これは、参照配列（例えば、ヒト参照ゲノム）中の各ゲノム位置における指定された長さのベクトルについて複数の可能性のあるメチル化状態を生成することによって実行することができる。複数の可能性のあるメチル化状態を使用して、全ての可能性のあるメチル化状態の数、続いてゲノム位置における各々の予測されるメチル化状態の確率を求めることができる。次いで、試料核酸断片配列を予測される（例えば、可能性のある）配列とマッチングし、予測されるメチル化状態の計算された確率を取り出すことによって、参照配列におけるゲノム位置に対応する試料核酸メチル化断片の尤度を求めることができる。次いで、試料核酸断片配列の確率に基づいて、異常メチル化スコアが計算される。

【0246】

いくつかの実施形態では、それぞれの核酸メチル化断片のｐ値は、学習された表現を使用して決定される。当業者に明らかであるように、ｐ値を決定する任意の他の適切な方法が企図される。

【0247】

いくつかの実施形態では、（例えば、本明細書に開示される方法のいずれかによって決定される）ｐ値は、本明細書に開示される変異対立遺伝子を同定するためのシステム及び方法における（例えば、モデルのための）入力として使用するのに十分に異常ではない核酸断片配列を除去するためのフィルタとして使用される。

【0248】

いくつかのそのような実施形態では、閾値未満のｐ値を有する核酸断片配列は、本方法における更なる使用のために（例えば、変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定するためのモデルへの入力としての）保持される。例えば、いくつかの実施形態では、複数の核酸断片配列は、それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位全体にわたる対応するメチル化パターン（例えば、メチル化状態ベクトル）がｐ値閾値を満たさないｐ値を有するそれぞれの核酸断片配列を除去することによってフィルタリングされる。

【0249】

いくつかの実施形態では、ｐ値閾値は０．００１～０．２０である。いくつかの実施形態では、閾値は０．０１である（例えば、そのような実施形態では、ｐは＜０．０１であり得る）。いくつかの実施形態では、閾値は、０．００１、０，００５、０．０１、０．０１５、０．０２、０．０５、又は０．１０である。いくつかの実施形態では、閾値は．０００１～０．２０である。いくつかの実施形態では、複数の無細胞断片中のそれぞれの無細胞断片に対応するメチル化パターンが、０．１０以下、０．０５以下、又は０．０１以下のｐ値を有する場合、対象からのメチル化パターンのｐ値閾値が満たされる。

【0250】

再びブロック２１０を参照すると、いくつかの実施形態では、（ｉ）変異サブセット中の各核酸断片配列のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標における各指標は、変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の中心傾向の尺度、変異サブセット全体にわたる最小メチル化状態ｐ値、変異サブセット全体にわたる最大メチル化状態ｐ値、又は変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度である。

【0251】

例えば、いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標中の一指標が、変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の中心傾向の尺度であり、中心傾向の尺度は、変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の算術平均、加重平均、ミッドレンジ、ミッドヒンジ、三平均、ウィンザー化平均、平均、又は最頻値である。いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標中の一指標が、変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度であり、広がりの尺度は、変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の標準偏差、分散、範囲、又は四分位数間範囲である。

【0252】

いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の中心傾向の尺度、変異サブセット全体にわたる最小メチル化状態ｐ値、変異サブセット全体にわたる最大メチル化状態ｐ値、及び変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てを含む、変異サブセット全体にわたるメチル化状態の複数の指標である。

【0253】

いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、変異サブセット全体にわたる平均ｐ値、中央値ｐ値、最小ｐ値、最大ｐ値、及びｐ値の標準偏差を含む、変異サブセット全体にわたるメチル化状態の複数の指標である。

【0254】

いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、変異サブセットからのｐ値の最も高くランク付けされた（例えば、最も有意な）セットである。例えば、いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたるメチル化の１つ以上の指標は、変異サブセットからの最も高くランク付けされた（例えば、最も有意な）少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、又は少なくとも１０００個のｐ値を含む。いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたるメチル化の１つ以上の指標は、変異サブセットからの最も高くランク付けされた（例えば、最も有意な）上位５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は上位１％のｐ値を含む。

【0255】

いくつかの実施形態では、変異サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、メチル化状態ベクトル及び／又はその１つ以上の分布統計（例えば、変異サブセット全体にわたる中心傾向の尺度、変異サブセット全体にわたる最小値、変異サブセット全体にわたる最大値、及び変異サブセット全体にわたる広がりの尺度）を含む。

【0256】

いくつかの実施形態では、変異サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、ベータ値及び／又はその１つ以上の分布統計（例えば、変異サブセット全体にわたる中心傾向の尺度、変異サブセット全体にわたる最小値、変異サブセット全体にわたる最大値、及び変異サブセット全体にわたる広がりの尺度）を含む。

【0257】

いくつかの実施形態では、変異サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、Ｍ値及び／又はその１つ以上の分布統計（例えば、変異サブセット全体にわたる中心傾向の尺度、変異サブセット全体にわたる最小値、変異サブセット全体にわたる最大値、及び変異サブセット全体にわたる広がりの尺度）を含む。

【0258】

いくつかの実施形態では、変異サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、異常メチル化スコア及び／又はその１つ以上の分布統計（例えば、変異サブセット全体にわたる中心傾向の尺度、変異サブセット全体にわたる最小値、変異サブセット全体にわたる最大値、及び変異サブセット全体にわたる広がりの尺度）を含む。

【0259】

いくつかの実施形態では、変異サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、相互情報スコア及び／又はその１つ以上の分布統計（例えば、変異サブセット全体にわたる中心傾向の尺度、変異サブセット全体にわたる最小値、変異サブセット全体にわたる最大値、及び変異サブセット全体にわたる広がりの尺度）を含む。相互情報スコアに関する更なる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１２月１３日に出願された「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｐａｔｃｈ Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ」と題する米国仮特許出願第６２／９４８１２９号に開示されている。

【0260】

いくつかの実施形態では、中心傾向の尺度は、変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の算術平均、加重平均、ミッドレンジ、ミッドヒンジ、三平均、ウィンザー化平均、平均、又は最頻値である。いくつかの実施形態では、広がりの尺度は、変異サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の標準偏差、分散、範囲、又は四分位数間範囲である。

【0261】

いくつかの実施形態では、変異サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、変異サブセット全体にわたるメチル化状態の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも８００個、又は少なくとも１０００個の指標を含む。いくつかの実施形態では、変異サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、変異サブセット全体にわたるメチル化状態の２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、又は１０個以下の指標を含む。いくつかの実施形態では、変異サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、変異サブセット全体にわたるメチル化状態の３～１０個、５～２０個、１０～５０個、２０～１００個、５０～２００個、１００～５００個、３００～１０００個、又は５００～２０００個の指標を含む。いくつかの実施形態では、変異サブセット中のメチル化状態の１つ以上の指標は、変異サブセット全体にわたるメチル化状態の３個以上の指標から始まり、２０００個以下の指標で終わる別の範囲内にある。

【0262】

ブロック２１４を参照すると、いくつかの実施形態では、本方法は、訓練された二値分類器に、（ｉｉｉ）変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標を適用することを更に含む。

【0263】

いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位の指標は、ＣｐＧカウントである。例えば、いくつかの実施形態では、ＣｐＧカウントは、核酸断片配列に基づいて、核酸断片中のＣｐＧ部位の数を集計することによって取得される。いくつかの実施形態は、変異サブセット中の各核酸断片配列は、同じＣｐＧカウントを有する。いくつかの実施形態では、変異サブセット中の２つ以上の核酸断片配列は、異なるＣｐＧカウントを有する。いくつかの実施形態では、変異サブセット中の各核酸断片配列は、少なくとも最小数のＣｐＧ部位を有する（例えば、ゲノム位置のそれぞれの複数の核酸断片配列が、最小ＣｐＧカウント又は最大ＣｐＧカウントを使用してフィルタリングされる）。

【0264】

いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位の最小数は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のＣｐＧ部位である。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位の最小数は、１～１０個、１０～２０個、２０～３０個、３０～４０個、４０～５０個、又は５０個を超えるＣｐＧ部位である。

【0265】

いくつかの実施形態は、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの中心傾向の尺度、変異サブセット全体にわたる最小ＣｐＧカウント、変異サブセット全体にわたる最大ＣｐＧカウント、及び変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度を含む。

【0266】

例えば、いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの中心傾向の尺度であり、中心傾向の尺度は、変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの算術平均、加重平均、ミッドレンジ、ミッドヒンジ、三平均、ウィンザー化平均、平均、又は最頻値である。いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度であり、広がりの尺度は、変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの標準偏差、分散、範囲、又は四分位数間範囲である。

【0267】

いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの中心傾向の尺度、変異サブセット全体にわたる最小ＣｐＧカウント、変異サブセット全体にわたる最大ＣｐＧカウント、及び変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てを含む、変異サブセット全体にわたる複数のＣｐＧ部位指標である。

【0268】

いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウント、中央値ＣｐＧカウント、最小ＣｐＧカウント、最大ＣｐＧカウント、及びＣｐＧカウントの標準偏差を含む、変異サブセット全体にわたる複数のＣｐＧ部位指標である。

【0269】

いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、ＣｐＧ部位のゲノム位置及び／又はその１つ以上の分布統計を含む。いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、ＣｐＧ密度及び／又はその１つ以上の分布統計を含む。いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、２つ以上のＣｐＧ部位間のゲノム距離及び／又はその１つ以上の分布統計（例えば、変異サブセット全体にわたる中心傾向の尺度、変異サブセット全体にわたる最小値、変異サブセット全体にわたる最大値、及び変異サブセット全体にわたる広がりの尺度）を含む。

【0270】

いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、変異サブセット全体にわたる少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、又は少なくとも１００個のＣｐＧ指標を含む。いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、変異サブセット全体にわたる２００個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、又は１０個以下のＣｐＧ指標を含む。いくつかの実施形態では、変異サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、変異サブセット全体にわたる３～１０個、５～２０個、１０～５０個、２０～１００個、又は５０～２００個のＣｐＧ指標を含む。いくつかの実施形態では、変異サブセット中の１つ以上のＣｐＧ指標は、変異サブセット全体にわたる３個以上のＣｐＧ指標から始まり、２００個以下のＣｐＧ指標で終わる別の範囲内にある。

【0271】

ブロック２１６を参照すると、いくつかの実施形態では、訓練された二値分類器への適用は、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標を更に適用する。

【0272】

いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、ｐ値である。いくつかの実施形態では、参照サブセットのｐ値は、本明細書に開示される方法のいずれか、又は任意の適切な置換、修飾、付加、欠失、及び／もしくはそれらの組み合わせを使用して取得される。

【0273】

いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標中の各指標が、参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の中心傾向の尺度、参照サブセット全体にわたる最小メチル化状態ｐ値、変異参照全体にわたる最大メチル化状態ｐ値、又は参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度である。

【0274】

例えば、いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標中の一指標が、参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の中心傾向の尺度であり、中心傾向の尺度は、参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の算術平均、加重平均、ミッドレンジ、ミッドヒンジ、三平均、ウィンザー化平均、平均、又は最頻値である。いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標中の一指標が、参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度であり、広がりの尺度は、参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の標準偏差、分散、範囲、又は四分位数間範囲である。

【0275】

いくつかの実施形態では、訓練された二値分類器への適用は、参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の中心傾向の尺度、参照サブセット全体にわたる最小メチル化状態ｐ値、参照サブセット全体にわたる最大メチル化状態ｐ値、及び参照サブセット全体にわたるメチル化状態ｐ値の広がりの尺度のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てを含む、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の複数の指標を更に適用する。

【0276】

いくつかの実施形態では、サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、参照サブセット全体にわたる平均ｐ値、中央値ｐ値、最小ｐ値、最大ｐ値、及びｐ値の標準偏差を含む、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の複数の指標である。

【0277】

いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、参照サブセットからのｐ値の最も高くランク付けされた（例えば、最も有意な）セットである。例えば、いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたるメチル化の１つ以上の指標は、参照サブセットからの最も高くランク付けされた（例えば、最も有意な）少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、又は少なくとも１０００個のｐ値を含む。いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたるメチル化の１つ以上の指標は、参照サブセットからの最も高くランク付けされた（例えば、最も有意な）上位５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は上位１％のｐ値を含む。

【0278】

いくつかの実施形態では、参照サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、メチル化状態ベクトル及び／又はその１つ以上の分布統計（例えば、参照サブセット全体にわたる中心傾向の尺度、参照サブセット全体にわたる最小値、参照サブセット全体にわたる最大値、及び参照サブセット全体にわたる広がりの尺度）を含む。

【0279】

いくつかの実施形態では、参照サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、ベータ値及び／又はその１つ以上の分布統計（例えば、参照サブセット全体にわたる中心傾向の尺度、参照サブセット全体にわたる最小値、参照サブセット全体にわたる最大値、及び参照サブセット全体にわたる広がりの尺度）を含む。

【0280】

いくつかの実施形態では、参照サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、Ｍ値及び／又はその１つ以上の分布統計（例えば、参照サブセット全体にわたる中心傾向の尺度、参照サブセット全体にわたる最小値、参照サブセット全体にわたる最大値、及び参照サブセット全体にわたる広がりの尺度）を含む。

