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特表2024-530408ＬＣ－ＭＳによるヒト脳脊髄液中の高リン酸化Ｔａｕの決定方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-21
(54)【発明の名称】ＬＣ－ＭＳによるヒト脳脊髄液中の高リン酸化Ｔａｕの決定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/48 20060101AFI20240814BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20240814BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20240814BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240814BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20240814BHJP
【ＦＩ】
G01N33/48 A
G01N27/62 V ZNA
C12Q1/37
G01N33/68
C07K14/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024502004
(86)(22)【出願日】2022-08-04
(85)【翻訳文提出日】2024-03-13
(86)【国際出願番号】 EP2022071958
(87)【国際公開番号】W WO2023012278
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】21190078.2
(32)【優先日】2021-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591143065
【氏名又は名称】ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100141195
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 恵美子
(72)【発明者】
【氏名】ヤコブセン，アン－マリー
(72)【発明者】
【氏名】オルセン，ライン，ロールベック
(72)【発明者】
【氏名】マルベル，ニコ，ファン デ
(72)【発明者】
【氏名】シャルク，フランク
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041EA04
2G041FA12
2G041HA01
2G041JA02
2G041JA10
2G041LA08
2G045AA25
2G045BA13
2G045BB60
2G045DA36
2G045FA40
2G045FB06
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR16
4B063QS40
4B063QX04
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、サンプル中のｐＳ３９６Ｔａｕを測定する方法であって、ｉ～ｉｖのステップ、ｉ）Ｔａｕ病態を患っているか又は患っていることが疑われる対象からのＣＳＦサンプルをトリプシンで処理するステップと、ｉｉ）ステップｉ）のサンプルを脱リン酸化剤にさらし、続いて、ステップｉｖ）のためにサンプルの一部を取り置きした後、残りのサンプルを用いてステップｉｉｉ）に進むステップと、ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの脱リン酸化サンプルを第２のトリプシン処理にさらすステップと、ｉｖ）ＬＣ－ＭＳを用いて、ステップｉｉ）及びステップｉｉｉ）からのサンプル中のＴａｕ残基３９６～４０６に相当するＴａｕペプチド（ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ）の量を測定するステップとを含む方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中のｐＳ３９６Ｔａｕを測定する方法であって、ｉ～ｉｖのステップ、ｉ）Ｔａｕ病態を患っているか又は患っていることが疑われる対象からのＣＳＦサンプルをトリプシンで処理するステップと、
ｉｉ）前記ステップｉ）のサンプルを脱リン酸化剤にさらし、続いて、ステップｉｖ）のために前記サンプルの一部を取り置きした後、残りのサンプルを用いてステップｉｉｉ）に進むステップと、
ｉｉｉ）前記ステップｉｉ）からの脱リン酸化サンプルを第２のトリプシン処理にさらすステップと、
ｉｖ）ＬＣ－ＭＳを用いて、前記ステップｉｉ）及び前記ステップｉｉｉ）からのサンプル中のＴａｕ残基３９６～４０６に相当するＴａｕペプチド（ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ）の量を測定するステップと
を含む方法。
【請求項2】
前記ステップｉｖ）で測定された、前記ステップｉｉ）及び前記ステップｉｉｉ）からのＴａｕペプチド（ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ）の量を比較するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ステップｉｖ）で得られた結果と、Ｔａｕ残基２６０～２６７（ＩＧＳＴＥＮＬＫ）を含む対照とを比較するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記対象はヒトである、請求項１～３に記載の方法。
【請求項5】
