知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ オックスフォード ユニヴァーシティ イノヴェーション リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-16
(54)【発明の名称】方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240808BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240808BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240808BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240808BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240808BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240808BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20240808BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240808BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240808BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/86 Z
C12N15/12
A61K31/7105
A61K48/00
A61K47/54
A61K47/62
A61K35/76
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506731
(86)(22)【出願日】2022-08-04
(85)【翻訳文提出日】2024-03-29
(86)【国際出願番号】 GB2022052052
(87)【国際公開番号】W WO2023012481
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】2111250.3
(32)【優先日】2021-08-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517352500
【氏名又は名称】オックスフォード ユニヴァーシティ イノヴェーション リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】ロバーツ、トーマス チャールズ
(72)【発明者】
【氏名】ウッド、マシュー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC26
4C076CC41
4C076DD68
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZB21
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA13
4C086ZB21
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087NA05
4C087NA13
4C087ZB21
(57)【要約】
本発明は、ＲＮＡ転写物におけるスプライシングシグナルを標的とする化合物を用いて、対応するＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を調節して、該制御エレメントを含む１つ以上のエキソンのスプライス調節を誘導することにより、遺伝子の発現又は活性を調節することに関する。
【選択図】図４
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を調節するための方法であって、前記制御エレメントを含む１つ以上のエキソンのスプライス調節を誘導するために、ＲＮＡ転写物におけるスプライシングシグナルを標的とする化合物を細胞に送達することを含む方法。
【請求項2】
前記制御エレメントが、上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）等の翻訳制御エレメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ｕＯＲＦが、（ａ）一次オープンリーディングフレーム（ｐＯＲＦ）の上流１００ヌクレオチド以内にある；
（ｂ）ｐＯＲＦと重複している；
（ｃ）コザックコンセンサス配列ｎ［ａ／ｇ］ｎｎＡＵＧｇ（配列番号１７）を含む；
（ｄ）開始コドンと終止コドンとの間に、≦５個、≦４個、≦３個、≦２個、１個、又は０個のコドンを含む；及び／又は
（ｅ）芳香族疎水性アミノ酸と比較して、酸性及び塩基性のアミノ酸の割合が高い組成を有する、
請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記１つ以上のエキソンが、≦１０個、≦５個、又は１個のｕＯＲＦを含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
前記ｕＯＲＦが部分的にスキップされる、例えば、開始コドンをコードしているｕＯＲＦの一部がスキップされる、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記制御エレメントが、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）にあり、前記制御エレメントが、任意でｍｉＲＮＡ結合部位又は選択的ポリアデニル化シグナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記制御エレメントが、長鎖非コードＲＮＡ転写物中にあり、前記制御エレメントが、任意でマイクロペプチドコード配列、ＲＮＡ結合ドメイン、又はタンパク質と相互作用する二次構造である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記化合物がエキソンスキッピングを誘導し、任意で、前記化合物が、（ａ）ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む単一のエキソンのスキッピング；又は
（ｂ）ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む複数のエキソンのスキッピング、
を誘導する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記化合物が、エキソンのインクルージョンを誘導し、任意で、前記化合物が、（ａ）ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む単一のエキソンのインクルージョン；又は
（ｂ）ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む複数のエキソンのインクルージョン、
を誘導する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
複数の化合物を細胞に送達することを含み、各化合物が異なる標的部位を標的とし、任意で、前記複数の化合物がコンジュゲートしている、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記スプライシングシグナルが、（ａ）５’スプライスドナー部位；
（ｂ）３’スプライスアクセプタ部位；
（ｃ）エキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）配列；
（ｄ）スプライシング分岐点；
（ｅ）ポリピリミジントラクト；又は
（ｆ）イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）配列、
を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記化合物が、ＲＮＡ二次構造を欠く標的部位を標的とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記化合物が、オリゴヌクレオチドである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項15】
前記オリゴヌクレオチドが、（ａ）一本鎖である；
（ｂ）５～４０ヌクレオチド長である；
（ｃ）修飾オリゴヌクレオチドである；及び／又は
（ｄ）標的部位に対して≧５０％の配列相補性を有する、
請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項16】
前記オリゴヌクレオチドが、配列［Ｃ／Ａ］ＡＧｇｕ［ａ／ｇ］ａｇ（配列番号１８）を有する５’スプライスドナー部位に対して相補的な配列を含み、任意で、前記オリゴヌクレオチドが配列番号２２を含むか又はからなる、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記オリゴヌクレオチドが、配列ｃａｇＧ［Ｇ／Ｕ］（配列番号１９）を有する３’スプライスアクセプタ部位に対して相補的な配列を含み、任意で、前記オリゴヌクレオチドが配列番号２３を含むか又はからなる、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記オリゴヌクレオチドが、エキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）配列（例えば、配列ＣＡＣＡＣＧＡ（配列番号２０）を有するＳＲＳＦ１部位）に対して相補的な配列を含み、任意で、前記オリゴヌクレオチドが配列番号２４を含むか又は２４からなる、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記オリゴヌクレオチドが、配列ｃｕ［ａ／ｇ］Ａ［ｃ／ｕ］（配列番号２１）を有するスプライシング分岐点に対して相補的な配列を含み、任意で、前記オリゴヌクレオチドが配列番号２５を含むか又はからなる、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記オリゴヌクレオチドが、ポリピリミジントラクトに対して相補的な配列を含み、任意で、前記オリゴヌクレオチドが配列番号２６を含むか又はからなる、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記オリゴヌクレオチドが、４０～６０％のＧＣ含量を有する、請求項１３～２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項22】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾された糖部分、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合、及び／又は少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドから選択される１つ以上の修飾を含む、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記オリゴヌクレオチドにおける各糖部分が、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである（すなわち、オリゴヌクレオチドは完全にＰＳ－ＭＯＥオリゴヌクレオチドである）、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記化合物が、核酸分子、ペプチド、又は他の化学物質等の１つ以上の更なる化合物にコンジュゲートされる、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記ＲＮＡ転写物が、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＧ５、ＡＤＡＭ１０、ＡＬＢ、ＡＮＫ１、ＡＰＯＥ、ＡＴＰ２Ａ２、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＲＸ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮＩＬ、ＢＡＸ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＤＮＦ（例えば、ＢＤＮＦ ｖ１１）、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、Ｃ／ＥＢＰａ、ＣＡ２、ＣＡＳＰ８、ＣＣＢＥ１、ＣＤ３６、ＣＤ３Ｄ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＰ２９０、ＣＦＨ、ＣＦＴＲ、ＣＨＲＮＡ４、ＣＨＲＮＡ５、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＲ１、ＣＳＰＰ１、ＣＴＮＮＤ２、ＣＴＮＳ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＤＢＴ、ＤＣＡＦ１７、ＤＮＡＳＥ１、ＤＤＩＴ３、ＤＩＣＥＲ１、ＤＲＤ３、ＥＥＤ、ＥＦＮＢ１、ＥＰＯ、ＥＳＲ１、ＥＴＨＥ１、ＥＺＨ２、Ｆ８（及びＦ２、３、５、７、１１、１３）、ＦＡＰ、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＦＸＮ、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＴＡ３、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＨ２、ＧＲＮ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＣＲＴ、ＨＧＦ、ＨＮＦ４ａ、ＨＲ、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＤＯ１、ＩＦＮＥ、及び他のインターフェロン遺伝子、ＩＦＲＤ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＨＭＢＰ２、ＩＬ６、ＩＮＳ、ＩＱＧＡＰ１，ＩＱＧＡＰ２，ＩＲＦ６、ＩＲＳ２、ＩＴＧＡ７、ＪＡＧ１、ＫＣＮＪ１１、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＱ３、ＫＬＦ４、ＫＭＴ２Ｄ、ＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ５、ＬＲＰ８、ＬＲＰＰＲＣ、ＭＢＴＰＳ１、ＭＥＣＰ２、ＭＳＲＡ、ＭＳＸ２、ＭＴＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣＮ、ＭＹＦ６、ＮＡＭＰＴ、ＮＡＮＯＧ、ＮＥＵ４、ＮＦ１、ＮＫＸ２、ＮＫＸ３、ＮＫＸ５、ＮＫＸ８、ＮＯＤ２、ＮＲ５Ａ、ＮＲＦ１、ＮＳＤ１、ＰＡＨ、ＰＡＲＫ２、ＰＫＤ１、ＰＬＡＴ、ＰＯＮ１、ＰＯＮ２、ＰＰＡＲＤ、ＰＲＫＡＲＩＡ、ＰＲＰＦ３１、ＰＴＥＮ、ＰＹＣＲ１、ＲＢ１、ＲＢＬ１、ＲＢＬ２、ＲＢＢＰ４、ＲＮＡＳＥＨ１、ＲＯＲ２、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＮＩＡ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＳＨＢＧ、ＳＩＲＴ１、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＭＣＨＤ１、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＳＮＸ２７、ＳＰＩＮＫ１、ＳＲＢ１、ＳＲＹ、ＳＴ７、ＳＴ７Ｌ、ＳＴＡＴ３、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＧＦＢ３、ＴＨＰＯ、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＵＣＰ２、ＵＳＰ９Ｙ／ＳＰ３、ＵＴＲＮ、又はＶＥＧＦＡ等のｕＯＲＦ含有遺伝子によってコードされている、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記ＲＮＡ転写物が、ＢＤＮＦ ｖ１１等のｕＯＲＦ含有遺伝子のアイソフォームによってコードされている、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記ＲＮＡ転写物が、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＲＸ、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１，ＣＡ２、ＣＣＢＥ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＦＬ２、ＣＦＴＲ、ＣＳＰＰ１、ＣＴＮＳ、ＤＢＴ、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＬＲＥＩＣ、ＤＦＮＢ３１、ＤＬＧ４、ＤＭＤ、ＤＮＡＳＥ１、ＥＴＨＥ１、ＧＡＬＮＳ、ＧＣＨ１、ＨＡＭＰ、ＨＢＢ、ＨＭＢＳ、ＨＲ、ＩＧＨＭＢＰ２、ＩＲＦ６、ＩＴＧＡＺ、ＩＴＧＢ２、ＫＣＮＪ１１、ＫＣＮＱ３、ＬＤＬＲ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ５Ｌ、ＭＥＣＰ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＲ５Ａ１、ＰＡＬＢ２、ＰＡＮＫ２、ＰＥＸ７、ＰＨＹＨ、ＰＩＫ３Ｒ５、ＰＯＭＣ、ＰＯＭＴ１、ＲＯＲ２、ＳＣＮ２Ａ、ＳＧＣＡ、ＳＧＣＤ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１９Ａ３、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ７Ａ９、ＳＰＩＮＫ１、ＳＲＹ、ＳＴＩＬ、ＴＫ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＰ５３、ＴＰＩ１、ＴＰＭ３、ＴＲＭＵ、ＴＳＥＮ５４、又はＺＥＢ１等の１つ以上のｕＯＲＦを作り出す変異又はＳＮＰを有する遺伝子によってコードされている、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ＲＮＡ転写物が、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、長鎖介在非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、又はマクロＲＮＡ等の非コード転写物である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
ウイルスベクター（例えばＡＡＶ、レンチウイルス）等のベクターによって前記化合物を細胞に送達することを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
遺伝子の発現又は活性を調節する方法であって、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法に従って前記遺伝子にコードされているＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を調節することを含む方法。
【請求項32】
タンパク質発現を増加、減少、又は回復させる方法であって、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法に従ってＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を調節することを含む方法。
【請求項33】
制御エレメントを含む１つ以上のエキソンがスキッピング及び／又は保持されるようにオルタナティブスプライシングを誘導するための、ＲＮＡ転写物におけるスプライシングシグナルを標的とするオリゴヌクレオチド。
【請求項34】
請求項１３～２４に記載した通りの、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項35】
