特表 2024-530409 アルファ－シートポリペプチドおよびそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-21

(54)【発明の名称】アルファ－シートポリペプチドおよびそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240814BHJP

   C07K 17/00 20060101ALI20240814BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240814BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240814BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240814BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240814BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240814BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240814BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240814BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240814BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240814BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240814BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20240814BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240814BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K17/00

A61P25/28

A61P3/00

A61P3/10

A61P21/00

A61P43/00 111

A61P35/00

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P25/00

A61P25/16

A61K38/10

A61K38/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024502445

(86)(22)【出願日】2022-05-20

(85)【翻訳文提出日】2024-02-14

(86)【国際出願番号】 US2022030328

(87)【国際公開番号】W WO2023003623

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】63/224,815

(32)【優先日】2021-07-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．テフロン

(71)【出願人】

【識別番号】514104933

【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ ワシントン

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ダジェット，ヴァレリー

(72)【発明者】

【氏名】シア，ディラン

(72)【発明者】

【氏名】ブリーム，アリッサ

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA18

4C084BA41

4C084CA59

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZA151

4C084ZA152

4C084ZA161

4C084ZA162

4C084ZA221

4C084ZA222

4C084ZA941

4C084ZA942

4C084ZA961

4C084ZA962

4C084ZB151

4C084ZB152

4C084ZC211

4C084ZC212

4C084ZC351

4C084ZC352

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045AA40

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA60

4H045EA21

4H045EA34

4H045EA50

(57)【要約】

本明細書では、共有結合により連結された２つ以上の単量体－シートポリペプチドを含む、－シートポリペプチド多量体が開示される。様々な実施形態では、多量体は二量体、三量体、四量体、五量体、または六量体を含み、または、多量体は二量体を含む。－シートを含む組成物および医療装置、ならびにアミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を治療および診断するためのそれらの使用もまた、開示する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

共有結合により連結された２つ以上の単量体α－シートポリペプチドを含む、α－シートポリペプチド多量体。

【請求項2】

二量体、三量体、四量体、五量体、または六量体を含み、または前記多量体は二量体を含む、請求項１に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項3】

前記２つ以上の単量体α－シートポリペプチドは１以上（１、２、３、またはそれ以上）の下記により、共有結合により連結される、請求項１または２に記載のα－シートポリペプチド多量体：
（ａ）ジスルフィド結合；
（ｂ）２つの単量体中に存在するシステイン残基間の他の共有結合；
（ｃ）２つの単量体間のチオエーテル架橋；
（ｄ）２つの単量体中に存在するチロシン残基間の共有結合；
（ｅ）２つの単量体間の１，２，３－トリアゾール架橋；
（ｆ）２つの単量体間のアミド結合；
（ｇ）２つの単量体中に存在するヒスチジン残基間の共有結合；
（ｈ）複数の単量体α－シートポリペプチドを共有結合により連結するコア構造、例えば、限定はされないが、ポリ－リジン、ポリ－オルニチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、他のポリマー、およびナノ粒子コア構造へのコンジュゲーション；
（ｉ）２つの単量体中に存在するノルブロレン部分間の共有結合；
（ｊ）１つの単量体中に存在するマレイミドモチーフと別の単量体のシステイン残基上の硫黄原子の間の共有結合；および／または
（ｋ）連結部分、例えば、限定はされないが、ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）；１，１’－（２，２’－オキシビス（エタン－２，１－ジオイル））ビス（１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）（ＭａｌＰＥＧ１）；ならびに

【化1】

による、２つの単量体の共有結合。

【請求項4】

２つの単量体α－シートポリペプチドはジスルフィド結合により、共有結合により連結される、請求項２または３に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項5】

各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、少なくとも１つのシステイン残基を含む、請求項１－４のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項6】

各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、単一システイン残基を含み、任意で前記多量体は二量体である、請求項１－４のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項7】

（ａ）前記多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）の、ＬまたはＤ型のシステイン残基を含み；任意で、前記多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、ＬまたはＤ型の単一システイン残基を含み；
（ｂ）前記多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）の、ＬまたはＤ型のヒスチジン残基を含み；任意で、前記多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、ＬまたはＤ型の単一ヒスチジン残基を含み；
（ｃ）前記多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）の、ＬまたはＤ型のチロシン残基を含み；任意で、前記多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、ＬまたはＤ型の単一チロシン残基を含み；
（ｄ）前記多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）のノルボルネン部分を含み；任意で、前記多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、単一ノルボルネン部分を含み；
（ｅ）前記多量体中の１以上の単量体α－シートポリペプチドは、少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）のマレイミドモチーフを含み；任意で、前記多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、単一マレイミドモチーフを含み；および／または
（ｆ）二量体中の１つの単量体α－シートポリペプチド（Ｂ単量体）は少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）の、ＬまたはＤ型のシステイン残基を含み、他の単量体α－シートポリペプチド（Ａ単量体）はシステイン残基を含まず；任意で、前記二量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、前記Ａ単量体は単一の、ＬまたはＤ型のシステイン残基を含む、
請求項１－６のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項8】

前記２つ以上の単量体α－シートポリペプチドは、コア構造、例えば、限定はされないが、ポリ－リジン、ポリ－オルニチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、他のポリマー、およびナノ粒子コア構造へのコンジュゲーションにより、共有結合により連結される、請求項１－７のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項9】

前記２つ以上の単量体α－シートポリペプチドはコア構造へのコンジュゲーションにより、共有結合により連結され、前記コア構造は、ポリ－リジンおよびポリ－オルニチンからなる群より選択され、任意で、前記多量体は少なくとも三量体、四量体、五量体、または六量体である、請求項１－８のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項10】

各単量体α－シートポリペプチドは、一般式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５による１２－２３の連続するアミノ酸を含み、
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－７の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ５－１２の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－７の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ４－１２の連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－４の連続するアミノ酸残基である、請求項１－９のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項11】

各単量体α－シートポリペプチドにおける、前記少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）のシステイン、ヒスチジン、チロシン、ノルボルネン部分、マレイミド部分、または連結を促進する他の部分（例えば、限定はされないが、本明細書で開示されるもの）（集合的に「連結部分」と呼ばれる）は、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、またはＸ４に存在し、またはドメインＸ２、Ｘ３、またはＸ４に存在する、請求項１０に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項12】

各単量体α－シートポリペプチドについて、Ｘ１は独立して、Ｌ残基とＤ残基が交互に並ばない、０－２；２；または０の連続するアミノ酸残基である、請求項１０－１１のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項13】

１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて、全てのＸ１アミノ酸残基はＬアミノ酸である、請求項１０－１２のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項14】

各単量体α－シートポリペプチドについて、Ｘ２は独立して、Ｄアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ、６－１０、７－１０、７－９、７、８、９、または１０の連続するアミノ酸残基である、請求項１０－１３のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項15】

各単量体α－シートポリペプチドについて、Ｘ３は独立して、Ｌ残基とＤ残基が交互に並ばない、１－５、２－５、３－５、３、４、または５の連続するアミノ酸残基である、請求項１０－１４のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項16】

１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて、全てのＸ３アミノ酸はＬアミノ酸またはグリシンである、請求項１０－１５のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項17】

１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて、全てのＸ３アミノ酸はＤアミノ酸またはグリシンである、請求項１０－１５のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項18】

各単量体α－シートポリペプチドについて、Ｘ４は独立して、Ｄアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ、６－１２、７－１１、７、８、９、１０、または１１の連続するアミノ酸残基である、請求項１０－１７のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項19】

各単量体α－シートポリペプチドについて、Ｘ５は独立して、Ｌ残基とＤ残基が交互に並ばない、０－３、０－２、０、または２の連続するアミノ酸残基である、請求項１０－１８のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項20】

各単量体α－シートポリペプチドについて、全てのＸ５アミノ酸はＬアミノ酸またはグリシンである、請求項１０－１９のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項21】

前記多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて：
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－２の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７－１０または７－８の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない３－５または４－５の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７－１１の連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－２の連続するアミノ酸残基である、請求項１０－２０のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項22】

前記多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて：
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない２つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない５つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７つの連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない２つの連続するアミノ酸残基である、請求項１０－２０のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項23】

前記多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて：
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない２つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ８つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない４つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７つの連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない２つの連続するアミノ酸残基である、請求項１０－２０のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項24】

前記多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて：
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ９つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない３つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ１１の連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０の連続するアミノ酸残基である、請求項１０－２０のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項25】

前記多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて：
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ１０の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない４つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７つの連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない２つの連続するアミノ酸残基である、請求項１０－２０のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項26】

Ｘ１およびＸ５は、前記多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドにおいて同じ長さである、請求項１－２５のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項27】

Ｘ２およびＸ４は、前記多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドにおいて同じ長さである、請求項１－２６のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項28】

各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１４－２３、１７－２３、２１－２３、または２３アミノ酸の長さである、請求項１－２７のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項29】

各単量体α－シートポリペプチドは、配列番号１－３０またはその逆キラル対応物から選択されるアミノ酸配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、

【表1】

【請求項30】

各単量体α－シートポリペプチドは、配列番号８の選択されたアミノ酸配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み：

【表2】

【請求項31】

各単量体α－シートポリペプチドは同一である、請求項１－３０のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項32】

前記多量体は、互いに異なる単量体α－シートポリペプチド単位を含む、請求項１－３０のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項33】

単量体α－シートポリペプチドの１つまたは両方は追加の機能ドメインを含む、請求項１－３２のいずれか一項に記載のα－シートポリペプチド多量体。

【請求項34】

配列番号１－３０またはその逆キラル対応物から選択されるアミノ酸配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、

【表3】

【請求項35】

下記を含む、請求項３４に記載のα－シートポリペプチド：
（ａ）少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）の、ＬまたはＤ型のシステイン残基；任意で前記α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、ＬまたはＤ型の単一システイン残基を含む；
（ｂ）少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）の、ＬまたはＤ型のヒスチジン残基；任意で、前記α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、ＬまたはＤ型の単一ヒスチジン残基を含む；
（ｃ）少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）の、ＬまたはＤ型のチロシン残基；任意で、前記α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、ＬまたはＤ型の単一チロシン残基を含む；および／または
（ｄ）少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）のノルボルネン部分；任意で、前記α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、単一ノルボルネン部分を含む；および／または
（ｅ）少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）のマレイミドモチーフ；任意で、前記α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、単一マレイミドモチーフを含む。

【請求項36】

配列番号８またはその逆キラル対応物のアミノ酸配列に、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、

【表4】

【請求項37】

（ａ）いずれかの前記請求項に記載のα－シートポリペプチドまたは多量体；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
を下記を含む、医薬組成物。

【請求項38】

（ａ）表面上のポリマーコーティング；ならびに
（ｂ）前記ポリマーコーティングに共有結合により連結されたα－シートポリペプチド
を含む、組成物。

【請求項39】

前記ポリマーはカテコールアミンポリマーを含み；任意で、前記ポリマーは、ポリドーパミン、ポリ－Ｌ－ＤＯＰＡ、ポリエピネフリン、ポリノルアドレナリン、および、ジ－ヒドロキシルフェノールおよび一級アミンで終わる任意の長さの分枝鎖を含む任意の合成生成物、およびそれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

前記ポリマーはポリドーパミン（ＰＤＡ）を含む、請求項３８または３９に記載の組成物。

【請求項41】

前記ポリマーコーティングは約２５ｎｍ～約２５０ｎｍの厚さ、または約５０ｎｍ～約２００ｎｍの厚さ、または約６０ｎｍ～約１５０ｎｍの厚さ、または約６０ｎｍ～約１００ｎｍの厚さ、または約７０ｎｍ～約９０ｎｍの厚さ、または約７５ｎｍ～８５ｎｍの厚さ、または約８０ｎｍの厚さである、請求項３８－４０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項42】

前記表面としては、アッセイプレート（例えば、限定はされないが、マイクロウェルプレート）、ガラス、セラミック、マイクロ流体チャネルおよびデバイス、メンブラン、プラスチック、多糖、チタン、シリコーン、ナイロン、ニトロセルロース、テフロンビーズ、ガーゼ、外科用糸、包帯、および医療装置が挙げられるが、それらに限定されない、請求項３８－４１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項43】

前記α－シートポリペプチドは、米国特許９８９６４８７号で開示される１つ以上のα－シートポリペプチドを含み、または、一般式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５による１２－２３の連続するアミノ酸を含み、
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－７の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ５－９の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－５の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ４－１２の連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－４の連続するアミノ酸残基である、請求項３８－４２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項44】

前記α－シートポリペプチドは、いずれかの前記請求項に記載のα－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドを含む、請求項３８－４３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項45】

アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を有する被験体に、有効な量の、いずれかの前記請求項に記載のα－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドを投与し、疾患を治療するまたはその発症を制限することを含む、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を治療するまたはその発症を制限するための方法。

【請求項46】

前記アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症、軽鎖アミロイドーシス、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、アルツハイマー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、２型糖尿病、トランスサイレチンにより引き起こされたアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、パーキンソン病、レビー小体病、外傷性脳損傷、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、大動脈中膜アミロイド、プロラクチノーマ、透析関連アミロイドーシス、脳アミロイド血管症、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、多発性骨髄腫、およびアミロイド－バイオフィルム細菌感染と関連する疾患からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症、軽鎖アミロイドーシス、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、アルツハイマー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、２型糖尿病、トランスサイレチンにより引き起こされたアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、パーキンソン病、レビー小体病、外傷性脳損傷、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、大動脈中膜アミロイド、プロラクチノーマ、透析関連アミロイドーシス、脳アミロイド血管症、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、多発性骨髄腫、およびアミロイド－バイオフィルム細菌感染と関連する疾患からなる群より選択される障害を治療するまたはその発症を制限するための方法であって、前記方法はその必要のある被験体に有効な量の、いずれかの前記請求項に記載のα－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドを投与し、障害を治療するまたはその発症を制限することを含む、方法。

【請求項48】

（ａ）アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を有するリスクのある被験体由来の組織試料を、いずれかの前記請求項に記載のα－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドと、前記α－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドのアミロイド中間体（前記組織試料中に存在する場合）との結合に好適な条件下で、接触させ、結合複合体を生成させること、
（ｂ）前記組織試料中の結合複合体を検出すること；ならびに
（ｃ）前記検出に基づきアミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断または予測すること
を含む、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断する、予測する、またはモニタするための方法。

【請求項49】

前記組織試料は血液試料、血清試料、鼻汁、尿または脳脊髄液試料である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症、軽鎖アミロイドーシス、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、アルツハイマー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、２型糖尿病、トランスサイレチンにより引き起こされたアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、パーキンソン病、レビー小体病、外傷性脳損傷、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、大動脈中膜アミロイド、プロラクチノーマ、透析関連アミロイドーシス、脳アミロイド血管症、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、多発性骨髄腫、およびアミロイド－バイオフィルム細菌感染と関連する疾患からなる群より選択される、請求項４８または４９に記載の方法。

【請求項51】

（ａ）アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を有するリスクのある被験体由来の組織試料を、請求項３９－４４のいずれか一項に記載の組成物と、前記α－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドのアミロイド中間体（前記組織試料中に存在する場合）との結合に好適な条件下で、接触させ、結合複合体を生成させること、
（ｂ）前記組織試料中の結合複合体を検出すること；ならびに
（ｃ）前記検出に基づきアミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断または予測すること
を含む、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断または予測するための方法。

【請求項52】

前記組織試料は血液試料、血清試料、鼻汁、尿または脳脊髄液試料である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症、軽鎖アミロイドーシス、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、アルツハイマー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、２型糖尿病、トランスサイレチンにより引き起こされたアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、パーキンソン病、レビー小体病、外傷性脳損傷、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、大動脈中膜アミロイド、プロラクチノーマ、透析関連アミロイドーシス、脳アミロイド血管症、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、多発性骨髄腫、およびアミロイド－バイオフィルム細菌感染と関連する疾患からなる群より選択される、請求項５１または５２に記載の方法。

【請求項54】

前記医療装置の表面にコートされた、いずれかの前記請求項に記載のα－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドを含む、医療装置。

【請求項55】

前記医療装置は、前記装置の表面上の、ポリマーコーティング、例えば、限定はされないが、ポリドーパミン（ＰＤＡ）コーティングを含み、前記α－シートポリペプチド多量体またはα－シートポリペプチドは前記ポリマーコーティングに共有結合により連結される、請求項５４に記載の医療装置。

【請求項56】

前記医療装置は、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、髄液シャント、尿路カテーテル、血管内カテーテル、義眼、人工関節、整形外科用インプラント、チタン含有インプラント、ポリスチレン含有インプラント、外科用メッシュインプラント、乳房インプラント、歯科インプラント、および子宮内避妊具からなる群より選択される、請求項５４または５５に記載の医療装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は２０２１年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／２２４，８１５号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。

【0002】

連邦政府からの資金提供に関する声明
この発明は国立衛生研究所により授与された助成金番号Ｒ０１ ＧＭ０９５８０８号およびＲ０１ ＡＧ０６７４７６号、および、米国陸軍医学研究獲得活動により授与された助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ－１９－１－００５０号の下、政府支援を受けてなされた。政府は発明において一定の権利を有する。

【0003】

配列表声明
配列表のコンピュータ可読形態は電子申請により本出願と共に提出され、その全体が参照により本出願に組み込まれる。配列表は、２０２２年５月９日に作製された、「２１－０６４６－ＷＯ－ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイル名を有するファイル内に含まれ、２０ｋｂのサイズである。

【背景技術】

【0004】

アミロイド疾患は、世界中で１０億人を超える人々に影響を与える。最もよく知られているものの１つはアルツハイマー病（ＡＤ）、記憶と認知機能の悪化の進行により臨床的に特徴付けられる致命的神経変性障害である。ＡＤは米国では死亡原因の第６位であり、世界中では認知症の主因であり、５０００万を超える人々に影響を与えている。ＡＤの主な病理学的指標は細胞外アミロイド－β（Ａβ）プラークおよびタウタンパク質のニューロン内神経原線維タングルである。プラーク沈着およびタングル形成のカスケードは下記パターンに従う：嗅内／嗅周皮質から始まり、辺縁系構造および海馬を介して広がり、最終的には前頭、側頭、および頭頂皮質に到達する^４。プロセスは、α－、β－、およびγ－セクレターゼ酵素によりアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から切り取られるＡβペプチドのミスフォールディングから始まる。その単量体形態では、Ａβは様々な生物学的機能と関連するが、それは、凝集能を持つ状態にミスフォールドされる可能性があり、低～高分子量オリゴマーの不均一分布につながり、これは、最終的には、特徴的なアミロイドプラークを形成する。重要なことには、疾患進行は、アミロイドプラーク負荷ともタウタングル形成とも相関しないが、むしろ、主毒物として作用する低分子量（ＬＭＷ）可溶性オリゴマーの存在と相関する。実のところ、原線維がない場合、これらのＬＭＷ可溶性オリゴマーは、ＡＤのマウスモデルおよびプラークを生成しないＡＤの家族性症例において証明されるように毒性および神経細胞死を誘導する。

【発明の概要】

【0005】

第１の態様では、本開示は、共有結合により連結された２つ以上の単量体α－シートポリペプチドを含むα－シートポリペプチド多量体を提供する。様々な実施形態では、多量体は二量体、三量体、四量体、五量体、または六量体を含み、または、多量体は二量体を含む。様々な他の実施形態では、２つ以上の単量体α－シートポリペプチドは１以上（１、２、３、またはそれ以上）の下記により、共有結合により連結される：
（ａ）ジスルフィド結合；
（ｂ）２つの単量体中に存在するシステイン残基間の他の共有結合；
（ｃ）２つの単量体間のチオエーテル架橋；
（ｄ）２つの単量体中に存在するチロシン残基間の共有結合；
（ｅ）２つの単量体間の１，２，３－トリアゾール架橋；
（ｆ）２つの単量体間のアミド結合；
（ｇ）２つの単量体中に存在するヒスチジン残基間の共有結合；
（ｈ）複数の単量体α－シートポリペプチドを共有結合により連結するコア構造、例えば、限定はされないが、ポリ－リジン、ポリ－オルニチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、他のポリマー、およびナノ粒子コア構造へのコンジュゲーション；
（ｉ）２つの単量体中に存在するノルブロレン（ｎｏｒｂｒｏｒｅｎｅ）部分間の共有結合；
（ｊ）１つの単量体中に存在するマレイミドモチーフと別の単量体のシステイン残基上の硫黄原子の間の共有結合；および／または
（ｋ）連結部分、例えば、限定はされないが、ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）；１，１’－（２，２’－オキシビス（エタン－２，１－ジオイル））ビス（１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）（ＭａｌＰＥＧ１）；および下記による２つの単量体の共有結合。

【化1】

【0006】

他の実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、少なくとも１つのシステイン残基を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、２つ以上の単量体α－シートポリペプチドは、コア構造、例えば、限定はされないが、ポリ－リジン、ポリ－オルニチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、他のポリマー、およびナノ粒子コア構造へのコンジュゲーションにより、共有結合により連結される。

【0008】

様々な実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドは、表１に示される、配列番号：１－３０またはその逆キラル対応物から選択されるアミノ酸配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、ここで：
（ａ）各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１つのシステイン残基を含み；ならびに
（ｂ）小文字の残基はＤアミノ酸であり、大文字の残基はＬアミノ酸であり、Ｇ残基はアキラルである。

【0009】

いくつかの実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドは同一であり；他の実施形態では、多量体は互いに異なる単量体α－シートポリペプチドを含む。様々なさらなる実施形態では、１つ以上の単量体α－シートポリペプチドは追加の機能ドメインを含む。

【0010】

別の態様では、本開示は、表１に示される、配列番号：１－３０またはその逆キラル対応物から選択されるアミノ酸配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むα－シートポリペプチドを提供し、小文字の残基はＤアミノ酸であり、大文字の残基はＬアミノ酸であり、Ｇ残基はアキラルである。

