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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-16
(54)【発明の名称】ＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20240808BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240808BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240808BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240808BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240808BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240808BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20240808BHJP
C07K 14/74 20060101ALN20240808BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240808BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
A61K39/395 Y
A61K45/00
A61P35/02
A61P35/00
A61K38/17 100
C07K19/00 ZNA
C07K14/74
C12N15/113 140Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024507944
(86)(22)【出願日】2022-08-05
(85)【翻訳文提出日】2024-04-02
(86)【国際出願番号】 EP2022072130
(87)【国際公開番号】W WO2023012347
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】21190004.8
(32)【優先日】2021-08-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21190005.5
(32)【優先日】2021-08-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21207324.1
(32)【優先日】2021-11-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524048807
【氏名又は名称】イムノス セラピューティクス アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(74)【代理人】
【識別番号】100181906
【弁理士】
【氏名又は名称】河村 一乃
(72)【発明者】
【氏名】マロカン ベラウンザラン，オシリス
(72)【発明者】
【氏名】ラフィエイ，アナヒタ
(72)【発明者】
【氏名】クマール，アニル
(72)【発明者】
【氏名】レナー，クリストフ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA26
4C084DA38
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZB27
4C085AA33
4C085BB36
4C085BB42
4C085EE03
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA22
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、腫瘍性疾患の治療に使用するＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、がんの治療に使用するためのＨＬＡ融合タンパク質とチェックポイント阻害剤との両方を含む併用医薬も提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
がんの治療に使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は：ａ． ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉ． ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドであって：
・ ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン、特にＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３、又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン；又は
・ ＨＬＡ重鎖の前記細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、それぞれのＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインと比較して、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体；
から選択される、前記ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドと：
ｉｉ． 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質：及び
ｂ． ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）ポリペプチド
を含む、前記医薬組成物。
【請求項2】
ＨＬＡ融合タンパク質はＢ２ｍポリペプチドと非共有結合的に会合している、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項3】
ＨＬＡ融合タンパク質は、Ｂ２ｍポリペプチドと３：５～７：５の比、特に４：５～６：５の比、より特に約１の比で、非共有結合的に会合している、請求項１又は２に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項4】
ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｂ５７の細胞外ドメインの変異体であり、かつＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項5】
ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、配列番号００１の配列を含む、又は本質的にそれからになる、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項6】
ＨＬＡ融合タンパク質は：ａ． 請求項１～５のいずれか１項で特定されるＨＬＡ重鎖ポリペプチド；及び
ｂ． ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、より特に配列番号００２の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド；及び任意に
ｃ． ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー；
を含み、かつ
任意に、ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｄ． 分泌シグナル、特に１６～３０アミノ酸長である分泌シグナル、より特に分泌シグナルが細胞から分泌される過程の間で切断により除去される分泌シグナル、さらにより特に配列番号００４の配列を有する分泌シグナル、
をさらに含む、
請求項１～５のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項7】
ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに対してＮ末端に位置する、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項8】
ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００５と指定される配列を含む、又は本質的にそれからなる、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項9】
ＨＬＡ融合タンパク質は二量体の形態であり、前記二量体は第１のＨＬＡ単量体及び第２のＨＬＡ単量体を含む、又は本質的にそれからなり；－ 第１のＨＬＡ単量体は、本質的に、請求項１～８のいずれか１項に規定される第１のＨＬＡ融合タンパク質と、第１のＢ２ｍポリペプチドとからなり；かつ
－ 第２のＨＬＡ単量体は、本質的に、請求項１～８のいずれか１項に規定される第２のＨＬＡ融合タンパク質と、第２のＢ２ｍポリペプチドとからなり；
特に、第１のＨＬＡ単量体と第２のＨＬＡ単量体とは同一である、
請求項１～８のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項10】
ＨＬＡ融合タンパク質はペプチドエピトープと会合していない、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項11】
医薬組成物は、チェックポイント阻害剤の前に、それと組み合わせて、又はその後に、投与される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項12】
がん、特に血球由来がん、又は固形腫瘍、の治療に使用するためのチェックポイント阻害剤であって、チェックポイント阻害剤は、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物の前に、それと組み合わせて、又はその後に、投与される、前記チェックポイント阻害剤。
【請求項13】
前記チェックポイント阻害剤は、１０－７ｍｏｌ／Ｌ以下の解離定数で、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のいずれかに結合することが可能であり、特にチェックポイント阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物、又は請求項１２に記載の使用のためのチェックポイント阻害剤。
【請求項14】
前記チェックポイント阻害剤は全身送達に適した剤形で提供される、請求項１～１１、又は１２のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物、又は請求項１２又は１３に記載の使用のためのチェックポイント阻害剤。
【請求項15】
がんは：ａ． 血球由来のがん、特にリンパ腫、白血病、又は骨髄腫から選択される血球由来のがん、又は
ｂ． 固形腫瘍、特に肺細胞由来、乳房細胞由来、又は結腸細胞由来の固形腫瘍、
である、請求項１～１１、１３、又は１４のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項16】
悪性新生物疾患は、結腸がん、乳がん、膵臓がん、又は黒色腫から選択される、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の使用のためのチェックポイント阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、２０２１年８月５日に出願された欧州出願（ＥＰ）第２１１９０００４．８号及び欧州出願（ＥＰ）第２１１９０００５．５号、並びに２０２１年１１月９日に出願された欧州出願（ＥＰ）第２１２０７３２４．１号による優先権を主張し、これらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【0002】
本発明は、抗悪性腫瘍薬として使用するための医薬組成物に関し、前記組成物は、β２－ミクログロブリンポリペプチドと会合しているＨＬＡ融合タンパク質を含み、望ましい免疫調節特性及び組換えタンパク質発現特性を有する。
【背景技術】
【0003】
古典的なＭＨＣ－Ｉ分子（ヒトではＨＬＡ－Ｉとしても知られている）は、細胞外ドメイン（α１、α２、及びα３ドメインを含む）により特徴付けられる膜結合型重鎖を含む二量体構造又は三量体構造である。ＨＬＡ重鎖は、ＨＬＡ軽鎖としても知られるβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）と複合体を形成し、細胞表面のＨＬＡ重鎖ペプチド結合クレフトに会合した小さなペプチドエピトープの形態で抗原を提示する。ＭＨＣクラスＩ分子はまた、β２ｍ、及び／又はペプチドエピトープを欠く遊離重鎖へ解離することもある（Ａｒｏｓａら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７ Ｍａｒ；２８（３）：１１５－２３）。本発明者らは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ部分などの安定化ペプチドとの融合タンパク質として送達される場合に、特にここでＨＬＡがβ２ｍ、又はＨＬＡ結合クレフト内のペプチドエピトープとの会合を欠く場合に、ＨＩＶ感染における特定の免疫相関に関連するＨＬＡ－Ｂ２７又はＨＬＡ－Ｂ５７のハプロタイプなどの選択されたＨＬＡを、有望な免疫調節薬として同定した（国際公開（ＷＯ）第２０１７／１５３４３８号（Ａ１）、国際公開（ＷＯ）第２０１６／１２４６６１号（Ａ１）、国際公開（ＷＯ）第２０１８／０２９２８４号（Ａ１）参照）。
【0004】
本技術の以前の用途において使用される単離された非β２ｍ会合ＨＬＡを得るために、ＨＬＡ重鎖融合タンパク質／β２ｍ複合体は、単離されたＨＬＡ重鎖融合タンパク質のリフォールディングの前に、例えばサイズベースのクロマトグラフィーによって、精製の前に、例えば酸性条件下で、分離される。しかしながら、本明細書で研究されるＨＬＡ－Ｂ５７重鎖由来融合タンパク質などの非β２ｍ会合ＨＬＡ重鎖化合物は、望ましい免疫調節資質を有しているが、工業的な量まで製造規模を拡大することには課題がある。免疫調節ＨＬＡ融合タンパク質をβ２ｍから分離する過程の間に、ＨＬＡ融合タンパク質の最大半分が失われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開（ＷＯ）第２０１７／１５３４３８号（Ａ１）
【特許文献2】国際公開（ＷＯ）第２０１６／１２４６６１号（Ａ１）
【特許文献3】国際公開（ＷＯ）第２０１８／０２９２８４号（Ａ１）
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ａｒｏｓａら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７ Ｍａｒ；２８（３）：１１５－２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記の技術状態に基づき、本発明の目的は、悪性新生物疾患の治療に使用するための、改良された医薬組成物である、良好な免疫調節特性を有するＨＬＡ重鎖ベースの融合タンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成され、本明細書の従属請求項、実施例、図及び一般的説明に記載されたさらに有利な実施形態を伴う。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1-1】図１は、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）ＩｇＧ４融合タンパク質の優れた発現特性を示す。ＣＨＯ細胞クローン内でベクターから発現させた、示された（Ａ）ＨＬＡ－Ｂ５７ ＩｇＧ４融合タンパク質及び（Ｂ）β２ｍのＲＮＡプロファイル。
【図1-2】細胞生存率（Ｃ）及び発現タンパク質力価（Ｄ）に基づいた、ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ（ＤＧＣ８－Ｔ３９、ＤＧＣ８－Ｔ６４、及びＤＧＣ８－７３）とＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（ＤＧＣ８－Ｔ５４、ＤＧＣ８－Ｔ７５、及びＤＧＣ８－９１）をトランスフェクトしたクローンからの融合タンパク質発現。表は、試験した異なるトランスフェクション比における収率をまとめたものである。
【図2-1】図２は、３段階で精製した（Ａ）ＨＬＡ－Ｂ５７構築物及び（Ｂ）ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）構築物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。ＣＨＯ上清からのＡ：アフィニティー精製。
【図2-2】Ｂ：２つの方法の分岐。精製はＢ２ｍの除去のための追加工程を経てからＳＥＣ Ｃにより行われ、Ｂ２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７の精製は直接ＳＥＣ Ｄにより行われる。挿入した要約表（下部）は、両方の構築物から精製された化合物の収率を示している。ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍには多量の高分子量（ＨＭＷ）種、及び低分子量種（ＬＭＷ）もまた有し、単量体の含有量の減少を伴うが、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍでは有意にＨＭＷ、ＬＷＭの減少、及び単量体の高含有を有する。
【図2-3】（Ｃ）は、示したＨＬＡ－Ａ３０、Ｂ５７、Ｂ５８及びＣ０８の野生型及び４６位と９７位とに示したアミノ酸置換を有する変異型構造のＩｇＧ Ｆｃ融合体からの組換えタンパク質収量を示す。ＣＨＯ細胞に、ａ）Ｆｃ融合ＨＬＡ分子及びｂ）ヒトβ２ｍの２種のベクター構築物を１：１の割合で一過性にトランスフェクトした。発現タンパク質の力価は、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、プロテインＡバイオセンサーを用いて定量した。
【図3-1】図３（Ａ）は、ＥＬＩＳＡにより測定される、ＬＩＬＲＢ２と、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍとの結合親和性の定量的推定を示す。非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７はＥＣ５０が２１ｎＭであり、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）のＥＣ５０は８．３ｎＭであり、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍのＥＣ５０は５．７２ｎＭであり、アミノ酸置換がＨＬＡ－Ｂ５７重鎖のＬＩＬＲＢ２への結合を低下させないことを示している。
【図3-2】（Ｂ）バイオレイヤー干渉（Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：ＢＬＩ）によって測定された、ＬＩＬＲＢ２と、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）（Ｋｄ＝２０．３ｎＭ）及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（Ｋｄ＝２．３ｎＭ）との結合親和性の定量的推定。β２ｍに会合しているＢ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍの結合の改善が確認された。
【図4-1】図４は、β２ｍを有する、又は有さない場合のＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）のヒト初代マクロファージによる液体がん細胞及び固形がん細胞の貪食の誘導を示す。示した液状腫瘍及び固形腫瘍由来のがん細胞株をヒト初代マクロファージと共培養し、腫瘍細胞の貪食作用をＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージングシステムを用いて３６時間測定した。生物学的に独立した少なくとも２つの試料を用いて実験を繰り返した。エラーバーは、それぞれ２回の技術的繰り返しを含む、ｎ＝２の生物学的繰り返しのＳＥＭ。統計解析は２元配置ＡＮＯＶＡ多重比較を用い、その後Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック分析を行った。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図4-2】図４は、β２ｍを有する、又は有さない場合のＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）のヒト初代マクロファージによる液体がん細胞及び固形がん細胞の貪食の誘導を示す。示した液状腫瘍及び固形腫瘍由来のがん細胞株をヒト初代マクロファージと共培養し、腫瘍細胞の貪食作用をＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージングシステムを用いて３６時間測定した。生物学的に独立した少なくとも２つの試料を用いて実験を繰り返した。エラーバーは、それぞれ２回の技術的繰り返しを含む、ｎ＝２の生物学的繰り返しのＳＥＭ。統計解析は２元配置ＡＮＯＶＡ多重比較を用い、その後Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック分析を行った。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図4-3】図４は、β２ｍを有する、又は有さない場合のＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）のヒト初代マクロファージによる液体がん細胞及び固形がん細胞の貪食の誘導を示す。示した液状腫瘍及び固形腫瘍由来のがん細胞株をヒト初代マクロファージと共培養し、腫瘍細胞の貪食作用をＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージングシステムを用いて３６時間測定した。生物学的に独立した少なくとも２つの試料を用いて実験を繰り返した。エラーバーは、それぞれ２回の技術的繰り返しを含む、ｎ＝２の生物学的繰り返しのＳＥＭ。統計解析は２元配置ＡＮＯＶＡ多重比較を用い、その後Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック分析を行った。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図5-1】図５は、Ｂ２ｍを有する、又は有さない場合のＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）による単剤療法（それぞれＢ５７及びＢ５７．Ｂ２ｍと表示）が、ＢＲＧＳＦ－ＨＩＳヒト化ＰＤＸ肺がんマウスにおいて、腫瘍増殖を抑制し、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．Ｂ２ｍが生存期間を延長することを示す。Ａ． β２ｍを有する場合、有さない場合のＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）の単剤療法後の相対的腫瘍増殖（腫瘍の倍加時間）及び生存期間（Ｂ）。