【0281】

いくつかの実施形態では、参照サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、異常メチル化スコア及び／又はその１つ以上の分布統計（例えば、参照サブセット全体にわたる中心傾向の尺度、参照サブセット全体にわたる最小値、参照サブセット全体にわたる最大値、及び参照サブセット全体にわたる広がりの尺度）を含む。

【0282】

いくつかの実施形態では、参照サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、相互情報スコア及び／又はその１つ以上の分布統計（例えば、参照サブセット全体にわたる中心傾向の尺度、参照サブセット全体にわたる最小値、参照サブセット全体にわたる最大値、及び参照サブセット全体にわたる広がりの尺度）を含む。相互情報スコアに関する更なる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１２月１３日に出願された「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｐａｔｃｈ Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ」と題する米国仮特許出願第６２／９４８１２９号に開示されている。

【0283】

いくつかの実施形態では、参照サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも８００個、又は少なくとも１０００個の指標を含む。いくつかの実施形態では、参照サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、又は１０個以下の指標を含む。いくつかの実施形態では、参照サブセット中の各核酸断片のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標は、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の３～１０個、５～２０個、１０～５０個、２０～１００個、５０～２００個、１００～５００個、３００～１０００個、又は５００～２０００個の指標を含む。いくつかの実施形態では、参照サブセット中のメチル化状態の１つ以上の指標は、参照サブセット全体にわたるメチル化状態の３個以上の指標から始まり、２０００個以下の指標で終わる別の範囲内にある。

【0284】

ブロック２１８を参照すると、いくつかの実施形態では、訓練された二値分類器への適用は、参照サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標を更に適用する。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位の指標は、（例えば、上記のような）ＣｐＧカウントである。

【0285】

いくつかの実施形態は、参照サブセット中の各核酸断片配列は、同じＣｐＧカウントを有する。いくつかの実施形態では、参照サブセット中の２つ以上の核酸断片配列は、異なるＣｐＧカウントを有する。いくつかの実施形態では、参照サブセット中の各核酸断片配列は、少なくとも最小数のＣｐＧ部位を有する（例えば、ゲノム位置のそれぞれの複数の核酸断片配列が、最小ＣｐＧカウント又は最大ＣｐＧカウントを使用してフィルタリングされる）。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位の最小数は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のＣｐＧ部位である。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位の最小数は、１～１０個、１０～２０個、２０～３０個、３０～４０個、４０～５０個、又は５０個を超えるＣｐＧ部位である。

【0286】

いくつかの実施形態は、参照サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの中心傾向の尺度、参照サブセット全体にわたる最小ＣｐＧカウント、参照サブセット全体にわたる最大ＣｐＧカウント、及び参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度を含む。

【0287】

例えば、いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの中心傾向の尺度であり、中心傾向の尺度は、参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの算術平均、加重平均、ミッドレンジ、ミッドヒンジ、三平均、ウィンザー化平均、平均、又は最頻値である。いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ部位指標のうちの一指標が、参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度であり、広がりの尺度は、変異サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの標準偏差、分散、範囲、又は四分位数間範囲である。

【0288】

いくつかの実施形態では、訓練された二値分類器への適用は、参照サブセット全体にわたる複数のＣｐＧ部位指標を更に適用し、参照サブセット全体にわたる複数のＣｐＧ部位指標は、参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの中心傾向の尺度、参照サブセット全体にわたる最小ＣｐＧカウント、参照サブセット全体にわたる最大ＣｐＧカウント、及び参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウントの広がりの尺度のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てを含む。

【0289】

いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、参照サブセット全体にわたるＣｐＧカウント、中央値ＣｐＧカウント、最小ＣｐＧカウント、最大ＣｐＧカウント、及びＣｐＧカウントの標準偏差を含む、参照サブセット全体にわたる複数のＣｐＧ部位指標である。

【0290】

いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、参照サブセット全体にわたる少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、又は少なくとも１００個のＣｐＧ指標を含む。いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、参照サブセット全体にわたる２００個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、又は１０個以下のＣｐＧ指標を含む。いくつかの実施形態では、参照サブセット全体にわたる１つ以上のＣｐＧ指標は、参照サブセット全体にわたる３～１０個、５～２０個、１０～５０個、２０～１００個、又は５０～２００個のＣｐＧ指標を含む。いくつかの実施形態では、参照サブセット中の１つ以上のＣｐＧ指標は、参照サブセット全体にわたる３個以上のＣｐＧ指標から始まり、２００個以下のＣｐＧ指標で終わる別の範囲内にある。

【0291】

再びブロック２１０を参照すると、いくつかの実施形態では、（ｉｉ）変異サブセット中の核酸断片配列の数に対する参照サブセット中の核酸断片配列の数の指標は、参照サブセット中の核酸断片配列のカウントを含む。いくつかの実施形態では、変異サブセット中の核酸断片配列の数に対する参照サブセット中の核酸断片配列の数の指標は、変異サブセット中の核酸断片配列のカウントを含む。いくつかの実施形態では、変異サブセット中の核酸断片配列の数に対する参照サブセット中の核酸断片配列の数の指標は、参照サブセット中の核酸断片配列のカウントと比較した変異サブセット中の核酸断片配列のカウントの比を含む。

【0292】

いくつかの実施形態では、訓練された二値分類器への適用のための指標（例えば、変異サブセットのメチル化状態の１つ以上の指標、参照サブセットのメチル化状態の１つ以上の指標、変異サブセットに対する参照サブセットにおける核酸断片配列の数の指標、変異サブセットの１つ以上のＣｐＧ指標、及び／又は参照サブセットの１つ以上のＣｐＧ指標）は、プールされ（例えば、変異サブセット及び参照サブセット）、ゲノム位置の入力ベクトルにビニングされる。いくつかの実施形態では、入力ベクトル中のプールされた指標は、変異及び／又は参照としてラベル付けされる。

【0293】

いくつかの実施形態では、訓練された二値分類器への適用のための指標は、変異サブセットに対応する指標がゲノム位置の変異サブセットの第１の入力ベクトルにビニングされ、参照サブセットに対応する指標がゲノム位置の参照サブセットの第２の入力ベクトルにビニングされるようにファセット化される。

【0294】

いくつかの事例では、入力ベクトル中の指標は、訓練された二値分類器に特徴として適用される。

【0295】

いくつかの実施形態では、入力ベクトルは固定長を有する。いくつかの実施形態では、入力ベクトルは可変長を有する。いくつかの実施形態では、複数のゲノム位置中の各ゲノム位置は、同じ長さ又は異なる長さの入力ベクトルを有する。

【0296】

いくつかの実施形態では、それぞれのゲノム位置の入力ベクトルは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも８００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、又は少なくとも５０００個の指標（例えば、特徴）を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのゲノム位置の入力ベクトルは、１０，０００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、又は１０個以下の指標（例えば、特徴）を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのゲノム位置の入力ベクトルは、３～１０個、５～２０個、１０～５０個、２０～１００個、５０～２００個、１００～５００個、３００～１０００個、５００～２０００個、又は１０００～１０，０００個の指標を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのゲノム位置の入力ベクトルは、３個以上の指標から始まり、１０，０００個以下の指標で終わる別の範囲内にある複数の指標（例えば、特徴）を含む。

【0297】

したがって、例示的な実装形態では、対象のそれぞれのゲノム位置にある変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定することは、訓練された二値分類器に１つ以上の入力ベクトルを提供することを含み、ゲノム位置は、対象の候補変異対立遺伝子に対するものであり（例えば、ブロック２０４を参照して上述したように同定され）、１つ以上の入力ベクトルは、それぞれのゲノム位置に対する複数の特徴（例えば、指標）を含む。複数の特徴は、例えば、ゲノム位置にマッピングされる複数の核酸断片配列について取得される、（ｉ）１つ以上のｐ値及び／又はその分布統計、（ｉｉ）参照核酸断片配列に対する変異核酸断片配列の数の指標、並びに（ｉｉｉ）１つ以上のＣｐＧカウント及び／又はその分布統計を含み得る。次いで、訓練された分類器は、入力ベクトル中の複数の指標に基づいて、変異が体細胞変異であるか生殖系列変異であるかの判定を出力として提供することができる。

【0298】

分類器
いくつかの実施形態では、訓練された分類器は、訓練されたロジスティック回帰分類器又は多層パーセプトロン分類器である。

【0299】

いくつかの実施形態では、訓練された分類器は、訓練された決定木分類器、訓練されたランダムフォレスト分類器、訓練されたサポート・ベクトル・マシン分類器、訓練されたｋ最近傍分類器、訓練された最近傍セントロイド分類器、訓練されたニューラルネットワーク分類器、又は訓練されたナイーブベイズ分類器である。いくつかの実施形態では、訓練された分類器は、以下の実施例３に開示する分類器のいずれかである。

【0300】

いくつかの実施形態では、訓練された分類器は、対応する複数のパラメータ（例えば、重み；例えば、定義：パラメータを参照）を含む。

【0301】

いくつかの実施形態では、訓練された分類器は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、又は少なくとも５００個のパラメータを含む。いくつかの実施形態では、訓練された分類器は、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも８００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも６０００個、少なくとも７０００個、少なくとも８０００個、少なくとも９０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１５，０００個、少なくとも２０，０００個、又は少なくとも３０，０００個のパラメータを含む。いくつかの実施形態では、訓練された分類器は、３０，０００個以下、２０，０００個以下、１５，０００個以下、１０，０００個以下、９０００個以下、８０００個以下、７０００個以下、６０００個以下、５０００個以下、４０００個以下、３０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、９００個以下、８００個以下、７００個以下、６００個以下、５００個以下、４００個以下、３００個以下、２００個以下、１００個以下、又は５０個以下のパラメータを含む。いくつかの実施形態では、訓練された分類器は、２～２０個、２～２００個、２～１０００個、１０～５０個、１０～２００個、２０～５００個、１００～８００個、５０～１０００個、５００～２０００個、１０００～５０００個、５０００～１０，０００個、１０，０００～１５，０００個、１５，０００～２０，０００個、又は２０，０００～３０，０００個のパラメータを含む。いくつかの実施形態では、訓練された分類器は、２個以上のパラメータから始まり３０，０００個以下のパラメータで終わる別の範囲内にある複数のパラメータを含む。

【0302】

いくつかの実施形態では、訓練された分類器は、複数の隠れ層及び複数の隠れニューロンを含むニューラルネットワークである。例えば、いくつかの実施形態では、訓練された分類器はニューラルネットワークであり、複数の隠れ層は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、又は少なくとも１００個の隠れ層を含む。いくつかの実施形態では、複数の隠れ層は、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、又は５個以下の隠れ層を含む。いくつかの実施形態では、複数の隠れ層は、１～５個、１～１０個、１～２０個、１０～５０個、２～８０個、５～１００個、１０～１００個、５０～１００個、又は３～３０個の隠れ層を含む。いくつかの実施形態では、複数の隠れ層は、１層以上から始まり１００層以下で終わる別の範囲内にある。

【0303】

いくつかの実施形態では、訓練された分類器はニューラルネットワークであり、複数の隠れニューロン中の各隠れニューロンは、訓練された分類器のための対応する複数のパラメータ中のそれぞれの１つ以上の対応するパラメータ（例えば、重み）に関連付けられている。例えば、いくつかの実施形態では、複数の隠れニューロンは、２～２０個、２～２００個、２～１０００個、１０～５０個、１０～２００個、２０～５００個、１００～８００個、５０～１０００個、５００～２０００個、１０００～５０００個、５０００～１０，０００個、１０，０００～１５，０００個、１５，０００～２０，０００個、又は２０，０００～３０，０００個のパラメータを含む。いくつかの実施形態では、複数の隠れニューロンは、分類器のための対応する複数のパラメータ中のパラメータと少なくとも同じ数の隠れニューロンを含む。

【0304】

いくつかの実施形態では、訓練された分類器はニューラルネットワークであり、複数の隠れニューロン中の各隠れニューロンは、第１の活性化関数タイプ及び／又は第２の活性化関数タイプに関連付けられている。

【0305】

いくつかの実施形態では、（例えば、それぞれの隠れニューロンのための）第１の活性化関数及び／又は第２の活性化関数は、ｔａｎｈ、シグモイド、ソフトマックス、ロジスティック、ガウス、ボルツマン加重平均、絶対値、線形、整流線形ユニット（ＲｅＬＵ：ｒｅｃｔｉｆｉｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｕｎｉｔ）、リーキーＲｅＬＵ、指数線形ユニット（ｅＬＵ：ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｌｉｎｅａｒ ｕｎｉｔ）、有界整流線形、ソフト整流線形、パラメータ化整流線形、平均、最大、最小、符号、二乗、平方根、多二次曲面、逆二次曲面、逆多二次曲面、多調和スプライン、及び薄板スプラインの全て又は組み合わせからなる群から選択される。

【0306】

いくつかの実施形態では、本開示は、分類器（例えば、未訓練の又は部分的に未訓練のモデル）を訓練して、試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定する方法を提供する。

