特表 2024-530455 標的化タンパク質の分解のためのカチオン非依存性マンノース６リン酸受容体結合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-21

(54)【発明の名称】標的化タンパク質の分解のためのカチオン非依存性マンノース６リン酸受容体結合体

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240814BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240814BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240814BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240814BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240814BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20240814BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240814BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240814BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240814BHJP

   G01N 33/531 20060101ALI20240814BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240814BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

C07K16/46

C12N15/13

C12P21/08

C12Q1/68 100Z

A61P35/00

A61K39/395 N

A61K39/395 D

G01N33/53 D

G01N33/531 A

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024505574

(86)(22)【出願日】2022-07-29

(85)【翻訳文提出日】2024-03-29

(86)【国際出願番号】 EP2022071381

(87)【国際公開番号】W WO2023016828

(87)【国際公開日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】21188724.5

(32)【優先日】2021-07-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】514185600

【氏名又は名称】ブイアイビー ブイゼットダブリュ

【氏名又は名称原語表記】ＶＩＢ ＶＺＷ

【住所又は居所原語表記】Ｓｕｚａｎｎｅ Ｔａｓｓｉｅｒｓｔｒａａｔ １，９０５２ Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ

(71)【出願人】

【識別番号】514185611

【氏名又は名称】ユニベルシテイト ゲント

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＧＥＮＴ

【住所又は居所原語表記】Ｓｉｎｔ－Ｐｉｅｔｅｒｓｎｉｅｕｗｓｔｒａａｔ ２５， Ｂ－９０００ Ｇｅｎｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ

(74)【代理人】

【識別番号】110003971

【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キャルワート，ニコ

(72)【発明者】

【氏名】ネサンス，ジャスティン

(72)【発明者】

【氏名】ファン ランドゥイト，リンデ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA07

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ41

4B063QQ46

4B063QS40

4B063QX10

4B064AG01

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA44

4B065CA46

4C085AA13

4C085BB11

4C085BB36

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA51

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ヒトカチオン非依存性マンノース6リン酸受容体(CI-M6PR)に特異的に結合するタンパク質結合剤に関し、より具体的には、膜タンパク質、細胞外タンパク質または分泌タンパク質などの細胞外からアクセス可能なタンパク質標的に特異的に結合するさらなるタンパク質結合剤に融合された、ナノモルからピコモルの親和性でCI-M6PRに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)を含むポリペプチド剤に関する。より具体的には、該CI-M6PR特異的ISVDは、CI-M6PRのN末端ドメイン1、2および/または3を認識し、それにより、該ISVDを含む薬剤および該タンパク質結合剤に結合した標的の内在化、リソソーム標的化および分解のための手段および方法を提供する。したがって、本明細書において開示されるCI-M6PR結合体は、さらなるタンパク質結合剤に連結または融合され、特に、治療における使用に関連する、より具体的には該抗原結合タンパク質によって結合される該標的抗原によって影響される疾患の処置に関連する、別の抗原結合タンパク質(ISVDまたは抗体など)に連結または融合される。より具体的には、癌の処置のための、EGFRに特異的に結合する抗原結合タンパク質へのCI-M6PR ISVD融合物が本明細書において開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞外N末端CI-M6PRドメイン1、2および/または3上のヒトカチオン非依存性マンノース6リン酸受容体(CI-M6PR)に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)を含むタンパク質結合剤であって、該ISVDが、細胞外からアクセス可能なタンパク質標的に特異的に結合する結合剤に融合されている、タンパク質結合剤。

【請求項2】

該CI-M6PR特異的ISVDが、配列番号23に示されるアミノ酸残基Lys191、Gly194、Ala195、Tyr196、Leu197、Phe208、Arg219、Gln224、Leu225、Ile297、Lys357、Gly408、Asp409、Asn431、Glu433、およびPhe457を含むエピトープ、または、アミノ酸残基Lys59、Asn60、Met85、Asp87、Lys89、Ala146、Thr147、およびGlu148、およびAsp118もしくはGln119を含むエピトープに特異的に結合する、請求項1に記載のタンパク質結合剤。

【請求項3】

CI-M6PR特異的ISVDが、配列番号8に示される残基32、52～57、100～103、108を含むパラトープを介して、または配列番号7に示される残基31、33、35、53、54、56、57、96、104を含むパラトープを介して、または配列番号24に示される残基31～35、50、52～57、96～98を含むパラトープを介して、CI-M6PRに特異的に結合する、請求項1または2のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤。

【請求項4】

CI-M6PR特異的ISVDが、以下の式(1):FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)による4つのフレームワーク領域(FR)および3つの相補性決定領域(CDR)を含み、かつ、CDR1、CDR2およびCDR3領域が、配列番号1、5、7、8、24または25の配列の群から選択される配列のCDR1、CDR2およびCDR3領域から選択され、ここでCDR領域が、Kabat、MacCallum、IMGT、AbMまたはChothiaに従ってアノテーションされている、請求項1～3に記載のタンパク質結合剤。

【請求項5】

該CI-M6PR特異的ISVDが、配列番号36～41から選択されるCDR1配列、配列番号42～47から選択されるCDR2配列、および配列番号48～53から選択されるCDR3配列を含む、請求項1～4のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤。

【請求項6】

該CI-M6PR特異的ISVD剤が、配列番号78に対応するFR1配列、配列番号79に対応するFR2配列、配列番号80に対応するFR3配列、および配列番号81に対応するFR4配列を含む、請求項5に記載のタンパク質結合剤。

【請求項7】

該タンパク質結合剤が、配列番号1、5、7、8、24もしくは25の配列、またはその少なくとも85％のアミノ酸同一性を有しておりCDRが同一である配列の群から選択される配列、または配列番号26～35のいずれか1つなどのそのヒト化バリアントを含むCI-M6PR特異的ISVDを含む、請求項1～6のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤。

【請求項8】

該CI-M6PR特異的ISVD、および、細胞外からアクセス可能なタンパク質標的に特異的に結合する結合剤が、リンカー、好ましくはグリシン-セリンリンカーなどの短いペプチドリンカー、またはFcテールもしくは別の部分によって融合されている、請求項1～7のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤。

【請求項9】

細胞外からアクセス可能なタンパク質に特異的に結合する該結合剤が、抗原結合タンパク質ドメインを含み、好ましくはISVD、VHH-Fc融合物、VHH-Fc-VHH、またはノブ・イントゥ・ホールVHH-Fc融合物、IgGなどの抗体を含む、請求項1～8のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤。

【請求項10】

該タンパク質結合剤が、該細胞外からアクセス可能なタンパク質特異的結合剤に融合された該CI-M6PR特異的ISVD、および、治療部分もしくは別の抗原結合ドメインなどのさらなる機能性部分または半減期延長を含む多重特異性または多価結合剤である、請求項1～9のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤。

【請求項11】

検出可能な標識またはタグを含む、請求項1～10のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤。

【請求項12】

該細胞外からアクセス可能なタンパク質標的が上皮成長因子受容体(EGFR)である、および/または、該EGFR特異的結合剤が、配列番号12もしくは配列番号17を含む、またはその少なくとも90％の同一性を有しておりCDRが同一であるホモログを含む、または配列番号86および87を含む、請求項1～11のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤。

【請求項13】

該タンパク質結合剤が、配列番号13、14、18、19、82～85の配列の群から選択される配列、またはその少なくとも90％の同一性を有しておりCDRが同一である機能的ホモログ、または配列番号88もしくは89の重鎖-ISVD融合物および配列番号86の軽鎖によって形成される抗体を含む、請求項12に記載のタンパク質結合剤。

【請求項14】

請求項1～13のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤をコードする核酸分子。

【請求項15】

請求項1～13のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤を生産する方法であって、以下のステップ:
a.宿主細胞における発現のために、請求項14に記載の核酸分子を導入すること、および
b.細胞培養物からタンパク質結合剤を単離すること、
を含む方法。

【請求項16】

請求項1～13のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤または請求項14に記載の核酸分子を含む医薬組成物。

【請求項17】

医薬として使用するための、請求項1～13のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤、請求項14に記載の核酸分子、または請求項16に記載の医薬組成物。

【請求項18】

結合剤によって特異的に結合された細胞外からアクセス可能なタンパク質標的によって媒介される疾患の処置に使用するための、請求項1～13のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤、請求項14に記載の核酸分子、または請求項16に記載の医薬組成物。

【請求項19】

癌の処置に使用するための、請求項1～13のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤、請求項14に記載の核酸分子、または請求項16に記載の医薬組成物。

【請求項20】

診断として使用するための、またはin vivo画像化のための、請求項1～13のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤、請求項14に記載の核酸分子、または請求項16に記載の医薬組成物。

【請求項21】

細胞表面分子を除去する方法および/またはリソソーム中の該分子を分解する方法における、請求項1～13のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤、請求項14に記載の核酸分子または請求項16に記載の医薬組成物の使用。

【請求項22】

in vitroリソソームトラッキングのための、請求項1～13のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤、請求項14に記載の核酸分子、または請求項16に記載の医薬組成物の使用。

【請求項23】

創薬、構造分析、またはスクリーニングアッセイにおける、請求項1～13のいずれか一項に記載のタンパク質結合剤、請求項14に記載の核酸分子、または請求項16に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、ヒトカチオン非依存性マンノース6リン酸受容体(CI-M6PR)に特異的に結合するタンパク質結合剤に関し、より具体的には、膜タンパク質、細胞外タンパク質または分泌タンパク質などの細胞外からアクセス可能なタンパク質標的に特異的に結合するさらなるタンパク質結合剤に融合された、ナノモルからピコモルの親和性でCI-M6PRに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)を含むポリペプチド剤に関する。より具体的には、該CI-M6PR特異的ISVDは、CI-M6PRのN末端ドメイン1、2および/または3を認識し、それにより、該ISVDを含む薬剤および該タンパク質結合剤に結合した標的の内在化、リソソーム標的化および分解のための手段および方法を提供する。したがって、本明細書において開示されるCI-M6PR結合体は、さらなるタンパク質結合剤に連結または融合され、特に、治療における使用に関連する、より具体的には該抗原結合タンパク質によって結合される該標的抗原によって影響される疾患の処置に関連する、別の抗原結合タンパク質(ISVDまたは抗体など)に連結または融合される。より具体的には、癌の処置のための、EGFRに特異的に結合する抗原結合タンパク質へのCI-M6PR ISVD融合物が本明細書において開示される。

【背景技術】

【0002】

背景
小分子薬物は、疾患を引き起こすタンパク質の明確に定義されたポケットに結合し、その機能を調節することによって作用する。しかしながら、多くのタンパク質がそのような隙間を欠いているので、ヒトプロテオームの85％も多くのものが、現在、薬になり得ないと考えられている(Neklesa,et al.,2017,Pharmacol.Ther.174,138-144)。これは、細胞内標的タンパク質の選択的分解のためのユビキチン-プロテアソーム系を利用する治療モダリティであるPROteolysis TArgeting Chimera(PROTAC)技術の出現に挑戦している(Sakamoto,et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.98,8554-8559)。そのような分解物質は、標的タンパク質のいずれかの部位に結合することができるリガンドにカップリングされたE3リガーゼの結合体からなる。薬になり得ないタンパク質の標的化を可能にすることに加えて、標的化タンパク質の分解戦略は、阻害に基づく処置戦略を超える別の利点を有する:タンパク質の除去は、その機能のすべてを消失させ、これは、例えばタンパク質がシグナル伝達足場として作用する場合に重要である。しかしながら、PROTACはサイトゾルタンパク質分解機構を使用するので、それらは本質的に細胞内環境における標的係合に限定される。