【図5-2】Ａ． β２ｍを有する場合、有さない場合のＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）の単剤療法後の相対的腫瘍増殖（腫瘍の倍加時間）及び生存期間（Ｂ）。Ｉ．ｐ．注入は試験終了まで５日ごとに行った；注入化合物の濃度：アイソタイプＩｇＧ４（１０ｍｇ／ｋｇ）、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（１０ｍｇ／ｋｇ）；ｎ＝６。Ａのデータは、最小値から最大値までのすべての点を示す箱ひげでプロットされている。Ａの統計解析は、多重比較２元配置ＡＮＯＶＡ（混合効果モデル）を用いて、その後Ｔｕｋｅｙのポストホック分析を行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；生存期間Ｂの統計解析は、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて行った。
【図6】図６は、Ｖ－Ｐｌｅｘマルチプレックスサイトカインイムノアッセイで測定した、図５のＢＲＧＳＦ－ＨＩＳヒト化ＰＤＸ肺がんマウスのを示された血中サイトカインの分析を示す。統計分析は、通常の一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、その後Ｆｉｓｃｈｅｒのポストホック分析を行った。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図7-1】図７は、抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤の単剤療法及び併用療法と、（Ａ）非β２ｍ会合（ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ））及び（Ｂ）β２ｍ会合ＨＬＡ（ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ）が、Ｃ３８マウス滑液性結腸癌モデルにおいて腫瘍サイズを縮小することを示す。示された治療群の平均腫瘍体積ｍｍ３（上部）、及び個々の動物と各群の治療への応答を示すスパイダープロット（下部）。腫瘍体積は平均値±ＳＥＭで表し、二元配置ＡＮＯＶＡ、その後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉポストホック分析で解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図7-2】図７は、抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤の単剤療法及び併用療法と、（Ａ）非β２ｍ会合（ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ））及び（Ｂ）β２ｍ会合ＨＬＡ（ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ）が、Ｃ３８マウス滑液性結腸癌モデルにおいて腫瘍サイズを縮小することを示す。示された治療群の平均腫瘍体積ｍｍ３（上部）、及び個々の動物と各群の治療への応答を示すスパイダープロット（下部）。腫瘍体積は平均値±ＳＥＭで表し、二元配置ＡＮＯＶＡ、その後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉポストホック分析で解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図8】図８はＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（ｉｏｓＨ２と表示）はＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２に結合し、天然リガンドとの相互作用をブロックする。（Ａ）ｉｏｓＨ２はヒトＬＩＬＲＢ１に結合し、ＨＬＡ－Ｇとの相互作用を競合的にブロックする。（Ｂ）ｉｏｓＨ２はヒトＬＩＬＲＢ２に結合し、ＨＬＡ－Ｇ（自社製造）、ＡＮＧＰＴＬ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、９７９５－ＡＮ）及びＡＮＧＰＴＬ７（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、９１４－ＡＮ）との相互作用を競合的に阻害する。
【図9-1】図９はＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（ｉｏｓＨ２と表示）は、固形腫瘍及び液状腫瘍由来の細胞株の一次マクロファージ介在性貪食を増強する。様々な適応症に由来する癌細胞株（肺－Ｈ６９、白血病－Ｊｕｒｋａｔ、膵臓－ＭＩＡ ＰａＣａ２、肺－Ｈ４６０、骨髄腫－ＲＰＭＩ８２２６、リンパ腫－Ｄａｕｄｉ）をヒト初代マクロファージと共培養し、かつＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージングシステムにより食作用を測定した。食作用は、（Ａ）ＬＩＬＲＢ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３３３７２２）、ＬＩＬＲＢ２（ＭＫ４８３０、ＵＳ２０１８／０２９８０９６Ａ１、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＮＣＴ０３５６４６９１）、モノクローナル抗体、及び（Ｂ）Ｔｒｉｌｌｉｕｍ ＳＩＲＰａ Ｆｃ融合タンパク質（ＴＴＩ６２１（Ｌｉｎ Ｇ．ＰＬｏｓ Ｏｎｅ ２０１７ １２（１０）：ｅ０１８７６２６）及びＴＴＩ６２２（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＮＣＴ０３５３０６８３））と比較した。
【図9-2】食作用は、（Ａ）ＬＩＬＲＢ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３３３７２２）、ＬＩＬＲＢ２（ＭＫ４８３０、ＵＳ２０１８／０２９８０９６Ａ１、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＮＣＴ０３５６４６９１）、モノクローナル抗体、及び（Ｂ）Ｔｒｉｌｌｉｕｍ ＳＩＲＰａ Ｆｃ融合タンパク質（ＴＴＩ６２１（Ｌｉｎ Ｇ．ＰＬｏｓ Ｏｎｅ ２０１７ １２（１０）：ｅ０１８７６２６）及びＴＴＩ６２２（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＮＣＴ０３５３０６８３））と比較した。
【図10-1】図１０はＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（ｉｏｓＨ２と表示）は、単剤療法及びＰＤ－１との併用療法として、初代ヒトＴ細胞の殺傷活性を増強させることを示す。ヒト初代Ｔ細胞を、（Ａ、Ｂ）ＡＭＬ（ＴＨＰ１）及び（Ｃ、Ｄ）結腸（ＨＣＴ１１６）がん細胞と、１：１及び５：１の２種類のＥ：Ｔ（エフェクター細胞：ターゲット細胞）比で細胞接触的にインキュベートし、化合物で治療し、がん細胞の殺傷のパーセンテージをＩｎｃｕＣｙｔｅライブシステムで測定した。
【発明を実施するための形態】
【0010】
発明の概要
中間体であるＨＬＡ重鎖融合タンパク質／β２ｍポリペプチド複合体の免疫学的資質を、β２ｍポリペプチドを欠くＨＬＡ重鎖融合タンパク質と比較して調査することにより、本発明者らは、ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍポリペプチド複合体分子が望ましい免疫調節特性を示し、かつがんの治療、特にがんのヒト化免疫系モデルにおいて高められた有益な治療効果をもたらすという驚くべき観察結果が得られた。
中間体であるＨＬＡ重鎖融合タンパク質／β２ｍポリペプチド複合体の免疫学的資質を、β２ｍポリペプチドを欠くＨＬＡ重鎖融合タンパク質と比較して調査することにより、本発明者らは、ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍポリペプチド複合体分子が望ましい免疫調節特性を示し、かつがんの治療、特にがんのヒト化免疫系モデルにおいて高められた有益な治療効果をもたらすという驚くべき観察結果が得られた。
【0011】
本発明の第１の態様は、悪性新生物疾患の治療に使用するための医薬組成物に関し、前記組成物は、ＨＬＡ融合タンパク質（ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ重鎖細胞外ドメインポリペプチド及び免疫グロブリン（Ｉｇ）断片結晶化可能（Ｆｃ）ポリペプチドなどの安定化ポリペプチドを含む）を含み、ＨＬＡ融合タンパク質がさらにβ２ｍポリペプチドと会合し、そして前記組成物は少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含有する。特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３、又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択される天然に存在するＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインである。他の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチド、特にＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の変異体を含み、前記変異体は、上記のＨＬＡ重鎖の１つに対して少なくとも９５％の類似性を有し、かつ同様の生物学的機能を保持する。
【0012】
本発明に係る使用のための医薬組成物のさらなる実施形態は、ＨＬＡ融合タンパク質とβ２ｍポリペプチドとの非共有結合的な会合、並びに変異型ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチド、Ｉｇ Ｆｃポリペプチド、ペプチドリンカー、及び分泌シグナル（そのような医薬組成物に包含するために特に使用される）、並びにチェックポイント阻害剤をさらに含む組み合わせ医薬に関する。
【0013】
本発明の別の態様は、本発明の第１の態様によるＨＬＡ融合タンパク質とβ２ｍとを含む医薬組成物と組み合わせて投与するために製剤化された、がん、特に血液がん、又は悪性新生物疾患を有する患者の治療に使用するためのチェックポイント阻害剤に関する。
【0014】
用語と定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた同様である。以下に定める定義が、参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合は、ここに定める定義が優先されるものとする。
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた同様である。以下に定める定義が、参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合は、ここに定める定義が優先されるものとする。
【0015】
本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び他の同様の形態、並びにそれらの文法的に同等な用語は、意味において同等であること、及びこれらの単語のいずれか１つに続く１つ又は複数の項目が、係る１つ又は複数の項目を網羅的にリストするものではない、又はリストした１つ又は複数の項目のみに限定するものではないことにおいてオープンエンドとすることを意図している。例えば、成分Ａ、Ｂ及びＣを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」品目は、成分Ａ、Ｂ及びＣからなる（すなわち、成分Ａ、Ｂ及びＣのみを含有する）こともできるし、又は成分Ａ、Ｂ及びＣのみならず、１つ又は複数の他の成分を含むこともできる。このように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及びその類似の形態、並びにその文法的同等な用語は、「本質的にそれからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「それからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の実施形態の開示を含むことが意図及び理解される。
【0016】
値の範囲が提供されている場合、文脈上明らかにそうでないと指示されない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載の範囲内の他の記載の値若しくは介在値は、記載の範囲の具体的に除外される制限を受けて本開示内に包含されると理解される。記載の範囲に限界値の一方又は両方が含まれる場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除いた範囲もまた開示に含まれる。
【0017】
本明細書において、値又はパラメータの「約（ａｂｏｕｔ）」という言及は、その値又はパラメータそれ自体に向けられる変動を含む（及び記述する）。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）Ｘ」と言及する記述には、「Ｘ」という記述も含まれる。
【0018】
添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用されるとおり、単数形「ａ」、「ｏｒ（又は）」、「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の参照語を含む。
【0019】
本明細書で使用される「及び／又は」は、指定された２つの特徴又は構成要素の各々を、他方のものとともに又はなしに、具体的に記載したものとみなされる。したがって、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの表現で使用される「及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ（単独）」、及び「Ｂ（単独）」を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの表現で使用される「及び／又は」という用語は、以下の各態様を包含することを意図している：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。
【0020】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。標準的な手法が、分子学的、遺伝学的及び生化学的手法（一般に以下を参照。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第４編（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ． 及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）第５編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）及び化学的手法に用いられる。
【0021】
本明細書の文脈における「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸がペプチド結合によって接続されている直鎖を形成する５０以上のアミノ酸からなる分子を指す。ポリペプチドのアミノ酸配列は、（生理学的に見出される）タンパク質全体又はその断片のアミノ酸配列を表すこともある。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、タンパク質及びその断片を含む。ポリペプチドは、アミノ酸残基配列として本明細書に開示される。
【0022】
アミノ酸残基の配列はアミノ末端からカルボキシル末端へ記載される。配列位置の大文字は、１文字コードのＬ－アミノ酸を指す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３編． ｐ．２１）。アミノ酸配列の位置を示す小文字は、対応するＤ－又は（２Ｒ）－アミノ酸を意味する。配列はアミノ末端からカルボキシ末端に向かって左から右に記載される。標準的な命名法に従い、アミノ酸残基の配列は、以下のように３文字又は１文字のコードのいずれかで表記される：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
【0023】
「遺伝子発現」又は「発現」という用語、あるいは「遺伝子産物」という用語は、核酸（ＲＮＡ）の生成又はペプチド又はポリペプチドの生成のプロセス－及びその産物－のいずれか、又は両方を指す場合があり、それぞれ転写及び翻訳ともよばれ、又は遺伝情報の処理を調節してポリペプチド産物をもたらす中間プロセスのいずれかを指す。「遺伝子発現」という用語はまた、ＲＮＡ遺伝子産物、例えば調節ＲＮＡ又は構造的（例えば、リボソーム）ＲＮＡの転写及びプロセシングにも適用される。発現ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。発現は、転写及び翻訳の両方のレベルで、言い換えればｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物で、測定することができる。
【0024】
本明細書の文脈において、「配列同一性」、「配列類似性」及び「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、整列される２つのポリペプチド配列を位置ごとに比較することによって決定される配列比較の結果を表す１つの定量的パラメータを指す。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野でよく知られている。比較用の配列アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）、又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって実行され、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、例えば、アメリカ国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。
【0025】
アミノ酸配列の比較の一例として、デフォルト設定を使用したＢＬＡＳＴＰアルゴリズムがある：期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲内の最大マッチ：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）１１、拡張（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）１；組成調整（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）：条件付き組成スコアマトリックス調整（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）。他に記載がない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、ＢＬＡＳＴ一連のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を用いて、タンパク質について上記で特定されるデフォルトパラメータを使用して得られる値を指す。
【0026】
パーセンテージを指定しない同一配列への言及は、１００％同一配列（すなわち同じ配列）の意味を含む。
【0027】
本明細書の文脈において、「解離定数（ＫＤ）」という用語は、化学及び物理の技術分野で知られている意味で使用される：［主に２つの］異なる成分からなる複合体が、可逆的にその（２つの）構成成分に解離する傾向を測定する、平衡定数を意味する。この複合体は、例えば、抗体Ａｂと抗原Ａｇからなる抗体抗原複合体ＡｂＡｇとすることができる。ＫＤは、モル濃度［ｍｏｌ／ｌ］で表され、［Ａｇ］の結合部位の半分が占有される［Ａｂ］の濃度に相当し、言い換えれば、未結合の［Ａｂ］の濃度が［ＡｂＡｇ］複合体の濃度と等しいことに相当する。解離定数は、以下の式により算出することができる：
［Ａｂ］：抗体の濃度、［Ａｇ］：抗原の濃度、［ＡｂＡｇ］：抗体－抗原複合体の濃度
【数1】
【0028】
本明細書で使用されるとおり、「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とともに、本発明に係るβ２ｍと会合するＨＬＡ融合タンパク質を指す。特定の実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、局所投与、非経口投与、又は注射投与に適した形態で提供される。
【0029】
本明細書で使用されるとおり、「薬学的に許容される担体」という用語は、当業者に知られているように、任意の溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香料、色素など、及びその組み合わせを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ＩＳＢＮ ０８５７１１０６２４を参照）。
【0030】
本明細書で使用されるとおり、任意の疾患又は障害（例えば、がん）の「治療する」又は「治療」という用語は、一実施形態では、疾患又は障害を緩和すること（例えば、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発症を遅らせるか、阻止するか、又は軽減すること、例えば、腫瘍成長を遅らせること、又は減少すること）を指す。別の実施形態では、「治療する」又は「治療」とは、患者が識別できない可能性のあるものも含めて、少なくとも１つの身体的パラメータを緩和又は改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療する」又は「治療」とは、身体的（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的（例えば、身体的パラメーターの安定化）、又はその両方のいずれかで、疾患又は障害を調節することを指す。疾患の治療及び／又は予防を評価する方法は、以下の本明細書で特に説明しない限り、当技術分野で一般的に知られている。