（ａ）前記制御エレメントが、請求項２～７のいずれか一項に記載の通りであり、（ｂ）前記オリゴヌクレオチドが、請求項８又は９に記載の通り１つ以上のエキソンのスキッピング及び／若しくはインクルージョンを誘導するためのものである；
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドが、請求項１１に記載のスプライシングシグナルを標的とする；
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドが、請求項１２に記載の標的部位を標的とする；並びに／又は
（ｅ）前記ＲＮＡ転写物が、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の通りである、
請求項３３又は３４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項36】
前記オリゴヌクレオチドが、核酸分子、ペプチド、又は他の化学物質等の１つ以上の更なる化合物にコンジュゲートされる、請求項３３～３５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項37】
請求項３３～３６のいずれか一項に記載の２つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートオリゴヌクレオチド。
【請求項38】
請求項３３～３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項３７に記載のコンジュゲートオリゴヌクレオチドをコードしているポリヌクレオチド又はベクターであって、任意で、前記ベクターがＡＡＶ又はレンチウイルスである、ポリヌクレオチド又はベクター。
【請求項39】
請求項３３～３７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドを含む送達ビヒクル。
【請求項40】
未改変ＲＮＡ転写物と比較して制御エレメントを含む１つ以上のエキソンが存在しないか又は含まれていることを含む改変ＲＮＡ転写物。
【請求項41】
請求項３３～３７のいずれか一項に記載の２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、任意で、前記オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている組成物。
【請求項42】
請求項３３～３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項３７に記載のコンジュゲートオリゴヌクレオチド、請求項３８に記載のポリヌクレオチド若しくはベクター、請求項３９に記載の送達ビヒクル、又は請求項４１に記載の組成物と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項43】
ヒト又は動物の身体に対して実施される治療方法において使用するための、請求項３３～３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項３７に記載のコンジュゲートオリゴヌクレオチド、請求項３８に記載のポリヌクレオチド若しくはベクター、請求項３９に記載の送達ビヒクル、請求項４１に記載の組成物、又は請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項44】
遺伝子の発現を調節することによって対象における疾患又は病態を治療又は予防する方法において使用するための、請求項３３～３７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項３８に記載のポリヌクレオチド若しくはベクター、請求項３９に記載の送達ビヒクル、請求項４１に記載の組成物、又は請求項４２に記載の医薬組成物であって、治療的に有効な量の前記オリゴヌクレオチド、前記ポリヌクレオチド若しくはベクター、前記送達ビヒクル、前記組成物、又は前記医薬組成物を対象に投与することを含む、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド若しくはベクター、送達ビヒクル、組成物、又は医薬組成物。
【請求項45】
請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法に従ってＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を調節すること；請求項３１に記載の方法に従って遺伝子の発現又は活性を調節すること；又は請求項３２に記載の方法に従ってタンパク質発現を増加、減少、若しくは回復させることを含む、請求項４３又は４４に記載の通り使用するためのオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ベクター、送達ビヒクル、組成物、又は医薬組成物。
【請求項46】
遺伝子の発現又は活性を調節することにより対象における疾患又は状態を治療又は予防するための医薬の製造における、請求項３３～３７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項３８に記載のポリヌクレオチド若しくはベクター、請求項３９に記載の送達ビヒクル、請求項４１に記載の組成物、又は請求項４２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項47】
遺伝子の発現又は活性を調節することにより対象における疾患又は病態を治療又は予防する方法であって、治療的に有効な量の請求項３３～３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項３７に記載のコンジュゲートオリゴヌクレオチド、請求項３８に記載のポリヌクレオチド若しくはベクター、請求項３９に記載の送達ビヒクル、請求項４１に記載の組成物、又は請求項４２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項48】
請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法に従ってＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を調節する；請求項３１に記載の方法に従って遺伝子の発現又は活性を調節する；又は請求項３２に記載の方法に従ってタンパク質発現を増加、減少、若しくは回復させる、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子の発現又は活性を調節するための化合物、並びにその方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
内因性遺伝子の発現を調節する技術は当技術分野において公知である。例えば、遺伝子発現の調節は、ＤＮＡ結合剤、低分子、又は合成オリゴヌクレオチド等によって転写のレベルで媒介することができる。遺伝子発現はまた、例えばＲＮＡ干渉によって転写後に調節することもできる。
【0003】
アンチセンス技術、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技術、及びＣＲＩＳＰＲ干渉技術を含む標的遺伝子サイレンシング技術は比較的十分に開発されている。しかし、標的遺伝子のアップレギュレーションを誘導することができる技術は比較的少ない。
【0004】
本発明の目的は、特定の遺伝子の発現又は活性を調節するための、更なる改良された化合物及び方法を同定することである。
【発明の概要】
【0005】
本発明者らは、特定の遺伝子の発現又は活性を調節する新規方法を見出した。具体的には、本発明者らは、上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）等の遺伝子の発現又は活性に大きな影響を与える多くの制御エレメントがＲＮＡ転写物のエキソンに位置することを見出した。従って、特定のエキソンの有無、ひいてはそこに含まれる制御エレメントを変化させるためにスプライス調節を利用することができる。
【0006】
スプライス調節が誘導された結果として制御配列が除去されると、その制御エレメントの効果が逆転する。例えば、負の制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）を含むエキソンを除去するスプライス調節を行うと、該負の制御エレメントを欠くＲＮＡ転写物が生成され、それによって該制御エレメントが天然では調節することになったであろうタンパク質のアップレギュレーションが誘導される。あるいは、正の制御エレメント（例えば、転写物を安定化させるモチーフ）を含むエキソンを除去するスプライス調節を行うと、該正の制御エレメントを欠くＲＮＡ転写物が生成され、それによって該制御エレメントが天然では調節することになったであろうタンパク質のダウンレギュレーションが誘導される。更なる例としては、細胞内局在シグナルを含むエキソンを除去するスプライス調節を行うと、その転写物の細胞内局在が変化する。別の例としては、非コードＲＮＡ転写物中の他のＲＮＡ又はタンパク質と相互作用する制御エレメントを含むエキソンを除去するスプライス調節を行うと、特定の相互作用が喪失し、それによって該非コードＲＮＡ転写物の活性が調節される。
【0007】
逆に、スプライス調節が誘導された結果として制御配列が含められると、新たに含められたエキソンに存在する制御エレメントの性質に依存した結果を促進する効果が得られるであろう。例えば、負の制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）を含むオルタナティブスプライシングされたエキソン又は隠れエキソンを含めると、該負の制御エレメントを追加的に含むＲＮＡ転写物が生成され、それによって、該制御エレメントが天然では調節することになったであろうタンパク質のダウンレギュレーションが誘導される。あるいは、正の制御エレメント（例えば、転写物を安定化させるモチーフ）を含むオルタナティブスプライシングされたエキソン又は隠れエキソンを含めると、該正の制御エレメントを追加的に含むＲＮＡ転写物が生成され、それによって該制御エレメントが天然では調節することになったであろうタンパク質のアップレギュレーションが誘導される。更なる例としては、細胞内局在シグナルを含むエキソンを含めるスプライス調節を行うと、その転写物の細胞内局在が変化する。
【0008】
従って、本発明は、ＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を調節するための方法であって、該制御エレメントを含む１つ以上のエキソンのスプライス調節を誘導するために、ＲＮＡ転写物におけるスプライシングシグナルを標的とする化合物を細胞に送達することを含む方法を提供する。
【0009】
本発明はまた、遺伝子の発現又は活性を調節する方法であって、本発明の方法に従って該遺伝子にコードされているＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を調節することを含む方法を提供する。
【0010】
本発明はまた、タンパク質発現を増加、減少、又は回復させる方法であって、本発明の方法に従ってＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を調節することを含む方法を提供する。
【0011】
本発明はまた、制御エレメントを含む１つ以上のエキソンがスキッピング及び／又は保持されるようなオルタナティブスプライシングを誘導するための、ＲＮＡ転写物におけるスプライシングシグナルを標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。
【0012】
本発明はまた、２つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートオリゴヌクレオチドを提供する。
【0013】
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドをコードしているポリヌクレオチド又はベクターを提供し、任意で、該ベクターはＡＡＶ又はレンチウイルスである。
【0014】
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドを含む送達ビヒクルを提供する。
【0015】
本発明はまた、未改変ＲＮＡ転写物と比較して制御エレメントを含む１つ以上のエキソンが存在しないか又は含まれていることを含む改変ＲＮＡ転写物を提供する。
【0016】
本発明はまた、本発明に係る２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、任意で、該オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしている組成物を提供する。
【0017】
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲートオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド若しくはベクター、送達ビヒクル、又は組成物と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を提供する。
【0018】
本発明はまた、ヒト又は動物の身体に対して実施される治療の方法において使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲートオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド若しくはベクター、送達ビヒクル、組成物、又は医薬組成物を提供する。
【0019】
本発明はまた、遺伝子の発現を調節することによって対象における疾患又は病態を治療又は予防する方法において使用するための本発明に係るオリゴヌクレオチド、コンジュゲートオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド若しくはベクター、送達ビヒクル、組成物、又は医薬組成物であって、治療的に有効な量の該オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、送達ビヒクル、組成物、又は医薬組成物を該対象に投与することを含む、オリゴヌクレオチド、コンジュゲートオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド若しくはベクター、送達ビヒクル、組成物、又は医薬組成物を提供する。
【0020】
本発明はまた、遺伝子の発現又は活性を調節することにより対象における疾患又は病態を治療又は予防のための医薬の製造における、本発明に係るオリゴヌクレオチド、コンジュゲートオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド若しくはベクター、送達ビヒクル、組成物、又は医薬組成物の使用を提供する。
【0021】
本発明はまた、遺伝子の発現又は活性を調節することにより対象における疾患又は病態を治療又は予防するための、本発明に係るオリゴヌクレオチド、コンジュゲートオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド若しくはベクター、送達ビヒクル、組成物、又は医薬組成物の使用を提供する。
【0022】
本発明はまた、遺伝子の発現又は活性を調節することにより対象における疾患又は病態を治療又は予防する方法であって、治療的に有効な量の本発明のオリゴヌクレオチド若しくはコンジュゲートオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド若しくはベクター、送達ビヒクル、組成物、又は医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】図１Ａは、予測ｕＯＲＦを含むヒト及びマウスの転写物の割合を示す。図１Ｂは、転写物あたりのｕＯＲＦの数を示す。図１Ｃは、ｕＯＲＦの長さの分布を示す。図１Ｄは、ｐＯＲＦと重複するｕＯＲＦの割合を示す。図１Ｅは、転写開始点とｕＯＲＦとの間の距離の分布を示す。図１Ｆは、ｕＯＲＦとｐＯＲＦとの間の距離の分布を示す。図１Ｇは、ｐＯＲＦ及びｕＯＲＦの終止コドン使用率の分布を示す。図１Ｈは、弱い又は強いコザックコンテキストを含むｕＯＲＦ及びｐＯＲＦの割合を示す。図１Ｉは、ｕＯＲＦ及びｐＯＲＦにおけるコザックコンテキストのロゴプロットを示す。図１Ｊは、他のゲノム特徴に対するｕＯＲＦにおけるｐｈａｓｔＣｏｎｓスコアの分布を示す。図１Ｋは、追加のｒｉｂｏｓｅｑ及びＲＮＡ－ｓｅｑのトラックと共に、ゲノムブラウザにマッピングされたＨＴＴ遺伝子の予測ｕＯＲＦを示す。
【図2】図２Ａは、ＦＯＸＬ２、ＨＯＸＡ１１、ＪＵＮ、ＫＤＲ、ＲＮＡＳＥＨ１、ＳＭＯ、及びＳＲＹについての予測ｕＯＲＦのルシフェラーゼ検証データを示す。各５’ＵＴＲをウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）レポーター遺伝子の上流にクローニングし、ｕＯＲＦのＡＴＧをＴＴＧに変化させることによりｕＯＲＦを不活化した変異体コンストラクトを作製した。ルシフェラーゼ発現の活性化は、ｕＯＲＦを介した翻訳抑制が解除されたことを示す。図２Ｂは、図２Ａのコンストラクトの転写レベルデータを示す。図２Ｃは、ＭＡＰ２Ｋ２も含む図２Ａの独立した検証を示す。図２Ｄは、ＢＤＮＦ（２つのアイソフォーム）、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＧＡＴＡ２（３つのアイソフォーム）、ＧＤＮＦ、ＨＴＴ、及びＳＣＮ１Ａのルシフェラーゼレポーターデータを示す。まとめると、これらプロットにより複数のｕＯＲＦの存在が確認される。図２Ｅは、２９の健常ヒト組織から得られたプロテオミクスデータ（遍在的に発現しているタンパク質のみ）（１）の累積分布関数プロットを示し、それによって、ｕＯＲＦを含むものとｕＯＲＦを含まないものとに転写物を分類した。タンパク質発現値の分布は、ｕＯＲＦを含む転写物の方が有意に低い。図２Ｆは、２９の健常ヒト組織から集計したプロテオミクスデータ（全タンパク質）（１）の累積分布関数プロットを示し、それによって、ｕＯＲＦを含むものとｕＯＲＦを含まないものとに転写物を分類した。タンパク質発現値の分布は、ｕＯＲＦを含む転写物の方が有意に低い。
【図3】図３Ａは、ｕＯＲＦの特性の解析を示す。ＨＯＸＡ１１のｕＯＲＦに対して、コザックコンテキスト配列の強度を変化させた、ｕＯＲＦの長さを長くした、ｕＯＲＦを徐々に切断した、並びにｕＯＲＦにＦＬＡＧ及びＨｉＢｉＴのタグを付加した種々の機能変異体を作製した。ヌクレオチド配列は、配列番号２９～４１として配列表に示す（上から下に付番）。ポリペプチド配列は、配列番号４２～５０として配列表に示す（上から下に付番；４アミノ酸未満のポリペプチドには配列番号が割り当てられない）。図３Ｂ、Ｃ、及びＤは、２９の健常ヒト組織から得られたプロテオミクスデータ（１）の累積分布関数プロットを示し、それによって、転写物を以下の通り分類した：（Ｂ）強い又は弱いコザックコンテキスト、（Ｃ）最小ｕＯＲＦ（ＡＴＧ－終止）又は他のｕＯＲＦ、及び（Ｄ）翻訳開始部位（ＴＩＳ）に及ぶか否か。
【図4】図４は、制御エレメント含有エキソンスキッピング戦略を示す概略図である。（Ａ）エキソン２に制御エレメントを含む仮想ｍＲＮＡの構造を示す概略図。これは、一次ＯＲＦ（ｐＯＲＦ）の翻訳出力を抑制する上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）であり得る。プレｍＲＮＡが正常にスプライシングされると、制御エレメントによる制御を受ける成熟ｍＲＮＡが生成される。（Ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）によって、制御エレメントを含むｍＲＮＡエキソンのエキソンスキッピングが媒介された。この結果、成熟ｍＲＮＡから制御エレメントが排除される。制御エレメントがｕＯＲＦである場合、結果として生じるエキソンスキッピングされたｍＲＮＡの抑制が解除される。
