特表 2024-530271 椎間板変性症のＩＬ－１Ｒａ遺伝子治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-16

(54)【発明の名称】椎間板変性症のＩＬ－１Ｒａ遺伝子治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/761 20150101AFI20240808BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240808BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240808BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240808BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240808BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240808BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20240808BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20240808BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240808BHJP

   A61K 31/56 20060101ALI20240808BHJP

   A61P 23/02 20060101ALI20240808BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240808BHJP

   C12N 15/25 20060101ALN20240808BHJP

【ＦＩ】

A61K35/761

C12N15/861 Z

C12N15/63 100Z

C12N15/12

C12N7/01

A61K48/00

A61P19/08

A61P19/00

A61K38/16

A61K31/56

A61P23/02

A61P43/00 121

C12N15/25

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024511983

(86)(22)【出願日】2022-08-23

(85)【翻訳文提出日】2024-04-17

(86)【国際出願番号】 US2022075358

(87)【国際公開番号】W WO2023028492

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】63/236,580

(32)【優先日】2021-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522091232

【氏名又は名称】パシラ・セラピューティクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｐａｃｉｒａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】センター，レベッカ ケイ

(72)【発明者】

【氏名】ル メートル，クリスティン エル

(72)【発明者】

【氏名】スナッグス，ジョセフ ダブリュー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA01

4C084MA02

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4C084ZA21

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4C084ZC75

4C086AA01

4C086AA02

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4C086NA05

4C086ZA21

4C086ZA96

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA02

4C087MA17

4C087MA66

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA21

4C087ZA96

4C087ZC75

(57)【要約】

本開示は、ヒトまたは哺乳動物インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）をコードするアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物、ならびに変性円板疾患（ＤＤＤ）またはＤＤＤに関連する状態に罹患している対象の１つまたは複数の椎間板の細胞においてＩＬ－ＩＲＡを発現させるためにおよびＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置のために医薬組成物を使用する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

それを必要とする対象における変性円板疾患（ＤＤＤ）またはＤＤＤに関連する状態の処置のための医薬組成物であって、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質をコードする核酸を含む、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む、医薬組成物。

【請求項2】

核酸が、左側および右側逆方向末端反復配列、アデノウイルスパッケージングシグナル、ならびに非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

ＩＬ－１Ｒａ遺伝子の発現が炎症感受性プロモーターにより制御されるように、核酸が、ＩＬ－１Ｒａタンパク質をコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に位置する炎症感受性プロモーターをさらに含み、炎症感受性プロモーターが、ＮＦ－κＢ、インターロイキン６（ＩＩ－６）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ－２）、補体因子３（Ｃ３）、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）、およびマクロファージ炎症性タンパク質－１ａ（ＭＩＰ－１ａ）、またはこれらのハイブリッドコンストラクトにより誘導可能なプロモーターからなる群から選択されてもよい、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

ＩＬ－１Ｒａ遺伝子の発現がＮＦ－ｋＢ誘導性プロモーターにより制御されるように、核酸が、ＩＬ－１Ｒａタンパク質をコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に位置するＮＦ－ｋＢ誘導性プロモーターをさらに含む、請求項１または３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

核酸が、配列番号７の核酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるか、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１または４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

ＤＤＤに関連する状態が、腰痛、背筋緊張低下、背部柔軟性低下、血餅またはこれらの組合せである、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸の配列が、配列番号４の核酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるかまたは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸の配列が、配列番号６のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるかまたは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＩＬ－１Ｒａタンパク質をコードする核酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

ＩＬ－１Ｒａタンパク質が、ヒトＩＬ－１Ｒａである、請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系が、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えてタンパク質をコードする核酸をさらに含み、追加のタンパク質が、治療用タンパク質であってもよい、請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞への直接的なアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板が、変性した円板もしくは変性していない円板または両方である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板が、変性した円板である、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

１つまたは複数の椎間板の、軟骨終板（ＣＥＰ）の細胞、高度に組織化された線維輪（ＡＦ）の細胞および中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）領域の細胞（髄核（ＮＰ）細胞）またはこれらの組合せへの、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

髄核（ＮＰ）細胞へのアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

細胞が、髄核（ＮＰ）細胞である、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項17】

アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染している変性した円板の細胞のみが、ＩＬ－１Ｒａを産生する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞が、少なくとも２週間、少なくとも１カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、または少なくとも１年の期間にわたって、ＩＬ－１Ｒａを発現する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

対象に投与されたときに対象における変性円板疾患（ＤＤＤ）および／またはＤＤＤに関連する状態を処置するのに有効なアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の量を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項20】

対象が、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有さない、請求項１から１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項21】

対象が、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項22】

変性円板疾患（ＤＤＤ）またはＤＤＤに関連する状態に罹患している対象の１つまたは複数の椎間板の細胞においてＩＬ－ＩＲＡを発現させる方法であって、
ａ）それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞を請求項１から２１のいずれか一項に記載の医薬組成物に感染させる工程；および
ｂ）１つまたは複数の椎間板の細胞においてＩＬ－１Ｒａを発現させる工程
を含む方法。

【請求項23】

アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系が、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えてタンパク質をコードする核酸をさらに含み、追加のタンパク質が、治療用タンパク質であってもよく、方法が、１つまたは複数の椎間板の細胞において追加のタンパク質を発現させることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に１回感染させる、請求項２２または２３に記載の方法。

【請求項25】

１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる、請求項２２または２３の方法。

【請求項26】

１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、各感染が、アデノウイルスベースのベクターの異なる数のゲノムコピーを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、各感染が、アデノウイルスベースのベクターの同じ数のゲノムコピーを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、各感染が、対象の同じ椎間板において行われる、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、あらゆる第２および後続の感染が、前に感染を行った椎間板とは異なる対象の椎間板において行われる、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

１つまたは複数の椎間板の細胞を感染させる工程が、医薬組成物を１つまたは複数の椎間板の、軟骨終板（ＣＥＰ）領域、高度に組織化された線維輪（ＡＦ）領域もしくは中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）領域（髄核（ＮＰ）細胞）またはこれらの組合せに注射することを含む、請求項２２から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

１つまたは複数の椎間板の細胞を感染させる工程が、医薬組成物を１つまたは複数の椎間板の髄核（ＮＰ）領域に注射することを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

対象における変性円板疾患（ＤＤＤ）および／またはＤＤＤに関連する状態を処置する、請求項２２から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

ｃ）（ｂ）におけるＩＬ－１Ｒａの発現後に対象の変性された椎間板におけるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行をモニターする工程
をさらに含む、請求項２２から３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行をモニターする工程が、患者報告疼痛および／または機能測定からのスコアを決定することによって行われる、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

患者報告疼痛からスコアを決定することが、視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）を使用して行われる、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

対象におけるＶＡＳスコアが、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後のほうが低い、請求項２２から３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

患者－機能測定からスコアを決定することが、オスヴェストリー能力障害指数（ＯＤＩ）を使用して行われる、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

対象におけるＶＡＳスコアが、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後のほうが低い、請求項２２から３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行をモニターする工程が、ＮＧＦ、ＮＴ－３、ＶＥＧＦ、サブスタンスＰ、サイトカイン、アグリカン、ＩＩ型コラーゲン、およびこれらの組合せからなる群から選択される対象におけるマーカーのレベルを決定することを含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項40】

サイトカインが、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ α、ＭＭＰ ３、ＭＭＰ １３、ＡＤＡＭＴＳ ４、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

以下のうちの１つまたは複数：
（ａ）ＮＧＦ、ＮＴ－３、ＶＥＧＦ、サブスタンスＰ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ α、ＭＭＰ ３、ＭＭＰ １３もしくはＡＤＡＭＴＳ ４またはこれらの組合せ、のうちの１つまたは複数のレベルの低下または不変；
（ｂ）アグリカンもしくはＩＩ型コラーゲンまたはこれらの組合せのレベルの上昇；または
（ｃ）両方
が、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後に１つまたは複数の椎間板において生じる、請求項２２から４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

アグリカンのレベルが、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後に１つまたは複数の椎間板において上昇する、請求項２２から４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行をモニターする工程が、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後に１つまたは複数の椎間板についてのヒト椎間板変性症の組織病理スコアリングシステムに基づくスコアの変化を決定することにより行われる、請求項３３に記載の方法。

【請求項44】

１つまたは複数の椎間板についてのヒト椎間板変性症の組織病理スコアリングシステムに基づくスコアの減少が、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後に生じる、請求項２２から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

（ｄ）（ｃ）のモニターする工程によって、対象の椎間板の変性円板疾患が管理または処置されないことが示された場合、（ａ）について１つまたは複数の椎間板の細胞へのアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の同じ量の投与を継続する工程；または
（ｅ）（ｃ）のモニターする工程によって、対象の椎間板の変性円板疾患が進行したことが示された場合、（ａ）について、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の量をさらに調整し、それを必要とする対象における１つまたは複数の椎間板の細胞に投与する工程
をさらに含む、請求項３３から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

対象の椎間板へのコルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬の投与をさらに含む、請求項２２から４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬がアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と同時に投与されるように、コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬を単一の医薬製剤で投与する、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬が、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の前および／または後に投与されるように、コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬が、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と単一の医薬製剤で投与されない、請求項４６に記載の方法。

【請求項49】

アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の投与後に対象の椎間板への液体の投与をさらに含み、適宜、液体の量が、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌ、６０μｌ、６５μｌ、７０μｌ、７５μｌ、８０μｌ、８５μｌ、９０μｌ、９５μｌ、１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ、２５０μｌ、３００μｌ、３５０μｌ、４００μｌ、４５０μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、１０００μｌであるか、約２５μｌ、約３０μｌ、約３５μｌ、約４０μｌ、約４５μｌ、約５０μｌ、約５５μｌ、約６０μｌ、約６５μｌ、約７０μｌ、約７５μｌ、約８０μｌ、約８５μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、約１００μｌ、約１５０μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、約３５０μｌ、約４００μｌ、約４５０μｌ、約５００μｌ、約６００μｌ、約７００μｌ、約８００μｌ、約９００μｌ、約１０００μｌであるか、２５μｌ未満、３０μｌ未満、３５μｌ未満、４０μｌ未満、４５μｌ未満、５０μｌ未満、５５μｌ未満、６０μｌ未満、６５μｌ未満、７０μｌ未満、７５μｌ未満、８０μｌ未満、８５μｌ未満、９０μｌ未満、９５μｌ未満、１００μｌ未満、１５０μｌ未満、２００μｌ未満、２５０μｌ未満、３００μｌ未満、３５０μｌ未満、４００μｌ未満、４５０μｌ未満、５００μｌ未満、６００μｌ未満、７００μｌ未満、８００μｌ未満、９００μｌ未満、１０００μｌ未満であるか、約２５μｌ未満、約３０μｌ未満、約３５μｌ未満、約４０μｌ未満、約４５μｌ未満、約５０μｌ未満、約５５μｌ未満、約６０μｌ未満、約６５μｌ未満、約７０μｌ未満、約７５μｌ未満、約８０μｌ未満、約８５μｌ未満、約９０μｌ未満、約９５μｌ未満、約１００μｌ未満、約１５０μｌ未満、約２００μｌ未満、約２５０μｌ未満、約３００μｌ未満、約３５０μｌ未満、約４００μｌ未満、約４５０μｌ未満、約５００μｌ未満、約６００μｌ未満、約７００μｌ未満、約８００μｌ未満、約９００μｌ未満、約１０００μｌ未満であるか、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌ、６０μｌ、６５μｌ、７０μｌ、７５μｌ、８０μｌ、８５μｌ、９０μｌ、９５μｌ、１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ、２５０μｌ、３００μｌ、３５０μｌ、４００μｌ、４５０μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、１０００μｌを超えるか、約２５μｌ、約３０μｌ、約３５μｌ、約４０μｌ、約４５μｌ、約５０μｌ、約５５μｌ、約６０μｌ、約６５μｌ、約７０μｌ、約７５μｌ、約８０μｌ、約８５μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、約１００μｌ、約１５０μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、約３５０μｌ、約４００μｌ、約４５０μｌ、約５００μｌ、約６００μｌ、約７００μｌ、約８００μｌ、約９００μｌ、約１０００μｌを超えるか、または前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、適宜、２５～１０００μｌ、２５～５００μｌ、２５～２００μｌ、５０～１５０μｌ、５００～１０００μｌ、２００～８００μｌ、２００～６００μｌ、４００～８００μｌ、もしくは６００～８００μｌである、請求項２２から４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

液体が、食塩水である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

さらなる投与が、コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬および／または液体の円板内注射を含む、請求項４６から５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

対象が、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有さない、請求項２２から５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

対象が、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する、請求項２２から４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

医薬組成物の円板内注射を含む、請求項２２から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

円板内注射が、中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）領域へのものである、請求項５１または５４に記載の方法。

【請求項56】

医薬組成物の腱内注射も、筋肉内注射も、関節内注射も、肩峰下注射も含まない、請求項２２から５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

医薬組成物中のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の濃度が、１×１０^８～５×１０^１１ＶＰ／ｍｌ、２×１０^８～２×１０^１１ＶＰ／ｍｌ、２×１０^９～２×１０^１１ＶＰ／ｍｌ、１×１０^８～２×１０^９ＶＰ／ｍｌ、もしくは１×１０^９ＶＰ／ｍｌ未満であるか、または約前記範囲もしくは値である、請求項１から５６のいずれか一項に記載の組成物または方法。

【請求項58】

医薬組成物中のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の濃度が、１×１０^８～５×１０^１１ＧＣ／ｍｌ、２×１０^８～２×１０^１１ＧＣ／ｍｌ、２×１０^９～２×１０^１１ＧＣ／ｍｌ、１×１０^８～２×１０^９ＧＣ／ｍｌ、もしくは１×１０^９ＧＣ／ｍｌ未満であるか、または約前記範囲もしくは値である、請求項１から５６のいずれか一項に記載の組成物または方法。

【請求項59】

椎間板に投与される医薬組成物の単一用量が、０．１ｍｌ、０．２ｍｌ、０．３ｍｌ、０．４ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌもしくは５ｍｌである量、約０．１ｍｌ、約０．２ｍｌ、約０．３ｍｌ、約０．４ｍｌ、約０．５ｍｌ、約１ｍｌ、約２ｍｌ、約３ｍｌ、約４ｍｌもしくは約５ｍｌである量、もしくは０．１ｍｌ未満、０．２ｍｌ未満、０．３ｍｌ未満、０．４ｍｌ未満、０．５ｍｌ未満、１ｍｌ未満、２ｍｌ未満、３ｍｌ未満、４ｍｌ未満もしくは５ｍｌ未満である量、または前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、適宜、０．１ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～２ｍｌ、１ｍｌ～５ｍｌ、２ｍｌ～５ｍｌ、４ｍｌ～５ｍｌ、もしくは３ｍｌ～５ｍｌである量である、請求項１から５８のいずれか一項に記載の組成物または方法。

【請求項60】

感染細胞が、ＮＰ細胞を含む、請求項１７から５９のいずれか一項に記載の組成物または方法。

【請求項61】

アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系が、ＦＸ２０１／ＰＣＲＸ－２０１を含むか、からなるか、またはから本質的になる、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物または方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表の参照による組込み
本願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式で提出した配列表を含み、この配列表は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年８月２３日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、「ＰＣＲＴＸ＿０１７ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」という名であり、サイズ９７．５バイトである。

【背景技術】

【0002】

腰痛症は、人口の８０％に彼らの人生のある時点で発症し、症例のほぼ半数が、椎間板（ＩＶＤ）変性症に起因する。ＩＶＤ変性症は、ネイティブＩＶＤ細胞自体により誘発される；この場合、サイトカインおよび異化酵素産生のカスケードは、細胞外基質（ＥＣＭ）の破壊および円板（disc）生体力学の変化をもたらし、ＩＶＤ機能の喪失の一因となり、これは、椎間板内層への神経の侵入（ｎｅｒｖｅ ｉｎｇｒｏｗｔｈ）の導入および神経栄養因子の産生と結びついて、背部痛の一因になると考えられる。しかし、これまでのところ、処置の大多数は、短期疼痛管理、理学療法およびヘルニア組織の外科的切除に重点を置いており、ＩＶＤ変性の根本的な病態生理学的原因を標的とするものはない。遺伝子治療アプローチは、多種多様な疾患の処置の新規のわくわくするような可能性を提示する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

ＩＬ－１は、自然発症円板変性を誘導したノックアウトモデルにおいて円板変性およびＩＬ－１Ｒａの喪失中に多面発現サイトカインとして作用することが公知である。それに基づいて、ＩＶＤの細胞および組織におけるＩＬ－１を遮断することによるＩＶＤ処置のためのより効果的な、持続的な、費用効率のよい方法に対する明らかな、満たされていない医療ニーズがある。本開示は、アデノウイルス送達および発現系（ＦＸ２０１、ｈｕｍａｎｔａｋｉｎｏｇｅｎｅ ｈａｄｅｎｏｖｅｃ、本明細書ではＰＣＲＸ－２０１とも呼ばれる）を含む組成物、ならびに変性円板疾患（ＤＤＤ：degenerative disc disease）またはＤＤＤに関連する状態に罹患している対象におけるものを含むヒト椎間板の細胞を感染させるために、およびＩＬ－１Ｒａの産生および放出を増加させるために、それを使用する方法、ならびにＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を処置する方法を記載する。

【課題を解決するための手段】

【0004】

一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における変性円板疾患（ＤＤＤ）またはＤＤＤに関連する状態の処置のための医薬組成物であって、ヒトインターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質をコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系（アデノウイルスベースのベクターまたはヘルパー依存性アデノウイルスベクター）の、ある量、適宜、有効量を含み、ヒトＩＬ－１Ｒａ遺伝子の発現が、ヒトＩＬ－１Ｒａ遺伝子をコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に位置するＮＦ－ｋＢ誘導性プロモーターにより制御され、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列が、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％相同または同一である、医薬組成物を提供する。

【0005】

ＤＤＤに関連する状態は、腰痛、背筋緊張低下、背部柔軟性低下、もしくは血餅またはこれらの組合せであり得る。

【0006】

プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９９％相同または同一である。

【0007】

プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号７の核酸配列と同一である。

【0008】

アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列中のＩＬ－１Ｒａは、配列番号４の核酸を含み得る。

【0009】

配列番号４による核酸は、配列番号６と少なくとも９５％相同または同一であるアミノ酸配列のヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質を発現し得る。

【0010】

一部の実施形態では、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を処置するための、本明細書で開示される医薬組成物は、それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞への直接的なアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される。一部の実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物は、１つまたは複数の椎間板の、軟骨終板（ＣＥＰ：cartilaginous endplate）の細胞、高度に組織化された線維輪（ＡＦ）の細胞および中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）領域の細胞（髄核（ＮＰ）細胞）またはこれらの組合せへの、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される。それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板は、変性した円板もしくは変性していない円板または両方である。

【0011】

一部の実施形態では、本開示は、変性円板疾患（ＤＤＤ）に罹患している対象の１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染させる方法であって、ａ）それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞を、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系のある量、適宜有効量を含む医薬組成物に感染させる工程；およびｂ）１つまたは複数の椎間板の細胞においてＩＬ－１Ｒａを発現させる工程を含む方法も、提供する。

【0012】

一部の実施形態では、方法は、ｃ）（ｂ）におけるＩＬ－１Ｒａの発現後に対象の変性された椎間板におけるＤＤＤの処置または進行をモニターする工程をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、（ｄ）（ｃ）のモニターする工程によって、対象の椎間板の変性円板疾患が管理または処置されないことが示された場合、（ａ）について１つまたは複数の椎間板の細胞へのアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の同じ量の投与を継続する工程；または（ｅ）（ｃ）のモニターする工程によって、対象の椎間板の変性円板疾患が進行したことが示された場合、（ａ）について、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の量をさらに調整し、それを椎間板に投与する工程をさらに含む。

【0013】

上記態様のいずれか、または本明細書で開示される他の態様を、任意の他の態様と組み合わせることができる。

【0014】

本開示の実施形態は、以下の番号付き実施形態を含む：
１．それを必要とする対象における変性円板疾患（ＤＤＤ）またはＤＤＤに関連する状態の処置のための医薬組成物であって、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質をコードする核酸を含む、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む、医薬組成物。

【0015】

２．核酸が、左側および右側逆方向末端反復配列、アデノウイルスパッケージングシグナル、ならびに非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列をさらに含む、実施形態１の医薬組成物。

【0016】

３．核酸が、ＩＬ－１Ｒａ遺伝子の発現が炎症感受性プロモーターにより制御されるように、ＩＬ－１Ｒａタンパク質をコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に位置する炎症感受性プロモーターをさらに含み、炎症感受性プロモーターが、ＮＦ－κＢ、インターロイキン６（ＩＩ－６）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ－２）、補体因子３（Ｃ３）、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）、およびマクロファージ炎症性タンパク質－１ａ（ＭＩＰ－１ａ）、またはこれらのハイブリッドコンストラクトにより誘導可能なプロモーターからなる群から選択されてもよい、実施形態１または２の医薬組成物。