【0031】
本明細書の文脈において、「ペプチドリンカー」又は「アミノ酸リンカー」という用語は、一本鎖のポリペプチドを生成するために２つのポリペプチドを接続するために使用される可変長のポリペプチドを意味する。本明細書で規定する本発明の実施に有用なリンカーの例示的な実施形態は、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０又は５０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド鎖である。アミノ酸リンカーの非限定的な例は、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドを安定化ペプチドと連結するポリペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号００３）であり、例えば、ＨＬＡ融合タンパク質においてＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドとＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドとを連結する。
【0032】
本明細書の文脈において、「ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖」、「ＨＬＡ重鎖」という用語は、ＭＨＣクラスＩ組織適合抗原遺伝子によってコードされるタンパク質、特に古典的な、ＭＨＣクラス１ａ重鎖に関する。ヒトでは、ＨＬＡ重鎖は単量体であることが可能であり、又はβ２ｍ軽鎖と非共有結合的に結合した３つの細胞外ドメイン（α１、α２及びα３）を有する重鎖を含む二量体構造の一部を形成することが可能であり、又は任意に、ペプチド結合クレフト（ｃｌｅｆｔ）に低分子ペプチドが会合した三量体構造を形成することが可能である。全長ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、α１、α２、及びα３ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。
【0033】
本発明のこの態様に係る用語の実施形態と考えられる天然に存在するＨＬＡ重鎖のリストを表１に示す。
【0034】
【表1】
【0035】
本明細書の文脈における「変異体」という用語は、天然に存在するポリペプチド配列とは異なる少なくとも１つのアミノ酸残基を有するＨＬＡ重鎖ポリペプチド配列に関する。例えば、変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、由来する本来の天然に存在するヒトタンパク質配列とは異なるように、１個又は複数個のアミノ酸置換が導入されている。
【0036】
本明細書においてＨＬＡ重鎖又はＨＬＡ重鎖の変異体に適用される「細胞外ドメイン」という用語は、細胞表面から伸びるＨＬＡ重鎖ポリペプチドの細胞外部分を指す。ＨＬＡクラス１ａポリペプチドの細胞外部分は、アルファ（α）１ドメイン、α２ドメイン、及びα３ドメインを含み、これらは、本発明に係る使用のための医薬組成物中のＨＬＡ融合タンパク質の免疫調節効果を媒介するレセプターリガンド相互作用に必須である。「細胞外ドメイン」は膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを除く。
【0037】
本明細書の文脈において、「ＨＬＡ融合タンパク質」という用語は、ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインを、安定化ドメインと、特に安定化免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃと、任意にペプチドリンカーによって、結合してなる組換えポリペプチドを指す。この用語は、哺乳動物細胞培養から分泌されるβ２－ミクログロブリンポリペプチドと複合体化したこのような「ＨＬＡ融合タンパク質」、及びβ２－ミクログロブリンと会合していない精製ＨＬＡ融合タンパク質を包含する。「ＨＬＡ融合タンパク質」という用語は、単一の安定化免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインに結合した単一のＨＬＡポリペプチドを含む単量体、又は第１のＨＬＡ融合タンパク質単量体、及び第２のＨＬＡ融合タンパク質単量体の、特にそれらのＩｇＦｃドメインを介して結合される、会合によって形成される二量体を指し得る。
【0038】
本明細書の文脈において、「β２－ミクログロブリン（β２ｍ、Ｂ２ｍ）」、「Ｂ２ｍポリペプチド」、又は「β２ｍポリペプチド」という用語は、ＭＨＣクラスＩ分子のベータ（β）鎖を指し、ＨＬＡ軽鎖としても知られる。「β２－ミクログロブリン」という用語は、第１に、分泌シグナル、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ６１７６９の配列、又は配列番号００６の配列を含む処理前のβ２－ミクログロブリン、及び第２に、本発明に係る医薬組成物内に含まれるＨＬＡ融合タンパク質：β２ｍポリペプチド複合体中に見出されるとおり、タンパク質の分泌シグナル部分が分泌プロセス中の切断によって除去されている、タンパク質の分泌後形態を包含する。
【0039】
本明細書の文脈において、「分泌シグナル」、「分泌シグナルペプチド」又は「分泌シグナル配列」という用語は、ポリペプチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を開始するＮ末端リーダー配列を指し、通常、約６～３０アミノ酸長である。まれに、分泌シグナルがポリペプチドのＣ末端に配置されることがある。分泌シグナルは、標的化シグナル、局在化シグナル、トランジットペプチド、リーダー配列、又はリーダーペプチドとよばれることもある。細胞からのポリペプチドの効率的な分泌を可能にする分泌シグナルはよく知られており、細胞に基づくポリペプチド製造システムにおいてポリペプチドの上清への排出を促進し、細胞上清からポリペプチドを精製できるようにするために、組換えタンパク質のＯＲＦに含めることができる。分泌シグナルをコードするｍＲＮＡが翻訳されると、ｍＲＮＡ－リボソーム複合体の小胞体（ＥＲ）内のチャネルタンパク質への移行を媒介する細胞質タンパク質によって認識される。分泌シグナルペプチドを含む新しく合成されたポリペプチドは、チャネルタンパク質を介して小胞体内腔に移行し、細胞の分泌経路に入る。本発明に係る特有の使用のシグナル配列は、例えば、配列番号００４のように、翻訳後に最終ポリペプチド産物から切断されるものである。
【0040】
本明細書の文脈において、「免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｆｃ）領域」又は「Ｉｇ Ｆｃ」という用語は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される抗体若しくは免疫グロブリン（Ｉｇ）の画分を指す。Ｉｇ Ｆｃは、単量体、又はジスルフィド結合によって共有結合した２つのＩｇ Ｆｃからなる二量体の両方を含む。本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質の文脈において、ジスルフィド結合は、それぞれがＩｇ Ｆｃドメインを含む２つのＨＬＡ融合タンパク質分子を結合し得る。ＨＬＡ融合タンパク質にＩｇ Ｆｃが存在することで、溶解度、安定性、アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）、半減期を向上し、技術的な観点からは、哺乳動物系でのコスト効率の良い生産及び精製（プロテインＡ又はＧ精製）が容易になる。
【0041】
本明細書の文脈において、「チェックポイント阻害剤」という用語は、免疫チェックポイント機構として当該技術分野で知られている、免疫細胞の活性化、及び特にＴ細胞の活性化、を制限する阻害性シグナル伝達カスケードを破壊することができるがん免疫療法剤、特に「チェックポイント阻害抗体」又は「抗体様分子」、例えば、抗体断片、ダイアボディ、単鎖可変抗体断片などを包含する。「チェックポイント阻害剤」の例としては、例えば、ＣＴＬＡ－４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１６４１０）、ＰＤ－１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５１１６）、ＰＤ－Ｌ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＮＺＱ７）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＺＰＲ３）、ＶＩＳＴＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｈ７Ｍ９）、ＴＩＧＩＴ（ＵｎｉｐｒｏｔＱ４９５Ａ１）、又はＴＩＭ－３（ＨＡＶＣＲ２、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＴＤＱ０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０７０１１）、ＣＤ４０（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０９ＬＬ４）、ＣＤ２７（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２６８４１）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＵｎｉｐｒｏｔＰ４３４８９）、ＮＫＧ２Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２６７１５）、ＣＤ８６（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４２０８１）、ＣＤ８０（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３３６８１）、ＬＡＧ－３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１８６２７）、に特異的に結合する抗体、抗体様分子、又は天然リガンドレセプターが挙げられる。
【0042】
「がん」及び「悪性新生物疾患」という用語は、本明細書では同義に用いられる。本明細書に開示された態様及び実施形態のいずれかの特定の代替物は、固形腫瘍の治療における本発明の組み合わせの使用に向けられる。本明細書に開示される態様及び実施形態のいずれかの他の代替物は、骨髄性白血病又は顆粒球性白血病、特にＡＭＬ、リンパ性白血病、リンパ球性白血病、又はリンパ芽球性白血病及びリンパ腫、真性多血症又は赤血球減少症などの液体がんの治療における本発明の組み合わせの使用に向けられる。
【0043】
発明の詳細な説明
がん治療のためのＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物
本発明の第１の態様は、悪性新生物疾患の治療における使用のための医薬組成物に関し、前記組成物は、Ｂ２ｍポリペプチドと会合している、ＨＬＡ融合タンパク質を含む。本発明に係る前記ＨＬＡ融合タンパク質は、以下を含む：
－ ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン（特に、細胞外α１、α２及びα３ドメインを含むもの）を含む第１のポリペプチド、及び
－ 第２の安定化ポリペプチド、すなわち免疫グロブリンのＩｇ Ｆｃ部分。
がん治療のためのＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物
本発明の第１の態様は、悪性新生物疾患の治療における使用のための医薬組成物に関し、前記組成物は、Ｂ２ｍポリペプチドと会合している、ＨＬＡ融合タンパク質を含む。本発明に係る前記ＨＬＡ融合タンパク質は、以下を含む：
－ ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン（特に、細胞外α１、α２及びα３ドメインを含むもの）を含む第１のポリペプチド、及び
－ 第２の安定化ポリペプチド、すなわち免疫グロブリンのＩｇ Ｆｃ部分。
【0044】
β２ｍ会合ＨＬＡ融合タンパク質を使用することで、免疫調節性ＨＬＡ融合タンパク質の収量が増加するという利点がもたらされ、これは、この生成物の製造では、β２ｍ解離工程で生じるタンパク質の損失が生じないためであり（図２）、非β２ｍ会合ＨＬＡ融合タンパク質である代替物と比較して、腫瘍細胞の食細胞による取り込みなど、特定の免疫学的特性が向上するためである（図４）。重要なことに、ＨＬＡ融合タンパク質及びβ２ｍを含む本発明に係る医薬組成物は、β２ｍポリペプチドを欠くＨＬＡ融合タンパク質の形式と比較して、ヒト免疫細胞を含むヒト化マウスにおいてがんを治療するための本発明に係る医薬組成物を使用する場合に、生存の延長と関連している（図５）。
【0045】
本発明に係る使用のための医薬組成物のいくつかの実施形態において、β２ｍポリペプチドは、ＨＬＡ融合タンパク質にペプチドリンカーによって連結される。
【0046】
本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、β２ｍポリペプチドは、前記ＨＬＡ融合タンパク質と非共有結合的に会合している。
【0047】
本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、β２ｍ分子と３：５～７：５のモル比、より特に４：５～６：５のモル比で会合している。換言すれば、ＨＬＡ融合タンパク質及びβ２ｍポリペプチドは、１：１の比、又はそれに近い比で存在する。ＨＬＡとβ２Ｍとへの言及は、特に断りのない限り、本書全体を通してモル（ｍｏｌａｒ）として理解される。
【0048】
本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、それぞれβ２ｍポリペプチドと会合した２つのＨＬＡ融合タンパク質は、それらのＦｃ部分を介して二量化形態で会合し得る。
【0049】
ＨＬＡ重鎖ポリペプチド
コグネート（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンド相互作用に必要とされないＨＬＡ重鎖タンパク質の特定のドメインは、本発明に係る使用のための医薬組成物に含まれるＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡポリペプチド部分には含まれない。細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインはＨＬＡ重鎖ポリペプチドには存在しない。
コグネート（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンド相互作用に必要とされないＨＬＡ重鎖タンパク質の特定のドメインは、本発明に係る使用のための医薬組成物に含まれるＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡポリペプチド部分には含まれない。細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインはＨＬＡ重鎖ポリペプチドには存在しない。
【0050】
本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質若しくは単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造する方法の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質中に含まれるＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド変異体は、天然に存在するＨＬＡ重鎖タンパク質のアルファ１、２及び３ドメインを含み、これらの領域は、本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質の免疫調節効果を媒介するレセプターリガンド相互作用に必須である。
【0051】
本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質若しくは単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造する方法のより特定の実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドタンパク質変異体は、天然に存在するＨＬＡ重鎖タンパク質のアルファ１、２及び３ドメインであるが、Ｃ末端イソロイシン－バリンジペプチドを除き、それより細胞外ドメインのスレオニン－バリン－プロリン残基が先行し、それは時々「連結ペプチド」と注釈又は参照される膜貫通ドメインを先行するＨＬＡ－Ｂ５７領域内にある。
【0052】
ＨＬＡ重鎖は、キラー免疫グロブリン様レセプター（ＫＩＲ）及び白血球免疫グロブリン様レセプター（ＬＩＬＲ）といったリガンドと、膜貫通領域から離れた領域を介して相互作用することが構造データから示唆されている。膜に近いアミノ酸は、一般的にレセプターと相互作用しない。さらに、本発明者らは、天然に存在するＨＬＡ重鎖配列の細胞外ドメイン連結ペプチドの５Ｃ末端アミノ酸モチーフ内に疎水性アミノ酸が多く含まれることが、タンパク質の凝集傾向といった望ましくない性質を組換えタンパク質に導入する可能性が高く、その結果、下流の生産工程における生産、精製、安定性及び毒性に影響を及ぼす可能性があると推測している。
【0053】
特に本発明に係る使用のための医薬組成物において、ＨＬＡ融合タンパク質成分のＨＬＡ重鎖細胞外ドメインポリペプチドは、アルファ１、２及び３ドメインを含むＨＬＡ重鎖タンパク質配列の細胞外部分のコア構造を含み、この部分は、標的細胞上の表面分子と相互作用する能力をＨＬＡ融合タンパク質に付与するからである。
【0054】
本発明に係る使用のための医薬組成物のいくつかの実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖ポリペプチド部分は、表１に列挙される天然に存在するＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインのポリペプチド配列を有する。特定の実施形態において、ＨＬＡ重鎖細胞外ドメインは、自然免疫細胞及び適応免疫細胞の機能を変化させる制御性ＫＩＲ３ＤＬ１、ＬＩＬＲＡ及びＬＩＬＲＢ１／２細胞表面タンパク質への特異的結合といった免疫調節資質を有する天然に存在するＨＬＡ重鎖のものである。いくつかのそのような実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｂ５８の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。いくつかのそのような実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｂ２７の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。他の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｂ４４の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｂ８１の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。他の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｃ１２の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖部分は、ＨＬＡ－Ｂ５７の細胞外ドメインに由来する、又は本質的にそれである。
【0055】
本発明に係る医薬組成物の別の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質は、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とするＨＬＡ－Ｃｗ０８：０２重鎖の細胞外ドメインを含む。これは本発明者らがこのポリペプチドが良好な発現資質を持つことを発見したためである。
【0056】
がんの治療に使用するための医薬組成物のさらなる実施形態では、前記組成物は：
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉ． ４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とするＨＬＡ－Ｃ０８重鎖の細胞外ドメイン；又はＨＬＡ－Ｃ０８重鎖の細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体と；
ｉｉ． 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｂ． β２ｍポリペプチド、
を含み、
特にここでＨＬＡ融合タンパク質は、ポリペプチド配列番号０１０を含み、より特にＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号０１０の配列からなる。
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉ． ４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とするＨＬＡ－Ｃ０８重鎖の細胞外ドメイン；又はＨＬＡ－Ｃ０８重鎖の細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体と；
ｉｉ． 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｂ． β２ｍポリペプチド、
を含み、
特にここでＨＬＡ融合タンパク質は、ポリペプチド配列番号０１０を含み、より特にＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号０１０の配列からなる。
【0057】
本発明による医薬組成物の別の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質は、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とするＨＬＡ－Ｂ５８：０１重鎖の細胞外ドメインを含み、これは本発明者らがこの重鎖ドメインが良好な発現資質を有することを発見したためである。
【0058】
がんの治療に使用するための医薬組成物のさらなる実施形態では、前記組成物は、以下を含む：
ａ．ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉ． ４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とするＨＬＡ－Ｂ５８重鎖の細胞外ドメイン；又はＨＬＡ－Ｂ５８重鎖の細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体と；
