特表 2024-530352 標的ポリヌクレオチドの配列を分析するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-16

(54)【発明の名称】標的ポリヌクレオチドの配列を分析するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20240808BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024514518

(86)(22)【出願日】2021-09-07

(85)【翻訳文提出日】2024-04-26

(86)【国際出願番号】 CN2021116930

(87)【国際公開番号】W WO2023035110

(87)【国際公開日】2023-03-16

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516122667

【氏名又は名称】深▲セン▼華大智造科技股▲ふん▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＭＧＩ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】Ｍａｉｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄ Ｆｌｏｏｒ ｏｆ Ｎｏ．１１ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｂｅｉｓｈａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｚｏｎｅ，Ｙａｎｔｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０８３，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ゴン， メイファ

(72)【発明者】

【氏名】ジョウ， シュアン

(72)【発明者】

【氏名】ワン， ジンジン

(72)【発明者】

【氏名】リ， ジグァン

(72)【発明者】

【氏名】マ， カシン

(72)【発明者】

【氏名】ルオ， ユーフェン

(72)【発明者】

【氏名】シュ， チョンジュン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， ホイ

(72)【発明者】

【氏名】リュウ， チアン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ06

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR42

4B063QR62

4B063QR66

4B063QS26

4B063QS36

(57)【要約】

本発明は、ヌクレオチド混合物及びポリメラーゼを複数回重合させることによって、完全重合を達成し、それによって、シーケンシングの要件を満たし、リード長及び精度を向上させる、標的ポリヌクレオチドの配列を分析するための方法に関する。更に、本発明は、試薬テストキットに関し、この試薬テストキットは、ポリヌクレオチドの分析又はシーケンシングに使用される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的ポリヌクレオチドの配列を分析するための方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを提供するステップと、
（ｂ）ハイブリダイゼーション又はアニーリングを可能にする条件下で、前記標的ポリヌクレオチドをプライマーと接触させ、それによって、前記標的ポリヌクレオチドと成長鎖として使用される前記プライマーとを含む部分二重鎖を形成する、ステップと、
（ｃ）前記部分二重鎖をポリメラーゼ及び第１のヌクレオチド混合物と、前記成長鎖が伸長されるように前記ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことができる条件下で接触させるステップであって、前記第１のヌクレオチド混合物は、標識で標識された少なくとも１種のヌクレオチドを含み；
任意選択で、前記第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを更に含み；例えば、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含み；
前記第１のヌクレオチド混合物中の各ヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、核酸鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基（例えば、２’－又は３’－酸素原子基を介して結合した保護基）を含む、ステップと；
（ｄ）前のステップの生成物をポリメラーゼ及び第２のヌクレオチド混合物と、前記成長鎖が伸長されるように前記ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことができる条件下で接触させるステップであって、前記第２のヌクレオチド混合物は、（１）標識されていないヌクレオチド、又は（２）不可逆的ブロッキングヌクレオチド、又は（３）前記標識されていないヌクレオチドと前記不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの組み合わせ、の少なくとも１種（例えば、１、２、３、又は４種）を含み；
好ましくは、前記第２のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを含み；例えば、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含み；
前記第２のヌクレオチド混合物中の各標識されていないヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、ヌクレオチド鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基（例えば、２’－又は３’－酸素原子を介して結合した保護基）を含む、ステップと；
（ｅ）前記第２のヌクレオチド混合物中の少なくとも１種のヌクレオチドが不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む場合、このステップは実施しない；
前記第２のヌクレオチド混合物が不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含まない場合、前のステップの生成物をポリメラーゼ及び第３のヌクレオチド混合物と、前記成長鎖が伸長されるように前記ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことができる条件下で接触させるステップであって；第３のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む、ステップと；
（ｆ）前のステップの生成物中の標識の存在を検出するステップと；
（ｇ）前のステップの生成物に含まれる保護基及び標識を取り除くステップと；
（ｈ）任意選択で、ステップ（ｃ）から（ｇ）を１回以上繰り返すステップと；
を含み、
これにより、前記標的ポリヌクレオチドの配列情報を得る、方法。

【請求項2】

ステップ（ｃ）において、前記伸長が前記標的ポリヌクレオチドを鋳型とする伸長であり；好ましくは、前記伸長が１ヌクレオチドの伸長であり；
好ましくは、前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチド若しくは標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み；任意選択で、前記第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを更に含む；又は
好ましくは、前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、第４の標識で標識された第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド及び標識されていない第３のヌクレオチドを含み；
好ましくは、前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）であり；より好ましくは、前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２であり；最も好ましくは、前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、３：２であり；
好ましくは、前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）であり；より好ましくは、前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２であり；最も好ましくは、前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、３：２であり；
好ましくは、前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）であり；より好ましくは、前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２であり；最も好ましくは、前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、３：２であり；
好ましくは、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）であり；より好ましくは、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２であり；最も好ましくは、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、３：２であり；
好ましくは、前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）であり；より好ましくは、前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２であり；最も好ましくは、前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、３：２である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ｄ）において、前記第２のヌクレオチド混合物が、
（１）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチド；又は
（２）第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド；又は
（３）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、及び第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド；
を含み、
好ましくは、前記標識されていない第１のヌクレオチドと前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００であり；より好ましくは、前記標識されていない第１のヌクレオチドと前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１であり；最も好ましくは、前記標識されていない第１のヌクレオチドと前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１であり；
好ましくは、前記標識されていない第２のヌクレオチドと前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００であり；より好ましくは、前記標識されていない第２のヌクレオチドと前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１であり；最も好ましくは、前記標識されていない第２のヌクレオチドと前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１であり；
好ましくは、前記標識されていない第３のヌクレオチドと前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００であり；より好ましくは、前記標識されていない第３のヌクレオチドと前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１であり；最も好ましくは、前記標識されていない第３のヌクレオチドと前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１であり；
好ましくは、前記標識されていない第４のヌクレオチドと前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００であり；より好ましくは、前記標識されていない第４のヌクレオチドと前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１であり；最も好ましくは、前記標識されていない第４のヌクレオチドと前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識及び前記第４の標識が、各々独立して同一又は異なり；
好ましくは、前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識、前記第４の標識が異なり；
好ましくは、前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識及び前記第４の標識が、発光標識（例えば、蛍光標識）であり；
より好ましくは、前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識及び前記第４の標識が、各々独立して、クマリン、アレクサフルオロ、ボディピー、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、フェノキサジン、アクリジン、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＡＦ５３２、テキサスレッド及びそれらの誘導体からなる群より選択され；
好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、又はそれらであり；好ましくは、前記核酸分子の前記伸長産物がＤＮＡであり；
好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドが、真核生物（例えば、動物、植物、真菌）、原核生物（例えば、細菌、放線菌）、ウイルス、ファージ、又はそれらの任意の組み合わせに由来するサンプルから得られ；
好ましくは、前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕからなる群より選択され；
好ましくは、前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが異なり；
更に好ましくは、前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇであり；
好ましくは、前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕからなる群より選択され；
好ましくは、前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが異なり；
更に好ましくは、前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇであり；
好ましくは、前記不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオチドであり；
好ましくは、
前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチドを含む場合；前記第２のヌクレオチド混合物が、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む；又は
前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む場合、前記第２のヌクレオチド混合物は、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、及び標識されていない第３のヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

キットであって、
（ａ）第１のヌクレオチド混合物であって、標識で標識された少なくとも１種のヌクレオチドを含み；
任意選択で、前記第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを更に含み；例えば、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含み；
前記第１のヌクレオチド混合物中の各ヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、核酸鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基（例えば、２’－又は３’－酸素原子を介して結合した保護基）を含む、第１のヌクレオチド混合物と；
（ｂ）第２のヌクレオチド混合物であって、（１）標識されていないヌクレオチド、又は（２）不可逆的ブロッキングヌクレオチド、又は（３）前記標識されていないヌクレオチドと前記不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの組み合わせ、の少なくとも１種（例えば、１、２、３又は４種）を含み；
好ましくは、前記第２のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを含み；例えば、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含み；
前記第２のヌクレオチド混合物中の各標識されていないヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、核酸鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基（例えば、２’－又は３’－酸素原子を介して結合した保護基）を含む、第２のヌクレオチド混合物と；
を含み、
（ｃ）前記第２のヌクレオチド混合物が不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含まない場合、前記キットは、少なくとも１種の不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む第３のヌクレオチド混合物を含み；
前記第２のヌクレオチド混合物中の少なくとも１種のヌクレオチドが不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む場合、前記キットは第３のヌクレオチド混合物を含まず；
好ましくは、前記不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオチドである、キット。

【請求項6】

前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチド若しくは標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み；任意選択で、前記第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを更に含む；又は
好ましくは、前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、第４の標識で標識された第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド及び標識されていない第３のヌクレオチドを含み；
好ましくは、前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）であり；より好ましくは、前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２であり；最も好ましくは、前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、３：２であり；
好ましくは、前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）であり；より好ましくは、前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２であり；最も好ましくは、前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、３：２であり；
好ましくは、前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）であり；より好ましくは、前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２であり；最も好ましくは、前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、３：２であり；
好ましくは、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）であり；より好ましくは、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２であり；最も好ましくは、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、３：２であり；
好ましくは、前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）であり；より好ましくは、前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２であり；最も好ましくは、前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、３：２である、請求項５に記載のキット。

【請求項7】

前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチドを含む場合；前記第２のヌクレオチド混合物が、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む；又は
前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む場合、前記第２のヌクレオチド混合物が、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、及び標識されていない第３のヌクレオチドを含む、請求項５又は６に記載のキット。

【請求項8】

前記第２のヌクレオチド混合物が、
（１）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチド；又は
（２）第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド；又は
（３）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド
を含み、
好ましくは、前記標識されていない第１のヌクレオチドと前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００であり；より好ましくは、前記標識されていない第１のヌクレオチドと前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１であり；最も好ましくは、前記標識されていない第１のヌクレオチドと前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１であり；
好ましくは、前記標識されていない第２のヌクレオチドと前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００であり；より好ましくは、前記標識されていない第２のヌクレオチドと前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１であり；最も好ましくは、前記標識されていない第２のヌクレオチドと前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１であり；
好ましくは、前記標識されていない第３のヌクレオチドと前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００であり；より好ましくは、前記標識されていない第３のヌクレオチドと前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１であり；最も好ましくは、前記標識されていない第３のヌクレオチドと前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１であり；
好ましくは、前記標識されていない第４のヌクレオチドと前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００であり；より好ましくは、前記標識されていない第４のヌクレオチドと前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１であり；最も好ましくは、前記標識されていない第４のヌクレオチドと前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１であり；
好ましくは、前記不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオチドである、請求項５～７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項9】

