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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-16
(54)【発明の名称】抗４－１ＢＢナノボディ
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240808BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240808BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20240808BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240808BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240808BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240808BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240808BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240808BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240808BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240808BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240808BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240808BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240808BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240808BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240808BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C07K14/725
C07K19/00
C07K14/705
C12N15/62 Z
C12N15/13
C12N15/12
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/30
A61P35/00
A61K39/395 T
A61K39/395 E
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513383
(86)(22)【出願日】2022-08-29
(85)【翻訳文提出日】2024-03-28
(86)【国際出願番号】 CN2022115536
(87)【国際公開番号】W WO2023030258
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/115621
(32)【優先日】2021-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520266960
【氏名又は名称】ラノバ メディシンズ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】リー， ルンシェン
(72)【発明者】
【氏名】フアン， ウェンタオ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA92Y
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB11
4C085EE01
4C085GG02
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA42
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
抗４－１ＢＢナノボディ、およびこのナノボディを組み込んだ二重特異性抗体または多重特異性抗体が、提供される。がんなどの疾患を処置および診断するためにそれらの抗体を使用する方法もまた、提供される。その抗体またはポリペプチドと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物もまた提供される。その抗体またはポリペプチドをコードする１種もしくは複数種のポリヌクレオチド、その抗体またはそのフラグメントをコードする１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む単離された細胞もまた、さらに提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単一ドメイン抗体または前記単一ドメイン抗体を含むポリペプチドであって、前記単一ドメイン抗体はヒト４－１ＢＢタンパク質に対する結合特異性を有し、前記単一ドメイン抗体は相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号５８のアミノ酸配列および配列番号３２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号５９のアミノ酸配列および配列番号３８のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列および配列番号３１のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸配列および配列番号３２のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列および配列番号３３のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列および配列番号３４のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；
（ｏ）配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列および配列番号３３のアミノ酸配列；
（ｐ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３７のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号２３のアミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列および配列番号３８のアミノ酸配列；または
（ｒ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３９のアミノ酸配列
を含む、単一ドメイン抗体または前記単一ドメイン抗体を含むポリペプチド。
【請求項2】
前記ＣＤＲ１が配列番号１８のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が配列番号５８のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項3】
配列番号４０～４８および６０～６２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項4】
前記ＣＤＲ１が配列番号１８のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が配列番号５９のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が配列番号３８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項5】
配列番号４９～５７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項6】
配列番号１～１６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項7】
前記ポリペプチドが、４－１ＢＢとは異なる抗原に対する結合特異性を有するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）または４－１ＢＢとは異なる抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体と、４－１ＢＢではない標的抗原に対する結合特異性を有する第２の抗体または抗原結合性フラグメントとを含む、二重特異性抗体。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチドをコードする、１種または複数種のポリヌクレオチド。
【請求項10】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチドと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物。
【請求項12】
がんの処置を必要とする患者においてがんを処置する方法であって、前記患者に有効量の請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチドを投与する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
（背景）
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー９）は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、免疫細胞（自然免疫細胞および適応免疫細胞の両方）の活性化後に発現される共刺激分子である。４－１ＢＢは、種々の免疫細胞の活性を調節することにおいて重要な役割を果たす。４－１ＢＢアゴニストは、免疫細胞の増殖、生存、サイトカインの分泌およびＣＤ８ Ｔ細胞の細胞溶解活性を増強する。他の多くの研究により、４－１ＢＢの活性化がマウスにおいて腫瘍を除去する免疫応答を増強することが示された。したがって、４－１ＢＢはがん免疫学において有望な標的分子であることが、示唆された。
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー９）は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、免疫細胞（自然免疫細胞および適応免疫細胞の両方）の活性化後に発現される共刺激分子である。４－１ＢＢは、種々の免疫細胞の活性を調節することにおいて重要な役割を果たす。４－１ＢＢアゴニストは、免疫細胞の増殖、生存、サイトカインの分泌およびＣＤ８ Ｔ細胞の細胞溶解活性を増強する。他の多くの研究により、４－１ＢＢの活性化がマウスにおいて腫瘍を除去する免疫応答を増強することが示された。したがって、４－１ＢＢはがん免疫学において有望な標的分子であることが、示唆された。