【0307】

分類器訓練は、ゲノム位置における参照対立遺伝子の同定を取得することによって行うことができる。複数の対象中のそれぞれの対象における複数のゲノム位置中のそれぞれのゲノム位置について、それぞれの対象のそれぞれのゲノム位置における変異対立遺伝子に対する体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子の一方としての直交コールを取得すること、及びそれぞれの対象のそれぞれのゲノム位置における変異対立遺伝子の同定を取得することを含む手順を実施することができる。本方法は、それぞれのゲノム位置上にマッピングされる、それぞれの対象から取得された生体試料に由来する（例えば、少なくとも１×１０^６個の核酸断片配列を含む）シーケンシングデータセット中のそれぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のメチル化状態及びそれぞれの配列を取得することを更に含むことができる。

【0308】

（ａ）それぞれのゲノム位置における参照対立遺伝子の同定と、（ｂ）それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のそれぞれの配列とを使用して、それぞれの複数の核酸断片配列のうちでそれぞれのゲノム位置に参照対立遺伝子を有する各核酸断片配列を参照サブセットに割り当てることができる。更に、（ａ）それぞれのゲノム位置における変異対立遺伝子の同定と、（ｂ）それぞれの複数の核酸断片配列中の各核酸断片配列のそれぞれの配列を使用して、それぞれの複数の核酸断片配列のうちでそれぞれのゲノム位置に変異対立遺伝子を有する各核酸断片配列を変異サブセットに割り当てることができる。

【0309】

本方法は、複数の対象中のそれぞれの対象における複数のゲノム位置中のそれぞれのゲノム位置について、少なくとも、（ｉ）それぞれのゲノム位置のそれぞれの対象の変異サブセットにおける各核酸断片配列のメチル化状態全体にわたるメチル化状態の１つ以上の指標、（ｉｉ）それぞれのゲノム位置のそれぞれの対象の変異サブセットにおける核酸断片配列の数に対する参照サブセットにおける核酸断片配列の数の指標、及び（ｉｉｉ）それぞれの対象のそれぞれのゲノム位置における変異対立遺伝子に対する体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子の一方としての直交コールを使用して、試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定するように分類器を訓練することを更に含むことができる。

【0310】

例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも、（ｉ）メチル化状態の１つ以上の指標、（ｉｉ）変異サブセットにおける核酸断片配列の数に対する参照サブセットにおける核酸断片配列の数の指標、及び（ｉｉｉ）変異対立遺伝子に対する体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての直交コールを、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルに適用し、したがって、試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子を体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子として同定するように分類器を訓練することを含むことができる。

【0311】

いくつかの実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルは、本明細書に（例えば、上記及び／又は以下の実施例３で）開示する分類器のいずれかを含む。

【0312】

いくつかの実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、又は少なくとも５００個のパラメータを含む。いくつかの実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルは、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも８００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも６０００個、少なくとも７０００個、少なくとも８０００個、少なくとも９０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１５，０００個、少なくとも２０，０００個、又は少なくとも３０，０００個のパラメータを含む。いくつかの実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルは、３０，０００個以下、２０，０００個以下、１５，０００個以下、１０，０００個以下、９０００個以下、８０００個以下、７０００個以下、６０００個以下、５０００個以下、４０００個以下、３０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、９００個以下、８００個以下、７００個以下、６００個以下、５００個以下、４００個以下、３００個以下、２００個以下、１００個以下、又は５０個以下のパラメータを含む。いくつかの実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルは、２～２０個、２～２００個、２～１０００個、１０～５０個、１０～２００個、２０～５００個、１００～８００個、５０～１０００個、５００～２０００個、１０００～５０００個、５０００～１０，０００個、１０，０００～１５，０００個、１５，０００～２０，０００個、又は２０，０００～３０，０００個のパラメータを含む。いくつかの実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルは、２個以上のパラメータから始まり３０，０００個以下のパラメータで終わる別の範囲内にある複数のパラメータを含む。

【0313】

いくつかの実施形態では、複数の訓練対象は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、又は少なくとも５００個の対象を含む。いくつかの実施形態では、複数の訓練対象は、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも８００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも６０００個、少なくとも７０００個、少なくとも８０００個、少なくとも９０００個、少なくとも１０，０００個、又は少なくとも２０，０００個の対象を含む。いくつかの実施形態では、複数の訓練対象は、２０，０００個以下、１０，０００個以下、５０００個以下、４０００個以下、３０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、９００個以下、８００個以下、７００個以下、６００個以下、５００個以下、４００個以下、３００個以下、又は２００個以下の対象を含む。いくつかの実施形態では、複数の訓練対象は、２０～５００個、１００～８００個、５０～１０００個、５００～２０００個、１０００～５０００個、又は５０００～１０，０００個の対象を含む。いくつかの実施形態では、複数の訓練対象は、２０個以上の対象から始まり、２００００個以下の対象で終わる別の範囲内にある。

【0314】

いくつかの実施形態では、分類器を訓練することは、複数の訓練対象のための訓練データセットを使用することを含む。いくつかの実施形態では、訓練データセットは、複数の訓練対象中のそれぞれの訓練対象のそれぞれの複数の核酸断片配列を電子形態で含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸断片配列の取得は、複数の訓練対象中の各々の訓練対象について、本明細書に開示される方法のいずれか、並びに／又は任意の好適な置換、修飾、付加、欠失、及び／もしくはそれらの組み合わせを使用して行われる。

【0315】

いくつかの実施形態では、本方法は、複数の訓練対象中のそれぞれの訓練対象について、複数の生体試料を取得することを含み、それぞれの対象の複数の生体試料中のそれぞれの生体試料は、それぞれの複数の核酸断片配列を取得するために使用される。例えば、いくつかの実施形態では、第１の複数の核酸断片配列は、第１の生体試料（例えば、液体生体試料由来の無細胞核酸）から取得することができ、第２の複数の核酸断片配列は、同じそれぞれの訓練対象由来の第２の適合生体試料（例えば、健常組織試料又は固形腫瘍試料）から取得することができる。

【0316】

いくつかの実施形態では、本方法は、複数の訓練対象中のそれぞれの訓練対象について、複数のシーケンシング方法を使用して、それぞれの訓練対象から取得されたそれぞれの生体試料をシーケンシングすることを含み、それぞれのシーケンシング方法は、それぞれの複数の核酸断片配列を生成する。例えば、いくつかの実施形態では、第１の複数の核酸断片配列は、それぞれの訓練対象から取得されたそれぞれの生体試料の第１のシーケンシング方法（例えば、ＷＧＳ）から取得することができ、第２の複数の核酸断片配列は、それぞれの訓練対象から取得されたそれぞれの生体試料の第２のシーケンシング方法（例えば、ＷＧＢＳ及び／又は標的メチル化）から取得することができる。

【0317】

いくつかの実施形態では、任意の数の適合試料及び／又は適合シーケンシングアッセイを、複数の訓練対象中のそれぞれの訓練対象について実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、第１の複数の核酸断片配列は、それぞれの訓練対象（例えば、健常な組織試料上のＷＧＳ）の第１の生体試料の第１のシーケンシング方法を使用して取得することができ、第２の複数の核酸断片配列は、それぞれの訓練対象からの、第１の生体試料とは異なる第２の生体試料の第１のシーケンシング方法以外の第２のシーケンシング方法（例えば、液体生体試料中のｃｆＤＮＡ上の標的メチル化）を使用して取得することができる。

【0318】

いくつかの実施形態では、分類器は、試験対象のシーケンシングデータセットと同じ生体試料タイプから取得された訓練データセットを使用して訓練される。例えば、いくつかの実施形態では、分類器は、複数の訓練対象からの固形組織試料に由来する核酸断片配列を使用して訓練され、訓練された分類器を使用して変異を体細胞変異又は生殖系列変異として同定する方法は、試験対象からの固形組織試料に由来する核酸断片配列を使用して実施される。いくつかの実施形態では、分類器は、異なる生体試料タイプから取得された訓練データセットを試験対象のシーケンシングデータセットとして使用して訓練される。例えば、いくつかの形態では、分類器は、複数の訓練対象からの固形組織試料に由来する核酸断片配列を使用して訓練され、訓練された分類器を使用して変異を体細胞変異又は生殖系列変異として同定する方法は、試験対象からの液体生体試料に由来する無細胞核酸断片配列を使用して実施される。

【0319】

代替的又は追加的に、いくつかの実施形態では、分類器は、試験対象に対して使用されるものと同じシーケンシング方法によって取得された訓練データセットを使用して訓練される。例えば、いくつかの実施形態では、分類器は、複数の訓練対象由来の組織試料の全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）から取得された核酸断片配列を使用して訓練され、訓練された分類器を使用して変異を体細胞変異又は生殖系列変異として同定することは、試験対象由来の組織試料の全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）から取得された核酸断片配列を使用して行われる。いくつかの実施形態では、分類器は、試験対象に対して使用されるものとは異なるシーケンシング方法によって取得された訓練データセットを使用して訓練される。例えば、いくつかの実施形態では、分類器は、複数の訓練対象由来の組織試料の全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）から取得された核酸断片配列を使用して訓練され、訓練された分類器を使用して変異を体細胞変異又は生殖系列変異として同定することは、試験対象由来の液体生体試料中の無細胞核酸の標的メチル化から取得された核酸断片配列を使用して行われる。

【0320】

いくつかの実施形態では、訓練データセットは、複数の訓練対象中のそれぞれの訓練対象について、腫瘍画分及び／又は腫瘍遺伝子変異量を更に含む。

【0321】

上記で定義されるように、腫瘍画分は、非癌性組織と比較した、対象の癌性組織に由来する試料中の核酸分子の画分を指すことができる（定義：「腫瘍画分」を参照されたい）。腫瘍画分は、０～１の値として表され得るか、又はパーセンテージ（例えば、０～１００）に変換され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍画分は１０^－６～０．９９９である。いくつかの実施形態では、腫瘍画分は、１０^－５～０．９９９である。いくつかの実施形態では、腫瘍画分は、１０^－４～０．９９９である。いくつかの実施形態では、腫瘍画分は０．００１～０．９９９である。いくつかの実施形態では、腫瘍画分は０．０１～０．９９である。いくつかの実施形態では、腫瘍画分は、１０^－５～０．０４、１０^－４～０．０２、０．００１～０．５、又は０．００１～０．１である。いくつかの実施形態では、腫瘍画分は、０．３以下、０．２以下、０．１以下、０．０９以下、０．０８以下、０．０７以下、０．０６以下、０．０５以下、０．０４以下、０．０３以下、０．０２以下、０．０１以下、０．００９以下、０．００８以下、０．００７以下、０．００６以下、０．００５以下、０．００４以下、０．００３以下、０．００２以下、０．００１以下、１０^－４以下、又は１０^－５以下である。いくつかの実施形態では、腫瘍画分は、少なくとも１０^－４、少なくとも０．００１、少なくとも０．００５、少なくとも０．０１、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、又は少なくとも０．５である。いくつかの実施形態では、腫瘍画分は、１０^－６以上から始まり、０．９９９以下で終わる別の範囲内にある。

【0322】

上記で定義したように、腫瘍遺伝子変異量は、患者のゲノムの単位当たりの癌における突然変異の尺度を指す（定義：「腫瘍遺伝子変異量」を参照されたい）。いくつかの実施形態では、腫瘍遺伝子変異量は、（例えば、患者のゲノム及び／又はコード配列の）メガベース（Ｍｂ）当たりの突然変異の数で測定される。いくつかの実施形態では、腫瘍遺伝子変異量は、Ｍｂ当たり０．０００１～５個、０．００１～５個、０．００１～１個、又は０．１～５個の突然変異である。いくつかの実施形態では、腫瘍遺伝子変異量は、Ｍｂ当たり５～１０個の突然変異である。いくつかの実施形態では、腫瘍遺伝子変異量は、Ｍｂ当たり１０～２０個、１０～３０個、１０～５０個、又は１０～１００個の突然変異である。いくつかの実施形態では、腫瘍遺伝子変異量は、Ｍｂ当たり５０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個以下、０．５個以下、０．１個以下、０．０５個以下、０．０１個以下、０．００５個以下、０．００１個以下、０．０００５個以下、又は０．０００１個以下の突然変異である。いくつかの実施形態では、腫瘍遺伝子変異量は、Ｍｂ当たり少なくとも０．００１個、少なくとも０．００５個、少なくとも０．０１個、少なくとも０．０５個、少なくとも０．１個、少なくとも０．５個、少なくとも１個、少なくとも５個、又は少なくとも１０個の突然変異である。いくつかの実施形態では、腫瘍遺伝子変異量は、Ｍｂ当たり０．０００１個以上の突然変異から始まり、Ｍｂ当たり１００個以下の突然変異で終わる別の範囲内にある。

【0323】

いくつかの実施形態では、訓練データセットは、複数の訓練対象中の１つ以上の訓練対象についての（例えば、試料タイプ及び／又は腫瘍画分の差異を説明するための）重み付け係数及び／又は希釈係数を含む。

【0324】

いくつかの実施形態では、訓練データセットは、（例えば、本明細書に開示されるフィルタ、例えば、「サブセットの割り当て」と題する上記のセクションを参照のこと；のいずれかを使用して）フィルタリングされる。いくつかの実施形態では、フィルタリングは、複数の訓練対象中の全ての訓練対象全体にわたって、複数のゲノム位置からゲノム位置を除去することを含む。