ｉｉ． 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｂ． β２ｍポリペプチド、
を含み、
特にここで、ＨＬＡ融合タンパク質はポリペプチド配列番号００９を含み、より特にＨＬＡ融合タンパク質は配列番号００９の配列からなる。本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、変異型ＨＬＡ重鎖細胞外ドメインポリペプチドを含む。前記変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ重鎖の非変異型細胞外ドメインに対して少なくとも（≧）９５％の（タンパク質レベルにおける）配列類似性、及びＨＬＡ融合タンパク質において本来の配列と比較して類似の生物学的活性を有することを特徴とする。特定の実施形態において、変異型ＨＬＡ重鎖は、ＨＬＡ融合タンパク質において本来の配列と比較して類似の生物学的活性を有すると同時に、由来する天然に存在するＨＬＡ重鎖細胞外ドメインと９８％以上類似している。
ａ．ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉ． ４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とするＨＬＡ－Ｂ５８重鎖の細胞外ドメイン；又はＨＬＡ－Ｂ５８重鎖の細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体と；
ｉｉ． 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｂ． β２ｍポリペプチド、
を含み、
特にここで、ＨＬＡ融合タンパク質はポリペプチド配列番号００９を含み、より特にＨＬＡ融合タンパク質は配列番号００９の配列からなる。本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、変異型ＨＬＡ重鎖細胞外ドメインポリペプチドを含む。前記変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ重鎖の非変異型細胞外ドメインに対して少なくとも（≧）９５％の（タンパク質レベルにおける）配列類似性、及びＨＬＡ融合タンパク質において本来の配列と比較して類似の生物学的活性を有することを特徴とする。特定の実施形態において、変異型ＨＬＡ重鎖は、ＨＬＡ融合タンパク質において本来の配列と比較して類似の生物学的活性を有すると同時に、由来する天然に存在するＨＬＡ重鎖細胞外ドメインと９８％以上類似している。
【0059】
「類似の生物学的活性」とは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）で測定した場合、等価な非変異体構造と比較して、変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチドＨＬＡ融合タンパク質がＬＩＬＲＢ２に結合する能力の少なくとも６５％、又は特に８５％、又は１００％と定義される。生物学的活性はＥＣ５０を計算することによって評価することができる。すなわち、半最大応答を与える融合タンパク質の濃度であり、この場合はビオチン化ＬＩＬＲＢ２分子への最大結合の半分である。例えば、同等の非β２ｍ関連ＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）重鎖融合タンパク質のＥＣ５０は、それぞれ２１ｎＭ及び８．３ｎＭであることが示され、変異体の生物学的機能が野生型配列の生物学的機能を上回ることが示された（図３Ａ）。
【0060】
本発明に係るＥＣ５０を決定するために、ストレプトアビジンでコーティングした高結合能９６ウェルプレートに、ＰＢＳバッファー中で最終濃度が５μｇ／ｍｌであるｃ末端ビオチン化ＬＩＬＲＢ２（例えば、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１００３３５から入手）５０μｌでコーティングする。陰性コントロールとしてＰＢＳ及びＩｇＧアイソタイプを使用することができる。ＨＬＡ融合タンパク質の連続希釈を漸増連続で行う（例えば、８つの濃度ポイント：１０、２．５、１、０．２５、０．１、０．０２５、０．０１、０．００２５μｇ／ｍｌ）、好ましくは５０ｕｌの繰り返し（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で適用する。次いで、融合タンパク質を検出できる標識抗体（例えば、ＡＰＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－１３５－０９８、ＴＢＳ ５０μｌ中１：１００希釈）を適用して、ＨＬＡ融合タンパク質の結合とバックグラウンドとを検出することができ、かつ蛍光の励起と発光とを適切な波長（例えば、６５０ｎｍと６６０ｎｍ）で測定することができる。ＥＬＩＳＡによりＬＩＬＲＢ２に結合するＨＬＡ融合タンパク質のＥＣ５０を決定するには、３種のパラメータに基づくｌｏｇ（アゴニスト）モデルが一つの適切な手段である。
【0061】
本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、天然に存在するＨＬＡ重鎖細胞外ドメインポリペプチドのポリペプチド配列と異なる少なくとも１個、又は２個の特定のアミノ酸置換を特徴とする、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖細胞外ドメインポリペプチドを含む。ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖遺伝子ファミリーは、現在、２２１個の既知の変異体を包含し、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１～ＨＬＡ－Ｂ＊５７：１４１で番号付けした特有の核酸配列を有し、数十の特有のタンパク質配列をコードする。該タンパク質配列は既知であり、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｄａｔａｂａｓｅ，（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｊ．ら，２０１３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４１：Ｄ１２３４，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ａｌｌｅｌｅ．ｈｔｍｌ）が提供するＭＧＴ／ＨＬＡ Ａｌｌｅｌｅ Ｑｕｅｒｙ Ｆｏｒｍに検索語「Ｂ＊５７」を入力することで検索することができる。より特定の実施形態において、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチド配列の天然に存在する細胞外ドメインの変異体であり、この変異体ＨＬＡ重鎖ポリペプチドが４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とするように、１個又は２個のアミノ酸置換が行われている。すなわち、Ｅ以外のアミノ酸が４６位のＥで置換され、及び／又はＲ以外のアミノ酸が９７位のＲで置換されている。これらのアミノ酸の番号付けは、分泌シグナルを欠く分泌型ＨＬＡ－Ｂ５７部分の細胞外ドメインを開始するＧ、Ｓ、Ｈモチーフ（又は同等のモチーフ、例えばＨＬＡ－Ｃ０８ポリペプチドではＣ、Ｓ、Ｈ）から始まる整数を１、２、３と順次割り当てることを意味する。本発明者らは、これらのアミノ酸置換が、野生型配列と比較して得られる変異型ベースのＨＬＡ融合タンパク質の収率が高く（図１及び図２）、ＬＩＬＲＢ２結合プロファイルが良好であることと相関することを見出した。
【0062】
本発明に係る使用のための医薬組成物のより特定の実施形態において、本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖細胞外ポリペプチド部分は、配列番号００１と指定される変異体ＨＬＡ－Ｂ５７配列を含む。さらにより特定の実施形態では、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、配列番号００１と指定される配列から本質的になる。
【0063】
本発明に係る医薬組成物の別の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質は、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とするＨＬＡ－Ａ３０：０１重鎖の細胞外ドメインの変異体を含む。これは本発明者らがこの重鎖が良好な発現資質を持つことを発見したためである。
【0064】
がんの治療に使用するための医薬組成物のさらなる実施形態では、前記組成物は、以下を含む：
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉｉｉ． ４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とするＨＬＡ－Ａ３０重鎖の細胞外ドメイン；又はＨＬＡ－Ａ３０重鎖の細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体と；
ｉｖ． 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｂ． β２ｍポリペプチド、
を含み、
特にここでＨＬＡ融合タンパク質は、ポリペプチド配列番号０１２を含み、より特にＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号０１２の配列からなる。
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉｉｉ． ４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とするＨＬＡ－Ａ３０重鎖の細胞外ドメイン；又はＨＬＡ－Ａ３０重鎖の細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体と；
ｉｖ． 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｂ． β２ｍポリペプチド、
を含み、
特にここでＨＬＡ融合タンパク質は、ポリペプチド配列番号０１２を含み、より特にＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号０１２の配列からなる。
【0065】
本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡ重鎖ポリペプチド及びＩｇ Ｆｃポリペプチドは、ペプチドリンカーによって結合される。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、５～２０のアミノ酸長である。より特定の実施形態において、この結合化ペプチドリンカーは、配列番号００３の配列を有する。
【0066】
本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００５と指定される配列を有するポリペプチドを含み、かつβ２ｍポリペプチドと会合している。他の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００５の配列の上流に分泌シグナルをさらに含む。特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質ポリペプチドの上流の分泌シグナルは配列番号００４である。他の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００４の分泌シグナルが配列番号００５と指定されるポリペプチドに結合したものから本質的になる。本発明に係る使用のための医薬組成物のより特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、本質的に配列番号００５と指定される配列（ＩｇＧ４ Ｆｃに融合したＨＬＡ－Ｂ５７の変異型細胞外ドメインを含むもの）からなり、かつβ２ｍポリペプチドと会合している。
【0067】
本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質と会合しているβ２ｍポリペプチドは、配列番号００６と指定される配列を有する。
【0068】
本発明に係る使用のための医薬組成物の別の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、単一の異なるアミノ酸残基（ここで、単一の異なるアミノ酸残基は、４６位又は９７位ではない）を除いて、配列番号００１と同一のＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドを含む。換言すれば、４６位及び／又は９７位の１個、場合によっては２個のアミノ酸置換に加えて、本実施形態による組換えＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、それが由来する天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７分子と比較して、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含む。
【0069】
ペプチドの安定化と連結
本発明に係る使用のための医薬組成物のＨＬＡ融合部分は、発現及び精製の間の安定性を付与する安定化ポリペプチドを含む。ＨＬＡ融合タンパク質の安定化部分の存在は、ＨＬＡ融合タンパク質の分解とオリゴマー化とを減少させることにより、収量及び溶解度を増加させ、さらに融合タンパク質を発現する細胞の生存率の改善に関連している。
本発明に係る使用のための医薬組成物のＨＬＡ融合部分は、発現及び精製の間の安定性を付与する安定化ポリペプチドを含む。ＨＬＡ融合タンパク質の安定化部分の存在は、ＨＬＡ融合タンパク質の分解とオリゴマー化とを減少させることにより、収量及び溶解度を増加させ、さらに融合タンパク質を発現する細胞の生存率の改善に関連している。
【0070】
本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質の安定化ポリペプチドは、ヒトＩｇ Ｆｃポリペプチドである。また、Ｉｇ Ｆｃ部分は、リサイクルレセプターに結合することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長する可能性がある。本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、安定化ポリペプチドはアイソタイプＩｇＧ Ｆｃである。ＩｇＧ Ｆｃ安定化ペプチドドメインは、ＨＬＡ融合タンパク質の精製時にさらなる利点をもたらし、プロテインＡ又はＧでコーティングした表面への吸収を可能にする。本発明者らは、Ｉｇ Ｆｃの代わりに機能性ＨＬＡポリペプチドに結合させれば、同様の利点をもたらす可能性のある代替物はウシ血清アルブミンであり得ると考えている。本発明者らのこれまでの研究により、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン分子もまた安定化ポリペプチドとして機能し得ることが確立されている。ＰＥＧ化は循環中のタンパク質の半減期を延長することができ、本発明による安定化ポリペプチドとしてうまく機能する可能性があることも知られている。
【0071】
本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、低い細胞毒性のために治療的融合タンパク質の望ましいアイソタイプであるＩｇＧ４ポリペプチドを含む。本発明に係る使用のための医薬組成物のさらに特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００２の配列を有する改変ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ．ｄｋ分子を含む。これはＩｇＧ４のヒンジ領域の変異を特徴とし、本来のＩｇＧ４抗体の２２８位のプロリン（Ｐ）がセリン（Ｓ）に置換されており、及びｄＫは本来のＩｇＧ４配列上の最後のアミノ酸であるリジン（Ｋ）の欠失を示す。これらの変更により、ＩｇＧ４フォーマットは安定化し、異種性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が少なくなる。どちらの変化もよく確立されており、及び多様なＦｃ構築物において一般的に使用される。
【0072】
本発明に係る使用のための医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、ペプチドリンカー（長さが５、１０、１５、又は２０残基のアミノ酸の短い配列）によって単一のポリペプチド鎖の一部としてＩｇＧポリペプチドと結合されたＨＬＡポリペプチドを含む。
【0073】
特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、セリン残基及びグリシン残基に富む配列などの非免疫原性配列である。より特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号００３の配列を有する。
【0074】
がんの治療に使用するための医薬組成物の特定の実施形態では、それは二量体の形式である。前記二量体は、第１の単量体と第２の単量体とを含み、及び各単量体は、他の単量体とは独立に、ＨＬＡ融合タンパク質、Ｉｇ Ｆｃ部分に融合したＨＬＡ重鎖細胞外ドメインポリペプチドを含み、後者はジスルフィド結合を介して会合し得る。本発明に係る各単量体は、Ｂ２ｍポリペプチドとさらに会合している。
【0075】
ヒト細胞の小胞体で発現する天然ＨＬＡ分子は、細胞表面への輸送及び表示を受ける前に、ペプチドエピトープと会合する。本発明に係る医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡポリペプチドは、ペプチドエピトープと会合しない。すなわち、ＨＬＡポリペプチドのアルファ１ドメイン及びアルファ２ドメインによって形成される抗原結合溝、又は抗原結合クレフトには、小さな抗原性ペプチドは結合しない。ペプチドがＨＬＡクラス分子に結合すると、そのコンフォメーションが変化し、ＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２といった結合パートナーとの相互作用に影響を及ぼす可能性があると考えられている。本発明に係るＢ２ｍポリペプチドに会合し、さらにペプチドエピトープに結合していない、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの結合親和性及び免疫調節効果は、実施例の図３～図１１に示される。
【0076】
ＨＬＡ融合タンパク質医薬組成物の用量及び用法
本発明に係る悪性新生物疾患の治療に使用するための医薬組成物は、Ｂ２ｍポリペプチドに会合しているＨＬＡ融合タンパク質を含み、典型的には、薬剤の制御が容易な投与量を提供し、患者に洗練された取り扱いが容易な製品を与えるために、医薬剤形に製剤化される。前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。さらなる実施形態において、本組成物は、本明細書に記載されるような少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。
本発明に係る悪性新生物疾患の治療に使用するための医薬組成物は、Ｂ２ｍポリペプチドに会合しているＨＬＡ融合タンパク質を含み、典型的には、薬剤の制御が容易な投与量を提供し、患者に洗練された取り扱いが容易な製品を与えるために、医薬剤形に製剤化される。前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。さらなる実施形態において、本組成物は、本明細書に記載されるような少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。
【0077】
本発明の医薬品組成物の投与レジメンは、特定の薬剤の薬力学的特性及びその投与様式及び投与経路；レシピエントの種、年齢、性別、健康状態、病状、及び体重；症状の性質及び程度；同時治療の種類；治療の頻度；投与経路、患者の腎機能及び肝機能、並びに所望の効果などの既知の因子によって変化する。特定の実施形態において、本発明の医薬品組成物は、１日１回投与してもよいし、１日の総投与量を１日に２回、３回、又は４回の用量に分けて投与してもよい。
【0078】
医薬組成物を調製するための多くの手順及び方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎら，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第４編，２０１３（ＩＳＢＮ ８１２３９２２８９２）を参照されたい。
【0079】
併用医薬
本発明の別の態様は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与するために製剤化された医薬組成物（本発明の第１の態様によるＨＬＡ融合タンパク質：Ｂ２ｍポリペプチド複合体を含む）である。
本発明の別の態様は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与するために製剤化された医薬組成物（本発明の第１の態様によるＨＬＡ融合タンパク質：Ｂ２ｍポリペプチド複合体を含む）である。
【0080】
本発明の別の態様は、本発明の第１の態様によるＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物と組み合わせて投与するために製剤化される、悪性新生物疾患の治療に使用するためのチェックポイント阻害剤である。
【0081】
本発明に係る医薬組成物、又はチェックポイント阻害剤の特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、免疫細胞の活性化、及び特にＴ細胞の活性化、を制限する阻害性シグナル伝達カスケードを破壊することができる。特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、１０－７ｍｏｌ／Ｌ以下の解離定数でＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のいずれかに結合可能な抗体断片、又は抗体様分子である。
【0082】