前記Ｔａｕ病態は、アルツハイマー病、ダウン症候群、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤによる精神病又はＡＤ患者における精神病、ＡＤによるアパシー又はＡＤ患者におけるアパシー、レビー小体型認知症患者の精神症状、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ又はその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性又は慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年認知症、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に連鎖するパーキンソニズム、Ｌｙｔｉｃｏ－Ｂｏｄｉｇ病（グアムのパーキンソン－認知症複合）、神経節膠腫及び神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハラーフォルデン－シュパッツ病及びリポフスチン沈着症から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記Ｔａｕ病態はアルツハイマー病又はダウン症候群である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
Ｔａｕ病態を有する患者を診断するための、先行請求項のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項8】
Ｔａｕ病態を有する患者の疾患を監視するための、先行請求項のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項9】
Ｔａｕ病態を患っている対象における治療効果を監視するための、先行請求項のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項10】
前記治療は、抗Ｔａｕ抗体治療である、請求項９に記載の使用。
【請求項11】
前記Ｔａｕ病態は、アルツハイマー病、ダウン症候群、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤによる精神病又はＡＤ患者における精神病、ＡＤによるアパシー又はＡＤ患者におけるアパシー、レビー小体型認知症患者の精神症状、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ又はその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性又は慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年認知症、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に連鎖するパーキンソニズム、Ｌｙｔｉｃｏ－Ｂｏｄｉｇ病（グアムのパーキンソン－認知症複合）、神経節膠腫及び神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハラーフォルデン－シュパッツ病及びリポフスチン沈着症から選択される、請求項７～１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項12】
前記Ｔａｕ病態はアルツハイマー病又はダウン症候群である、請求項７～１０のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トリプシン消化及び液体クロマトグラフィー／質量分析ワークフロー（ＬＣ－ＭＳ）を用いて、ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）中の高リン酸化Ｔａｕ、特に、Ｔａｕの３９６位のセリン残基（Ｓ３９６）でリン酸化されたＴａｕを決定する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アルツハイマー病（ＡＤ）又はダウン症候群などのＴａｕ病態においてＴａｕ病態の進行を追跡する方法は、患者を診断するため、又はその病期を監視するために非常に適切であり得る。現在、後になってＡＤに進行する可能性のある軽度認知機能障害（ＭＣＩ）を有する患者に見られるようなＴａｕ病態の初期段階の患者を特定するために、診断及び予測バイオマーカー、並びに分類目的のバイオマーカーが臨床的に強く必要とされている。
【0003】
有望な脳脊髄液（ＣＳＦ）バイオマーカー候補は、十分な診断精度及び予測力を有することが判明する可能性のある総Ｔａｕタンパク質及びリン酸化Ｔａｕタンパク質（ｐＴａｕ）である。本発明者らは、セリン３９６でリン酸化された（ｐＳ３９６）Ｔａｕタンパク質を用いて、高リン酸化Ｔａｕを検出することができるアッセイを開発し、この分析／バイオマーカーは、例えば、高レベルのヒトＴａｕ及びＴａｕ病態を発現するトランスジェニックマウスにおける抗体治療の効果を示し得ることが示された。
【0004】
本発明の発明者らは、高リン酸化Ｔａｕ病態における特徴である、Ｔａｕがセリン３９６でリン酸化されている（ｐＳ３９６）場合、トリプシンがアミノ酸リジン３９５の後で切断しないという事実を利用する方法を用いて、ｐＳ３９６－Ｔａｕを測定する信頼できる方法を見出した。したがって、この部位でリン酸化されていないＴａｕタンパク質のみがトリプシンによって切断され、ペプチド
（配列番号１）が生じることになる。ここで、
は非リン酸化Ｓ３９６セリンである。
【化1】
（配列番号１）が生じることになる。ここで、
【化2】
は非リン酸化Ｓ３９６セリンである。
【0005】
Ｔａｕタンパク質は、（少なくとも）６つのプロテオフォーム（３５２～４４１アミノ酸の範囲）からなり、翻訳後修飾（ＰＴＭ）のために８０を超える可能な部位を含有する非常に複雑な構造である。不均一な構造は、対象となるシグネチャーペプチドの質量が可能性なＰＴＭに応じて変化し得るので、タンパク質の質量分光分析にとっての課題である。
【0006】
本発明において、対象となるシグネチャーペプチドは、セリン３９６を含有する。トリプシンの切断点は、後のアミノ酸がリン酸化されている場合を除いて、アミノ酸Ｌｙｓ（Ｋ）及びＡｒｇ（Ｒ）のカルボニル（Ｃ）側である。したがって、ｐＳ３９６－Ｔａｕの分析の場合、トリプシン切断により、シグネチャーペプチド
（配列番号２）が生じる。しかしながら、このペプチドは、アミノ酸Ｔ３８６、Ｙ３９４、Ｓ４００、Ｔ４０３及びＳ４０４においてリン酸化されている（又はされていない）可能性がある。これらのリン酸化の種々の可能な組合せは何百もの異なるペプチドをもたらし、これらはそれぞれ、ＬＣ－ＭＳ分析に対して特定のクロマトグラフ保持時間及び／又は分子質量を有する。ｐＳ３９６を含有するシグネチャーペプチドの直接定量分析がＬＣ－ＭＳを用いて実行される場合、リン酸化ペプチドの個々の変化形のそれぞれの定量化が必要とされ得る。このアプローチは膨大な分析作業を必要とし、ｐＳ３９６のより重要な分析シグナルがこれらの種々のペプチドに「希釈」され得る。ヒトＣＳＦ中のｐＳ３９６の予想濃度は低ｐＭ範囲なので、このような直接分析を適用する場合、質量分析計の感度への要求が制限となり得る。