【0325】

いくつかの実施形態では、フィルタリングは、複数の訓練対象から訓練対象を除去することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、それぞれの訓練対象の複数のゲノム位置中のゲノム位置の全てがフィルタリング基準を満たすことができない（例えば、訓練対象の全てのゲノム位置がデータセットから除去される）場合、それぞれの訓練対象の対応する複数の核酸断片配列がデータセットから除去される。

【0326】

任意の適切な試料タイプ、組織タイプ、試料採取、シーケンシング方法、処理及び／又はバイオインフォマティクス分析を使用して、本明細書に開示する試験対象、並びに／又は任意の置換、修飾、付加、欠失、及び／もしくはそれらの組み合わせについて、１つ以上の訓練対象のための訓練データセットを取得することができる。

【0327】

いくつかの実施形態では、（例えば、複数の対象中のそれぞれの対象における複数のゲノム位置中のそれぞれのゲノム位置の）分類器の訓練、対象及び試料の包含、変異対立遺伝子及び参照対立遺伝子の同定の取得、シーケンシング（例えば、メチル化シーケンシング）、核酸断片配列の処理、メチル化状態の取得、参照サブセット及び変異サブセットの割り当て、特徴の取得などの他の態様は、（例えば、対象及び試料の包含、変異対立遺伝子及び参照対立遺伝子の同定の取得、シーケンシング（例えば、メチル化シーケンシング）、核酸断片配列の処理、メチル化状態の取得、参照サブセット及び変異サブセットの割り当て、特徴の取得などを含む）変異対立遺伝子の体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての同定のシステム及び方法に関して本明細書に開示される方法のいずれかを使用して、並びに／あるいは、任意の好適な置換、修飾、付加、欠失、及び／もしくはそれらの組み合わせを使用して実施される。

【0328】

上記のように、いくつかの実施形態では、分類器を訓練することは、複数の対象中のそれぞれの対象における複数のゲノム位置中のそれぞれのゲノム位置について、それぞれのゲノム位置における変異対立遺伝子に対する体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子の一方としての直交コールを取得することを含む。したがって、訓練データセットは、それぞれの対象における目的の変異の各ゲノム位置について、変異が体細胞変異又は生殖系列変異であるという対応するラベルを含む。

【0329】

いくつかの実施形態では、変異対立遺伝子に対する直交コールは、異常試料と参照試料との間の比較を使用して決定される。例えば、以下の実施例６に記載するように、いくつかの実施形態では、変異対立遺伝子に対する直交コールは、患者適合腫瘍試料と正常組織参照との間の分析を使用して決定される。次いで、直交コール（例えば、体細胞ラベル又は生殖系列ラベル）は、分類器を訓練するために、各訓練対象の複数の指標と共に入力として使用される。

【0330】

一般に、分類器（例えば、ロジスティック回帰モデル、ニューラルネットワーク、及び／又は別の適切なモデル）を訓練することは、逆伝搬（例えば、勾配降下）によってそれぞれの分類器の複数のパラメータを更新することを含む。最初に、入力データが未訓練の又は部分的に未訓練のモデルに受け入れられ、選択された活性化関数及びパラメータの初期セット（例えば、重み）に基づいて出力が計算される順伝搬が実行される。次に、それぞれのパラメータごとに誤差勾配を計算することによって逆方向パスを実行することができ、各パラメータの誤差は、出力（例えば、予測値）及び入力データ（例えば、期待値又は真のラベル）に基づいて損失（例えば、誤差）を計算することによって決定される。

【0331】

パラメータは、次いで、パラメータが更新される程度又は重大度を規定する所定の学習率ハイパーパラメータによって計測される計算された損失に基づいて値を調整すること（例えば、小さい調整対大きい調整）によって更新することができ、それによって、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルを訓練する。

【0332】

例えば、機械学習のいくつかの一般的な実施形態では、逆伝搬は、複数のパラメータ（例えば、埋め込み）を含む、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルを訓練する方法である。未訓練の又は部分的に未訓練のモデルの出力（例えば、変異の体細胞変異又は生殖系列変異としての同定）は、任意に選択された初期パラメータのセットを使用して生成することができる。次いで、出力は、（例えば、損失関数を使用して）誤差関数を評価して誤差を計算することによって、元の入力（例えば、それぞれのゲノム位置におけるそれぞれの訓練対象の変異対立遺伝子の直交コール）と比較される。次いで、（例えば、損失関数に従って）誤差が最小になるようにパラメータを更新することができる。いくつかの実施形態では、種々の逆伝搬アルゴリズム及び／又は方法のうちのいずれか１つが、複数のパラメータを更新するために使用される。

【0333】

いくつかの実施形態では、誤差は、誤差関数（例えば、損失関数）を使用して計算される。いくつかの実施形態では、損失関数は、平均二乗誤差、二次損失、平均絶対誤差、平均バイアス誤差、ヒンジ、マルチクラス・サポート・ベクトル・マシン、及び／又はクロスエントロピーである。いくつかの実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルを訓練することは、勾配降下アルゴリズム及び／又は最小化関数に従って誤差を計算することを含む。

【0334】

いくつかの実施形態では、誤差関数は、計算された損失に比例する量だけ１つ以上のパラメータの値を調整することによって、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルの１つ以上のパラメータを更新し、それによってモデルを訓練するために使用される。いくつかの実施形態では、パラメータが調整される量（例えば、より小さい又はより大きい調整）は、パラメータが更新される程度又は重大度を指示する所定の学習率によって計測される。いくつかの実施形態では、学習率は、医師によって選択され得るハイパーパラメータである。

【0335】

いくつかの実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルを訓練することは、誤差関数の第１の評価に従って、訓練された分類器を形成する。いくつかのそのような実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルを訓練することは、誤差関数の第１の評価に基づく１つ以上のパラメータの第１の更新に従って、訓練された分類器を形成する。いくつかの代替的な実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルを訓練することは、誤差関数の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも５００００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも２００，０００個、少なくとも５００，０００個、又は少なくとも１００万個の評価に従って、訓練された分類器を形成する。いくつかのそのような実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルを訓練することは、誤差関数の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも２００，０００個、少なくとも５００，０００個、又は少なくとも１００万個の評価に基づく、１つ以上のパラメータの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも２００，０００個、少なくとも５００，０００個、又は少なくとも１００万個の更新に従って、訓練された分類器を形成する。

【0336】

いくつかの実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルを訓練することは、モデルが最小性能要件を満たす場合に、訓練された分類器を形成する。例えば、いくつかの実施形態では、未訓練の又は部分的に未訓練のモデルを訓練することは、訓練された分類器について計算された誤差が、それぞれの１つ以上の訓練対象の１つ以上の訓練データセット全体にわたる誤差関数の評価に従って誤差閾値を満たす場合に、訓練された分類器を形成する。いくつかの実施形態では、それぞれの１つ以上の訓練対象の１つ以上の訓練データセット全体にわたる誤差関数によって計算された誤差は、誤差が２０パーセント未満、１８パーセント未満、１５パーセント未満、１０パーセント未満、５パーセント未満、又は３パーセント未満である場合に、誤差閾値を満たす。

【0337】

いくつかの実施形態では、最小性能要件は、検証訓練に基づいて満たされる。いくつかの実施形態では、検証訓練は、Ｋ倍交差検証によって行われる。

【0338】

いくつかの実施形態では、分類器訓練は、複数の機械（例えば、コンピュータ、及び／又はシステム）上で行われる。いくつかの実施形態では、試験対象のゲノム位置における変異対立遺伝子に対する体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての分類器の使用は、複数の機械（例えば、コンピュータ及び／又はシステム）上で行われる。

【0339】

いくつかの実施形態では、分類器訓練は、複数のパラメータ中の１つ以上のパラメータを固定（例えば、凍結）し、それによって、（例えば、ゲノム位置における変異対立遺伝子の体細胞変異対立遺伝子又は生殖系列変異対立遺伝子としての）判定及び／又は分類を行うために使用することができる対応する訓練された分類器を取得することを更に含む。

【0340】

当業者には明らかであるように、訓練に適した任意の他のモデルパラメータ及びアーキテクチャが企図される。

【0341】

用途
ブロック２２０を参照すると、いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子が、訓練された二値分類器によって生殖系列変異対立遺伝子であると判定された場合、本方法は、試験対象における変異対立遺伝子を使用して、試験対象の癌リスクを判定することを更に含む。例えば、いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、ＢＲＣＡ１遺伝子座又はＢＲＣＡ２遺伝子座であり、ゲノム位置における変異対立遺伝子は、訓練された二値分類器によって生殖系列変異対立遺伝子であると判定され、方法は、試験対象に乳癌のリスクがあると判定することを更に含む。

【0342】

ブロック２２２を参照すると、いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子が、訓練された二値分類器によって生殖系列変異対立遺伝子であると判定された場合、本方法は、試験対象における変異対立遺伝子を使用して、対象の民族性を予測することを更に含む。例えば、癌遺伝子の生殖系列変異は民族特異的であることが報告されており、所与の遺伝子座の異なる変異対立遺伝子が様々な民族集団で過剰出現する。したがって、それぞれの対象について、癌遺伝子の遺伝子座（例えば、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２）における変異対立遺伝子を使用して、民族性を判定し、それぞれの民族性について癌リスクを評価することができる。

【0343】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子が、訓練された二値分類器によって体細胞変異対立遺伝子であると判定された場合、本方法は、試験対象における変異対立遺伝子を使用して疾患の臨床的判断を行うことを更に含む。いくつかの実装形態では、疾患の臨床的判断は、診断、疾患の病期の判定、進行の監視、予後、治療の処方もしくは投与、臨床試験への登録のマッチングもしくは推奨、更なる合併症もしくはリスクの発生の経時的な監視、及び／又は治療の有効性の評価である。いくつかの実施形態では、疾患は癌である。いくつかの実施形態では、疾患は、不確定性のクローン造血（ＣＨＩＰ）、心血管リスク、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。

【0344】

例えば、いくつかの実施形態では、ゲノム位置はＫＲＡＳ遺伝子座であり、ゲノム位置における変異対立遺伝子は、訓練された二値分類器によって体細胞変異対立遺伝子であると判定され、本方法は、変異対立遺伝子を使用して、患者が癌（例えば、膵臓癌、結腸直腸癌、及び／又は肺癌）を有すると診断することを更に含む。

【0345】

いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子が、訓練された二値分類器によって体細胞変異対立遺伝子であると判定された場合、本方法は、試験対象における変異対立遺伝子を使用して、対象の腫瘍遺伝子変異量（例えば、塩基対単位当たりの体細胞変異の正規化されたカウント）を決定することを更に含む。腫瘍遺伝子変異量を計算するための典型的な方法は、一般に、腫瘍試料及び正常対照試料（例えば、正常参照）を利用する。いくつかの実施形態では、本方法は、試験対象における変異対立遺伝子を使用して対象の腫瘍遺伝子変異量を決定するための、（例えば、液体生体試料を使用する）補足的な方法を提供する。

【0346】

ブロック２２４を参照すると、いくつかの実施形態では、ゲノム位置における変異対立遺伝子が、訓練された二値分類器によって体細胞変異対立遺伝子であると判定された場合、本方法は、試験対象における変異対立遺伝子を使用して、対象の腫瘍画分を決定することを更に含む。例えば、いくつかの実施形態では、それぞれの試験対象の生体試料が無細胞核酸に由来する場合、無細胞核酸は、かなりの腫瘍画分を示し得る。いくつかの実施形態では、それぞれの試験対象における対応する腫瘍画分は、少なくとも２パーセント、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、又は少なくとも９８パーセントである。いくつかの実施形態では、それぞれの試験対象における対応する腫瘍画分は、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、又は０．１％以下である。いくつかのそのような実施形態では、そのような腫瘍画分推定値は、以下の実施例３に記載されるように、対象における癌を検出するために使用される。

【0347】

腫瘍画分及び／又は腫瘍遺伝子変異量は、いくつかの実装形態では、更なる診断用途に使用することができる。例えば、腫瘍画分及び／又は腫瘍遺伝子変異量を使用して、癌治療（例えば、化学療法、免疫療法など）の有効性を評価又は監視することができる。

【0348】

いくつかの実施形態では、本方法は、第１の時点及び第２の時点で試験対象の腫瘍画分推定値を取得することを含み、試験対象の診断は、対象の腫瘍画分推定値が第１の時点と第２の時点との間で閾値量だけ変化したことが観察された場合に変更される。例えば、いくつかの実施形態では、診断は、癌を有する状態から寛解状態に変更される。別の例として、いくつかの実施形態では、診断は、癌を有さない状態から癌を有する状態に変更される。別の例として、いくつかの実施形態では、診断は、癌の第１の病期にある状態から癌の第２の病期にある状態に変更される。別の例として、いくつかの実施形態では、診断は、癌の第２の病期にある状態から癌の第３の病期にある状態に変更される。更に別の例として、いくつかの実施形態では、診断は、癌の第３の病期にある状態から癌の第４の病期にある状態に変更される。更に別の例として、いくつかの実施形態では、診断は、転移していない癌を有する状態から転移した癌を有する状態に変更される。