【0002】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（ナノボディとしても知られている）は、単一のモノマー抗体可変ドメインからなる抗体フラグメントである。ラクダ科動物および他の特定の動物から作製されたナノボディは、ＶＨＨフラグメントとも呼ばれる。抗体全体と同様に、ナノボディは、特定の抗原に選択的に結合できる。わずか１２ｋＤａ～１５ｋＤａの分子量を有しており、単一ドメイン抗体は一般的な抗体（１５０ｋＤａ～１６０ｋＤａ）よりもかなり小さい。単一ドメイン抗体は、その小さいサイズおよび一本鎖の性質を考慮すると、他のタンパク質（例えば、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）および二重特異性抗体）中のフラグメントとして含めるために特に適切であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
（概要）
二重特異性抗体または三重特異性抗体に含むために適切な抗ヒト４－１ＢＢナノボディが、提供される。したがって、本開示の一実施形態において、単一ドメイン抗体またはこの単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが提供され、この単一ドメイン抗体はヒト４－１ＢＢタンパク質に対する結合特異性を有し、この単一ドメイン抗体は相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、このＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号５８のアミノ酸配列および配列番号３２のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号５９のアミノ酸配列および配列番号３８のアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列および配列番号３１のアミノ酸配列；（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸配列および配列番号３２のアミノ酸配列；（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列および配列番号３３のアミノ酸配列；（ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列および配列番号３４のアミノ酸配列；（ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；（ｈ）配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；（ｊ）配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；（ｋ）配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；（ｌ）配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；（ｍ）配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；（ｎ）配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；（ｏ）配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列および配列番号３３のアミノ酸配列；（ｐ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３７のアミノ酸配列；（ｑ）配列番号２３のアミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列および配列番号３８のアミノ酸配列；または（ｒ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３９のアミノ酸配列；のアミノ酸配列を含む。
二重特異性抗体または三重特異性抗体に含むために適切な抗ヒト４－１ＢＢナノボディが、提供される。したがって、本開示の一実施形態において、単一ドメイン抗体またはこの単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが提供され、この単一ドメイン抗体はヒト４－１ＢＢタンパク質に対する結合特異性を有し、この単一ドメイン抗体は相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、このＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号５８のアミノ酸配列および配列番号３２のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号５９のアミノ酸配列および配列番号３８のアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列および配列番号３１のアミノ酸配列；（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸配列および配列番号３２のアミノ酸配列；（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列および配列番号３３のアミノ酸配列；（ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列および配列番号３４のアミノ酸配列；（ｇ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；（ｈ）配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；（ｊ）配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列；（ｋ）配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；（ｌ）配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；（ｍ）配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；（ｎ）配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列；（ｏ）配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列および配列番号３３のアミノ酸配列；（ｐ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３７のアミノ酸配列；（ｑ）配列番号２３のアミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列および配列番号３８のアミノ酸配列；または（ｒ）配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３９のアミノ酸配列；のアミノ酸配列を含む。
【0004】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１は配列番号１８のアミノ酸配列を含み、そのＣＤＲ２は配列番号５８のアミノ酸配列を含み、そのＣＤＲ３は配列番号３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その単一ドメイン抗体またはポリペプチドは、配列番号４０～４８および６０～６２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0005】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１は配列番号１８のアミノ酸配列を含み、そのＣＤＲ２は配列番号５９のアミノ酸配列を含み、そのＣＤＲ３は配列番号３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その単一ドメイン抗体またはポリペプチドは、配列番号４９～５７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0006】
一部の実施形態において、その単一ドメイン抗体またはポリペプチドは、配列番号１～１６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0007】
その抗体またはポリペプチドと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物もまた提供される。その抗体またはポリペプチドをコードする１種もしくは複数種のポリヌクレオチド、その抗体またはそのフラグメントをコードする１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む単離された細胞もまた、さらに提供される。
【0008】
処置方法および使用もまた、提供される。一実施形態において、それを必要とする患者においてがんを処置する方法が提供され、この方法は、その患者に有効量の本開示の抗体またはポリペプチドを投与する工程を含む。一部の実施形態において、そのがんは固形腫瘍である。一部の実施形態において、そのがんは、膀胱がん、肝がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、消化器がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎がん、黒色腫、前立腺がんおよび甲状腺がんからなる群より選択される。一部の実施形態において、その方法は、その患者に第２のがん治療剤を投与する工程をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【0010】
【0011】
【0012】
【図4-2】同上。
【0013】
【0014】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
（詳細な説明）
（定義）
用語「ある（１つの）（ａ）」または「ある（１つの）（ａｎ）」実体とは、１つまたは複数のその実体を指すことが、留意されるべきであり；例えば、「（ある）抗体」は、１つまたは複数の抗体を示すと理解される。このように、用語「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」と、「１つまたは複数」と、「少なくとも１つ」とは、本明細書において交換可能に使用され得る。
（定義）