【0017】

４．核酸が、ＩＬ－１Ｒａ遺伝子の発現がＮＦ－ｋＢ誘導性プロモーターにより制御されるように、ＩＬ－１Ｒａタンパク質をコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に位置するＮＦ－ｋＢ誘導性プロモーターをさらに含む、実施形態１または３の医薬組成物。

【0018】

５．核酸が、配列番号７の核酸配列と、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるか、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１または４の医薬組成物。

【0019】

６．ＤＤＤに関連する状態が、腰痛、背筋緊張低下、背部柔軟性低下、血餅またはこれらの組合せである、実施形態１～５のいずれか１つの医薬組成物。

【0020】

７．ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸の配列が、配列番号４の核酸と、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるか、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１～６のいずれか１つの医薬組成物。

【0021】

８．ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸の配列が、配列番号６のアミノ酸配列と、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるか、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＩＬ－１Ｒａタンパク質をコードする核酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１～７のいずれか１つの医薬組成物。

【0022】

９．ＩＬ－１Ｒａタンパク質が、ヒトＩＬ－１Ｒａである、実施形態１～８のいずれか１つの医薬組成物。

【0023】

１０．アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系が、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えてタンパク質をコードする核酸をさらに含み、追加のタンパク質が、治療用タンパク質であってもよい、実施形態１～９のいずれか１つの医薬組成物。

【0024】

１１．それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞への直接的なアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される、実施形態１～１０のいずれか１つの医薬組成物。

【0025】

１２．それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板が、変性した円板もしくは変性していない円板または両方である、実施形態１～１１のいずれか１つの医薬組成物。

【0026】

１３．それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板が、変性した円板である、実施形態１２の医薬組成物。

【0027】

１４．１つまたは複数の椎間板の、軟骨終板（ＣＥＰ）の細胞、高度に組織化された線維輪（ＡＦ）の細胞および中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）領域の細胞（髄核（ＮＰ）細胞）またはこれらの組合せへの、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される、実施形態１～１３のいずれか１つの医薬組成物。

【0028】

１５．髄核（ＮＰ）細胞へのアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される、実施形態１４の医薬組成物。

【0029】

１６．細胞が、髄核（ＮＰ）細胞である、実施形態１４の医薬組成物。

【0030】

１７．アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染している変性した円板の細胞のみが、ＩＬ－１Ｒａを産生する、実施形態１～１６のいずれか１つの医薬組成物。

【0031】

１８．それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞が、少なくとも２週間、少なくとも１カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、または少なくとも１年間の期間にわたって、ＩＬ－１Ｒａを発現する、実施形態１～１７のいずれか１つの医薬組成物。

【0032】

１９．対象に投与されたときに対象における変性円板疾患（ＤＤＤ）および／またはＤＤＤに関連する状態を処置するのに有効なアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の量を含む、実施形態１～１８のいずれか１つの医薬組成物。

【0033】

２０．対象が、椎間関節症候群（ＦＪＳ：Facet Joint Syndrome）を有さない、実施形態１～１８のいずれか１つの医薬組成物。

【0034】

２１．対象が、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する、実施形態１～１８のいずれか１つの医薬組成物。

【0035】

２２．変性円板疾患（ＤＤＤ）またはＤＤＤに関連する状態に罹患している対象の１つまたは複数の椎間板の細胞においてＩＬ－ＩＲＡを発現させる方法であって、
ａ）それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞を実施形態１～２１のいずれか１つの医薬組成物に感染させる工程；および
ｂ）１つまたは複数の椎間板の細胞においてＩＬ－１Ｒａを発現させる工程
を含む方法。

【0036】

２３．アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系が、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えてタンパク質をコードする核酸をさらに含み、追加のタンパク質が、治療用タンパク質であってもよく、方法が、１つまたは複数の椎間板の細胞において追加のタンパク質を発現させることをさらに含む、実施形態２２の方法。

【0037】

２４．１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に１回感染させる、実施形態２２または２３による方法。

【0038】

２５．１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる、実施形態２２または２３による方法。

【0039】

２６．１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、各感染が、アデノウイルスベースのベクターの異なる数のゲノムコピーを含む、実施形態２５による方法。

【0040】

２７．１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、各感染が、アデノウイルスベースのベクターの同じ数のゲノムコピーを含む、実施形態２５による方法。

【0041】

２８．１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、各感染が、対象の同じ椎間板において行われる、実施形態２５～２７のいずれか１つによる方法。

【0042】

２９．１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、あらゆる第２および後続の感染が、前に感染を行った椎間板とは異なる対象の椎間板において行われる、実施形態２５～２７のいずれか１つによる方法。

【0043】

３０．１つまたは複数の椎間板の細胞を感染させる工程が、医薬組成物を１つまたは複数の椎間板の、軟骨終板（ＣＥＰ）領域、高度に組織化された線維輪（ＡＦ）領域もしくは中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）領域（髄核（ＮＰ）細胞）またはこれらの組合せに注射することを含む、実施形態２２～２９のいずれか１つによる方法。

【0044】

３１．１つまたは複数の椎間板の細胞を感染させる工程が、医薬組成物を１つまたは複数の椎間板の髄核（ＮＰ）領域に注射することを含む、実施形態３０の方法。

【0045】

３２．対象における変性円板疾患（ＤＤＤ）および／またはＤＤＤに関連する状態を処置する、実施形態２２～３１のいずれか１つの方法。

【0046】

３３．ｃ）（ｂ）におけるＩＬ－１Ｒａの発現後に対象の変性された椎間板におけるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行をモニターする工程をさらに含む、実施形態２２～３２のいずれか１つの方法。

【0047】

３４．ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行をモニターする工程が、患者報告疼痛および／または機能測定からのスコアを決定することによって行われる、実施形態３３の方法。

【0048】

３５．患者報告疼痛からスコアを決定することが、視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）を使用して行われる、実施形態３４の方法。

【0049】

３６．対象におけるＶＡＳスコアが、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後のほうが低い、実施形態２２から３５のいずれか１つの方法。

【0050】

３７．患者－機能測定からスコアを決定することが、オスヴェストリー能力障害指数（ＯＤＩ：Oswestry disability index）を使用して行われる、実施形態３４～３６のいずれか１つの方法。

【0051】

３８．対象におけるＶＡＳスコアが、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後のほうが低い、実施形態２２～３７のいずれか１つの方法。

【0052】

３９．ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行をモニターする工程が、ＮＧＦ、ＮＴ－３、ＶＥＧＦ、サブスタンスＰ、サイトカイン、アグリカン、ＩＩ型コラーゲン、およびこれらの組合せからなる群から選択される対象におけるマーカーのレベルを決定することを含む、実施形態３３の方法。

【0053】

４０．サイトカインが、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ α、ＭＭＰ ３、ＭＭＰ １３、ＡＤＡＭＴＳ ４、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態３９の方法。

【0054】

４１．以下のうちの１つまたは複数：
（ａ）ＮＧＦ、ＮＴ－３、ＶＥＧＦ、サブスタンスＰ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ α、ＭＭＰ ３、ＭＭＰ １３もしくはＡＤＡＭＴＳ ４またはこれらの組合せ、のうちの１つまたは複数のレベルの低下または不変；
（ｂ）アグリカンもしくはＩＩ型コラーゲンまたはこれらの組合せのレベルの上昇；または
（ｃ）両方
が、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後に１つまたは複数の椎間板において生じる、実施形態２２～４０のいずれか１つの方法。

【0055】

４２．アグリカンのレベルが、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後に１つまたは複数の椎間板において上昇する、実施形態２２～４１のいずれか１つの方法。

【0056】

４３．ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行をモニターする工程が、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後に１つまたは複数の椎間板についてのヒト椎間板変性症の組織病理スコアリングシステムに基づくスコアの変化を決定することにより行われる、実施形態３３の方法。

【0057】

４４．１つまたは複数の椎間板についてのヒト椎間板変性症の組織病理スコアリングシステムに基づくスコアの減少が、医薬組成物による対象の１つまたは複数の椎間板の細胞の感染後に生じる、実施形態２２～４３のいずれか１つの方法。

【0058】

４５．（ｄ）（ｃ）のモニターする工程によって、対象の椎間板の変性円板疾患が管理または処置されないことが示された場合、（ａ）について１つまたは複数の椎間板の細胞へのアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の同じ量の投与を継続する工程；または
（ｅ）（ｃ）のモニターする工程によって、対象の椎間板の変性円板疾患が進行したことが示された場合、（ａ）について、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の量をさらに調整し、それを必要とする対象における１つまたは複数の椎間板の細胞に投与する工程
をさらに含む、実施形態３３～４４のいずれか１つの方法。

【0059】

４６．対象の椎間板へのコルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬の投与をさらに含む、実施形態２２～４５のいずれか１つの方法。

【0060】

４７．コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬がアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と同時に投与されるように、コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬が、単一の医薬製剤中にある、実施形態４６の方法。

【0061】

４８．コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬が、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の前および／または後に投与されるように、コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬が、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と単一の医薬製剤で投与されない、実施形態４６の方法。

【0062】

４９．アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の投与後に対象の椎間板への液体（fluid）の投与をさらに含み、適宜、液体の量が、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌ、６０μｌ、６５μｌ、７０μｌ、７５μｌ、８０μｌ、８５μｌ、９０μｌ、９５μｌ、１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ、２５０μｌ、３００μｌ、３５０μｌ、４００μｌ、４５０μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、１０００μｌであるか、約２５μｌ、約３０μｌ、約３５μｌ、約４０μｌ、約４５μｌ、約５０μｌ、約５５μｌ、約６０μｌ、約６５μｌ、約７０μｌ、約７５μｌ、約８０μｌ、約８５μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、約１００μｌ、約１５０μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、約３５０μｌ、約４００μｌ、約４５０μｌ、約５００μｌ、約６００μｌ、約７００μｌ、約８００μｌ、約９００μｌ、約１０００μｌであるか、２５μｌ未満、３０μｌ未満、３５μｌ未満、４０μｌ未満、４５μｌ未満、５０μｌ未満、５５μｌ未満、６０μｌ未満、６５μｌ未満、７０μｌ未満、７５μｌ未満、８０μｌ未満、８５μｌ未満、９０μｌ未満、９５μｌ未満、１００μｌ未満、１５０μｌ未満、２００μｌ未満、２５０μｌ未満、３００μｌ未満、３５０μｌ未満、４００μｌ未満、４５０μｌ未満、５００μｌ未満、６００μｌ未満、７００μｌ未満、８００μｌ未満、９００μｌ未満、１０００μｌ未満であるか、約２５μｌ未満、約３０μｌ未満、約３５μｌ未満、約４０μｌ未満、約４５μｌ未満、約５０μｌ未満、約５５μｌ未満、約６０μｌ未満、約６５μｌ未満、約７０μｌ未満、約７５μｌ未満、約８０μｌ未満、約８５μｌ未満、約９０μｌ未満、約９５μｌ未満、約１００μｌ未満、約１５０μｌ未満、約２００μｌ未満、約２５０μｌ未満、約３００μｌ未満、約３５０μｌ未満、約４００μｌ未満、約４５０μｌ未満、約５００μｌ未満、約６００μｌ未満、約７００μｌ未満、約８００μｌ未満、約９００μｌ未満、約１０００μｌ未満であるか、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌ、６０μｌ、６５μｌ、７０μｌ、７５μｌ、８０μｌ、８５μｌ、９０μｌ、９５μｌ、１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ、２５０μｌ、３００μｌ、３５０μｌ、４００μｌ、４５０μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、１０００μｌを超えるか、約２５μｌ、約３０μｌ、約３５μｌ、約４０μｌ、約４５μｌ、約５０μｌ、約５５μｌ、約６０μｌ、約６５μｌ、約７０μｌ、約７５μｌ、約８０μｌ、約８５μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、約１００μｌ、約１５０μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、約３５０μｌ、約４００μｌ、約４５０μｌ、約５００μｌ、約６００μｌ、約７００μｌ、約８００μｌ、約９００μｌ、約１０００μｌを超えるか、または２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌ、６０μｌ、６５μｌ、７０μｌ、７５μｌ、８０μｌ、８５μｌ、９０μｌ、９５μｌ、１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ、２５０μｌ、３００μｌ、３５０μｌ、４００μｌ、４５０μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、１０００μｌのいずれか２つにより定義される範囲、適宜、２５～１０００μｌ、２５～５００μｌ、２５～２００μｌ、５０～１５０μｌ、５００～１０００μｌ、２００～８００μｌ、２００～６００μｌ、４００～８００μｌ、もしくは６００～８００μｌである、実施形態２２～４８のいずれか１つの方法。

【0063】

５０．液体が、食塩水である、実施形態４９の方法。

【0064】

５１．さらなる投与が、コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬および／または液体の円板内注射を含む、実施形態４６～５０のいずれか１つの方法。

【0065】

５２．対象が、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有さない、実施形態２２～５１のいずれか１つの方法。

【0066】

５３．対象が、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する、実施形態２２～５１のいずれか１つの方法。

【0067】

５４．医薬組成物の円板内注射を含む、実施形態２２～５３のいずれか１つの方法。

【0068】

５５．円板内注射が、中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）領域へのものである、実施形態５１または５４の方法。

【0069】

５６．医薬組成物の腱内注射も、筋肉内注射も、関節内注射も、肩峰下注射も含まない、実施形態２２～５５のいずれか１つの方法。

【0070】

５７．医薬組成物中のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の濃度が、１×１０^８～５×１０^１１ＶＰ／ｍｌ、２×１０^８～２×１０^１１ＶＰ／ｍｌ、２×１０^９～２×１０^１１ＶＰ／ｍｌ、１×１０^８～２×１０^９ＶＰ／ｍｌ、もしくは１×１０^９ＶＰ／ｍｌ未満であるか、または約１×１０^８～５×１０^１１ＶＰ／ｍｌ、２×１０^８～２×１０^１１ＶＰ／ｍｌ、２×１０^９～２×１０^１１ＶＰ／ｍｌ、１×１０^８～２×１０^９ＶＰ／ｍｌ、もしくは約１×１０^９ＶＰ／ｍｌ未満である、実施形態１～５６のいずれか１つの組成物または方法。

【0071】

５８．医薬組成物中のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の濃度が、１×１０^８～５×１０^１１ＧＣ／ｍｌ、２×１０^８～２×１０^１１ＧＣ／ｍｌ、２×１０^９～２×１０^１１ＧＣ／ｍｌ、１×１０^８～２×１０^９ＧＣ／ｍｌ、もしくは１×１０^９ＧＣ／ｍｌ未満であるか、または約前記範囲もしくは値である、実施形態１～５６のいずれか１つの組成物または方法。

【0072】

５９．椎間板に投与される医薬組成物の単一用量が、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌである量、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌである量、もしくは０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌ未満である量、または前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、適宜、０．１ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～２ｍｌ、１ｍｌ～５ｍｌ、２ｍｌ～５ｍｌ、４ｍｌ～５ｍｌ、もしくは３ｍｌ～５ｍｌである量である、実施形態１～５８のいずれか１つの組成物または方法。

【0073】

６０．感染細胞が、ＮＰ細胞を含む、実施形態１７～５９のいずれか１つの組成物または方法。

【0074】

６１．アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系が、ＦＸ２０１／ＰＣＲＸ－２０１を含むか、からなるか、またはから本質的になる、前記実施形態のいずれか１つの組成物または方法。

【0075】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本開示を踏まえて読まれるとき、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本開示では、単数形は、文脈による別段の明確な定めがない限り、複数形も含み；例として、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、単数または複数であると解され、用語「または」は、両立的なものであると解される。例として、「要素」は、１つまたは複数の要素を意味する。本明細書全体を通して、語「含む（comprising）」、または語尾変化形、例えば、「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」は、述べられている要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の包含を含意するが、他のいかなる要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の除外も含意しないと、解されるものとする。約は、述べられている値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と解され得る。文脈から別様に明らかである場合を除き、本明細書で提供される全ての数値は、用語「約」により修飾されている。

【0076】

本明細書に記載の用語「変性円板疾患」は、用語「椎間板性腰痛症」、「椎間板内断裂（internal disc disruption）」または椎間板変性症」または「椎間板変性疾患（degenerated intervertebral disc disease）」と同義で使用される。

【0077】

本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本開示の実施または試験の際に使用することができるが、好適な方法および材料が下で説明される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それら全体が、および本明細書で論じられる特定の情報について、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用される参考文献は、請求項に関わる開示に対する先行技術であること認めるものではない。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定することを意図したものではない。本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0078】

【図1】図１は、ｈｕｍａｎｔａｋｉｎｏｇｅｎｅ ｈａｄｅｎｏｖｅｃ（ＦＸ２０１、別名ＰＣＲＸ－２０１）のゲノムマップを描示する。ＩＴＲ＝逆方向末端反復配列（５’における１～１０３ｂｐ；３’における２９，１５８～２９，２６０ｂｐ）、Ψ＝パッケージングシグナル（２４０～３７５ｂｐ）、ＨＰＲＴスタッファー＝ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（４６３～１６，５１８ｂｐ）、ヒトコスミドインサート＝ヒトコスミド（１６，５３２～２７，６３７ｂｐ）、ＳＶ４０ポリＡ＝サルウイルス４０ポリＡ（２７，７５０～２８，０２０ｂｐ）、ｈｕＩＬ－１Ｒａ＝ヒトインターロイキン－１受容体アンタゴニスト、目的のゲノム（２８，０３３～２８，５６６ｂｐ）、ＮＦ－ｋＢ５－ＥＬＡＭプロモーター＝ＮΦ－κＢ ινδυχιβλεプロモーター（２８，５８１～２８，８４２ｂｐ）。

【図2】図２は、本開示のヘルパー依存性アデノウイルスベクターの実施形態の基礎遺伝子マップを描示する。ベクター骨格は、左側および右側逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、アデノウイルスパッケージングシグナル（Ψ）、ならびに非コード、非ウイルス性スタッファー配列（ＩＴＲ間の標識のない配列を維持する）からなる。ヒトＩＬ－１Ｒａ、ウマＩＬ－１Ｒａ（ＧＱ－２０１）またはマウスＩＬ－１ＲａのｃＤＮＡが、使用されるアデノウイルスベースのベクターのウイルス性左側および右側ＩＴＲの間にクローニングされる。ＩＬ－１－Ｒａの遺伝子の発現は、炎症感受性ＮＦ－ＫＢ５－ＥＬＡＭプロモーターにより支配される。

【図3】図３Ａ～３Ｄは、ＰＣＲＸ－２０１に様々なＭＯＩで感染させたヒトＮＰ細胞の感染後２４時間（図３Ａ）、４８時間（図３Ｂ）、７２時間（図３Ｃ）および１週間（図３Ｄ）での代謝活性の実施形態を描示する（^＊＝Ｐ＜０．０５）。

【図4】図４は、アルジネート培養で２１日後にピコグリーンＤＮＡ定量化キットを使用して測定したアルジネートビーズ培養による総ＤＮＡ含有量の実施形態を描示する（＊＝Ｐ＜０．０５）。

【図5】図５Ａ～５Ｂは、ＰＣＲＸ－２０１（別名ＦＸ２０１）に感染させた単層ヒトＮＰ細胞によるＩＬ－１Ｒａ産生の実施形態を描示する。２日、±１日の１０ｎｇのＩＬ－１βでの刺激後の、単層培養したヒトＮＰ細胞（患者ｎ＝７名からの）の細胞培養上清におけるＩＬ－１Ｒａ産生（図５Ａ）、および５日±４日の１０ｎｇ ＩＬ－１β刺激後の、細胞培養上清におけるＩＬ－１Ｒａ産生（図５Ｂ）が示されている。ｘ軸は、示されているように、ＰＣＲＸ－２０１およびＩｌ－１βを加えたＰＣＲＸ－２０１のＭＯＩである異なる刺激を描示し、ｙ軸は、ＥＬＩＳＡにより決定された、細胞培養上清中のＩＬ－１Ｒａのｐｇ／ｍｌでの濃度を描示する。試験された７名の患者の各々からのＮＰ細胞により産生されたＩＬ－１Ｒａの濃度が、示されているようにドットで表されている。特定の刺激群におけるＮＰ細胞により産生されたＩＬ－１Ｒａの平均レベルも示されている。異なる刺激群間のタンパク質濃度の差の有意性が示されている（^＊）。

