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特表2024-530220２’－デオキシグアノシン、グアノシン及びその組成物の調製方法、並びに使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-16
(54)【発明の名称】２’－デオキシグアノシン、グアノシン及びその組成物の調製方法、並びに使用
(51)【国際特許分類】
A01N 43/90 20060101AFI20240808BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20240808BHJP
A01P 1/00 20060101ALI20240808BHJP
A01K 61/13 20170101ALI20240808BHJP
C12P 19/40 20060101ALI20240808BHJP
C12N 1/14 20060101ALN20240808BHJP
【ＦＩ】
A01N43/90 105
A01P3/00
A01P1/00
A01K61/13
C12P19/40
C12N1/14 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508795
(86)(22)【出願日】2023-05-08
(85)【翻訳文提出日】2024-02-09
(86)【国際出願番号】 CN2023092819
(87)【国際公開番号】W WO2023217094
(87)【国際公開日】2023-11-16
(31)【優先権主張番号】202210496024.5
(32)【優先日】2022-05-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524055621
【氏名又は名称】山東蓬勃生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＰＥＮＧＢＯ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１，Ｂｅｉｔｉａｎｍｅｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｚｏｎｅ，Ｔａｉ’ａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２７１０００，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000291
【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】孔 波
(72)【発明者】
【氏名】張 暁英
(72)【発明者】
【氏名】孫 健
(72)【発明者】
【氏名】王 洪鳳
(72)【発明者】
【氏名】向 亜美
(72)【発明者】
【氏名】趙 紅玲
(72)【発明者】
【氏名】耿 全政
(72)【発明者】
【氏名】陳 大印
【テーマコード（参考）】
2B104
4B064
4B065
4H011
【Ｆターム（参考）】
2B104AA01
2B104AA22
2B104BA14
4B064AF34
4B064CA05
4B064CE02
4B064CE08
4B064CE10
4B064DA04
4B064DA12
4B065AA57X
4B065BD01
4B065BD14
4B065BD16
4B065CA19
4B065CA43
4B065CA47
4H011AA01
4H011AA04
4H011BB09
4H011BB21
(57)【要約】
本発明は、２’－デオキシグアノシン、グアノシン及びその組成物の調製方法、並びに使用を開示し、病原微生物の防除の技術分野に属し、具体的には、海水魚養殖における腸炎ビブリオ菌の抑制における２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの使用、抗植物ウイルスにおける２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの使用、並びに、植物内の２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の含有量の向上における２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの使用であり、本発明は、２’－デオキシグアノシンとグアノシンを含む組成物を提供し、また、パエシロミセス・バリオティＳＪ１菌体から２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを抽出する方法を提供し、本発明は、２’－デオキシグアノシン及びグアノシンは、病原微生物を防除する作用、特に、顕著な抗植物ウイルス作用を有し、しかも、植物内の２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の含有量を向上できることを見出した。
【選択図】図１３
【選択図】図１３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
海水魚養殖における腸炎ビブリオ菌の抑制における組成物の使用であって、前記組成物の成分は、グアノシンと２’－デオキシグアノシンを含む、ことを特徴とする使用。
【請求項2】
抗植物ウイルスにおける化合物の使用であって、前記化合物は、グアノシン又は２’－デオキシグアノシンである、ことを特徴とする使用。
【請求項3】
抗植物ウイルスにおける組成物の使用であって、前記組成物の成分は、グアノシンと２’－デオキシグアノシンを含む、ことを特徴とする使用。
【請求項4】
前記２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、（１～２）：１である、ことを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項5】
前記植物ウイルスは、タバコモザイクウイルス、ジャガイモウイルスＸ、キュウリモザイクウイルス、ジャガイモウイルスＹである、ことを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項6】
前記組成物の使用濃度が、１５０ｎｇ／ｍＬ以上である、ことを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項7】
植物内の２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の含有量の向上における化合物の使用であって、前記化合物は、グアノシン又は２’－デオキシグアノシンである、ことを特徴とする使用。
【請求項8】
植物内の２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の含有量の向上における組成物の使用であって、前記組成物の成分は、グアノシンと、２’－デオキシグアノシンと、を含む、ことを特徴とする使用。
【請求項9】
成分として２’－デオキシグアノシンとグアノシンを含み、前記２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、（１～２）：１である、ことを特徴とする抗植物ウイルス組成物。
【請求項10】
パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１菌体から２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを抽出する方法であって、寄托番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１０１１４のパエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１の菌体を調製し、菌体を粉砕して、使用に備えるステップ（１）と、
ステップ（１）で粉砕された菌体と体積分率１０～５０％のエタノール溶液と、を、１：（１～１０）ｇ／ｍＬの質量体積比で混合し、超音波処理した後、固液分離し、液体部分をパエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１菌体の抽出物とするステップ（２）と、
ステップ（２）で調製された抽出物を、逆相ＨＰＬＣ半分取クロマトグラフィーにかけて、２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを分離して調製するステップ（３）と、を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項11】
ステップ（２）におけるエタノール溶液の体積分率は、２０～３５％であり、ステップ（２）における菌体とエタノール溶液との質量体積比が、１：（１～５）ｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
ステップ（２）におけるエタノール溶液の体積分率は、２８～３２％である、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、病原微生物の防除の技術分野に属し、具体的には、２’－デオキシグアノシン、グアノシン及びその組成物の調製方法、並びに使用である。
【0002】
本発明は、２０２２年５月９日に中国特許庁に提出され、出願番号が２０２２１０４９６０２４．５、発明の名称が「２’－デオキシグアノシン、グアノシン及びその組成物の調製方法、並びに使用」である中国特許出願の優先権を主張しており、そのすべての内容は引用により本発明に組み込まれており、本発明の一部となる。
【背景技術】
【0003】
植物ウイルス病は、「植物の癌」と呼ばれ、深刻な植物病害を引き起こし、農業生産に巨大な経済損失をもたらす。現在、植物ウイルス病の防除方法は、主に、例えば、種苗の無毒化、合理的な輪作、耐病性品種の選択などの農業的な防除、及び化学農薬による防除があり、よく見られる防除用農薬には、グアニジノ・酢酸銅、アミノオリゴサッカリン、レンチナン、モロキシジン塩酸塩などがある。実際の植物ウイルス病の防除において、依然として化学的な防除が主であるが、現在、植物ウイルス病をコントロールできる有効な化学農薬がまだなく、しかも、ウイルス耐性の向上や化学農薬の生態環境への汚染が注目されるにつれて、化学由来の抗ウイルス剤の開発は大きく制限されている。