【0003】

ナノボディは、小さいサイズ(±15kDa)によって特徴づけられるラクダ由来の重鎖のみの抗体(VHH)の可変ドメインである［1］。これにより、従来の抗体と同様の効力および結合特異性を維持しながら、良好な組織浸透が可能になる［3］。モジュール式のビルディングブロックとして、VHHは、このアプローチで利用される多価および/または多重特異性フォーマットで容易に繋がれることができる。VHHはまた、非常に安定かつ可溶性であるため、細菌および酵母などの下等生物において容易かつ費用効果的に製造されることができる［4］。調査された細胞内TPDアプローチの中でも、ARMeDシステムと呼ばれるナノボディに基づく融合は、E3ユビキチンリガーゼRNF4のRINGドメインにカップリングされた、目的のタンパク質を特異的に標的化するNbを提供し、それにより、細胞への送達時にオフターゲット効果なしに分解を引き起こすことが示されている(Zhong et al.Eur J Med Chem.2022;231:114142;Ibrahim,et al.Molecular Cell,2020.79,(1),155-166.e9)。

【0004】

それらの大きな立体配座安定性のために、それらは高い固有pHおよびプロテアーゼ耐性［1］を有し、これらはエンドソーム-リソソーム系を循環するための魅力的な特性である。さらに、VHHに基づくフォーマットは、静脈内注射および吸入によることを包含する様々な投与経路に適しており、これらを治療目的のための理想的なコンポーネントとして位置付ける。GlueTACは、たとえば、膜タンパク質を標的とし、かつリソソーム分解を誘発するための細胞透過性ペプチドおよびリソソーム選別配列にコンジュゲートされた共有結合性抗原結合ナノボディに基づくキメラである(Zhang,et al.J.American Chem.Society.2021.143(40),16377-16382)。

【0005】

実際、リソソームは、70を超える加水分解酵素を含有する細胞の酸性化オルガネラである。これらの酵素は、切断可能な細胞巨大分子のそれらの元のビルディングブロックへの分解を担う［2］。巨大分子は、一般に、エンドサイトーシス、食作用またはエンドサイトーシスを介してリソソームに到達し、その後、各基本単位はリサイクルされて他の巨大分子の合成に使用されることができるか、またはエネルギーの供給源としてさらに代謝されることができる。

【0006】

膜結合タンパク質標的は、膜結合E3リガーゼの発現によってユビキチン化され、それによってそれらのエンドサイトーシスおよびリソソーム分解を誘導することが知られている。新規技術は、分解のために膜または細胞外タンパク質を共標的化するために膜結合E3リガーゼを適用するためにこの機構を使用することを実証した。たとえば、Cotton et al.(J.Am.Chem.Soc.2021,143,593-598)によって報告されているAbTAC;およびMaurice(WO2021/176034A1)によって報告されている膜結合E3リガーゼおよび膜貫通標的タンパク質を標的とするヘテロ二機能性分子。

【0007】

細胞外からアクセス可能なタンパク質の分解はまた、リソソームを、細胞の原形質膜上のP型レクチンであるカチオン非依存性マンノース6リン酸受容体(CI-M6PR)を介した受容体媒介性エンドサイトーシスによって外部から利用することによって可能となり得、これはエンドリソソーム経路を介して絶えずリサイクルし、それによって受容体に結合されたタンパク質または標的を効率的に内在化し、エンドソームおよびリソソームに送達する。したがって、さらなる応用は、エンドソーム中の酸性pHに基づいており、これは、後期エンドソーム段階で5.8付近のpHでCI-M6PR受容体からカーゴまたは複合体の解離をもたらし［20］、事実上すべての細胞型において細胞表面と後期エンドソーム区画との間を絶えず往復して細胞外リガンドをリソソームに標的化することができるCI-M6PR受容体自体の迅速なリサイクルを可能にする(Dahms,et al.(1989),S.J.Biol.Chem.264,12115-12118)。

【0008】

したがって、CI-M6PRカーゴは、PROTACと同様に、リソソーム標的化キメラ(LYTAC)［10］の設計で使用される概念であるエンドサイトーシスサイクルを介してリソソームに効率的に送達され、CI-M6PRの複雑な化学合成糖ペプチドリガンドを抗標的抗体にカップリングする代替フォーマットを提供する。LYTACSは、分泌タンパク質および膜関連タンパク質の枯渇を可能にし、CI-M6PRのアゴニストとして示された［10］。LYTACは、細胞に投与された場合、細胞外および膜貫通タンパク質の両方の選択をin vitroで内在化および分解することが示された。しかしながら、in vivo用途および大規模生産の観点からのマイナス面は、構築物の大きなサイズであり(モノクローナル抗体の±150kDa)、このことは固体組織におけるその生体内分布を妨げることができ［21］、哺乳動物細胞における組換え発現が必要とされる。さらに、マンノース6ホスホナート(M6Pn)グリコポリペプチドがCI-M6PRの結合に使用される場合、リガンドを生産するための長い合成プロセスおよびその後の抗体へのコンジュゲーションは非常に複雑で非常に高価である。実際、マンノース6ホスホナート(M6Pn)グリコポリペプチドリガンドの生産およびその後の抗体へのコンジュゲーションは、13ステップの合成プロセスを伴う。

【0009】

細胞外からアクセス可能なタンパク質標的の興味深い例は、たとえば、上皮組織の成長および維持において中心的な役割を果たす膜貫通受容体チロシンキナーゼ(RTK)であるヒト上皮成長因子(EGFR)である。これは頻繁に過剰発現され、結腸直腸癌(CRC)の推定60～80％を包含する多くのタイプの癌において疾患の進行を引き起こす［23］。化学療法は通常、切除不能な転移性CRC(mCRC)の第一選択処置であり、RAS野生型(WT)癌を有するペイシェントでは、これは、2つの承認された抗EGFRモノクローナル抗体(mAb)であるセツキシマブまたはパニツムマブのうちの1つと組み合わせられる。これらは、主に、EGFRのEGF刺激活性化の拮抗によってその機能を発揮し、結果としてそのキナーゼ機能を阻害する。RAS-WT mCRCの処置のための化学療法へのそのようなmAbの添加は、化学療法単独と比較して数ヶ月の全生存期間の延長を示した［24］。しかしながら、EGFRシグナル伝達経路の下流コンポーネントであるKRAS(CRC中の主に突然変異したRASアイソフォーム)の活性化突然変異は、CRCのおよそ35～45％で発生し、抗EGFR mAbに対する主要な固有の耐性機構である［25］。しかし、RAS-WT mCRCの中でも、BRAF遺伝子にV4600E突然変異を保有するものはまた、処置に応答しない［26］。さらに、抗EGFR mAbに対する獲得された耐性は、事実上すべてのペイシェントにおいて生じ、症例の半分は、KRAS遺伝子［27］および時にはEGFR細胞外ドメインにおける二次的な突然変異によって引き起こされ、抗体結合を回避する［28］。この文脈において、EGFRの標的化分解は、内因性および獲得された耐性を克服するための刺激的な新しい戦略を提供し得る。EGFR阻害とは対照的に、EGFRの下方制御は、比較的低いEGFR発現を有しておりセツキシマブに応答しないKRAS突然変異HCT116細胞株を包含する、ある範囲の癌細胞において細胞死を誘導することが示されている［29］。実際、キナーゼ阻害EGFRは、いくつかの方法で生存タンパク質との相互作用および下流の生存促進シグナル伝達の維持のための足場ノードとして機能することができる［29～30］。

【0010】

したがって、多数の治療用途のために、標的化タンパク質分解の補助としてのリソソーム標的化アプローチは、新規な医療モダリティを提供するための代替作用機構として有益であろう。したがって、既存のリソソーム標的化戦略の上記の障害を克服する次世代リソソーム標的化結合剤を生成する必要がある。

【発明の概要】

【0011】

発明の概要
CI-M6PR受容体への可逆的結合を介してリソソーム標的化を媒介することが可能な新しいタイプの結合剤を提供する目的で、本発明は、生理学的pHでCI-M6PRに結合しpH依存的様式でそこから解離してリソソーム取り込みをもたらすヒトからマウスへの交差反応性免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)、特にVHHの適用に基づく(Callewaert et al.,PCT/EP2022/054278)。細胞外標的タンパク質、分泌標的タンパク質または膜貫通標的タンパク質に特異的なさらなる結合体へのそのような抗CI-M6PR VHHの共有結合的カップリングは、最終的に、CI-M6PR媒介性リソソーム取り込みおよび分解のための新規なモダリティをもたらす。したがって、本発明は、nanoLYTACとも呼ばれる新しいVHHに基づくLYTACフォーマットに関し、ここで、エンドソーム/リソソーム標的化の有効性および効力は、一方では、リサイクルのためにCI-M6PRを認識する免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)によって提供される融合タンパク質の特性に依存し、他方では、細胞外からアクセス可能な標的タンパク質に特異的なカップリングされた結合剤に依存する。この新しいフォーマットは、既存の細胞外標的化タンパク質分解モダリティを超えるいくつかの実質的な利点を提供することが見出された。

【0012】

リソソーム標的化のために特異的に設計および特徴づけされた抗CI-M6PR VHHを使用することによって、代替的なナノボディに基づくLYTAC(またはnanoLYTAC)は、機能的二重特異性治療ツールを形成して、リソソーム分解のために、好ましくは抗体などの抗原結合タンパク質ドメイン、またはより具体的にはISVDまたはVHHも含む他のカップリングされた結合剤を送達し、該結合剤は次に、目的の特定の細胞外からアクセス可能なタンパク質を標的化する際のそれらの特性について選択されることができる。概念実証として、Callewaert et al.(PCT/EP2022/054278)に報告されているCI-M6PRに特異的な特徴づけられたVHHが、本明細書において例示されるように、膜貫通受容体であるEGFRを標的とすることが知られている抗原結合タンパク質にカップリングされた。さらなるPOCが、本明細書において開示される少なくとも2つのタイプのCI-M6PR特異的VHHとのカップリングに基づいて、エンドサイトーシス内在化および/またはリソソーム分解が得られたことを示すことが証明され、ここで、各タイプは、Callewaert et al.(PCT/EP2022/054278)において特徴づけられるように、N末端ドメイン1～3に位置するCI-M6PRエピトープに結合することが特徴づけられる。実際に、VHHの該パネルは、受容体との会合について異なるpH依存性を有するCI-M6PR結合体のパネルとして以前に特徴づけられており、したがって、所望の成果または処置目的を考慮してカスタマイズされたNbに基づくLYTACを設計するのに有用なツールボックスをもたらす。

【0013】

本発明は、ナノリソソーム標的化キメラまたはnanoLYTACと呼ばれる多重特異性リソソーム標的化可能な抗CI-M6PR結合剤に関し、形質膜の細胞外側に存在するヒトおよびマウスのCI-M6PRのそのN末端領域に特異的に結合し、それによってエンドリソソーム経路を通る輸送を可能にするVHHのパネルの同定に基づく。さらに、抗CI-M6PR VHHは、リソソーム区画への送達を促進する特異的pH依存性解離特性を採用する。これらの抗CI-M6PR VHH部分のさらなるタンパク質結合剤への融合は、好ましくは他の細胞外または膜標的を標的化するための抗原結合を伴い、これらの結合剤を標的化されたリソソーム内在化およびタンパク質標的分解に適用することを可能にする。

【0014】

したがって、本発明の第1の側面は、ヒトカチオン非依存性マンノース6リン酸受容体(CI-M6PR;IGF2Rとしても知られている)に特異的に結合し、ヒトCI-M6PRの細胞外N末端ドメイン1、2および/または3上に位置する結合部位を特異的に認識する免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)を含有するタンパク質結合体に関し、該ISVDは、細胞外からアクセス可能な標的に特異的に結合するタンパク質結合ドメインまたは薬剤に融合されている。より具体的には、該タンパク質結合剤の該CI-M6PR特異的ISVDは、in vitroまたは細胞における受容体への高親和性結合を提供し、K_D値は100nM以下の範囲である。より具体的には、該タンパク質結合剤は、CI-M6P受容体に結合すると、細胞内で内在化する。好ましくは、該タンパク質結合剤は、CI-M6PRに結合すると、細胞外からアクセス可能な標的に特異的に結合するカップリングされた結合剤に結合された細胞外からアクセス可能な標的との複合体として細胞内に内在化する。

