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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-16
(54)【発明の名称】イネの雑草抵抗におけるフラボノイド配糖体の作用
(51)【国際特許分類】
A01H 3/04 20060101AFI20240808BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20240808BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20240808BHJP
A01N 43/16 20060101ALI20240808BHJP
A01P 21/00 20060101ALI20240808BHJP
A01P 13/00 20060101ALI20240808BHJP
A01N 65/44 20090101ALI20240808BHJP
A01M 21/04 20060101ALI20240808BHJP
A01G 7/06 20060101ALI20240808BHJP
A01G 22/22 20180101ALI20240808BHJP
【ＦＩ】
A01H3/04
A01H6/46 ZNA
A01H1/00 A
A01N43/16 C
A01P21/00
A01P13/00
A01N65/44
A01M21/04 C
A01G7/06 A
A01G22/22 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024510257
(86)(22)【出願日】2022-01-05
(85)【翻訳文提出日】2024-04-15
(86)【国際出願番号】 CN2022070229
(87)【国際公開番号】W WO2023019871
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】202110942015.X
(32)【優先日】2021-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524061976
【氏名又は名称】中国科学院植物研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】漆小泉
(72)【発明者】
【氏名】馬愛民
(72)【発明者】
【氏名】宋波
(72)【発明者】
【氏名】戴均貴
(72)【発明者】
【氏名】宋治軍
【テーマコード（参考）】
2B022
2B121
4H011
【Ｆターム（参考）】
2B022EA10
2B121AA19
2B121CC05
2B121EA26
2B121FA15
4H011AB02
4H011AB03
4H011BB08
(57)【要約】
本発明は、イネの雑草抵抗におけるフラボノイド配糖体の作用を開示している。本発明は、イソオリエンチンの以下のいずれかにおける使用：雑草の成長抑制、植物の他感作用の制御、植物の雑草に対する抵抗力の制御を提供する。本発明の結果は、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）により植物の他感作用を制御することができ、雑草の成長を抑制するために使用できることを示している。本発明は、環境に優しいグリーン農薬の開発に重要な意義を持つとともに、水田における雑草の防除に理論的指針を与える。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
イソオリエンチンの以下のいずれかにおける使用：Ｐ１：雑草の成長抑制、
Ｐ２：植物の他感作用の制御、
Ｐ３：植物の雑草に対する抵抗力の制御。
【請求項2】
Ｐ２において、前記植物の他感作用の制御は、当該植物体内におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることにより、前記植物の他感作用を強化することであり、Ｐ３において、前記植物の雑草に対する抵抗力の制御は、前記植物体内におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることにより、前記植物の雑草に対する抵抗力を強化することである、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記植物はイネであり、前記雑草はイヌビエである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項4】
雑草にイソオリエンチンを施用する工程を含む、雑草の成長抑制方法。
【請求項5】
前記イソオリエンチンの作用濃度が５００ｍｇ／Ｌ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記イソオリエンチンの作用濃度が５００ｍｇ／Ｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記雑草の成長抑制は、雑草の根又は幼根の成長を抑制することである、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることにより、他感作用が強化された植物品種を得る工程を含む、他感作用が強化された植物品種の育種方法。
【請求項9】
受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を低下させることにより、他感作用が低減された植物品種を得る工程を含む、他感作用が低減された植物品種の育種方法。
【請求項10】
受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることにより、雑草に対する抵抗力が強化された植物品種を得る工程を含む、雑草に対する抵抗力が強化された植物品種の育種方法。
【請求項11】
受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を低下させることにより、雑草に対する抵抗力が低減された植物品種を得る工程を含む、雑草に対する抵抗力が低減された植物品種の育種方法。
【請求項12】
前記方法において、前記受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることは、以下のように達成される、請求項８又は１０に記載の方法：（Ａ１）前記受容体植物における、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を低下させる、及び／又は
（Ａ２）前記受容体植物における、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を向上させる。
【請求項13】
前記方法において、前記受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を低下させることは、以下のように達成される、請求項９又は１１に記載の方法：（Ｂ１）前記受容体植物における、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を向上させる、及び／又は
（Ｂ２）前記受容体植物における、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を低下させる。
【請求項14】
（Ａ１）は、以下の（ａ１）により達成され、（Ａ２）は、以下の（ａ２）により達成される、請求項１２に記載の方法：（ａ１）前記受容体植物における、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する、
（ａ２）前記受容体植物に、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子を導入する。
【請求項15】
（Ｂ１）は、以下の（ｂ１）により達成され、（Ｂ２）は、以下の（ｂ２）により達成される、請求項１３に記載の方法：（ｂ１）前記受容体植物に、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子を導入する、
（ｂ２）前記受容体植物における、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する。
【請求項16】
前記他の物質は、前記受容体植物の他感作用を強化できない物質であるか、又はイソオリエンチンよりも弱い程度で前記受容体植物の他感作用を強化する物質である、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項17】
前記他の物質は、前記受容体植物の雑草に対する抵抗力を強化できない物質であるか、又はイソオリエンチンよりも弱い程度で前記受容体植物の雑草に対する抵抗力を強化する物質である、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
（Ａ１）、（ａ１）、（Ｂ１）及び（ｂ１）において、前記他の物質は、イソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシドである、請求項１２から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項19】
植物がイネであり、前記雑草はイヌビエである、請求項４から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項20】
Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質又はその関連生物材料の以下のいずれかにおける使用：Ｑ１：イソオリエンチンのグリコシル化反応を触媒すること、