任意選択で、核酸ポリメラーゼ、伸長用試薬、シーケンシング用試薬、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１種以上を更に含み；
好ましくは、前記伸長用試薬が、前記ポリヌクレオチドに完全又は部分的に相補的なプライマー、酵素（例えば、核酸ポリメラーゼ）用の作業緩衝液、水、イオン（例えば、Ｍｇ^２＋）を含む溶液、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１種以上を含み；
好ましくは、前記シーケンシング用試薬が、シーケンシング用スライド、ヌクレオチド上の保護基及び標識を除去するための試薬、並びに前記標識の発光シグナルを検出するための試薬（例えば蛍光混合物）からなる群より選択される１種以上を含み；
好ましくは、前記核酸ポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼであり；好ましくは、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィレス（Ｔｔｈ）、サーマス・フィリフォルミス、サーミス・フラバス、サーモコッカス・リテラリス、サーマス・アントラニルダニイ、サーマス・カルドフィラス、サーマス・チリアロフィラス、サーマス・フラバス、サーマス・イグニテレア、サーマス・ラクテウス、サーマス・オシマイ、サーマス・ルバー、サーマス・ルーベンス、サーマス・スコトダクタス、サーマス・シルヴァヌス、サーマス・サーモフィラス、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーモシホ・アフリカヌス、サーモコッカス・リトラリス、サーモコッカス・バロッシ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーモシホ・アフリカヌス、ピロコッカス・ウオエセイ、ピロコッカス・ホリコシ、ピロコッカス・アビシ、ピロジクチウム・オクルタム、アクイフェックス・ピロフィラス、及びアクイフェックス・アエロリウスから得られ；
好ましくは、前記キットが、ポリヌクレオチドの分析に使用され；
好ましくは、前記キットが、ポリヌクレオチドのシーケンシングに使用され；
好ましくは、前記標識の存在が、発光シグナルによって検出され；
好ましくは、前記標識の存在が、１種以上（例えば、２、３、４種）の発光シグナルによって検出され；
好ましくは、前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識、及び前記第４の標識が、各々独立して同一又は異なり；
好ましくは、前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識、前記第４の標識が異なり；
好ましくは、前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識及び前記第４の標識が、発光標識（例えば、蛍光標識）であり；
より好ましくは、前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識及び前記第４の標識が、各々独立して、クマリン、アレクサフルオロ、ボディピー、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、フェノキサジン、アクリジン、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＡＦ５３２、ＥＦ７００、テキサスレッド及びそれらの誘導体からなる群より選択され；
好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、又はそれらであり；好ましくは、前記核酸分子の前記伸長産物がＤＮＡであり；
好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドが、真核生物（例えば、動物、植物、真菌）、原核生物（例えば、細菌、放線菌）、ウイルス、ファージ、又はそれらの任意の組み合わせに由来するサンプルから得られ；
好ましくは、前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕからなる群より選択され；
好ましくは、前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが異なり；
更に好ましくは、前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ及びＧであり；
好ましくは、前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕからなる群より選択され；
好ましくは、前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが異なり；
更に好ましくは、前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ及びＧである、請求項５～８のいずれか一項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標的ポリヌクレオチドの配列を分析するための方法に関し、シーケンシングの必要性に応じて、ヌクレオチド混合物を複数回重合することにより、効率的に且つ十分な重合を実現する。更に、本発明は、ポリヌクレオチドの分析又はシーケンシングに使用できるキットに関する。

【背景技術】

【0002】

合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）が商業的な主流である、ハイスループットシーケンシングは、主にＤＮＡポリメラーゼと可逆的なブロッキング及び蛍光標識を持つヌクレオチドを使用して、ＤＮＡ配列を同定する。一度に数十万から数百万のＤＮＡ分子を並行してシーケンシングすることができ、高スループット、高速検出、柔軟性と汎用性、低コストという利点がある。

【0003】

現在、合成によるシーケンシングの具体的なプロセスは、増幅又はローリングサークル複製を採用して多数のＤＮＡ鋳型を生成すること、次に特異的シーケンシングプライマーを固定すること、ＤＮＡポリメラーゼと蛍光標識ヌクレオチドを反応系に同時に加える、又はＤＮＡポリメラーゼと蛍光標識ヌクレオチドと非蛍光修飾ヌクレオチドの混合物を反応系に同時に加えることを含む。これらのｄＮＴＰの３’－ＯＨは保護されているので、一度に付加できるｄＮＴＰは１つだけである。ｄＮＴＰが付加されるたびに、ＤＮＡ鎖の複製反応は停止し、次に、蛍光シグナルが励起・収集され、その次に化学試薬が添加されて蛍光シグナルが消光され、ｄＮＴＰの３’－ＯＨ保護基が除去され、次のラウンドのシーケンシング反応が実行できるようになる。

【0004】

しかし、このシーケンシング技術は特に高い合成効率が要求される。複数コピーの合成が不完全であればシグナルが混乱し、シーケンシング精度及びシーケンシングリード長に影響を及ぼす。これは現在、第２世代シーケンサーが直面している重要な技術的問題の一つでもある。シーケンシング時間の短縮やスループットの向上が求められる中、ポリメラーゼの反応効率には限界があり、特に蛍光基を有するヌクレオチドの重合能には限界があり、これらは重合効率がシーケンシングの品質に影響を及ぼす原因となる。先行技術には、蛍光標識ヌクレオチドと非蛍光標識ヌクレオチドの混合溶液を反応系内で同時重合することにより重合効率を向上させることも記載されているが、その効果はやはり限定的である。これらの重合効率がシーケンシング速度に追いつかなくなると、不完全な重合が複数のコピーで起こり、シーケンシング中のシグナルの混乱を招き、シーケンシングのリード長及び精度が制限されることになる。

【0005】

したがって、ポリヌクレオチドのシーケンシングにおいて、シーケンシングのリード長及び精度を向上させるための方法を提供する必要がある。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】実験群１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡの合成とシーケンシングのフローチャートである。

【図2】実験群２における大腸菌ＤＮＡの合成とシーケンシングのフローチャートである。

【図3】実験群３における大腸菌ＤＮＡの合成とシーケンシングのフローチャートである。

【図4】実験群４における大腸菌ＤＮＡの合成とシーケンシングのフローチャートである。

【図5】実験群５、６、及び７における大腸菌ＤＮＡの合成とシーケンシングのフローチャートである。

【図6】実験群８、９、及び１０における大腸菌ＤＮＡの合成とシーケンシングのフローチャートである。

【図7】実験群１～４の４つの実験の各サイクルにおけるＱ３０（％）比率の結果を示している。このうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルにおけるＱ３０（％）比率である。

【図8】実験群１～４の４つの実験の各サイクルにおけるシーケンシングのエラー率（％）の結果を示している。このうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルにおけるシーケンシングのエラー率（％）である。

【図9】実験群２、３、５、６、及び７の５つの実験の各サイクルにおけるＱ３０（％）比率の結果を示している。実験群２をコントロールとし、他の実験群では各反応サイクルにおいて２ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目に重合したヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２とを３：２の割合で調製した混合溶液であり、第２ラウンド目に重合したヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液２とジデオキシヌクレオチド混合溶液とを異なる割合で調製した混合溶液であった。このうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルのＱ３０（％）比率である。

【図10】実験群２、３、５、６、及び７の５つの実験の各サイクルにおけるシーケンシングのエラー率（％）の結果を示している。実験群２をコントロールとし、他の実験群では各反応サイクルにおいて２ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目に重合するヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２とを３：２の割合で調製した混合溶液であり、第２ラウンド目に重合したヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液２とジデオキシヌクレオチド混合溶液とを異なる割合で調製した混合溶液である。このうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルのシーケンシングのエラー率（％）である。

【図11】実験群２、４、８、９、及び１０の５つの実験の各サイクルにおけるＱ３０（％）比率の結果を示している。実験群２をコントロールとし、他のすべての実験群では、各反応サイクルにおいて３ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目に重合するヌクレオチドは濃度の異なるヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２で調製した混合溶液、第２ラウンド目に重合するヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液２、第３ラウンド目に重合するヌクレオチドはジデオキシヌクレオチド混合溶液とした。これらのうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルのＱ３０（％）比率である。

【図12】実験群２、４、８、９、及び１０の５つの実験の各サイクルにおけるシーケンシングのエラー率（％）の結果を示している。実験群２をコントロールとし、他のすべての実験群では、各反応サイクルにおいて３ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目に重合するヌクレオチドは濃度の異なるヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２で調製した混合溶液、第２ラウンド目に重合するヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液２、第３ラウンドに重合するヌクレオチドはジデオキシヌクレオチド混合溶液とした。このうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルのシーケンシングのエラー率（％）である。

【発明を実施するための形態】

【0007】

重合反応の回数を増やし、重合反応に関与するヌクレオチド成分を調整することで、重合速度がシーケンシングのニーズを満たし、シーケンシングのリード長と品質を向上させることができるようになり、本願発明が完成した。

【0008】

したがって、第１の態様において、本出願は、標的ポリヌクレオチドの配列を分析するための方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを提供するステップと；
（ｂ）ハイブリダイゼーション又はアニーリングを可能にする条件下で、標的ポリヌクレオチドをプライマーと接触させ、それによって、標的ポリヌクレオチドと成長鎖として使用されるプライマーとを含む部分二重鎖を形成する、ステップと；
（ｃ）部分二重鎖をポリメラーゼ及び第１のヌクレオチド混合物と、成長鎖が伸長されるようにポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことができる条件下で接触させるステップであって、第１のヌクレオチド混合物は、標識で標識された少なくとも１種のヌクレオチドを含み；
任意選択で、第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを更に含み；例えば、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含み；
第１のヌクレオチド混合物中の各ヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、核酸鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基（例えば、２’－又は３’－酸素原子基を介して結合した保護基）を含む、ステップと；
（ｄ）前のステップの生成物をポリメラーゼ及び第２のヌクレオチド混合物と、成長鎖が伸長されるようにポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことができる条件下で接触させるステップであって、第２のヌクレオチド混合物は、（１）標識されていないヌクレオチド、又は（２）不可逆的ブロッキングヌクレオチド、又は（３）標識されていないヌクレオチドと不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの組み合わせ、の少なくとも１種（例えば、１、２、３、又は４種）を含み；
特定の実施形態において、第２のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを含み；例えば、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含み；
第２のヌクレオチド混合物中の各標識されていないヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、ヌクレオチド鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基（例えば、２’－又は３’－酸素原子を介して結合した保護基）を含む、ステップと；
（ｅ）第２のヌクレオチド混合物中の少なくとも１種のヌクレオチドが不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む場合、このステップは実施しない；
第２のヌクレオチド混合物が不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含まない場合、前のステップの生成物をポリメラーゼ及び第３のヌクレオチド混合物と、成長鎖が伸長されるようにポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことができる条件下で接触させるステップであって；第３のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む、ステップと；
（ｆ）前のステップの生成物中の標識の存在を検出するステップと；
（ｇ）前のステップの生成物に含まれる保護基及び標識を取り除くステップと；
（ｈ）任意選択で、ステップ（ｃ）から（ｇ）を１回以上繰り返すステップと；
を含み、
これにより、標的ポリヌクレオチドの配列情報を得る、方法を提供する。