【0015】

特定の態様では、該タンパク質結合剤(本明細書においてnanoLYTACとも呼ばれる)は、N末端ドメイン2および3上に位置する結合部位を特異的に認識し、配列番号23に示されるアミノ酸残基191、194～197、208、219、224、225、297、357,408～409、431、433および457を含むエピトープによって定義される、CI-M6PRに特異的に結合するISVDを含む。さらなる特定の態様は、配列番号8に示されるその残基32、52～57、100～103および108と、本明細書においてCI-M6PRのN末端ドメイン2および3におけるエピトープとして示される残基との相互作用を介して特異的に結合するISVDを含む該結合剤を提供する。

【0016】

別の特定の態様は、N末端ドメイン1上に位置する結合部位を特異的に認識し、配列番号23に示されるアミノ酸残基59、60、85、87、89、146、147、および148および118または119を含むエピトープによって定義される、CI-M6PRに特異的に結合するISVDを含む、該タンパク質結合剤(本明細書においてnanoLYTACとも呼ばれる)に関する。さらなる特定の態様は、配列番号7に示されるその残基31、33、35、53、54、56、57、96および104、または配列番号24に示される残基31～35、50、52～57、96～98と、本明細書においてCI-M6PRのN末端ドメイン1におけるエピトープとして示される残基との相互作用を介して特異的に結合するISVDを含む該結合剤を提供する。

【0017】

特定の態様では、該結合剤は、本明細書において記載されるCI-M6PR特異的ISVDおよび直接もしくはリンカーを介して融合された細胞外からアクセス可能なタンパク質標的に特異的に結合する結合剤を含む融合タンパク質を含むかまたはそれからなり、好ましくは、該ISVDは、以下の式(1):FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)に従って構造化されており、配列番号1、5、7、8、24または25の群から選択されるISVD配列のCDR1、CDR2およびCDR3領域から選択されるCDR1、CDR2およびCDR3領域を含み、CDR領域は、Kabat、MacCallum、IMGT、AbMまたはChothiaに従ってアノテーションされている。特定の態様では、該M6PR特異的ISVDは、配列番号1からのCDR1、CDR2およびCDR3、または配列番号5からのCDR1、CDR2およびCDR3、または配列番号7からのCDR1、CDR2およびCDR3、または配列番号8からのCDR1、CDR2およびCDR3、または配列番号24からのCDR1、CDR2およびCDR3、または配列番号25からのCDR1、CDR2およびCDR3を含み、該CDRは、本明細書においてさらに定義されるKabat、MacCallum、IMGT、AbM、またはChothiaのアノテーションに従って定義され得る。

【0018】

さらなる態様は、本明細書において記載される該タンパク質結合剤に関し、ここで、CI-M6PR特異的ISVDは、配列番号36～41から選択されるCDR1配列、配列番号42～47から選択されるCDR2配列、および配列番号48～53から選択されるCDR3配列を含むか、あるいは、以下を有するISVDを含む:
-配列番号36からなるCDR1、配列番号42からなるCDR2、および配列番号48からなるCDR3、
-配列番号37からなるCDR1、配列番号43からなるCDR2、および配列番号49からなるCDR3、
-配列番号38からなるCDR1、配列番号44からなるCDR2、および配列番号50からなるCDR3、
-配列番号39からなるCDR1、配列番号45からなるCDR2、および配列番号51からなるCDR3、
-配列番号40からなるCDR1、配列番号46からなるCDR2、および配列番号52からなるCDR3、または
-配列番号41からなるCDR1、配列番号47からなるCDR2、および配列番号53からなるCDR3。

【0019】

さらなる態様は、AbMに従ってアノテーションされた配列番号1、5、7、8、24または25の該CDRを含むCI-M6PR特異的ISVDを含む該タンパク質結合剤であって、配列番号78に対応するFR1配列、配列番号79に対応するFR2配列、配列番号80に対応するFR3配列、および配列番号81に対応するFR4配列、あるいは配列番号54～59から選択されるFR1配列、配列番号60～65から選択されるFR2配列、配列番号66～71から選択されるFR3配列、および配列番号72～77から選択されるFR4配列を含むか、あるいは以下を含むタンパク質結合剤:
-配列番号54からなるFR1、配列番号60からなるFR2、配列番号66からなるFR3、および配列番号72からなるFR4、
-配列番号55からなるFR1、配列番号61からなるFR2、配列番号67からなるFR3、および配列番号73からなるFR4、
-配列番号56からなるFR1、配列番号62からなるFR2、配列番号68からなるFR3、および配列番号74からなるFR4、
-配列番号57からなるFR1、配列番号63からなるFR2、配列番号69からなるFR3、および配列番号75からなるFR4、
-配列番号58からなるFR1、配列番号64からなるFR2、配列番号70からなるFR3、および配列番号76からなるFR4、または
-配列番号59からなるFR1、配列番号65からなるFR2、配列番号71からなるFR3、および配列番号77からなるFR4、
または本明細書においてさらに記載されるそのいずれかのヒト化バリアントに関する。

【0020】

別の態様は、該CI-M6PR特異的ISVDが、配列番号1、5、7、8、24もしくは25の配列、またはその少なくとも85％のアミノ酸同一性を有する配列であって配列番号5、7、8、24もしくは25と同一のCDRを含有する配列、または本明細書においてさらに定義されるか、もしくは配列番号26～35に示されるものなどのそのヒト化バリアントの群から選択される配列を含む、該結合剤に関する。

【0021】

さらなる特定の態様は、多重特異性または多価結合剤である本明細書において記載される結合剤に関する。より特に、二価または二重特異性薬剤が本明細書において想定される。さらにより具体的には、ヒトCI-M6PRに特異的に結合し、本明細書において定義されるヒトCI-M6PRの細胞外N末端ドメイン1、2および/または3上に位置する結合部位を特異的に認識し、かつ、細胞外からアクセス可能な標的に特異的に結合する結合剤に融合または連結されるISVDを含む多重特異性タンパク質結合剤が想定され、該融合または連結は、直接的なカップリングによって、または短いペプチドリンカーであり得るリンカー、またはさらなる抗原結合ドメインもしくはより具体的にはISVDを含み得るFcテールもしくは別の部分などのポリペプチド部分を介して行われる。具体的には、CI-M6PRに特異的に結合するISVDを含む該結合剤は、細胞表面または細胞外分子に特異的に結合する結合部分を含み得、この結合部分は、具体的には、細胞外からアクセス可能な標的に結合するためのISVDおよび/またはさらなる部分も含む。

【0022】

特定の態様では、本発明の該融合タンパク質または結合剤は、細胞外からアクセス可能な標的に特異的に結合するタンパク質結合体に融合した本発明のCI-M6PR特異的ISVDおよび任意にさらなる部分を含む多重特異性融合タンパク質であり、該コンポーネントのいずれかは、検出のために標識され得るか、またはタグもしくは標識を提供し得る。

【0023】

別の態様は、細胞外からアクセス可能な標的に特異的に結合するタンパク質結合体に融合した本発明のCI-M6PR特異的ISVDおよび任意にさらなる部分を含む多重特異性融合タンパク質を含む本発明の該タンパク質結合剤に関し、該標的特異的タンパク質結合体は、抗原結合タンパク質ドメインを含むかまたはそれからなり、より具体的には、ISVD、または抗体もしくはその活性断片、または具体的にはIgG、またはいずれかのタイプのVHH-Fc融合フォーマットを含む。さらに特定の態様では、該さらなる部分は、好ましくはさらなる標的に結合する治療部分などの抗原結合ドメインを好ましくは含む機能性部分、および/または半減期延長である。

【0024】

本明細書において開示される特定の態様では、本発明の該タンパク質結合剤は、細胞外部位で膜貫通タンパク質上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合する結合剤を含む。より具体的には、該融合タンパク質は、本明細書において記載されるCI-M6PR特異的ISVD、ならびに、配列番号12、17、またはその少なくとも90％の同一性を有しておりCDRが同一であるホモログからなるISVDを含むかまたは配列番号87に示される重鎖および配列番号86に示される軽鎖から構成される抗体を含むEGFR特異的結合剤を含み、EGFR特異的結合体としてEGFR特異的な従来の抗体結合を提供し、より具体的には、該タンパク質結合剤は、配列番号88または89および配列番号86を含み得る。あるいはまた、細胞外からアクセス可能なタンパク質標的EGFRに特異的に結合する本発明のタンパク質結合剤は、配列番号13、14、18、19、82から85の配列、またはその少なくとも90％の同一性を有しておりCDRが同一である機能的ホモログ、または軽鎖配列番号86とともにEGFR特異的抗体として提供される配列番号88もしくは89の重鎖-VHH融合物の群から選択される配列を含む。

【0025】

別の側面は、本明細書において記載される細胞外からアクセス可能な標的特異的タンパク質結合剤に融合したCI-M6PR特異的ISVDを含むタンパク質結合剤または融合タンパク質、またはさらに組み合わされた多重特異性結合剤をコードする核酸に関する。さらに、該結合剤または融合タンパク質の発現のための、該核酸分子を含むベクターが本明細書において開示される。

【0026】

別の側面は、創薬、構造分析、またはスクリーニングアッセイ、たとえば構造に基づく創薬もしくは断片に基づくスクリーニングアッセイなどにおける、本明細書において開示される結合剤、多重特異性結合剤、融合タンパク質または核酸の適用または使用に関する。

【0027】

別の側面は、本明細書において記載される結合剤を得るための生産方法であって、宿主において核酸分子および任意にさらなる核酸分子(抗体発現の場合)の組換え発現によって本発明の融合タンパク質を提供するステップ、および該宿主から融合タンパク質を、任意に融合タンパク質およびさらなる抗体鎖によって形成される抗体のフォーマットで精製するステップを含む生産方法に関する。

【0028】

さらなる態様は、本明細書において記載される多重特異性結合、たとえば、CI-M6PRに特異的に結合するISVDと細胞外からアクセス可能な標的タンパク質に結合するための第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性薬剤の適用または使用であって、細胞表面分子または細胞外分子または膜貫通タンパク質である該標的を、該標的に結合したときにリソソームでの該多重特異性薬剤のリソソーム取り込みによって分解する方法における適用または使用に関する。特定の態様は、任意に標識に作動可能に連結されているかまたは化学的にカップリングされている場合の、in vitroリソソームトラッキングのための本明細書において記載される該結合剤、多重特異性結合剤または融合タンパク質の使用をさらに開示する。

【0029】

さらなる側面は、本明細書において記載される結合剤、多重特異性結合剤、または本明細書において記載される融合タンパク質のいずれかを含む医薬組成物に関する。

【0030】

本発明の別の側面は、本明細書において記載される結合剤、多重特異性結合剤、融合タンパク質、または医薬組成物の医学的使用に関する。より具体的には、リソソーム蓄積症の処置に使用するための、または酵素補充治療に使用するための該薬剤またはタンパク質。本発明の別の態様は、結合剤が特異的に結合される細胞外からアクセス可能なタンパク質標的、より具体的には細胞表面または細胞外分子である標的によって引き起こされるまたはそれに関連する疾患の標的に関連する障害において使用するための、本明細書において記載される多重特異性結合剤または該多重特異性結合剤を含む医薬組成物に関する。具体的には、一態様では、該標的はEGFRであり、癌の処置に使用するための結合剤を提供する。

【0031】

本発明の最終側面は、診断またはin vivo画像化として使用するための該結合剤、多重特異性結合剤、融合タンパク質、またはその標識形態に関する。

【0032】

説明される図面は概略的なものに過ぎず、非限定的である。図面では、いくつかの要素のサイズは誇張され得、例示を目的として縮尺通りに描かれていない場合がある。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】図1は、Pichia pastorisにおけるLYTAC発現試験のSDS-PAGE分析である。構築物14～19(表1に示す組成物)は、野生型Pichia pastoris(すなわち、NCYC2543)中で生産され、20μlの上清がSDS-PAGEで分析された。「MM」＝分子量マーカー(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)

【図2】図2は、LYTACのエンドグリコシダーゼH(EndoH)消化物のSDS-PAGE分析である。構築物14～19(表1に示す組成物)は、野生型Pichia pastoris(すなわち、NCYC2543)中で生産され、19μlの上清が37℃で一晩EndoHとインキュベートされ、その後SDS-PAGEで分析された。「MM」＝分子量マーカー(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)