【0004】
ヌクレオシド類物質は、生物体細胞の生命活動を維持する基本的な構成元素であり、プリン塩基やピリミジン塩基とリボースとがグリコシド結合を介して結合してできた小分子化合物であり、従来技術におけるヌクレオシド類物質の薬理活性に関する研究は、主にヒトのウイルス病や腫瘍の研究に重点を置いており、植物に作用する影響に関する報告は少ない。
【0005】
従来技術における２’－デオキシグアノシン及びグアノシンに関する研究は主に医療分野で行われている。２’－デオキシグアノシンは、オリゴデオキシヌクレオチドなど多くの抗ウイルス薬や抗腫瘍核酸薬を合成するための重要な原料として使用され、グアノシンはリバビリンやアシクロビルなどのヌクレオシド系抗ウイルス薬などの医薬品の中間体として使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
従来技術の欠点に対して、本発明は、２’－デオキシグアノシン、グアノシン及びその組成物の調製方法、並びに使用を提供する。
【0007】
２’－デオキシグアノシンは、２’－デオキシグアニンリボシドとも呼ばれ、
グアノシンは、グアニンリボシドとも呼ばれる。
グアノシンは、グアニンリボシドとも呼ばれる。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の第１態様では、本発明は、海水魚養殖における腸炎ビブリオ菌（ＶＰ：Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の抑制における組成物の使用であって、前記組成物の成分が、グアノシンと２’－デオキシグアノシンを含む、使用を提供する。
【0009】
本発明の第２態様では、本発明は、抗植物ウイルスにおける物質の使用であって、前記物質は、グアノシン又は２’－デオキシグアノシン、又はグアノシンと２’－デオキシグアノシンを含む組成物である、使用を提供する。
【0010】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物ウイルスは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ：Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ：ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ：Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ：ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ）である。
【0011】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記物質の使用濃度が、１５０ｎｇ／ｍＬ以上である。
【0012】
本発明のさらに別のいくつかの実施形態によれば、前記物質の使用濃度が、１５０ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬである。
【0013】
本発明のいくつかの実施形態によれば、グアノシンと２’－デオキシグアノシンを含む組成物が抗植物ウイルスに適用される場合、前記２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、（１～２）：１である。本発明のさらに別のいくつかの実施形態によれば、前記組成物において、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、１：１である。
【0014】
本発明の第３態様では、本発明は、植物内の２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の含有量の向上における物質の使用であって、前記物質が、グアノシン又は２’－デオキシグアノシン、又はグアノシンと２’－デオキシグアノシンを含む組成物である、使用を提供する。
【0015】
本発明のいくつかの実施形態によれば、グアノシンと２’－デオキシグアノシンを含む前記組成物において、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、（１～２）：１である。本発明のさらに別のいくつかの実施形態によれば、前記組成物において、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、１：１である。
【0016】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記組成物の使用濃度が、１５０ｎｇ／ｍＬ以上である。本発明のさらに別のいくつかの実施形態によれば、前記組成物の使用濃度が、１５０ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬである。
【0017】
本発明の第４態様では、本発明は、成分として２’－デオキシグアノシンとグアノシンを含み、前記２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、（１～２）：１である、抗植物ウイルス組成物を提供する。本発明のいくつかの実施形態によれば、前記組成物において、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、１：１である。
【0018】
本発明の第５態様では、本発明は、パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１菌体から２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを抽出する方法であって、
寄托番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１０１１４のパエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１の菌体を調製し、菌体を粉砕して使用に備えるステップ（１）と、
ステップ（１）で粉砕された菌体と体積分率１０～５０％エタノール溶液とを１：（１～１０）ｇ／ｍＬの質量体積比で混合し、超音波処理した後、固液分離し、液体部分をパエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１菌体の抽出物とするステップ（２）と、
ステップ（２）で調製された抽出物を、逆相ＨＰＬＣ半分取クロマトグラフィーにかけて、２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを分離して調製するステップ（3）と、を含む、方法を提供する。
寄托番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１０１１４のパエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１の菌体を調製し、菌体を粉砕して使用に備えるステップ（１）と、
ステップ（１）で粉砕された菌体と体積分率１０～５０％エタノール溶液とを１：（１～１０）ｇ／ｍＬの質量体積比で混合し、超音波処理した後、固液分離し、液体部分をパエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１菌体の抽出物とするステップ（２）と、
ステップ（２）で調製された抽出物を、逆相ＨＰＬＣ半分取クロマトグラフィーにかけて、２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを分離して調製するステップ（3）と、を含む、方法を提供する。
【0019】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップ（１）では、菌糸体の粉砕メッシュが、５０～７０メッシュである。
【0020】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップ（２）では、エタノール溶液の体積分率は、２０～３５％であり、ステップ（２）では、菌体とエタノール溶液との質量体積比は、１：（１～５）ｇ／ｍＬである。
【0021】
本発明のさらに別のいくつかの実施形態によれば、ステップ（２）では、エタノール溶液の体積分率は、２８～３２％である。
【0022】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップ（２）における超音波強度は１２００～１６００Ｗである。
【0023】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップ（２）では、超音波処理の時間は、５０～７０ｍｉｎである。
【0024】
本発明の第６態様では、本発明は、組成物を用いて腸炎ビブリオ菌を抑制することを含む方法であって、前記組成物が、グアノシンと２’－デオキシグアノシンを成分とする、方法を提供する。
【0025】
腸炎ビブリオ菌は海水や魚介類に広く存在しており、食中毒を引き起こしやすいため、本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、主に、前記組成物を海水魚養殖又は魚介類に用いて腸炎ビブリオ菌を抑制することを含み、例えば、前記組成物を海水魚養殖の養殖水又は魚介類に直接接触する保存環境（特に液体環境）に添加する。
【0026】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記組成物において、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、（１～２）：１である。本発明のさらに別のいくつかの実施形態によれば、前記組成物において、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、１：１である。