【0009】

標的ポリヌクレオチドの配列をシーケンシングするための方法は、標的ポリヌクレオチドの配列を変性すること、標的ポリヌクレオチドを各々異なるヌクレオチドと接触させて標的ヌクレオチドの相補体を形成すること、及びヌクレオチドの取り込みを検出すること、によって行うことができる。この方法は、重合を利用し、ポリメラーゼが、標的に相補的な正しいヌクレオチドを取り込むことによって成長鎖を伸長させる。

【0010】

重合の各ラウンドにおいて、ヌクレオチドの取り込みはポリメラーゼによって行われる。多くの異なるポリメラーゼが存在し、最も適したポリメラーゼを決定することは、当業者には容易に明らかである。好ましい酵素としては、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｔ４又はＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ又はＶｅｎｔポリメラーゼが挙げられる。特定の性質を持つように操作されたポリメラーゼも使用できる。

【0011】

重合が行われる条件は当業者によく知られている。ポリメラーゼ反応を実施するために、プライマーは通常、最初に標的ポリヌクレオチドにアニールされ、その際、プライマーはポリメラーゼによって認識され、その後の成長鎖の伸長の開始部位として機能する。プライマーは、標的ポリヌクレオチドに対して別個の成分として加えてもよい。ポリメラーゼ反応の実施に必要な他の条件は当業者によく知られており、これらの条件には温度、ｐＨ、緩衝液組成が含まれる。

【0012】

特定の実施形態において、本発明の第１のヌクレオチド混合物をプライマー及びポリメラーゼと接触させ、第１ラウンドの重合を可能にする。ヌクレオチドは、順次（すなわち、各タイプのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ／Ｕ）を別々に）又は同時に添加することができる。シーケンシング速度の必要性に応じて、本発明の第２のヌクレオチド混合物を再度ポリメラーゼと接触させ、第２ラウンドの重合を行う。ヌクレオチドは、順次（すなわち、各タイプのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ／Ｕ）を別々に）又は同時に添加することができる。最後に、第２のヌクレオチド混合物がジデオキシヌクレオチドを含むか含まないかに応じて、第３ラウンドの重合は行われない、又は行われる。特定の実施形態において、第２のヌクレオチド混合物はジデオキシヌクレオチドを含まず、本発明の第３のヌクレオチド混合物をポリメラーゼと接触させて第３ラウンドの重合を可能にする。ヌクレオチドは、逐次的に（すなわち、各タイプのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ／Ｕ）を別々に）又は同時に添加することができる。

【0013】

特定の実施形態において、取り込まれなかったヌクレオチドが除去される。例えば、取り込まれなかったヌクレオチドは、洗浄ステップを実施することによって除去される。

【0014】

特定の実施形態において、標識は検出される。検出は従来の方法で行うことができ、蛍光標識又はシグナルを検出する手段は当技術分野でよく知られている。例えば、これは蛍光の波長を検出する装置によって達成することができる。このような装置は当技術分野でよく知られている。例えば、そのような装置は、シーケンシングされる核酸分子に直接結合している蛍光体を画像化するために、固体支持体の表面をレーザーで走査する共焦点走査顕微鏡であってもよい。更に、発生した各シグナルは、例えば電荷結合検出器（ＣＣＤ）などの高感度２次元検出器で観察することができる。例えば、走査型近接場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）のような他の技術も使用することができる。

【0015】

特定の実施形態において、検出後、適切な条件を使用して標識を除去することができる。

【0016】

本発明の標識ヌクレオチドの使用は、ＤＮＡシーケンシング技術に限定されない。本発明のヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ＤＮＡハイブリダイゼーション分析、及び一塩基多型研究を含む他の研究形態を実施するためにも使用することができる。ヌクレオチドと酵素との間の相互作用を含むいかなる技術も、本発明の分子を利用することができる。例えば、分子は逆転写酵素又は末端転移酵素の基質として使用することができる。

【0017】

特定の実施形態においては、ステップ（ｃ）において、伸長は、標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用する伸長である。特定の実施形態においては、伸長は、１ヌクレオチドの伸長である。

【0018】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド混合物は、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチド若しくは標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む。任意選択で、第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを更に含む。

【0019】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド混合物は、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、第４の標識で標識された第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド及び標識されていない第３のヌクレオチドを含む。

【0020】

特定の実施形態において、第１の標識で標識された第１のヌクレオチドと標識されていない第１のヌクレオチドとの比は、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）である。特定の実施形態において、第１の標識で標識された第１のヌクレオチドと標識されていない第１のヌクレオチドとの比は、２０：１、１：１０、１：１、又は３：２である。特定の実施形態において、第１の標識で標識された第１のヌクレオチドと標識されていない第１のヌクレオチドとの比は、３：２である。

【0021】

特定の実施形態において、第２の標識で標識された第２のヌクレオチドと標識されていない第２のヌクレオチドとの比は、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）である。特定の実施形態において、第２の標識で標識された第２のヌクレオチドと標識されていない第２のヌクレオチドとの比は、２０：１、１：１０、１：１、又は３：２である。特定の実施形態において、第２の標識で標識された第２のヌクレオチドと標識されていない第２のヌクレオチドとの比は、３：２である。

【0022】

特定の実施形態において、第３の標識で標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）である。特定の実施形態において、第３の標識で標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、２０：１、１：１０、１：１、又は３：２である。特定の実施形態において、第３の標識で標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、３：２である。

【0023】

特定の実施形態において、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）である。特定の実施形態において、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、２０：１、１：１０、１：１又は３：２である。特定の実施形態において、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、３：２である。

【0024】

特定の実施形態において、第４の標識で標識された第４のヌクレオチドと標識されていない第４のヌクレオチドとの比は、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）である。特定の実施形態において、第４の標識で標識された第４のヌクレオチドと標識されていない第４のヌクレオチドとの比は、２０：１、１：１０、１：１、又は３：２である。特定の実施形態において、第４の標識で標識された第４のヌクレオチドと標識されていない第４のヌクレオチドとの比は、３：２である。

【0025】

特定の実施形態においては、ステップ（ｄ）において、第２のヌクレオチド混合物が、
（１）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチド；又は
（２）第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド；又は
（３）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、及び第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド；
を含む。

【0026】

特定の実施形態において、標識されていない第１のヌクレオチドと第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１～１：１００である、又は不可逆的ブロッキングヌクレオチドのみが存在する。特定の実施形態において、標識されていない第１のヌクレオチドと第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１：１００、５０：１、又は１００：１である。特定の実施形態において、標識されていない第１のヌクレオチドと第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１である。

【0027】

特定の実施形態において、標識されていない第２のヌクレオチドと第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１～１：１００である、又は不可逆的ブロッキングヌクレオチドのみが存在する。特定の実施形態において、標識されていない第２のヌクレオチドと第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１：１００、５０：１、又は１００：１である。特定の実施形態において、標識されていない第２のヌクレオチドと第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１である。

【0028】

特定の実施形態において、標識されていない第３のヌクレオチドと第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１～１：１００である、又は不可逆的ブロッキングヌクレオチドのみが存在する。特定の実施形態において、標識されていない第３のヌクレオチドと第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１：１００、５０：１、又は１００：１である。特定の実施形態において、標識されていない第３のヌクレオチドと第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１である。

【0029】

特定の実施形態において、標識されていない第４のヌクレオチドと第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１～１：１００である、又は不可逆的ブロッキングヌクレオチドのみが存在する。特定の実施形態において、標識されていない第４のヌクレオチドと第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１：１００、５０：１、又は１００：１である。特定の実施形態において、標識されていない第４のヌクレオチドと第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１である。

【0030】

特定の実施形態において、第１の標識、第２の標識、第３の標識及び第４の標識は、各々独立して同一又は異なる。

【0031】

特定の実施形態において、第１の標識、第２の標識、第３の標識及び第４の標識は、異なる。

【0032】

特定の実施形態において、第１の標識、第２の標識、第３の標識及び第４の標識は、発光標識（例えば蛍光標識）である。

【0033】

特定の実施形態において、第１の標識、第２の標識、第３の標識及び第４の標識は、各々独立して、クマリン、アレクサフルオロ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）、ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、フェノキサジン、アクリジン、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＡＦ５３２、テキサスレッド及びそれらの誘導体からなる群より選択される。

【0034】

特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、又はそれらである。特定の実施形態において、核酸分子の伸長産物はＤＮＡである。

【0035】

特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、真核生物（例えば、動物、植物、真菌）、原核生物（例えば、細菌、放線菌）、ウイルス、ファージ、又はそれらの任意の組み合わせに由来するサンプルから得られる。

【0036】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、及び第４のヌクレオチドは、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、及びＵからなる群より選択される。

【0037】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、及び第４のヌクレオチドは、各々異なる。

【0038】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、及び第４のヌクレオチドは、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇである。特定の実施形態において、第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドは、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕからなる群より選択される。

【0039】

特定の実施形態において、第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドは、異なる。

【0040】

特定の実施形態において、第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドは、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇである。

【0041】

特定の実施形態において、不可逆的ブロッキングヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドである。

【0042】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチドを含む場合；第２のヌクレオチド混合物は、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む。

【0043】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識ヌクレオチドで標識された第３のヌクレオチド及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチを含む場合、第２のヌクレオチド混合物は、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、及び標識されていない第３のヌクレオチドを含む。

