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特表2024-530215低酸素トリガーの人工転写因子、転写制御システム及びその応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-16
(54)【発明の名称】低酸素トリガーの人工転写因子、転写制御システム及びその応用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20240808BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240808BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240808BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240808BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240808BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240808BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240808BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240808BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240808BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240808BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240808BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240808BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240808BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240808BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00
C12N15/867 Z ZNA
C12N5/10
C12N15/09 Z
C12N15/63 100Z
A61P35/00
A61P9/10
A61K35/17
A61K35/76
A61K48/00
A61K31/7088
A61K38/16
C12N5/0783
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508507
(86)(22)【出願日】2021-12-27
(85)【翻訳文提出日】2024-04-05
(86)【国際出願番号】 CN2021141636
(87)【国際公開番号】W WO2023015822
(87)【国際公開日】2023-02-16
(31)【優先権主張番号】202110930268.5
(32)【優先日】2021-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523476384
【氏名又は名称】上海▲シン▼湾生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＩＮＯＢＡＹ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ６， Ｎｏ．５１８ Ｈａｏｙｅ Ｒｏａｄ， Ｊｉｎｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１５０６， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100197642
【弁理士】
【氏名又は名称】南瀬 透
(74)【代理人】
【識別番号】100219483
【弁理士】
【氏名又は名称】宇野 智也
(72)【発明者】
【氏名】徐建青
(72)【発明者】
【氏名】張曉燕
(72)【発明者】
【氏名】廖啓彬
(72)【発明者】
【氏名】丁相卿
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084NA14
4C084ZA401
4C084ZB261
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA40
4C086ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA40
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
低酸素トリガーの人工転写因子を提供し、低酸素トリガーの転写制御システムをさらに提供し、前記転写制御システムは、ＨＡＴＦをコードする核酸配列及びＲＥを含み、前記低酸素トリガーの転写制御システムであって、前記低酸素トリガーの転写制御システムは、上流と下流とが接続された２つの転写制御エレメントを含み、そのうち前記上流転写制御エレメントは、ＨＡＴＦを制御するための低酸素トリガーの転写反応エレメント及びＨＡＴＦをコードする核酸配列を含み、前記下流転写制御エレメントは、ＲＥ及び標的遺伝子を含み、人工転写因子ＨＡＴＦと認識エレメントＲＥ連携制御標的遺伝子の増幅倍数は、百倍に達することができる。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
低酸素トリガーの人工転写因子ＨＡＴＦであって、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列に比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列、又は
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含む、ＨＡＴＦ。
【請求項2】
請求項１に記載のＨＡＴＦをコードする核酸配列。
【請求項3】
請求項１に記載のＨＡＴＦの認識エレメントＲＥであって、前記ＲＥは、以下から選ばれるコア配列、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列を誘導体化して得られた配列、
を含み、
好ましくは、前記ＲＥは、前記コア配列の複数のコピー及び最小プロモーターを含み、より好ましくは、前記複数のコピーは、２個のコピー、３個のコピー、４個のコピー、５個のコピー、６個のコピー、７個のコピー、８個のコピー、９個のコピー又は１０個のコピーであり、さらに好ましくは、前記認識エレメントＲＥは、前記コア配列の５個又は６個のコピー及び最小プロモーターを含み、
よりさらに好ましくは、前記ＲＥは、以下から選ばれる配列、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列を誘導体化して得られた配列、
を含み、
最も好ましくは、前記ＲＥは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される、ＲＥ。
【請求項4】
低酸素トリガーの転写制御システムであって、前記転写制御システムは、請求項２に記載の核酸配列及び請求項３に記載のＲＥを含み、好ましくは、前記低酸素トリガーの転写制御システムは、上流と下流とが接続されたの２つの転写制御ユニットを含み、ここで前記上流転写制御ユニットは、ＨＡＴＦを制御するための低酸素トリガーの転写反応エレメントＨＲＴＥ及びＨＡＴＦをコードする核酸配列を含み、前記下流転写制御ユニットは、ＲＥ及び標的遺伝子ＧＯＩを含む、転写制御システム。
【請求項5】
前記上流と下流とが接続された転写制御ユニットは、非線形に直列接続され、２つのベクターに位置し、好ましくは、前記転写制御システムは、
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥとＲＥ－ＧＯＩ、
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥとＧＯＩ－ＲＥ、
ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦとＧＯＩ－ＲＥ又は
ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦとＲＥ－ＧＯＩのいずれか１つに示される組み合わせ形式を有し、
又は前記上流と下流とが接続された転写制御ユニットは、線形に直列接続され、同一のベクターに位置し、
好ましくは、前記転写制御システムは、
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＧＯＩ、
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＧＯＩ－ＲＥ、
ＨＲＴＥ－ＨＲＥ－ＧＯＩ、
ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦ－ＧＯＩ－ＲＥ、
ＲＥ－ＧＯＩ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ、
ＲＥ－ＧＯＩ－ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦ、
ＧＯＩ－ＲＥ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ又は
ＧＯＩ－ＲＥ－ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦのいずれか１つに示される組み合わせ形式を有する、請求項４に記載の低酸素トリガーの転写制御システム。
【請求項6】
前記ＨＲＴＥは、低酸素誘導遺伝子の一部の配列から選ばれ、好ましくは、前記ＨＲＴＥは、血管内皮増殖因子遺伝子、エリスロポエチン遺伝子、解糖系酵素遺伝子のフランキング領域から選ばれ、より好ましくは、前記ＨＲＴＥのコア配列は、５’－（Ａ／Ｇ）ＣＧＴ（Ｇ／Ｃ）－３’であり、好ましくは、前記ＨＲＴＥは、以下から選ばれるコア配列、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列を誘導体化して得られた配列、
を含み、
好ましくは、前記ＨＲＴＥは、前記コア配列の複数のコピー及び最小プロモーターを含み、より好ましくは、前記複数のコピーは、２個のコピー、３個のコピー、４個のコピー、５個のコピー、６個のコピー、７個のコピー、８個のコピー、９個のコピー又は１０個のコピーであり、さらに好ましくは、前記ＨＲＴＥは、前記コア配列の５個又は６個のコピー及び最小プロモーターを含み、
よりさらに好ましくは、前記ＨＲＴＥは、以下から選ばれる配列、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列を誘導体化して得られた配列、
を含み、
最も好ましくは、前記ＨＲＴＥは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される、請求項４又は５に記載の低酸素トリガーの転写制御システム。
【請求項7】
前記ＧＯＩは、好ましくはＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α／β／γ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、ＩＬ－３７、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＭＩＰ－１α又はＭＩＰ－１βから選ばれるサイトカイン及びケモカイン、
好ましくはＴＮＦ－α、異なる抗原標的に対するＴ細胞アダプター、異なる抗原標的に対するキメラ抗原受容体、アポトーシス遺伝子、パイロトーシス遺伝子又は毒素から選ばれる細胞毒性分子、
好ましくは抗ＣＤ２８抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体又は抗ＣＤ２７抗体から選ばれる異なる抗原標的に対する作動性抗体、
又は、好ましくはＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＬＡＧ－３抗体又はＴｉｍ３抗体から選ばれる異なる抗原標的に対する遮断性抗体、
又は上記任意の２種又は複数種の組み合わせから選ばれる１種又は複数種であり、
より好ましくは、対象とする抗原標的は、ＡＸＬ、ＥＧＦＲ、ＭＨＣ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＦＡＰ、ＣＤ１４７、ＨＥＲ－２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＣＤ１３３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ１２６、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＴＡＧ７２、ＩＬ－１３Ｒα、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＦＲα、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＧＰＣ３、ＣＡＩＸ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ｃ－Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７－Ｈ３及びＴｒｏｐ２から選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記ＧＯＩの発現カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６－８のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の低酸素トリガーの転写制御システム。
【請求項8】
請求項４～７のいずれか一項に記載の低酸素トリガーの転写制御システムを含む核酸配列であって、好ましくは、前記核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される、核酸配列。
【請求項9】
請求項８に記載の核酸配列を含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターは、プラスミド、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ダニ媒介性脳炎ウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、ニューカッスルウイルスベクター、トランスポゾン又はその１種又は複数種の組み合わせから選ばれ、より好ましくは、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、ベクター。