特に、チェックポイント阻害剤は、非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンド、非アゴニストＰＤ－１リガンド、非アゴニストＰＤ－Ｌ１リガンド、又は非アゴニストＰＤ－Ｌ２リガンドであり、これらはＴ細胞表面のＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２にそれぞれ結合する場合にＴ細胞の活性の減衰をもたらさない。特定の実施形態において、「非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンド」又は「非アゴニストＰＤ－１リガンド」という用語は、ＣＴＬＡ－４又はＰＤ－１のアンタゴニストと、ＣＴＬＡ－４又はＰＤ－１のシグナル伝達に対して中立であるリガンドの両方を含む。いくつかの実施形態において、本発明で使用される非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドは、ＣＴＬＡ－４に結合した場合に、ＣＴＬＡ－４とその結合パートナーであるＣＤ８０及び／又はＣＤ８６との相互作用を立体的にブロックすることができ、本発明で使用される非アゴニストＰＤ－１リガンドは、ＰＤ－１に結合した場合に、ＰＤ－１とその結合パートナーであるＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２との相互作用を立体的にブロックすることができる。
【0083】
特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、少なくとも、ＫＤ値１０－７ｍｏｌ／Ｌで表されるように少なくとも親和性を示す解離定数でＣＴＬＡ－４に結合する能力、又は少なくとも１０－８ｍｏｌ／Ｌ、さらには１０－９ｍｏｌ／ＬのＫＤ値を特徴とするより強い結合能力、を介して阻害性シグナル伝達カスケードを破壊し、その結果、それぞれの標的の生物学的活性を阻害する。本発明の意味における非アゴニストＰＤ－１リガンド又は非アゴニストＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－Ｌ２）リガンドとは、少なくとも１０－７ｍｏｌ／Ｌ、特に１０－８ｍｏｌ／Ｌ又はさらには１０－９ｍｏｌ／Ｌ以下の解離定数でＰＤ－１（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２）に結合することができ、それぞれの標的の生物学的活性を阻害する分子を指す。
【0084】
さらに特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、臨床的に利用可能な抗体薬であるイピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；ＣＡＳ番号４７７２０２－００－９）、トレメリムマブ（ＣＡＳ７４５０１３－５９－６）、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；ＣＡＳ番号９４６４１４－９４－４）、ピディリズマブ（ＣＡＳ番号１０３６７３０－４２－３）、アテゾリズマブ（Ｒｏｃｈｅ ＡＧ；ＣＡＳ番号１３８０７２３－４４－３）、アベルマブ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ；ＣＡＳ番号１５３７０３２－８２－８）、デュルバルマブ（Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ、ＣＡＳ番号１４２８９３５－６０－７）、及びセミプリマブ（Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ；ＣＡＳ番号１８０１３４２－６０－８）から選択されるチェックポイント阻害抗体である。さらにより特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤はペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｃ；ＣＡＳ番号１３７４８５３－９１－４）である。
【0085】
チェックポイント阻害剤の形式に関する抗体断片は、抗体のＦａｂドメイン又は可変断片（Ｆｖ）ドメインであってもよく、又はペプチドリンカーで連結した抗体の軽鎖と重鎖との可変領域からなる融合タンパク質である一本鎖抗体断片であってもよい。チェックポイント阻害抗体はまた、重鎖又は軽鎖からの単離された可変ドメインからなる、単一ドメイン抗体であってもよい。さらに、抗体は、ラクダ科動物に見られる抗体のように、重鎖のみからなる重鎖抗体であってもよい。抗体様分子は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、チューリッヒ）などのリピートタンパク質であってもよい。
【0086】
特定の実施形態において、併用療法は、２種の異なる剤形を含み、例えば、ＨＬＡ融合タンパク質を含む前記医薬組成物が、例えば固形腫瘍への皮下注入又は腫瘍内注入による、腫瘍内送達又は腫瘍近傍の局所送達のための剤形として提供され、前記チェックポイント阻害剤が、特に静脈注入による、全身送達のための剤形として提供される。しかしながら、前記チェックポイント阻害剤及びＨＬＡ融合タンパク質を含む前記医薬組成物は、２種の類似の剤形で送達することもできる。
【0087】
併用投与とは、チェックポイント阻害剤とＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物とを両方同時に投与すること、あるいは別々の製剤で投与すること、あるいは第１の物質を、例えば、第２の物質の投与前１週間、あるいは少なくとも投与前１ヶ月、あるいは直後、例えば、第２の物質の投与後１週間、あるいは多くても投与後１ヶ月に投与することを包含する。
【0088】
医療、剤形、製造方法
本発明に係る使用のための医薬組成物は、様々な形態のがんの治療に使用するために提供される。他の形態のＬＩＬＢＲ２指向性抗新生物療法（本発明に係る医薬組成物が作用すると予測される複数の機序の１つ）に関する前臨床研究では、腎がん及び卵巣がんにおける有効性が実証されている。ＬＩＬＲＢ２標的抗体ＭＫ－４８３０の安全性及び忍容性は、現在、幅広い固形臓器がん（中皮腫、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、肺がん、神経膠芽腫、膵臓がん、胃がん）を対象とする臨床試験において、化学療法との併用において調査中であり（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０３５６４６９１）、本発明者らは、これらすべてのがんが、本発明に係る医薬組成物によってうまく効果的に治療される可能性があると考える。
本発明に係る使用のための医薬組成物は、様々な形態のがんの治療に使用するために提供される。他の形態のＬＩＬＢＲ２指向性抗新生物療法（本発明に係る医薬組成物が作用すると予測される複数の機序の１つ）に関する前臨床研究では、腎がん及び卵巣がんにおける有効性が実証されている。ＬＩＬＲＢ２標的抗体ＭＫ－４８３０の安全性及び忍容性は、現在、幅広い固形臓器がん（中皮腫、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、肺がん、神経膠芽腫、膵臓がん、胃がん）を対象とする臨床試験において、化学療法との併用において調査中であり（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０３５６４６９１）、本発明者らは、これらすべてのがんが、本発明に係る医薬組成物によってうまく効果的に治療される可能性があると考える。
【0089】
ＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物の特定の実施形態では、液状がん、血液がんの一種を治療するのに使用するために提供される。本発明者らは、本発明に係る医薬組成物によって誘導される特徴的なＴ細胞の排出、及び血液がん細胞をＴ細胞へ循環するアクセス性、及びマクロファージの活性化は、治療が有効である可能性が高いことを意味すると考えている。特にそのような実施形態では、医薬組成物は、Ｔ細胞白血病と診断された患者に使用するために提供される。他の特定の実施形態において、医薬組成物は、実施例においてＤａｕｄｉ細胞によってモデル化されたバーキットリンパ腫を含むがこれらに限定されない、リンパ腫と診断された患者における使用のために提供される。さらなる実施形態において、医薬組成物は、ＲＰＭＩ－８２２６細胞株（図４）によってモデル化されるとおり、多発性骨髄腫と診断された患者に使用するために提供される。
【0090】
他の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物は、固形がん、又は固形がんの転移と診断された患者に使用するために提供される。いくつかの特定の実施形態において、医薬組成物は、肺がんと診断された患者に使用するためのものである。特定の実施形態では、肺がんは非小細胞肺がんの一形態である。他の特定の実施形態では、肺がんは小細胞肺がん又はがん腫の一形態である。他の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物は、乳がんの一形態と診断された患者に使用するためのものである。より特定の実施形態では、がんはエストロゲンレセプター陽性である。他の特定の実施形態では、がんはプロゲステロンレセプター陽性である。他の特定の実施形態では、がんはヒト上皮成長因子レセプター２陽性である。
【0091】
いくつかの特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質、又は免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物は、結腸がんと診断された患者に使用するためのものである。特定の実施形態では、転移性結腸がんである。
【0092】
チェックポイント阻害剤と組み合わせた本発明に係る医薬組成物の投与に関する本発明の態様のいくつかの実施形態では、チェックポイント阻害療法が単剤療法、又は併用療法として承認されている悪性疾患、又はがんの一形態における使用のために提供される。特定の実施形態において、併用治療は結腸がん、特に転移性結腸がんの患者に使用するためのものである。他の特定の実施形態では、がんは黒色腫である。さらに特定の実施形態では、がんは膵臓がんである。さらに特定の実施形態では、がんは乳がんである。
【0093】
同様に本発明の範囲内にあるのは、がん患者を治療する方法であって、本発明に係るＢ２ｍポリペプチドに会合しているＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物を、任意にチェックポイント阻害剤と組み合わせて、患者に投与することを含む方法である。本発明は、さらに別の態様として、がんの治療又は予防のための医薬の製造方法において使用するための、上記で詳細に規定したＨＬＡ融合タンパク質及びβ－２－ミクログロブリンを含む医薬組成物の使用をさらに包含する。
【0094】
剤形は、皮下注射、静脈注射、肝内注射、筋肉内注射などの非経口投与であってもよい。任意に、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。
【0095】
本明細書において、１つの分離可能な特徴の代替形態が「実施形態」として記載されている場合、そのような代替形態は自由に組み合わせて、本明細書に開示される本発明の個別の実施形態を形成することができると理解されるものとする。
【0096】
本発明は、以下の項目によってさらに説明される：
【0097】
項目Ａ． 悪性新生物疾患の治療に使用するためのＨＬＡ融合タンパク質であって、前記ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｉ． 天然に存在するＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチド、又は変異型ＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチドであって、
天然に存在するＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチドのポリペプチド配列と、１個又は２個以下のアミノ酸置換によって異なる、前記変異型ＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチド；及び
ｉｉ． Ｉｇ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド；
を含み、かつ
ここで、ＨＬＡ融合タンパク質はβ２ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）ポリペプチドと会合している、
前記ＨＬＡ融合タンパク質。
ｉ． 天然に存在するＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチド、又は変異型ＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチドであって、
天然に存在するＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチドのポリペプチド配列と、１個又は２個以下のアミノ酸置換によって異なる、前記変異型ＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチド；及び
ｉｉ． Ｉｇ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド；
を含み、かつ
ここで、ＨＬＡ融合タンパク質はβ２ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）ポリペプチドと会合している、
前記ＨＬＡ融合タンパク質。
【0098】
項目Ｂ． 天然に存在するＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチドは、Ｂ５７、Ｃ０８、Ａ２５、Ｂ５８、Ｂ２７、Ａ３０、Ｂ５３、又はＣ１２から選択されるＨＬＡ重鎖からのＭＨＣクラスＩａ重鎖ポリペプチドの細胞外ドメインである、項目Ａに記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質。
【0099】
項目Ｃ． 変異型ＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの天然に存在する細胞外ドメインの変異体であり、
かつ変異型ＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチドは、４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とする、項目Ａ又はＢに記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質。
かつ変異型ＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチドは、４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とする、項目Ａ又はＢに記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質。
【0100】
項目Ｄ． 組換えＭＨＣクラス１ａ重鎖ポリペプチドは、配列番号００１の配列を含む、又はそれから本質的になる、項目Ａ～Ｃのいずれか１項に記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質。
【0101】
項目Ｅ．
ａ． 項目Ａ～Ｄのいずれか１項に規定される変異型ＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチド、又は天然に存在するＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチド、
ｂ． ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、より特に配列番号００２の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、
ｃ． 組換えＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドをＩｇ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー、
を含む、項目Ａ～Ｄのいずれか１項に記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質であって、かつ
任意に、ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｄ． 分泌シグナル、特に１６～３０アミノ酸長であり、より特に分泌シグナルが細胞から分泌される過程の間に切断により除去される分泌シグナル、さらにより特に配列番号００４の配列を有する分泌シグナル、
をさらに含む、
前記ＨＬＡ融合タンパク質。
ａ． 項目Ａ～Ｄのいずれか１項に規定される変異型ＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチド、又は天然に存在するＭＨＣクラス１ａ重鎖細胞外ドメインポリペプチド、
ｂ． ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、より特に配列番号００２の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、
ｃ． 組換えＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドをＩｇ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー、
を含む、項目Ａ～Ｄのいずれか１項に記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質であって、かつ
任意に、ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｄ． 分泌シグナル、特に１６～３０アミノ酸長であり、より特に分泌シグナルが細胞から分泌される過程の間に切断により除去される分泌シグナル、さらにより特に配列番号００４の配列を有する分泌シグナル、
をさらに含む、
前記ＨＬＡ融合タンパク質。
【0102】
項目Ｆ． ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００５と指定される配列を含む、又はそれから本質的になる、項目Ａ～Ｅのいずれか１項に記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質。
【0103】
項目Ｇ． ＨＬＡ融合タンパク質は、Ｂ２ｍポリペプチドと、３：５～７：５の比、より特に４：５～６：５の比で、非共有結合的に会合している、項目Ａ～Ｆのいずれか１項に記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質。
【0104】
項目Ｈ． 前記ＨＬＡは、第１のＨＬＡ単量体及び第２のＨＬＡ単量体を含む二量体の形態であり、
前記第１のＨＬＡ融合タンパク質単量体は、本質的に、第１のＢ２ｍポリペプチドと会合している、項目Ａ～Ｇのいずれか１項に規定される第１のＨＬＡ融合タンパク質からなり；かつ
前記第２のＨＬＡ融合タンパク質単量体は、本質的に、第２のＢ２ｍポリペプチドと会合している、項目Ａ～Ｇのいずれか１項に規定される第２のＨＬＡ融合タンパク質からなり、かつ
特に、第１のＨＬＡ単量体と第２のＨＬＡ単量体とが同一である、
項目Ａ～Ｇのいずれか１項に記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質。
前記第１のＨＬＡ融合タンパク質単量体は、本質的に、第１のＢ２ｍポリペプチドと会合している、項目Ａ～Ｇのいずれか１項に規定される第１のＨＬＡ融合タンパク質からなり；かつ
前記第２のＨＬＡ融合タンパク質単量体は、本質的に、第２のＢ２ｍポリペプチドと会合している、項目Ａ～Ｇのいずれか１項に規定される第２のＨＬＡ融合タンパク質からなり、かつ
特に、第１のＨＬＡ単量体と第２のＨＬＡ単量体とが同一である、
項目Ａ～Ｇのいずれか１項に記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質。
【0105】
項目Ｉ． 前記ＨＬＡは、ペプチドエピトープと会合していない、項目Ａ～Ｇのいずれか１項に記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質。
【0106】
項目Ｊ． 項目Ａ～Ｉのいずれか１項に記載のＨＬＡ融合タンパク質を含む、医薬組成物であって、
特に、ＨＬＡ融合タンパク質は、Ｂ２ｍポリペプチドと３：５～７：５の比、より特に４：５～６：５の比で非共有結合的に会合している、前記医薬組成物。
特に、ＨＬＡ融合タンパク質は、Ｂ２ｍポリペプチドと３：５～７：５の比、より特に４：５～６：５の比で非共有結合的に会合している、前記医薬組成物。
【0107】
項目Ｋ． 悪性新生物疾患の治療における使用のための、項目Ｊに記載のＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物。
【0108】
項目Ｌ．
－ 医薬組成物は、チェックポイント阻害剤と、特に抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択されるチェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与され、
－ 特に前記チェックポイント阻害抗体は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のうちの１つと少なくとも１０－７Ｍ－１の解離定数で結合することができ、かつ
－ 前記チェックポイント阻害抗体は、全身投与用の剤形で提供される、
項目Ｋに記載の使用のための医薬組成物。
－ 医薬組成物は、チェックポイント阻害剤と、特に抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択されるチェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与され、
－ 特に前記チェックポイント阻害抗体は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のうちの１つと少なくとも１０－７Ｍ－１の解離定数で結合することができ、かつ
－ 前記チェックポイント阻害抗体は、全身投与用の剤形で提供される、
項目Ｋに記載の使用のための医薬組成物。
【0109】
項目Ｍ． 悪性新生物疾患の治療に使用するチェックポイント阻害剤であって、
－ チェックポイント阻害剤は、項目Ａ～Ｉのいずれか１項に記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質、又は項目Ｊ～Ｌのいずれか１項に記載の医薬組成物と組み合わせて投与され、
－ 前記チェックポイント阻害抗体は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のうちの１つと１０－７Ｍ以下の解離定数で結合可能であり、
－ 前記チェックポイント阻害抗体は、全身投与用の剤形で提供され、かつ