【図3】図3は、Pichia pastorisにおけるLYTAC発現試験のSDS-PAGE分析である。構築物26～29(表1に示す組成物)は、WT Pichia pastoris中で生産され、20μlの上清がSDS-PAGEで分析された。赤色で示されるクローンが、より大規模な発現および精製のために選択された。「MM」＝分子量マーカー(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)

【図4】図4は、LYTAC構築物に対する重力流固定化金属イオンクロマトグラフィー(IMAC)精製のSDS-PAGEである。構築物26～29(表1に示す組成物)は、野生型Pichia pastoris(すなわち、NCYC2543)の50ml培養物中で発現され、重力流IMACおよびその後の脱塩を通して上清から精製された。20μlのフロースルー(FT)画分および洗浄(W)画分ならびに1μgの精製タンパク質(P)がSDS-PAGEで分析された。「MM」＝分子量マーカー(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)

【図5A】図5は、フローサイトメトリーによって決定されるVHHに基づくnanoLYTAC構築物のin vitroでのEGFR内在化有効性である。HeLa細胞は、5または50nMのnanoLYTAC構築物(26～27)または対照で24時間処置された。生細胞は、細胞表面EGFR(PE-AF647)について染色され、BD LSR IIフローサイトメーターで測定された。(A)未処置HeLa細胞または5nMのnanoLYTAC構築物26(9G8 S54A-VHH8)もしくは27(2x9G8 S54A-VHH8)または対応する対照構築物28(9G8 S54A-GBP)もしくは29(2x9G8 S54A-GBP)でそれぞれ処置したHeLa細胞について測定した細胞表面EGFRレベルの代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。

【図5B】図5は、フローサイトメトリーによって決定されるVHHに基づくnanoLYTAC構築物のin vitroでのEGFR内在化有効性である。HeLa細胞は、5または50nMのnanoLYTAC構築物(26～27)または対照で24時間処置された。生細胞は、細胞表面EGFR(PE-AF647)について染色され、BD LSR IIフローサイトメーターで測定された。(B)未処置HeLa細胞または50nMのnanoLYTAC構築物26(9G8 S54A-VHH8)もしくは27(2x9G8 S54A-VHH8)または対応する対照構築物28(9G8 S54A-GBP)もしくは29(2x9G8 S54A-GBP)でそれぞれ処置したHeLa細胞について測定した細胞表面EGFRレベルの代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。

【図5C】図5は、フローサイトメトリーによって決定されるVHHに基づくnanoLYTAC構築物のin vitroでのEGFR内在化有効性である。HeLa細胞は、5または50nMのnanoLYTAC構築物(26～27)または対照で24時間処置された。生細胞は、細胞表面EGFR(PE-AF647)について染色され、BD LSR IIフローサイトメーターで測定された。(C)各条件について測定された蛍光強度中央値を示す棒グラフである。データは、2回のレプリケートの平均±SEMである。

【図6】図6は、HeLa細胞溶解物中の全EGFRの検出のためのウエスタンブロット分析である。HeLa細胞は、50nMの構築物26(9G8 S54A-VHH8)、27(2x9G8 S54A-VHH8)、28(9G8 S54A-GBP)もしくは29(2x9G8 S54A-GBP)で二連で処置され、または24時間未処置(UT)のままにされた。EGFR分解の陽性対照として、細胞は、50ng/mlの組換えヒトEGFで処置された。細胞溶解物が得られ、EGFRおよびβ-アクチンについて免疫ブロットされた。「kDa」＝キロダルトン。

【図7】図7は、生細胞画像化実験の一次画像である。(A～F)Alexa Fluor 488に蛍光標識された特定のVHH(すなわち、VHH7、-1、-5、-8、陰性対照(GBP)または陽性対照として使用した組換えヒト酸性α-グルコシダーゼ(rhGAA))を示す。各画像について、120分間のインキュベーションで最も適切なZスタックが選択され、細胞内タンパク質(緑色)がLysoTracker(マゼンタ)および明視野シグナルと共に示された。画像化は、Plan-Apochromat 40X(1.40油DIC UV-Vis-IR M27)対物レンズを備えたZeiss Spinning Disk顕微鏡で行われた。

【図8】図8は、内在化およびリソソーム内の抗CI-M6PR VHH7およびVHH8の顕微鏡分析である。Alexa Fluor 488(AF488)標識VHHは、HeLa細胞上で4時間インキュベートされ(37℃)、DyLight594がカップリングされた抗体を使用して検出される抗LAMP1抗体で染色された。(A)LAMP1陽性リソソーム中に検出されたエンドサイトーシスされた抗CI-M6PR VHH-AF488のパーセンテージである。(B)VHH7およびVHH8を含有するLAMP1染色リソソームのパーセンテージである。(C)AF488-VHH7、AF488-VHH8処置および未処置(培地)細胞(緑色)とLAMP1(マゼンタ)の共局在化に対応する画像である。核はDAPI(シアン)で染色された。3つの視野の画像化は、63X対物レンズを使用してSRモードでLSM880 Airyscan共焦点顕微鏡(Zeiss)でVHH-AF488ごとに行われた。

【図9】図9は、バイオレイヤー干渉法(BLI)を使用して分析されたヒト化VHH7バリアントの会合-解離グラフである。BLIは、Octet Red96(ForteBio)機器で、カイネティクス緩衝液(0.2M Na₂HPO₄、0.1M Na^＋クエン酸塩、0.01％ウシ血清アルブミン、0.002％ Tween-20)中で行われた。ビオチン化ヒトドメイン_1-3His₆は、ストレプトアビジンSAバイオセンサ(Sartorius)上に0.6nmのシグナルまで固定化された。pH7.4のリン酸クエン酸緩衝液で段階希釈(0～200nM)されたVHH7(A)、VHH7h1(B)、VHH7h2(C)、VHH7h3(D)またはVHH7hWN(E)中の120秒間の会合相の後、pH7.4、6.5、6.0、5.5または5.0のいずれかのリン酸緩衝液中で420秒間の解離が行われた。実行の間に、バイオセンサは、再生緩衝液(10mMグリシンpH3)への10秒間の3回の曝露によって再生された。会合および解離の程度は、経時的(s)にδnmで測定された。黒い曲線は、1:1結合モデル(灰色の破線)に従ってフィッティングされた二重基準減算データを表す。

【図10】図10は、バイオレイヤー干渉法(BLI)を使用して分析されたヒト化VHH8バリアントの会合-解離グラフである。BLIは、Octet Red96(ForteBio)機器で、カイネティクス緩衝液(0.2M Na₂HPO₄、0.1M Na^＋クエン酸塩、0.01％ウシ血清アルブミン、0.002％ Tween-20)中で行われた。ビオチン化ヒトドメイン_1-3His₆は、ストレプトアビジンSAバイオセンサ(Sartorius)上に0.6nmのシグナルまで固定化された。pH7.4のリン酸クエン酸緩衝液で段階希釈(0～200nM)されたVHH8(A)、VHH8h1(B)、VHH8h2(C)、VHH8h3(D)またはVHH8hWN(E)中の120秒間の会合相の後、pH7.4、6.5、6.0、5.5または5.0のいずれかのリン酸緩衝液中で420秒間の解離が行われた。アッセイの間に、バイオセンサは、再生緩衝液(10mMグリシンpH3)への10秒間の3回の曝露によって再生された。会合および解離の程度は、経時的(s)にδnmで測定された。黒い曲線は、1:1結合モデル(灰色の破線)に従ってフィッティングされた二重基準減算データを表す。

【図11】図11は、ヒト、マウスおよびウシのタンパク質についてのCI-M6PRドメイン1～3のアミノ酸配列アラインメントならびにVHH7/1H11エピトープ残基およびVHH8エピトープ残基の表示である。抗原の3つの異なるドメイン、ドメイン1(D1;ウシ残基49～171)、ドメイン2(D2;ウシres.172～325)およびドメイン3(D3;ウシres.326～476)を示す、ウシ(B/、Bos taurus)、ヒト(H/、Homo sapiens)およびマウス(M/、Mus musculus)のCI-M6PRドメイン1～3配列の多重アラインメントである。全丸は、VHH、PISAおよびFastContact分析の4オングストローム距離の出力の積分に基づいて選択されたコアエピトープ残基を表す。半円は、VHHの4オングストローム距離以内のさらなる残基を定義する。

【図12】図12は、VHH7およびhCI-M6PRのドメイン1～3の共結晶構造の図解提示である。(A)VHH7は黒で着色され、そのパラトープ残基(スティックとして示される)はCI-M6PRのドメイン1(D1)(灰色)に面している。VHH7のCI-M6PRエピトープの詳細な図は、BおよびCに示される。(B)表面図解として表示されたCI-M6PR D1の詳細な界面、およびVHH7のCDR1、-2および-3のスティックされたパラトープ残基である。(C)表面図解として表示されたVHH7の詳細な界面およびスティックとして示されたCI-M6PR D1のエピトープ残基である。(D)D1(灰色)上のエピトープ領域から4A未満以内のVHH7(黒色)のパラトープ残基を示す。

【図13】図13は、VHH8およびhCI-M6PRのドメイン1～3の共結晶構造の図解提示である。(A)VHH8は黒で着色され、そのパラトープはCI-M6PRのドメイン2(D2)およびD3(灰色)に面している。VHH8のCI-M6PRエピトープの詳細な図は、BおよびCに示される。(B)表面図解として表示されたCI-M6PR D2およびD3の詳細な界面(薄灰色)、ならびにVHH7のCDR1、-2および-3のスティックされたパラトープ残基(暗灰色)である。(C)表面図解として表示されたVHH8の詳細な界面およびスティックとして示されたCI-M6PR D2およびD3のエピトープ残基である。(D)D1(灰色)上のエピトープ領域から4A未満以内のVHH8(黒色)のパラトープ残基を示す。

【図14】図14は、VHH 1H11およびhCI-M6PRのドメイン1～3の共結晶構造の図解提示である。(A)VHH 1H11は黒で着色され、そのパラトープ残基(スティックとして示される)はCI-M6PRのドメイン1(D1)(灰色)に面している。VHH 1H11のCI-M6PRエピトープの詳細な図は、BおよびCに示される。(B)表面図解として表示されたCI-M6PR D1の詳細な界面、およびVHH 1H11のCDR1、-2および-3のスティックされたパラトープ残基である。(C)表面図解として表示されたVHH 1H11の詳細な界面およびスティックとして示されたCI-M6PR D1のエピトープ残基である。(D)D1(灰色)上のエピトープ領域から4A未満以内のVHH 1H11(黒色)のパラトープ残基を示す。

【図15】図15は、hCI-M6PRのドメイン1～3への抗CI-M6PR VHHの結合の概略図である。(A)CI-M6PR_D1-D3(PDB:1q25と同様)のトレフォイル形状の構造が概略的に示され(白色)、VHH7およびVHH8はそれぞれD1およびD2～D3のいずれかに結合されている(灰色)。(B)Aと同じであるが、CI-M6PR_D1-D3はPDB:6p8iと同様であり、VHH 1H11はD1に結合する(灰色)。

【図16】図16は、抗CI-M6PR VHH7との複合体におけるカチオン非依存性マンノース6リン酸受容体のN末端3ドメインの結晶構造情報である。VHH7中の観察された結晶接触:hCI-M6PR_D1-D3構造;1つのタンパク質のAsn112連結グリカンおよび別のタンパク質のhCI-M6PR_D3中のM6P結合ポケットによって可能にされる結晶充填。図はPyMol 2.3.3で作成された。