【請求項10】
宿主細胞であって、前記宿主細胞は、前記請求項９に記載のベクターを含むか、又は前記宿主細胞の染色体に請求項８に記載の核酸分子が統合され、前記宿主細胞は、好ましくは単離されたヒト由来細胞であり、より好ましくは胚性幹細胞、臍帯血由来幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はマクロファージから選ばれ、さらに好ましくは、前記ヒト由来細胞は、遺伝子操作された免疫細胞であり、よりさらに好ましくは、前記遺伝子操作された免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はマクロファージであり、よりさらに好ましくは、前記遺伝子操作された免疫細胞は、Ｔ細胞であり、
最も好ましくは、前記遺伝子操作された免疫細胞は、
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）、
キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、
キメラ抗原受容体ＮＫＴ細胞（ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞）、
キメラ抗原受容体マクロファージ（ＣＡＲ－ｍφ）、
Ｔ細胞受容体Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）からなる群から選ばれる、宿主細胞。
【請求項11】
低酸素性疾患、虚血性疾患又はがんを治療するための医薬又は製剤の調製における、請求項１に記載の前記低酸素トリガーの人工転写因子ＨＡＴＦ、請求項３に記載の認識エレメントＲＥ、請求項４～７のいずれか一項に記載の低酸素トリガーの転写制御システム、請求項８に記載の核酸分子、請求項９に記載のベクター又は請求項１０に記載の宿主細胞の用途であって、好ましくは、前記がんは、固形腫瘍であり、
より好ましくは、前記固形腫瘍は、神経芽細胞腫、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、腎臓がん、膵臓がん、鼻咽頭がん、小腸がん、大腸がん、結腸直腸がん、膀胱がん、骨がん、前立腺がん、甲状腺がん又は脳がんから選ばれる１種又は複数種である、用途。
【請求項12】
低酸素性疾患、虚血性疾患又はがんの治療方法であって、前記方法は、治療有効量の請求項１に記載の前記低酸素トリガーの人工転写因子ＨＡＴＦ、請求項３に記載の認識エレメントＲＥ、請求項４～７のいずれか一項に記載の低酸素トリガーの転写制御システム、請求項８に記載の核酸分子、請求項９に記載のベクター又は請求項１０に記載の宿主細胞を必要とする被験者に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医薬技術分野に属し、具体的には、低酸素トリガーの人工転写因子に関するものであり、本発明は、前記低酸素トリガーの人工転写因子を含む低酸素トリガーの転写制御システム、及び低酸素性腫瘍治療におけるそれらの応用にさらに関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍の免疫細胞療法、例えばＴ細胞受容体修飾Ｔ細胞（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ、ＴＣＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ）及びキメラ抗原受容体Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ、ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ）は、臨床研究において良好な抗腫瘍効果を示す。しかしながら、臨床試験及び応用において、細胞療法の新たな問題が絶えない。緻密な固形腫瘍に進入しにくいことに加えて、一般的な有害反応は、腫瘍特異的抗原の欠乏によるオフターゲット効果、致命的な神経毒性、アレルギー反応などの副作用を含み、これらは、いずれも細胞で固形腫瘍を治療する臨床応用を制限している。そのため、正常組織の損傷を低減するために、制御可能な、腫瘍を精確に標的とする免疫細胞の治療方法をさらに開発する必要がある。
【0003】
研究によれば、固形腫瘍内の異常な血管構造に起因する血液供給不足及び腫瘍細胞の過剰増殖により、相対的に低酸素の腫瘍微小環境が造り出され、腫瘍組織内の酸素レベルが常に２％未満であるため、低酸素は、様々な固形腫瘍の１つの共有特徴であることを発見した。固形腫瘍の低酸素の微小環境に対して、低酸素シグナルによってＴＣＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は遺伝子操作されたＴ細胞を活性化する腫瘍殺傷技術を開発することにより、腫瘍治療の特異性の向上が期待される。
【0004】
従来の研究によれば、低酸素誘導因子－１α（Ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ １－ａｌｐｈａ、ＨＩＦ－１α）の酸素依存性分解ドメイン（Ｏｘｙｇｅｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、ＯＤＤ）をキメラ抗原受容体に融合させることにより、キメラ抗原受容体を通常の酸素環境において分解させるが、低酸素環境において富化させ、それによって腫瘍細胞を認識して殺傷することができることが示された。しかしながら、酸素依存性分解ドメインを融合させられたキメラ抗原受容体の低酸素性環境での誘導レベルは、依然として比較的低いレベルにあり、抗原の不均一性が比較的大きい腫瘍、特に腫瘍抗原低発現の固形腫瘍の制御に不利であり、また、現在のＯＤＤによって制御された低酸素感受性ＣＡＲ－Ｔ細胞は、依然として比較的高いレベルのバックグラウンド漏洩があり、一定レベルの非低酸素依存性殺傷が生じ、安全性上の懸念がある。また、低酸素トリガーのプロモーターによって駆動されるＣＡＲ－Ｔ細胞は、一定の酸素濃度反応能力を備えているが、同様に比較的高いレベルのバックグラウンド漏洩が存在することによって、比較的高いレベルの非低酸素依存性殺傷が生じ、オンターゲットオフ腫瘍毒性（Ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）が生じる可能性がある。
【0005】
そのため、より高感度で効率的な低酸素トリガーの人工転写因子をさらに開発する必要があり、それによってより安全で効果的な低酸素感受性の治療方法を研究開発し、細胞治療の安全性を向上させつつ、腫瘍の成長を効果的に制御することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、従来技術の不足に対して、低酸素トリガーの転写制御システムを提供することである。本発明によって提供される低酸素トリガーの転写制御システムは、上流と下流が連鎖された２つの転写制御ユニットを含む。本発明は、前記低酸素トリガーの転写制御システムの用途をさらに提供する。本発明によって提供される転写制御システムは、低酸素に高度に敏感であるという目的を達成するために、連鎖された２つの転写制御ユニットから構成され、上流と下流の２段増幅を形成する。当該システムは、異なる標的遺伝子を携帯することによって、腫瘍治療薬の調製及び精度よい治療を実現することができる。従来技術と比較して、本発明の低酸素トリガーの転写制御システムは、低酸素下で効率的に誘導発現され、それによって低酸素トリガーの厳密性及び感受性を向上させる。また、本発明の転写制御システムを用いると、少量の転写因子で比較的高い標的遺伝子の発現を駆動し、低酸素に対するその感受性をさらに増幅させることができる。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の目的は、次の技術的解決手段によって達成される。
一態様では、本発明は、低酸素トリガーの人工転写因子（Ｈｙｐｏｘｉａ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ、ＨＡＴＦ）を提供し、前記ＨＡＴＦは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列に比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列、又は
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。
一態様では、本発明は、低酸素トリガーの人工転写因子（Ｈｙｐｏｘｉａ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ、ＨＡＴＦ）を提供し、前記ＨＡＴＦは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列に比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列、又は
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0008】
別の態様では、本発明は、前記ＨＡＴＦをコードする核酸配列をさらに提供する。
【0009】
更なる一態様では、本発明は、前記ＨＡＴＦの認識エレメント（Ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ Ｅｌｅｍｅｎｔ、ＲＥ）を提供し、前記ＲＥは、以下から選ばれるコア配列、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列を誘導体化して得られた配列、
を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列を誘導体化して得られた配列、
を含む。
【0010】
好ましくは、前記ＲＥは、前記コア配列の複数のコピー及び最小プロモーターを含み、より好ましくは、前記複数のコピーは、２個のコピー、３個のコピー、４個のコピー、５個のコピー、６個のコピー、７個のコピー、８個のコピー、９個のコピー又は１０個のコピーであり、さらに好ましくは、前記認識エレメントＲＥは、前記コア配列の５個又は６個のコピー及び最小プロモーターを含む。
【0011】
よりさらに好ましくは、前記ＲＥは、以下から選ばれる配列、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列を誘導体化して得られた配列、
を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列を誘導体化して得られた配列、
を含む。
【0012】
最も好ましくは、前記ＲＥは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される。
【0013】
本発明によって提供されるＨＡＴＦは、新規な人工転写因子であり、本発明の発明者は、当該ＨＡＴＦとそれにマッチングするＲＥで共に制御した標的遺伝子の増幅倍数が百倍以上に達することができ、従来の人工転写因子及びその反応エレメントのアップレギュレーション倍数より遥かに大きいことを見出した。
【0014】
別の態様では、本発明は、低酸素トリガーの転写制御システムを提供し、前記転写制御システムは、ＨＡＴＦをコードする核酸配列及びＲＥを含む。
【0015】
本発明に係る低酸素トリガーの転写制御システムによれば、前記低酸素トリガーの転写制御システムは、上流と下流とが接続された２つの転写制御ユニットを含み、ここで前記上流転写制御ユニットは、ＨＡＴＦを制御するための低酸素トリガーの転写反応エレメント（Ｈｙｐｏｘｉａ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔ、ＨＲＴＥ）及びＨＡＴＦをコードする核酸配列を含み、前記下流転写制御ユニットは、ＲＥ及び標的遺伝子（Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＧＯＩ）を含む。
【0016】
ここで、前記ＨＡＴＦは、ＲＮＡ転写レベル及びタンパク質翻訳レベルとの両方で低酸素によってトリガーされ、即ち、前記低酸素トリガーの人工転写因子は、通常の酸素下では発現されないか、又は低レベルで発現されるが、低酸素下では効率的に誘導発現され、それによって低酸素トリガーの厳密性及び感受性を向上させる。
【0017】
本発明に係る低酸素トリガーの転写制御システムによれば、前記上流と下流接続された転写制御ユニットは、非線形に直列接続され、２つのベクターに位置し、好ましくは、前記転写制御システムは、
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥとＲＥ－ＧＯＩ、
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥとＧＯＩ－ＲＥ、
ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦとＧＯＩ－ＲＥ又は
ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦとＲＥ－ＧＯＩのいずれか１つに示される組み合わせ形式を有する。
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥとＲＥ－ＧＯＩ、
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥとＧＯＩ－ＲＥ、
ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦとＧＯＩ－ＲＥ又は
ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦとＲＥ－ＧＯＩのいずれか１つに示される組み合わせ形式を有する。
【0018】
或いは、前記上流と下流とが接続された転写制御ユニットは、線形に直列接続され、同一のベクターに位置し、好ましくは、前記転写制御システムは、
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＧＯＩ、
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＧＯＩ－ＲＥ、
ＨＲＴＥ－ＨＲＴＥ－ＧＯＩ、
ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦ－ＧＯＩ－ＲＥ、
ＲＥ－ＧＯＩ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ、
ＲＥ－ＧＯＩ－ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦ、
ＧＯＩ－ＲＥ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ又は
ＧＯＩ－ＲＥ－ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦのいずれか１つに示される組み合わせ形式を有する。