【0011】

本開示はまた、下記を含む医薬組成物を提供する：
（ａ）本明細書におけるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせのα－シートポリペプチドまたは多量体；ならびに
（ｂ）薬学的に許容される担体。

【0012】

本開示は、下記を含む組成物をさらに提供する：
（ａ）表面上のポリマーコーティング；および
（ｂ）ポリマーコーティングに共有結合により連結されたα－シートポリペプチド。

【0013】

１つの実施形態では、ポリマーはカテコールアミンポリマーを含み；任意で、ポリマーは、ポリドーパミン、ポリ－Ｌ－ＤＯＰＡ、ポリエピネフリン、ポリノルアドレナリン、および、ジ－ヒドロキシルフェノールおよび一級アミンで終わる任意の長さの分枝鎖を含む任意の合成生成物、およびそれらの組み合わせを含む。様々な実施形態では、ポリマーコーティングは約２５ｎｍ～約２５０ｎｍの厚さ、または約５０ｎｍ～約２００ｎｍの厚さ、または約６０ｎｍ～約１５０ｎｍの厚さ、または約６０ｎｍ～約１００ｎｍの厚さ、または約７０ｎｍ～約９０ｎｍの厚さ、または約７５ｎｍ～８５ｎｍの厚さ、または約８０ｎｍの厚さであってもよい。他の実施形態では、表面としては、アッセイプレート（例えば、限定はされないが、マイクロウェルプレート）、ガラス、セラミック、マイクロ流体チャネルおよびデバイス、メンブラン、プラスチック、多糖、チタン、シリコーン、ナイロン、ニトロセルロース、テフロンビーズ、ガーゼ、外科用糸、包帯、および医療装置が挙げられるが、それらに限定されない。様々なさらなる実施形態では、α－シートポリペプチドは、本明細書で開示されるいずれかの実施形態の多量体またはポリペプチド、米国特許９８９６４８７号において開示される１つ以上のα－シートポリペプチドを含んでもよく、または、一般式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５による１２－２３の連続するアミノ酸を含み、ここで
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－７の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ５－９の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－５の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ４－１２の連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－４の連続するアミノ酸残基である。

【0014】

別の態様では、本開示は、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を有する被験体に有効な量の本明細書で開示されるいずれかの実施形態のα－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドを投与し、疾患を治療するまたはその発症を制限することを含む、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を治療するまたはその発症を制限するための方法を提供する。

【0015】

さらなる態様では、本開示は、下記からなる群より選択される障害を治療するまたはその発症を制限するための方法を提供し：クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症、軽鎖アミロイドーシス、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、アルツハイマー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、２型糖尿病、トランスサイレチンにより引き起こされたアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、パーキンソン病、レビー小体病、外傷性脳損傷、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、大動脈中膜アミロイド、プロラクチノーマ、透析関連アミロイドーシス、脳アミロイド血管症、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、多発性骨髄腫、およびアミロイド－バイオフィルム細菌感染と関連する疾患、方法はその必要のある被験体に、有効な量の本明細書で開示されるいずれかの実施形態のα－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドを投与し、障害を治療するまたはその発症を制限することを含む。

【0016】

１つの態様では、本開示は、下記を含む、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断する、予測する、またはモニタするための方法を提供する：
（ａ）アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を有するリスクのある被験体由来の組織試料を、本明細書で開示されるいずれかの実施形態のα－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドと、α－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドのアミロイド中間体（組織試料中に存在する場合）との結合に好適な条件下で、接触させ、結合複合体を生成させること；
（ｂ）組織試料中の結合複合体を検出すること；ならびに
（ｃ）検出に基づきアミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断または予測すること。

【0017】

別の態様では、本開示は、下記を含む、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断または予測するための方法を提供する：
（ａ）アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を有するリスクのある被験体由来の組織試料を、本明細書で開示されるいずれかの実施形態の組成物と、α－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドのアミロイド中間体（組織試料中に存在する場合）との結合に好適な条件下で、接触させ、結合複合体を生成させること；
（ｂ）組織試料中の結合複合体を検出すること；ならびに
（ｃ）検出に基づきアミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断または予測すること。

【0018】

１つの態様では、本開示は、医療装置の表面にコートされた、本明細書で開示されるいずれかの実施形態のα－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドを含む医療装置を提供する。いくつかの実施形態では、医療装置は、装置の表面上の、ポリマーコーティング、例えば、限定はされないが、ポリドーパミン（ＰＤＡ）コーティングを含み、α－シートポリペプチド多量体またはα－シートポリペプチドはポリマーコーティングに共有結合により連結される。他の実施形態では、医療装置は、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、髄液シャント、尿路カテーテル、血管内カテーテル、義眼、人工関節、整形外科用インプラント、チタン含有インプラント、ポリスチレン含有インプラント、外科用メッシュインプラント、乳房インプラント、歯科インプラント、および子宮内避妊具からなる群より選択され得る。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1(a-c)】線維形成の阻害に関しての、単量体に対する二量体の改善された阻害を示す。（ａ）二量体による％阻害。（ｂ）パネル（ａ）と同じであるが、破線が、個々の設計をつないでいる。（ｃ）性能比、％阻害二量体／％阻害単量体（同じ設計）で反映される二量体対単量体の相対性能。阻害剤の比が降下するにつれ、単量体効力は降下し、二量体は４０－８５Ｘ倍で単量体を上回り、ホモ二量体については予測される２Ｘを著しく上回る。

【図2】生きた大腸菌におけるバイオフィルムアミロイド形成の阻害を試験するためのプロトコルを示す。アミロイド形成を上記ＡｂｅｔａおよびＩＡＰＰと共に使用されるもののようなＴｈＴアッセイにより評価する。加えて、アミロイドの阻害はバイオフィルムを破壊し、プランクトン様浮遊性細菌細胞の増加につながり、そうして、それらは抗生物質感受性である。

【図3】ＴＥＭ画像は、（ａ）ペプチドを含まないバイオフィルムおよび（ｃ）Ｐ１の存在下で増殖したバイオフィルムにおける広範なカーリー（ｃｕｒｌｉ）アミロイド線維形成を明らかにするが、（ｂ）ＡＰ１９５二量体の存在下で増殖したものではそうではない（スケールバー＝２μｍ）。Ｐ１およびＡＰ１９５を等モル濃度で添加した。ＡＰ１９５はα－シートペプチドであり、Ｐ１はランダムコイル対照である。

【図4】生きた大腸菌臨床分離株におけるアルファ－シート設計によるアミロイド形成の阻害を示す。（ａ）二量体設計ＡＰ１９３、ＡＰ１９５、ＡＰ１９５／１９９、およびＡＰ５単量体は、ＴｈＴ蛍光により測定されるように、ＵＴＩ８９ ＷＴバイオフィルムにおけるアミロイド量の用量依存的低減を引き起こした。濃度が二量体について提供されるが、Ｐ１およびＡＰ５単量体は、設計の比較のために、同じ数の単量体単位を提供するようにその濃度の２倍とした（例えば、５μＭのＡＰ５が適用されたと言う場合、それは実際には１０μＭであった）。ｃＮＦＵ＝較正された、正規化蛍光単位であり、正規化シグナルは、大腸菌ＵＴＩ８９ΔｃｓｇＡバイオフィルムの非特異的ＴｈＴ蛍光により較正した。（ｂ）合成α－シートペプチドＡＰ１９３およびＡＰ１９５は、大腸菌ＧＥＲＢ３１９バイオフィルム、ゲンタマイシンおよびシプロフロキサシンに対する耐性を有する、臨床ＵＴＩ分離株のＴｈＴ蛍光を減少させた（二量体ペプチドを８μＭで添加し、ならびに、ＡＰ５およびＰ１は１６μＭとし、同じ単量体当量を提供した）。非構造化対照ペプチドＰ１は同じ濃度で適用した場合効果がなかった。パネルＣおよびＤについては、エラーバーは、少なくとも３反復の平均からの標準偏差を表し、ｐ値は下記の通りに示される：^＊はｐ＜０．０５を示し、^＊＊はｐ＜０．０１を示し、^＊＊＊はｐ＜０．００１を示し、ｎ．ｓ．はｐ≧０．０５を示す。

【図5】二量体ＡＰによる大腸菌の処理により、単量体よりも、より多くの細胞がプランクトン様状態にシフトされ、バイオフィルム中の細菌量が著しく低減される。（ａ）ＡＰ１９３ｄ、（ｂ）ＡＰ１９５ｄ、（ｃ）ＡＰ１９５／１９９ヘテロ二量体、（ｄ）ＡＰ５単量体、（ｅ）Ｐ１。浮遊性でプランクトン様である場合、細菌は抗生物質および宿主免疫系感受性である。バイオフィルムＴｈＴアッセイにおける細菌細胞数の推定。細胞をアッセイの各相中（プランクトン様、リンス、バイオフィルム）収集し、ホモジナイズし、細胞の数を６００ｎｍでの試料の光学密度により推定した。ペプチドは増殖に影響しなかった；代わりに、それらは細菌をバイオフィルム結合状態からプランクトン様状態にシフトさせた。エラーバーは、３反復の平均からの標準偏差を示す。

【図6】（ａ）大腸菌ＵＴＩ８９ ＳＬＣ－７１９（ＧＦＰ）のＲＡＷ２６４．７マクロファージ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７）との１時間コインキュベーション後の蛍光顕微鏡法（スケールバー＝３０μｍ）画像。（ｂ）食作用は８μＭ ＡＰ１９３ｄの存在下で培養されたバイオフィルム中で増加した。ＡＰ１９３二量体の存在下での改善された食作用は、改善されたバイオフィルム溶解度および個々の細菌の増加したアベイラビリティに起因した。

【図7】合成α－シートペプチドはＰＤＡコート表面に共有結合により結合する。（ａ）ドーパミンはＤＯＰＡおよびリジン官能基の両方を表示する。（ｂ）ＰＧＡＰを構成するための反応スキーム。弱アルカリ性ｐＨで、ドーパミンは自己重合を受け、粘着性ポリドーパミン（ＰＤＡ）コーティングを生成し、同時に、カテコール基のキノン形態への酸化が起こる。合成α－シートペプチドはアミノ基（Ｐｅｐ－ＮＨ_２）を含み、これはマイケル付加またはマイケル付加／シッフ塩基反応を受け、ＰＤＡ表面に共有結合により結合する。

【図8】ＰＤＡは、二量体ＡＰ１９３のポリプロピレン基材への付着を増強させる。ポリプロピレンマイクロタイタープレートを、ＰＧＡＰアセンブリプロトコルに従い、調製し、次いで、Ｐａｃ５３ポリクローナル抗体でプロービングし、これはＡＰ１９３ｄ配列の一部を認識する。Ｐａｃ５３をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＡＦ４８８）にコンジュゲートさせ、これにより、（ａ）蛍光測定および（ｂ）蛍光顕微鏡法（２００Ｘ倍率）によるＡＰ１９３ｄ結合の評価が可能になった。下記図１３に示されるように、単量体ＡＰ１９３のカップリングはほとんどないことに注意されたい。

【図9】ＰＤＡグラフトα－シートペプチドはポリプロピレン基材上での大腸菌バイオフィルムの形成を防止する。ポリプロピレンＰＤＡグラフトα－シートペプチド（９６ウェルマイクロタイタープレート）に大腸菌ＵＴＩ８９ ＳＬＣ－７１９を接種し、４８時間２６℃でインキュベートした。得られたバイオフィルムを（ａ－ｄ）蛍光顕微鏡法および（ｅ－ｆ）クリスタルバイオレット染色により可視化した。（ａ－ｄ）におけるスケールバーは６０μｍを示し、（ｅ）のエラーバーは３試料の平均からの標準偏差を表す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定。

【図10】ＰＤＡグラフトα－シートペプチドはチタン基材上での大腸菌バイオフィルムの形成を防止する。チタンディスクをＰＤＡおよびＡＰ１９３ｄで機能化し、大腸菌ＵＴＩ８９ ＳＬＣ－７１９を接種させ、４８時間２６℃でインキュベートした。表面を優しく洗浄し、共焦点顕微鏡法により撮像した。（ｃ）ＡＰ１９３ｄを有するコーティングは、（ａ－ｂ）、（ｄ）対照と比較して、実質的なバイオフィルム破壊を引き起こした。スケールバーは５５μｍを示す。

【図11】シリコーンＰＤＡグラフトα－シートペプチドのキャラクタリゼーション。Ａ）シリコーン片をＰＧＡＰ（ＡＰ１９３ｄ）で機能化し、大腸菌ＵＴＩ８９ ＳＬＣ－７１９を接種させ、４８時間２６℃でインキュベートした。リンスステップ後、小片を超音波処理し、粘着性バイオフィルムを除去し、次いで、バイオフィルム懸濁液のＧＦＰ蛍光をプレートリーダーにおいて測定した（ａ）。ＡＰ１９３ｄを有するコーティングでは、付着バイオフィルムの量の著しい減少という結果になった（^＊＊＊ｐ＜０．０００５）。（ｂ）コロニー形成単位（ＣＦＵ）カウントをシリコーン結合バイオフィルムについて、３００μｇ／ｍＬ Ｇｍチャレンジあり（ハッシュバー）およびなし（ソリッドバー）で決定した。表面上のＡＰ１９３ｄの存在により、ペプチドを含まない対照と比較して、Ｇｍチャレンジ後およそ１００倍少ない生菌という結果になった（^＊＊＊ｐ＜０．０００３）。（ｃ）使用済みシリコーン片をＥＬＩＳＡ様アッセイにおいてＰａｃ５３抗体でプロービングした。これらの材料は依然として、表面上でアクセス可能な、おそらく、活性なＡＰ１９３ｄを示した（^＊ｐ＜０．０２）。全てのｐ値を有意性について両側スチューデントｔ検定により作成し、エラーバーは、平均からの標準偏差を示す。

【図12】ＰＤＡグラフトα－シートペプチドコーティングは経時的に機能性を保持し、細胞生存率に影響しない。（ａ）ＡＰ１９３を有するポリプロピレンプレートをＰＢＳ（黒色菱形）またはプールしたヒト血漿（白色菱形）中３７℃で最大５日までの間インキュベートし、表面上のα－シートペプチドの存在をＰａｃ５３でプロービングすることにより定量化した。（ｂ）マウス３Ｔ３線維芽細胞を、示されたコーティングを有する９６ウェルポリスチレン組織培養プレート上で、２４時間増殖させ、次いで、細胞生存率をＭＴＴアッセイにより決定した。吸光度読み取りにより、試料間に著しい違いはないことが示された。エラーバーは３反復の平均からの標準偏差を示す。

【図13】ＳＯＢＡアッセイの開発および検出限界（ＬＯＤ）。ａ．ＮｕｎｃプレートおよびＴＭＢプロトコルを使用したＡＰ１９３二量体（黒色）対ＡＰ１９３単量体（灰色）の比較。プレインキュベートした、毒性Ａｂｅｔａ４２を段階希釈し、プレートに適用した。二量体はＳＯＢＡシグナルに２ｘを超える効果を提供し、単量体シグナルはより低い濃度でより早く消滅する。ＡＰ１９３単量体のＰＤＡコーティングへのカップリングもまた、二量体に比べ最小である。ｂ．２８０ｎｍでの吸光度は、表面にカップリングされていないペプチドの程度を反映する。ＰＤＡコーティングは、Ｎｕｎｃプレートと比較して、シグナルの増幅についてＡＰ１９３二量体捕捉ペプチドの表示を改善した。ｃ．ＰＤＡは、ＴＭＢプロトコルを使用した前に検出不能なレベルでのシグナルの増加につながる。透明なポリスチレンプレートをＰＤＡでコートし、ＡＰ５１０の段階希釈物を、２６０μＭから開始して適用し、１６μＭ ＡＰ５１０に及んだ。次いで、プレインキュベートした、毒性Ａｂｅｔａ４２を１ｎＭで、カップリングされたＡＰ１９３二量体を有さない１組のウェルを含む、全てのウェルに添加したが、バックグラウンドシグナルを定量するために完全に反応停止せた。我々は、パネルｂから、「元の」プロトコルに対し、全ての条件についてシグナルの増加を確認し、最大シグナルは６５μＭで到達し、プレートにカップリングされたＡＰ１９３二量体のより高い濃度ではプラトーに達した。ｄ．Ｎｕｎｃプレートを使用した化学ルミネセンスプロトコルによるＬＯＤ較正。Ｎｕｎｃアミノリンカープレートを使用して、化学ルミネセンスを直接、パネルＢで定量した比色分析感度と比較した。我々は、１００ｆＭまでの有意の検出減少を観察し、この小さな変化を、比色分析アッセイの１０ｎＭと比較した。ｅ．プレインキュベートしたＡβ４２毒性オリゴマー、単量体（Ｍｏｎ １００ｐＭ）、または前原線維（Ｆｉｂ １００ｐＭ）が添加された、プールしたヒト血漿について、化学ルミネセンスプロトコルを使用する、ＰＤＡ－機能化プレートを用いたＬＯＤ較正。１００ｐＭ毒性オリゴマー対同じ濃度の単量体および原線維型（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ）形態のＡβ４２についてのシグナルの大きな差に注目されたい。挿入図はより低い濃度および他の配座異性体試料の拡大である。我々は、ＰＤＡでコートされた白色ポリスチレンプレートにカップリングされた６５μＭのＡＰ５１０ｄを使用した。有意性が１ｆＭで観察された。ｆ．パネルｅからの血漿ＳＯＢＡ結果のＬｏｇ－ｌｏｇプロット。ＬＯＤは１ｆＭであり、２１，９４３のＳＯＢＡシグナルに対応し、そのため、それ未満では、結果は統計的に有意ではなく、ブランクと区別することができない。全てのｐ値はその試料のブランクに対するものである。^＊ｐ－値＜０．０５、^＊＊ｐ－値＜０．０１、^＊＊ｐ－値＜０．００１、^＊＊＊ｐ－値＜０．０００１。

【図14】アルツハイマー病およびパーキンソン病と関連する毒性オリゴマーの検出のためのＳＯＢＡ結果。Ａ．元の２抗体法を使用し、シグナルを増幅するために、二量体捕捉剤ＡＰ１９３二量体およびウェルのポリマーコーティングを用いた、ヒト血漿試料中のＡｂｅｔａオリゴマーのＳＯＢＡ検出についての生ルミネセンス値。Ｂ．パネルＡにおける被験体についての対応するＣＳＦ総Ａｂｅｔａ４２濃度。Ｃ．市販の対照およびＡＤ血漿試料を使用し、ＳＯＢＡのＮｅｘｔ－Ｇｅｎバージョンを使用し、二量体捕捉ペプチド、例えばＡＰ５３０ｄ、ＰＤＡコーティングおよび単一抗体検出を用いた、生ルミネセンス値。Ｄ．パネルＣにおける被験体についてのＣＳＦ中の対応する総Ａｂｅｔａ４２濃度。Ｅ．患者試料のＣＳＦ中の、ＰＤおよびレビー小体認知症と関連するαシヌクレインオリゴマーの検出。

【図15】Ｆ^１８標識アルファ－シートペプチドを使用したＷＴ（左）およびトランスジェニックＡＤマウスのＰＥＴ画像。

【図16】ＡＰ５デンドリマーはポリ－リジンコアを使用し、ＡＰ５単量体が結合される複数の枝を生成させる。デンドリマーは、その後のアミノ酸のカップリングのために２つの一級アミンを露出させるための、リジン残基のＮ末端および側鎖上のＦｍｏｃ保護基の同時脱保護により合成することができる。我々は４価構築物から開始した。

【図17】異なる濃度のＡｂｅｔａ４２毒性オリゴマーをＮｕｎｃ ＳＯＢＡプレートに適用した。各濃度のＡｂｅｔａ４２に対し、左の灰色バーはＡＰ５１０二量体であり、ＡＰ５デンドリマーは中央の濃灰色バーであり、右のバーはブランクである。デンドリマーはより強いシグナルを提供し、それは、特に、最低濃度で非常に重要となり、その場合、効果は＞４倍となる。

【図18】Ｎｕｎｃプレートに結合させたデンドリマーと共に化学ルミネセンスおよびＰＤＡを採用すると、非常に高いシグナル（黒色）対ブランク（灰色）が提供される。

【発明を実施するための形態】

【0020】

引用される全ての参考文献は本明細書でその全体が参照により組み込まれる。本出願内では、別記されない限り、使用される技術は、下記などのいくつかのよく知られた参考文献のいずれかにおいて見出すことができる：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８５， Ｄ． Ｇｏｅｄｄｅｌ編， １９９１． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， “Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ｍ．Ｐ． Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ， ｅｄ．， （１９９０） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓ， ｅｔ ａｌ． １９９０． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， 第２版 （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ． １９８７． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ｐｐ． １０９－１２８， ｅｄ． Ｅ．Ｊ． Ｍｕｒｒａｙ， Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｃｌｉｆｔｏｎ， Ｎ．Ｊ．）， およびｔｈｅ Ａｍｂｉｏｎ １９９８ Ｃａｔａｌｏｇ （Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）。

【0021】

本明細書では、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明確に別記されない限り、複数の指示対象を含む。

【0022】

本明細書では、アミノ酸残基は下記のように省略される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、およびノルロイシン（Ｎｌｅ、Ｂ）。