Ｑ２：イソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシドの調製、
Ｑ３：植物におけるイソオリエンチン含有量の制御；
前記関連生物材料は、前記Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質を発現することができる核酸分子又は前記核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター、組換え菌又はトランスジェニック細胞株である；
前記Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質は、以下のいずれかで示されるタンパク質である:
（Ｄ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるタンパク質、
（Ｄ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加されるとともに、同一の機能を有するタンパク質、
（Ｄ３）（Ｄ１）～（Ｄ２）のいずれかに限定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、又は８０％以上の相同性を有するとともに、同一の機能を有するタンパク質、
（Ｄ４）（Ｄ１）～（Ｄ３）のいずれかに限定されるタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端にタグを結合して得られる融合タンパク質。
【請求項21】
請求項８から１９のいずれかに記載の方法を用いて育種することにより得られた植物品種。
【請求項22】
イソオリエンチンである、雑草の成長抑制化合物。
【請求項23】
前記雑草は、イヌビエである、請求項２２に記載の化合物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はバイオテクノロジーの分野に関し、具体的にはイネの雑草抵抗におけるフラボノイド配糖体の作用に関する。
【背景技術】
【0002】
水田における雑草の成長は、イネの収量や品質に深刻な影響を及ぼしている（Ａｍｂ ａｎｄ Ａｈｌｕｗａｌｉａ，２０１６；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。現在、除草剤の施用が主な雑草防除方法であるが、除草剤の大量施用には、環境汚染を引き起こし（Ａｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、ヒトの健康を危険にさらし、抵抗性雑草を増加させる（Ｊａｂｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）など、多くの危険が伴う。したがって、環境に優しい雑草管理技術、特に他感作用に基づく雑草防除戦略の開発がますます注目を集めている（Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ、２０１５）。植物の他感作用とは、生物間の相互作用、すなわち、ある植物（又は微生物）が、１つ又は複数の化学物質（他感物質）を環境に放出することによって、他の植物（又はは微生物）の成長に直接的又は間接的に影響を与える作用を指す（Ｒｉｃｅ，１９８４）。
【0003】
現在、イネで発見された他感物質は、主にインドール類、フェノール酸類、テルペノイド類、フラボノイド類、脂肪酸類、アルカロイド類などに分けられ（Ｋｈａｎｈ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｋａｔｏ－Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、他感作用を有するフラボノイド類物質は主にトリシン（ｔｒｉｃｉｎ，５，７，４’－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ－３’，５’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）であり、他のフラボノイド類物質に他感作用があるかどうか、またイネの他感作用の遺伝メカニズムや抑草メカニズムは明らかになっていない。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、イネの雑草抵抗におけるフラボノイド配糖体の作用について保護を求める。
【0005】
第一態様において、本発明は、イソオリエンチンの以下のいずれかにおける使用について保護を求める。
Ｐ１：雑草の成長抑制、
Ｐ２：植物の他感作用の制御、
Ｐ３：植物の雑草に対する抵抗力の制御。
Ｐ１：雑草の成長抑制、
Ｐ２：植物の他感作用の制御、
Ｐ３：植物の雑草に対する抵抗力の制御。
【0006】
植物の他感作用の制御は、植物体内におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることにより、植物の他感作用を強化することである。
【0007】
植物の雑草に対する抵抗力の制御は、植物体内におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることにより、植物の雑草に対する抵抗力を強化することである。
【0008】
第二態様において、本発明は、雑草の成長抑制方法について保護を求める。
【0009】
本発明が保護を求める雑草の成長抑制方法は、雑草にイソオリエンチンを施用する工程を含むことができる。
【0010】
ここで、イソオリエンチンの作用濃度が５００ｍｇ／Ｌ以上であってもよい。
【0011】
本発明の具体的な実施形態において、イソオリエンチンの作用濃度は５００ｍｇ／Ｌである。
【0012】
本発明の具体的な実施形態において、雑草の成長抑制は、具体的に雑草の根又は幼根の成長を抑制することである。
【0013】
第三態様において、本発明は、以下のいずれかの方法について保護を求める。
方法Ｉ：受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることにより、他感作用が強化された植物品種を得る工程を含む、他感作用が強化された植物品種の育種方法。
方法II：受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を低下させることにより、他感作用が低減された植物品種を得る工程を含む、他感作用が低減された植物品種の育種方法。
方法III：受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることにより、雑草に対する抵抗力が強化された植物品種を得る工程を含む、雑草に対する抵抗力が強化された植物品種の育種方法。
方法IV：受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を低下させることにより、雑草に対する抵抗力が低減された植物品種を得る工程を含む、雑草に対する抵抗力が低減された植物品種の育種方法。
方法Ｉ：受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることにより、他感作用が強化された植物品種を得る工程を含む、他感作用が強化された植物品種の育種方法。
方法II：受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を低下させることにより、他感作用が低減された植物品種を得る工程を含む、他感作用が低減された植物品種の育種方法。
方法III：受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることにより、雑草に対する抵抗力が強化された植物品種を得る工程を含む、雑草に対する抵抗力が強化された植物品種の育種方法。
方法IV：受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を低下させることにより、雑草に対する抵抗力が低減された植物品種を得る工程を含む、雑草に対する抵抗力が低減された植物品種の育種方法。
【0014】
上記方法において、受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を向上させることは、以下のように達成することができる。
（Ａ１）受容体植物における、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を低下させる、及び／又は
（Ａ２）受容体植物における、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を向上させる。
（Ａ１）受容体植物における、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を低下させる、及び／又は
（Ａ２）受容体植物における、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を向上させる。
【0015】
上記方法において、受容体植物におけるイソオリエンチンの含有量を低下させることは、以下のように達成することができる。
（Ｂ１）受容体植物における、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を向上させる、及び／又は
（Ｂ２）受容体植物における、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を低下させる。
（Ｂ１）受容体植物における、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を向上させる、及び／又は