用語「ある（１つの）（ａ）」または「ある（１つの）（ａｎ）」実体とは、１つまたは複数のその実体を指すことが、留意されるべきであり；例えば、「（ある）抗体」は、１つまたは複数の抗体を示すと理解される。このように、用語「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」と、「１つまたは複数」と、「少なくとも１つ」とは、本明細書において交換可能に使用され得る。
【0017】
ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が別の配列に対して特定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８ ％または９９ ％）の「配列同一性」を有するとは、整列させた場合に、その２つの配列を比較する際にそのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が同じであることを意味する。この整列、および相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにおいて記載されているソフトウェアプログラムを使用して、決定され得る。好ましくは、デフォルトパラメータが整列のために使用される。整列プログラムの１つはＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメータを使用する。詳細には、プログラムはＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトパラメータを使用する：遺伝暗号（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ）＝標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）；フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）＝なし（ｎｏｎｅ）；鎖（ｓｔｒａｎｄ）＝両方（ｂｏｔｈ）；カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）＝６０；期待値（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０種の配列；ソーティング（ｓｏｒｔ ｂｙ）＝高スコア（ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ）；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅｓ）＝重複なしの（ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。生物学的に同等なポリヌクレオチドとは、上記の特定の相同性パーセントを有し、同じ生物学的活性または類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドである。
【0018】
用語「同等な核酸またはポリヌクレオチド」とは、核酸またはその相補体のヌクレオチド配列と特定の程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、核酸を指す。二本鎖核酸のホモログは、その相補体とまたはその相補体と、特定の程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むと意図される。一態様において、核酸のホモログは、その核酸またはその相補体とハイブリダイズ可能である。同様に、「同等なポリペプチド」とは、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と特定の程度の相同性または配列同一性を有するポリペプチドを指す。一部の態様において、その配列同一性は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％である。一部の態様において、その同等なポリペプチドまたは同等なポリヌクレオチドは、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドと比較した場合に１個、２個、３個、４個または５個の、付加、欠失、置換、およびそれらの組合せを有する。一部の態様において、その同等な配列は、参照配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば、塩架橋）を保持する。
【0019】
本明細書において使用される場合、「抗体」または「抗原結合性ポリペプチド」とは、抗原を特異的に認識して結合する、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、抗体全体および任意の抗原結合性フラグメントであっても、それらの単鎖であってもよい。したがって用語「抗体」は、その抗原に対する結合という生物学的活性を有する、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む、任意のタンパク質含有分子またはペプチド含有分子を含む。それらの例としては、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそれらのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、重鎖もしくは軽鎖の定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはそれらの任意の部分、あるいは結合タンパク質の少なくとも一部が挙げられるが、これらに限定されない。
【0020】
用語「抗体フラグメント」または「抗原結合性フラグメント」とは、本明細書において使用される場合、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの、抗体の部分である。構造に関係なく、抗体フラグメントは、そのインタクト抗体により認識されるのと同じ抗原に結合する。用語「抗体フラグメント」は、アプタマー、スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）、およびダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を含む。用語「抗体フラグメント」はまた、特定の抗原へ結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する、任意の合成タンパク質または遺伝子操作されたタンパク質を含む。
【0021】
「単鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」とは、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）との融合タンパク質を指す。一部の態様において、それらの領域は、１０アミノ酸～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結されている。そのリンカーは、可撓性のためにグリシンが豊富であり得、溶解度のためにセリンまたはスレオニンが豊富で有り得、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結にするかまたはその逆であるかのいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入にも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。ＳｃＦｖ分子は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。
【0022】
抗体という用語は、生化学的に区別され得る種々の広範な種類のポリペプチドを含む。重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、その中にいくつかのサブクラス（例えば、γｌ～γ４）があることを、当業者は理解する。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５など）は、十分に特徴付けられており、機能的特殊化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の改変バージョンは、本開示の範囲を考慮すれば当業者には容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内にある。免疫グロブリンのすべてのクラスが明らかに本開示の範囲内にあり、以下の議論は、一般的にＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子に関する。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量およそ２３，０００ダルトンの２つの同一な軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００～７０，０００の２つの同一な重鎖ポリペプチドとを含む。これらの４つの鎖は、典型的には、ジスルフィド結合によって「Ｙ」字構成で連結されており、これらの軽鎖は、この「Ｙ」字の入り口から始まって可変領域を通って続くこれらの重鎖を挟んでいる。
【0023】
本開示の抗体、抗原結合性ポリペプチド、それらの改変体、または誘導体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合性フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＫドメインまたはＶＨのいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメント、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書において開示されているＬＩＧＨＴ抗体に対する抗Ｉｄ抗体が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の免疫グロブリン分子または抗体分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２）またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。
【0024】
「特異的に結合する」または「に対する特異性を有する」によって、抗体がその抗原結合ドメインによってエピトープに結合すること、およびその結合はその抗原結合ドメインとそのエピトープとの間のいくらかの相補性を伴うことが、一般的に意味される。この定義にしたがって、抗体は、抗体がその抗原結合ドメインによってエピトープに、その抗体がランダムかつ無関連なエピトープに結合するよりも容易に結合する場合に、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、特定の抗体が特定のエピトープに結合する相対的親和性を定量化するために、本明細書において使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所定のエピトープに対して抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有すると考えられ得、または抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対してその抗体「Ａ」が有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われ得る。
