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▶ ユナイテッド セラピューティクス コーポレイションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-16
(54)【発明の名称】細胞を肺組織から得る方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240808BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20240808BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/077
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024510617
(86)(22)【出願日】2022-08-25
(85)【翻訳文提出日】2024-04-17
(86)【国際出願番号】 US2022041460
(87)【国際公開番号】W WO2023028193
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】63/237,003
(32)【優先日】2021-08-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511266520
【氏名又は名称】ユナイテッド セラピューティクス コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100227008
【弁理士】
【氏名又は名称】大賀 沙央里
(72)【発明者】
【氏名】ルーシュ，ベンジャミン
(72)【発明者】
【氏名】ケイシー，アシュレー
(72)【発明者】
【氏名】ミショー，ジェニファー
(72)【発明者】
【氏名】ラウドサリ，ライラ
(72)【発明者】
【氏名】ドッカム，アシュレー アール．
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA91X
4B065AC12
4B065AC20
4B065BD14
4B065CA44
(57)【要約】
細胞を肺と分離する方法が開示される。機械的圧力は、肺胞ＩＩ型細胞を含む、分離された細胞の収量を高めるプロセスの１つの段階において使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞を肺組織から単離する方法であって、機械的圧力を前記肺組織に適用することを含む、方法。
【請求項2】
機械的圧力の前記適用が、５ｍｍまたはそれよりも大きいサイズの組織片を１０重量％以下有する破砕組織を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
機械的圧力の前記適用が、５ｍｍまたはそれよりも大きいサイズの組織片を５重量％以下有する破砕組織を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
機械的圧力の前記適用が、５ｍｍまたはそれよりも大きいサイズの組織片を１重量％有する破砕組織を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記肺組織が破砕されている、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記破砕が、ヒト操作者の手において破砕することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
２つよりも多い肺葉が、一緒に加工処理される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
酵素消化をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
酵素消化において使用される酵素が、エラスターゼを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
酵素消化において使用される酵素が、ＩＶ型コラゲナーゼをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記破砕された肺組織を濾過することをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記破砕された肺組織を精製することをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記精製ステップが、白血球および少なくとも１つの他の細胞型を除去することを含み、前記１つの他の細胞型が白血球ではない、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞が肺胞ＩＩ型細胞である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞が気道上皮基底細胞である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記細胞が間質細胞である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞が内皮細胞である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法によって単離された細胞。
【請求項19】
前記方法の最終的な精製収量が、少なくとも１０億個の細胞である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
白血球および少なくとも１つの他の細胞型を除去することを含む、目的の細胞集団を肺組織単離物から精製する方法であって、前記１つの他の細胞型が白血球ではない、方法。
【請求項21】
磁気粒子に結合された抗体が、前記白血球および前記少なくとも１つの他の細胞型を選択して除去するのに使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
白血球、間質細胞、および気道上皮基底細胞を選択することを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
白血球、間質細胞、気道上皮基底細胞、および内皮細胞を選択することを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
ＣＤ４５、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ１４０ｂ、およびＣＤ２７１細胞表面タンパク質から選択される細胞表面タンパク質に対する少なくとも１つの抗体が、非ＡＴ２細胞を選択して除去するのに使用される、請求項１５、１６または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
ＣＤ４５、ＣＤ９０、およびＣＤ２７１細胞表面タンパク質に対する抗体が、白血球、間質細胞、および気道基底細胞を除去するのに使用される、請求項１５、１６、１９または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ３１、およびＣＤ２７１細胞表面タンパク質に対する抗体が、白血球、間質細胞、内皮細胞、および気道基底細胞を除去するのに使用される、請求項１５、１６、１９または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
ＣＤ３１が、内皮細胞を選択するのに使用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項26】
培養選択による精製をさらに含む、請求項１５から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記培養選択が、白血球を除去する、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
細胞を単離する方法であって、機械的圧力を肺組織に適用することと、
白血球および少なくとも１つの他の細胞型を、破砕された肺組織から除去することと
を含み、前記１つの他の細胞型が白血球ではない、方法。
【請求項29】
機械的圧力の前記適用が、５ｍｍまたはそれよりも大きいサイズの組織片を１０重量％以下有する破砕組織を生じる、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
機械的圧力の前記適用が、サイズが５ｍｍまたはそれよりも大きいサイズの組織片を５重量％以下有する破砕組織を生じる、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
機械的圧力の前記適用が、サイズが５ｍｍまたはそれよりも大きいサイズの組織片を１重量％以下有する破砕組織を生じる、請求項２８に記載の方法。
【請求項32】
操作された肺構造を形成する方法であって、肺スキャフォールドに、請求項１に記載の方法から得られた細胞を播種することを含む、方法。
【請求項33】