【0044】

第２の態様において、本出願はキットであって、
（ａ）第１のヌクレオチド混合物であって、標識で標識された少なくとも１種のヌクレオチドを含み；
任意選択で、第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを更に含み；例えば、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含み；
第１のヌクレオチド混合物中の各ヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、核酸鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基（例えば、２’－又は３’－酸素原子を介して結合した保護基）を含む、第１のヌクレオチド混合物；
（ｂ）第２のヌクレオチド混合物であって、（１）標識されていないヌクレオチド、又は（２）不可逆的ブロッキングヌクレオチド、又は（３）標識されていないヌクレオチドと不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの組み合わせ、の少なくとも１種（例えば、１、２、３又は４種）を含み；
特定の実施形態において、第２のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを含み；例えば、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含み；
第２のヌクレオチド混合物中の各標識されていないヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、核酸鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基（例えば、２’－又は３’－酸素原子を介して結合した保護基）を含む、第２のヌクレオチド混合物；を含み、
（ｃ）第２のヌクレオチド混合物が不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含まない場合、キットは、少なくとも１種の不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む第３のヌクレオチド混合物を含み；
第２のヌクレオチド混合物中の少なくとも１種のヌクレオチドが不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む場合、キットは第３のヌクレオチド混合物を含まない、キットを提供する。

【0045】

特定の実施形態において、第２のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを含み；例えば、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含む。

【0046】

特定の実施形態において、不可逆的ブロッキングヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドである。

【0047】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド混合物は、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチド若しくは標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む。任意選択で、第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを更に含む。

【0048】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド混合物は、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、第４の標識で標識された第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド及び標識されていない第３のヌクレオチドを含む。

【0049】

特定の実施形態において、第１の標識で標識された第１のヌクレオチドと標識されていない第１のヌクレオチドとの比は、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）である。特定の実施形態において、第１の標識で標識された第１のヌクレオチドと標識されていない第１のヌクレオチドとの比は、２０：１、１：１０、１：１、又は３：２である。特定の実施形態において、第１の標識で標識された第１のヌクレオチドと標識されていない第１のヌクレオチドとの比は、３：２である。

【0050】

特定の実施形態において、第２の標識で標識された第２のヌクレオチドと標識されていない第２のヌクレオチドとの比は、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）である。特定の実施形態において、第２の標識で標識された第２のヌクレオチドと標識されていない第２のヌクレオチドとの比は、２０：１、１：１０、１：１、又は３：２である。特定の実施形態において、第２の標識で標識された第２のヌクレオチドと標識されていない第２のヌクレオチドとの比は、３：２である。

【0051】

特定の実施形態において、第３の標識で標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）である。特定の実施形態において、第３の標識で標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、２０：１、１：１０、１：１、又は３：２である。特定の実施形態において、第３の標識で標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、３：２である。

【0052】

特定の実施形態において、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）である。特定の実施形態において、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、２０：１、１：１０、１：１、又は３：２である。特定の実施形態において、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチドと標識されていない第３のヌクレオチドとの比は、３：２である。

【0053】

特定の実施形態において、第４の標識で標識された第４のヌクレオチドと標識されていない第４のヌクレオチドとの比は、２０：１～１：１０（例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３）である。特定の実施形態において、第４の標識で標識された第４のヌクレオチドと標識されていない第４のヌクレオチドとの比は、２０：１、１：１０、１：１、又は３：２である。特定の実施形態において、第４の標識で標識された第４のヌクレオチドと標識されていない第４のヌクレオチドとの比は、３：２である。

【0054】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチドを含む場合；第２のヌクレオチド混合物は、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチドを含む。

【0055】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第１の標識及び第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む場合、第２のヌクレオチド混合物は、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、及び標識されていない第３のヌクレオチドを含む。

【0056】

特定の実施形態において、第２のヌクレオチド混合物は、
（１）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチド；又は
（２）第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド；又は
（３）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、及び第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド；
を含む。

【0057】

特定の実施形態において、標識されていない第１のヌクレオチドと第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１～１：１００である、又は不可逆的ブロッキングヌクレオチドのみが存在する。特定の実施形態において、標識されていない第１のヌクレオチドと第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１：１００、５０：１、又は１００：１である。特定の実施形態において、標識されていない第１のヌクレオチドと第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１である。

【0058】

特定の実施形態において、標識されていない第２のヌクレオチドと第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１～１：１００である、又は不可逆的ブロッキングヌクレオチドのみが存在する。特定の実施形態において、標識されていない第２のヌクレオチドと第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１：１００、５０：１、又は１００：１である。特定の実施形態において、標識されていない第２のヌクレオチドと第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１である。

【0059】

特定の実施形態において、標識されていない第３のヌクレオチドと第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１～１：１００である、又は不可逆的ブロッキングヌクレオチドのみが存在する。特定の実施形態において、標識されていない第３のヌクレオチドと第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１：１００、５０：１、又は１００：１である。特定の実施形態において、標識されていない第３のヌクレオチドと第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１である。

【0060】

特定の実施形態において、標識されていない第４のヌクレオチドと第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１～１：１００である、又は不可逆的ブロッキングヌクレオチドのみが存在する。特定の実施形態において、標識されていない第４のヌクレオチドと第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１：１００、５０：１、又は１００：１である。特定の実施形態において、標識されていない第４のヌクレオチドと第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比は、１００：１である。

【0061】

特定の実施形態において、不可逆的ブロッキングヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドである。

【0062】

特定の実施形態において、キットは、核酸ポリメラーゼ、伸長を行うための試薬、シーケンシングを行うための試薬、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１種以上を更に含む。

【0063】

特定の実施形態において、伸長を行うための試薬は、ポリヌクレオチドの全部又は一部に相補的なプライマー、ＤＮＢ調製緩衝液、酵素（例えば、核酸重合酵素）用の作業緩衝液、水、イオン（例えば、Ｍｇ^２＋）を含む溶液、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１種以上からなる。

【0064】

特定の実施形態において、シーケンシング用試薬は、シーケンシング用スライド、ヌクレオチド上の保護基及び標識を除去するための試薬、標識の発光シグナルを検出するための試薬（例えば、蛍光混合溶液）からなる群より選択される１種以上を含む。

【0065】

特定の実施形態において、核酸ポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態において、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィレス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）（Ｔｔｈ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーミス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーモコッカス・リテラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ）、サーマス・アントラニルダニイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｌｄａｎｉｉ）、サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｌｌｕｓ）、サーマス・チリアロフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・イグニテレア（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ）、サーマス・ラクテウス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ）、サーマス・オシマイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ）、サーマス・ルバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）、サーマス・ルーベンス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ）、サーマス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）、サーマス・シルヴァヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｌｌｕｓ）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、サーモシホ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、サーモコッカス・バロッシ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ）、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーモシホ・アフリカヌス、ピロコッカス・ウオエセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）、ピロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、ピロジクチウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）、アクイフェックス・ピロフィラス（Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ）、及びアクイフェックス・アエロリウス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓ）から得られる。

【0066】

特定の実施形態において、キットはポリヌクレオチドの分析に使用される。

【0067】

特定の実施形態において、キットはポリヌクレオチドのシーケンシングに使用される。

【0068】

特定の実施形態において、標識の存在は発光シグナルによって検出される。

【0069】

特定の実施形態において、標識の存在は、１種以上（例えば、２、３、４種）の発光シグナルによって検出される。

【0070】

特定の実施形態において、第１の標識、第２の標識、第３の標識及び第４の標識は、各々独立して同一又は異なる。

【0071】

特定の実施形態において、第１の標識、第２の標識、第３の標識及び第４の標識は異なる。

【0072】

特定の実施形態において、第１の標識、第２の標識、第３の標識及び第４の標識は発光標識（例えば蛍光標識）である。

【0073】

特定の実施形態において、第１の標識、第２の標識、第３の標識及び第４の標識は、各々独立して、クマリン、アレクサフルオロ、ボディピー、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、フェノキサジン、アクリジン、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＡＦ５３２、ＥＦ７００、テキサスレッド及びそれらの誘導体からなる群より選択される。

【0074】

特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、又はそれらである。特定の実施形態において、核酸分子の伸長産物はＤＮＡである。

【0075】

特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、真核生物（例えば、動物、植物、真菌）、原核生物（例えば、細菌、放線菌）、ウイルス、ファージ、又はそれらの任意の組み合わせに由来するサンプルから得られる。

【0076】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、及び第４のヌクレオチドは、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、及びＵからなる群より選択される。

【0077】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、及び第４のヌクレオチドは、各々異なる。

【0078】

特定の実施形態において、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、及び第４のヌクレオチドは、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇである。特定の実施形態において、第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドは、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕからなる群より選択される。

【0079】

特定の実施形態において、第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドは、異なる。

【0080】

特定の実施形態において、第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドは、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇである。

【0081】

特定の実施形態において、不可逆的ブロッキングヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドである。

【0082】

［用語の定義］
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたすべての特許、出願及びその他の刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書に記載された定義が、参照により本明細書に組み込まれた特許、出願、及びその他の刊行物に記載された定義と対立する場合、又は矛盾する場合には、本明細書に記載された定義が優先するものとする。

【0083】

本明細書において、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）などを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖であってよく、又は一本鎖と二本鎖の両方の配列を含むことができる。ポリヌクレオチド分子は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）形態（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ及び増幅産物など）から誘導することもでき、又は一本鎖ＤＮＡ形態（ｓｓＤＮＡ）若しくはＲＮＡから誘導してｄｓＤＮＡ形態に変換することもできるし、その逆もできる。ポリヌクレオチド分子の正確な配列は、既知であっても未知であってもよい。遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥタグなど）、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスポーターＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、及び前述の配列のいずれかの核酸プローブ、プライマー又は増幅されたコピーは、ポリヌクレオチドの例示である。

【0084】

ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含んでもよい。ヌクレオチドは、通常、糖（例えば、リボース又はデオキシリボース）、塩基、及び少なくとも１つのリン酸基を含む。ヌクレオチドは非塩基性（すなわち、塩基を欠く）であってもよい。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、修飾ペプチドヌクレオチド、修飾糖－リン酸骨格ヌクレオチド及びそれらの混合物を含む。ヌクレオチドの例としては、例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）が挙げられる。修飾塩基を含むヌクレオチド類似体も、本明細書に記載の方法において使用されてもよい。ポリヌクレオチド中に含まれてよい例示的な修飾塩基としては、ネイティブな骨格を有する又は類似する構造を有するかにかかわらず、例えば、イノシン、キササニン、ヒポキササニン、イソシトシン、イソグアニン、２－アミノプリン、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、２－プロピルグアニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、１５－ハロゲン化ウラシル、１５－ハロゲン化シトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル、４－チオウラシル、８－ハロゲン化アデニン又はグアニン、８－アミノアデニン又はグアニン、８－チオアデニン又はグアニン、８－チオアルキルアデニン又はグアニン、８－ヒドロキシアデニン又はグアニン、５－ハロゲン化ウラシル又はシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニンなどが、挙げられる。当技術分野で知られているように、ある種のヌクレオチド類似体、例えば、アデノシン５’－ホスホリル硫酸のようなヌクレオチド類似体は、ポリヌクレオチドに取り込むことができない。

