特表 2024-530441 形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦ－β１）模倣エピトープを示す自己組織化ペプチド両親媒性物質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-21

(54)【発明の名称】形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦ－β１）模倣エピトープを示す自己組織化ペプチド両親媒性物質

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/495 20060101AFI20240814BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20240814BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20240814BHJP

   A61K 31/728 20060101ALI20240814BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240814BHJP

【ＦＩ】

C07K14/495 ZNA

C07K7/06

A61K38/08

A61K31/728

A61P19/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024505073

(86)(22)【出願日】2022-07-28

(85)【翻訳文提出日】2024-02-29

(86)【国際出願番号】 US2022074263

(87)【国際公開番号】W WO2023010082

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】63/227,097

(32)【優先日】2021-07-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＭＡＴＬＡＢ

(71)【出願人】

【識別番号】513208191

【氏名又は名称】ノースウエスタン ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】ＮＯＲＴＨＷＥＳＴＥＲＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】６３３ Ｃｌａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｅｖａｎｓｔｏｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６０２０８，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ユアン，シェルビー チー

(72)【発明者】

【氏名】ストゥップ，サミュエル アイ．

(72)【発明者】

【氏名】サザー，ニコラス エー．

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA18

4C084BA26

4C084BA36

4C084CA59

4C084DB60

4C084MA02

4C084MA23

4C084MA66

4C084MA67

4C084NA14

4C084ZA961

4C084ZA962

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA25

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA23

4C086MA66

4C086MA67

4C086NA20

4C086ZA96

4C086ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA11

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA32

4H045BA50

4H045CA40

4H045DA22

4H045DA86

4H045EA20

4H045FA33

(57)【要約】

生物活性形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦ－β１）模倣エピトープを含む自己組織化ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、ＴＧＦ－β１模倣エピトープを示すＰＡの高アスペクト比ナノ構造、ならびに軟骨の再生／修復及び／または変形性関節症及び他の筋骨格損傷及び疾患の治療を増強する方法が本明細書に提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物活性ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）を含む組成物であって、前記生物活性ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）が、
（ｉ）疎水性非ペプチドセグメントと、
（ｉｉ）βシート形成ペプチドセグメントと、
（ｉｉｉ）酸性ペプチドセグメントと、
（ｉｖ）ＴＧＦ－β１模倣エピトープペプチドと、を含む、前記組成物。

【請求項2】

前記ＴＧＦ－β１模倣エピトープペプチドが、ＣＥＳＰＬＫＲＱＣ（配列番号１）に対して３つ以下の置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ＴＧＦ－β１模倣エピトープペプチドが、ＣＥＳＰＬＫＲＱＣ（配列番号１）と１００％の配列類似性を含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記生物活性ペプチド両親媒性物質の前記疎水性非ペプチドセグメントが、アシル鎖を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記アシル鎖が、Ｃ_６～Ｃ_２０を含む、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記アシル鎖が、Ｃ１６を含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記生物活性ペプチド両親媒性物質の前記βシート形成ペプチドセグメントが、２～６つのＶ残基及びＡ残基の組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記生物活性ペプチド両親媒性物質及び荷電ペプチド両親媒性物質の前記βシート形成ペプチドセグメントが、ＶＶＶＡＡＡ（配列番号３）、ＡＡＡＶＶＶ（配列番号４）、ＡＡＶＶ（配列番号５）、ＶＶＡＡ（配列番号６）、ＡＡ、ＶＶ、ＶＡ、またはＡＶから選択される、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記生物活性ペプチド両親媒性物質の前記酸性ペプチドセグメントが、１～４つのＧｌｕ（Ｅ）残基及び／またはＡｓｐ（Ｄ）残基の組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記酸性ペプチドセグメントが、Ｅ、ＥＥ、ＥＥＥ、Ｄ、ＤＤ、ＤＤＤ、ＥＤ、ＤＥ、ＥＤＥ、ＤＥＤ、ＥＤＤ、及びＤＥＥから選択される、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

Ｃ１６－ＡＡＥＥ（配列番号７）、Ｃ１６－ＡＥＡＥ（配列番号８）、及びＣ１６－ＶＶＶＡＡＡＥＥＥ（配列番号９）から選択される前記生物活性ペプチド両親媒性物質の骨格ＰＡを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記ＴＧＦ－β１模倣エピトープペプチドが、ジスルフィドを介して環化されたＣＥＳＰＬＫＲＱＣ（配列番号１）である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記ＴＧＦ－β１模倣エピトープペプチドが、リジンリンカーによって前記骨格ＰＡに連結される、請求項１１に記載の組成物。

【請求項14】

（ｉ）疎水性非ペプチドセグメントと、
（ｉｉ）βシート形成ペプチドセグメントと、
（ｉｉｉ）荷電ペプチドセグメントと、を含む、希釈ＰＡを更に含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項15】

前記希釈ペプチド両親媒性物質の前記疎水性非ペプチドセグメントが、アシル鎖を含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記アシル鎖が、Ｃ_６～Ｃ_２０を含む、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記アシル鎖が、Ｃ１６を含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記希釈ペプチド両親媒性物質の前記βシート形成ペプチドセグメントが、２～６つのＶ残基及びＡ残基の組み合わせを含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項19】

前記希釈ペプチド両親媒性物質の前記βシート形成ペプチドセグメントが、ＶＶＶＡＡＡ（配列番号３）、ＡＡＡＶＶＶ（配列番号４）、ＡＡＶＶ（配列番号５）、ＶＶＡＡ（配列番号６）、ＡＡ、ＶＶ、ＶＡ、またはＡＶから選択される、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記希釈ペプチド両親媒性物質の前記酸性ペプチドセグメントが、１～４つのＧｌｕ（Ｅ）残基及び／またはＡｓｐ（Ｄ）残基の組み合わせを含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項21】

前記希釈ペプチド両親媒性物質の前記酸性ペプチドセグメントが、Ｅ、ＥＥ、ＥＥＥ、Ｄ、ＤＤ、ＤＤＤ、ＥＤ、ＤＥ、ＥＤＥ、ＤＥＤ、ＥＤＤ、及びＤＥＥから選択される、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

Ｃ１６－ＡＡＥＥ（配列番号７）、Ｃ１６－ＡＥＡＥ（配列番号８）、及びＣ１６－ＶＶＶＡＡＡＥＥＥ（配列番号９）から選択される前記希釈ペプチド両親媒性物質の骨格ＰＡを含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項23】

５％～９５％（ｍｏｌ）の生物活性ペプチド両親媒性物質と、５％～９５％（ｍｏｌ）の希釈ペプチド両親媒性物質と、を含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項24】

請求項１～２３の一項に記載の組成物と、生体適合性ポリマーと、を含む、複合材料。

【請求項25】

前記生体適合性ポリマーが、ヒアルロン酸である、請求項２４に記載の複合物。

【請求項26】

前記ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸粒子として存在する、請求項２５に記載の複合物。

【請求項27】

軟骨の修復または再生を促進する方法であって、軟骨の欠損または損傷を患う対象に、請求項１～２３の一項に記載の組成物または請求項２４～２６の一項に記載の複合物を投与することを含む、前記方法。

【請求項24】

変形性関節症または筋骨格損傷もしくは疾患を治療する方法であって、変形性関節症または筋骨格損傷もしくは疾患を患う対象に、請求項１～２３の一項に記載の組成物または請求項２４～２６の一項に記載の複合物を投与することを含む、前記方法。

【請求項25】

変形性関節症または筋骨格損傷もしくは疾患を予防する方法であって、変形性関節症または筋骨格損傷もしくは疾患のリスクが高い対象に、請求項１～２３の一項に記載の組成物または請求項２４～２６の一項に記載の複合物を投与することを含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月２９日出願の米国仮特許出願第６３／２２７，０９７号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
１０，５４４バイトのファイルサイズを有する、２０２２年７月２８日に作成された「３９６４８－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ」と題された、本明細書とともに出願されたコンピュータ可読配列表のテキストは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

生物活性形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦ－β１）模倣エピトープを含む自己組織化ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、ＴＧＦ－β１模倣エピトープを示すＰＡの高アスペクト比ナノ構造、ならびに軟骨の再生／修復及び／または変形性関節症及び他の筋骨格損傷及び疾患の治療を増強する方法が本明細書に提供される。

【背景技術】

【0004】

軟骨変性は、最も広範で治癒不能な筋骨格障害のうちの１つである。関節軟骨は、関節の動きに不可欠であり、常に高い負荷及び反復的な影響を受け、経時的に変形性関節症（ＯＡ）を含む変性を引き起こす^１。ＯＡは、米国の３２００万人を超える成人に痛みを伴う機能障害及び併存疾患をもたらし、この数は人口の高齢化に伴って増加すると予測されている^２。軟骨の再生は、既存の治療法では対処が不十分ないくつかの独特な生物学的及び機械的課題に直面しており、全国的に７２０億ドルの直接医療費をもたらす^２。現在、認可された疾患修飾ＯＡ薬はなく、現在の治療は一時的なものであり、再生的ではなく対症的であり、疾患の進行を遅らせるか、または避けられない関節全置換を延期させることを目的としている^３、４。マイクロフラクチャー術は、臨床的に軟骨を修復するためのゴールドスタンダードであり続けているが^５、最近、新しい生体材料及び成長因子戦略が有望的な工学的アプローチとして浮上している。しかしながら、これらの戦略はしばしば、非生分解性、低い機械的強度、及びオフターゲット免疫効果の問題に直面する^６、７。軟骨の再生を促進するために、生体材料足場は、軟骨形成分化及び維持に必要な生体分子シグナル伝達を促進しながら、関節環境の機械的負荷に耐えなければならない。

【発明の概要】

【0005】

生物活性形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦ－β１）模倣エピトープを含む自己組織化ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、ＴＧＦ－β１模倣エピトープを示すＰＡの高アスペクト比ナノ構造、ならびに軟骨の再生／修復及び／または変形性関節症及び他の筋骨格損傷及び疾患の治療を増強する方法が本明細書に提供される。

【0006】

いくつかの実施形態では、生物活性ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）を含む組成物であって、生物活性ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）が、（ｉ）疎水性非ペプチドセグメントと、（ｉｉ）βシート形成ペプチドセグメントと、（ｉｉｉ）酸性ペプチドセグメントと、（ｉｖ）ＴＧＦ－β１模倣エピトープペプチドとを含む、組成物が本明細書で提供される。

【0007】

いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１模倣エピトープペプチドは、ＣＥＳＰＬＫＲＱＣ（配列番号１）に対して３つ以下（例えば、３、２、１、０）の置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１模倣エピトープペプチドは、ＣＥＳＰＬＫＲＱＣ（配列番号１）に対して少なくとも５０％の配列類似性（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれらの間の範囲）を有する。

【0008】

いくつかの実施形態では、生物活性ペプチド両親媒性物質の疎水性非ペプチドセグメントは、アシル鎖を含む。いくつかの実施形態では、アシル鎖は、Ｃ_６～Ｃ_２０（例えば、Ｃ_６、Ｃ_８、Ｃ_１０、Ｃ_１２、Ｃ_１４、Ｃ_１６、Ｃ_１８、Ｃ_２０）を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、生物活性ペプチド両親媒性物質のβシート形成ペプチドセグメントは、２～６つのＶ残基及びＡ残基の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、生物活性ペプチド両親媒性物質及び荷電ペプチド両親媒性物質のβシート形成ペプチドセグメントは、ＶＶＶＡＡＡ（配列番号３）、ＡＡＡＶＶＶ（配列番号４）、ＡＡＶＶ（配列番号５）、ＶＶＡＡ（配列番号６）、ＡＡ、ＶＶ、ＶＡ、またはＡＶから選択される。

【0010】

いくつかの実施形態では、生物活性ペプチド両親媒性物質の酸性ペプチドセグメントは、１～４つのＧｌｕ（Ｅ）残基及び／またはＡｓｐ（Ｄ）残基の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、酸性ペプチドセグメントは、Ｅ、ＥＥ、ＥＥＥ、Ｄ、ＤＤ、ＤＤＤ、ＥＤ、ＤＥ、ＥＤＥ、ＤＥＤ、ＥＤＤ、及びＤＥＥから選択される。

【0011】

いくつかの実施形態では、生物活性ＰＡは、Ｃ１６－ＡＡＥＥ（配列番号７）、Ｃ１６－ＡＥＡＥ（配列番号８）、及びＣ１６－ＶＶＶＡＡＡＥＥＥ（配列番号９）から選択される骨格ＰＡを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１模倣エピトープペプチドは、ジスルフィドを介して環化されたＣＥＳＰＬＫＲＱＣ（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１模倣エピトープペプチドは、リジンリンカーによって骨格ＰＡに連結される。

【0012】

いくつかの実施形態では、本明細書の組成物（例えば、ナノ構造）は、（ｉ）疎水性非ペプチドセグメントと、（ｉｉ）βシート形成ペプチドセグメントと、（ｉｉｉ）荷電ペプチドセグメントと、を含む、希釈ＰＡを更に含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、希釈ペプチド両親媒性物質の疎水性非ペプチドセグメントは、アシル鎖を含む。いくつかの実施形態では、アシル鎖は、Ｃ_６～Ｃ_２０（例えば、Ｃ_６、Ｃ_８、Ｃ_１０、Ｃ_１２、Ｃ_１４、Ｃ_１６、Ｃ_１８、Ｃ_２０）を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、希釈ペプチド両親媒性物質のβシート形成ペプチドセグメントは、２～６つのＶ残基及びＡ残基の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、生物活性ペプチド両親媒性物質及び荷電ペプチド両親媒性物質のβシート形成ペプチドセグメントは、ＶＶＶＡＡＡ（配列番号３）、ＡＡＡＶＶＶ（配列番号４）、ＡＡＶＶ（配列番号５）、ＶＶＡＡ（配列番号６）、ＡＡ、ＶＶ、ＶＡ、またはＡＶから選択される。

【0015】

いくつかの実施形態では、希釈ペプチド両親媒性物質の酸性ペプチドセグメントは、１～４つのＧｌｕ（Ｅ）残基及び／またはＡｓｐ（Ｄ）残基の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、酸性ペプチドセグメントは、Ｅ、ＥＥ、ＥＥＥ、Ｄ、ＤＤ、ＤＤＤ、ＥＤ、ＤＥ、ＥＤＥ、ＤＥＤ、ＥＤＤ、及びＤＥＥから選択される。

【0016】

いくつかの実施形態では、希釈ＰＡは、Ｃ１６－ＡＡＥＥ（配列番号７）、Ｃ１６－ＡＥＡＥ（配列番号８）、及びＣ１６－ＶＶＶＡＡＡＥＥＥ（配列番号９）から選択される骨格ＰＡを含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、本明細書の組成物（例えば、ナノ構造）は、５％～９５％（ｍｏｌ）の生物活性ペプチド両親媒性物質と、５％～９５％（ｍｏｌ）の希釈ペプチド両親媒性物質とを含む。例えば、５～９５％は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれらの間の範囲（例えば、２５～７５％）を含み得る。

【0018】

いくつかの実施形態では、軟骨の欠損または損傷を患う対象に、本明細書のＰＡナノ構造組成物を投与することを含む、軟骨の修復または再生を促進する方法が本明細書で提供される。

【0019】

いくつかの実施形態では、変形性関節症または筋骨格損傷もしくは疾患を治療する方法であって、変形性関節症または筋骨格損傷もしくは疾患を患う対象に、ＰＡナノ構造組成物を投与することを含む、方法を本明細書で提供する。

【0020】

いくつかの実施形態では、変形性関節症または筋骨格損傷もしくは疾患を予防する方法であって、変形性関節症または筋骨格損傷もしくは疾患のリスクが高い対象に、ＰＡナノ構造組成物を投与することを含む、方法を本明細書で提供する。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】１Ａ～Ｄは、ＰＡ及びペプチド分子の化学構造。（ａ）骨格ＰＡ－ａ（配列番号７）（上）及び骨格ＰＡ－ｂ（配列番号８）（下）、式中、Ｒ＝Ｈ、（ｂ）ＴＧＦ－β１模倣ＰＡ、（ｃ）直鎖ｌｎＴＧＦ－β１ＰＡ、及び（ｄ）ＴＧＦ－β１模倣ペプチド（配列番号１）。

【図2】２Ａ～Ｊは、（ａ～ｆ）（ａ）骨格ＰＡ－ａ、（ｂ）ＴＧＦ ＰＡ－ａ、（ｃ）直鎖ｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａ、（ｄ）骨格ＰＡ－ｂ、（ｅ）ＴＧＦ ＰＡ－ｂ、及び（ｆ）直鎖ｌｎＴＧＦ ＰＡ－ｂナノ構造の低温ＴＥＭ顕微鏡写真。骨格ＰＡナノ構造は１００ｍｏｌ％で組織化し、エピトープナノ構造は、希釈骨格ＰＡと１０ｍｏｌ％で共組織化する。（ｇ～ｊ）各骨格ＰＡ－ａ（青の色合い）及び骨格ＰＡ－ｂ（赤の色合い）ベースの系上の骨格ＰＡ、ＴＧＦ ＰＡ、及びｌｎＴＧＦ ＰＡナノ構造の構造分析。（ｇ）ＳＡＸＳパターン、（ｈ）ＷＡＸＳパターン、（ｉ）ＣＤスペクトル、及び（ｊ）ＦＴＩＲスペクトル。全てのＰＡ溶液を、１２ｍＭの総ＰＡ、３０ｍＭのＮａＣｌ、及びｐＨ６．８の水に溶解した。（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。

【図3】３Ａ～Ｃは、ＴＧＦ－β１模倣ＰＡ組織化体の超分子動態の分析であり、ＴＧＦ ＰＡ分子は、希釈骨格ＰＡ分子と１０ｍｏｌ％で共組織化する。（ａ）ＴＡＭＲＡ標識ＴＧＦ－β１模倣エピトープを有するＴＧＦ ＰＡ－ａ及びＴＧＦ ＰＡ－ｂ組織化体の蛍光異方性。（ｂ）ＴＧＦ ＰＡ－ａ及びＴＧＦ ＰＡ－ｂ組織化体についての時間及び回帰線の関数としての^１Ｈ ＮＭＲスペクトルピーク強度。（ｃ）ＴＧＦ ＰＡ－ａ及びＴＧＦ ＰＡ－ｂ組織化体におけるプロトンの^１Ｈスピン格子緩和速度。