請求項１に記載の方法からの細胞が、１つまたは複数のＣＤマーカーを使用するステップ後に他の細胞から分離されて、白血球および少なくとも１つの他の細胞型を、細胞懸濁液から除去する、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
ＣＤ４５、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ１４４、ＣＤ３１、ＣＤ９０、ＣＤ１４０ｂ、およびＣＤ２７１由来のＣＤマーカーに対する少なくとも１つの抗体が使用される、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
白血球、線維芽細胞、および気道基底細胞が除去される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項36】
前記播種された細胞が肺胞ＩＩ型細胞である、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記播種された細胞が気道基底細胞である、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記播種された細胞が肺間質細胞である、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記播種された細胞が肺内皮細胞である、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願に対する相互参照
本出願は、その全体が参照により組み込まれる、２０２１年８月２５日に出願された米国仮出願第６３／２３７，００３号に対する優先権を主張する。
本出願は、その全体が参照により組み込まれる、２０２１年８月２５日に出願された米国仮出願第６３／２３７，００３号に対する優先権を主張する。
【0002】
本出願は概して、組織からの細胞単離に、限定されないがより具体的には、肺細胞を肺組織から単離する方法および組成物に、ならびにそのような方法から産生された細胞に関する。これらの細胞は、研究、細胞療法、組織操作、および他の適用に使用され得る。
【背景技術】
【0003】
種々の細胞集団を死体組織から単離する方法は通常、各細胞集団に特有であり、多くの場合、種々の消化酵素、インキュベーション時間、および解離アプローチを要する。各細胞型に対する種々の単離要件に起因して、複数の細胞型が同じ臓器から必要とされる場合、組織は多くの場合、別々の片に分けられ、したがって、各細胞型について全体的な見込まれる収量を低減させる。さらに、これらのアプローチは通常、集約的であり、時間がかかり、それにより、適切な細胞の健康を維持しながら加工処理することができる組織の量がさらに制限されている。その結果、１名のドナーの組織から多数の異なる型の初代ヒト細胞を生成することが課題である。この課題は、細胞数の要件が高く、初代細胞が限られた増殖能を有する、自家および同種異系適用の両方に関する組織操作の分野に特に関連している。これらの単離の制限は、個別化医療ならびに医薬品の開発およびスクリーニングにも影響を与える可能性があり、それによりｉｎ ｖｉｔｒｏモデルでは、患者の転帰を正確に代理（represent）するのに十分な細胞の複雑さを達成するために、ドナー組織の小片からの多細胞プラットフォームの生成を要する可能性がある。
【0004】
細胞単離の課題の具体例の１つは、肺組織の加工処理に端を発する。肺胞２型（ＡＴ２）細胞は、単離することが難しいことで有名である。ＡＴ２細胞は多くの場合、右肺中葉から単離される。既存の方法を使用してＡＴ２細胞を単離することは、複数の研究者が丸一日を要し、数億個の細胞しか生じない。この長期にわたる実践的なプロセスは、肺において重要な機能を果たす他の細胞型の単離を制限することが多い。したがって、ドナー肺組織から目的の全ての重要な細胞を生じる単離方法に対する必要性は満たされていない。さらに、目的の全ての細胞型を単離する単一の消化方法の使用は、各細胞型の細胞収量を高める。
【発明の概要】
【0005】
種々の細胞型を、単一の解離方法を使用してドナー臓器から単離する方法が本明細書において記載される。一部の例では、肺胞ＩＩ型細胞（ＡＴ２）、気道上皮基底細胞（ＡＥＰ）、間質細胞、および内皮細胞のうちの１つまたは複数などの肺細胞をヒトドナー肺組織から単離する方法が開示される。一部の実施形態では、開示される方法は、他の既存の方法よりも大量の細胞の単離を可能にする。組織解離の方法および細胞精製の方法が本明細書において開示され、これにより、より多数の細胞を一度に単離することが可能となり得る。
【0006】
充分な数のＡＴ２細胞などの肺細胞型の特定の型を、ヒトドナー肺組織から得ることは、長年にわたる課題であった。これらの細胞を使用して、診断検査、創薬と開発、細胞治療、または操作された臓器の構築を支持し得る。ＡＴ２細胞は、最初はＬｅｌａｎｄ Ｄｏｂｂｓ氏によって開発されたノースカロライナ州立大学のＳａｎｎｅｓ研究所において最適化された方法（「Ｓａｎｎｅｓ法」、Zhang, H., Newman, D. and Sannes, P. "HSULF-1 inhibits ERK and AKT signaling and decreases cell viability in vitro in human lung epithelial cells." Respiratory Research. 2012; 13(1): 69を参照、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して単離することができる。Ｓａｎｎｅｓ法を使用したＡＴ２単離は通常、ヒトドナー肺組織の１～２個の葉から数億個のＡＴ２細胞を生じる。対比して、本明細書において開示される方法は、５つの肺葉全ての加工処理を可能にする場合があり、これにより、スタッフまたは加工処理時間を増加させずに、１０億個ものＡＴ２細胞を産生し得る。
【0007】
別の主要な課題は、Ｓａｎｎｅｓまたは他の公開されている方法を使用して下流の増殖に充分な純度で、多数の、ＡＴ２細胞などの肺細胞の特定型を単離することである。例えば、Ｓａｎｎｅｓ法の精製アプローチは、パニングを使用して白血球を除去し（細胞のプレートへの差次的な接着）、続いて線維芽細胞についてのネガティブ選択を行う。パニングアプローチは、容易にスケーリングせず、したがって、本明細書において開示される方法によって生成される細胞数の増加に伴い困難となり得る。別の既存の精製方法は、ＡＴ２細胞表面マーカーであるＨＴ２－２８０に基づく磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）ベースのポジティブ選択アプローチの使用である。しかしながら、この方法も、多くの脆弱なＡＴ２細胞が残存しないため理想的ではない（ＭＡＣＳベースのＨＴ２－２８０選択による精製効率平均１９％）。
【0008】
図１は、ＡＴ２細胞、気道上皮基底細胞、および間質細胞をドナー肺臓器から単離することに関する実施形態における特定細胞型を単離する方法の概要を示す。これは単なる実施形態であり、類似した方法が他の細胞型を他の型の臓器から単離するのに用いることが可能であるはずであることに留意すべきである。本開示の実施形態は、細胞を生体組織から単離することに関する。これらの細胞は、機械的圧力を組織に適用することによって単離され得る。一部の実施形態では、生体組織は肺組織であり得る。一部の実施形態では、機械的圧力は、肺組織の酵素消化後に適用され得る。生体組織は破砕されてもよく、例えば、生体組織は、遠位組織が液化されるまで、ヒト操作者の手で破砕されてもよい。この方法により、２つまたはそれよりも多い肺葉を一緒に加工処理することが可能である。これにより、一緒に加工処理され得る材料の量が増加し得る。単離方法は、濾過ステップをさらに含んでもよい。消化および濾過後の未精製の総収量は、３００億個を超える細胞であり得る（本明細書において、濾過後の試料として記載される）。単離方法は、精製ステップを含んでもよい。本方法の最終的な精製収量は、１０億個またはそれよりも多いＡＴ２細胞であり得る。気道上皮基底細胞、間質細胞、および内皮細胞の場合、本方法は、培養選択による精製を含んでもよい。培養選択により、白血球が除去され得る。
【0009】
細胞を肺組織から精製する方法が本明細書において開示される。本方法は、白血球を除去することを含んでもよい。本方法は、１つまたは複数の他の細胞型を除去することを含んでもよい。一部の実施形態では、磁性粒子に結合された抗体は、磁気活性化細胞選別技法を使用して白血球を選択および除去するのに使用される。磁性粒子に結合された抗体は、１つまたは複数の他の細胞型を選択および除去するのに使用され得る。残りの細胞は、肺胞ＩＩ型細胞（ＡＴ２）であってもよい。選択される細胞は、とりわけ気道上皮基底細胞（ＡＥＰ）、間質細胞、内皮細胞のうちの１つまたは複数であり得る。本方法は、目的の細胞集団を肺組織単離物から精製することを含み得る。本方法は、白血球、間質細胞、および気道上皮基底細胞を除去することを含み得る。本方法は、内皮細胞を選択することを含み得る。本方法は、白血球およびＡＴ２細胞を除去することを含み得る。
【0010】