【0085】

一般に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又はＵを含む。本明細書で使用される場合、「ヌクレオチドＡ」という用語は、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ等、アデニン（Ａ）又はその改変体若しくは類似体を含むヌクレオチドを指す。「ヌクレオチドＧ」は、ＧＴＰ、ｄＧＴＰ等、グアニン（Ｇ）又はその改変体若しくは類似体を含むヌクレオチドを指す。「ヌクレオチドＣ」は、ＣＴＰ、ｄＣＴＰ等、シトシン（Ｃ）又はその改変体若しくは類似体を含むヌクレオチドを指す。「ヌクレオチドＴ」は、ＴＴＰ、ｄＴＴＰ等、チミン（Ｔ）又はその改変体若しくは類似体を含むヌクレオチドを指す。「ヌクレオチドＵ」は、ＵＴＰ、ｄＵＴＰ等、ウラシル（Ｕ）又はその改変体若しくは類似体を含むヌクレオチドを指す。

【0086】

本明細書で使用する場合、「ジデオキシヌクレオチド」という用語は、リボースの２’－及び３’－炭素において脱酸素化されたヌクレオチドを指し、２’，３’－ジデオキシヌクレオチドとしても知られている。一般的に、ジデオキシヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又はＵを含む。「ジデオキシヌクレオチドＡ」という用語は、ｄｄＡＴＰ等、アデニン（Ａ）又はその類似体を含むジデオキシヌクレオチドを指す。「ジデオキシヌクレオチドＧ」は、ｄｄＧＴＰ等、グアニン（Ｇ）又はその類似体を含むジデオキシヌクレオチドを指す。「ジデオキシヌクレオチドＣ」は、ｄｄＣＴＰ等、シトシン（Ｃ）又はその類似体を含むジデオキシヌクレオチドを指す。「ジデオキシヌクレオチドＴ」は、ｄｄＴＴＰ等、チミン（Ｔ）又はその類似体を含むジデオキシヌクレオチドを指す。「ジデオキシヌクレオチドＵ」は、ｄｄＵＴＰ等、ウラシル（Ｕ）又はその類似体を含むジデオキシヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、ｄｄＮＴＰは、ジデオキシアデノシン三リン酸（ｄｄＡＴＰ）、ジデオキシグアノシン三リン酸（ｄｄＧＴＰ）、ジデオキシシチジン三リン酸（ｄｄＣＴＰ）、ジデオキシウリジン三リン酸（ｄｄＵＴＰ）、ジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）のうちの１種、又はそれらの２種以上の組み合わせであって、ジデオキシウリジン三リン酸とジデオキシチミジン三リン酸が同時に出現しないものを指す。

【0087】

本明細書において、「標識」という用語は、特定の条件下で発光シグナルを発することができる基を指す。

【0088】

本明細書で使用する場合、「発光標識」という用語は、適切な励起波長で励起されたときに、特定の発光波長で蛍光を発することができる任意の物質を指す。このような発光標識は、化学発光標識であってもよく、例えば、異なる発光動態を誘発する生化学発光標識、及びそれらの任意の組み合わせから選択され、例えば、化学発光標識は、異なる発光動態を誘発するルシフェラーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される；このような発光標識は、例えば、クマリン、アレクサフルオロ、ボディピー、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、フェノキサジン、アクリジン、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＥＦ７００、ＡＦ５３２、テキサスレッド及びその誘導体などから選択される蛍光体であってもよい。

【0089】

本明細書において、「保護基」という用語は、その基を含むヌクレオチドが合成中のポリヌクレオチド鎖に取り込まれた後、ポリメラーゼ（その基を含むヌクレオチドを合成中のポリヌクレオチド鎖に取り込む）が、別のヌクレオチドの取り込みを連続的に触媒することを防止する基を指す。このような保護基は、本明細書では３’－ＯＨ保護基とも呼ばれる。このような保護基を含むヌクレオチドは、本明細書では３’－ブロックヌクレオチドとも呼ばれる。保護基は、別のヌクレオチド分子がポリヌクレオチド鎖に付加されるのを保護基が防ぎ、ポリヌクレオチド鎖を損傷することなくヌクレオチドの糖部分から容易に除去されるものであれば、ヌクレオチドに付加され得る任意の適切な基であってよい。更に、保護基で修飾されたヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖に取り込むために使用されるポリメラーゼ又は他の適切な酵素に対して耐性がある必要がある。したがって、理想的な保護基は、長期安定性を示し、ポリメラーゼによって効率的に取り込むことができ、ヌクレオチドの二次取り込み又は更なる取り込みを防止することができ、そしてポリヌクレオチド構造を損傷することなく、温和な条件下、好ましくは水性条件下で、除去することができる。

【0090】

先行技術は、上記の説明に適合する様々な保護基が記載している。例えば、国際公開第９１／０６６７８号は、３’－ＯＨ保護基として、エステル及びエーテル、－Ｆ、－ＮＨ_２、－ＯＣＨ_３、－Ｎ_３、－ＯＰＯ_３、－ＮＨＣＯＣＨ_３、２－ニトロベンゼンカーボネート、２，４－スルフェニルジニトロ及びテトラヒドロフランエーテルが挙げられることを開示している。Ｍｅｔｚｋｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２０）：４２５９－４２６７，１９９４）は、８つの３’－修飾２－デオキシリボヌクレオシド５’－三リン酸（３’－修飾ｄＮＴＰ）の合成と応用を開示している。国際公開第２００２／０２９００３号は、ポリメラーゼ反応において成長ＤＮＡ鎖上の３’－ＯＨ基をキャップするためのアリル保護基の使用を記載している。好ましくは、国際出願公開第２０１４１３９５９６号及び第２００４／０１８４９７号に報告されている種々の保護基を使用することができ、例えば、図１Ａの例示的な保護基及び国際公開第２０１４／１３９５９６号の特許請求の範囲に規定されている３’－ヒドロキシル保護基（すなわち、保護基）、並びに例えば、図３及び４に例示されている保護基及び国際公開第２００４／０１８４９７号の特許請求の範囲に規定されている保護基が挙げられる。上記文献は、参照によりその全体が組み込まれる。

【0091】

本明細書で使用する場合、「可逆的ブロッキング基」という用語は、合成中のポリヌクレオチド鎖に取り込まれると、ポリメラーゼが次の重合ラウンドに進むことができなくなり、それによって重合反応の終了を引き起こす、基を指す。この場合、重合反応の各ラウンドにおいて、成長中の核酸鎖に塩基が１つだけ取り込まれる。加えて、この基は除去することができ、その後、成長核酸鎖は次の重合ラウンドに進むことができ、再び塩基が導入される。可逆的ブロッキング基の例は、３’－ＯＨのＨがエステル、エーテル、－Ｆ、－ＮＨ_２、－ＯＣＨ_３、－Ｎ_３、－ＯＰＯ_３、－ＮＨＣＯＣＨ_３、２－ニトロベンゼンカーボネート、２，４－スルフェニルジニトロ及びテトラヒドロフランエーテル－ＣＨ_２－ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｓ－Ｓの基で置換されているものであり、又は塩基が大きな立体障害基と蛍光基でブロックされ、Ｓ－Ｓを介して蛍光と連結されているものである。

【0092】

本明細書で使用する場合、「不可逆的ブロッキングヌクレオチド」という用語は、合成中のポリヌクレオチド鎖に取り込まれると、そのブロッキング効果により、その後のヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖への取り込みを妨げるヌクレオチドを指す。そして、このブロック効果は不可逆的である。不可逆的ブロッキングヌクレオチドとしては、通常、ジデオキシヌクレオチド、又は３’－ＯＨが３’末端においてメトキシ基で置換されたヌクレオチド（３’－ＯＭｅ、又は３’－ＯＣＨ_３）、及び３’－末端アジド（３’－Ｎ_３）及び３’－末端エトキシ（３’－ＯＥｔ、３’－ＯＣＨ_２ＣＨ_３）を有するヌクレオチドが挙げられる。

【0093】

［本発明の有益な技術的効果］
シーケンシングにおいて、本発明は、重合反応回数を増加させることにより、より効率的な重合反応を実現し、それによって重合速度がシーケンシングのニーズを満たし、シーケンシングのリード長及び品質を向上させることができる。更に、本発明では、重合に参加するヌクレオチド成分を調整しながら（例えば、蛍光標識を有さないヌクレオチド成分を重合する）、第１ラウンドの重合を短縮し、第２ラウンド又は第２ラウンド及び第３ラウンドの重合を迅速に行うことで、より効率的な重合反応を実現する。

【0094】

本発明の方法は、重合反応の効率を向上させることができるだけでなく、重合反応がシーケンシングのリード長及び品質を向上させるのに十分であることを保証することができる。また、不潔な蛍光の切除又はその切除された蛍光の不潔な溶出によるシグナル干渉を低減し、切除効率を向上させ、シーケンシングエラー率を低減することができる。

【実施例】

【0095】

次に、以下の実施例を参照して本発明を説明するが、以下の実施例は本発明を説明することを意図するのであって、本発明を限定することを意図しない。

【0096】

本発明で使用する分子生物学実験法は、特に断らない限り、基本的にＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｏｍｐｉｌｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３^ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５を参照する。当業者であれば、実施例は例示として本発明を説明するものであり、本発明により保護される範囲を限定することを意図するものではないことを理解するであろう。

【0097】

１．この実施例で使用した主な機器：
ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンサー、ＭＧＩＤＬ－２００Ｈローダー、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンシングスライド。

【0098】

２．この実施例で使用した主な試薬を以下の表１に示す：

【0099】

【表1】

【0100】

実施例１
この実施例では、様々な試薬をあらかじめ用意した。
１）ヌクレオチド混合溶液１の調製
以下の表２に示すように、ヌクレオチド混合溶液１中のすべてのヌクレオチドは、蛍光色素と可逆的ブロッキング基の両方を有しており、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃはそれぞれアデニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチドであり、ヌクレオチドが有する蛍光色素は、ｄＡＴＰ－Ｃｙ５、ｄＧＴＰ－Ｃｙ３、ｄＴＴＰ－ＲＯＸ、ｄＣＴＰ－ＥＦ７００であり、いずれも可逆的ブロッキング基を有していた。