【図4】４Ａ～Ｆは、ＴＧＦ ＰＡで処理したヒト軟骨細胞におけるＳｍａｄ２活性化及び下流ＴＧＦ－β１経路分析。（ａ）インビトロで４時間、様々な共組織化体比及び濃度での、ＴＧＦ ＰＡ－ａ及びＴＧＦ ＰＡ－ｂで処理した軟骨細胞におけるＳｏｘ９、リン酸化Ｓｍａｄ２（ｐ－Ｓｍａｄ２）、Ｓｍａｄ２、及びアクチンのウエスタンブロット。ＴＧＦ－β１タンパク質（ｒｈＴＧＦ－β１）及び飢餓培地（Ｓｔｒｖ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照として使用した。（ｂ）リン酸化されるＳｍａｄ２の画分を示す、（ａ）からのウエスタンブロットデータの定量的密度測定分析（＊、対ｒｈＴＧＦ－β１；＃、対１０％ＴＧＦ ＰＡ－ａ ５０μＭ）。（ｃ）インビトロで４時間、Ｓｔｒｖ、ｒｈＴＧＦ－β１、ＴＧＦ模倣ペプチド、及び異なるＰＡ条件（骨格ＰＡ、ＴＧＦ模倣ＰＡ、及び直鎖ｌｎＴＧＦ ＰＡ）で処理した軟骨細胞におけるｐ－Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ２のウエスタンブロット。（ｄ）リン酸化されるＳｍａｄ２の画分を示す、（ｃ）からのウエスタンブロットデータの定量的密度測定分析（＊、対ｒｈＴＧＦ－β１；＃、対ＴＧＦ ＰＡ－ａ）。（ｅ）Ｓｔｒｖ、ｒｈＴＧＦ－β１、ＴＧＦ ＰＡ－ａ、及びＴＧＦ ＰＡ－ｂで処理した軟骨細胞におけるｐ－Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ２のウエスタンブロット（各々、汎ＴＧＦ－β中和抗体１Ｄ１１の添加なし（－）及びあり（＋））。（ｆ）リン酸化されるＳｍａｄ２の画分を示す、（ｅ）からのウエスタンブロットデータの定量的密度測定分析（＊、対ｒｈＴＧＦ－β１－１Ｄ１１；＃、ＴＧＦ ＰＡ－ａ β１－１Ｄ１１）。（＃、ｐ＜０．０５；＊＊／＃＃、ｐ＜０．０１、＊＊＊／＃＃＃、ｐ＜０．００１）。

【図5】５Ａ～Ｅは、ＴＧＦ ＰＡで処理したヒト軟骨細胞におけるＥＣＭタンパク質合成。（ａ）インビトロで３日間、Ｃｔｒｌ、ｒｈＴＧＦ－β１、ＴＧＦ模倣ペプチド、及び異なるＰＡ条件（骨格ＰＡ、ＴＧＦ模倣ＰＡ、及び直鎖ＴＧＦ ＰＡ）で処理した軟骨細胞におけるコラーゲンＩＩ、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、Ｓｏｘ９、及びアグレカンのウエスタンブロット。（ｂ）アクチンに正規化された各ＥＣＭタンパク質の画分を示す、（ａ）からのウエスタンブロットデータの定量的密度測定分析（＊、対ｒｈＴＧＦ－β１；＃、ＴＧＦ ＰＡ－ａ）。（ｃ～ｄ）インビトロで３日間、Ｃｔｒｌ、ｒｈＴＧＦ－β１、ＴＧＦ模倣ペプチド、及び異なるＰＡ条件（骨格ＰＡ、ＴＧＦ模倣ＰＡ、及び直鎖ＴＧＦ ＰＡ）で処理したヒト軟骨細胞の蛍光顕微鏡写真。細胞を、（ｃ）中のコラーゲンＩＩ（赤色）、（ｄ）中のアグレカン（赤色）、Ｆ－アクチン（緑色）、及びＤＡＰＩ（核、青色）について染色した。（ｅ）（ｃ～ｄ）のＩＣＣ顕微鏡写真からのコラーゲンＩＩ及びアグレカンの蛍光強度定量化（＊、対ｒｈＴＧＦ－β１；＃、ＴＧＦ ＰＡ－ａ）。（＊／＃、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊／＃＃＃、ｐ＜０．００１）。

【図6】６Ａ～Ｇは、ＰＡヒドロゲルの機械的特徴付け、及びヒドロゲルに封入されたヒト軟骨細胞の軟骨形成挙動。（ａ～ｃ）（ａ）骨格ＰＡ－ａのみ、（ｂ）ＴＧＦ ＰＡ－ａ、及び（ｃ）ｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａ ＰＡゲルのＳＥＭ顕微鏡写真。（ｄ）骨格ＰＡ－ａのみ、ＴＧＦ ＰＡ－ａ、及びｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａのＰＡゲルのひずみの関数としての貯蔵弾性率及び損失弾性率。流動ひずみ及び弾性率は、それぞれ、垂直線及び水平線によって示される。（ｅ～ｇ）ＰＡヒドロゲルに封入されたヒト軟骨細胞。インビトロで３日後の（ｅ）骨格ＰＡ－ａゲル、（ｆ）ＴＧＦ ＰＡ－ａゲル、及び（ｇ）ｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａゲルに封入された細胞の３次元ｚスタック再構築物。細胞を、Ｆ－アクチン（緑色）及び核（赤色）について染色し、Ｆ－アクチンと核との間のオーバーレイ領域は黄色として現れる。

【図7】それぞれ、１０、２５、５０、７５、及び１００ｍｏｌ％で、希釈骨格ＰＡ－ａ及び骨格ＰＡ－ｂと共組織化したＴＧＦ ＰＡ－ａ（上）及びＴＧＦ ＰＡ－ｂ（下）の低温ＴＥＭ顕微鏡写真。

【図8】それぞれ、１０、２５、及び５０ｍｏｌ％で、希釈骨格ＰＡ－ａ及び骨格ＰＡ－ｂと共組織化した直鎖ｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａ（上）及びｌｎＴＧＦ ＰＡ－ｂ（下）の低温ＴＥＭ顕微鏡写真。

【図9】１００ｍｏｌ％でのＴＧＦ模倣ペプチドの低温ＴＥＭ顕微鏡写真。（ｂ）１００ｍｏｌ％でのミセルＴＧＦ模倣ペプチド凝集体の動的光散乱。

【図10】１００ｍｏｌ％でのミセルＴＧＦ模倣ペプチド凝集体の動的光散乱。

【図11】１１Ａ～Ｂは、それぞれ、１０、２５、５０、７５、及び１００ｍｏｌ％で、希釈骨格ＰＡ－ａ及び骨格ＰＡ－ｂと共組織化したＴＧＦ ＰＡ－ａ（上）及びＴＧＦ ＰＡ－ｂ（下）の構造分析。ＴＧＦ ＰＡ共組織化体の（ａ）ＳＡＸＳパターン、及び（ｂ）ＷＡＸＳパターン。

【図12】１２Ａ～Ｂは、それぞれ、１０、２５及び５０ｍｏｌ％で、希釈骨格ＰＡ－ａ及び骨格ＰＡ－ｂと共組織化した直鎖ｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａ（上）及びｌｎＴＧＦ ＰＡ－ｂ（下）の構造分析。ｌｎＴＧＦ ＰＡ共組織化体及びペプチドミセル構造体の（ａ）ＳＡＸＳパターン、及び（ｂ）ＷＡＸＳパターン。

【図13】１３Ａ～Ｂは、それぞれ、１０、２５、５０、７５、及び１００ｍｏｌ％で、希釈骨格ＰＡ－ａ及び骨格ＰＡ－ｂと共組織化したＴＧＦ ＰＡ－ａ（上）及びＴＧＦ ＰＡ－ｂ（下）の二次構造分析。ＴＧＦ ＰＡ共組織化体の（ａ）円形二色性、及び（ｂ）ＦＴＩＲスペクトル。

【図14】１４Ａ～Ｂは、それぞれ、１０、２５、及び５０ｍｏｌ％で、希釈骨格ＰＡ－ａ及び骨格ＰＡ－ｂと共組織化した直鎖ｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａ（上）及びｌｎＴＧＦ ＰＡ－ｂ（下）の構造分析。ｌｎＴＧＦ ＰＡ共組織化体及びペプチドミセル構造体の（ａ）円形二色性、及び（ｂ）ＦＴＩＲスペクトル。

【図15】０．２ｍｏｌ％のＴＧＦ ＰＡ分子がＴＡＭＲＡ色素にコンジュゲートされ、ＴＧＦ ＰＡが希釈骨格ＰＡと１０ｍｏｌ％で共組織化される、ＴＧＦ ＰＡナノ構造のＴＥＭ顕微鏡写真。

【図16】１６Ａ～Ｂは、（ａ）ＴＧＦ ＰＡ－ａ及び（ｂ）ＴＧＦ ＰＡ－ｂにおけるプロトンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。エピトープリジン残基のメチレンプロトンは赤色で示され、アルキル鎖の末端炭素のメチルプロトンは青色で示される。

【図17】１７Ａ～Ｂは、（ａ）ＴＧＦ ＰＡ－ａ及び（ｂ）ＴＧＦ ＰＡ－ｂについてＴ２－ＮＭＲで使用されるプロトンの位置。エピトープリジン残基のメチレンプロトンは赤色で示され、アルキル鎖の末端炭素のメチルプロトンは青色で示される。

【図18】１８Ａ～Ｂは、様々な共組織化体比及び濃度で、ＴＧＦ ＰＡ－ａ及びＴＧＦ ＰＡ－ｂの生体適合性を試験する生存率アッセイ。ＴＧＦ－β１タンパク質（ｒｈＴＧＦ－β１）及び成長培地を対照として使用した。（ａ）２４時間インビトロで処理し、続いてカルセインＡＭ（緑色、生）及びヨウ化プロピジウム（赤色、死）について染色した、細胞の蛍光顕微鏡写真。（ｂ）細胞／ｍｍ^２に基づく細胞生存の定量化（＃、対培地対照）。（＊、ｐ＜０．０５；＃＃、ｐ＜０．０１）

【図19】１９Ａ～Ｂは、様々な共組織化体比及び濃度で、ＴＧＦ ＰＡ－ａ及びＴＧＦ ＰＡ－ｂの生体適合性を試験する生存率アッセイ。ＴＧＦ－β１タンパク質（ｒｈＴＧＦ－β１）及び成長培地を対照として使用した。（ａ）３日間インビトロで処理し、続いてカルセインＡＭ（緑色、生）及びヨウ化プロピジウム（赤色、死）について染色した、細胞の蛍光顕微鏡写真。（ｂ）細胞／ｍｍ^２に基づく細胞生存の定量化（＃、対培地対照；＾、対１０％ＴＧＦ ＰＡ－ａ １０μＭ）。（＊／＃／＾、ｐ＜０．０５；＊＊／＃＃／＾＾、ｐ＜０．０１；＊＊＊／＃＃＃／＾＾＾、ｐ＜０．００１）。

【図20】２０Ａ～Ｂは、様々な濃度で、異なるＰＡ条件（ＴＧＦ模倣ペプチド、骨格、ＴＧＦ模倣ＰＡ １０ｍｏｌ％共組織化体、及び直鎖ｌｎＴＧＦ ＰＡ １０ｍｏｌ％共組織化体）の生体適合性を試験する生存率アッセイ。ＴＧＦ－β１タンパク質（ｒｈＴＧＦ－β１）及び成長培地を対照として使用した。（ａ）２４時間インビトロで処理し、続いてカルセインＡＭ（緑色、生）及びヨウ化プロピジウム（赤色、死）について染色した、細胞の蛍光顕微鏡写真。（ｂ）細胞／ｍｍ^２に基づく細胞生存の定量化。（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）

【図21】２１Ａ～Ｂは、様々な濃度で、異なるＰＡ条件（ＴＧＦ模倣ペプチド、骨格、ＴＧＦ模倣ＰＡ １０ｍｏｌ％共組織化体、及び直鎖ｌｎＴＧＦ ＰＡ １０ｍｏｌ％共組織化体）の生体適合性を試験する生存率アッセイ。ＴＧＦ－β１タンパク質（ｒｈＴＧＦ－β１）及び成長培地を対照として使用した。（ａ）３日間インビトロで処理し、続いてカルセインＡＭ（緑色、生）及びヨウ化プロピジウム（赤色、死）について染色した、細胞の蛍光顕微鏡写真。（ｂ）細胞／ｍｍ^２に基づく細胞生存の定量化。（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）

【図22】アクチンに正規化されたＳｏｘ９発現を示す図４ａからのウエスタンブロットデータの定量的密度測定分析（＾、対１０％ＴＧＦ ＰＡ－ｂ １０μＭ；°、対２５％ＴＧＦ ＰＡ－ｂ５０μＭ）。（°／＾、ｐ＜０．０５；＾＾、ｐ＜０．０１）。

【図23】インビトロで３日後の、ゲルに封入された細胞からのＬＤＨ放出。

【図24】２４Ａ～Ｆは、骨格ＰＡ－ａ（ａ、ｄ）、ＴＧＦ ＰＡ－ａ（ｂ、ｅ）、及びｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａゲル（ｃ、ｆ）のレオロジー分析。（ａ～ｃ）０～１００ｒａｄ／ｓの範囲の角周波数の貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ”）を示す周波数掃引。（ｄ～ｆ）０～１００％の範囲の剪断ひずみにおける貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ’’）を示すひずみ掃引。

【図25】２５Ａ～Ｂは、ハイブリッドＴＧＦ ＰＡゲルの機械的特性。架橋ＨＡ粒子の濃度を変化させたＴＧＦ ＰＡ－ａスラリーの（ａ）貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失（Ｇ”）弾性率。（ｂ）Ｇ’＝Ｇ”のときの交差点によって定義されるＴＧＦ ＰＡ－ａヒドロゲルを破砕するために必要なひずみ（＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。

【図26】２６Ａ～Ｃは、ウサギ骨軟骨欠損モデルにおけるＴＧＦ模倣ＰＡスラリーの移植。内側顆への移植後、手術の（ａ）１日後、（ｂ）２日後、及び（ｃ）７日後に、染料標識ＰＡ分子を使用してスラリー保持を追跡した。顆の組織学的切片の蛍光画像化（中段）及びＨ＆Ｅ染色（下段）は、新しい軟骨が形成されるにつれて良好なインプラント統合及び生分解を示した。

【発明を実施するための形態】

【0022】

定義
本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法及び材料は、本明細書に記載の実施形態の実施または試験に使用され得るが、いくつかの好ましい方法、組成物、デバイス、及び材料が、本明細書に記載される。しかしながら、本発明の材料及び方法を説明する前に、本明細書に記載の特定の分子、組成物、方法論、またはプロトコルは日常的な実験及び最適化に従って変化し得るため、本発明はそれらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される専門用語は、特定のバージョンまたは実施形態を説明することのみを目的としており、本明細書に記載の実施形態の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。

【0023】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。したがって、本明細書に記載の実施形態の文脈において、以下の定義が適用される。

【0024】

本明細書において、また付属の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈によってそうでない旨が明確に示されない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ペプチド両親媒性物質」への言及は、当業者などに既知の１つ以上のペプチド両親媒性物質及びその等価物への言及である。

【0025】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語及びその言語的変形は、追加の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を除外することなく、列挙された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を示す。逆に、「からなる」という用語及びその言語的変形は、列挙された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を示し、通常関連する不純物を除いて、任意の列挙されていない特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などを除外する。「から本質的になる」という語句は、列挙された特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）など、及び組成物、システム、または方法の基本的な性質に実質的に影響を与えない任意の追加の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などを示す。本明細書の多くの実施形態は、オープンな「含む」という言葉を使用して説明される。そのような実施形態は、複数のクローズな「からなる」及び／または「から本質的になる」の実施形態を包含し、これは、代替的にそのような言葉を使用して特許請求または説明され得る。

【0026】

「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸類似体を指し、それらの構造がそのような立体異性体形態を許容する場合、別段の指示がない限り、全てそれらのＤ及びＬ立体異性形態にある。

【0027】

天然アミノ酸としては、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、及びバリン（ＶａｌまたはＶ）が挙げられる。

【0028】

非天然アミノ酸としては、アゼチジンカルボン酸、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、ベータ－アラニン、ナフチルアラニン（「ｎａｐｈ」）、アミノプロピオン酸、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－アミノピメリン酸、三級ブチルグリシン（「ｔＢｕＧ」）、２，４－ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ホモプロリン（「ｈＰｒｏ」または「ｈｏｍｏＰ」）、ヒドロキシリジン、ａｌｌｏ－ヒドロキシリジン、３－ヒドロキシプロリン（「３Ｈｙｐ」）、４－ヒドロキシプロリン（「４Ｈｙｐ」）、イソデスモシン、ａｌｌｏ－イソロイシン、Ｎ－メチルアラニン（「ＭｅＡｌａ」または「Ｎｉｍｅ」）、Ｎ－メチルグリシンを含むＮ－アルキルグリシン（「ＮＡＧ」）、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルペンチルグリシンを含むＮ－アルキルペンチルグリシン（「ＮＡＰＧ」）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｎ－メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン（「Ｎｏｒｖａｌ」）、ノルロイシン（「Ｎｏｒｌｅｕ」）、オクチルグリシン（「ＯｃｔＧ」）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ペンチルグリシン（「ｐＧ」または「ＰＧｌｙ」）、ピペコリン酸、チオプロリン（「ＴｈｉｏＰ」または「ｔＰｒｏ」）、ホモリジン（「ｈＬｙｓ」）、及びホモアルギニン（「ｈＡｒｇ」）。

【0029】

「アミノ酸類似体」という用語は、Ｃ末端カルボキシ基、Ｎ末端アミノ基、及び側鎖生物活性基のうちの１つ以上が、化学的に遮断されているか、可逆的もしくは不可逆的に修飾されているか、またはさもなければ別の生物活性基に変更されている、天然または非天然アミノ酸を指す。例えば、アスパラギン酸－（ベータ－メチルエステル）は、アスパラギン酸のアミノ酸類似体であるか、Ｎ－エチルグリシンは、グリシンのアミノ酸類似体であるか、またはアラニンカルボキサミドは、アラニンのアミノ酸類似体である。他のアミノ酸類似体としては、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ－（カルボキシメチル）－システイン、Ｓ－（カルボキシメチル）－システインスルホキシド、及びＳ－（カルボキシメチル）－システインスルホンが挙げられる。

【0030】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸の短いポリマーに対するオリゴマーを指す。他のアミノ酸ポリマー（例えば、タンパク質、ポリペプチドなど）とは対照的に、ペプチドは、約５０アミノ酸以下の長さのものである。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／または修飾アミノ酸を含み得る。ペプチドは、天然に存在するタンパク質の部分配列または非天然（人工）配列であり得る。

【0031】

本明細書で使用される場合、「人工」という用語は、人によって設計または調製され、天然に存在しない組成物及び系を指す。例えば、人工ペプチド、ペプトイド、または核酸は、非天然配列（例えば、天然に存在するタンパク質またはその断片と１００％の同一性を有しないペプチド）を含むものである。