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＧＯＩ、
ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＧＯＩ－ＲＥ、
ＨＲＴＥ－ＨＲＴＥ－ＧＯＩ、
ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦ－ＧＯＩ－ＲＥ、
ＲＥ－ＧＯＩ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ、
ＲＥ－ＧＯＩ－ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦ、
ＧＯＩ－ＲＥ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ又は
ＧＯＩ－ＲＥ－ＨＲＴＥ－ＨＡＴＦのいずれか１つに示される組み合わせ形式を有する。
【0019】
本発明に係る低酸素トリガーの転写制御システムによれば、前記ＨＲＴＥは、血管内皮増殖因子遺伝子、エリスロポエチン遺伝子、解糖系酵素遺伝子などの低酸素誘導遺伝子のフランキング領域から選ばれ、そのコア配列は、５’－（Ａ／Ｇ）ＣＧＴ（Ｇ／Ｃ）－３’である。
【0020】
本発明に係る低酸素トリガーの転写制御システムによれば、前記ＨＲＴＥは、以下から選ばれるコア配列、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列を誘導体化して得られた配列、を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列を誘導体化して得られた配列、を含む。
【0021】
好ましくは、前記ＨＲＴＥは、前記コア配列の複数のコピー及び最小プロモーターを含み、より好ましくは、前記複数のコピーは、２個のコピー、３個のコピー、４個のコピー、５個のコピー、６個のコピー、７個のコピー、８個のコピー、９個のコピー又は１０個のコピーであり、さらに好ましくは、前記ＨＲＴＥは、前記コア配列の５個又は６個のコピー及び最小プロモーターを含む。
【0022】
よりさらに好ましくは、前記ＨＲＴＥは、以下から選ばれる配列、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列を誘導体化して得られた配列、を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列、又はその相補配列、
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列とハイブリダイズする配列、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有する配列、又は
（４）１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列を誘導体化して得られた配列、を含む。
【0023】
最も好ましくは、前記ＨＲＴＥは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される。
【0024】
１つの具体的な実施形態では、本発明に係る人工転写因子ＨＡＴＦは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有し、その認識エレメントＲＥは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるコア核酸配列を有し、それらが共に制御した標的遺伝子（赤色蛍光タンパクｍＣｈｅｒｒｙ）の増幅倍数は、百倍に達することができ、従来の人工転写因子（ＧＡＬ４）及びその反応エレメント（ＵＡＳ）の１０倍アップレギュレーションより遥かに優れている。
【0025】
本発明に係る低酸素トリガーの転写制御システムによれば、前記標的遺伝子ＧＯＩは、機能遺伝子であり、
好ましくは、前記ＧＯＩは、
例えばＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α／β／γ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、ＩＬ－３７、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１βなどのサイトカイン及びケモカイン、
例えばＴＮＦ－α、異なる抗原標的に対するＴ細胞アダプター（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、ＢｉＴＥ）、異なる抗原標的に対するキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）、アポトーシス遺伝子、パイロトーシス遺伝子、毒素などの細胞毒性分子、又は
例えば抗ＣＤ２８抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体及び抗ＣＤ２７抗体などの異なる抗原標的に対する作動性抗体、又はＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＬＡＧ－３抗体及びＴｉｍ３抗体などの異なる抗原標的に対する遮断性抗体、
又は上記任意の２種又は複数種の組み合わせから選ばれる１種又は複数種である。
好ましくは、前記ＧＯＩは、
例えばＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α／β／γ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、ＩＬ－３７、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１βなどのサイトカイン及びケモカイン、
例えばＴＮＦ－α、異なる抗原標的に対するＴ細胞アダプター（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、ＢｉＴＥ）、異なる抗原標的に対するキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）、アポトーシス遺伝子、パイロトーシス遺伝子、毒素などの細胞毒性分子、又は
例えば抗ＣＤ２８抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体及び抗ＣＤ２７抗体などの異なる抗原標的に対する作動性抗体、又はＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＬＡＧ－３抗体及びＴｉｍ３抗体などの異なる抗原標的に対する遮断性抗体、
又は上記任意の２種又は複数種の組み合わせから選ばれる１種又は複数種である。
【0026】
好ましくは、対象とする抗原標的は、異なる細胞膜に発現される広域汎用型標的であり、ＡＸＬ、ＥＧＦＲ、ＭＨＣ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＦＡＰ、ＣＤ１４７、ＨＥＲ－２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＣＤ１３３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ８、ＣＤ１２６、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＴＡＧ７２、ＩＬ－１３Ｒα、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＦＲα、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＧＰＣ３、ＣＡＩＸ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ｃ－Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７－Ｈ３及びＴｒｏｐ２などを含むが、これらに限定されず、
好ましくは、前記ＧＯＩの発現カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される赤色蛍光タンパクｍＣｈｅｒｒｙ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される腫瘍抗原ＨＥＲ２に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＣＤ４７／ＣＤ３の二重特異性Ｔ細胞アダプター（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、ＢｉＴＥ）を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６－８のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記ＧＯＩの発現カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される赤色蛍光タンパクｍＣｈｅｒｒｙ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される腫瘍抗原ＨＥＲ２に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＣＤ４７／ＣＤ３の二重特異性Ｔ細胞アダプター（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、ＢｉＴＥ）を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６－８のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。
【0027】
本発明は、本発明に記載の低酸素トリガーの転写制御システムを含む核酸配列をさらに提供し、
好ましくは、前記核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。
好ましくは、前記核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。
【0028】
本発明は、前記核酸配列を含むベクターをさらに提供し、好ましくは、前記ベクターは、プラスミド、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ダニ媒介性脳炎ウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、ニューカッスルウイルスベクター、トランスポゾン又はその１種又は複数種の組み合わせから選ばれる。より好ましくは、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【0029】
本発明は、宿主細胞をさらに提供し、前記宿主細胞は、前記ベクターを含むか、又は前記宿主細胞の染色体に前記核酸分子が統合される。
【0030】
好ましくは、前記宿主細胞は、胚性幹細胞、臍帯血由来幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞及びマクロファージを含む単離されたヒト由来細胞であり、より好ましくは、前記ヒト由来細胞は、遺伝子操作された免疫細胞であり、さらに好ましくは、前記遺伝子操作された免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はマクロファージであり、よりさらに好ましくは、前記遺伝子操作された免疫細胞は、Ｔ細胞である。
【0031】
最も好ましくは、前記遺伝子操作された免疫細胞は、
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）、
キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、
キメラ抗原受容体ＮＫＴ細胞（ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞）、
キメラ抗原受容体マクロファージ（ＣＡＲ－ｍφ）、
Ｔ細胞受容体Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）からなる群から選ばれる。
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）、
キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、
キメラ抗原受容体ＮＫＴ細胞（ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞）、
キメラ抗原受容体マクロファージ（ＣＡＲ－ｍφ）、
Ｔ細胞受容体Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）からなる群から選ばれる。
【0032】
１つの好ましい実施形態では、前記遺伝子操作された免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞であり、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、前記ベクターを介して本発明の低酸素トリガーの転写制御システムをトランスフェクション又は形質導入することによって、低酸素環境下で赤色蛍光タンパクｍＣｈｅｒｒｙ、キメラ抗原受容体又は二重特異性Ｔ細胞アダプターを誘導発現する。
【0033】
本発明は、前記低酸素トリガーの転写制御システムを含む、遺伝子操作された細胞の調製方法をさらに提供し、前記方法は、本発明の低酸素トリガーの転写制御システムを含むベクターを宿主細胞内に導入して前記遺伝子操作された細胞を得るステップを含む。
【0034】
１つの好ましい実施形態では、前記導入は、同時、相前後、又は順次導入を含む。
【0035】
本発明は、低酸素性疾患、虚血性疾患又はがんを治療するための医薬又は製剤の調製における、前記低酸素トリガーの人工転写因子ＨＡＴＦ、前記ＨＡＴＦの認識エレメントＲＥ、前記低酸素トリガーの転写制御システム、前記核酸分子、前記ベクター、前記宿主細胞の用途をさらに提供する。
【0036】
好ましくは、前記がんは、固形腫瘍であり、より好ましくは、前記固形腫瘍は、神経芽細胞腫、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、腎臓がん、膵臓がん、鼻咽頭がん、小腸がん、大腸がん、結腸直腸がん、膀胱がん、骨がん、前立腺がん、甲状腺がん又は脳がんから選ばれる１種又は複数種である。
【0037】
低酸素性疾患、虚血性疾患又はがんの治療方法であって、前記方法は、治療有効量の低酸素トリガーの人工転写因子ＨＡＴＦ、前記ＨＡＴＦの認識エレメントＲＥ、前記低酸素トリガーの転写制御システム、前記核酸分子、前記ベクター、宿主細胞、ベクターと細胞との組み合わせ、又は上記と他の治療薬及び技術との組み合わせ（ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＴＩＧＩＴ抗体、Ｔｉｍ－３抗体、ＬＡＧ－３抗体が含まれるが、これらに限定されない）を必要とする被験者に投与することを含む。