一部の実施形態では、細胞表面タンパク質は、細胞を分離するのに使用され得る。本方法は、ＣＤ４５、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ９０、ＣＤ１４４、ＣＤ３１、ＣＤ１４０ｂ、およびＣＤ２７１から選択される少なくとも１つのマーカーに対する抗体を使用して、感受性の低い細胞を選択することを含み得る。本方法は、ＣＤ４５、ＣＤ９０、およびＣＤ２７１マーカーから選択される少なくとも１つのマーカーを使用して、感受性の低い細胞を除去することを含み得る。ＣＤ４５、ＣＤ９０、およびＣＤ２７１ビーズは、白血球、間質細胞、および気道上皮基底細胞を除去するために使用され得る。一部の実施形態では、磁性粒子に結合された抗体は、白血球、間質細胞、および気道上皮基底細胞を選択ならびに除去するのに使用される。一部の実施形態では、２ステップ選択が実施されてもよく、それによりＣＤ４５選択に続いて、ＣＤ９０およびＣＤ２７１選択の組み合わせが行われる。
【0011】
操作された臓器を形成する方法が本明細書において開示される。臓器は、合成または天然の肺マトリックスから作製され得る。本方法は、スキャフォールドマトリックスに、本明細書において開示される方法から得られた細胞を播種することを含み得る。１つの実施形態では、操作された肺構造は、肺スキャフォールドに、本明細書において開示される方法から得られた細胞を播種することによって形成され得る。
【0012】
スキャフォールドに、本明細書において開示される方法から得られた細胞を播種することによって形成された操作された臓器が、本明細書において開示される。肺スキャフォールドに、本明細書において開示される方法から得られた細胞を播種することによって形成された操作された肺構造が、本明細書において開示される。細胞は、１つまたは複数の分化クラスター（ＣＤ）マーカーに対する抗体を使用して、白血球および少なくとも１つの他の細胞型を選択することによって精製され得る。ＣＤマーカーは、ＣＤ４５、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ３１、ＣＤ９０、ＣＤ１４４、ＣＤ１４０ｂ、およびＣＤ２７１のうちの１つまたは複数であり得る。一部の実施形態では、白血球、線維芽細胞などの間質細胞、内皮細胞、および気道基底細胞が選択され得る。一部の実施形態では、播種される細胞は、肺胞ＩＩ型細胞、気道上皮基底細胞、肺間質細胞、および肺内皮細胞のうちの１つまたは複数であり得る。
【0013】
本明細書において使用される場合、「肺クラッシュ方法（Lung Crush Method）」または「ＬＣＭ」は、細胞が単離されるべき組織を破砕するための機械的な力の適用を含む方法を指す。力の適用は、組織の酵素消化中または後に行われ得る。本方法はさらなるステップを含んでもよく、破砕力は、任意の適切な手段、例えば、機械的粉砕または技術者の手によって適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】組織を破砕して解離することと、肺胞２型細胞を精製するためのネガティブ選択とを含む本明細書において記載される方法（下パネル、黄色で強調表示している）と比較して、組織を解離するためのハサミの使用および肺胞２型細胞を精製するためのポジティブ選択で構成される、既存のＳａｎｎｅｓラボ法（上パネル）を使用した生体臓器からの細胞単離プロセスの概略図を示す図である。
【図2】２つの組織解離方法のドナー適合性比較による、Ｓａｎｎｅｓ対ＬＣＭに関する組織１グラムあたりの濾過後（ＰＦ）の収量を示す図である（ｎ＝３）。
【図3】２つの解離方法のドナー適合性比較による、Ｓａｎｎｅｓ対ＬＣＭに関する濾過後（ＰＦ）のＡＴ２純度（ＨＴ２－２８０＋％）を示す図である（ｎ＝３）。
【図4】２つの解離方法のドナー適合性比較による、Ｓａｎｎｅｓ対ＬＣＭに関する理論上のＡＴ２／ｇ（組織）を示す図である（ｎ＝３）。理論上のＡＴ２／ｇは、総細胞数／ｇにＨＴ２－２８０％を乗算したものとして算出される。
【図5】２つの解離方法のドナー適合性比較による、Ｓａｎｎｅｓ対ＬＣＭに関するＣＤ４５／ＣＤ９０／ＣＤ２７１枯渇ＡＴ２試料の選択後のＡＴ２純度（ＨＴ２－２８０％）を示す図である（ｎ＝３）。
【図6】２つの解離方法のドナー適合性比較による、Ｓａｎｎｅｓ対ＬＣＭの組織１グラムあたりの選択後のＡＴ２を示す図である（ｎ＝３）。
【図7】２つの解離方法のドナー適合性比較による各単離方法に関する平均ＡＴ２収量を示す図である（ｎ＝３）。
【図8】精製後の実際のＡＴ２収量を、精製前の理論上のＡＴ２収量で除算したものに基づいて算出されたＳａｎｎｅｓとＬＣＭとの選択効率の比較を示す図である。
【図9】ＬＣＭプロセスが単一ドナー由来の肺組織の全てを利用するようにスケーリングされた場合のＡＴ２細胞単離の改善の要約を示す図である。
【図10】プロセスの概略図を示す図であり、肺組織の全てを消化および解離する１つの方法、ならびに気道上皮基底細胞、間質細胞、ＡＴ２細胞、および内皮細胞を肺組織から分離するのに使用することができる精製方法を強調表示している。
【図11】一実施形態により１名のドナーから単離された４つの細胞型全てを示す図である。
【図12】肺クラッシュ法の画像を示す図である。
【図13】肺クラッシュ法を使用して４つの異なる細胞型（気道上皮基底細胞、間質細胞、ＡＴ２細胞、および内皮細胞）を１名のドナーから単離した場合の肺からの細胞収量および純度の要約を示す図である。
【図14】肺クラッシュ法から得られた気道上皮基底細胞の一例を示す図である。
【図15】肺クラッシュ法から得られた間質細胞の一例を示す図である。
【図16】肺クラッシュ法から得られた内皮細胞の一例を示す図である。
【図18】本明細書において記載される肺クラッシュ法およびネガティブ選択戦略によるＡＴ２単離および特徴付けの要約を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
ヒトまたは動物の臓器から単離された細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断薬および医薬品の検査、細胞療法の開発、および再生医療用のスキャフォールドの細胞化（cellularization）を支持するのに使用され得る。これらの細胞化されたスキャフォールドは、臨床製品として患者への移植に使用され得る。しかしながら、充分な数の特定の肺細胞型を得ることは、当該分野において長年にわたる課題となっている。そのような例の１つは、操作された肺組織の形成において使用するための、ヒトドナー肺組織からのＡＴ２細胞の単離である。単離されたＡＴ２細胞は、バンクに保存され（bank）、増殖され、ブタまたは３Ｄプリンターで製造され（3D-print）た肺スキャフォールドを細胞化するのに使用され得る。これらのブタまたは３Ｄプリンターで製造された肺スキャフォールドは、患者に移植され得る。単離されたＡＴ２細胞はまた、ＡＴ２細胞の独自性および機能、成長特性、病態、および種々のプラットフォームにおける医薬品候補スクリーニングの研究を支持するのに使用され得る。
【0016】
ＡＴ２細胞の単離は、ノースカロライナ州立大学のＰｈｉｌｉｐ Ｓａｎｎｅｓの研究室において開発された方法（本明細書において、Ｓａｎｎｅｓ法と記載される）を使用して実施されている。Ｓａｎｎｅｓ法を使用したＡＴ２単離は通常、ヒトドナー肺組織の１～２個の葉から数億個のＡＴ２細胞を生じる。したがって、Ｓａｎｎｅｓ法は、１０億個またはそれよりも多い細胞を確保するためには、異なるドナーに対して複数回繰り返されなければならず、時間および材料において高いコストがかかる。さらに、ヒト細胞、組織、ならびに細胞および組織ベースの産物に対する異なるドナーからの細胞のプールは、ＦＤＡによって制限されている。
【0017】
対照的に、本明細書において開示される方法は、５つの肺葉全ての加工処理を可能にする場合があり、スタッフまたは加工処理時間を増加させずに、１０億個ものＡＴ２細胞を産生し得る。さらに、本明細書において開示される方法は、バイオリアクターにおけるラージスケールの増殖を可能にし得るより大量の細胞の加工処理を可能にし得る。本明細書において開示される方法は、増加数の細胞の産生を可能にし、これにより、細胞をさらなるドナーから単離する必要性が減少し得る。本明細書において開示される方法はまた、複数の肺細胞型のドナー適合性バンクの構築を可能にし、また単一のドナーに由来する細胞を用いたスキャフォールドのリポピュレイションを可能にし得る。このことは、同種異系組織製品にとって重視すべき事項であり、それにより近いＨＬＡ適合を有する単一ドナー由来の細胞を使用することは、臓器拒絶を防ぐのに重要であり得る。
【0018】
さらに、Ｓａｎｎｅｓ法または他の公開されている方法を使用して下流の増殖に充分な純度で、多数のＡＴ２細胞または他の特定肺細胞型を単離することは困難となっていた。この課題を解決する精製戦略が、本明細書において開示される。この精製方法は、ネガティブ選択を使用して、下流の培養物において異常成長する可能性のある非ＡＴ２細胞を除去し、感受性の高いＡＴ２細胞を、下流での使用のために未標識の状態でネガティブ集団に残す。ポジティブ選択された非ＡＴ２細胞を培養物に播種して、目的の他の細胞型のバンクを生成することができる。図１は、下流の培養および増殖に充分な純度でドナー肺臓器から単離されたＡＴ２細胞の数を最大化することに関する実施形態において、特定細胞型を単離する方法の概要を示す。これは単なる実施形態であり、類似した方法が他の細胞型を他の型の臓器から単離するのに用いることが可能であるはずであることに留意すべきである。