【図17】図17-18は、精製抗CI-M6PR VHHのタンデム競合BLI。タンデム競合BLIは、Octet Red96(ForteBio)機器で、カイネティクス緩衝液(1×PBS、1mg/mlウシ血清アルブミン、0.02％ Tween-20および0.05％アジ化ナトリウム)中で行われた。ヒトCI-M6PRドメイン_1-3His₆(50mM MES、150mM NaCl、pH6.5中、0.5mg/mL)が、EZ-Link(商標)NHS-PEG4-ビオチン(1mg、Thermo Fischer A39259)およびNaHCO₃ ^-(100mM)と共に室温で30分間インキュベートされた。ビオチン化ヒトドメイン_1-3His₆が、Zebaスピン脱塩カラム(商標)(7K MWCO、2mL、Thermo Fischer 89890)を使用して精製され、ストレプトアビジンSAバイオセンサ(Sartorius)上に0.5nmのシグナルまで固定化された。競合アッセイ(左)では、400nMの精製されたVHH7(上)またはVHH8(下)における60秒の会合相の後に、400mMの大腸菌において組換え生産されて精製された一連の抗CI-M6PR VHHのうちの1つ(図17)、または一連の抗CI-M6PR VHHのうちの1つを発現する大腸菌のペリプラズム抽出物(図18)における第2の会合相が続けられた。第2の逆アッセイ(右)では、大腸菌において組換え生産されて精製された400nMの抗CI-M6PR-VHH(図17)、または一連の抗CI-M6PR VHHのうちの1つを発現する大腸菌のペリプラズム抽出物(図18)のいずれかにおける60秒の会合相の後に、400nMのVHH7またはVHH8における第2の60秒の会合相が続けられた。アッセイの間に、バイオセンサは、再生緩衝液(10mMグリシンpH3)への10秒間の3回の曝露によって再生された。データは二重基準減算され、Octet Data Analysisソフトウェアv9.0(ForteBio)でアライメントされた。グレースケール曲線は、二重基準減算データを表す。競合表は、どの飽和VHHと競合VHHの組み合わせ(図17ではすべて400nM)が競合または非ブロッキング相互作用をもたらしたかを示す。

【図18】図17-18は、精製抗CI-M6PR VHHのタンデム競合BLI。タンデム競合BLIは、Octet Red96(ForteBio)機器で、カイネティクス緩衝液(1×PBS、1mg/mlウシ血清アルブミン、0.02％ Tween-20および0.05％アジ化ナトリウム)中で行われた。ヒトCI-M6PRドメイン_1-3His₆(50mM MES、150mM NaCl、pH6.5中、0.5mg/mL)が、EZ-Link(商標)NHS-PEG4-ビオチン(1mg、Thermo Fischer A39259)およびNaHCO₃ ^-(100mM)と共に室温で30分間インキュベートされた。ビオチン化ヒトドメイン_1-3His₆が、Zebaスピン脱塩カラム(商標)(7K MWCO、2mL、Thermo Fischer 89890)を使用して精製され、ストレプトアビジンSAバイオセンサ(Sartorius)上に0.5nmのシグナルまで固定化された。競合アッセイ(左)では、400nMの精製されたVHH7(上)またはVHH8(下)における60秒の会合相の後に、400mMの大腸菌において組換え生産されて精製された一連の抗CI-M6PR VHHのうちの1つ(図17)、または一連の抗CI-M6PR VHHのうちの1つを発現する大腸菌のペリプラズム抽出物(図18)における第2の会合相が続けられた。第2の逆アッセイ(右)では、大腸菌において組換え生産されて精製された400nMの抗CI-M6PR-VHH(図17)、または一連の抗CI-M6PR VHHのうちの1つを発現する大腸菌のペリプラズム抽出物(図18)のいずれかにおける60秒の会合相の後に、400nMのVHH7またはVHH8における第2の60秒の会合相が続けられた。アッセイの間に、バイオセンサは、再生緩衝液(10mMグリシンpH3)への10秒間の3回の曝露によって再生された。データは二重基準減算され、Octet Data Analysisソフトウェアv9.0(ForteBio)でアライメントされた。グレースケール曲線は、二重基準減算データを表す。競合表は、どの飽和VHHと競合VHHの組み合わせ(図17ではすべて400nM)が競合または非ブロッキング相互作用をもたらしたかを示す。

【図19】図19-20は、BLIを使用して分析された、それぞれ抗CI-M6PR VHH1H11およびVHH1H52の会合-解離グラフである。BLIは、Octet Red96(ForteBio)機器で、カイネティクス緩衝液(0.2M Na₂HPO₄、0.1M Na^＋クエン酸塩、0.01％ウシ血清アルブミン、0.002％ Tween-20)中で行われた。ビオチン化ヒトドメイン_1-3His₆は、ストレプトアビジンSAバイオセンサ(Sartorius)上に0.6nmのシグナルまで固定化された。pH7.4のリン酸クエン酸緩衝液で段階希釈(0～200nM)されたVHH 1H11(図19)またはVHH 1H52(図20)中の120秒間の会合相の後、pH7.4、6.5、6.0、5.5または5.0のいずれかのリン酸緩衝液中で420秒間の解離が行われた。アッセイの間に、バイオセンサは、再生緩衝液(10mMグリシンpH3)への10秒間の3回の曝露によって再生された。会合および解離の程度は、経時的(s)にδnmで測定された。黒い曲線は、1:1結合モデル(灰色の破線)に従ってフィッティングされた二重基準減算データを表す。

【図20】図19-20は、BLIを使用して分析された、それぞれ抗CI-M6PR VHH1H11およびVHH1H52の会合-解離グラフである。BLIは、Octet Red96(ForteBio)機器で、カイネティクス緩衝液(0.2M Na₂HPO₄、0.1M Na^＋クエン酸塩、0.01％ウシ血清アルブミン、0.002％ Tween-20)中で行われた。ビオチン化ヒトドメイン_1-3His₆は、ストレプトアビジンSAバイオセンサ(Sartorius)上に0.6nmのシグナルまで固定化された。pH7.4のリン酸クエン酸緩衝液で段階希釈(0～200nM)されたVHH 1H11(図19)またはVHH 1H52(図20)中の120秒間の会合相の後、pH7.4、6.5、6.0、5.5または5.0のいずれかのリン酸緩衝液中で420秒間の解離が行われた。アッセイの間に、バイオセンサは、再生緩衝液(10mMグリシンpH3)への10秒間の3回の曝露によって再生された。会合および解離の程度は、経時的(s)にδnmで測定された。黒い曲線は、1:1結合モデル(灰色の破線)に従ってフィッティングされた二重基準減算データを表す。

【図21】図21は、アノテーションされたCDRを有するVHH7およびVHH8のアミノ酸配列である。アミノ酸残基のナンバリングにはKabatナンバリングが使用される。相補性決定領域1、2および3(CDR1,2,3)は、AbM、MacCallum、Chothia、IMGTまたはKabatアノテーションに従って、灰色で標識された四角で囲んで示される。

【図22】図22は、ジチオスレイトールを含む場合(A)と含まない場合(B)の両方でLaemmli試料緩衝液中で行われた、Pichia pastorisで生産されたVHHに基づく抗EGFR nanoLYTAC構築物および対照のクーマシーブリリアントブルー染色SDS-PAGEである。「MM」＝分子量マーカー。構築物30＝VHH7-FLAG3His6。構築物31＝VHH8-FLAG3His6。構築物33＝9G8 S54A-FLAG3His6。構築物34＝9G8 S54A-VHH7-FLAG3His6。構築物35＝9G8 S54A-VHH8-FLAG3His6。構築物36＝2x9G8 S54A-VHH7-FLAG3His6。構築物37＝2x9G8 S54A-VHH8-FLAG3His6。構築物38＝9G8 S54A-GBP-FLAG3His6。構築物39＝2x9G8 S54A-GBP-FLAG3His6。

【図23】図23は、フローサイトメトリーによって決定されるVHHに基づくnanoLYTAC構築物のin vitroでのEGFR内在化有効性である。HeLa細胞は、50nMのnanoLYTAC構築物(34～37)または対照で24時間処置された。生細胞は、細胞表面EGFR(PE-AF647)について染色され、BD LSR IIフローサイトメーターで測定された。(A)未処置HeLa細胞または50nMのnanoLYTAC構築物34(9G8 S54A-VHH7)もしくは35(9G8 S54A-VHH8)または対応する対照構築物38(9G8 S54A-GBP)もしくは50ng/mlの組換えヒトEGF(rhEGF)で処置したHeLa細胞について測定した細胞表面EGFRレベルの代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。(B)未処置HeLa細胞または50nMのnanoLYTAC構築物36(2x9G8 S54A-VHH7)もしくは37(2x9G8 S54A-VHH8)または対応する対照構築物39(2x9G8 S54A-GBP)もしくは50ng/ml rhEGFで処置したHeLa細胞について測定した細胞表面EGFRレベルの代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。(C)未処置HeLa細胞の中央蛍光強度に対して正規化され、パーセンテージで表された、各条件について測定された蛍光強度中央値を示す棒グラフである。Erbitux、FDA/EMA承認モノクローナル抗EGFR抗体。データは、2回のレプリケートの平均±SEMである。示されたアスタリスクは、LYTAC処置条件を未処置(黒色)および対照構築物(38または39)処置条件(灰色)と比較した対応のないt検定から得られたp値を表す。＊P≦0.05。＊＊P≦0.01。＊＊＊P≦0.001。＊＊＊＊P≦0.0001。

【図24】図24は、VHHに基づくnanoLYTAC構築物のin vitro EGFR分解有効性を評価するためのウエスタンブロットアッセイである。HeLa細胞は、50nMのnanoLYTAC構築物(34～37)、対照構築物(38～39)または50ng/mlの組換えヒトEGF(rhEGF)で24時間処置された。細胞溶解物が得られ、EGFRおよびβ-チューブリンについて免疫ブロットされた。EGFRの強度値はデンシトメトリーによって決定され、ローディング対照に対して正規化され、未処置または構築物38処置条件と比較して表された。(A)1回目の生物学的レプリケートのウエスタンブロット分析である。(B)2回目の生物学的レプリケートのウエスタンブロット分析である。(C)3回目の生物学的レプリケートのウエスタンブロット分析である。「kDa」＝キロダルトン。「r」＝生物学的レプリケート

【図25】図25は、VHHに基づくnanoLYTAC構築物による処置に応答したリガンド誘導性EGFR活性化のin vitro阻害である。HeLa細胞は、50nMのnanoLYTAC構築物(34～37)、対照構築物(38～39)またはErbitux(50nMまたは40μg/ml)で24時間処置され、その後、細胞は、50ng/mlの組換えヒトEGF(rhEGF)で5分間刺激された。細胞溶解物が得られ、ホスホ-EGFR(Tyr1068)について免疫ブロットされた。膜のポンソーS染色は、総タンパク質レベルを実証することが示されている。「UT」＝未処置。「Ebx」＝Erbitux(FDA/EMA承認モノクローナル抗EGFR抗体)。「kDa」＝キロダルトン。

【図26】図26は、ジチオスレイトールを含む場合と含まない場合の両方でLaemmli試料緩衝液中で行われた、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で生産されたセツキシマブに基づく抗EGFR nanoLYTAC構築物およびセツキシマブのクーマシーブリリアントブルー染色SDS-PAGEである。「MM」＝分子量マーカー。「Ctx-VHH7」＝セツキシマブ-VHH7融合構築物。「Ctx-VHH8」＝セツキシマブ-VHH8融合構築物。「Ctx」＝セツキシマブ。

【図27】図27は、フローサイトメトリーによって決定されるLYTAC構築物としてのセツキシマブ-VHH融合物のin vitroでのEGFR内在化有効性である。HeLa細胞は、5または50nMのセツキシマブに基づくnanoLYTAC構築物(Ctx-VHH7またはCtx-VHH8)または対照で24時間処置された。生細胞は、細胞表面EGFR(PE-AF647)について染色され、BD LSR IIフローサイトメーターで測定された。(A)未処置HeLa細胞または5nMのセツキシマブに基づくnanoLYTAC構築物もしくはセツキシマブまたは50ng/mlまたは組換えヒトEGF(rhEGF)で処置したHeLa細胞について測定した細胞表面EGFRレベルの代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。(B)未処置HeLa細胞の中央蛍光強度に対して正規化され、パーセンテージで表された、各条件について測定された蛍光強度中央値を示す棒グラフである。データは、2回のレプリケートの平均±SEMである。Erbitux＝FDA/EMA承認モノクローナル抗EGFR抗体。示されたアスタリスクは、LYTAC処置条件を未処置(黒色)およびセツキシマブ処置条件(灰色)と比較した対応のないt検定から得られたp値を表す。＊P≦0.05。＊＄P≦0.01。＊＊＊P≦0.001。＊＊＊＊P≦0.0001。