【0032】

本明細書で使用される場合、「保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチド中のアミノ酸の、サイズまたは電荷などの類似の化学的特性を有する別のアミノ酸との置換を指す。本開示の目的のために、次の８つの群の各々は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）、ならびに
８）システイン（Ｃ）及びメチオニン（Ｍ）。

【0033】

天然に存在する残基は、共通の側鎖特性、例えば、極性陽性（または塩基性）（ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、及びアルギニン（Ｒ））、極性陰性（または酸性）（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））、極性中性（セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ））、非極性脂肪酸（アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ））、非極性芳香族（フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ））、プロリン及びグリシン、ならびにシステインに基づいて、クラスに分けてもよい。本明細書で使用される場合、「半保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチド中のアミノ酸の、同じクラス内の別のアミノ酸との置換を指す。

【0034】

いくつかの実施形態では、別段の定めがない限り、保存的または半保存的アミノ酸置換はまた、天然残基と同様の化学的特性を有する天然に存在しないアミノ酸残基を包含し得る。これらの非天然残基は、典型的には、生物学的系における合成によってではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる。これらには、ペプチド模倣物及び他の逆転または反転形態のアミノ酸部分が含まれるが、これらに限定されない。本明細書の実施形態は、いくつかの実施形態では、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び／またはアミノ酸類似体に限定され得る。

【0035】

非保存的置換は、あるクラスのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴い得る。

【0036】

本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が同じモノマーサブユニットの連続した組成を有する程度を指す。「配列類似性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が、保存的及び／または半保存的アミノ酸置換によってのみ異なる程度を指す。「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）は、（１）比較ウィンドウ（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、特定されたウィンドウなど）にわたって２つの最適に整列された配列を比較すること、（２）同一の（または類似の）モノマーを含有する位置の数（例えば、同じアミノ酸が両方の配列に発生し、類似したアミノ酸が両方の配列に発生する）を決定して、一致した位置の数を得ること、（３）一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、特定されたウィンドウ）で割ること、及び（４）結果に１００を掛けて、配列同一性パーセントまたは配列類似性パーセントを得ることによって計算される。例えば、ペプチドＡ及びペプチドＢが両方とも２０アミノ酸の長さであり、かつ１つの位置を除いた全ての位置で同一のアミノ酸を有するならば、ペプチドＡ及びペプチドＢは、９５％の配列同一性を有する。非同一位置のアミノ酸が同じ生物物理学的特徴（例えば、双方とも酸性であった）を共有する場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは、１００％の配列類似性を有するであろう。別の例として、ペプチドＣが２０個のアミノ酸の長さであり、ペプチドＤが１５個のアミノ酸の長さであり、かつペプチドＤ内の１５個のアミノ酸のうちの１４個が、ペプチドＣの一部のものと同一である場合、ペプチドＣ及びＤは、７０％の配列同一性を有するが、ペプチドＤは、ペプチドＣの最適な比較ウィンドウと９３．３％の配列同一性を有する。本明細書では、「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）を計算する目的で、整列された配列における任意のギャップは、その位置でのミスマッチとして扱われる。

【0037】

参照配列ＩＤ番号と特定の配列同一性または類似性パーセント（例えば、少なくとも７０％）を有するものとして本明細書に記載の任意のポリペプチドはまた、その参照配列に対して最大数の置換（または末端欠失）を有するものとして表されてもよい。例えば、配列番号Ｚ（例えば、１００個のアミノ酸）と少なくともＹ％の配列同一性（例えば、９０％）を有する配列は、配列番号Ｚに対して最大Ｘの置換（例えば、１０）を有し得、したがって、「配列番号Ｚに対してＸ（例えば、１０）以下の置換を有する」としても表され得る。

【0038】

本明細書で使用される場合、「ナノ繊維」という用語は、典型的には１００ナノメートル未満の直径を有する（例えば、幅または直径よりも顕著に大きい長さの寸法を有する）細長いまたは糸状のフィラメントを指す。

【0039】

本明細書で使用される場合、「超分子」（例えば、「超分子複合体」、「超分子相互作用」、「超分子繊維」、「超分子ポリマー」など）という用語は、結果として形成される分子（例えば、ポリマー、巨大分子など）と、多成分組織化体、複合体、系、及び／または繊維との間の非共有結合相互作用を指す。

【0040】

本明細書で使用される場合、「自己組織化する」及び「自己組織化」という用語は、構成要素部分からの別個の非ランダムな凝集構造の形成を指し、該組織化は、それらの構成要素の固有の化学的または構造的特性及び引力のみに起因して、構成要素（例えば、分子）のランダムな動きを通じて自発的に生じる。

【0041】

本明細書で使用される場合、「ペプチド両親媒性物質」という用語は、少なくとも、非ペプチド親油性（疎水性）セグメント、構造ペプチドセグメント、及び／または荷電ペプチドセグメント（多くの場合、両方）、ならびに任意選択で生物活性セグメント（例えば、リンカーセグメント、生物活性セグメントなど）を含む分子を指す。ペプチド両親媒性物質は、生理的ｐＨで、正味の正または負のいずれかの正味の電荷で正味の電荷を表す場合があるか、または両性イオン性であってもよい（すなわち、正の電荷及び負の電荷の両方を有する）。ある特定のペプチド両親媒性物質は、（１）疎水性、非ペプチドセグメント（例えば、６つ以上の炭素のアシル基を含む）、（２）構造ペプチドセグメント（例えば、βシート形成）、（３）荷電ペプチドセグメント、及び（４）生物活性セグメント（例えば、リンカーセグメント）からなるか、またはそれらを含む。

【0042】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、「親油性部分」または「疎水性部分」という用語は、ペプチド両親媒性物質の一方の末端（例えば、Ｃ末端、Ｎ末端）に配置された部分（例えば、アシル、エーテル、スルホンアミド、またはホスホジエステル部分）を指し、本明細書及び他の箇所では、親油性または疎水性セグメントまたは構成要素と称され得る。疎水性セグメントは、両親媒性挙動をもたらし、水または別の極性溶媒系中で凝集体（またはナノスフィアまたはナノ繊維）形成をもたらすのに十分な長さのものでなければならない。したがって、本明細書に記載の実施形態の関連において、疎水性構成要素は、好ましくは、式：Ｃ_ｎ－１Ｈ_２ｎ－１Ｃ（Ｏ）－－（式中、ｎ＝２～２５）の単一の直鎖アシル鎖を含む。いくつかの実施形態では、直鎖アシル鎖は、親油性基（飽和または不飽和炭素）、パルミチン酸である。しかしながら、ステロイド、リン脂質、及びフルオロカーボンなどのアシル鎖の代わりに他の親油性基を使用してもよい。

【0043】

本明細書で使用される場合、「構造的ペプチド」という用語は、典型的には、疎水性セグメントと荷電ペプチドセグメントとの間に配置された、ペプチド両親媒性物質の一部分を指す。構造ペプチドは、一般に、非極性の非荷電側鎖（例えば、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｐｈｅ（Ｆ））を有する３～１０のアミノ酸残基で構成され、これらは、隣接する構造セグメントの構造セグメントと水素結合または他の安定化相互作用（例えば、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用など）を形成する傾向があるために選択される。いくつかの実施形態では、構造ペプチドセグメントを有するペプチド両親媒性物質のナノ繊維は、顕微鏡によって検査されたときに直鎖または２Ｄ構造を示し、及び／または環状二色性（ＣＤ）によって検査されたときにαヘリックス及び／またはβシート特性を示す。

【0044】

本明細書で使用される場合、「ベータ（β）シート形成ペプチドセグメント」という用語は、βシート様特性を示す（例えば、ＣＤによって分析される場合）傾向を有する構造的ペプチドセグメントを指す。いくつかの実施形態では、ベータ（β）シート形成ペプチドセグメント中のアミノ酸は、ベータシート二次構造を形成する傾向があるために選択される。２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される好適なアミノ酸残基の例としては、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｌａ（Ａ）、及びＧｌｙ（Ｇ）（ベータシートを形成する傾向の順に列挙される）が挙げられる。しかしながら、同様のベータシート形成傾向の天然に存在しないアミノ酸も使用され得る。ベータシートを形成するために相互作用することができるペプチドセグメント及び／またはベータシートを形成する傾向を有するペプチドセグメントが理解される（例えば、Ｍａｙｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６），５：１３０１－１３１５を参照されたい；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0045】

本明細書で使用される場合、「荷電ペプチドセグメント」という用語は、荷電アミノ酸残基が豊富（例えば、５０％超、７５％超など）であるペプチド両親媒性物質の一部分、または生理学的条件下で正味の正もしくは負の電荷を有するアミノ酸残基を指す。荷電ペプチドセグメントは、酸性（例えば、負荷電）、塩基性（例えば、正荷電）、または両性イオン性（例えば、酸性残基及び塩基性残基の両方を有する）であり得る。

【0046】

本明細書で使用される場合、「カルボキシ豊富ペプチドセグメント」、「酸性ペプチドセグメント」、及び「負荷電ペプチドセグメント」という用語は、カルボン酸側鎖を示す側鎖（例えば、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｐ（Ｄ）、または非天然アミノ酸）を有する１つ以上のアミノ酸残基を含むペプチド両親媒性物質のペプチド配列を指す。カルボキシ豊富ペプチドセグメントは、任意選択で、１つ以上の追加の（例えば、非酸性）アミノ酸残基を含有してもよい。当業者には明らかであるように、非天然アミノ酸残基、または酸性側鎖を有するペプチド模倣物を使用することができる。このセグメントには、約２～約７個のアミノ酸、及び／または約３もしくは４個のアミノ酸が存在し得る。

【0047】

本明細書で使用される場合、「アミノ豊富ペプチドセグメント」、「塩基性ペプチドセグメント」、及び「正荷電ペプチドセグメント」という用語は、正荷電酸側鎖を示す側鎖（例えば、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、もしくは非天然アミノ酸、またはペプチド模倣物）を有する１つ以上のアミノ酸残基を含むペプチド両親媒性物質のペプチド配列を指す。塩基性ペプチドセグメントは、任意選択で、１つ以上の追加の（例えば、非塩基性）アミノ酸残基を含有してもよい。当業者には明らかであるように、塩基性側鎖を有する非天然アミノ酸残基を使用することができる。このセグメントには、約２～約７個のアミノ酸、及び／または約３もしくは４個のアミノ酸が存在し得る。

【0048】

本明細書で使用される場合、「生物活性ペプチド」という用語は、それに関連する配列、分子、または超分子複合体の作用を媒介するアミノ酸配列を指す。ペプチド両親媒性物質及び生物活性ペプチド（例えば、ＴＧＦ－β１模倣ペプチドなど）を有する構造（例えば、ナノ繊維）は、生物活性ペプチドの機能性を示す。

【0049】

本明細書で使用される場合、「生体適合性」という用語は、細胞または生物に毒性がない材料及び薬剤を指す。いくつかの実施形態では、物質は、インビトロでの細胞へのその添加が、約１０％以下の細胞死、通常５％未満、より通常には１％未満をもたらす場合、「生体適合性」であるとみなされる。

【0050】

本明細書で使用される場合、本明細書でポリマー、ヒドロゲル、及び／または創傷被覆材を説明するために使用される「生分解性」は、生理学的条件への曝露下で分解された、またはそうでなければ「分解された（ｂｒｏｋｅｎ ｄｏｗｎ）」組成物を意味する。いくつかの実施形態では、生分解性物質は、細胞機構、酵素分解、化学プロセス、加水分解などによって分解される。いくつかの実施形態では、創傷被覆材またはコーティングは、生分解性を提供する加水分解性エステル結合を含む。

【0051】

本明細書で使用される場合、「生理学的条件」という語句は、組織の細胞内及び細胞外流体に遭遇する可能性が高い化学的（例えば、ｐＨ、イオン強度）及び生化学的（例えば、酵素濃度）条件の範囲に関する。ほとんどの組織について、生理的ｐＨは、約７．０～７．４の範囲である。

【0052】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、及び「治療すること」という用語は、特定の状態、疾患状態（例えば、変形性関節症、軟骨損傷など）、またはその症状の量または重症度を、その状態または疾患状態を現在経験しているまたは患っている対象において低減することを指す。これらの用語は、必ずしも完全な治療（例えば、状態、疾患、またはそれらの症状の完全な消失）を示すものではない。「治療」は、疾患（例えば、ヒトを含む哺乳動物における）に対する治療薬または技法の任意の投与または適用を包含し、疾患の阻害、その発症の阻止、疾患の緩和、退行の誘発、または喪失、欠損した、もしくは不全な機能の回復もしくは修復、または非効率的なプロセスの刺激を含む。

【0053】

本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防」、及び「予防すること」という用語は、特定の状態または疾患状態（例えば、変形性関節症、軟骨劣化など）が、現在その状態または疾患状態を経験していないか、または患っていない対象において発生する可能性を低減することを指す。この用語は、必ずしも、完全なまたは絶対的な予防を示すものではない。例えば、「変形性関節症の予防」とは、変形性関節症を現在経験していないか、またはそれと診断されていない対象において変形性関節症が発生する可能性を低減することを指す。「変形性関節症を予防する」ために、組成物または方法は、変形性関節症の可能性を低減することだけを必要とし、そのあらゆる可能性を完全に遮断する必要はない。「予防」は、（例えば、ヒトを含む哺乳動物において）疾患発症の可能性を低減するための治療薬または技法の任意の投与または適用を包含する。そのような可能性は、集団または個体について評価され得る。

【0054】

本明細書で使用される場合、「共投与」及び「共投与すること」という用語は、対象への少なくとも２つの薬剤（複数可）または療法（例えば、ＴＧＦ－β１模倣ペプチドを示すＰＡナノ構造及び１つ以上の治療薬）の投与を指す。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤または療法の共投与は、同時である。他の実施形態では、第１の薬剤／療法は、第２の薬剤／療法の前に投与される。当業者は、使用される様々な薬剤または療法の製剤化及び／または投与経路が異なり得ることを理解する。共投与のための適切な投与量は、当業者によって容易に決定され得る。いくつかの実施形態では、薬剤または療法が共投与される場合、それぞれの薬剤または療法は、それらの単独投与に適切な投与量よりも少ない投与量で投与される。よって、薬剤もしくは療法の共投与が、潜在的に危険な（例えば、毒性の）薬剤（複数可）の必要投与量を低下させる実施形態において、及び／または２つ以上の薬剤の共投与が、薬剤のうちの一方の共投与によって、他方の薬剤の有益な効果に対する対象の感作をもたらす場合、共投与が特に望ましい。
［発明を実施するための形態］

【0055】

生物活性形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦ－β１）模倣エピトープを含む自己組織化ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）、ＴＧＦ－β１模倣エピトープを示すＰＡの高アスペクト比ナノ構造、ならびに軟骨の再生／修復及び／または変形性関節症及び他の筋骨格損傷及び疾患の治療を増強する方法が本明細書に提供される。

【0056】

この技術は、軟骨再生のためのＴＧＦ－β１の軟骨形成活性を模倣するペプチド両親媒性（ＰＡ）分子及び超分子ＰＡナノ構造を含む。ＴＧＦ－β１模倣エピトープにコンジュゲートされた生物活性ＰＡ分子は、自己組織化のために希釈エピトープ不含分子と共組織化され、それらの表面に生物活性ＴＧＦ－β１模倣ドメインを提示する高アスペクト比ナノ構造になることができる。これらのナノ構造は、ＰＡナノ構造上のエピトープの好ましい提示を通じて、細胞シグナル伝達及び軟骨形成応答を増強する。これらの生物活性ＰＡ系は、追加の外因性成長因子なしで軟骨の再生及び修復を増強することができ、変形性関節症ならびに他の筋骨格損傷及び疾患を治療するための無細胞再生足場として使用することができる。

【0057】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態のペプチド両親媒性分子及び組成物は、ペプチドのＮ末端（またはＣ末端）で標準アミノ酸の代わりに脂肪酸を添加して、当業者に周知の調製技法、好ましくは、標準固相ペプチド合成によって、親油性セグメントを作製するために合成される（しかしながら、いくつかの実施形態では、ナノ繊維の整列は、当技術分野で以前に開示または使用されていない技法（例えば、メッシュスクリーンを通した押出）を介して行われる。合成は、典型的には、アミノ酸が、Ｒｉｎｋアミド樹脂（樹脂からの切断後、ペプチドのＣ末端に－－ＮＨ２基をもたらす）またはＷａｎｇ樹脂（Ｃ末端に－－ＯＨ基をもたらす）のいずれかを使用して順次付加されるＣ末端から始まる。したがって、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、－－Ｈ、－－ＯＨ、－－ＣＯＯＨ、－－ＣＯＮＨ２、及び－－ＮＨ２からなる群から選択され得るＣ末端部分を有するペプチド両親媒性物質を包含する。

【0058】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、ペプチドに連結された疎水性（非ペプチド）セグメントを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、構造セグメント（例えば、水素結合形成セグメント、ベータシート形成セグメントなど）、及び荷電セグメント（例えば、酸性セグメント、塩基性セグメント、両性イオンセグメントなど）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、溶解性、可撓性、セグメント間の距離などを追加するためのリンカーまたはスペーサーセグメントを更に含む。いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、疎水性セグメントとは反対のペプチドの末端にスペーサーセグメント（例えば、ペプチド及び／または非ペプチドスペーサー）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーセグメントは、ペプチド及び／または非ペプチド要素を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーセグメントは、１つ以上の生物活性基（例えば、アルケン、アルキン、アジド、チオールなど）を含む。いくつかの実施形態では、様々なセグメントは、リンカーセグメント（例えば、ペプチド（例えば、ＧＧ）または非ペプチド（例えば、アルキル、ＯＥＧ、ＰＥＧなど）リンカー）によって接続されてもよい。

【0059】

親油性または疎水性セグメントは、典型的には、最後のアミノ酸カップリングの後、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に組み込まれ、アシル結合によりＮ末端またはＣ末端アミノ酸に連結される脂肪酸または他の酸で構成される。水溶液中では、ＰＡ分子は、そのコア中に親油性セグメントを埋め、表面上に生物活性ペプチドを示す（例えば、円筒形ミセル（別名、ナノ繊維）に）自己組織化する。構造ペプチドは、分子間水素結合を受けて、ミセルの長軸に平行に配向するベータシートを形成する。