【0025】
本明細書において使用される場合、用語「処置する」または「処置」とは、治療的処置および予防的手段または防止的手段の両方を指し、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害（例えば、がんの進行）を予防するまたは減速（減少）させることである。有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、検出可能であろうと検出不能であろうと、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延もしくは減速、疾患状態の好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）もしくは緩和、および寛解（部分的であろうと完全であろうと）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予測される生存と比較して、生存を延長させることも意味し得る。処置を必要とする者とは、その状態または障害を既に有する者、ならびにその状態または障害を有する傾向がある者、またはその状態または障害が予防されるべき者を含む。
【0026】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」によって、診断、予後判定、または治療が望まれる、任意の対象（特に哺乳動物対象）が意味される。哺乳動物対象としては、ヒト、家畜動物、農場の動物、および動物園の動物、スポーツ用動物、または愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシなど）が挙げられる。
【0027】
本明細書において使用される場合、「処置を必要とする患者に」または「処置を必要とする対象」などの句は、例えば、検出、診断手順、および／または処置のために使用される本開示の抗体もしくは組成物の投与から利益を受ける対象（例えば、哺乳動物対象）を含む。
【0028】
（抗４－１ＢＢナノボディ）
本開示は、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対するナノボディ（ヒト化ナノボディが挙げられる）を提供する。これらの抗体は、４－１ＢＢに対する高い結合親和性を有し、４－１ＢＢとそのリガンドとの間の相互作用を効果的に遮断し得る。実施例４において示されるとおり、これらの抗体は、Ｆｃ架橋の存在下でのみ、４－１ＢＢ媒介性ＮＦ－κＢ活性を誘導する強力な能力を示した。したがって、これらの抗体は、それら単独では４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しない非アゴニスト抗体である。しかし、第２の抗体と組み合わせた場合、その結果生じる二重特異性抗体は、その第２の抗体の標的抗原の存在下で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化し得る。換言すると、本ナノボディは、二重特異性抗体または多重特異性抗体への発展のために特に適している。
本開示は、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対するナノボディ（ヒト化ナノボディが挙げられる）を提供する。これらの抗体は、４－１ＢＢに対する高い結合親和性を有し、４－１ＢＢとそのリガンドとの間の相互作用を効果的に遮断し得る。実施例４において示されるとおり、これらの抗体は、Ｆｃ架橋の存在下でのみ、４－１ＢＢ媒介性ＮＦ－κＢ活性を誘導する強力な能力を示した。したがって、これらの抗体は、それら単独では４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しない非アゴニスト抗体である。しかし、第２の抗体と組み合わせた場合、その結果生じる二重特異性抗体は、その第２の抗体の標的抗原の存在下で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化し得る。換言すると、本ナノボディは、二重特異性抗体または多重特異性抗体への発展のために特に適している。
【0029】
したがって、本開示の一実施形態において、単一ドメイン抗体またはこの単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが提供され、この単一ドメイン抗体はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、これらのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ、表１中の抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を有する。
【0030】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＬＰ－３１７（配列番号１）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１７のアミノ酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列および配列番号３１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0031】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＬＰ－２６３（配列番号２）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸配列および配列番号３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0032】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＬＰ－３５５（配列番号３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列および配列番号３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0033】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－３ＬＰ－６６（配列番号４）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列および配列番号３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0034】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＬＰ－２６５（配列番号５）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0035】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－２ＬＰ－１３（配列番号６）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0036】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－３ＬＰ－１４２（配列番号７）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２０のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0037】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－３ＬＰ－８３（配列番号８）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0038】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＬＰ－４１７（配列番号９）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0039】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＬＰ－４２２（配列番号１０）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号１０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0040】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＬＰ－２３８（配列番号１１）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0041】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＬＰ－２８８（配列番号１２）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号１２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0042】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＳＰ（１）－１６８（配列番号１３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列および配列番号３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0043】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＳＰ（１）－５５（配列番号１４）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0044】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＳＰ（１）－７３（配列番号１５）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２３のアミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列および配列番号３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0045】