【0349】

いくつかの実施形態では、対象の腫瘍画分推定値が、第１の時点と第２の時点との間で閾値量だけ変化したことが観察された場合、試験対象の予後が変更される。例えば、いくつかの実施形態では、予後は平均余命を含み、予後は第１の平均余命から第２の平均余命に変更され、第１の平均余命と第２の平均余命とはそれらの期間が異なる。いくつかの実施形態では、予後の変更は、対象の平均余命を増加させる。いくつかの実施形態では、予後の変更は、対象の平均余命を減少させる。

【0350】

いくつかの実施形態では、対象の腫瘍画分推定値が第１の時点と第２の時点との間で閾値量だけ変化したことが観察された場合、試験対象の治療が変更される。いくつかの実施形態では、治療の変更は、癌治療薬の開始、癌治療薬の投与量の増加、癌治療薬の停止、又は癌治療薬の投与量の減少を含む。

【0351】

いくつかの実施形態では、試験対象の腫瘍画分推定値の値及び／又はゲノム位置における変異の体細胞変異もしくは生殖系列変異としての同定に少なくとも部分的に基づいて、治療レジメンが対象に適用される。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、ゲノム位置における変異対立遺伝子が、訓練された二値分類器によって体細胞変異対立遺伝子であると判定された場合に、第１の治療を試験対象に投与することと、ゲノム位置における変異対立遺伝子が、訓練された二値分類器によって生殖系列変異対立遺伝子であると判定された場合に、第２の治療を試験対象に投与することとを更に含む。

【0352】

いくつかの実施形態では、治療レジメンは、癌に対する薬剤を試験対象に適用することを含む。いくつかの実施形態では、癌に対する薬剤は、ホルモン、免疫療法、放射線撮影、又は癌治療薬である。いくつかの実施形態では、癌に対する薬剤は、レナリドミド、ペンブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス四価（６型、１１型、１６型、及び１８型）、ワクチン、ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、エルトロンボパグ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ボルテゾミブ、又はそれらの一般的等価物である。

【0353】

いくつかの実施形態では、試験対象は、癌に対する薬剤で治療されており、試験対象の腫瘍画分推定値及び／又はゲノム位置における変異の体細胞変異又は生殖系列変異としての同定は、癌に対する薬剤への対象の応答を評価するために使用される。癌に対する薬剤の詳細は、本明細書の他の箇所に記載される。

【0354】

いくつかの実施形態では、試験対象は、癌に対する薬剤で治療されており、試験対象の腫瘍画分推定値及び／又はゲノム位置における変異の体細胞変異又は生殖系列変異としての同定は、試験対象における癌に対する薬剤を強化又は中断するかどうかを決定するために使用される。例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも腫瘍画分推定値（例えば、０．０５超、０．１０超、０．１５超、０．２０超、０．２５超、又は０．３０超など）の観察は、試験対象における癌に対する薬剤の増強（例えば、線量の増加、放射線治療における放射線レベルの増加など）のための基礎として使用される。いくつかの実施形態では、閾値腫瘍画分推定値未満（例えば、０．３０未満、０．２５未満、０．２０未満、０．１５未満、０．１０未満、０．０５未満、又は０．０１未満など）の観察は、試験対象における癌に対する薬剤の使用を中止するための基準として使用される。

【0355】

いくつかの実施形態では、試験対象は、癌に対処するための外科的介入を受けており、試験対象の腫瘍画分推定値及び／又はゲノム位置における変異の体細胞変異又は生殖系列変異としての同定は、外科的介入に応答した試験対象の状態を評価するために使用される。いくつかの実施形態では、状態は、本開示で提供する方法を使用した、腫瘍画分推定値及び／又はゲノム位置における変異の体細胞変異もしくは生殖系列変異としての同定に基づくメトリックである。

【0356】

腫瘍画分及び腫瘍遺伝子変異量を決定するための方法は、各々の全体が全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年２月２５日出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｌｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ」と題する米国特許出願第１７／１８５８８５号、及び２０２１年２月出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｌｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ」と題するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１９７４６号に更に詳細に記載されている。

【0357】

いくつかの実施形態では、本開示のシステム及び方法は、試験対象のゲノム位置における変異の体細胞変異又は生殖系列変異としての同定を使用して汚染を検出することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、試験対象のゲノム位置における変異の体細胞変異又は生殖系列変異としての同定を使用して交差汚染を検出するために、２０１８年２月２０日に出願され、米国特許出願公開第２０１８／０２３７８３８号として公開された「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｃｒｏｓｓ－ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」と題する米国特許出願第１５／９００６４５号、２０１８年６月２６日に出願され、米国特許出願公開第２０１８／０３７３８３２号として公開された「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｃｒｏｓｓ－ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ」と題する米国特許出願第１６／０１９，３１５号、及び／又は、２０２０年９月１８日に出願された「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｃｒｏｓｓ－ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ」と題する米国特許出願第６３／０８０，６７０号に開示された技術が用いられる。

【0358】

追加の実施形態
ブロック２２６を参照すると、いくつかの実施形態では、本方法は、複数のゲノム位置中の各ゲノム位置について本方法を繰り返し、それによって、試験対象の複数の変異を同定し、複数の変異中のそれぞれの変異について、それぞれの変異が体細胞変異であるか生殖系列変異であるかを同定することを更に含む。

【0359】

いくつかの実施形態では、複数の変異は、２００個の変異を含む。

【0360】

いくつかの実施形態では、複数の変異は、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１０，０００個、又は少なくとも２０，０００個の変異を含む。いくつかの実施形態では、複数の変異は、２０，０００個以下、１０，０００個以下、５０００個以下、４０００個以下、３０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、９００個以下、８００個以下、７００個以下、６００個以下、５００個以下、４００個以下、３００個以下、２００個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、又は２０個以下の変異を含む。いくつかの実施形態では、複数の変異は、１０～５０個、５０～１００個、１００～５００個、５００～１０００個、１０００～５０００個、５０００～１０，０００個、又は１０，０００～２０，０００個の変異である。いくつかの実施形態では、複数の変異は、１０個以上の変異から始まり、２０，０００個以下の変異で終わる別の範囲内にある。

【0361】

いくつかの実施形態では、複数の変異中のそれぞれの変異は、臨床的に実用可能な変異（例えば、癌遺伝子）である。臨床的に実用可能な変異に適した実施形態は、本明細書に開示する実施形態のいずれかを含むことができる（例えば、上記の「参照対立遺伝子及び変異対立遺伝子」と題するセクションを参照されたい）。いくつかの実施形態では、複数の変異は、臨床的に実用可能な変異（例えば、目的の癌遺伝子）のパネルである。

【0362】

いくつかの実施形態では、複数の変異はフィルタリングされる。複数の変異をフィルタリングするための適切な方法は、当業者に明らかであるように、本明細書に詳細に開示する変異コール、ゲノム位置、及び／又は核酸断片配列をフィルタリングするための実施形態のいずれか（例えば、「変異コール」、「サブセットの割り当て」、及び「指標の入力」と題する前述のセクションを参照されたい）、又は任意の置換、修飾、付加、欠失、及び／又はそれらの組み合わせを含む。

【0363】

いくつかの実施形態では、本方法は、それぞれの変異が品質メトリックを満たさない場合に、複数の変異からそれぞれの変異を除去することを更に含む。

【0364】

いくつかの実施形態では、品質メトリックは、それぞれの変異コールのゲノム位置にマッピングされる、電子形態のそれぞれの複数の核酸断片配列における最小変異対立遺伝子画分である。いくつかの実施形態では、最小変異対立遺伝子画分は１０パーセントである。

【0365】

いくつかの実施形態では、品質メトリックは、それぞれの変異のゲノム位置にマッピングされる、電子形態のそれぞれの複数の核酸断片配列における最大変異対立遺伝子画分である。いくつかの実施形態では、最大変異対立遺伝子画分は９０パーセントである。

【0366】

いくつかの実施形態では、品質メトリックは、それぞれの変異のゲノム位置にマッピングされる、それぞれの複数の核酸断片配列の最小深度である。いくつかの実施形態では、最小深度は１０である。

【0367】

本開示での使用が企図される品質メトリックの追加の実施形態は、前述のセクション「変異コール」で説明した品質メトリックを含む。

【0368】

本開示の別の態様は、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサによって実行される１つ以上のプログラムであって、上記で開示した方法のいずれかを単独で又は組み合わせて実行するための命令を含む１つ以上のプログラムを記憶するメモリと、を備えるコンピューティングシステムを提供する。

【0369】

本開示の更に別の態様は、コンピュータによって実行されるように構成された１つ以上のプログラムであって、上記で開示した方法のいずれかを単独で又は組み合わせて実行するための命令を含む１つ以上のプログラムを記憶する非一時的コンピュータ可読記憶媒体を提供する。

【0370】

追加の例示的な実施形態
実施例１－複数の配列リードの取得
図７は、本開示のいくつかの実施形態による、シーケンシングのための核酸試料を調製するための方法７００のフローチャートである。方法７００は、以下の工程を含むが、これらに限定されない。例えば、方法７００の任意の工程が、品質管理又は任意の他の実験室アッセイ手順のための定量サブ工程を含んでもよい。

【0371】

ブロック７０２を参照すると、核酸試料（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を対象から抽出した。試料は、全ゲノムを含むヒトゲノムの任意のサブセットであってもよい。試料は、癌を有することが知られているか、又は癌を有する疑いのある対象から抽出されたものであってもよい。試料は、血液、血漿、漿液、尿、糞便、唾液、他の種類の体液、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、血液試料を採取するための方法（例えば、シリンジ又は指穿刺）は、組織生検を取得するための、外科手術を使用し得る手順よりも侵襲性が低い場合がある。抽出された試料は、ｃｆＤＮＡ及び／又はｃｔＤＮＡを含んでもよい。健常個体の場合、ヒトの身体は、ｃｆＤＮＡ及び他の細胞破片を自然に取り除くことができる。対象が癌又は疾患を有する場合、抽出された試料中のｃｔＤＮＡは、診断のために検出可能なレベルで存在している可能性がある。

【0372】

ブロック７０４を参照すると、シーケンシングライブラリーを調製した。ライブラリー調製中に、ユニーク分子識別子（unique molecular identifiers、ＵＭＩ）を、アダプターライゲーションによって核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）に付加した。ＵＭＩは、アダプターライゲーション中にＤＮＡ断片の末端に付加される短い核酸配列（例えば、４～１０塩基対）である。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、特定のＤＮＡ断片に由来する配列リードを同定するために使用することができる固有のタグとして機能する縮重塩基対であった。アダプターライゲーション後のＰＣＲ増幅中に、ＵＭＩを、結合したＤＮＡ断片と共に複製した。これは、下流分析において同じ元の断片に由来する配列リードを同定する方法を提供した。

【0373】

ブロック７０６を参照すると、標的ＤＮＡ配列をライブラリーから富化させた。富化中に、ハイブリダイゼーションプローブ（本明細書では「プローブ」とも呼ばれる）を使用して、癌（又は疾患）の有無、癌の状態、又は癌の分類（例えば、癌のクラス又は起源組織）についての高い情報価値を有する核酸断片を標的化し、プルダウンした。所与のワークフローについて、いくつかの実施形態では、プローブを、ＤＮＡの標的（相補的）鎖にアニール（又はハイブリダイズ）するように設計した。いくつかの実施形態では、各プローブは、８～５０００塩基長、１２～２５００塩基長、又は１５～１２２５塩基長であった。いくつかの実施形態では、標的鎖は、「正」鎖（例えば、ｍＲＮＡに転写され、続いてタンパク質に翻訳される鎖）又は相補的な「負」鎖を有する。いくつかの実施形態では、プローブは、数十、数百又は数千の塩基対の長さの範囲であってもよい。

【0374】

いくつかの実施形態では、プローブはメチル化部位パネルに基づいて設計された。

【0375】

いくつかの実施形態では、プローブは、特定の癌又は他の種類の疾患に対応することが疑われる（例えば、ヒト又は別の生物の）ゲノムの特定の突然変異又は標的領域を分析するために、標的遺伝子及び／又はゲノム領域のパネルに基づいて設計された。例えば、いくつかの実施形態では、プローブの各々は、各々が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０２０１５４６８２Ａ３号、第ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１号、又は第ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２号に記載されているゲノム領域に一意的にマッピングされた。

【0376】

いくつかの実施形態では、プローブは、標的領域の重複部分をカバーした。ブロック７０８を参照すると、いくつかの実施形態では、プローブを使用して、核酸試料の配列リードを生成した。

【0377】

図８は、一実施形態による、配列リードを取得するためのプロセスのグラフ表示である。図８は、試料由来の核酸セグメント８００の一例を示す。核酸セグメント８００は、一本鎖核酸セグメントであり得る。いくつかの実施形態では、核酸セグメント８００は二本鎖ｃｆＤＮＡセグメントであった。図示の例は、異なるプローブの標的となり得る核酸セグメントの３つの領域８０５Ａ、８０５Ｂ、及び８０５Ｃを示す。具体的には、３つの領域８０５Ａ、８０５Ｂ、及び８０５Ｃの各々は、核酸セグメント８００上に重複位置を含む。例示的な重複位置は、シトシン（「Ｃ」）ヌクレオチド塩基８０２として図８に示されている。シトシンヌクレオチド塩基８０２は、領域８０５Ａの第１の縁部付近、領域８０５Ｂの中央、及び領域８０５Ｃの第２の縁部付近に位置する。