【0060】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、次に疎水性セグメント及びペプチドセグメントを含むＰＡビルディングブロックを含む。ある特定の実施形態では、十分な長さ（例えば、２個の炭素、３個の炭素、４個の炭素、５個の炭素、６個の炭素、７個の炭素、８個の炭素、９個の炭素、１０個の炭素、１１個の炭素、１２個の炭素、１３個の炭素、１４個の炭素、１５個の炭素、１６個の炭素、１７個の炭素、１８個の炭素、１９個の炭素、２０個の炭素、２１個の炭素、２２個の炭素、２３個の炭素、２４個の炭素、２５個の炭素、２６個の炭素、２７個の炭素、２８個の炭素、２９個の炭素、３０個以上の炭素、またはそれらの間の任意の範囲）の疎水性（例えば、炭化水素及び／またはアルキル／アルケニル／アルキニル尾部、またはコレステロールなどのステロイド）セグメントは、ペプチドセグメント（例えば、ベータ鎖立体構造または他の超分子相互作用を好むセグメントを含むペプチド）に共有結合して、ペプチド両親媒性分子をもたらす。いくつかの実施形態では、複数のそのようなＰＡは、水（または水溶液）中でナノ構造（例えば、ナノ繊維）に自己組織化する。様々な実施形態では、ペプチドセグメント及び疎水性セグメントの相対長さは、異なるＰＡ分子形状及びナノ構造アーキテクチャをもたらす。例えば、より広いペプチドセグメント及びより狭い疎水性セグメントは、ＰＡの組織化体に影響を有する概して円錐形の分子形状をもたらす（例えば、Ｊ．Ｎ．Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉ Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｒｃｅｓ；２ｎｄ ｅｄ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｌｏｎｄｏｎ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９２を参照されたい；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。他の分子形状は、組織化体及びナノ構造アーキテクチャに対して同様の影響を有する。

【0061】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質の水溶液の自己組織化を誘導するために、溶液のｐＨを変更（上げるまたは下げる）してもよく、あるいはカルシウムなどの多価イオン、または荷電ポリマーもしくは他の巨大分子を溶液に添加してもよい。

【0062】

いくつかの実施形態では、疎水性セグメントは、非ペプチドセグメント（例えば、アルキル／アルケニル／アルキニル基）である。いくつかの実施形態では、疎水性セグメントは、４～２５個の炭素（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個）、フッ素化セグメント、フッ素化アルキル尾部、複素環式環、芳香族セグメント、ｐｉコンジュゲートセグメント、シクロアルキル、オリゴチオフェンなどのアルキル鎖（例えば、飽和）を含む。いくつかの実施形態では、疎水性セグメントは、２～３０個の炭素（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個）のアシル／エーテル鎖（例えば、飽和）を含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、ＰＡは、１つ以上のペプチドセグメントを含む。ペプチドセグメントは、天然アミノ酸、修飾アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、ペプチド模倣物、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドセグメントは、本明細書に記載のペプチド配列の１つ以上に対して少なくとも５０％の配列同一性または類似性（例えば、保存的または半保存的）を含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、荷電ペプチドセグメントを含む。荷電セグメントは、酸性、塩基性、または両性イオン性であり得る。

【0065】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、酸性ペプチドセグメントを含む。例えば、いくつかの実施形態では、酸性ペプチドは、配列に１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７つ以上）の酸性残基（Ｄ及び／またはＥ）を含む。いくつかの実施形態では、酸性ペプチドセグメントは、最大７つの残基の長さを含み、少なくとも５０％の酸性残基を含む。いくつかの実施形態では、酸性ペプチドセグメントは、（Ｘａ）_１－７を含み、各Ｘａは、独立して、ＤまたはＥである。いくつかの実施形態では、酸性ペプチドセグメントは、ＥＥを含む。

【0066】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、塩基性ペプチドセグメントを含む。例えば、いくつかの実施形態では、酸性ペプチドは、配列に１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７つ以上）の塩基性残基（Ｒ、Ｈ、及び／またはＫ）を含む。いくつかの実施形態では、塩基性ペプチドセグメントは、最大７つの残基の長さを含み、少なくとも５０％の塩基性残基を含む。いくつかの実施形態では、酸性ペプチドセグメントは、（Ｘｂ）_１－７を含み、各Ｘｂは、独立して、Ｒ、Ｈ、及び／またはＫである。

【0067】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、構造及び／またはベータシート形成セグメントを含む。いくつかの実施形態では、構造セグメントは、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、及びＡ残基が豊富である。いくつかの実施形態では、構造及び／またはベータシート形成セグメントは、アラニン及びバリン豊富ペプチドセグメント（例えば、ＡＡＶＶ、ＡＡＡＶＶＶ（配列番号４）、またはＶ残基及びＡ残基の他の組み合わせなど）を含む。いくつかの実施形態では、構造及び／またはベータシートペプチドは、４つ以上の連続したＡ及び／またはＶ残基、またはそれに対して保存的もしくは半保存的置換を含む。いくつかの実施形態では、構造及び／またはベータシート形成ペプチドセグメントは、４つ以上の連続した非極性脂肪族残基（例えば、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ））を含む。いくつかの実施形態では、構造及び／またはベータシート形成ペプチドセグメントは、２～１６個のアミノ酸の長さを含み、４つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれらの間の範囲）の非極性脂肪族残基を含む。

【0068】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、非ペプチドスペーサーまたはリンカーセグメントを含む。いくつかの実施形態では、非ペプチドスペーサーまたはリンカーセグメントは、疎水性セグメントとは反対のペプチドの末端に位置する。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはリンカーセグメントは、生物活性基の結合部位を提供する。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはリンカーセグメントは、ＰＡの機能化のための反応性基（例えば、アルケン、アルキン、アジド、チオール、マレイミドなど）を提供する。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはリンカーは、ＣＨ_２、Ｏ、（ＣＨ_２）_２Ｏ、Ｏ（ＣＨ_２）_２、ＮＨ、及びＣ＝Ｏ基（例えば、ＣＨ２（Ｏ（ＣＨ_２）_２）_２ＮＨ、ＣＨ２（Ｏ（ＣＨ_２）_２）_２ＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_２ＣＣＨなど）の実質的に直鎖である。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはリンカーは、追加の生物活性基、置換基、分岐などを更に含む。

【0069】

本明細書の材料で使用するのに好適なペプチド両親媒性物質、ならびにＰＡ及び関連材料の調製方法、ＰＡで使用するためのアミノ酸配列、ならびにＰＡで使用することができる材料は、以下の特許に記載されている：米国特許第９，０４４，５１４号、米国特許第９，０４０，６２６号、米国特許第９，０１１，９１４号、米国特許第８，７７２，２２８号、米国特許第８，７４８，５６９号、米国特許第８，５８０，９２３号、米国特許第８，５４６，３３８号、米国特許第８，５１２，６９３号、米国特許第８，４５０，２７１号、米国特許第８，２３６，８００号、米国特許第８，１３８，１４０号、米国特許第８，１２４，５８３号、米国特許第８，１１４，８３５号、米国特許第８，１１４，８３４号、米国特許第８，０８０，２６２号、米国特許第８，０７６，２９５号、米国特許第８，０６３，０１４号、米国特許第７，８５１，４４５号、米国特許第７，８３８，４９１号、米国特許第７，７４５，７０８号、米国特許第７，６８３，０２５号、米国特許第７，５５４，０２１号、米国特許第７，５４４，６６１号、米国特許第７，５３４，７６１号、米国特許第７，４９１，６９０号、米国特許第７，４５２，６７９号、米国特許第７，３７１，７１９号、米国特許第７，０３０，１６７号（それらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0070】

ＰＡ超分子構造の特徴（例えば、形状、剛性、親水性など）は、ペプチド両親媒性物質（例えば、親油性セグメント、酸性セグメント、構造セグメント、生物活性セグメントなど）の構成要素の同一性に依存する。例えば、ナノ繊維、ナノスフィア、中間形状、及び他の超分子構造は、ＰＡ構成要素部分の同一性を調整することによって達成される。いくつかの実施形態では、ＰＡの超分子ナノ構造の特徴は、組織化後の操作（例えば、加熱／冷却、延伸など）によって変更される。

【0071】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、（ａ）８～２４個の炭素のアルキル鎖を含む疎水性尾部、（ｂ）構造セグメント（例えば、ＶＶＡＡを含む）、及び（ｃ）荷電セグメント（例えば、ＫＫ、ＥＥなどを含む）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構成要素を含む、本明細書に記載の範囲内の、または当業者の技術内の任意のＰＡが、本明細書において使用され得る。

【0072】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、生物活性部分（例えば、ＴＧＦ－β１模倣エピトープ）を含む。特定の実施形態では、生物活性部分は、ＰＡの最もＣ末端またはＮ末端のセグメントである。いくつかの実施形態では、生物活性部分は、荷電セグメントの末端に結合している。いくつかの実施形態では、生物活性部分は、組織化ＰＡ構造（例えば、ナノ繊維）の表面上に露出される。生物活性部分は、典型的には、ペプチド（例えば、ＴＧＦ－β１模倣エピトープなど）であるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、生物活性部分は、目的のペプチドまたはポリペプチドに結合するペプチド配列、例えば、成長因子である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１模倣エピトープは、ＰＡ生物活性部分として提供される。いくつかの実施形態では、そのようなＴＧＦ－β１模倣エピトープは、配列番号１（ＣＥＳＰＬＫＲＱＣ）と、少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１模倣エピトープペプチドは、環化される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１模倣エピトープは、配列番号１である。いくつかの実施形態では、配列番号１のうちの１つと少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有するペプチドのうちの１つ以上を示す生物活性ＰＡを含むナノ繊維が提供される。いくつかの実施形態では、生物活性ペプチドは、配列番号１のうちの１つに対して保存的または半保存的置換を含む。

【0073】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、（ａ）８～２４個の炭素のアルキル鎖を含む疎水性尾部、（ｂ）構造セグメント（例えば、ＶＶＡＡ（配列番号６）、ＡＡＶＶ（配列番号５）、ＶＡ、ＡＶ、ＡＡなどを含む）、（ｃ）荷電セグメント（例えば、ＫＫ、ＥＥ、ＥＫ、ＫＥ、ＥＥＥなどを含む）、及び生物活性ペプチド（例えば、ＴＧＦ－β１模倣エピトープ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡは、ＰＡのペプチド部分に疎水性尾部を結合させるための結合セグメントまたは残基（例えば、Ｋ）を更に含む。いくつかの実施形態では、疎水性尾部は、リジン側鎖に結合している。いくつかの実施形態では、ＰＡは、生物活性ペプチドを構造セグメントに結合させるための結合セグメントまたは残基（例えば、Ｋ）を更に含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、（例えば、Ｃ末端からＮ末端に、またはＮ末端からＣ末端に）、生物活性ペプチド（例えば、ＴＧＦ－β１模倣エピトープ）－荷電セグメント（例えば、ＫＫ、ＥＥ、ＥＫ、ＫＥ、ＥＥＥなどを含む）－構造セグメント（例えば、ＶＶＡＡ（配列番号６）、ＡＡＶＶ（配列番号５）、ＶＡ、ＡＶ、ＡＡなどを含む）－疎水性尾部（例えば、８～２４個の炭素のアルキル鎖を含む）を含む。

【0075】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、（例えば、Ｃ末端からＮ末端に、またはＮ末端からＣ末端に）、生物活性ペプチド（例えば、ＴＧＦ－β１模倣エピトープ）－荷電セグメント（例えば、ＫＫ、ＥＥ、ＥＫ、ＫＥ、ＥＥＥなどを含む）－構造セグメント（例えば、ＶＶＡＡ（配列番号６）、ＡＡＶＶ（配列番号５）、ＶＡ、ＡＶ、ＡＡなどを含む）－結合セグメントまたはペプチド（例えば、Ｋ）－疎水性尾部（例えば、８～２４個の炭素のアルキル鎖を含む）を含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、（例えば、Ｃ末端からＮ末端に、またはＮ末端からＣ末端に）、生物活性ペプチド（例えば、ＴＧＦ－β１模倣エピトープ）－結合セグメントまたはペプチド（例えば、Ｋ）－荷電セグメント（例えば、ＫＫ、ＥＥ、ＥＫ、ＫＥ、ＥＥＥなどを含む）－構造セグメント（例えば、ＶＶＡＡ（配列番号６）、ＡＡＶＶ（配列番号５）、ＶＡ、ＡＶ、ＡＡなどを含む）－疎水性尾部（例えば、８～２４個の炭素のアルキル鎖を含む）を含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、（例えば、Ｃ末端からＮ末端に、またはＮ末端からＣ末端に）、生物活性ペプチド（例えば、ＴＧＦ－β１模倣エピトープ）－ＥＥＥＡＡＡＶＶＶ（配列番号１０）－疎水性尾部（例えば、８～２４個の炭素のアルキル鎖を含む）を含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、ペプチド両親媒性物質は、（例えば、Ｃ末端からＮ末端に、またはＮ末端からＣ末端に）、生物活性ペプチド（例えば、ＴＧＦ－β１模倣エピトープ）－ＥＥＡＡ（配列番号１１）－疎水性尾部（例えば、８～２４個の炭素のアルキル鎖を含む）を含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチド両親媒性物質から組織化されたナノ繊維及びナノ構造が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ナノ繊維は、本明細書に記載のＰＡの自己組織化によって調製される。いくつかの実施形態では、ナノ繊維は、ＴＧＦ－β１模倣エピトープを示すＰＡを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１模倣エピトープは、ナノ繊維の表面上に示される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１模倣エピトープを示すＰＡに加えて、フィラーＰＡがナノ繊維に含まれる。いくつかの実施形態では、フィラーＰＡは、本明細書に記載されるペプチド両親媒性物質（例えば、構造セグメント、荷電セグメント、疎水性セグメントなど）であるが、生物活性部分を欠く。いくつかの実施形態では、フィラーペプチドは、生物活性部分（例えば、Ｖ３Ａ３Ｋ３、Ｖ３Ａ３Ｅ３など）を欠く塩基性または酸性のペプチドである。いくつかの実施形態では、フィラーＰＡ及びＴＧＦ－β１模倣エピトープＰＡは、両方の種類のＰＡを含むナノ繊維に自己組織化する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチド両親媒性物質から組織化されたナノ構造（例えば、ナノ繊維）が提供される。

【0080】

いくつかの実施形態では、ナノ構造は、（１）生物活性部分（例えば、ＴＧＦ－β１模倣エピトープ）を有するＰＡ、及び（２）フィラーＰＡ（例えば、標識されていない、または生物活性部分を示していない酸性または塩基性のＰＡなど）から組織化される。いくつかの実施形態では、ナノ構造（例えば、ナノ繊維）は、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％（またはそれらの間の任意の範囲）のＴＧＦ－β１模倣エピトープＰＡを含む。いくつかの実施形態では、ナノ構造（例えば、ナノ繊維）は、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％（またはそれらの間の任意の範囲）の酸性フィラーＰＡを含む。いくつかの実施形態では、ナノ構造（例えば、ナノ繊維）は、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％（またはそれらの間の任意の範囲）の塩基性フィラーＰＡを含む。いくつかの実施形態では、ナノ繊維におけるＴＧＦ－β１模倣エピトープＰＡと酸性及び／または塩基性ＰＡとの比率は、ナノ繊維材料の機械的特徴（例えば、液体またはゲル）を決定し、どのような条件下で材料が様々な特徴（例えば、生理学的条件への曝露によるゲル化、生理学的条件への曝露による液化など）を採用するかを決定する。

【0081】

ペプチド両親媒性（ＰＡ）ナノ繊維溶液は、ＰＡの任意の好適な組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、溶液の少なくとも０．０５ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．１０ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２０ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．３０ｍｇ／ｍｌ、０．３５ｍｇ／ｍｌ、０．４０ｍｇ／ｍｌ、０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．５０ｍｇ／ｍｌ、０．６０ｍｇ／ｍｌ、０．７０ｍｇ／ｍｌ、０．８０ｍｇ／ｍｌ、０．９０ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ以上、またはそれらの間の範囲）は、フィラーＰＡ（例えば、ペプチドエピトープまたは他のナノ繊維表面提示部分を含まない）である。いくつかの実施形態では、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬの溶液は、フィラーＰＡである。いくつかの実施形態では、フィラーＰＡは、分子の末端（例えば、表面提示末端）に高荷電グルタミン酸残基を有する非生物活性ＰＡ分子である。これらの負の荷電ＰＡは、イオン架橋を介してナノ繊維間でゲル化が行われることを可能にする。いくつかの実施形態では、フィラーＰＡは、分子の末端（例えば、表面提示末端）に高荷電リジン残基を有する非生物活性ＰＡ分子である。これらの正の荷電ＰＡは、基塩基性条件下でゲル化が行われることを可能にする。フィラーＰＡは、ナノ繊維溶液のゲル化能力を依然として確保しながら、他の生物活性ＰＡ分子をナノ繊維マトリックスに組み込む能力を提供する。いくつかの実施形態では、溶液は、粘度の増加及びより強いゲル力学のためにアニールされる。これらのフィラーＰＡは、例えば、米国特許第８，７７２，２２８号（例えば、Ｃ_１６－ＶＶＶＡＡＡＥＥＥ（配列番号９））（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される配列を有する。

【0082】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＡナノ繊維は、小さな断面直径（例えば、２５ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１５ｎｍ未満、約１０ｎｍなど）を示す。いくつかの実施形態では、ナノ繊維の小さな断面（直径約１０ｎｍ）は、繊維が脳実質に浸透することを可能にする。

【0083】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＡ及びナノ構造は、変形性関節症、軟骨損傷／劣化、ならびに他の筋骨格損傷及び疾患の治療または予防に使用される。

【0084】

いくつかの実施形態では、本明細書のＴＧＦ－β１模倣エピトープＰＡナノ構造組成物は、対象への送達のために製剤化される。本明細書に記載の薬学的組成物を投与する好適な経路としては、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、鼓室内、臓器内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、及び脳室内投与が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β１模倣エピトープＰＡナノ構造組成物は、非経口投与される。いくつかの実施形態では、非経口投与は、髄腔内投与、脳室内投与、または実質内投与によるものである。

【0085】

本明細書のＴＧＦ－β１模倣エピトープＰＡナノ構造組成物は、唯一の活性剤として、または変形性関節症、軟骨損傷／劣化、ならびに他の筋骨格損傷及び疾患の治療に使用される他の薬剤などの他の医薬品と組み合わせて投与され得る。

【0086】

いくつかの実施形態では、本明細書のＰＡナノ構造は、１つ以上の追加の構成要素を有する複合材料として提供される。いくつかの実施形態では、本明細書の複合物は、ＰＡナノ構造と、生体適合性ポリマーとを含む。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは、粒子（例えば、微粒子（例えば、１μｍより大きいが１ｍｍ未満の直径）、ナノ粒子（例えば、１ｎｍより大きいが１μｍ未満の直径）など）の形態である。いくつかの実施形態では、複合物は、スラリー、ペースト、ゲルなどの形態である。