【0019】
図１は、生体臓器からの細胞選択の方法の１つの実施形態の概略図を示す。この実施形態では、生体臓器は肺であり、所望の精製細胞はＡＴ２細胞である。肺はドナーから確保される。肺は、例えば気道を緩衝溶液で洗浄することによって浄化される。続いて、肺はエラスターゼまたはコラゲナーゼなどの酵素で消化される。この時点で、細胞組織は、Ｓａｎｎｅｓ法、または肺クラッシュ法のいずれかによって解離することができる。
【0020】
Ｓａｎｎｅｓ法（ＳＭ）は、大きくて白い気道および未消化組織の大きな塊を除去することを含み得る。消化された組織の小片をカップに移し、一緒にテープで留めた３対の手術用ハサミ（トリプルシザーと称される）を使用して刻み、収集し得る。このプロセスは、消化組織全てが刻まれるまで数回繰り返されてもよい。
【0021】
肺クラッシュ法（ＬＣＭ）は、手などの物体または機械的に自動化された破砕デバイス、例えばローラーを直列もしくは並列に使用するものを使用して、組織を破砕する力を適用して、消化された組織全体を全て一度に破砕することを包含し得る。破砕は、胸膜を引き裂くように開き、消化された組織および細胞を注ぎ出させて、容器に収集することを包含し得る。破砕は、消化された組織を圧搾することを含み得る。破砕は、組織を引き離すことを包含し得る。破砕は、組織を絞り出して、さらなる細胞懸濁液を収集することを含み得る。肺組織は、気道および胸膜のみが残るまで破砕されてもよい。気道組織が除去され、破砕組織が収集されてもよい。破砕後の細胞懸濁液には、組織の未消化の片はほとんど残っていない。対照的に、Ｓａｎｎｅｓ法を使用して組織を切断した後、およそ１から５ｍｍの範囲の組織片は、細胞懸濁液全体にわたって可視的である。例えば、ＬＣＭを使用して加工処理された組織は、２０重量％、１０重量％、５重量％、２重量％、または１重量％以下の、直径が１ｍｍ、２ｍｍ、もしくは５ｍｍまたはそれよりも長い組織片を有し得る。一部の実施形態では、ＬＣＭを使用して加工処理された組織は、５重量％以下の、直径が５ｍｍまたはそれよりも長い組織片を含有する。一部の実施形態では、ＬＣＭを使用して加工処理された組織は、５重量％以下の、直径が２ｍｍまたはそれよりも長い組織片を含有する。一部の実施形態では、ＬＣＭを使用して加工処理された組織は、５重量％以下の、直径が１ｍｍまたはそれよりも長い組織片を含有する。特定のサイズの組織片の相対量を決定することは、適切なサイズのふるい、メッシュなどを使用して遂行することができる。
【0022】
解離された後、収集された液体は濾過されてもよい。液体は、外科用ガーゼまたはメッシュ、絹、またはナイロンフィルターに通して濾過されてもよい。液体は、複数回、および複数のフィルターに通して濾過されてもよい。また、液体を１回またはそれよりも多い回数で遠心分離し、細胞ペレットを再懸濁させてもよい。
【0023】
ＬＣＭをスケールアップする前に、３回の直接競合的な（head-to-head）単離をドナー適合性組織で実施して、ＬＣＭをＳａｎｎｅｓ法と比較した。この比較研究における各ドナーについて、組織は左肺および右肺に分けられた。各ドナー由来の肺の１つは、Ｓａｎｎｅｓ法を使用して加工処理され、もう１つは、ＬＣＭを使用して処理された。各プロセスに割り当てられた肺は、各ドナー、ならびに分離を実施する操作者で変化させた。この比較研究からのデータは、図２～図４に含まれている。
【0024】
図２は、Ｓａｎｎｅｓ対ＬＣＭに関する組織１グラムあたりの濾過後の（ＰＦ）総細胞収量を示す（ｎ＝３）。これらのデータにより、組織１グラムあたりの収量が、Ｓａｎｎｅｓ法および肺クラッシュ法に関して類似していることが実証される。組織１グラムあたりの精製された細胞量において、統計学的有意差は見られない（ウェルチのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【0025】
図３は、解離後のＳａｎｎｅｓ対ＬＣＭに関する濾過後の（ＰＦ）ＡＴ２細胞純度を示す（ｎ＝３）。２つの解離法間で、濾過後の細胞の純度において有意差は見られなかった（ウェルチのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【0026】
図４は、濾過後の収量に濾過後の純度を乗算したものとして算出された、Ｓａｎｎｅｓ対ＬＣＭに関する組織１グラムあたりのＡＴ２細胞の理論上の数を示す（ｎ＝３）。２つの異なる解離方法を使用して組織から単離したＡＴ２細胞の理論上の収量において、統計学的有意差は明白ではなかった（ウェルチのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【0027】
濾過後、所望の細胞は精製されてもよい。選択プロセスは、ネガティブまたはポジティブ選択プロセスであり得る。Ｓａｎｎｅｓ精製法では、望ましくない細胞は、抗体の使用を伴って、または伴わずに、非組織培養ペトリ皿への差次的接着によって除去され得る。一部の実施形態では、差次的接着および磁気除去の組合せが使用されてもよい。ＳａｎｎｅｓのＡＴ２精製プロセスは、白血球および線維芽細胞などの間質細胞を除去するためのプレーティングおよびパニングを包含し得る。精製プロセスは、間質細胞に選択的に結合するように、ＡＳ０２抗体などの抗体を使用することを包含し得る。抗体は金属粒子に結合されてもよく、間質細胞を磁気的に除去することが可能となる。別の一般的に使用される方法は、ＡＴ２細胞表面マーカーであるＨＴ２－２８０に対する抗体（Ｔｅｒｒａｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、マウスＩｇＭモノクローナル抗体）を使用して、細胞をポジティブ選択し、続いて抗マウスＩｇＭ磁気ビーズで染色することである。ＨＴ２－２８０を介したポジティブ選択は、低レベルの、培養物を異常成長させる可能性のある混入細胞型を有する高純度試料を生じる一方で、精製効率はこの選択方法を用いた場合に低く、したがって低い全体的なＡＴ２収量をもたらす。
【0028】
本明細書において記載される精製方法において、他の非ＡＴ２細胞も、除去され得る。例えば、ＣＤ４５、ＣＤ９０、およびＣＤ２７１抗体が、添加されて、白血球、間質細胞、および気道基底細胞に結合し得る。これらの抗体は、金属粒子に結合されてもよい。金属粒子、抗体、ならびに結合された血液細胞、間質細胞、および気道基底細胞は、磁気的に除去され得る。
【0029】
磁性粒子に結合された抗体はまた、１つまたは複数の細胞型を選択および除去して、最も感受性の高い所望の細胞を残すのに使用され得る。ネガティブ集団中の残された所望の細胞は、後の使用のためにバンクに保存されてもよい。単離された細胞は肺胞ＩＩ型細胞（ＡＴ２）であってもよい。単離された細胞は、とりわけ気道上皮基底細胞、間質細胞、内皮細胞のうちの１つまたは複数であり得る。
【0030】
所望の細胞の独自性に応じて、本方法は、白血球、間質細胞、および／または気道上皮基底細胞を除去することを含み得る。本方法は、白血球および／または肺胞ＩＩ型細胞を除去することを含み得る。細胞表面タンパク質に対する抗体に結合された磁気ビーズを使用して、ＡＴ２細胞ではない細胞を選択的に分離し得る。選択された細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ１４０ｂおよびＣＤ２７１から選択される細胞表面タンパク質に対する少なくとも１つの抗体を使用して除去され得る。選択された細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ９０、およびＣＤ２７１マーカーから選択される細胞表面タンパク質に対する少なくとも１つの抗体を使用して除去され得る。ＣＤ４５、ＣＤ９０、およびＣＤ２７１抗体は、ＡＴ２集団由来の白血球、間質細胞、および気道基底細胞に使用され得る。代替マーカーを使用して、所望の細胞以外の全ての細胞を、試料から除去し得る。
【0031】
ＣＤ４５、ＣＤ９０、およびＣＤ２７１に対する抗体に結合された磁気ビーズを使用したネガティブ選択アプローチが実施されて、図２～図４に提示したＬＣＭおよびＳａｎｎｅｓ解離法の直接競合的な単離検査によりＡＴ２細胞を精製した。これらの比較からの精製後のデータは、図５～図８に含まれている。
【0032】
図５は、Ｓａｎｎｅｓ対ＬＣＭの比較によるＣＤ４５／ＣＤ９０／ＣＤ２７１枯渇試料の精製後のＡＴ２純度（ＨＴ２－２８０に関する陽性細胞の％）を示す。２つの試料の間に統計学的有意差は認められなかった（ｎ＝３名のドナー、ウェルチのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【0033】
図６は、Ｓａｎｎｅｓ対ＬＣＭの比較による組織１グラムあたりの精製後のＡＴ２細胞数を示す。２つの試料間に統計学的有意差は認められなかった（ｎ＝３名のドナー、ウェルチのｔ検定、ｐ＜０．０５）
【0034】
図７は、類似した量の組織（ドナー１：Ｓａｎｎｅｓ４００ｇ、ＬＣＭ ３８０ｇ；ドナー２：Ｓａｎｎｅｓ２４４ｇ、ＬＣＭ２２０ｇ；ドナー３：Ｓａｎｎｅｓ３０６ｇ、ＬＣＭ３０１ｇ）で実施されたＳａｎｎｅｓおよびＬＣＭ単離法それぞれについて、精製後の平均総ＡＴ２細胞収量を示す。同量の組織が加工処理され、同じ精製戦略が実施されたと仮定して予想されるように、２つの試料間に統計学的に有意な差は見られなかった（ｎ＝３名のドナー、ウェルチのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【0035】