【0027】
本発明の第７態様では、本発明は、物質を植物に施用して、植物ウイルスを阻害することを含む方法であって、前記物質が、グアノシン又は２’－デオキシグアノシン、又はグアノシンと２’－デオキシグアノシンを含む組成物である、方法を提供する。
【0028】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は、タバコ、ジャガイモ及びキュウリを含むが、これらに限定されるものではなく、本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は植物の若苗であってもよく、前記若苗は、例えば少なくとも葉が成長した若苗である。前記施用方式は、例えば葉面散布又は種子浸漬である。
【0029】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物ウイルスは、タバコモザイクウイルス、ジャガイモウイルスＸ、キュウリモザイクウイルス、及びジャガイモウイルスＹを含むが、これらに限定されるものではない。
【0030】
本発明のいくつかの実施形態によれば、グアノシンと２’－デオキシグアノシンを含む前記組成物において、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、（１～２）：１である。本発明のさらに別のいくつかの実施形態によれば、前記組成物において、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、１：１である。
【0031】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記組成物の使用濃度が、１５０ｎｇ／ｍＬ以上である。例えば、本発明のさらに別のいくつかの実施形態によれば、前記組成物の使用濃度が、１５０ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬである。
【0032】
本発明の第８態様では、本発明は、植物に物質を施用して、植物内の２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の含有量を向上させることを含む方法であって、前記物質が、グアノシン又は２’－デオキシグアノシン、又はグアノシンと２’－デオキシグアノシンを含む組成物である、方法を提供する。前記施用方式は、例えば、植物葉面散布又は種子浸漬である。
【0033】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は、タバコ、ジャガイモ及びキュウリなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【0034】
本発明のいくつかの実施形態によれば、２’－デオキシグアノシンとグアノシンを含む組成物を植物に施用する際に、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、（１～２）：１である。本発明のさらに別のいくつかの実施形態によれば、植物に２’－デオキシグアノシンとグアノシンの組成物を施用する際に、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が、１：１である。
【0035】
本発明のいくつかの実施形態によれば、２’－デオキシグアノシンとグアノシンを含む組成物を植物に施用する際に、前記組成物の使用濃度が、１５０ｎｇ／ｍＬ以上である。本発明のさらに別のいくつかの実施形態によれば、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの組成物を植物に施用する際に、前記組成物の使用濃度が、１５０ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬである。
【発明の効果】
【0036】
有益な効果
１．本発明では、パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１抽出物から２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの２種の物質を同定し、抽出物中の他の物質成分と比較して、この２種の物質が明らかな抗植物ウイルス作用を有し、しかもこの２種の物質を一定の配合比で組み合わせて使用すると、抗ウイルス作用効果がより優れていることを見出した。後続の新規な農薬の開発・登録を容易にし、産業化生産を実現する。
２．本発明では、また、２’－デオキシグアノシンとグアノシンを含有する抽出物を植物に散布することにより、植物内の２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の蓄積を増加することができ、植物の免疫作用の増強に有利であることを見出した。本発明はまた、パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの含有量を効果的に増加させる抽出方法を提供する。
１．本発明では、パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１抽出物から２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの２種の物質を同定し、抽出物中の他の物質成分と比較して、この２種の物質が明らかな抗植物ウイルス作用を有し、しかもこの２種の物質を一定の配合比で組み合わせて使用すると、抗ウイルス作用効果がより優れていることを見出した。後続の新規な農薬の開発・登録を容易にし、産業化生産を実現する。
２．本発明では、また、２’－デオキシグアノシンとグアノシンを含有する抽出物を植物に散布することにより、植物内の２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の蓄積を増加することができ、植物の免疫作用の増強に有利であることを見出した。本発明はまた、パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの含有量を効果的に増加させる抽出方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】パエシロミセス・バリオティＳＪ１菌体抽出物の液体クロマトグラムであり、図においては、クロマトグラフィーのピークの番号は、それぞれ、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０の順に対応する。
【図6】２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの構造図であり、図においては、ａは、２’－デオキシグアノシンであり、ｂは、グアノシンである。
【図7】２’－デオキシグアノシン１０μｇ／ｍＬ及びグアノシン１０μｇ／ｍＬの標準品の液体クロマトグラムである。
【図8】バッチ３の菌体抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの液体クロマトグラムである。
【図9】実施例７における対照群ＣＫのサリチル酸を検出した液体クロマトグラムである。
【図10】実施例７におけるＡ群のサリチル酸を検出した液体クロマトグラムである。
【図11】実施例７における対照群ＣＫの２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを検出した液体クロマトグラムである。
【図12】実施例７におけるＡ群の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを検出した液体クロマトグラムである。
【図13】腸炎ビブリオ菌の平板図であり、図においては、ａは、２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを加えないＴＣＢＳ培地平板であり、ｂは、配合比が１：１の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを１ｍｇ／ｍＬ含有するＴＣＢＳ培地平板である。
【発明を実施するための形態】
【0038】
以下、実施例を参照して、本発明の技術的解決手段についてさらに説明するが、本発明によって保護される範囲はこれに限定されない。
【0039】
実施例において詳細に説明されていない内容は、いずれも当該分野の従来技術に従ったものである。
【0040】
主な材料の由来
アミノオリゴサッカリンはいずれも山東浜海瀚生生物科技有限公司より購入した。
２’－デオキシグアノシン及びグアノシンは上海源葉生物科技有限公司より購入した。
パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１の寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１０１１４であり、この菌の寄託情報は特許文献ＣＮ２０１５１００５９６６０．１に公開されている。寄託日は２０１４年１２月０８日で、中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター（アドレス：北京市朝陽区北辰西路１号院３号）に寄託されている。
ＴＣＢＳ培地は広東環凱微生物科技有限公司より購入した。
パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１は、以下「パエシロミセス・バリオティ菌株ＳＪ１」と略称する。
アミノオリゴサッカリンはいずれも山東浜海瀚生生物科技有限公司より購入した。
２’－デオキシグアノシン及びグアノシンは上海源葉生物科技有限公司より購入した。
パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１の寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１０１１４であり、この菌の寄託情報は特許文献ＣＮ２０１５１００５９６６０．１に公開されている。寄託日は２０１４年１２月０８日で、中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター（アドレス：北京市朝陽区北辰西路１号院３号）に寄託されている。
ＴＣＢＳ培地は広東環凱微生物科技有限公司より購入した。
パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）菌株ＳＪ１は、以下「パエシロミセス・バリオティ菌株ＳＪ１」と略称する。
【実施例1】
【0041】
パエシロミセス・バリオティＳＪ１菌体抽出物の調製
パエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株を平板ＰＤＡ培地に接種し、２５℃で６日間培養し、パンチで菌体の成長した寒天塊を取り、ＰＤＡ培地５０ｍＬを入れた２５０ｍＬ三角フラスコに接種し、２８℃、１２０ｒ／ｍｉｎでロータリーシェーカーにて３日間培養して種子液とし、種子液を１０％の体積量でＰＤＡ培地１５０ｍＬを入れた５００ｍＬ三角フラスコに接種し、２８℃、１２０ｒ／ｍｉｎでロータリーシェーカーにて５日間培養し、発酵を停止した。培養により得られた菌糸体を洗浄した後、６０℃で乾燥し、重量を計量し、高速粉砕機で粉砕し、６０メッシュスクリーンにかけ、粉砕した菌粉と体積分率２０％エタノール溶液とを１：１ｇ／ｍＬの質量体積比で混合した後、１２００Ｗ超音波で６０ｍｉｎ処理し、真空吸引濾過し、濾液を収集して使用に備え、濾液をパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株の抽出物とした。
パエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株を平板ＰＤＡ培地に接種し、２５℃で６日間培養し、パンチで菌体の成長した寒天塊を取り、ＰＤＡ培地５０ｍＬを入れた２５０ｍＬ三角フラスコに接種し、２８℃、１２０ｒ／ｍｉｎでロータリーシェーカーにて３日間培養して種子液とし、種子液を１０％の体積量でＰＤＡ培地１５０ｍＬを入れた５００ｍＬ三角フラスコに接種し、２８℃、１２０ｒ／ｍｉｎでロータリーシェーカーにて５日間培養し、発酵を停止した。培養により得られた菌糸体を洗浄した後、６０℃で乾燥し、重量を計量し、高速粉砕機で粉砕し、６０メッシュスクリーンにかけ、粉砕した菌粉と体積分率２０％エタノール溶液とを１：１ｇ／ｍＬの質量体積比で混合した後、１２００Ｗ超音波で６０ｍｉｎ処理し、真空吸引濾過し、濾液を収集して使用に備え、濾液をパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株の抽出物とした。
【実施例2】
【0042】
実施例１で調製されたパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株抽出物１ｍＬを１．５ｍＬ遠心管に入れ、１２０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた上清を０．２２μｍのろ過膜でろ過し、ろ液を逆相ＨＰＬＣ半分取クロマトグラフィーにより勾配溶出して分離し、１０個の化合物を得、それぞれ１０個の化合物サンプルを採取し、液体クロマトグラム及び化合物番号を図１に示す。
【実施例3】
【0043】
実施例２の抽出物から分離された１０個の化合物の抗ウイルス実験
（１）タバコ育苗：通常の育苗方法によりタバコの育苗を行った。
（２）接種及び施薬方法：タバコが４～８枚の葉に成長した後、タバコ若苗を得て、成長の状態が一致したタバコを選び、濃度が２００ｎｇ／ｍＬ、使用量が１０ｍＬの実施例２で分離された１０個の化合物サンプルをそれぞれタバコの葉に散布し、それぞれ処理群１～１０とし、処理群ごとに５本のタバコに散布し、清水散布を対照（ＣＫ）とし、処理ごとに３回繰り返し、各葉に均等に散布し、処理２時間後に摩擦接種方法でタバコ系統の葉の下の３枚の真葉に接種し、ウイルス溶液５０μＬを取り、６００メッシュの石英砂を各葉の前面に軽く摩擦して接種し、接種したウイルスは、それぞれタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）及びジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）であり、接種後、人工気候室内で５ｄ培養した。
（３）ウイルス含有量の計算：接種５ｄ後、ステップ（２）で処理した葉を取り、紫外灯の下に置いて各薬剤処理群のウイルスタンパク質の蛍光状況を観察し、蛍光標識を持った発病系統の葉を取り、アルミホイルで標識を作って迅速に液体窒素に入れ、すべて処理してサンプルを取り終わった後、－８０℃の冷蔵庫に入れて長期保存し、酵素結合免疫吸着測定法を用いて、ウイルスを持った系統の葉のウイルス含有量を測定した。
抗ウイルス実験方法の参考文献は、「Ｕｌｔｒａｈｉｇｈ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｄｕｃｅｒ ｆｒｏｍ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｆｕｎｇｉ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｏｂａｃｃｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ＳＡ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」Ｐｅｎｇ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ａ，Ｗａｎｇ Ｑ，ｅｔ ａｌ．Ｕｌｔｒａｈｉｇｈ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｄｕｃｅｒ ｆｒｏｍ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｆｕｎｇｉ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｏｂａｃｃｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ＳＡ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０２０， ２０（１）である。
（４）ウイルス含有量の具体的な検出結果を表１に示す。
表１の実験データを分析した結果、１０個の化合物でタバコの葉を処理した後、各処理群は４種類のウイルスに対していずれも一定の抵抗性があり、そのウイルス含有量はすべて対照群より低かった。このうち、化合物８では、４種類のウイルスの含有量はいずれも最も低く、発症が最も軽く、対照群の０．４倍前後であり、化合物１０はその次であり、ウイルス含有量は対照群の０．５倍前後であり、残りの化合物は、対照と比べて有意差がないため、本発明は、化合物８及び化合物１０がパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株抽出物の主な抗ウイルス物質であると判明した。
（１）タバコ育苗：通常の育苗方法によりタバコの育苗を行った。
（２）接種及び施薬方法：タバコが４～８枚の葉に成長した後、タバコ若苗を得て、成長の状態が一致したタバコを選び、濃度が２００ｎｇ／ｍＬ、使用量が１０ｍＬの実施例２で分離された１０個の化合物サンプルをそれぞれタバコの葉に散布し、それぞれ処理群１～１０とし、処理群ごとに５本のタバコに散布し、清水散布を対照（ＣＫ）とし、処理ごとに３回繰り返し、各葉に均等に散布し、処理２時間後に摩擦接種方法でタバコ系統の葉の下の３枚の真葉に接種し、ウイルス溶液５０μＬを取り、６００メッシュの石英砂を各葉の前面に軽く摩擦して接種し、接種したウイルスは、それぞれタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）及びジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）であり、接種後、人工気候室内で５ｄ培養した。
（３）ウイルス含有量の計算：接種５ｄ後、ステップ（２）で処理した葉を取り、紫外灯の下に置いて各薬剤処理群のウイルスタンパク質の蛍光状況を観察し、蛍光標識を持った発病系統の葉を取り、アルミホイルで標識を作って迅速に液体窒素に入れ、すべて処理してサンプルを取り終わった後、－８０℃の冷蔵庫に入れて長期保存し、酵素結合免疫吸着測定法を用いて、ウイルスを持った系統の葉のウイルス含有量を測定した。
抗ウイルス実験方法の参考文献は、「Ｕｌｔｒａｈｉｇｈ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｄｕｃｅｒ ｆｒｏｍ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｆｕｎｇｉ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｏｂａｃｃｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ＳＡ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」Ｐｅｎｇ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ａ，Ｗａｎｇ Ｑ，ｅｔ ａｌ．Ｕｌｔｒａｈｉｇｈ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｄｕｃｅｒ ｆｒｏｍ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｆｕｎｇｉ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｏｂａｃｃｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ＳＡ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０２０， ２０（１）である。