【図5】図５は、制御エレメント含有エキソンインクルージョン戦略を示す概略図である。（Ａ）「エキソン１ｂ」とラベル付けされた、通常スプライシングされた成熟ｍＲＮＡには存在せずかつ制御エレメントを含有する、オルタナティブスプライシングされるエキソン（又は隠れエキソン）を有する仮想ｍＲＮＡの構造を示す概略図。この制御エレメントは、一次ＯＲＦ（ｐＯＲＦ）の翻訳出力を抑制する潜在力を有する上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）であり得る。プレｍＲＮＡが正常にスプライシングされると、制御エレメントによる制御を受けない成熟ｍＲＮＡが生成される。（Ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）によって、制御エレメントを含むｍＲＮＡエキソンのエキソンインクルージョンが媒介された。この結果、結果として得られる成熟ｍＲＮＡに制御エレメントが含められる。制御エレメントがｕＯＲＦである場合、結果として生じるエキソンインクルージョンされたｍＲＮＡは直ちに抑制される。
【図6】図６は、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）に適用される制御エレメント含有エキソンスキッピング戦略を示す概略図である。（Ａ）エキソン２に制御エレメントを含む長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の仮想の構造を示す概略図。これは、細胞内で何らかの機能を発揮する翻訳されたマイクロペプチドであり得る。逆に、制御エレメントはｌｎｃＲＮＡの機能にとって重要なドメイン（例えば、ＲＮＡ：タンパク質相互作用を媒介するＲＮＡ二次構造を形成する）であってもよい。プレｌｎｃＲＮＡが正常にスプライシングされて成熟ｌｎｃＲＮＡが生成されると、マイクロペプチドが生成される／制御ドメインが含められる。（Ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）によって、制御エレメントを含むｌｎｃＲＮＡエキソンのエキソンスキッピングが媒介された。この結果、成熟ｌｎｃＲＮＡからエレメントが排除される。制御エレメントがマイクロペプチドである場合、このペプチドはもはやエキソンスキッピングされた成熟ｌｎｃＲＮＡによっては生成されない。制御エレメントがＲＮＡ：タンパク質相互作用ドメインである場合、エキソンスキッピングされた成熟ｌｎｃＲＮＡの場合にはこの相互作用が結果的に破壊されることになる。
【図7】図７は、ＢＤＮＦ遺伝子座における予測ｕＯＲＦの解析を示す。（Ａ）１７のＲｅｆＳｅｑ転写物アイソフォームを示すＢＤＮＦ遺伝子座のゲノムブラウザのスクリーンショット。ＭＡＮＥセレクトバリアントが示されている。ＮＭ＿００１１４３８１１及びＮＭ＿００１１４３８１４は、スキッピング可能な５’ＵＴＲエキソンを有する２つのアイソフォームである。予測ｕＯＲＦの位置が示され、データはＧＷＩＰＳ－ｖｉｚブラウザから公的に入手可能なｒｉｂｏｓｅｑ及びＲＮＡ－ｓｅｑのデータと組み合わされている。（Ｂ）特定のｕＯＲＦにおける翻訳のｒｉｂｏｓｅｑによる証拠と共に９つの転写物アイソフォームの最初のエキソンを拡大した図。
【図8】図８は、エキソンの欠失がＢＤＮＦの一次ＯＲＦ翻訳に及ぼす影響を示す。（Ａ）エキソンのサイズ及び位置、予測ｕＯＲＦの位置、並びにエキソンあたりのｕＯＲＦ数を示すＢＤＮＦ ｖ１１転写物（ＮＭ＿００１１４３８１１）の５’ＵＴＲの概略図。ｐＯＲＦの開始コドンはエキソン４に位置する。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、指定通りＢＤＮＦ ｖ１１の５’ＵＴＲ－ＤＬＲの野生型及び変異型のコンストラクトをトランスフェクトし、２４時間後にルシフェラーゼ活性を求めた。各変異体について、エキソンの構造及び機能的ｕＯＲＦ（白丸）の数を示す。ＨＯＸＡ１１ ＷＴ及びＨＯＸＡ１１ ＴＴＧ（ｕＯＲＦ破壊）のコンストラクトを、ｕＯＲＦ制御及びトランスフェクション成功についての陽性対照として並行してトランスフェクトした。（Ｃ）ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて、ＦＬｕｃ発現に対して正規化したＲＬｕｃ転写レベルを並行して求めた。（Ｄ）ＢＤＮＦ ｖ１４転写物（ＮＭ＿００１１４３８１４）の５’ＵＴＲの概略。ｐＯＲＦの開始コドンはエキソン３に位置する。（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、指定通りＢＤＮＦ ｖ１４の５’ＵＴＲ－ＤＬＲの野生型及びΔエキソン２型のコンストラクトをトランスフェクトし、２４時間後にルシフェラーゼ活性を求めた。値は平均＋ＳＥＭであり、ＤＬＲデータではｎ＝４、ＲＴ－ｑＰＣＲデータではｎ＝３である。各実験につき少なくとも３回の独立した反復実験から、非常によく似た結果が得られた。一元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定によって群間差を検定した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図9】図９は、ｕＯＲＦがＢＤＮＦ ｖ１１エキソン２の抑制活性に部分的に関与していることを示す。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、指定通りＢＤＮＦ ｖ１１（ＮＭ＿００１１４３８１１）の５’ＵＴＲ－ＤＬＲの野生型及び変異型のコンストラクトをトランスフェクトし、トランスフェクション２４時間後にルシフェラーゼ活性を求めた。エキソン２、エキソン３、又はエキソン２及び３の両方を欠失させたコンストラクトを作製した。更に、開始コドンをＴＴＧに変異させることによって、エキソン２の８つのｕＯＲＦを全て破壊したコンストラクトも作製した。各コンストラクトについて、エキソンの構造及び機能的又は破壊されたｕＯＲＦの数（それぞれ白丸及び黒丸）を示す。ＨＯＸＡ１１ ＷＴ及びＨＯＸＡ１１ ＴＴＧ（ｕＯＲＦ破壊）のコンストラクトを、ｕＯＲＦ制御及びトランスフェクション成功についての陽性対照として並行してトランスフェクトした。（Ｂ）ＨｕＲ＃１及びＨｕＲ＃２モチーフ部位が示されているＢＤＮＦ ｖ１１の５’ＵＴＲの概略。エキソンのサイズ及び位置、予測ｕＯＲＦの位置、並びにエキソンあたりのｕＯＲＦの数も示す。（Ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、種々のＢＤＮＦ ｖ１１の５’ＵＴＲ－ＤＬＲコンストラクトをトランスフェクトした。ＨｕＲモチーフの一方又は両方が欠失した変異体を作製した。両モチーフが欠失し、エキソン２のｕＯＲＦが全て破壊された追加のコンストラクトも並行して試験した。トランスフェクションの２４時間後にルシフェラーゼ活性を求めた。値は平均±ＳＥＭ、ｎ＝４である。各実験につき少なくとも３回の独立した反復実験から、非常によく似た結果が得られた。一元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定によって群間差を検定した。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ、有意差無し。
【図10】図１０は、ＢＤＮＦ ｖ１１エキソン２の欠失ウォーク解析を示す。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、指定通りＢＤＮＦ ｖ１１（ＮＭ＿００１１４３８１１）の５’ＵＴＲ－ＤＬＲの野生型及び変異型のコンストラクトをトランスフェクトし、トランスフェクション２４時間後にルシフェラーゼ活性を求めた。エキソン２に及ぶ５０ｂｐの領域を逐次欠失させたコンストラクトを作製した。ＨＯＸＡ１１ ＷＴ及びＨＯＸＡ１１ ＴＴＧ（ｕＯＲＦ破壊）のコンストラクトを、ｕＯＲＦ制御及びトランスフェクション成功についての陽性対照として並行してトランスフェクトした。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、エキソン２の最初の５０ｂｐに及ぶ１０ｂｐ領域を逐次欠失させたＢＤＮＦ ｖ１１コンストラクトで上記の通り処理した。値は平均±ＳＥＭ、ｎ＝４である。各実験につき少なくとも２つの独立した反復実験から、非常によく似た結果が得られた。一元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定によって群間差を検定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ、有意差無し。
【発明を実施するための形態】
【0024】
制御エレメント
本発明は、ＲＮＡ転写物における任意の制御エレメントであって、関心対象の遺伝子の発現又は活性を制御する制御エレメントに関する。例えば、制御エレメントは、遺伝子がＲＮＡ又はタンパク質の形で発現する時期、場所、及び量、並びに／又はその活性を制御することができる。例えば、制御エレメントは、翻訳制御エレメント、ＲＮＡプロセシング制御エレメント、局在化エレメント、鉄応答エレメント（ＩＲＥ）、リボスイッチ、ｍｉＲＮＡ認識エレメント、ＲＮＡ結合タンパク質認識部位、又は別の内因性ＲＮＡ転写物とのハイブリダイゼーション部位であり得る。
本発明は、ＲＮＡ転写物における任意の制御エレメントであって、関心対象の遺伝子の発現又は活性を制御する制御エレメントに関する。例えば、制御エレメントは、遺伝子がＲＮＡ又はタンパク質の形で発現する時期、場所、及び量、並びに／又はその活性を制御することができる。例えば、制御エレメントは、翻訳制御エレメント、ＲＮＡプロセシング制御エレメント、局在化エレメント、鉄応答エレメント（ＩＲＥ）、リボスイッチ、ｍｉＲＮＡ認識エレメント、ＲＮＡ結合タンパク質認識部位、又は別の内因性ＲＮＡ転写物とのハイブリダイゼーション部位であり得る。
【0025】
翻訳制御エレメントは、上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）、又はステムループ、ヘアピン、若しくはグアニン四重鎖等の二次構造であり得る。
【0026】
ＲＮＡプロセシング制御エレメントは、スプライシングシグナル、アデニル酸－ウリジル酸リッチエレメント（ＡＲＥ）、又は転写物安定化モチーフであり得る。
【0027】
制御エレメントは、シス制御エレメントであってもトランス制御エレメントであってもよい。通常、制御エレメントはシス制御エレメントである。一実施形態では、制御エレメントはトランス制御エレメントではない。
【0028】
制御エレメントがトランス制御エレメントである実施形態においては、制御エレメントは、例えば、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）内にコードされているマイクロペプチドコード配列であり得る。マイクロペプチドとは、短いオープンリーディングフレームによってコードされている１００～１５０アミノ酸長未満のポリペプチドである。例えば、参照文献２を参照。従って、マイクロペプチドを翻訳できないように、マイクロペプチドをコードしている配列を含むエキソンを本発明に従ってスキッピングし得る。
【0029】
制御エレメントはＲＮＡ転写物のどこに存在してもよい。例えば、ＲＮＡ転写物がタンパク質をコードしているＲＮＡ転写物である場合、制御エレメントはｕＯＲＦ等の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在し得る。あるいは、制御エレメントはｍｉＲＮＡ結合部位又は選択的ポリアデニル化シグナル等の３’ＵＴＲに存在してもよい。一実施形態では、制御エレメントはＲＮＡプロセシング制御エレメントではない。一実施形態では、制御エレメントはスプライシングシグナルではない。
【0030】
制御エレメントは、ｕＯＲＦであってもよい。ｕＯＲＦは５’ＵＴＲに存在する制御配列であり、開始コドン及びインフレームの終止コドンからなる。ＲＮＡ転写物中の１つ以上のｕＯＲＦの存在は、下流ｐＯＲＦの翻訳抑制と関連している。ｕＯＲＦはまた、ナンセンス媒介崩壊を介した転写物の安定性等の他の機序を介して遺伝子発現に影響を与えることもできる。ｕＯＲＦの特徴は当技術分野で公知であり、同定方法は当業者の技能の範囲内である（例えば、参照文献３及び４を参照）。
【0031】
本発明者らは、ＲＮＡ転写物における１つ以上のｕＯＲＦを付加及び／又は除去することにより、下流ｐＯＲＦのタンパク質発現を大幅に調節できることを見出した。具体的には、本発明者らは、それぞれＲＮＡ転写物の５’ＵＴＲに複数のｕＯＲＦを含有するＢＤＮＦ、ＳＣＮ１Ａ、及びＢＲＤ３の３つの遺伝子のＲＮＡ転写物に対して機能的変異誘発を行った。次に、これら各ｕＯＲＦを逐次欠失させることにより、ｕＯＲＦを介した抑制が相加的であること、そして、ＲＮＡ編集を用いて単一のｕＯＲＦを標的破壊すると、下流のタンパク質に対する抑制効果が減少し、タンパク質発現が著しく増加することが実証された。
【0032】
従って、本発明は、１つ以上の制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）、例えば≦５０個、≦４０個、≦３０個、≦２０個、≦１０個、≦５個、又は１個の制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）を含む１つ以上のエキソンを導入及び／又は除去することを含み得る。制御エレメントは１つ以上のエキソンに位置し得る。
【0033】
本発明者らは、制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）が強力であるほど、制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）を導入及び／又は除去したときの機能的影響（すなわち、下流ｐＯＲＦの発現）がより有効になることを見出した。従って、本発明は、下記の特徴のうちの１つ以上を含む、強力なｕＯＲＦ等の制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）を同定する工程を含み得る。例えば、導入及び／又は除去される制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）は、それが天然で調節するタンパク質（例えば、下流ｐＯＲＦ）の発現を≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、又は１００％低下させることができる。
【0034】
本発明で有用なｕＯＲＦは、ｐＯＲＦの上流５００ヌクレオチド以内に存在し得る。例えば、制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）は、ｐＯＲＦ開始コドンの≦４００ヌクレオチド、≦３００ヌクレオチド、≦２００ヌクレオチド、≦１００ヌクレオチド、≦９０ヌクレオチド、≦８０ヌクレオチド、≦７０ヌクレオチド、≦６０ヌクレオチド、≦５０ヌクレオチド、≦３０ヌクレオチド、≦２０ヌクレオチド、≦１０ヌクレオチド、≦５ヌクレオチド上流にあり得る。例えば、ｕＯＲＦは、成熟ＲＮＡ転写物（ＲＮＡ転写物の天然のスプライシングが行われた後）においてｐＯＲＦの上流１００ヌクレオチド以内に存在することになったであろうものであり得る。
【0035】
本発明者らは、ｕＯＲＦが成熟ＲＮＡ転写物（ＲＮＡ転写物の天然のスプライシングが行われた後）のｐＯＲＦ開始コドンに近いほど、その抑制作用が強くなるので、これらｕＯＲＦは本発明の有用な標的となるであろうことを見出した。従って、複数のｕＯＲＦを含むＲＮＡ転写物において、本発明は、成熟ＲＮＡ転写物（ＲＮＡ転写物の天然スプライシングが行われた後）においてｐＯＲＦ開始コドンに最も近接することになったであろうｕＯＲＦを少なくともスキッピングすることを含み得る。
【0036】
本発明で有用なｕＯＲＦは、任意の長さであってよい。本発明者らは、最小配列（開始－終止）からなるｕＯＲＦが強力な翻訳抑制因子であるので、これらｕＯＲＦが本発明の有用な標的となるであろうことを見出した。従って、本発明で有用なｕＯＲＦは、開始コドンと終止コドンとの間に≦５０個、≦４０個、≦３０個、≦２０個、≦１０個、≦５個、≦４個、≦３個、≦２個、１個、又は０個のコドンを含み得る。特定の実施形態においては、ｕＯＲＦは、開始コドンと終止コドンとの間に、≦５個、≦４個、≦３個、≦２個、１個、又は０個のコドンを含み得る。
【0037】
本発明で有用なｕＯＲＦは、ｐＯＲＦと重複していてもよい。例えば、ｕＯＲＦは、成熟転写物（ＲＮＡ転写物の天然のスプライシングが行われた後）においてｐＯＲＦと重複することになったであろうものであり得る。この実施形態では、本発明に係るスプライス調節の結果、ｕＯＲＦは部分的に切り取られるが、ｐＯＲＦはインタクトなままである。
【0038】
本発明で有用なｕＯＲＦは、ｐＯＲＦと重複していなくてもよい。
【0039】
本発明で有用なｕＯＲＦは、別のｕＯＲＦと重複していてもよい。
【0040】
本発明で有用なｕＯＲＦは、コザックコンセンサス配列ｎｎｎｎＡＵＧｎ（配列番号１６）を含み得る。コザック配列は、（開始コドンの最初のヌクレオシド、例えばＡＵＧ開始コドンのＡに対して）＋４位のグアニン及び－３位のプリンを含む強力なコザック配列であってよい。コザック配列は、（開始コドンの最初のヌクレオシド、例えばＡＵＧ開始コドンのＡに対して）－３位のプリンを含むが＋４位のグアニンは含まない弱いコザック配列であってもよく、逆もまた同様である。コザック配列は、（開始コドンの最初のヌクレオシド、例えばＡＵＧ開始コドンのＡに対して）－３位のプリン及び＋４位のグアニンの両方を欠く弱いコザック配列であってもよい。例えば、ｕＯＲＦは、ｎ［ａ／ｇ］ｎｎＡＵＧｇ（配列番号１７）等のコザック配列を含み得る。
【0041】
本発明で有用なｕＯＲＦは、芳香族疎水性アミノ酸と比較して、酸性及び塩基性のアミノ酸の割合が高い組成を含み得る。
【0042】
本発明で有用な制御エレメントは、ＲＮＡ転写物中に天然に存在していてもよい。あるいは、制御エレメントは非古典的及び／又は異所的なスプライシング事象によって導入されてもよい。あるいは、制御エレメントは変異によって導入されてもよい。
【0043】
例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）又は他の変異によって制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）が導入されてもよい。そのような実施形態では、本発明に係るスプライス調節は、変異によって誘導される制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）の効果を逆転させる目的で、変異体転写物の発現を調節するために利用され得る。例えば、ｕＯＲＦを作り出す変異又はＳＮＰを有する遺伝子及びその関連疾患の例を表４に列挙する。
【0044】
更なる例では、制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）を含む隠れエキソンが、ＲＮＡ転写物の５’ＵＴＲのイントロンのうちの１つ以上に存在していてもよい。隠れエキソンは、野生型ＲＮＡ転写物中に天然に存在する場合もあり、変異の結果として導入される場合もある。隠れエキソンの非古典的及び／又は異所的なスプライシングによって、ＲＮＡ転写物中に隠れエキソンが導入される場合もある。そのような実施形態では、本発明に係るスプライス調節を利用して隠れエキソンを除去し、それによって、挿入された制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）を除去することができる。
【0045】
典型的には、本発明は、開始コドンから終止コドンまでのｕＯＲＦ全体等、制御エレメント全体の存在の調節に関する。しかし、本発明は制御エレメントの一部の存在の調節に関する場合もある。例えば、本発明は、ｕＯＲＦの一部の存在の調節、例えば、ｕＯＲＦの開始コドンをコードしている部分のみを除去するが、残りのｕＯＲＦはＲＮＡ転写物中に残すことに関する場合もある。従って、本発明の方法及び使用において、制御エレメントは完全に除去又は導入されてもよく、部分的に除去又は導入されてもよい。
【0046】
スプライス調節
本発明は、１つ以上の制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）を含む１つ以上のエキソンをスキッピングする及び／又は含めるようにスプライス調節を誘導することに関する。疾患の治療のためにスプライス調節を誘導する方法は、当技術分野において公知である（５）。しかし、これまでのスプライス調節アプローチは、機能的タンパク質産物が生成されるようにＲＮＡ転写物のリーディングフレームを復元することを目的として、ＲＮＡ転写物のコード領域に適用されるのが一般的であった。対照的に、本発明は、ＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を変化させるためにスプライス調節を用いることに関する。