【0038】
本発明は、低酸素トリガーの人工制御因子及びそれを含む転写制御システムを提供し、本発明は、固形腫瘍などの低酸素性疾患治療における応用、特に固形腫瘍のＣＡＲ－Ｔ細胞治療における応用をさらに提供する。
【発明の効果】
【0039】
本発明は、従来技術に比べて以下の効果を有する。
１．本発明の人工転写因子ＨＡＴＦと認識エレメントＲＥとが共に制御した標的遺伝子の増幅倍数は、百倍に達することができ、従来の人工転写因子（ＧＡＬ４）及びその反応エレメント（ＵＡＳ）の１０倍アップレギュレーションより遥かに優れている。
２．本発明の人工転写因子ＨＡＴＦは、ＲＮＡ転写とタンパク質翻訳との両方で酸素によって制御され、通常の酸素環境では効率的に分解されるが、低酸素環境下では効率的に誘導発現され、当該システムの低酸素トリガーの厳密性及び感受性を保証する。
３．本発明の人工転写因子ＨＡＴＦは、それにマッチングする認識エレメントＲＥに特異的に結合し、標的遺伝子の効率的な転写と発現を開始することができ、それによって低酸素環境における標的送達を実現し、全身投与による重篤な毒副作用を避けることができる。
４．本発明に記載の低酸素トリガーの転写制御システムにおける、標的遺伝子によりコードされるタンパク質は、低酸素トリガーの機能ドメインでいかなる修飾もなされておらず、標的遺伝子によりコードされるタンパク質機能が妨害されないことを確保し、その最大の活性を発揮させることができる。
１．本発明の人工転写因子ＨＡＴＦと認識エレメントＲＥとが共に制御した標的遺伝子の増幅倍数は、百倍に達することができ、従来の人工転写因子（ＧＡＬ４）及びその反応エレメント（ＵＡＳ）の１０倍アップレギュレーションより遥かに優れている。
２．本発明の人工転写因子ＨＡＴＦは、ＲＮＡ転写とタンパク質翻訳との両方で酸素によって制御され、通常の酸素環境では効率的に分解されるが、低酸素環境下では効率的に誘導発現され、当該システムの低酸素トリガーの厳密性及び感受性を保証する。
３．本発明の人工転写因子ＨＡＴＦは、それにマッチングする認識エレメントＲＥに特異的に結合し、標的遺伝子の効率的な転写と発現を開始することができ、それによって低酸素環境における標的送達を実現し、全身投与による重篤な毒副作用を避けることができる。
４．本発明に記載の低酸素トリガーの転写制御システムにおける、標的遺伝子によりコードされるタンパク質は、低酸素トリガーの機能ドメインでいかなる修飾もなされておらず、標的遺伝子によりコードされるタンパク質機能が妨害されないことを確保し、その最大の活性を発揮させることができる。
【0040】
本発明の範囲内において、本発明の上記各技術的特徴と以下の（例えば実施例）において具体的に説明される各技術的特徴は、互いに組み合わせてもよく、それによって新しい又は好ましい技術案を構成することを理解されたい。紙面の都合上、ここでは説明を省略する。
【図面の簡単な説明】
【0041】
以下、図面と結び付けて本発明の実施形態を詳細に説明し、ここで、
【図1】低酸素によってトリガーされない従来のＨＥＲ２ ＣＡＲ（図１ａ）と、２ユニット形態の低酸素トリガーの転写制御システム（図１ｂ～ｃ）と、１ユニット形態の低酸素転写制御システム（図１ｄ～ｆ）とを携帯するレンチウイルス発現プラスミドマップを示す。ここで、２ユニット形態の低酸素トリガーの転写制御システムは、２つのレンチウイルス発現プラスミドによって提供されるＨＡＴＦ及びＨＲＴＥ、並びにＲＥ及びＧＯＩから構成され、１ユニット形態の低酸素トリガーの転写制御システムは、１つのレンチウイルス発現プラスミドによって提供されるＨＡＴＦ、ＨＲＴＥ、ＲＥ及びＧＯＩから構成される。ＧＯＩは、それぞれ赤色蛍光タンパクｍＣｈｅｒｒｙ（図１ｄ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（図１ｅ）又は二重特異性Ｔ細胞アダプター（ＢｉＴＥ）（図１ｆ）をコードし、ここで、ｍＣｈｅｒｒｙは指示作用を有し、ＣＡＲ及びＢｉＴＥは、腫瘍免疫治療に使用可能である。
【図2】本発明のＨＡＴＦとそれにマッチングするＲＥとが共に制御した赤色蛍光タンパクｍＣｈｅｒｒｙの増幅倍数が百倍以上に達し、従来の人工転写因子（ＧＡＬ４－ＶＰ６４）ベクター及びその反応エレメント（ＧＡＬ４ ＵＡＳ）の１０倍アップレギュレーションより遥かに優れていることを示す。図２ａは、トランスフェクション４８ｈ後の標的遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）の発現のフローサイトメトリーグラフである。図２ｂと図２ｃは、それぞれトランスフェクション４８ｈ後のｍＣｈｅｒｒｙの発現陽性率と蛍光強度がいずれも明らかに向上し、しかも本発明のＨＡＴＦとそれにマッチングするＲＥエレメントは、バックグラウンド漏洩においても、標的誘導レベルにおいても、いずれも従来の人工転写因子及びそれにマッチングする反応エレメントより顕著に優れていることを示す。
【図3】図１のレンチウイルス発現プラスミドで調製されたレンチウイルス発現ベクターが陽性のプライマリＴ細胞を形質導入したことを示し、通常の酸素環境下では極めて低いレベルのｍＣｈｅｒｒｙ発現しか検出できないが、低酸素条件下ではｍＣｈｅｒｒｙの発現を効果的に誘導する。また、ダブルウイルスベクターで導入された２ユニット形態の低酸素トリガーの転写制御システムの低酸素誘導レベルは、モノウイルスベクターで導入された１ユニット形態の低酸素トリガーの転写制御システムより遥かに低い。
【図4】低酸素トリガーの転写制御システムによりエンジニアリングＴ細胞（低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞）と従来のＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の異なる酸素濃度でのＣＡＲ誘導発現レベルを示す。フローサイトメトリー結果に示すように、低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は良好な低酸素誘導特性を持ち、生理的低酸素（１％Ｏ2）条件下で、ＨＥＲ２ ＣＡＲの発現量が顕著に増え、ＨＲＴＥ２ ＣＡＲ低酸素誘導発現レベルが現在よく使われているＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＨＥＲ２ ＣＡＲ発現レベルと同程度である。
【図5】低酸素トリガーの転写制御システムによって制御されるＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞）は低酸素環境下でＨＥＲ２抗原によって発現されるＳＫＯＶ３とＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍細胞を選択的に殺傷するが、従来のＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞殺傷は選択性がなく、通常の酸素と低酸素環境下での腫瘍細胞殺傷効率に差がないことを示す。
【図6】ヒト由来ＨＥＲ２標的抗原のヒト化マウスモデル上で、低酸素トリガーの転写制御システムによって制御されるＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞）のインビボ安全性を評価することを示す。対照ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみはマウス体重の進行的な低下、死亡率の増加及び肝機能障害を引き起こし、しかも大量のＴ細胞活性化関連サイトカインが血液中に放出されるが、低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は上記の毒副作用を引き起こさない。
【図7】低酸素トリガーの転写制御システムに制御されるＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞）が卵巣がん（ＳＫＯＶ３）と肺がんＮＣＩ－Ｈ２９２）の成長を効果的に制御できることを示す。
【図8】低酸素トリガーの転写制御システムが二重特異性Ｔ細胞アダプタータンパク質の発現を制御することを示す。即ち通常の酸素環境下での低酸素感受性人工転写因子は発現されず、低酸素環境下で誘導発現された人工転写因子は異なるコピー数の人工転写因子認識エレメントと組み合ってＣＤ４７／ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞アダプタータンパク質の発現を駆動することができることを示す。
【図9】低酸素トリガーの転写制御システムにより制御されるＢｉＴＥ－Ｔ細胞（低酸素感受性ＢｉＴＥ－Ｔ細胞）が、低酸素環境下でＳＫＯＶ３及びＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍細胞を選択的に殺傷できることを示す。
【図10】静脈注射と腫瘍内注射された、低酸素トリガーの転写制御システムにより制御されるＢｉＴＥ－Ｔ細胞（低酸素感受性ＢｉＴＥ－Ｔ細胞）がいずれも腫瘍の成長を効果的に抑制できることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0042】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【0043】
以下の実施例の実験方法は、特に断らない限り、いずれも当分野の通常実験方法である。以下の実施例で使用される実験材料は、特に断らない限り、通常の生化学試薬の販売会社から購入したものであり、ここで、
ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地は、いずれもＣｏｒｎｉｎｇ社から購入し、リンパ球培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５はＬｏｎｚａ社から購入した。
Ｔ細胞増殖培地の調製方法は、中国特許ＣＮ２０１９１０１６３３９１．１を参照し、それは基本培地及びサイトカインからなり、基本培地はリンパ球培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５であり、サイトカイン ５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５及び３０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２１を追加的に添加した。ここで、サイトカインＩＬ－７及びＩＬ－１５は、Ｒ＆Ｄ社から購入し、ＩＬ－２１は、近岸蛋白質科技有限公司から購入した。
ウシ胎児血清は、ＢＩ社から購入した。
ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクションキットはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。
Ｌｅｎｔｉ－Ｘレンチウイルス濃縮試薬は、Ｔａｋａｒａ社から購入した。
遺伝子の合成は、上海捷瑞生物工程有限公司から購入した。
ブランクレンチウイルス発現プラスミド（ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ及びｐＸＷ－ＥＦ１α－ＭＣＳ）におけるパッキングプラスミドｐｓＰＡＸ２とエンベローププラスミドＰＭＤ２．Ｇは、Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入し、ｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＡＴＲ－ＲＥ、ｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＧＡＬ４ＵＡＳ、ｐＳＶ１．０－ＨＡＴＦ、ｐＳＶ１．０－Ｔａｔ及びｐＳＶ１．０－ＧＡＬ４－ＶＰ６４は、いずれも上海▲シン▼湾生物科技有限公司から購入した。
Ｓｔａｂｌｅ３化学的コンピテント細胞は、上海唯地生物技術有限公司から購入した。
エンドトキシンフリープラスミドミニプレップキットとエンドトキシンフリープラスミドミディプレップキットは、それぞれＯＭＥＧＡ社及びＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ社から購入した。
ルシフェラーゼ基質は、プロメガバイオテクノロジー有限公司から購入した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ａ５４９肺がん細胞、ＳＫＯＶ３卵巣がん細胞及びＮＣＩ－Ｈ２９２肺がん細胞は、米国ＡＴＣＣから購入した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を安定的に統合したＳＫＯＶ３－ｌｕｃ及びＮＣＩ－Ｈ２９２－ｌｕｃは、当社により改造した。
重症複合免疫不全マウス（Ｂ－ＮＤＧ）は、百奥賽図江蘇遺伝子生物技術有限公司から購入した。
ヒト由来ＨＥＲ２遺伝子とホタルルシフェラーゼの複製欠損型５型アデノウイルス（ＨＥＲ２－Ｌｕｃ－Ａｄ）は、Ｇｅｎｅｃｈｅｍ社から購入した。
ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地は、いずれもＣｏｒｎｉｎｇ社から購入し、リンパ球培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５はＬｏｎｚａ社から購入した。
Ｔ細胞増殖培地の調製方法は、中国特許ＣＮ２０１９１０１６３３９１．１を参照し、それは基本培地及びサイトカインからなり、基本培地はリンパ球培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５であり、サイトカイン ５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５及び３０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２１を追加的に添加した。ここで、サイトカインＩＬ－７及びＩＬ－１５は、Ｒ＆Ｄ社から購入し、ＩＬ－２１は、近岸蛋白質科技有限公司から購入した。
ウシ胎児血清は、ＢＩ社から購入した。
ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクションキットはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。
Ｌｅｎｔｉ－Ｘレンチウイルス濃縮試薬は、Ｔａｋａｒａ社から購入した。
遺伝子の合成は、上海捷瑞生物工程有限公司から購入した。
ブランクレンチウイルス発現プラスミド（ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ及びｐＸＷ－ＥＦ１α－ＭＣＳ）におけるパッキングプラスミドｐｓＰＡＸ２とエンベローププラスミドＰＭＤ２．Ｇは、Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入し、ｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＡＴＲ－ＲＥ、ｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＧＡＬ４ＵＡＳ、ｐＳＶ１．０－ＨＡＴＦ、ｐＳＶ１．０－Ｔａｔ及びｐＳＶ１．０－ＧＡＬ４－ＶＰ６４は、いずれも上海▲シン▼湾生物科技有限公司から購入した。