【化3】
（配列番号２）が生じる。しかしながら、このペプチドは、アミノ酸Ｔ３８６、Ｙ３９４、Ｓ４００、Ｔ４０３及びＳ４０４においてリン酸化されている（又はされていない）可能性がある。これらのリン酸化の種々の可能な組合せは何百もの異なるペプチドをもたらし、これらはそれぞれ、ＬＣ－ＭＳ分析に対して特定のクロマトグラフ保持時間及び／又は分子質量を有する。ｐＳ３９６を含有するシグネチャーペプチドの直接定量分析がＬＣ－ＭＳを用いて実行される場合、リン酸化ペプチドの個々の変化形のそれぞれの定量化が必要とされ得る。このアプローチは膨大な分析作業を必要とし、ｐＳ３９６のより重要な分析シグナルがこれらの種々のペプチドに「希釈」され得る。ヒトＣＳＦ中のｐＳ３９６の予想濃度は低ｐＭ範囲なので、このような直接分析を適用する場合、質量分析計の感度への要求が制限となり得る。
【0007】
したがって、本発明の態様は、ＣＳＦから得られるサンプルのトリプシン消化にある。本発明では、単一のヒトＴａｕ由来ペプチドＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ［ａａ３９６～４０６］（配列番号１）に分析の焦点を合わせることを可能にする、間接的な分析アプローチが適用される。
【0008】
この方法では、Ｓ３９６におけるリン酸化によってこの位置でトリプシンがタンパク質鎖を切断することが防止され、したがって、Ｓ３９６－リン酸化Ｔａｕタンパク質のトリプシン消化は、ペプチドＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ［ｐ］ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（配列番号２）をもたらすという事実を利用する。したがって、Ｓ３９６でリン酸化されていないＴａｕタンパク質のみが最初のワークフローでトリプシンによって切断され、ペプチドＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（配列番号１）をもたらす（ホスファターゼ処理により全ての可能なリン酸化を除去した後）。したがって、ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲのワークフロー１分析は、非リン酸化Ｓ３９６の量に相当する。
【0009】
ワークフロー２では、第２のトリプシン消化が適用される。ペプチドＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（配列番号１）はこの処理の影響を受けないが、ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲは、セリン３９６においてペプチドがもはやリン酸化されていない（ホスファターゼ処理により除去される）ので、この時点でアミノ酸リジン３９５とセリン３９６との間で切断されることになる。したがって、第２のトリプシン消化により追加量のＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲが生じ、ワークフロー２分析は、非リン酸化Ｓ３９６及びリン酸化Ｓ３９６の合計（Ｔａｕの総量に等しい）に相当する。
【0010】
したがって、ワークフロー１及びワークフロー２で測定されるＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ［３９６～４０６］（配列番号１）の量の差は、最初にＳ３９６でリン酸化されていたＴａｕタンパク質（ｐＳ３９６－Ｔａｕ）の量に等しい。
【発明の概要】
【0011】
本発明は、ＣＳＦサンプル中のｐＳ３９６Ｔａｕを測定する方法であって、
ｉ）Ｔａｕ病態を患っているか又は患っていることが疑われる対象からの（インビトロ）ＣＳＦサンプルをトリプシンで処理するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）のサンプルを脱リン酸化剤にさらし、続いて、ステップｉｖ）のためにサンプルの一部を取り置きした後、残りのサンプルを用いてステップｉｉｉ）に進むステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの脱リン酸化サンプルを第２のトリプシン処理にさらすステップと、
ｉｖ）ＬＣ－ＭＳを用いて、ステップｉｉ）及びステップｉｉｉ）からのサンプル中のＴａｕ残基３９６～４０６に相当するＴａｕペプチド（ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（配列番号１））の量を測定するステップと
を含む方法に関する。
ｉ）Ｔａｕ病態を患っているか又は患っていることが疑われる対象からの（インビトロ）ＣＳＦサンプルをトリプシンで処理するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）のサンプルを脱リン酸化剤にさらし、続いて、ステップｉｖ）のためにサンプルの一部を取り置きした後、残りのサンプルを用いてステップｉｉｉ）に進むステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの脱リン酸化サンプルを第２のトリプシン処理にさらすステップと、
ｉｖ）ＬＣ－ＭＳを用いて、ステップｉｉ）及びステップｉｉｉ）からのサンプル中のＴａｕ残基３９６～４０６に相当するＴａｕペプチド（ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（配列番号１））の量を測定するステップと
を含む方法に関する。
【0012】