【0087】

本明細書の材料で使用するための好適な生体適合性ポリマーは、ＰＬＡ、ＰＬＬＡ、ＰＧＡ、ＰＧＬＡ、ＰＣＬ、キトサン、ポリラクチド、ポリグリコリド、イプシロン－カプロラクトン、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリヒドロキシ酪酸、他のポリヒドロキシ酸、ポリトリメチレンカーボネート、ポリアミン、ビニルポリマー、エステルを含有するポリアクリル酸及びそれらの誘導体、ポリエチレングリコール、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリオルトエステル、ポリアミノ酸、ポリホスホエステル、ポリエステルアミド、ポリフマレート、ポリ無水物、ポリシアノアクリレート、ポリオキサマー、ポリウレタン、ポリホスファゼン、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル－エステル）、ポリアキレンオキサレート、ポリアミド、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基含有ポリオキサエステル、ポリアセタール、ポリアルカノエート、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、多糖類、アルギネート、キチン、ヒアルロン酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0088】

いくつかの実施形態では、粒子は、任意の好適なサイズ及び形状のものである。いくつかの実施形態では、粒子は微粒子であり、１μｍ～１ｍｍ（例えば、１μｍ、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１ｍｍ、またはそれらの間の範囲）の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子はナノ粒子であり、１ｎｍ～１μｍ（例えば、１ｎｍ、２ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１ｎｍ、またはそれらの間の範囲）の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、冷凍（例えば、液体Ｎ_２下で）、乾燥、冷凍乾燥、凍結乾燥、破砕、粉砕、溶媒（例えば、エタノール）への曝露、ふるい分け、及びこれらの組み合わせなどの任意の好適な技法を使用して生成される。

【0089】

例示的な実施形態では、生体適合性粒子及びペプチド両親媒性溶液を、中性ｐＨ水中、５重量％の生体適合性粒子及び１重量％のＰＡで混合する。他の範囲（例えば、１重量％～２０重量％（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれらの間の任意の範囲）の生体適合性粒子；０．１重量％～１０重量％（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれらの間の任意の範囲）のＰＡ）を用いてもよい。特定の実施形態では、ポリマー（例えば、ＨＡ）は、０重量％～２０重量％で使用され、ＰＡは、０．０５重量％～３重量％で使用される。

【実施例】

【0090】

実験
実施例１
ＴＧＦ－β１模倣超分子ナノ構造のインビトロ特徴付け
材料及び方法
ＰＡの合成及び精製
Ｗａｎｇ樹脂（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での標準フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）合成を使用して、全てのＰＡ分子を合成した。ＰＡは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。ＨＰＬＣ精製後のＰＡの各画分の質量スペクトルを、Ａｇｉｌｅｎｔモデル６５２０で直接注入Ｑ－ＴｏＦ ＭＳを使用して検証した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラムを使用して、０．１％水酸化アンモニウムを含む５％から９５％の水対アセトニトリル勾配にわたって液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＬＣＭＳ）により、ＰＡの純度を確認した。

【0091】

直交保護基を有する樹脂上のＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨリジン残基を使用して、ＴＧＦ－β１模倣ＰＡ分子を合成した。Ｆｍｏｃ脱保護後、Ｃ_１６－ＡＡＥＥ（配列番号７）またはＣ_１６－ＡＥＡＥ（配列番号８）のいずれかのＰＡ骨格を、Ｃ末端からＮ末端に、リジンα－アミノ基から合成した。Ｍｔｔ脱保護後、ＰＥＧ_４をリジン側鎖アミンから合成し、続いてＴＧＦ－β１模倣エピトープを合成し、これを樹脂でのジスルフィド結合によって環化した。合成の後、ペプチドの環化を確実にするために、高速液体クロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィー質量分析でペプチドを精製した。

【0092】

各ＰＡの精製確認画分をプールし、溶液を凍結乾燥により冷凍乾燥した。希釈骨格ＰＡを、凍結乾燥粉末を滅菌水に溶解することによって、異なるモルパーセントでそれぞれのＴＧＦ－β１模倣ＰＡまたは直鎖状のエピトープＰＡと共組織化した。ＰＡ溶液を、１ＭのＮａＯＨの滅菌濾過溶液を使用してｐＨ７に調整し、次いで３０分間超音波浴を行った。溶液を８０℃で３０分間熱的にアニールし、次いで１分当たり１℃の速度で２５℃に冷却した。次いで、溶液を１５０ｍＭのＮａＣｌの滅菌溶液を使用して３０ｍＭのＮａＣｌに調整し、次いで５０℃で３０分間アニールし、冷却した。

【0093】

ＰＡゲル調製
ゲルを、前述のように調製した２重量％のＰＡ溶液を使用して、１０ｍｏｌ％のエピトープＰＡと希釈ＰＡとの共組織化体を使用して作製した。１２ウェルチャンバースライド（Ｉｂｉｄｉ）を、０．０１ｍｇ／ｍＬのポリＤ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液でコーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。ウェルを水で３回洗浄し、少なくとも３０分間空気乾燥させた。１２０μＬのＰＡ溶液をピペットで均等にウェルに入れ、１１０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、及び２５ｍＭのＣａＣｌ_２で構成されるゲル化溶液をＰＡ溶液の上にピペットで滴下した。ゲルを３７℃で３０分間インキュベートし、次いで過剰なゲル化溶液を除去した。

【0094】

低温透過型電子顕微鏡法
レーシーカーボンフィルムを有する３００メッシュの銅グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、ＰＥＬＣＯ ｅａｓｉＧｌｏｗシステム（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ， Ｉｎｃ．）で３０秒間グロー放電した。ＰＡ溶液を前述のように調製し、次いで、画像化の前に水中で１ｍＭに希釈した。７μＬのＰＡ溶液を、グリッド上に配置し、ブロットし、９５～１００％の湿度に維持されたＦＥＩ Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（ＦＥＩ）を使用して、液体エタン中でプランジ凍結した。液体窒素に浸漬しながら、Ｇａｔａｎ ６２６クライオホルダー（Ｇａｔａｎ）にガラス化試料を移し、１００ｋＶの加速電圧で動作するＪＥＯＬ １２３０ ＴＥＭで画像化した。液体窒素温度は画像化中維持され、顕微鏡写真はＧａｔａｎ ８３２ ＣＣＤカメラで捕捉した。

【0095】

従来の透過型電子顕微鏡法
ＰＡ溶液を水中で０．６ｍＭに希釈し、直ちに銅ＴＥＭメッシュグリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に３０秒間配置し、水で２回ブロットし、２％酢酸ウラニルで染色し、１５分間空気乾燥させた。画像化は、ＦＥＩ Ｓｐｒｉｔ Ｇ２透過型電子顕微鏡で行った。

【0096】

動的光散乱
ＤＬＳ測定は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳＰ光散乱分光計で行った。ＰＡを含まないＴＧＦ－β１模倣ペプチド単独を、前述のように１重量％で調製した。試料測定中、温度を２５℃に保った。各測定を行う前に、試料を３０秒間平衡化した。各測定の持続時間は１０秒であり、測定角度は１７３°の後方散乱であった。減衰器は、各実行の蓄積数と同様に、機器によって自動的に決定された。各測定実行を３回繰り返した。

【0097】

Ｘ線散乱
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤｕｐｏｎｔ－Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ－Ｄｏｗ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ａｃｃｅｓｓ Ｔｅａｍ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒで、ビームライン５ＩＤ－Ｄで実験を行った。４．８ｍＭのＰＡ溶液を石英キャピラリーセルで調製し、１７ｋｅＶの単色Ｘ線に５回、２～３秒間曝露した。散乱強度は、試料の２４５ｃｍ後ろに配置されたＣＣＤ検出器で記録した。収集した２次元散乱画像を、データ還元プログラムＦＩＴ２Ｄを使用して方位積分によって平均化し、波数ベクトルｑ＝（４π）ｓｉｎ（θ／２）（ここで、ｄ＝２π／ｑ）に対してプロットした。３０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液のみの試料をバックグラウンド減算して、最終強度を得た。ＳＡＸＳパターンを両対数スケールでプロットし、必要に応じてコア－シェルシリンダーモデルに適合させた。ＷＡＸＳパターンを線形スケールでプロットし、データのピーク及び最小値をＭＡＴＬＡＢピークファインダー機能を使用して特定した。

【0098】

円二色性
ＣＤスペクトルは、０．５ｍｍの光学長さの平行プレート石英チャンバーを使用して、ＪＡＳＣＯモデルＪ－８１５分光偏光計で記録した。測定直前に、ＰＡ溶液を水中で０．１及び０．５ｍＭに希釈した。スペクトルを、１ｎｍのステップサイズ、１００ｎｍ／分の走査速度、及び標準感度で、１９０～３００ｎｍの波長範囲にわたって収集した。測定値が飽和していないことを確認するために、各試料について高張力電圧を記録した。３つの測定値の蓄積を使用し、３０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液のみの試料をバックグラウンド減算して、最終スペクトルを得た。全てのＰＡ濃度を一緒に分析して、線形二色性がないことを確認し、０．５ｍＭのＰＡ溶液のスペクトルを最終分析に使用した。

【0099】

フーリエ変換赤外線分光法
前述の方法を使用して、ＰＡ溶液を無水条件下で調製した。ＰＡをＤ_２Ｏに可溶化し、ＤＯＨでｐＨを調整し、Ｄ_２Ｏ中１５０ｍＭのＮａＣｌを使用して１２ｍＭのＰＡ及び３０ｍＭのＮａＣｌに希釈した。ＰＡ溶液を、測定直前にＤ_２Ｏ中５ｍＭに希釈し、次いで、５０μｍの分離を伴う２つのＣａＦ_２ウィンドウの間に配置した。透過率は、Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｅｎｓｏｒ ３７ ＦＴＩＲ分光計で測定した。１ｃｍ^－１の解像度で２５回のスキャンにわたってスペクトルを記録し、平均化し、Ｄ_２Ｏ緩衝液のみ試料の３０ｍＭのＮａＣｌ及び空気をバックグラウンド減算して、最終スペクトルを得た。スペクトル内のピークは、ＭＡＴＬＡＢピークファインダー機能を使用して特定し、二次構造は、ピーク位置を通して特定した。

【0100】

蛍光異方性
希釈ＰＡ、ＴＧＦ－β１模倣ＰＡ、及び蛍光色素コンジュゲートＴＧＦ－β１模倣ＰＡのＰＡ共組織化体を、９０：８：２ｍｏｌ％の比率で調製した。色素コンジュゲートＰＡを、ＴＧＦ－β１模倣エピトープのＮ末端アミンにコンジュゲートしたテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）分子と前述のように合成した。ＰＡ溶液を前述のように調製し、測定直前に１００μＭのＰＡ、１００μＭのＣａＣｌ２、及び３０ｍＭのＮａＣｌに希釈した。蛍光測定は、電力が１８Ａに設定された３００Ｗキセノンアークランプを装備したＩＳＳ ＰＣ１光子計数定常状態蛍光分光計で行った。１ｍｍの励起スリット幅（８ｎｍ帯域幅）及び０．５ｍｍの放射スリット幅（４ｎｍ帯域幅）が使用された。蛍光異方性の測定は、λｅｘ＝５５４ｎｍ及びλｅｍ＝５８０ｎｍで、式：

【数1】

（式中、Ｆ_｜｜は励起平面に平行な強度であり、Ｆ_⊥は励起平面に垂直な強度であり、ｇはｇ因子であり、これは垂直格子と平行格子の間の放射の違いを説明する）に従って行われた^１。測定は３つ組みで行われ、最終データ分析のために平均化された。

【0101】

横緩和核磁気共鳴分光法
ＮＭＲスペクトルは、ＱＣＩ－Ｆクライオプローブを有するＢｒｕｃｋｅｒ Ｎｅｏシステムで、６００ＭＨｚで取得した。ＴＦＡ－ｄ、Ｈ_２Ｏ／Ｄ_２Ｏを９／１の比率（Ｄ_２Ｏは０．０５重量％の３－（トリメチルシリル）プロピオン－２，２，３，３－ｄ_４酸、ナトリウム塩を含有する）で溶媒として使用して、ＰＡのＮＭＲスペクトルを２５℃で記録した。化学シフトは、１００万分の１（ｐｐｍ）で報告される。９０°のパルス幅は１５μｓであり、典型的なスペクトルは３２回のスキャンを必要とした。可変ループにおいて、０．２ｍｓの遅延時間でＣａｒｒ－Ｐｕｒｃｅｌｌ－Ｇｉｌｌ－Ｍｅｉｂｏｏｍパルスシーケンスを使用して、スピン－スピン緩和速度を測定した。ピーク強度データは、以下の形態に適合し、指数関数的であった：

【数2】

（式中、τは遅延時間の長さであり、Ｒ２はスピン－スピン緩和速度であり、ｂはベースラインである）^２。

【0102】

細胞培養
Ｃ２８／Ｉ２ヒト関節軟骨細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、標準細胞培養技法を使用して維持した。０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を継代し、継代３～８で実験に使用した。

【0103】

インビトロでのＰＡ細胞処理
ＰＡ溶液（骨格ＰＡ、ＴＧＦ ＰＡ、ｌｎＴＧＦ ＰＡ、及びペプチドのみ）を前述のように１重量％で滅菌条件下で調製した。２４時間未満にわたる細胞処理のために、ＰＡ処理溶液または天然ｒｈＴＧＦ－β１タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．５％ウシ胎仔血清（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｇｉｂｃｏ）で構成される飢餓培地中で希釈した。２４時間以上にわたる細胞処理のために、ＰＡ処理溶液または天然ｒｈＴＧＦ－β１タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を完全成長培地中で希釈した。ＰＡ溶液を、１、１０、５０、及び１００μＭの様々な濃度で調製し、濃度は、エピトープＰＡの濃度を指す。

【0104】

細胞生存率アッセイのために、細胞を、約１５，４００細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。次いで、細胞を、インビトロで２４時間または３日間、溶液中のＰＡで処理した。

【0105】

４時間のＰＡ処理のウエスタンブロットのために、細胞を、６００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。次いで、細胞を、０．５％ウシ胎仔血清（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｇｉｂｃｏ）中で２０時間、血清飢餓状態にした。次いで、細胞を、インビトロで４時間、溶液中のＰＡで処理した。３日間のＰＡ処理のウエスタンブロットのために、細胞を、２３０，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。次いで、細胞を、インビトロで３日間、溶液中のＰＡで処理した。

【0106】

免疫細胞化学（ＩＣＣ）のために、１２ｍｍガラスカバースリップを、滅菌濾過した０．０１ｍｇ／ｍＬのポリ－Ｄ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液でコーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。カバースリップを滅菌水で３回洗浄し、少なくとも３０分間空気乾燥させた。細胞を、約３，０００細胞／カバースリップの密度でカバースリップ上に播種し、２４時間培養した。次いで、細胞を、インビトロで３日間、溶液中のＰＡで処理した。処理後、細胞を、室温で１５分間、４％パラホルムアルデヒド中に固定した。

【0107】

生存率アッセイ
２Ｄ生存率アッセイのために、細胞を培養し、前述のようにインビトロでＰＡ溶液で処理した。２４時間または３日間の培養後、細胞をＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、３７℃で３０分間、２μＭのカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００ｎｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＨＢＳＳと培地を交換した。細胞をＨＢＳＳで洗浄し、画像化した。

【0108】

３Ｄ生存率アッセイのために、細胞をＰＡゲルに封入し、後述するようにインビトロで培養した。３日間の培養後、培地の画分を収集して、ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）ＬＤＨ細胞傷害性アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞溶解時にのみ放出される細胞質酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の存在を測定した。

【0109】

ウエスタンブロット
タンパク質を、Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞から抽出し、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を行って、各試料のタンパク質含有量を決定した。細胞タンパク質を充填し、４～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して分離した。次いで、それをゲルからニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に電気泳動転写した。膜を１０％乳溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で３０分間遮断し、続いて４℃で一次抗体を用いて一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した：ウサギ抗ｐＳｍａｄ２（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗Ｓｍａｄ２（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗Ｓｏｘ９（１：５００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗アグレカン（１：５００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウサギ抗ＣＯＭＰ／軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（１：５００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗コラーゲンＩＩ（１：５００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、及びマウス抗アクチン（１：１０００、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏ）。次いで、膜を、対応する二次ＨＲＰコンジュゲート抗体（１：１０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ）とインキュベートした。タンパク質シグナルは、Ｒａｄｉａｎｃｅ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＥＣＬ基質（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して検出した。タンパク質負荷の対照として総受容体含有量またはアクチンに標準化された密度測定分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行った。定量化のために、実験的な３つ組みの試料を分析し、２つの異なる実験を行った。

【0110】

免疫細胞化学
固定試料を透過させ、室温で２時間、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び１％正常ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の溶液中で遮断した。試料を一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した：ウサギ抗Ｓｏｘ９（１：５００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗アグレカン（１：５００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、マウス抗コラーゲンＩＩ（１：５００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ）、及びマウス抗核（１：５００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。翌日、試料をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８二次抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５二次抗体、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、及び／またはＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と室温で２～３時間インキュベートした。次いで、２Ｄ細胞培養のために、試料をＤＡＰＩ（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに室温で１０分間インキュベートした。ガラスカバースリップにまだ設置していない場合、試料をＩｍｍｕ－Ｍｏｕｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに載置し、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒスペクトル顕微鏡で画像化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、画像分析を行った。

【0111】

細胞の封入
計数するために、軟骨細胞をトリプシン処理し、成長培地に再懸濁し、次いで、ペレット化し、成長培地に６×１０^７細胞／ｍＬまで再懸濁した。細胞溶液を、３０ｍＭのＮａＣｌ中３重量％で調製した滅菌ＰＡ溶液と１：２ｖ／ｖで混合した。またｒｈＴＧＦ－β１タンパク質を封入するゲル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）については、熱アニーリング後に可溶性タンパク質をＰＡ溶液に添加した。１２０μＬのＰＡ／細胞溶液をピペットで穏やかに完全に混合し、次いでＰＤＬコーティングされた１２ウェルチャンバースライド（Ｉｂｉｄｉ）に配置した。１１０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、及び２５ｍＭのＣａＣｌ_２で構成される滅菌ゲル化溶液を、ＰＡ／細胞溶液の上にピペットで滴下し、ゲルを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、過剰なゲル化溶液を除去し、２５０μＬの成長培地を各ウェルに添加した。上述のように、ＬＤＨ生存率アッセイのために培地を３日後に除去した。ＩＣＣについては、３日間のインビトロ培養後、ゲルを４％のパラホルムアルデヒドで室温で３０分間固定した。

【0112】

統計分析
統計分析は、ＭＡＴＬＡＢ２０２１ソフトウェアを使用して行った。データが非ガウスであり、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を代わりに使用した細胞面積分析を除き、Ｔｕｋｅｙの事後分析を伴う有意性の分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を、全ての多群分析に使用した。エラーバーは、標準誤差を表す。