（Ｂ２）受容体植物における、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質の活性及び／又は発現量を低下させる。
【0016】
さらに、（Ａ１）は、以下の（ａ１）により達成することができ、（Ａ２）は、以下の（ａ２）により達成することができる。
（ａ１）受容体植物における、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する、
（ａ２）受容体植物に、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子を導入する。
（ａ１）受容体植物における、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する、
（ａ２）受容体植物に、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子を導入する。
【0017】
さらに、（Ｂ１）は、以下の（ｂ１）により達成することができ、（Ｂ２）は、以下の（ｂ２）により達成することができる。
（ｂ１）受容体植物に、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子を導入する、
（ｂ２）受容体植物における、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する。
（ｂ１）受容体植物に、イソオリエンチンから他の物質への変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子を導入する、
（ｂ２）受容体植物における、他の物質からイソオリエンチンへの変換を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する。
【0018】
ここで、他の物質は、受容体植物の他感作用を強化できない物質であるか、又はイソオリエンチンよりも弱い程度で受容体植物の他感作用を強化する物質である。あるいは、他の物質は、受容体植物の雑草に対する抵抗力を強化できない物質であるか、又はイソオリエンチンよりも弱い程度で受容体植物の雑草に対する抵抗力を強化する物質である。
【0019】
本発明の具体的な実施形態において、（Ａ１）、（ａ１）、（Ｂ１）及び（ｂ１）における他の物質は、具体的にはイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシドである。
【0020】
上記各態様において、植物はイネであってもよく、雑草はイヌビエであってもよい。
【0021】
第四態様において、本発明は、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質又はその関連生物材料の以下のいずれかにおける使用について保護を求める。
Ｑ１：イソオリエンチンのグリコシル化反応を触媒すること、
Ｑ２：イソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシドの調製、
Ｑ３：植物におけるイソオリエンチン含有量の制御。
Ｑ１：イソオリエンチンのグリコシル化反応を触媒すること、
Ｑ２：イソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシドの調製、
Ｑ３：植物におけるイソオリエンチン含有量の制御。
【0022】
関連生物材料は、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質を発現することができる核酸分子又は核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター、組換え菌又はトランスジェニック細胞株である。
【0023】
Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質は、以下のいずれかで示されるタンパク質であってもよい。
（Ｄ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるタンパク質、
（Ｄ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加されるとともに、同一の機能を有するタンパク質、
（Ｄ３）（Ｄ１）～（Ｄ２）のいずれかに限定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、又は８０％以上の相同性を有するとともに、同一の機能を有するタンパク質、
（Ｄ４）（Ｄ１）～（Ｄ３）のいずれかに限定されるタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端にタグを結合して得られる融合タンパク質。
（Ｄ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるタンパク質、
（Ｄ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加されるとともに、同一の機能を有するタンパク質、
（Ｄ３）（Ｄ１）～（Ｄ２）のいずれかに限定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、又は８０％以上の相同性を有するとともに、同一の機能を有するタンパク質、
（Ｄ４）（Ｄ１）～（Ｄ３）のいずれかに限定されるタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端にタグを結合して得られる融合タンパク質。
【0024】
上記タンパク質において、タグとは、目的タンパク質の発現、検出、追跡及び／又は精製を容易にするために、生体外組換えＤＮＡ技術を用いて目的タンパク質と一緒に融合して発現させたポリペプチド又はタンパク質を意味する。タグは、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、ＭＢＰタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグ及び／又はＳＵＭＯタグなどであってもよい。
【0025】
上記タンパク質において、相同性とはアミノ酸配列の同一性を指す。アミノ酸配列の同一性は、ＮＣＢＩホームページのＢＬＡＳＴページなど、インターネット上の相同性検索サイトを使用して測定することができる。例えば、高度なＢＬＡＳＴ２．１では、プログラムとしてｂｌａｓｔｐを使用し、Ｅｘｐｅｃｔ値を１０に設定し、すべてのＦｉｌｔｅｒをＯＦＦに設定し、ＭａｔｒｉｘとしてＢＬＯＳＵＭ６２を使用し、Ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ、Ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ、Ｌａｍｂｄａ ｒａｔｉｏをそれぞれ１１、１、０．８５（デフォルト値）に設定し、一対のアミノ酸配列の同一性を検索して計算すると、同一性の値（％）を得ることができる。
【0026】
上記タンパク質において、９９％以上の同一性は、少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％の同一性であってもよい。９５％以上の同一性は、少なくとも９６％、９７％、９８％の同一性であってもよい。９０％以上の同一性は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％の同一性であってもよい。８５％以上の同一性は、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％の同一性であってもよい。８０％以上の同一性は、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％の同一性であってもよい。
【0027】
Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質を発現することができる核酸分子は、以下のいずれかで示されるＤＮＡ分子であってもよい。
（Ｅ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で示されるＤＮＡ分子、
（Ｅ２）ストリンジェントな条件下で、（Ｅ１）で限定されるＤＮＡ分子とハイブリダイズするとともに、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質をコードするＤＮＡ分子、
（Ｅ３）（Ｅ１）又は（Ｅ２）で限定されるＤＮＡ分子と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上又は８０％以上の同一性を有するとともに、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質をコードするＤＮＡ分子。
（Ｅ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で示されるＤＮＡ分子、
（Ｅ２）ストリンジェントな条件下で、（Ｅ１）で限定されるＤＮＡ分子とハイブリダイズするとともに、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質をコードするＤＮＡ分子、
（Ｅ３）（Ｅ１）又は（Ｅ２）で限定されるＤＮＡ分子と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上又は８０％以上の同一性を有するとともに、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【0028】