本方法は、Ｔａｕ病態を有する患者を診断する、又はＴａｕ病態を有する患者の疾患を監視するのに使用することができる。或いは、本方法は、Ｔａｕ病態を有する患者の治療効果を監視するために使用可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】全長Ｔａｕタンパク質と、ＬＣ－ＭＳ分析のために選択されたペプチドであるＴａｕ（２６０～２６７）及びＴａｕ（３９６～４０６）との概略図である。またこの図は、Ｓ３９６上のリン酸化の位置（ｐＳ３９６）及びペプチドＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫ［ｐ］ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（Ｔａｕ（３８６～４０６））も示し、これは、リジン３９５における切断ミスの結果である。ｐＳ３９６－Ｔａｕは、脱リン酸化の前後のＴａｕペプチド（アミノ酸３９６～４０６）濃度の差として間接的に測定される。
【図2】Ｓ３９６での３０％のリン酸化によって例示されるＳ３９６リン酸化Ｔａｕの分析について、サンプルワークフローの個々のステップで得られるシグネチャーペプチドを示す理論的なＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。本方法ではＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（配列番号１）が測定されるが、この図には参考のためだけにＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（配列番号２）が含まれる。上部区画（Ａ＋Ｂ）は、第１のトリプシン消化及び脱リン酸化の後の分析ピークを示す。Ａ：ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲの分析ピークはＳ３９６でリン酸化されたＴａｕに相当する（切断ミス）が、Ｂ：ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲの分析ピークはＳ３９６でリン酸化されていないＴａｕに相当する。下部区画（Ｃ＋Ｄ）は、第２のトリプシン消化後に得られる分析ピークを示す。Ｃ：ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲは、この時点でリジン３９５部位において切断されている（Ｓ３９６はもはやリン酸化されていない）ので、これは検出不能である。Ｄ：ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲの分析ピークは、区画Ａのピークに相当する面積を伴って増大する。追加の面積は、Ｓ３９６でリン酸化された（ｐＳ３９６）Ｔａｕの量に相当する。
【図3A】図３Ａ－Ｂ。ヒトＣＳＦ中のＴａｕ（３９６～４０６）ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲペプチドの内因性レベルの分析についてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。パネルＡは、ワークフロー１の後（すなわち、第１のトリプシン消化及び脱リン酸化後）に得られたクロマトグラムを示し、パネルＢは、ワークフロー２の後（すなわち、第２のトリプシン消化後）のクロマトグラムを示す。分析ピーク面積は、ＷＦ１の３０４８９カウントからＷＦ２の５２５８５カウントまで増大し、２２０９６カウント又は４２％の差に等しいことに注意されたい。この差は、Ｓ３９６におけるリン酸化（ｐＳ３９６）の量に相当する。
【図3B】上記と同じ。
【図4-1】図４Ａ－Ｄ。人工ＣＳＦにおいて調製された較正標準中のＴａｕ（３９６～４０６）ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲペプチドの分析についてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。パネル１はブランクサンプルを示し、パネル２は定量下限（ＬＬＯＱ）に相当する２ｐＭの較正標準を示し、パネル３は２０ｐＭの較正標準（ヒトＣＳＦ中の通常のレベル）を示し、パネル４は定量上限（ＵＬＯＱ）に相当する１００ｐＭの較正標準を示す。各パネルにおいて、図ａは非標識ペプチドであり、図ｂは内部標準（１５Ｎ－ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ）である。
【図4-2】上記と同じ。
【図4-3】上記と同じ。
【図4-4】上記と同じ。
【図4-5】上記と同じ。
【図4-6】上記と同じ。
【図4-7】上記と同じ。
【図4-8】上記と同じ。
【図5】対照ｈＩｇＧ抗体（Ｂ１２、Ｔａｕに結合することは予想されない）、又はｐＳ３９６－Ｔａｕエピトープを標的とするように開発されたモノクローナルｈＩｇＧ抗Ｔａｕ抗体のいずれかを６週間投与（週１回）した後に、トランスジェニックマウス（ｒｔｇ４５１０）からのＣＳＦサンプルの分析で得られたデータである。若齢マウスは、ＣＳＦを採取したときに３．５ヶ月であり、低レベルのＴａｕ病態を有することが分かっている。老齢マウスは、ＣＳＦを採取したときに９カ月であり、その齢で重度レベルのＴａｕ病態を有することが分かっている。上部区画はＴａｕ（３９６～４０６）の分析の結果を示し、下部区画は、第２のトリプシン消化の前後のＴａｕ（３９６～４０６）の間の差として計算されたＳ３９６リン酸化Ｔａｕの結果を示す。対照抗体処置マウスでは、ｔａｕ（３９６～４０６）及びｐＳ３９６の測定濃度は、若齢マウスと比較して老齢マウスの方が高いことが観察され得る。さらに、老齢マウス（Ｔａｕ病態を有する）では、抗Ｔａｕ ｈＩｇＧによる処置後にｔａｕ（３９６～４０６）及びｐＳ３９６の用量依存的な減少が観察される。
【発明を実施するための形態】
【0014】
参照によって援用される配列
配列番号１ ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（Ｔａｕ３９６～４０６）
配列番号２ ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（Ｔａｕ３８６～４０６）
配列番号３ ＩＧＳＴＥＮＬＫ（Ｔａｕ２６０～２６７）。
配列番号１ ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（Ｔａｕ３９６～４０６）
配列番号２ ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（Ｔａｕ３８６～４０６）