【図28】図28は、nanoLYTAC構築物としてのセツキシマブ-VHH融合物のin vitro EGFR分解有効性を評価するためのウエスタンブロットアッセイである。2つの独立した実験において、HeLa細胞は、5nMのLYTAC構築物(Ctx-VHH7またはCtx-VHH8)、セツキシマブまたは50ng/mlの組換えヒトEGF(rhEGF)で24時間処置された。細胞溶解物が得られ、EGFRおよびβ-チューブリンについて免疫ブロットされた。EGFRの強度値はデンシトメトリーによって決定され、ローディング対照に対して正規化され、未処置またはセツキシマブ処置条件と比較して表された。「kDa」＝キロダルトン。「Ctx-VHH7」＝セツキシマブ-VHH7融合構築物。「Ctx-VHH8」＝セツキシマブ-VHH8融合構築物。「Ctx」＝セツキシマブ。「r」＝生物学的レプリケート。

【図29】図29は、Pichia pastorisで生産されたVHHに基づく抗GFP nanoLYTAC構築物および対照のクーマシーブリリアントブルー染色SDS-PAGEである。「MM」＝分子量マーカー。構築物42＝GBP-FLAG3His6。構築物43＝GBP-VHH7-FLAG3His6。構築物44＝GBP-VHH8-FLAG3His6。構築物45＝GBP-VHH1-FLAG3His6。構築物46＝GBP-VHH5-FLAG3His6。構築物47＝GBP-VHH 1H11-FLAG3His6。構築物48＝GBP-VHH 1H52-FLAG3His6。

【図30】図30は、抗GFP nanoLYTAC構築物で処置したHeLa細胞におけるin vitroでのGFP内在化および分解を評価するためのウエスタンブロットアッセイである。HeLa細胞は、50nMの組換えGFP(rGFP)および50nMのnanoLYTAC構築物(43＝GBP-VHH7および44＝GBP-VHH8)またはクロロキンを含むまたは含まない対照構築物(42＝GBP)で24時間処置された。細胞溶解物が得られ、GFPおよびβ-チューブリンについて免疫ブロットされた。陽性対照として、2.5ngのrGFPが分析された。「UT」＝未処置。「kDa」＝キロダルトン。「CQ」＝クロロキン」。

【図31】図31は、抗GFP nanoLYTAC構築物で処置したMCF7細胞におけるin vitroでのGFP内在化および分解を評価するためのウエスタンブロットアッセイである。MCF7細胞は、200nMの組換えGFPおよび200nMのnanoLYTAC構築物(43＝GBP-VHH7および44＝GBP-VHH8)またはクロロキンを含むまたは含まない対照構築物(42＝GBP)で24時間処置された。細胞溶解物が得られ、GFPおよびβ-チューブリンについて免疫ブロットされた。「UT」＝未処置。「kDa」＝キロダルトン。「CQ」＝クロロキン」。

【図32】図32は、抗GFP nanoLYTAC構築物で処置したHeLa細胞におけるin vitroでのGFP内在化および分解を評価するためのウエスタンブロットアッセイである。HeLa細胞は、200nMの組換えGFP(rGFP)および200nMのnanoLYTAC構築物(43＝GBP-VHH7、44＝GBP-VHH8、45＝GBP-VHH1、46＝GBP-VHH5、47＝GBP-VHH 1H11、48＝GBP-VHH 1H52)または対照構築物(42＝GBP)で24時間処置された。細胞溶解物が得られ、GFPおよびβ-チューブリンについて免疫ブロットされた。「UT」＝未処置。「kDa」＝キロダルトン。「CQ」＝クロロキン」。

【図33】図33は、抗GFP nanoLYTAC処置のウォッシュアウト後のHeLa細胞におけるin vitroでのGFP内在化および分解を評価するためのウエスタンブロットアッセイである。HeLa細胞は、50nMの組換えGFP(rGFP)および50nMのnanoLYTAC構築物(43＝GBP-VHH7および44＝GBP-VHH8)またはクロロキンを含むまたは含まない対照構築物(42＝GBP)で24時間処置された。細胞溶解物は、新鮮な増殖培地中での処置後(＋0時間)ならびに追加の3時間(＋3時間)および7時間(＋7時間)のインキュベーション後に得られた。溶解物は、GFPおよびβ-チューブリンについて免疫ブロットされた。陽性対照として、2.5ngのrGFPが分析された。「UT」＝未処置。「kDa」＝キロダルトン。「CQ」＝クロロキン」。

【発明を実施するための形態】

【0034】

詳細な説明
本発明は、特定の態様に関して、および特定の図面を参照して説明されるが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲におけるあらゆる参照符号は、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当然のことながら、本発明のいずれかの特定の態様に従って必ずしもすべての側面または利点が達成され得るとは限らないことを理解されたい。したがって、例えば、当業者は、本発明が、本明細書において教示または示唆され得る他の側面または利点を必ずしも達成することなく、本明細書において教示される1つの利点または利点群を達成または最適化するように具体化または実施され得ることを認識するであろう。本発明は、その特徴および利点と共に、構成および動作方法の両方に関して、添付の図面と併せて読まれるときに以下の詳細な説明を参照することによって最もよく理解され得る。本発明の側面および利点は、本明細書において以下に記載される態様(複数可)を参照して明らかになり、解明されるであろう。この明細書を通じた「一態様」または「態様」への言及は、態様に関して説明される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも1つの態様に包含されることを意味する。このようにして、この明細書全体の様々な箇所における「一態様では」または「態様では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ態様を指しているわけではないが、そうであり得る。

【0035】

定義
単数名詞を指すときに不定冠詞または定冠詞(例、「a」または「a」、「the」)が使用される場合、何か他のことが具体的に記載されていない限り、これはその名詞の複数を包含する。「含む(comprising)」という用語が本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、他の要素またはステップを排除するものではない。さらに、明細書および特許請求の範囲における第1、第2、第3という用語、その他同種類の用語は、同様の要素を区別するために使用され、必ずしも連続的または時系列的な順序を説明するためのものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書において記載される本発明の態様は、本明細書において記載または図示されている以外の順序での動作が可能であることを理解されたい。以下の用語または定義は、単に本発明の理解を助けるために提供される。本明細書において具体的に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての用語は、本発明の当業者にとって同じ意味を有する。専門家は、特に、当該技術分野の定義および用語について、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4^th ed.,Cold Spring Harbor Press,Plainsview,New York(2012);およびAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 114),John Wiley&Sons,New York(2016)に向けられる。他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、(例、分子生物学、生化学、構造生物学、および/または計算生物学における)当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0036】

本明細書において使用される「ヌクレオチド配列」、「DNA配列」または「核酸分子(複数可)」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は、二本鎖および一本鎖DNA、(逆)相補DNA、およびRNAを包含する。それはまた、既知のタイプの改変、例えば、メチル化、類似物による天然に存在するヌクレオチドの1以上の「キャップ」置換も包含する。「核酸構築物」とは、天然には一緒に見られない1以上の機能単位を含むように構築された核酸配列を意味する。例は、環状、線状、二本鎖、染色体外DNA分子(プラスミド)、コスミド(ラムダファージ由来のCOS配列を含有するプラスミド)、非天然核酸配列を含むウイルスゲノム、その他同種類のものを包含する。「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にmRNAに転写され、および/またはポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、5'末端の翻訳開始コドンおよび3'末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、mRNA、cDNA、組換えヌクレオチド配列またはゲノムDNAを包含することができるが、これらに限定されず、イントロンも特定の状況下で存在し得る。本明細書において使用される「ベクター構築物」、「発現ベクター」、または「組換えベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子を指すことが意図される。より特に、該ベクターは、たとえば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター(ラムダファージなど)、ウイルスベクター、さらにより特に、レンチウイルス、アデノウイルス、AAVもしくはバキュロウイルスベクター、または細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)もしくはP1人工染色体(PAC)などの人工染色体ベクターを包含するがこれらに限定されない、あらゆる適切なタイプを包含する当業者に公知のあらゆるベクターを包含し得る。発現ベクターは、プラスミドならびにウイルスベクターを含み、一般に、特定の宿主生物(例、細菌、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物)またはin vitro発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な所望のコード配列および適切なDNA配列を含有する。クローニングベクターは、一般に、特定の所望のDNA断片を操作および増幅するために使用され、所望のDNA断片の発現に必要な機能的配列が欠けたものであり得る。細胞のトランスフェクションに使用するための発現ベクターの構築も当技術分野でよく知られており、したがって、標準的な技術を介して達成することができる(例えば、Sambrook,Fritsch,and Maniatis,in:Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989;Gene Transfer and Expression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clif ton,N.J.)、およびthe Ambion 1998 Catalog(Ambion,Austin,Tex.を参照)。

【0037】

「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、アミノ酸残基のポリマーならびにそのバリアントおよび合成類似体を指すために本明細書においてさらに互換的に使用される。「ペプチド」は、たとえばトリプシン消化後の、その元のタンパク質に由来する部分アミノ酸配列とも呼ばれ得る。したがって、これらの用語は、1以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体などの合成の天然に存在しないアミノ酸であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。この用語はまた、グリコシル化、リン酸化およびアセチル化などのポリペプチドの翻訳後改変も包含する。アミノ酸配列および改変に基づいて、ポリペプチドの原子または分子の質量または重量は、(キロ)ダルトン(kDa)で表される。「単離された」または「精製された」とは、その天然の状態で通常付随するコンポーネントを実質的または本質的に含まない材料を意味する。例えば、「単離されたポリペプチド」または「精製されたポリペプチド」は、天然に存在する状態で隣接する分子から精製されたポリペプチド(例、該ポリペプチドに隣接する生産宿主などの試料または混合物中に存在する分子から除去された、本明細書において同定および開示される融合タンパク質または抗体またはナノボディなどのタンパク質結合剤)を指す。単離されたタンパク質またはペプチドは、アミノ酸化学合成によって生成されることができるか、または組換え生産によってもしくは複合体試料からの精製によって生成されることができる。

【0038】

タンパク質の「ホモログ」、「ホモログ(複数)」または「機能的ホモログ」は、問題の未改変タンパク質と比較してアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を有し、それらが由来する未改変タンパク質と同様の生物学的および機能的活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素が範囲内である。本明細書において使用される「アミノ酸同一性」という用語は、配列が比較ウィンドウにわたってアミノ酸ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって2つの最適にアラインメントされた配列を比較し、両配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数(すなわち、ウィンドウサイズ)で割り、その結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。本明細書において使用される「置換」または「突然変異」または「バリアント」は、親タンパク質またはその断片のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、それぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドによる1以上のアミノ酸またはヌクレオチドの置き換えから生じる。タンパク質またはその断片は、タンパク質の活性または機能性に実質的に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換を有し得ることが理解される。

【0039】

アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides.Eur.J.Biochem.138:9-37(1984))でも定義され提供されるそれらの3または1文字コード命名法によって提示され;以下の通りである:アラニン(AまたはAla)、システイン(CまたはCys)、アスパラギン酸(DまたはAsp)、グルタミン酸(EまたはGlu)、フェニルアラニン(FまたはPhe)、グリシン(GまたはGly)、ヒスチジン(HまたはHis)、イソロイシン(IまたはIle)、リジン(KまたはLys)、ロイシン(LまたはLeu)、メチオニン(MまたはMet)、アスパラギン(NまたはAsn)、プロリン(PまたはPro)、グルタミン(QまたはGln)、アルギニン(RまたはArg)、セリン(SまたはSer)、スレオニン(TまたはThr)、バリン(VまたはVal)、トリプトファン(WまたはTrp)およびチロシン(YまたはTyr)。