上記核酸分子において、ストリンジェントな条件は以下の通りである。５０℃で、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａ３ＰＯ４および１ｍＭのＥＤＴＡの混合溶液でハイブリダイズし、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄してもよい。又は、５０℃で、７％ＳＤＳ、０．５ＭのＮａ３ＰＯ４および１ｍＭのＥＤＴＡの混合溶液でハイブリダイズし、５０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄してもよい。又は、５０℃で、７％ＳＤＳ、０．５ＭのＮａ３ＰＯ４および１ｍＭのＥＤＴＡの混合溶液でハイブリダイズし、５０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄してもよい。又は、５０℃で、７％ＳＤＳ、０．５ＭのＮａ３ＰＯ４および１ｍＭのＥＤＴＡの混合溶液でハイブリダイズし、５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄してもよい。又は、５０℃で、７％ＳＤＳ、０．５ＭのＮａ３ＰＯ４および１ｍＭのＥＤＴＡの混合溶液でハイブリダイズし、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄してもよい。又は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液で、６５℃でハイブリダイズした後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで一回ずつ洗浄してもよい。
【0029】
上記核酸分子において、相同性とはヌクレオチド配列の同一性を指す。ヌクレオチド配列の同一性は、ＮＣＢＩホームページのＢＬＡＳＴページなど、インターネット上の相同性検索サイトを使用して測定することができる。例えば、高度なＢＬＡＳＴ２．１では、プログラムとしてｂｌａｓｔｐを使用し、Ｅｘｐｅｃｔ値を１０に設定し、すべてのＦｉｌｔｅｒをＯＦＦに設定し、ＭａｔｒｉｘとしてＢＬＯＳＵＭ６２を使用し、Ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ、Ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ、Ｌａｍｂｄａ ｒａｔｉｏをそれぞれ１１、１、０．８５（デフォルト値）に設定し、一対のヌクレオチド配列の同一性を検索して計算すると、同一性の値（％）を得ることができる。
【0030】
上記核酸分子において、９５％以上の相同性は、少なくとも９６％、９７％、９８％の同一性であってもよい。９０％以上の相同性は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％の同一性であってもよい。８５％以上の相同性は、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％の同一性であってもよい。８０％以上の相同性は、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％の同一性であってもよい。
【0031】
組換え発現ベクターは、既存の植物発現ベクターを用いて構築することができる。植物発現ベクターには、バイナリーアグロバクテリウムベクターやマイクロプロジェクタイルボンバードメントに使用可能なベクターなど、例えば、ｐＣＡＭＢＩＡ－１３００－２２１、ｐＧｒｅｅｎ００２９、ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００、ｐＢＩ１２１、ｐＢｉｎ１９、ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ＵｂｉＮ又はこれらのベクター由来の植物発現ベクターが含まれる。植物発現ベクターはさらに、外来遺伝子の３’末端非翻訳領域、すなわちポリアデニル酸シグナル及びｍＲＮＡ処理又は遺伝子発現に関与する他の任意のＤＮＡ断片を含むこともできる。ポリアデニル酸シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸の付加を指示することができる。上記遺伝子を用いて組換え発現ベクターを構築する場合には、その転写開始ヌクレオチドの前に、強化的、構成的、組織特異的又は誘導性プロモーターのいずれかを付加することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣＡＭＶ）３５Ｓプロモーター、ユビキチン遺伝子Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎプロモーター（ｐＵｂｉ）、ストレス誘導性プロモーターｒｄ２９Ａなどが挙げられ、これらは単独で又は他の植物プロモーターと組み合わせて使用することができる。さらに、本発明の遺伝子を用いて組換え発現ベクターを構築する場合には、翻訳エンハンサーや転写エンハンサーなどのエンハンサーを使用することもできる。これらのエンハンサー領域は、ＡＴＧ開始コドンや隣接領域開始コドンなどであってもよいが、配列全体を確実に翻訳するために、コード配列のリーディングフレームと一致しなければならない。翻訳制御シグナル及び開始コドンは、様々な起源に由来するものであり、天然であってもよく、合成であってもよい。翻訳開始領域は、転写開始領域又は構造遺伝子に由来することができる。トランスジェニック植物細胞又は植物の同定やスクリーニングを容易にするために、使用される組換え発現ベクターを処理することができる。例えば、植物で発現することができる色変化酵素や発光化合物をコードする遺伝子、耐性を有する抗生物質マーカーや化学薬剤耐性マーカー遺伝子などを付加する。また、選択的マーカー遺伝子を付加することなく、そのまま植物をストレススクリーニングにより形質転換することもできる。
【0032】
第五態様において、本発明はさらに、前文の第三態様に記載の方法を用いて育種することにより得られた植物品種について保護を求める。
【0033】
植物品種には、完全な植物、種子、繁殖可能な組織又は器官などが含まれるが、これらに限定されない。
【0034】
育種方法によって、植物品種は、他感作用が強化された植物品種、他感作用が低減された植物品種、雑草に対する抵抗力が強化された植物品種、雑草に対する抵抗力が低減された植物品種、のいずれであってもよい。
【0035】
第六態様において、本発明はさらに、雑草の成長抑制化合物について保護を求める。
【0036】
本発明が保護を求める雑草の成長抑制化合物は、イソオリエンチンである。
【0037】
ここで、雑草はイヌビエであってもよい。
【0038】
上記各態様において、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）の構造式は、図１で示される。イソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の構造式は、図２で示される。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）の構造式である。
【図2】イソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の構造式である。
【図3】Ｏｓ０２ｇ０５８９４００タンパク質の精製である。矢印は、タンパク質精製後の組換えタンパク質の大きさである。
【図4】Ｏｓ０２ｇ０５８９４００のインビトロ酵素活性アッセイのクロマトグラムである。
【図5】化合物イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）とイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の雑草抑制効果の比較を示す。Ａは、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）とイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）のイヌビエの幼根の成長に対する影響を示し、Ｂは、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）とイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）のイヌビエの幼芽の成長に対する影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【0040】
以下の実施例は本発明の理解を容易にするためのものであるが、本発明を限定するものではない。以下の実施例における実験方法は、特に説明がない限り、通常の方法である。以下の実施例に使用される試験材料は、特に説明がない限り、通常の生化学試薬の店から購入したものである。以下の実施例における定量試験は、いずれも３回の重複実験を設定し、その結果を平均化したものである。
【0041】
実施例１、化合物の精製
（１）目的化合物の含有量の高いインディカ米の生葉を播種後約５５日で採取し、凍結乾燥機で乾燥後、粉末状に粉砕する。８倍体積の７５％エタノールを加え、超音波で３回、各回２０分間抽出する。
（１）目的化合物の含有量の高いインディカ米の生葉を播種後約５５日で採取し、凍結乾燥機で乾燥後、粉末状に粉砕する。８倍体積の７５％エタノールを加え、超音波で３回、各回２０分間抽出する。
【0042】
（２）抽出液をろ過し、ロータリーエバポレーターでアルコール臭がなくなるまで濃縮し、等体積の石油エーテルを加えて３回抽出し、石油エーテル相の抽出液を集めた後、残りの水相に等体積のジクロロメタンを加えて３回抽出し、ジクロロメタン相の抽出液を集めた後、残りの水相に等体積のｎ－ブタノールを加えて３回抽出し、ｎ－ブタノール相の抽出液を集める。