配列番号３ ＩＧＳＴＥＮＬＫ（Ｔａｕ２６０～２６７）。
【0015】
発明の説明
本発明は、ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル中のセリン残基Ｓ３９６でリン酸化された（ｐＳ３９６）Ｔａｕの量を測定するアッセイに関する。目的は、特に、診断が所望される対象又は治療の効果を決定若しくは監視すべき対象において、ｐＳ３９６を測定することによって対象のＣＳＦ中の高リン酸化Ｔａｕの尺度を得ることである。これらの対象は、アルツハイマー病（ＡＤ）及びダウン症候群などのＴａｕ病態を患っているか又は患っていることが疑われる。
本発明は、ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル中のセリン残基Ｓ３９６でリン酸化された（ｐＳ３９６）Ｔａｕの量を測定するアッセイに関する。目的は、特に、診断が所望される対象又は治療の効果を決定若しくは監視すべき対象において、ｐＳ３９６を測定することによって対象のＣＳＦ中の高リン酸化Ｔａｕの尺度を得ることである。これらの対象は、アルツハイマー病（ＡＤ）及びダウン症候群などのＴａｕ病態を患っているか又は患っていることが疑われる。
【0016】
本発明の発明者らは、ＣＳＦ中の高リン酸化Ｔａｕの間接的な尺度として、ｐＳ３９６Ｔａｕの分析を使用した。トリプシン切断ステップを使用することにより、本発明の発明者らは、リン酸化されているときにＴａｕのセリン残基３９６（Ｓ３９６）の直前でトリプシンがＴａｕを切断できないことを利用した。
【0017】
したがって、本発明の態様は、ＣＳＦから得られるサンプルのトリプシン消化にある。ＴａｕがＳ３９６位でリン酸化されていないと、トリプシンは残基Ｓ３９６の直前で切断して、ペプチドＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ［アミノ酸３９６～４０６］を生成することができる。この断片は、例えば、Ｔａｕ病態のない健常者において優勢である。Ｔａｕ病態の病期（例えば、ＡＤ）において、Ｔａｕは高リン酸化され、残基Ｓ３９６もリン酸化されることになる。ｐＳ３９６を生じるＳ３９６でのリン酸化はトリプシンの切断能力を妨害し、したがって、トリプシン消化によってシグネチャーペプチドＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲが生じないことになる。代わりに、より大きいペプチドＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲが生じる。
【0018】
一態様では、本発明は、
ｉ）対象（例えば、ヒト）からのＣＳＦサンプルをトリプシンで処理するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の残りのサンプルを脱リン酸化剤（ホスファターゼなど）にさらし、続いて、ステップｉｖ）のためにサンプルの一部を取り置きした後、ステップｉｉｉ）に進むステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの脱リン酸化サンプルをトリプシン処理にさらすステップと、
ｉｖ）ステップｉｉ）及びステップｉｉｉ）からのサンプル中のペプチドＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲの量を測定する（例えば、ＬＣ－ＭＳを用いて）ステップと、
ｖ）任意選択的に、ステップｉｖ）で測定されたステップｉｉ）及びステップｉｉｉ）からのＴａｕペプチド（ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ）の量を比較するステップと、
ｖｉ）任意選択的に、ステップｉｖ）で測定されたステップｉｉ）及びステップｉｉｉ）からのＴａｕペプチド（ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ）の量と、リン酸化による影響を受けないトリプシン消化されたＴａｕペプチド断片（例えば、残基２６０～２６７（ＩＧＳＴＥＮＬＫ）を含むＴａｕペプチド）（配列番号３）などの対照とを比較するステップと
を含む方法に関する。
ｉ）対象（例えば、ヒト）からのＣＳＦサンプルをトリプシンで処理するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の残りのサンプルを脱リン酸化剤（ホスファターゼなど）にさらし、続いて、ステップｉｖ）のためにサンプルの一部を取り置きした後、ステップｉｉｉ）に進むステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）からの脱リン酸化サンプルをトリプシン処理にさらすステップと、
ｉｖ）ステップｉｉ）及びステップｉｉｉ）からのサンプル中のペプチドＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲの量を測定する（例えば、ＬＣ－ＭＳを用いて）ステップと、
ｖ）任意選択的に、ステップｉｖ）で測定されたステップｉｉ）及びステップｉｉｉ）からのＴａｕペプチド（ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ）の量を比較するステップと、
ｖｉ）任意選択的に、ステップｉｖ）で測定されたステップｉｉ）及びステップｉｉｉ）からのＴａｕペプチド（ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ）の量と、リン酸化による影響を受けないトリプシン消化されたＴａｕペプチド断片（例えば、残基２６０～２６７（ＩＧＳＴＥＮＬＫ）を含むＴａｕペプチド）（配列番号３）などの対照とを比較するステップと
を含む方法に関する。
【0019】
トリプシンは、セリン３９６がリン酸化されていない場合にだけアミノ酸リジン３９５とセリン３９６の間を切断することができるので、上記ステップｉｉ）で測定されるＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲは、ＣＳＦサンプル中の非リン酸化Ｓ３９６に相当するＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲの部分を測定することになる。
【0020】