【0040】

「結合」は、直接的であれ間接的であれ、あらゆる相互作用を意味する。直接的な相互作用は、結合パートナー間の接触を意味する。間接的相互作用とは、相互作用パートナーが2よりも多くの分子の複合体中で相互作用するあらゆる相互作用を意味する。相互作用は、1以上の架橋分子の助けを借りて完全に間接的であることができ、または1以上の分子の追加の相互作用によって安定化されるパートナー間の直接接触が依然として存在する部分的に間接的であることができる。本明細書において使用される「特異的に結合する」という用語によって、特定の標的を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識または結合しない結合ドメインが意味される。特異的結合は排他的結合を意味しない。しかしながら、特異的結合は、タンパク質がそれらの結合体の1つまたはいくつかに対して特定の増加した親和性または優先性を有することを意味する。本明細書において使用される「親和性」という用語は、一般に、リガンド、化学物質、タンパク質またはペプチドが別の(標的)タンパク質またはペプチドに結合して、単一タンパク質モノマーの平衡をそれらの結合によって形成される複合体の存在に向かってシフトさせる程度を指す。親和性は、単一分子のそのリガンドへの結合の強度である。これは、典型的には、二分子相互作用の次数強度を評価およびランク付けするために使用される平衡解離定数(K_D)によって測定および報告される。抗体のその抗原への結合は可逆的プロセスであり、結合反応の速度は反応物の濃度に比例する。平衡状態では、［抗体］［抗原］複合体形成速度は、そのコンポーネント［抗体］＋［抗原］への解離速度に等しい。反応速度定数の測定は、平衡または親和定数(1/K_D)を定義するために使用されることができる。要するに、K_D値が小さいほど、その標的に対する抗体の親和性が大きくなる。反応の両方向の速度定数は、会合反応速度定数(K_on)と呼ばれ、これは、「オン速度」(K_on)を計算するために使用される反応の一部であり、抗体がその標的にどれだけ速く結合するかを特徴づけるために使用される定数である。逆に、解離反応速度定数(K_off)は、抗体がその標的からどれだけ速く解離するかを特徴づけるために使用される定数である「オフ速度」(K_off)を計算するために使用される反応の一部である。本明細書において示される測定では、傾きが平坦であるほど、オフ速度が遅くなるか、または抗体結合が強くなる。逆に、より急なマイナス面は、より速いオフ速度およびより弱い抗体結合を示す。実験的に測定されたオフ速度とオン速度の比(K_off/K_on)は、K_D値を計算するために使用される。オン速度およびオフ速度を測定し、K_Dを計算するためのいくつかの決定方法が当業者に知られており、したがって、K_Dは、使用されるアッセイとは無関係の値と考えられる標準誤差を考慮している。本明細書において使用される場合、「タンパク質複合体」または「複合体」または「集合したタンパク質(複数可)」という用語は、2つ以上の会合した巨大分子の群を指し、巨大分子の少なくとも1つはタンパク質である。本明細書において使用されるタンパク質複合体は、典型的には、生理学的条件下で形成されることができる巨大分子の会合を指す。タンパク質複合体の個々のメンバーは、非共有結合相互作用によって連結されている。

【0041】

「結合剤」は、別の分子に結合することが可能な分子に関し、該結合は、好ましくは、定義された結合部位、ポケットまたはエピトープを認識する特異的結合である。結合剤はまた、抗体などまたは同様のもののいくつかの分子の(共有結合)複合体として提供され得る。結合剤は、あらゆる性質またはタイプであり得、その起源に依存しない。結合剤は、化学的に合成され、天然に存在し、組換え生産され(および精製され)、ならびに設計され、合成的に生産され得る。したがって、該結合剤は、小分子、化学物質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、またはとりわけペプチド模倣物、抗体模倣物、活性断片、化学誘導体などのそのあらゆる誘導体であり得る。本明細書において開示されるタンパク質結合剤は、それ自体で、第1の結合剤、具体的には本明細書において記載されるCI-M6PR特異的ISVD、および細胞外からアクセス可能な標的タンパク質に特異的に結合する第2の結合剤を含む融合タンパク質からも構成されるポリペプチドである。特定の態様では、融合タンパク質の該第2の結合剤は、本発明のタンパク質結合剤を形成する融合タンパク質と共に、全体として細胞外からアクセス可能な標的タンパク質の結合部位を形成するために、抗体軽鎖などのさらなるコンポーネントを必要とし得る。「結合ポケット」または「結合部位」という用語は、その形状および電荷の結果として、別の化学的実体、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体またはNbと有利に会合する分子または分子複合体の領域を指す。「ポケット」という用語は、クレフト、チャネルまたは部位を包含するが、これらに限定されない。「結合ポケット/部位の一部」という用語は、結合ポケットまたは結合部位を定義するアミノ酸残基のすべて未満を指す。例えば、残基の一部は、リガンド結合において役割を果たす重要な残基であり得るか、または空間的に関連し、結合ポケットの三次元区画を定義する残基であり得る。残基は、一次配列において連続していても不連続であり得る。抗体関連分子の場合、「エピトープ」という用語はまた、本明細書において互換的に使用される結合部位を説明するために使用される。アミノ酸の空間的立体配座を決定する方法は当技術分野で知られており、例えば、X線結晶学、Cryo-EMおよび多次元核磁気共鳴を包含する。

【0042】

本明細書において使用される「抗体」、「抗体断片」および「活性抗体断片」という用語は、抗原に特異的に結合することが可能な免疫グロブリン(Ig)ドメインまたは抗原結合ドメイン、この場合は(ヒト)CI-M6PRタンパク質のN末端ドメイン1～3を含むタンパク質を指す。「抗体」はさらに、天然源または組換え源に由来するインタクトな免疫グロブリンであることができ、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。抗体は、典型的には、免疫グロブリン分子の四量体である。「活性抗体断片」という用語は、それ自体が抗原決定基またはエピトープに対して高い親和性を有し、そのような特異性を説明する1以上の相補性決定領域(CDR)を含有するあらゆる抗体または抗体様構造の一部を指す。非限定的な例とは、免疫グロブリンドメイン、Fab、F(ab)'2、scFv、重鎖-軽鎖二量体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ナノボディ、ドメイン抗体、および完全軽鎖または完全重鎖などの一本鎖構造を包含する。本発明に照らして該断片の「活性」のための追加の要件は、該断片がCI-M6PRと結合することが可能であること、または結合剤が細胞外からアクセス可能な標的を特異的に認識することを考慮して、抗体断片であることであり、活性は、細胞外からアクセス可能な標的自体に特異的に結合する能力、または軽鎖もしくは軽鎖可変ドメインなどのさらなるタンパク質ドメインの存在下で/共発現後に結合する能力を包含する。好ましくは、該CI-M6PR結合活性は、特異的に結合すること、および、より低いpH(すなわち、pH7未満のエンドソームおよびリソソームのような酸性条件)において好ましい解離プロファイルを有することを包含し、より好ましくは、対象において5.8付近のpHにおいて解離することが可能であり、および/または、(適用/処置に依存して)該pHにおいて結合を保持することができる。「免疫グロブリン(Ig)ドメイン」、またはより具体的には「免疫グロブリン可変ドメイン」(「IVD」と略記される)という用語は、4つの「フレームワーク領域」(当技術分野および本明細書において以下で「フレームワーク領域1」または「FR1」;「フレームワーク領域2」または「FR2」;「フレームワーク領域3」または「FR3」;および「フレームワーク領域4」または「FR4」とそれぞれ呼ばれる)から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味する。どのフレームワーク領域が3つの「相補性決定領域」または「CDR」(当技術分野および本明細書において以下で「相補性決定領域1」または「CDR1」;「相補性決定領域2」または「CDR2」;および「相補性決定領域3」または「CDR3」とそれぞれと呼ばれる)によって中断されている。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造または配列は、以下のように示すことができる:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。それは、抗原結合部位を保有することによって抗原に対する抗体に特異性を付与する免疫グロブリン可変ドメイン(IVD)(複数可)である。典型的には、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン(VH)と軽鎖可変ドメイン(VL)とが相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合、VHおよびVLの両方の相補性決定領域(CDR)が、抗原結合部位に寄与する、すなわち、合計6つのCDRが抗原結合部位の形成を伴う。上記の定義を考慮して、従来の4鎖抗体(例えば、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE分子;当該技術分野で知られている)の抗原結合ドメイン、またはそのような従来の4鎖抗体に由来するFab断片、F(ab')2断片、ジスルフィド連結FvもしくはscFv断片などのFv断片、またはダイアボディ(すべて当技術分野で公知である)の抗原結合ドメインは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインなどの(関連する)免疫グロブリンドメインの対、すなわち、それぞれの抗原のエピトープに一緒に結合する免疫グロブリンドメインのVH-VL対によって、抗原のそれぞれのエピトープに結合する。本明細書において使用される免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)は、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4のフォーマットに従って、4つのフレームワーク領域(FR)および3つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。本発明の「免疫グロブリンドメイン」はまた、用語「単一可変ドメイン」と同等の「免疫グロブリン単一可変」(「ISVD」と略記される)を指し、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン上に存在し、単一免疫グロブリンドメインによって形成される分子を定義する。これにより、免疫グロブリン単一可変ドメインは、2つの免疫グロブリンドメイン、特に2つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する「従来の」免疫グロブリンまたはそれらの断片とは別に設定される。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のVH/VHHまたはVLドメインによって形成される。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、3つ以下のCDRによって形成される。したがって、単一可変ドメインは、単一の抗原結合単位(すなわち、機能的抗原結合単位を形成するために単一の抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用する必要がないように、単一の可変ドメインから本質的になる機能的抗原結合単位)を形成することが可能である限りにおいて、軽鎖可変ドメイン配列(例、VL配列)もしくはその適切な断片;または重鎖可変ドメイン配列(例、VH配列またはVHH配列)もしくはその適切な断片であり得る。

【0043】

特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ナノボディ(登録商標)(本明細書において定義される)またはその適切な断片であり得る。注:ナノボディ(登録商標)、Nanobodies(登録商標)およびNanoclone(登録商標)は、Ablynx N.V.(サノフィ社)の登録商標である。ナノボディの一般的な説明については、以下のさらなる説明(ならびに例、国際公開第2008/020079号に記載されているもの)などの本明細書において引用されている先行技術に対して参照がなされる。VHH、VHHドメイン、VHH抗体断片、およびVHH抗体としても知られる「VHHドメイン」は、元々、「重鎖抗体」(すなわち、「軽鎖を欠く抗体」;Hamers-Casterman et al(1993)Nature 363:446-448)の抗原結合免疫グロブリン(Ig)(可変)ドメインとして記載されている。「VHHドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、従来の4鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン(本明細書において「VHドメイン」と呼ばれる)および従来の4鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン(本明細書において「VLドメイン」と呼ばれる)と区別するために選択されている。VHHおよびナノボディのさらなる説明については、Muyldermansによる総説論文(Molecular Biotechnology 74:277-302,2001の総説)、ならびに一般的な背景技術として言及されている以下の特許出願に対して参照がなされる:Vrije Universiteit Brusselの国際公開第94/04678号、国際公開第95/04079号および国際公開第96/34103号;Unileverの国際公開第94/25591号、国際公開第99/37681号、国際公開第00/40968号、国際公開第00/43507号、国際公開第00/65057号、国際公開第01/40310号、国際公開第01/44301号、欧州特許第1134231号および国際公開第02/48193号;Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)の国際公開第97/49805号、国際公開第01/21817号、国際公開第03/035694号、国際公開第03/054016号および国際公開第03/055527号;Algonomics N.V.およびAblynx N.V.の国際公開第03/050531号;カナダ国家研究会議による国際公開第01/90190号;抗体協会による国際公開第03/025020号(＝欧州特許第1433793号);ならびにAblynx N.V.による国際公開第04/041867号、国際公開第04/041862号、国際公開第04/041865号、国際公開第04/041863号、国際公開第04/062551号、国際公開第05/044858号、国際公開第06/40153号、国際公開第06/079372号、国際公開第06/122786号、国際公開第06/122787号および国際公開第06/122825号、ならびにAblynx N.V.によるさらに公開された特許出願。これらの参考文献に記載されているように、ナノボディ(特に、VHH配列および部分的にヒト化されたナノボディ)は、特に、1以上のフレームワーク配列中の1以上の「ホールマーク残基」の存在によって特徴づけられることができる。ナノボディのヒト化および/またはラクダ化、ならびに他の改変、部分または断片、誘導体または「ナノボディ融合物」、多価または多重特異性構築物(リンカー配列のいくつかの非限定的な例を包含する)、ならびにナノボディおよびそれらの調製物の半減期を延長するための異なる改変を包含するナノボディのさらなる説明は、例、国際公開第08/101985号および国際公開第08/142164号に見出されることができる。ナノボディは、全長抗体の結合親和性および特異性を完全に保持する最小の抗原結合断片を形成する。Nbsは、非常に長い相補性決定領域3(CDR3)ループおよび凸状パラトープを保有し、これらは標的抗原の隠れた空洞にそれらが侵入することを可能にする。