【0101】

【表2】

【0102】

このうち、ｄＡＴＰ－１は可逆的ブロッキング基修飾とＣｙ５蛍光修飾とを有するアデニンヌクレオチドを指し、ｄＴＴＰ－１は可逆的ブロッキング基修飾とＲＯＸ蛍光修飾とを有するチミンヌクレオチドを指し、ｄＧＴＰ－１は可逆的ブロッキング基修飾とＣｙ３蛍光修飾とを有するグアニンヌクレオチドを指し、ｄＣＴＰ－１は可逆的ブロッキング基修飾とＥＦ７００蛍光修飾とを有するシトシンヌクレオチドを指す。

【0103】

２）ヌクレオチド混合溶液２の調製
以下の表３に示すように、ヌクレオチド混合溶液２中のすべてのヌクレオチドは、可逆的ブロッキング基のみを有し、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣは、それぞれアデニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、及びシトシンヌクレオチドであった。

【0104】

【表3】

【0105】

このうち、Ｃｏｌｄ ｄＡＴＰは可逆的ブロッキング基のみで修飾されたアデニンヌクレオチドを指し、Ｃｏｌｄ ｄＴＴＰは可逆的ブロッキング基のみで修飾されたチミンヌクレオチドを指し、Ｃｏｌｄ ｄＧＴＰは可逆的ブロッキング基のみで修飾されたグアニンヌクレオチドを指し、Ｃｏｌｄ ｄＣＴＰは可逆的ブロッキング基のみで修飾されたシトシンヌクレオチドを指す。

【0106】

３）ヌクレオチド混合溶液３の調製
以下の表４に示すように、ヌクレオチド混合溶液３中のヌクレオチドはすべてジデオキシヌクレオチドであり、ｄｄＡＴＰはアデニン三リン酸ジデオキシヌクレオチドを指し、ｄｄＴＴＰはチミン三リン酸ジデオキシヌクレオチドを指し、ｄｄＧＴＰはグアニン三リン酸ジデオキシヌクレオチドを指し、ｄｄＣＴＰはシトシン三リン酸ジデオキシヌクレオチドを指す。

【0107】

【表4】

【0108】

４）合成試薬１の調製
合成試薬１は、後で使用するために、混合により以下の表５に従って調製した。合成試薬１のヌクレオチドは、蛍光色素と可逆的ブロッキング基の両方で修飾されたヌクレオチドであった。

【0109】

【表5】

【0110】

５）合成試薬２の調製
合成試薬２は、後で使用するために、混合により以下の表６に従って調製した。合成試薬２のヌクレオチドは、可逆的ブロッキング基のみで修飾されたヌクレオチドであった。

【0111】

【表6】

【0112】

６）合成試薬３－１、３－２、３－３及び３－４の調製。これらのヌクレオチド混合溶液は、各々ヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２とを濃度比を変えて調製した。具体的な濃度比を表７から表１０に示した。

【0113】

合成試薬３－１は、後で使用するために、混合により以下の表７に従って調製した。

【0114】

【表7】

【0115】

７）合成試薬３－２の調製
合成試薬３－２は、後で使用するために、混合により以下の表８に従って調製した。

【0116】

【表8】

【0117】

８）合成試薬３－３の調製
合成試薬３－３は、後で使用するために、混合により以下の表９に従って調製した。

【0118】

【表9】

【0119】

９）合成試薬３－４の調製
合成試薬３－４は、後で使用するために、混合により以下の表１０に従って調製した。

【0120】

【表10】

【0121】

１０）合成試薬４の調製
合成試薬４は、後で使用するために、混合により以下の表１１に従って調製した。

【0122】

【表11】

【0123】

１１）合成試薬５－１、５－２及び５－３の調製。これらのヌクレオチド混合溶液は、各々ヌクレオチド混合溶液２とヌクレオチド混合溶液３とを異なる濃度比で混合することにより調製した。具体的な濃度比は表１２から表１４に示した。

【0124】

合成試薬５－１は、後で使用するために、混合により以下の表１２に従って調製した。

【0125】

【表12】

【0126】

１２）合成試薬５－２の調製
合成試薬５－２は、後で使用するために、混合により以下の表１３に従って調製した。

【0127】

【表13】

【0128】

１３）合成試薬５－３の調製
合成試薬５－３は、後で使用するために、混合により以下の表１４に従って調製した。

【0129】

【表14】

【0130】

実施例２
以下のすべての実験において、大腸菌の一本鎖環状ＤＮＡ（すなわちＭＧＩの標準ライブラリー試薬Ｖ３．０）を鋳型として使用し、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキット（ＭＧＩ）を使用してＤＮＡナノスフェアの調製を完了し、それを、その後のシーケンシングのためのチップにロードした。

【0131】

実験群１：ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットを使用し、キット中の＃１ウェルの試薬を除去し、上記で調製した合成試薬１、すなわち、蛍光及び可逆的ブロッキング修飾基の両方を有するヌクレオチド混合溶液の反応液、で置き換えた。各反応サイクルにおいて、１ラウンドの重合のみ行い、重合したヌクレオチドは蛍光及び可逆的ブロッキング修飾基の両方を有するヌクレオチド混合溶液であった。ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンシングプラットフォームを使用し、図１に示す実験プロセスに従ってＳＥ１００シーケンシングを行った。つまり、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットの説明書に従って、溶出試薬で遊離ヌクレオチドを溶出し、撮影試薬でシグナルを収集し、切除試薬で保護基を除去し、溶出試薬で洗浄することを順次行った。その後、各サイクルのＱ３０低下率と各サイクルのシーケンシングのエラー率のカーブを算出し、シーケンシングの品質を評価した。

【0132】

実験群２：ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットを使用し、キット中の＃１ウェルの試薬を除去し、上記で調製した合成試薬３－２、すなわち、蛍光及び可逆的ブロッキング修飾基の両方を有するヌクレオチド混合溶液１と可逆的ブロッキング修飾基のみを有するヌクレオチド混合溶液２とを３：２の割合となるように混合して調製した反応溶液、で置き換えた。各反応サイクルにおいて、１ラウンドの重合のみ行い、重合したヌクレオチドは、ヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２を３：２の割合で調製した混合溶液とした。ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンシングプラットフォームを使用し、図２に示す実験プロセスに従ってＳＥ１００シーケンシングを行った。つまり、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットの説明書に従って、溶出試薬で遊離ヌクレオチドを溶出し、撮影試薬でシグナルを収集し、切除試薬で保護基を除去し、溶出試薬で洗浄することを順次行った。その後、各サイクルのＱ３０低下率と各サイクルのシーケンシングのエラー率のカーブを算出し、シーケンシングの品質を評価した。

【0133】

実験群３：ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットを使用し、キット中の＃１ウェルの試薬及び＃２ウェル試薬を除去し、＃１ウェル試薬をシーケンシング群の合成試薬３－２に、＃２ウェル試薬をシーケンシング群の合成試薬４に置き換え、各反応サイクルにおいて２ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目の重合ヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２とを３：２の割合となるように調製した混合溶液であり、第２ラウンド目の重合ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチドの混合溶液であった。ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンシングプラットフォームを使用し、図３に示す実験プロセスに従ってＳＥ１００シーケンシングを行った。つまり、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットの説明書に従って、溶出試薬で遊離ヌクレオチドを溶出し、撮影試薬でシグナルを収集し、切除試薬で保護基を除去し、溶出試薬で洗浄することを順次行った。その後、各サイクルのＱ３０低下率と各サイクルのシーケンシングのエラー率のカーブを算出し、シーケンシングの品質を評価した。

【0134】

実験群４：ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットを使用し、キット中の＃１ウェルの試薬、＃２ウェルの試薬、＃１７のウェルの試薬を除去し、＃１ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬３－２に、＃２ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬２に、＃１７ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬４に置き換えた。ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンシングプラットフォームを使用し、図４に示すような実験プロセスに従ってＳＥ１００シーケンシングを行った。各反応サイクルにおいて３ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目の重合ヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２とを３：２の割合で調製した混合溶液であり、第２ラウンド目の重合ヌクレオチドは混合溶液２であり、第３ラウンド目の重合ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチド混合溶液であった。つまり、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットの説明書に従って、溶出試薬で遊離ヌクレオチドを溶出し、撮影試薬でシグナルを収集し、切除試薬で保護基を除去し、溶出試薬で洗浄することを順次行った。その後、各サイクルのＱ３０低下率と各サイクルのシーケンシングのエラー率のカーブを算出し、シーケンシングの品質を評価した。

【0135】

実験群５：ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットを使用し、キット中の＃１ウェルの試薬及び＃２ウェルの試薬を除去し、＃１ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬３－２に、＃２ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬５－１に置き換えた。各反応サイクルにおいて２ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目の重合ヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２とを３：２の割合となるように調製した混合溶液であり、第２ラウンド目の重合ヌクレオチドは、ヌクレオチド混合溶液２とジデオキシヌクレオチド混合溶液を１：１００の割合で調製した混合溶液であった。ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンシングプラットフォームを使用し、図５に示す実験プロセスに従ってＳＥ１００シーケンシングを行った。つまり、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットの説明書に従って、溶出試薬で遊離ヌクレオチドを溶出し、撮影試薬でシグナルを収集し、切除試薬で保護基を除去し、溶出試薬で洗浄することを順次行った。その後、各サイクルのＱ３０低下率と各サイクルのシーケンシングのエラー率のカーブを算出し、シーケンシングの品質を評価した。

【0136】

実験群６：ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットを使用し、キット中の＃１ウェル試薬及び＃２ウェル試薬を除去し、＃１ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬３－２に、＃２ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬５－２に置き換え、各反応サイクルにおいて２ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目の重合ヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２とを３：２の割合となるように調製した混合溶液であり、第２ラウンドの重合ヌクレオチドは、ヌクレオチド混合溶液２とジデオキシヌクレオチド混合溶液を１００：１の割合となるように調製した混合溶液であった。ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンシングプラットフォームを使用し、図５に示す実験プロセスに従ってＳＥ１００シーケンシングを行った。つまり、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットの説明書に従い、溶出試薬で遊離ヌクレオチドを溶出し、撮影試薬でシグナルを収集し、切除試薬で保護基を除去し、溶出試薬で洗浄することを順次行った。その後、各サイクルのＱ３０低下率と各サイクルのシーケンシングのエラー率のカーブを算出し、シーケンシングの品質を評価した。