ステップｉｉｉ）において、第２のトリプシン消化は、ステップｉｉ）の脱リン酸化ステップの後に適用される。ステップｉ）からのリン酸化及び非切断ＴａｕペプチドＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲの部分は、セリン３９６においてＴａｕがもはやリン酸化されていないので、この時点でアミノ酸リジン３９５とセリン３９６の間で切断されることになる。したがって、第２のトリプシン消化は、非リン酸化Ｓ３９６及びリン酸化Ｓ３９６の合計（Ｔａｕの総量）に相当する追加量のＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲをもたらす。
【0021】
さらに、ステップｉ）の後に直接測定されるＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（非リン酸化Ｓ３９６）の量と、ステップｉｉｉ）の第２の消化後に測定されるＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ（総Ｔａｕ）の量との差は、Ｓ３９６でリン酸化されたＴａｕタンパク質の量である。ＩＧＳＴＥＮＬＫ［２６０～２６７］はリン酸化部位を全く含有しないので、このペプチドは参照ペプチドとしての役割を果たし、第２のトリプシン消化ステップの前後で同じ濃度が測定されるはずである。これは、Ｔａｕタンパク質の総濃度を測定するための確認ペプチドとしての役割を果たす。
【0022】
脱リン酸化ステップの前にトリプシンの残留物を除去するために、ステップｉ）でトリプシン消化されたペプチドは、脱リン酸化処理の前に固相抽出（ＳＰＥ）にさらされる（リン酸化が除去されたときにＳ３９６における切断を回避するため）。脱リン酸化の前に、ｐＨは５．５に調整される。このｐＨでは、トリプシンの酵素活性は最小限にされるが、ラムダタンパク質ホスファターゼ（λＰＰ）の活性は維持される。ステップｖ）において、上記のアッセイでのＴａｕタンパク質の分析に適した方法は、ペプチドＴａｕ（３９６～４０６）及びＴａｕ（２６０～２６７）のＬＣ－ＭＳ分析であり得る。
【0023】
本発明に従う方法は、哺乳類（マウス又はサル）、特にヒトなどの対象のＴａｕ病態を評価又は監視するために使用することができる。
【0024】
Ｔａｕ病態は、アルツハイマー病、ダウン症候群、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、精神病、特に、ＡＤによる精神病又はＡＤ患者における精神病、ＡＤによるアパシー又はＡＤ患者におけるアパシー、レビー小体型認知症患者の精神症状、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ又はその変異型）、ＴＢＩ（外傷性脳損傷、急性又は慢性）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優位型老年認知症、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に連鎖するパーキンソニズム、Ｌｙｔｉｃｏ－Ｂｏｄｉｇ病（グアムのパーキンソン－認知症複合）、神経節膠腫及び神経節細胞腫、髄膜血管腫症（Meningioangiomatosis）、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハラーフォルデン－シュパッツ病及びリポフスチン沈着症などの多くの疾患で見ることができる。上記で開示された方法は、アルツハイマー病又はダウン症候群などのＴａｕ病態を有する患者を診断するために使用可能であることが予想される。さらに、この方法は、Ｔａｕ病態を有する対象の疾患を監視するためにも有用であると考えられる。
【0025】
さらに、上記で開示された方法は、アルツハイマー病又はダウン症候群などのＴａｕ病態を有する対象における治療効果を監視するために使用可能であることが予想される。特に、この方法は、抗Ｔａｕ抗体治療などの、Ｔａｕ病態を標的とし得る任意の治療を監視するために有用であると考えられる。
【実施例】
【0026】
実施例１：材料及び試薬
ラムダタンパク質ホスファターゼ（λＰＰ、５０μＬの４０００００単位／ｍＬ）及び１０ｍＭの塩化マンガン（ＩＩ）（１ｍＬの１０ｍＭのＭｎＣｌ２）は、Ｂｉｏｋｅから入手した。
ラムダタンパク質ホスファターゼ（λＰＰ、５０μＬの４０００００単位／ｍＬ）及び１０ｍＭの塩化マンガン（ＩＩ）（１ｍＬの１０ｍＭのＭｎＣｌ２）は、Ｂｉｏｋｅから入手した。
【0027】
Ｓｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）ｔＣ１８ １００ｍｇ ９６ウェルＳＰＥプレートは、Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳから入手した。
【0028】
ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩＩは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【0029】
トリプシン（ブタ膵臓由来、Ｔ０３０３）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【0030】
トリプシン阻害剤は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【0031】
生体サンプル
ヒトＣＳＦは、ＢｉｏＩＶＴ又はＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄから入手した。
ヒトＣＳＦは、ＢｉｏＩＶＴ又はＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄから入手した。
【0032】
マウスＣＳＦは、自社の研究所から入手した。ＣＳＦは、疾患関連変異Ｐ３０１Ｌを保有するヒト０Ｎ４Ｒ ｔａｕを発現するｒｔｇ４５１０マウスから採取した。
【0033】
【表1】
【0034】
以下の試薬は、サンプルの調製中に新たに調製される。調製の詳細はサンプル調製で説明される：
消化混合物１ 水中２５０ｍＭのＡＢＣ中１００μｇ／ｍＬのトリプシン
トリプシン停止溶液 水中１．００ｍｇ／ｍＬのトリプシン阻害剤