－ 特にチェックポイント阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択される、
前記チェックポイント阻害剤。
－ チェックポイント阻害剤は、項目Ａ～Ｉのいずれか１項に記載の使用のためのＨＬＡ融合タンパク質、又は項目Ｊ～Ｌのいずれか１項に記載の医薬組成物と組み合わせて投与され、
－ 前記チェックポイント阻害抗体は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のうちの１つと１０－７Ｍ以下の解離定数で結合可能であり、
－ 前記チェックポイント阻害抗体は、全身投与用の剤形で提供され、かつ
－ 特にチェックポイント阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択される、
前記チェックポイント阻害剤。
【0110】
項目Ｎ． 悪性新生物疾患の治療に使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は：
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉ． ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドであって：
・ ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン、特にＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３、又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン；又は
・ ＨＬＡ重鎖の前記細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体；
から選択される、前記ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドと；
ｉｉ．免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｂ． ベータ２ミクログロブリン（β２ｍ）ポリペプチド、
を含む、前記医薬組成物。
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉ． ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドであって：
・ ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン、特にＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３、又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖の細胞外ドメイン；又は
・ ＨＬＡ重鎖の前記細胞外ドメインの変異体であって、前記変異体は、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記変異体；
から選択される、前記ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドと；
ｉｉ．免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｂ． ベータ２ミクログロブリン（β２ｍ）ポリペプチド、
を含む、前記医薬組成物。
【0111】
項目Ｏ． ＨＬＡ融合タンパク質は、β２ｍポリペプチドと非共有結合的に会合している、項目Ｎに記載の使用のための医薬組成物。
【0112】
項目Ｐ． ＨＬＡ融合タンパク質は、β２ｍポリペプチドと３：５～７：５の比、特に４：５～６：５の比、より特には約１の比で、非共有結合的に会合している、項目Ｎ又はＯに記載の使用のための医薬組成物。
【0113】
項目Ｑ． ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｂ５７の細胞外ドメインの変異体であり、かつ
ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とする、項目Ｎ～Ｐのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物、
ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とする、項目Ｎ～Ｐのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物、
【0114】
項目Ｒ． ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、配列番号００１の配列を含む、又は本質的にそれからなる、項目Ｎ～Ｑのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【0115】
項目Ｓ． ＨＬＡ融合タンパク質は：
ａ． 項目Ｎ～Ｒのいずれか１項で特定されるＨＬＡ重鎖ポリペプチド；
ｂ． ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆポリペプチド、より特に配列番号００２の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド；及び／又は
ｃ． ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー；
を含み、かつ
任意に、ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｄ． 分泌シグナル、特に１６～３０アミノ酸長である分泌シグナル、より特に分泌シグナルが細胞から分泌される過程の間で切断により除去される分泌シグナル、さらにより特に配列番号００４の配列を有する分泌シグナル、
をさらに含む、
項目Ｎ～Ｒのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
ａ． 項目Ｎ～Ｒのいずれか１項で特定されるＨＬＡ重鎖ポリペプチド；
ｂ． ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆポリペプチド、より特に配列番号００２の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド；及び／又は
ｃ． ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー；
を含み、かつ
任意に、ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｄ． 分泌シグナル、特に１６～３０アミノ酸長である分泌シグナル、より特に分泌シグナルが細胞から分泌される過程の間で切断により除去される分泌シグナル、さらにより特に配列番号００４の配列を有する分泌シグナル、
をさらに含む、
項目Ｎ～Ｒのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【0116】
項目Ｔ． ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに対してＮ末端に位置する、項目Ｎ～Ｓのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【0117】
項目Ｕ． ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００５と指定される配列を含む、又は本質的にそれからなる、項目Ｎ～Ｔのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【0118】
項目Ｖ． ＨＬＡ融合タンパク質は、二量体の形態であり、前記二量体は、第１のＨＬＡ単量体及び第２のＨＬＡ単量体を含む、又は本質的にそれからなり；
－ 第１のＨＬＡ単量体は、項目Ｎ～Ｕのいずれか１項に規定される第１のＨＬＡ融合タンパク質、及び第１のβ２ｍポリペプチドから本質的になり；かつ
－ 第２のＨＬＡ単量体は、項目Ｎ～Ｕのいずれか１項に規定される第２のＨＬＡ融合タンパク質、及び第２のＢ２ｍポリペプチドから本質的になり；
特に、第１のＨＬＡ単量体と第２のＨＬＡ単量体とが同一である、
項目Ｎ～Ｕのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
－ 第１のＨＬＡ単量体は、項目Ｎ～Ｕのいずれか１項に規定される第１のＨＬＡ融合タンパク質、及び第１のβ２ｍポリペプチドから本質的になり；かつ
－ 第２のＨＬＡ単量体は、項目Ｎ～Ｕのいずれか１項に規定される第２のＨＬＡ融合タンパク質、及び第２のＢ２ｍポリペプチドから本質的になり；
特に、第１のＨＬＡ単量体と第２のＨＬＡ単量体とが同一である、
項目Ｎ～Ｕのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【0119】
項目Ｗ． ＨＬＡ融合タンパク質は、ペプチドエピトープと会合していない、項目Ｎ～Ｖのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【0120】
項目Ｘ．
医薬組成物は、チェックポイント阻害剤の前に、それと組み合わせて、又はその後に投与される、項目Ｎ～Ｗのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
医薬組成物は、チェックポイント阻害剤の前に、それと組み合わせて、又はその後に投与される、項目Ｎ～Ｗのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【0121】
項目Ｙ． 悪性新生物疾患の治療における使用のためのチェックポイント阻害剤であって、チェックポイント阻害剤は、項目Ｎ～Ｘのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物の前に、それと組み合わせて、又はその後に投与される、前記チェックポイント阻害剤。
【0122】
項目Ｚ． 前記チェックポイント阻害剤は、少なくとも１０－７ｍｏｌ／Ｌの解離定数で、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のうちの１つに結合することが可能であり、特に、前記チェックポイント阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択される、項目Ｎ～Ｘのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物、又は項目Ｙに記載の使用のためのチェックポイント阻害剤。
【0123】
項目ＡＡ． 前記チェックポイント阻害剤は、全身送達に適した剤形で提供される、項目Ｘ若しくはＺのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物、又は項目Ｙ若しくはＺに記載の使用のためのチェックポイント阻害剤。
【0124】
項目ＢＢ．悪性新生物疾患は：
ａ． 血球由来のがん、特にリンパ腫、白血病、骨髄腫から選択される血球由来のがん、又は
ｂ． 固形腫瘍、特に肺細胞由来、乳房細胞由来、又は結腸細胞由来の固形腫瘍、
である、項目Ｎ～Ｘ、Ｚ、又はＡＡのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
ａ． 血球由来のがん、特にリンパ腫、白血病、骨髄腫から選択される血球由来のがん、又は
ｂ． 固形腫瘍、特に肺細胞由来、乳房細胞由来、又は結腸細胞由来の固形腫瘍、
である、項目Ｎ～Ｘ、Ｚ、又はＡＡのいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【0125】
項目ＣＣ．悪性新生物疾患は、結腸がん、乳がん、膵臓がん、又は黒色腫から選択される、項目Ｙ～ＡＡのいずれか１項に記載の使用のためのチェックポイント阻害剤。本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を導き出すことができる。これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
【0126】
本発明はさらに、がん治療への適用において上記に詳細に開示されるとおり、医薬組成物を対象とした以下の項目を包含する：
【0127】
項目１：医薬組成物であって：
ａ．ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉ． ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインから選択されるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドと、
特に、ＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３、又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖と；
ｉｉ． 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｂ． ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）ポリペプチド
を含む、前記医薬組成物。
ａ．ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉ． ＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインから選択されるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドと、
特に、ＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３、又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖と；
ｉｉ． 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｂ． ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）ポリペプチド
を含む、前記医薬組成物。
【0128】
項目１ａ：医薬組成物であって、：
ａ．ＨＬＡ融合タンパク質
ｉ． ＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３、又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインの変異体から選択されるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドであって、前記変異体は、ＨＬＡ重鎖のそれぞれの細胞外ドメインと比較して、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドと；
ｉｉ． 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質：及び
ｂ． ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）ポリペプチド
を含む、前記医薬組成物。
ａ．ＨＬＡ融合タンパク質
ｉ． ＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｃ０８、ＨＬＡ－Ａ２５、ＨＬＡ－Ｂ５８、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５３、又はＨＬＡ－Ｃ１２から選択されるＨＬＡ重鎖の細胞外ドメインの変異体から選択されるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドであって、前記変異体は、ＨＬＡ重鎖のそれぞれの細胞外ドメインと比較して、少なくとも（≧）９５％、特に≧９８％の配列類似性、及び類似の生物学的活性を特徴とする、前記ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）重鎖ポリペプチドと；
ｉｉ． 免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｉｇ Ｆｃ）ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質：及び
ｂ． ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）ポリペプチド
を含む、前記医薬組成物。
【0129】
項目２：ＨＬＡ融合タンパク質はＢ２ｍポリペプチドと非共有結合的に会合している、項目１～２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【0130】
項目３：ＨＬＡ融合タンパク質は、Ｂ２ｍポリペプチドと３：５～７：５の比、特に４：５～６：５の比、より特に約１の比で、非共有結合的に会合している、項目１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【0131】
項目４： ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｂ５７の細胞外ドメインの変異体であり、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とする、項目１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【0132】
項目５： ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、配列番号００１の配列を含む、又は本質的にそれからなる、項目１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【0133】
項目６：ＨＬＡ融合タンパク質は：
ａ．項目 １～５のいずれか１項に規定されるＨＬＡ重鎖ポリペプチド；及び
ｂ． ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆポリペプチド、より特に配列番号００２の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド；及び任意に
ｃ． ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー；
を含み、かつ
任意に、ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｄ． 分泌シグナル、特に１６～３０アミノ酸長である分泌シグナル、より特に分泌シグナルが細胞から分泌される過程の間で切断により除去される分泌シグナル、さらにより特に配列番号００４の配列を有する分泌シグナル、
をさらに含む、
項目１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ａ．項目 １～５のいずれか１項に規定されるＨＬＡ重鎖ポリペプチド；及び
ｂ． ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆポリペプチド、より特に配列番号００２の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド；及び任意に
ｃ． ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー；
を含み、かつ
任意に、ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｄ． 分泌シグナル、特に１６～３０アミノ酸長である分泌シグナル、より特に分泌シグナルが細胞から分泌される過程の間で切断により除去される分泌シグナル、さらにより特に配列番号００４の配列を有する分泌シグナル、
をさらに含む、
項目１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【0134】
項目７：ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに対してＮ末端に位置する、項目１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【0135】
項目８：ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００５と指定される配列を含む、又は本質的にそれからなる、項目１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【0136】
項目９：ＨＬＡ融合タンパク質は二量体の形態であり、前記二量体は、第１のＨＬＡ単量体及び第２のＨＬＡ単量体を含む、又は本質的にそれからなり；
－ 第１のＨＬＡ単量体は、本質的に、項目１～８のいずれか１項に規定される第１のＨＬＡ融合タンパク質、及び第１のＢ２ｍポリペプチドからなり；かつ
－ 第２のＨＬＡ単量体は、本質的に、項目１～８のいずれか１項に規定される第２のＨＬＡ融合タンパク質、及び第２のＢ２ｍポリペプチドからなり；
特に、第１のＨＬＡ単量体と第２のＨＬＡ単量体とが同一である、
項目１～８のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
－ 第１のＨＬＡ単量体は、本質的に、項目１～８のいずれか１項に規定される第１のＨＬＡ融合タンパク質、及び第１のＢ２ｍポリペプチドからなり；かつ
－ 第２のＨＬＡ単量体は、本質的に、項目１～８のいずれか１項に規定される第２のＨＬＡ融合タンパク質、及び第２のＢ２ｍポリペプチドからなり；
特に、第１のＨＬＡ単量体と第２のＨＬＡ単量体とが同一である、
項目１～８のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【0137】
項目１０：前記ＨＬＡ融合タンパク質はペプチドエピトープと会合していない、項目１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【実施例】
【0138】
実施例１：クローンプールの生成