【0023】

本明細書で開示される様々なポリペプチド配列では、小文字はＤ－アミノ酸を示し、大文字はＬアミノ酸を表し、「Ｇ」（グリシン）はアキラルである。

【0024】

発明の任意の態様の全ての実施形態は、文脈で明確に別記されない限り、組み合わせて使用することができる。

【0025】

第１の態様では、本開示は、共有結合により連結された２つ以上の単量体α－シートポリペプチドを含むα－シートポリペプチド多量体を提供する。

【0026】

発明者らは、以前、α－シート構造を採用する単量体ポリペプチドは、一次アミノ酸配列に関係なく、よって、例えば、治療および診断方法において使用することができることを証明した（米国特許９８９６４８７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。その中で示されるように、ポリペプチドの一次アミノ酸配列はそれ自体、ポリペプチド活性を決定しない。代わりに、動作可能な安定なα－シート構造を取るのはポリペプチドの能力であり、それは列挙されたポリペプチドの一般的な構造および交互のＤ／Ｌアミノ酸の列挙された配列により達成される。その中で示されるように、アミノ酸のランダム一次配列は発明のポリペプチドにおいて活性である。これらの同じ一次配列は、ポリペプチドがＬ－アミノ酸のみによって構成される場合、または、Ｌ／Ｄアミノ酸がポリペプチド内にランダムに分布し、それらが、交互のＬ／Ｄ位置を含まない場合、活性ではない。

【0027】

発明者らは、本明細書で、共有結合により連結された２つ以上の単量体α－シートポリペプチドの多量体は、単量体α－シートポリペプチドに対する阻害効力において、劇的、かつ、驚くべき改善を有することを開示する。

【0028】

本明細書では、「α－シートポリペプチド」はα－鎖においてＬ－およびＤ－型の隣り合うアミノ酸のテンプレート化された交互配列を含むポリペプチドであり、α－シートを形成することができる特徴的な二次構造を生成する。α－シートは、カルボニル酸素が鎖の一面上に整列され、他方、ＮＨ基は、交互配列ではなく、これにより、異なる物理的性質が提供されることを除き、β－シートに類似する。

【0029】

多量体は、使用目的に適切と考えられる、共有結合により連結された、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の単量体α－シートポリペプチドを含み得る。本明細書における教示を考慮して、当業者により理解されるように、任意の好適な数の単量体α－シートポリペプチドを共有結合により連結することができ、開示の多量体が形成される。特定の実施形態では、多量体は共有結合により連結された２つのα－シートポリペプチドを含む（すなわち：二量体）。他の実施形態では、多量体は共有結合により連結された３つのα－シートポリペプチドを含む（すなわち、三量体）。他の実施形態では、多量体は共有結合により連結された４つのα－シートポリペプチドを含む（すなわち、四量体）。他の実施形態では、多量体は共有結合により連結された５つのα－シートポリペプチドを含む（すなわち、五量体）。他の実施形態では、多量体は共有結合により連結された６つのα－シートポリペプチドを含む（すなわち、六量体）。

【0030】

多量体は、２つ以上の単量体α－シートポリペプチド間に任意の好適な共有結合を含み得る。１つの実施形態では、２つ以上の単量体α－シートポリペプチドは融合タンパク質で、タンパク質挿入として、または、任意で、任意の好適な長さおよびアミノ酸組成のアミノ酸リンカーにより分離されて提供される。

【0031】

１つの特定の実施形態では、２つ以上の単量体α－シートポリペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合により、共有結合により連結される。１つの特定の実施形態では、２つの単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１つのジスルフィド結合により、共有結合により連結される。さらなる特定の実施形態では、２つの単量体α－シートポリペプチドは１つのジスルフィド結合により、共有結合により連結される。

【0032】

様々な他の実施形態では、２つ以上の単量体α－シートポリペプチドは下記の１つ以上により、共有結合により連結され得る：
Ａ．システイン多量体化。Ｃｙｓマレイミドはマレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）チオール反応を利用して、２つのペプチドを配位させ、二量体または他の多量体を形成させる。１つの単量体は、マレイミドモチーフを含み（この単量体中にはＣｙｓ残基はない）、他方は、システイン残基を含む（この単量体中にはマレイミドはない）。マレイミド環の二重結合側はＣｙｓ残基のチオール上の水素を移動させ、共有結合により硫黄原子に結合し、二量体が形成される。マレイミドは、アミノ酸側鎖修飾として動作することが示されているが、それはまた、ペプチドへの偽アミノ酸またはキャップとして、配列中全く単独で動作することができる。Ｃｙｓと同様に、ペプチド全体にわたる多くの単位が二量体よりもむしろ多量体を促進することができるであろう。

【0033】

Ｂ．チオエーテル二量体化。１つの単量体単位Ａはアルキルハロゲン化（例えば、限定はされないが、臭素化）アミノ酸を含み、システインを含まないが、単量体Ｂは単一システインアミノ酸を含み、これは、チオールのアルキル化を介して容易に反応し、二量体を配位させるチオエーテル架橋が形成される。単量体Ａ中の任意のアミノ酸はアルキルハロゲン化（例えば、限定はされないが、臭素化）させることができる。

【0034】

Ｃ．ジチロシン多量体化。Ｍｉｙａｕｒａ－Ｓｕｚｕｋｉ反応（またはより効率的でないペルオキシダーゼ触媒反応）を利用して、各々が単一チロシン残基を含む２つの単量体間でジチロシン結合が形成され得る。メカニズムはチロシンの酸化を含み、容易に反応する側鎖が生成され、ジチロシン二量体が形成される。一単量体あたり２つ以上のＴｙｒ残基を使用すると、多量体が促進され、一単量体あたりたった一つのＴｙｒでは、二量体が生成される。

【0035】

Ｄ．ジチロシン多量体化。ＵＶ曝露に応じてＲｕ（ｂｐｙ）３２＋反応を使用して達成された光誘起ジチロシン架橋は、各単量体におけるチロシン残基を迅速に架橋し、二量体を形成する。一単量体あたり２つ以上のＴｙｒ残基の使用により、多量体が促進され、一単量体あたりたった一つのＴｙｒでは二量体が生成される。

【0036】

Ｅ．クリックケミストリー。Ｒ１－アルキン基（単量体Ａにアミノ酸修飾を介して、または、単量体Ａ配列の末端にコンジュゲートされている、ここでＲ１＝＝単量体Ａ）を有する単量体Ａ、および、Ｒ２－アジド基（単量体Ｂにアミノ酸修飾を介して、または、単量体配列の末端にコンジュゲートされている、ここでＲ２＝＝単量体Ｂ）を有する１つの単量体Ｂ、および銅キレート化を使用して、二量体は、多量体化のための２つ以上の単量体単位間での１，２，３－トリアゾール架橋を用いて容易に形成される。

【0037】

Ｆ．アミド結合連結多量体。アミド結合連結単量体はＣ末端二量体化のためにリジン残基、または、Ｎ末端二量体化のためにグルタミン酸残基を組み入れることにより生成される。第１のアプローチはリジン残基のαおよびεアミノ基を使用し、２－単量体の第１の残基のαアミン基とのアミド結合を生成させる。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨをこのために、それを樹脂に結合させることにより使用することができ、αおよびε－Ｆｍｏｃ基脱保護後、２つの単量体鎖が同時に伸長される。第２のアプローチは、樹脂からの切断前に、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯＨの、保護基なしのそのαおよびδカルボン酸基との使用を必要とし、２つ以上の伸長された単量体鎖が連結される。これらは、２つの単量体鎖への最初の付加物が別のＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨである場合、木の枝がこのようにして広がるので、多量体に拡大することができる。

【0038】

Ｇ．ＲＯＭＰ二量体化。開環メタセシス重合（ＲＯＭＰ）は、単量体を重合させ、反応条件によって、様々なサイズの多量体を形成させることができる。ＲＯＭＰはルテニウム錯体を使用して、ノルボルネン環における環ひずみを低減させることによりエネルギーを最小化することにより、ノルボルネンモチーフでの重合を開始させる。ペプチド配列中に代理アミノ酸代用物として付加されたノルボルネンはこの高速重合を可能にし、二量体ならびに所望のサイズの多量体が形成される。

【0039】

Ｈ．各単量体α－シートポリペプチド上に存在するシステイン残基またはヒスチジン残基を連結するためのデカフルオロビフェニル（ＤＦＢＰ）。

【0040】

Ｉ．多量体は、２つ以上の単量体α－シートポリペプチドの、複数の単量体α－シートポリペプチドを共有結合により連結させるように機能する様々なコア構造へのコンジュゲーションにより生成させることができ、二量体および高次構造（すなわち：三量体およびそれ以上）が形成される。非限定的、かつ、例示的なそのようなコア構造としては、ポリ－リジン、ポリ－オルニチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、適切な任意の他のポリマー、ナノ粒子、などが挙げられる。この実施形態では、多量体は様々なサイズ（ＭＷ）および配位数（コンジュゲートされたペプチドの数）で、標準方法を使用して構築させることができる。これらの材料は、単量体配列における一級アミンおよびチオールと容易に反応することができるように官能化することができる（アミンについてはＬｙｓおよびＣ末端、およびチオールについてはＣｙｓ）。

【0041】

Ｊ．２つ以上の単量体α－シートポリペプチドを共有結合により連結させるために使用することができるいくつかの他の部分：ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）；１，１’－（２，２’－オキシビス（エタン－２，１－ジオイル））ビス（１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）（ＭａｌＰＥＧ１）；ならびに

【化2】

【0042】

よって、様々な実施形態では：
・多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、少なくとも１つのシステイン残基を含み、または多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、単一システイン残基を含み、単量体α－シートポリペプチドは、システイン残基を介して、共有結合により連結される。１つの実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、単一システイン残基を含み、多量体は二量体を含む。

【0043】

・多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、少なくとも１つのヒスチジン残基を含み、または多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、単一ヒスチジン残基を含み、単量体α－シートポリペプチドは、ヒスチジン残基を介して、共有結合により連結される。１つの実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、単一ヒスチジン残基を含み、多量体は二量体を含む。

【0044】

・多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、少なくとも１つのチロシン残基を含み、または多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、単一チロシン残基を含み、単量体α－シートポリペプチドは、チロシン残基を介して、共有結合により連結される。１つの実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、単一チロシン残基を含み、多量体は二量体を含む。

【0045】

・多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、アミノ酸代用物として少なくとも１つのノルボルネン部分を含み、または多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、アミノ酸代用物として単一ノルボルネン部分を含み、単量体α－シートポリペプチドは、ノルボルネン部分を介して、共有結合により連結される。１つの実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、単一ノルボルネン部分残基を含み、多量体は二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、またはさらに高次の多量体を含む。１つの非限定的実施形態では、多量体はＲＯＭＰ二量体化により形成され、それは、単量体を重合させ、反応条件によって様々なサイズの多量体を形成させることができる。ＲＯＭＰはルテニウム錯体を使用して、ノルボルネン環における環ひずみを低減させることによりエネルギーを最小化することにより、ノルボルネンモチーフでの重合を開始させる。単量体中に代理アミノ酸代用物として付加されたノルボルネンはこの高速重合を可能にし、二量体ならびに所望のサイズの多量体が形成される。

【0046】

・多量体中の１つの単量体α－シートポリペプチド（単量体Ａ）はシステイン残基を有さず、多量体中の他の単量体α－シートポリペプチド（単量体Ｂ）は少なくとも１つのシステイン残基を含み、または、単量体Ｂは単一システイン残基を含み、単量体ＡおよびＢは、単量体Ａ上の任意のアミノ酸残基と単量体Ｂ中のシステイン残基上の硫黄原子の間の共有結合を介して、共有結合により連結される。１つの実施形態では、多量体は二量体を含む。非限定的例として、１つの実施形態では（単量体Ａ）はマレイミドモチーフを含み（単量体Ａ中の任意の残基上または単量体Ａ配列中の独立残基として）、システインを含まず、単量体Ｂは少なくとも１つのシステイン残基を含み、または、単量体Ｂは単一システイン残基を含み、単量体ＡおよびＢは、単量体Ａ上のマレイミドモチーフと単量体Ｂ中のシステイン残基上の硫黄原子の間の共有結合を介して、共有結合により連結される。１つの実施形態では、多量体は二量体を含む。

【0047】

・多量体中の１つの単量体α－シートポリペプチド（単量体Ａ）はシステイン残基を有さず、多量体中の他の単量体α－シートポリペプチド（単量体Ｂ）は少なくとも１つのシステイン残基を含み、または、単量体Ｂは単一システイン残基を含み、単量体ＡおよびＢは、単量体Ａ上の任意のアミノ酸残基と単量体Ｂ中のシステイン残基上の硫黄原子の間のチオエーテル架橋を介して、共有結合により連結される。１つの実施形態では、多量体は二量体を含む。非限定的例として、１つの実施形態では、Ａは、アルキルハロゲン化（例えば、限定はされないが、臭素化）アミノ酸を含み（単量体中の任意のＡＡはアルキルハロゲン化（例えば、限定はされないが、臭素化）されてもよい）、システインを含まず、単量体Ｂは少なくとも１つのシステイン残基を含み、または、単量体Ｂは単一システイン残基を含み、単量体ＡおよびＢは、単量体Ａ上の前の、アルキルハロゲン化（例えば、限定はされないが、臭素化）残基（単量体の共有結合で、新規Ｓ－結合で置換されるアルキルハロゲン）と単量体Ｂ中のシステイン残基上の硫黄原子の間のチオエーテル架橋を介して、共有結合により連結される。

【0048】

・多量体中の２つ以上の単量体α－シートポリペプチドは、単量体単位間の１，２，３－トリアゾール架橋を介して、共有結合により連結される。１つの実施形態では、多量体は二量体を含む。非限定的例として、１つの実施形態では、多量体中の１つの単量体α－シートポリペプチド（単量体Ａ）は単量体Ａ中の任意の残基にコンジュゲートされた、または、単量体Ａの末端に付加されたアルキン基を含み、多量体中の他の単量体α－シートポリペプチド（単量体Ｂ）は、単量体Ｂ中の任意の残基にコンジュゲートされた、または、単量体Ｂの末端に付加されたアジド基を含み、単量体ＡおよびＢは、銅キレート化後に、２つの単量体単位間の１，２，３－トリアゾール架橋を介して共有結合により連結される。

【0049】

・多量体中の２つ以上の単量体α－シートポリペプチドは、単量体単位間のアミド結合を介して、共有結合により連結される。１つの実施形態では、多量体は二量体を含む。非限定的例として、様々な実施形態では、（ａ）各単量体α－シートポリペプチドは、Ｃ末端多量体化（例えば、二量体化）のためにＣ末端にリジン残基を含み、または、（ｂ）各単量体α－シートポリペプチドは、Ｎ末端多量体化（例えば、二量体化）のためにＮ末端にグルタミン酸残基を含む。第１のアプローチはリジン残基のαおよびεアミノ基を使用し、２－単量体の第１の残基のαアミン基とのアミド結合を生成させる。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨは、それを樹脂に結合することにより、このために使用することができ、αおよびε－Ｆｍｏｃ基脱保護後、２つの単量体鎖は同時に伸長される。第２のアプローチは、樹脂からの切断前に、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯＨの、保護基なしのそのαおよびδカルボン酸基との使用を必要とし、伸長された単量体鎖が連結される。

【0050】

・多量体は、好適なコア構造に共有結合により連結された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の単量体α－シートポリペプチドを含み、好適なコア構造としては、ポリ－リジン、ポリ－オルニチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、適切な任意の他のポリマー、およびナノ粒子が挙げられるが、それらに限定されない。

【0051】

・多量体は、下記から選択される、１つ以上のリンカーを介して、共有結合により連結される２つ以上の単量体α－シートポリペプチドを含む：ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）；１，１’－（２，２’－オキシビス（エタン－２，１－ジオイル））ビス（１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）（ＭａｌＰＥＧ１）；ならびに

【化3】

【0052】

１つの実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、追加の機能ドメインおよび他の残基、例えば、単量体連結目的のために付加され得る追加の残基を含まない。

【0053】

１つの実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、ＬまたはＤ型の少なくとも１つのシステイン残基を含む。１つの実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、ＬまたはＤ型の単一システイン残基を含む。

【0054】

別の実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）の、ＬまたはＤ型のヒスチジン残基を含む。１つの実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、ＬまたはＤ型の単一ヒスチジン残基を含む。

【0055】

１つの実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）の、ＬまたはＤ型のチロシン残基を含む。１つの実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、ＬまたはＤ型の単一チロシン残基を含む。

【0056】

さらなる実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは、少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）のノルボルネン部分を含む。１つの実施形態では、多量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、単一ノルボルネン部分を含む。

【0057】

別の実施形態では、二量体中の１つの単量体α－シートポリペプチド（Ｂ単量体）は少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）の、ＬまたはＤ型のシステイン残基を含み、他の単量体α－シートポリペプチド（Ａ単量体）はシステイン残基を含まない。１つの実施形態では、二量体中の各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１２－２３アミノ酸の長さであり、Ａ単量体は単一の、ＬまたはＤ型のシステイン残基を含む。

【0058】

別の実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドは、一般式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５による１２－２３の連続するアミノ酸を含み、
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－７の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ５－１２の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－７の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ４－１２の連続するアミノ酸残基であり；ならびに、
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－４の連続するアミノ酸残基である。

【0059】

本明細書では、「交互に並ぶ」は、Ｌ異性体とＤ異性体が交互に並ぶ少なくとも３つのアミノ酸のひと続き（すなわち、Ｌ－Ｄ－Ｌ；Ｄ－Ｌ－Ｄ；など）を意味する。

【0060】

本明細書では、「Ｌ残基とＤ残基が交互に並ばない」は、その領域はＬ異性体とＤ異性体が交互に並ぶ少なくとも３つのアミノ酸のひと続きを含まないことを意味する。よって、そのような領域（Ｘ１、Ｘ３、およびＸ５）は、ＤおよびＬ残基の両方を含み得る。例えば、ポリペプチドＲＧＮｗＮｅＳｋＭＮＥＹＳＧＷｍＬｍＣｔＭＧＲ（ＡＰ５００；配列番号１）（大文字のアミノ酸残基はＬアミノ酸であり、小文字のアミノ酸残基はＤアミノ酸である）は本明細書で規定される下記サブユニット構造を有し：
Ｘ１はＬアミノ酸とＤアミノ酸が交互に並ばない２つの連続するアミノ酸残基であり（ＲＧ）；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７つの連続するアミノ酸残基であり（ＮｗＮｅＳｋＭ）（配列番号６２）；
Ｘ３はＬアミノ酸とＤアミノ酸が交互に並ばない５つの連続するアミノ酸残基であり（ＮＥＹＳＧ）（配列番号６３）；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７つの連続するアミノ酸残基であり（ＷｍＬｍＣｔＭ）（配列番号６４）；ならびに
Ｘ５はＬアミノ酸とＤアミノ酸が交互に並ばない２つのアミノ酸残基である（ＧＲ）。

【0061】

別の例では、ポリペプチドｒＧｎＷｎＥｓＫｍｎｅｙｙＧｗＭｌＭｃＴｍＧｒ（配列番号６５）（ＡＰ５０６）は本明細書で規定される下記サブユニット構造を有し：
Ｘ１はＬアミノ酸とＤアミノ酸が交互に並ばない０の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ９つの連続するアミノ酸残基であり（ｒＧｎＷｎＥｓＫｍ）（配列番号６６）；
Ｘ３はＬアミノ酸とＤアミノ酸が交互に並ばない３つの連続するアミノ酸残基であり（ｎｅｙ）；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ１１の連続するアミノ酸残基であり（ｙＧｗＭｌＭｃＴｍＧｒ）（配列番号６７）；ならびに
Ｘ５はＬアミノ酸とＤアミノ酸が交互に並ばない０のアミノ酸残基である。

【0062】

当業者であれば、どのように、他のポリペプチド配列が本明細書で記載される様々な一般式内に収まるかを認識するであろう。本明細書で記載されるポリペプチドは標準技術を使用して化学的に合成され得る。

【0063】

少なくとも１つ（１、２、３、またはそれ以上）のシステイン、ヒスチジン、チロシン、ノルボルネン部分、または連結を促進する他の部分（例えば、限定はされないが、本明細書で開示されるもの）（集合的に「連結部分」と呼ばれる）は各単量体α－シートポリペプチド中の任意の場所に配置され得る。さらなる実施形態では、各単量体α－シートポリペプチド中の少なくとも１つの連結部分は、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、またはＸ４中に独立して存在する。別の実施形態では、各単量体α－シートポリペプチド中の少なくとも１つのシステイン残基は、ドメインＸ２、Ｘ３、またはＸ４中に独立して存在する。

【0064】

１つの実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドについて、Ｘ１は独立して、Ｌ残基とＤ残基が交互に並ばない０－２、０または２の連続するアミノ酸残基である。１つの実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドについて、全てのＸ１アミノ酸残基（存在する場合）はＬアミノ酸である。別の実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドについて、全てのＸ１アミノ酸残基はＤアミノ酸である。

【0065】

１つの実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドについて、Ｘ２は独立して、Ｄアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ、６－１０、７－１０、７－９、７、８、９、または１０の連続するアミノ酸残基である。

【0066】

別の実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドについて、Ｘ３は独立して、Ｌ残基とＤ残基が交互に並ばない、１－５、２－５、３－５、３、４、または５の連続するアミノ酸残基である。１つの実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドについて、全てのＸ３アミノ酸は独立して、Ｌアミノ酸またはグリシンである。別の実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドについて、全てのＸ３アミノ酸は独立して、Ｄアミノ酸またはグリシンである。

【0067】

１つの実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドについて、Ｘ４は独立して、Ｄアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ、６－１２、７－１１、７、８、９、１０、または１１の連続するアミノ酸残基である。

【0068】

別の実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドについて、Ｘ５は独立して、Ｌ残基とＤ残基が交互に並ばない、０－３、０－２、０、または２の連続するアミノ酸残基である。１つの実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドについて、全てのＸ５アミノ酸（存在する場合）は独立して、Ｌアミノ酸である。

【0069】

１つの実施形態では、多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて：
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－２の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７－１０または７－８の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない３－５または４－５の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７－１１の連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－２の連続するアミノ酸残基である。１つの実施形態では、多量体中の全てのポリペプチドは、この一般式を含む。