【0043】
（３）（２）における各相の抽出液を１ｍＬ取り、乾燥させた後にメタノールで溶解し、遠心分離し、上清を吸引してＡｇｉｌｅｎｔバイアルに移し、ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ／ＭＳを使用して各相の化合物を測定する。カラム：ＲＲＨＤ ＳＢ－Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ）、充填剤粒径：１．８μｍ、仕様：２．１ｍｍ（内径）×１００ｍｍ（長さ）。カラム温度：４０℃、注入量：５μＬ。移動相Ａ：Ｈ２Ｏ（ギ酸０．１％含有、％は体積百分率を表す）、移動相Ｂ：アセトニトリル。溶出勾配：０～２分：５％Ｂ～１０％Ｂ、２～１２分：１０％Ｂ～２５％Ｂ、１２～１８分：２５％Ｂ～７０％Ｂ、１８～２３分：７０％Ｂ～９０％Ｂ、２３～２５分：９０％Ｂ～１００％Ｂ、２５～３０分：１００％Ｂ、ポストラン５分。流速：０．３ｍＬ／Ｍｉｎ。質量分析システムは、正イオン測定モードのエレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）を使用し、キャリアガスが高純度窒素、圧力：４０ｐｓｉ、温度：３２５℃である。測定した結果、目的化合物が主にｎ－ブタノール相に存在していることが分かった。
【0044】
（４）得られたｎ－ブタノール相をロータリーエバポレーターで濃縮した後、低・中圧分取高速液体クロマトグラフ（Ｂｉｏｔａｇｅ ＩｓｏｌｅｒａＴＭ Ｐｒｉｍｅ）を用いてウェットローディング法で粗分画を行う。シリカゲルカラムの充填剤は、粒子径５０μｍ、孔径１２ｎｍのＹＭＣ＊ＧＥＬ Ｃ１８球形充填剤である。移動相は水（ギ酸０．１％含有、％は体積百分率を表す）、メタノールである。移動相比は１０％～９０％メタノールを１０カラム体積、９０％～１００％メタノールを２カラム体積であり、％は体積百分率を表す。流速：５０ｍＬ／ｍｉｎ。
【0045】
（５）ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ／ＭＳを用いて各画分中の目的化合物の含有量を（３）と同じ方法で測定する。その後、目的化合物を含む画分を合わせて、ロータリーエバポレーターで濃縮する。
【0046】
（６）濃縮物をＯＤＳカラムで予備分離し、１８：８２、２４：７６、３０：７０、３５：６５、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、１００：００（体積比）のメタノール：Ｈ２Ｏ溶液で順次溶出する。合計８画分を得た後、ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ／ＭＳを使用して各画分中の目的化合物の含有量を測定する。測定した結果、画分２（Ｆｒ２）及び画分３（Ｆｒ３）には目的化合物が含まれていることが分かった。
【0047】
（７）Ｆｒ２を濃縮して秤量する。その後、逆相セミ分取高速液体クロマトグラフを使用して２０３ｍｇのＦｒ２を分離する。移動相：アセトニトリル－Ｈ２Ｏ（１５：８５、ｖ／ｖ）、流速：２．５ｍＬ／ｍｉｎ。合計１３画分（Ｆｒ２．１～Ｆｒ２．１３）を得た。測定した結果、Ｆｒ２．１０には目的化合物が含まれていることが分かった。これを濃縮して、４３ｍｇの濃縮物を得た後、逆相セミ分取高速液体クロマトグラフを使用してさらに分離する。移動相：メタノール－Ｈ２Ｏ（４０：６０、ｖ／ｖ）、流速：２．５ｍＬ／ｍｉｎ、イソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（１３．０ｍｇ、ＲＴ＝１８．３ｍｉｎ）を得た。
【0048】
（８）Ｆｒ３を濃縮して１０８ｍｇの濃縮物を得た。その後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０カラムで予備分離し、溶出液はメタノールである。合計８画分を得、そのうち画分２（Ｆｒ３．２）には目的化合物が含まれている。濃縮後、Ｆｒ３．２（５４ｍｇ）を逆相セミ分取高速液体クロマトグラフにより精製する。移動相：アセトニトリル－Ｈ２Ｏ（２０：８０、ｖ／ｖ）、流速：２．５ｍＬ／ｍｉｎ、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）（１６．９ｍｇ、ＲＴ＝１６．３ｍｉｎ）を得た。
【0049】
（９）得られた化合物単体を、ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＩＩＩ ４００分光計）を用いて構造同定する。イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）の構造は図１に示され、具体的なＮＭＲ結果は、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：６．５３（１Ｈ，ｓ，Ｈ－３），６．４７（１Ｈ，ｓ，Ｈ－８），７．３５（１Ｈ，ｓ，Ｈ－２′），６．８９（１Ｈ，ｂｒｓＨ－５′），７．３５（１Ｈ，ｓ，Ｈ－６′），４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ－１′′），４．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２′′），３．４８（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３′′），３．５０（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４′′），３．４３（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５′′），３．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，Ｈ－６ａ′′），３．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．４，５．２Ｈｚ，Ｈ－６ｂ′′）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：１６６．２（Ｃ－２），１０３．９（Ｃ－３），１８４．０（Ｃ－４），１６２．０（Ｃ－５），１０９．１（Ｃ－６），１６４．８（Ｃ－７），９５．２（Ｃ－８），１５８．７（Ｃ－９），１０５．２（Ｃ－１０），１２３．５（Ｃ－１′），１１４．１（Ｃ－２′），１４７．０（Ｃ－３′），１５１．０（Ｃ－４′），１１６．８（Ｃ－５′），１２０．３（Ｃ－６′），７５．３（Ｃ－１′′），７２．６（Ｃ－２′′），８０．１（Ｃ－３′′），７１．８（Ｃ－４′′），８２．６（Ｃ－５′′），６２．９（Ｃ－６′′）である。
イソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の構造は図２に示され、具体的なＮＭＲ結果は、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１３．６５（１Ｈ，ｓ，５－ＯＨ），７．３５（１Ｈ，ｓ，Ｈ－６′），７．３５（１Ｈ，ｓ，Ｈ－２′），６．８４（１Ｈ，ｂｒｓＨ－５′），６．５４（１Ｈ，ｓ，Ｈ－３），６．４０（１Ｈ，ｓ，Ｈ－８），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ－１′′），４．５２（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２′′），３．４１（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３′′），３．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４′′），３．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５′′），３．１９（１Ｈ，ｍ，Ｈ－６′′），４．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ－１′′′），２．８５（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２′′′），３．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３′′′），３．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４′′′），３．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５′′′），３．６６（１Ｈ，ｍ，Ｈ－６′′′）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６３．３．２（Ｃ－２），１０２．３（Ｃ－３），１８１．６（Ｃ－４），１６０．５（Ｃ－５），１０８．２（Ｃ－６），１６１．５（Ｃ－７），９３．２（Ｃ－８），１５６．９（Ｃ－９），１０４．７（Ｃ－１０），１２１．１（Ｃ－１′），１１２．８（Ｃ－２′），１４６．０（Ｃ－３′），１５０．６（Ｃ－４′），１１６．１１（Ｃ－５′），１１８．９（Ｃ－６′），７１．６（Ｃ－１′′），８１．３（Ｃ－２′′），７８．６（Ｃ－３′′），７０．５（Ｃ－４′′），８１．６（Ｃ－５′′），６０．７（Ｃ－６′′），１０５．６（Ｃ－１′′′），７４．６（Ｃ－２′′′），７６．６（Ｃ－３′′′），６９．８（Ｃ－４′′′），７６．６（Ｃ－５′′′），６１．７（Ｃ－６′′′）である。
イソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の構造は図２に示され、具体的なＮＭＲ結果は、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１３．６５（１Ｈ，ｓ，５－ＯＨ），７．３５（１Ｈ，ｓ，Ｈ－６′），７．３５（１Ｈ，ｓ，Ｈ－２′），６．８４（１Ｈ，ｂｒｓＨ－５′），６．５４（１Ｈ，ｓ，Ｈ－３），６．４０（１Ｈ，ｓ，Ｈ－８），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ－１′′），４．５２（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２′′），３．４１（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３′′），３．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４′′），３．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５′′），３．１９（１Ｈ，ｍ，Ｈ－６′′），４．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ－１′′′），２．８５（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２′′′），３．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３′′′），３．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４′′′），３．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５′′′），３．６６（１Ｈ，ｍ，Ｈ－６′′′）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６３．３．２（Ｃ－２），１０２．３（Ｃ－３），１８１．６（Ｃ－４），１６０．５（Ｃ－５），１０８．２（Ｃ－６），１６１．５（Ｃ－７），９３．２（Ｃ－８），１５６．９（Ｃ－９），１０４．７（Ｃ－１０），１２１．１（Ｃ－１′），１１２．８（Ｃ－２′），１４６．０（Ｃ－３′），１５０．６（Ｃ－４′），１１６．１１（Ｃ－５′），１１８．９（Ｃ－６′），７１．６（Ｃ－１′′），８１．３（Ｃ－２′′），７８．６（Ｃ－３′′），７０．５（Ｃ－４′′），８１．６（Ｃ－５′′），６０．７（Ｃ－６′′），１０５．６（Ｃ－１′′′），７４．６（Ｃ－２′′′），７６．６（Ｃ－３′′′），６９．８（Ｃ－４′′′），７６．６（Ｃ－５′′′），６１．７（Ｃ－６′′′）である。
【0050】
実施例２、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００遺伝子の使用
（１）遺伝子クローニング
ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｖ．Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１、ＺＨ１１）の幼苗期の葉身のゲノムＤＮＡを鋳型としてＯｓ０２ｇ０５８９４００遺伝子をクローニングする。酵素切断連結法により目的遺伝子をｐＥＡＳＹ－Ｔ３ベクター（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ｐＥＡＳＹ（登録商標）－Ｔ３ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）に連結する。その後、連結生成物をＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、青白スポットで陽性クローンをスクリーニングし、得られた組換えプラスミドをｐＥＡＳＹ－Ｔ３－Ｏｓ０２ｇ０５８９４００と命名する。
組換えベクターｐＥＡＳＹ－Ｔ３－Ｏｓ０２ｇ０５８９４００の構造は、ｐＥＡＳＹ－Ｔ３ベクターにおける酵素切断部位ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間の小さな断片をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示すＤＮＡ断片に置き換えた組換えプラスミドとして説明されている。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２はＯｓ０２ｇ０５８９４００遺伝子のＣＤＳ配列で、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すタンパク質をコードする。
（１）遺伝子クローニング
ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｖ．Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１、ＺＨ１１）の幼苗期の葉身のゲノムＤＮＡを鋳型としてＯｓ０２ｇ０５８９４００遺伝子をクローニングする。酵素切断連結法により目的遺伝子をｐＥＡＳＹ－Ｔ３ベクター（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ｐＥＡＳＹ（登録商標）－Ｔ３ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）に連結する。その後、連結生成物をＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、青白スポットで陽性クローンをスクリーニングし、得られた組換えプラスミドをｐＥＡＳＹ－Ｔ３－Ｏｓ０２ｇ０５８９４００と命名する。
組換えベクターｐＥＡＳＹ－Ｔ３－Ｏｓ０２ｇ０５８９４００の構造は、ｐＥＡＳＹ－Ｔ３ベクターにおける酵素切断部位ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間の小さな断片をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示すＤＮＡ断片に置き換えた組換えプラスミドとして説明されている。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２はＯｓ０２ｇ０５８９４００遺伝子のＣＤＳ配列で、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すタンパク質をコードする。
【0051】
（２）Ｏｓ０２ｇ０５８９４００の原核発現
組換えベクターｐＥＡＳＹ－Ｔ３－Ｏｓ０２ｇ０５８９４００を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全に切断すると同時に、発現ベクターｐＭＡＬ－ｃ２Ｘ（華越洋、ＶＥＣＴ－５７０）を切断する。アガロース電気泳動後、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００を含む約１．３Ｋｂのサイズの断片と、約６．６ＫｂのｐＭＡＬ－ｃ２Ｘベクター断片を回収して連結し、得られた組換えプラスミドを配列決定により正しいことを確認した後、ｐＭＡＬ－Ｏｓ０２ｇ０５８９４００と命名する。ｐＭＡＬ－Ｏｓ０２ｇ０５８９４００の構造は、ｐＭＡＬ－ｃ２Ｘベクターにおける２つの酵素切断部位ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間の配列をＯｓ０２ｇ０５８９４００遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）に置き換えたベクターとして説明されている。
組換えベクターｐＥＡＳＹ－Ｔ３－Ｏｓ０２ｇ０５８９４００を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全に切断すると同時に、発現ベクターｐＭＡＬ－ｃ２Ｘ（華越洋、ＶＥＣＴ－５７０）を切断する。アガロース電気泳動後、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００を含む約１．３Ｋｂのサイズの断片と、約６．６ＫｂのｐＭＡＬ－ｃ２Ｘベクター断片を回収して連結し、得られた組換えプラスミドを配列決定により正しいことを確認した後、ｐＭＡＬ－Ｏｓ０２ｇ０５８９４００と命名する。ｐＭＡＬ－Ｏｓ０２ｇ０５８９４００の構造は、ｐＭＡＬ－ｃ２Ｘベクターにおける２つの酵素切断部位ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間の配列をＯｓ０２ｇ０５８９４００遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）に置き換えたベクターとして説明されている。
【0052】
得られた組換え原核発現ベクターｐＭＡＬ－Ｏｓ０２ｇ０５８９４００を大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ（華越洋、ＷＲ４４７８）コンピテントセルに形質転換する。同時にｐＭＡＬ－ｃ２Ｘ空ベクターを形質転換してコントロールとする。アンピシリン抗生物質を含むＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングし、ＰＣＲ増幅法により陽性クローンを同定し、プライマーはＦ１／Ｒ１であり、増幅断片のサイズは４１４ｂｐである。
【0053】