【0378】

いくつかの実施形態では、プローブの１つ以上（又は全部）が、特定の癌又は他の種類の疾患に対応すると疑われる（例えば、ヒト又は別の生物の）ゲノムの特定の突然変異又は標的領域を分析するために、遺伝子パネル又はメチル化部位パネルに基づいて設計された。方法８００は、「全エクソームシーケンシング」としても知られる、ゲノムの全ての発現遺伝子のシーケンシングではなく、標的遺伝子パネル又はメチル化部位パネルを使用することによって、標的領域のシーケンシング深度を増加させるために使用されてもよく、深度は、試料内の所与の標的配列がシーケンシングされた回数のカウントを指す。シーケンシング深度を増加させると、核酸試料の使用される投入量が減少する。例えば、いくつかの実施形態では、標的遺伝子パネル又はメチル化部位パネルは、複数のプローブを含み、プローブの各々は、各々が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０２０１５４６８２Ａ３号、第ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１号、又は第ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２号に記載されているゲノム領域に一意的にマッピングされる。

【0379】

１つ以上のプローブを使用する核酸試料８００のハイブリダイゼーションは、標的配列８７０の理解をもたらす。図８に示すように、標的配列８７０は、ハイブリダイゼーションプローブによって標的とされる領域８０５のヌクレオチド塩基配列である。標的配列８７０は、ハイブリダイズされた核酸断片とも称され得る。例えば、標的配列８７０Ａは、第１のハイブリダイゼーションプローブによって標的とされる領域８０５Ａに対応し、標的配列８７０Ｂは、第２のハイブリダイゼーションプローブによって標的とされる領域８０５Ｂに対応し、そして標的配列８７０Ｃは、第３のハイブリダイゼーションプローブによって標的とされる領域８０５Ｃに対応する。シトシンヌクレオチド塩基８０２がハイブリダイゼーションプローブによって標的とされる各領域８０５Ａ～Ｃ内の異なる位置に位置すると仮定すると、各標的配列８７０は、標的配列８７０上の特定の位置のシトシンヌクレオチド塩基８０２に対応するヌクレオチド塩基を含む。

【0380】

ハイブリダイゼーション工程の後、ハイブリダイズした核酸断片を捕捉し、ＰＣＲを用いて増幅することもできる。例えば、標的配列８７０を富化させて、その後シーケンシングすることができる富化配列８８０を取得することができる。いくつかの実施形態では、各富化配列８８０は、標的配列８７０から複製された。標的配列８７０Ａ及び８７０Ｃからそれぞれ増幅された富化配列８８０Ａ及び８８０Ｃはまた、各配列リード８８０Ａ又は８８０Ｃのエッジ付近に位置するチミンヌクレオチド塩基を含む。以下で使用する場合、参照対立遺伝子（例えば、シトシンヌクレオチド塩基８０２）に対して変異した富化配列８８０中の変異ヌクレオチド塩基（例えば、チミンヌクレオチド塩基）を、代替対立遺伝子とみなした。更に、標的配列８７０Ｂから増幅された各富化配列８８０Ｂは、各富化配列８８０Ｂの中心付近又は中心に位置するシトシンヌクレオチド塩基を含んでいた。

【0381】

再び図７のブロック７０８を参照すると、例えば、図８に示す富化配列８８０などの富化ＤＮＡ配列から、配列リードが生成された。シーケンシングデータは、富化ＤＮＡ配列から取得することができる。例えば、方法８００は、合成技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、パイロシーケンシング（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、イオン半導体技術（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング）、単一分子リアルタイムシーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ライゲーションによるシーケンシング（ＳＯＬｉＤシーケンシング）、ナノポアシーケンシングＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、又はペアエンドシーケンシングを含む次世代シーケンシング（next-generation sequencing、ＮＧＳ）技術を含み得る。いくつかの実施形態では、可逆的色素ターミネーターを用いた合成によるシーケンシングを使用して、大規模並列シーケンシングを行った。

【0382】

いくつかの実施形態では、配列リードは、アライメント位置情報を決定するために、当技術分野において公知の方法を使用して参照ゲノムにアライメントされた。アライメント位置情報は、所与の配列リードの開始ヌクレオチド塩基及び終了ヌクレオチド塩基に対応する参照ゲノム内の領域の開始位置及び終了位置を示し得る。アライメント位置情報はまた、開始位置及び終了位置から決定され得る配列リード長を含み得る。参照ゲノム中の領域は、遺伝子又は遺伝子のセグメントに関連し得る。

【0383】

いくつかの実施形態では、それぞれの断片に対するメチル化シーケンシングによって取得された対応する複数の配列リードの平均配列リード長は、１４０～２８０ヌクレオチドであった。

【0384】

様々な実施形態において、配列リードは、Ｒ_１及びＲ_２として示されるリード対から構成される。例えば、第１のリードＲ_１は、核酸断片の第１の末端からシーケンシングされてもよく、第２のリードＲ_２は、核酸断片の第２の末端からシーケンシングすることができる。したがって、第１のリードＲ_１及び第２のリードＲ_２のヌクレオチド塩基対は、参照ゲノムのヌクレオチド塩基と整合的に（例えば、対向する配向で）アライメントされ得る。リード対Ｒ_１及びＲ_２から導出されるアライメント位置情報は、第１のリードの末端に対応する参照ゲノム中の開始位置（例えば、Ｒ_１）及び第２のリードの末端に対応する参照ゲノム中の終了位置（例えば、Ｒ_２）を含み得る。言い換えれば、参照ゲノムにおける開始位置及び終了位置は、核酸断片が対応する可能性の高い参照ゲノム内の位置を表す。ＳＡＭ（配列アライメントマップ）形式やＢＡＭ（バイナリ）形式の出力ファイルを生成し、メチル化状態判定などの更なる分析のために出力してもよい。

【0385】

実施例２－本開示のいくつかの実施形態によるメチル化状態ベクトルの生成
図９は、本開示の一実施形態による、ｃｆＤＮＡの断片をシーケンシングしてメチル化状態ベクトルを取得するプロセス９００を説明するフローチャートである。

【0386】

ブロック９０２を参照すると、ｃｆＤＮＡ断片を生体試料から取得した。ブロック９２０を参照すると、ｃｆＤＮＡ断片を処理して、非メチル化シトシンをウラシルに変換した。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡは、メチル化シトシンを変換することなくｃｆＤＮＡの断片の非メチル化シトシンをウラシルに変換する亜硫酸水素塩処理に供された。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）－Ｇｏｌｄ、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）－Ｄｉｒｅｃｔ、又はＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から入手可能）などの市販のキットを亜硫酸水素塩変換に使用した。他の実施形態では、非メチル化シトシンのウラシルへの変換は、酵素反応を使用して達成された。例えば、変換は、ＡＰＯＢＥＣ－Ｓｅｑ（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）などの非メチル化シトシンをウラシルに変換するための市販のキットを使用することができる。

【0387】

変換されたｃｆＤＮＡ断片から、シーケンシングライブラリーを調製する（ブロック９３０）。任意選択的に、シーケンシングライブラリーは、複数のハイブリダイゼーションプローブを使用して、癌状態についての高い情報価値を有するｃｆＤＮＡ断片又はゲノム領域が富化される（ブロック９３５）。ハイブリダイゼーションプローブは、特定のｃｆＤＮＡ断片又は標的領域にハイブリダイズし、その後のシーケンシング及び分析のためにそれらの断片又は領域を富化させることができる短いオリゴヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションプローブは、研究者にとって関心のある特定のＣｐＧ部位のセットの標的化された高深度分析を行うために使用され得る。シーケンシングライブラリー又はその一部は、一旦調製されると、複数の配列リードを取得するためにシーケンシングされ得る（ブロック９４０）。配列リードは、コンピュータソフトウェアによる処理及び解釈のためのコンピュータ可読デジタル形式であってもよい。

【0388】

配列リードから、ＣｐＧ部位の各々の位置及びメチル化状態を、参照ゲノムに対する配列リードのアライメントに基づいて判定した（ブロック９５０）。（例えば、各断片中の第１のＣｐＧ部位の位置、又は別の同様のメトリックによって特定される）参照ゲノム中の断片の位置、断片中のＣｐＧ部位の数、及び断片中の各ＣｐＧ部位のメチル化状態を特定する、各断片についてのメチル化状態ベクトル（ブロック９６０）。

【0389】

実施例３－ｃｆＤＮＡ画分の関数として癌を検出する能力
いくつかの実施形態では、本方法は、複数の変異コールに関連付けられた少なくとも腫瘍画分推定情報を使用して（例えば、対象の１つ以上の対応する対立遺伝子位置について体細胞変異及び／又は生殖系列変異として同定された１つ以上のそれぞれのコールされた変異に少なくとも部分的に基づいて）、対象の癌状態又は対象が癌状態となる尤度を判定するように分類器を訓練することを更に含む。

【0390】

例えば、いくつかの実施形態では、訓練されていない分類器は、（例えば、体細胞変異及び／又は生殖系列変異として同定された）１つ以上の参照複数の変異コールを含む訓練セットで訓練され、各参照複数の変異コールは、対応する腫瘍画分推定情報と関連付けられる。

【0391】

いくつかの実施形態では、分類器はロジスティック回帰であった。いくつかの実施形態では、分類器は、ニューラル・ネットワーク・アルゴリズム、サポート・ベクトル・マシン・アルゴリズム、単純ベイズアルゴリズム、最近傍アルゴリズム、ブースト木アルゴリズム、ランダム・フォレスト・アルゴリズム、決定木アルゴリズム、多項ロジスティック回帰アルゴリズム、線形モデル、又は線形回帰アルゴリズムであった。

【0392】

いくつかの実施形態で使用するための分類器は、例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１２月１１日出願の米国特許出願第１７／１１９６０６号、及び２０２０年１２月１８日出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｓｏｕｒｃｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願公開第２０１９－０３８５８１３ Ａ１号に更に詳細に記載されている。

【0393】

いくつかの実施形態では、分類器は、ニューラル・ネットワーク・アルゴリズム、サポート・ベクトル・マシン・アルゴリズム、決定木アルゴリズム、教師なしクラスタリングアルゴリズム、教師ありクラスタリングアルゴリズム、又はロジスティック回帰アルゴリズム、混合モデル、又は隠れマルコフモデルに基づいていた。いくつかの実施形態では、訓練された分類器は、多項式分類器である。

【0394】

いくつかの実施形態では、分類器は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年３月１３日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ，Ｍａｎａｇｉｎｇ，ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｄａｔａ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙ」と題する米国特許出願公開第２０１９－０２８７６４９ Ａ１号に記載されているＢスコア分類器を利用した。

【0395】

いくつかの実施形態では、分類器は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年３月１３日に出願された「Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎｏｍａｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」と題する米国特許出願公開第２０１９－０２８７６５２ Ａ１号に記載されているＭスコア分類器を利用した。

【0396】

いくつかの実施形態では、分類器は、ニューラルネットワーク又は畳み込みニューラルネットワークであった。本開示に従ってメチル化パターンを分類するために使用することができる畳み込みニューラルネットワークの開示については、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年６月１日に出願された「Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄａｔａ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願第６２／６７９，７４６号を参照されたい。

【0397】

いくつかの実施形態では、分類器は、サポート・ベクトル・マシン（support vector machine、ＳＶＭ）であった。分類に使用される場合、ＳＶＭは、ラベル付けされたバイナリデータの所与のセットを、ラベル付けされたデータから最大に離れた超平面で分離する。線形分離が不可能な場合、ＳＶＭは、特徴空間への非線形マッピングを自動的に実現する「カーネル」の技術と組み合わせて機能することができる。特徴空間においてＳＶＭによって見出された超平面は、入力空間における非線形決定境界に対応する。

【0398】

いくつかの実施形態では、分類器は決定木であった。ツリーベースの方法は、特徴空間を矩形のセットに分割し、次いで、各々に（定数のような）モデルを当てはめる。いくつかの実施形態では、決定木はランダムフォレスト回帰であった。使用され得る１つの特定のアルゴリズムは、分類回帰木（classification and regression tree、ＣＡＲＴ）である。他の特定の決定木アルゴリズムには、ＩＤ３、Ｃ４．５、ＭＡＲＴ、及びランダムフォレストが含まれるが、これらに限定されない。