【図6】図６Ａ～６Ｄは、ＰＣＲＸ－２０１に感染させた３ＤヒトＮＰ細胞によるＩＬ－１Ｒａ産生の実施形態を描示する。細胞培養上清におけるＰＣＲＸ－２０１に感染させた（０、７５０および３０００のＭＯＩ）３Ｄ培養ヒトＮＰ細胞（患者ｎ＝６名からの）による、感染の２日後（図６Ａ）、感染の７日後（図６Ｂ）、感染の１４日後（図６Ｃ）、および感染の２１日後±１０ｎｇのＩＬ－１β刺激による刺激の７日後（図６Ｄ）のＩＬ－１Ｒａの産生が、示されている。ｘ軸は、示されているように、ＰＣＲＸ－２０１およびＩｌ－１βを加えたＰＣＲＸ－２０１のＭＯＩである異なる刺激を描示し、ｙ軸は、ＥＬＩＳＡにより決定された、細胞培養上清中のタンパク質のｐｇ／ｍｌでの濃度を描示する。試験された６名の患者の各々からのＮＰ細胞により産生されたＩＬ－１Ｒａの濃度が、示されているようにドットで表されている。特定の刺激群におけるＮＰ細胞により産生されたＩＬ－１Ｒａの平均濃度も示されている。異なる刺激群間のタンパク質濃度の差の有意性が示されている（^＊）。

【図7】図７Ａ～７Ｈは、ＰＣＲＸ－２０１に感染させた変性したＮＰ細胞からのＩＬ－１Ｒａ産生の長期維持の実施形態を描示する。変性した円板組織から、非感染対照細胞およびＰＣＲＸ－２０１にＭＯＩ ３０００で感染させた細胞から、単離されたＮＰ細胞によるＩＬ－１Ｒａ産生。４８時間感染させた後に３Ｄアルジネートビーズにおいて２日間（図７Ａ）、１週間（図７Ｂ）、２週間（図７Ｃ）、３週間（図７Ｄ）、４週間（図７Ｅ）、６週間（図７Ｆ）、８週間（図７Ｇ）、１０週間（図７Ｈ）培養したＮＰ細胞（^＊＝Ｐ＜０．０５）。

【図8】図８は、ＰＣＲＸ－２０１によるＭＯＩ ７５０または３０００での４８時間の感染後に変性した円板から単離され、１４日間アルジネート中で培養された後にさらに１週間、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ－１βで刺激されたＮＰ細胞における、１８ｓおよび未処置対照に正規化されたＮＧＦについての相対遺伝子発現の実施形態を描示する。

【図9】図９Ａ～９Ｄは、ＰＣＲＸ－２０１に感染させた３ＤヒトＮＰ細胞によるＶＥＧＦ産生の実施形態を描示する。細胞培養上清におけるＰＣＲＸ－２０１に感染させた（０、７５０および３０００のＭＯＩ）３Ｄ培養ヒトＮＰ細胞（患者ｎ＝６名からの）による、感染の２日後（図９Ａ）、感染の７日後（図９Ｂ）、感染の１４日後（図９Ｃ）、および感染の２１日後±１０ｎｇのＩＬ－１β刺激による刺激の７日後（図９Ｄ）のＶＥＧＦの産生が、示されている。ｘ軸は、示されているように、ＰＣＲＸ－２０１およびＩＬ－１βを加えたＰＣＲＸ－２０１のＭＯＩである異なる刺激を描示し、ｙ軸は、ＥＬＩＳＡにより決定された、細胞培養上清中のタンパク質のｐｇ／ｍｌでの濃度を描示する。試験された６名の患者の各々からのＮＰ細胞により産生されたＶＥＧＦの濃度が、示されているようにドットで表されている。特定の刺激群におけるＮＰ細胞により産生されたＶＥＧＦの平均レベルも示されている。異なる刺激群間のタンパク質濃度の差の有意性が示されている（^＊）。

【図10】図１０Ａ～１０Ｄは、ＰＣＲＸ－２０１に感染させた３ＤヒトＮＰ細胞によるＩＬ－１β産生の実施形態を描示する。細胞培養上清におけるＰＣＲＸ－２０１に感染させた（０、７５０および３０００のＭＯＩ）３Ｄ培養ヒトＮＰ細胞（患者ｎ＝６名からの）による、感染の２日後（図１０Ａ）、感染の７日後（図１０Ｂ）、感染の１４日後（図１０Ｃ）、および感染の２１日後±１０ｎｇのＩＬ－１β刺激による刺激の７日後（図１０Ｄ）のＩＬ－１βの産生が、示されている。ｘ軸は、示されているように、ＰＣＲＸ－２０１およびＩＬ－１βを加えたＰＣＲＸ－２０１のＭＯＩである異なる刺激を描示し、ｙ軸は、ＥＬＩＳＡにより決定された、細胞培養上清中のタンパク質のｐｇ／ｍｌでの濃度を描示する。試験された６名の患者の各々からのＮＰ細胞により産生されたＩＬ－１βの濃度が、示されているようにドットで表されている。特定の刺激群におけるＮＰ細胞により産生されたＩＬ－１βの平均レベルも示されている。異なる刺激群間のタンパク質濃度の差の有意性が示されている（^＊）。

【図11】図１１Ａ～１１Ｃは、ＰＣＲＸ－２０１に感染させた３ＤヒトＮＰ細胞によるＩＬ－６産生の実施形態を描示する。細胞培養上清におけるＰＣＲＸ－２０１に感染させた（０、７５０および３０００のＭＯＩ）３Ｄ培養ヒトＮＰ細胞（患者ｎ＝６名からの）による、感染の７日後（図１１Ａ）、感染の１４日後（図１１Ｂ）、および感染の２１日後±１０ｎｇのＩＬ－１β刺激による刺激の７日後（図１１Ｃ）のＩＬ－６の産生が、示されている。ｘ軸は、示されているように、ＰＣＲＸ－２０１およびＩＬ－１βを加えたＰＣＲＸ－２０１のＭＯＩである異なる刺激を描示し、ｙ軸は、ＥＬＩＳＡにより決定された、細胞培養上清中のタンパク質のｐｇ／ｍｌでの濃度を描示する。試験された６名の患者の各々からのＮＰ細胞により産生されたＩＬ－６の濃度が、示されているようにドットで表されている。特定の刺激群におけるＮＰ細胞により産生されたＩＬ－６の平均レベルも示されている。異なる刺激群間のタンパク質濃度の差の有意性が示されている（^＊）。 図１１Ｄ～１１Ｆは、ＰＣＲＸ－２０１に感染させた３ＤヒトＮＰ細胞によるＩＬ－８産生の実施形態を描示する。細胞培養上清におけるＰＣＲＸ－２０１に感染させた（０、７５０および３０００のＭＯＩ）３Ｄ培養ヒトＮＰ細胞（患者ｎ＝６名からの）による、感染の７日後（図１１Ｄ）、感染の１４日後（図１１Ｅ）、および感染の２１日後±１０ｎｇのＩＬ－１β刺激による刺激の７日後（図１１Ｆ）のＩＬ－８の産生が、示されている。ｘ軸は、示されているように、ＰＣＲＸ－２０１およびＩＬ－１βを加えたＰＣＲＸ－２０１のＭＯＩである異なる刺激を描示し、ｙ軸は、ＥＬＩＳＡにより決定された、細胞培養上清中のＩＬ－８のｐｇ／ｍｌでの濃度を描示する。試験された６名の患者の各々からのＮＰ細胞により産生されたＩＬ－８の濃度が、示されているようにドットで表されている。特定の刺激群におけるＮＰ細胞により産生されたＩＬ－８の平均レベルも示されている。異なる刺激群間のタンパク質濃度の差の有意性が示されている（^＊）。

【図12】図１２Ａは、ＰＣＲＸ－２０１に感染させた３ＤヒトＮＰ細胞によるＭＭＰ３産生の実施形態を描示する。細胞培養上清におけるＰＣＲＸ－２０１に感染させた（０、７５０および３０００のＭＯＩ）３Ｄ培養ヒトＮＰ細胞（患者ｎ＝６名からの）による、感染の２１日後±１０ｎｇのＩＬ－１β刺激による刺激の７日後のＭＭＰ３の産生が、示されている（図１２Ａ）。ｘ軸は、示されているように、ＰＣＲＸ－２０１およびＩＬ－１βを加えたＰＣＲＸ－２０１のＭＯＩである異なる刺激を描示し、ｙ軸は、ＥＬＩＳＡにより決定された、細胞培養上清中のＭＭＰ３のｐｇ／ｍｌでの濃度を描示する。試験された６名の患者の各々からのＮＰ細胞により産生されたＭＭＰ３の濃度が、示されているようにドットで表されている。特定の刺激群におけるＮＰ細胞により産生されたＭＭＰ３の平均レベルも示されている。異なる刺激群間のタンパク質濃度の差の有意性が示されている（^＊）。 図１２Ｂは、ＰＣＲＸ－２０１に感染させた３ＤヒトＮＰ細胞によるＡＤＡＭＴＳ４産生の実施形態を描示する。細胞培養上清におけるＰＣＲＸ－２０１に感染させた（０、７５０および３０００のＭＯＩ）３Ｄ培養ヒトＮＰ細胞（患者ｎ＝６名からの）による、感染の２１日後±１０ｎｇのＩＬ－１β刺激による刺激の７日後のＡＤＡＭＴＳ４の産生が、示されている（図１２Ｂ）。ｘ軸は、示されているように、ＰＣＲＸ－２０１およびＩＬ－１βを加えたＰＣＲＸ－２０１のＭＯＩである異なる刺激を描示し、ｙ軸は、ＥＬＩＳＡにより決定された、細胞培養上清中のタンパク質のｐｇ／ｍｌでの濃度を描示する。試験された６名の患者の各々からのＮＰ細胞により産生されたＡＤＡＭＴＳ４の濃度が、示されているようにドットで表されている。特定の刺激群におけるＮＰ細胞により産生されたＡＤＡＭＴＳ４の平均レベルも示されている。異なる刺激群間のタンパク質濃度の差の有意性が示されている（^＊）。

【図13】図１３Ａ～１３Ｅは、ＰＣＲＸ－２０１感染細胞のパラ分泌効果の実施形態を描示する。処置された変性した円板から得られたヒトＮＰ細胞の処置後の、＋／－ＰＣＲＸ－２０１感染細胞からの患者適合馴化培地からの馴化培地の、ＩＬ－１Ｒａ（図１３Ａ）、ＩＬ－１β（図１３Ｂ）、ＩＬ－６（図１３Ｃ）、ＭＭＰ ３（図１３Ｄ）、ＡＤＡＭＴＳ４（図１３Ｅ）についてのタンパク質産生（^＊＝Ｐ＜０．０５）。

【図14】図１４は、半制限培養系（semi-constrained culture system）におけるヒトＮＰ組織外植片の実施形態を描示する。

【図15】図１５Ａ～１５Ｂは、注射していない対照とともに、約ＭＯＩ ３０００でＰＣＲＸ－２０１を注射した変性ＩＶＤ試料からのヒトＮＰ外植片におけるＩＬ－１Ｒａについての免疫陽性染色による、培地に放出されたＩＬ－１Ｒａタンパク質濃度の実施形態（図１５Ａ）および細胞の数の実施形態（図１５Ｂ）を描示する（^＊＝Ｐ＜０．０５）。

【図16】図１６Ａ～１６Ｇは、注射していない対照とともに、約ＭＯＩ ３０００でＰＣＲＸ－２０１を注射した変性したＩＶＤ試料からのヒトＮＰ外植片からの培地の放出されたＶＥＧＦ（図１６Ａ）、ＩＬ－１β（図１６Ｂ）、ＩＬ－６（図１６Ｃ）、ＭＭＰ ３（図１６Ｄ）、ＡＤＡＭＴｓ４（図１６Ｅ）、ＩＩ型コラーゲン（図１６Ｆ）およびアグリカン（図１６Ｇ）の濃度の実施形態を描示する（^＊＝Ｐ＜０．０５）。

【図17】図１７Ａ～１７Ｆは、注射していない対照とともに、約ＭＯＩ ３０００でＰＣＲＸ－２０１を注射した変性したＩＶＤ試料からのヒトＮＰ外植片におけるＶＥＧＦ（図１７Ａ）、ＮＧＦ（図１７Ｂ）、ＩＬ－１β（図１７Ｃ）、ＭＭＰ ３（図１７Ｄ）、ＡＤＡＭＴｓ４（図１７Ｅ）およびＩＩ型コラーゲン（図１７Ｆ）についての免疫陽性パーセンテージの実施形態を描示する（^＊＝Ｐ＜０．０５）。

【発明を実施するための形態】

【0079】

本開示は、変性円板疾患（ＤＤＤ）またはＤＤＤに関連する状態に罹患している対象のものを含む、椎間板の細胞における生物活性組換えインターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）の長期発現を可能にする改善された送達および発現系についての組成物を提供する。一部の実施形態では、これらの組成物は、変性円板疾患（ＤＤＤ）またはＤＤＤに関連する状態の処置に使用される。ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の患者の処置のために開発中である、椎間板への投与のための新規ＩＬ－１Ｒａ遺伝子治療（ＦＸ２０１、ｈｕｍａｎｔａｋｉｎｏｇｅｎｅ ｈａｄｅｎｏｖｅｃ、これはＰＣＲＸ－２０１とも呼ばれる）が、本明細書で開示される。ＦＸ２０１（ｈｕｍａｎｔａｋｉｎｏｇｅｎｅ ｈａｄｅｎｏｖｅｃ、ＰＣＲＸ－２０１）は、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を有する患者の椎間板への投与のための、核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）誘導性プロモーターの支配下にあるヒトＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列を送達するヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）である。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えて１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、追加のタンパク質は、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を処置するための治療用タンパク質である。

【0080】

本明細書に記載の用語「変性円板疾患（ＤＤＤ）またはＤＤＤに関連する状態の処置」または「ＤＤＤの処置」は、本開示を踏まえて読まれる場合、その通常かつ通例の意味を有し、ＤＤＤがそれに罹患する対象の１つまたは複数の椎間板において発症または発生するのを予防することを包含するのではなく、既存のＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態がそれに罹患している対象の１つまたは複数の椎間板において進行するのを阻止または抑制することを包含する。一部の態様では、「変性円板疾患（ＤＤＤ）またはＤＤＤに関連する状態の処置」または「ＤＤＤの処置」は、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態から、それに罹患している対象の１つまたは複数の椎間板を好転または回復させることも包含する。用語「予防」は、本開示を踏まえて読まれる場合、その通常かつ通例の意味を有し、当技術分野において公知であるように、それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板におけるＤＤＤの発生またはＤＤＤに関連することが公知の特徴／状態の発生を予防することまたは停止させることを包含し、この場合、対象における１つまたは複数の椎間板は、ＤＤＤ、またはＤＤＤに関連することが公知の特徴／状態を、まだ提示していない。

【0081】

本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト）インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質、例えばＦＸ２０１をコードする核酸配列を含む、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系（アデノウイルスベースのベクター）の椎間板注射（すなわち、円板内注射）のための組成物を提供する。椎間板注射後、アデノウイルス送達および発現系は、炎症に応答してＩＬ－１Ｒａを局所的に産生するように椎間板内の細胞を感染させる。一部の実施形態では、アデノウイルス送達および発現系（例えば、ＦＸ２０１）は、ＩＬ－１Ｒａ（例えば、ヒトＩＬ－１Ｒａ）の遺伝子コード配列を運ぶように操作された、ウイルスコード配列を有さない非複製、非組込みＨＤＡｄベクターである。一部の実施形態では、アデノウイルスパッケージングシグナルおよび逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）のみが、これらは製造に必要とされるので、アデノウイルスゲノム内に残存する。一部の実施形態では、転写は、炎症感受性ＮＦ－κＢ誘導性プロモーターにより支配され、このプロモーターが、炎症環境に応答してＩＬ－１Ｒａの発現を駆動する。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えて１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、追加のタンパク質は、ＤＤＤまたはａまたはＤＤＤに関連する状態を処置するための治療用タンパク質である。

【0082】

一部の実施形態では、アデノウイルス送達および発現系は、単一用量として椎間板注射（円板内）により投与される。期待される臨床的利点は、疼痛の軽減と機能の改善または回復の両方を含む持続的な症状軽減、およびＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を有する患者における基礎疾患の経過の有益な修飾である。有利なことに、一部の実施形態では、本開示のアデノウイルス送達および発現系は、椎間板に投与されたとき、椎間板の細胞内に特異的に位置する。したがって、一部の実施形態では、ＩＬ－１Ｒａ濃度は、本開示のベクターが注射された椎間板において最も高く、その上、いずれの他の臓器にも有意な副作用が存在しない。

【0083】

一部の実施形態では、本明細書で開示される組成物のアデノウイルス送達および発現系は、ＰＣＴ出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５１６４２（公開番号：ＷＯ２０２１／０５５８６０）において開示されているものと同じであり、この参考特許文献の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書で開示される組成物のアデノウイルス送達および発現系は、ＰＣＴ出願番号：ＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０００１９８（公開番号：ＷＯ２０１３／１１４１９９）において開示されているものと同じであり、この参考特許文献の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。アデノウイルス送達および発現系の実施形態の特性は、下に記載される。

【0084】

ベクター骨格：一部の実施形態では、（例えば、ＦＸ２０１）アデノウイルス送達および発現系は、非複製、非組込みＨＤＡｄベクターである。ゲノム成分は、サイズおおよそ２９．３キロベース（ｋｂ）の二本鎖線状ＤＮＡで構成されている。一部の実施形態では、（例えば、ＦＸ２０１）アデノウイルス送達および発現系ゲノムは、その製造を可能にするための増幅およびパッケージングに必要な最少アデノウイルスエレメント：左側および右側逆方向末端反復配列（本明細書では以降、それぞれ「Ｌ ＩＴＲ」および「Ｒ ＩＴＲ」と呼ばれる）ならびにパッケージングシグナル（Ψ）を含有する。一部の実施形態では、おおよそ１．１ｋｂのアデノウイルス送達および発現系（例えば、ＦＸ２０１）ゲノムは、ゲノムの右末端に逆（右から左）方向で挿入されている、ヒトＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、Ｒ ＩＴＲの直前に配置されているプロモーターとで構成されている。一部の実施形態では、プロモーターは、炎症性サイトカインに応答する、ヒトＥＬＡＭ遺伝子の近位プロモーター領域に融合された５つの種保存ＮＦ－κＢ結合モチーフ反復配列である（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ １９９４）。一部の実施形態では、おおよそ２７ｋｂのアデノウイルス送達および発現系（例えば、ＦＸ２０１）ゲノムは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）およびヒトコスミドインサートで構成されている非コードスタッファー配列からなり、このスタッファー配列は、各ウイルス粒子（ＶＰ）へのベクターゲノムの効率的なパッケージングを可能にするサイズにゲノムを拡大するために挿入される。アデノウイルス送達および発現系、ＦＸ２０１の実施形態についてのゲノムマップは、図１に提示される。

【0085】

目的のゲノム：一部の実施形態では、（例えば、ＦＸ２０１）アデノウイルス送達および発現系ゲノムは、ヒトＩＬ－１Ｒａの５３４塩基対（ｂｐ）配列を含有し、この配列は、ＮＦ－κＢ誘導性プロモーターの２６２ｂｐ配列により制御される。

【0086】

ＦＸ２０１の、および本開示のＨＤＡｄベクターの実施形態の遺伝子マップ（図２）が、本明細書で開示される。本開示のＨｄＡｄベクターは、ＩＴＲおよびアデノウイルスパッケージングシグナルばかりでなく、配列番号１または４のいずれか一方によるＩＬ－１Ｒａ ｃＤＮＡの上流に炎症感受性ＮＦ－κＢ－ＥＬＡＭプロモーターも含有し得る。ＨＤＡｄ－ｍＩＬ－１Ｒａ、ＧＱ－２０１、およびＨＤＡｄ－ヒトＩＬ－１Ｒａの完全ベクター配列は、それぞれ、配列番号２、３および７で示される。３つのベクター間の唯一の相違は、ＧＱ－２０１がｍＩＬ－１Ｒａのウマ変異体を有し、ＨＤＡｄ－ｍＩＬ－ＲａがマウスＩＬ－１Ｒａ変異体を有し、ＨＤＡｄ－ｈｕＩＬ－１ＲａがヒトＩＬ－１Ｒａを有することである。一例として、配列番号３による核酸配列のＨＤＡｄ－ｍＩＬ－１Ｒａは、配列番号１によるマウスＩＬ－１Ｒａをコードする核酸を含み得る。一例として、配列番号７による核酸配列のＨＤＡｄ－ヒトＩＬ－１Ｒａは、配列番号４によるヒトＩＬ－１Ｒａをコードする核酸を含み得る。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えて１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、追加のタンパク質は、ＤＤＤまたはａまたはＤＤＤに関連する状態を処置するための治療用タンパク質である。