一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗体ＶＶ０２－１ＳＰ（１）－３５８（配列番号１６）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0046】
ヒト化抗体（例えば、抗体ＶＶ０２－１ＬＰ－２６３について配列番号４０～４８および６０～６２で提供されているヒト化抗体、ならびに抗体ＶＶ０２－１ＳＰ（１）－７３について配列番号４９～５７で提供されているヒト化抗体）もまた、提供される。ＶＶ０２－１ＬＰ－２６３（配列番号１８におけるＣＤＲ１、配列番号２５におけるＣＤＲ２および配列番号３２におけるＣＤＲ３）について、そのＣＤＲ２は、変異（Ｋａｂａｔ番号付けのＤ５４ＧおよびＤ６１Ｅ）のいずれかまたは両方を組み込み得る。したがって、一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号５８のアミノ酸配列および配列番号３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、配列番号４０～４８および６０～６２のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号４０～４８および６０～６２のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0047】
これらのヒト化配列のうち、２６３ ｈｕＮｂ－１－３＿１（配列番号６０）、２６３ ｈｕＮｂ－１－３＿２（配列番号６１）、および２６３ ｈｎＮｂ－１－３＿３（配列番号６２）が、さらに最適化されたヒト化配列であり、これらは、さらなる臨床開発のために適していることが示された（実施例７および図６～図７）。一部の実施形態において、その抗体は配列番号６０を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号６０に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、その抗体は配列番号６１を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号６１に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、その抗体は配列番号６２を含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号６２に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0048】
ＶＶ０２－１ＳＰ（１）－７３（配列番号２３におけるＣＤＲ１、配列番号３０におけるＣＤＲ２および配列番号３８におけるＣＤＲ３）について、１つの変異（Ｋａｂａｔ番号付けのＮ３１Ｓ）がそのＣＤＲ１に、または２つの変異（Ｋａｂａｔ番号付けのＤ５４ＳおよびＤ６１Ｅ）のうちのいずれかがそのＣＤＲ２に、それぞれ組み込まれ得る。したがって、一部の実施形態において、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号５９のアミノ酸配列および配列番号３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、その抗体は、配列番号４９～５７のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態において、その抗体は、記載されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号４９～５７のうちのいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【0049】
一部の実施形態において、ナノボディまたはそのナノボディを含むポリペプチドもまた提供され、これは、配列番号１７～２３から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２４～３０または５８～５９から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３１～３９から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。
【0050】
一部の実施形態において、ナノボディまたはそのナノボディを含むポリペプチドもまた提供され、これは、配列番号２１～２２から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。
【0051】
一部の実施形態において、本明細書において開示されている抗体のいずれかとヒト４－１ＢＢへの結合において競合する、抗４－１ＢＢ抗体および抗原結合性フラグメントもまた提供される。一部の実施形態において、本明細書において開示されている抗体のいずれかと同じエピトープに結合する、抗４－１ＢＢ抗体および抗原結合性フラグメントもまた提供される。一部の実施形態において、本明細書において開示されている抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、抗４－１ＢＢ抗体および抗原結合性フラグメントもまた提供される。
【0052】
その抗体またはポリペプチドと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物もまた、提供される。
【0053】
本明細書において開示されている抗体は、その由来元である天然に存在する結合性ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるように改変され得ることもまた、当業者により理解される。例えば、指定のタンパク質に由来するポリペプチド配列またはアミノ酸配列は、同様であり得、例えば、その出発配列に対して特定の同一性パーセントを有し得、例えば、それはその出発配列に対して６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり得る。一部の実施形態において、その改変された抗体またはフラグメントは、指定のＣＤＲ配列を保持する。
【0054】
特定の実施形態において、その抗体は、抗体に通常は付随しない、アミノ酸配列または１つもしくは複数の部分を含む。例示的な改変が、以下により詳細に記載される。例えば、本開示の抗体は、可撓性リンカー配列を含み得、または機能的部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、もしくは標識）を付加するように改変され得る。
【0055】
二重特異性抗体および多重特異性抗体もまた提供され、これらは、１単位、２単位、３単位または４単位の本明細書において開示される単一ドメイン抗４－１ＢＢ抗体と、１つまたは複数の他の特異性（４－１ＢＢではない）とを含む。
【0056】
（二重特異性抗体および多重特異性抗体、ならびにキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ））
提示されたとおり、本明細書に開示されている抗４－１ＢＢ抗体は、二重特異性抗体および多重特異性抗体、ならびにキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を調製するために特に有用である。これは、少なくとも、これらの抗体の増強された治療指数およびそれらの小さいサイズが原因である。
提示されたとおり、本明細書に開示されている抗４－１ＢＢ抗体は、二重特異性抗体および多重特異性抗体、ならびにキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を調製するために特に有用である。これは、少なくとも、これらの抗体の増強された治療指数およびそれらの小さいサイズが原因である。
【0057】
したがって、一実施形態において、本開示の抗４－１ＢＢナノボディまたはその抗原結合性フラグメントと、４－１ＢＢではない標的抗原に対する結合特異性を有する第２の抗体または抗原結合性フラグメントとを含む、二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態において、第３または第４の特異性が、さらに含まれる。
【0058】
その４－１ＢＢではない標的抗原は、一部の実施形態においては、腫瘍抗原である。多くの腫瘍抗原が当該分野で公知であり、新規な腫瘍抗原がスクリーニングによって容易に同定され得る。腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＡＢＬ、ＡＬＫ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＢＡＦＦ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ、ＢＴＫ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ７３、クローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）１８．２、ＣＴＬＡ－４、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、ＦＬＴ３、ＨＤＡＣ、ＨＥＲ２、ＩＤＨ２、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＪＡＫ１／２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＬＡＧ－３、ＭＥＫ、ネクチン（Ｎｅｃｔｉｎ）４、ＲＯＲ１、ｍＴＯＲ、ＰＡＲＰ、ＰＤ－１、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤ－Ｌ１、ＰＩ３Ｋδ、ＰＩＧＦ、ＰＴＣＨ、ＲＡＦ、ＲＡＮＫＬ、スムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲ２が挙げられる。他の例は、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン（Ｍｕｃｉｎ）、ＴＡＧ－７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、αＶβ３、α５β１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰおよびテネイシン（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）である。
【0059】
本開示のナノボディを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）もまた、提供される。そのＣＡＲにおいて、そのナノボディは抗原認識ドメインとして役立ち得る。さらに、一部の実施形態において、そのＣＡＲはまた、細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。