【0399】

いくつかの実施形態では、分類器は教師なしクラスタリングモデルであった。いくつかの実施形態では、分類器は教師ありクラスタリングモデルである。クラスタリングの問題は、データセット中に自然分類を見出すことの１つとして説明される。自然分類を識別するために、２つの問題に対処する。第１に、２つの試料間の類似性（又は非類似性）を測定する方法が決定される。このメトリック（例えば、類似性測度）は、１つのクラスタ内の試料が、他のクラスタ内の試料よりも互いに類似していることを保証するために使用される。第２に、類似性測度を使用してデータをクラスタに分割するための機構が決定される。クラスタリング調査を開始する１つの方法は、距離関数を定義し、訓練セット内の試料の全ての対の間の距離の行列を計算することである。距離が良好な類似性測度である場合、同じクラスタ内の参照エンティティ間の距離は、異なるクラスタ内の参照エンティティ間の距離よりも大幅に小さくなる。クラスタリングは、距離メトリックの使用を必要としない。例えば、非メトリック類似性関数ｓ（ｘ，ｘ’）を使用して、２つのベクトルｘ及びｘ’を比較することができる。従来、ｓ（ｘ，ｘ’）は、ｘ及びｘ’が何らかの形で「類似」している場合に値が大きくなる対称関数である。データセット内の点の間の「類似性」又は「非類似性」を測定するための方法が選択されると、クラスタリングは、データの任意のパーティションのクラスタリング品質を測定する基準関数を必要とする。基準関数を極値化するデータセットのパーティションを、データのクラスタリングに使用する。本開示において使用することができる特定の例示的なクラスタリング技術は、階層クラスタリング（最近傍アルゴリズム、最遠傍アルゴリズム、平均連結法アルゴリズム、重心アルゴリズム、又は二乗和アルゴリズムを使用する凝集クラスタリング）、ｋ平均クラスタリング、ファジーｋ平均クラスタリングアルゴリズム、及びＪａｒｖｉｓ－Ｐａｔｒｉｃｋクラスタリングを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、クラスタリングは、（例えば、事前に想定された数のクラスタ及び／又はクラスタ割り当ての事前決定を伴わない）教師なしクラスタリングを含む。

【0400】

いくつかの実施形態では、分類器は、マルチカテゴリ・ロジット・モデルなどの回帰モデルであった。いくつかの実施形態では、分類器は、回帰モデルを利用する。

【0401】

いくつかの実施形態では、分類器は単純ベイズアルゴリズムであった。いくつかの実施形態では、分類器は、ノンパラメトリック法などの最近傍アルゴリズムであった。いくつかの実施形態では、分類器は混合モデルである。いくつかの実施形態、特に時間成分を含む実施形態では、分類器は隠れマルコフモデルであった。

【0402】

いくつかの実施形態では、分類器はＡスコア分類器であった。Ａスコア分類器は、非同義突然変異の標的シーケンシング分析に基づく腫瘍遺伝子変異量の分類器であった。例えば、腫瘍遺伝子変異量データに対するロジスティック回帰を使用して分類スコア（例えば、「Ａスコア」）を計算することができ、各個体についての腫瘍遺伝子変異量の推定値は、標的ｃｆＤＮＡアッセイから得られる。いくつかの実施形態では、腫瘍遺伝子変異量は、ｃｆＤＮＡにおける候補変異と呼ばれ、ノイズモデリング及びジョイントコールを通過し、かつ／又は変異と重複する任意の遺伝子注釈において非同義として見出される個体当たりの変異の総数として推定することができる。訓練セットの腫瘍遺伝子変異数を罰則付きロジスティック回帰分類器に供給して、交差検証を使用して９５％の特異性が達成されるカットオフを決定することができる。

【0403】

いくつかの実施形態では、分類器はＢスコア分類器であった。Ｂスコア分類器は、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ，Ｍａｎａｇｉｎｇ，ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｄａｔａ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙ」と題する米国特許出願公開第２０１９－０２８７６４９ Ａ１号に記載されている。Ｂスコア法によれば、健常対象の参照群における健常対象由来の核酸試料の配列リードの第１のセットが、変動性の低い領域について分析される。したがって、各健常対象由来の核酸試料の配列リードの第１のセット中の各配列リードは、参照ゲノム中の領域にアライメントされる。これから、訓練群の対象由来の核酸試料の配列リードからの配列リードの訓練セットが選択される。訓練セット中の各配列リードは、参照セットから同定された参照ゲノム中の変動性の低い領域のうちの一領域にアライメントされる。訓練セットは、健常対象由来の核酸試料の配列リード、並びに癌を有することが知られている罹患した対象由来の核酸試料の配列リードを含む。訓練群からの核酸試料は、健常対象の参照群からの核酸試料のタイプと同じ又は類似のタイプの核酸試料である。これから、訓練セットの配列リードから導出された量を使用して、健常対象由来の核酸試料の配列リードと訓練群内の罹患した対象由来の核酸試料の配列リードとの間の差異を反映する１つ以上のメトリックが決定される。次いで、癌に関する状態が未知である試験対象由来の無細胞核酸断片を含む核酸試料に関連付けられた配列リードの試験セットが受信され、試験対象が癌を有する尤度が、１つ以上のメトリックに基づいて決定される。

【0404】

いくつかの実施形態では、分類器はＭスコア分類器であった。Ｍスコア分類器は、参照により本明細書に組み込まれる、「Ａｎｏｍａｌｏｕｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願公開第ＵＳ ２０１９－０２８７６５２ Ａ１号に記載されている。

【0405】

実施例４－全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシング（ＷＧＢＳ）
ＷＧＢＳは、参照により本明細書に組み込まれる、「Ａｎｏｍａｌｏｕｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願公開第ＵＳ ２０１９－０２８７６５２ Ａ１号に記載されている。

【0406】

実施例５－無細胞ゲノムアトラス研究（Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｓｔｕｄｙ、ＣＣＧＡ）コホート
本開示の実施例では、ＣＣＧＡ［ＮＣＴ０２８８９９７８］からの対象を使用した。ＣＣＧＡは、１４１施設で１５，２５４人の人口統計学的にバランスのとれた参加者を登録した、前向き多施設観察ｃｆＤＮＡベースの早期癌検出研究である。血液試料を、新規に診断された治療未経験癌（Ｃ、症例）を有する対象及び登録時に定義された癌の診断を受けていない参加者（非癌［ＮＣ］、対照）からの１５，２５４人の登録参加者（５６％癌、４４％非癌）から採取した。

【0407】

第１のコホート（事前指定サブスタディ）（ＣＣＧＡ－１）では、血漿ｃｆＤＮＡ抽出物を、３，５８３人のＣＣＧＡ及びＳＴＲＩＶＥ参加者（ＣＣＧＡ：１，５３０人の癌対象及び８８４人の非癌対象；ＳＴＲＩＶＥ １，１６９人の非癌参加者）から得た。ＳＴＲＩＶＥは、スクリーニングマンモグラフィーを受けている女性が登録された多施設の前向きコホート研究である（９９，２５９人の参加者が登録）。血漿ｃｆＤＮＡ抽出のために、新たに診断された未治療癌（２０種の腫瘍型、全病期）を有する９８４人のＣＣＧＡ参加者及び癌の診断を受けていない７４９人の参加者（対照）から血液を採取した（ｎ＝１，７８５）。この事前に計画されたサブスタディには、２０の腫瘍型及び全ての臨床段階全体にわたる８７８症例、５８０対照、及び１６９アッセイ対照（ｎ＝１６２７）が含まれた。

【0408】

各参加者から採取した血液に対して３つのシーケンシングアッセイを実施した：１）一塩基変異／インデルについてのｃｆＤＮＡと白血球（ＷＢＣ）のペアを標的としたシーケンシング（６００００Ｘ、５０７遺伝子パネル）（ＡＲＴシーケンシングアッセイ）；ジョイントコーラによってＷＢＣ由来体細胞変異及び残留している技術的ノイズを除去した；２）コピー数変異についてのｃｆＤＮＡとＷＢＣとのペアの全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ；３５Ｘ）；新規な機械学習アルゴリズムによって癌関連シグナルスコアを生成した；共同分析によって共有事象を特定した；及び、３）メチル化についてのｃｆＤＮＡ全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシング（ＷＧＢＳ；３４Ｘ）；異常にメチル化された断片を使用して、正規化スコアを生成した。加えて、癌を有する参加者から組織試料を採取し、比較用の腫瘍変異の同定のために、４）全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ；３０Ｘ）を、腫瘍とＷＢＣ ｇＤＮＡとのペアに対して行った。

【0409】

ＣＣＧＡ－１研究の文脈内で、ｃｆＤＮＡ試料の腫瘍画分を推定するためのいくつかの方法を開発した。各々が参照により本明細書に組み込まれる、「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＤＥＴＥＲＭＩＮＩＮＧ ＴＵＭＯＲ ＦＲＡＣＴＩＯＮ ＩＮ ＣＥＬＬ－ＦＲＥＥ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０１９／２０４３６０号、「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＥＳＴＩＭＡＴＩＮＧ ＣＥＬＬ ＳＯＵＲＣＥ ＦＲＡＣＴＩＯＮＳ ＵＳＩＮＧ ＭＥＴＨＹＬＡＴＩＯＮ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ」と題する国際特許公開第ＷＯ２０２０／１３２１４８号、及び「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＴＵＭＯＲ ＦＲＡＣＴＩＯＮ ＥＳＴＩＭＡＴＩＯＮ ＦＲＯＭ ＳＭＡＬＬ ＶＡＲＩＡＮＴＳ」と題する米国特許出願公開第ＵＳ ２０２０－０３４００６４ Ａ１号を参照されたい。

【0410】

第２の事前指定サブスタディ（ＣＣＧＡ－２）では、全ゲノムシーケンシングアッセイではなく標的亜硫酸水素塩シーケンシングアッセイを使用し、標的メチル化シーケンシングアプローチに基づいて、癌対非癌及び起源組織の分類器を開発した。ＣＣＧＡ－２については、３，１３３人の訓練参加者及び１，３５４個の検証試料（癌対非癌状態の確認前の登録時判定で、７７５個が癌を有し、５７９個が癌を有さない）を使用した。血漿ｃｆＤＮＡを、固有のメチル化データベース並びに以前のプロトタイプ全ゲノム及び標的シーケンシングアッセイから同定されたメチロームの最も高い情報価値を有する領域を標的とする亜硫酸水素塩シーケンシングアッセイ（ＣＯＭＰＡＳＳアッセイ）に供して、癌及び組織を定義するメチル化シグナルを同定した。訓練のために確保された元の３，１３３個の試料のうち、１，３０８個の試料が臨床的に評価可能かつ分析可能であるとみなされた。分析を、一次分析集団ｎ＝９２７（６５４個の癌及び２７３個の非癌）及び二次分析集団ｎ＝１０２７（６５９個の癌及び３７３個の非癌）に対して行った。最後に、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織及び腫瘍からの単離細胞からのゲノムＤＮＡを全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシング（ＷＧＢＳ）に供して、パネル設計及び性能を最適化するための訓練で使用するための癌定義メチル化シグナルの大規模データベースを生成した。

【0411】

これらのデータは、浸潤性癌に対して＞９９％の特異性を達成する実現可能性を実証し、早期癌検出のためのｃｆＤＮＡアッセイの有望性を裏付ける。例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｌｅｉｎ他、２０１８、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ （ｃｆＤＮＡ）ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｕｍｏｒ ｔｙｐｅｓ：Ｔｈｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ （ＣＣＧＡ）ｓｔｕｄｙ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３６（１５），１２０２１－１２０２１；ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１８．３６．１５＿ｓｕｐｐｌ．１２０２１、及びＬｉｕ他、２０１９、「Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ（ＴＯＯ）ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３７（１５），３０４９－３０４９；ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１９．３７．１５＿ｓｕｐｐｌ．３０４９を参照されたい。

【0412】

ＣＣＧＡ－２研究の文脈内で、（標的メチル化又はＷＧＢＳによって取得される）メチル化データに基づいてｃｆＤＮＡ試料の腫瘍画分を推定するための複数の方法を開発した（例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＥＳＴＩＭＡＴＩＮＧ ＣＥＬＬ ＳＯＵＲＣＥ ＦＲＡＣＴＩＯＮＳ ＵＳＩＮＧ ＭＥＴＨＹＬＡＴＩＯＮ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ」と題する国際公開第ＷＯ ２０２０／１３２１４８号、及び「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｔｈａｔ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ ｏｒ Ｉｎｄｉｃａｔｅ ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ」と題する２０２０年２月２８日出願の米国仮特許出願第６２／９８３４４３号を参照されたい）。例示的なアプローチでは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織由来の核酸試料を、全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシング（ＷＧＢＳ）によって分析した。シーケンシングデータに基づいて同定された体細胞変異を、同じ患者からの適合ｃｆＤＮＡ ＷＧＢＳシーケンシングデータに対して分析し、腫瘍画分推定値を決定するために使用した。

【0413】

実施例６－異常なメチル化パターンと体細胞変異との同時発生
実験１高メチル化断片と変異断片との間に相関が存在するかどうかを判定するための最初の実験を、フィッシャーの正確確率検定及び体細胞変異の富化についての評価を使用して行われる高メチル化断片のシミュレートされたプルダウンによって実施した。

【0414】

ＷＧＢＳを使用してシーケンシングされた２２０個の組織試料のデータセットをサブセット化して、メチル化が富化された領域を選択した。データセットは、ＷＧＳを使用してシーケンシングされた患者適合組織を使用して注釈付けされた約１３，５００個の体細胞変異を更に含んでいた。体細胞変異は、患者適合正常組織参照を含む分析に基づいてコールされ、したがって、グラウンドトゥルースとみなされた。各体細胞変異について、変異位置に対応するデータセット中の各断片が参照対立遺伝子又は代替対立遺伝子をサポートするかどうかに基づいて、データセットを「参照」断片又は「代替」断片に分割した。各断片のメチル化画分（ベータ値）を計算することによって、各断片が低メチル化又は高メチル化されていると更に判定した。例えば、０．５より大きいベータ値を有する断片は高メチル化されていると判定され、一方、０．５以下のベータ値を有する断片は低メチル化されていると判定された。各体細胞変異について、過剰メチル化と突然変異断片との間の相関を、以下に示すマトリックスに従ってフィッシャーの正確確率検定を用いて評価した。