【0113】

結果
ＴＧＦ－β１模倣ＰＡナノ構造の設計
本明細書の実施形態の開発中に、環状ペプチドＣＥＳＰＬＫＲＱＣ（配列番号１）の提示を介して、軟骨におけるＴＧＦ－β１シグナル伝達を模倣する超分子ナノ構造を開発するための実験を行った。ＴＧＦ－β１模倣ＰＡ分子（ＴＧＦ ＰＡ）を、このペプチドを、テトラ（エチレングリコール）スペーサーを介して２つの異なるＰＡ分子のＣ末端にコンジュゲートすることによって設計した（図１）。エピトープＳＥＳＰＬＫＲＱＳ（配列番号２）を提示する模倣ＰＡ（ｌｎＴＧＦ ＰＡ）の直鎖非環化誘導体もまた設計した。１００ｍｏｌ％のエピトープＰＡ分子を含有するＰＡ組織化体は、おそらくエピトープの立体要求のために、長い繊維状構造を形成することができなかった（図７）。各骨格ＰＡ単独では、堅牢な高アスペクト比構造を形成し^３７、これは、細胞生存率及び生物活性をより促進することが示されている^{３８、３９}。したがって、非生物活性希釈骨格ＰＡ分子（骨格ＰＡ－ａ及び骨格ＰＡ－ｂ）を、それぞれ、環状エピトープ（ＴＧＦ ＰＡ－ａ及びＴＧＦ ＰＡ－ｂ）または非環状対照（ｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａ及びｌｎＴＧＦ ＰＡ－ｂ）にコンジュゲートされたそれぞれのＰＡと共組織化して、それらの表面上にエピトープを示す長い繊維状ナノ構造を形成した。エピトープの生物活性が、ＰＡ超分子ナノ構造上でのその提示によって増強されるかどうかを調べるために、可溶性環状ＴＧＦ－β１模倣ペプチドも単独で評価した。

【0114】

ＴＧＦ－β１模倣ＰＡナノ構造の材料特徴付け
生物体活性及び希釈ＰＡのモル比が、ナノ構造形態、エピトープ提示、及び生物活性に影響を与えることが示されているため^{２８、３０、３１}、エピトープＰＡと対応する希釈骨格ＰＡとの様々な共組織化体比（１０、２５、５０、７５、及び１００モル％）を特徴付けて、細胞生存率及び生物活性を促進する長く均一な構造に自己組織化するための最適な比率を決定した。低温透過型電子顕微鏡法（低温ＴＥＭ）は、異なる骨格系と共組織化体比との間のナノ構造形態の明確な違いを明らかにした（図２ａ～ｆ、図７、及び図８）。希釈骨格ＰＡのみが、エピトープＰＡ分子との共組織化時に変化する、高アスペクト比のねじれたリボン様構造を形成した（図２ａ及び２ｄ）。１０％のモル比で、ＴＧＦ ＰＡ系及びｌｎＴＧＦ ＰＡ系の両方が、高アスペクト比構造を形成した。ＴＧＦ ＰＡ－ａは、幅５０～６０ｎｍの広い螺旋状リボン様構造を形成し、ＴＧＦ ＰＡ－ｂは、一次元円筒形繊維を形成した（図２ｂ及び２ｅ）。ＴＧＦ ＰＡのモル比が５０ｍｏｌ％以上に増加すると、両方の系は、おそらく環状エピトープからの立体反発に起因して、短い繊維またはミセルを形成した（図７）。両方の直鎖ｌｎＴＧＦ ＰＡ系は、１０ｍｏｌ％で幅２０～３０ｎｍの狭いねじれリボンを形成した（図２ｃ、２ｆ、及び８）。動的光散乱は、ＴＧＦ－β１模倣エピトープのみが、約２ｎｍの水力学的直径を有するミセル及び２００ｎｍ程度のミセルの凝集体を形成したことを明らかにした（図９及び１０）。

【0115】

低温ＴＥＭで観察されるこれらの形態をより定量的に特徴付けるために、ナノ構造を、小角度及び広角度Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ及びＷＡＸＳ）を使用してインサイチュで分析した（図２ｇ～ｈ、１１、１２）。両対数スケールでプロットされたＳＡＸＳ強度プロファイルは、ＴＧＦ ＰＡ－ａについては約－２、ＴＧＦ ＰＡ－ｂについては約－１の傾きを有する低ｑ Ｇｕｉｎｉｅｒ領域に線形的に適合させることができ、それぞれ、高アスペクト比の二次元及び一次元構造を示した（図２ｇ）^４０。ＷＡＸＳは、２つの骨格系間の分子充填スキームの明確な違いを明らかにした（図２ｈ）。ＴＧＦ ＰＡ－ａ ＷＡＸＳパターンにおける複数の鋭いピークは、ＴＧＦ ＰＡ－ｂの低秩序内部組織とは対照的に、高秩序の結晶充填を示した。次に、組織化体の二次構造及びＰＡ分子間の水素結合の程度を調べるために、円形二色性（ＣＤ）及びフーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）分光法を行った（図２ｉ～ｊ、１３、及び１４）。骨格ＰＡ－ａ、骨格ＰＡ－ｂ、及びＴＧＦ ＰＡ－ａ組織化体は、ＣＤ最大がおよそ１９５ｎｍで強いβシート様特性を示したが^４１、両方のｌｎＴＧＦ ＰＡ組織化体は、ほとんどまたは全くβシート構造を有さず（図２ｉ）、直鎖エピトープがβシート形成に必要とされる水素結合をより重度に妨げたことを示した。同様に、ＴＧＦ ＰＡ－ａ及びＴＧＦ ＰＡ－ｂ組織化体の両方のＦＴＩＲスペクトルは、およそ１６２５～１６４０ｃｍ^－１の正準βシートアミドＩバンドを示し^４２、これはｌｎＴＧＦ ＰＡスペクトルの両方に存在しなかった（図２ｊ）。骨格ＰＡ－ａはまた、およそ１６００ｃｍ^－１で第２のピークを示し、これは他の全ての試料に存在しなかった（図２ｊ）。骨格ＰＡ及びエピトープＰＡの異なる組み合わせは、組織化体の内部秩序及び二次構造の変化をもたらした。

【0116】

組織化体内の個々のＰＡ分子の分子間の動態及び移動度を更にプローブするために、蛍光異方性（ＦＡ）を使用して、ＴＧＦ ＰＡナノ構造内のＴＡＭＲＡ標識エピトープの回転拡散を測定した（図３ａ）。ＴＧＦ ＰＡを１０ｍｏｌ％で希釈骨格ＰＡと共組織化し、０．２ｍｏｌ％のＴＧＦ ＰＡ分子を環状エピトープ上のＴＡＭＲＡとコンジュゲートした。ＴＡＭＲＡフルオロフォアは自己組織化を妨げず、ＴＡＭＲＡ標識エピトープを有するＰＡナノ構造は、標識されていない組織化体と同じ形態を形成したことが確認された（図１５）。ＦＡは、ＴＧＦ ＰＡ－ｂと比較して、回転拡散の観点から、エピトープ移動度の増加を示したＴＧＦ ＰＡ－ａにおける顕著に低い異方性値を明らかにした（図３ａ）。このより高い回転拡散は、ＴＧＦ ＰＡ－ａ組織化体上のエピトープが高次構造を変化させるか、またはナノ構造から延在し、細胞受容体と結合することを可能にし得る。

【0117】

組織化体の内部動態及び個々のＰＡ分子の移動拡散をよりよく理解するために、横緩和核磁気共鳴（Ｔ２－ＮＭＲ）分光法を使用して、ＣＥＳＰＬＫＲＱＣ（配列番号１）環状エピトープのリジン残基のε炭素（Ｈε）上のメチレンプロトン（２．６４ｐｐｍで観察される）、及びペプチドＮ末端のアルキル尾部の末端炭素上のメチルプロトン（０．７７ｐｐｍ）のスピン格子緩和（Ｔ２）速度を測定した（図３ｂ～ｃ、１６、及び１７）。標識エピトープの回転拡散のみを測定するＦＡとは対照的に、Ｔ２－ＮＭＲはまた、組織化体内のＰＡ分子の移動拡散をプローブし、分子間凝集を推定することができる。ＴＧＦ ＰＡ－ａ組織化体におけるアルキル尾部プロトンの緩和速度は、ＴＧＦ ＰＡ－ｂ組織化体よりもはるかに高く、ほぼ５倍高かった（図３ｂ～ｃ）。この高い緩和速度は、超分子構造を安定化するＰＡ分子間の引力によって説明されるように、より低い移動拡散及びより強い分子間凝集と一致していた。アルキル尾部プロトンからのＴ２－ＮＭＲ測定は、我々のＷＡＸＳ結果を確認し、ＴＧＦ ＰＡ－ａ組織化体が、ＴＧＦ ＰＡ－ｂと比較して高い内部秩序及びより強い分子間凝集を有したことを示した。対照的に、ＴＧＦ ＰＡ－ａ及びＴＧＦ ＰＡ－ｂ組織化体の両方におけるエピトーププロトンは、同様の低い緩和速度を有した（図３ｂ～ｃ）。これは、ＴＧＦ ＰＡ－ａ組織化体が高い内部秩序を有していたが、ナノ構造表面上に提示されたエピトープが可撓性及び移動性であったことを示した。内部結晶化度及びエピトープ移動度のこの共存は、エピトープＰＡ分子がＴＧＦ ＰＡ－ａナノ構造内の超分子動態に顕著に影響を及ぼしたことを明らかにした。ＴＧＦ ＰＡ－ａ組織化体において、環状エピトープＰＡ分子は、結晶構造に局所的な破壊を生じさせ、エピトープにより大きな移動度を提供した可能性がある。骨格ＰＡ組織化体におけるアルキル尾部プロトンの同様のＴ２－ＮＭＲ測定は、骨格ＰＡ－ｂと比較して、骨格ＰＡ－ａ組織化体の外周における超分子動態の増加を明らかにした（表１）。ＴＧＦ ＰＡ－ａにおける骨格及びエピトープＰＡ動態のこれらの相互作用は、組織化体の内核が非常に秩序がありかつ凝集している場合でも、エピトープ及び外周は依然として動的移動度を示すことができることを示したため、予想外であった。ＴＧＦ ＰＡ－ａナノ構造はまた、それらの広いベルト様形態に起因して表面積が増加しており、これは、細胞とより好ましく相互作用するための動的運動範囲を有する環状エピトープ分子を提示する可能性が高い。

【表1】

【0118】

ＴＧＦ－β１模倣ペプチド両親媒性ナノ構造に対する細胞応答
ＴＧＦ ＰＡ－ａ及びＴＧＦ ＰＡ－ｂのナノ構造間の形態、内部秩序、及び超分子動態の違いを考慮して、培地中で希釈したＰＡ溶液で、インビトロでヒト関節軟骨細胞を処理することによって、生物活性に対するこれらの違いの効果を分析した。生体適合性を、異なる共組織化体比及び濃度で、各ＴＧＦ ＰＡ溶液で細胞を処理することによって測定し、次いで、培養の２４時間及び３日後に生存率を分析した（図１８及び１９）。２４時間後、全てのＰＡ処理は、１０μＭ及び５０μＭの両方で高い生存率（３００細胞／ｍｍ^２超）を示した。３日後、ほぼ全ての１０μＭのＰＡ処理は同様に、高い生存率（４００細胞／ｍｍ^２超）を示した。２５ｍｏｌ％及び５０ｍｏｌ％の共組織化体は、生体適合性及び形態の両方が変化したが、均一な繊維構造を形成した１０％共組織化体は、一貫した濃度及び時間依存的生体適合性を明らかにした。総ＰＡ濃度を１０ｍｏｌ％エピトープの共組織化体で変更して、生体適合性のための最適濃度を決定した。細胞を、様々な濃度で各ＴＧＦ ＰＡ、ｌｎＴＧＦ ＰＡ、骨格ＰＡ、ペプチド単独、または天然組換えヒトＴＧＦ－β１（ｒｈＴＧＦ－β１）を含む溶液中で処理した（図２０及び２１）。培養の２４時間後、１００μＭの骨格ＰＡ－ｂ及びｌｎＴＧＦ ＰＡ－ｂを除く全てのＰＡ処理は、高い生存率（３００細胞／ｍｍ^２超）を示した。培養の３日後、１０μＭ以下の全てのＰＡ処理は、高い生存率（３００細胞／ｍｍ^２超）を示したが、より高い濃度は、おそらく過度のシグナル伝達または３日後に細胞の上に蓄積した過剰なＰＡ材料に起因して、生存率を顕著に減少させた。これらの結果は、５０μＭ及び１０μＭのＰＡ処理が、それぞれ、最大２４時間及び３日間の処理時点に対して適切な濃度であったことを実験設計に知らせた。

【0119】

３日後、骨格ＰＡ－ａ系、ＴＧＦ ＰＡ－ａ、及びｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａは、対応する骨格ＰＡ－ｂ系よりも高い生体適合性を示した。生体適合性のこの違いは、全ての組織化体が、一般的に細胞生存率の向上に起因する物理的属性である長い高アスペクト比構造を形成したため、予想外であった^{３５、４３}。各系の分子は、非生物活性ＰＡ骨格内の２つの隣接するアミノ酸の順序のみ異なる。しかしながら、ＷＡＸＳ及びＴ２－ＮＭＲ分光法は、ＴＧＦ ＰＡ－ｂ組織化体について、内部秩序があまりなく、緩和速度が低いことを明らかにし、それらがナノ繊維からのＴＧＦ ＰＡ－ｂ分子の解離を介して細胞脂質膜を破壊し、細胞死をもたらす原因となった可能性がある、移動拡散の増加及びより弱い内部凝集を示唆した。逆に、ＴＧＦ ＰＡ－ａ組織化体の高い内部秩序及び緩和率は、高アスペクト比ナノ構造が無傷のままであり、共存し、細胞と相互作用することを可能にする、より強い内部凝集を示した。

【0120】

ＴＧＦ－β１模倣ＰＡナノ構造が細胞内シグナル伝達を活性化する
本明細書の実施形態の開発中に、軟骨細胞における細胞内ＴＧＦ－β１シグナル伝達を活性化するＰＡ材料の能力を評価するために実験を行った。ＴＧＦ ＰＡ－ａナノ構造について、広いベルト様形態、結晶内部秩序、及び動的エピトープは、軟骨形成シグナル伝達のための増強された生物活性に寄与するだろうと仮定された。共組織化体及び濃度掃引を、異なる共組織化体比（１０、２５、及び５０ｍｏｌ％）及び濃度（１０及び５０μＭ）の各ＴＧＦ ＰＡ、陽性対照としてのｒｈＴＧＦ－β１、または陰性対照としての飢餓培地で細胞を処理することによって行った。処理の４時間後、リン酸化Ｓｍａｄ２（ｐ－Ｓｍａｄ２）及びＳｏｘ９のレベルを評価するために、ウエスタンブロット分析を行った（図４ａ～ｂ及び２２）。Ｓｍａｄ２リン酸化は、受容体結合後の軟骨における正準ＴＧＦ－β１シグナル伝達の最初のステップである。活性化時に、リン酸化Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３は、核に転座して転写を開始する（軟骨形成遺伝子の転写を含む）Ｓｍａｄ４と複合体を形成する^{１１、１２}。１０ｍｏｌ％共組織化体及び５０μＭでのＴＧＦ ＰＡ－ａは、強いｐ－Ｓｍａｄ２活性化を示した。同様に、おそらく短い繊維及びミセルがあまり好ましくない立体構造または分布のエピトープを示したため、高い共組織化体比は、細胞応答をほとんど誘導せず、長い繊維構造で以前に見られた増強されたシグナル伝達を妨げた。Ｓｏｘ９は、初期の間葉系幹細胞縮合中に発現する核転写因子であり、成熟した軟骨細胞において顕著に上方調節されるとは予想されなかった^１０。Ｓｏｘ９の顕著な上方調節はなかったが、全ての条件でベースラインレベルの発現が示され、健康な軟骨細胞表現型を示した（図２２）。

【0121】

生体適合性及び生物活性の結果に基づいて、全てのエピトープＰＡ組織化体については１０ｍｏｌ％共組織化体、短時間（２４時間未満）の処理については５０μＭ、そして長時間（２４時間超）の処理については１０μＭで実験を行った。細胞を、５０μＭの各ＴＧＦ ＰＡ、ｌｎＴＧＦ ＰＡ、骨格ＰＡ、ペプチド単独、またはｒｈＴＧＦ－β１で４時間処理した。ウエスタンブロット分析は、骨格ＰＡ、直鎖エピトープＰＡ、またはペプチド単独による活性化を示さず、エピトープの環化及びＰＡナノ構造上のその提示の両方が生物活性を付与したという仮説を確認した（図４ｃ～ｄ）。ＴＧＦ ＰＡ－ａは、その構成異性体であるＴＧＦ ＰＡ－ｂを含む他の全てのＰＡ処理よりも顕著にｐ－Ｓｍａｄ２を上方調節した。これは更に、内側ＰＡ骨格が形態及び内部動態を介して生物活性シグナル伝達に影響を及ぼし、ＴＧＦ ＰＡ－ａ組織化体上により好ましく提示されるエピトープとの細胞受容体相互作用を増強するという仮説を支持した。次に、模倣ＰＡナノ構造によるＴＧＦ－β１活性化の性質を研究するために、細胞を、各々がインビトロ及びインビボでＴＧＦ－βの３つのアイソフォーム全てを中和することが示されている汎ＴＧＦ－β中和抗体、１Ｄ１１を添加される、または添加されない、ＴＧＦ ＰＡ－ａ、ＴＧＦ ＰＡ－ｂ、またはｒｈＴＧＦ－β１で処理した^{４４～４６}。ウエスタンブロット分析は、１Ｄ１１がｐ－Ｓｍａｄ２の活性化においてＴＧＦ ＰＡ－ａ、ＴＧＦ ＰＡ－ｂ、及びｒｈＴＧＦ－β１を効果的に中和したことを明らかにした（図４ｅ～ｆ）。１Ｄ１１の有無にかかわらずｐ－Ｓｍａｄ２の活性化を比較すると、ＴＧＦ ＰＡ－ａに対する１Ｄ１１の中和効果は統計的に有意であったが、ＴＧＦ ＰＡ－ｂに対するその効果は有意ではなかった。これは、ＴＧＦ ＰＡ－ａがｐ－Ｓｍａｄ２をＴＧＦ ＰＡ－ｂよりも上方調節したためである可能性が最も高い。これらの結果は、模倣ＴＧＦ ＰＡ－ａナノ構造が軟骨細胞における細胞内ＴＧＦ－β１シグナル伝達を活性化したことを確認した。