Ｓｔａｂｌｅ３化学的コンピテント細胞は、上海唯地生物技術有限公司から購入した。
エンドトキシンフリープラスミドミニプレップキットとエンドトキシンフリープラスミドミディプレップキットは、それぞれＯＭＥＧＡ社及びＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ社から購入した。
ルシフェラーゼ基質は、プロメガバイオテクノロジー有限公司から購入した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ａ５４９肺がん細胞、ＳＫＯＶ３卵巣がん細胞及びＮＣＩ－Ｈ２９２肺がん細胞は、米国ＡＴＣＣから購入した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を安定的に統合したＳＫＯＶ３－ｌｕｃ及びＮＣＩ－Ｈ２９２－ｌｕｃは、当社により改造した。
重症複合免疫不全マウス（Ｂ－ＮＤＧ）は、百奥賽図江蘇遺伝子生物技術有限公司から購入した。
ヒト由来ＨＥＲ２遺伝子とホタルルシフェラーゼの複製欠損型５型アデノウイルス（ＨＥＲ２－Ｌｕｃ－Ａｄ）は、Ｇｅｎｅｃｈｅｍ社から購入した。
【0044】
実施例１ レンチウイルス発現プラスミドの構築
上海捷瑞生物工程有限公司によってＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２－５及び９に示される核酸配列は合成され、ブランクレンチウイルス発現プラスミド（ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰとｐＸＷ－ＥＦ１α－ＭＣＳ）にクローニングされることで、下記の組換えレンチウイルス発現プラスミドを得た。
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ、
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＢＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ、
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ、
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ、
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＣＡＲ、
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＢｉＴＥ
プラスミドプロファイルは図１に示すとおりである。
上海捷瑞生物工程有限公司によってＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２－５及び９に示される核酸配列は合成され、ブランクレンチウイルス発現プラスミド（ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰとｐＸＷ－ＥＦ１α－ＭＣＳ）にクローニングされることで、下記の組換えレンチウイルス発現プラスミドを得た。
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ、
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＢＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ、
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ、
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ、
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＣＡＲ、
ｐＸＷ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＢｉＴＥ
プラスミドプロファイルは図１に示すとおりである。
【0045】
実施例２ レンチウイルスのパッキング、濃縮及び力価測定
２．１ レンチウイルスのパッキング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞処理：トランスフェクション前２４時間、対数増殖期にあるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を収集し、それを１０ｃｍ細胞シャーレに接種し（６×１０6～８×１０6個細胞）、細胞を１０ｍＬの完全ＤＭＥＭ培地にて成長させ、３７℃、５％ＣＯ2細胞インキュベータに置いて１８～２４時間培養し、細胞密度が７０～９０％に達するとプラスミドトランスフェクションを行うことができる。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞トランスフェクション：１５ｍＬ遠心分離管に１ｍＬ基本ＤＭＥＭ培地を加え、質量比がレンチウイルス発現プラスミド：パッキングプラスミド：エンベローププラスミド＝１：３：１となるようにトランスフェクション混合液を調製し、プラスミドの総量は合計１５μｇ／皿であった。プラスミド量（μｇ）：トランスフェクション試薬（μＬ）＝１：２の割合でＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬３０μＬを入れ、室温で１５～２０ｍｉｎインキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を敷いたシャーレに入れ、３７℃、５％ＣＯ2細胞インキュベータに置いて４８時間培養を続けた後、ウイルス上澄みを収集し、１０００×ｇ、４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、チューブ底の沈殿を捨ててウイルス上澄みを収集した。
２．１ レンチウイルスのパッキング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞処理：トランスフェクション前２４時間、対数増殖期にあるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を収集し、それを１０ｃｍ細胞シャーレに接種し（６×１０6～８×１０6個細胞）、細胞を１０ｍＬの完全ＤＭＥＭ培地にて成長させ、３７℃、５％ＣＯ2細胞インキュベータに置いて１８～２４時間培養し、細胞密度が７０～９０％に達するとプラスミドトランスフェクションを行うことができる。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞トランスフェクション：１５ｍＬ遠心分離管に１ｍＬ基本ＤＭＥＭ培地を加え、質量比がレンチウイルス発現プラスミド：パッキングプラスミド：エンベローププラスミド＝１：３：１となるようにトランスフェクション混合液を調製し、プラスミドの総量は合計１５μｇ／皿であった。プラスミド量（μｇ）：トランスフェクション試薬（μＬ）＝１：２の割合でＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬３０μＬを入れ、室温で１５～２０ｍｉｎインキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を敷いたシャーレに入れ、３７℃、５％ＣＯ2細胞インキュベータに置いて４８時間培養を続けた後、ウイルス上澄みを収集し、１０００×ｇ、４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、チューブ底の沈殿を捨ててウイルス上澄みを収集した。
【0046】
２．２ レンチウイルスの濃縮
０．４５μｍフィルターを用いて遠心分離で収集されたウイルス上澄みをさらに濾過し、ウイルス上澄みの１／３体積のＬｅｎｔｉ－Ｘレンチウイルス濃縮試薬を加え、数回転倒混和し、４℃で一晩インキュベートし、２０００×ｇ、４℃で４５ｍｉｎ遠心分離すると、遠心分離管の底部に白色沈殿が視認されることができ、それは濃縮後のウイルス粒子であった。上澄みを慎重に捨て、元ウイルス上澄みの１／５０～１／１００体積のブランクＲＰＭＩ１６４０培地で白色沈殿を再懸濁し、分注して－８０℃で凍結保存して使用に備えた。
０．４５μｍフィルターを用いて遠心分離で収集されたウイルス上澄みをさらに濾過し、ウイルス上澄みの１／３体積のＬｅｎｔｉ－Ｘレンチウイルス濃縮試薬を加え、数回転倒混和し、４℃で一晩インキュベートし、２０００×ｇ、４℃で４５ｍｉｎ遠心分離すると、遠心分離管の底部に白色沈殿が視認されることができ、それは濃縮後のウイルス粒子であった。上澄みを慎重に捨て、元ウイルス上澄みの１／５０～１／１００体積のブランクＲＰＭＩ１６４０培地で白色沈殿を再懸濁し、分注して－８０℃で凍結保存して使用に備えた。
【0047】
２．３ レンチウイルス力価測定
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を１×１０5個／ウェルで９６ウェルＵベースプレートに接種し、収集したレンチウイルス濃縮液を１０倍で漸増希釈した。１００μＬのウイルス希釈液を相応なウェルに加え、感染促進試薬である硫酸プロタミンを加えて濃度を１０μｇ／ｍＬに調整し、１０００×ｇ、３２℃で９０ｍｉｎ遠心分離して感染させ、一晩培養した後、新鮮なＲＰＭＩ１６４０完全培地に交換し、４８時間培養し続け、フローサイトメーターで蛍光陽性細胞の割合を検出した。ウイルス力価は以下の式で計算される。
ウイルス力価（ＴＵ／ｍＬ）＝１×１０5×蛍光陽性細胞割合／１００×１０００×相応な希釈倍数。
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を１×１０5個／ウェルで９６ウェルＵベースプレートに接種し、収集したレンチウイルス濃縮液を１０倍で漸増希釈した。１００μＬのウイルス希釈液を相応なウェルに加え、感染促進試薬である硫酸プロタミンを加えて濃度を１０μｇ／ｍＬに調整し、１０００×ｇ、３２℃で９０ｍｉｎ遠心分離して感染させ、一晩培養した後、新鮮なＲＰＭＩ１６４０完全培地に交換し、４８時間培養し続け、フローサイトメーターで蛍光陽性細胞の割合を検出した。ウイルス力価は以下の式で計算される。
ウイルス力価（ＴＵ／ｍＬ）＝１×１０5×蛍光陽性細胞割合／１００×１０００×相応な希釈倍数。
【0048】
実施例３ 遺伝子操作されたＴ細胞の調製
以下の通りに記載される濃縮により得られたレンチウイルスベクター：
ＬＶ－ＥＦ１α－ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ、
ＬＶ－ＥＦ１α－ＢＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ、
ＬＶ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ、
ＬＶ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ、
ＬＶ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＣＡＲ、
ＬＶ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＢｉＴＥをＭＯＩ＝３の割合で、１×１０6個の予め活性化された末梢血単核細胞を敷いた４８ウェル平底プレートに加え、感染促進試薬である硫酸プロタミンを添加し、使用濃度を１０μｇ／ｍＬに調整し、１０００×ｇ、３２℃での遠心分離で９０ｍｉｎ感染させ、一晩培養した後、新鮮なＴ細胞増殖培地に交換して培養し続けた。２～３日毎に新鮮なＴ細胞増殖培地を添加し、細胞密度を０．５×１０6～２×１０6個細胞／ｍＬに調整した。感染後６～７日後、Ｔ細胞を活性化させた免疫磁気ビーズを除去し、遺伝子操作されたＴ細胞を引き続き培養、増幅し、細胞が休止した後（磁気ビーズ除去後９～１４日）に後の機能実験が可能になった。
以下の通りに記載される濃縮により得られたレンチウイルスベクター：
ＬＶ－ＥＦ１α－ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ、
ＬＶ－ＥＦ１α－ＢＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ、
ＬＶ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ、
ＬＶ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ、
ＬＶ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＣＡＲ、
ＬＶ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＢｉＴＥをＭＯＩ＝３の割合で、１×１０6個の予め活性化された末梢血単核細胞を敷いた４８ウェル平底プレートに加え、感染促進試薬である硫酸プロタミンを添加し、使用濃度を１０μｇ／ｍＬに調整し、１０００×ｇ、３２℃での遠心分離で９０ｍｉｎ感染させ、一晩培養した後、新鮮なＴ細胞増殖培地に交換して培養し続けた。２～３日毎に新鮮なＴ細胞増殖培地を添加し、細胞密度を０．５×１０6～２×１０6個細胞／ｍＬに調整した。感染後６～７日後、Ｔ細胞を活性化させた免疫磁気ビーズを除去し、遺伝子操作されたＴ細胞を引き続き培養、増幅し、細胞が休止した後（磁気ビーズ除去後９～１４日）に後の機能実験が可能になった。
【0049】
実施例４ 遺伝子操作されたＡ５４９細胞の調製
濃縮により得られた２～６個のコピー数のＲＥを含有するレンチウイルスベクターＬＶ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＢｉＴＥ（ＭＯＩ＝３）を、隔日に３×１０5個のＡ５４９細胞を敷いた６ウェルの平底プレートに加え、感染促進試薬であるポリブレンを添加し、使用濃度を１０μｇ／ｍＬに調整し、一晩培養した後、新鮮な完全培地Ｒ１０（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ＰＳ）に交換して培養し続けた。細胞を８０％カバレージまで成長させた後、拡大培養を行って使用に備えた。
濃縮により得られた２～６個のコピー数のＲＥを含有するレンチウイルスベクターＬＶ－ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＢｉＴＥ（ＭＯＩ＝３）を、隔日に３×１０5個のＡ５４９細胞を敷いた６ウェルの平底プレートに加え、感染促進試薬であるポリブレンを添加し、使用濃度を１０μｇ／ｍＬに調整し、一晩培養した後、新鮮な完全培地Ｒ１０（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ＰＳ）に交換して培養し続けた。細胞を８０％カバレージまで成長させた後、拡大培養を行って使用に備えた。