【0060】
そのヒンジ（スペーサーとも呼ばれる）は、その抗原認識領域と細胞の外膜との間に存在する、小さい構造ドメインである。適切なヒンジは、ｓｃＦｖレセプターのヘッド部の可撓性を増強して、そのＣＡＲとその標的抗原との間の空間的制約を減少する。例示的なヒンジ配列は、免疫分子（例えば、ＩｇＧ、ＣＤ８、およびＣＤ２８）に由来する膜近位領域をベースとする。
【0061】
その膜貫通ドメインは、細胞膜をまたぐ疎水性αヘリックスからなる構造成分である。それはＣＡＲを形質膜に固定して、その細胞外ヒンジドメインおよび抗原認識ドメインと細胞内シグナル伝達領域とに架橋する。代表的には、内部ドメインの膜近位成分に由来する膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８膜貫通ドメイン）が、使用され得る。
【0062】
その細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、細胞内部のレセプターの内部ドメイン中に存在する。抗原が外部抗原認識ドメインに結合された後に、ＣＡＲレセプター群が一緒になってクラスター形成し、活性化シグナルを伝達する。その後、そのレセプターの内部細胞質末端が、そのＴ細胞の内部のシグナル伝達を永続させる。このプロセスを模倣するために、ＣＤ３－ζの細胞質ドメインが、主要なＣＡＲ内部ドメイン成分として一般的に使用される。
【0063】
Ｔ細胞はまた、活性化後に持続するためにＣＤ３シグナル伝達に加えて共刺激分子を必要とする。一部の実施形態において、ＣＡＲレセプターの内部ドメインはまた、共刺激タンパク質（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、およびＣＤ１３７（４－１ＢＢ））に由来する１つまたは複数のキメラドメインを含む。
【0064】
（本抗体をコードするポリヌクレオチドおよびその抗体を調製する方法）
本開示はまた、本開示の抗体、その改変体または誘導体をコードする、単離されたポリヌクレオチドもしくは核酸分子を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子上または別々のポリヌクレオチド分子上に、本抗原結合性ポリペプチド、その改変体または誘導体の、重鎖可変領域全体および軽鎖可変領域全体をコードし得る。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子上または別々のポリヌクレオチド分子上に、本抗原結合性ポリペプチド、その改変体または誘導体の、重鎖可変領域の部分および軽鎖可変領域の部分をコードし得る。
本開示はまた、本開示の抗体、その改変体または誘導体をコードする、単離されたポリヌクレオチドもしくは核酸分子を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子上または別々のポリヌクレオチド分子上に、本抗原結合性ポリペプチド、その改変体または誘導体の、重鎖可変領域全体および軽鎖可変領域全体をコードし得る。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子上または別々のポリヌクレオチド分子上に、本抗原結合性ポリペプチド、その改変体または誘導体の、重鎖可変領域の部分および軽鎖可変領域の部分をコードし得る。
【0065】
抗体を作製する方法は、当該分野で周知であり、本明細書において記載されている。特定の実施形態において、本開示の抗原結合性ポリペプチドの可変領域および定常領域の両方は、完全にヒトのものである。完全ヒト抗体は、当該分野において記載されている技術を使用し、本明細書において記載されているとおりに、作製され得る。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原性チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変されたがその内在性遺伝子座は無効化されたトランスジェニック動物にその抗原を投与することによって、調製され得る。そのような抗体を作製するために使用され得る例示的な技術は、米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号において記載されており、これらの米国特許は、それらの全体が参照により援用される。
【0066】
（がんの処置）
本明細書において記載されるとおり、本開示の抗体、二重特異性抗体、ポリペプチド、改変体または誘導体は、特定の処置方法および診断方法において使用され得る。
本明細書において記載されるとおり、本開示の抗体、二重特異性抗体、ポリペプチド、改変体または誘導体は、特定の処置方法および診断方法において使用され得る。
【0067】
本開示はさらに、本明細書において記載されている障害または状態のうちの１つもしくは複数を処置するための抗体ベースの治療法に関し、これは、本開示の抗体を患者（例えば、動物、哺乳動物、およびヒト）に投与する工程を含む。本開示の治療化合物としては、本開示の抗体（本明細書において記載されているその改変体および誘導体を含む）ならびに本開示の抗体（本明細書において記載されているその改変体および誘導体を含む）をコードする核酸またはポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【0068】
一部の実施形態において、それを必要とする患者においてがんを処置するための方法が提供される。その方法は、一実施形態においては、その患者に有効量の本開示の抗体を投与する工程を含む。一部の実施形態において、その患者中のがん細胞（例えば、間質細胞）のうちの少なくとも１つは、腫瘍抗原を過剰発現する。
【0069】
細胞療法（例えば、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法またはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）ＮＫ細胞療法）もまた、本開示において提供される。本開示の抗体もしくはＣＡＲと接触して配置された（または代替的には、本開示の抗体もしくはＣＡＲを発現するように操作された）、適切な細胞が使用され得る。そのような接触または操作をされると、その後、その細胞は、処置を必要とするがん患者に導入され得る。そのがん患者は、本明細書において開示されている型のいずれかのがんを有し得る。その細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、例えば、腫瘍浸潤Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組合せであり得るが、これらに限定されない。
【0070】
一部の実施形態において、その細胞は、そのがん患者自身から単離された。一部の実施形態において、その細胞は、ドナーによって、または細胞バンクから、提供された。その細胞がそのがん患者から単離される場合、望ましくない免疫反応は最小化され得る。
【0071】
本開示の抗体またはその改変体もしくは誘導体を用いて処置、予防、診断および／あるいは予後判定され得る、細胞生存の増加に関連するさらなる疾患または状態としては、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病が挙げられる））ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）が挙げられる）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに固形腫瘍（肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵がん、乳がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫が挙げられるが、それらに限定されない）などの、悪性疾患および関連障害の進行ならびに転移が挙げられるが、それらに限定されない。
【0072】
（診断方法）
４－１ＢＢの過剰発現が特定の腫瘍サンプルにおいて観察され、４－１ＢＢを過剰発現する細胞を有する患者は、本開示の抗４－１ＢＢ抗体での処置に反応する可能性がある。したがって、本開示の抗体はまた、診断目的または予後判定目的のために使用され得る。
４－１ＢＢの過剰発現が特定の腫瘍サンプルにおいて観察され、４－１ＢＢを過剰発現する細胞を有する患者は、本開示の抗４－１ＢＢ抗体での処置に反応する可能性がある。したがって、本開示の抗体はまた、診断目的または予後判定目的のために使用され得る。
【0073】
細胞を好ましくは含むサンプルが患者から取得され得、その患者は、がん患者または診断を望む患者であり得る。その細胞は、その患者に由来する腫瘍組織もしくは腫瘍ブロック、血液サンプル、尿サンプル、または任意のサンプルの細胞であり得る。そのサンプルの必要に応じた事前処理を行って、そのサンプルは、本開示の抗体とともに、そのサンプル中に存在する可能性がある４－１ＢＢタンパク質とその抗体が相互作用するのを可能にする条件下でインキュベートされ得る。ＥＬＩＳＡなどの方法が使用されて、抗４－１ＢＢ抗体を利用して、そのサンプルにおける４－１ＢＢタンパク質の存在が検出され得る。
【0074】
そのサンプルにおける４－１ＢＢタンパク質の存在が（必要に応じて量または濃度とともに）、がんの診断のために、その患者がその抗体での処置のために適切であることの指標として、またはその患者ががん処置に反応した（もしくはしなかった）ことの指標として、使用され得る。予後判定方法のために、その検出は、がん処置を開始してその処置の進行を示すために、特定の段階で、１回、２回、またはそれよりも多く行われ得る。
【0075】
（組成物）
本開示はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、有効量の抗体と、受容可能なキャリアとを含む。一部の実施形態において、その組成物は、第２の抗がん薬（例えば、免疫チェックポイント阻害薬）をさらに含む。
本開示はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、有効量の抗体と、受容可能なキャリアとを含む。一部の実施形態において、その組成物は、第２の抗がん薬（例えば、免疫チェックポイント阻害薬）をさらに含む。
【0076】
特定の実施形態において、用語「薬学的に受容可能」とは、動物（より詳細にはヒト）における使用について、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識されている薬局方において列挙されていることを意味する。さらに、「薬学的に受容可能なキャリア」は、一般的には、非毒性で、固体もしくは半固体もしくは液体の、任意の型の充填剤、希釈剤、封入材料または製剤化助剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｕｘｉｌｉａｒｙ）である。
【0077】