本発明は、１つ以上の制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）を含む１つ以上のエキソンをスキッピングする及び／又は含めるようにスプライス調節を誘導することに関する。疾患の治療のためにスプライス調節を誘導する方法は、当技術分野において公知である（５）。しかし、これまでのスプライス調節アプローチは、機能的タンパク質産物が生成されるようにＲＮＡ転写物のリーディングフレームを復元することを目的として、ＲＮＡ転写物のコード領域に適用されるのが一般的であった。対照的に、本発明は、ＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を変化させるためにスプライス調節を用いることに関する。
【0047】
５’ＵＴＲにおけるエキソンスキッピングが関与する本発明の実施形態においては、標的ＲＮＡ転写物は、天然では成熟ＲＮＡ転写物（天然のスプライシング事象が行われた後）においてスプライシングされた５’ＵＴＲを有することになったであろうものである。従って、ＲＮＡ転写物は、天然のスプライシング事象が行われる前に、ｐＯＲＦ開始コドンを含むエキソンの上流に少なくとも２つのエキソンを含有する（図４参照）。例えば、エキソンスキッピングは、５’ＵＴＲにおけるエキソン２及び／又は１つ以上の下流のエキソンを除去することを含み得る。ｐＯＲＦ開始コドンを含むエキソンはスキッピングされない。
【0048】
本発明は、単一のエキソン又は複数のエキソンのスキッピングを含み得る。制御エレメントは１つ以上のエキソンに位置し得る。従って、本発明は、ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む単一のエキソンをスキッピングすることを含み得る。あるいは、本発明は、ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む複数のエキソンをスキッピングすることを含み得る。
【0049】
本発明は、単一のエキソン又は複数のエキソンのエキソンインクルージョンを含み得る。制御エレメントは１つ以上のエキソンに位置し得る。従って、本発明は、ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む単一のエキソンを導入することを含み得る。あるいは、本発明は、ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む複数のエキソンを導入することを含み得る。
【0050】
本発明は、マルチエキソンスプライス調節、すなわち、１つ以上のエキソンをスキッピングし、１つ以上のエキソンを導入することを含み得る。従って、本発明は、ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む単一のエキソンをスキッピングし、ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む単一のエキソンを導入することを含み得る。あるいは、本発明は、ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む複数のエキソンをスキッピングし、ＲＮＡ転写物における１つ以上の制御エレメントを含む複数のエキソンを導入することを含み得る。
【0051】
マルチエキソンスプライス調節は、以下に更に説明する通り、本発明の２つ以上の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の組成物を用いて達成することができる。
【0052】
標的部位及びＲＮＡ転写物
本発明は、スプライシングシグナルを標的としてスプライス調節を誘導することを含む。
本発明は、スプライシングシグナルを標的としてスプライス調節を誘導することを含む。
【0053】
本発明で有用なスプライシングシグナルは、５’スプライスドナー部位、３’スプライスアクセプタ部位、エキソンスプライシングエンハンサー配列（ＥＳＥ）、スプライシング分岐点、ポリピリミジントラクト、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）配列等のスプライシングモチーフを含み得る。このようなスプライシングモチーフは当技術分野で公知であり、当技術分野で公知である方法、例えばバイオインフォマティクス技術を用いて同定することができる。
【0054】
５’スプライスドナー部位は、配列［Ｃ／Ａ］ＡＧｇｕ［ａ／ｇ］ａｇ（配列番号１８）を含み得る。
【0055】
３’スプライスアクセプタ部位は、配列ｃａｇＧ［Ｇ／Ｕ］（配列番号１９）を含み得る。
【0056】
エキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）は、ＳＲファミリーのタンパク質によって認識されるモチーフであり、スプライシング機構の構成要素をスプライス部位に動員する機能を有する。本発明で有用なＥＳＥは、セリン／アルギニンリッチなスプライシング因子１（ＳＲＳＦ１）結合部位（ＳＦ２／ＡＳＦモチーフとしても知られている）、ＳＣ３５結合部位、ＳＲｐ４０結合部位、又はＳＲｐ５５結合部位であり得る。例えば、本発明で有用なＥＳＥは、配列ＣＡＣＡＣＧＡ（配列番号２０）を含むＳＲＳＦ１結合部位であり得る。ＥＳＥは当技術分野において周知であり、バイオインフォマティクスによって同定することができる（例えば、参照文献６、７を参照）。
【0057】
スプライシング分岐点は、配列ｃｕ［ａ／ｇ］Ａ［ｃ／ｕ］（配列番号２１）を含み得る。
【0058】
本発明の実施形態においては、標的部位が、５’スプライスドナー部位、３’スプライスアクセプタ部位、エキソンスプライシングエンハンサー配列（ＥＳＥ）、スプライシング分岐点、又はポリピリミジントラクトである場合、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、エキソン排除を誘導し得る。
【0059】
ＩＳＳ配列が標的となる本発明の実施形態では、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）はエキソンインクルージョンを誘導し得る。
【0060】
本発明の化合物は、スプライシングシグナルに直接結合（例えばハイブリダイズ）し得る。例えば、化合物は、スプライシングシグナルに完全又は部分的にハイブリダイズし得る。本発明の化合物は、通常、スプライシングシグナルから離れて結合することはない。
【0061】
標的部位は、通常、ＲＮＡの二次構造を有しない。
【0062】
本発明で有用なＲＮＡ転写物は、典型的には、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）である。プレｍＲＮＡは、スプライシングを受けていなくてもよい。プレｍＲＮＡは、部分的にスプライシングを受けていてもよい、すなわち、部分的にプロセシングされたｍＲＮＡ転写物であってよい。ＲＮＡ転写物は、成熟ｍＲＮＡではなくてもよい。
【0063】
ＲＮＡ転写物は、タンパク質をコードしているＲＮＡ転写物であってもよく、非コードＲＮＡ転写物であってもよい。非コードＲＮＡ転写物は、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、長鎖介在非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、又はマクロＲＮＡであってよい。
【0064】
ＲＮＡ転写物は、通常、関心対象の遺伝子の天然の転写物である。
【0065】
あるいは、ＲＮＡ転写物は、例えば異常な遺伝的事象又はＲＮＡプロセシング事象から生じるキメラＲＮＡであってもよい。例えば、キメラＲＮＡは、例えばＢＣＲ－ＡＢＬ融合体等、多くの場合変異（染色体配置等）の結果である並置を通して結合した可能性のある２つの遺伝子からなる融合遺伝子から生じる場合がある。更なる例として、キメラＲＮＡは、隣接する２つの遺伝子が同じ転写物において転写され、その後スプライシングを受け、それらのエキソンが互いに結合した結果として生じる場合もある。このような場合、本発明の化合物、方法、又は使用を利用して、融合遺伝子の発現又はキメラＲＮＡの発現若しくは活性を調節することができる。
【0066】
本発明はまた、未改変ＲＮＡ転写物と比較して制御エレメントを含む１つ以上のエキソンが存在しないか又は含まれていることを含む改変ＲＮＡ転写物を提供する。
【0067】
化合物
本発明の化合物は、細胞内の１つ以上のスプライシングタンパク質複合体を活性化させて、ＲＮＡ転写物から１つ以上のエキソンを除去又は導入することができる。化合物は、スプライシング活性を制御するタンパク質を阻害し得る。化合物は、スプライシング活性を制御するタンパク質を活性化し得る。化合物は、１つ以上のスプライソソーム構成要素がスプライスモチーフを認識する及び／又はスプライスモチーフにアクセスするのを妨げ得る。
本発明の化合物は、細胞内の１つ以上のスプライシングタンパク質複合体を活性化させて、ＲＮＡ転写物から１つ以上のエキソンを除去又は導入することができる。化合物は、スプライシング活性を制御するタンパク質を阻害し得る。化合物は、スプライシング活性を制御するタンパク質を活性化し得る。化合物は、１つ以上のスプライソソーム構成要素がスプライスモチーフを認識する及び／又はスプライスモチーフにアクセスするのを妨げ得る。
【0068】
本発明の化合物は、標的ＲＮＡ転写物の切断を惹起するようには設計されない。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明の化合物は標的配列のステリックブロックを誘導し、ＲＮａｓｅＨの動員を介した標的切断を誘導しないようにする。従って、本発明の特定の実施形態においては、本発明の化合物は、標的核酸のＲＮａｓｅＨ切断を誘導しないか、又は誘導する能力が低下している。
【0069】
本発明の化合物は、遺伝子の発現又は活性に対する意図した効果に反する作用をもたらさないように設計される。例えば、遺伝子発現のアップレギュレーションが望ましい場合、本発明の化合物は、誘導されるスプライス調節によって負の制御エレメント（例えば、ｕＯＲＦ）が導入も形成もされないように設計される。
【0070】
化合物は、典型的にはオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、化合物は、低分子（例えば、９００Ｄａ未満の分子量を有する）であってもよい。あるいは、化合物は、ポリペプチド、例えば抗体であってもよい。
【0071】
オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ等の複数の連結されたヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドであってもよい、すなわち、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド（例えば、少なくとも１つの修飾糖部分及び／又は少なくとも１つの修飾核酸塩基部分）及び／又は少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、及びポリプリン逆フーグスティーン型ヘアピンであってよい。
【0072】
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
【0073】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、５０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、又は５ヌクレオチド長以下であり得る。オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、少なくとも５ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、又は４０ヌクレオチド長であり得る。例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、５～４０ヌクレオチド長、１０～４０ヌクレオチド長、１８～３０ヌクレオチド長、又は１３～２５ヌクレオチド長であり得る。
【0074】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、生理的条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、標的核酸に対して十分に相補的な領域を含む。オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、標的部位（上記で説明）に対して相補的な配列を含む。オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、標的部位に対して完全に又は部分的に相補的であってよい。例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、標的部位に対して≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列相補性を有し得る。
【0075】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、オリゴヌクレオチド内部及び／又はオリゴヌクレオチドの末端にミスマッチ領域を含んでいてもよい。
【0076】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、≧３、≧４、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２、≧１３、≧１４、≧１５、≧１６、≧１７、≧１８、≧１９、及び／又は≧２０の連続する標的部位の相補的塩基を含み得る。
【0077】
オリゴヌクレオチドは、配列番号２２～２６のいずれかを含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。
【0078】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）が５’スプライスドナー部位に対して相補的な配列を含む実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、
５’－［Ｎ］ａＧＡＲＵＧＧＡＭ［Ｎ］ｂ－３’（配列番号２２）
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオシド又はその修飾ヌクレオシドであり；
Ｒは、アデノシン（Ａ）若しくはグアノシン（Ｇ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
Ｍは、アデノシン（Ａ）若しくはシチジン（Ｃ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
ａは、０～２７であり；
ｂは、０～２７である）
を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。
５’－［Ｎ］ａＧＡＲＵＧＧＡＭ［Ｎ］ｂ－３’（配列番号２２）
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオシド又はその修飾ヌクレオシドであり；
Ｒは、アデノシン（Ａ）若しくはグアノシン（Ｇ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
Ｍは、アデノシン（Ａ）若しくはシチジン（Ｃ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
ａは、０～２７であり；
ｂは、０～２７である）
を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。
【0079】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）が３’スプライスアクセプタ部位に対して相補的な配列を含む実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、
５’－［Ｎ］ａＫＧＧＡＣ［Ｎ］ｂ－３’（配列番号２３）
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオシド又はその修飾ヌクレオシドであり；
Ｋは、グアノシン（Ｇ）若しくはウリジン（Ｕ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
ａは、０～２７であり；
ｂは、０～２７である）
を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。
５’－［Ｎ］ａＫＧＧＡＣ［Ｎ］ｂ－３’（配列番号２３）
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオシド又はその修飾ヌクレオシドであり；
Ｋは、グアノシン（Ｇ）若しくはウリジン（Ｕ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
ａは、０～２７であり；
ｂは、０～２７である）
を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。
【0080】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）がＳＦ２／ＡＳＦモチーフに対して相補的な配列を含む実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、
５’－［Ｎ］ａＵＣＧＵＧＵＧ［Ｎ］ｂ－３’（配列番号２４）
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオシド又はその修飾ヌクレオシドであり；
ａは、０～２７であり；
ｂは、０～２７である）
を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。
５’－［Ｎ］ａＵＣＧＵＧＵＧ［Ｎ］ｂ－３’（配列番号２４）
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオシド又はその修飾ヌクレオシドであり；
ａは、０～２７であり；
ｂは、０～２７である）
を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。
【0081】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）がスプライス分岐点に対して相補的な配列を含む実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、
５’－［Ｎ］ａＲＵＹＡＧ［Ｎ］ｂ－３’（配列番号２５）
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオシド又はその修飾ヌクレオシドであり；
Ｙは、シチジン（Ｃ）若しくはウリジン（Ｕ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
Ｒは、アデノシン（Ａ）若しくはグアノシン（Ｇ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
ａは、０～２７であり；
ｂは、０～２７である）
を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。
５’－［Ｎ］ａＲＵＹＡＧ［Ｎ］ｂ－３’（配列番号２５）
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオシド又はその修飾ヌクレオシドであり；
Ｙは、シチジン（Ｃ）若しくはウリジン（Ｕ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
Ｒは、アデノシン（Ａ）若しくはグアノシン（Ｇ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
ａは、０～２７であり；
ｂは、０～２７である）
を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。