【0050】
実施例５ 本発明の低酸素トリガーの人工転写因子の転写誘導レベル
本発明のＨＡＴＦが従来のＧＡＬ４－ＶＰ６４人工転写因子よりもより優れたな外来遺伝子発現誘導能力を有することを検証するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にプラスミドトランスフェクション実験を行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５×１０4個／ウェルで４８ウェルプレートに敷き、翌日の細胞接着後、トランスフェクションを行った。単一トランスフェクション群では、０．２５μｇ反応エレメントプラスミドｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＡＴＲ－ＲＥ又はｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＧＡＬ４ＵＡＳのみをトランスフェクションし、実験群では、０．２５μｇのｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＲＥプラスミド及びｐＳＶ１．０－ＨＡＴＦ又はｐＳＶ１．０－Ｔａｔ、又は０．２５μｇのｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＧＡＬ４ＵＡＳプラスミド及びｐＳＶ１．０－ＧＡＬ４－ＶＰ６４をトランスフェクションし、プラスミド量（μｇ）：トランスフェクション試薬（μＬ）＝１：２の割合でＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬を加え、室温で１５～２０ｍｉｎインキュベートした後、細胞培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ2細胞インキュベータに置いて４８ｈ培養した後、標的遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙの発現状況をフローサイトメトリーにより検出した。
結果は、図２に示すとおりであり、ＲＥトランスフェクション群では、標的遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙの発現陽性率はわずか３．９０％であり、ＨＡＴＦ誘導後のｍＣｈｅｒｒｙ陽性率は９３．３％と高く、さらにＴａｔを添加した場合、陽性率は９６．９％と高かったが、ＧＡＬ４ＵＡＳトランスフェクション群では、標的遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙの発現陽性率は１１．４％であり、ＧＡＬ４－ＶＰ６４誘導後のｍＣｈｅｒｒｙ陽性率は７０．９％であった（図２ａ）。ＨＡＴＦ誘導の場合、陽性率は、反応エレメント対照群の２２．７倍であり（図２ｂ）、蛍光強度は、反応エレメント対照群の１１０倍であり（図２ｃ）、Ｔａｔを加えた場合、さらに誘導レベルを向上させ、陽性率及び蛍光強度の誘導倍数は、それぞれ２３．６倍及び３４７倍に向上し、従来のＧＡＬ４－ＶＰ６４誘導の場合、陽性率は、反応エレメント対照群の５．７倍であり（図２ｂ）、蛍光強度は、反応エレメント対照群の１５倍のみであり（図２ｃ）、本発明において構築されたＨＡＴＦ人工転写因子は、バックグラウンド漏洩レベルにおいても、標的遺伝子の誘導能力においても、従来のＧＡＬ４－ＶＰ６４人工転写因子より優れていることが示された。
本発明のＨＡＴＦが従来のＧＡＬ４－ＶＰ６４人工転写因子よりもより優れたな外来遺伝子発現誘導能力を有することを検証するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にプラスミドトランスフェクション実験を行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５×１０4個／ウェルで４８ウェルプレートに敷き、翌日の細胞接着後、トランスフェクションを行った。単一トランスフェクション群では、０．２５μｇ反応エレメントプラスミドｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＡＴＲ－ＲＥ又はｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＧＡＬ４ＵＡＳのみをトランスフェクションし、実験群では、０．２５μｇのｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＲＥプラスミド及びｐＳＶ１．０－ＨＡＴＦ又はｐＳＶ１．０－Ｔａｔ、又は０．２５μｇのｐＳＶ１．０－ＥＧＦＰ－ＧＡＬ４ＵＡＳプラスミド及びｐＳＶ１．０－ＧＡＬ４－ＶＰ６４をトランスフェクションし、プラスミド量（μｇ）：トランスフェクション試薬（μＬ）＝１：２の割合でＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬を加え、室温で１５～２０ｍｉｎインキュベートした後、細胞培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ2細胞インキュベータに置いて４８ｈ培養した後、標的遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙの発現状況をフローサイトメトリーにより検出した。
結果は、図２に示すとおりであり、ＲＥトランスフェクション群では、標的遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙの発現陽性率はわずか３．９０％であり、ＨＡＴＦ誘導後のｍＣｈｅｒｒｙ陽性率は９３．３％と高く、さらにＴａｔを添加した場合、陽性率は９６．９％と高かったが、ＧＡＬ４ＵＡＳトランスフェクション群では、標的遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙの発現陽性率は１１．４％であり、ＧＡＬ４－ＶＰ６４誘導後のｍＣｈｅｒｒｙ陽性率は７０．９％であった（図２ａ）。ＨＡＴＦ誘導の場合、陽性率は、反応エレメント対照群の２２．７倍であり（図２ｂ）、蛍光強度は、反応エレメント対照群の１１０倍であり（図２ｃ）、Ｔａｔを加えた場合、さらに誘導レベルを向上させ、陽性率及び蛍光強度の誘導倍数は、それぞれ２３．６倍及び３４７倍に向上し、従来のＧＡＬ４－ＶＰ６４誘導の場合、陽性率は、反応エレメント対照群の５．７倍であり（図２ｂ）、蛍光強度は、反応エレメント対照群の１５倍のみであり（図２ｃ）、本発明において構築されたＨＡＴＦ人工転写因子は、バックグラウンド漏洩レベルにおいても、標的遺伝子の誘導能力においても、従来のＧＡＬ４－ＶＰ６４人工転写因子より優れていることが示された。
【0051】
実施例６ 低酸素感受性転写制御システムによる蛍光タンパク質の発現の制御
実施例１のレンチウイルス発現プラスミド、実施例２のレンチウイルスベクターの調製方法及び実施例３に記載の方法を用いて、ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ、ＥＦ１α－ＢＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥとＥＦ１α－ＧＦＰ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を統合した３種の異なるＴ細胞を調製し、それぞれＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ反応エレメント、２ユニット形態の低酸素感受性転写制御システム（二重ベクター共感染）及び１ユニット形態の低酸素感受性転写制御システム（単一ベクター感染）とした。上記の３種の遺伝子操作されたＴ細胞を通常の酸素条件（２１％Ｏ2）と低酸素条件（１％Ｏ2）に置いて２４ｈ培養し、培養終了後に細胞を収集してＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳの１×ＰＢＳ）で１回溶出し、５００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、終了後、３００μＬ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁して均一に混合し、さらにフローサイトメーターを用いて赤色蛍光タンパクｍＣｈｅｒｒｙの発現を検出した。
結果は、図３に示すとおりである。図３のフローサイトメトリー結果から、本発明の１ユニット形態の低酸素感受性転写制御システムは、通常の酸素環境下でのバックグラウンド漏洩が３．０５％と低く、低酸素環境下で高レベルの赤色蛍光タンパクｍＣｈｅｒｒｙを誘導発現し、陽性率が９１．４％に増え、平均蛍光強度（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）が１４８０と高かったことが分かった。興味深いことに、ダブルウイルスベクター共感染によって得られた２ユニット形態の低酸素感受性転写制御システムの低酸素誘導レベルは、単一ウイルスベクターの感染によって得られた１ユニット形態の低酸素感受性転写制御システムに比べて遥かに低く、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性率と蛍光強度が、わずか３１．８％と８６．６であり、１ユニット形態の低酸素誘導陽性率と平均蛍光強度の３４．８％と５．８５％のみであり、１ユニット形態の低酸素感受性転写制御システムを携帯する単一ベクターの低酸素誘導効果が最善であることと、バックグラウンド漏洩と低酸素誘導レベルが、いずれも現在報告されている二重ベクターのバイナリ転写増幅システムよりも顕著に優れていたことを示唆している。
実施例１のレンチウイルス発現プラスミド、実施例２のレンチウイルスベクターの調製方法及び実施例３に記載の方法を用いて、ＥＦ１α－ＧＦＰ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ、ＥＦ１α－ＢＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥとＥＦ１α－ＧＦＰ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を統合した３種の異なるＴ細胞を調製し、それぞれＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ反応エレメント、２ユニット形態の低酸素感受性転写制御システム（二重ベクター共感染）及び１ユニット形態の低酸素感受性転写制御システム（単一ベクター感染）とした。上記の３種の遺伝子操作されたＴ細胞を通常の酸素条件（２１％Ｏ2）と低酸素条件（１％Ｏ2）に置いて２４ｈ培養し、培養終了後に細胞を収集してＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳの１×ＰＢＳ）で１回溶出し、５００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、終了後、３００μＬ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁して均一に混合し、さらにフローサイトメーターを用いて赤色蛍光タンパクｍＣｈｅｒｒｙの発現を検出した。
結果は、図３に示すとおりである。図３のフローサイトメトリー結果から、本発明の１ユニット形態の低酸素感受性転写制御システムは、通常の酸素環境下でのバックグラウンド漏洩が３．０５％と低く、低酸素環境下で高レベルの赤色蛍光タンパクｍＣｈｅｒｒｙを誘導発現し、陽性率が９１．４％に増え、平均蛍光強度（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）が１４８０と高かったことが分かった。興味深いことに、ダブルウイルスベクター共感染によって得られた２ユニット形態の低酸素感受性転写制御システムの低酸素誘導レベルは、単一ウイルスベクターの感染によって得られた１ユニット形態の低酸素感受性転写制御システムに比べて遥かに低く、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性率と蛍光強度が、わずか３１．８％と８６．６であり、１ユニット形態の低酸素誘導陽性率と平均蛍光強度の３４．８％と５．８５％のみであり、１ユニット形態の低酸素感受性転写制御システムを携帯する単一ベクターの低酸素誘導効果が最善であることと、バックグラウンド漏洩と低酸素誘導レベルが、いずれも現在報告されている二重ベクターのバイナリ転写増幅システムよりも顕著に優れていたことを示唆している。
【0052】
実施例７ 低酸素感受性転写制御システムによるキメラ抗原受容体の発現の制御
実施例１のレンチウイルス発現プラスミド、実施例２のレンチウイルスベクターの調製方法及び実施例３に記載の方法を用いて、ＥＦ１α－ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ及びＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＣＡＲ遺伝子を携帯する２種のエンジニアリングＴ細胞を調製し、それぞれＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（陽性対照）及び低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞と命名した。上記の２種の遺伝子操作されたＴ細胞をそれぞれ通常の酸素条件（２１％Ｏ2）又は低酸素条件（１％Ｏ2）で２４ｈ培養し、終了後に細胞を収集しＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで１回溶出し、２μｇ／ｍＬのフローサイトメトリー抗体ＰＥ－ａｎｔｉ－ＤＹＫＤＤＤＤＫを加え、室温で２０ｍｉｎ遮光インキュベートし、終了後、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回溶出し、３００μＬ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁して均一に混合し、そしてフローサイトメーターでＨＥＲ２ ＣＡＲ分子の発現を検出した。