【0122】

ＴＧＦ ＰＡナノ構造は、軟骨細胞におけるＥＣＭ合成を増強する
関節軟骨における軟骨細胞の主な役割は、ＥＣＭの維持であるため^１、８、軟骨性タンパク質の合成を、インビトロで３日間の１０μＭのＰＡ処理後に分析した。ウエスタンブロットを使用して、コラーゲンＩＩ（Ｃｏｌ２ａ１）、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、及びアグレカン（Ａｃａｎ）のレベル、関節軟骨の全ての必須成分^{１０、１２}、及び転写因子Ｓｏｘ９（図５ａ～ｂ）を分析した。一般に、ＴＧＦ ＰＡ－ａは、他の全てのＰＡ処理よりも顕著にＥＣＭ合成を上方調節した。骨格ＰＡ、直鎖状のエピトープＰＡ、及びペプチド単独の処理は、再び低い活性化を示し、ＰＡナノ構造上の環状エピトープの提示が生物活性にとって重要であることを更に実証した。興味深いことに、ＴＧＦ ＰＡ－ａで処理された細胞は、天然ｒｈＴＧＦ－β１タンパク質で処理された細胞よりも顕著に高いレベルのコラーゲンＩＩを有した。軟骨細胞シグナル伝達は、主に、インテグリン－コラーゲンＩＩ結合^４７、及びＥＣＭで隔絶された内因性ＴＧＦ－β１の機械的活性化^４８などの物理的な細胞－ＥＣＭ相互作用によって媒介され、ＴＧＦ ＰＡ－ａナノ構造の形態及び超分子動態が、受容体結合に対してより好ましく模倣エピトープを物理的に提示し得ることを示す。

【0123】

ウエスタンブロットからのこれらの結果を確認するために、免疫細胞化学（ＩＣＣ）染色及び蛍光強度画像分析を、ウエスタンブロットと同じ条件下で処理された細胞で行った（図５ｃ～ｄ）。共焦点顕微鏡画像化の結果は、ウエスタンブロットの結果と一致し、模倣ＴＧＦ ＰＡ－ａが、天然ｒｈＴＧＦ－β１よりも顕著に多くのコラーゲンＩＩ産生を誘導したことを明らかにした（図５ｃ）。これらの結果は、ＴＧＦ ＰＡ－ａナノ構造が、溶液中の天然タンパク質と比較して、受容体結合のための最適な配向、密度、及び／または動的運動を有するエピトープを提示した可能性があることを示す。加えて、天然ＴＧＦ－β１タンパク質は、インビボでその活性形態でわずか２～３分の半減期を有する^４９。したがって、ＰＡナノ構造は、天然タンパク質に対して、エピトープ分解を遅らせ、活性化動態を改善した可能性がある。ｒｈＴＧＦ－β１及びＴＧＦ ＰＡ－ａの両方が、同様のレベルでアグレカン合成を顕著に増加させた。模倣ペプチド単独で処理した細胞は、いずれのタンパク質の上方調節をほとんど示さず、再び、ペプチド単独ではＴＧＦ－β１を模倣することができないことを示した。Ｆ－アクチンの染色はまた、ｒｈＴＧＦ－β１及びＴＧＦ ＰＡ－ａで処理された細胞が健全な軟骨細胞表現型を維持し、肥大を防いだことを明らかにし、これは、規則的な、丸いまたは楕円形の形態、及びコンパクトな細胞サイズによって証明された（図５ｃ～ｄ）。これらの結果は、ＴＧＦ ＰＡ－ａがＥＣＭ合成を増強しただけでなく、より長いインビトロ培養期間にわたって肥大することなく成熟軟骨細胞表現型を維持したことも示した。

【0124】

三次元ＴＧＦ ＰＡ足場は、軟骨細胞表現型を維持する
ＴＧＦ－β１模倣ＰＡナノ構造は、細胞内ＴＧＦ－β１シグナル伝達及びＥＣＭ合成を効果的に活性化したため、関節軟骨の構造及び機能における三次元ＥＣＭ組織の重要な役割に起因して、三次元ゲルネットワークとしてのそれらの機能を調べるために、本明細書の実施形態の開発中に実験を行った。ＴＧＦ ＰＡ－ａは生物活性を示したため、試験は、骨格ＰＡ－ａ、ＴＧＦ ＰＡ－ａ、及びｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａで構成されるヒドロゲルに焦点を当てた。ＰＡヒドロゲルネットワークは、ＰＡ溶液をカルシウムイオンに曝露することによって調製された^２６。生物活性の違いがヒドロゲルの機械的特性の違いによって引き起こされないことを確認するために、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）及びレオロジーを行い、ＰＡヒドロゲルがそれぞれ同様の形態及び粘弾性挙動を有することを実証した（図６ａ～ｄ、２４、表２）。３つのＰＡゲルは、同様の流動ひずみ及び弾性率を有し、それらがインビボで剪断ひずみと同様に挙動し得ることを示した。次に、軟骨細胞をＰＡゲル内に封入し、インビトロでそれらを３日間培養して、生体適合性を測定し、軟骨形成挙動を観察した。細胞は、封入プロセスに耐え、培養培地中の細胞溶解時にのみ放出される細胞質酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のレベルによって測定した場合、高い生存率を維持した（図２３）。封入された細胞の形態及び分布を、Ｆ－アクチンＩＣＣ染色及び共焦点顕微鏡法を使用して調べた（図６ｅ～ｇ）。細胞の遊走またはクラスター化の増加は、変形性関節症、脱分化、及び軟骨形成能力の低下を示すため^{５０～５３}、ＰＡゲル内の軟骨細胞の表現型応答及び遊走応答を分析した。生存率に顕著な違いはなかったが、各ＰＡゲルにおける細胞は顕著に異なって挙動した。同じ濃度の細胞が封入されているにもかかわらず、ＴＧＦ ＰＡ－ａゲルと比較して、大部分の骨格ＰＡ－ａ及びｌｎＴＧＦ ＰＡ－ａゲル内で目に見える細胞ははるかに少なかった（図６ｅ～ｇ）。対照的に、ＴＧＦ ＰＡ－ａゲル中の細胞は、ゲル内に留まり、インビトロで３日間生存し、ＴＧＦ ＰＡ－ａヒドロゲルが、持続可能な微小環境のために必要な生物活性シグナルを提供したことを示した。更に、細胞は、コンパクトで楕円形の形態を示し、天然軟骨における軟骨形成挙動に類似したＴＧＦ ＰＡ－ａゲル全体によく分散していた。これらの細胞－ＰＡ相互作用は、軟骨形成性ＴＧＦ－β１応答を誘導することに加えて、我々のＴＧＦ－β１模倣ＰＡナノ構造が、３次元ＥＣＭ環境内で健全な軟骨細胞の表現型及び挙動を維持したことを示した。

【表2】

【0125】

実施例２
スラリー製剤及びインビボデータ
方法
ＰＡ／ＨＡスラリー製剤
インビトロデータについて記載したように、ＰＡ溶液を２重量％で調製し、次いで様々な量の架橋ヒアルロン酸粒子と混合した。得られたスラリーを物理的に攪拌し、次いで１５分間微量遠心分離した後、４℃で２４時間保管して、ＨＡ粒子を完全に水和させた。スラリー材料を１９ゲージの針を備えた１ｍＬのシリンジに充填し、手術中に使用するまで氷上に保持した。蛍光標識ＰＡは、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）の希釈骨格ＰＡ－ａのＣ末端への共有結合機能化によって産生された。蛍光標識ＰＡ実験について、最終共組織化体比は、１０ｍｏｌ％エピトープＰＡ、８８ｍｏｌ％骨格ＰＡ、及び２ｍｏｌ％ＴＡＭＲＡ ＰＡであった。

【0126】

レオロジー
測定は、２５ｍｍ平行プレート固定具を備えたＡｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＭＣＲ３０２レオメータで行った。１２０μＬのＰＡ／ＨＡハイブリッドスラリーを底板上に配置し、３０μＬの５０ｍＭのＣａＣｌ_２／７５ｍＭのＮａＣｌゲル化溶液を上部固定具上に配置した。固定具を１０分間、０．５ｍｍのギャップまで下げ、その間、０．１％の振動ひずみを１０ｒａｄ／ｓの角周波数で適用した。ギャップの高さを変化させて、通常の力を０Ｎに保った。次に、０．１％～１００％のひずみで、１０ｒａｄ／ｓでひずみ掃引を行い、ゲルを破壊するひずみを測定した。

【0127】

ウサギ骨軟骨欠損モデル
この手順には、ニュージーランド白ウサギ（２．８～３．２ｋｇ）を使用した。手術前に、ウサギを手術部位にわたってクリップで留め、クロルヘキシジンスクラブで滅菌処理した。全てのウサギについて、膝蓋腱の外側面に３ｃｍの曲線切開を行った。関節包及び滑膜は、関節の外側面にわたって切開された。我々の確立されたプロトコルに従って、各ウサギの内側顆に約３ｍｍの深さの円形骨軟骨欠損（直径２～３ｍｍ）を両側に作製した。約３０μＬのＰＡ／ＨＡスラリーをシリンジから排出し、欠損空間に充填した。ＰＡ／ＨＡスラリーで欠損部を充填した後、約３０μＬの滅菌５０ｍＭのＣａＣｌ_２、７５ｍＭのＮａＣｌゲル化溶液を各欠損部の上に滴加した。生理食塩水で関節を洗浄した後、滑膜及び関節包を連続パターンで４－０の吸収性縫合糸を使用して１層に閉じた。また、筋層及び皮下組織を４－０の吸収性縫合糸で閉じ、表皮下パターンで４－０または５－０の吸収性縫合糸で皮膚を閉じた。安楽死後、手術関節を採取し、肉眼的な外観をデジタル写真で記録した。次いで、帯のこを使用して、各群の手術した内側顆を、欠損部及びそれに関連する下部の軟骨下骨を含む小さな骨ブロックに切断した。骨ブロックを１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、その後、ＥＤＴＡ／スクロース脱灰溶液（５％スクロース中２０％ＥＤＴＡ）を使用して脱灰した。脱灰後、カミソリの刃を使用して欠損部の中心を通してブロックを半分に切断し、両方の部分を同じパラフィンブロックに埋め込んだ。連続する５μｍ厚さの切片を調製し、Ｈ＆Ｅで染色して、移植部位の一般的な形態を評価した。ＴｉｓｓｕｅＧｎｏｓｔｉｃｓ顕微鏡を使用して、染色した切片（組織学）及び染色していない切片（蛍光）の両方を画像化した。

【0128】

結果
インビボでＴＧＦ模倣ＰＡの生物活性を試験するために、ＴＧＦ ＰＡ－ａナノ繊維の溶液を架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）粒子と混合して、軟骨欠損部に移植することができ、関節内の剪断力に耐えることができる堅牢な注射可能なスラリー製剤を作製した。このハイブリッド材料の様々な比率を、異なる量のＨＡ（２～６重量％）と混合した２重量％のＰＡ溶液を使用して試験した。ハイブリッドゲルを破砕するために必要な貯蔵弾性率及びひずみは、ＨＡの濃度の増加に伴って増加した（図２５）。ＰＡゲル単独と比較して、ハイブリッドＰＡ／ＨＡスラリーは、破断するひずみが３～４倍高く、ハイブリッド材料の延性及び剪断に対する耐性の増加を強調した。高濃度のＨＡは、ゲルの剛性及び靭性を改善するが、それはまた、生理食塩水中の体積膨張の増加をもたらし、これは、移植後の材料の変位につながる可能性がある。したがって、機械的靭性と最小限の膨潤とのバランスをとるために、２重量％のＰＡ＋４重量％のＨＡスラリー製剤をインビボ研究に使用した。

【0129】

インビボで軟骨欠損部における材料保持を試験するために、ウサギの顆モデルにおいて、蛍光標識ＰＡで、ハイブリッドスラリーを骨軟骨欠損部に移植した（図２６）。ＰＡ／ＨＡスラリー（ピンク色）は、移植後の欠損部にはっきりと見えて局在していた。手術の１日後及び２日後の関節の外植片は、頑丈な血餅が肉眼的に観察され、インプラント部位で明確な蛍光シグナルが検出されたため、欠損部におけるインプラントの良好な保持を示した。組織学的染色は、インプラントと周囲の骨及び軟骨組織との良好な統合を示し、これは、堅牢な軟骨再生にとって重要である。７日後、欠損部位は、組織学的スライスにおいて、肉眼的に良好な組織充填及び軟骨再生の初期段階を示した。ＰＡ材料から蛍光シグナルは検出されず、インプラントが組織再生プロセスを開始し、次いで予想通りに生分解を開始したことを示唆した。

【0130】

前述の詳細な説明及び付随する例は、単なる例示にすぎず、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではなく、本開示の範囲は、専ら添付の特許請求の範囲及び等価物によって定義されることを理解されたい。

【0131】

本開示の実施形態に対する様々な変更及び修正は、当業者には明らかであろう。本開示の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または使用方法に関連するもの含むがこれらに限定されない、そのような変更及び修正は、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得る。