塩化マンガン（ＩＩ）溶液 水中３．１２５ｍＭのＭｎＣｌ２
ラムダタンパク質ホスファターゼ（λＰＰ）溶液 水中３６３６４単位／ｍＬのλＰＰ
消化混合物２ 水中２５０ｍＭのＡＢＣ中３００μｇ／ｍＬのトリプシン。
消化混合物１ 水中２５０ｍＭのＡＢＣ中１００μｇ／ｍＬのトリプシン
トリプシン停止溶液 水中１．００ｍｇ／ｍＬのトリプシン阻害剤
塩化マンガン（ＩＩ）溶液 水中３．１２５ｍＭのＭｎＣｌ２
ラムダタンパク質ホスファターゼ（λＰＰ）溶液 水中３６３６４単位／ｍＬのλＰＰ
消化混合物２ 水中２５０ｍＭのＡＢＣ中３００μｇ／ｍＬのトリプシン。
【0035】
原液
原液１５Ｎ－Ｔａｕタンパク質（１．００ｍｇ／ｍＬ）（＝２１．６μＭ、ＭＷ＝４６３５３．２ｇ／ｍｏｌ）
１００μｇ相当を１００μＬのＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ２０中に溶解する。
原液１５Ｎ－Ｔａｕタンパク質（１．００ｍｇ／ｍＬ）（＝２１．６μＭ、ＭＷ＝４６３５３．２ｇ／ｍｏｌ）
１００μｇ相当を１００μＬのＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ２０中に溶解する。
【0036】
原液ｐＳ３９６Ｔａｕタンパク質（約１．２０ｍｇ／ｍＬ）（＝２６．１μＭ、ＭＷ＝４５９０２．２ｇ／ｍｏｌ）
この溶液は、方法の適合性を実証し、確実に測定可能なＳ３９６－リン酸化の最低の割合を決定するために使用される。
この溶液は、方法の適合性を実証し、確実に測定可能なＳ３９６－リン酸化の最低の割合を決定するために使用される。
【0037】
実施例２：サンプル調製のための手順－ワークフロー１
第１のトリプシン消化
凍結したＣＳＦサンプルを室温で解凍し、ゆっくり反転させて（少なくとも５回）３０秒間ボルテックスすることによって均質化した。サンプルを約５００ｘｇ及び２０℃で１分間遠心分離し、２００μＬのサンプルを１ｍＬのプレートにピペットで移す。１０．０μＬのＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ２０を（ダブル）ブランクに添加し、１０．０μＬの内部標準ワーキング溶液（２．７ｎＭの１５Ｎ－Ｔａｕタンパク質）を他の全てのウェルに添加する。
第１のトリプシン消化
凍結したＣＳＦサンプルを室温で解凍し、ゆっくり反転させて（少なくとも５回）３０秒間ボルテックスすることによって均質化した。サンプルを約５００ｘｇ及び２０℃で１分間遠心分離し、２００μＬのサンプルを１ｍＬのプレートにピペットで移す。１０．０μＬのＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ２０を（ダブル）ブランクに添加し、１０．０μＬの内部標準ワーキング溶液（２．７ｎＭの１５Ｎ－Ｔａｕタンパク質）を他の全てのウェルに添加する。
【0038】
材料及び試薬で説明されるように、消化混合物１を新たに調製する（１００μｇ／ｍＬのトリプシン）。１ｍＭのＨＣｌ溶液中５ｍｇ／ｍＬのトリプシン１００μＬをチューブ内で４９００μＬの消化溶媒（水中２５０ｍＭのＡＢＣ）と混合する。新たに調製した消化混合物４０．０μＬを各ウェルに添加し、プレートを１２００ｒｐｍ（サーモミキサー）及び３７℃で６０分間ボルテックスする。
【0039】
消化停止溶液を新たに調製する（１．００ｍｇ／ｍＬ）。約１．５ｍｇの量のトリプシン阻害剤を秤量し、１．００ｍｇ／ｍＬの濃度を達成するために必要な量のＭｉｌｌｉ－Ｑに溶解させる。
【0040】
新たに調製された消化停止溶液１２．０μＬを各ウェルに添加し、プレートを１２００ｒｐｍ（サーモミキサー又はミックスメイト）及び３７℃で２分間ボルテックスする。
【0041】
６０．０μＬの消化溶媒（水中２５０ｍＭのＡＢＣ）及び３００μＬのＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ２０を各ウェルに添加し、ボルテックス混合する。
【0042】
固相抽出
固相抽出ステップは、脱リン酸化ステップの前にトリプシンの残留物を除去し（リン酸化が除去されたときにＳ３９６における切断を回避するため）、サンプルを濃縮するために適用される。
固相抽出ステップは、脱リン酸化ステップの前にトリプシンの残留物を除去し（リン酸化が除去されたときにＳ３９６における切断を回避するため）、サンプルを濃縮するために適用される。
【0043】
ＳＰＥカラム（Ｓｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）ｔＣ１８ １００ｍｇ）を５００μＬのメタノールでコンディショニングした後、１０００μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水でコンディショニングした。完全なサンプルをＳＰＥカラムにロードする。１０００μＬのＳＰＥ洗浄液（１００ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．５）でＳＰＥカラムを２回洗浄する。
【0044】
ＳＰＥプレートを（清浄な）５００μＬプレート上に置き、５００μＬプレート上のＳＰＥプレートを４００＊ｇで１分間遠心分離して、残存するＳＰＥ洗浄液（廃棄物）を全て収集する。４５０μＬのメタノールでサンプルを新しい清浄な５００μＬのＬｏＢｉｎｄプレートディープウェルプレート内に溶出させる。
【0045】
穏やかな窒素流の下、６５℃で約４５分間溶媒を蒸発乾固させ、２０．０μＬの脱リン酸化溶媒（１００ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．５）でサンプルを再構成する。このｐＨでは、トリプシンの酵素活性は最小限にされるが、ラムダタンパク質ホスファターゼ（λＰＰ）の活性は維持される。
【0046】
脱リン酸化ステップ