本発明者らは、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１：０１ポリペプチドの重鎖細胞外ドメインをＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド（配列番号００２）に連結して配列番号００８のＨＬＡ融合タンパク質を提供することにより、ヒトに医療的に使用するための最初のＨＬＡ融合タンパク質を開発した。このＨＬＡ融合タンパク質の収率を増加させるために、天然のＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインのアミノ酸配列内で同定された阻害性アミノ酸を、４６位のアラニン（Ａ）残基をグルタミン（Ｅ）へ、９７位のバリン（Ｖ）をアルギニン（Ｒ）へ置換することによって改変し、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド変異体（配列番号００１）を提供した。これを、連結ペプチド（配列番号００３）を介してＩｇＧ４ポリペプチドへ融合し、ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質変異体（配列番号００５）を提供した。２つの変異を欠如する天然のＨＬＡ－Ｂ５７由来融合タンパク質コントロール及び組換えＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、分泌シグナルをコードする核酸配列（配列番号００４）の下流に市販の発現ベクター（Ｐｒｏｂｉｏｇｅｎ）内にクローニングした。ＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃを発現するベクター構築物を、β２ｍタンパク質（配列番号００６）をコードする核酸を含むプラスミドとともに、ＮＥＯＮ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＭＰＫ１００９６）を用いたマイクロポレーション（ＭＰ）によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内にコトランスフェクトした。ＣＨＯ－ＤＧ４４スターター細胞を、ＨＬＡ融合タンパク質とβ２ｍプラスミドとの比率を変えてトランスフェクトした（４：１、２：１、１：１、１：２）。選択したクローンプールは、標準シェーカーフラスコで、ピューロマイシン及びメトトレキセートを含むＰＢＧ－ＣＤ－Ｃ４添加培地１２５ｍＬ中に、規定の４Ｅ５ｖｃ／ｍＬの細胞播種密度で培養された。抗生物質で調整された選択圧の後、個々のクローンプールが分析のために選択された。生存率及び生存細胞密度の測定は、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲシステム及びトリパンブルー細胞排除法を用いて行った。力価の定量は、プロテインＡバイオセンサーを備えたＯｃｔｅｔ ＲＥＤ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いて、異なる時点（日数）で測定した。
本発明者らは、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１：０１ポリペプチドの重鎖細胞外ドメインをＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド（配列番号００２）に連結して配列番号００８のＨＬＡ融合タンパク質を提供することにより、ヒトに医療的に使用するための最初のＨＬＡ融合タンパク質を開発した。このＨＬＡ融合タンパク質の収率を増加させるために、天然のＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインのアミノ酸配列内で同定された阻害性アミノ酸を、４６位のアラニン（Ａ）残基をグルタミン（Ｅ）へ、９７位のバリン（Ｖ）をアルギニン（Ｒ）へ置換することによって改変し、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド変異体（配列番号００１）を提供した。これを、連結ペプチド（配列番号００３）を介してＩｇＧ４ポリペプチドへ融合し、ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質変異体（配列番号００５）を提供した。２つの変異を欠如する天然のＨＬＡ－Ｂ５７由来融合タンパク質コントロール及び組換えＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、分泌シグナルをコードする核酸配列（配列番号００４）の下流に市販の発現ベクター（Ｐｒｏｂｉｏｇｅｎ）内にクローニングした。ＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃを発現するベクター構築物を、β２ｍタンパク質（配列番号００６）をコードする核酸を含むプラスミドとともに、ＮＥＯＮ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＭＰＫ１００９６）を用いたマイクロポレーション（ＭＰ）によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内にコトランスフェクトした。ＣＨＯ－ＤＧ４４スターター細胞を、ＨＬＡ融合タンパク質とβ２ｍプラスミドとの比率を変えてトランスフェクトした（４：１、２：１、１：１、１：２）。選択したクローンプールは、標準シェーカーフラスコで、ピューロマイシン及びメトトレキセートを含むＰＢＧ－ＣＤ－Ｃ４添加培地１２５ｍＬ中に、規定の４Ｅ５ｖｃ／ｍＬの細胞播種密度で培養された。抗生物質で調整された選択圧の後、個々のクローンプールが分析のために選択された。生存率及び生存細胞密度の測定は、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲシステム及びトリパンブルー細胞排除法を用いて行った。力価の定量は、プロテインＡバイオセンサーを備えたＯｃｔｅｔ ＲＥＤ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いて、異なる時点（日数）で測定した。
【0139】
実施例２：ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍの精製、及びβ２ｍの除去手順。
β２ｍに対する天然型ＨＬＡ－Ｂ５７又は改変型ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の融合タンパク質の等モルＲＮＡレベルを、選択されたクローン細胞で確認した（図１Ａ）。ＨＬＡ－Ｂ５７又は変異型融合タンパク質を発現するクローンを分析した結果、ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ細胞の生存率及び力価は、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍよりも有意に低いことが示された（図１Ｂ及びＣ）。それぞれの上清から採取したタンパク質のＨＰＬＣ分析から、ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍは多量の高分子量（ＨＭＷ）種、及び低分子量種（ＬＭＷ）も有しており、単量体含量の減少を伴うが、一方でＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍは著しいＨＭＷ、ＬＷＭの減少、高い単量体含量を有し（図２Ａ及びＢ）、変異型ＨＬＡ重鎖の安定性が向上していることが示された。
β２ｍに対する天然型ＨＬＡ－Ｂ５７又は改変型ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の融合タンパク質の等モルＲＮＡレベルを、選択されたクローン細胞で確認した（図１Ａ）。ＨＬＡ－Ｂ５７又は変異型融合タンパク質を発現するクローンを分析した結果、ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ細胞の生存率及び力価は、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍよりも有意に低いことが示された（図１Ｂ及びＣ）。それぞれの上清から採取したタンパク質のＨＰＬＣ分析から、ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍは多量の高分子量（ＨＭＷ）種、及び低分子量種（ＬＭＷ）も有しており、単量体含量の減少を伴うが、一方でＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍは著しいＨＭＷ、ＬＷＭの減少、高い単量体含量を有し（図２Ａ及びＢ）、変異型ＨＬＡ重鎖の安定性が向上していることが示された。
【0140】
ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ複合体は、次いでアフィニティーカラム精製によって、ろ過したＣＨＯ細胞上清から単離された。酸性条件下でのタンパク質の精製及びβ２ｍの除去は、２段階の精製プロトコールとして行われた。第１段階として、上清からβ２ｍと会合したＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）を捕捉するために、プロテインＧセファロース［（４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）Ｓｉｇｍａ、＃ＧＥ－１７－０６１８－０１）］ビーズを使用した。ロッカーにおいて４度で一晩インキュベートした後、回収したビーズをＰＢＳで洗浄し、標準ＩｇＧ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ２．８）を用いてＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質を溶出した（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ ＃２１００４）。サイズ排除クロマトグラフィーに基づく精製の第二段階として、酸性条件下でＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）をβ２ｍと分離し、非β２ｍ会合ＨＬＡ融合タンパク質を得た。分離には、クエン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ３．０）であらかじめ平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ １０／３００ゲルろ過カラムを使用した。２．０ｍｇ／ｍｌ濃度のタンパク質を０．５ｍｌ注入して、目的の非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）タンパク質のピークは１２．７ｍｌで溶出し、β２ｍのピークは２２．０ｍｌで溶出した。図２は、上述のプロセスの様々な段階の収率を示しており、非β２ｍ会合ＨＬＡ融合タンパク質を得るためにβ２ｍを分離することにより、免疫調節ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質の約５０％が失われることを示している。
【0141】
ヒト集団において異なる免疫表現型に関連する種々のＨＬＡクラスＩ重鎖の最適な組換え発現における４６Ｅ残基及び９７Ｒ残基の重要性を確認するために、本発明者らは、ヒト集団において免疫原性効果に関連する他の代表的なＨＬＡクラスＩ重鎖ポリペプチド配列、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５８、及びＨＬＡ－Ｃ０８を含む追加のＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質構築物に対するこれらのアミノ酸置換の影響を測定した（図２Ｃ）。ＨＬＡ－Ｂ５７ ＩｇＧ４融合タンパク質の場合と同じプロセスを用いて、代替の免疫原性ＨＬＡクラスＩ重鎖ＩｇＧ４融合タンパク質をコードする核酸発現ベクターを作成した：ＨＬＡ－Ａ３０、Ａ＊３０：０１：０１：０１（配列番号００７）、ＨＬＡ－Ｂ５７ Ｂ＊５７：０１：０１：０１（配列番号００８）、ＨＬＡ－Ｂ５８、Ｂ＊５８：０１：０１：０１（配列番号００９）、及びＨＬＡ－Ｃ０８、Ｃ＊０８：０２：０１：０１（配列番号０１０）。次に、各ＨＬＡ－Ｆｃ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖細胞外ドメイン部分にＥ４６アミノ酸残基又はＲ９７残基を付加又は除去したアミノ酸置換の影響を測定するために、以下のとおり導入して改変構築物を作成した：ＨＬＡ－Ａ３０Ｅ４６Ａ（配列番号０１１）、ＨＬＡ－Ａ３０Ｉ９７Ｒ（配列番号０１２）、ＨＬＡ－Ａ３０Ｅ４６Ａ／Ｉ９７Ｒ（配列番号０１３）、ＨＬＡ－Ｂ５７Ａ４６Ｅ（配列番号０１４）、ＨＬＡ－Ｂ５７Ｖ９７Ｒ（配列番号０１５）、ＨＬＡ－Ｂ５７Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ（配列番号００５）、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｅ４６Ａ（配列番号０１６）、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｒ９７Ｖ（配列番号０１７）、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｅ４６Ａ／Ｒ９７Ｖ（配列番号０１８）、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｅ４６Ａ（配列番号０１９）、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｒ９７Ｖ（配列番号０２０）、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｅ４６Ａ／Ｒ９７Ｖ（配列番号０２１）。野生型及び変異型のＨＬＡ重鎖ＩｇＧ４融合タンパク質とβ２ｍとをコードする核酸発現ベクターを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞による組換え発現β２ｍ会合ＨＬＡ構築物の生産収率を、ＣＨＯ細胞の上清中で、プロテインＡバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて評価した。
【0142】
これらの結果から、試験したすべての分子において、アミノ酸４６Ｅ残基と９７Ｒ残基との両方を特徴とするＨＬＡ重鎖が最適な組換えタンパク質の収量と関連し、かつＨＬＡ－Ｂ５７重鎖配列にＡ４６ＥとＶ９７Ｒとの両方の置換を導入することで、すべての構築物の中で最も高い収量が得られることが確認された。逆に、野生型ＨＬＡ－Ｂ５７に存在する４６Ａと９７Ｖとの両方をＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５８、又はＨＬＡ－Ｃ０８に導入する場合、生産収率が著しく低下した。このことから、アミノ酸４６Ｅと９７Ｒとが、β２ｍに会合する様々なＨＬＡ－Ｆｃ分子を含むＨＬＡ重鎖の安定化と最適な力価の産生にとって重要であることが確認された。
【0143】
実施例３：ＬＩＬＲＢ２と、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）及びβ２ｍを有する、又は有さない場合のＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）との相互作用の定量化
本発明者らは、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の各形態に関連する腫瘍免疫に最も関連する免疫学的特性を解明するために、β２ｍポリペプチドに未だ会合している親ＨＬＡと比較して、ＨＬＡの精製に伴う収量の大きな損失を考慮した。第一段階として、ＨＬＡ－Ｂ５７ ＩｇＧ４融合タンパク質からβ２ｍを除去することが自然免疫レセプターＬＩＬＲＢ２との結合に与える影響を調べた。
本発明者らは、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の各形態に関連する腫瘍免疫に最も関連する免疫学的特性を解明するために、β２ｍポリペプチドに未だ会合している親ＨＬＡと比較して、ＨＬＡの精製に伴う収量の大きな損失を考慮した。第一段階として、ＨＬＡ－Ｂ５７ ＩｇＧ４融合タンパク質からβ２ｍを除去することが自然免疫レセプターＬＩＬＲＢ２との結合に与える影響を調べた。
【0144】
非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）、並びにＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍとＬＩＬＲＢ２との相互作用の親和性の定量は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて測定した。平底のＰｉｅｒｃｅ（商標）ストレプトアビジンでコーティングした高結合能９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ ＃１５５００）に、ＰＢＳバッファー中の最終濃度５μｇ／ｍｌで固定化したｃ末端ビオチン化抗原分子（ＬＩＬＲＢ２、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１００３３５）を５０μｌでコーティングした。陰性コントロールとしてＰＢＳ及びＩｇＧアイソタイプを使用した。非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）、及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍの連続希釈液（８段階の濃度点：１０、２．５、１、０．２５、０．１、０．０２５、０．０１、０．００２５μｇ／ｍｌ）を繰り返し（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）適用した（５０μｌ）。検出には、ＴＢＳ（５０μｌ）で１：１００に希釈したＡＰＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－１３５－０９８）を用いた。最後に、各ウェルに５０μｌのＴＢＳを加え、及びＡＰＣの励起波長６５０ｎｍ及び発光波長６６０ｎｍで蛍光スキャンを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ９．１．２及び３種のパラメータに基づくｌｏｇ（アゴニスト）と応答モデルとを用いて、ＬＩＬＲＢ２との相互作用のＥＣ５０を決定した（図３Ａ）。
【0145】
非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）、及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２の結合を、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）によっても評価した。Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６ｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に基づくバイオレイヤー干渉技術（ＢＬＩ）は、ＨＬＡ融合タンパク質とＬＩＬＲＢ２との結合親和性の定量化、及びＨＬＡ－ＧとＡＮＧＰＴＬ２／７を用いたブロッキング実験に使用した。ビオチン化ＬＩＬＲＢ２（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）タンパク質をストレプトアビジン（ＳＡＸＳ）バイオセンサーに固定化した。バイオセンサーを、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の濃度を増加させながら（５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６、７．８ｎＭ）及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）：β２ｍの濃度を増加させながら（１０５、５２．５、２６．３、１３．２、及び６．６ｎＭ）インキュベートし、相互作用及びリファレンスのセンサーグラムを記録した（図３Ｂ）。ブロッキング実験では、ビオチン化ＬＩＬＲＢ２センサーを１μＭ又は４μＭ濃度のＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）：β２ｍとインキュベートし、続いてＨＬＡ－Ｇ（３７５０～１２．５ｎＭ）、又はＡＮＧＴＰＬ２及びＡＮＧＰＴＬ７（１００～１．５６ｎＭ）の濃度を増加させた（図８）。データ解析、二重リファレンスの差し引き、及び結合親和力と速度論パラメータの定量は、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １２．０．２．５９ソフトウェアパッケージを使用し、データはリガンド－アナリテート反応の二価分析物モデル（２：１モデル）を用いて局所的にフィッティングした。
【0146】
まとめると、結合アッセイでは、β２ｍの会合を欠くＨＬＡとして、ＬＩＬＲＢ２への変異型ＨＬＡ融合タンパク質の結合が改善されたこと、特にβ２ｍと会合している場合に、変異型ＨＬＡ重鎖ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）が高い免疫調節能を持つことが示唆された（図３及び図８）。
【0147】
実施例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞に対する殺傷作用の増大
次に、ヒト初代マクロファージによるＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）ＩｇＧ４融合タンパク質による腫瘍細胞の貪食誘導に影響を与えるβ２ｍポリペプチドの能力を、液状がん細胞（リンパ腫、白血病、骨髄腫）及び固形がん細胞（乳がん、肺がん）に対して評価した。示された液状腫瘍及び固形腫瘍由来のがん細胞株をヒト初代マクロファージと共培養し、製造元の指示に従ってＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞メージングシステムを使用して腫瘍細胞の食作用を３６時間モニタリングした。初代ヒトドナー由来単球は、健康なドナーのＰＢＭＣから単離され、特異的マクロファージ培養液で５～７日間培養することによりマクロファージに分化した。プレーティング後１日目に、化合物を１０ｕｇ／ｍｌ（アイソタイプコントロール）又は２０ｕｇ／ｍｌ（ＨＬＡ融合タンパク質）でウェルに添加した。プレーティング後５～７日目に、化合物をマクロファージに再度添加し、生細胞イメージングを用いてマクロファージの貪食能を測定する２つの下流実験を行った。
次に、ヒト初代マクロファージによるＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）ＩｇＧ４融合タンパク質による腫瘍細胞の貪食誘導に影響を与えるβ２ｍポリペプチドの能力を、液状がん細胞（リンパ腫、白血病、骨髄腫）及び固形がん細胞（乳がん、肺がん）に対して評価した。示された液状腫瘍及び固形腫瘍由来のがん細胞株をヒト初代マクロファージと共培養し、製造元の指示に従ってＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞メージングシステムを使用して腫瘍細胞の食作用を３６時間モニタリングした。初代ヒトドナー由来単球は、健康なドナーのＰＢＭＣから単離され、特異的マクロファージ培養液で５～７日間培養することによりマクロファージに分化した。プレーティング後１日目に、化合物を１０ｕｇ／ｍｌ（アイソタイプコントロール）又は２０ｕｇ／ｍｌ（ＨＬＡ融合タンパク質）でウェルに添加した。プレーティング後５～７日目に、化合物をマクロファージに再度添加し、生細胞イメージングを用いてマクロファージの貪食能を測定する２つの下流実験を行った。