（４）ウイルス含有量の具体的な検出結果を表１に示す。
【表1】
【実施例4】
【0044】
抗ウイルス物質の同定
実施例３においてウイルスに対して明らかな抵抗性を有する２個の化合物について、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計と核磁気共鳴装置をそれぞれ用いて検出し、スペクトルデータ分析により、抗ウイルス作用を有する２個の化合物の構造を特定した。液体クロマトグラフィータンデム質量分析スペクトル及び核磁気スペクトルを、それぞれ図２、図３、図４、及び図５に示す。
まず、抽出物を半分取高速液体クロマトグラフにより分離して精製し、この工程で得られた成分中に微量の不純物が存在する。次に、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計を用いて全走査を行う場合、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計システム自体にも微量の干渉イオンが存在する。したがって、図２、図３の質量スペクトルには、２’－デオキシグアノシン及びグアノシン以外にも、微量の他の化合物が存在する。図２では、相対存在量の多い２つのイオンｍ／ｚは２６８．１３と１５２．１１であり、データベース検索により、それぞれ２’－デオキシグアノシンの親イオンと子イオンであると推定された。図３では、相対存在量の多い２つのイオンｍ／ｚは２８４．１３と１５２．１６であり、データベース検索により、それぞれグアノシンの親イオンと子イオンであると推定された。
分析した結果、化合物８は、分子式がＣ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ４、相対分子量が２６７．２４であった。ESI-MS m/z268.1[M-H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.93(1H,s,H-8),6.49(2H,s,NH2),5.69(1H,d,J=6.0Hz,H-1’),4.39(1H,m,H-2’),4.08(1H,m,H-3’),3.86(1H,d,J=2.96Hz,H-4’),3.52~3.61(2H,m,Ha-5’,Hb-5’);13C-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:159.70(C-6),154.59(C-2),152.04(C-4),138.54(C-8),117.41(C-5),87.98(C-1’),84.80(C-4’),72.03(C-3’),62.50(C-2’),39.57(C-5’)。
分析した結果、化合物１０は、分子式がＣ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ５、相対分子質量が２８３．２であった。ESI-MS m/z284.1[M-H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.93(1H,s,H-8),6.49(2H,s,NH2),5.69(1H,d,J=6.0Hz,H-1’),4.39(1H,m,H-2’),4.08(1H,m,H-3’),3.86(1H,d,J=2.96Hz,H-4’),3.52~3.61(2H,m,Ha-5’,Hb-5’);13C-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:157.21(C-6),154.15(C-2),151.77(C-4),135.98(C-8),117.18(C-5),86.81(C-1’),85.65(C-4’),74.15(C-3’),70.83(C-2’),61.86(C-5’)。
２’－デオキシグアノシン及びグアノシンは既知のものであり、その構造も関連文献で報告されているので、図２では、相対存在量の多い２つのイオンｍ／ｚは２６８．１３と１５２．１１であり、図３では、相対存在量の多い２つのイオンｍ／ｚは２８４．１３と１５２．１６であることから、データベース検索により、このイオンは、それぞれ２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの親イオンと子イオンであると推定された。また、図４及び図５の核磁気共鳴では、水素スペクトル及び炭素スペクトルのデータは、参照文献の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンのデータと一致していることから、化合物８は２’－デオキシグアノシン（２’－ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ）であると同定され、構造図は図６のａを参照し、化合物１０はグアノシン（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）であると同定され、構造図は図６のｂを参照する。
参考文献は以下のとおりである。
焦森、毛淑傑、梁曜華ら．石菖蒲中のヌクレオシド類成分の分離同定及び転化経路の分析［Ｊ］．中国実験方剤学雑誌，２０２０，２６（１２）：９。
徐小博、高節竹（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｐｒｏｍｉｎｅｎｓ）の葉、タケノコの化学成分の研究［Ｄ］．中国林業科学研究院，２０１５．
実施例３においてウイルスに対して明らかな抵抗性を有する２個の化合物について、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計と核磁気共鳴装置をそれぞれ用いて検出し、スペクトルデータ分析により、抗ウイルス作用を有する２個の化合物の構造を特定した。液体クロマトグラフィータンデム質量分析スペクトル及び核磁気スペクトルを、それぞれ図２、図３、図４、及び図５に示す。
まず、抽出物を半分取高速液体クロマトグラフにより分離して精製し、この工程で得られた成分中に微量の不純物が存在する。次に、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計を用いて全走査を行う場合、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計システム自体にも微量の干渉イオンが存在する。したがって、図２、図３の質量スペクトルには、２’－デオキシグアノシン及びグアノシン以外にも、微量の他の化合物が存在する。図２では、相対存在量の多い２つのイオンｍ／ｚは２６８．１３と１５２．１１であり、データベース検索により、それぞれ２’－デオキシグアノシンの親イオンと子イオンであると推定された。図３では、相対存在量の多い２つのイオンｍ／ｚは２８４．１３と１５２．１６であり、データベース検索により、それぞれグアノシンの親イオンと子イオンであると推定された。
分析した結果、化合物８は、分子式がＣ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ４、相対分子量が２６７．２４であった。ESI-MS m/z268.1[M-H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.93(1H,s,H-8),6.49(2H,s,NH2),5.69(1H,d,J=6.0Hz,H-1’),4.39(1H,m,H-2’),4.08(1H,m,H-3’),3.86(1H,d,J=2.96Hz,H-4’),3.52~3.61(2H,m,Ha-5’,Hb-5’);13C-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:159.70(C-6),154.59(C-2),152.04(C-4),138.54(C-8),117.41(C-5),87.98(C-1’),84.80(C-4’),72.03(C-3’),62.50(C-2’),39.57(C-5’)。
分析した結果、化合物１０は、分子式がＣ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ５、相対分子質量が２８３．２であった。ESI-MS m/z284.1[M-H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.93(1H,s,H-8),6.49(2H,s,NH2),5.69(1H,d,J=6.0Hz,H-1’),4.39(1H,m,H-2’),4.08(1H,m,H-3’),3.86(1H,d,J=2.96Hz,H-4’),3.52~3.61(2H,m,Ha-5’,Hb-5’);13C-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:157.21(C-6),154.15(C-2),151.77(C-4),135.98(C-8),117.18(C-5),86.81(C-1’),85.65(C-4’),74.15(C-3’),70.83(C-2’),61.86(C-5’)。
２’－デオキシグアノシン及びグアノシンは既知のものであり、その構造も関連文献で報告されているので、図２では、相対存在量の多い２つのイオンｍ／ｚは２６８．１３と１５２．１１であり、図３では、相対存在量の多い２つのイオンｍ／ｚは２８４．１３と１５２．１６であることから、データベース検索により、このイオンは、それぞれ２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの親イオンと子イオンであると推定された。また、図４及び図５の核磁気共鳴では、水素スペクトル及び炭素スペクトルのデータは、参照文献の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンのデータと一致していることから、化合物８は２’－デオキシグアノシン（２’－ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ）であると同定され、構造図は図６のａを参照し、化合物１０はグアノシン（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）であると同定され、構造図は図６のｂを参照する。