【0070】

１つの特定の実施形態では、多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて：
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない２つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない５つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７つの連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない２つの連続するアミノ酸残基である。１つの実施形態では、多量体中の全てのポリペプチドは、この一般式を含む。

【0071】

別の特定の実施形態では、多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて：
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない２つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ８つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない４つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７つの連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない２つの連続するアミノ酸残基である。１つの実施形態では、多量体中の全てのポリペプチドは、この一般式を含む。

【0072】

さらなる特定の実施形態では、多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて：
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ９つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない３つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ１１の連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０の連続するアミノ酸残基である。１つの実施形態では、多量体中の全てのポリペプチドは、この一般式を含む。

【0073】

別の特定の実施形態では、多量体中の１つ以上の単量体α－シートポリペプチドについて：
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ１０の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない４つの連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ７つの連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない２つの連続するアミノ酸残基である。１つの実施形態では、多量体中の全てのポリペプチドは、この一般式を含む。

【0074】

１つの実施形態では、Ｘ１およびＸ５は一定の単量体α－シートポリペプチドにおいて同じ長さ（すなわち：多量体中の少なくとも１つの単量体α－シートポリペプチドにおいて同じ長さ）である。別の実施形態では、Ｘ１およびＸ５は各単量体α－シートポリペプチドにおいて同じ長さである。

【0075】

別の実施形態では、Ｘ２およびＸ４は、一定の単量体α－シートポリペプチドにおいて、または各単量体α－シートポリペプチドにおいて同じ長さである。

【0076】

さらなる実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１４－２３、１７－２３、２１－２３、または２３アミノ酸の長さである。

【0077】

１つの実施形態では、各単量体α－シートポリペプチドは、表１に示される、配列番号１－３０、またはその逆キラル対応物から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み：
（ａ）各単量体α－シートポリペプチドは少なくとも１つのシステイン残基を含み；ならびに
（ｂ）小文字の残基はＤアミノ酸であり、大文字の残基はＬアミノ酸であり、Ｇ残基はアキラルである（常に、大文字で「Ｇ」と示される）。

【表1】

【0078】

多量体は、２つ以上の単量体α－シートポリペプチドを含み、各単量体は、同一のアミノ酸配列を含んでもよく、または、異なるアミノ酸配列を含み得る。１つの実施形態では、多量体中の全ての単量体は同じアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、一定の多量体中の単量体は異なるアミノ酸配列を有する単量体を含み得る。

【0079】

単量体α－シートポリペプチドまたは多量体は、それらのＮ－およびまたはＣ末端に追加の残基を含み得る。非限定的な実施形態では、追加の残基は、追加の機能ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、単量体の共有結合を促進するために、１つ以上の追加の残基または部分が付加され；非限定的なそのような「連結部分」は以上で記載される。他の非限定的な実施形態では、付加される機能ドメインは、治療部分、診断部分、検出可能部分、多量体を特定のインビボ場所にターゲティングさせるための部分を含み得る。

【0080】

単量体は、任意のアミノ酸、非天然アミノ酸またはそうでなければ多量体化のために使用される様式を有する官能化基準アミノ酸を含むことができ、ノルロイシン、マレイミド、ノルボルネン、および本明細書で記載される他のものが挙げられるが、それらに限定されない。

【0081】

別の実施形態では、ポリペプチドまたは多量体は、下記でより詳細に記載されるように、ポリマー、例えば、限定はされないが、ポリドーパミン（ＰＤＡ）にコンジュゲートされる。

【0082】

第２の態様では、本開示は、配列番号１－３０またはその逆キラル対応物から選択されるアミノ酸配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むα－シートポリペプチドを提供し、小文字の残基はＤアミノ酸であり、大文字の残基はＬアミノ酸であり、Ｇ残基はアキラルである。

【0083】

開示のこの第２の態様のポリペプチドは、例えば、第１の態様の多量体を調製するために、本明細書で記載される多量体の使用のために、ならびに本明細書で開示される他の治療および診断使用のために使用することができる。

【0084】

開示の第１の態様における単量体のために記載される全ての実施形態は、この第２の態様の単量体と共に使用することができる。よって、例えば、単量体は、第１の態様において記載される１つ以上（１、２、３、またはそれ以上）の連結部分の任意の実施形態を含み得る。

【0085】

第１および第２の態様のいくつかの実施形態では、基準ポリペプチドアミノ酸配列におけるＬまたはＤアミノ酸に対する任意のアミノ酸置換はキラリティーを維持する（すなわち：Ｌアミノ酸はＬアミノ酸で置換され；Ｄアミノ酸はＤアミノ酸で置換される）。

【0086】

開示の第１および第２の態様の全ての実施形態において、α－シートポリペプチドは、任意の一定の使用に最も適切なものとして、キャップされてもよく、またはキャップされなくてもよい。様々な実施形態では、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の１つまたは両方はアセチル化またはアミド化される。他の実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端のどちらも、キャップされない。

【0087】

１つの実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチドまたは多量体は、インビボでの半減期の増加を促進するために、例えば、ペグ化、ＨＥＳ化、ＰＡＳ化、またはグリコシル化により、他の化合物に連結されてもよい。そのような連結は共有結合性または非共有結合性とすることができる。

【0088】

別の実施形態では、本開示は、下記を含む医薬組成物を提供する：
（ａ）開示の第１および第２の態様のいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせのα－シートポリペプチドまたは多量体；ならびに
（ｂ）薬学的に許容される担体。

【0089】

本発明の医薬組成物は、例えば、本明細書で開示される方法において使用することができる。医薬組成物は、ペプチド（複数可）に加えて（ａ）凍結乾燥保護剤；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤；（ｄ）張度調整剤；（ｅ）安定剤；（ｆ）保存剤および／または（ｇ）緩衝液を含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の緩衝液はトリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である。医薬組成物はまた、凍結乾燥保護剤、例えばスクロース、ソルビトールまたはトレハロースを含み得る。ある一定の実施形態では、医薬組成物は、保存剤、例えば塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびそれらの様々な混合物を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、グリシンのような増量剤を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、界面活性剤、例えば、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０ポリソルベート－８５、ポロクサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミタート、ソルビタンモノステアレート、モノオレイン酸ソルビタン、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、トリオレイン酸ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎ ｔｒｉｏｌｅａｓｔｅ）、またはそれらの組み合わせを含む。医薬組成物はまた、張度調整剤、例えば、製剤を、ヒト血液と実質的に等張または等浸透圧にする化合物を含み得る。例示的な張度調整剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよびアルギニン塩酸塩が挙げられる。他の実施形態では、医薬組成物は加えて、安定剤、例えば、対象となるタンパク質と合わせられると、凍結乾燥または液体形態での対象となるタンパク質の化学的および／または物理的不安定性を実質的に防止または低減する分子を含む。例示的な安定剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、およびアルギニン塩酸塩が挙げられる。

【0090】

本明細書で記載される医薬組成物は薬学的に許容されない成分を実質的に含まず、すなわち、本出願の出願時の米国の規制上の要件により許可されるものより低い量の薬学的に許容されない成分を含む。この態様のいくつかの実施形態では、化合物が水中で溶解され、または懸濁される場合、組成物はさらに任意で、追加の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。他の実施形態では、本明細書で記載される医薬組成物は、固体医薬組成物（例えば、錠剤、カプセル、など）である。

【0091】

組成物は、任意の型の送達、例えば、限定はされないが、経口、非経口、静脈内、皮下、肺、および経鼻送達のために製剤化することができる。

【0092】

α－シートポリペプチドまたは多量体は医薬組成物中で投与される唯一の活性剤であってもよく、または、組成物は、使用目的に好適な１つ以上の他の活性剤を含み得る。様々な非限定的な実施形態では、組成物は、ペプチダーゼ阻害剤をさらに含み得る。

【0093】

第３の態様では、本開示は、下記を含む組成物を提供する：
（ａ）表面上のポリマーコーティング；ならびに
（ｂ）ポリマーコーティングに共有結合により連結されたα－シートポリペプチド。

【0094】

本明細書における実施例で開示されるように、α－シートポリペプチドは、ポリドーパミン（ＰＤＡ）コート表面により例示されるポリマコート表面に共有結合により結合する。開示の組成物を生成させるための非限定的な、例示的技術が、実施例において提供され、よって、本開示は、本明細書で開示されるステップを含む、この第３の態様の組成物を調製するための方法をさらに提供する。

【0095】

発明者らは、開示の組成物は、例えば、被験体から得られた生体試料中のα－シート含有毒性タンパク質種の非常に高い感度の検出のために使用することができることを示している。ポリマーコーティングに共有結合により連結されたα－シートポリペプチドは生体試料中のα－シート含有毒性タンパク質種の捕捉剤として使用される。

【0096】

ポリマーは任意の自己組織化ポリマーとすることができ、限定はされないが、カテコールアミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリドーパミン、ポリ－Ｌ－ＤＯＰＡ、ポリエピネフリン、ポリノルアドレナリン、またはジ－ヒドロキシルフェノールおよび一級アミンで終わる任意の長さの分枝鎖（カテコールアミンを構成する）を含む任意の合成生成物、およびそれらの組み合わせを含み得る。１つの非限定的実施形態では、ポリマーコーティングはポリドーパミン（ＰＤＡ）を含む。

【0097】

ポリマーコーティングは意図された目的に好適な任意の厚さとすることができる。非限定的実施形態では、ポリマーコーティングは約２５ｎｍ～約２５０ｎｍの厚さ、または約５０ｎｍ～約２００ｎｍの厚さ、または約６０ｎｍ～約１５０ｎｍの厚さ、または約６０ｎｍ～約１００ｎｍの厚さ、または約７０ｎｍ～約９０ｎｍの厚さ、または約７５ｎｍ～８５ｎｍの厚さ、または約８０ｎｍの厚さである。本明細書では、「約」は列挙パラメータの＋／－５％を意味する。

【0098】

ポリマーコーティングは表面全体、または表面の一部にわたっていてもよい。表面は使用目的に好適な任意の表面であってもよく、限定はされないが、アッセイプレート（例えば、限定はされないが、マイクロウェルプレート）、ガラス、セラミック、マイクロ流体チャネルおよびデバイス、メンブラン、プラスチック、多糖、チタン、シリコーン、ナイロン、ニトロセルロース、テフロンビーズ、ガーゼ、外科用糸、包帯、医療装置、などが挙げられる。表面は使用目的に好適な任意のサイズおよび形状を有してもよい。

【0099】

任意の好適なα－シートポリペプチドは開示の組成物において使用することができる。１つの実施形態では、α－シートポリペプチドは、米国特許９８９６４８７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で開示される１つ以上のα－シートポリペプチドを含み得る。１つのそのような実施形態では、α－シートポリペプチドは、一般式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５による１２－２３の連続するアミノ酸を含み、式中、
Ｘ１はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－７の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ５－９の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ３はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－５の連続するアミノ酸残基であり；
Ｘ４はＤアミノ酸とＬアミノ酸が交互に並ぶ４－１２の連続するアミノ酸残基であり；ならびに
Ｘ５はＬ残基とＤ残基が交互に並ばない０－４の連続するアミノ酸残基である。

【0100】

別の実施形態では、α－シートポリペプチドは、開示の第１および第２の態様のいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる、α－シートポリペプチまたはα－シートポリペプチドまたは多量体を含む。

【0101】

第４の態様では、本開示は、医療装置の表面にコートされた、本明細書で開示されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせのα－シートポリペプチド多量体またはα－シートポリペプチドを含む医療装置を提供する。１つの実施形態では、医療装置は、装置の表面上のポリドーパミン（ＰＤＡ）コーティングを含み、α－シートポリペプチド多量体またはα－シートポリペプチドはＰＤＡコーティングに共有結合により連結される。

【0102】

医療装置は、例えば、医療装置上での細菌感染／バイオフィルム形成のリスクを低減させるために、その必要がある被験体における留置のために使用することができる。任意の好適な医療装置が使用でき、限定はされないが、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、髄液シャント、尿路カテーテル、血管内カテーテル、義眼、人工関節、整形外科用インプラント、チタン含有インプラント、ポリスチレン含有インプラント、外科用メッシュインプラント、乳房インプラント、歯科インプラント、および子宮内避妊具が挙げられる。

【0103】

第５の態様では、本開示は、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を有する被験体に、有効な量の、本明細書で開示されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせのα－シートポリペプチド多量体またはα－シートポリペプチドを投与し、疾患を治療するまたはその発症を制限することを含む、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を治療するまたはその発症を制限するための方法を提供する。

【0104】

１つの実施形態では、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患は、限定はされないが、クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症、軽鎖アミロイドーシス、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、アルツハイマー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、２型糖尿病、トランスサイレチンにより引き起こされたアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、パーキンソン病、レビー小体病、外傷性脳損傷、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、大動脈中膜アミロイド、プロラクチノーマ、透析関連アミロイドーシス、脳アミロイド血管症、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、多発性骨髄腫、およびアミロイド－バイオフィルム細菌感染と関連する疾患から構成される群から選択される。

【0105】

別の実施形態では、本開示は、限定はされないが、下記を含む群から選択される障害を治療するまたはその発症を制限するための方法を提供し：クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症、軽鎖アミロイドーシス、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、アルツハイマー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、２型糖尿病、トランスサイレチンにより引き起こされたアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、パーキンソン病、レビー小体病、外傷性脳損傷、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、大動脈中膜アミロイド、プロラクチノーマ、透析関連アミロイドーシス、脳アミロイド血管症、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、多発性骨髄腫、およびアミロイド－バイオフィルム細菌感染と関連する疾患、方法は、その必要のある被験体に、有効な量の、本明細書で開示されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせのα－シートポリペプチド多量体またはα－シートポリペプチを投与し、障害を治療するまたはその発症を制限することを含む。

【0106】

本明細書では、「アミロイド疾患／アミロイド関連疾患を治療する」は下記の１つ以上を達成することを意味する：（ａ）疾患の重症度を低減させる；（ｂ）治療される疾患（複数可）に特徴的な症状の発症を制限または防止する；（ｃ）治療される疾患（複数可）に特徴的な症状の悪化を阻止する；（ｄ）前に障害（複数可）を有した患者において疾患（複数可）の再発を制限または防止する；（ｅ）前に疾患（複数可）の症状があった患者において症状の再発を制限または防止する；ならびに（ｆ）疾患を発症するリスクがある、または疾患の臨床効果をまだ示していない被験体において疾患の発症を制限する。

【0107】

本明細書では、「有効な量」は、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を治療および／または制限するのに有効なポリペプチドまたは多量体の量を示す。ポリペプチドまたは多量体は典型的には、医薬組成物、例えば以上で開示されるものとして製剤化され、任意の好適な経路を介して、例えば、経口的に、非経口的に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）、吸入スプレーにより、経鼻的に、直腸に、または局所的に、従来の薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを含む投与単位製剤において、投与することができる。非経口という用語は本明細書では、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、注入技術または腹腔内を含む。１つの実施形態では、投与は経鼻的である。

【0108】

投与計画は、最適の望ましい応答（例えば、治療または予防的応答）を提供するように調整することができる。好適な投与量範囲は、例えば、０．１ｆｇ／ｋｇ－１００ｍｇ／ｋｇ体重とすることができ；あるいは、０．５ｆｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ；１ｆｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ、または５ｆｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。ポリペプチドまたは多量体は単一ボーラスで送達させることができ、または主治医により決定されるように複数回（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上の回数）投与することができる。

【0109】

第６の態様では、本開示は、下記を含む、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断する、予測する、またはモニタするための方法を提供する：
（ａ）アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を有するリスクのある被験体由来の組織試料を、本明細書で開示されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせのα－シートポリペプチド多量体またはα－シートポリペプチドと、α－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドのアミロイド中間体（組織試料中に存在する場合）との結合に好適な条件下で、接触させ、結合複合体を生成させること；
（ｂ）組織試料中の結合複合体を検出すること；ならびに
（ｃ）検出に基づき、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断する、予測する、またはモニタすること。

【0110】

この態様の方法を使用して、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を患っている可能性がある患者のための治療の経過をより正確に診断、予測、またはモニタし、よって、担当介護者による、治療選択肢のより多くの情報に基づく決定を提供することができる。アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患のリスクがある個体は、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患、例えば、限定はされないが、クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症、軽鎖アミロイドーシス、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、アルツハイマー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、２型糖尿病、トランスサイレチンにより引き起こされたアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、パーキンソン病、レビー小体病、外傷性脳損傷、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、大動脈中膜アミロイド、プロラクチノーマ、透析関連アミロイドーシス、脳アミロイド血管症、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、多発性骨髄腫、およびアミロイド－バイオフィルム細菌感染と関連する疾患についての１つ以上の徴候、症状、または危険因子を示すものである。

【0111】

組織試料は、任意の好適な組織試料であってもよく、限定はされないが、血液、血清、脳脊髄液、鼻汁、尿またはアミロイド疾患またはアミロイド関連疾患のリスクがある被験体由来の他の生物学的材料が挙げられる。

【0112】

ポリペプチドまたは多量体をアミロイド中間体（組織試料中に存在する場合）と結合させ、結合複合体を生成するのに好適な条件は、使用されるポリペプチド（複数可）、組織試料、および採用される技術の詳細に依存するであろう。そのような好適な条件の決定は本明細書における教示に基づく当技術分野における技術のレベル内にある。

【0113】

試料中のアミロイド中間体の存在を示すそのような複合体（もし、あれば）の形成は、それから、好適な手段により検出され、測定される。そのような方法としては、均一および不均一結合イムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、免疫組織化学、ＦＡＣＳ、ビアコアおよびウエスタンブロット解析が挙げられるが、それらに限定されない。１つの特定の実施形態では、方法は本明細書で詳述されるＳＯＢＡアッセイの使用を含む。

【0114】

この態様における使用のためのポリペプチドおよび多量体は、以上で開示されるコンジュゲートを含むことができ、一定のアッセイに好適な任意の検出技術に有用なタグが提供される。使用されるタグは、使用される特定の検出／分析／診断技術および／または方法に依存するであろう。方法は、溶液中で実施することができ、または、発明のポリペプチド（複数可）は、担体または基材、例えば、本明細書で記載されるＳＯＢＡプレート、マイクロタイタープレート（ｅｘ：ＥＬＩＳＡ用）、メンブランおよびビーズ、などに結合または付着させてもよい。担体または基材はガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖、ナイロン、ニトロセルロース、またはテフロン、などでできていてもよい。そのような支持体の表面は固体または多孔性であってもよく、任意の好都合な形状を有し得る。

【0115】

第７の態様では、本開示は、下記を含む、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断する、予測する、またはモニタするための方法を提供する：
（ａ）アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を有するリスクのある被験体由来の組織試料を、開示の第３の態様の組成物と、α－シートポリペプチド多量体またはポリペプチドのアミロイド中間体（組織試料中に存在する場合）との結合に好適な条件下で接触させ、結合複合体を生成させること；
（ｂ）組織試料中の結合複合体を検出すること；ならびに
（ｃ）検出に基づき、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を診断する、予測する、またはモニタすること。

【0116】

この態様の方法を使用して、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を患っている可能性がある患者のための治療の経過をより正確に診断、予測、またはモニタし、よって、担当介護者による、治療選択肢のより多くの情報に基づく決定を提供することができる。アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患のリスクがある個体は、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患、例えば、限定はされないが、クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症、軽鎖アミロイドーシス、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、アルツハイマー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、２型糖尿病、トランスサイレチンにより引き起こされたアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、パーキンソン病、レビー小体病、外傷性脳損傷、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、大動脈中膜アミロイド、プロラクチノーマ、透析関連アミロイドーシス、脳アミロイド血管症、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、多発性骨髄腫、およびアミロイド－バイオフィルム細菌感染と関連する疾患についての１つ以上の徴候、症状、または危険因子を示すものである。

【0117】

組織試料は、任意の好適な組織試料であってもよく、限定はされないが血液、血清、脳脊髄液、鼻汁、尿またはアミロイド疾患またはアミロイド関連疾患のリスクがある被験体由来の他の生物学的材料が挙げられる。

【0118】

ポリペプチドまたは多量体をアミロイド中間体（組織試料中に存在する場合）と結合させ、結合複合体を生成するのに好適な条件は、使用されるポリペプチド（複数可）、組織試料、および採用される技術の詳細に依存するであろう。そのような好適な条件の決定は本明細書における教示に基づく当技術分野における技術のレベル内にある。

【0119】

本明細書で開示される診断および予測方法の１つの実施形態では、対照試料に対するＬＯＤ／ＬＯＱ／カットオフより高い結合複合体の量は、被験体を、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を有すると診断するのに役立つ。別の実施形態では、対照より高い結合複合体の量は、被験体をアミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を発症する可能性があると予測するのに役立つ。さらなる実施形態では、被験体由来の前の試料と比較しての、被験体由来の試料中の結合複合体の量の増加は被験体におけるアミロイド疾患またはアミロイド関連疾患の進行を示し、または、被験体がアミロイド疾患またはアミロイド関連疾患のために受けている治療は変更する必要がある可能性がある（すなわち：現在の治療の代わりとなる別の治療、投与される治療薬の投与量の増加、投与回数の増加、別の投与方法、または現在の治療に対する補完治療アプローチなど）ことを示す。

【0120】

担当医療関係者により適切と決定される任意の対照が使用され得る。１つの実施形態では、対照は、「正常」（すなわち：アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を示すα－シート成分の存在を示さない）と指定された、予め決定されたレベルの結合複合体を含み得る。別の実施形態では、対照は、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患を有さないことが知られている１または複数の被験体由来の試料であってもよい。他の実施形態では、対照は１つ以上の以前の時間点での同じ被験体由来の試料（複数可）であってもよく；この実施形態は、アミロイド疾患またはアミロイド関連疾患をモニタする、または、被験体がアミロイド疾患またはアミロイド関連疾患のために受けている治療の効力をモニタするのに特に有用である。