【0087】

一部の実施形態では、本明細書で開示されるベクターは、次の戦略による標準的な消化／ライゲーション反応によりクローニングされる。ＮＦ－ＫＢ５－ＥＬＡＭプロモーターにより駆動されるルシフェラーゼｃＤＮＡを含有するプラスミドであるｐＮｉｆｔｙ－ｌｕｃにおけるルシフェラーゼｃＤＮＡを、ＮｃｏｌおよびＮｈｅｌで切除し、ウマ、マウスまたはヒトＩＬ－１ＲａのｃＤＮＡをこの位置にライゲーションした。ＮＦ－ＫＢ５－ＥＬＡＭプロモーター－マウスＩＬ－１ＲａまたはＮＦ－ＫＢ５－ＥＬＡＭプロモーター－ウマＩＬ－１ＲａまたはＮＦ－ＫＢ５－ＥＬＡＭプロモーター－ヒトＩＬ－１Ｒａカセットを、ＮｏｔｌおよびＰａｄまたはＥｃｏＲＩおよびＰａｄで切除し、平滑末端化し、ｐＬＰＢＬシャトルプラスミドに挿入し、それをＳａｉｌで線状化し、平滑末端化した。次いで、ＮＦ－ＫＢ５－ＥＬＡＭプロモーター－マウスＩＬ－１ＲａまたはＮＦ－ＫＢ５－ＥＬＡＭプロモーター－ウマＩＬ－１ＲａまたはＮＦ－ＫＢ５－ＥＬＡＭプロモーター－ヒトＩＬ－１Ｒａカセットを、複数のクローニング部位の両側に位置するＡｓｃｌで切除し、Ａｓｃｌ線状化ρΔ２８プラスミド（Toietta, G., Pastore, L, Cerullo, V., Finegold, M., Beaudet, A.L., and Lee, Β. (2002)。Generation of helper-dependent adenoviral-based vectors by homologous recombination. Mol Ther 5, 204-210.）にライゲーションし、それによって、ゲノムプラスミドｐＡ２８－ｍｌｌ－１Ｒａ、ｐＡ２８－ｅｑｌｌ－１ＲａおよびｐＡ２８－ ｈｕｌｌ－１Ｒａを得た。これらのプラスミドをＰｍｅｌで消化してベクターを線状化し、逆方向末端反復配列を遊離させ、細菌耐性遺伝子を切除した。ヘルパーウイルスＡｄＮＧ１６３Ｒ－２および１１６の細胞工場を使用して以前に記載されたように（Palmer, D., and Ng, P. (2003). Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther 8, 846-852 ;Suzuki, M., Cela, R., Clarke, C, Bertin, T.K., Mourino, S., and Lee, B. (2010). Large-scale production of high-quality helper-dependent adenoviral-based vectors using adherent cells in cell factories. Hum Gene Ther 21, 120-126.）ベクターをレスキューし、増幅した。

【0088】

本開示の組成物
一部の実施形態では、本開示の組成物は、アデノウイルスベースのベクターに基づくアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含み得、アデノウイルスベースのベクターは、ヒトまたは哺乳動物インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）をコードする核酸配列、Ｌ ＩＴＲ、Ｒ ＩＴＲ、アデノウイルスパッケージングシグナル、および非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列は、マウスＩｌ－１Ｒａ、ウマ１－１Ｒａ、イヌＩｌ－１Ｒａ、ネコＩｌ－１Ｒａ、ウサギＩｌ－１Ｒａ、ハムスターＩｌ－１Ｒａ、ウシＩｌ－１Ｒａ、ラクダＩｌ－１Ｒａおよび他の哺乳動物種におけるそれらのホモログからなる群から選択されるＩｌ－１ＲａのｃＤＮＡ配列を含有する。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えて１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、追加のタンパク質は、ＤＤＤまたはａまたはＤＤＤに関連する状態を処置するための治療用タンパク質である。

【0089】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースのベクターは、宿主における免疫応答を最小限に抑え、ＤＤＤを患っているものを含む椎間板においてヒトまたは哺乳動物ＩＬ－１Ｒａの長期遺伝子発現をもたらす。一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースのベクターは、ヘルパー依存性のアデノウイルスベースのベクター（ＨＤＡｄ）である。

【0090】

一部の実施形態では、本開示の組成物におけるヒトまたは哺乳動物インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）をコードする配列は、炎症感受性プロモーターにより支配される。理論により拘束されることを望まないが、本開示の組成物における炎症感受性プロモーターの使用は、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態に罹患している椎間板の組織および細胞におけるＩＬ－１Ｒａ遺伝子発現に対する特異的支配をもたらす。この疾患またはこの疾患に関連する状態を患っている細胞のみがＩＬ－１Ｒａ遺伝子産物を発現し、分泌するのに対して、患っていない細胞は、ＩＬ－１Ｒａを発現も分泌もしない。一部の態様では、プロモーター配列は、ヒトまたは哺乳動物ＩＬ－１Ｒａをコードする配列のリーディングフレームの上流に位置する。

【0091】

一部の実施形態では、本開示の組成物において使用される炎症感受性プロモーターは、免疫刺激物質および／またはサイトカインをはじめとする因子のレベル上昇によって特異的に活性化される。理論により拘束されることを望まないが、ＤＤＤ中またはＤＤＤに関連する状態中に、様々な免疫刺激物質およびサイトカインが放出され、その結果、高レベルのプロモーター活性化物質が生じることになる。非限定的な例では、免疫刺激物質は、ＩＬ－１であり、ＩＬ－１は、ＤＤＤの発生および発病においてならびに椎間板基質分解を誘導する上で極めて重要な役割を果たすことが公知である。放出された免疫刺激物質および／またはサイトカインは、ＮＦ－κＢプロモーターを制御するＮＦ－κＢなどの転写因子を活性化することができる。それ故、そのようなＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態に特異的な免疫刺激物質および／またはサイトカインの放出は、ＤＤＤおよびＤＤＤに関連する状態に罹患しているヒトまたは哺乳動物の椎間板における遺伝子発現を支配することを可能にし得る。一部の実施形態では、そのようなＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態に特異的な免疫刺激物質および／またはサイトカインの放出は、ＤＤＤおよびＤＤＤに関連する状態を処置または予防するためにヒトまたは哺乳動物の椎間板における遺伝子発現を支配することを可能にし得る。

【0092】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染している変性した円板の細胞のみが、ＩＬ－１Ｒａを産生する。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染させた変性した円板の細胞により産生されるＩＬ－１Ｒａは、自己分泌様式で椎間板のＩＬ－１受容体に作用する。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染させた変性した円板の細胞により産生されるＩＬ－１Ｒａは、パラ分泌様式で椎間板細胞および／または椎間板の周囲の組織の細胞のＩＬ－１受容体に作用する。本明細書に記載の用語「自己分泌」は、本開示を踏まえて読まれる場合、その通常かつ通例の意味を有し、細胞による産生される分子が、その因子自体を産生する細胞に作用するときのものである。本明細書に記載の用語「パラ分泌」は、本開示を踏まえて読まれる場合、その通常かつ通例の意味を有し、細胞による産生される分子が、周囲組織におけるそれ自体以外の細胞に作用するときのものである。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染させた変性した円板の細胞により産生されるＩＬ－１Ｒａは、同じ変性した椎間板の細胞のＩＬ－１受容体に作用する。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染させた変性した円板の細胞により産生されるＩＬ－１Ｒａは、周囲の他の変性された椎間板の細胞のＩＬ－１受容体に作用する。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染させた変性した円板の細胞により産生されるＩＬ－１Ｒａは、周囲の他の変性していない椎間板の細胞のＩＬ－１受容体に作用する。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染させた変性した円板の細胞により産生されるＩＬ－１Ｒａは、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現によって感染させた変性した椎間板の周囲の組織の細胞に直接または間接的に作用する。一部の実施形態では、変性した円板の周囲の組織は、血管、神経組織、筋肉、靱帯、腱、骨格組織（例えば、椎骨）もしくは脊髄組織またはこれらの組合せである。血管は、脊柱またはその任意の枝へまたはそれから血液を運ぶ血管であり得る。神経組織は、脊柱またはその任意の枝に分布している神経であり得る。

【0093】

任意の炎症感受性プロモーターを本開示の文脈において使用することができると考えられる。一部の実施形態では、炎症感受性プロモーターは、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を有する椎間板の細胞および組織におけるＩＬ－１Ｒａ遺伝子産物の特異的発現をもたらすと考えられる。一部の実施形態では、本開示における使用のための炎症感受性プロモーターは、ＮＦ－κΒ、インターロイキン６（ＩＩ－６）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ－２）、補体因子３（Ｃ３）、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）、マクロファージ炎症性タンパク質－１ａ（ＭＩＰ－１ａ）、もしくは前述のもののハイブリッドコンストラクトによって誘導可能なプロモーター、または本明細書で別様に開示されるプロモーターを含むが、これらに限定されない。

【0094】

一部の実施形態では、炎症感受性プロモーターは、ＮＦ－κ Ｂ５－ＥＬＡＭプロモーターである。ヒト内皮白血球接着分子（ＥＬＡＭ）遺伝子の近位プロモーター領域に融合された５つの種保存ＮＦ－κＢ結合モチーフ反復配列で構成されている、ＮＦ－κＢ誘導性プロモーターを、いくつかの理由からＩＬ－１Ｒａの発現を駆動するために選択した。第１に、転写因子としてのＮＦ－κＢは、体のあらゆる細胞において普遍的に発現され、いずれの形質導入細胞も、炎症の合図による刺激を受けると、原理上、ＩＬ－１Ｒａ導入遺伝子を発現することができる。それ故、ＩＬ－１Ｒａ発現を誘導するための細胞特異性要件はない。加えて、ＮＦ－κＢは、インターロイキン－１（ＩＬ－１）および腫瘍壊死因子－αなどの炎症性サイトカインの受容体、ならびに他の免疫細胞受容体、例えばｔｏｌｌ様受容体の末端シグナル伝達分子であり、多くの炎症性入力への細胞応答を開始させるように作用する。したがって、ＩＬ－１Ｒａ産生の活性化は、椎間板において様々な炎症シグナルにより刺激されるように設計される。一部の実施形態では、炎症感受性プロモーターは、これらの特徴の１つまたは複数をＮＦ－κＢ誘導性プロモーターと共有する。

【0095】

一部の実施形態では、椎間板注射後、ＩＬ－１Ｒａの遺伝子は、中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）領域（髄核（ＮＰ）細胞）を含むがこれらに限定されない、椎間板細胞に送達される。一部の実施形態では、注射後、炎症を患っているＮＰ細胞は、炎症感受性プロモーター（例えば、ＮＦ－κＢプロモーター）の支配下にある組換えＩＬ－１Ｒａタンパク質を産生し始める。一部の実施形態では、次いで、大量のＩＬ－１Ｒａが、椎間板腔に分泌され、そこでＩＬ－１Ｒａは、椎間板領域および腔に埋め込まれたＮＰ細胞および他の細胞表面上のインターロイキン－１受容体を遮断することにより、炎症および異化タンパク質を阻害し、ならびに／または軟骨分解を停止もしくは低減させる。一部の実施形態では、組換えＩＬ－１Ｒａの高い局所濃度は、いかなる有害副作用ももたらさない。

【0096】

本明細書で開示される、一部の実施形態では、椎間板分解、およびＤＤＤの椎間板の発病に関与するタンパク質は、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を使用して有効に阻害される。一部の実施形態では、治療用タンパク質ＩＬ－１Ｒａの高い局所および低い全身濃度は、本開示の組成物の投与によって達成される。一部の実施形態では、結果は、副作用なしまたは最少の副作用でのＤＤＤの処置の高い有効性である。

【0097】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染させた、それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞は、少なくとも２週間、少なくとも１カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月または少なくとも１年の期間にわたってＩＬ－１Ｒａを発現する。その結果として、一部の実施形態では、短期処置に必要とされる高頻度の椎間板注射に関連する医療および経済的負担は、有意に削減される。一部の実施形態では、円板変性障害（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｄｉｓｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）のための処置に関連する可能性のある合併症が最小限に抑えられ、椎間板の健康が確保され、その結果として、処置された対象（例えば、ヒト）の持続的な健康改善が見られる。

【0098】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系（アデノウイルスベースのベクター）の炎症感受性ＩＬ－１Ｒａ産生は、ＤＤＤの発生の予防を可能にする。残存する本開示のアデノウイルスベースのベクターに感染している椎間板における細胞は、ＮＦ－κＢ５－ＥＬＡＭプロモーターまたは任意の他の炎症感受性プロモーターを活性化し得る免疫刺激物質の非存在下でＩＬ－１Ｒａ遺伝子を発現しないからである。ＤＤＤの発病が開始した場合にのみ、プロモーターが、炎症の結果として活性化され、その後、ＩＬ－１Ｒａが産生され、分泌される。かくて、本開示のアデノウイルス送達および発現系を使用することにより、この機序によってＤＤＤの発生の早期の予防が可能になる。

【0099】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースのベクターの炎症感受性ＩＬ－１Ｒａ産生は、ＤＤＤ条件が解消するかまたは消滅してしまと、もはやＩＬ－１Ｒａが産生されないことになる。結果として、一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースのベクターの炎症感受性ＩＬ－１Ｒａ産生は、対象への投与の安全性がより高い。

【0100】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースのベクターは、Ｌ ＩＴＲ、Ｒ ＩＴＲおよびアデノウイルスパッケージングシグナルを除いて、いずれのウイルス配列も運ばない。一部の実施形態では、本開示で使用されるアデノウイルスベースのベクターは、ＰａｌｍｅｒおよびＮｇ（Palmer, D., and Ng, P. (2003). Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther 8, 846-852.）ならびにＴｏｉｅｔｔａら（Toietta, G., Pastore, L., Cerullo, V., Finegold, M., Beaudet, A.L., and Lee, B. (2002). Generation of helper-dependent adenoviral-based vectors by homologous recombination. Mol Ther 5, 204-210.）により開発された、ヘルパーウイルスおよびヘルパー依存性骨格系に基づくヘルパー依存性のアデノウイルスベースのベクターである。一部の実施形態では、本開示によるアデノウイルス送達および発現系は、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含む、アデノウイスルベースの生物学的送達および発現系の核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、アデノウイルス送達および発現系は、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号７で示される核酸配列、またはその生物学的に有効な部分を含むかまたはそれからなる。配列番号２の核酸配列は、マウスヘルパー依存性アデノウイルスベースのベクターを記載し、配列番号３で示される核酸配列は、ウマヘルパー依存性アデノウイルスベースのベクターを記載し、配列番号７で示される核酸配列は、ヒトヘルパー依存性アデノウイルスベースのベクターを記載し、３つ全てのベクターは、それぞれ、マウスＩＬ－１Ｒａ遺伝子、ウマＩＬ－１Ｒａ遺伝子またはヒトＩＬ－１Ｒａ遺伝子のいずれか１つを有する。一部の実施形態では、本開示の系は、配列番号２、配列番号３または配列番号７で示されるベクターと少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性のいずれか１つを有する。一部の実施形態では、アデノウイルス送達および発現系は、配列番号２、配列番号３または配列番号７で示されるベクターと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるかまたは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる。アデノウイルス送達および発現系の一部の実施形態では、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列は、配列番号４の核酸と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるかまたは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる。アデノウイルス送達および発現系の一部の実施形態では、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列は、配列番号６のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるかまたは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＩＬ－１Ｒａタンパク質をコードする核酸配列を含むかまたはそれからなる。

【0101】

一部の実施形態では、本開示は、ヒトインターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物、およびＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態を有すると同定されたか、またはそれを発生するリスクがあると同定された対象の椎間板細胞、例えば、ＮＰ細胞を感染させるためにそれを使用する方法を提供する。一部の実施形態では、核酸配列は、左側および右側逆方向末端反復配列、アデノウイルスパッケージングシグナル、ならびに非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１Ｒａ遺伝子の発現は、ヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質をコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に位置するＮＦ－κＢ誘導性プロモーターにより制御される。一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１Ｒａ遺伝子は、ＮＦ－κＢ誘導性プロモーター以外の炎症感受性プロモーターにより制御される。一部の実施形態では、炎症感受性プロモーターは、ＮＦ－κΒ、インターロイキン６（ＩＩ－６）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ－２）、補体因子３（Ｃ３）、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）、マクロファージ炎症性タンパク質－１ａ（ＭＩＰ－１ａ）、もしくは前述のもののハイブリッドコンストラクトによって誘導可能なプロモーター、または本明細書で別様に開示されるプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置のための医薬組成物のアデノウイルス送達および発現系は、配列番号２、配列番号３または配列番号７で示されるベクターと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるかまたは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象における椎間板炎症および異化活性に対するＩＬ－１の作用を中和するためにならびに／または対象におけるＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態の１つもしくは複数の測定量の改善をもたらすために有効量のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む。一部の実施形態では、椎間板細胞、例えばＮＰ細胞の感染は、椎間板への医薬組成物の円板内注射により行われる。一部の実施形態では、注射は、関節内注射ではない。

【0102】

一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象におけるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置のための医薬組成物であって、ヒトインターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質をコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の有効量を含み、ヒトＩＬ－１Ｒａ遺伝子の発現が、ヒトＩＬ－１Ｒａ遺伝子をコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に位置するＮＦ－ｋＢ誘導性プロモーターにより制御され、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列が、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％相同または同一である、医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１Ｒａ遺伝子は、ＮＦ－κＢ誘導性プロモーター以外の炎症感受性プロモーターにより制御される。一部の実施形態では、炎症感受性プロモーターは、ＮＦ－κΒ、インターロイキン６（ＩＩ－６）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ－２）、補体因子３（Ｃ３）、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）、マクロファージ炎症性タンパク質－１ａ（ＭＩＰ－１ａ）、もしくは前述のもののハイブリッドコンストラクトによって誘導可能なプロモーター、または本明細書で別様に開示されるプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置のための医薬組成物のアデノウイルス送達および発現系は、配列番号２、配列番号３または配列番号７で示されるベクターと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるかまたは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有さない。

【0103】

一部の実施形態では、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同または同一である。

【0104】

一部の実施形態では、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号７の核酸配列と同一である。

【0105】

「長期発現」は、本開示を踏まえて読まれる場合、その通常かつ通例の意味を有し、本開示の文脈において、アデノウイルス送達および発現系の遺伝子産物（すなわち、ＩＬ－１Ｒａ）が、本開示のアデノウイルスベースのベクター（アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系）に感染させた椎間板において少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、または少なくとも１２カ月間、発現される場合を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１Ｒａは、本開示のアデノウイルスベースのベクターに感染させた椎間板において少なくとも３カ月間、発現される。一部の実施形態では、ＩＬ－１Ｒａは、本開示のアデノウイルスベースのベクターに感染させた椎間板細胞、例えばＮＰ細胞において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２０、２４もしくは５２週間であるか、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２０、２４もしくは５２週間であるか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２０、２４もしくは５２週間であるか、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２０、２４もしくは５２週間であるか、または前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、例えば、１～２４、１～５２、４～１２、４～２４、８～１２、８～２４、１２～２４、もしくは８～１６週間である期間にわたって発現される。

【0106】

「生物学的に有効な」は、本開示を踏まえて読まれる場合、その通常かつ通例の意味を有し、本開示の文脈において、アデノウイルス送達および発現系の遺伝子産物が、椎間板炎症および異化活性に対するＩＬ－１の効果を中和するならびに／またはＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態の１つもしくは複数の測定量の改善をもたらす椎間板内活性（in-intervertebral disc activity）を有するＩＬ－１Ｒａの全または部分ポリペプチド配列を含む場合を含む。

【0107】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースのベクター（アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系）は、炎症感受性プロモーターの支配下にあるＩＬ－１Ｒａの核酸配列を含む。ＩＬ－１Ｒａは、種特異的核酸配列を含有するが、一部の実施形態では、アデノウイルスベースのベクターは、任意の哺乳動物種またはヒトからのインターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）を発現することができる。一部の実施形態では、クローニングに使用され、アデノウイルスベースのベクターに含まれる哺乳動物インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）をコードするｃＤＮＡは、ヒトＩＬ－１Ｒａ、マウスＩＬ－１Ｒａ、ウマＩＬ－１Ｒａ、イヌＩＬ－１Ｒａ、ネコＩＬ－１Ｒａ、ウサギＩＬ－１Ｒａ、ハムスターＩＬ－１Ｒａ、ウシＩＬ－１Ｒａ、ラクダＩＬ－１Ｒａまたは他の哺乳動物種におけるそれらのホモログからなる群から選択されるｃＤＮＡである。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えて１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、追加のタンパク質は、ＤＤＤまたはａまたはＤＤＤに関連する状態を処置するための治療用タンパク質である。

【0108】

一部の実施形態では、注射した椎間板の細胞におけるゲノムベクター配列の存在をモニターするために、本開示によるアデノウイルスベースのベクター（アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系）は、視覚的にまたは機器により検出可能であるマーカー遺伝子をコードする配列をさらに含み得る。一部の実施形態では、マーカー遺伝子は、次の群から選択されるが、これらに限定されない：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＬａｃＺ、およびルシフェラーゼ酵素。

【0109】

一部の実施形態では、一例として、本開示で使用される場合のマウスＩＬ－１Ｒａの核酸配列は、配列表中の配列番号１で示されている。上で述べられたように、および本明細書で別様に開示されるように、任意の哺乳動物またはヒト種の生物活性ＩＬ－１Ｒａタンパク質をもたらす任意の核酸配列を、本開示の文脈において使用することができる。さらに、同じアミノ酸、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする保存核酸配列は、本開示の範囲下に入る。一部の実施形態では、本開示によるアデノウイルスベースのベクターは、配列番号１で示される核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有するＩＬ－１Ｒａの核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含有する。一部の実施形態では、本開示は、ＩＬ－１Ｒａの生物活性核酸配列またはその断片も含む。したがって、一部の実施形態では、本開示のヘルパー依存性のアデノウイルスベースのベクターは、配列番号１で提示される核酸配列の生物活性断片を含み得る。