参考文献は以下のとおりである。
焦森、毛淑傑、梁曜華ら．石菖蒲中のヌクレオシド類成分の分離同定及び転化経路の分析［Ｊ］．中国実験方剤学雑誌，２０２０，２６（１２）：９。
徐小博、高節竹（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｐｒｏｍｉｎｅｎｓ）の葉、タケノコの化学成分の研究［Ｄ］．中国林業科学研究院，２０１５．
【実施例5】
【0045】
パエシロミセス・バリオティＳＪ１菌体抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの含有量の測定
１０バッチのパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌体抽出物１ｍＬをそれぞれ１．５ｍＬ遠心管に取り、１２０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、遠心分離により得られた上清を０．２２μｍのろ過膜でろ過し、分析型液相検出に供した。１０バッチのパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌体の培養方法は実施例１と同様であった。
標準品溶液の調製：一定重量まで乾燥した２’－デオキシグアノシン及びグアノシン標準品をそれぞれ１ｍｇずつ計量し、水で溶解して１００ｍＬまで定容し、１０μｇ／ｍＬの標準品母液を調製した。
検量線の作製：標準品の母液０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．４ｍＬ、０．６ｍＬ、０．８ｍＬ、１．０ｍＬをそれぞれ吸引し、１ｍＬまで定容し、標準作動液を調製した。
標準品のピーク時間を参照にして、サンプルを積分し、式（１）によりパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの含有量を計算した。
式中、
Ｘは、試料中の測定対象成分の含有量で、単位はミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）であり、
Ｃは、検量線から得られた試料液中の測定対象物の質量濃度で、単位はマイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍＬ）であり、
Ｖは、試料定容体積で、単位はミリリットル（ｍＬ）であり、
ｍは、試料質量で、単位はグラム（ｇ）である。
結果を表２に示す。
分析の結果、パエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの含有量は、それぞれ５．４４～１０．３ｍｇ／ｋｇ及び４．２２～７．３１ｍｇ／ｋｇであり、パエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株抽出物中の２’－デオキシグアノシンとグアノシンの含有量の比が（１～２）：１であることが分かった。
２’－デオキシグアノシン１０μｇ／ｍＬ及びグアノシン１０μｇ／ｍＬ標準品の液体クロマトグラムを図７に示す。
表２のバッチ３の菌体抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの液体クロマトグラムを図８に示す。
１０バッチのパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌体抽出物１ｍＬをそれぞれ１．５ｍＬ遠心管に取り、１２０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、遠心分離により得られた上清を０．２２μｍのろ過膜でろ過し、分析型液相検出に供した。１０バッチのパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌体の培養方法は実施例１と同様であった。
標準品溶液の調製：一定重量まで乾燥した２’－デオキシグアノシン及びグアノシン標準品をそれぞれ１ｍｇずつ計量し、水で溶解して１００ｍＬまで定容し、１０μｇ／ｍＬの標準品母液を調製した。
検量線の作製：標準品の母液０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．４ｍＬ、０．６ｍＬ、０．８ｍＬ、１．０ｍＬをそれぞれ吸引し、１ｍＬまで定容し、標準作動液を調製した。
標準品のピーク時間を参照にして、サンプルを積分し、式（１）によりパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの含有量を計算した。
【数1】
Ｘは、試料中の測定対象成分の含有量で、単位はミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）であり、
Ｃは、検量線から得られた試料液中の測定対象物の質量濃度で、単位はマイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍＬ）であり、
Ｖは、試料定容体積で、単位はミリリットル（ｍＬ）であり、
ｍは、試料質量で、単位はグラム（ｇ）である。
結果を表２に示す。
【表2】
２’－デオキシグアノシン１０μｇ／ｍＬ及びグアノシン１０μｇ／ｍＬ標準品の液体クロマトグラムを図７に示す。
表２のバッチ３の菌体抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの液体クロマトグラムを図８に示す。
【実施例6】
【0046】
２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの抗ウイルス効果の検証実験
実施例３の育苗、接種及び施薬方法に従って処理し、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比１：２の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液はＡ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比１：１の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液はＢ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比２：１の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液はＣ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比３：１の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液はＤ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比４：１の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液はＥ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬの２’－デオキシグアノシンはＦ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬのグアノシン溶液はＧ群、質量分率５％のアミノオリゴサッカリン溶液はＨ群、清水は対照群ＣＫとし、各比での２’－デオキシグアノシンとグアノシンのタバコモザイクウイルスに対する抵抗性を研究し、結果を表３に示す。
表３から分かるように、２’－デオキシグアノシン及びグアノシンはいずれもタバコモザイクウイルスに対して防除効果があり、しかも効果は対照薬品の質量分率５％アミノオリゴサッカリン溶液より大きく、同じ濃度の条件下で、２’－デオキシグアノシン標準品とグアノシン標準品との組み合わせの作用効果は２’－デオキシグアノシン及びグアノシン単独の抗植物ウイルス作用効果より優れており、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの両者が一定の相乗作用を生じていることが証明された。
また、表３より、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が（１～２）：１の場合、抗植物ウイルス作用効果が顕著であり、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が４：１の場合の抗植物ウイルス作用効果よりも優れており、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が１：２の場合の抗植物ウイルス作用効果よりも優れていることが分かった。特に、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が１：１である場合、抗植物ウイルス作用効果が最も優れている。
さらに、表３から分かるように、同じ濃度の条件下で、２’－デオキシグアノシン単独施用による抗植物ウイルス作用効果は、グアノシン単独施用による抗植物ウイルス作用効果より優れているが、両者を組み合わせて施用する場合、組成物中の２’－デオキシグアノシンの比が高いほど、作用効果が良いわけではなく、表３のＣ群、Ｅ群の実験データにより、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの両者が一定の相乗作用を生じていることがさらに証明された。