【0082】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）がポリピリミジントラクトに対して相補的な配列を含む実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、
５’－［Ｎ］ａ［Ｒ］ｂ［Ｎ］ｃ（配列番号２６）
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチド又はその修飾体若しくは誘導体であり；
Ｒは、グアノシン（Ｇ）若しくはアデノシン（Ａ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
ａは、０～２７であり；
ｂは、０～２７であり；
ｃは、０～２７である）
を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。
５’－［Ｎ］ａ［Ｒ］ｂ［Ｎ］ｃ（配列番号２６）
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチド又はその修飾体若しくは誘導体であり；
Ｒは、グアノシン（Ｇ）若しくはアデノシン（Ａ）；又はそれらの修飾ヌクレオシドであり；
ａは、０～２７であり；
ｂは、０～２７であり；
ｃは、０～２７である）
を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。
【0083】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、≧４０％、≧５０％、≧６０％のＧＣ含量を有し得る。例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、４０～６０％のＧＣ含量を有し得る。
【0084】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）はオーバーハングを含んでいてもよく、それにより配列の一部が標的転写物（標的認識ドメインに関して部分的又は完全な相補性を有する）に結合し、またオリゴヌクレオチドの一方又は両方の末端に（最大１００ヌクレオチドの）配列オーバーハングを含む。これらオーバーハングは、（例えば）アプタマー構造を形成することによって細胞タンパク質（すなわち、スプライシング因子）の動員を促進したり、オリゴヌクレオチドの送達を支援したりすることができる。
【0085】
典型的には、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は一本鎖であってよいが、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、部分的又は完全に二本鎖であってもよい。
【0086】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、任意でウラシルヌクレオチドがチミンヌクレオチドで置換されている、配列番号１～５から選択される配列に対して≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。本発明で有用なオリゴヌクレオチドの例を表１及び表２に提供する。
【0087】
オリゴヌクレオチド化学
本明細書で論じるオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。例えば分子の生物学的安定性（例えば、ヌクレアーゼ耐性）を増大させる、標的結合を強化する、組織への取り込みを増加させる、及び／又はオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増大させる等の有用な特性を付与するためのオリゴヌクレオチドに対する修飾は、当業者に周知である（例えば、参照文献８を参照）。
本明細書で論じるオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。例えば分子の生物学的安定性（例えば、ヌクレアーゼ耐性）を増大させる、標的結合を強化する、組織への取り込みを増加させる、及び／又はオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増大させる等の有用な特性を付与するためのオリゴヌクレオチドに対する修飾は、当業者に周知である（例えば、参照文献８を参照）。
【0088】
典型的には、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は標的配列のステリックブロックを誘導し、ＲＮａｓｅＨの動員を介した標的切断を誘導しないようにする。例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＲＮａｓｅＨの切断をサポートしない（すなわち、ＤＮＡ又はＤＮＡ様塩基の連続するランを生成しない）化学物質を含んでいてもよい。例えば、参照文献９を参照。例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、オリゴヌクレオチドが２つ以上の異なる核酸化学物質を含み得るが、２つ又は３つを超えるＤＮＡ又はＤＮＡ様塩基（これはＲＮａｓｅＨを介した切断をサポートする）のランが回避される「ミキシマー」パターンを含んでいてもよい。
【0089】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はヌクレオチド類似体を含み得る。ヌクレオチド類似体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＦＡＮＡ、ＤＡＮＡ、ＬＮＡ、及び他の分岐核酸（ＥＮＡ、ｃＥｔ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、並びに／又はトリシクロＤＮＡであり得る。
【0090】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、無塩基部位、すなわち、プリン（アデニン及びグアニン）又はピリミジン（チミン、ウラシル、及びシトシン）核酸塩基が存在しない部位を含んでいてもよい。
【0091】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＤＮＡ又はＲＮＡに天然にみられるような３’→５’ホスホジエステル（ＰＯ）結合を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオシド間結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、ボラノホスフェート結合、ホスホロジアミデート連結、ホスホアミデート結合、及び／又はチオホスホルアミデート結合を含んでいてもよい。修飾されたヌクレオシド間結合は、当技術分野で公知である他の修飾であってもよい。
【0092】
オリゴヌクレオチドは１つ以上の不斉中心を含んでいてもよく、従ってエナンチオマー、ジアステレオマー、及び他の立体異性体配置、例えばＲ、Ｓが生じる。例えば、立体化学は、１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合で制約を受けることがある。例えば、オリゴヌクレオチドは、反復する左－左－右（又はＳＳＲ）キラルＰＳ中心を含んでいてもよい。
【0093】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するＲＮＡにみられるような糖部分（すなわち、リボフラノシル）又は天然に存在するＤＮＡにみられるような糖部分（すなわち、デオキシリボフラノシル）を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわち置換された糖部分又は糖サロゲートを含んでいてもよい。置換された糖部部分としては、２’位、３’位、５’位、及び／又は４’位に置換基を含むフラノシルが挙げられる。置換された糖部分は、二環式糖部分（ＢＮＡ）であってもよい。糖サロゲートとしては、モルホリノ、シクロヘキセニル、及びシクロヘキシトールが挙げられる。
【0094】
修飾された糖部分は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－Ｏ－プロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、若しくは２’Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’Ｏ－ＮＭＡ）の修飾、又はロック若しくは架橋されたリボース立体構造（例えば、ＬＮＡ、ｃＥｔ、又はＥＮＡ）を含み得る。修飾された糖部分は、当技術分野で公知の他の修飾を含んでいてもよい。
【0095】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、その５’末端及び／若しくは３’末端に末端修飾、例えばビニルホスホネート、並びに／又は逆位末端塩基を含んでいてもよい。
【0096】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するＲＮＡ及びＤＮＡにみられるような核酸塩基（すなわち、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）、及び５－メチルＣ）を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、修飾された核酸塩基、例えば５－ヒルドキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、及び５－カルボキシシトシンを含んでいてもよい。５’メチルシトシンが含まれると、オリゴヌクレオチドの疎水性が変化することによって塩基対合が強化され得る。
【0097】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、一種類の核酸化学物質（例えば、完全ＰＳ－ＭＯＥ又は完全ＰＭＯ）又は異なる核酸化学物質の組み合わせを含み得る。
【0098】
例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）における各糖部分は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）修飾を含んでいてよく、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートであってよい（すなわち、完全ＰＳ－ＭＯＥオリゴヌクレオチド）。ＰＳ修飾は、広範なヌクレアーゼに対する耐性をもたらし、タンパク質結合を増加させ、このことが組織への取り込みを改善することも知られている（１０、１１）。２’ＭＯＥ修飾は、最小限の毒性で標的ｍＲＮＡへの結合親和性を高め、血漿タンパク質の結合を減少させ得ることが知られている。
【0099】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、完全ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）であってもよい。モルホリノは、より高い標的親和性を提供し、ヌクレアーゼ回避を容易にすることが知られている（１２）。
【0100】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＰＯ及びＰＳのヌクレオシド間結合の組合せを含んでいてもよい。これにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態の微調整が容易になり得る。
【0101】
オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、当技術分野において公知の手順を使用して、化学合成及び／又は酵素的ライゲーション反応を使用して構築され得る。例示的な方法としては、参照文献１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０に記載されているものを挙げることができる。
【0102】
あるいは、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、オリゴヌクレオチドがアンチセンス配向でサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に産生され得る（すなわち、挿入されたオリゴヌクレオチドから転写されるＲＮＡは、関心対象の標的核酸に対してアンチセンス配向となる）。
【0103】
本発明の化合物は、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）ベースのトリガー（例えば、Ｕ７ ｓｎＲＮＡ又はＵ１ ｓｎＲＮＡ）等の発現したエキソンスキッピングトリガーであってもよい。上流エキソンのオルタナティブスプライシングを促進するための発現したスプライス調節系は、プラスミド又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）又はレンチウイルス）を介して送達され得る。
【0104】
コンジュゲート
（例えば、特定の組織、細胞型、又は細胞発生段階への）ターゲティングを改善する目的、細胞浸透（例えば、送達）を改善する目的、エンドソーム脱出を改善する目的、細胞内局在を改善する目的、活性を改善する目的、及び／又は細胞タンパク質の動員を促進する目的で、本発明の化合物を核酸分子、ペプチド、又は他の化学物質等の１つ以上の更なる化合物にコンジュゲートさせてもよい。化合物は、当技術分野で公知の任意の手段によってコンジュゲートさせてよく、例えば、切断可能又は非切断可能なリンカーを介して更なる化合物に化学的に結合させてよい。
（例えば、特定の組織、細胞型、又は細胞発生段階への）ターゲティングを改善する目的、細胞浸透（例えば、送達）を改善する目的、エンドソーム脱出を改善する目的、細胞内局在を改善する目的、活性を改善する目的、及び／又は細胞タンパク質の動員を促進する目的で、本発明の化合物を核酸分子、ペプチド、又は他の化学物質等の１つ以上の更なる化合物にコンジュゲートさせてもよい。化合物は、当技術分野で公知の任意の手段によってコンジュゲートさせてよく、例えば、切断可能又は非切断可能なリンカーを介して更なる化合物に化学的に結合させてよい。
【0105】
例えば、本発明のコンジュゲート化合物（例えば、コンジュゲートオリゴヌクレオチド）は、本発明の更なるアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートした本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。各コンジュゲート化合物は、同じＲＮＡ転写物における異なる部位を標的とすることができる。
【0106】
更なる化合物は、細胞透過性ペプチド、タンパク質形質導入ドメイン、ターゲティングペプチド、エンドソーム溶解性（endosmolytic）ペプチド等のペプチドであってもよい。本発明の化合物にコンジュゲートしたペプチドは、スプライシングを強化、阻害、又は調節するためのスプライシング因子を含んでいてもよい。
【0107】
更なる化合物は、ＲＮＡ転写物の５’ＵＴＲにおけるスプライシングシグナルを標的としなくてもよい。
【0108】
更なる化合物は、低分子リガンド（例えば、分子量９００Ｄａ未満）であってもよい。
【0109】
更なる化合物は、抗体、例えばナノボディ、Ｆａｂ断片であってもよい。
【0110】
更なる化合物は、糖ベースのリガンド、例えばＧａｌＮＡｃ又はその誘導体）であってもよい。
【0111】
更なる化合物は、脂質ベースのリガンド、例えば、コレステロール、リピドイド、脂質様コンジュゲート、親油性分子であってもよい。
【0112】
更なる化合物は、ポリマー（例えば、ＰＥＩ、デンドリマー）であってもよい。
【0113】
更なる化合物は、ポリエチレングリコール、クリック反応性基、又はエンドソーム溶解性基（例えば、クロロキン又はその誘導体）であってもよい。
【0114】
更なる化合物は、ＲＮＡ分子、例えばアプタマー又はスプライシングを強化、阻害、若しくは調節する任意の構造体であってもよい。
【0115】
本発明の化合物は、プラットフォーム分子、例えば動的ポリコンジュゲートの一部として組み合わせてもよい。
【0116】
本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、送達ビヒクルにコンジュゲートしてもよい。従って、本発明はまた、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む送達ビヒクルを提供する。送達ビヒクルは、部位特異的、組織特異的、細胞特異的、又は発生段階特異的な送達を行うことができる。
【0117】
送達ビヒクルは、脂質ベースのナノ粒子、カチオン性細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、直鎖状若しくは分岐状のカチオン性ポリマー、又はコレステロール、胆汁酸、脂質、ペプチド、ポリマー、タンパク質、若しくはアプタマー等のバイオコンジュゲートを含み得る。
【0118】
例えば、送達ビヒクルは、抗体又はその一部を含み得る。抗体は、特定の細胞に本発明の化合物を送達するために、関心対象の細胞上の細胞表面マーカーに特異的であってよい。例えば、特定の細胞は、膵臓のβ細胞、胸腺細胞、悪性細胞、及び／又は前がん状態の細胞（例えば、前白血病及び骨髄異形成症候群、又は病理組織学的に明確な前がん病変又は病態）であってよい。
【0119】
送達ビヒクルは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含んでいてもよい。好適なＣＰＰは当技術分野において公知であり、例えば参照文献２１に記載されている通りである。例えば、ＣＰＰは、アルギニン及び／又はリジンリッチなペプチドであってよい。従って、ＣＰＰは、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）及び／又はポリ－アルギニンを含んでいてよい。ＣＰＰは、Ｐｉｐペプチドを含み得る。有利なことに、Ｐｉｐペプチドコンジュゲートは高い効力を有し、全身送達後に心筋に到達することができる。送達ビヒクルは、複数のＣＰＰが電荷相互作用を介してポリ核酸ポリマーと複合体を形成する、ペプチドベースのナノ粒子（ＰＢＮ）を含んでいてもよい。
【0120】
送達ビヒクルは、ナノ粒子を含んでいてもよい。ナノ粒子の利点としては、サイズ、形状、材料、及びターゲティングのためのリガンド機能付与等、ナノ粒子の生物物理学的特性をオーダーメイドで最適化できることが挙げられる。好適なナノ粒子の例としては、リポプレックス、リポソーム、エクソソーム、球状核酸、及びＤＮＡナノ構造体（例えばＤＮＡケージ）が挙げられる。
【0121】
本発明の化合物は、送達ビヒクルと（例えば、イオン結合により）複合体を形成又は共有結合していてもよい。好適なコンジュゲーション法は当技術分野で公知であり、例えば参照文献２２に記載の通りである。例えば、コンジュゲーション方法は、反応性基（例えば、－ＮＨ２又は－ＳＨ２）を含む好適なテザーを、活性中間体としての本発明の化合物及び送達ビヒクル（例えば、ペプチド）に合成後に導入し、続いて、水性媒体中でカップリング反応を実施することを含み得る。別の方法は、単一の固相支持体上においてリニアモードでコンジュゲートを行うことを含み得る。
【0122】
ポリヌクレオチド及びベクター
本発明はまた、本発明に係るオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、本発明に係るオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。
【0123】
本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドをコードしているポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法によって得ることができる。ベクターを構築することができる一般的な方法であるトランスフェクション法及び培養法は、当業者に周知である。例えば２３を参照。
【0124】