【0137】

実験群７：ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットを使用し、キット中の＃１ウェルの試薬及び＃２ウェルの試薬を除去し、＃１ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬３－２に、＃２ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬５－３に置き換え、各反応サイクルにおいて２ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目の重合ヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２とを３：２の割合となるように調製した混合溶液であり、第２ラウンドの重合ヌクレオチドは、ヌクレオチド混合溶液２とジデオキシヌクレオチド混合溶液とを５０：１の割合で調製した混合溶液であった。ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンシングプラットフォームを使用し、図５に示す実験プロセスに従ってＳＥ１００シーケンシングを行った。つまり、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットの説明書に従って、溶出試薬で遊離ヌクレオチドを溶出し、撮影試薬でシグナルを収集し、切除試薬で保護基を除去し、溶出試薬で洗浄することを順次行った。その後、各サイクルのＱ３０低下率と各サイクルのシーケンシングのエラー率のカーブを算出し、シーケンシングの品質を評価した。

【0138】

実験群８：ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットを使用し、キット中の＃１ウェルの試薬、＃２ウェルの試薬及び＃１７ウェルの試薬を除去し、＃１ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬３－１、＃２ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬２、＃１７ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬４に置き換えた。ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンシングプラットフォームを使用し、図６に示すような実験プロセスに従ってＳＥ１００シーケンシングを行い、各反応サイクルにおいて３ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目の重合ヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２を１：１の割合で調製した混合溶液であり、第２ラウンド目の重合ヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液２であり、第３ラウンド目の重合ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチド混合溶液であった。つまり、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットの説明書に従って、溶出試薬で遊離ヌクレオチドを溶出し、撮影試薬でシグナルを収集し、切除試薬で保護基を除去し、溶出試薬で洗浄することを順次行った。その後、各サイクルのＱ３０低下率と各サイクルのシーケンシングのエラー率のカーブを算出し、シーケンシングの品質を評価した。

【0139】

実験群９：ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットを使用し、キット中の＃１ウェルの試薬、＃２ウェルの試薬、＃１７ウェルの試薬を除去し、＃１ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬３－３に、＃２ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬２に、＃１７ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬４に置き換えた。ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンシングプラットフォームを使用し、図６に示すような実験プロセスに従ってＳＥ１００シーケンシングを行い、各反応サイクルにおいて３ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目の重合ヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２を１：１０の割合で調製した混合溶液、第２ラウンド目の重合ヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液２、第３ラウンド目の重合ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチド混合溶液であった。つまり、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットの説明書に従って、溶出試薬で遊離ヌクレオチドを溶出し、撮影試薬でシグナルを収集し、切除試薬で保護基を除去し、溶出試薬で洗浄することを順次行った。その後、各サイクルのＱ３０低下率と各サイクルのシーケンシングのエラー率のカーブとを算出し、シーケンシングの質を評価した。

【0140】

実験群１０：ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットを使用し、キット中の＃１ウェルの試薬、＃２ウェルの試薬、＃１７ウェルの試薬を除去し、＃１ウェルの試薬をシーケンシング群の合成試薬３－４に、＃２ウェル試薬をシーケンシング群の合成試薬２に、＃１７ウェル試薬をシーケンシング群の合成試薬４に置き換えた。ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシーケンシングプラットフォームを使用して、図６に示すような実験プロセスに従ってＳＥ１００シーケンシングを行い、各反応サイクルにおいて３ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目の重合ヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２を２０：１の割合で調製した混合溶液、第２ラウンド目の重合ヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液２、第３ラウンド目の重合ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチド混合溶液であった。つまり、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシーケンシングキットの説明書に従って、溶出試薬で遊離ヌクレオチドを溶出し、撮影試薬でシグナルを収集し、切除試薬で保護基を除去し、溶出試薬で洗浄することを順次行った。その後、各サイクルのＱ３０低下率と各サイクルのシーケンシングのエラー率のカーブを算出し、シーケンシングの質を評価した。

【0141】

結果：図７から図１２に示すように、図７は４つの実験、すなわち実験群１～４の各サイクルにおけるＱ３０（％）比率の結果を示している。このうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルにおけるＱ３０（％）比率である。

【0142】

図８は、４つの実験、すなわち実験群１～４の各サイクルにおけるシーケンシングのエラー率（％）の結果を示している。このうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルにおけるシーケンシングのエラー率（％）である。

【0143】

図９は５つの実験、すなわち実験群２、３、５～７の結果を示している。実験群２をコントロールとし、それ以外のすべての実験では、各反応サイクルにおいて２ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目に重合するヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２を３：２の割合で調製した混合溶液であり、第２ラウンド目に重合するヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液２とジデオキシヌクレオチド混合溶液を異なる割合で調製した混合溶液である。これらのうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルのＱ３０（％）比率である。

【0144】

図１０は５つの実験、すなわち実験群２、３、５～７の結果を示している。実験群２をコントロールとし、それ以外のすべての実験では、各反応サイクルにおいて２ラウンドの重合を行い、１ラウンド目に重合するヌクレオチドは、ヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２を３：２の割合で調製した混合物であり、２ラウンド目に重合するヌクレオチドは、ヌクレオチド混合溶液２とジデオキシヌクレオチド混合溶液を異なる割合で調製した混合物である。これらのうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルのシーケンシングのエラー率（％）である。

【0145】

図１１は５つの実験、すなわち実験群２、４、８～１０の結果を示している。実験群２をコントロールとし、それ以外のすべての実験では、各反応サイクルにおいて３ラウンドの重合を行い、第１ラウンド目に重合するヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２を異なる濃度比で調製した混合溶液、第２ラウンド目に重合するヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液２、第３ラウンド目に重合するヌクレオチドはジデオキシヌクレオチド混合溶液であった。このうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルのＱ３０（％）比率である。

【0146】

図１２は５つの実験、すなわち実験群２、４、８～１０の結果を示している。実験群２をコントロールとして、それ以外のすべての実験では、各反応サイクルにおいて３ラウンドの重合を行い、１ラウンド目に重合するヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液１とヌクレオチド混合溶液２を異なる濃度比で調製した混合溶液、第２ラウンド目に重合するヌクレオチドはヌクレオチド混合溶液２、第３ラウンド目に重合するヌクレオチドはジデオキシヌクレオチド混合溶液であった。このうち、横軸はシーケンシングサイクルの数、縦軸は各サイクルのシーケンシングのエラー率（％）である。

【0147】

各サイクルにおけるＱ３０の比率（％）が高いほど品質が良く、Ｑ３０の減少率が低いほど品質が良い。各サイクルのシーケンシングのエラー率（％）が低いほど、シーケンシングの品質が高い。

【0148】

図７及び図８の結果から、実験群４のシーケンシングの品質及びエラー率が最も良好であり、次いで実験群３が良好であり、両者の結果は実験群２及び実験群１よりも有意に良好であった。本出願の重合方法が既存の重合方法よりも優れていることが確認された。図９、１０より、実験群３、５～７は実験群２（コントロール）より有意に良好であり、実験群６が最も良好な結果（Ｑ３０の低下が最も小さい）であった。本出願の２回重合法の効果は、１回重合法よりも優れていることが確認された。

【0149】

図１１、図１２に基づいて、実験群４、８、９、及び１０はいずれも実験群２（コントロール群）より優れており、実験群４が最も優れていた。本出願の３回重合法の効果が１回重合法よりも優れていることが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【手続補正書】

【提出日】2024-04-26

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的ポリヌクレオチドの配列を分析するための方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを提供するステップと；
（ｂ）ハイブリダイゼーション又はアニーリングを可能にする条件下で、前記標的ポリヌクレオチドをプライマーと接触させ、それによって、前記標的ポリヌクレオチドと成長鎖として使用される前記プライマーとを含む部分二重鎖を形成する、ステップと；
（ｃ）前記部分二重鎖をポリメラーゼ及び第１のヌクレオチド混合物と、前記成長鎖が伸長されるように前記ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことができる条件下で接触させるステップであって、
前記第１のヌクレオチド混合物は、標識で標識された少なくとも１種のヌクレオチドを含み、
前記第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを含み、又は含まず、
前記第１のヌクレオチド混合物中の各ヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、核酸鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基を含む、ステップと；
（ｄ）前のステップの生成物をポリメラーゼ及び第２のヌクレオチド混合物と、前記成長鎖が伸長されるように前記ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことができる条件下で接触させるステップであって、
前記第２のヌクレオチド混合物は、（１）標識されていないヌクレオチド、又は（２）不可逆的ブロッキングヌクレオチド、又は（３）前記標識されていないヌクレオチドと前記不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの組み合わせ、の少なくとも１種を含み、
前記第２のヌクレオチド混合物中の各標識されていないヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、ヌクレオチド鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基を含む、ステップと；
（ｅ）前記第２のヌクレオチド混合物中の少なくとも１種のヌクレオチドが不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む場合、このステップは実施しない；
前記第２のヌクレオチド混合物が不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含まない場合、前のステップの生成物をポリメラーゼ及び第３のヌクレオチド混合物と、前記成長鎖が伸長されるように前記ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことができる条件下で接触させるステップであって、第３のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む、ステップと；
（ｆ）前のステップの生成物中の標識の存在を検出するステップと；
（ｇ）前のステップの生成物に含まれる保護基及び標識を取り除くステップと；
（ｈ）ステップ（ｃ）から（ｇ）を、０回、１回、又はそれ以上繰り返すステップと；
を含み、
これにより、前記標的ポリヌクレオチドの配列情報を得る、方法。

【請求項2】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項１に記載の方法：
（１）前記第１のヌクレオチド混合物が、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含む；
（２）前記保護基が、２’－又は３’－酸素原子基を介して結合している；
（３）前記第２のヌクレオチド混合物が、標識されていないヌクレオチドを少なくとも１種含む；
（４）前記第２のヌクレオチド混合物が、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含む。

【請求項3】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項１に記載の方法：
（１）ステップ（ｃ）において、前記伸長が前記標的ポリヌクレオチドを鋳型とする伸長である；
（２）ステップ（ｃ）において、前記伸長が１ヌクレオチドの伸長である；
（３）前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチド若しくは標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、前記第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを更に含み、又は含まない；又は
（４）前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、第４の標識で標識された第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド及び標識されていない第３のヌクレオチドを含む。