図８は、精製後のＡＴ２収量を精製前の理論上のＡＴ２収量で除算したものに基づいて算出された、ＳａｎｎｅｓとＬＣＭとの選択効率の比較を示す。肺クラッシュ法は、Ｓａｎｎｅｓ法と比較した場合、選択効率において統計学的に有意な改善をもたらした（ｎ＝３名のドナー、ウェルチのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【0036】
直接競合的な比較後に、ＬＣＭをスケールアップして、ドナー由来の左および右の肺組織の両方（両側の肺）を加工処理した。Ｓａｎｎｅｓプロトコルに関するトリプルシザー解離ステップは、労力と時間がかかり、それにより一度に加工処理することができる組織の量が制限される。肺クラッシュ法を用いた簡略化された解離法により、１名のドナー由来の肺組織全体を一度に取り扱うことが可能であり、全体的な加工処理時間を減少させる。
【0037】
図９は、本明細書において開示される方法の１つの実施形態に見られる改善の要約を示す。この実施形態では、ＡＴ２細胞は、これまでのＳａｎｎｅｓ法（トリプルシザーで刻まれた試料を含む）データと比較して、スケールアップした肺クラッシュ法を使用してドナー肺組織から単離された。次に、ＡＴ２細胞は、ネガティブ磁気ビーズ選択法を使用して精製され、他の確立された精製法を使用してこれまでのデータと比較された。肺クラッシュ法解離アプローチは、（ａ）組織加工処理能および（ｂ）消化後の試料中の未精製ＡＴ２細胞の数（理論上のＡＴ２細胞収量）を有意に増加させた。このデータセットは、両側の肺（肺葉全て）が加工処理された全てのフルスケールのＬＣＭ実行を包含した。（ｃ）種々の精製戦略は、Ｓａｎｎｅｓトリプルシザー法により単離された細胞に関して比較した。ＣＤ４５枯渇法は、ＨＴ２－２８０選択法と比較して、精製効率を改善する傾向にあった。しかしながら、ＨＴ２－２８０選択法は、下流のＡＴ２培養に充分な純度で細胞を産生した一方で、ＣＤ４５枯渇だけでは産生しなかった。したがって、ＣＤ４５／ＣＤ９０／ＣＤ２７１枯渇法が確立され、表面マーカーによるネガティブ選択を使用して、ＣＤ４５＋細胞とともに基底細胞（ＣＤ２７１＋）および線維芽細胞（ＣＤ９０＋）を枯渇させた。（ｄ）種々の単離および精製アプローチから生成された最終的なＡＴ２収量の比較。ドナー１名あたりの平均ＡＴ２収量は、元の方法（Ｓａｎｎｅｓ、スモールスケールＭＡＣＳ機器でＨＴ２－２８０選択を実施）を使用して７３Ｍであった。ＣＤ４５の枯渇またはＣＤ４５／ＣＤ９０／ＣＤ２７１枯渇と組み合わせたＳａｎｎｅｓ法は、ＡＴ２収量の増加傾向にあった。しかしながら、ＣＤ４５／ＣＤ９０／ＣＤ２７１と組み合わせた肺クラッシュ法は、最も高いＡＴ２収量を生じた。さらに、より高い細胞収量を考慮して、ラージスケールのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ精製機器は、フルスケールの加工処理に必要とされた。このデータセットは、ＬＣＭのフルスケールの実行を含んでおり、ここで、両側の肺は枯渇チュービングを使用してＣｌｉｎｉＭＡＣＳで加工処理および精製され、そこではプロセスエラーまたは逸脱は起こらなかった。これらの新しい方法を組み合わせると、１名のドナーから単離された平均９億３千万個のＡＴ２細胞への統計学的に有意な増加が実証された。（ａおよびｂに関するｔ検定、ＡＮＯＶＡ、ｃおよびｄに関するテューキーの多重比較検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【0038】
これらの精製方法を以下の表にまとめる：
【0039】
【表1】
【0040】
【表2】
【実施例】
【0041】
下記実施例は、当業者のために記載を説明および提供するために、本開示の一部の実施形態の特定態様について記載している。実施例は、この開示の一部の実施形態を理解および実行するのに有用な特定の方法論を単に提供するだけであるため、実施例は、この開示を限定するものと解釈されるべきではない。
【0042】
[比較例１]
Ｓａｎｎｅｓ法を使用した解離および精製
この方法では、葉（通常は右中葉）を加工処理用に解剖する。
Ｓａｎｎｅｓ法を使用した解離および精製
この方法では、葉（通常は右中葉）を加工処理用に解剖する。
【0043】
浄化：肺葉血管系を、溶液ＩＩ（ＮａＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、ＣａＣｌ２、およびＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏの水溶液）で３７℃にて、血液が含まれない状態に灌流した。肺葉から空気を除去し、葉にカニューレ挿入し、溶液Ｉ（ＮａＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、グルコースおよびＥＧＴＡの水溶液）で洗浄した。洗浄は、排出溶液が透明に流れるまで繰り返した。
【0044】
消化：エラスターゼを３７℃で溶液ＩＩ中に溶解した。肺葉を、３７℃に設定した水浴中でインキュベートし、温エラスターゼ溶液を充填した。肺は、十分に弛緩するようになるまで消化させた。
【0045】
組織解離（Ｓａｎｎｅｓ法）：組織の大きな未消化の塊を切除した。大きな白い気道を除去して、廃棄した。より小さな葉片を、冷ＤＮａｓｅ溶液（溶液ＩＩ ５０ｍＬ中にＤＮａｓｅ ２５ｍｇ）５ｍＬを含有する氷上の冷却カップに添加した。これらのより小さな葉片を、タンデムで一緒に保持されたか、またはテープで留められた３対の手術用ハサミ「トリプルシザー」を用いてバッチで刻んだ。刻まれた細胞溶液を、氷上で冷やした状態の１リットルのフラスコに収集した。組織全てが加工処理されたら、ＦＢＳを細胞懸濁液に添加し、フラスコを水浴（３７℃）中で３分間激しく振盪した。
【0046】
濾過：細胞懸濁液を、湿らせた手術用ガーゼの層に最大３回通して濾過した。細胞懸濁液を、湿らせた手術用ガーゼの２層に通して濾過した。これを少なくとも１回繰り返して、大きな組織片のほとんどを除去した。続いて、細胞懸濁液を、湿らせた三重層ガーゼに通して１回または２回濾過した。細胞懸濁液を、１６５μｍの絹またはナイロンメッシュに通して濾過した。
【0047】
遠心分離：細胞懸濁液を２００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットをＤＭＥＭ培地５ｍＬ中に再懸濁した。
【0048】
プレーティング：ｐＨ９．５のトリス緩衝液中の５００μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを入れたペトリ皿を調製した。一部の場合では、皿を４℃で一晩インキュベートした。細胞溶液約５ｍＬを、調製したＩｇＧ皿に送達した。
【0049】
パニング：白血球が十分に接着されて灰色に見えるまで、調製した細胞皿をインキュベーター中で最大１時間パニングしたが、ＡＴ２細胞は依然として屈折性（refractile）があり、結合されなかった。線維芽細胞も結合し始めた。細胞皿をインキュベーターから取り出し、静かに揺動させて、ＡＴ２細胞を移動させた。未結合の細胞溶液を収集し、２００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。上清を廃棄した。
【0050】
線維芽細胞枯渇選択肢１－差次的接着：線維芽細胞集団は、非組織培養物処置ペトリ皿への差次的接着によっておよそ１時間枯渇させた。
【0051】
線維芽細胞枯渇選択肢２－磁気的除去：線維芽細胞集団は、ＡＳ０２抗線維芽細胞抗体ネガティブ選択ステップを使用して枯渇させた。細胞ペレットをＤＭＥＭ中に再懸濁した。ＡＳ０２抗体を使用して、線維芽細胞に選択的に接着させた。細胞および抗体のチューブを４℃で１０分間のインキュベーション時間、静かに転がした。ＤＭＥＭ／０．１％細胞培養グレードＢＳＡを添加し、溶液を遠心分離した（１０分、８００ｒｐｍ、４℃）。上清を除去し、細胞をＤＭＥＭ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁した。
【0052】
ダイナビーズ調製：汎マウスＩｇＧダイナビーズをＤＭＥＭ／０．１％ＢＳＡ １ｍＬ中で洗浄し、磁気的に収集し、ＤＭＥＭ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁した。ダイナビーズを細胞に添加し、溶液を４℃で３０分間インキュベートし、端から端までゆっくりと転がした。線維芽細胞をＤｙｎａＭａｇ－１５磁石によっておよそ２分間磁気的に除去した。未結合のＡＴ２細胞を注ぎ出して、収集および計数した。細胞を遠心分離して濃縮し、播種のために培地を交換した。ペレットを、１０％ＦＢＳおよび２×抗生物質／抗真菌薬を有するＤＭＥＭ中で再懸濁した。細胞を計数し、後の使用のために保管した。
【0053】
線維芽細胞枯渇選択肢３：線維芽細胞は、選択肢１および選択肢２の複合方法を使用して枯渇させた。
【0054】
[実施例２]
肺クラッシュ法およびＣＤ４５／ＣＤ９０／ＣＤ２７１枯渇を使用した、ＡＴ２細胞、気道上皮基底細胞、および間質細胞の単離
この方法では、両側の肺（肺葉全て）が、加工処理に使用される。