本発明のポリヌクレオチドは、挿入された配列に動作可能に連結され、それによって、インビボで本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドを発現させることができる制御配列を含む発現カセットの形態で提供され得る。従って、本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドをコードしている１つ以上のポリヌクレオチドをコードしている１つ以上の発現カセットを提供する。次に、これら発現カセットは、通常ベクター内で提供される。従って、一実施態様において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドをコードしているベクターを提供する。ベクターは、クローニング目的のベクター（例えば、プラスミド）であってよい。ベクターは、ポリヌクレオチドを細胞内で発現させるためのベクターであってもよい。
【0125】
ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）又はレンチウイルスベクター等のウイルスベクターであってよい。ベクターは、本発明に係るオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドに特定の細胞型を標的とさせる任意のウイルスを含み得る。
【0126】
本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、又はベクターは宿主細胞に導入される。従って、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、又はベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、又はベクターは、宿主細胞に一過的又は持続的に導入することができ、発現カセット又はベクターからのオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドの発現を可能にする。
【0127】
組成物
本発明は、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、コンジュゲート化合物（例えば、コンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ポリヌクレオチド、又はベクターを含む組成物を提供する。組成物は、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の組み合わせ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）を含み得る。各化合物は、同じＲＮＡ転写物の異なる（しかし重複する可能性のある）配列を標的とすることができる。あるいは、各化合物は、異なるＲＮＡ転写物を標的とすることもできる。
本発明は、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、コンジュゲート化合物（例えば、コンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ポリヌクレオチド、又はベクターを含む組成物を提供する。組成物は、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の組み合わせ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）を含み得る。各化合物は、同じＲＮＡ転写物の異なる（しかし重複する可能性のある）配列を標的とすることができる。あるいは、各化合物は、異なるＲＮＡ転写物を標的とすることもできる。
【0128】
組成物は、医薬組成物であってよい。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤、担体、バッファー、安定化剤、又は当業者に周知の他の材料を含んでいてよい。このような材料は、通常、非毒性であり、活性成分の有効性には干渉しない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に従って当業者が決定することができる。
【0129】
一実施形態において、医薬組成物は、滅菌生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）及び１つ以上の本発明のアンチセンス化合物を含む。
【0130】
本発明の組成物は、１つ以上の薬学的に許容し得る塩、エステル、又はそのようなエステルの塩を含み得る。薬学的に許容し得る塩とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、任意の望ましくない毒性作用を付与することのない塩を指す。そのような塩の例としては、ナトリウム塩又はカリウム塩が挙げられる。
【0131】
本発明の化合物は、プロドラッグの形態であり得る。プロドラッグは、投与時に内因性ヌクレアーゼによって切断されて活性化合物を形成するオリゴヌクレオチドの一端又は両端における追加のヌクレオシドを組み込むことを含み得る。
【0132】
医薬組成物は、脂質部分を含み得る。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、カチオン性脂質と中性脂質との混合物で作製される予形成リポソーム又はリポプレックスに導入される。脂質部分は、特定の細胞又は組織、例えば脂肪組織又は筋肉組織へのオリゴヌクレオチドの分布を増加させるように選択してよい。
【0133】
医薬組成物は、化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）及び１つ以上の賦形剤を含み得る。賦形剤は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、及び／又はポリビニルピロリドンであってよい。
【0134】
医薬組成物は、リポソーム及びエマルション等の送達系を含んでいてもよい。特定の実施形態では、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒が使用される。
【0135】
医薬組成物は、本発明の１つ以上の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を特定の組織又は細胞型に送達するように設計された１つ以上の組織特異的送達分子を含み得る。例えば、送達分子は、組織特異的抗体でコーティングされたリポソームを含み得る。
【0136】
遅延放出のために、徐放のために製剤化された医薬組成物中、例えば生体適合性ポリマーから形成されたマイクロカプセル中又は当技術分野で公知の方法によるリポソーム担体系中にベクターを含めてもよい。
【0137】
本発明の医薬組成物は、追加の活性剤、例えば薬物又はプロドラッグを含んでいてもよい。
【0138】
医薬組成物は、例えば本明細書に記載の通り、任意の投与経路によって投与されるように製剤化され得る。医薬組成物は、通常注射によって投与される。そのような実施形態においては、医薬組成物は、担体を含み、水又は生理学的に適合するバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液、若しくは生理食塩水バッファー等の水性溶液中で製剤化される。特定の実施形態では、他の成分が含まれる（例えば、溶解性を支援する成分又は防腐剤として機能する成分）。
【0139】
使用及び方法
本発明の方法及び使用は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボのいずれであってもよい。例えば、本発明はまた、ＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を調節するためのインビトロ又はエクスビボ法であって、該制御エレメントを含む１つ以上のエキソンのスプライス調節を誘導するために、ＲＮＡ転写物におけるスプライシングシグナルを標的とする化合物を細胞に送達することを含む方法を提供する。
本発明の方法及び使用は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボのいずれであってもよい。例えば、本発明はまた、ＲＮＡ転写物における制御エレメントの存在を調節するためのインビトロ又はエクスビボ法であって、該制御エレメントを含む１つ以上のエキソンのスプライス調節を誘導するために、ＲＮＡ転写物におけるスプライシングシグナルを標的とする化合物を細胞に送達することを含む方法を提供する。
【0140】
従って、幾つかの実施形態では、本発明の方法又は使用は、手術又は療法によるヒト又は動物の身体の治療ではなく、ヒト又は動物の身体に対して実施される診断法でもない。
【0141】
本発明は更に、例えばヒト又は動物の身体に対して実施される治療方法における本明細書に記載の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、コンジュゲート化合物、化合物をコードしているポリヌクレオチド若しくはベクター、又は組成物の使用に関する。
【0142】
例えば、本発明は、治療的に有効な量の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）又は本発明の組成物を対象に投与することを含む、遺伝子の発現又は活性を調節することによって対象における疾患又は病態を治療又は予防する方法に関する。
【0143】
本発明はまた、遺伝子の発現を調節することによって対象における疾患又は病態を治療又は予防するための医薬の製造における、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）又は組成物の使用に関する。
【0144】
本発明はまた、遺伝子の発現又は活性を調節することによって対象における疾患又は病態を治療又は予防する方法において使用するための、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）又は組成物に関する。
【0145】
本発明はまた、遺伝子の発現又は活性を調節することによって対象における疾患又は病態を治療又は予防する方法のための本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）又は組成物に関する。
【0146】
本発明の方法及び使用は、所望の終点に達するまで疾患状態を阻害すること、例えばその発症を阻止すること；及び／又は疾患状態を緩和すること、例えば疾患状態の後退を引き起こすことを含み得る。本発明の方法及び使用は、疾患状態の症状の重症度、持続時間、又は頻度の改善又は低減（例えば、疼痛又は不快感の減弱）を含み得、そのような改善は、疾患に直接影響を及ぼすこともあり、及ぼさないこともある。
【0147】
例えば、本発明は、表３又は表４に列挙する疾患を治療又は予防する方法に関する。従って、本発明の方法及び使用は、治療的に有効な量の本発明の化合物又は本発明の組成物、本発明の化合物を対象に投与することを含み、該化合物は、表３又は４に列挙するそれぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物を標的とする。
【0148】
ＲＮＡ転写物は、例えばＡＢＣＡ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＧ５、ＡＤＡＭ１０、ＡＬＢ、ＡＮＫ１、ＡＰＯＥ、ＡＴＰ２Ａ２、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＲＸ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮＩＬ、ＢＡＸ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＤＮＦ（例えば、ＢＤＮＦ ｖ１１）、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、Ｃ／ＥＢＰａ、ＣＡ２、ＣＡＳＰ８、ＣＣＢＥ１、ＣＤ３６、ＣＤ３Ｄ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＰ２９０、ＣＦＨ、ＣＦＴＲ、ＣＨＲＮＡ４、ＣＨＲＮＡ５、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＲ１、ＣＳＰＰ１、ＣＴＮＮＤ２、ＣＴＮＳ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＤＢＴ、ＤＣＡＦ１７、ＤＮＡＳＥ１、ＤＤＩＴ３、ＤＩＣＥＲ１、ＤＲＤ３、ＥＥＤ、ＥＦＮＢ１、ＥＰＯ、ＥＳＲ１、ＥＴＨＥ１、ＥＺＨ２、Ｆ８（及びＦ２、３、５、７、１１、１３）、ＦＡＰ、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＦＸＮ、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＴＡ３、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＨ２、ＧＲＮ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＣＲＴ、ＨＧＦ、ＨＮＦ４ａ、ＨＲ、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＤＯ１、ＩＦＮＥ、及び他のインターフェロン遺伝子、ＩＦＲＤ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＨＭＢＰ２、ＩＬ６、ＩＮＳ、ＩＱＧＡＰ１，ＩＱＧＡＰ２，ＩＲＦ６、ＩＲＳ２、ＩＴＧＡ７、ＪＡＧ１、ＫＣＮＪ１１、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＱ３、ＫＬＦ４、ＫＭＴ２Ｄ、ＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ５、ＬＲＰ８、ＬＲＰＰＲＣ、ＭＢＴＰＳ１、ＭＥＣＰ２、ＭＳＲＡ、ＭＳＸ２、ＭＴＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣＮ、ＭＹＦ６、ＮＡＭＰＴ、ＮＡＮＯＧ、ＮＥＵ４、ＮＦ１、ＮＫＸ２、ＮＫＸ３、ＮＫＸ５、ＮＫＸ８、ＮＯＤ２、ＮＲ５Ａ、ＮＲＦ１、ＮＳＤ１、ＰＡＨ、ＰＡＲＫ２、ＰＫＤ１、ＰＬＡＴ、ＰＯＮ１、ＰＯＮ２、ＰＰＡＲＤ、ＰＲＫＡＲＩＡ、ＰＲＰＦ３１、ＰＴＥＮ、ＰＹＣＲ１、ＲＢ１、ＲＢＬ１、ＲＢＬ２、ＲＢＢＰ４、ＲＮＡＳＥＨ１、ＲＯＲ２、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＮＩＡ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＳＨＢＧ、ＳＩＲＴ１、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＭＡＤ７、ＳＭＣＨＤ１、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＳＮＸ２７、ＳＰＩＮＫ１、ＳＲＢ１、ＳＲＹ、ＳＴ７、ＳＴ７Ｌ、ＳＴＡＴ３、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＧＦＢ３、ＴＨＰＯ、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＵＣＰ２、ＵＳＰ９Ｙ／ＳＰ３、ＵＴＲＮ、又はＶＥＧＦＡ等のｕＯＲＦ含有遺伝子によってコードされ得る。
【0149】
ＲＮＡ転写物は、ＢＤＮＦ ｖ１１等のｕＯＲＦ含有遺伝子のアイソフォームによってコードされていてもよい。
【0150】
ＲＮＡ転写物は、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＲＸ、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１，ＣＡ２、ＣＣＢＥ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＦＬ２、ＣＦＴＲ、ＣＳＰＰ１、ＣＴＮＳ、ＤＢＴ、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＬＲＥＩＣ、ＤＦＮＢ３１、ＤＬＧ４、ＤＭＤ、ＤＮＡＳＥ１、ＥＴＨＥ１、ＧＡＬＮＳ、ＧＣＨ１、ＨＡＭＰ、ＨＢＢ、ＨＭＢＳ、ＨＲ、ＩＧＨＭＢＰ２、ＩＲＦ６、ＩＴＧＡＺ、ＩＴＧＢ２、ＫＣＮＪ１１、ＫＣＮＱ３、ＬＤＬＲ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ５Ｌ、ＭＥＣＰ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＲ５Ａ１、ＰＡＬＢ２、ＰＡＮＫ２、ＰＥＸ７、ＰＨＹＨ、ＰＩＫ３Ｒ５、ＰＯＭＣ、ＰＯＭＴ１、ＲＯＲ２、ＳＣＮ２Ａ、ＳＧＣＡ、ＳＧＣＤ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１９Ａ３、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ７Ａ９、ＳＰＩＮＫ１、ＳＲＹ、ＳＴＩＬ、ＴＫ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＰ５３、ＴＰＩ１、ＴＰＭ３、ＴＲＭＵ、ＴＳＥＮ５４、又はＺＥＢ１等の１つ以上のｕＯＲＦを作り出す変異又はＳＮＰを有する遺伝子によってコードされていてもよい。
【0151】
ＲＮＡ転写物は、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）であってもよい。
【0152】
本発明の方法及び使用は、そのＲＮＡ転写物のスプライス調節によって、関心対象のタンパク質の発現を増加、減少、又は回復させることを含み得る。
【0153】
ＲＮＡ転写物の５’ＵＴＲにおける特定のエキソン、ひいてはその中に含まれる制御エレメントの包含及び／又は排除を誘導するためのスプライス調節は、下流ｐＯＲＦに対する機能的影響を有する。
【0154】
従って、本発明はまた、本明細書に記載の１つ以上のエキソンのオルタナティブスプライシングを誘導する方法を含む、標的遺伝子の発現量又は活性を増加、減少、又は回復させる方法を提供する。
【0155】
遺伝子の発現又は活性が増加する本発明の実施形態において、遺伝子の発現又は活性は、本発明の化合物と接触したことのいない細胞における遺伝子の発現又は活性と比較して≧５０％（すなわち、５０％以上）、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧１００％、又は≧２００％増加し得る。
【0156】
遺伝子発現又は活性が減少する本発明の実施形態において、遺伝子の発現又は活性は、本発明の化合物と接触したことのない細胞における遺伝子の発現又は活性と比較して≧５０％（すなわち、５０％以上）、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、又は１００％減少し得る。
【0157】
本発明の方法及び使用は、患者由来のサンプルにおける、スプライシングによって調節されるＲＮＡ転写物（例えば、成熟ｍＲＮＡ）及び／又はＲＮＡ転写物によってコードされているタンパク質の発現及び／又は活性のレベルを求める工程を含み得る。ＲＮＡ及びタンパク質の発現及び／又は活性のレベルを求める方法は、当技術分野で公知である。例えば、当技術分野で公知である通り、サンプルからＲＮＡを単離し、ハイブリダイゼーション又はＰＣＲ技術によって試験してよい。あるいは、タンパク質発現アッセイは、核酸の精製を必要としないように、インビボ、インサイチュ、すなわち、生検又は切除によって得られた患者組織の組織切片（固定及び／又は凍結）に対して直接行うことができる。例えばウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイも使用できる。
【0158】
ＲＮＡ転写物は、表３又は４に列挙されている遺伝子によってコードされ得る。表３中の各遺伝子に関連する疾患は、それぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物を標的とする本発明の化合物を用いる本発明の方法によって治療又は予防することができる。
【0159】
本発明の方法及び使用は、本発明の化合物を細胞に送達することに関する。細胞は、真核細胞、例えばヒト細胞であってよい。マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、又はイヌ等の非ヒト動物由来であってよい細胞も企図される。
【0160】
典型的には、本発明は、それを必要とするヒト対象のための方法及び使用に関する。しかし、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、又はイヌ等の非ヒト動物も企図される。