結果は、図４に示すとおりであり、フローサイトメトリー結果からに示されているように、通常の酸素と低酸素条件下でＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（陽性対照）はいずれもＨＥＲ２ ＣＡＲ分子を高発現させたが、低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は通常の酸素条件下でＨＥＲ２ ＣＡＲ分子を低発現させ（１０．８％）、低酸素条件下でＨＥＲ２ ＣＡＲ分子の発現をアップレギュレーションし（６２．６％）、ＣＡＲ陽性率と平均蛍光強度がそれぞれ６倍及び２３５倍向上し、現在報告されている低酸素感受性ＣＡＲ－Ｔ細胞の誘導効果より遥かに優れていた（Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ Ａ，Ｍａｒｅｃｈａｌ Ａ，Ｆｉｌｈｏｌ ＪＭ，ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｆ－ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｍａｋｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＡＲ Ｔ－ｃｅｌｌ［Ｊ］． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１７，７：３９８３３、Ｌｉａｏ Ｑ，Ｈｅ Ｈ，Ｍａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＨｉＣＡＲ） ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｋｉｌｌｉｎｇ． Ｂｉｏｍａｒｋ Ｒｅｓ． ２０２０，８（１）：５６）。
実施例１のレンチウイルス発現プラスミド、実施例２のレンチウイルスベクターの調製方法及び実施例３に記載の方法を用いて、ＥＦ１α－ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ及びＥＦ１α－ＧＦＰ－ＨＡＴＦ－ＨＲＴＥ－ＲＥ－ＣＡＲ遺伝子を携帯する２種のエンジニアリングＴ細胞を調製し、それぞれＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（陽性対照）及び低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞と命名した。上記の２種の遺伝子操作されたＴ細胞をそれぞれ通常の酸素条件（２１％Ｏ2）又は低酸素条件（１％Ｏ2）で２４ｈ培養し、終了後に細胞を収集しＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで１回溶出し、２μｇ／ｍＬのフローサイトメトリー抗体ＰＥ－ａｎｔｉ－ＤＹＫＤＤＤＤＫを加え、室温で２０ｍｉｎ遮光インキュベートし、終了後、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回溶出し、３００μＬ ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁して均一に混合し、そしてフローサイトメーターでＨＥＲ２ ＣＡＲ分子の発現を検出した。
結果は、図４に示すとおりであり、フローサイトメトリー結果からに示されているように、通常の酸素と低酸素条件下でＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（陽性対照）はいずれもＨＥＲ２ ＣＡＲ分子を高発現させたが、低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は通常の酸素条件下でＨＥＲ２ ＣＡＲ分子を低発現させ（１０．８％）、低酸素条件下でＨＥＲ２ ＣＡＲ分子の発現をアップレギュレーションし（６２．６％）、ＣＡＲ陽性率と平均蛍光強度がそれぞれ６倍及び２３５倍向上し、現在報告されている低酸素感受性ＣＡＲ－Ｔ細胞の誘導効果より遥かに優れていた（Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ Ａ，Ｍａｒｅｃｈａｌ Ａ，Ｆｉｌｈｏｌ ＪＭ，ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｆ－ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｍａｋｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＡＲ Ｔ－ｃｅｌｌ［Ｊ］． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１７，７：３９８３３、Ｌｉａｏ Ｑ，Ｈｅ Ｈ，Ｍａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＨｉＣＡＲ） ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｋｉｌｌｉｎｇ． Ｂｉｏｍａｒｋ Ｒｅｓ． ２０２０，８（１）：５６）。
【0053】
実施例８ 低酸素感受性転写制御システムによるキメラ抗原受容体Ｔ細胞の腫瘍細胞殺傷の制御
腫瘍細胞殺傷効率は、ルシフェラーゼに基づく細胞殺傷検出法（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ）により評価した。まず、１×１０4個のＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ遺伝子で修飾されたヒト卵巣がん細胞）又はＮＣＩ－Ｈ２９２－Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ遺伝子で修飾されたヒト肺がん細胞）を９６ウェルの平底ブラックプレートに接種し、ウェルあたり１００μＬの培地に入れ、３７℃、５％ＣＯ2細胞インキュベータに置いて１８ｈ培養した。翌日、エフェクター細胞：標的細胞が１：２、１：１及び２：１の割合で、実施例６の遺伝子操作されたＴ細胞及び同時に培養された形質転換されていないＴ細胞を、標的細胞を含有するウェルに加え、それぞれ通常の酸素条件（２１％Ｏ2）又は低酸素条件（１％Ｏ2）で２４ｈ培養し、共培養終了後、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）９６マイクロプレート発光検出器を用いて標的細胞のルシフェラーゼ活性値を検出した。
細胞殺傷率の計算式は以下のとおりである。
細胞殺傷率（％）＝（形質導入されていないＴ細胞群のルシフェラーゼ活性値－実験群のルシフェラーゼ活性値）／形質導入されていないＴ細胞群のルシフェラーゼ活性値×１００
結果は、図５に示すとおりであり、ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（陽性対照）は、通常の酸素条件においても、低酸素条件においてもＳＫＯＶ３及びＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍細胞を効果的に殺傷でき、選択的殺傷特性がなかった。低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、通常の酸素条件下での腫瘍殺傷活性が比較的低く、エフェクター細胞：標的細胞が２：１となる場合の殺傷率が、１０．３３％（ＳＫＯＶ３）と１３．３３％（ＮＣＩ－Ｈ２９２）であり、低酸素環境下では、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞（６７．６７％）とＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍細胞（９３．３３％）を選択的に効率的に殺傷でき、腫瘍細胞の殺傷活性が６倍向上した。
腫瘍細胞殺傷効率は、ルシフェラーゼに基づく細胞殺傷検出法（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ）により評価した。まず、１×１０4個のＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ遺伝子で修飾されたヒト卵巣がん細胞）又はＮＣＩ－Ｈ２９２－Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ遺伝子で修飾されたヒト肺がん細胞）を９６ウェルの平底ブラックプレートに接種し、ウェルあたり１００μＬの培地に入れ、３７℃、５％ＣＯ2細胞インキュベータに置いて１８ｈ培養した。翌日、エフェクター細胞：標的細胞が１：２、１：１及び２：１の割合で、実施例６の遺伝子操作されたＴ細胞及び同時に培養された形質転換されていないＴ細胞を、標的細胞を含有するウェルに加え、それぞれ通常の酸素条件（２１％Ｏ2）又は低酸素条件（１％Ｏ2）で２４ｈ培養し、共培養終了後、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）９６マイクロプレート発光検出器を用いて標的細胞のルシフェラーゼ活性値を検出した。
細胞殺傷率の計算式は以下のとおりである。
細胞殺傷率（％）＝（形質導入されていないＴ細胞群のルシフェラーゼ活性値－実験群のルシフェラーゼ活性値）／形質導入されていないＴ細胞群のルシフェラーゼ活性値×１００
結果は、図５に示すとおりであり、ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（陽性対照）は、通常の酸素条件においても、低酸素条件においてもＳＫＯＶ３及びＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍細胞を効果的に殺傷でき、選択的殺傷特性がなかった。低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、通常の酸素条件下での腫瘍殺傷活性が比較的低く、エフェクター細胞：標的細胞が２：１となる場合の殺傷率が、１０．３３％（ＳＫＯＶ３）と１３．３３％（ＮＣＩ－Ｈ２９２）であり、低酸素環境下では、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞（６７．６７％）とＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍細胞（９３．３３％）を選択的に効率的に殺傷でき、腫瘍細胞の殺傷活性が６倍向上した。
【0054】
実施例９ 低酸素感受性ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ安全性
組換えアデノウイルス（ＨＥＲ２－Ａｄ）を１×ＰＢＳで目標用量８×１０9ＴＵ／ｍＬに希釈した。
１２５μＬ ＨＥＲ２－Ａｄを１ｍＬのシリンジで腹腔内注射し、７日後に小動物用生体イメージャーを用いてルシフェラーゼの発現を検出し、陽性マウスを選択してからランダムに群分けし、ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞注入群１３匹のマウスを除き、残りの各群には４匹のマウスを選択して後続の実験に用いた。
５×１０6個のＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞、低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及び対照細胞を静脈再注入し、２～３日おきにマウスの体重を秤量し、眼窩静脈から採血して血清サイトカインを測定し、及びマウスの健康状態を観察した。
結果は、図６に示すとおりであり、コントロールのＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、マウスの体重の進行的な低下（図６ａ）、死亡率の増加（図６ｂ）を引き起こし、また、肝機能の障害によりアラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）が大量に血液中に放出され（図６ｃ）、且つＴ細胞活性化関連サイトカインが大量に血液中に放出された（図６ｄ）が、低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は上記の毒副作用を引き起こさず、これは、オンターゲットオフ腫瘍毒性（Ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を引き起こさないことが示唆された。
組換えアデノウイルス（ＨＥＲ２－Ａｄ）を１×ＰＢＳで目標用量８×１０9ＴＵ／ｍＬに希釈した。
１２５μＬ ＨＥＲ２－Ａｄを１ｍＬのシリンジで腹腔内注射し、７日後に小動物用生体イメージャーを用いてルシフェラーゼの発現を検出し、陽性マウスを選択してからランダムに群分けし、ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞注入群１３匹のマウスを除き、残りの各群には４匹のマウスを選択して後続の実験に用いた。
５×１０6個のＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞、低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及び対照細胞を静脈再注入し、２～３日おきにマウスの体重を秤量し、眼窩静脈から採血して血清サイトカインを測定し、及びマウスの健康状態を観察した。
結果は、図６に示すとおりであり、コントロールのＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、マウスの体重の進行的な低下（図６ａ）、死亡率の増加（図６ｂ）を引き起こし、また、肝機能の障害によりアラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）が大量に血液中に放出され（図６ｃ）、且つＴ細胞活性化関連サイトカインが大量に血液中に放出された（図６ｄ）が、低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は上記の毒副作用を引き起こさず、これは、オンターゲットオフ腫瘍毒性（Ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を引き起こさないことが示唆された。
【0055】
実施例１０ 低酸素感受性ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍作用
１日前に無菌アイソレーターで飼育されたＢ－ＮＤＧマウスに対して背部局所除毛を行い、除毛については除毛クリームや動物用シェーバーを用いて、腫瘍細胞接種部位の皮膚を露出させればよい。
左手でマウスを固定し、即ち、左手でマウスの頭部、頸部及び背部皮膚を同時に把持し、その背部を左に向けて、背部右側の毛剃り部位を十分に露出させた後、右手でアルコール綿球を用いて消毒処理を行った。１ｍＬのインスリンシリンジで予め用意したＳＫＯＶ３又はＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍細胞をブローして均一に混合させた後、１２５μＬ細胞懸濁液（５×１０6個の腫瘍細胞）を吸い取り、針を針先と皮膚とが３０°～４０°の角度となるようにマウスの皮下に斜めに刺し、細胞が漏れないように細胞懸濁液をゆっくり注入した。１２５μＬの細胞懸濁液の注射が完了したあと、２～３秒間針を刺したままにしておき迅速に抜き出し、注射部位の皮下に小さくてはっきりと見える膨らみが見られた。
細胞接種後、２～３日おきにマウスの腫瘍形成状況及び健康状態を観察し、腫瘍形成後、ノギスでベースライン腫瘍体積を測定し、後続の実験を行った。