【0121】

実施例
実施例１：アルファ－シート二量体によるアミロイド線維形成の改善された阻害
我々は、ヘアピンペプチドのα－鎖におけるテンプレート化された、交互に並ぶＬ－およびＤ－アミノ酸を介して、ベースα－シート構造を全て維持する独特な配列を有する一連のペプチドを設計した。各配列は、単一システイン残基（３文字コードＣｙｓおよび１文字コードＣ）を用いて設計し、それは、高ｐＨ（炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６）でＤＭＳＯを使用するチオール基（－ＳＨ）の酸化によるジスルフィド結合を介する、指示された二量体化の部位として作用する。表２は３０の設計されたα－シート単量体／二量体ペプチドおよびＡＰ９０（我々のα－シートペプチドベンチマーク設計）についての配列を示す。Ｌアミノ酸は大文字で示され、Ｄアミノ酸は小文字で示され（グリシンは常に「Ｇ」により示されることに注意されたい。この単一水素アミノ酸のＬおよびＤ型については区別はないからである）、全ての配列は１文字コードを用いて示されることに注意すべきである。加えて、Ｘは非標準アミノ酸ノルロイシンを示し、Ａｃ－はアセチル化Ｎ末端を示し、－ＮＨ２はアミド化Ｃ末端を示す。

【表2】

【0122】

ペプチド設計の効力を、ＴｈＴ蛍光アッセイにより、線維形成の阻害を介して研究した。ペプチドを、７５μＭ ＡβとＰＢＳ凝集緩衝液中でコインキュベートし、β－シート形成についてＴｈＴ蛍光を介して経時的にモニタした。各場合において、Ａβのみ（すなわちＡβはＰＢＳ中阻害剤なしで凝集する）を、標準対照として実行し、下記式により％阻害を計算するために使用した：

【数1】

【0123】

重要なことには、各値は生データから減算されるその対応する「ブランク」を有し、すなわち：最終阻害剤値＝アッセイの終わりでの生値－所定の濃度でのＰＢＳ中のペプチドのみに対する値。

【0124】

「ブランク」値は２ｘ開始Ａβ値を決して超えず、過剰補正はデータ処理における効力源ではないことが確認され－最終Ａβ値は平均して２０ｘ開始Ａβ値であった。Ａβ濃度は固定したまま、ペプチド濃度を変動させ、ＡＰ：Ａβの等および準化学量論比での設計の効力を調べた（調査した比は１：１、１：１０、および１：１００を含む）。表３および図１は、ＴｈＴアッセイによる線維形成を阻害するそれらの能力における各独特なペプチドの性能を示し－配列ＩＤに続く「ｍ」はそれが単量体形態であることを示し、「ｄ」はそれが二量体形態であることを示す。α－シートペプチドの二量体形態はことのほか強力であり、それらの単量体対応物をはるかにしのぎ－全ての単量体形態は１：１００比で約０％阻害を示したが、平均二量体阻害は５４．７％であり、最大は８９．２％であり、最小は３８．５％であった。図１ｃはこのデータを、二量体についての％阻害値を単量体についての％阻害値により除算し、その値をプロットすることにより計算された「性能比」として示し－単量体についての％阻害（分母）が０となった場合については、この比は、可能な最大性能比が１００となるように、１の値を使用して計算した。二量体ペプチドが凝集阻害でそれらの単量体対応物よりも、単純に２ｘ、より効率的であった場合（２ｘの結合するα－シート「面」を有するため）、そうすると、この比は試験した各比について、図１ｃにおける水平な黒色破線で示される、２の値を有するであろう。

【表3】

【0125】

二量体化の追加の方法
ジスルフィド結合以外の二量体化法を使用して、開示の二量体を生成させることができ、細胞内毒性オリゴマーを有する疾患に対する治療薬に対し、特に細胞内などの還元環境において安定性を向上させるなどの利点が提供され得る。

【0126】

例えば、ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）および１，１’－（２，２’－オキシビス（エタン－２，１－ジオイル））ビス（１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）（ＭａｌＰＥＧ１）を使用して、２つの単量体をそれらのＣｙｓ残基を介して連結させた。

【化4】

【化5】

【0127】

Ａｂｅｔａ凝集の阻害を我々の標準ＴｈＴアッセイにおいて評価し、結果は、それらの単量体および二量体形態の異なるペプチドを、１０倍過剰のＡｂｅｔａを用いて比較する表中のものと比較することができる。

【表4】

【0128】

ジスルフィド結合形態と同様に、より長いリンカーを有する二量体は２ｘをはるかに超える応答を提供している。これらの連結は細胞内アミロイド疾患、例えばハンチントン病を標的にするのを助ける。

【0129】

他の哺乳類および細菌アミロイド系におけるアミロイド阻害
これらの改善されたα－シート設計は、ＡＤに限定されず、それらは、配列および開始構造に関係なくアミロイド形成中に、アミロイド形成ペプチドおよびタンパク質により形成される一般的なアルファ－シート構造を標的にするために、様々なアミロイド系において改善された阻害を示す。一例として、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）によるアミロイド形成、２型糖尿病、の阻害もまた、二量体α－シートペプチドについてより有効である（表５）。配列に関係なく、二量体は２ｘより大きな効果により、単量体をしのぎ、それはＩＡＰＰが過剰である場合に、特に明らかである。

【表5】

【0130】

哺乳類アミロイドタンパク質に加えて、二量体設計の改善された阻害はまた、細菌アミロイド系において観察される。一例として、持続尿路感染を有する患者由来の大腸菌の臨床分離株を使用した結果が提示される。実験アプローチが図２に示される。ＵＴＩ８９は、アミロイド線維構造を使用して、インビボで、抗生物質治療からの大きな破壊に抵抗する頑強なバイオフィルムを形成する尿路病原性大腸菌株である。バイオフィルム構造物が破壊できる場合、抗生物質はより有効でなければならない。哺乳類系におけるα－シート－媒介アミロイド形成はまた、グラム陰性および陽性細菌の両方において保護バイオフィルムを安定化するために使用される細菌アミロイドに当てはまる。

【0131】

図３は治療なしの生きた大腸菌におけるアミロイド形成およびＡＰ１９５二量体の存在下での線維形成の阻害を示す。ランダムコイルペプチド対照（Ｐ１）は効果がなかった。

【0132】

様々な用量の異なる合成α－シートペプチド（ＡＰ１９３、ＡＰ１９５、ＡＰ１９５／１９９二量体、またはＡＰ５単量体）または非構造化対照ペプチド（Ｐ１）を接種時に添加し、培養物を複製させた。ＡＰ５は２３－残基、単量体α－シートヘアピンである。ＡＰ１９５およびＡＰ１９３は、２つの同一α－シートヘアピンからなるホモ二量体であり、ＡＰ１９５／１９９は１つのＡＰ１９５単量体および１つのＡＰ１９９単量体からなるヘテロ二量体である。４８時間の増殖後、バイオフィルムをすすぎ、ホモジナイズし、アミロイド染料チオフラビンＴ（ＴｈＴ）で染色し、これはβ－シート原線維に結合すると蛍光を発し、アミロイド線維含量のレポーターとして機能する。ＴｈＴはまた、非特異的に細菌細胞表面に結合し、そのため、ＵＴＩ８９ΔｃｓｇＡノックアウト株のバイオフィルムが、同時に増殖し、非特異的ＴｈＴ蛍光の推定が提供された。この非特異的結合シグナルをＵＴＩ８９ ＷＴシグナルから減算し、図４に示される較正蛍光値（ｃＮＦＵ）を生成させた。ホモ二量体およびヘテロ二量体がＡＰ５単量体よりずっと強力であり、Ｐ１ランダムコイル対照は効果がなかった（図４Ａ）。

【0133】

ＵＴＩ８９系を超えた合成α－シートペプチドの適用性を調べるために、我々は、大腸菌分離株を抗生物質耐性尿路感染を提示した小児患者から入手した。ＰＣＲにより、全ての分離株においてｃｓｇＡ遺伝子の存在を確認したが、ＹＥＳＣＡ＋コンゴレッド寒天上でカールした（ｃｕｒｌｉａｔｅｄ）、「ｒｄａｒ」コロニー形態を示したもののみをさらなるキャラクタリゼーションのために選択した。ＵＴＩ８９ ＷＴ系と同様に、ＡＰ１９３およびＡＰ１９５は、ゲンタマイシン／シプロフロキサシン耐性株ＧＥＲＢ３１９のＴｈＴ蛍光において著しい減少を引き起こした（図４Ｂ）が、ランダムコイル対照ペプチドおよびＡＰ５単量体は２倍濃度で効果がなかった。

【0134】

アミロイド線維形成を阻害する効果はバイオフィルムを不安定にし、そのため、遊離した浮遊細菌が増加した。効果は、二量体については、単量体の用量の半分であっても、ずっとより顕著であった（図５の各プロットにおいて上部灰色バーを比較されたい）。細胞におけるこのシフトは、多数の非保護、浮遊細菌という結果となり、それらはより抗生物質および免疫クリアランス感受性である。例えば、耐性ＵＴＩ８９株は、ＡＰ設計物の共投与により、ゲンタマイシンに対して１３，０００倍感受性となった。同様に、細菌は、図６に示されるように、マクロファージによる食作用により感受性となった。

【0135】

材料および方法
ペプチドを、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標）マイクロ波ペプチドシンセサイザーを使用し、Ｆｍｏｃに基づくＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ化学を用いて、標準方法に従い合成した。ペプチドは全て、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ ＨＰＬＣシステム上で標準方法に従い精製した。ペプチドを分子量について、Ｂｒｕｋｅｒ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ（商標）ＥＳＩ－ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ ＥｓｑｕｉｒｅまたはＢｒｕｋｅｒａｍａＺｏｎ（商標）Ｓｐｅｅｄのいずれかを使用した）を使用して確認し、配列はＭＳ／ＭＳを使用して確認し、構造は二次構造妥当性確認により、Ｊａｓｃｏ（商標）円二色性分光計（Ｊ－７２０またはＪ－１５００システムのいずれかを使用した）上で確認した。

【0136】

二量体ペプチドを、精製単量体ペプチドを用いて、最初に、約５ｍｇの純粋単量体ペプチドを１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、１９ｍＬのｐＨ９．６炭酸塩緩衝液を添加し、２時間３７℃で撹拌しながら混合し、続いて、一晩１６時間室温で撹拌することにより、形成させた。次いで、二量体を非二量体化単量体からＨＰＬＣにより精製し、単量体形態について使用される同じ方法下で確認した。

【0137】

Ａβ凝集および線維形成、ならびにα－シートペプチドを用いた阻害実験を、ＴｈＴ蛍光を介して下記の通りの手順に従い、モニタした。６ｍＭ ＮａＯＨ（ａｑ）および２２μＭ ＴｈＴ溶液を調製する。Ａβ４２フィルム（複数可）を－８０℃から除去する。ＲＴに５分ベンチトップで平衡化させる。０．７５ｍｇ／ｍＬ溶液のために十分な体積の６ｍＭ ＮａＯＨ（ａｑ）をＡβ４２フィルムに添加する。０．７５ｍｇ／ｍＬ混合物を５分間超音波処理器内で超音波処理し、Ａβ４２を溶解させる。超音波処理後、溶液を含むチューブを指でたたき、混合させる。ペプチドが溶解していない（すなわち、微粒子が残っている）ことが観察された場合、超音波処理を５分ずつ、各々の後に溶解についてチェックしながら続ける。Ａβ４２が溶解されるとすぐに、０．７５ｍｇ／ｍＬ溶液を、０．２２μｍ酢酸セルロース遠心分離機フィルタに通して濾過し、不溶性材料を除去する。試料を２－３分間、低ＲＰＭで（４．３ｘｇ）遠心分離し、全ての溶液をフィルタに通過させる。濾過したＡβ４２溶液についてＵＶ／Ｖｉｓ分光法を実施し、２８０ｎｍで、１４９０Ｍ^－１ｃｍ^－１の消衰係数を用いて、正確なＡβ４２濃度を決定した。

【0138】

Ａβ４２原液を４時間、２５℃インキュベーター内でＮａＯＨ処理のためにインキュベートする。このインキュベーション後、ストックは４℃で最大１週間まで、将来の試料調製において使用するために保存することができる。染料含有凝集溶媒中で作る必要がある阻害剤溶液の総体積を決定する。わずかに過剰の全ての阻害剤溶液を、原液の小アリコート（１０－２０ｍｇ／ｍＬ）を所望の濃度（複数可）まで、染料含有凝集溶媒／緩衝液（ＰＢＳ）を用いて希釈することにより調製する。初期希釈後、全てのペプチド阻害剤の正確な濃度をＵＶ／Ｖｉｓ分光法を用いて決定し、必要に応じ、さらなる希釈／添加を行う。単一試料を調製するのに必要とされるＡβ４２原液（Ｖｓｔｏｃｋ）の体積を決定する。これは、下記に依存するであろう：ストック濃度（ｃｓｔｏｃｋ）、所望の最終濃度（ｃｆｉｎａｌ）、および使用される蛍光プレートについてのウェル体積。最終試料体積（Ｖｆｉｎａｌ）はウェルの総体積未満で、ウェルの底面をコートするのに必要とされる最小体積より大きくなければならない。一般に、９６－ウェルプレートでは、１５０μＬを使用し、３８４－ウェルプレートでは６０μＬを使用する。下記式を使用する：Ｖｓｔｏｃｋ＝（Ｖｆｉｎａｌ×ｃｆｉｎａｌ）／（ｃｓｔｏｃｋ）。Ａβ４２を完全ＮａＯＨ処理させるとすぐに、最終試料を、ピペット操作により３ｘ Ｖｓｔｏｃｋアリコートをｌｏ－結合（ｌｏ－ｂｉｎｄ）チューブに入れ、それらを３ｘ Ｖｆｉｎａｌまで、適切な染料含有溶媒（凝集溶媒／緩衝液または阻害剤を含む凝集溶媒／緩衝液）を用いて希釈することにより調製する。ピペット上での設定を変更せずに上下に４回混合する。プレートをフィルムで密閉し、それをプレートリーダーに移動し、標準的なＴｈＴ蛍光アッセイを、４３８ｎｍの励起波長および４８５ｎｍの発光波長を使用して実施する。ＩＡＰＰ凝集および阻害を、同じ一般プロトコルを、いくらかの若干の改良と共に使用して評価した。

【0139】

ＡＰ設計物のＢＭＯＥ二量体化のための方法

【化6】

６ｍＭ（１．３ｍｇ／ｍＬ）ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）の原液を２ｍＬエッペンドルフチューブ内で調製した。ＢＭＯＥを秤量し（２．０ｍｇ）、２ｍＬエッペンドルフチューブに移し、１．５ｍＬのＤＭＦをマイクロピペットで添加し、チューブを、完全溶解が達成されるまで繰り返して反転させた。０．１Ｍ、ｐＨ８ トリス緩衝液の原液を５０ｍＬコニカルチューブ中で調製し：０．４４４ｇのＴｒｉｚｍａ ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．２６５ｇのＴｒｉｚｍａ塩基（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０ｍＬチューブに添加し、５０ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ ＤＩ Ｈ_２Ｏに溶解した。ｐＨをｐＨプローブ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）を用いて確認し、ｐＨ紙（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で二重チェックした。スターラーバーを有する２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中で、ＡＰ５２７の１．３ｍＭ（３．９ｍｇ／ｍＬ）溶液を、５０％ＤＭＦ、５０％ストックトリス緩衝液中で６．２ｍｇのペプチドおよび１．６ｍＬの溶液を使用して調製した。ＡＰ５２７濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００ｃ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１３，９４０Ｍ^－１ｃｍ^－１の消衰係数を使用して２８０ｎｍでチェックした。マイクロピペットを使用して、適切な量のＢＭＯＥを含むＤＭＦ原液をペプチド溶液に添加し、約０．５ｍｏｌ、ＡＰ５２７に対するＢＭＯＥのＥｑ．比を達成した。溶液を１０００ｒｐｍで、室温で約１６時間混合し、その時点で反応完了を超高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用して確認した。少量（正確な重量は重要ではない）のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をシンチレーションバイアルに添加し、溶液を１０００ｒｐｍで、室温で１時間混合し、全ての望まれない、ジスルフィド結合二量体副産物を分解させた。次いで、溶液をＭｉｌｌｉＱ ＤＩ Ｈ_２Ｏで３倍希釈し、－８０℃フリーザー内で凍結させ、凍結乾燥した。粗二量体を逆相－ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＳＨ Ｃ１８ ＯＢＤ Ｐｒｅｐ Ｃｏｌｕｍｎ）により精製した。精製二量体をＬＣＭＳにより確認し、凍結乾燥し、－８０℃で保存した。

【0140】

ＡＰ設計物のＭａｌＰＥＧ１二量体化のための方法

【化7】

３６ｍＭ（９．６ｍｇ／ｍＬ）１，１’－（２，２’－オキシビス（エタン－２，１－ジオイル））ビス（１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）（ＭａｌＰＥＧ１；Ａｂｏｓｙｎ）を含むＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）の原液を２ｍＬエッペンドルフチューブにおいて調製した。ＭａｌＰＥＧ１を秤量し（４．８ｍｇ）、２ｍＬエッペンドルフチューブに移し、０．５ｍＬ ＤＭＦをマイクロピペットで添加した。溶液を３０００ｒｐｍで（ＦｉｓｈｅｒＢｒａｎｄ）約１分間ボルテックスし、次いで、完全溶解が達成されるまで繰り返して反転させた。０．１Ｍ、ｐＨ８トリス緩衝液の原液を５０ｍＬコニカルチューブ中で調製した：０．４４４ｇのＴｒｉｚｍａ ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．２６５ｇのＴｒｉｚｍａ塩基（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０ｍＬチューブに添加し、５０ｍＬ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ ＤＩ Ｈ_２Ｏに溶解した。ｐＨをｐＨプローブ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）で確認し、ｐＨ紙（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で二重チェックした。スターラーバーを有する２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中、ＡＰ５２７の０．７９ｍＭ（２．３ｍｇ／ｍＬ）溶液を、５０％ＤＭＦ、５０％ストックトリス緩衝液中、９．５ｍｇのペプチドおよび４．１４ｍＬの溶液を使用して調製した。ＡＰ５２７濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００ｃ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１３，９４０Ｍ^－１ｃｍ^－１の消衰係数を使用して２８０ｎｍでチェックした。マイクロピペットを使用して、適切な量のＭａｌＰＥＧ１を含むＤＭＦ原液をペプチド溶液に添加し、約０．５ｍｏｌ、ＡＰ５２７に対するＭａｌＰＥＧ１のＥｑ．比を達成した。溶液を１０００ｒｐｍで、室温で約１６時間混合し、その時点で、反応完了を超高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用して確認した。少量（正確な重量は重要ではない）のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をシンチレーションバイアルに添加し、溶液を１０００ｒｐｍで、室温で１時間混合し、全ての望まれない、ジスルフィド結合二量体副産物を分解させた。次いで、溶液をＭｉｌｌｉ－Ｑ ＤＩ Ｈ_２Ｏで３倍希釈し、－８０℃フリーザー内で凍結させ、凍結乾燥した。粗二量体を逆相－ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＳＨ Ｃ１８ ＯＢＤ Ｐｒｅｐ Ｃｏｌｕｍｎ）により精製した。精製二量体をＬＣＭＳにより確認し、凍結乾燥し、－８０℃で保存した。

【0141】

バイオフィルム培養およびアッセイ
一晩培養物をＬＢ培地中、約１８時間増殖させた。細菌を遠心分離により８０００ｘｇで３分間収集し、ＹＥＳＣＡブロス（５３）＋４％ｖ／ｖＤＭＳＯ中で再懸濁させ、６００ｎｍで０．１の光学密度まで希釈した。ペプチドストックを水に溶解し、濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により決定した。２０μＬのペプチドストックおよび／または無菌ｄｄＨ２Ｏを、最終ペプチド濃度が０、２、４、１０、または１６μＭ（二量体ペプチドについては０、１、２、５、または８μＭ）となるように無菌４８ウェルプレートの各ウェルに添加し、次いで、１８０μＬの希釈細菌培養物を上面に添加した。プレートをカバーし、プラスチックバッグ内に密封し、２６℃で４８時間インキュベートした。増殖後、浮遊細胞および培地を除去し、バイオフィルムを１回２５０μＬのＰＢＳですすいだ。浮遊細胞を沈降させ、ＰＢＳ中で再懸濁させ、浮遊およびリンス試料の両方の光学密度を６００ｎｍで決定し、細胞密度を推定した。ＰＢＳ溶液を除去し、バイオフィルムを２５０μＬ ＰＢＳ＋２０μＭ ＴｈＴに再懸濁させた。バイオフィルムを、激しいピペット操作（３０ｘ／ウェル）、超音波処理３分、およびプレートシェーカー上で１分によりホモジナイズした。次いで、１００μＬの各バイオフィルム懸濁液を、プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）における測定のために黒色壁、クリアボトム９６ウェルプレートに移した。ＴｈＴ蛍光をアミロイド形成の代理として４３８／４９５ｎｍで測定し、バイオフィルム吸光度を６００ｎｍで測定し、細菌細胞密度を推定した。ＵＴＩ８９ ＷＴについては、バイオフィルムＴｈＴ蛍光値を、ペプチドを含まない対照の平均値に対して正規化し、次いで、ＵＴＩ８９ΔｃｓｇＡ試料の平均蛍光値を、非特異的結合を説明するために、減算した。抗生物質感受性試験の場合、バイオフィルムを同じように培養したが、１００μＬのＹＥＳＣＡまたは１００μＬの、９００μｇ／ｍＬ Ｇｍが補充されたＹＥＳＣＡをインキュベーションの終わり６時間前にウェルに添加した。インキュベーション後、浮遊細胞および培地を除去し、バイオフィルムを１回無菌ＰＢＳ中ですすいだ。次いで、バイオフィルムを無菌ＰＢＳに再懸濁させ、超音波処理により５秒間、氷上でホモジナイズし、次いで、ドロッププレート方法によるＣＦＵプレートカウントのために１０倍単位で希釈した。