用語「キャリア」とは、治療剤がともに投与される、希釈剤、佐剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的キャリアは、滅菌した液体、例えば、水および油（石油起源、動物起源、植物起源または合成起源の油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる）であり得る。その医薬組成物が静脈内投与される場合は、水が好ましいキャリアである。食塩溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、特に注射可能な溶液のための液体キャリアとして、使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。その組成物は、望まれる場合には、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩）もまた含み得る。抗菌薬（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；および張度調整剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）もまた、想定される。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態を採り得る。その組成物は、伝統的な結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリド）を用いて、坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、標準的なキャリア（例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（参照により本明細書に援用される）に記載されている。そのような組成物は、治療有効量の本抗原結合性ポリペプチド（好ましくは精製形態である）を、患者への適切な投与のための形態を提供するために適切な量のキャリアとともに含む。その製剤は、投与様式に適しているべきである。その非経口調製物は、ガラス製もしくはプラスティック製の、アンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量バイアルに封入され得る。
【0078】
ある実施形態において、その組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適合された医薬組成物として、慣用的な手順にしたがって製剤化される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌した等張性水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、その組成物はまた、可溶化剤および注射部位の痛みを緩和するための局所麻酔薬（例えば、リグノカイン）を含み得る。一般的には、それらの成分は、単位剤形で別々にかまたは一緒に混合した状態のいずれかで、例えば、活性物質の量を示す密封した容器（例えば、アンプルまたは小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ））中で凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、供給される。その組成物が注入により投与されるべき場合、その組成物は、滅菌した医薬品グレードの水または食塩水を含む輸液ボトルで分配され得る。その組成物が注射によって投与される場合、滅菌した注射用水または食塩水のアンプルが、それらの成分が投与前に混合され得るように提供され得る。
【実施例】
【0079】
（実施例）
（実施例１：ヒト４－１ＢＢに対するナノボディの作製）
本実施例は、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対するナノボディの作製を記載する。
（実施例１：ヒト４－１ＢＢに対するナノボディの作製）
本実施例は、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対するナノボディの作製を記載する。
【0080】
ラマを、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインと融合したヒト４－１ＢＢの組換えＥＣＤで免疫化した。その血清が十分な力価の抗４－１ＢＢ抗体を含んだラマを、ファージライブラリーの作製のために選択した。簡単に述べると、免疫化したラマから収集した末梢血からリンパ球を単離した。そのリンパ球のＲＮＡを抽出し、ＶＨＨドメインをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、Ｍ１３ファージディスプレイをベースとするナノボディライブラリーの構築のために使用した。数回のパニングを適用して、抗４－１ＢＢナノボディを発現するファージライブラリーをスクリーニングした。
【0081】
その陽性クローンすべてを、配列決定の前にＥＬＩＳＡアッセイおよびＦＡＣＳアッセイを通じてスクリーニングした。その配列の多様性に基づいて、１６個の独特なクローンを選択した。それらの配列を表１に示す。Ｃ末端にＮ２９７Ａ変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントと融合した抗４－１ＢＢナノボディを、一連の機能的アッセイ（結合、リガンド競合および４－１ＢＢシグナル活性化を含む）を通じてそれらの特異性および活性について特徴付け、その結果、さらなるヒト化のためのリードナノボディを同定した。
（表１．選択した１６個の独特なクローンの配列）
（表１．選択した１６個の独特なクローンの配列）
【表1-1】
【表1-2】
【0082】
それらのＣＤＲ配列を以下の表１Ａに要約する。
（表１Ａ．選択した１６個の独特なクローンの配列）
（表１Ａ．選択した１６個の独特なクローンの配列）
【表1A】
【0083】
抗体ＶＶ０２－１ＬＰ－４１７、ＶＶ０２－１ＬＰ－４２２、ＶＶ０２－１ＬＰ－２３８、およびＶＶ０２－１ＬＰ－２８８が非常に類似したＣＤＲを共有するように見え、一方で、残りの抗体もまた相同なＣＤＲを有する。
【0084】
（実施例２．抗４－１ＢＢナノボディの可溶性４－１ＢＢ結合特性）
本実施例は、生じた抗４－１ＢＢナノボディのヒト４－１ＢＢタンパク質およびカニクイザル４－１ＢＢタンパク質に対する結合特性をＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。
本実施例は、生じた抗４－１ＢＢナノボディのヒト４－１ＢＢタンパク質およびカニクイザル４－１ＢＢタンパク質に対する結合特性をＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。
【0085】
Ｈｉｓタグ付き４－１ＢＢを２μｇ／ｍｌで一晩コートし、その後、ＰＢＳ中２％のＢＳＡによってブロッキングした。系列希釈した抗４－１ＢＢナノボディを、そのコートした抗原とともに室温で１時間インキュベートし、参照抗体「参照モノクローナル抗体（Ｒｅｆ ｍＡｂ）」を用いた。生じたプレートをＰＢＳ／Ｔで洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰとともに室温で１時間インキュベートした。それらのプレートをＴＭＢ基質で発色させ、分光光度計によってＯＤ ４５０ｎｍにて分析した。これらのＥＬＩＳＡアッセイの結果を図１および表２に示す。この表２は、ヒト４－１ＢＢタンパク質およびカニクイザル４－１ＢＢタンパク質への結合のＥＣ５０を示す。
（表２．ヒト４－１ＢＢタンパク質およびカニクイザル（Ｃｙｎｏ）４－１ＢＢタンパク質に関する結合ＥＣ５０（ｎＭ））
（表２．ヒト４－１ＢＢタンパク質およびカニクイザル（Ｃｙｎｏ）４－１ＢＢタンパク質に関する結合ＥＣ５０（ｎＭ））
【表2】
【0086】
（実施例３．抗４１ＢＢナノボディによる４－１ＢＢ／４－１ＢＢリガンド相互作用の遮断）
本実施例において、抗４１ＢＢナノボディを、４－１ＢＢのそのリガンドへの結合をそれらの抗４１ＢＢナノボディが遮断する能力について調べた。
本実施例において、抗４１ＢＢナノボディを、４－１ＢＢのそのリガンドへの結合をそれらの抗４１ＢＢナノボディが遮断する能力について調べた。
【0087】
ヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を、系列希釈した抗４１ＢＢナノボディの存在下でビオチン化ヒト４－１ＢＢリガンド（０．３μｇ／ｍｌ）とともに４℃にて１時間インキュベートし、参照抗体として参照モノクローナル抗体（Ｒｅｆ ｍＡｂ）を用いた。その後、細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３結合体化ストレプトアビジンとともにインキュベートした。結合を、Ａｇｉｌｅｎｔフローサイトメーターを用いて測定した。図２および表３に示すとおり、試験したナノボディのすべてが４－１ＢＢへの４－１ＢＢリガンドの結合を濃度依存的様式で遮断し得た一方で、参照モノクローナル抗体（Ｒｅｆ ｍＡｂ）はそのような効果を有しなかった。
（表３．４－１ＢＢ／４－１ＢＢリガンド相互作用に関する競合ＩＣ５０（ｎＭ））
（表３．４－１ＢＢ／４－１ＢＢリガンド相互作用に関する競合ＩＣ５０（ｎＭ））
【表3】
【0088】
（実施例４．Ｊｕｒｋａｔ－４１ＢＢ ＮＦκＢレポーターアッセイにおける抗４１ＢＢナノボディの機能的特性）
本実施例は、４－１ＢＢレポーターアッセイにおける抗４１ＢＢナノボディの機能的特性を評価した。
本実施例は、４－１ＢＢレポーターアッセイにおける抗４１ＢＢナノボディの機能的特性を評価した。
【0089】
このアッセイにおいて、そのエフェクター細胞は、ヒト４－１ＢＢを安定的に発現し、そのゲノム中に組み込まれたＮＦκＢルシフェラーゼレポーター構築物を有する、４－１ＢＢ ＮＦκＢレポーターＪｕｒｋａｔ細胞株であった。４－１ＢＢ活性化後に、内在性ＮＦκＢ転写因子がＤＮＡ応答エレメントに結合して、そのルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導する。その後、このルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質産物を、その発光シグナルを測定することによって定量化する。４－１ＢＢ ＮＦκＢレポーターＪｕｒｋａｔ細胞株を、標的細胞株ＣＨＯ－Ｋ１またはヒトＦｃγレセプターＩＩ Ｂを過剰発現するＦｃγＲＩＩＢ－ＣＨＯ－Ｋ１細胞株とともに共培養した。抗体を系列希釈し、白色の９６ウェルアッセイプレートに添加した。３７℃にて１６時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼの基質を添加することによって発光を得、マイクロプレートリーダーによって測定した。
【0090】
図３および表４に示すとおり、試験した４－１ＢＢナノボディは、Ｆｃ架橋の存在下で４－１ＢＢ媒介性ＮＦ－κＢ活性を誘導し、ＥＣ５０範囲は０．００２ｎＭ～０．０８１ｎＭであった。しかし、Ｆｃ架橋が存在しない場合は、試験した抗体はＮＦ－κＢシグナルを活性化できなかった。