肺クラッシュ法およびＣＤ４５／ＣＤ９０／ＣＤ２７１枯渇を使用した、ＡＴ２細胞、気道上皮基底細胞、および間質細胞の単離
この方法では、両側の肺（肺葉全て）が、加工処理に使用される。
【0055】
浄化：肺気道にカニューレ挿入し、ＨＢＳＳ（－ＭｇＣｌ２、－ＣａＣｌ２）を注入した。ＨＢＳＳは、穏やかなマッサージで肺から排出された。洗浄を３回繰り返した。２回の最終的なすすぎをＨＢＳＳ（＋ＭｇＣｌ２、＋ＣａＣｌ２）で完了させた。
【0056】
消化：エラスターゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、塩化カルシウム、およびＤＮａｓｅを３７℃でＨＢＳＳ（－ＭｇＣｌ２、－ＣａＣｌ２）中に溶解し、肺に注入した（比較例１では、ＩＶ型コラゲナーゼおよびＤｎａｓｅは使用していない）。肺をＷｈｉｒｌｐａｋバッグに入れ、３７℃に設定した水浴に入れ、肺をおよそ４５分間消化させた。
【0057】
組織解離（肺クラッシュ法）：滅菌手袋を着用し、ヒト操作者がバッグの中に手を入れた。胸膜を引き裂くように開き、肺組織を引き離し、気道のみが残るまで手で破砕した。この時点で、残存する気道組織をバッグから取り出して廃棄した。Ｗｈｉｒｌｐａｋバッグの液体内容物を収集した。
【0058】
濾過：細胞懸濁液を、孔径を減少させて（２０００μｍ、１０００μｍ、２００μｍ、１００μｍ）一連のメッシュシートに通して濾過した。濾過後、細胞懸濁液をＤＮａｓｅとともにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で育成した。５％ＦＢＳを細胞懸濁液に添加し、混合した。
【0059】
遠心分離：細胞懸濁液を、３００×ｇで８分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、ＤＮａｓｅを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２ ５ｍＬ中に再懸濁した。
【0060】
上記の方法に従って細胞懸濁液が確保されたら、ＡＴ２細胞、ＡＥＰ細胞、および間質細胞を下記方法に従って精製した。
【0061】
間質細胞、気道基底細胞、および白血球の磁気ビーズ標識：細胞を、例えば、Ｋ２Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）を用いて計数した。細胞懸濁液を、例えば３００×ｇで４℃にて５分間遠心分離した。細胞懸濁液を培地に再懸濁した。一部の場合では、培地にはＤＮａｓｅが含まれていた。ＣＤ４５、ＣＤ９０、およびＣＤ２７１ビーズを添加して、それぞれ、白血球、線維芽細胞、および気道基底細胞と結合させた。一部の実施形態では、ビーズは、試料中の予想される間質細胞、気道基底細胞、および／または白血球の数に対して過剰に添加した。試料を十分混合し、インキュベートした。一部の実施形態では、インキュベーションは、室温で４５分間行われた。細胞を洗浄し、遠心分離し、培地に再懸濁した。
【0062】
間質細胞、気道上皮基底細胞、白血球からのＡＴ２細胞の磁気的分離：細胞を血液移送バッグなどの容器に入れ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳチュービングセットに取り付けた。枯渇プログラム、この実施例では具体的に、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）システム（細胞精製システム）での枯渇プログラム３．１プログラムを選択した。枯渇プログラムを使用して選択されなかった細胞（ＡＴ２細胞）を、Ｋ２ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（商標）（細胞計数器）を介して計数し、後の使用のために保管した。
【0063】
選択された細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ２７１＋）を分割し、気道上皮基底細胞または間質細胞を支持するよう設計された培養培地中で別々のフラスコにおよそ３００，０００～４００，０００個の細胞数／ｃｍ２で播種した。これらの培養物は、継代を越えてＡＥＰおよび間質細胞の精製された集団を生成した。
【0064】
[実施例３]
肺クラッシュ法の組織解離後の培養選択による間質精製
肺細胞を下記の方法に従って肺組織から単離した。ドナー肺組織を、本明細書において開示される方法または当業者に既知の方法に従って浄化および消化した。肺組織を、肺クラッシュ法などの方法を使用して解離した。細胞懸濁液を、本明細書において開示される方法または当該技術分野において既知の他の方法に従って、外科用ガーゼ、ナイロン、メッシュ、または他の多孔質材料に通して濾過した。
肺クラッシュ法の組織解離後の培養選択による間質精製
肺細胞を下記の方法に従って肺組織から単離した。ドナー肺組織を、本明細書において開示される方法または当業者に既知の方法に従って浄化および消化した。肺組織を、肺クラッシュ法などの方法を使用して解離した。細胞懸濁液を、本明細書において開示される方法または当該技術分野において既知の他の方法に従って、外科用ガーゼ、ナイロン、メッシュ、または他の多孔質材料に通して濾過した。
【0065】
上記の方法に従って細胞懸濁液が確保されたら、間質細胞を下記の方法に従って精製した。
【0066】
濾過後の試料を凍結した。単離後に採取した試料をＣＤ９０発現について評価した。濾過後の細胞を解凍し、３，０００ ＣＤ９０＋細胞数／ｃｍ２の濃度で間質細胞培地において播種した。これらの培養物は、継代を越えて間質細胞の精製された集団を生成した。この精製方法は、間質細胞培養物を生成するための選択された細胞の使用に対する代替法として機能し、気道上皮基底細胞培養物の生成に使用されるよう選択された集団の最大化を可能にする。
【0067】
[実施例４]
肺クラッシュ法後のポジティブ選択による内皮細胞の単離
内皮細胞を下記の方法に従って肺組織から単離した。ドナー肺組織を、本明細書において開示される方法または当業者に既知の方法に従って浄化および消化した。肺組織を、肺クラッシュ法などの方法を使用して解離した。細胞懸濁液を、本明細書において開示される方法または当該技術分野において既知の他の方法に従って、外科用ガーゼ、ナイロン、メッシュ、または他の多孔質材料に通して濾過した。
肺クラッシュ法後のポジティブ選択による内皮細胞の単離
内皮細胞を下記の方法に従って肺組織から単離した。ドナー肺組織を、本明細書において開示される方法または当業者に既知の方法に従って浄化および消化した。肺組織を、肺クラッシュ法などの方法を使用して解離した。細胞懸濁液を、本明細書において開示される方法または当該技術分野において既知の他の方法に従って、外科用ガーゼ、ナイロン、メッシュ、または他の多孔質材料に通して濾過した。
【0068】
上記の方法に従って細胞懸濁液が確保されたら、内皮細胞を下記の方法に従って選択した。
【0069】
磁気ビーズ標識および内皮細胞の分離：細胞を、例えば、Ｋ２ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）を用いて計数した。細胞懸濁液を、例えば３００×ｇで５分間遠心分離した。細胞懸濁液を培地中に再懸濁した。一部の場合では、培地はＤＮａｓｅを含有していた。ＣＤ４５ビーズを細胞懸濁液に添加して、白血球と結合させた。一部の実施形態では、インキュベーションは１５分間行われた。細胞を血液移送バッグなどの容器に入れ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳチュービングセットに取り付けた。枯渇プログラムを利用して、ＣＤ４５陽性白血球を選択した。続いて、内皮細胞と結合させるように、ＣＤ３１ビーズを第１の精製ステップからの陰性画分に添加した。一部の実施形態では、ビーズは、試料中の予想される内皮細胞の数に対して過剰に添加した。試料を十分に混合して、インキュベートした。一部の実施形態では、インキュベーションは室温で１５分間行われた。細胞を洗浄し、遠心分離し、培地中に再懸濁した。次に、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ機器を使用して、内皮細胞を選択した。選択された内皮細胞を、Ｋ２ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを介して計数し、内皮細胞培養培地において培養物に播種した。
【0070】
内皮細胞はまた、培養の１～２継代後にＣＤ３１選択を使用した精製を伴う消化後に、細胞を直接培養物に播種することによって得ることができる。
【0071】
[実施例５]
１名のドナー由来の４つの細胞型の単離