【0148】
がん細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で製造者の指示に従って染色し、次いで１０００細胞／ウェルを１０００－５０００個のプライマリーＴ細胞とともに平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）内に播種した。培地には２５０ｎＭのＣｙｔｏｔｏｘ Ｒｅｄ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を含んだ。生細胞イメージングはＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３ Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて行った。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２０２０Ｃを用いて、１ウェルあたり４枚の非隣接画像を解析した。ＣＦＳＥシグナルを緑色のオブジェクトで区分し、すべてのオブジェクトをがん細胞としてカウントした。死細胞はＣｙｔｏｔｏｘシグナルで識別し、赤いオブジェクトで区分した。がん細胞死は、緑色及び赤色のオブジェクトの共局在によって検出された。その結果、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．Ｂ２ｍはがん細胞に対するマクロファージ貪食活性を高めるが、β２ｍを欠くＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）は活性がわずかに低下することが示された（図４）。
【0149】
実施例５ ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖の免疫調節
非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．Ｂ２ｍを、ＢＲＧＳＦ－ＨＩＳマウス（Ｒａｇ２－／－、ＩＬ－２Ｒγ－／－、Ｆｌｋ２－／－。マウス内因性マクロファージを阻害するＮＯＤ特異的ＳＩＲＰａ変異を有するもの）にて、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖への影響をそれぞれ評価した。これらのレシピエントは、精製ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の肝内注入によりヒト化され、患者由来異種移植片（ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ：ＰＤＸ）肺がん細胞を移植された。これらのマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び骨髄系細胞など、ヒトの主要な免疫細胞サブセットをすべて含んでいる。異種移植に用いた非小細胞肺がん腫瘍について、市販の免疫組織化学抗体を用いて、肺移植後のＨＬＡ融合タンパク質標的ＬＩＬＲＢ２の発現を評価したところ、生着後に陽性発現が確認され、ヒトＬＩＬＲＢ２媒介性免疫調節効果を評価するための有効なモデルであることが示された。
非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．Ｂ２ｍを、ＢＲＧＳＦ－ＨＩＳマウス（Ｒａｇ２－／－、ＩＬ－２Ｒγ－／－、Ｆｌｋ２－／－。マウス内因性マクロファージを阻害するＮＯＤ特異的ＳＩＲＰａ変異を有するもの）にて、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖への影響をそれぞれ評価した。これらのレシピエントは、精製ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の肝内注入によりヒト化され、患者由来異種移植片（ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ：ＰＤＸ）肺がん細胞を移植された。これらのマウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び骨髄系細胞など、ヒトの主要な免疫細胞サブセットをすべて含んでいる。異種移植に用いた非小細胞肺がん腫瘍について、市販の免疫組織化学抗体を用いて、肺移植後のＨＬＡ融合タンパク質標的ＬＩＬＲＢ２の発現を評価したところ、生着後に陽性発現が確認され、ヒトＬＩＬＲＢ２媒介性免疫調節効果を評価するための有効なモデルであることが示された。
【0150】
ＬＵ６４２５肺ＰＤＸ ＮＳＣＬＣ腫瘍片は、ＣｒｏｗｎＢｉｏ社のＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）ＰＤＸコレクションから凍結状態で入手した。ＬＵ６４２５は西洋人女性（６９歳）由来の腫瘍である。病理診断：肺腺癌。有効性試験のために１８匹のＢＲＧＳＦ－ＨＩＳヒト化マウスを得た。ヒト化は６種類のＨＳＣ（造血幹細胞）のＣＤ３４＋ドナーを用いて行われ、生着カットオフはヒトＣＤ４５＋細胞（Ｇｅｎｏｗａｙ）３０％以上とした。ＬＵ６４２５のＰＤＸ腫瘍をＢＲＧＳＦマウスで増殖し、ＰＤＸ断片は使用まで液体窒素中でＲＰＭＩ１６４０：ＦＢＳ：ＤＭＳＯ（６：３：１）で凍結保存される。断片を３７℃で５分間解凍し、培養液ＲＰＭＩ１６４０培地（製品番号Ｌ０５００－５００、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ又は同等品）で２回すすいだ。１０匹の雌性ＢＲＧＳＦマウスにＬＵ６４２５腫瘍片を左脇腹に皮下移植した。ｉｎ ｖｉｖｏ増幅期のマウスの腫瘍体積が５００～１０００ｍｍ３に達した時点で外科的に切除し、腫瘍片（２～３ｍｍ３）を１８匹の雌性ＢＲＧＳＦ－ＨＩＳマウスの左脇腹に皮下移植した。腫瘍を移植した日を０日目（Ｄ０）とする。腫瘍が形成されると、マウスはＦｌｔ３リガンド（１回の注入あたり１０μｇ）を７日間かけて４回腹腔内注入を受けた。このプロトコールでは、Ｆｌｔ３リガンドが骨髄系細胞集団を増殖する。Ｆｌｔ３注入は、治療開始前１日に、腫瘍が平均体積約３０～２５０ｍｍ３に達した時点で、開始した。それぞれ６匹のマウスをＩｇＧ４アイソタイプコントロール、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）、又はＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．β２ｍの治療群（群間の平均腫瘍体積が均一）に割り当てた。治療は腹腔内注入（ＩＰ）によって行った。投与体積は、直近の個々の体重に合わせて１０ｍＬ／ｋｇとした。マウスは腫瘍体積のカットオフで安楽死させた。この研究における動物福祉は、科学的目的に使用される動物の保護に関する２０１０年９月２２日の欧州議会及び欧州理事会指令２０１０／６３／ＥＵに従い、１９８６年英国動物科学的手続法（ＵＫ Ａｎｉｍａｌｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ：ＡＳＰＡ）に準拠している。すべての実験データの管理及び報告手順は、適用されるＣｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＵＫガイドライン及び標準操作手順書に厳密に従った。
【0151】
両方のＨＬＡ融合タンパク質化合物を、実験期間中５日ごとに腹腔内に注入した。相対的な腫瘍増殖（倍加時間）は、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ単剤療法の両方によって有意に減少した（図５Ａ）。しかし、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ単剤療法もまた、ヒト免疫療法に非常に関連性の高いこのがんモデルにおいて、治療マウスの生存期間をコントロールに対して有意に延長した（図５Ｂ）。次いで、終末期に採取したＢＲＧＳＦ－ＨＩＳヒト化ＰＤＸ肺がんマウスの血漿中のサイトカイン濃度を、Ｖ－ＰＬＥＸ炎症誘発性パネル１ヒトＭＳＤ（ＭＳＤ）を用いて評価した。ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．β２ｍは、マウスの治療後、複数の血中サイトカインを有意に調節した。一方で、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）単剤療法は、コントロールのＩｇＧ４治療群と比較してＩＬ－１０レベルのみを変化させた。このことによりβ２ｍに会合しているＨＬＡ融合タンパク質が、このがんモデルにおいてより強力な免疫調節因子であることが確認された（図６）。
【0152】
実施例６ チェックポイント阻害剤との併用
次に、β２ｍとの会合を有する、又は有さない場合の両方のＨＬＡ融合タンパク質化合物に対して、ＰＤ－１中和抗体によるチェックポイント阻害剤療法を補完する能力を試験した。Ｃ３８腫瘍片を、同系遺伝子雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下注入した。腫瘍が±５０ｍｍ３に達した時点で、動物を平均腫瘍体積サイズが同等である群間に応じて均等に分配した。腫瘍径は試験過程にわたってノギスを用いて測定し、体積は式Ｄ／２×ｄ２（式中、Ｄ及びｄはそれぞれ腫瘍の最長径と最短径とをｍｍ単位で表す）のに従って算出した。細胞の注入時点と物質の注入の実験計画は以下のとおりである：アイソタイプＩｇＧ４（１０ｍｇ／Ｋｇ）隔週×３；非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）（５ｍｇ／Ｋｇ）隔週×３；ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（５ｍｇ／ｋｇ）隔週×２。一部の群は、抗ＰＤ－１（ＲＭＰ１－１４）１０ｍｇ／ｋｇ注入による同時併用治療を受けた。このマウスモデルでは、両方の化合物は腫瘍増殖に対抗するためにある程度の利点をもたらしたが、β２ｍ会合ＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物の方が抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた場合、群内のすべての動物で腫瘍の増殖をより効果的に制御したのに対し、同等の非β２ｍ会合ＨＬＡ融合タンパク質群では腫瘍回避及び増殖が１例観察された（図７）。
次に、β２ｍとの会合を有する、又は有さない場合の両方のＨＬＡ融合タンパク質化合物に対して、ＰＤ－１中和抗体によるチェックポイント阻害剤療法を補完する能力を試験した。Ｃ３８腫瘍片を、同系遺伝子雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下注入した。腫瘍が±５０ｍｍ３に達した時点で、動物を平均腫瘍体積サイズが同等である群間に応じて均等に分配した。腫瘍径は試験過程にわたってノギスを用いて測定し、体積は式Ｄ／２×ｄ２（式中、Ｄ及びｄはそれぞれ腫瘍の最長径と最短径とをｍｍ単位で表す）のに従って算出した。細胞の注入時点と物質の注入の実験計画は以下のとおりである：アイソタイプＩｇＧ４（１０ｍｇ／Ｋｇ）隔週×３；非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）（５ｍｇ／Ｋｇ）隔週×３；ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（５ｍｇ／ｋｇ）隔週×２。一部の群は、抗ＰＤ－１（ＲＭＰ１－１４）１０ｍｇ／ｋｇ注入による同時併用治療を受けた。このマウスモデルでは、両方の化合物は腫瘍増殖に対抗するためにある程度の利点をもたらしたが、β２ｍ会合ＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物の方が抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた場合、群内のすべての動物で腫瘍の増殖をより効果的に制御したのに対し、同等の非β２ｍ会合ＨＬＡ融合タンパク質群では腫瘍回避及び増殖が１例観察された（図７）。
【0153】
実施例７ ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍの抗腫瘍活性のメカニズム
ＨＬＡ－Ｂ５７は、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、及びＫＩＲ３ＤＬ１を含む複数の抑制性免疫分子と結合する能力を有する。ＬＩＬＲＢ１／２及びＫＩＲ３ＤＬ１は多様な免疫細胞セットで発現しており、これには骨髄系細胞（マクロファージなど）、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、及び腫瘍におけるＬＩＬＲＢ１の発現、骨髄系細胞（マクロファージなど）、Ｔ細胞、腫瘍におけるＬＩＬＲＢ２の発現、及びＮＫ細胞におけるＫＩＲ３ＤＬ１の発現が含まれる。ここでは腫瘍細胞が発現するＨＬＡ－Ｇ又はＭＨＣファミリー分子などの細胞結合性リガンド、あるいはアンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ）などの可溶性阻害因子と結合することで、細胞溶解機能が阻害されると考えられている。マクロファージにより発現されるＬＩＬＲＢ１／２のライゲーションは、Ｍ２マクロファージ及び骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）（どちらも腫瘍細胞の許容的な増殖に関連している）などの抑制性骨髄系細胞サブセットの分化を促進すると考えられている。
ＨＬＡ－Ｂ５７は、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、及びＫＩＲ３ＤＬ１を含む複数の抑制性免疫分子と結合する能力を有する。ＬＩＬＲＢ１／２及びＫＩＲ３ＤＬ１は多様な免疫細胞セットで発現しており、これには骨髄系細胞（マクロファージなど）、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、及び腫瘍におけるＬＩＬＲＢ１の発現、骨髄系細胞（マクロファージなど）、Ｔ細胞、腫瘍におけるＬＩＬＲＢ２の発現、及びＮＫ細胞におけるＫＩＲ３ＤＬ１の発現が含まれる。ここでは腫瘍細胞が発現するＨＬＡ－Ｇ又はＭＨＣファミリー分子などの細胞結合性リガンド、あるいはアンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ）などの可溶性阻害因子と結合することで、細胞溶解機能が阻害されると考えられている。マクロファージにより発現されるＬＩＬＲＢ１／２のライゲーションは、Ｍ２マクロファージ及び骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）（どちらも腫瘍細胞の許容的な増殖に関連している）などの抑制性骨髄系細胞サブセットの分化を促進すると考えられている。
【0154】
本発明者らは、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍがＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２及びＫＩＲ３ＤＬ１レセプターのマルチモーダル阻害によって作用するかどうかを調査した。ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（ＩｏｓＨ２）のＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、及びＫＩＲ３ＤＬ１への結合はバイオレイヤー干渉法によって確認した。初代ヒトマクロファージをＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍに暴露すると、ＳＨＰ１及びＳＨＰ２のリン酸化が減少したことにより、これらの分子を介した免疫応答の負の制御のアンタゴニストとして作用することが示唆された。次に、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍが、様々な天然リガンドとＬＩＬＲＢ１／２との結合をブロックする能力を評価した。実際、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（ｉｏｓＨ２）は、ＬＩＬＲＢ１のＨＬＡ－Ｇへの相互作用、及びＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ－Ｇ、ＡＮＧＰＴＬ２、及びＡＮＧＰＴＬ７との相互作用を競合的にブロックした（図８）。
【0155】
次に、研究者らはＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍが初代ヒトマクロファージの腫瘍細胞を貪食する能力を増強することができるかどうかを評価した。ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍは、ＬＩＬＲＢ１又は２を標的とするモノクローナル抗体（図９Ａ）又はシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）ＩｇＦｃ融合タンパク質構築物（図９Ｂ）などの既存のマクロファージチェックポイント標的分子と比較して、肺がん、血液がん（骨髄腫又は白血病）、及び膵臓がんの優れた貪食を誘導した。さらに、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍは、単剤又は抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤との併用療法としての両方で、初代ヒトＴ細胞の腫瘍細胞殺傷活性を高めた（図１０）。これには、抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル抗体と比較して、標的細胞に対するエフェクターの比率が非常に低くても、腫瘍殺傷を改善したことを含む。最後に、ＮＫ細胞に影響を与える構築物の能力を評価した。ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍは、ＬＩＬＲＢ１又は２に特異的なモノクローナル抗体よりも、ＮＫ細胞の殺傷能力を高めることが示された（図１１Ａ）。この効果は、全ＮＫ細胞と比較して、選別されたＫＩＲ３ＤＬ１＋ＮＫ細胞の培養液でより強かったことから、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍのＫＩＲ３ＤＬ１への結合が、この殺腫瘍効果の増強に役割を果たしたことが示唆された（図１１Ｂ）。
【0156】
概要
予想外なことに、β２ｍの有無にかかわらず、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６／Ｖ９７）ＩｇＧ４融合タンパク質はｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖を妨げることに有効であることが示された。本発明者の知る限り、β２ｍのヒトＨＬＡ融合タンパク質との会合の有用性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び ｉｎ ｖｉｖｏの両方でＨＬＡ融合タンパク質機能の重要な標的であるヒトリンパ球及び骨髄系細胞を試験する包括的モデルで試験されたのはこれが初めてである。ＨＬＡ重鎖融合タンパク質は、より短縮された製造工程により非常に高い収率を有するため（図２）、これらの知見は、肺がん、結腸がん、乳がんなどの上皮癌、及び骨髄腫、リンパ腫、白血病などの血球悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない抗悪性腫瘍治療の場において、本発明に係るＨＬＡ分子とβ２ｍ分子とを含む医薬組成物を使用することが望ましい可能性を示唆している。メカニズムの研究により、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍは、単一の免疫阻害経路を標的とする既存の薬剤と比較して、マクロファージ、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞上の複数の阻害経路に拮抗する能力が、その強力な抗腫瘍活性の根底にあることが示唆される。
予想外なことに、β２ｍの有無にかかわらず、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６／Ｖ９７）ＩｇＧ４融合タンパク質はｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖を妨げることに有効であることが示された。本発明者の知る限り、β２ｍのヒトＨＬＡ融合タンパク質との会合の有用性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び ｉｎ ｖｉｖｏの両方でＨＬＡ融合タンパク質機能の重要な標的であるヒトリンパ球及び骨髄系細胞を試験する包括的モデルで試験されたのはこれが初めてである。ＨＬＡ重鎖融合タンパク質は、より短縮された製造工程により非常に高い収率を有するため（図２）、これらの知見は、肺がん、結腸がん、乳がんなどの上皮癌、及び骨髄腫、リンパ腫、白血病などの血球悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない抗悪性腫瘍治療の場において、本発明に係るＨＬＡ分子とβ２ｍ分子とを含む医薬組成物を使用することが望ましい可能性を示唆している。メカニズムの研究により、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍは、単一の免疫阻害経路を標的とする既存の薬剤と比較して、マクロファージ、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞上の複数の阻害経路に拮抗する能力が、その強力な抗腫瘍活性の根底にあることが示唆される。
【0157】
引用文献
Ａｒｏｓａら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７ Ｍａｒ；２８（３）：１１５－２３
国際公開（ＷＯ）第２０１７／１５３４３８号（Ａ１）；国際公開第２０１６／１２４６６１号（Ａ１）；国際公開第２０１８／０２９２８４号（Ａ１）。
本明細書中で引用されているすべての科学刊行物及び特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
Ａｒｏｓａら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７ Ｍａｒ；２８（３）：１１５－２３
国際公開（ＷＯ）第２０１７／１５３４３８号（Ａ１）；国際公開第２０１６／１２４６６１号（Ａ１）；国際公開第２０１８／０２９２８４号（Ａ１）。
本明細書中で引用されているすべての科学刊行物及び特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0158】
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】