【0110】

一部の実施形態では、一例として、本開示で使用される場合のヒトＩＬ－１Ｒａの核酸配列は、配列表中の配列番号４で示されている。上で述べられ、本明細書で別様に述べられるように、一部の実施形態では、ヒトの生物活性ＩＬ－１Ｒａタンパク質をもたらす核酸配列を、本開示の文脈において使用することができる。一部の実施形態では、同じアミノ酸、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする保存核酸配列は、本開示の範囲下に入る。一部の実施形態では、本開示によるアデノウイルスベースのベクターは、配列番号４で示される核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有するＩＬ－１Ｒａの核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含有する。一部の実施形態では、本開示は、ＩＬ－１Ｒａの生物活性核酸配列またはその断片も含む。したがって、一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースのベクターは、配列番号４で提示される核酸配列の生物活性断片を含み得る。

【0111】

一部の実施形態では、一例として、本開示で使用される場合のヒトＩＬ－１Ｒａの核酸配列は、配列番号６と少なくとも９５％相同または同一であるアミノ酸配列のヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質を発現し得る。一部の実施形態では、本開示で使用される場合のヒトＩＬ－１Ｒａの核酸配列は、配列番号６と少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％相同または同一であるアミノ酸配列のヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質を発現し得る。配列番号４で示される本開示で使用される場合のヒトＩＬ－１Ｒａの核酸配列は、配列番号６と少なくとも９９％相同または同一であるアミノ酸配列のヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質を発現し得る。一部の実施形態では、本開示で使用される場合のヒトＩＬ－１Ｒａの核酸配列は、配列番号６によるアミノ酸配列のヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質を発現し得る。

【0112】

一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１Ｒａは、野生型ヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％～９９％相同または同一であるアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１Ｒａは、配列番号６によるアミノ酸配列のヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質と９５％～９９％相同または同一であるアミノ酸配列を有し得る。

【0113】

一部の実施形態では、本開示は、椎間板の細胞におけるＩＬ－１Ｒａの発現のための、および／あるいはＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態に罹患していると同定されたか、またはそれを発生するリスクがあると同定されたヒトにおける、ＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態の処置のための、またはそのような状態の予防のための、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系であって、ヒトインターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベースのベクターのゲノムコピー（ＧＣ）を含む、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を提供する。一部の実施形態では、核酸は、左側および右側逆方向末端反復配列、アデノウイルスパッケージングシグナル、ならびに非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１Ｒａ遺伝子の発現は、ヒトＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に位置するＮＦ－κＢ誘導性プロモーターにより制御される。一部の実施形態では、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号２、配列番号３または配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％相同または同一である。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターおよびヘルパーウイルスに感染している宿主細胞から単離され、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、ａ）１ミリリットル当たり１．４×１０^８～１．４×１０^１２ＧＣ（１ｍｌ当たりのＧＣ）のヘルパー依存性アデノウイルスベクター；ｂ）１５％未満のヘルパーウイルス粒子；ｃ）１０％未満の空のカプシド；ｄ）最高で１００μｇ／ｍｌ以下の宿主細胞タンパク質；ｅ）最高で２０ｎｇ／ｍｌ以下の宿主細胞核酸；ｆ）３５ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシン；およびｇ）≦３００ＧＣ／ＴＣＩＤ_５０のウイルス粒子対感染単位比を含む。

【0114】

一部の実施形態では、本明細書で開示されるアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系におけるヘルパーウイルスのレベルは、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％のヘルパーウイルス粒子であるか、または１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％未満であるか、または前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、例えば、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１０％～１１％、１１％～１２％、１２％～１３％、１３％～１４％、１４％～＜１５％、１％～１５％、もしくは１％～５％ヘルパーウイルス粒子である。

【0115】

一部の実施形態では、本明細書で開示されるアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系における空のカプシドのレベルは、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％の空のカプシドであるか、または１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％未満であるか、または前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、例えば、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～＜１０％、１％～１０％、もしくは１％～５％の空のカプシドである。一部の実施形態では、本明細書で開示されるアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系における、空のカプシドのレベルとヘルパーウイルスのレベルは、同じである。

【0116】

本明細書で使用される場合、用語「空のカプシド」、および「空の粒子」は、本開示を踏まえて読まれる場合、その通常かつ通例の意味を有し、ヘルパー依存性アデノウイルスタンパク質シェルを含むが、ヒトインターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトを全部または一部欠いている、アデノウイルスベースのウイルスビリオンを指す。

【0117】

本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本開示を踏まえて読まれる場合、その通常かつ通例の意味を有し、例えば、本発明の、およびヘルパーウイルスのヘルパー依存性アデノウイルスベクターコンストラクトのレシピエントとして使用され得るかまたは使用されたことがある微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を意味する。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、外来性ＤＮＡ配列がトランスフェクトされた細胞を一般に指す。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発的または意図的突然変異のため、形態の点でまたはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体の点で元の親と必ずしも完全に同一であるとは限らないことを理解されたい。

【0118】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、７．０±１．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、６．０～６．５、６．５～７．０、７．０～７．５または７．０～８．０のｐＨを有する。

【0119】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、≦６００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、１００ｍＯｓｍ／ｋｇ～２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ～３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、４００ｍＯｓｍ／ｋｇ～５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または５００ｍＯｓｍ／ｋｇ～６００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。

【0120】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、１ｍｌ当たりのＧＣ：ａ）１．４×１０^９～１．４×１０^１２；ｂ）１．４×１０^９～１．４×１０^１１；またはｃ）１．４×１０^９～１．４×１０^１０で、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）を含む。

【0121】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、１ｍｌ当たり≧１．４×１０^９ＧＣ～１ｍｌ当たり＜５．６×１０^９ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^９ＧＣ、１ｍｌ当たり≧１．４×１０^１０ＧＣ～１ｍｌ当たり＜５．６×１０^１０ＧＣ、１ｍＬ当たり２．８×１０^１０ＧＣ、１ｍＬ当たり≧１．４×１０^１１ＧＣ～１ｍＬ当たり＜５．６×１０^１１ＧＣ、１ｍＬ当たり２．８×１０^１１ＧＣ、１ｍＬ当たり１．４×１０^９～５．６×１０^９ＧＣ、１ｍＬ当たり１．４×１０^１０～５．６×１０^１０ＧＣ、１ｍｌ当たり１．４×１０^１１～５．６×１０^１１ＧＣ、１ｍｌ当たり２×１０^９～５．６×１０^９ＧＣ、１ｍｌ当たり２×１０^１０～５．６×１０^１０ＧＣ、１ｍｌ当たり２×１０^１１～５．６×１０^１１ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^９～５．６×１０^９ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^１０～５．６×１０^１０ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^１１～５．６×１０^１１ＧＣ、１ｍｌ当たり２×１０^９～２．８×１０^９ＧＣ、１ｍｌ当たり２×１０^１０～２．８×１０^１０ＧＣ、１ｍｌ当たり２×１０^１１～２．８×１０^１１ＧＣ、１ｍｌ当たり１．４×１０^９～２．８×１０^１０ＧＣ、１ｍｌ当たり１．４×１０^１０～２．８×１０^１１ＧＣ、１ｍｌ当たり１．４×１０^１１～２．８×１０^１１ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^９～１．４×１０^１２ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^１０～１．４×１０^１２ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^１１～１．４×１０^１２ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^９～２．８×１０^１１ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^９～１．４×１０^１０ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^１０～２．８×１０^１１ＧＣ、１ｍｌ当たり１．４×１０^９ＧＣ、１ｍｌ当たり１．４×１０^１０ＧＣ、１ｍｌ当たり１．４×１０^１１ＧＣ、１ｍｌ当たり１．４×１０^１２ＧＣ、１ｍｌ当たり２×１０^９ＧＣ、１ｍｌ当たり２×１０^１０ＧＣ、１ｍｌ当たり２×１０^１１ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^９ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^１０ＧＣ、１ｍｌ当たり２．８×１０^１１ＧＣ、１ｍｌ当たり５．６×１０^９ＧＣ、１ｍｌ当たり５．６×１０^１０ＧＣ、または１ｍｌ当たり５．６×１０^１１ＧＣの濃度で、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）を含む。

【0122】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、１ｍｌ～５ｍｌ、２ｍｌ～５ｍｌ、３ｍｌ～５ｍｌ、４ｍｌ～５ｍｌ、５ｍｌ、または２ｍｌの用量容量を含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、１ｍｌ、３ｍｌ、または４ｍｌの用量容量を含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌであるか、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌであるか、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌ未満であるか、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌ未満であるか、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌを超えるか、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌを超えるか、または前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、例えば、０．１ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～２ｍｌ、１ｍｌ～５ｍｌ、２ｍｌ～５ｍｌ、４ｍｌ～５ｍｌ、もしくは３ｍｌ～５ｍｌである、用量容量を含む。

【0123】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、７×１０^９～７×１０^１２ＧＣ、７×１０^９～７×１０^１１ＧＣ、７×１０^９～７×１０^１０ＧＣ、７×１０^９～２．８×１０^１０ＧＣ、７×１０^１０～２．８×１０^１１ＧＣ、７×１０^１１～２．８×１０^１２ＧＣ、７×１０^１０～７×１０^１２ＧＣ、７×１０^１０～７×１０^１１ＧＣ、７×１０^１１～７×１０^１２ＧＣ、７×１０^９～２．８×１０^１０ＧＣ、７×１０^１０～２．８×１０^１１ＧＣ、７×１０^１１～２．８×１０^１２ＧＣ、１０^１０～２．８×１０^１０ＧＣ、１０^１１～２．８×１０^１１ＧＣ、１０^１２～２．８×１０^１２ＧＣ、２．８×１０^９～５．６×１０^９ＧＣ、２．８×１０^１０～５．６×１０^１０ＧＣ、２．８×１０^１１～５．６×１０^１１ＧＣ、１０^１０～１．４×１０^１０ＧＣ、１０^１１～１．４×１０^１１ＧＣ、１０^１２～１．４×１０^１２ＧＣ、７×１０^９～５．６×１０^１１ＧＣ、７×１０^１０～５．６×１０^１２ＧＣ、７×１０^１１～５．６×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１０～７×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１１～７×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１２～７×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１０～１．４×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１０～１．４×１０^１１ＧＣ、１．４×１０^１１～１．４×１０^１２ＧＣ、７×１０^９ＧＣ、７×１０^１０ＧＣ、７×１０^１１ＧＣ、７×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１０ＧＣ、１．４×１０^１１ＧＣ、１．４×１０^１２ＧＣ、２．８×１０^１０ＧＣ、２．８×１０^１１ＧＣ、または２．８×１０^１２ＧＣの総用量で、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）を含む。一部の実施形態では、総用量は、投与１回当たりの、単一の円板に注入される量である。

【0124】

医薬組成物
一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、ＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態に罹患しているまたはそれを発生している椎間板への投与に好適な医薬組成物に組み込まれる。一部の実施形態では、対象は、ＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態に罹患しているまたはそれを発生していると同定された者である。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞への直接的なアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つまたは複数の変性した円板もしくは変性していない円板または両方の細胞への直接的なアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つまたは複数の変性した円板の細胞への直接的なアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＤＤＤは、頸部または腰部変性円板疾患のいずれか一方である。一部の実施形態では、ＤＤＤは、腰部変性円板疾患である。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、脊柱骨対：Ｃ２－Ｃ３、Ｃ３－Ｃ４、Ｃ４－Ｃ５、Ｃ５－Ｃ６、Ｃ６－Ｃ７、Ｃ７－Ｔ１、Ｔ１－Ｔ２、Ｔ２－Ｔ３、Ｔ３－Ｔ４、Ｔ４－Ｔ５、Ｔ５－Ｔ６、Ｔ６－Ｔ７、Ｔ７－Ｔ８、Ｔ８－Ｔ９、Ｔ９－Ｔ１０、Ｔ１０－Ｔ１１、Ｔ１１－Ｔ１２、Ｔ１２－Ｌ１、Ｌ１－Ｌ２、Ｌ２－Ｌ３、Ｌ３－Ｌ４、Ｌ４－Ｌ５およびＬ５－Ｓ１間の椎間板またはこれらの任意の組合せの細胞への直接的なアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有さない。

【0125】

一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つまたは複数の椎間板の、軟骨終板（ＣＥＰ）の細胞、高度に組織化された線維輪（ＡＦ）の細胞および中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）領域の細胞（髄核（ＮＰ）細胞）またはこれらの組合せへの、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）領域の細胞（髄核（ＮＰ）細胞）へのアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、ＮＰ細胞である細胞へのアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の送達用に製剤される。

【0126】

一部の実施形態では、本開示の組成物は、ヒトまたは哺乳動物インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）をコードする核酸配列と、Ｌ ＩＴＲと、Ｒ ＩＴＲと、パッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースのベクターを含む医薬組成物であって、ヒトまたは哺乳動物インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）遺伝子の発現が、ヒトまたは哺乳動物ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に位置する炎症感受性プロモーターにより制御される、医薬組成物を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置に使用される。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えて１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、追加のタンパク質は、ＤＤＤまたはａまたはＤＤＤに関連する状態を処置するための治療用タンパク質である。

【0127】

本開示の文脈において使用される場合の炎症感受性プロモーターは、例えば、ＮＦ－κΒ、インターロイキン６（ＩＩ－６）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ－２）、補体因子３（Ｃ３）、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）、マクロファージ炎症性タンパク質－１ａ（ＭＩＰ－１ａ）、または前述のもののハイブリッドコンストラクトによって誘導可能なプロモーターである。一部の実施形態では、炎症感受性プロモーターは、ＮＦ－κＢ５－ＥＬＡＭプロモーターである。

【0128】

一部の実施形態では、本開示の組成物のアデノウイルスベースのベクター（アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系）は、ヘルパー依存性のアデノウイルスベースのベクター（ＨＤＡｄ）である。一部の実施形態では、そのような組成物は、本明細書で開示されるヘルパー依存性アデノウイルスベクターウイルス粒子、および薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、組成物は、ヘルパーウイルスおよび／または空のウイルス粒子を本明細書で開示される量でさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、本開示を踏まえて読まれる場合、その通常かつ通例の意味を有し、医薬品投与に適合する、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含むように意図されている。好適な担体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、当分野における標準的な参考テキストであるRemington’s Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の非限定的な例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、リポソームおよび非水性媒体、例えば、固定油も、使用され得る。医薬活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と非適合性である場合を除いて、組成物におけるその使用が考えられる。一部の実施形態では、補助活性化合物も組成物に組み込まれる。

【0129】

本開示の医薬組成物は、その意図された投与経路である椎間板への円板内注射に適合するように製剤される。円板内注射に使用される溶液または懸濁液は、次の成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば、注射用蒸留水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩；および等張性の調整用の薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨを、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムで、調整することができる。医薬調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアルに封入される。一部の実施形態では、医薬組成物は、椎間板への直接注射（円板内注射）用に製剤される。

【0130】

一部の実施形態では、椎間板に直接注射するための本開示の医薬組成物は、少量の局所麻酔薬、例えば、リドカインまたはブピバカインに加えて、コルチコステロイド、例えば、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、またはトリアムシノロンをさらに含む。一部の実施形態では、椎間板に直接注射するための本開示の医薬組成物は、コルチコステロイドをさらに含む。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、コルチコステロイドが、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の前または後に投与できるように、コルチコステロイド、例えば、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、またはこれらの組合せは、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系とは別個の剤形である。一部の実施形態では、コルチコステロイドが、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と同時に投与されるように、コルチコステロイド、例えば、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、またはこれらの組合せは、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と同じ剤形（例えば、単一の液体）中にある。一部の実施形態では、椎間板に直接注射するための本開示の医薬組成物は、局所麻酔薬をさらに含む。一部の実施形態では、局所麻酔薬は、リドカイン、ブピバカイン、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、局所麻酔薬が、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の前または後に投与できるように、局所麻酔薬、例えば、リドカイン、ブピバカイン、またはこれらの組合せは、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系とは別個の剤形中にある。一部の実施形態では、局所麻酔薬が、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と同時に投与されるように、局所麻酔薬、例えば、リドカイン、ブピバカイン、またはこれらの組合せは、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と同じ剤形（例えば、単一の液体）の形態である。一部の実施形態では、椎間板に直接注射するための本開示の医薬組成物は、少なくとも１つの増粘剤をさらに含む。一部の実施形態では、椎間板に直接注射するための本開示の医薬組成物は、少なくとも１つの保存剤を含む。増粘剤は、当技術分野において公知の、例えば、Handbook of Pharmaceutical Excipients Ninth edition, Paul J Sheskey, Bruno C Hancock, Gary P Moss, David J Goldfarb; およびThe United States pharmacopeia : USP 30 ; The National formulary : NF 25）に記載されているような、任意の１つまたは複数の増粘剤であり得、参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0131】

注射剤使用に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。全ての場合に、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造および保管条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の夾雑作用に対抗して保存されなければならない。一部の実施形態では、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合は必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって、達成することができる。一部の実施形態では、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましであろう。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることにより、もたらすことができる。

【0132】

滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて、上に列挙されている成分の１つまたは組合せとともに、適切な溶媒に添合し、その後、濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒と上に列挙されているものからの他の必要成分とを含有する滅菌媒体に活性化合物を添合することにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の方法は、任意の追加の所望成分を加えた活性成分の粉末を、事前に滅菌濾過されたその溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥である。

【0133】

本開示のアデノウイルス発現および送達系の化学特性
一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系（例えば、ＦＸ２０１／ＰＣＲＸ－２０１）のカプシドは、非包膜型であり、２９．３ｋｂ二本鎖ＤＮＡで構成されている。カプシドの理論分子量は、１０３．９メガダルトン（ＭＤａ）であり、ゲノムは、１８．１ＭＤａである。ＦＸ２０１のカプシドは、おおよそ１００ｎｍの直径を有し得る。

【0134】

製剤：一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系（例えば、ＦＸ２０１／ＰＣＲＸ－２０１）は、約１～２０ｍＭ、ＴＲＩＳ、約５０～１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１～１％重量／容量（ｗ／ｖ）ポリソルベエート８０、１～１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１～１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０～５００μＭ ＥＤＴＡ、１～５％容量／容量（ｖ／ｖ）エタノール、および５～５０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンで構成されている緩衝液中で製剤される。一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系（例えば、ＦＸ２０１）は、１０ｍＭ ＴＲＩＳ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（重量／容量（ｗ／ｖ）ポリソルベエート８０、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００μＭ ＥＤＴＡ、０．５％（容量／容量（ｖ／ｖ）のエタノール、および１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンで構成されている緩衝液中で製剤される。一部の実施形態では、生成物は、目視可能な微粒子を有さない、透明からやや半透明の無色懸濁液である。

【0135】

保管条件および安定性：一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系（例えば、ＦＸ２０１／ＰＣＲＸ－２０１）は、凍結された液体として≦－６５℃で保管される。一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系（例えば、ＦＸ２０１）は、≦－６５℃で保管されたとき、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間または少なくとも１２カ月間、安定している。一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系（例えば、ＦＸ２０１）は、≦－６５℃で保管されたとき、少なくとも２４カ月間、安定している。一部の実施形態では、解凍したら、生成物を２～８℃で保管し、７日以内に使用するべきである。一部の実施形態では、解凍したら、生成物を２～８℃で保管し、１４日以内に使用するべきである。一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系（例えば、ＦＸ２０１）は、ある程度の期間、室温（ＲＴ）に保つことができる。一部の実施形態では、バイアルの使用準備が完了したら、それはＲＴでバイアル内に７時間以下、保持される（一部の実施形態では、ＲＴで保持されたバイアルを後の使用のために冷蔵に戻すことはできない）。一部の実施形態では、バイアルの使用準備が完了したら、それはＲＴでバイアル内に１２時間以下、保持される（一部の実施形態では、ＲＴで保持されたバイアルを後の使用のために冷蔵に戻すことはできない）。一部の実施形態では、投薬量を注射器の中で調製したら、それをＲＴで保持し、４時間以内に使用しなければならない。一部の実施形態では、投薬量を注射器の中で調製したら、それをＲＴで保持し、８時間以内に使用しなければならない。