１０００μＬの１０ｍＭのＭｎＣｌ２をチューブ内で２２００μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑと混合することにより、ＭｎＣｌ２の３．１２５ｍＭ溶液を調製する。２０．０μＬの（新たに）調製された３．１２５ｍＭのＭｎＣｌ２溶液をサンプルに添加する。５０．０μＬのλＰＰ溶液（２００００単位を含有する）を元のカップ内で５００μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑと混合することにより、λＰＰ溶液を新たに調製する。１０．０μＬの（新たに）調製されたλＰＰ溶液をサンプルに添加し、プレートを１２００ｒｐｍ（サーモミキサー）及び３７℃で１２０分間ボルテックスする。５０．０μＬの脱リン酸化溶媒（１００ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．５）をプレートに添加し、プレートを１２００ｒｐｍ（サーモミキサー）及び３７℃で１分間ボルテックスする。
１０００μＬの１０ｍＭのＭｎＣｌ２をチューブ内で２２００μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑと混合することにより、ＭｎＣｌ２の３．１２５ｍＭ溶液を調製する。２０．０μＬの（新たに）調製された３．１２５ｍＭのＭｎＣｌ２溶液をサンプルに添加する。５０．０μＬのλＰＰ溶液（２００００単位を含有する）を元のカップ内で５００μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑと混合することにより、λＰＰ溶液を新たに調製する。１０．０μＬの（新たに）調製されたλＰＰ溶液をサンプルに添加し、プレートを１２００ｒｐｍ（サーモミキサー）及び３７℃で１２０分間ボルテックスする。５０．０μＬの脱リン酸化溶媒（１００ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．５）をプレートに添加し、プレートを１２００ｒｐｍ（サーモミキサー）及び３７℃で１分間ボルテックスする。
【0047】
ワークフロー１を終了させ、ワークフロー２に備える
５０．０μＬのサンプルを新しい５００μＬのタンパク質プレートに移す。このサンプルはワークフロー２で使用され、第２のトリプシン消化を受ける（ワークフロー２プレート）。
５０．０μＬのサンプルを新しい５００μＬのタンパク質プレートに移す。このサンプルはワークフロー２で使用され、第２のトリプシン消化を受ける（ワークフロー２プレート）。
【0048】
元のプレートに、５０．０μＬの水中１％のギ酸を添加し、プレートを１２００ｒｐｍ及び室温で１分間ボルテックスする。このプレートは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の準備ができている。
【0049】
第２のトリプシン消化
１ｍＭのＨＣｌ溶液中５ｍｇ／ｍＬのトリプシン３００μＬを２５０ｍＭのＡＢＣ溶液４７００μＬとチューブ内で混合することにより、消化混合物２を新たに調製する（３００μｇ／ｍＬのトリプシン）。３０．０μＬの新たに調製された消化混合物２をワークフロー２プレートの各ウェルに添加し、１２００ｒｐｍ（サーモミキサー）及び３７℃で６０分間ボルテックスする。
１ｍＭのＨＣｌ溶液中５ｍｇ／ｍＬのトリプシン３００μＬを２５０ｍＭのＡＢＣ溶液４７００μＬとチューブ内で混合することにより、消化混合物２を新たに調製する（３００μｇ／ｍＬのトリプシン）。３０．０μＬの新たに調製された消化混合物２をワークフロー２プレートの各ウェルに添加し、１２００ｒｐｍ（サーモミキサー）及び３７℃で６０分間ボルテックスする。
【0050】
２０．０μＬの水中１％のギ酸をワークフロー２プレートに添加することによって消化を停止させ、プレートを１２００ｒｐｍ及び３７℃で１分間ボルテックスする。このプレートは、この時点でＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の準備ができている。
【0051】
実施例３：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
内因性妨害化合物からの分離は、３０℃に設定されたＡｃｑｕｉｔｙ ＨＳＳ Ｔ３（１００ｘ２．１ｍｍ、１．８μｍ）分析カラムと、移動相Ａとして水中０．１％のギ酸及び０．５％のＤＭＳＯ、及び移動相Ｂとしてメタノールとを用いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって達成される。流速０．５００ｍＬ／分で１１分のグラジエントが適用され、最初の１分間は５％の移動相Ｂで実行し、９分後に１４％のＢになるまで直線的に増大され、続いて９０％のＢまでステップされ、これを１分間維持した後、再び５％のＢまで減少される。注入量は４０μＬである。
内因性妨害化合物からの分離は、３０℃に設定されたＡｃｑｕｉｔｙ ＨＳＳ Ｔ３（１００ｘ２．１ｍｍ、１．８μｍ）分析カラムと、移動相Ａとして水中０．１％のギ酸及び０．５％のＤＭＳＯ、及び移動相Ｂとしてメタノールとを用いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって達成される。流速０．５００ｍＬ／分で１１分のグラジエントが適用され、最初の１分間は５％の移動相Ｂで実行し、９分後に１４％のＢになるまで直線的に増大され、続いて９０％のＢまでステップされ、これを１分間維持した後、再び５％のＢまで減少される。注入量は４０μＬである。
【0052】
ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ［３９６～４０６］の予想される保持時間は７．２分であり、ＩＧＳＴＥＮＬＫ［２６０～２６７］では６．５分である。
【0053】
ターボイオンスプレー源を備えたＳＣＩＥＸ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄ ６５００質量分析計を、陽イオンモードでの検出に使用する。ターボイオンスプレー源は、イオンスプレー電圧５５００Ｖ及び温度５００℃において陽イオンモードで操作される。カーテンガスは３０に設定される。
【0054】
定量化は、以下の表に明記されるトランジションを用いた多重反応モニタリング（ＭＲＭ）に基づく。ＣＳＦ中の総Ｔａｕタンパク質２～１００ｐＭの範囲で、１／ｘ２重み付け因子を有する線形（アナリスト）較正曲線が使用される。
【0055】
【表2】
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図4-6】
【図4-7】
【図4-8】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】