【請求項4】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項３に記載の方法：
（１）前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０である；
（２）前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、１０：１～１：１０、５：１～１：５、又は３：１～１：３である；
（３）前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２である；
（４）前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０である；
（５）前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、１０：１～１：１０、５：１～１：５、又は３：１～１：３）である；
（６）前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２である；
（７）前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０である；
（８）前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、１０：１～１：１０、５：１～１：５、又は３：１～１：３である；
（９）前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２である；
（１０）前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０である；
（１１）前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３である；
（１２）前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２である；
（１３）前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０である；
（１４）前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３である；
（１５）前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２である。

【請求項5】

ステップ（ｄ）において、前記第２のヌクレオチド混合物が、
（１）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチド；又は
（２）第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド；又は
（３）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、及び第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項５に記載の方法：
（１）前記標識されていない第１のヌクレオチドと前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００である；
（２）前記標識されていない第１のヌクレオチドと前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１である；
（３）前記標識されていない第２のヌクレオチドと前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００である；
（４）前記標識されていない第２のヌクレオチドと前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１である；
（５）前記標識されていない第３のヌクレオチドと前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００である；
（６）前記標識されていない第３のヌクレオチドと前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１である；
（７）前記標識されていない第４のヌクレオチドと前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００である；
（８）前記標識されていない第４のヌクレオチドと前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１である。

【請求項7】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法：
（１）前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識及び前記第４の標識が、各々独立して同一又は異なる；
（２）前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識、前記第４の標識が異なる；
（３）前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識及び前記第４の標識が、発光標識である；
（４）前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識及び前記第４の標識が、各々独立して、クマリン、アレクサフルオロ、ボディピー、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、フェノキサジン、アクリジン、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＡＦ５３２、テキサスレッド及びそれらの誘導体からなる群より選択される；
（５）前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、又はそれらである；
（６）前記核酸分子の前記伸長産物がＤＮＡである；
（７）前記標的ポリヌクレオチドが、真核生物、原核生物、ウイルス、ファージ、又はそれらの任意の組み合わせに由来するサンプルから得られる；
（８）前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、及びＵからなる群より選択される；
（９）前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが異なる；
（１０）前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇである；
（１１）前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、及びＵからなる群より選択される；
（１２）前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが異なる；
（１３）前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇである。

【請求項8】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項７に記載の方法：
（１）前記発光標識が蛍光標識である；
（２）前記真核生物が、動物、植物、又は真菌である；
（３）前記原核生物が、細菌又は放線菌である；
（４）前記不可逆的ブロッキングヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドである；
（５）前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチドを含む場合、前記第２のヌクレオチド混合物が、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む；又は
前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む場合、前記第２のヌクレオチド混合物は、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、及び標識されていない第３のヌクレオチドを含む。

【請求項9】

キットであって、
（ａ）第１のヌクレオチド混合物であって、標識で標識された少なくとも１種のヌクレオチドを含み、
前記第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを更に含み、又は含まず、
前記第１のヌクレオチド混合物中の各ヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、核酸鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基を含む、第１のヌクレオチド混合物と；
（ｂ）第２のヌクレオチド混合物であって、（１）標識されていないヌクレオチド、又は（２）不可逆的ブロッキングヌクレオチド、又は（３）前記標識されていないヌクレオチドと前記不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの組み合わせ、の少なくとも１種を含み、
前記第２のヌクレオチド混合物中の各標識されていないヌクレオチドは、そのリボース又はデオキシリボース部分に、核酸鎖伸長を可逆的にブロックできる保護基を含む、第２のヌクレオチド混合物と；
を含み、
（ｃ）前記第２のヌクレオチド混合物が不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含まない場合、前記キットは、少なくとも１種の不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む第３のヌクレオチド混合物を含み、
前記第２のヌクレオチド混合物中の少なくとも１種のヌクレオチドが不可逆的ブロッキングヌクレオチドを含む場合、前記キットは第３のヌクレオチド混合物を含まない、キット。

【請求項10】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項９に記載のキット：
（１）前記第１のヌクレオチド混合物が、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを更に含む；
（２）前記保護基が、２’－又は３’－酸素原子を介して結合している；
（３）前記第２のヌクレオチド混合物が、標識されていないヌクレオチドを少なくとも１種含む；
（４）前記第２のヌクレオチド混合物が、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチドを含む；
（５）前記不可逆的ブロッキングヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドである。

【請求項11】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項９に記載のキット：
前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチド若しくは標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、前記第１のヌクレオチド混合物は、少なくとも１種の標識されていないヌクレオチドを更に含み、又は含まず；又は
前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、第４の標識で標識された第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド及び標識されていない第３のヌクレオチドを含む。

【請求項12】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項１１に記載のキット：
（１）前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０である；
（２）前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、１０：１～１：１０、５：１～１：５、又は３：１～１：３である；
（３）前記第１の標識で標識された前記第１のヌクレオチドと標識されていない前記第１のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２である；
（４）前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０である；
（５）前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、１０：１～１：１０、５：１～１：５、又は３：１～１：３である；
（６）前記第２の標識で標識された前記第２のヌクレオチドと標識されていない前記第２のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２である；
（７）前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０である；
（８）前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、１０：１～１：１０、５：１～１：５、又は３：１～１：３である；
（９）前記第３の標識で標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２である；
（１０）前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０である；
（１１）前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、１０：１～１：１０、５：１～１：５、又は３：１～１：３である；
（１２）前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された前記第３のヌクレオチドと標識されていない前記第３のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２である；
（１３）前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、２０：１～１：１０である；
（１４）前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、１０：１～１：１０、５：１～１：５、又は３：１～１：３である；
（１５）前記第４の標識で標識された前記第４のヌクレオチドと標識されていない前記第４のヌクレオチドとの比が、２０：１、１：１０、１：１又は３：２である。

【請求項13】

前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び第４の標識で標識された第４のヌクレオチドを含む場合、前記第２のヌクレオチド混合物が、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む；又は
前記第１のヌクレオチド混合物が、第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、第３の標識で標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含み、又は第１の標識で標識された第１のヌクレオチド、第２の標識で標識された第２のヌクレオチド、前記第１の標識及び前記第２の標識で共標識された第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチドを含む場合、前記第２のヌクレオチド混合物が、標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、及び標識されていない第３のヌクレオチドを含む、請求項９～１２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項14】

前記第２のヌクレオチド混合物が、
（１）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、及び標識されていない第４のヌクレオチド；又は
（２）第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド；又は
（３）標識されていない第１のヌクレオチド、標識されていない第２のヌクレオチド、標識されていない第３のヌクレオチド、標識されていない第４のヌクレオチド、第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、及び第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチド
を含む、請求項１３に記載のキット。

【請求項15】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項１４に記載のキット：
（１）前記標識されていない第１のヌクレオチドと前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００である；
（２）前記標識されていない第１のヌクレオチドと前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１である；
（３）前記標識されていない第２のヌクレオチドと前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００である；
（４）前記標識されていない第２のヌクレオチドと前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１である；
（５）前記標識されていない第３のヌクレオチドと前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００である；
（６）前記標識されていない第３のヌクレオチドと前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１である；
（７）前記標識されていない第４のヌクレオチドと前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１００：１～１：１００である；
（８）前記標識されていない第４のヌクレオチドと前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドとの比が、１：１００、５０：１又は１００：１である；
（９）前記不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオチドである。

【請求項16】

核酸ポリメラーゼ、伸長用試薬、シーケンシング用試薬、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１種以上を更に含む、請求項９に記載のキット。

【請求項17】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項１６に記載のキット：
（１）前記伸長用試薬が、前記ポリヌクレオチドに完全又は部分的に相補的なプライマー、酵素用の作業緩衝液、水、イオンを含む溶液、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１種以上を含む；
（２）前記シーケンシング用試薬が、シーケンシング用スライド、ヌクレオチド上の保護基及び標識を除去するための試薬、並びに前記標識の発光シグナルを検出するための試薬からなる群より選択される１種以上を含む；
（３）前記核酸ポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである：
（４）前記核酸ポリメラーゼが、サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィレス（Ｔｔｈ）、サーマス・フィリフォルミス、サーミス・フラバス、サーモコッカス・リテラリス、サーマス・アントラニルダニイ、サーマス・カルドフィラス、サーマス・チリアロフィラス、サーマス・フラバス、サーマス・イグニテレア、サーマス・ラクテウス、サーマス・オシマイ、サーマス・ルバー、サーマス・ルーベンス、サーマス・スコトダクタス、サーマス・シルヴァヌス、サーマス・サーモフィラス、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーモシホ・アフリカヌス、サーモコッカス・リトラリス、サーモコッカス・バロッシ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーモシホ・アフリカヌス、ピロコッカス・ウオエセイ、ピロコッカス・ホリコシ、ピロコッカス・アビシ、ピロジクチウム・オクルタム、アクイフェックス・ピロフィラス、及びアクイフェックス・アエロリウスから得られる；
（５）前記キットがポリヌクレオチドの分析に使用される；
（６）前記キットがポリヌクレオチドのシーケンシングに使用される；
（７）前記標識の存在が発光シグナルによって検出される；
（８）前記標識の存在が、１種以上の発光シグナルによって検出される；
（９）前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識、及び前記第４の標識が、各々独立して同一又は異なる；
（１０）前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識、前記第４の標識が異なる；
（１１）前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識及び前記第４の標識が、発光標識である；
（１２）前記第１の標識、前記第２の標識、前記第３の標識及び前記第４の標識が、各々独立して、クマリン、アレクサフルオロ、ボディピー、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、フェノキサジン、アクリジン、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＡＦ５３２、ＥＦ７００、テキサスレッド及びそれらの誘導体からなる群より選択される；
（１３）前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、又はそれらである；
（１４）前記核酸分子の前記伸長産物がＤＮＡである；
（１５）前記標的ポリヌクレオチドが、真核生物、原核生物、ウイルス、ファージ、又はそれらの任意の組み合わせに由来するサンプルから得られる。

【請求項18】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項１６に記載のキット：
（１）前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、及びＵからなる群より選択される；
（２）前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが異なる；
（３）前記第１のヌクレオチド、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド及び前記第４のヌクレオチドが、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ及びＧである；
（４）前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、各々独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕからなる群より選択される；
（５）前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが異なる；
（６）前記第１の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第２の不可逆的ブロッキングヌクレオチド、前記第３の不可逆的ブロッキングヌクレオチド及び前記第４の不可逆的ブロッキングヌクレオチドが、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ及びＧである。

【請求項19】

以下の１つ以上を特徴とする、請求項１７に記載のキット：
（１）前記核酸ポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである；
（２）前記発光標識が蛍光標識である；
（３）前記真核生物が、動物、植物、又は真菌である；
（４）前記原核生物が、細菌又は放線菌である。

【国際調査報告】