【0142】

細菌の免疫細胞に対する感受性を評価するために、緑色蛍光大腸菌ＵＴＩ８９ ＳＬＣ－７１９のバイオフィルムを、ＹＥＳＣＡブロス＋４％ＤＭＳＯ中４８時間、４８ウェルポリスチレンプレートにおいて２６℃で増殖させた。浮遊細胞および培地を除去し、バイオフィルムを１回無菌ＰＢＳで洗浄した。ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清＋１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン）中で、継代１２±２まで増殖させ、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋５％ＦＢＳ）に再懸濁させた。コインキュベーションでは、２５０μＬの染色マクロファージ懸濁液を、各バイオフィルムの上面に、１：１００のＭＯＩ（マクロファージ：細菌）で適用した。浮遊細菌およびマクロファージを同じ比で別個にコインキュベートした。コインキュベーションは１時間３７℃で進行し、その後、細胞およびバイオフィルムを優しく擦ることにより剥離させた。

【0143】

考察
ここで記載される新規クラスの二量体α－シート設計物は、哺乳類および細菌の両方の異なるアミロイド系にわたって、単量体対応物を超える著しい改善を提供し、ならびにそれらの改善された結合のために異なる用途に適用可能である。

【0144】

【表6】

【0145】

実施例２．ＡＰ表面コーティングは材料上での線維形成を阻害する
要約
バイオフィルムは医療装置バイアビリティーにとって大きな脅威のままであり、というのも、これらの表面結合細菌がインプラント拒絶および難治性感染につながる可能性があるからである。そのため、医療装置材料のための人工コーティングは、バイオフィルム病原性の局面を特異的に標的とする化学物質を使用しなければならない。この研究において、我々は、合成α－シートペプチドの予防、抗感染特性を、それらを医学的に関連する材料の表面にグラフトさせることによって証明している。ポリドーパミン（ＰＤＡ）コーティングは、様々な基材上でペプチドを表示する好都合なコンジュゲーション戦略として機能し、機能性生体材料の防汚特性を、試験生物として尿路病原性大腸菌バイオフィルムを使用して証明した。

【0146】

序論
特殊材料製造と組み合わせた、現代医療技術、例えば麻酔および抗生物質療法の開発により、多種多様な疾患および障害の外科手術による治療が可能になった。不運なことに、過去数十年間における侵襲性手順の増加は、医療関連感染の対応する増加を伴い、これらの感染の大半は、手術部位上または内でのバイオフィルム形成に端を発する可能性がある。

【0147】

成熟バイオフィルム構造物は、細胞外マトリクスを構成する３つの材料：水和多糖、細胞外ＤＮＡ、およびタンパク質の各々の物理化学的寄与に起因する。特定のサブセットのマトリクスタンパク質、機能性アミロイド線維は、様々な病原体の間で高度に保存され、この複雑な生物学的材料内の構造的足場として機能する。

【0148】

ドーパミン（図７Ａ）は重合して、多種多様の基材上でＰＤＡの薄い、均一なコーティングを形成する。ＰＤＡが表面上に堆積されるとすぐに、それはそのカテコール部分の複数の酸化キノン形態を表し、それは次いで、アミンまたはチオールとの反応を受け、共有結合によりグラフトされた機能層が形成される（図７Ｂ）。さらに、ＰＤＡはそれ自体、親水性、非汚損表面を提示し、それは、非常に疎水性の材料上であっても濡れ性を付与することができる。

【0149】

この研究において、ＰＤＡグラフトα－シートペプチド（ＰＧＡＰ）は、様々な表面に適用することができる新規抗バイオフィルムアプローチとして提示される。簡単で有効なプロセスにより、合成α－シートペプチドを有機および無機材料基材に連結させ、それらは、複数の培養モデルにおいて、バイオフィルムマトリクス中のカーリー（ｃｕｒｌｉ）アセンブリを妨害することにより、尿路病原性大腸菌の付着を防止した。ＰＧＡＰ材料はまた、医療用インプラントに望ましい品質を有し：それらは哺乳類細胞に対し無毒性であり、それらは経時的に活性を維持する。我々が知る限りでは、これは材料コーティングにおける抗アミロイド活性の最初の証拠であり、ここで提示された結果は、様々な材料表面上でのバイオフィルム形成の防止におけるα－シートペプチドの有用性を確立する。

【0150】

結果
ＰＤＡは合成α－シートペプチドの表面への共有結合を可能にする
バイオフィルムは事実上全ての型の医療装置インプラント、いくつかの医学的に関連する材料イタニウム（ｉｔａｎｉｕｍ）（ＴｉＯ_２）、整形外科用インプラントのために使用される無機材料；ポリプロピレン（ＰＰ）、合成縫合糸においてしばしば使用される有機材料；ならびに、ポリウレタンおよびガラスに加えて、カテーテルにおいて最も一般的に使用されるシリコーン上で形成する。ＰＤＡの堆積は水溶液中アルカリ性ｐＨで自然に起こる^３３。清浄な基材をドーパミンＨＣｌの溶液（５０ｍＭ トリス中２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８．５）に２４時間、３００ｒｐｍで振盪しながら浸すことは、表面をＰＤＡの薄膜で完全にコートするのに十分であった。ペプチドグラフティングについては、１２５μＭの合成α－シートペプチド溶液（ＡＰ９０またはＡＰ１９３；Ｐ１およびＢＳＡは、対照として機能した）をＰＤＡコート基材に４時間２５℃で適用し、次いで４℃に一晩、約１８時間の総反応時間の間移動させた。ペプチド溶液を除去し、完全に形成したＰＧＡＰ（図７Ｂ）を使用前に滅菌水で完全にすすいだ。

【0151】

ペプチドのＰＤＡ表面へのグラフティングの成功を２つの方法により確認した。最初に比色分析アッセイ（ＢＣＡアッセイ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、カップリング効率および表面密度を推定した。９６ウェルＰＰマイクロタイタープレートをＰＤＡでコートし、以上のようにペプチドと共にインキュベートし、次いで、グラフティング後の溶液中のペプチドの濃度を適用した濃度と比較し、カップリング効率を決定した。ＡＰ１９３は、同じ濃度のＡＰ９０（４６％）よりも高いカップリング効率（６８％）を示し、おそらく、表面へのその物理吸着を促進するＡＰ１９３二量体配列中のより疎水性の側鎖の存在によるものであろう。よって、ＡＰ１９３ｄを、その後実験におけるグラフティングのためのα－シートペプチドとして選択した。カップリング後のＡＰ１９３の表面被覆率を、ＰＰプレート内のウェルの寸法および結合したペプチドの質量に基づき、約９μｍｏｌ／ｃｍ^２と推定した。次に、ＰＧＡＰ表面上のＡＰ１９３の到達性（９６ウェルＰＰプレート）を機能化ＰＧＡＰをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８－コンジュゲートＰａｃ５３抗体をもちいてプロービングすることにより決定し、これは、ＡＰ１９３ヘアピンの１つのストランドを認識する。プレートリーダーにおける免疫蛍光測定および蛍光顕微鏡法により、表面への十分なペプチド結合が明らかになった（図８Ａ、Ｂ）。ＡＰ１９３はＰＤＡなしであっても、ＰＰ表面へのいくらかの非特異的吸着を示したが、ＰＤＡによるプレコーティングは結合したペプチドの量を実質的に増加させた（図８Ａ）。これはＰＤＡにより、非特異的物理吸着およびペプチドアミン基とＰＤＡキノン間の特異的共有結合の両方が可能になったという事実に起因した。

【0152】

ＰＧＡＰ材料は細菌バイオフィルム形成を阻害する
ＰＰ表面上でのＰＧＡＰの良好な付着およびアベイラビリティは必ずしも、グラフトペプチドの活性を確実なものにせず、そのため、さらなる試験を実施して、ＰＧＡＰはバイオフィルム形成を、懸濁液中の合成α－シートペプチドと同様に、阻害することができたかどうか決定した。ＵＰＥＣバイオフィルムをＰＧＡＰ表面上で４８時間、ＥＭにおいて（２６℃、ＹＥＳＣＡブロス＋４％ＤＭＳＯ）頑強なアミロイド生成を引き出す（ｉｌｌｉｃｉｔ）ことが知られている条件下で培養し、次いでバイオフィルム付着度をいくつかの方法により評価した。最初に、蛍光大腸菌ＵＴＩ８９（ＳＬＣ－７１９株）^４１をＰＤＡ／ＡＰ１９３、ＰＤＡ／Ｐ１、ＰＤＡ単独で機能化された、またはコーティングなしの９６ウェルＰＰプレートにおいて培養し、得られたバイオフィルムを蛍光顕微鏡法およびクリスタルバイオレット（ＣＶ）染色を用いて評価した。図９Ａ－Ｄに示されるように、ＡＰ１９３ ＰＧＡＰは実質的にＰＰ表面の汚損を低減させ、ＰＤＡ単独またはランダムコイル対照ペプチド、Ｐ１で機能化したＰＤＡと比較して、プレートには非常に少ない細菌が付着した。これらの観察結果を、ＣＶ染色により確認し、これにより、ＡＰ１９３が機能性コーティング中に存在する場合の、著しく少ないバイオフィルム付着（図９Ｅ）ならびに裸眼で視認可能な汚損が非常に少ないこと（図９Ｆ）が証明された。共焦点顕微鏡法により、ＴｉＯ_２上で表示されたＰＧＡＰについての同様の特性が明らかになり；これらの材料はまた、ＰＤＡ単独、ＢＳＡによる機能化ＰＤＡ、無コートＴｉＯ_２と比較して減少したバイオフィルム被覆を示した（図１０）。

【0153】

医療ケア関連大腸菌感染は典型的には尿路内で現れ、それはシリコーンカテーテルの表面上でのバイオフィルム形成に関与する。そのため、シリコーンチューブは、ＰＧＡＰアプローチおよびバイオフィルム発生に関するその効果の評価のための臨床的に関連する基材として実行した。ＰＤＡコートシリコーン片を、蛍光大腸菌ＵＴＩ８９ ＳＬＣ－７１９の培養物中に４８時間（以上で記載されるカーリー（ｃｕｒｌｉ）誘導条件）浸し、それにより、シリコーンはバイオフィルムに包まれた。次いで各片を注意深くすすぎ、緩く結合した細胞を除去し、無菌ＰＢＳのチューブに移し、１分間超音波処理し、付着バイオフィルムを完全に脱離させた。プレートリーダーでの蛍光測定により各バイオフィルム懸濁液の細菌密度を決定し、ＡＰ１９３ ＰＧＡＰシリコーン上で形成されたバイオフィルムはＰＤＡ対照またはシリコーン単独上のものよりも著しく低密度であった（図１１Ａ）。さらに、ＰＧＡＰシリコーン材料は、抗生物質に対するバイオフィルムの感受性を増加させた。この場合、細菌密度アッセイと同じ培養条件を使用したが、Ｇｍ（３００μｇ／ｍＬ）をインキュベーションの終わり前６時間に試料の半分に添加した。細菌の抗生物質死滅は、ＰＤＡ単独を有する、またはコーティングなしのシリコーンとは対照的に、バイオフィルムをＰＧＡＰシリコーン上で増殖させた場合著しく増加した（図１１Ｂ）。

【0154】

長期機能性の試験として、ＰＧＡＰシリコーンをイムノアッセイにより探り、バイオフィルムがすでに材料表面上に発生した後のＡＰ１９３の到達性を決定した。バイオフィルム密度アッセイ（図１１Ａ）からのＰＧＡＰシリコーン片は事実上、超音波処理ステップ後付着細菌を有さなかったが、小片をさらに３０秒間新鮮ＰＢＳ中でボルテックスし、完全脱離を確保した。これらの「使用済み」材料を次いで微量遠心管に移し、そこで、それらをＥＬＩＳＡ様様式でＰａｃ５３一次抗体および抗ＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体でプロービングした。反応停止させた反応溶液の吸光度測定により、対照と比較して、ＰＧＡＰ材料内の表面上に残るかなりのＡＰ１９３が明らかになった（図１１Ｃ）。成熟バイオフィルムの発生および除去後での、ＰＧＡＰ表面上のアクセス可能な－おそらく、活性なα－シートペプチドの保持はこれらの材料の長期バイアビリティの可能性を示す。

【0155】

ＰＧＡＰ材料におけるＡＰ１９３の安定性をさらに評価するために、ＰＰプレートのいくつかのウェルをＰＤＡおよびペプチドを用いて調製し、次いで、材料を生理食塩水（ＰＢＳ）か、またはプールしたヒト血漿（ＰＨＰ；ＰＢＳ中５０％ｖ／ｖ）溶液中で３７℃にてインキュベートした。溶液を２４時間毎に最大５日まで、引き抜き、取り換え、ウェルをインキュベーションの終わりにＰａｃ５３抗体でプロービングし、表面上のアクセス可能なα－シートペプチドの量を定量した。ＡＰ１９３とＰａｃ５３の間の結合シグナルは、ＰＧＡＰ材料がＰＢＳまたはＰＨＰ中でインキュベートされたかに関係なく、経時的に減少しなかった（図１２Ａ）。結合シグナルの大きさは、ＰＢＳと比較して、ＰＨＰ中でインキュベートしたＰＧＡＰについては実質的に低く、血漿溶液中のタンパク質による表面結合ＡＰ１９３の非特異的遮蔽が示唆された。それにもかかわらず、ＰＧＡＰの表面上のα－シートペプチドは、インキュベーションの過程を通して、機能性結合部分を表示し続け、インプラント材料としてのそれらの長期使用の可能性が示される。実際、ＰＧＡＰの５ヶ月間、ＰＢＳ中４℃でのインキュベーション後であっても、ＡＰ１９３はＰａｃ５３により容易に検出可能であった。最後に、比色分析ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞生存率アッセイを適用し、ＰＧＡＰのマウス胚性線維芽細胞（３Ｔ３）との適合性を決定した。ポリスチレン組織培養プレートを前のようにＰＤＡでコートし、次いで、ＡＰ１９３およびＰ１を表面にグラフトさせた。３Ｔ３細胞を固定希釈で各調製ウェルに三連で適用し、２４時間３７℃で増殖させ、その後、ＭＴＴの適用、細胞溶解、および比色分析測定を実施した。ＰＧＡＰコーティングは、対照と比較して３Ｔ３細胞の生存率に著しくは影響せず（図１２Ｂ）、機能材料と潜在的患者宿主の間の良好な適合性が示された。

【0156】

考察
ここで提示した結果は、医用材料上でのグラフトさせた合成α－シートペプチドの効力を示し、それらの、様々な表面化学物質、例えば、シリコーンカテーテル、チタンインプラント、およびポリプロピレン装置への適応性が示される。ＰＧＡＰ材料は、尿路病原性大腸菌バイオフィルムのマトリクス内のカーリー（ｃｕｒｌｉ）含量を激減させ、強力な防汚効果につながった。ＰＧＡＰ表面上で増殖させたバイオフィルムは、不十分な接着および可溶性表現型を示し、ＰＤＡコーティングアプローチは、材料表面に対する特異性を有する抗アミロイド機能性を可能にした。それらの効力に加えて、ＰＧＡＰコーティングは、合成α－シートペプチドの分散または全身投与を超える複数の改善の可能性を示す。第１に、合成α－シートペプチドのＰＤＡへの共有結合は、表面を安定化し、機能分子のクリアランスを防止する。第２に、ＰＧＡＰ機能性の材料表面への特異的な制限は、治療効果を達成するのに必要とされるペプチドの量を低減させる。最後に、シリコーンＰＧＡＰ上でのバイオフィルムチャレンジ後のＡＰ１９３ペプチドの長期安定性により、これらの材料はそれらの最初の埋め込み後機能性を長く維持することが示される。

【0157】

材料および方法
ＰＧＡＰの生成
ＰＤＡによるコーティング前に、全ての材料を前に確立したプロトコルに従い、完全にクリーニングした^４３。簡単に言うと、チタンディスク（医療用、１”直径；Ｓｉｇｍａ）を、５分間、各々、アセトン、エタノール、および水中で超音波処理によりクリーニングし、次いで、蒸留水中で完全にすすいだ。シリコーンチューブをメスにより切断し約２ｍｍｘ２ｍｍ片とし、次いで７０％エタノール中で１０分間洗浄した。９６ウェルＰＰプレート（Ｇｒｅｎｉｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ； Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ）はすでに無菌であり、さらなるクリーニングに供されなかった。コーティングプロセスを開始するために、２ｍｇ／ｍＬのドーパミンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）を１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５に溶解し、基材に２４時間３００ｒｐｍで振盪させながら適用した。チタンおよびシリコーンについては、材料をドーパミン溶液を含むペトリ皿に浸し、その一方、９６ウェルプレートを、各ウェルを１６５μＬドーパミン溶液で充填することによりコートした。インキュベーションにより、溶液の暗色化および全ての表面上での薄い、褐色ＰＤＡフィルムの堆積から明らかなように、ドーパミンの重合につながった。次いで、基材を５回蒸留水ですすぎ、空気乾燥させ、真空チャンバ内３０℃で１時間、完全に乾燥させた。ＰＤＡを有さない対照基材もまた、同じプロトコルに従い、だが、ドーパミン溶液の代わりにトリス緩衝液中でのインキュベーションを用い作製した。

【0158】

全てのペプチドを、前に報告されたプロトコル^２４に従い合成し、精製し、凍結乾燥させたペプチドを適切な緩衝液に使用直前に再懸濁させた。ＡＰ１９３二量体化が溶液中で前に確立したプロトコル^４４を使用して起きた。簡単に言うと、０．２５ｍｇｏｆ凍結乾燥したＡＰ１９３単量体を４μＬのＤＭＳＯに溶解し、次いで、約３００μＬの５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中で希釈し、ペプチドの濃度を２５０μＭ（単量体濃度）とした。ＡＰ１９３ペプチド溶液を３７℃で２時間インキュベートし、４１２ｎｍでのＥｌｌｍａｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）による吸収の欠如から明らかなように、ジスルフィド結合の完全酸化が得られた。ＡＰ９０はジスルフィド結合を含まず、よって、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．５中２５０μＭの濃度まで再懸濁させた。同様に、ＢＳＡを、精製２ｍｇ／ｍＬストック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）から、リン酸カリウム緩衝液中０．３ｍｇ／ｍＬまで希釈した。ペプチド（またはＢＳＡ、示された場合）の溶液を清浄な、ＰＤＡコート基材に４時間２５℃で適用し、次いで、一晩４℃でおよそ１８時間の総反応時間の間反応させ続けた。９６ウェルＰＰプレートの場合、５０μＬのペプチド溶液を各ウェルにアリコートして、カップリングを開始させた。チタンディスクについては、ペプチド溶液の２０μＬスポットをディスクの特定領域にピペッティングし、インキュベーションを、蒸発を防止するために加湿チャンバ内で実施した。調製したシリコーン片を８０μＬペプチド溶液を有する無菌１．５ｍＬエッペンドルフチューブに浸した。ペプチド溶液を除去し、基材を３回滅菌水で洗浄した。ペプチド濃度（グラフティングおよび洗浄）を適用した濃度とＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、カップリング効率についての単純な計量を使用して比較した：

【数2】

【0159】

ペプチド安定性評価
抗ＡＰ１９３ポリクローナル抗体（Ｐａｃ５３、ウサギ由来）を使用して、ペプチドグラフティングの成功を確認し、ＰＧＡＰの安定性を決定した。グラフティング確認のために、９６ウェルＰＰプレート上のＰＧＡＰを３％ｗ／ｖＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ－２０）で１時間室温で振盪させながらブロックし、次いで、１００μＬ Ｐａｃ５３溶液（ＰＢＳ－Ｔ＋３％ＢＳＡ中１：１０，０００）を、１時間室温で振盪させながら適用した。３洗浄後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）４８８標識を有するウサギＩｇＧへの二次抗体（Ａｂｃａｍ； Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）を４５分間、室温で振盪させながら適用し、その後、蛍光顕微鏡法およびプレートリーダー測定による結合評価を実施した。安定性試験については、９６ウェルＰＰプレート上のＰＧＡＰを１００μＬのＰＢＳまたは１００μＬのプールしたヒト血漿（ＰＢＳ中５０％；Ｓｉｇｍａ）で充填し、被覆し、３７℃で振盪なしでインキュベートした。２４時間毎に、合計５日のインキュベーションの間、ＰＢＳおよび血漿を引き出し、置換した。サンドイッチＥＬＩＳＡを、Ｐａｃ５３および抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて実施し、インキュベーション中に表面から放出されたペプチドの量を推定した。高知のＡＰ１９３濃度（ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）により決定）は、同じプレートにおける標準として機能し、比色分析定量を、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ（商標）ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４クエンチング、続いて、プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）における吸光度測定を使用して実施した。

【0160】

「使用済み」ＰＧＡＰシリコーン片については、同じ抗体および試薬を以上のように使用した。簡単に言うと、使用済みシリコーン片を３０秒間新鮮ＰＢＳ中でボルテックスし、完全細菌脱離を確保した。次いでそれらを１．５ｍＬ微量遠心管に移し、そこで、それらを２００μＬのＢＳＡ溶液で一晩ブロックし（３％ｗ／ｖを含むＰＢＳ－Ｔ）、２時間室温で、２００μＬのＰａｃ５３ポリクローナル抗体（ＰＢＳ－Ｔ＋３％ｗ／ｖＢＳＡ中１：１０，０００）を用いてプロービングし、３回、５００μＬＰＢＳ－Ｔ中でボルテックスしながら洗浄し、２時間室温で２００μＬのウサギＩｇＧに対する二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてプロービングし、３回、５００μＬのＰＢＳ－Ｔ中でボルテックスしながら洗浄し、次いで２時間、２００μＬの１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ（商標） ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて発色させた。５０μＬの各試料を２連でマイクロタイタープレートに移し、反応を５０μＬの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させ、その後、プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）において吸光度測定を実施した。