【0161】
本発明は、対象からのサンプルの分析に関する。サンプルは、対象から単離された組織、細胞、及び生物学的流体、並びに対象内に存在する組織、細胞、及び流体であってよい。サンプルは、血液、及び血清、血漿、又はリンパを含む血液の画分又は成分であってもよい。
【0162】
タンパク質検出アッセイはインサイチュで実施することができ、この場合、サンプルは対象から生検又は切除によって得られた組織の組織切片（固定及び／又は凍結）である。
【0163】
本発明の化合物又は組成物は、皮下投与、静脈内投与、皮内投与、経口投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、硝子体内投与、又は局所投与（例えば、皮膚用クリームの形態）してよい。
【0164】
本発明で使用するのに適切な投与量及び投与レジメンは、組成物の投与を担当する医師の通常の技能の範囲内で決定することができる。例えば、治療目的の場合、治療的に有効な量の本発明の化合物又は組成物をそのような対象に投与する。治療的に有効な量とは、障害の１つ以上の症状を改善するのに有効な量である。
【0165】
投与量は、様々なパラメータに応じて、特に治療される患者の年齢、体重、及び状態；活性成分の性質；投与経路；並びに必要なレジメンに応じて決定することができる。医師は、任意の特定の患者に必要な投与経路及び投与量を決定することができる。
【0166】
例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５０ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉内注射により投与することができる。
【0167】
用量は単回用量として提供されてもよいが、繰り返し提供されてもよい（例えば、ベクターが正しい領域及び／又は組織を標的としていない可能性がある場合（外科合併症等））。
【0168】
本発明の化合物又は組成物は、複数の投与レジメンで投与してもよい。例えば、初回用量に続いて、第２の又は複数のその後の用量の投与を行ってよい。第２の及びそれ以降の用量は、適切な時間をおいて投与してよい。
【0169】
本発明の化合物又は組成物は、通常、単一の医薬組成物／組み合わせ物（共製剤化される）で使用される。しかし、本発明は、一般に、別々の調製物／組成物において本発明の化合物又は組成物を併用することも含む。本発明はまた、本明細書に記載の通り、本発明の化合物又は組成物を追加の治療剤と併用することも含む。
【0170】
２つ以上の剤の併用投与は、多数の異なる方法で達成され得る。一実施形態では、全ての成分を単一の組成物で一緒に投与してよい。別の実施形態では、各成分を併用療法の一部として別々に投与してよい。
【0171】
例えば、本発明の化合物又は組成物は、本発明の別の化合物又は組成物の前、後、又は同時に投与してよい。
【0172】
本発明はまた、本発明と共に使用するためのキット及び製品も提供する。キットは、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、コンジュゲート化合物（例えば、コンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ポリヌクレオチド、ベクター、送達ビヒクル、組成物、又は医薬組成物と、使用説明書とを含み得る。キットは、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の構成及び送達に必要なバッファー等の１つ以上の追加の試薬を更に含んでもよい。キットは更に、使用説明書と共に添付文書を含んでいてもよい。
【0173】
その他
本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことを理解されたい。
本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことを理解されたい。
【0174】
更に、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「制御エレメント（ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）」に対する言及は、２つ以上の制御エレメントを含む。
【0175】
更に、本明細書において「≧ｘ」という場合、これはｘに等しいか又はｘよりも大きいことを意味する。
【0176】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」も包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなる場合もあり、例えばＸ＋Ｙのように何らかの追加物を含む場合もある。
【0177】
本発明の目的で、２つの配列（２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドの配列等）の同一性パーセントを求めるために、最適な比較の目的のための配列のアラインメントを行う（例えば、第２の配列と最適にアラインさせるために第１の配列にギャップを導入してもよい）。次いで、各位置のヌクレオチド又はアミノ酸の残基を比較する。第１の配列におけるある位置が第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチド又はアミノ酸で占められている場合、その位置のヌクレオチド又はアミノ酸は同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、該配列によって共有されている同一位置の数の関数である（すなわち、同一性パーセント＝同一位置の数／参照配列における位置の総数×１００）。
【0178】
通常、配列比較は、参照配列の全長に対して行われる。例えば、所与の（「試験」）配列が配列番号３に対して９５％同一であるかどうかをユーザが判定したい場合、配列番号３が参照配列となる。配列が配列番号３（参照配列の一例）に対して少なくとも９５％同一であるかどうかを評価するために、当業者は配列番号３の全長に対してアライメントを実施し、試験配列における何箇所が配列番号３と同一であるかを特定する。位置の少なくとも９５％が同一である場合、試験配列は配列番号３に対して少なくとも９５％同一である。配列が配列番号３よりも短い場合、ギャップ又は欠損している位置は非同一位置であるとみなすべきである。
【0179】
当業者は、２つの配列間の相同性又は同一性を求めるために利用可能な様々なコンピュータプログラムを認識している。例えば、数学的アルゴリズムを用いて配列を比較し、２つの配列間の同一性パーセントを求めることができる。実施形態では、２つのアミノ酸又は核酸の配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、及び１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ加重、及び１、２、３、４、５、又は６の長さ加重を用いて、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）アルゴリズムを用いて求められる。
【0180】
本明細書で使用するとき、オリゴマー化合物に関する「相補的」とは、そのようなオリゴマー化合物又はその領域が、ストリンジェントな条件下で核酸塩基の相補性によって別のオリゴマー化合物又はその領域にハイブリダイズする能力を意味する。例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）に対して相補的である。例えば、ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）に対して相補的である。特定の修飾を含む核酸塩基は、対応する核酸塩基と対合する能力を維持することができ、従って、依然として核酸塩基相補的であり得る。
【0181】
相補性パーセントとは、標的核酸の等長部分に対して相補的であるオリゴマー化合物の核酸塩基の割合を意味する。２つのオリゴマー化合物の相補性パーセントは、最適な比較の目的でアライメントを行い（例えば、第２の配列と最適にアラインさせるために、第１の配列にミスマッチ又はギャップを導入してもよい）、各位置の核酸塩基を比較することによって求めることができる。相補性パーセントは、標的核酸における対応する位置の核酸塩基に対して相補的なオリゴマー化合物の核酸塩基の数を、オリゴマー化合物の全長で除することによって計算することができる。
【0182】
本願に添付された配列表における核酸配列は、必要に応じて各配列を「ＲＮＡ」又は「ＤＮＡ」のいずれかとして識別している。しかし、当業者であれば、配列表中のこのような配列には修飾オリゴヌクレオチドも記載されると理解するであろう、すなわち、これら配列はまた、本明細書に記載される修飾の任意の組合せを有するオリゴヌクレオチドを表す場合もある。例えば、配列「ＧＡＡＴＧＧＡＣ」を有するオリゴヌクレオチドは、修飾又は非修飾にかかわらず、このような核酸塩基配列を有する任意のオリゴヌクレオチド、例えば、ＲＮＡ塩基、例えば「ＧＡＡＵＧＧＡＣ」を有するオリゴヌクレオチド及び／又は「ＧＡＡＵＧＧＡ ｍＣ」（式中、ｍＣは５－メチルシトシンである）等の他の修飾された若しくは天然に存在する塩基を有するオリゴヌクレオチドを包含する。
【0183】
上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0184】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【実施例】
【0185】
実施例１
ヒト及びマウスのトランスクリプトームにおけるｕＯＲＦの予測
真核生物のｍＲＮＡでは、一次オープンリーディングフレーム（ｐＯＲＦ）の前に１つ以上の上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）があることが多い。これらｕＯＲＦは、配列の長さ、転写物あたりのｕＯＲＦの数、５’ｍ７Ｇ－ｃａｐからの距離、ｐＯＲＦからの距離、ｕＯＲＦコザック配列の強度、進化的保存、及びｕＯＲＦがｐＯＲＦと重複しているかどうかという点で非常に多様である。ｕＯＲＦは、コンピュータで計算することにより予測することもでき、又は実験で観察することもできる。この実験の目的は、ヒト及びマウスのタンパク質コード遺伝子のｕＯＲＦを同定することであり、その結果を以下に説明する。
ヒト及びマウスのトランスクリプトームにおけるｕＯＲＦの予測
真核生物のｍＲＮＡでは、一次オープンリーディングフレーム（ｐＯＲＦ）の前に１つ以上の上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）があることが多い。これらｕＯＲＦは、配列の長さ、転写物あたりのｕＯＲＦの数、５’ｍ７Ｇ－ｃａｐからの距離、ｐＯＲＦからの距離、ｕＯＲＦコザック配列の強度、進化的保存、及びｕＯＲＦがｐＯＲＦと重複しているかどうかという点で非常に多様である。ｕＯＲＦは、コンピュータで計算することにより予測することもでき、又は実験で観察することもできる。この実験の目的は、ヒト及びマウスのタンパク質コード遺伝子のｕＯＲＦを同定することであり、その結果を以下に説明する。
【0186】
カスタムスクリプトを用いて、ヒト及びマウスの全タンパク質コード遺伝子の５’ＵＴＲにおける予測ｕＯＲＦを同定した。ヒト転写物の５９．３％及びマウス転写物の４８．５％が少なくとも１つの予測ｕＯＲＦを有することが見出された（図１Ａ）。これは、以前のゲノムビルドで同様のアプローチを用いた過去の推定値と同程度であった（２４、２５、２６、２７）。予測ｕＯＲＦを有する転写物では、大部分はｕＯＲＦを１つしか含んでいなかったが、ヒト転写物の約６％及びマウス転写物の約４％は１０個以上のｕＯＲＦを含んでいた（図１Ｂ）。ｕＯＲＦの大多数は６～約３０アミノ酸長であり（図１Ｃ）、ｕＯＲＦの約８５％はｐＯＲＦと重複していなかった（図１Ｄ）。転写開始部位（ＴＳＳ）とｕＯＲＦの開始点との間（図１Ｅ）及びｕＯＲＦとｐＯＲＦとの間（図１Ｆ）の距離は、各群の転写物の大部分で約１００～４００ｎｔであり、ヒトゲノムでは１～約６０００ｎｔ、マウスゲノムでは１～約３０００ｎｔの範囲であった（図１Ｅ及びＦ）。最もよく使用される終止コドンは、ｐＯＲＦとｕＯＲＦとの間で同様であり、ＵＧＡが最も高頻度であった（図１Ｇ）。
【0187】
コザックコンセンサス配列は、一般にｐＯＲＦよりもｕＯＲＦの方が弱かった（図１Ｈ、Ｉ）。予測ｕＯＲＦについてゲノム座標（すなわちＢＥＤフォーマット）を計算し、それによって、各ｕＯＲＦについて平均ｐｈａｓｔＣｏｎｓスコアを求める（そして、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ＣＤＳ、及びイントロンの領域と比較する）ことが可能になった。ｕＯＲＦ配列の保存値は非常に多様であり、本質的に可能性のあるｐｈａｓｔＣｏｎｓ値の全範囲に及んでおり、このことは、高度に保存されているものもあれば、それほど保存されていないものもあることを示唆している（図１Ｊ）。全体として、予測ｕＯＲＦの特性はヒトとマウスとの間で非常に類似していた（図１Ａ～Ｊ）。
【0188】
集約したリボソームプロファイリング及びＲＮＡ－ｓｅｑデータと共にＧＷＩＰＳ－ｖｉｚゲノムブラウザ（２８）を用いてｕＯＲＦ予測を可視化し、これにより、実験的証拠のあるｕＯＲＦを同定することが可能になる。ＨＴＴ遺伝子を例として示すと（図１Ｋ）、予測ｕＯＲＦでは顕著な初期リボソームピーク及びリボソームフットプリントが観察される。
【0189】
予測ｕＯＲＦの機能性の検証
デュアルルシフェラーゼレポーター系においてウミシイタケルシフェラーゼの上流の対応する５’ＵＴＲにクローニングすることによって、予測ヒトｕＯＲＦ含有遺伝子を試験した。各候補遺伝子について、ｕＡＴＧからＴＴＧへの変異を誘発することによってｕＯＲＦを破壊した対照コンストラクトを作製した。ウミシイタケ及びホタルのルシフェラーゼの相対レベルを、各５’ＵＴＲ及び変異体対照についてＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。
デュアルルシフェラーゼレポーター系においてウミシイタケルシフェラーゼの上流の対応する５’ＵＴＲにクローニングすることによって、予測ヒトｕＯＲＦ含有遺伝子を試験した。各候補遺伝子について、ｕＡＴＧからＴＴＧへの変異を誘発することによってｕＯＲＦを破壊した対照コンストラクトを作製した。ウミシイタケ及びホタルのルシフェラーゼの相対レベルを、各５’ＵＴＲ及び変異体対照についてＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。
【0190】
結果を図２に示す。ＦＯＸＬ２、ＨＯＸＡ１１、ＪＵＮ、ＫＤＲ、ＲＮＡＳＥＨ１、ＳＭＯ、及びＳＲＹでルシフェラーゼ発現の有意な増加が観察されたが（図２Ａ）、これは転写レベルの変化では説明することができなかった（図２Ｂ）。ルシフェラーゼのデータを独立に再作成し、追加の遺伝子ＭＡＰ２Ｋ２をパネルに追加した（図２Ｃ）。ＢＤＮＦ（２つのアイソフォーム）、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＧＡＴＡ２（３つのアイソフォーム）、ＧＤＮＦ、ＨＴＴ、及びＳＣＮ１Ａのレポーターコンストラクトでは、予測ｕＯＲＦを全てＡＴＧからＴＴＧに変異させた場合、有意なｕＯＲＦを介した抑制が更に観察された（図２Ｄ）。
【0191】
翻訳抑制に対するｕＯＲＦ配列の影響を世界規模で評価するために、２９の健常ヒト組織から得られた公的に入手可能な対応するプロテオミクス／トランスクリプトミクスデータ（１）を利用した。これらデータにより、１８，０７２の転写物及び１３，６４０のタンパク質を研究することが可能になる。複数の転写物アイソフォームを有する遺伝子のうち、アイソフォームのうちの少なくとも１つがｕＯＲＦを欠くものを除外するためにデータをフィルタリングし、残りのデータはそれぞれｕＯＲＦを含むもの又はｕＯＲＦを欠くものとしてビニングした。次に、各ビン内の全遺伝子について、タンパク質発現データの累積分布（全組織にわたって集計）をプロットし、遍在的に発現しているタンパク質（図２Ｅ）又は全タンパク質（図２Ｆ）について、分布間の差をマン・ホイットニー検定によって検定した。ｕＯＲＦを含む遺伝子は、ｕＯＲＦを欠く遺伝子よりもタンパク質発現レベルの中央値が有意に低いことが観察された。
【0192】
ｕＯＲＦの構造及び機能の解析
レポーター試験において強い抑制翻訳抑制効果（～４倍）を付与し、５’ＵＴＲ及びｕＯＲＦの両方の長さが実験的操作を容易にするのに便利な長さであったことから、ＨＯＸＡ１１ ｕＯＲＦを更なる試験のために選択した。ＨＯＸＡ１１ ｕＯＲＦをクローニングサイトで置き換えたプラスミドを構築し、その後、野生型ＨＯＸＡ１１ ｕＯＲＦの様々な変異体を作製した。ＨＯＸＡ１１ ｕＯＲＦ ｕＡＴＧのコザックコンセンサスを変化させた結果、下流遺伝子の抑制が２２％増強されたが、Ｐ＜０．０５レベルでは統計的有意には達しなかった（図３Ａ）。同様に、公的に入手可能なタンパク質発現データのグローバル解析によって、予測ｕＯＲＦに「弱い」コザックコンテキストを含む転写物（ｎ＝１，７２９）又は「強い」コザックコンテキストを含む転写物（ｎ＝３５０）の間で発現中央値に差がないことが明らかになり、コザックコンテキストの強さがｕＯＲＦ活性を決定する主な要因ではないことが示唆された（図３Ｂ）。この解析は、強いコザックコンセンサス配列を有する単一のｕＯＲＦを含む転写物の数が比較的少ないため複雑である。注目すべきことに、この知見は、マウスのプロテオミクスデータセットを利用した以前の報告とは対照的であるが、この研究では、「強い」ｕＯＲＦコザックコンテキストを有する転写物が９２しか含まれていなかった（２４）。
レポーター試験において強い抑制翻訳抑制効果（～４倍）を付与し、５’ＵＴＲ及びｕＯＲＦの両方の長さが実験的操作を容易にするのに便利な長さであったことから、ＨＯＸＡ１１ ｕＯＲＦを更なる試験のために選択した。ＨＯＸＡ１１ ｕＯＲＦをクローニングサイトで置き換えたプラスミドを構築し、その後、野生型ＨＯＸＡ１１ ｕＯＲＦの様々な変異体を作製した。ＨＯＸＡ１１ ｕＯＲＦ ｕＡＴＧのコザックコンセンサスを変化させた結果、下流遺伝子の抑制が２２％増強されたが、Ｐ＜０．０５レベルでは統計的有意には達しなかった（図３Ａ）。同様に、公的に入手可能なタンパク質発現データのグローバル解析によって、予測ｕＯＲＦに「弱い」コザックコンテキストを含む転写物（ｎ＝１，７２９）又は「強い」コザックコンテキストを含む転写物（ｎ＝３５０）の間で発現中央値に差がないことが明らかになり、コザックコンテキストの強さがｕＯＲＦ活性を決定する主な要因ではないことが示唆された（図３Ｂ）。この解析は、強いコザックコンセンサス配列を有する単一のｕＯＲＦを含む転写物の数が比較的少ないため複雑である。注目すべきことに、この知見は、マウスのプロテオミクスデータセットを利用した以前の報告とは対照的であるが、この研究では、「強い」ｕＯＲＦコザックコンテキストを有する転写物が９２しか含まれていなかった（２４）。
【0193】
次に、一連のＣ末端からのＣ末端切断（すなわち、９アミノ酸長、７アミノ酸長、５アミノ酸長、３アミノ酸長、２アミノ酸長、及び１アミノ酸長のｕＯＲＦの生成）を通して、ｕＯＲＦペプチドの長さの重要性について調べた。ＨＯＸＡ１１ ｕＯＲＦの切断が進むと、切断の程度に比例して抑制活性が部分的に失われた。最小ｕＯＲＦ（すなわちＡＴＧ－終止、Ｍ＊、メチオニン－終止）はこのパターンに当てはまらず、代わりに野生型ＨＯＸＡ１１ ｕＯＲＦと統計的に差のない抑制を示した（図３Ａ）。リボソームＥ部位が未占有であると、翻訳が抑制されることが報告されている（２９）。このことは、少なくとも２つの翻訳抑制機序があることを示唆している。注目すべきことに、このような最小ｕＯＲＦは予測データセットにおいて高頻度で出現し、ヒトでは５，４４７個（全ｕＯＲＦの６％）、マウスでは２，７５９個（６．５％）である。
【0194】
ヒトのプロテオミクスデータを集計したグローバル解析では、ｕＯＲＦを含む転写物全ての場合、最小ｕＯＲＦ（ｎ＝８０２）を含むものは、他のタイプのｕＯＲＦを含むもの（ｎ＝４，９９１）よりも低いレベルで発現する傾向がある（Ｐ＝０．００２７）ことが明らかになった（図３Ｃ）。
【0195】
全アミノ酸配列を繰り返すことによってｕＯＲＦの長さを長くすると、抑制活性が統計的に有意に約４０％増加した。しかし、タグ配列（すなわち、ＦＬＡＧ及びＨｉＢｉＴ）の付加によってｕＯＲＦの長さを延長しても、翻訳抑制の程度には最小限の効果しかなかった（図３Ａ）。