【0136】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系（アデノウイルスベースのベクター）を含む本開示の医薬組成物は、円板変性疾患（（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ））のまたはＤＤＤに関連する状態の処置に使用され、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、アデノウイルスベースのベクターのゲノムコピー（ＧＣ）を含み、このベクターは、ヒトインターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）をコードする核酸配列を含み、さらに、左側および右側逆方向末端反復配列、アデノウイルスパッケージングシグナル、ならびに非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列を含み、ヒトＩＬ－１Ｒａ遺伝子の発現は、ヒトＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に位置する炎症感受性プロモーターにより制御されてもよい。一部の実施形態では、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号２、配列番号３または配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％相同または同一である。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、１ミリリットル（ｍｌ）当たりアデノウイルスベースのベクターの１．４×１０^８～１．４×１０^１２ＧＣを含む。一部の実施形態では、炎症感受性プロモーターは、ＮＦ－κΒ、インターロイキン６（ＩＩ－６）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ－２）、補体因子３（Ｃ３）、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）、マクロファージ炎症性タンパク質－１ａ（ＭＩＰ－１ａ）または前述のもののハイブリッドコンストラクトのいずれか１つによって誘導可能な、プロモーターである。一部の実施形態では、炎症感受性プロモーターは、ＮＦ－κ誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、ＮＦ－κＢ誘導性プロモーターは、ＮＦ－ＫＢ５－ＥＬＡＭプロモーターである。

【0137】

一部の実施形態では、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号２、配列番号３または配列番号７の核酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％相同または同一である。一部の実施形態では、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号２、配列番号３または配列番号７の核酸配列と少なくとも９９％相同または同一である。一部の実施形態では、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号２、配列番号３または配列番号７のものである。

【0138】

一部の実施形態では、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％相同または同一である。一部の実施形態では、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％相同または同一である。

【0139】

一部の実施形態では、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列は、配列番号１の核酸を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列は、配列番号４の核酸配列を含む。配列番号４は、ヒトＩＬ－１Ｒａの元のコード配列（配列番号５）のコドン最適化バージョンであり、配列番号４によるコドン最適化配列は、ａ）野生型ヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質における０．７８のＣＡＩと比較して０．９６のコドン適応指標（ＣＡＩ：codon adaptive index）、ｂ）野生型ヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質における５６％の最高使用頻度と比較して最高使用頻度内のコドンの８５％、ｃ）野生型ヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質における５１．９８の平均ＧＣ含量と比較して６０．４の平均ＧＣ含量を有し、ｄ）野生型ヒトＩＬ－１Ｒａタンパク質と比較して、スプライス部位（ＧＧＴＡＡＧ）、スプライス部位（ＧＧＴＧＡＴ）、ポリＡ（ＡＡＴＡＡＡ）、ポリＡ（ＡＴＴＡＡＡ）、不安定化（ＡＴＴＴＡ）、ポリＴ（ＴＴＴＴＴＴ）およびポリＡ（ＡＡＡＡＡＡＡ）をはじめとする負のシス作用エレメントを有さない。

【0140】

一部の実施形態では、ヒトＩＬ－１Ｒａのアミノ酸配列は、配列番号６によるものである。一部の実施形態では、プロモーターと、ＩＬ－１Ｒａをコードする核酸配列と、左側および右側逆方向末端反復配列と、アデノウイルスパッケージングシグナルと、非ウイルス性の非コードスタッファー核酸配列とを含むアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の核酸配列は、配列番号２、配列番号３または配列番号７の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。

【0141】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースのベクターは、感染細胞におけるベクター配列の存在をモニターするために視覚的にまたは機器により検出可能であるタンパク質産物をコードするマーカー遺伝子をさらに含んでもよい。マーカー遺伝子は、蛍光タンパク質、酵素または検出可能な細胞表面タンパク質のいずれか１つをコードする遺伝子であり得る。一部の実施形態では、マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質ＬａｃＺまたはルシフェラーゼ酵素のいずれか一方をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えて１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、追加のタンパク質は、ＤＤＤまたはａまたはＤＤＤに関連する状態を処置するための治療用タンパク質である。

【0142】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む本開示の医薬組成物は、医薬組成物の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターのａ）１．４×１０^９～１．４×１０^１２、ｂ）１．４×１０^９～１．４×１０^１１、またはｃ）１．４×１０^９～１．４×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）を含む。

【0143】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む本開示の医薬組成物は、医薬組成物の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターの１．０×１０^１０～１．０×１０^１２、１．０×１０^１０～１．０×１０^１１、１．０×１０^１１～１．０×１０^１２、９×１０^１０～９×１０^１１、１．４×１０^１０～１．４×１０^１２、１．４×１０^１０～１．４×１０^１１、１．４×１０^１１～１．４×１０^１２、１．４×１０^９～５．６×１０^９、１．４×１０^１０～５．６×１０^１０、１．４×１０^１１～５．６×１０^１１、２×１０^９～５．６×１０^９、２×１０^１０～５．６×１０^１０、２×１０^１１～５．６×１０^１１、２．８×１０^９～５．６×１０^９、２．８×１０^１０～５．６×１０^１０、２．８×１０^１１～５．６×１０^１１、２×１０^９～２．８×１０^９、２×１０^１０～２．８×１０^１０、２×１０^１１～２．８×１０^１１、１．４×１０^９～２．８×１０^１０、１．４×１０^１０～２．８×１０^１１、１．４×１０^１１～２．８×１０^１１、２．８×１０^９～１．４×１０^１２、２．８×１０^１０～１．４×１０^１２、２．８×１０^１１～１．４×１０^１２、２．８×１０^９～２．８×１０^１１、２．８×１０^９～１．４×１０^１０、２．８×１０^１０～２．８×１０^１１、１．４×１０^９、１．４×１０^１０、１．４×１０^１１、１．４×１０^１２、２×１０^９、２×１０^１０、２×１０^１１、２．８×１０^９、２．８×１０^１０、２．８×１０^１１、５．６×１０^９、５．６×１０^１０、または５．６×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）を含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む本開示の医薬組成物は、医薬組成物の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターの１×１０^８ＧＣ、１×１０^９ＧＣ、１×１０^１０ＧＣ、１×１０^１１ＧＣ、２×１０^８ＧＣ、２×１０^９ＧＣ、２×１０^１０ＧＣ、２×１０^１１ＧＣ、３×１０^８ＧＣ、３×１０^９ＧＣ、３×１０^１０ＧＣ、もしくは３×１０^１１ＧＣ、または医薬組成物の１ｍｌ当たりのアデノウイルスベースのベクターの前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、例えば、１×１０^８ＧＣ～３×１０^１１ＧＣ、１×１０^８ＧＣ～３×１０^９ＧＣ、もしくは１×１０^９ＧＣ～３×１０^９ＧＣを含む。

【0144】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む本開示の医薬組成物は、１ｍｌ～５ｍｌ、２ｍｌ～５ｍｌ、４ｍｌ～５ｍｌ、３ｍｌ～５ｍｌ、または最大５ｍｌの用量容量を含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む本開示の医薬組成物は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌであるか、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌであるか、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌ未満であるか、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌ未満であるか、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌを超えるか、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４もしくは５ｍｌを超えるか、または前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、例えば、０．１ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～２ｍｌ、１ｍｌ～５ｍｌ、２ｍｌ～５ｍｌ、４ｍｌ～５ｍｌ、もしくは３ｍｌ～５ｍｌである、用量容量を含む。

【0145】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む本開示の医薬組成物は、アデノウイルスベースのベクターの７×１０^９～７×１０^１２ＧＣ、７×１０^９～７×１０^１１ＧＣ、７×１０^９～７×１０^１０ＧＣ、７×１０^１０～７×１０^１２ＧＣ、７×１０^１０～７×１０^１１ＧＣ、７×１０^１１～７×１０^１２ＧＣ、７×１０^９～２．８×１０^１０ＧＣ、７×１０^１０～２．８×１０^１１ＧＣ、７×１０^１１～２．８×１０^１２ＧＣ、７×１０^９～２．８×１０^１１ＧＣ、７×１０^９～２．８×１０^１２ＧＣ、７×１０^１０～２．８×１０^１２ＧＣ、１×１０^１０～２．８×１０^１０ＧＣ、１×１０^１１～２．８×１０^１１ＧＣ、１×１０^１２～２．８×１０^１２ＧＣ、２．８×１０^９～５．６×１０^９ＧＣ、２．８×１０^１０～５．６×１０^１０ＧＣ、２．８×１０^１１～５．６×１０^１１ＧＣ、１×１０^１０～１．４×１０^１０ＧＣ、１×１０^１１～１．４×１０^１１ＧＣ、１×１０^１２～１．４×１０^１２ＧＣ、７×１０^９～５．６×１０^１１ＧＣ、７×１０^１０～５．６×１０^１２ＧＣ、７×１０^１１～５．６×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１０～７×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１１～７×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１２～７×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１０～１．４×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１０～１．４×１０^１１ＧＣ、１．４×１０^１１～１．４×１０^１２ＧＣ、７×１０^９ＧＣ、７×１０^１０ＧＣ、７×１０^１１ＧＣ、７×１０^１２ＧＣ、１．４×１０^１０ＧＣ、１．４×１０^１１ＧＣ、１．４×１０^１２ＧＣ、２．８×１０^１０ＧＣ、２．８×１０^１１ＧＣ、または２．８×１０^１２ＧＣの総用量を含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む本開示の医薬組成物は、１×１０^８ＧＣ、１×１０^９ＧＣ、１×１０^１０ＧＣ、１×１０^１１ＧＣ、２×１０^８ＧＣ、２×１０^９ＧＣ、２×１０^１０ＧＣ、２×１０^１１ＧＣ、３×１０^８ＧＣ、３×１０^９ＧＣ、３×１０^１０ＧＣ、もしくは３×１０^１１ＧＣ、または前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、例えば、１×１０^８ＧＣ～３×１０^１１ＧＣ、１×１０^８ＧＣ～３×１０^９ＧＣ、もしくは１×１０^９ＧＣ～３×１０^９ＧＣの総用量を含む。本開示の医薬組成物の一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系のアデノウイルスベースのベクターは、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）である。

【0146】

一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、ヒト椎間板への円板内注射用に製剤される。一部の実施形態では、組成物は、関節内注射されない。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、対象の椎間板への円板内注射用に製剤される。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、椎間板の髄核への円板内注射用に製剤される。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有さない。

【0147】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物は、ミリリットル（ｍｌ）当たりのアデノウイ ルスベースのベクターのゲノムコピー（ＧＣ）またはミリリットル（ｍｌ）当たりのアデノウイルスベースのベクターのウイルス粒子（ＶＰ）として定量化されるヘルパー依存性アデノウイルスベクターのウイルス粒子を含み、１ＶＰ／ｍｌは、１．４ＧＣ／ｍｌに相当する。

【0148】

一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、ミリリットル（ｍｌ）当たりアデノウイルスベースのベクターの１．４×１０^８～１．４×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）を含む、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、椎間板内の流体のミリリトル（ｍｌ）当たりまたは椎間板の容量の１ｍｌ当たり本開示のヘルパー依存性アデノウイルスベクターの１０^８～１０^１２ウイルス粒子（ＶＰ）も含み得る。

【0149】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物は、椎間板内の流体の１ｍｌ当たりまたは椎間板の容量の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターの１０^９～１０^１２、１０^９～１０^１１、または１０^９～１０^１０ＶＰを含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物は、椎間板内の流体の１ｍｌ当たりまたは椎間板の容量の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターの１０^９～１０^１１ＶＰを含む。

【0150】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物は、椎間板内の流体の１ｍｌ当たりまたは椎間板の容量の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターの２．８×１０^９～２．８×１０^１１、２．８×１０^９～２．８×１０^１０、２．８×１０^１０～２．８×１０^１１、２×１０^９～２×１０^１１、２×１０^９～２×１０^１０、または２×１０^１０～２×１０^１１ＶＰを含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物は、椎間板内の流体の１ｍｌ当たりまたは椎間板の容量の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターの１×１０^８ＶＰ、１×１０^９ＶＰ、１×１０^１０ＶＰ、１×１０^１１ＶＰ、２×１０^８ＶＰ、２×１０^９ＶＰ、２×１０^１０ＶＰ、２×１０^１１ＶＰ、３×１０^８ＶＰ、３×１０^９ＶＰ、３×１０^１０ＶＰ、もしくは３×１０^１１ＶＰ、またはアデノウイルスベースのベクターの前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、例えば、１×１０^８ＶＰ～３×１０^１１ＶＰ、１×１０^８ＶＰ～３×１０^９ＶＰ、もしくは１×１０^９ＶＰ～３×１０^９ＶＰを含む。

【0151】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物は、椎間板内の流体の１ｍｌ当たりまたは椎間板の容量の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターの２．８×１０^９、２．８×１０^１０、２．８×１０^１１、または２．８×１０^１１ＶＰを含む。

【0152】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物は、椎間板内の流体の１ｍｌ当たりまたは椎間板の容量の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターの１０^９～１０^１２、１０^９～１０^１１、または１０^９～１０^１０ＶＰを含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物は、椎間板内の流体の１ｍｌ当たりまたは椎間板の容量の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターの１０^９～１０^１１ＶＰを含む。

【0153】

一部の実施形態では、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態に罹患しているヒトの１つまたは複数の椎間板の細胞を、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染させる方法は、それを必要とするヒトの１つまたは複数の椎間板を、椎間板内の流体のミリリットル（ｍｌ）当たりまたは椎間板の容量の１ｍｌ当たり本開示のアデノウイルスベースのベクターの１０^８～１０^１２ウイルス粒子（ＶＰ）に感染させることを含む。

【0154】

一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物は、椎間板内の流体の１ｍｌ当たりまたは椎間板の容量の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターの１０^９～１０^１２、１０^９～１０^１１、または１０^９～１０^１０ＶＰを含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を含む医薬組成物は、椎間板内の流体の１ｍｌ当たり、または椎間板の容量の１ｍｌ当たりアデノウイルスベースのベクターの１０^９～１０^１１ＶＰを含む。

【0155】

一部の実施形態では、椎間板は、約０．５ｍｌ～約２０ｍｌ、０．５ｍｌ～１０ｍｌ、０．５ｍｌ～５ｍｌ、５ｍｌ～１０ｍｌ、１０ｍｌ～１５ｍｌ、１５ｍｌ～１７ｍｌ、もしくは１７ｍｌ～２０ｍｌの流体またはｍｌの椎間板容量を有する。

【0156】

本開示の方法
一部の実施形態では、本開示は、変性円板疾患（ＤＤＤ）に罹患している対象または罹患していると同定された対象の１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に感染させる方法であって、ａ）対象の、またはそれを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞を、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系のある量、適宜、有効量を含む医薬組成物に感染させる工程；およびｂ）１つまたは複数の椎間板の細胞においてＩＬ－１Ｒａを発現させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系は、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）タンパク質に加えて１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、追加のタンパク質は、ＤＤＤまたはａまたはＤＤＤに関連する状態を処置するための治療用タンパク質である。一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の椎間板の細胞において追加のタンパク質を発現させることをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有さない。

【0157】

一部の実施形態では、方法は、コルチコステロイド、例えば、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、またはこれらの組合せを対象の椎間板に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、コルチコステロイドがアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と同時に投与されるように、コルチコステロイドは、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と単一の医薬組成物に製剤される。一部の実施形態では、コルチコステロイドが対象の椎間板へのアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の投与の前または後に投与できるように、コルチコステロイドは、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系とは別個の剤形中にある。一部の実施形態では、方法は、局所麻酔薬、例えば、リドカイン、ブピバカイン、またはこれらの組合せを対象の椎間板に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、局所麻酔薬がアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と同時に投与されるように、局所麻酔薬は、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と単一の医薬組成物に製剤される。一部の実施形態では、局所麻酔薬が対象の椎間板へのアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の投与の前または後に投与できるように、局所麻酔薬は、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系とは別個の剤形中にある。一部の実施形態では、方法は、コルチコステロイドと局所麻酔薬との両方を対照の椎間板に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬がアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と同時に投与されるように、コルチコステロイドおよび局部麻酔薬の一方または両方が、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系と単一の医薬組成物に製剤される。一部の実施形態では、コルチコステロイドおよび／または局所麻酔薬が、対象の椎間板へのアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の投与の前または後に投与できるように、コルチコステロイドおよび局部麻酔薬の一方または両方は、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系とは別個の剤形中にある。

【0158】

一部の実施形態では、方法は、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の投与後に対象の椎間板に液体を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、液体は、生理食塩水、例えば、０．９％生理食塩水である。一部の実施形態では、液体は、緩衝溶液、例えば、ＰＢＳである。一部の実施形態では、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の投与後に対象の椎間板に投与される液体の容量は、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌ、６０μｌ、６５μｌ、７０μｌ、７５μｌ、８０μｌ、８５μｌ、９０μｌ、９５μｌ、１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ、２５０μｌ、３００μｌ、３５０μｌ、４００μｌ、４５０μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、１０００μｌであるか、約２５μｌ、約３０μｌ、約３５μｌ、約４０μｌ、約４５μｌ、約５０μｌ、約５５μｌ、約６０μｌ、約６５μｌ、約７０μｌ、約７５μｌ、約８０μｌ、約８５μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、約１００μｌ、約１５０μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、約３５０μｌ、約４００μｌ、約４５０μｌ、約５００μｌ、約６００μｌ、約７００μｌ、約８００μｌ、約９００μｌ、約１０００μｌであるか、２５μｌ未満、３０μｌ未満、３５μｌ未満、４０μｌ未満、４５μｌ未満、５０μｌ未満、５５μｌ未満、６０μｌ未満、６５μｌ未満、７０μｌ未満、７５μｌ未満、８０μｌ未満、８５μｌ未満、９０μｌ未満、９５μｌ未満、１００μｌ未満、１５０μｌ未満、２００μｌ未満、２５０μｌ未満、３００μｌ未満、３５０μｌ未満、４００μｌ未満、４５０μｌ未満、５００μｌ未満、６００μｌ未満、７００μｌ未満、８００μｌ未満、９００μｌ未満、１０００μｌ未満であるか、約２５μｌ未満、約３０μｌ未満、約３５μｌ未満、約４０μｌ未満、約４５μｌ未満、約５０μｌ未満、約５５μｌ未満、約６０μｌ未満、約６５μｌ未満、約７０μｌ未満、約７５μｌ未満、約８０μｌ未満、約８５μｌ未満、約９０μｌ未満、約９５μｌ未満、約１００μｌ未満、約１５０μｌ未満、約２００μｌ未満、約２５０μｌ未満、約３００μｌ未満、約３５０μｌ未満、約４００μｌ未満、約４５０μｌ未満、約５００μｌ未満、約６００μｌ未満、約７００μｌ未満、約８００μｌ未満、約９００μｌ未満、約１０００μｌ未満であるか、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌ、６０μｌ、６５μｌ、７０μｌ、７５μｌ、８０μｌ、８５μｌ、９０μｌ、９５μｌ、１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ、２５０μｌ、３００μｌ、３５０μｌ、４００μｌ、４５０μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、１０００μｌを超えるか、約２５μｌ、約３０μｌ、約３５μｌ、約４０μｌ、約４５μｌ、約５０μｌ、約５５μｌ、約６０μｌ、約６５μｌ、約７０μｌ、約７５μｌ、約８０μｌ、約８５μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、約１００μｌ、約１５０μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、約３５０μｌ、約４００μｌ、約４５０μｌ、約５００μｌ、約６００μｌ、約７００μｌ、約８００μｌ、約９００μｌ、約１０００μｌを超えるか、または前述の値のいずれか２つにより定義される範囲、例えば、２５～１０００、２５～５００、２５～２００、５０～１５０、５００～１０００、２００～８００、２００～６００、４００～８００、もしくは６００～８００μｌである。一部の実施形態では、液体の投与は、液体の円板内注射または注入を含む。一部の実施形態では、液体の投与は、円板のＮＰにおけるアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の分布を増加させる。

【0159】

一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板の細胞を、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に１回感染させる。一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板の細胞を、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる。一部の実施形態では、細胞を医薬組成物の円板内注射によって感染させる。

【0160】

一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、各感染は、アデノウイルスベースのベクターの異なる数のゲノムコピーを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に少なくとも２回感染させる場合、第１の感染は、第２のまたは一切の後続の感染の１ｍｌ当たりのＧＣ数未満である１ｍｌ当たりのＧＣ数を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に少なくとも２回感染させる場合、第１の感染は、第２のまたは一切の後続の感染の１ｍｌ当たりのＧＣ数より多い１ｍｌ当たりのＧＣ数を含む。

【0161】

一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板の細胞を、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、各感染は、アデノウイルスベースのベクターの異なる数のゲノムコピーを含み、第１の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^９ＧＣ～１．４×１０^１０ＧＣ／ｍｌを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１１～１．４×１０^１２ＧＣを含むか、第１の感染は、１．４×１０^１０～１．４×１０^１１ＧＣ／ｍｌを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１１～１．４×１０^１２ＧＣを含むか、第１の感染は、１．４×１０^９～１．４×１０^１０ＧＣ／ｍｌを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１０～１．４×１０^１１ＧＣを含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^９ＧＣ～５．６×１０^９ＧＣ／ｍｌを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１０～５．６×１０^１０ＧＣを含むか、第１の感染は、１．４×１０^１０～５．６×１０^１０ＧＣ／ｍｌを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１１～５．６×１０^１１ＧＣを含むか、第１の感染は、１．４×１０^９～５．６×１０^９ＧＣ／ｍｌを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１１～５．６×１０^１１ＧＣを含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^９ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^１０ＧＣを含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^１０ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^１１ＧＣを含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^９ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^１１ＧＣを含むか、第１の感染は、第２のもしくは一切の後続の感染の１ｍｌ当たりのＧＣ数より多い１ｍｌ当たりのＧＣ数を含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１１～１．４×１０^１２ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^９～１．４×１０^１０ＧＣ／ｍｌを含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１１～１．４×１０^１２ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１．４×１０^１０～１．４×１０^１１ＧＣ／ｍｌを含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１０～１．４×１０^１１ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１．４×１０^９～１．４×１０^１０ＧＣ／ｍｌを含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１０～５．６×１０^１０ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^９～５．６×１０^９ＧＣ／ｍｌを含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１１～５．６×１０^１１ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１．４×１０^１０～５．６×１０^１０ＧＣ／ｍｌを含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^１１～５．６×１０^１１ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１．４×１０^９～５．６×１０^１０ＧＣ／ｍｌを含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^１０ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^１０ＧＣを含むか、第１の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^１１ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^１０ＧＣを含むか、または第１の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^１１ＧＣを含み、第２もしくは後続の感染は、１ｍｌ当たり２．８×１０^９ＧＣを含む。