図１０は、プロセスの一実施形態の概略図を示し、肺組織の全てを消化および解離するのに使用された方法、ならびに気道上皮基底細胞、間質細胞、ＡＴ２細胞、および内皮細胞を肺組織と分離するのに使用された精製方法を強調表示している。肺葉は全て、肺クラッシュ法を使用して消化および解離した。間質細胞の精製された集団を生成するために、濾過後の試料を間質培地に直接播種し、３継代（Ｐ２）で成長させた。２０Ｂの濾過後の細胞をＣＤ４５ビーズで染色し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳでＤｅｐｌｅｔｉｏｎ ３．１プログラムを使用して精製した。次に、この第１の精製からの枯渇試料をＣＤ９０およびＣＤ２７１で染色し、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ機器で精製した。第２の精製ステップからの枯渇細胞試料をＡＴ２集団と称した。第２の精製ステップからの選択された細胞試料を、気道上皮基底細胞成長培地中の培養物に播種し、３継代（Ｐ２）で培養を介してさらに精製した。内皮細胞を生成するために、濾過後の試料の別々のアリコートをまずＣＤ４５ビーズで染色し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳで枯渇させ、続いてＣＤ３１ビーズで染色して、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ装置でポジティブ選択を介して精製した。選択した試料を内皮細胞培地中の培養物に播種し、４継代（Ｐ３）で成長させた。
１名のドナー由来の４つの細胞型の単離
図１０は、プロセスの一実施形態の概略図を示し、肺組織の全てを消化および解離するのに使用された方法、ならびに気道上皮基底細胞、間質細胞、ＡＴ２細胞、および内皮細胞を肺組織と分離するのに使用された精製方法を強調表示している。肺葉は全て、肺クラッシュ法を使用して消化および解離した。間質細胞の精製された集団を生成するために、濾過後の試料を間質培地に直接播種し、３継代（Ｐ２）で成長させた。２０Ｂの濾過後の細胞をＣＤ４５ビーズで染色し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳでＤｅｐｌｅｔｉｏｎ ３．１プログラムを使用して精製した。次に、この第１の精製からの枯渇試料をＣＤ９０およびＣＤ２７１で染色し、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ機器で精製した。第２の精製ステップからの枯渇細胞試料をＡＴ２集団と称した。第２の精製ステップからの選択された細胞試料を、気道上皮基底細胞成長培地中の培養物に播種し、３継代（Ｐ２）で培養を介してさらに精製した。内皮細胞を生成するために、濾過後の試料の別々のアリコートをまずＣＤ４５ビーズで染色し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳで枯渇させ、続いてＣＤ３１ビーズで染色して、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ装置でポジティブ選択を介して精製した。選択した試料を内皮細胞培地中の培養物に播種し、４継代（Ｐ３）で成長させた。
【0072】
図１１は、図１０に記載される１名のドナー由来の４つの肺細胞型（ＡＴ２、内皮、間質、および気道上皮基底）の単離の結果を示す。図１１（ａ）は、組織単離（重量および濾過後の総細胞収量）および総ＡＴ２収量情報を示し、図１１（ｂ）は、４つの細胞型それぞれの形態画像を示す。ＡＴ２：播種の２４時間後、２０倍対物レンズ；内皮：継代３、１０倍対物レンズ；間質および気道上皮：継代２、１０倍対物レンズ。図１１（ｃ）は、フローサイトメトリーによって示されるような４つの細胞集団それぞれの純度を示す（ＡＴ２、ＣＤ４５／ＣＤ９０／ＣＤ２７１枯渇後のＨＴ２－２８０発現；内皮、継代３でのＣＤ１４４発現；間質、継代２でのＣＤ９０発現；ＡＥＰ、継代２でのＣＫ５発現）。図１１（ｄ）は、内皮（継代３）、間質（継代２）、およびＡＥＰ（継代２）培養物の成長特性を提示している。
【0073】
図１２は、プロセスを実証するために消化された肺組織に対して実施されている肺クラッシュ法を撮影した写真である。図１２（ａ）は、肺胸膜を引き裂いて、消化された組織および細胞を収集バッグに放出させることを示す一連の画像を示す。図１２（ｂ）は、肺組織を圧迫して細胞を収集バッグに放出させることを示す一連の画像を示す。図１２（ｃ）は、肺クラッシュ法後の２つの異なる肺の画像を示しており、肺クラッシュ解離が完了した後、最小限の残存する肺組織が見られることを示している。図１２（ｄ）は、肺クラッシュ法により収集した結果として生じる細胞懸濁液の画像を示し、無傷の肺組織片が最小限であることを示している。
【0074】
図１３は、ＡＴ２細胞単離および特徴付けの要約である。図１３（ａ）は、ＡＴ２収量（総生細胞収量×ＨＴ２－２８０陽性細胞のパーセント）を示し、図１３（ｂ）は、両側の肺が、肺クラッシュ法を使用して消化および解離され、磁気ビーズを使用して精製され、枯渇チュービングセットを使用してＣｌｉｎｉＭＡＣＳ機器でＣＤ４５、ＣＤ２７１、およびＣＤ９０の枯渇を除去した１５個の単離物における純度（ＨＴ２－２８０陽性細胞パーセント）を示し、図１０に記載されているようにＣｌｉｎｉＭＡＣＳおよびＭｕｌｔｉＭＡＣＳでの２ステップ精製が実施された実行を含み、プロセスエラーのある実行は排除する。平均ＡＴ２収量は、９３０ｅ６個の細胞で、平均ＡＴ２純度は７０％であった。図１３（ｃ）は、１名のドナー由来の単離および精製されたＡＴ２細胞の例となるフローサイトメトリードットプロットを示し、ＨＴ２－２８０およびｐｒｏ－ＳＰ－Ｃ抗体（黒：標的抗体、紫：アイソタイプ対照）を使用して、予想されるマーカー発現を確認している。図１３（ｄ）は、肺胞１型様（ＡＴ１様）細胞遺伝子発現に対して正規化された２名のドナーについてのＡＴ２遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。ＡＴ１様細胞を、ＡＴ１変換を促進すると意図される培地中でＡＴ２細胞を７日間培養することによって生成した。ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して試料から単離した。ｃＤＮＡを生成し、目的の遺伝子に関するプローブを使用してリアルタイムＰＣＲを実行した。これらのデータは、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＤ、ＬＡＭＰ３、ＡＢＣＡ３、およびＮＡＰＳＡを含む、本明細書において記載される方法を使用して単離されたＡＴ２細胞におけるいくつかの予想されるＡＴ２遺伝子の発現を実証している。
【0075】
図１４は、気道上皮基底細胞を実施例２に記載されるような肺クラッシュ法解離後のＣＤ４５／ＣＤ９０／ＣＤ２７１枯渇の選択された画分から成長させたドナーからの気道上皮基底細胞の単離および増殖の要約を示す。ＣＤ４５／ＣＤ９０／ＣＤ２７１選択細胞を単離の当日に凍結し、その後解凍して、気道細胞培地に播種し、培養を開始した。細胞は合計３継代（継代０から継代２まで）で成長させた。図１４（ａ）の表は、気道上皮基底細胞の増殖の測定基準を示す。あらゆる継代で、培養面積、採取時の細胞数／ｃｍ２、採取した総細胞数、倍率変化、集団倍加数、集団倍加レベル、および集団倍加時間を収集した。１０億よりも多い気道基底上皮基底細胞が、培養のほんの１継代（継代０）後にこのドナーから生成された。継代１および継代２における続く培養物のサイズは最大化されなかった一方で、さらなる継代を越えた基底細胞の増殖力が実証された。継代１および継代２における細胞の倍率変化は、それぞれ７０．１および４３．０であった。継代１および継代２における集団倍加時間は、それぞれ２３．７時間および２６．４時間であった。図１４（ｂ）は、継代０から継代２までのフローサイトメトリーによって測定された気道上皮基底細胞マーカーであるサイトケラチン５（ｃｋ５）および腫瘍タンパク質６３（ｐ６３）の発現を示し、増殖の過程での基底細胞の独自性の維持を実証している。８０％よりも多い集団が、継代０から継代２まで両方のマーカーを発現した。誘導気道からの基底細胞は通常、消化気道組織セグメントを介して単離され、続いて気道内腔が掻き出される。本明細書において記載される方法の利点は、別々の細胞単離プロセスを実施する必要なく、またいかなるＡＴ２細胞も犠牲にすることなく、ＡＴ２細胞を単離するのに使用される精製アプローチの選択された画分から細胞を簡素に収集することができることである。
【0076】
図１５は、実施例３において説明されるように、間質細胞を、肺クラッシュ法により収集された濾過後の細胞を間質細胞培地に播種することによって成長させたドナー由来の間質細胞増殖の要約を示す。濾過後の細胞を単離の当日に凍結し、その後解凍して、間質培養を開始した。細胞を合計３継代（継代０から継代２まで）で成長させた。図１５（ａ）は、間質細胞の増殖の測定基準を示す。あらゆる継代で、培養面積、採取時の細胞数／ｃｍ２、採取した総細胞数、倍率変化、集団倍加数、集団倍加レベル、および集団倍加時間を収集した。継代０での細胞収量は、７，２００万個の細胞であり、増殖をさらなる２継代で継続し、継代１および継代２で倍加時間が減少し（継代０の５７．６時間と比較して、それぞれ２８．６時間および３０．５時間）、細胞成長速度の増加が示された。図１５（ｂ）は、増殖の過程でのフローサイトメトリーによって測定された間質細胞マーカーであるＣＤ９０およびＣＤ１４０ｂの発現を示し、間質細胞の独自性が維持されたことを実証している。ＣＤ１４０ｂ発現は、継代０では低かった一方で、継代１および２では、８０％よりも多い細胞が、ＣＤ９０およびＣＤ１４０ｂの両方を発現した。肺クラッシュ法解離を使用した両側の肺の加工処理による濾過後の平均収量は、およそ３５０億個の細胞である。したがって、ＡＴ２または気道上皮基底細胞の多くを犠牲にすることなく、過剰な濾過後の試料を、間質細胞培養物を播種するのに残したままにしているうちに、２０～３０Ｂの濾過後の細胞をＡＴ２精製に割り当てることができる。