【0161】

バイオフィルムチャレンジアッセイ
大腸菌ＵＴＩ８９ ＳＬＣ－７１９をＹＥＳＣＡブロス＋４％ＤＭＳＯ中で調製した^４５。ＰＰプレートに１２０μＬ／ウェルの希釈培養物を接種し、チタンディスクをペトリ皿に入れ、５ｍＬ希釈培養物に浸し、シリコーン片を４８ウェルポリスチレンプレートのウェルに入れ、４００μＬの希釈培養物に浸した。全てのバイオフィルムを振盪なしで４８時間２６℃で増殖させた。増殖後、浮遊細胞および培地を除去し、バイオフィルムを１回ＰＢＳですすいだ。ＰＰプレートを４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ（商標） Ｏｂｓｅｒｖｅｒ （Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ）倒立蛍光顕微鏡上で撮像し、一方、ＴｉＯ_２ディスクをガラススライド上に油を塗ったカバースリップを用いて載置し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０共焦点レーザー走査顕微鏡上で撮像した。ＣＶアッセイでは、１２０μＬクリスタルバイオレット染色液を各ウェルに１時間適用し、その後、除去し、ＰＢＳですすぎ、一晩乾燥させた。乾燥させた、ＣＶ染色バイオフィルムを１２０μＬの３０％酢酸に再懸濁させ、５５０ｎｍでの吸光度測定は、バイオフィルムバイオマスの粗測定として機能した。シリコーン付着性アッセイについては、バイオフィルム被覆シリコーン片を３００μＬの無菌ＰＢＳを含む１．５エッペンドルフチューブに移し、氷上で１分間超音波処理し、付着細菌を脱離させた。次いで、バイオフィルム懸濁液を黒色９６ウェルプレート中にアリコートし、４８８ｎｍでの蛍光（ＧＦＰ）は、付着細胞の数の推定値として機能した。シリコーン付着性アッセイにおける抗生物質チャレンジについては、バイオフィルムで被覆したシリコーン片を、インキュベーションの最終６時間中に、新鮮ＹＥＳＣＡ培地を、３００μｇ／ｍＬのＧｍと共に、またはそれなしで含むウェルに移した。次いで小片を１回２００μＬの無菌ＰＢＳ中ですすぎ、緩く付着した細菌、培地、および抗生物質を除去し、次いで小片を以上のように超音波処理し、付着細菌を脱離させた。バイオフィルム懸濁液を無菌ＰＢＳ中で段階希釈し、ドロッププレート法^４６に従い寒天プレート上に列挙させた。コロニー数を逆算し、各シリコーン片上の細菌の総数を決定し、次いで、これらのカウントを、シリコーン片の表面積に従い正規化した（ＣＦＵ／ｍｍ^２）。

【0162】

細胞毒性評価
ＰＧＡＰの哺乳類細胞との適合性を比色分析ＭＴＴアッセイを用いて評価した。マウス線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞；ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清＋１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン）で７０％集密度まで培養し、次いで、細胞をトリプシンにより脱離させ、血球計数器により計数した。その一方、無菌９６ウェルポリスチレン組織培養プレートを以上で記載される通りＰＤＡでコートし、ＡＰ１９３またはＢＳＡで機能化した。調製したプレートの滅菌水を用いた完璧な洗浄後、１５０μＬの、新鮮完全培地中の３Ｔ３懸濁液（５ｘ１０^４細胞／ｍＬ）を各ウェルに適用し少なくとも３つのウェルを１条件あたり調製した。１ｘ１０^６～１ｘ１０^３細胞／ｍＬの範囲の段階希釈物もまた、三連で同じプレートに添加し、検量線を提供し、アッセイの直線範囲を決定した。３７℃での２４時間の増殖後、３７．５μＬのＭＴＴ溶液（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド；ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、プレートをさらに４時間インキュベートした。次いで、細胞をカオトロピック緩衝液（２０％ＳＤＳ、５０％ＤＭＦ、１％酢酸、０．２％ＨＣｌ）を用いて溶解し、一晩インキュベートし、細胞内オキシドレダクターゼ酵素を放出させた。これらの酵素はＭＴＴを黄色から暗紫色に変換させ、それをプレートリーダー上、５７０ｎｍで吸光度により測定し；より高い吸光度はより大きな細胞生存率を示した。

【0163】

【表7】

【0164】

実施例３．ＳＯＢＡ：初期分子病態生理に関連するバイオマーカーを標的にする可溶性オリゴマー結合アッセイ
序論
アルツハイマー病（ＡＤ）は５０を超えるアミロイド疾患の１つであり、現在、米国では死亡原因の第６位であり、５８０万を超える米国人に影響を与え、有償および無償ケアにおいて２０５０までに＄１．１兆を超えるコストがかかると予測される。ＡＤはアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの、低分子量（ＬＭＷ）オリゴマーの不均一な動的分散への凝集により特徴付けられ、それは、高分子量（ＨＭＷ）、βシートリッチ前原線維にまで進行し、最終的には、特徴的なクロスβプリーツシート原線維の形成という結果となり、それは、ニューロンをコートし、アミロイド疾患の病理学的特徴となる。最近の研究により、ＬＭＷ可溶性オリゴマーはＡＤにおいて主毒物となり、それは疾患進行と強く相関するが、プラーク負荷はそうではないことが示唆される。興味深いことに、疾患症状は、Ａｂ凝集の後期（その時には、プラークがすでに沈着し、ニューロンへの主要ダメージが起きている）まで、提示し始めない。現在の検査は、前原線維および原線維が支配する疾患後期におけるＡＤを診断することができるにすぎず、これは介入して、疾患を効果的に治療するには遅すぎる。実のところ、後期Ａｂｅｔａ凝集体を標的にするいくつかの薬物候補は大規模、多施設臨床試験において成功していない。軽度認知障害（ＭＣＩ）ステージにおける初期診断シナリオの場合、＄７．９兆超が、医学的長期ケアのみで節約できるであろう。

【0165】

我々は、アルファ－シート二次構造を含む様々なアミロイド系において起こる最初期の構造変化に焦点をあてており、それは疾患の初期段階におけるＬＭＷオリゴマーの凝集および毒性に関与する主要成分であると我々は考える。分子レベルで起こる初期ミスフォールディングに焦点を当てることにより、我々は、凝集を阻害し、毒性を軽減し、毒性オリゴマーをインビボで捕捉し、ＡＤ患者においてアルファ－シート含有毒性種を症状が出る前に検出する診断薬として作用する安定なアルファ－シートペプチドを設計した。我々の診断テストは可溶性オリゴマー結合アッセイ（ＳＯＢＡ）と呼ばれ、それはＥＬＩＳＡ様アッセイであり、アルファ－シートペプチドがプレートに共有結合により連結され、抗体ではなく捕捉剤として使用される。我々は、９６ウェルポリスチレンプレートを発症前および症候性ＡＤ診断において使用するためのペプチド結合について機能化するためにポリドーパミン（ＰＤＡ）堆積を使用する新規技術を記載する。加えて、我々は、将来の治療介入の場合の改善尺度として使用することができるであろう二次診断的検証のためのアルファ－シートに基づくＰＥＴトレーサーを記載する。

【0166】

結果
ＳＯＢＡはアルファ－シート含量を、合成Ａｂｅｔａ調製物ならびに動物または患者由来試料の両方において、標準サンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルを使用し、アルファ－シートペプチドを捕捉剤として用いて測定するＥＬＩＳＡ様アッセイである。この関連で、ＳＯＢＡは、相補性により毒性種に結合することにより、適用試料におけるアルファ－シート構造の直接レポーターである。ＰＤＡを表面コーティング分子として使用し、アルファ－シートペプチドをプレートに共有結合により連結させる－Ｎｕｎｃイモビライザー（商標）アミノプレートの専売連結メカニズムの代わり－と、アルファ－シートペプチドの取り込み率が２１ｍｇ／ｍｌから１９６ｍｇ／ｍｌ結合総ペプチドまで増加した（図１３Ａ）。捕捉ペプチドの増加した密度により、１０ｎＭから１ｎＭの改善された感度が得られた（図１３Ｂ、Ｃ）。ＰＤＡコーティングなしで、ＴＭＢ比色分析検出の代わりに化学ルミネセンスを使用すると、検出が１０ｎＭから１００ｆＭまで減少した（図１３Ｄ）。ＰＤＡコーティングを化学ルミネセンスと組み合わせると、１ｆＭ－１００ａＭ検出へのさらなる減少につながった（図１３Ｅ、Ｆ）。よって、二量体アルファ－シート捕捉ペプチドの共有結合を用いたＰＤＡコーティングの付加および化学発光発生は以前の方法の感度を著しく上回り、ブランクでの検出の最低限界を有した。重要なことには、特異性は全てのプロトコルを通して、１００ｐＭで適用されたＡｂｅｔａ４２の単量体および原線維（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ）形態として維持され、１００ｐＭで適用された毒性オリゴマー（約７００，０００のＳＯＢＡシグナルになる）に比べ、バックグラウンドと同等な本質的にヌルシグナルとなった（＜１０，０００ＳＯＢＡシグナルは、２１，９４３の検出シグナルカットオフの下限未満である）（図１３Ｅ）。

【0167】

Ａｂｅｔａ４２毒性オリゴマーが添加されたＣＳＦ、血漿およびＰＢＳ中の捕捉剤のディスプレイを増加させるためにポリマーコーティングを介してプレートに共有結合により連結された二量体ＡＰ捕捉剤を使用するＳＯＢＡアッセイの性能を確立した後（図１３における結果は添加血漿である）、患者試料を試験した。特に、毒性オリゴマーのレベルは血液中で非常に低く、それらはＰＤＡコーティングおよび二量体捕捉剤の組み合わせなしでは検出できない。

【0168】

我々は、包括的な臨床評価に基づき分類した、３１０の個体由来の３７９の横断的および縦断的ヒト血漿試料を試験した：認知障害なしの対照（ＣＯ、ｎ＝２２１）、軽度認知障害ＡＤ型（ＭＣＩ、ｎ＝４５）、および中等度から重度のＡＤ（ｎ＝１０２）、および他の非ＡＤ認知障害（非ＡＤ ＣＩ、ｎ＝１１）。ＣＯ症例のうち、追跡臨床通院で、１１が「コンバーター」であり、ＭＣＩに進行し：８がＭＣＩ（ＡＤ型）に（ｎ＝１０、２の縦断的試料を含む）、３が非ＡＤ ＣＩに進行した。３７９の試料は集計分析のために独立したものとみなされた。

【0169】

ＣＯ、ＭＣＩおよびＡＤ群は同様の平均年齢およびほぼ等しい性別分布を有した。ＣＯ群にはＳＯＢＡ値の二峰性分布があり：（１）ネガティブＣＯ症例および（２）かなりのＳＯＢＡスコアを有し、後に、ＭＣＩ（我々は前臨床ＡＤと呼ぶ）、またはＰＣ－ＡＤに変わった個体（図１４Ａ）。ＳＯＢＡはＣＯとＭＣＩとＡＤ参加者の間で良好な区別を提供し、受信者動作特性分析により決定すると、カットオフ値は２８，２０７であった。このカットオフを超える値はＳＯＢＡポジティブと、未満の値はＳＯＢＡネガティブと考えた（図１４Ａ）。対応させたＳＯＢＡポジティブおよびネガティブ試料を区別するこのカットオフはＡβ４２オリゴマーが添加された血漿における検出限界と同様である（図１３Ｅ、Ｆ）。

【0170】

ＭＣＩおよびＡＤ試料（ｎ＝１４７）に対するＳＯＢＡと臨床診断の間の一致は優れており、食い違いはたった１つであった。この場合、臨床診断はＡＤであったが、血漿ＳＯＢＡ値は低かった（１２，３２３±３５０３）。我々はＳＯＢＡか臨床診断が誤っているかを断定的に決定することはできず；神経病理学的結果は入手不可能である。ＣＯ群由来の１３の試料が試験してポジティブであり、１２／１３が後年にＭＣＩに進行することが確認された。血漿（およびＣＳＦ）中での毒性オリゴマーの検出とＡＤ連続上にあることとの間に高い相関があり、対照とＭＣＩおよびＡＤ症例、ならびに症状が出る前に疾患を潜伏させる個体の間には頑強な区別があった。ＳＯＢＡを用いて得られた頑強な区別は毒性オリゴマーに対する高い特異性によるものであった。比較のために、総Ａｂｅｔａ４２濃度もまた、これらの個体についてのＣＳＦ中で測定した；ＣＳＦは通常、血液に比べ優れた結果を提供し、［Ａｂｅｔａ４２］はＭＣＩおよびＡＤの確認のために最も広く使用されるバイオマーカーである。図１４Ｂに示されるように、Ａｂｅｔａ４２レベルはＣＯ、ＭＣＩおよびＡＤ症例について著しく重なり、ＣＯをＭＣＩ／ＡＤから区別することはできない。よって、ＳＯＢＡは試料中の総Ａｂｅｔａ４２を用いて追跡せず、ここで開発した改善のために、ＳＯＢＡは選択的に、血液中の毒性オリゴマーを含むアルファ－シートを検出することができ、それは、前の方法を使用しては可能でなかった。比較のために、血液におけるＳＯＢＡは９９％感度および９９％特異性を提供し、非ＡＤ認知症症例はＳＯＢＡ－ネガティブであり、ＣＳＦ中のＡｂｅｔａ４２は６７％／６５％感度および特異性を提供することに注意されたい。

【0171】

我々はまた、配列ではなく、構造に基づくことを示すために、別の捕捉ペプチド（ＡＰ５３０）を使用して、併せて、セイヨウワサビペルオキシダーゼレポータータンパク質を含む単一抗体およびブロッカーを洗浄ステップにおいて使用して、ＳＯＢＡの一バージョン（次世代）を開発した。決定的に、ＰＤＡコーティングおよび二量体－ペプチドコーティングは保持されたが、試験自体は、高速で、含むステップは少ない。このバージョンのＳＯＢＡを用いたテスト（図１４Ｃ）は図１４Ａのものに相当する結果を提供したが、それらはまた、新規コホート、新鮮試料にまで及び、ドナーにおける民族の多様性を増加させた（試料２－３歳）。ここで再び、感度および特異性は優れている（シグナルの値はわずかに低く、というのも、新規バージョンは、オリジナルＥＬＩＳＡ様アッセイにおける二次抗体と関連する非特異的シグナルが少なくなるという結果になるからである）。加えて、これらの試料がより新しいものとなるにつれ、ＣＳＦ中のＡｂｅｔａ４２の検出のために改善された技術を利用した。図１４Ｄで見てわかるように、対照とＡＤ患者の間の重なりは残っており、これらの２つの群間では、この広く使用されるＡＤバイオマーカーを使用して、区別することはできない。

【0172】

ＳＯＢＡアッセイはアルツハイマー病と関連するアミロイドベータ毒性オリゴマーの検出に制限されない。それはまた、パーキンソン病（ＰＤ）と診断された患者由来のＣＳＦおよび血漿についても試験されている。この場合、２－抗体ＰＤＡ／二量体バージョンのアッセイが採用されたが、Ａｂｅｔａ抗体はαシヌクレイン抗体に置き換えられ、というのも、αシヌクレインの毒性オリゴマーがＰＤおよびレビー小体認知症（ＬＢＤ）と関連するからである。ＰＤ患者由来のＣＳＦ試料は非常に強いシグナルを提供した（ＰＢＳ中で１：１０希釈）（図１４Ｅ）。以上で記載される血漿研究からのＣＯおよびＡＤ被験体由来のＣＳＦ試料を評価し、それらはＳＯＢＡネガティブであった。ＡＤ試料はαシヌクレイン抗体についてネガティブであったが、それらはＡＤ、ＣＳＦおよび血漿の両方に対して、Ａｂｅｔａ抗体を使用してポジティブであった。対照群における被験体のいく人かが、剖検を実施した後最大１６年までにＰＤおよび／またはＬＢＤと診断されたこともまた興味深かった。剖検所見を見た後、我々は、彼等が認知障害ではなく、ＳＯＢＡ－ポジティブであった場合、彼等の保存ＣＳＦを試験した。これらの結果は、ＳＯＢＡは、対照およびＡＤ症例由来のＰＤとＬＢＤを区別することができ、ならびに症状が出る前に毒性オリゴマーを検出することができることを示す。

【0173】

我々はまた、ＰＥＴ画像法により毒性可溶性オリゴマーを追跡するために放射性トレーサを有するアルファ－シートペプチドを設計した。我々のアルファ－シートペプチドは小さく、非常に可溶性であり（＞５０ｍｇ／ｍｌ）、血液脳関門を横切って容易に輸送される。それらは凝集傾向ではなく、動物にとって無毒性である。この点を考慮して、我々はインビボでのＰＥＴスキャンのための^１８Ｆ－修飾アルファ－シートペプチドを使用する検出診断を開発している。アミロイドプラーク（例えばフロルベタベン）を特異的に認識する他のアミロイドＰＥＴ－トレーサーに比べ、我々のアルファ－シートＰＥＴ－トレーサーは脳内の毒性、可溶性オリゴマーを標的にする。

【0174】

図１５は、左にＷＴ対照マウスおよび右にトランスジェニック発症前ＡＤマウスを示す。注射の送達、投与およびタイミングおよび撮像は最適化されていないが、トレーサーが右の動物において確認でき、それは嗅球内にあると考えられる。別の研究は最近、Ａｂｅｔａオリゴマーと関連する別のＡＤトランスジェニックマウス系統における嗅覚の異常およびマウスの末梢嗅覚ニューロンに影響する匂い検出を同定した。

【0175】

考察
アミロイド疾患のための診断法
上記ＳＯＢＡを用いて対処される疾患領域に焦点を当てると、ＡＤは治療の未来に困難な経路を提示し、というのも症状の提示はしばしば、生物学的損傷が起きた後、数十年であるからである。これにより、介入が有効となるには、それは個人または彼等の医者が疾患が存在している可能性があると示す前数十年に起こるべきであることが意味される。よって、ＡＤ治療における最も重要な因子は初期検出である。ＡＤのための診断テストが提案されており、何十年も調査されているが、予後能力の観点から成功はほとんど、または、全くない。ほとんどのテストが、原線維または高分子量凝集体がすでに形成されたことを示すという点で、予想にすぎない。プラークは時として症状の提示よりも早く見られることがあるが、疾患過程においてうまく介入するには依然として遅すぎる。というのも、低分子量凝集体が毒性原因となり、何年もかけてダメージを与えているからである。さらに、認知正常人が何の症状もなくプラークを有する可能性もある。初期毒性種を検出することができる頑強なアッセイのための他の使用としては、前臨床動物試験（上記二量体阻害剤について実施される）におけるそれらの使用、ヒトにおける治療の効果をモニタするためのそれらの使用、およびトライアルにおける臨床エンドポイントとしてが挙げられる。

【0176】

パーキンソン病は非常に類似している。それは、その初期段階では正確に診断することができず、代わりに症状が重篤になってから発見される。しかしながら、この場合、早期発見と共に使用することができる治療がいくらかあるが；しかしながら、真に疾患修飾治療が依然として望ましく、そのためには、初期診断法が重要である。ＳＯＢＡ技術の２つの適用はどのようにして初期、発症前検出が可能であるかを強調し、後期における頑強な、非侵襲的診断は、現在採用されている、よりコストのかかる、より主観的な評価およびより侵襲性のバイオマーカー（ＣＳＦ、ＰＥＴ画像法）よりも好ましいであろう。というのも、特に、それらはアミロイド線維およびプラークが存在する疾患のより遅い段階について報告するからである。その結果として、我々はまた、ＰＥＴ画像法を介して毒性可溶性オリゴマー（プラーク形成に先行する）を追跡するための放射性トレーサを有するアルファ－シート設計物を設計した。

【0177】

材料および方法
アルファ－シートペプチドの合成
ＳＯＢＡのためのＡＰ１９３捕捉ペプチド（Ａｃ－ＲＧＥｍＮｙＦｗＭＮＥＹＹＧＷｔＭｎＣｋＭＧＲ－ＮＨ２）（配列番号８）を、Ｒｉｎｋアミド樹脂上でＦｍｏｃ化学を用い、手動標準固相ペプチド合成およびＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ化学を使用して、ならびに、マイクロ波ペプチド合成を介してＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅペプチドシンセサイザー（ＣＥＭ）およびＯｘｙｍａ／ＤＩＣ化学を使用して生成させた。樹脂に結合したペプチドを開裂させ、側鎖をＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏ（９２．５：２．５：２．５：２．５）で脱保護し、冷エーテルを用いて沈殿させた。粗ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）により、＞９８％純度まで精製した（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ５μｍ Ｃ１８ ３００Ａ ＬＣ分取カラム２５０ｘ２１．２ｍｍ）。精製ペプチドの質量および配列を質量分析（ＭＳ）により、Ｂｒｕｋｅｒ Ｅｓｑｕｉｒｅイオントラップエレクトロスプレー質量分析計上で確認した。ペプチドのα－シート構造を円二色性（ＣＤ、Ｊａｓｃｏ Ｊ７２０）により確認した。ペプチドを凍結乾燥し、－８０℃で保存した。