【0162】

一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、各感染は、アデノウイルスベースのベクターの同じ数のゲノムコピーを含む。

【0163】

一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に少なくとも２回感染させる場合、各感染は、１ｍｌ当たり１．４×１０^９～５．６×１０^１０、１．４×１０^１０～５．６×１０^１０、１．４×１０^１１～５．６×１０^１１、２．８×１０^９、２．８×１０^１０、または２．８×１０^１１ＧＣを含む。

【0164】

一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、各感染が対象の同じ椎間板において行われる。

【0165】

一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板の細胞をアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系に２回以上感染させる場合、あらゆる第２および後続の感染が、前に感染を行った椎間板とは異なる対象の椎間板において行われる。

【0166】

一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板を感染させることは、本開示の医薬組成物の円板内注射を含む。本明細書に記載の「１つまたは複数の椎間板を感染させること」は、本開示を踏まえて読まれる場合、その通常かつ通例の意味を有し、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を患っている１つまたは複数の椎間板に本開示の医薬組成物を投与することを含み、投与することは、医薬組成物を、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を患っている、１つまたは複数の椎間板に、１つまたは複数の椎間板の円板内に、注射することを含む。一部の実施形態では、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を患っている椎間板に本開示の医薬組成物を投与することは、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を患っている１つまたは複数の椎間板に組成物を円板内注射により注射することによって行われる。一部の実施形態では、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を患っている椎間板に本開示の医薬組成物を投与することは、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態を患っている１つまたは複数の椎間板に組成物を関節内にではない方法により注射することによって行われる。

【0167】

一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板の細胞を感染させる工程は、本開示の医薬組成物を１つまたは複数の椎間板の軟骨終板（ＣＥＰ）領域、高度に組織化された線維輪（ＡＦ）領域もしくは中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）領域（髄核（ＮＰ）細胞）またはこれらの組合せに注射することを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の椎間板の細胞を感染させる工程は、医薬組成物を１つまたは複数の椎間板の髄核（ＮＰ）領域に注射することを含む。

【0168】

処置のモニタリング
一部の実施形態では、本開示の方法は、ｃ）本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系のある量（ａｎｄ ａｍｏｕｎｔ）、適宜、有効量を含む医薬組成物に感染させた、それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板の細胞におけるＩＬ－１Ｒａの発現後に、対象の変性された椎間板におけるＤＤＤの処置または進行をモニターする工程を、さらに含み得る。

【0169】

一部の実施形態では、対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有さない。

【0170】

一部の実施形態では、ＤＤＤの処置または進行のモニタリングは、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系のある量、適宜、有効量を含む医薬組成物に感染させたそれを必要とする対象における１つまたは複数の椎間板における、ＮＧＦ、ＮＴ－３、ＶＥＧＦ、サブスタンスＰ、サイトカイン：ＩＬ－１βＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ α、ＭＭＰ ３、ＭＭＰ １３、ＡＤＡＭＴＳ ４、アグリカンもしくはＩＩ型コラーゲンまたはこれらの組合せのレベルを決定することを含む。

【0171】

一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系のある量、適宜、有効量を含む医薬組成物に感染させた、それを必要とする対象における１つまたは複数の椎間板における、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングは、それを必要とする対象における疼痛、身体機能、患者の包括的評価、および椎間板画像診断を判定すること；患者報告疼痛および／もしくは機能測定からのスコアを使用して円板変性疾患の進行を評価すること；または対象の視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）スコアを決定することによりＤＤＤ関連疼痛を評価することを含み、ＶＡＳは、次のような、質問票に基づく得点評価システムであってもよい：０（疼痛なし）；１～３（軽度の疼痛）；４～６（中等度から重度の疼痛）：７～９（非常に重度の疼痛）；および１０（最悪の疼痛）。一部の実施形態、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングでは、対象のＶＡＳスコアが本開示の医薬組成物の注射後に、より高かったまたは不変であった場合、対象の椎間板における変性円板疾患は、管理されていないとまたは処置されていないとみなされる。一部の実施形態、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングでは、対象のＶＡＳスコアが本開示の医薬組成物の注射後に、より低かった場合、対象の椎間板における変性円板疾患は、管理または処置されているとみなされる。

【0172】

一部の実施形態では、それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板における円板変性疾患（ＤＤＤ）またはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングは、次のようなオスヴェストリー能力障害指数（ＯＤＩ）によって機能の喪失または獲得を評価することを含む：０～２０％（最小限の能力障害）；２１％～４０％（中等度の能力障害）；４１％～６０％（重度の能力障害）；６１～８０％（肢体不自由状態）：８１％～１００％（寝たきり状態または症状悪化）。一部の実施形態、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングでは、対象のＯＤＩスコアが本開示の医薬組成物の注射後に、より高かったまたは不変であった場合、対象の椎間板における変性円板疾患は、管理されていないとまたは処置されていないとみなされる。一部の実施形態、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングでは、対象のＯＤＩスコアが本開示の医薬組成物の注射後に、より低かった場合、対象の椎間板における変性円板疾患は、管理または処置されているとみなされる。

【0173】

一部の実施形態では、それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板におけるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングは、それを必要とする対象を、頸部または背下部における疼痛もしくは圧痛、脊椎の柔軟性および可動域、動作（着席および歩行を含む）に影響を与える疼痛およびこわばり、刺痛、しびれ、または上下肢の脱力のいずれか１つまたは全てについて身体検査することを含む。一部の実施形態では、それを必要とする対象の１つまたは複数の椎間板におけるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングは、それを必要とするヒトを、うつ、睡眠不足、痛覚過敏、中枢性感作、および破滅化、またはこれらの組合せについて身体検査することを含む。

【0174】

一部の実施形態では、それを必要とする対象の椎間板におけるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングは、放射線画像診断を使用して、（ａ）椎間板の高さの変化を示す椎体間の間隔；ならびに（ｂ）骨棘の形成、および隣接した椎体終板が硬化し、不規則であるかどうかを決定することを含む。一部の実施形態では、それを必要とする対象の椎間板におけるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングは、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）、超音波（ＵＳ）、および光干渉断層撮影（ＯＣＴ）のいずれか１つまたは組合せを使用して、それを必要とする対象の椎間板を画像診断することを含む。

【0175】

一部の実施形態では、それを必要とする対象の椎間板におけるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングは、椎間板におけるインターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）およびインターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）タンパク質濃度の測定；本開示のアデノウイルスベースのベクターに対する免疫応答を評価すること；本開示の医薬組成物または方法で処置されたヒトの血液試料を、抗カプシドおよび抗ＩＬ－１Ｒａ抗体の存在について試験すること；および／または本開示の医薬組成物または方法で処置されたヒトの椎間板組織および流体試料におけるＩＬ－１ＲａおよびＩＬ－１βタンパク質濃度を試験することを含む。

【0176】

一部の実施形態では、それを必要とする対象の椎間板におけるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングは、本開示の医薬組成物または方法で処置されたヒトの椎間板組織および流体試料におけるＮＧＦ、ＮＴ－３、ＶＥＧＦ、サブスタンスＰ、サイトカイン：ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ α、ＭＭＰ ３、ＭＭＰ １３およびＡＤＡＭＴＳ ４、アグリカンもしくはＩＩ型コラーゲンのレベルまたはこれらの組合せを決定することを含む。一部の実施形態、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングでは、ＮＧＦ、ＮＴ－３、ＶＥＧＦ、サブスタンスＰ、サイトカイン：ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ α、ＭＭＰ ３、ＭＭＰ １３およびＡＤＡＭＴＳ ４のいずれか１つまたは複数のレベルが、本開示の医薬組成物の注射後に、より高かったまたは不変であった場合、対象の椎間板における変性円板疾患は、管理されていないとまたは処置されていないとみなされる。一部の実施形態、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングでは、アグリカンまたはＩＩ型コラーゲンのいずれか１つまたは複数のレベルが、本開示の医薬組成物の注射後に、より低かった場合、対象の椎間板における変性円板疾患は、管理されていないとまたは処置されていないとみなされる。一部の実施形態、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングでは：医薬組成物の注射後の１つまたは複数の椎間板における（ａ）ＮＧＦ、ＮＴ－３、ＶＥＧＦ、サブスタンスＰ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ α、ＭＭＰ ３、ＭＭＰ １３もしくはＡＤＡＭＴＳ ４またはこれらの組合せのレベルの上昇、あるいは（ｂ）アグリカンもしくはＩＩ型コラーゲンまたはこれらの組合せのレベルの低下または不変、あるいは（ｃ）両方は、対象の椎間板における変性円板疾患が管理されていないまたは処置されていないことを示す。一部の実施形態、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングでは、ＮＧＦ、ＮＴ－３、ＶＥＧＦ、サブスタンスＰ、サイトカイン：ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ α、ＭＭＰ ３、ＭＭＰ １３およびＡＤＡＭＴＳ ４のいずれか１つまたは複数のレベルが、本開示の医薬組成物の注射後に、より低かった場合、対象の椎間板における変性円板疾患は、管理または処置されているとみなされる。一部の実施形態、ＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態の処置または進行のモニタリングでは、アグリカンまたはＩＩ型コラーゲンのいずれか１つまたは複数のレベルが、本開示の医薬組成物による感染後に、より高かった場合、本開示の医薬組成物による感染後、対象の椎間板における変性円板疾患は、管理または処置されているとみなされる。一部の実施形態、ＤＤＤの処置または進行のモニタリングでは：医薬組成物の注射後の１つまたは複数の椎間板における（ａ）ＮＧＦ、ＮＴ－３、ＶＥＧＦ、サブスタンスＰ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ α、ＭＭＰ ３、ＭＭＰ １３もしくはＡＤＡＭＴＳ ４またはこれらの組合せのレベルの低下または不変、あるいは（ｂ）アグリカンもしくはＩＩ型コラーゲンまたはこれらの組合せのレベルの上昇、または（ｃ）両方は、対象の椎間板における変性円板疾患が管理または処置されていることを示す。

【0177】

一部の実施形態では、ＤＤＤの処置または進行のモニタリングは、医薬組成物の注射後に１つまたは複数の椎間板についてのヒト椎間板変性症の組織病理スコアリングシステムに基づくスコアの変化を決定することにより行われる。一部の実施形態では、ヒト椎間板変性症の組織病理スコアリングシステムは、当技術分野において公知のスコアリングシステム、例えば、Christine L. Le Maitre et al., JOR Spine, Vol. 4, Issue 2, June 2021に記載されているグレード分類システム（グレード０～３）、Ｎａｃｈｅｍｓｏｎ分類システム（グレード１～４）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ分類システム（グレード１～５）、Ｇｒｉｅｓ分類システム（グレード１～４）、Ｂｏｏｓ分類システム（グレード０～２２）、Ｓｉｖｅ分類システム（グレード０～１２）およびＲｕｔｇｅｓ分類システム（グレード０～１２）のいずれか１つである。一部の実施形態、ＤＤＤの処置または進行のモニタリングでは、医薬組成物の注射後の１つまたは複数の椎間板についてのヒト椎間板変性症の組織病理スコアリングシステムに基づくスコアの増加または不変は、対象の椎間板における変性円板疾患が管理または処置されていないことを示す。一部の実施形態、ＤＤＤの処置または進行のモニタリングでは、医薬組成物の注射後の１つまたは複数の椎間板についてのヒト椎間板変性症の組織病理スコアリングシステムに基づくスコアの減少は、対象の椎間板における変性円板疾患が管理または処置されていることを示す。

【0178】

一部の実施形態では、本開示方法は、（ｄ）（ｃ）のモニターする工程によって、対象の椎間板の変性円板疾患が管理されていないまたは処置されないことが示された場合、（ａ）について１つまたは複数の椎間板の細胞へのアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の同じ量の投与を継続する工程；または（ｅ）（ｃ）のモニターする工程によって、対象の椎間板の変性円板疾患が進行したことが示された場合、（ａ）について、アデノウイルスベースの生物学的送達および発現系の量をさらに調整し、それを１つもしくは複数の椎間板の細胞に投与する工程をさらに含む。

【0179】

ＤＤＤ、ＤＤＤに関連する状態、およびそれに罹患している対象、
腰痛症（ＬＢＰ）は、人口の８０％に彼らの人生のある時点で発症する、世界的に見て病的状態の最大の原因である（Hoy DG et al., Ann Rheum Dis. 2014; Hoy D et al., Ann Rheum Dis. 2014）。ＬＢＰ症例の４０パーセントは、変性円板疾患（ＤＤＤ）として公知の変性過程での椎間板（ＩＶＤ）の損傷に起因する（Luoma K, et al., Spine. 2000）が、円板変性症それ自体が、必ずしもＬＢＰを伴うとは限らない（Brinjikji W et al., AJNR Am J Neuroradiol. 2015）。使い尽くされた保存的処置（例えば、鎮痛薬および理学療法）を受けた、ＩＶＤ変性症（ＩＤＤ）またはＤＤＤに起因する慢性ＬＢＰに罹患している患者には、侵襲的で費用のかかる外科的介入以外に残された選択肢がない。これまでのところ、何百万人もの人々の生活の質を低下させるＤＤＤの大きな社会経済的負担および影響にもかかわらず、ＤＤＤを食い止めることまたは好転させることができる処置はない。

【0180】

正常なＩＶＤは、軟骨終板（ＣＥＰ）、高度に組織化された線維輪（ＡＦ）、および中心部のゼラチン状の髄核（ＮＰ）という、３つの形態学的に明確に異なる領域で構成されており、これらは共同で、脊椎全体にわたって均一に荷重を伝達してエネルギーを分散させるように働く。これら３つの組織間の相互作用によって、ＩＶＤを健康に保つために必要な局所生物物理学的現象も支配される。ＣＥＰは、ＩＶＤの無血管内部構造への栄養素および酸素の拡散を助長する硝子軟骨の薄層である（Benneker LM et al., Spine. 2005; Bibby SR et al., Eur Spine J. 2004）。ＡＦは、ラメラに配向された大量の線維状Ｉ型コラーゲンを含有する。それは、脊椎の曲げおよびねじりからの張力に対する耐性（Shankar H et al., Techniques in Regional Anesthesia and Pain Management. 2009）および圧縮加重の影響下での高次に水和されたＮＰの外側への伸長に対する耐性をもたらす。ＮＰ細胞外基質（ＥＣＭ）は、プロテオグリカン（主として、アグリカン）が豊富な基質内にランダムに配列されたＩＩ型コラーゲン線維で主として構成されており（Mwale F et al., Eur.Cell Mater. 2004）、このプロテオグリカンが、円板膨張能力および圧縮に対する耐性をもたらし、その一方で、組織膨張が、コラーゲン網の線維を伸ばす（Dolan P et al., Clin.Biomech.(Bristol., Avon.). 2001）。円板の細胞は、機械的感受性であり、機械的負荷のこの内部機能的分配によって、円板組織の適切な生物学的維持にとって重要な生物物理学的シグナルが局所的に生じる。

【0181】

ＤＤＤは、細胞代謝の変更、基質合成および正常な基質成分の分解増加に起因するＥＣＭの漸進的変化、ならびに基質の組成の変化を特徴とする（Le Maitre CL et al., Biochem Soc Trans. 2007; Inkinen RI et al., J Rheumatol. 1998）。並行して、基質分解が、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテイナーゼ）およびＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンモチーフを有する、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）の上方制御により加速される（Pockert AJ et al., Arthritis Rheum. 2009; Le Maitre CL et al., J Pathol. 2004）。ＩＶＤ変性症中の基質の組成の変化は、組織細胞性の低下（Vo NV et al., Orthop Res. 2016）と共に、アポトーシス増加（Gruber HE et al., Spine. 1998, Zhao CQ et al., Apoptosis. 2006）および老化（Heathfield SK et al., Arthritis Res.Ther. 2008; Gruber HE et al., Spine. 2007; Le Maitre CL et al., Arthritis Res Ther. 2007; Roberts S et al., Eur Spine J. 2006）による細胞の変化も伴う。ＩＶＤの細胞は、大量の異化サイトカインおよびケモカインを産生し（Vo NV et al., Orthop Res. 2016; Phillips KL et al., Osteoarthritis Cartilage. 2015; Phillips KL et al., Arthritis Res Ther. 2013; Shamji MF et al., Arthritis Rheum. 2010）、最も高度な発現がＮＰおよび内部ＡＦに見られる（Phillips KL et al., Osteoarthritis Cartilage. 2015; Le Maitre CL et al., Arthritis Res Ther. 2005）。ＩＬ－１およびＩＬ－１Ｒａ（ＩＬ－１受容体アンタゴニスト）は、ＤＤＤの発病に極めて重要な役割を果たす（Hoyland JA et al., Rheumatology (Oxford). 2008; Phillips KL et al., Ann Rheum Dis. 2013; Karppinen J et al., Eur Spine J. 2009; Solovieva S et al., Eur Spine J. 2005; Solovieva S et al., Epidemiology. 2004; Solovieva S, et al., Pain. 2004; Eskola PJ et al., Int J Mol Epidemiol Genet. 2012; Kim DH et al., Spine (Phila Pa 1976). 2010; Paz Aparicio J et al., Eur Spine J. 2011; Le Maitre CL et al., nt J Exp Pathol. 2006）。

【0182】

本開示の方法の一部の実施形態では、ＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態に罹患している対象または罹患していると同定された対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、対象は、ＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態に罹患している対象または罹患していると同定された対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有さない。

【0183】

一部の実施形態では、ＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態に罹患しているヒトまたは罹患していると同定されたヒトは、２０歳より高齢から８０歳より高齢であるか、４０～５０歳の間であるか、または５０歳より高齢である。一部の実施形態では、ＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態に罹患しているヒト、または罹患していると同定されたヒトは、頸椎椎間板症（cervical disc disease）：円板の変性が脊椎の頸部に生じる；胸椎椎間板症（thoracic disc disease）：円板の変性が脊椎の中背部に生じる、または腰椎椎間板変性症（lumbar disc disease）：円板の変性が脊椎の下背部に生じる、に罹患している。一部の実施形態では、ＤＤＤは、椎間板の乾燥または椎間板の亀裂または椎間板スリップまたは椎間板ヘルニアを含むがこれらに限定されない、変性過程によって引き起こされる。一部の実施形態では、変性過程は、外傷または老化に起因する。

【0184】

一部の実施形態では、ＤＤＤに関連する状態は、腰痛、背筋緊張低下、背部柔軟性低下、もしくは血餅またはこれらの組合せであり得る。一部の実施形態では、ＤＤＤに関連する状態は、特発性腰痛症、腰髄神経根障害、脊髄症、腰部狭窄症、脊柱管狭窄症、脊椎の変形性関節症、脊椎症、脊椎すべり症、脊柱側弯症、関節突起間関節（zygapophydeal joint）変性症またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有さない。

【0185】

一部の実施形態では、ＤＤＤは、下記のようなＰｆｉｒｒｍａｎｎ分類によるグレード２、３、４および５のいずれか１つである：グレード２、核と輪との間が多少不鮮明である、水平帯を有する不均一な形状；グレード３、輪の形状がまだ認識可能である、核と輪との間が不鮮明な不均一な形状；グレード４、低強度であり、輪の形状が無傷でなく、核と輪との間の区別が不可能であり、円板の高さが通常は減少されている、不均一な形状；グレード５、円板腔が潰れていること以外、グレード４と同じ。

【0186】

一部の実施形態では、ＤＤＤは、下記のようなグレード１、２、３および４のいずれか１つの線維輪を有するものである：グレード１：造影剤が、亀裂を通って軟骨終板に入る；グレード２：造影剤が、骨終板に流入する；グレード３：造影剤が、終板の下の椎骨の海綿骨に侵入する；グレード４：造影剤が、海綿骨に完全に漏入する。一部の実施形態では、ＤＤＤの異なるステージまたはグレードは、ＣＴスキャン、ＭＲＩもしくはｘ線またはこれらの組合せを使用して診断される。