（表４．Ｊｕｒｋａｔ－４１ＢＢ ＮＦκＢレポーターアッセイにおけるＥＣ５０（ｎＭ））
（表４．Ｊｕｒｋａｔ－４１ＢＢ ＮＦκＢレポーターアッセイにおけるＥＣ５０（ｎＭ））
【表4】
【0091】
（実施例５．抗４１ＢＢナノボディヒト化）
リードナノボディ（ＶＶ０２－１ＬＰ－２６３およびＶＶ０２－１ＳＰ（１）－７３）のヒト化を、ＣＤＲ移植および復帰変異戦略によって行った。それらのヒト化配列を表５に示す。
（表５．ヒト化リードナノボディの配列）
リードナノボディ（ＶＶ０２－１ＬＰ－２６３およびＶＶ０２－１ＳＰ（１）－７３）のヒト化を、ＣＤＲ移植および復帰変異戦略によって行った。それらのヒト化配列を表５に示す。
（表５．ヒト化リードナノボディの配列）
【表5-1】
【表5-2】
【0092】
ＶＶ０２－１ＬＰ－２６３について、２つの変異（Ｋａｂａｔ番号付けのＤ５４ＧおよびＤ６１Ｅ）をＣＤＲ２に導入して、開発可能性を向上させた。ＶＶ０２－１ＳＰ（１）－７３について、１つの変異（Ｋａｂａｔ番号付けのＮ３１Ｓ）をＣＤＲ１に、２つの変異（Ｋａｂａｔ番号付けのＤ５４ＳおよびＤ６１Ｅ）をＣＤＲ２に、それぞれ導入して、開発可能性を向上させた。それらの配列の比較を以下の表５Ａに示す。
（表５Ａ．更新したＣＤＲ）
（表５Ａ．更新したＣＤＲ）
【表5A】
【0093】
（実施例６．抗４－１ＢＢヒト化ナノボディの細胞表面４－１ＢＢ結合特性）
細胞ベースの設定における抗原結合特性を評価するために、４－１ＢＢヒト化ナノボディを、ＣＨＯ－Ｋ１細胞上で過剰発現させた４－１ＢＢへのそれらの４－１ＢＢヒト化ナノボディの結合についてＦＡＣＳによって分析した。
細胞ベースの設定における抗原結合特性を評価するために、４－１ＢＢヒト化ナノボディを、ＣＨＯ－Ｋ１細胞上で過剰発現させた４－１ＢＢへのそれらの４－１ＢＢヒト化ナノボディの結合についてＦＡＣＳによって分析した。
【0094】
簡単に述べると、ヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞またはカニクイザル４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を、系列希釈した抗４－１ＢＢナノボディとともに４℃にて３０分間インキュベートした。その後、それらの細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３結合体化抗ヒトＦｃ二次抗体とともにインキュベートした。結合を、Ａｇｉｌｅｎｔフローサイトメーターで測定した。それらの結果は、試験したヒト化ナノボディすべてが、細胞表面ヒト４－１ＢＢおよび細胞表面カニクイザル（ｃｙｎｏ）４－１ＢＢに対して典型的なシグモイド型結合挙動を示したことを示した（図４および図５）。それらの結合ＥＣ５０を表６および表７に適宜示す。
（表６．親クローンＶＶ０２－１ＬＰ－２６３に由来するヒト化ナノボディの細胞表面４－１ＢＢに関する結合ＥＣ５０（ｎＭ））
（表７．親クローンＶＶ０２－１ＳＰ（１）－７３に由来するヒト化ナノボディの細胞表面４－１ＢＢに関する結合ＥＣ５０（ｎＭ））
（表６．親クローンＶＶ０２－１ＬＰ－２６３に由来するヒト化ナノボディの細胞表面４－１ＢＢに関する結合ＥＣ５０（ｎＭ））
【表6】
【表7】
【0095】
（実施例７．部位変異による抗４－１ＢＢナノボディの配列最適化）
これらの候補の開発可能性をさらに増大させるために、抗４－１ＢＢナノボディＶＶ０２－１ＬＰ－２６３ ｈｕＮｂ＿１＿３を選択して、部位変異によって最適化した。その最適化配列を表８に示す。
（表８．ＶＶ０２－１ＬＰ－２６３ ｈｕＮｂ＿１＿３の最適化配列）
これらの候補の開発可能性をさらに増大させるために、抗４－１ＢＢナノボディＶＶ０２－１ＬＰ－２６３ ｈｕＮｂ＿１＿３を選択して、部位変異によって最適化した。その最適化配列を表８に示す。
（表８．ＶＶ０２－１ＬＰ－２６３ ｈｕＮｂ＿１＿３の最適化配列）
【表8】
【0096】
二重特異性抗体を構築するための最適化抗４－１ＢＢ配列の実現可能性を評価するために、この最適化抗４－１ＢＢを、Ｆｃフラグメント中にＮ２９７Ａ変異を有する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的化するＩｇＧ１抗体の重鎖Ｃ末端に、Ｇ４Ｓリンカーを介して融合させた。その後、それらの軽鎖発現ベクターおよび重鎖発現ベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞中に同時トランスフェクトした。一過性トランスフェクション後に、それらの二重特異性抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって培地から精製した。十分に適格な抗体をインビトロ特徴付け（細胞ベースの４－１ＢＢ結合、４－１ＢＢ活性化および開発可能性評価を含む）に適用した。
【0097】
（細胞ベースの４－１ＢＢ結合）
それらの最適化４－１ＢＢナノボディをベースとする二重特異性抗体を、ＣＨＯ－Ｋ１細胞上に過剰発現させた４－１ＢＢへのそれらの結合について、上記のプロトコルにしたがって分析した。図６に示すとおり、それらの最適化抗４－１ＢＢ配列は、４－１ＢＢを保有するＣＨＯ－Ｋ１細胞に対して親配列と匹敵する結合活性を維持した。
それらの最適化４－１ＢＢナノボディをベースとする二重特異性抗体を、ＣＨＯ－Ｋ１細胞上に過剰発現させた４－１ＢＢへのそれらの結合について、上記のプロトコルにしたがって分析した。図６に示すとおり、それらの最適化抗４－１ＢＢ配列は、４－１ＢＢを保有するＣＨＯ－Ｋ１細胞に対して親配列と匹敵する結合活性を維持した。
【0098】
（ＴＡＡ依存性４－１ＢＢ活性化）
抗ＴＡＡ－４－１ＢＢ二重特異性抗体が４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する能力を評価するために、古典的なレポーター遺伝子アッセイを使用した。このアッセイにおいて、４－１ＢＢを安定的に発現し、そのゲノム中に組み込まれたＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター構築物を有する、操作したＪｕｒｋａｔ細胞を、エフェクター細胞として使用した。ＴＡＡを過剰発現するように操作したＣＨＯ－Ｋ１細胞またはブランクのＣＨＯ－Ｋ１細胞を、標的細胞として使用した。これらの２種類の細胞を、５％ ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて一晩、種々の濃度の抗体とともに共インキュベートした。その後、ルシフェラーゼの基質を添加し、その発光強度をマイクロプレートリーダーによって決定した。
抗ＴＡＡ－４－１ＢＢ二重特異性抗体が４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する能力を評価するために、古典的なレポーター遺伝子アッセイを使用した。このアッセイにおいて、４－１ＢＢを安定的に発現し、そのゲノム中に組み込まれたＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター構築物を有する、操作したＪｕｒｋａｔ細胞を、エフェクター細胞として使用した。ＴＡＡを過剰発現するように操作したＣＨＯ－Ｋ１細胞またはブランクのＣＨＯ－Ｋ１細胞を、標的細胞として使用した。これらの２種類の細胞を、５％ ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて一晩、種々の濃度の抗体とともに共インキュベートした。その後、ルシフェラーゼの基質を添加し、その発光強度をマイクロプレートリーダーによって決定した。
【0099】
図７に示すとおり、それらの最適化抗４－１ＢＢをベースとする二重特異性抗体は、標的細胞の存在下での４－１ＢＢ活性化の誘導において、親抗体ＴＡＡ－２６３－１－３に匹敵する効力を有した。
【0100】
（熱安定性評価）
強制分解試験を行って、ＴＡＡ－４－１ＢＢ二重特異性抗体の熱安定性を評価した。それらの抗体を、２０ｍＭ Ｈｉｓ、６％スクロース＋０．０２％ ＰＳ８０ ｐＨ６．０を含む緩衝液中で、４０℃にて２週間インキュベートした。代表的な品質属性（特に、凝集およびフラグメント化）を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して２週間でモニターした。親抗４－１ＢＢ配列に由来する二重特異性抗体は、インキュベーション中の凝集およびフラグメント化によって証明されるとおり、乏しい熱安定性を示した。対照的に、最適化４－１ＢＢ配列をベースとする新規ＴＡＡ－４－１ＢＢ二重特異性抗体は、４０℃にて２週間、許容可能な熱安定性を示し、これは、前進させるのに妥当な有望な開発可能性を示す（表９）。
（表９．強制分解試験におけるＴＡＡ－４－１ＢＢ二重特異性抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣ特徴付け）
* * *
強制分解試験を行って、ＴＡＡ－４－１ＢＢ二重特異性抗体の熱安定性を評価した。それらの抗体を、２０ｍＭ Ｈｉｓ、６％スクロース＋０．０２％ ＰＳ８０ ｐＨ６．０を含む緩衝液中で、４０℃にて２週間インキュベートした。代表的な品質属性（特に、凝集およびフラグメント化）を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して２週間でモニターした。親抗４－１ＢＢ配列に由来する二重特異性抗体は、インキュベーション中の凝集およびフラグメント化によって証明されるとおり、乏しい熱安定性を示した。対照的に、最適化４－１ＢＢ配列をベースとする新規ＴＡＡ－４－１ＢＢ二重特異性抗体は、４０℃にて２週間、許容可能な熱安定性を示し、これは、前進させるのに妥当な有望な開発可能性を示す（表９）。
（表９．強制分解試験におけるＴＡＡ－４－１ＢＢ二重特異性抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣ特徴付け）
【表9】
【0101】
本開示は、本開示の個別の態様の個々の例示として意図される記載された具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に同等であるあらゆる組成物または方法が本開示の範囲内にある。種々の改変および変形が、本開示の趣旨からも範囲からも逸脱することなく、本開示の方法および組成物において実施され得ることが、当業者にとって明らかである。したがって、本開示は、本開示の改変および変形が添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内にあるという条件で、それらの本開示の改変および変形を含むことが、意図される。
【0102】
本明細書において言及されたすべての公開物および特許出願は、あたかも個々の公開物または特許出願が参照によって援用されると具体的で個別に示された場合と同じ程度に、本明細書において参照によって援用される。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】