実施例３の育苗、接種及び施薬方法に従って処理し、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比１：２の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液はＡ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比１：１の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液はＢ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比２：１の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液はＣ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比３：１の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液はＤ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比４：１の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液はＥ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬの２’－デオキシグアノシンはＦ群、濃度１５０ｎｇ／ｍＬのグアノシン溶液はＧ群、質量分率５％のアミノオリゴサッカリン溶液はＨ群、清水は対照群ＣＫとし、各比での２’－デオキシグアノシンとグアノシンのタバコモザイクウイルスに対する抵抗性を研究し、結果を表３に示す。
【表3】
また、表３より、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が（１～２）：１の場合、抗植物ウイルス作用効果が顕著であり、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が４：１の場合の抗植物ウイルス作用効果よりも優れており、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が１：２の場合の抗植物ウイルス作用効果よりも優れていることが分かった。特に、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの配合質量比が１：１である場合、抗植物ウイルス作用効果が最も優れている。
さらに、表３から分かるように、同じ濃度の条件下で、２’－デオキシグアノシン単独施用による抗植物ウイルス作用効果は、グアノシン単独施用による抗植物ウイルス作用効果より優れているが、両者を組み合わせて施用する場合、組成物中の２’－デオキシグアノシンの比が高いほど、作用効果が良いわけではなく、表３のＣ群、Ｅ群の実験データにより、２’－デオキシグアノシンとグアノシンの両者が一定の相乗作用を生じていることがさらに証明された。
【実施例7】
【0047】
パエシロミセス・バリオティＳＪ１菌体抽出物による植物内在性ヌクレオシド類物質及びサリチル酸の変化の誘導
通常の育苗方法に従ってタバコの育苗を行い、タバコが４週間まで成長したときに、１０本のタバコを選び、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比１：１の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液をＡ群、清水を対照群ＣＫとしてそれぞれ散布し、１本当たりの施用量を１０ｍＬとし、処理ごとに３回繰り返した。２ｈ後、Ａ群と対照群ＣＫのベンサミアナタバコの葉を取り、液体クロマトグラフィーで２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の含有量を検出した。
（１）ヌクレオシド類物質の抽出方法：タバコの葉０．５０ｇを液体窒素条件下で粉砕して粉末にし、タバコの葉の粉末０．１０ｇを１０ｍＬ遠心管に正確に計量し、純水３ｍＬを加え、室温、２５０Ｗのパワーで３０ｍｉｎ超音波処理し、超音波処理後のサンプルを８０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、上清の１／２体積のトリクロロメタンを加え、３０ｍｉｎ振とうさせ、水相を吸引し、上記の操作を繰り返し、２回抽出した水相溶液を合わせ、不溶性ポリビニルピロリドン（ＰＶＰＰ）１５ｍｇを加え、上下に振とうさせ、８０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、０．２２μｍの微多孔性ろ過膜でろ過し、液体検出に供した。
（２）サリチル酸の抽出方法：葉１０．０ｇを十分に粉砕した後、１００ｍＬ遠心管に入れ、５％トリクロロ酢酸を４ｍＬ加え、水を２０ｍＬまで加えた後、更にエチルエーテル３０ｍＬを加え、十分に揺らし、１２ｈ浸出し、８０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上部のエチルエーテル相を取り出し、更に水相をエチルエーテルで２回繰り返し抽出し、エチルエーテル相を合わせ、乾固まで真空回転蒸発した後、５０％メタノール＋５０％酢酸緩衝液（ｐＨ＝３．２）の混合液１ｍＬを加えて溶解し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に保存し、遊離状態のサリチル酸サンプルとした。水相に１８．５％のＨＣｌを加えて最終ｐＨを３．２にし、８０℃の水浴にて１ｈ加熱し、冷却した後、エチルエーテルで３回抽出し、エチルエーテル相を併せて、乾固まで蒸発させて、その後に５０％メタノール＋５０％酢酸緩衝液（ｐＨ＝３．２）の混合液１ｍＬを加えて溶解し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れて保存し、結合状態のサリチル酸サンプルとした。結合状態のサリチル酸サンプルを０．２２μｍの微多孔性ろ過膜でろ過した後、液体検出に供した。
（３）結果を表４に示す。
表４から分かるように、２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの１：１溶液を散布したところ、タバコの葉中の２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の含有量は対照群に比べて２０～３５％上昇し、２’－デオキシグアノシンとグアノシンを一定の配合比で含む溶液を植物に散布すると、植物内の２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の蓄積を引き起こすことを明らかにした。
対照群ＣＫ：サリチル酸を検出した液体クロマトグラムを図９に示し、
Ａ群：サリチル酸を検出した液体クロマトグラムを図１０に示し、
対照群ＣＫ：２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを検出した液体クロマトグラムを図１１に示し、
Ａ群：２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを検出した液体クロマトグラムを図１２に示した。
通常の育苗方法に従ってタバコの育苗を行い、タバコが４週間まで成長したときに、１０本のタバコを選び、濃度１５０ｎｇ／ｍＬ、質量比１：１の２’－デオキシグアノシン及びグアノシン溶液をＡ群、清水を対照群ＣＫとしてそれぞれ散布し、１本当たりの施用量を１０ｍＬとし、処理ごとに３回繰り返した。２ｈ後、Ａ群と対照群ＣＫのベンサミアナタバコの葉を取り、液体クロマトグラフィーで２’－デオキシグアノシン、グアノシン、及びサリチル酸の含有量を検出した。
（１）ヌクレオシド類物質の抽出方法：タバコの葉０．５０ｇを液体窒素条件下で粉砕して粉末にし、タバコの葉の粉末０．１０ｇを１０ｍＬ遠心管に正確に計量し、純水３ｍＬを加え、室温、２５０Ｗのパワーで３０ｍｉｎ超音波処理し、超音波処理後のサンプルを８０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、上清の１／２体積のトリクロロメタンを加え、３０ｍｉｎ振とうさせ、水相を吸引し、上記の操作を繰り返し、２回抽出した水相溶液を合わせ、不溶性ポリビニルピロリドン（ＰＶＰＰ）１５ｍｇを加え、上下に振とうさせ、８０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、０．２２μｍの微多孔性ろ過膜でろ過し、液体検出に供した。
（２）サリチル酸の抽出方法：葉１０．０ｇを十分に粉砕した後、１００ｍＬ遠心管に入れ、５％トリクロロ酢酸を４ｍＬ加え、水を２０ｍＬまで加えた後、更にエチルエーテル３０ｍＬを加え、十分に揺らし、１２ｈ浸出し、８０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上部のエチルエーテル相を取り出し、更に水相をエチルエーテルで２回繰り返し抽出し、エチルエーテル相を合わせ、乾固まで真空回転蒸発した後、５０％メタノール＋５０％酢酸緩衝液（ｐＨ＝３．２）の混合液１ｍＬを加えて溶解し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に保存し、遊離状態のサリチル酸サンプルとした。水相に１８．５％のＨＣｌを加えて最終ｐＨを３．２にし、８０℃の水浴にて１ｈ加熱し、冷却した後、エチルエーテルで３回抽出し、エチルエーテル相を併せて、乾固まで蒸発させて、その後に５０％メタノール＋５０％酢酸緩衝液（ｐＨ＝３．２）の混合液１ｍＬを加えて溶解し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れて保存し、結合状態のサリチル酸サンプルとした。結合状態のサリチル酸サンプルを０．２２μｍの微多孔性ろ過膜でろ過した後、液体検出に供した。
（３）結果を表４に示す。
【表4】
対照群ＣＫ：サリチル酸を検出した液体クロマトグラムを図９に示し、
Ａ群：サリチル酸を検出した液体クロマトグラムを図１０に示し、
対照群ＣＫ：２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを検出した液体クロマトグラムを図１１に示し、