【0187】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＤＤＤは、頸部または腰部変性円板疾患のいずれか一方である。一部の実施形態では、ＤＤＤは、腰部変性円板疾患である。一部の実施形態では、本明細書に記載のＤＤＤは、脊柱骨対：Ｃ２－Ｃ３、Ｃ３－Ｃ４、Ｃ４－Ｃ５、Ｃ５－Ｃ６、Ｃ６－Ｃ７、Ｃ７－Ｔ１、Ｔ１－Ｔ２、Ｔ２－Ｔ３、Ｔ３－Ｔ４、Ｔ４－Ｔ５、Ｔ５－Ｔ６、Ｔ６－Ｔ７、Ｔ７－Ｔ８、Ｔ８－Ｔ９、Ｔ９－Ｔ１０、Ｔ１０－Ｔ１１、Ｔ１１－Ｔ１２、Ｔ１２－Ｌ１、Ｌ１－Ｌ２、Ｌ２－Ｌ３、Ｌ３－Ｌ４、Ｌ４－Ｌ５およびＬ５－Ｓ１間の椎間板またはこれらの任意の組合せのＤＤＤである。一部の実施形態では、ＤＤＤは、脊柱骨対：Ｌ４－Ｌ５間もしくはＬ５－Ｓ１間の椎間板またはこれらの組合せのＤＤＤである。

【0188】

一部の実施形態では、ヒトは、老化、遺伝的素因、肥満、代謝性疾患、関節損傷、脊柱への反復ストレス、スポーツ外傷もしくは骨変形またはこれらの組合せによって引き起こされるＤＤＤまたはＤＤＤに関連する状態に罹患している、あるいは罹患していると同定される。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有する。一部の実施形態では、対象は、椎間関節症候群（ＦＪＳ）を有さない。

【0189】

一部の実施形態では、ヒトは、次のステージのいずれか１つのＤＤＤもしくはＤＤＤに関連する状態に罹患している、または罹患していると同定される：ステージ１：脊椎が、その正常なバランスを失っており、脊椎湾曲障害の可能性があり、その結果、姿勢に影響を与える。関節および神経がストレスを受け、より急速に老化する。全エネルギーの低下およびさらには高さのわずかな減少があり得るが、疼痛も不快感もほとんどない；ステージ２：円板がより狭くなり、骨変形（骨棘）が現れるので、円板崩壊の程度がより大きい。姿勢の変化がより顕著になり、脊椎管狭窄も始まる。疼痛および不快感がより明らかであり、身長が減少し続けることがある。より全般的な疲弊、しかしまた、ストレスに対処する能力の低下；ステージ３：姿勢が、著しく影響される。より一層高度な円板薄化があり、中等度から重度の神経損傷および瘢痕組織形成があることもある。より進行した症例では、さらなる骨変形が起こる。患者の全身および／または精神状態の増悪ならびにエネルギーの大きな損失；およびステージ４：重度の脊椎損傷。円板の薄化がその最大のものであるか、またはさらに悪い例では、完全に消失する。バランスの悪い姿勢は深刻であり、動作および柔軟性が極度に制限される。患者は、多くの場合、顕著な神経損傷を被り、永久的な瘢痕組織が形成し、骨が癒着し始めることもある。重度の疼痛、ならびにより進行度の高い身体および／または精神機能低下を経験する。身長およびエネルギレベルの継続的な低下もある。ステージ４ ＤＤＤは、通常は不治とみなされる。

【0190】

本開示は、以下の実施例によってさらに例証されるが、以下の実施例を限定とみなすべきではない。

【実施例】

【0191】

［実施例１］
ＰＣＲＸ－２０１感染はＮＰ細胞の生存率に影響を与えない（レサズリン還元アッセイ）。
ヒト髄核（ＮＰ）細胞を外科手術試料からコラゲナーゼ消化によって単離した。各外科手術試料からの組織を組織学的グレード分類のためにパラフィンろうにも包埋し、この組織学的グレード分類は、０～３が変性していないものであり、４～６が中等度に変性したものであり、７～９が重度に変性したものである、０～９の尺度で、ＮＰ領域のみをグレード分類するヒトＩＶＤ変性症のためのコンセンサスグレード分類システムを利用するものであった。変性していないおよび変性した円板から得たＮＰ細胞を、最大で２継代まで単層培養で拡大させ、ＰＣＲＸ－２０１（ＦＸ２０１としても公知）に０、１００、５００、１０００、２０００および３００感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、２４時間、４８時間、７２時間および１週間でレサズリン還元アッセイを使用して代謝活性を（生存率のプロキシ測定量として）調査した。代謝活性の喪失は、３０００の最高ＭＯＩででもＰＣＲＸ－２０１感染後７２時間まで観察されなかったが、代謝活性の若干の低下が、ＭＯＩ ２０００および３０００での１週間の感染後に観察された（Ｐ＜０．０５）（図３）。

【0192】

［実施例２］
ＰＣＲＸ－２０１感染はＮＰ細胞の生存率に影響を与えない（ＤＮＡ含有量）
変性したヒトＩＶＤ（ｎ＝６、グレード分類：４、５、５、６、７および８）から得たＮＰ細胞を単層で０、７５０および３０００のＭＯＩでＰＣＲＸ－２０１に４８時間感染させ、次いで、アルジネートビーズ培養に移して、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）表現型を模倣し、再分化および増殖率を誘導した。アルジネートビーズを低グルコース培地におい５％Ｏ_２で維持して、最大２１日間、インビボ環境＋／－培養の最後の７日間、生理学的に適切な濃度のＩＬ－１β（１００ｐｇ／ｍｌ）での刺激を模倣した。４名の患者（グレード５、５、７、８）から得たＮＰ細胞において、ＥＬＩＳＡを使用してＩＬ－１Ｒａ産生を決定し、ピコグリーン定量化を使用してＤＮＡ含有量によって生存率を評価した。ＤＮＡ含有量の減少は、ＰＣＲＸ－２０１感染後の２１日のアルジネート培養後に観察されず（図４）、これは、細胞生存率に対する有害効果がないことを示唆していた。

【0193】

［実施例３］
ＰＣＲＸ－２０１は変性していないおよび変性した円板から得たヒトＩＶＤ細胞においてＩＬ－１Ｒａ遺伝子およびタンパク質の発現を誘導することができる
ＰＣＲＸ－２０１が、変性した円板から得たＮＰ細胞においてＩＬ－１Ｒａタンパク質を誘導することができるかどうかを調査するために、７つの患者試料（グレード：４、４、５、５、８、９および９）を、単独でのまたは追加の１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１β刺激と組み合わせた継代２の単層培養におけるＰＣＲＸ－２０１に、３０００のＭＯＩで４８時間、感染させた。ＩＬ－１β刺激を伴うおよび伴わない感染の４８時間および１２０時間後に、馴化培地を収集し、ＥＬＩＳＡを使用してＩＬ－１Ｒａ産生を決定した。単層培養における非感染ヒトＮＰ細胞のＩＬ－１βでの刺激は、４８時間および１２０時間後にＮＰ細胞によるＩＬ－１Ｒａ産生の有意な増加を誘導した（Ｐ＜０．０５）（図５Ａおよび５Ｂ）。単層培養でのＰＣＲＸ－２０１による感染は、感染から４８および１２０時間後に培養培地へのＩＬ－１Ｒａタンパク質分泌の大きな約１００倍の増加を誘導し（Ｐ＜０．０５）（図５Ａおよび５Ｂ）、産生は、ＩＬ－１β刺激後にさらに増進された。本明細書に記載の研究の結果は、ＰＣＲＸ－２０１が、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での単層および３Ｄ条件で、変性したヒトＮＰ細胞を感染させる能力およびその細胞におけるＩＬ－１Ｒａの産生を増加させる能力があることを実証した。

【0194】

［実施例４］
インビボ環境を模倣する条件での長期培養期間にわたってのＰＣＲＸ－２０１の維持およびＩＬ－１Ｒａの放出プロファイルの決定
変性したヒトＩＶＤ（ｎ＝６、グレード分類：４、５、５、６、７および８）から得たＮＰ細胞を単層で０、７５０および３０００のＭＯＩでＰＣＲＸ－２０１に４８時間感染させ、次いで、アルジネートビーズ培養に移して、インビボ表現型を模倣し、再分化および増殖率を誘導した。アルジネートビーズを低グルコース培地において５％Ｏ_２で維持して、最大２１日間、インビボ環境＋／－培養の最後の７日間、生理学的に適切な濃度のＩＬ－１β（１００ｐｇ／ｍｌ）での刺激を模倣した。ＩＬ－１Ｒａ産生を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。ＰＣＲＸ－２０１に感染させたＮＰ細胞によるＩＬ－１Ｒａタンパク質分泌は、アルジネート培養での２、７、１４および２１日後に、アルジネート培養での長期ＩＬ－１Ｒａ産生の維持に伴う経時的なＭＯＩの用量依存的増加と、ＭＯＩ ７５０での培養において２１日後に誘導されるＩＬ－１Ｒａ産生の約２０００倍増加およびＭＯＩ ３０００後の約３０００倍増加を示した（Ｐ＜０．０５）（図６Ａ～６Ｄ）。生理的濃度（１００ｐｇ／ｍｌ）でのＩＬ－１による刺激は、ＩＬ－１Ｒａ放出の有意な増加を誘導しなかった（図６Ａ～６Ｄ）。

【0195】

［実施例５］
ＰＣＲＸ－２０１に感染させた変性したＮＰ細胞からのＩＬ－１Ｒａ産生の長期維持
ＰＣＲＸ－２０１に感染させた変性したＮＰ細胞からのＩＬ－１Ｒａ産生の維持を調査するために、上記の培養を最大１０週間低グルコースＤＭＥＭ培地において５％Ｏ_２で維持して生理条件を模倣した。培養培地へのＩＬ－１Ｒａ放出を、感染後１、２、３、４、６、８および１０週間後に定量化した。ＰＣＲＸ－２０１に感染させた細胞からのＩＬ－１ Ｒａ産生は、培養で１０週間後でも有意に増進された（Ｐ＜０．０５）（図７）が、培養で８週間後、アルジネート培養物の完全性は、馴化培地におけるより低いＩＬ－１Ｒａ含有量と一致するアルジネート培養物からの細胞の喪失に伴って、減少された。これらの結果は、ヒトの変性した円板から単離されたＮＰ細胞におけるＰＣＲＸ－２０１の感染によって誘導されるＩＬ－１Ｒａタンパク質の産生が、低グルコースおよび５％Ｏ_２のネイティブ生理条件を模倣する３Ｄ培養環境で、少なくとも１０週間、高レベルで維持されることを実証する。

【0196】

［実施例６］
円板変性の異化特徴および疼痛誘導因子の放出に対するヒトＩＶＤ細胞におけるＰＣＲＸ－２０１によるＩＬ－１Ｒａ誘導の有効性
変性したヒトＮＰ組織（ｎ＝６、グレード分類：４、５、５、６、７および８）から得たＮＰ細胞を単層で０、７５０および３０００のＭＯＩで感染させ、アルジネートビーズ培養に移した。培養を、１４日間、インビボ環境を模倣するために低グルコース培地において５％Ｏ_２で維持した後、さらに１週間、＋／－１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ－１βで刺激した。血管新生および中和因子：ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、サイトカイン：ＩＬ－１、ＩＬ－６、およびＩＬ－８；ならびに基質分解酵素：ＭＭＰ ３およびＡＤＡＭＴＳ ４の発現を阻害するＰＣＲＸ－２０１の能力の決定は、馴化培地へのタンパク質の放出を調査することにより決定した。ＮＧＦの遺伝子発現も調査した。

【0197】

ＮＧＦタンパク質発現は、１つの患者試料の中で唯一低レベルで検出され、他の患者のものはＥＬＩＳＡの検出可能限界未満であったため、ＰＣＲＸ－２０１およびＮＧＦ産生の潜在的な影響を調査するために遺伝子発現解析を利用した（－５３－ｔｉｌｉｚｅｄ）。ＮＧＦ ｍＲＮＡ発現は、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ－１β刺激によって有意に増加され、その一方で、ＰＣＲＸ－２０１による感染は、ＮＧＦ ｍＲＮＡ発現の用量依存的減少を誘導した（図８）。

【0198】

ＶＥＧＦ産生は、ＰＣＲＸ－２０１に感染させた細胞において培養で７、１４および２１日後に有意に減少し、その一方で、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ－１βは、ＶＥＧＦの増加を誘導しなかった（図９Ａ～９Ｄ）。

【0199】

ＩＬ－１βタンパク質放出は、培養で２、７、１４および２１日に、ＰＣＲＸ－２０１感染後、用量依存的に有意に減少した（Ｐ＜０．０５）（図１０Ａ～１０Ｄ）。ＩＬ－６およびＩＬ－８タンパク質が、２日間の培養後、多くの患者試料の培養上清において、検出されなかった。ＩＬ－６は、培養で７、１４および２１日に、ＰＣＲＸ－２０１感染後、用量依存的に有意に減少し、ＩＬ－１βによる刺激は、全ての処置群においてＩＬ－６産生を増加させた（Ｐ＜０．０５）（図１１Ａ～１１Ｃ）。対照的に、ＩＬ－８産生は、ＩＬ－１β刺激による影響も、ＰＣＲＸ－２０１による感染による影響も受けなかった（図１２Ａ～１２Ｃ）。

【0200】

ＰＣＲＸ－２０１にＭＯＩ ７５０および３０００で感染させた、および再分化を可能にするためにアルジネート中で１４日間培養した後に１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ－１βによってさらに１週間の刺激した、変性した円板から得たＮＰ細胞において、基質分解酵素ＭＭＰ ３およびＡＤＡＭＴＳ ４の産生を調査した。ＭＭＰ ３およびＡＤＡＭＴＳ ４は、７５０および３０００両方のＭＯＩでのＰＣＲＸ－２０１後に有意に下方制御され（Ｐ＜０．０５）、その一方で、ＩＬ－１β刺激は、非感染細胞においてのみ、ＭＭＰ ３およびＡＤＡＭＴＳ ４産生の、有意でないが若干の増加を誘導した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。

【0201】

これらの結果は、変性した円板から得たＮＰ細胞のＰＣＲＸ－２０１による感染が、ＰＣＲＸ－２０１に感染させた細胞における肝要な異化、血管新生および神経栄養因子の産生を減少させることを実証する。

【0202】

ＰＣＲＸ－２０１感染ＮＰ細胞から放出されたＩＬ－１Ｒａが、パラ分泌方式で作用することもできるかどうか、したがって、ＰＣＲＸ－２０１に直接感染させた細胞のものに勝る円板への作用のさらなる除去を潜在的に送達するかどうかを判定すること。馴化培地を、ＰＣＸＲ－２０１に感染させた患者適合ヒトＮＰ細胞から収集し、それを利用して、７２時間、低グルコース培地において５％Ｏ_２で非感染対照細胞を処置した。未処置非感染対照細胞、およびＰＣＲＸ－２０１患者適合細胞からの馴化培地で刺激したものによる、ＩＬ－１Ｒａ（図１３Ａ）、ＩＬ－１β（図１３Ｂ）、ＩＬ－６（図１３Ｃ）、ＭＭＰ ３（図１３Ｄ）およびＡＤＡＭＴＳ ４（図１３Ｅ）のタンパク質産生を、ＥＬＩＳＡを使用して判定した。ＰＣＲＸ－２０１細胞からの馴化培地は、パラ分泌形式での非感染細胞におけるＩＬ－６、ＭＭＰ ３およびＡＤＡＭＴ ４のタンパク質産生を有意に減少させ（Ｐ＜０．０５）、その一方で、ＩＬ－１βの若干の増加が観察され、非常に低レベルがＩＬ－１Ｒａの増加濃度と比較して見られた。

【0203】

これらの結果は、変性した円板から得たＮＰ細胞のＰＣＲＸ－２０１による感染が、パラ分泌様式で、ＰＣＲＸ－２０１に感染させた細胞および局所細胞における肝要な異化、血管新生および神経栄養因子の産生を減少させることを実証する。

【0204】

［実施例７］
外植片モデルを使用して直接注射後にヒトＩＶＤ組織においてＩＬ－１Ｒａ産生を誘導するＰＣＲＸ－２０１の能力
ＰＣＲＸ－２０１を利用して、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子送達とは対照的にＩＬ－１ＲａをＩＶＤ内に直接送達することができるかどうかを判定するために、ＰＣＲＸ－２０１を、ＮＰ組織完全性および表現型を維持する半制限培養系内で培養したヒトＩＶＤ組織外植片に、直接注射した（図１４）。５つの患者試料（組織学的グレード分類：４、５、６、７および８）をこの研究に利用した。組織外植片を、３つの処置群、注射していない対照、ＰＣＲＸ－２０１を注射したもの（外植片１つ当たり５０μｌ）に分けた。３０００のＭＯＩを生じさせるために、４×１０６細胞／ｍｍ３の円板組織の細胞密度および９８．２ｍｍ３の組織外植片エリア（コア直径５ｍｍ、高さ５ｍｍ）に基づいて感染率を計算した。全ての処置を最大２週間、低グルコース、５％Ｏ_２培養において三連で行った。細胞培養上清を回収して、培地へのＩＬ－１Ｒａの放出をＥＬＩＳＡによって調査し、加えて、組織外植片をろうに加工し、免疫組織化学検査を利用して組織外植片におけるＩＬ－１Ｒａの発現を調査した。組織外植片からのＩＬ－１Ｒａタンパク質放出とＩＬ－１Ｒａについて免疫陽性のＮＰ組織内の細胞の数との両方の有意な増加が、ＮＰ組織外植片へのＰＣＲＸ－２０１の注射の２週間後に見られた（図１５Ａ～１５Ｂ）。

【0205】

さらに、これらの円板外植片を利用して、ネイティブＮＰ組織へのＰＣＲＸ－２０１の直接注射が、変性した円板において同化を促進し、異化過程を阻害することができるかどうかを調査した。細部培養上清を、ＥＬＩＳＡを使用してＶＥＧＦ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＭＭＰ ３、ＡＤＡＭＴ ４、ＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンについて解析し、パラフィン包埋組織外植片に免疫組織化学検査を行って、各外植片内のＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＩＬ－１β、ＭＭＰ ３、ＡＤＡＭＴ ４、ＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンについて免疫陽性である細胞のパーセンテージを決定した。変性した円板から得たヒトＮＰ組織外植片に対するＰＣＲＸ－２０１の注射は、ＶＥＧＦ（図１６Ａ）およびＭＭＰ３（図１６Ｄ）の濃度を有意に低下させ、Ｉｌ－１β（図１６Ｂ）およびＩＬ－６（図１６Ｃ）の低下も観察されたが、これは、有意性に至らなかった。培養培地に放出されたＡＤＡＭＴ ４タンパク質濃度は、注射の２週間後に変わりなかった（図１６Ｅ）。ごくわずかなＩＩ型コラーゲンが馴化培地において観察され（図１６Ｆ）、その一方で、アグリカンは、培地に放出され、それが、ＰＣＲＸ－２０１を注射したそれらの組織外植片では有意に減少され、これは、分解低減に起因する可能性があった（図１６Ｇ）。免疫組織化学解析は、これらの結果を確証し、ＶＥＧＦ（図１７Ａ）、ＩＬ－１β（図１７Ｃ）およびＭＭＰ ３（図１７Ｄ）の免疫陽性細胞の数が有意に減少した。免疫陽性細胞パーセンテージの有意でないが若干の低下が、ＡＤＡＭＴＳ ４についても見られた（図１７Ｅ）。一方、ＮＧＦ（図１７Ｂ）およびＩＩ型コラーゲン（図１７Ｆ）の免疫陽性細胞の数は、注射の２週間後に影響を受けていなかった。

【0206】

これらのデータは、ＰＣＲＸ－２０１が直接注射によってネイティブ組織内のＩＬ－１Ｒａ産生の増加を誘導することができることおよびこれがアグリカンの異化の低減および分解の減少を誘導することの証拠を提供する。

【0207】

結論：
まとめると、外科手術によって除去したヒトＩＶＤ組織から単離した細胞および組織を使用して行ったこれらのデータは、ＰＣＲＸ－２０１が、変性した円板から得たＮＰ細胞による活性ＩＬ－１Ｒａタンパク質産生を成功裏に増加させることができることを実証した。感染細胞によるＩＬ－１Ｒａタンパク質の発現を、グルコース、Ｏ_２、細胞表現型および増殖能の点でＩＶＤ環境を模倣する３Ｄ培養系において、長期間（最大１０週間調査した）維持することができた。誘導されたＩＬ－１Ｒａは、馴化培地での処理によって感染細胞においてパラ分泌方式で肝要な異化因子（分解酵素ならびに異化および炎症性サイトカイン）、血管新生および神経栄養因子（ＶＥＧＦおよびＮＧＦ）の下方制御をもたらした。さらに、ｅｘ ｖｉｖｏ培養系でのネイティブ円板組織へのＰＣＲＸ－２０１の直接注射は、注射した円板において異化の一致した減少に伴ってＩＬ－１Ｒａ産生および発現の増加を誘導した。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図16-4】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【配列表】

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【国際調査報告】