【0132】

本明細書で参照される任意の特許及び刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0133】

参照文献
以下の参考文献（そのうちのいくつかは番号によって本明細書に引用される）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
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Ｓｈａｈ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ ｆｏｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７，３２９３－３２９８（２０１０）．
Ｇｈａｔａｋ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １（ＴＧＦ１）－ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＤ４４Ｖ６－ＮＯＸ４ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９２，１０４９０－１０５１９（２０１７）．
Ｌｉ，Ｌ．，Ｏｒｎｅｒ，Ｂ．Ｐ．，Ｈｕａｎｇ，Ｔ．，Ｈｉｎｃｋ，Ａ．Ｐ．＆Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｌ．Ｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｈａｔ ｕｓｅ ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｂｏｔｈ ＴＧＦ－β ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．６，２３９２－２４０２（２０１０）．
Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＴＧＦ－β ｍｉｍｉｃ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｈｅｌｍｉｎｔｈ ｐａｒａｓｉｔｅ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８，（２０１７）．
Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６６１，１２７．Ａｕｇｕｓｔ ２６，１９９７．
Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７８０，４３６．Ｊｕｌｙ １４，１９９８．
Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ＴＧＦ－．ｂｅｔａ．ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，６３８，９１２．Ｏｃｔｏｂｅｒ ２８，２００３．
（１）Ｈｕｅｙ，Ｄ．Ｊ．；Ｈｕ，Ｊ．Ｃ．；Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ，Ｋ．Ａ．Ｕｎｌｉｋｅ Ｂｏｎｅ，Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅｍａｉｎｓ Ｅｌｕｓｉｖｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １６，２０１２，ｐｐ ９１７－９２１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２２４５４．
（２）Ｌｅｉｆｅｒ，Ｖ．Ｐ．；Ｋａｔｚ，Ｊ．Ｎ．；Ｌｏｓｉｎａ，Ｅ．Ｔｈｅ Ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ＯＡ－Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒ．Ｃａｒｔｉｌ．２０２１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｏｃａ．２０２１．０５．００７．
（３）Ｋａｒｓｄａｌ，Ｍ．Ａ．；Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ，Ｍ．；Ｌａｄｅｌ，Ｃ．；Ｓｉｅｂｕｈｒ，Ａ．Ｓ．；Ｂｉｈｌｅｔ，Ａ．Ｒ．；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｇｕｅｈｒｉｎｇ，Ｈ．；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｃ．；Ｂａｙ－Ｊｅｎｓｅｎ，Ａ．Ｃ．；Ｋｒａｕｓ，Ｖ．Ｂ．Ｄｉｓｅａｓｅ－Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＤＭＯＡＤｓ）ｏｆ ｔｈｅ Ｋｎｅｅ ａｎｄ Ｈｉｐ：Ｌｅｓｓｏｎｓ Ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｆａｉｌｕｒｅｓ ａｎｄ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒ．Ｃａｒｔｉｌ．２０１６，２４（１２），２０１３－２０２１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｏｃａ．２０１６．０７．０１７．
（４）Ｇｈｏｕｒｉ，Ａ．；Ｃｏｎａｇｈａｎ，Ｐ．Ｇ．Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ Ｎｏｖｅｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｔｈｅｒ．Ａｄｖ．Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ．Ｄｉｓ．２０１９，１１，１－１１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７７／１７５９７２０ｘ１９８６４４９２．
（５）Ｅｒｇｇｅｌｅｔ，Ｃ．；Ｖａｖｋｅｎ，Ｐ．Ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｋｎｅｅ Ｊｏｉｎｔ － Ａ Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ？ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒａｕｍａ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂ．Ｖ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １，２０１６，ｐｐ １４５－１５２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｔ．２０１６．０６．０１５．
（６）Ａｎｄｒｉｏｌｏ，Ｌ．；Ｒｅａｌｅ，Ｄ．；Ｄｉ Ｍａｒｔｉｎｏ，Ａ．；Ｂｏｆｆａ，Ａ．；Ｚａｆｆａｇｎｉｎｉ，Ｓ．；Ｆｉｌａｒｄｏ，Ｇ．Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｉｎ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｋｎｅｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ：Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ Ｍｅｔａ－Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ．Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ２０１９，１９４７６０３５１９８５２４０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７７／１９４７６０３５１９８５２４０６．
（７）Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．；Ｌｕｏ，Ｊ．；Ｐｒｉｎｇｌｅ，Ｅ．Ｗ．；Ｃａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ＣｈｏｎｄｒｏＧＥＬｅｓｉｓ：Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｔｏ Ｈａｒｎｅｓｓ ｔｈｅ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．Ｃ ２０２１，１２１，１１１８２２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｓｅｃ．２０２０．１１１８２２．
（８）Ｓｏｐｈｉａ Ｆｏｘ，Ａ．Ｊ．；Ｂｅｄｉ，Ａ．；Ｒｏｄｅｏ，Ｓ．Ａ．Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｐｏｒｔｓ Ｈｅａｌｔｈ ２００９，１（６），４６１－４６８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７７／１９４１７３８１０９３５０４３８．
（９）Ｂｌｕｎｋ，Ｔ．；Ｓｉｅｍｉｎｓｋｉ，Ａ．Ｌ．；Ｇｏｏｃｈ，Ｋ．Ｊ．；Ｃｏｕｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ａ．Ｐ．；Ｍｅｎａｈｅｍ Ｎａｈｉｒ，Ａ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｖｕｎｊａｋ－ｎｏｖａｋｏｖｉｃ，Ｇ．；Ｆｒｅｅｄ，Ｌ．Ｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．ＴＩＳＳＵＥ Ｅｎｇ．２００２，８（１）．
（１０）Ｇｏｌｄｒｉｎｇ，Ｍ．Ｂ．；Ｔｓｕｃｈｉｍｏｃｈｉ，Ｋ．；Ｉｊｉｒｉ，Ｋ．Ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００６，９７（１），３３－４４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｊｃｂ．２０６５２．
（１１）Ｗａｎｇ，Ｗ．；Ｒｉｇｕｅｕｒ，Ｄ．；Ｌｙｏｎｓ，Ｋ．Ｍ．ＴＧＦｂ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｒｅｓ．（Ｐａｒｔ Ｃ）２０１４，１０２，３７－５１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｂｄｒｃ．２１０５８．
（１２）Ｔｈｉｅｌｅｎ，Ｎ．；ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒａａｎ，Ｐ．；ｖａｎ Ｃａａｍ，Ａ．ＴＧＦβ／ＢＭＰ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｃｅｌｌｓ ２０１９，８（９），９６９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｃｅｌｌｓ８０９０９６９．
（１３）Ｓｈｅｎ，Ｊ．；Ｌｉ，Ｓ．；Ｃｈｅｎ，Ｄ．ＴＧＦ－β Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｂｏｎｅ Ｒｅｓ．２０１４，２（１４００２），１－７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｂｏｎｅｒｅｓ．２０１４．２．
（１４）Ｂｌａｎｅｙ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．；Ｓｃｈａｒｓｔｕｈｌ，Ａ．；Ｖｉｔｔｅｒｓ，Ｅ．Ｌ．；ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒａａｎ，Ｐ．Ｍ．；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｗ．Ｂ．Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－Ｂｅｔａ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｏｆ Ｏｌｄ Ｍｉｃｅ：Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｃａｐａｃｉｔｙ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．２００５，７（６），Ｒ１３３８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ａｒ１８３３．
（１５）Ｖａｎ Ｂｅｕｎｉｎｇｅｎ，Ｈ．Ｍ．；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒａａｎ，Ｐ．Ｍ．；Ａｒｎｔｚ，Ｏ．Ｊ．；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｗ．Ｂ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－Β１ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｏｓｔｅｏｐｈｙｔｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｕｒｉｎｅ Ｋｎｅｅ Ｊｏｉｎｔ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．１９９４，７１（２），２７９－２９０．
（１６）Ｗａｎｇ，Ｗ．；Ｌｉ，Ｂ．；Ｙａｎｇ，Ｊ．；Ｘｉｎ，Ｌ．；Ｌｉ，Ｙ．；Ｙｉｎ，Ｈ．；Ｑｉ，Ｙ．；Ｊｉａｎｇ，Ｙ．；Ｏｕｙａｎｇ，Ｈ．；Ｇａｏ，Ｃ．Ｔｈｅ Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｌｌ－Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｗｉｔｈ ＢＭＳＣｓ ａｎｄ ＴＧＦ－Ｂｅｔａ １ Ｌｏａｄｅｄ ＰＬＧＡ／Ｆｉｂｒｉｎ Ｇｅｌ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１０，３１（３４），８９６４－８９７３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１０．０８．０１８．
（１７）Ｒｅｙｅｓ，Ｒ．；Ｄｅｌｇａｄｏ，Ａ．；Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｅ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ａ．；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ａ．；Ｅｖｏｒａ，Ｃ．Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ａｎ Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ Ｄｅｆｅｃｔ ｂｙ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＢＭＰ－２ ｏｒ ＴＧＦβ１ ｆｒｏｍ ａ Ｂｉｌａｙｅｒｅｄ Ａｌｇｉｎａｔｅ－ＰＬＧＡ Ｓｃａｆｆｏｌｄ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．２０１２，８（７），ｎ／ａ－ｎ／ａ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｔｅｒｍ．１５４９．
（１８）Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ａ．；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．；Ｃａｒｒｏｗ，Ｊ．Ｋ．；Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｔ．Ｄ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．Ｃ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ β－１ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．ＡＣＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．２０２０，６（８），ａｃｓｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．０ｃ００６７９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．０ｃ００６７９．
（１９）Ｓｈａｈ，Ｒ．Ｎ．；Ｓｈａｈ，Ｎ．Ａ．；Ｌｉｍ，Ｍ．Ｍ．Ｄ．Ｒ．；Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．；Ｎｕｂｅｒ，Ｇ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ ｆｏｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１０，１０７（８），３２９３－３２９８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９０６５０１１０７．
（２０）Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．ＴＧＦβ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ Ｃｏｎｔｅｘｔ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１２，１３（１０），６１６－６３０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｒｍ３４３４．
（２１）Ｖａｚ，Ｅ．Ｒ．；Ｆｕｊｉｍｕｒａ，Ｐ．Ｔ．；Ａｒａｕｊｏ，Ｇ．Ｒ．；ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｃ．Ａ．Ｔ．；Ｓｉｌｖａ，Ｒ．Ｌ．；Ｃｕｎｈａ，Ｔ．Ｍ．；Ｌｏｐｅｓ－Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｍ．；Ｌｉｍａ，Ｃ．；Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｍ．Ｊ．；Ｃｕｎｈａ－Ｊｕｎｉｏｒ，Ｊ．Ｐ．；Ｔａｋｅｔｏｍｉ，Ｅ．Ａ．；Ｇｏｕｌａｒｔ，Ｌ．Ｒ．；Ｕｅｉｒａ－Ｖｉｅｉｒａ，Ｃ．Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈａｔ Ｍｉｍｉｃｓ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＴＧＦ－Β１ Ｐｒｅｓｅｎｔｓ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉ－Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１５，１０（８），ｅ０１３６１１６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３６１１６．
（２２）Ａｒａｕｊｏ，Ｇ．Ｒ．；Ａｇｌａｓ，Ｌ．；Ｖａｚ，Ｅ．Ｒ．；Ｍａｃｈａｄｏ，Ｙ．；Ｈｕｂｅｒ，Ｓ．；Ｈｉｍｌｙ，Ｍ．；Ｄｕｓｃｈｌ，Ａ．；Ｇｏｕｌａｒｔ，Ｌ．Ｒ．；Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｆ．ＴＧＦβ１ Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｇｒａｓｓ Ｐｏｌｌｅｎ Ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ．Ａｌｌｅｒｇｙ ２０２０，７５（４），８８２－８９１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ａｌｌ．１４１０８．
（２３）Ｌｏｕｒｅｎｃｏ，Ｔ．Ｃ．；Ｍｅｌｌｏ，Ｌ．Ｒ．；Ｓｉｌｖａ，Ｂ．Ｂ．Ｓ．；Ｓｉｌｖａ，Ｅ．Ｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ＴＧＦ－Β１ Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２０２０，１２１９，１２８６９１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｓｔｒｕｃ．２０２０．１２８６９１．
（２４）Ｌｉｕ，Ｑ．；Ｊｉａ，Ｚ．；Ｄｕａｎ，Ｌ．；Ｘｉｏｎｇ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｄ．；Ｄｉｎｇ，Ｙ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．２０１８，１０（２），５０１－５１０．
（２５）Ｇｒｅｓｈａｍ，Ｒ．Ｃ．Ｈ．；Ｂａｈｎｅｙ，Ｃ．Ｓ．；Ｌｅａｃｈ，Ｊ．Ｋ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ－Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２０２１，６（７），１９４５－１９５６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏａｃｔｍａｔ．２０２０．１２．０１２．
（２６）Ｈａｒｔｇｅｒｉｎｋ，Ｊ．Ｄ．；Ｂｅｎｉａｓｈ，Ｅ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１，２９４（５５４７），１６８４－１６８８．
（２７）Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ，Ｍ．Ｐ．；Ｓａｔｏ，Ｋ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．Ｃ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１７，５０（１０），２４４０－２４４８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ａｃｃｏｕｎｔｓ．７ｂ００２９７．
（２８）Ｓｉｌｖａ，Ｇ．Ａ．；Ｃｚｅｉｓｌｅｒ，Ｃ．；Ｎｉｅｃｅ，Ｋ．Ｌ．；Ｂｅｎｉａｓｈ，Ｅ．；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ａ．；Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ａ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ－Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４，３０３（５６６２），１３５２－１３５５．
（２９）Ｂｅｎｉａｓｈ，Ｅ．；Ｈａｒｔｇｅｒｉｎｋ，Ｊ．Ｄ．；Ｓｔｏｒｒｉｅ，Ｈ．；Ｓｔｅｎｄａｈｌ，Ｊ．Ｃ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ Ｎａｎｏｆｉｂｅｒ Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００５，１（４），３８７－３９７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２００５．０４．００２．
（３０）Ｂｅｒｎｓ，Ｅ．Ｊ．；Ａｌｖａｒｅｚ，Ｚ．；Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｅ．；Ｂｏｅｋｈｏｖｅｎ，Ｊ．；Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ａ．；Ｋｕｈｎ，Ｈ．Ｇ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ａ Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ Ｎａｎｏｆｉｂｅｒ Ｇｅｌ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌｓ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２０１６，３７，５０－５８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２０１６．０４．０１０．
（３１）Ｅｄｅｌｂｒｏｃｋ，Ａ．Ｎ．；Ａｌｖａｒｅｚ，Ｚ．；Ｓｉｍｋｉｎ，Ｄ．；Ｆｙｒｎｅｒ，Ｔ．；Ｃｈｉｎ，Ｓ．Ｍ．；Ｓａｔｏ，Ｋ．；Ｋｉｓｋｉｎｉｓ，Ｅ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＴｒｋＢ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１８，１８（１０），６２３７－６２４７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．８ｂ０２３１７．
（３２）Ｓｕｒ，Ｓ．；Ｔａｎｔａｋｉｔｔｉ，Ｆ．；Ｍａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．２０１５，３（３），５２０－５３２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ４ｂｍ００３２６ｈ．
（３３）Ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｒ．Ｍ．Ｐ．；Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｚｗａａｇ，Ｄ．；Ａｌｂｅｒｔａｚｚｉ，Ｌ．；Ｌｅｅ，Ｓ．Ｓ．；Ｍｅｉｊｅｒ，Ｅ．Ｗ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｓｕｐｅｒ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｍｏｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ Ｎａｎｏｆｉｂｒｅｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６，７（１），１－１０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１１５６１．
（３４）Ｄｅｍｓ，Ｄ．；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．；Ｒｉｋｅｒ，Ｋ．Ｄ．；Ｃｏｒａｄｉｎ，Ｔ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．；Ａｉｍｅ，Ｃ．Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ Ｎａｎｏｆｉｂｅｒ－Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２０２１，１１９，３０３－３１１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２０２０．１１．００９．
（３５）Ｎｅｗｃｏｍｂ，Ｃ．Ｊ．；Ｓｕｒ，Ｓ．；Ｏｒｔｏｎｙ，Ｊ．Ｈ．；Ｌｅｅ，Ｏ．Ｓ．；Ｍａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．；Ｂｏｅｋｈｏｖｅｎ，Ｊ．；Ｙｕ，Ｊ．Ｍ．；Ｓｃｈａｔｚ，Ｇ．Ｃ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｖｅｒｓｕｓ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｈｅｓｉｏｎ ｏｆ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４，５（１），１－１０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ４３２１．
（３６）Ａｌｖａｒｅｚ，Ｚ．；Ｋｏｌｂｅｒｇ－Ｅｄｅｌｂｒｏｃｋ，Ａ．Ｎ．；Ｓａｓｓｅｌｌｉ，Ｉ．Ｒ．；Ｏｒｔｅｇａ，Ｊ．Ａ．；Ｑｉｕ，Ｒ．；Ｓｙｒｇｉａｎｎｉｓ，Ｚ．；Ｍｉｒａｕ，Ｐ．Ａ．；Ｃｈｅｎ，Ｆ．；Ｃｈｉｎ，Ｓ．Ｍ．；Ｗｅｉｇａｎｄ，Ｓ．；Ｋｉｓｋｉｎｉｓ，Ｅ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２１，３７４（６５６９），８４８－８５６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｈ３６０２．
（３７）Ｙｕａｎ，Ｓ．Ｃ．；Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ａ．；Ｓａｉ，Ｈ．；Ｗｅｉｇａｎｄ，Ｓ．Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．Ｃ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ－Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｅｐ．
（３８）Ｔａｎｔａｋｉｔｔｉ，Ｆ．；Ｂｏｅｋｈｏｖｅｎ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．；Ｋａｚａｎｔｓｅｖ，Ｒ．Ｖ．；Ｙｕ，Ｔ．；Ｌｉ，Ｊ．；Ｚｈｕａｎｇ，Ｅ．；Ｚａｎｄｉ，Ｒ．；Ｏｒｔｏｎｙ，Ｊ．Ｈ．；Ｎｅｗｃｏｍｂ，Ｃ．Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．Ｃ．；Ｓｈｅｋｈａｗａｔ，Ｇ．Ｓ．；Ｄｅ Ｌａ Ｃｒｕｚ，Ｍ．Ｏ．；Ｓｃｈａｔｚ，Ｇ．Ｃ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１６，１５（４），４６９－４７６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍａｔ４５３８．
（３９）Ｓａｔｏ，Ｋ．；Ｊｉ，Ｗ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．Ｃ．；Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．；Ｂａｒｚ，Ｍ．；Ｓｔｕｐｐ，Ｓ．Ｉ．Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ ｖｉａ Ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ－ｔｏ－Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｂｏｎｄ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９（２６），８９９５－９０００．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊａｃｓ．７ｂ０３８７８．
（４０）Ｌｉ，Ｔ．；Ｓｅｎｅｓｉ，Ａ．Ｊ．；Ｌｅｅ，Ｂ．Ｓｍａｌｌ Ａｎｇｌｅ Ｘ－Ｒａｙ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２８，２０１６，ｐｐ １１１２８－１１１８０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｃｈｅｍｒｅｖ．５ｂ００６９０．
（４１）Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．；Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ Ｓｐｅｃｔｒａ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６７，８（１０），４１０８－４１１６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｉ００８３８ａ０３１．
（４２）Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．；Ｍａｎｔｓｃｈ，Ｈ．Ｈ．Ｔｈｅ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｍｉｓｕｓｅ ｏｆ ＦＴＩＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５，３０（２），９５－１２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３１０９／１０４０９２３９５０９０８５１４０．
（４３）Ｇｏｓａｌ，Ｗ．Ｓ．；Ｍｏｒｔｅｎ，Ｉ．Ｊ．；Ｈｅｗｉｔｔ，Ｅ．Ｗ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｎ．Ｈ．；Ｒａｄｆｏｒｄ，Ｓ．Ｅ．Ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ Ｆｉｂｒｉｌ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｂ ２－Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎｔｏ Ａｍｙｌｏｉｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，３５１（４），８５０－８６４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００５．０６．０４０．
（４４）Ｄａｓｃｈ，Ｊ．Ｒ．；Ｐａｃｅ，Ｄ．Ｒ．；Ｗａｅｇｅｌｌ，Ｗ．；Ｉｎｅｎａｇａ，Ｄ．；Ｅｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－Ｂｅｔａ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９，１４２（５）．
（４５）Ｘｉｅ，Ｌ．；Ｔｉｎｔａｎｉ，Ｆ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．；Ｌｉ，Ｆ．；Ｚｈｅｎ，Ｇ．；Ｑｉｕ，Ｔ．；Ｗａｎ，Ｍ．；Ｃｒａｎｅ，Ｊ．；Ｃｈｅｎ，Ｑ．；Ｃａｏ，Ｘ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－β Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１６，１３７６（１），５３－６４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｎｙａｓ．１３０００．
（４６）Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．ＴＧＦβ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：２０２０．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０２１，２１７，１０７６６６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｐｈａｒｍｔｈｅｒａ．２０２０．１０７６６６．
（４７）Ｌｏｅｓｅｒ，Ｒ．Ｆ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｎｄ Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ－Ｍａｔｒｉｘ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．２０１４，３９，１１－１６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍａｔｂｉｏ．２０１４．０８．００７．
（４８）Ｗｉｐｆｆ，Ｐ．Ｊ．；Ｈｉｎｚ，Ｂ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｔｅｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Β１ － Ａｎ Ｉｎｔｉｍａｔｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００８，８７（８－９），６０１－６１５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｊｃｂ．２００８．０１．０１２．
（４９）Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｍ．；Ｗｉｎｏｋｕｒ，Ｔ．Ｓ．；Ｈｏｌｌａｎｄｓ，Ｒ．Ｓ．；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ，Ｋ．；Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．；Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｌａｔｅｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ １ Ｈａｓ ａ Ｌｏｎｇｅｒ Ｐｌａｓｍａ Ｈａｌｆ－Ｌｉｆｅ ｉｎ Ｒａｔｓ ｔｈａｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ １，ａｎｄ ａ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９０，８６（６），１９７６－１９８４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７２／ＪＣＩ１１４９３２．
（５０）Ｋｏｅｌｌｉｎｇ，Ｓ．；Ｋｒｕｅｇｅｌ，Ｊ．；Ｉｒｍｅｒ，Ｍ．；Ｐａｔｈ，Ｊ．Ｒ．；Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｂ．；Ｍｉｒｏ，Ｘ．；Ｍｉｏｓｇｅ，Ｎ．Ｍｉｇｒａｔｏｒｙ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｒｅｐａｉｒ Ｔｉｓｓｕｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌａｔｅｒ Ｓｔａｇｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００９，４（４），３２４－３３５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２００９．０１．０１５．
（５１）Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｇ．Ｄ．；Ｔａｎ，Ａ．Ｒ．；Ｃｕｉ，Ｖ．；Ｂｕｌｉｎｓｋｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｃｏｏｋ，Ｊ．Ｌ．；Ａｔｔｕｒ，Ｍ．；Ａｂｒａｍｓｏｎ，Ｓ．Ｂ．；Ａｔｅｓｈｉａｎ，Ｇ．Ａ．；Ｈｕｎｇ，Ｃ．Ｔ．Ｈｕｍａｎ Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｔｏ Ｇｕｉｄｅ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．２０１７，１１（３），８７７－８８６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｔｅｒｍ．１９８８．
（５２）Ｗａｎｇ，Ｙ．－Ｘ．；Ｚｈａｏ，Ｚ．－Ｄ．；Ｗａｎｇ，Ｑ．；Ｌｉ，Ｚ．－Ｌ．；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．；Ｚｈａｏ，Ｓ．；Ｈｕ，Ｗ．；Ｌｉａｎｇ，Ｊ．－Ｗ．；Ｌｉ，Ｐ．－Ｌ．；Ｗａｎｇ，Ｈ．；Ｍａｏ，Ｎ．；Ｗｕ，Ｃ．－Ｔ．；Ｚｈｕ，Ｈ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｇｒａｔｏｒｙ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｋｎｅｅ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．２０２０，２２，１－１３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０７５－０２０－２１４４－ｚ．
（５３）Ｈａｌｌ，Ａ．Ｃ．Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｖｏｌｕｍｅ ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ－Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｒｅｐａｉｒ，ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｇｒｏｕｐ ＬＬＣ １ Ａｕｇｕｓｔ １，２０１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１１９２６－０１９－０８３７－６．

【0134】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A-B】

【図17A-B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【配列表】

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【国際調査報告】