【0415】

【表1】

【0416】

高メチル化変異及び低メチル化変異をそれぞれ集約し、プロットした。６．６％の変異が、高メチル化（ＦＤＲ＜０．０５）と有意に関連することが見出され、高メチル化断片が単離において体細胞変異を有意に富化させなかったことを示した。図４Ａは、変異全体にわたる断片ベータ値（ｘ軸）に対してプロットされた代替断片の確率密度の分布プロットを使用して、これらの結果を示す。

【0417】

別のアプローチを利用して、変異レベルではなく断片レベルのメチル化画分を体細胞変異と相関させることができるかどうかを判定した。データセット中の全ての断片を、参照サポート及び代替サポートにファセット化して、変異全体にわたって一緒に集約した。メチル化画分（ベータ値）を各断片について計算した。図４Ｂは、ベータ値（ｘ軸）に対してプロットされた代替断片及び参照断片の確率密度の分布プロットを示し、代替断片が高メチル化画分で有意に富化されなかったことを更に示す。

【0418】

実験２メチル化によってマークされた腫瘍由来断片が、特に近傍にＣｐＧ部位が存在する場合に体細胞変異検出についての高い情報価値を有し得るかどうかを判定するための実験を行った。

【0419】

ＣＣＧＡ－１サブスタディからのＷＧＢＳを使用してシーケンシングされた２３８個の組織試料のデータセット（実施例５を参照されたい）をサブセット化して、メチル化が富化された領域を選択した。単純化された変異コールワークフローを、ベイズ尤度フィルタ、一塩基多型データベース（ｄｂＳＮＰ；ＮＣＢＩ）、及び各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年２月２５日出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｌｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ」と題する米国特許出願第１７／１８５８８５号、及び２０２１年２月出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｌｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ」と題するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１９７４６号に開示されている組織再発ブラックリストを使用して行った。データセットは、ＷＧＳを使用してシーケンシングされた患者適合組織を使用して取得された１２，９２８個の体細胞変異及び４９，０８３個の生殖系列変異を含んでいた。各候補変異について、各断片が参照対立遺伝子又は代替対立遺伝子のいずれかをサポートするかどうかに基づいて、断片を「参照」ビン又は「代替」ビンにグループ分けした。各候補変異について、参照ビン及び代替ビンそれぞれにわたるｐ値分布統計（例えば、平均、最小、最大、中央値、及び標準偏差）を計算した。更に、各候補変異について、参照ビン及び代替ビンそれぞれにおける全ての断片にわたるＣｐＧ部位の数についての分布統計（例えば、平均、最小、最大、中央値、及び標準偏差）を計算した。参照カウント及び代替カウント、ｐ値、ＣｐＧ部位の数、並びにそれらの分布統計は、本明細書に開示されるように、本開示のいくつかの実施形態に従って決定された。各候補変異について、取得された特徴（例えば、参照断片カウント及び代替断片カウント、ｐ値、及び／又はＣｐＧ部位）を、それぞれの変異の固定長ベクトルに一緒にビニングし、候補変異が体細胞変異であるか生殖系列変異であるかを判定するための分類器を訓練及び評価するための入力として使用した。分類器を訓練し、８０／２０訓練－試験変異分割を使用して評価した。

【0420】

図５Ａ及び図５Ｂは、参照断片カウント及び代替断片カウントを入力として使用するベースライン二値分類モデルの性能を示している。図５Ａは、候補変異が体細胞変異であるか生殖系列変異であるかを判定するためのロジスティック回帰分類器の性能の評価を示す受信者操作特性（receiver operating characteristic、ＲＯＣ）曲線である。同様の性能が、訓練データセット及び試験データセットの両方について観察された（訓練：ＡＵＣ＝０．７０；試験：ＡＵＣ＝０．６９）。図５Ｂは、５０％の陽性予測値（ＰＰＶ又は精度）で２０％の感度（再現率）が達成される、ロジスティック回帰分類器の精度－再現率曲線を示している。上記で定義したように、陽性予測値（ＰＰＶ）は、体細胞変異又は生殖細胞変異として正しく分類される変異の割合（例えば、真陽性の数を真陽性の数と偽陽性の数との和で割ったもの）を指す。

【0421】

対照的に、図６Ａ及び図６Ｂは、参照断片カウント及び代替断片カウント、ｐ値分布統計値（例えば、平均、最小、最大、中央値、及び標準偏差）、並びに参照ビン及び代替ビンの各々についての全ての断片にわたるＣｐＧ部位の数についての分布統計値（例えば、平均、最小、最大、中央値、及び標準偏差）をそれぞれ含む拡張特徴入力を使用した二値分類モデルの性能を示している。図６Ａは、候補変異が体細胞変異であるか生殖系列変異であるかを判定するための多層パーセプトロン（multi-layer perceptron、ＭＬＰ）ニューラルネットワーク分類器の性能の評価を示すＲＯＣ曲線である。同様の性能が、訓練データセット及び試験データセットの両方について観察され（訓練：ＡＵＣ＝０．８０；試験：ＡＵＣ＝０．８０）、入力として参照断片カウント及び代替断片カウントを利用する以前のモデルと比較して更に改善される。加えて、図６Ｂは、５０％の陽性予測値（ＰＰＶ又は精度）で達成される感度（再現率）が以前のモデルにおける２０％と比較して６０％である、ＭＬＰ分類器の精度－再現率曲線を示している。

【0422】

実験３メチル化によってマークされた腫瘍由来断片が、ｃｆＤＮＡ試料における体細胞変異検出についての高い情報価値を有し得るかどうかを判定するための追加の実験を行った。標的メチル化を使用してシーケンシングされた１４８個のｃｆＤＮＡ試料のデータセットをサブセット化して、メチル化が富化された領域を選択した。データセットは、ＷＧＳを使用して注釈付けされ、ｃｆＤＮＡ試料からシーケンシングされた断片中のリードサポートがゼロである変異を除去する（例えば、非ゼロの代替サポート深度を有する変異をフィルタリングする）ようにフィルタリングされた４０４個の体細胞変異及び６２，５７５個の生殖系列変異を含んでいた。分類器を訓練し、８０／２０訓練－試験変異分割を使用して評価した。

【0423】

図１０Ａ及び図１０Ｂは、参照断片カウント及び代替断片カウントを入力として使用するベースライン二値分類モデルの性能を示している。図１０Ａは、候補変異が体細胞変異であるか生殖系列変異であるかを判定するためのロジスティック回帰分類器の性能の評価を示すＲＯＣ曲線である。同様の性能が、訓練データセット及び試験データセットの両方について観察された（訓練：ＡＵＣ＝０．６３；試験：ＡＵＣ＝０．６３）。図１０Ｂは、ロジスティック回帰分類器の精度－再現率曲線を示し、モデルによって得られた精度の低さによって示されるように、変異の分解が不十分であることを示している（組織試料と比較して、腫瘍シグナルが低いため及びｃｆＤＮＡ試料中の正常由来断片からのノイズの割合が高いためと思われる）。

【0424】

対照的に、図１１Ａ及び図１１Ｂは、参照断片カウント及び代替断片カウント、ｐ値分布統計値（例えば、平均、最小、最大、中央値、及び標準偏差）、並びに参照ビン及び代替ビンの各々についての全ての断片にわたるＣｐＧ部位の数についての分布統計値（例えば、平均、最小、最大、中央値、及び標準偏差）をそれぞれ含む拡張特徴入力を使用したモデルの性能を示している。図１１Ａは、ロジスティック回帰モデルの性能の評価を示すＲＯＣ曲線であり、訓練データセット及び試験データセットの両方について同様の性能が観察され（訓練：ＡＵＣ＝０．８６；試験：ＡＵＣ＝０．８５）、入力として参照断片カウント及び代替断片カウントを利用するモデルを上回る改善を明らかにしている（訓練：ＡＵＣ＝０．６３；試験：ＡＵＣ＝０．６３）。加えて、図１１Ｂは、ロジスティック回帰モデルの精度－再現率曲線を示し、ＰＰＶが改善され、約１０％のＰＰＶで約３０％の感度が達成されたことを示している。

【0425】

結論データは、ＣｐＧ部位が変異の近傍に存在すると、異常なメチル化パターンが体細胞変異と同時発生することを示している。例えば、ＷＧＢＳ組織では、この関係を使用して、感度は４０％低下するが、前述のＷＧＳ ｃｆＤＮＡを用いた腫瘍画分推定方法において使用されたフィルタリング方法と同様のＰＰＶ（５０％）を達成することができる。例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年２月２５日出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｌｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ」と題する米国特許出願第１７／１８５８８５号、及び２０２１年２月出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｌｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ」と題するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１９７４６号を参照されたい。

【0426】

標的メチル化ｃｆＤＮＡにおいて、上記の実験は、拡張特徴入力を使用した場合の体細胞変異検出についてのＰＰＶの増加を明らかにした。場合によっては、より大きな訓練データセット及びクラスバランスを低下させるための方法を使用して、ｃｆＤＮＡにおける体細胞変異と生殖系列変異との間の差異を相殺する（例えば、組織内のクラスバランスをより密接に近似させる）ことができ、これによりＰＰＶ及び感受性が更に改善され得る。

【0427】

結論
本明細書で使用される用語は、あくまで特定の事例を説明する目的のものに過ぎず、限定を目的としたものではない。本明細書で使用される場合、文脈上特に明記されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数形も含むものとする。また、本開示で使用される「及び／又は」という用語は、関連する複数の列挙された用語のうちの１つ又はそれ以上の任意の及び全ての考えられうる組み合わせを言及し、これらを包含するものとして理解されよう。更に、用語「含む（comprise）」及び／又は「含んでいる（comprising）」は、本明細書で用いられる場合、記載された特徴、整数、工程、動作、要素、及び／又は構成部品の存在を示すものであるが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、動作、要素、構成要素、及び／又はそれらの群の存在もしくは追加を除外するものではない点を理解されたい。更に、用語「含む（including）」、「含む（includes）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「有する（with）」、又はこれらの変形が発明を実施するための形態及び／又は特許請求の範囲のいずれかで使用される限りにおいて、そのような用語は、用語「備える（comprising）」と同様に包含的であることが意図されている。

【0428】

複数の事例が、単一の事例として本明細書で説明される構成要素、動作、又は構造に対して提供され得る。最後に、様々な構成要素、動作、及びデータストアの間の境界は、ある程度恣意的であり、特定の動作が、特定の例示的な構成の文脈で示されている。機能の他の割り当てが想定され、実装の範囲内に含まれ得る。一般に、例示的な構成において別個の構成要素として提示された構造及び機能は、組み合わされた構造又は構成要素として実装されてもよい。同様に、単一の構成要素として提示された構造及び機能は、別個の構成要素として実装されてもよい。これら及び他の変形、修正、追加、及び改善は、実装の範囲内に含まれる。

【0429】

本明細書では、第１、第２などの用語は、様々な要素を説明するために使用され得るが、これらの要素は、それらの用語によって限定されるべきではないことも理解されるであろう。これらの用語は、ある要素を別の要素と区別するためにのみ使用される。例えば、本開示の範囲から逸脱することなく、第１の対象を第２の対象と呼ぶこともでき、同様に、第２の対象を第１の対象と呼ぶこともできる。第１の対象及び第２の対象は両方とも対象であるが、それらは同じ対象ではない。

【0430】

本明細書で使用される「～の場合（if）」という用語は、文脈に応じて、「～時（when）」もしくは「～時（upon）」、又は「～と判定したことに応じて（in response to determining）」もしくは「～を検出したことに応じて（in response to detecting）」を意味すると解釈される。同様に、「～と判定された場合（if it is determined）」又は「（記載の状態又は事象）が検出された場合（if (a stated condition or event)is detected）」という語句は、文脈に応じて、「～と判定した時（upon determining）」もしくは「～と判定したことに応じて（in response to determining）」、又は「（記載の状態又は事象）を検出した時（upon detecting (the stated condition or event)）」もしくは「（記載の状態又は事象）を検出したことに応じて（in response to detecting (the stated condition or event)）」を意味すると解釈される。

【0431】

前述の説明は、例示的な実装形態を具現化する例示的なシステム、方法、技術、命令シーケンス、及び計算機プログラム製品を含んでいた。説明の目的で、本発明の主題の様々な実装形態の理解を提供するために、多数の具体的な詳細が記載された。しかしながら、本発明の主題の実装形態は、これらの具体的な詳細なしに実施され得ることが当業者には明らかであろう。一般に、周知の命令インスタンス、プロトコル、構造、及び技術は、詳細に示されていない。

【0432】

上記を、説明の目的で、特定の実装形態を参照して記載してきた。しかしながら、上記の例示的な論考は、網羅的であること、又は実装形態を開示された厳密な形態に限定することを意図するものではない。上記の教示を考慮して、多くの修正及び変形が可能である。これらの実施形態は、原理及びその実際的な応用を最良の形で説明し、それによって他の当業者が、これらの実装形態及び企図される特定の用途に適した様々な修正を加えた様々な実装形態を最良の形で利用できるようにするために、選択され記載されたものである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【国際調査報告】