Ａ群：２’－デオキシグアノシン及びグアノシンを検出した液体クロマトグラムを図１２に示した。
【実施例8】
【0048】
因子の選択及び応答曲面の最適化
材料－液体比、超音波処理時間、超音波パワー及び溶媒濃度などの４つの因子を選択して応答曲面試験を設計し、ヌクレオシド類物質の抽出量を応答値とし、最適な抽出条件を得て検証し、試験設計因子及び結果を表５に示す。
モデルの作成及び統計解析
得られたデータに基づいて多重回帰分析を行い、対応する変数である材料－液体比、超音波処理時間、超音波パワー及び溶媒濃度とヌクレオシド抽出含有量との間の多重二次回帰方程式を得た。
Y=130.30+65.87*A+12.10*B+3.09*C+0.8250*D+5.89*A*B-2.39*A*C+0.2125*A*D-0.5375*B*C+6.51*B*D-1.61*C*D-1.06*A２-0.4208*B２-8.71*C２+2.99*D２
この回帰方程式Ｒ２＝０．９８０９、Ａｄｊ Ｒ２＝０．９６３０は、この方程式の予測値と実際値との間の相関が良好であることを示している。
分散結果の分析：表６の分析から分かるように、モデルのＦ値は５４．８９であり、このモデルが有意であることを示唆し、Ｐ値は０．０００１より小さく、わずか０．０１％の確率でこのＦ値がノイズによるものであることを示した。Ｐ値が０．０５より小さいことは、このモデルの項目が有意であることを示唆し、今回の実験では、Ａ、Ｂ、ＢＤ、Ｃ２は、有意項であり、有意レベルの順序はＡ＞Ｂ＞Ｃ２＞ＢＤであり、その他の項は有意ではない。不適合度のＦ値が１であることは、不適合度が絶対誤差に対して有意でないことを示し、５３．５４％の確率で不適合度のＦ値がノイズによるものであることを示し、不適合度が有意でないことはこのモデルが良いことを示唆した。各項のＦ値は、Ａ（材料－液体比）とＢ（エタノール濃度）が抽出液濃度に著しい影響を与え、Ａの影響はＢよりはるかに大きいことを示した。
Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔソフトウェアを用いて、材料－液体比１：３（ｇ／ｍＬ）、エタノールの体積濃度３０％、抽出時間６３．３ｍｉｎ、超音波パワー１６００Ｗという最適なパラメータの組み合わせを得た。
材料－液体比、超音波処理時間、超音波パワー及び溶媒濃度などの４つの因子を選択して応答曲面試験を設計し、ヌクレオシド類物質の抽出量を応答値とし、最適な抽出条件を得て検証し、試験設計因子及び結果を表５に示す。
【表5】
【表6】
得られたデータに基づいて多重回帰分析を行い、対応する変数である材料－液体比、超音波処理時間、超音波パワー及び溶媒濃度とヌクレオシド抽出含有量との間の多重二次回帰方程式を得た。
Y=130.30+65.87*A+12.10*B+3.09*C+0.8250*D+5.89*A*B-2.39*A*C+0.2125*A*D-0.5375*B*C+6.51*B*D-1.61*C*D-1.06*A２-0.4208*B２-8.71*C２+2.99*D２
この回帰方程式Ｒ２＝０．９８０９、Ａｄｊ Ｒ２＝０．９６３０は、この方程式の予測値と実際値との間の相関が良好であることを示している。
分散結果の分析：表６の分析から分かるように、モデルのＦ値は５４．８９であり、このモデルが有意であることを示唆し、Ｐ値は０．０００１より小さく、わずか０．０１％の確率でこのＦ値がノイズによるものであることを示した。Ｐ値が０．０５より小さいことは、このモデルの項目が有意であることを示唆し、今回の実験では、Ａ、Ｂ、ＢＤ、Ｃ２は、有意項であり、有意レベルの順序はＡ＞Ｂ＞Ｃ２＞ＢＤであり、その他の項は有意ではない。不適合度のＦ値が１であることは、不適合度が絶対誤差に対して有意でないことを示し、５３．５４％の確率で不適合度のＦ値がノイズによるものであることを示し、不適合度が有意でないことはこのモデルが良いことを示唆した。各項のＦ値は、Ａ（材料－液体比）とＢ（エタノール濃度）が抽出液濃度に著しい影響を与え、Ａの影響はＢよりはるかに大きいことを示した。
Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔソフトウェアを用いて、材料－液体比１：３（ｇ／ｍＬ）、エタノールの体積濃度３０％、抽出時間６３．３ｍｉｎ、超音波パワー１６００Ｗという最適なパラメータの組み合わせを得た。
【実施例9】
【0049】
最適抽出条件の検証試験
粉砕したパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株の菌粉を、一定濃度のエタノール溶液と一定の質量体積比で混合した後、一定のパワーで一定時間超音波処理し、真空吸引濾過し、濾液を収集し、使用に備え、濾液はパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株抽出物であり、具体的な条件は以下の通りであり、その他の条件は実施例１の抽出方法と同じであった。
Ａ群の材料－液体比は１：３（ｇ／ｍＬ）、エタノールの体積濃度は３０％、超音波パワーは１６００Ｗ、抽出時間は６３．３ｍｉｎであり、
Ｂ群の材料－液体比は１：５（ｇ／ｍＬ）、エタノールの体積濃度は３０％、超音波パワーは１６００Ｗ、抽出時間は６３．３ｍｉｎであり、
Ｃ群の材料－液体比は１：３（ｇ／ｍＬ）、エタノールの体積濃度は２０％、超音波パワーは１６００Ｗ、抽出時間は６３．３ｍｉｎであり、
Ｄ群の材料－液体比は１：１（ｇ／ｍＬ）、エタノールの体積濃度は２０％、超音波パワーは１６００Ｗ、抽出時間は６３．３ｍｉｎである。
実施例５のステップに従って抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの含有量を測定し、その結果を表７に示す。
表７の実験データから分かるように、本発明による抽出方法では、抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの含有量が高く、特に抽出条件として、材料－液体比が１：３（ｇ／ｍＬ）で、エタノールの体積濃度が３０％である場合、菌体抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの含有量は最も高く、２’－デオキシグアノシンの含有量は１０．９３ｍｇ／ｋｇで、グアノシンの含有量は８．５４ｍｇ／ｋｇであり、本発明による抽出方法は、２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの後続の生産や利用などの研究の展開に有利である。
粉砕したパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株の菌粉を、一定濃度のエタノール溶液と一定の質量体積比で混合した後、一定のパワーで一定時間超音波処理し、真空吸引濾過し、濾液を収集し、使用に備え、濾液はパエシロミセス・バリオティＳＪ１菌株抽出物であり、具体的な条件は以下の通りであり、その他の条件は実施例１の抽出方法と同じであった。
Ａ群の材料－液体比は１：３（ｇ／ｍＬ）、エタノールの体積濃度は３０％、超音波パワーは１６００Ｗ、抽出時間は６３．３ｍｉｎであり、
Ｂ群の材料－液体比は１：５（ｇ／ｍＬ）、エタノールの体積濃度は３０％、超音波パワーは１６００Ｗ、抽出時間は６３．３ｍｉｎであり、
Ｃ群の材料－液体比は１：３（ｇ／ｍＬ）、エタノールの体積濃度は２０％、超音波パワーは１６００Ｗ、抽出時間は６３．３ｍｉｎであり、
Ｄ群の材料－液体比は１：１（ｇ／ｍＬ）、エタノールの体積濃度は２０％、超音波パワーは１６００Ｗ、抽出時間は６３．３ｍｉｎである。
実施例５のステップに従って抽出物中の２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの含有量を測定し、その結果を表７に示す。
【表7】
【実施例10】
【0050】
腸炎ビブリオ菌に対する２’－デオキシグアノシン及びグアノシンの影響に関する実験
腸炎ビブリオ菌（ＶＰ：Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、海水や魚介類に広く存在し、中国の沿海地域でよく見られる食中毒病原菌である。
腸炎ビブリオ菌を３７℃で１２ｈかけて対数期まで培養し、０．０１Ｍ ｐＨ７．２リン酸緩衝液で１０６ＣＦＵ／ｍＬまで希釈した。２’－デオキシグアノシンとグアノシンを１：１の質量比で含む１ｍｇ／ｍＬのＴＣＢＳ培地、及び２’－デオキシグアノシンとグアノシンを含まないＴＣＢＳ培地にそれぞれ接種し、３７℃で一晩インキュベートした後、培地上の腸炎ビブリオ菌の成長状況を観察した。図１３に示すように、２’－デオキシグアノシンとグアノシンを含まない対照と比べて、１：１の２’－デオキシグアノシンとグアノシンは、腸炎ビブリオ菌に対して一定の抑制効果があった。
腸炎ビブリオ菌（ＶＰ：Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、海水や魚介類に広く存在し、中国の沿海地域でよく見られる食中毒病原菌である。
腸炎ビブリオ菌を３７℃で１２ｈかけて対数期まで培養し、０．０１Ｍ ｐＨ７．２リン酸緩衝液で１０６ＣＦＵ／ｍＬまで希釈した。２’－デオキシグアノシンとグアノシンを１：１の質量比で含む１ｍｇ／ｍＬのＴＣＢＳ培地、及び２’－デオキシグアノシンとグアノシンを含まないＴＣＢＳ培地にそれぞれ接種し、３７℃で一晩インキュベートした後、培地上の腸炎ビブリオ菌の成長状況を観察した。図１３に示すように、２’－デオキシグアノシンとグアノシンを含まない対照と比べて、１：１の２’－デオキシグアノシンとグアノシンは、腸炎ビブリオ菌に対して一定の抑制効果があった。
【0051】
以上は、本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を限定するためのものではなく、当業者にとって、本発明は様々な変更や変化が可能である。本発明の精神及び原則を逸脱することなく行われるすべての補正、均等置換や改良などは、本発明の保護範囲内に含まれるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】