陽性クローンを２０ｍＬのアンピシリン耐性を含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで１２～１４時間振とう培養する。その後、１：１０００の割合（体積比）で菌液を４００ｍＬのＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）に移し、３７℃、２２０ｒｐｍでＯＤ６００＝０．６～０．８まで培養する。菌液を取り出し、氷に置いて冷やした後、濃度が５００ｍＭのＩＰＴＧを１６０μＬ加え、ＩＰＴＧの最終濃度を０．２ｍＭとする。タンパク質発現を誘導するために、１６℃、１００ｒｐｍで２４時間振とう培養する。４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細菌を回収する。その後、菌体をカラム緩衝液に再懸濁し、－２０℃で一晩凍結する。カラム緩衝液（１Ｌ）の処方は、ＮａＣｌ １１．７ｇ；ＤＴＴ １５４ｍｇ；０．５Ｍ ＥＤＴＡ２ｍＬ；１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）４０ｍＬ；残りは水である。翌日、サンプルが溶融した後、超音波破砕機で細胞を破砕して、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。直鎖デンプンカラムを用いて目的タンパク質を精製する。
【0054】
具体的な精製方法は以下の通りである。
ａ、カラム緩衝液（処方は上記を参照）を用いてアフィニティカラム充填剤を活性化する（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）。
ｂ、得られた粗タンパク質上清を活性化した直鎖デンプンカラムにゆっくりと添加し、目的タンパク質がアフィニティカラム充填剤に十分に結合するように、流速を約０．５ｍＬ／ｍｉｎに調整する。
ｃ、すべてのサンプルが充填剤を流れた後、カラム緩衝液を加え、数回洗浄して未結合の不純タンパク質を除去する。
ｄ、マルトースを含むカラム緩衝液（カラム緩衝液１Ｌにマルトース３．６ｇが含まれる）を１５ｍＬ加えて目的タンパク質を溶出し、この工程を１回繰り返す。
ｅ、溶出液を数回に分けて限外ろ過チューブに加え、４℃、５０００ｒｐｍで１５分間ずつ遠心分離する。
ｆ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを１ｍＬ加え、４℃、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、廃液を流し出す。目的タンパク質溶液を１．５ｍＬエッペンドルフ遠心分離チューブに移す。
ｇ、得られた目的タンパク質溶液を２μＬ吸い取り、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｑｕｉｃｋ ＳｔａｒｔＴＭ Ｂｒａｄｆｏｒｄ １×Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ，ＢｉｏＲＡＤ，ＣＡＳ６７－５６－１）を１ｍＬ加え、分光光度計を用いて被測定タンパク質の５９５ｎｍ（ＯＤ５９５）における吸収ピークを測定する。目的タンパク質の吸収値をタンパク質濃度に換算し、精製して得られたＯｓ０２ｇ０５８９４００組換えタンパク質の濃度は２．０３μｇ／μＬである。
ｈ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動後、クマシーブリリアントブルー染色により、組換えタンパク質Ｏｓ０２ｇ０５８９４００のサイズは約９０ＫＤであることが確認された（図３）。
プライマーＦ１：５’－ＧＧＣＧＡＣＡＣＡＧＣＴＣＴＣＡＴＧＴＣＣＴＣＧＴ－３’；
プライマーＲ１：５’－ＣＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＧＴＡＧＣＴＣ－３’。
ａ、カラム緩衝液（処方は上記を参照）を用いてアフィニティカラム充填剤を活性化する（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）。
ｂ、得られた粗タンパク質上清を活性化した直鎖デンプンカラムにゆっくりと添加し、目的タンパク質がアフィニティカラム充填剤に十分に結合するように、流速を約０．５ｍＬ／ｍｉｎに調整する。
ｃ、すべてのサンプルが充填剤を流れた後、カラム緩衝液を加え、数回洗浄して未結合の不純タンパク質を除去する。
ｄ、マルトースを含むカラム緩衝液（カラム緩衝液１Ｌにマルトース３．６ｇが含まれる）を１５ｍＬ加えて目的タンパク質を溶出し、この工程を１回繰り返す。
ｅ、溶出液を数回に分けて限外ろ過チューブに加え、４℃、５０００ｒｐｍで１５分間ずつ遠心分離する。
ｆ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを１ｍＬ加え、４℃、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、廃液を流し出す。目的タンパク質溶液を１．５ｍＬエッペンドルフ遠心分離チューブに移す。
ｇ、得られた目的タンパク質溶液を２μＬ吸い取り、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｑｕｉｃｋ ＳｔａｒｔＴＭ Ｂｒａｄｆｏｒｄ １×Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ，ＢｉｏＲＡＤ，ＣＡＳ６７－５６－１）を１ｍＬ加え、分光光度計を用いて被測定タンパク質の５９５ｎｍ（ＯＤ５９５）における吸収ピークを測定する。目的タンパク質の吸収値をタンパク質濃度に換算し、精製して得られたＯｓ０２ｇ０５８９４００組換えタンパク質の濃度は２．０３μｇ／μＬである。
ｈ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動後、クマシーブリリアントブルー染色により、組換えタンパク質Ｏｓ０２ｇ０５８９４００のサイズは約９０ＫＤであることが確認された（図３）。
プライマーＦ１：５’－ＧＧＣＧＡＣＡＣＡＧＣＴＣＴＣＡＴＧＴＣＣＴＣＧＴ－３’；
プライマーＲ１：５’－ＣＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＧＴＡＧＣＴＣ－３’。
【0055】
（３）Ｏｓ０２ｇ０５８９４００のインビトロ酵素活性化
酵素活性化反応系は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０，５０ｍＭ，１０ｍＭ ＤＴＴ含有）３８μＬ、１０ｍＭグリコシル受容体（Ｏｓ０２ｇ０５８９４００のグリコシル受容体はイソオリエンチンである）１μＬ、１００ｍＭグリコシル供与体（ＵＤＰＧ）１μＬ、（２）で得られたＯｓ０２ｇ０５８９４００組換えタンパク質１０μＬ（Ｏｓ０２ｇ０５８９４００のタンパク濃度は２．０３μｇ／μＬ）である。３０℃の水浴中で１時間反応させた後、等体積のメタノールで反応を中止させる。ｐＭＡＬ－ｃ２Ｘ空ベクターを形質転換した大腸菌に加え、上記工程（２）に従って得られたタンパク質のサンプルを陰性コントロールとする。４℃、１２,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を３０μＬ取り、ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ／ＭＳで測定し、測定方法は実施例１で示されるＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ／ＭＳ測定方法と同じである。
酵素活性化反応系は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０，５０ｍＭ，１０ｍＭ ＤＴＴ含有）３８μＬ、１０ｍＭグリコシル受容体（Ｏｓ０２ｇ０５８９４００のグリコシル受容体はイソオリエンチンである）１μＬ、１００ｍＭグリコシル供与体（ＵＤＰＧ）１μＬ、（２）で得られたＯｓ０２ｇ０５８９４００組換えタンパク質１０μＬ（Ｏｓ０２ｇ０５８９４００のタンパク濃度は２．０３μｇ／μＬ）である。３０℃の水浴中で１時間反応させた後、等体積のメタノールで反応を中止させる。ｐＭＡＬ－ｃ２Ｘ空ベクターを形質転換した大腸菌に加え、上記工程（２）に従って得られたタンパク質のサンプルを陰性コントロールとする。４℃、１２,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を３０μＬ取り、ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ／ＭＳで測定し、測定方法は実施例１で示されるＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ／ＭＳ測定方法と同じである。
【0056】
測定の結果は、空ベクターコントロールと比較して、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００組換えタンパク質を添加した反応系では、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００がイソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）からイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の生成を触媒することができることが分かった。これは、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００がイソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）からイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の生成を触媒するプロセスにおいて重要な役割を果たしていることを示した（図４を参照）。