【0077】
図１６は、実施例４において記載されるような、内皮細胞を、肺クラッシュ法による濾過後の細胞を播種することによって成長させたドナー由来の内皮細胞の単離および増殖の要約を示す。濾過後の細胞を単離の当日に凍結し、その後解凍して、内皮細胞増殖培地において播種し、内皮培養を開始した。細胞を、合計５継代で（継代０から継代４まで）首尾よく成長させ、ＣＤ３１磁気ビーズ選択を継代１の採取後に実施した。図１６（ａ）における表は、内皮細胞の増殖の要約を示す。あらゆる継代で、培養面積、採取時の細胞数／ｃｍ２、採取した総細胞数、倍率変化、集団倍加数、集団倍加レベル、および集団倍加時間を収集した。図１６（ｂ）は、精製前および精製後を含む、継代１から始まるあらゆる継代後のフローサイトメトリーによって測定された内皮細胞のマーカーであるＣＤ１４４の発現を示す。継代１後のＣＤ３１磁気ビーズ選択後に、ＣＤ１４４発現は、８０％を上回って維持された。
【0078】
[実施例６]
代替精製アプローチを用いた１名のドナー由来の４つの細胞型の単離
図１７は、４つの異なる細胞型（ＡＴ２細胞、気道上皮基底細胞、間質細胞、および内皮細胞）を１名のドナーから得るプロセスの異なる実施形態の概略図を示す。消化および組織解離は、実施例５に記載されるものと同じであるが、ＡＴ２および内皮細胞に対する異なる精製アプローチが、この実施形態において記載される。ＡＴ２細胞の精製された集団を生成するために、２０～３０Ｂの濾過後の細胞をＣＤ４５、ＣＤ９０、およびＣＤ２７１ビーズで、１ステップで一緒に染色して、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ機器でのいかなる続く精製も伴わずにＣｌｉｎｉＭＡＣＳ機器で枯渇カラムに通して流す。枯渇された細胞試料は、ＡＴ２集団と称される。実施例５において記載されるように、気道上皮基底細胞の精製された集団を生成するために、選択された画分を基底細胞増殖培地に播種する。内皮細胞の精製集団を生成するために、濾過後の試料の一部を単離の当日に内皮細胞培地に直接播種する。次に、実施例４に記載されるように、細胞を１継代後に採取し、ＭＡＣＳベースのＣＤ３１選択アプローチを使用して精製する。続いて、内皮細胞は、続く増殖または実験のために培養に戻される。最終的に、間質細胞を生成するために、濾過後の試料の一部を、実施例３に記載されるように、間質細胞増殖培地に播種する。
代替精製アプローチを用いた１名のドナー由来の４つの細胞型の単離
図１７は、４つの異なる細胞型（ＡＴ２細胞、気道上皮基底細胞、間質細胞、および内皮細胞）を１名のドナーから得るプロセスの異なる実施形態の概略図を示す。消化および組織解離は、実施例５に記載されるものと同じであるが、ＡＴ２および内皮細胞に対する異なる精製アプローチが、この実施形態において記載される。ＡＴ２細胞の精製された集団を生成するために、２０～３０Ｂの濾過後の細胞をＣＤ４５、ＣＤ９０、およびＣＤ２７１ビーズで、１ステップで一緒に染色して、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ機器でのいかなる続く精製も伴わずにＣｌｉｎｉＭＡＣＳ機器で枯渇カラムに通して流す。枯渇された細胞試料は、ＡＴ２集団と称される。実施例５において記載されるように、気道上皮基底細胞の精製された集団を生成するために、選択された画分を基底細胞増殖培地に播種する。内皮細胞の精製集団を生成するために、濾過後の試料の一部を単離の当日に内皮細胞培地に直接播種する。次に、実施例４に記載されるように、細胞を１継代後に採取し、ＭＡＣＳベースのＣＤ３１選択アプローチを使用して精製する。続いて、内皮細胞は、続く増殖または実験のために培養に戻される。最終的に、間質細胞を生成するために、濾過後の試料の一部を、実施例３に記載されるように、間質細胞増殖培地に播種する。
【0079】
図１８は、肺クラッシュ法が１名のドナー由来の４つの異なる細胞型（ＡＴ２：肺胞２型、ＡＥＰ：気道上皮基底部、内皮、および間質）の単離を試みるのに使用された肺からの単離された細胞の要約を示す。図１８（ａ）における表は、各細胞型について報告された収量および純度と関連付けられた総細胞収量、細胞純度、および継代数を示す。表における全ての細胞型について、総収量は、報告された継代からの採取時に計数された生細胞の数であり、純度は、フローサイトメトリーを介して測定された総収量における目的の細胞型のパーセントである。ＨＴ２－２８０発現を使用して、ＡＴ２細胞純度を決定した。Ｃｋ５発現を使用して、気道上皮基底細胞純度を決定した。ＣＤ１４４発現を使用して、内皮細胞純度を決定した。ＣＤ９０発現を使用して、間質細胞純度を決定した。肺クラッシュ法および細胞培養培地に従った種々の精製戦略を、この表において提示される結果に使用した。総収量の隣のアスタリスクは、その細胞型の単離がそのドナーに対して最大化されなかったことを示し、したがって、総細胞収量は、より高かった可能性があると予測される。ＡＴ２細胞に関する「初期」継代の表記は、ＡＴ２細胞が総収量および純度の分析前に増殖していなかったことを示す。単離後の細胞培養物を使用して、他の３つの細胞型（ＡＥＰ、内皮、および間質）をさらに精製し、これが、それらがより高い継代で含まれた理由である。最終的に、総収量の列におけるＸは、その細胞型の単離が、微生物混入、細胞成長の欠如、または異なる細胞型の異常成長に起因してそのドナーでは不首尾であったことを示す。図１８（ｂ）は、図１８（ａ）において言及した不首尾の単離の試みそれぞれについての原因の内訳を示す。
【0080】
本明細書において使用される場合、単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他の状況を指示しない限り、複数の指示対象を含んでもよい。したがって、例えば、物体に対する言及は、文脈が明確に他の状況を指示しない限り、複数の物体を含んでもよい。
【0081】
本明細書で使用される場合、「実質的に」および「ほぼ」という用語は、小さな変動を記載および説明するのに用いられる。事象または状況と併せて使用する場合、この用語は、事象または状況が正確に起きる場合、ならびに事象または状況がほぼ近似して起きる場合を指し得る。数値と併せて使用する場合、この用語は、その数値の±１０％未満であるか、またはそれに等しい、例えば、±５％未満であるか、またはそれに等しい、±４％未満であるか、またはそれに等しい、±３％未満であるか、またはそれに等しい、±２％未満であるか、またはそれに等しい、±１％未満であるか、またはそれに等しい、±０．５％未満であるか、またはそれに等しい、±０．１％未満であるか、またはそれに等しい、あるいは±０．０５％未満であるか、またはそれに等しい変動の範囲を指し得る。第１の数値を第２の数値と「実質的に」または「ほぼ」同じであると言及する場合、この用語は、第１の数値が第２の数値の１０％未満であるか、またはそれに等しい、例えば、±５％未満であるか、またはそれに等しい、±４％未満であるか、またはそれに等しい、±３％未満であるか、またはそれに等しい、±２％未満であるか、またはそれに等しい、±１％未満であるか、またはそれに等しい、±０．５％未満であるか、またはそれに等しい、±０．１％未満であるか、またはそれに等しい、あるいは±０．０５％未満であるか、またはそれに等しい変動範囲内にあることを指し得る。
【0082】
さらに、量、比率、および他の数値は、場合によっては範囲フォーマットで本明細書において提示される。そのような範囲フォーマットは、便宜上および簡潔さのために使用され、範囲の限界として明示的に指定された数値を含むだけでなく、各数値および部分範囲が明示的に指定されているかのように、その範囲内に包含される全ての個々の数値または部分範囲を含むように柔軟に理解されるべきであることが理解されよう。例えば、約１から約２００の範囲の比率は、約１および約２００の明示的に列挙された限界を含むと理解されるべきであるが、約２、約３、および約４などの個々の比率、および約１０から約５０、約２０から約１００などの部分範囲も含むと理解されるべきである。
【0083】
本開示は、その特定実施形態を参照して説明されたが、添付の特許請求の範囲によって規定されるような開示の真の主旨および範囲から逸脱することなく、種々の変更が成されてもよく、均等物が置き換えられてもよいことが当業者に理解されよう。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、方法、操作（単数またま複数）を、本開示の目的、主旨、および範囲に適合させるように、多くの変更が成されてもよい。そのような変更は全て、本明細書に添付された特許請求の範囲内にあると意図される。特に、ある特定の方法は、特定の順序で実施される特定の操作を参照して記載されている可能性がある一方で、これらの操作は、本開示の教示から逸脱することなく、等価な方法を形成するために、組み合わされるか、細分化されるか、または並べ替えられてもよいことが理解されよう。したがって、本明細書に別記されない限り、操作の順序および分類は、本開示の限定にはならない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【国際調査報告】