【0196】
プロテオミクスの集計データから、ＴＩＳに及ぶｕＯＲＦ（ｎ＝８１６）と５’ＵＴＲに完全に含まれるｕＯＲＦ（ｎ＝１，６５２）との間には抑制能に差がないことが示され（図３Ｄ）、これは以前の所見と一致している６。ｐＯＲＦをレポーター遺伝子（本明細書に記載の通り）で置き換えた場合、ＴＩＳに及ぶｕＯＲＦの実験的検証が複雑になる。
【0197】
実施例２
この実施例では、少なくとも１つのｕＯＲＦを含むエキソンを除去する目的で、ＡＣＹ３、ＣＬＧＮ、又はＳＹＳ１のＲＮＡ転写物の５’ＵＴＲにおけるスプライシングシグナルを標的とするようにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を設計する。ＡＣＹ３、ＣＬＧＮ、又はＳＹＳ１タンパク質の発現に対するこれらＡＳＯの効果について調べる。
この実施例では、少なくとも１つのｕＯＲＦを含むエキソンを除去する目的で、ＡＣＹ３、ＣＬＧＮ、又はＳＹＳ１のＲＮＡ転写物の５’ＵＴＲにおけるスプライシングシグナルを標的とするようにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を設計する。ＡＣＹ３、ＣＬＧＮ、又はＳＹＳ１タンパク質の発現に対するこれらＡＳＯの効果について調べる。
【0198】
ＡＣＹ３、ＣＬＧＮ、及びＳＹＳ１はそれぞれ３つの上流エキソンを含み、ｐＯＲＦの開始コドンはエキソン３に位置し、少なくとも１つのｕＯＲＦがエキソン２に位置していた。
【0199】
ＡＳＯの幾つかの例の配列を表１に提供する。各ＡＳＯは完全にホスホロチオエートＲＮＡであり、完全に２’ＭＯＥ修飾されている。
【0200】
【表1】
【0201】
培養中の哺乳類細胞にＡＳＯを投与するか、又はヒト患者若しくは動物モデルにＡＳＯを注射する。ヒト患者又は動物モデルに筋肉内注射することによってＡＳＯを注射する。約５０ｍｇ／ｋｇの用量で滅菌バッファー（例えば、生理食塩水）中ＡＳＯを注射する。
【0202】
細胞又は対象にＡＳＯを投与する前及び後に、ＡＣＹ３、ＣＬＧＮ、又はＳＹＳ１タンパク質の量及び／又は活性を求める。
【0203】
各ＡＳＯは、ＡＣＹ３、ＣＬＧＮ、又はＳＹＳ１のＲＮＡ転写物におけるエキソン２のスキッピングを誘導し、対照（細胞又は対象にモックＡＳＯを投与した場合）と比較して、ＡＣＹ３、ＣＬＧＮ、又はＳＹＳ１のタンパク質の発現及び／又は活性を増加させる。
【0204】
実施例３
この実施例では、マイクロペプチドをコードしている配列を含むエキソンを除去する目的で、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を標的とするようにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を設計する。マイクロペプチドの発現に対するこれらＡＳＯの効果について調べる。
この実施例では、マイクロペプチドをコードしている配列を含むエキソンを除去する目的で、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を標的とするようにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を設計する。マイクロペプチドの発現に対するこれらＡＳＯの効果について調べる。
【0205】
ｌｎｃＲＮＡ ＨＯＸＢ－ＡＳ３は、結腸がんに関与する短いペプチドをコードしている。このペプチドの配列は、ＨＯＸＢ－ＡＳ３転写物（例えば、ＮＲ＿０３２０１．２及びＮＲ＿０３３２０４．２）のエキソン２から始まる。この転写物のエキソン２をスキッピングするように設計されたＡＳＯは、この短いペプチドの翻訳を妨げるであろう。
【0206】
表２に、ＨＯＸＢ－ＡＳ３のエキソン２のスプライシングシグナルを標的とするＡＳＯの幾つかの例を示す。各ＡＳＯは完全にホスホロチオエートＲＮＡであり、完全に２’ＭＯＥ修飾されている。
【0207】
【表2】
【0208】
培養中の哺乳類細胞にＡＳＯを投与するか、又はヒト患者若しくは動物モデルにＡＳＯを注射する。ヒト患者又は動物モデルに筋肉内注射することによってＡＳＯを注射する。約５０ｍｇ／ｋｇの用量で滅菌バッファー（例えば、生理食塩水）中ＡＳＯを注射する。
【0209】
細胞又は対象にＡＳＯを投与する前及び後に、マイクロペプチドの量及び／又は活性を求める。
【0210】
各ＡＳＯはｌｎｃＲＮＡにおけるエキソン２のスキッピングを誘導し、対照（細胞又は対象にモックＡＳＯを投与した場合）と比較してマイクロペプチドの発現を欠如させる。
【0211】
実施例４
この実施例では、ヒトＢＤＮＦ遺伝子座を解析して、ｒｉｂｏｓｅｑ／ＲＮＡ－ｓｅｑのデータを重ね合わせて予測ｕＯＲＦを同定した（図７）。
この実施例では、ヒトＢＤＮＦ遺伝子座を解析して、ｒｉｂｏｓｅｑ／ＲＮＡ－ｓｅｑのデータを重ね合わせて予測ｕＯＲＦを同定した（図７）。
【0212】
推定エキソンスキッピング標的と認定された２つのＢＤＮＦアイソフォーム：転写バリアント１１（ＮＭ＿００１１４３８１１）及び転写バリアント１４（ＮＭ＿００１１４３８１４）が同定された。これら転写物は、５’ＵＴＲに少なくとも３つのエキソンを含み、スキッピング可能なエキソンは少なくとも１つのｕＯＲＦを含んでいた（図７）。
【0213】
これら各転写物の５’ＵＴＲを、社内のデュアルルシフェラーゼレポータープラスミドの一部としてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の下流にクローニングし、各スキッピング可能なエキソン又はエキソンの組み合わせを欠失させたバリアントを作製した。全てのコンストラクトをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【0214】
ＢＤＮＦ ｖ１１では、エキソン２（予測ｕＯＲＦを８つ含む）の欠失により、ｐＯＲＦレポーター遺伝子の発現が約８倍アップレギュレーションされた（図８Ａ、Ｂ）。エキソン２及び３の両方を欠失させると、更に抑制が解除され、ウミシイタケルシフェラーゼ活性が約２３倍上昇した。しかし、エキソン３（予測ｕＯＲＦを２つ含む）だけを欠失させても、ｐＯＲＦレポーター遺伝子の発現に影響はなかった。タンパク質レベルの大幅なアップレギュレーションを転写物レベルの変化では説明することはできなかったが、それは、群間に差がなかったためである（図８Ｃ）。
【0215】
これらデータは、成熟ＢＤＮＦ転写物からエキソン２又はエキソン２及び３を排除することを目的としたエキソンスキッピング戦略を、翻訳レベルでの治療的ＢＤＮＦアップレギュレーションに利用できる可能性を示唆している。
【0216】
対照的に、ＢＤＮＦ ｖ１４の解析では、エキソン２を欠失させた場合（ｕＯＲＦを１つ含む）、レポーター遺伝子の発現に対して有意な効果はなかった（図８Ｄ、Ｅ）。これらデータから、この転写物のバリアントは上流エキソンスキッピングの標的としてあまり適していないことが示唆される。
【0217】
これら所見に基づき、ＢＤＮＦ ｖ１１を更なる分析のために選択した。エキソン２を欠失させたときに観察されたアップレギュレーションは、結果として生じた「エキソンスキッピングされた」ｍＲＮＡから８つのｕＯＲＦ配列が排除された結果である可能性があるという仮説を立てた。この目的のために、開始コドンのＡＴＧトリヌクレオチドをＴＴＧに変異させることによって、エキソン２のｕＯＲＦを８つ全て破壊したコンストラクトを試験した。エキソン２のｕＯＲＦを破壊すると、レポーター遺伝子の発現が約３倍アップレギュレーションし（図９Ａ）、これは、ｕＯＲＦを介した抑制が緩和されたことと一致していた。興味深いことに、このアップレギュレーションは、エキソン２を完全に欠失させた場合に観察されたアップレギュレーションのほんの一部に過ぎなかった。このことは、ｕＯＲＦがｐＯＲＦ抑制に寄与しているとはいえ、抑制活性の全てを占めることはできないことを示唆している。
【0218】
ＢＲＩＯ（ＢＥＡＭ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍＯｔｉｆｓ）（参照文献３０）を用いてＢＤＮＦ ｖ１１エキソン２の配列を解析したところ、関心対象の２つのＲＮＡ結合モチーフ（ＨｕＲ＃１及びＨｕＲ＃２）が同定された（図９Ｂ）。しかし、これらモチーフの欠失は、個々に欠失させた場合も、一緒に欠失させた場合も、ｐＯＲＦレポーターの発現に有意な効果を及ぼさなかった（図９Ｃ）。このことから、これらモチーフはエキソン２内に含まれる翻訳抑制活性に関与していないことが示唆される。
【0219】
次に、翻訳抑制活性の主な原因である可能性があるＢＤＮＦ ｖ１１のエキソン２における配列を同定するために、欠失ウォークを行った。エキソン２の５０ｂｐの領域を逐次欠失させた変異体コンストラクトを作製した。この実験の目的のために、エキソン２内の全てのｕＯＲＦを破壊し、その結果、非ｕＯＲＦ抑制エレメントを同定することが可能になった。最初の５０ｂｐを欠失させると（Δセグメント１）、エキソン２の全てのｕＯＲＦを破壊した対照コンストラクトと比較してレポーター活性が顕著に３倍アップレギュレーションした（図１０Ａ）。これらデータは、ｕＯＲＦを介した抑制と、この最初の５０ｂｐに含まれる更なるモチーフとの組み合わせが、このエキソンの抑制活性の大部分を占めることを示唆している。エキソン２の開始点における関心対象の５０ｂｐの領域にわたって１０ｂｐの領域を欠失させた第２の一連の欠失変異体を作製した。これらコンストラクトのいずれについても、アップレギュレーション活性は観察されなかった（図１０Ｂ）。
【0220】
これらデータを総合すると、エキソン内に含まれる複雑なシグナルは、標的遺伝子のアップレギュレーションを目的として成熟ｍＲＮＡ転写物から排除される可能性があることが示される。これらシグナルとしては、ｕＯＲＦが挙げられるが、これに限定されない。これらシグナルは、ＲＮＡ結合モチーフ及び／又はＲＮＡ構造的特徴を含み得る。
【0221】
【表3-1】
【0222】
【表3-2】
【0223】
【表3-3】
【0224】
【表3-4】
【0225】
【表3-5】
【0226】
【表3-6】
【0227】
【表3-7】
【0228】
【表4-1】
【0229】
【表4-2】
【0230】
【表4-3】
【0231】
参照文献
１ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５：ｅ８５０３（２０１９）．
２ Ｓｏｕｓａ ａｎｄ Ｆａｒｋａｓ，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １４（１２）：ｅ１００７７６４（２０１８）．
３ Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔ．５８１：４１８４／４１８８（２００７）．
４ Ｍｏｒｒｉｓ ａｎｄ Ｇａｂｅｌｌｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０，８６３５－８６４２（２０００）．
５ Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ ａｎｄ Ｏｍｍｅｎ，ＲＮＡ １３：１６０９－１６２４（２００７）．
６ Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｃｉ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４，３２（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１８７－１９０．
７ Ｃａｒｔｇｅｇｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ ３１（１３）：３５６８－７１．
８ Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７ Ｍａｒ；３５（３）：２３０－２３７．
９ Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０２０ Ｏｃｔ；１９（１０）：６７３－６９４．
１０ Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７ Ｍａｒ；３５（３）：２３０－２３７．
１１ Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１５ Ｊｕｎ ２９；８７：４６－５１．
１２ Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９９ Ｄｅｃ １０；１４８９（１）：１４１－５８．
１３ 米国特許第５，１４２，０４７号
１４ 米国特許第５，１８５，４４４号
１５ 国際公開第２００９０９９９４２号
１６ 欧州特許第１５７９０１５号
１７ Ｇｒｉｆｆｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９（２６）：５１００－５１０９（１９９７））
１８ Ｏｂｉｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８（５０）：８７３５（１９９７）
１９ Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８（２）：１４４－１４９（２００６）
２０ Ａｂｒａｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８Ｂ：１７２１－１７２６（２００９）
２１ Ｂｏｉｓｇｕeｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１５）
２２ Ｌｏｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ５８（２００４） ２３７－２５１
２３ Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９９）．
２４ Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６：７５０７－７５１２（２００９）．
２５ Ｉａｃｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４９：９７－１０５（２００５）．
２６ Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，３２６：９８７－９９１（２００３）．
２７ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０９：Ｅ２４２４－２４３２（２０１２）．
２８ Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２：Ｄ８５９－８６４（２０１４）．
２９ Ｓｃｈｕｌｌｅｒ ＆ Ｇｒｅｅｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９：５２６－５４１（２０１８）．
３０ Ｇｕａｒｒａｃｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４９，Ｗ６７－Ｗ７１（２０２１）．
１ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５：ｅ８５０３（２０１９）．
２ Ｓｏｕｓａ ａｎｄ Ｆａｒｋａｓ，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １４（１２）：ｅ１００７７６４（２０１８）．
３ Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔ．５８１：４１８４／４１８８（２００７）．
４ Ｍｏｒｒｉｓ ａｎｄ Ｇａｂｅｌｌｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０，８６３５－８６４２（２０００）．
５ Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ ａｎｄ Ｏｍｍｅｎ，ＲＮＡ １３：１６０９－１６２４（２００７）．
６ Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｃｉ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４，３２（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１８７－１９０．
７ Ｃａｒｔｇｅｇｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ ３１（１３）：３５６８－７１．
８ Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７ Ｍａｒ；３５（３）：２３０－２３７．
９ Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０２０ Ｏｃｔ；１９（１０）：６７３－６９４．
１０ Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７ Ｍａｒ；３５（３）：２３０－２３７．
１１ Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１５ Ｊｕｎ ２９；８７：４６－５１．
１２ Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９９ Ｄｅｃ １０；１４８９（１）：１４１－５８．
１３ 米国特許第５，１４２，０４７号
１４ 米国特許第５，１８５，４４４号
１５ 国際公開第２００９０９９９４２号
１６ 欧州特許第１５７９０１５号
１７ Ｇｒｉｆｆｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９（２６）：５１００－５１０９（１９９７））
１８ Ｏｂｉｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８（５０）：８７３５（１９９７）
１９ Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８（２）：１４４－１４９（２００６）
２０ Ａｂｒａｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８Ｂ：１７２１－１７２６（２００９）
２１ Ｂｏｉｓｇｕeｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１５）
２２ Ｌｏｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ５８（２００４） ２３７－２５１
２３ Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９９）．
２４ Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６：７５０７－７５１２（２００９）．
２５ Ｉａｃｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４９：９７－１０５（２００５）．
２６ Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，３２６：９８７－９９１（２００３）．
２７ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０９：Ｅ２４２４－２４３２（２０１２）．
２８ Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２：Ｄ８５９－８６４（２０１４）．
２９ Ｓｃｈｕｌｌｅｒ ＆ Ｇｒｅｅｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９：５２６－５４１（２０１８）．
３０ Ｇｕａｒｒａｃｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４９，Ｗ６７－Ｗ７１（２０２１）．
【0232】
配列表
配列番号１～１５を表１に列挙する。
配列番号２７～２８を表２に列挙する。
配列番号１～１５を表１に列挙する。
配列番号２７～２８を表２に列挙する。
【0233】
【表5】
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】