【0057】
実施例３、化合物のレタス及びイヌビエへの施用
一、化合物のレタス及びイヌビエへの施用の実験の流れ
試験化合物：イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）及びイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）。
（１）試験化合物を遠心濃縮機で粉末状に乾燥して秤量し、適量の滅菌水を加えて最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬにする。
（２）０．８％寒天を５００ｍＬ調製し、オートクレーブに入れて滅菌する。
（３）滅菌した寒天をクリーンベンチで室温まで冷却（注：培地を固化させないように）した後、滅菌した１０ｍＬ遠心チューブに培地を４．７５ｍＬ正確に吸い取る。１０ｍｇ／ｍＬ試験化合物溶液２５０μＬを加え、化合物の最終濃度を５００ｍｇ／Ｌとする。試験化合物を含む培地を１０ｃｍ×１０ｃｍの角型シャーレに素早く注ぎ、角型シャーレを素早く振って培地を角型シャーレに均一に平らに広げる。等量の滅菌水を加えた培地をコントロールとする。
（４）イヌビエの種子を蒸留水で数回洗浄し、滅菌ろ紙に載せて乾燥させる。
（５）培地が固まった後、滅菌ピンセットでイヌビエの種子を入れ、各シャーレに２６粒ずつ入れる（１３粒ずつ２列に分けて入れる）。各処理には３つの生物学的レプリケートが含まれる。
（６）シャーレを２８℃のインキュベーターに入れて暗所で３日間培養する。
（７）表現型統計：３日後に各処理材の幼根と幼芽の長さを統計する。
一、化合物のレタス及びイヌビエへの施用の実験の流れ
試験化合物：イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）及びイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）。
（１）試験化合物を遠心濃縮機で粉末状に乾燥して秤量し、適量の滅菌水を加えて最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬにする。
（２）０．８％寒天を５００ｍＬ調製し、オートクレーブに入れて滅菌する。
（３）滅菌した寒天をクリーンベンチで室温まで冷却（注：培地を固化させないように）した後、滅菌した１０ｍＬ遠心チューブに培地を４．７５ｍＬ正確に吸い取る。１０ｍｇ／ｍＬ試験化合物溶液２５０μＬを加え、化合物の最終濃度を５００ｍｇ／Ｌとする。試験化合物を含む培地を１０ｃｍ×１０ｃｍの角型シャーレに素早く注ぎ、角型シャーレを素早く振って培地を角型シャーレに均一に平らに広げる。等量の滅菌水を加えた培地をコントロールとする。
（４）イヌビエの種子を蒸留水で数回洗浄し、滅菌ろ紙に載せて乾燥させる。
（５）培地が固まった後、滅菌ピンセットでイヌビエの種子を入れ、各シャーレに２６粒ずつ入れる（１３粒ずつ２列に分けて入れる）。各処理には３つの生物学的レプリケートが含まれる。
（６）シャーレを２８℃のインキュベーターに入れて暗所で３日間培養する。
（７）表現型統計：３日後に各処理材の幼根と幼芽の長さを統計する。
【0058】
二、化合物のイヌビエ及びレタスへの施用の表現型
図５に示すように、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）及びイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を５００ｍｇ／Ｌの濃度でそれぞれイヌビエに施用した場合に、コントロールと比較して、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）で処理したイヌビエの幼根の長さは有意に短かくなった（ｐ＝１．５３９×１０－３）が、イソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で処理したイヌビエの幼根の長さは、コントロールと比較して有意差はなかった（ｐ＝０．３２１）。また、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）及びイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で処理したイヌビエの幼芽の長さは、コントロールと比較していずれも有意差はなかった（ｐ＝０．２９７、ｐ＝０．９０２）。これは、化合物イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）の施用が主にイヌビエの幼根の成長に影響を及ぼし、生成物のイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）よりも、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）はイヌビエの幼根の成長に対して顕著な抑制作用を有することを示した。
図５に示すように、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）及びイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を５００ｍｇ／Ｌの濃度でそれぞれイヌビエに施用した場合に、コントロールと比較して、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）で処理したイヌビエの幼根の長さは有意に短かくなった（ｐ＝１．５３９×１０－３）が、イソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で処理したイヌビエの幼根の長さは、コントロールと比較して有意差はなかった（ｐ＝０．３２１）。また、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）及びイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で処理したイヌビエの幼芽の長さは、コントロールと比較していずれも有意差はなかった（ｐ＝０．２９７、ｐ＝０．９０２）。これは、化合物イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）の施用が主にイヌビエの幼根の成長に影響を及ぼし、生成物のイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）よりも、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）はイヌビエの幼根の成長に対して顕著な抑制作用を有することを示した。
【0059】
以上、本発明を詳細に説明した。当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、及び不要な実験を行うことなく、同等のパラメータ、濃度及び条件下で、より広い範囲で本発明を実施することができる。本発明は特定の実施形態を示したが、本発明にさらなる改良を加えることができることを理解されたい。要するに、本発明の原理に基づいて、本願は、本願で開示される範囲から逸脱し、当分野で知られている従来の技術を使用して行われる変更を含む、あらゆる変更、使用、又は本発明に対する改良を含むことを意図している。いくつかの基本的な特徴は、以下の添付された特許請求の範囲内で適用され得る。
【産業上の利用可能性】
【0060】
本発明により提供される他感作用に関連するフラボノイド配糖体類物質はイソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）である。化合物の施用実験では、イソオリエンチンはイヌビエの幼根の成長に対して顕著な抑制作用を有することを示した。本発明により提供されるイソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）化合物の形成に関与する遺伝子は、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００である。インビトロ酵素活性化実験では、Ｏｓ０２ｇ０５８９４００がイソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）からグリコシル化生成物であるイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の生成を触媒することができることを示した。化合物の施用濃度が５００ｍｇ／Ｌである場合、生成物のイソオリエンチン－２’’－Ｏ－グルコピラノシド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ－２’’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）よりも、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）はイヌビエの幼根の成長に対して顕著な抑制作用を有する。このことから、イソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）は植物の他感作用を制御することができ、雑草の成長抑制に使用できることが分かった。本発明は、環境に優しいグリーン農薬の開発に重要な意義を持つとともに、水田における雑草の防除に理論的指針を与えるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】