５×１０6個の低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞と対照細胞を静脈再注入し、２～３日おきに腫瘍のサイズを測定し、ノギスで腫瘍の長径と短径をそれぞれ測定し、腫瘍体積の計算式は体積＝（長径×短径2）／２とした。
結果は、図７に示すとおりであり、低酸素感受性転写制御システムによって制御されたＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、ＳＫＯＶ３（卵巣がん）及びＮＣＩ－Ｈ２９２（肺がん）の成長を効果的に抑制することができ、細胞再注入３５日目の腫瘍抑制率が１００％及び７８．５％と高かった。
１日前に無菌アイソレーターで飼育されたＢ－ＮＤＧマウスに対して背部局所除毛を行い、除毛については除毛クリームや動物用シェーバーを用いて、腫瘍細胞接種部位の皮膚を露出させればよい。
左手でマウスを固定し、即ち、左手でマウスの頭部、頸部及び背部皮膚を同時に把持し、その背部を左に向けて、背部右側の毛剃り部位を十分に露出させた後、右手でアルコール綿球を用いて消毒処理を行った。１ｍＬのインスリンシリンジで予め用意したＳＫＯＶ３又はＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍細胞をブローして均一に混合させた後、１２５μＬ細胞懸濁液（５×１０6個の腫瘍細胞）を吸い取り、針を針先と皮膚とが３０°～４０°の角度となるようにマウスの皮下に斜めに刺し、細胞が漏れないように細胞懸濁液をゆっくり注入した。１２５μＬの細胞懸濁液の注射が完了したあと、２～３秒間針を刺したままにしておき迅速に抜き出し、注射部位の皮下に小さくてはっきりと見える膨らみが見られた。
細胞接種後、２～３日おきにマウスの腫瘍形成状況及び健康状態を観察し、腫瘍形成後、ノギスでベースライン腫瘍体積を測定し、後続の実験を行った。
５×１０6個の低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞と対照細胞を静脈再注入し、２～３日おきに腫瘍のサイズを測定し、ノギスで腫瘍の長径と短径をそれぞれ測定し、腫瘍体積の計算式は体積＝（長径×短径2）／２とした。
結果は、図７に示すとおりであり、低酸素感受性転写制御システムによって制御されたＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（低酸素感受性ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、ＳＫＯＶ３（卵巣がん）及びＮＣＩ－Ｈ２９２（肺がん）の成長を効果的に抑制することができ、細胞再注入３５日目の腫瘍抑制率が１００％及び７８．５％と高かった。
【0056】
実施例１１ 低酸素トリガーのＣＤ４７／ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞アダプタータンパク質の発現
実施例４の遺伝子操作されたＡ５４９細胞を１日前に１２ウェル平底プレートに敷いて、ウェルあたり３×１０5個の細胞とし、総体積は１ｍＬであった。
翌日、平底プレートを通常の酸素条件（２１％Ｏ2）又は低酸素条件（１％Ｏ2）で２４ｈ培養し、終了後に細胞を収集し、１×ＢＳで再懸濁し、４×ＳＤＳ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加えて１×に希釈した後、十分にブローして均一に混合させ、サンプルをポットに入れ、電磁調理器で１０ｍｉｎ加熱して煮沸し、タンパク質を十分に変性させた。
目的タンパク質の低酸素感受性人工転写因子の分子量（７２．５ｋＤ）とＢｉＴＥの分子量（５４．７ｋＤ）に基づいて、濃度が１０％の上層と下層のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを調製し、サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにて２ｈ電気泳動で分離させ、次いで湿式転換法によりサンプルをゲルから予めメタノールで活性化されたＰＶＤＦ膜に転移させた。
タンパク質マーカーの指示に基づいて、目的タンパク質と参照タンパク質を含むＰＶＤＦ膜を切り取って５％脱脂粉乳ブロッキング液に置き、シェーカーにて室温で少なくとも１ｈインキュベートしブロッキングした。
ブロッキングされたＰＶＤＦ膜を取り出し、一次抗体の希釈率が１：１０００のマウス抗Ｈｉｓタグ一次抗体希釈液に置き、シェーカーにて４℃で一晩静置した。
一次抗体希釈液を回収し、－２０℃で凍結保存して使用に備えた。ＰＶＤＦ膜を取り出してＰＢＳＴでシェーカーにて８ｍｉｎ／回で３回振とう溶出し、溶出終了後、二次抗体の希釈率が１：３０００の相応なヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体希釈液を加え、二シェーカーにて室温で１ｈインキュベートした。
ＰＶＤＦ膜を取り出した後、ＰＢＳＴで３回溶出し、発色後に露光させた。
結果は、図８に示すとおりであり、図８は、ウェスタンブロッティング検出の露光結果であり、通常の酸素条件下では低酸素感受性人工転写因子及び下流標的遺伝子ＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥをほとんど発現しなかったが、低酸素環境下では低酸素感受性人工転写因子を誘導発現し、及び下流標的遺伝子ＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥの発現を開始することができる。また、２～６個のコピーのコア配列が直列に重複することは、低酸素感受性転写制御システムの制御活性に影響を与えず、いずれも通常の酸素環境での分解、低酸素環境下での目的タンパク質の効率的な誘導発現を実現できる。
実施例４の遺伝子操作されたＡ５４９細胞を１日前に１２ウェル平底プレートに敷いて、ウェルあたり３×１０5個の細胞とし、総体積は１ｍＬであった。
翌日、平底プレートを通常の酸素条件（２１％Ｏ2）又は低酸素条件（１％Ｏ2）で２４ｈ培養し、終了後に細胞を収集し、１×ＢＳで再懸濁し、４×ＳＤＳ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加えて１×に希釈した後、十分にブローして均一に混合させ、サンプルをポットに入れ、電磁調理器で１０ｍｉｎ加熱して煮沸し、タンパク質を十分に変性させた。
目的タンパク質の低酸素感受性人工転写因子の分子量（７２．５ｋＤ）とＢｉＴＥの分子量（５４．７ｋＤ）に基づいて、濃度が１０％の上層と下層のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを調製し、サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにて２ｈ電気泳動で分離させ、次いで湿式転換法によりサンプルをゲルから予めメタノールで活性化されたＰＶＤＦ膜に転移させた。
タンパク質マーカーの指示に基づいて、目的タンパク質と参照タンパク質を含むＰＶＤＦ膜を切り取って５％脱脂粉乳ブロッキング液に置き、シェーカーにて室温で少なくとも１ｈインキュベートしブロッキングした。
ブロッキングされたＰＶＤＦ膜を取り出し、一次抗体の希釈率が１：１０００のマウス抗Ｈｉｓタグ一次抗体希釈液に置き、シェーカーにて４℃で一晩静置した。
一次抗体希釈液を回収し、－２０℃で凍結保存して使用に備えた。ＰＶＤＦ膜を取り出してＰＢＳＴでシェーカーにて８ｍｉｎ／回で３回振とう溶出し、溶出終了後、二次抗体の希釈率が１：３０００の相応なヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体希釈液を加え、二シェーカーにて室温で１ｈインキュベートした。
ＰＶＤＦ膜を取り出した後、ＰＢＳＴで３回溶出し、発色後に露光させた。
結果は、図８に示すとおりであり、図８は、ウェスタンブロッティング検出の露光結果であり、通常の酸素条件下では低酸素感受性人工転写因子及び下流標的遺伝子ＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥをほとんど発現しなかったが、低酸素環境下では低酸素感受性人工転写因子を誘導発現し、及び下流標的遺伝子ＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥの発現を開始することができる。また、２～６個のコピーのコア配列が直列に重複することは、低酸素感受性転写制御システムの制御活性に影響を与えず、いずれも通常の酸素環境での分解、低酸素環境下での目的タンパク質の効率的な誘導発現を実現できる。
【0057】
実施例１２ 低酸素感受性転写制御システムによるＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥ－Ｔ細胞の腫瘍細胞殺傷の制御
腫瘍細胞殺傷効率検出方法及び殺傷効率計算方法は、実施例７と同じである。まず、１×１０4個のＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ遺伝子で修飾されたヒト卵巣がん細胞）又はＮＣＩ－Ｈ２９２－Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ遺伝子で修飾されたヒト肺がん細胞）を９６ウェルの平底ブラックプレートに接種し、ウェルあたり１００μＬの培地に入れ、３７℃、５％ＣＯ2細胞インキュベータに置いて１８ｈ培養した。翌日、エフェクター細胞：標的細胞＝１：２、１：１、２：１の割合で、実施例８の低酸素感受性ＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥ－Ｔ細胞及び同時に培養された形質導入されていないＴ細胞を、標的細胞を含むウェルに加え、それぞれ通常の酸素条件（２１％Ｏ2）又は低酸素条件（１％Ｏ2）で２０時間培養し、共培養終了後、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）９６マイクロプレート発光検出器を用いて標的細胞のルシフェラーゼ活性値を検出した。
結果は、図９に示すとおりであり、低酸素感受性ＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、通常の酸素条件下での腫瘍殺傷活性が比較的低く、エフェクター細胞：標的細胞＝２：１の場合、それぞれ２．６７％（ＳＫＯＶ３）と３．３３％（ＮＣＩ－Ｈ２９２）であり、低酸素環境下では、ＳＫＯＶ３細胞（７８．６７％）及びＮＣＩ－Ｈ２９２細胞（９７．６７％）を選択的に殺傷でき、殺傷活性が約３０倍増えた。
腫瘍細胞殺傷効率検出方法及び殺傷効率計算方法は、実施例７と同じである。まず、１×１０4個のＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ遺伝子で修飾されたヒト卵巣がん細胞）又はＮＣＩ－Ｈ２９２－Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ遺伝子で修飾されたヒト肺がん細胞）を９６ウェルの平底ブラックプレートに接種し、ウェルあたり１００μＬの培地に入れ、３７℃、５％ＣＯ2細胞インキュベータに置いて１８ｈ培養した。翌日、エフェクター細胞：標的細胞＝１：２、１：１、２：１の割合で、実施例８の低酸素感受性ＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥ－Ｔ細胞及び同時に培養された形質導入されていないＴ細胞を、標的細胞を含むウェルに加え、それぞれ通常の酸素条件（２１％Ｏ2）又は低酸素条件（１％Ｏ2）で２０時間培養し、共培養終了後、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）９６マイクロプレート発光検出器を用いて標的細胞のルシフェラーゼ活性値を検出した。
結果は、図９に示すとおりであり、低酸素感受性ＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、通常の酸素条件下での腫瘍殺傷活性が比較的低く、エフェクター細胞：標的細胞＝２：１の場合、それぞれ２．６７％（ＳＫＯＶ３）と３．３３％（ＮＣＩ－Ｈ２９２）であり、低酸素環境下では、ＳＫＯＶ３細胞（７８．６７％）及びＮＣＩ－Ｈ２９２細胞（９７．６７％）を選択的に殺傷でき、殺傷活性が約３０倍増えた。
【0058】
実施例１３ 低酸素感受性ＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥ－Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍作用
まず、５×１０6個のＮＣＩ－Ｈ２９２－Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ遺伝子で修飾されたヒト肺がん細胞）をＢ－ＮＤＧマウスの背部右側皮下に接種し、各匹に１２５μＬの腫瘍細胞懸濁液を注射し、腫瘍接種後６日目に、静脈又は腫瘍内に実施例３で調製した低酸素感受性ＢｉＴＥ－Ｔ細胞及び同時期に培養された形質導入されていないＴ細胞を注射し、各匹の担癌マウスに５×１０6個の陽性細胞を再注入した。腫瘍細胞の接種後、ノギスを用いて腫瘍の長径と短径を測って腫瘍体積を計算し、腫瘍体積の計算式は以下のとおりであり、腫瘍体積＝（長径×短径2）／２であった。
結果は、図１０に示すとおりであり、静脈再注入及び腫瘍内注射した低酸素感受性ＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、いずれも肺がんの成長を効果的に制御することができ、形質導入されていないＴ細胞の治療群に対して、細胞再注入後一か月の腫瘍抑制率が、それぞれ５２．３５％（静脈再注入）と７８．６９％（腫瘍内注射）であった。
まず、５×１０6個のＮＣＩ－Ｈ２９２－Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ遺伝子で修飾されたヒト肺がん細胞）をＢ－ＮＤＧマウスの背部右側皮下に接種し、各匹に１２５μＬの腫瘍細胞懸濁液を注射し、腫瘍接種後６日目に、静脈又は腫瘍内に実施例３で調製した低酸素感受性ＢｉＴＥ－Ｔ細胞及び同時期に培養された形質導入されていないＴ細胞を注射し、各匹の担癌マウスに５×１０6個の陽性細胞を再注入した。腫瘍細胞の接種後、ノギスを用いて腫瘍の長径と短径を測って腫瘍体積を計算し、腫瘍体積の計算式は以下のとおりであり、腫瘍体積＝（長径×短径2）／２であった。
結果は、図１０に示すとおりであり、静脈再注入及び腫瘍内注射した低酸素感受性ＣＤ４７／ＣＤ３－ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、いずれも肺がんの成長を効果的に制御することができ、形質導入されていないＴ細胞の治療群に対して、細胞再注入後一か月の腫瘍抑制率が、それぞれ５２．３５％（静脈再注入）と７８．６９％（腫瘍内注射）であった。
【0059】
上記実施例は、例示的なものであり、本発明を限定するものであると理解すべきではなく、当業者であれば、本発明の範囲内で上記実施例に対して変更、修正、置換及び変形を行うことができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】