【0178】

合成Ａβ４２オリゴマー標準の調製
Ａβ４２（残基１－４２、Ａβとも呼ばれる）をＥＲＩ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＬＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＣＴ）から入手した。我々はＳｈｅａ ｅｔ ａｌ． （２０１９）の手順に従い、それらは以下に記載される。Ａβをヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を使用してデシードし（ｄｅｓｅｅｄｅｄ）、アリコートした。アリコートをＨＦＩＰ中１ｍｇ／ｍｌで、超音波処理器浴内で５分間、続いて、２５分氷上で超音波処理し、次のラウンドを５分超音波処理、続いて、最終ラウンドを２５分氷上とした。次いで、得られた溶液をＮ_２ガスの穏やかな流れ下で吹き飛ばし、ＳｐｅｅｄＶａｃ（商標）濃縮器（Ｓａｖａｎｔ ＩＳＳ１１０， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２時間低温（無加温）設定で乾燥させ、これにより、単量体化Ａβフィルムが得られ、これを－２０または－８０℃で保存した。

【0179】

凝集アッセイおよび合成毒性オリゴマーのためのＡβストックを、フィルムアリコートを室温で（ＲＴ）５分間平衡化させることにより調製した。次いで、フィルムを、濾過した６ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１１．６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて０．７５ｍｇ／ｍＬまで溶解させ、はじいてフィルムが溶解したことを確認し、続いて、超音波処理を５分間実施した。この溶液を０．２２μｍ Ｃｏｓｔａｒ酢酸セルロース遠心分離機フィルタ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）にガラスピペットを使用して移し、７，０００ｒｐｍ（約４０００ｘｇ）で２分間遠心分離した。次いで、この溶液を、ガラスピペットを使用して、エッペンドルフ微量遠心機チューブ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に移し；ペプチド濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２８０ｎｍで１４９０Ｍ^－１ｃｍ^－１の消衰係数を使用して測定した。得られた原液を２５℃で４時間静置させ、その後、それを直ちに使用し、または４℃で必要になるまで（１週以下）保存した。ストックＡβを、２４時間、２５℃でのプレインキュベーション直前に、７５μＭまで、ｐＨ７．４リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭリン酸塩、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、および２．７ｍＭ ＫＣｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、前に記載されるように（１３）、凝集の誘導期中に、希釈し、毒性オリゴマーを得た。試料を、インキュベーション後、氷上に置き、保存した。試料を２５μＭまで希釈し、その直後に、ＣＤを実施し、α－シートスペクトルが得られたことを確認し、それは平らな、ヌルスペクトルにより特徴付けられる。平らなスペクトルが得られる。というのも、アルファ－シート構造は、局所α_Ｌおよびα_Ｒキラリティー間で交互に並ぶアミノ酸から構成されるからであり、それはＣＤによるシグナルのキャンセルにつながる。さらに、これらのオリゴマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により特徴付ける前の研究により、このプロトコルを用いて作成された毒性オリゴマーは、六量体および十二量体の混合物であることが示されたが、ＳＥＣは低分解能法であり、これらの割り当ては確定的なものではなく、例えば、それらは、それらは六量体ではなく五量体である可能性もあることに注意されたい。ＳＥＣを実施し、オリゴマー標準は低分子量種を含み、より高い分子量のβ－シート前原線維を欠いていることを確認した。単量体および前原線維試料もまた調製し、ＳＯＢＡに適用し、α－シートオリゴマーへの結合の特異性を確認した。単量体をＮａＯＨ中で調製し、凝集を防止し、前原線維をＡβ４２のより長いインキュベーション、１２０時間から得た。ＳＥＣおよびＣＤにより、単量体試料は実際単量体であり、無秩序／ランダムコイル構造を含んだことを確認した。同様に、前原線維試料はβ－シートであり、より高い分子量の無毒性凝集体を形成した。

【0180】

可溶性オリゴマー結合アッセイ（ＳＯＢＡ）
血漿中の毒性オリゴマーの検出のためのＳＯＢＡの設計
前のアッセイは、分子のリジン連結のために予め機能化したＮｕｎｃイモビライザー（商標）プレートを、および、比色分析読み取りのために発色試薬を使用した。血漿中の低濃度のＡβ４２、および毒性オリゴマーはこのごく一部にすぎないという事実を考えると、我々は下記によりシグナルを増幅しようとした：（Ａ）比色分析ＴＭＢ試薬よりもむしろ化学発光発色試薬を使用する、および（Ｂ）我々の捕捉ペプチドのディスプレイを増加させるためにポリスチレンプレートのためのコーティングを開発し、これはシグナルをさらに増加させ、ＬＯＱをアトモル－フェムトモル（ａＭ－ｆＭ、１０^－１８－１０^－１５モル）まで降下させた。その結果、ＳＯＢＡについてのＬＯＱ（ａｇ／ｍＬ－ｆｇ／ｍＬ）は、抗体－捕捉剤を使用するほとんどのＥＬＩＳＡアッセイ（ｐｇ／ｍＬ－ｎｇ／ｍＬ）よりも、３桁（１０^３）を超えて高感度である。この感度は、血漿中のアルファ－シート毒性オリゴマーの量が低いことを考えると、重要であった。

【0181】

ポリドーパミン表面コーティングは共有結合により結合される捕捉ペプチドの量を劇的に増加させ、取り込みはＮｕｎｃプレート上で２１μｇ／ｍｌから、ＰＤＡを用いると１９６μｇ／ｍＬまで増加した（図１３Ａ）。加えて、ＰＤＡ機能化はシグナルを、ＰＢＳ中の１ｎＭ適用Ａβ４２オリゴマーについて、ＴＭＢ比色分析プロトコルを使用して、バックグラウンドレベルから１０ｘバックグラウンドまで増加させた（図１３Ｂ、Ｃ）。ＰＤＡ機能化なしでの、化学発光試薬単独の導入は、ＬＯＤを１００ｆＭまで低下させた（ＰＢＳ中）が、統計学的有意性が維持された（図１３Ｄ）。化学ルミネセンスの使用およびＰＤＡコーティングによる我々のＡＰ１９３捕捉ペプチドのディスプレイの増加の組み合わせは、ＬＯＤを１０ａＭまで減少させ、「オリジナル」ＴＭＢプロトコルを９－桁だけ著しく上回った（ＰＢＳおよびＣＳＦ中）（図１３）。血漿中での性能を決定するために、商業用プールヒト血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｎｏｖｉ， ＭＩ）のＡβ４２オリゴマー添加試料を評価した。統計的に有意なシグナル（ブランクに対する）を血漿中１ｆＭまで観察した（図１３Ｅ）。重要なことには、特異性が全てのプロトコルを通して維持された；１００ｐＭの高濃度で適用された単量体および前原線維型（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ）Ａβ４２は、添加血漿について示されるように、バックグラウンドと同等のシグナルという結果となった（図１３Ｅ）。図１３ＦはＳＯＢＡ値対Ａβ４２オリゴマーの濃度のｌｏｇ－ｌｏｇプロットを示し、ＬＯＤは１ｆＭ（約４．５１ｆｇ／ｍｌ）であり、これは２１，９４３のＳＯＢＡシグナルに対応する。比較のために、毒性オリゴマー添加ＣＳＦのＬＯＤはより低く、０．１ｆＭ（または１００ａＭ）である。ＳＯＢＡの開発および使用における詳細なステップは以下に提示される。

【0182】

合成Ａβ ＴＭＢ（比色分析）プロトコル－較正
ストックＡβ（以上で記載される）を各実験について希釈し、ＰＢＳ中７５μＭでプレインキュベートした。我々は、我々のＡＰ１９３α－シート設計物を全てのＳＯＢＡ実験に対する捕捉剤として使用した。ＡＰ１９３を最初にＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて溶解し３６ｍＭとし、次いでＣＯ_３ ^２－緩衝液（ｐＨ９．６）を用いて３６μＭまで希釈し、３７℃水浴インキュベーター中で２時間インキュベートし、ペプチドを二量体させた。これによりずっと良好な捕捉が提供され、シグナルが著しく促進される。１００μＬのＡＰ１９３を、Ｎｕｎｃイモビライザー（商標）アミノ９６－ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ， ＵＳＡ）における全ての陽性対照ウェルについて、１ウェルあたりでプレーティングした。対照ブランクウェルを、ＡＰ１９３の付着をブランク炭酸塩緩衝液により置き換えたことを除き、全てのステップに従い、同時に調製した。ＡＰ１９３を表面に、振盪させながら室温で（ＲＴ）２時間カップリングさせた。次いで、ウェルを吸引し、３００μＬ ＰＢＳ－Ｔ（０．０１体積％ Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で５回洗浄した。次いで、１５０μＬの１０ｍＭエタノールアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ウェルあたりでプレーティングし、室温で２時間振盪することにより、表面上の未反応部位を反応停止させるために使用した。次いで、ウェルを吸引し、３００μＬ ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。プレインキュベートしたＡβ（７５μＭ）を次いで、ＰＢＳ、ＣＳＦ、または血漿中、段階希釈し（最高濃度で開始し、その後、同じチューブ内で次の最高濃度まで希釈し）較正のための関連作業濃度とし、１００μＬを１ウェルあたりで適用し、１時間、２５℃で振盪なしでインキュベートした。次いで、ウェルを吸引し、３００μＬ ＰＢＳで３回洗浄した。一次６Ｅ１０抗Ａβ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）の０．２μｇ／ｍｌ希釈を３％ＢＳＡを含むＴＢＳ－Ｔ（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１体積％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．６）中で調製し、この溶液の１００μＬを１ウェルあたりでプレーティングし、振盪させながら室温で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを吸引し、３００μＬ ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬの、３％ＢＳＡを含むＴＢＳ－Ｔ中の、二次ヤギ抗マウスＨＲＰ－コンジュゲート抗体（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）の０．０８μｇ／ｍｌ希釈物を１ウェルあたりでプレーティングし、振盪させながら室温で４５分間インキュベートし、その間、ＨＲＰの退色を回避するために箔で被覆した。次いで、ウェルを吸引し、３００μＬ ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬの、室温テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１ウェルあたりでプレーティングし、振盪させながら室温で１５分間インキュベートし、その間、箔で被覆した。反応を１００μＬの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで、多モードプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にて測定した。

【0183】

化学発光プロトコル－較正
このプロトコルにおける全てのステップは、ＴＭＢプロトコルと、一次抗体の添加に至るまで同じであった。この場合、一次６Ｅ１０抗Ａβ抗体の０．１μｇ／ｍｌ希釈物（０．２μｇ／ｍｌの代わり）を、３％ＢＳＡを含むＴＢＳ－Ｔ中で調製し、この溶液の１００μＬを１ウェルあたりでプレーティングし、振盪させながら室温で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを吸引し、３００μＬ ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬの、３％ＢＳＡを含むＴＢＳ－Ｔ中での二次ヤギ抗マウスＨＲＰ－コンジュゲート抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の０．０４μｇ／ｍｌ希釈物を１ウェルあたりで適用し、振盪させながら室温で４５分間インキュベートし、その間、ＨＲＰの退色を回避するために箔で被覆した。次いで、ウェルを吸引し、３００μＬ ＰＢＳで６回洗浄した。１１５μＬの室温ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を１ウェルあたりでプレーティングし、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ多モードプレートリーダーにおいて振盪させながら３０秒間インキュベートし、その後、ルミネセンスを１秒積分時間を用いて読み取った。化学ルミネセンスを使用したプロットにおけるＳＯＢＡ値は生の、未較正ルミネセンス読み取り値である。

【0184】

ポリドーパミン＋化学発光プロトコル－較正
ドーパミンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に溶解し、５ｍｇ／ｍｌとし、９６ウェルポリスチレンプレート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）において１ウェルあたり１５０μＬで直ちにプレーティングした。ドーパミンＨＣｌはこのｐＨで迅速に重合してポリドーパミン（ＰＤＡ）を形成し、プレートの壁上に薄膜コーティングを形成した。この溶液を室温で振盪させながら一晩２０時間、インキュベートした。翌朝、ＡＰ１９３をＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶解させ３６ｍＭとし、次いでＣＯ_３ ^２－緩衝液（ｐＨ９．６）を用いて３６μＭまで希釈し、３７℃水浴インキュベーター中で２時間インキュベートし、ペプチドを二量体させ、シグナルを増強した。次いで、ポリドーパミンコーティングを有するプレートのウェルを吸引し、３００μＬのＤＩ Ｈ_２Ｏで５回、攻撃洗浄を用いて洗浄し、残留ポリドーパミンを除去し、３７℃で１時間乾燥させた。次いで１００μＬのＡＰ１９３を１ウェルあたりで、ＰＤＡコートポリスチレンプレートにおける全ての陽性対照ウェルについてプレーティングし、振盪させながら室温で２時間カップリングさせた。次いで、ウェルを吸引し、３００μＬ ＰＢＳ－Ｔ（０．０１体積％Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で５回洗浄した。次いで、１５０μＬの１０ｍＭエタノールアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ウェルあたりでプレーティングし、室温で２時間振盪することにより、表面上の未反応部位を反応停止させるために使用した。次いで、ウェルを吸引し、３００μＬ ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。プロトコルの残りは上記化学発光較正プロトコルに、０．１ｍｇ／ｍｌ ６Ｅ１０一次抗体濃度および０．０４ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧ二次濃度を維持しながら、従った。

【0185】

ＳＯＢＡを用いた血漿試料の処理
ここで提示した全てのヒト血漿試料は、ＰＤＡ＋化学発光プロトコルを使用した。上記条件を確立した後、ＰＤＡコートプレートを、ポリドーパミン＋化学発光プロトコル－較正セクションにおいて提供されたプロトコルによって調製した。プレート調製後、ＣＯおよびＡＤ血漿試料（凍結－解凍サイクルの繰り返しを回避するために、１１５μＬの試料に予めアリコートした）をエタノールアミン反応ステップ中、５分間３７℃で解凍した。解凍後、全ての試料を３２００ｘｇで１５分間４℃で遠心分離し、血小板を除去した。１００μＬの各血漿試料を１ウェルあたりでプレーティングし、プレートを２５℃で１時間振盪なしでインキュベートした。次いで、ウェルを吸引し、３００μＬ ＰＢＳで３回洗浄した。最後に、化学ルミネセンスのためのプロトコルを採用した。生ルミネセンス値が三連で評価した試料について報告される。あらゆる場合において、試料を２の異なる日に評価し（１日に単一ウェル、および、別日に二つ組、またはその反対）、確実に、結果が再現可能なものとなるようにした。また、ほとんどの試料を、数ヶ月の期間にわたって試験し、シグナルの安定性を試験した。商業的起源のプール血漿または単一－ドナー小児血漿を全てのプレート上で陰性対照としてインキュベートした。

【0186】

ＳＯＢＡにより評価したアルツハイマー病血漿試料
３１０の研究参加者由来の３７９の血漿および対応ＣＳＦ試料を、Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇｒｏｕｐ （ＢＮＧ） Ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ［以前は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＷ ＡＤＲＣ）バイオバンク］から、ＶＡ Ｐｕｇｅｔ Ｓｏｕｎｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍおよびその調査員Ｄｒ． Ｅｌａｉｎｅ ＰｅｓｋｉｎｄとＤｒ． Ｖａｌｅｒｉｅ ＤａｇｇｅｔｔへのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎの間の物質移動合意書を介して、入手した。

【0187】

ＳＯＢＡにより評価したパーキンソン病ＣＳＦ試料
ＣＳＦおよび血液試料を、ワシントン大学メディカルセンター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）でパーキンソン病のための脳深部刺激（ＤＢＳ）電極の埋め込みを受けている参加者から入手した。

【0188】

ＰＤ ＣＳＦテストのためのＳＯＢＡプロトコル
ＣＳＦ ＳＯＢＡ－ＰＤプロトコルを、血漿ＳＯＢＡ－ＡＤプロトコルと同じ方法を使用し、下記を変更して実施した：ＣＳＦを５分間３７℃で解凍し、ＰＢＳを用いて１：１０希釈し（すなわち、３０μｌのＣＳＦを、三連測定のために、２７０μｌのＰＢＳを用いて希釈し、３００μｌの最終体積とした）、その後、プレーティングした。我々は４Ｂ１２抗α－シヌクレイン抗体クローン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ８０７８０１）を０．０２５μｇ／ｍｌで一次抗体として使用し、ＢＰ－ＨＲＰｍ－ＩｇＧκ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｃ－５１６１０２）を０．０１μｇ／ｍｌで二次抗体として使用した。

【0189】

次世代ＳＯＢＡ
より低い変動係数を提供する可変性のより低いＳＯＢＡの別のより速いバージョンもまた開発した。これは、異なる捕捉ペプチド、ブロッキング剤、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼを含む単一６Ｅ１０抗Ａｂｅｔａ抗体を利用し、二次抗体の必要性が除去される。ＳＯＢＡのこのバージョンの結果が市販の血漿試料を使用して提示される。

【0190】

インビボでの毒性オリゴマーの検出のための^１８Ｆ－アルファ－シートペプチドトレーサー
我々は、^１８Ｆ－ベンゾエートをＡＰペプチド上の一級アミンに連結させた。放射標識を確認し、精製をＨＰＬＣを使用して実施した。この方法を用いた、放射標識において十分な収量が得られれば、我々は前進し、そうでなければ、我々はクリックケミストリーに基づく放射標識または他の標識プロトコルを検討する。

【0191】

マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。我々は、Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異（Ｔｇ２５７６）を有するトランスジェニックマウスを使用した。これらを、我々は、我々の化合物を用いた他の研究において採用した。これらのマウスは老化中、行動欠陥およびＡＤの生化学的特徴を示し、下記が挙げられる：著しい炎症性変化；高リン酸化Ｔａｕ凝集体；ニューロン損失；アミロイドプラークおよび不溶性Ａｂｅｔａ沈着物および１３月齢で検出可能なプラーク；ならびに学習および記憶テストにおける劣った成績。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒはこれらのマウスにおける研究に対する予定表を開発し、５ヶ月が、治療を開始するのに良好な時間であることを示した。しかしながら、これは、Ｔｇ２５７６マウスは、この時点でｌａｂテストでの著しく低減した文脈的記憶および増加したエラーを示すという事実に基づく。よって、我々は我々のトレーサーをマウスを用いて３月齢、ならびに５月齢で開始して試験したい。３ヶ月で開始すると、我々には疾患の初期段階、症状が存在し、不溶性プラークが形成される前の洞察が、総Ａｂｅｔａが増加し始める（脳でのオリゴマー化およびクリアリングの減少を示す）のと同じように、得られる。これらの所見に基づき、我々はマウスを、ＡＤ進行初期のトランスジェニックマウスを用いて、野生型（ＷＴ）症例と比べ、３月齢および５月齢で試験した。テストは^１８Ｆ－標識アルファ－シートペプチドのＷＴおよびＴｇ２５７６マウスの両方への注射を含み、我々のトレーサーの局在化の有無を確認するために、ＰＥＴスキャンを実施した。我々はトランスジェニックマウスの脳内でトレーサーの局在化を観察した。

【0192】

【表8】

【0193】

実施例４．アミロイド形成の阻害の改善のためのＡＰペプチドデンドリマー
序論
実施例１で記載されるように、アルファ－シートペプチドの阻害特性を改善する目的で、二量体を設計し、試験した。ここでは、目的は二量体を超えてデンドリマーまで移行することである。ポリ－リジンコア足場の周りに構築されたデンドリマーは、多価アルファ－シート－ヘアピンペプチドを作製するために開発した。これらのデンドリマーにより、複数のヘアピンペプチドが、単一担体コアに結合される。ポリ－リジン足場は一級アミン保護基の同時脱保護により生成され、単一直鎖ペプチドではなく、分枝ペプチドが生成される。ポリ－リジンコアに共有結合により結合させた４つのＡＰ５単量体ペプチドからなるデンドリマーの例を記載する。

【0194】

結果
ＡＰ５デンドリマーは図１６において概略的に示されるように、リジン残基に共有結合により連結された４つのＡＰ５単量体ヘアピンを含む。これにより８つのアルファ－シート結合ストランド／表面が可能になる。

【0195】

ＡＰ５デンドリマーを、ＰＤＡコーティングを有さないＴＭＢ ＳＯＢＡアッセイにおいてＡｂｅｔａ４２オリゴマーの結合について試験した（図１７）。効果は結合活性がより重要となる低濃度で＞４倍である。例えば、２．５ｎＭでは、デンドリマーと二量体シグナルの比は５．８である。Ａｂｅｔａ４２オリゴマーの結合の同じ評価を、この場合、化学ルミネセンスおよびＰＤＡコーティングを使用して実施することにより、シグナルはＡＰ５１０二量体を用いた場合よりずっとより高くなり、それらは１ｆＭで依然として非常に有意である（図１８）。

【0196】

材料および方法
ペプチド合成
標準手動Ｆｍｏｃペプチド合成を使用して、ＡＰ５－ＭＡＰＳペプチドを生成させ^１、ニンヒドリンテストを使用して、各アミノ酸間の適正なカップリングを確認した。各カップリングを、前の残基上の有効な一級アミンに関して４倍モル過剰で実施した。コアリジン残基は２つの有効な一級アミンを有する。そのため、デンドリマーの第１のリジンを付加した後、一級Ｎ末端アミンおよびＲ－基アミンの両方を反応させなくてはならず、そのため、第１のリジン上の有効なアミン基に関して４倍過剰を使用し、これは反応するたった１つの有効なアミンしか有さない樹脂に関しては８倍モル過剰である。第２のリジンを合成に付加した後、我々は樹脂に関して１６倍Ｍ過剰で反応させ、全てのその後のカップリングにより、ポリ－リジンコア上にＡＰ５配列を合成させる。コアリジンアミノ酸のＮ末端およびＲ基を同時に脱保護し、その後、デンドリマーコアのために、配列の次のアミノ酸、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）アミノ酸の付加を使用した。これにより、両方のＦｍｏｃ保護基がピペリジン塩基による除去される。

【0197】

ＳＯＢＡ
実施例３において以上で提供される方法をＡｂｅｔａ４２標準の調製およびＳＯＢＡプレートおよびアッセイプロトコルの調製のために使用した。

【0198】

【表9】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A)】

【図9B)】

【図9C)】

【図9D)】

【図9E)】

【図9F)】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

2024530409000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-03-18

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024530409000001.app

【国際調査報告】