【0044】

本明細書において使用される場合、「決定すること」、「測定すること」、「評価すること」、「同定すること」、「スクリーニングすること」、および「アッセイすること」という用語は互換的に使用され、定量的および定性的決定の両方を包含する。

【0045】

タンパク質結合剤または結合剤組成物の「薬学的または治療的有効量」は、好ましくは、処置される特定の症状に結果をもたらすかまたは影響を及ぼす量である。「治療活性剤」は、疾患の処置に関連して治療効果(すなわち、治癒または安定化効果)を有するか、または有し得るあらゆる分子を指すために使用される(本明細書においてさらに記載される)。好ましくは、治療活性剤は、疾患改変剤および/または疾患に対する治癒効果を有する薬剤である。「薬学的に許容され得る」は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、その材料は、何らかの望ましくない生物学的効果を引き起こさず、またはそれが含有される医薬組成物の他のコンポーネントのいずれとも有害な様式で相互作用することなく、化合物と共に個体に投与され得る。薬学的に許容され得る担体は、好ましくは、活性成分の有効な活性と一致する濃度でペイシェントにとって比較的非毒性かつ無害であり、担体に起因するあらゆる副作用が活性成分の有益な効果を無効にしない担体である。適切な担体またはアジュバントは、典型的には、以下の非網羅的なリストに包含される化合物の1以上を含む:タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子などの大きなゆっくりと代謝される巨大分子。そのような成分および手順は、以下の参考文献に記載されているものを包含し、各々が参照により本明細書において組み込まれる:Powell,M.F.et al.(「Compendium of Excipients for Parenteral Formulations」PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 1998,52(5),238-311),Strickley,R.G(「Parenteral Formulations of Small Molecule Therapeutics Marketed in the United States(1999)-Part-1」PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 1999,53(6),324-349)、およびNema,S.et al.(「Excipients and Their Use in Injectable Products」PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 1997,51(4),166-171)。本明細書において使用される「賦形剤」という用語は、塩、結合剤(例、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール)、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝物質、安定剤、香味剤または着色剤など、医薬組成物中に存在し得、かつ活性成分ではないすべての物質を包含することが意図される。「希釈剤」、特に「薬学的に許容され得るビヒクル」は、水、塩類液、生理食塩溶液、グリセロール、エタノール等のビヒクルを包含する。湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質、防腐剤などの補助物質が、このようなビヒクルに包含され得る。

【0046】

本明細書において互換的に使用される用語「対象」、「個体」または「ペイシェント」は、脊椎動物、特に、診断、治療または予防が望まれるヒトおよび別の哺乳動物の両方を包含するあらゆる哺乳動物(例、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ラマ、ブタ、または非ヒト霊長類(例、サル)などの動物)などのあらゆる生物に関する。げっ歯類は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはチンチラであり得る。一態様では、対象は、ヒト、ラットまたは非ヒト霊長類である。好ましくは、対象はヒトである。一態様では、対象は、疾患または障害、特に本明細書において開示される疾患または障害を有するかまたは有することが疑われる対象であり、本明細書において「ペイシェント」とも呼ばれる。しかしながら、前述の用語は、症候が存在することを意味しないことが理解されよう。「処置」または「処置すること」または「処置する」という用語は互換的に使用されることができ、徴候、症候、障害、症状または疾患の進行または重症度を減速、中断、阻止、制御、停止、低減または逆転させる治療的介入によって定義されるが、必ずしもすべての疾患関連の徴候、症候、症状または障害の完全な排除を伴わない。

【0047】

本明細書において使用される「医薬」という用語は、治療において、すなわち疾患または障害の防止または処置において使用される物質/組成物を指す。本発明によれば、「疾患」または「障害」という用語は、あらゆる病的状態、特に本明細書において定義される疾患または障害を指す。

【0048】

詳細な説明
本発明は、細胞表面または細胞外空間での標的結合を可能にし、CI-M6P受容体エンドサイトーシス/リソソーム経路を介して該タンパク質結合剤と該標的との複合体の内在化を引き起こすために、さらなる抗原結合タンパク質に融合されたCI-M6PR特異的VHHの同定に基づく。VHHは、高度に安定かつ可溶性であることが知られており、細菌および酵母などの低生物において容易かつ費用効果的に製造することができるので、CI-M6PRと特異的に係合する結合剤として選択された。さらに、VHHは、それらの大きな立体配座安定性、ならびに高い固有pHおよびプロテアーゼ耐性において独特であり、これらはすべて、エンドソーム-リソソーム系を循環するための魅力的な特性を形成する。さらに、VHHに基づくフォーマットは、静脈内注射および吸入を介することを包含する様々な投与経路に適しており、したがって、任意にそれらの標的との複合体における、薬物製品のリソソーム標的化を適用するための新規アプローチを提供する。より具体的には、本明細書において記載される該CI-M6PR特異的ISVDまたはVHHに融合された標的結合剤は、標的タンパク質、好ましくは細胞表面上または細胞外に存在する標的に特異的な抗原結合ドメインであり得、それ自体で抗体に基づく標的結合、好ましくはISVDに基づく標的結合も提供する。本明細書においてnanoLYTACとも名付けられるそのような二重特異性結合体またはISVD融合ポリペプチドは、最終的にリソソーム内で分解される特異的な細胞外または細胞表面標的(複数可)の送達のためのカーゴとして、CI-M6PR媒介性リソソーム取り込みをもたらす。

【0049】

CI-M6PRは後期エンドソームと細胞膜との間を絶えず移動するので、本明細書において開示されるタンパク質結合剤は、これらの細胞下オルガネラにおいてより低いpHで解離し得るか、またはCI-M6PRへの結合を保持し、それと共にリサイクルし得る。後者は、対象におけるそのような結合剤の半減期の増加に寄与し得る。さらに、抗原結合ドメインのpH解離の調整能は当技術分野で公知であり、たとえばCI-M6PR特異的ISVDがその結合をリサイクルプロセス全体を通して維持することが可能な多重特異性結合体を生成することを可能にし得るが、さらなる抗原ドメイン結合体は、分解のためのその標的を放出するために、エンドソームおよびリソソーム内のpHに対応するpH値でそれらの標的から解離し得る。これは、それらの標的分解有効性を増加させ、したがって効力を増加させる。しかし、このようなISVDに基づく抗CI-M6PR結合体のリサイクルには、高いプロテアーゼ耐性も必要とされる。

【0050】

本発明は、CI-M6PRのN末端ドメイン上の特異的エピトープへのそれらの結合に基づく、少なくとも2つのタイプのCI-M6PR特異的ISVDを開示する。本明細書において例示されるように、どのISVDを本明細書において記載されるようなタンパク質結合剤の一部として選択するかは、細胞外からアクセス可能な標的およびその結合体の組み合わせおよび選択に依存するが、これは、エピトープ位置が、CI-M6PR結合および細胞外からアクセス可能な標的結合の両方の効力ならびにpH依存性プロファイルに関連し得るからである。各々がいくつかのVHH例によってカバーされる2つのタイプのCI-M6PR ISVDを提供することによって、CI-M6PR機構を介して標的化タンパク質分解を得ることを目指す当業者のために選択するためのツールボックスが提供される。

【0051】

したがって、本発明の第1の側面は、好ましくは融合タンパク質を含むタンパク質結合剤であって、細胞外からアクセス可能な標的タンパク質、より具体的には細胞によって分泌されるかまたは膜タンパク質であるかまたは細胞外に存在するタンパク質に特異的に結合する結合剤に連結された(該結合剤は、直接連結されているか、またはスペーサーもしくはリンカーを介して接続されている)、CI-M6PRタンパク質のN末端細胞外部分に特異的に結合するISVDに基づく結合剤を含んでおり、より具体的には、本明細書において定義されるドメイン1、2および/または3上に存在する立体配座エピトープに特異的に結合する、タンパク質結合剤を提供する。

【0052】

本発明の結合剤または融合タンパク質は、異なる結合剤が、鎖のアミノ酸残基とISVD自体との間のペプチド結合を介して作製される直接融合、またはリンカーによって作製される間接融合によって接続されるので、「融合」と呼ばれる。該融合部位は、好ましくは、フレキシブル融合タンパク質をもたらすように設計されており、異なるパラトープは、それらのそれぞれの標的または抗原への結合について互いに干渉しない。好ましい「リンカー分子」、「リンカー」または「短鎖ポリペプチドリンカー」は、約10アミノ酸長を有するペプチドである。適切なリンカー配列の非限定的な例は、当業者に知られている。リンカーは、構造ドメイン間の固定された距離を維持するように、ならびに融合パートナーの独立した機能(例、抗原結合)を維持するように選択され得る。

【0053】

特定の態様では、本発明のタンパク質結合剤の該CI-M6PR特異的ISVDと標的特異的結合剤との間の「リンカー」(「標的」は、本明細書において使用される場合、「細胞外からアクセス可能な標的タンパク質」である)は、少なくとも2つの異なる結合部位がタンパク質結合剤によって同時に到達または結合されることができるように、より長いポリペプチドリンカーであり得る。たとえば、本明細書において記載されるようなCI-M6PR特異的ISVDは、そのN末端またはC末端においてFcドメイン(たとえば、IgのFcテール)に融合され得、標的特異的結合剤は、そのN末端またはC末端を介して同一のまたは適合性のFcテールに融合され得、その結果、該Fc融合物の2つが、Fc部分のヒンジ領域におけるジスルフィド架橋を介して抗体タイプの分子の場合と同様に二量体を形成する二重特異性フォーマットのタンパク質結合剤がもたらされる。あるいは、FcテールをそのN末端またはC末端でCI-M6PR特異的ISVDに融合され得、他方の末端で標的特異的結合体に融合され得、その結果、CI-M6PR-ISVD-Fc-標的結合体タンパク質結合剤がもたらされ、これを二量体分子として形成して二価二重特異性薬剤が提供され得る。さらなるリンカーフォーマットは、ノブ・イントゥ・ホール連結の可能性を有するFcも包含し、ここでも、CI-M6PR-ISVDおよび標的特異的結合剤またはN末端もしくはC末端が該Fcに融合して、二量体二重特異的結合剤が得られる。

【0054】

さらなる態様では、該CI-M6PR特異的ISVDと本発明のタンパク質結合剤の標的特異的結合剤との間の該リンカーは、対象へ投与した場合に有利なさらなる官能基または部分によって提供され得る。そのような官能基およびそれらを導入するための技術の例は当業者には明らかであり、一般に、当技術分野で言及されるすべての官能基および技術、ならびに医薬タンパク質の改変、特に抗体または抗体断片の改変についてそれ自体公知の官能基および技術を含むことができ、それについては、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,16th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1980)に対して参照がなされる。そのような官能基は、当業者には再び明らかであるように、例えば、ISVDおよび/または標的特異的結合剤に直接(例えば、共有結合的に)連結され得、または任意に、さらなる適切なリンカーまたはスペーサーを介して連結され得る。該官能基はまた、CI-M6PR特異的ISVDまたは標的特異的結合体に連結されたさらなる部分として適用され得る。医薬タンパク質の半減期を増加させるおよび/または免疫原性を低下させるための最も広く使用されている技術の1つは、ポリ(エチレングリコール)(PEG)またはその誘導体(メトキシポリ(エチレングリコール)またはmPEGなど)などの適切な薬理学的に許容され得るポリマーの付着を含む。例えば、この目的のために、PEGは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインに天然に存在するシステイン残基に付着され得、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、PEGの付着のための1以上のシステイン残基を適切に導入するように改変され得るか、またはPEGの付着のための1以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列は、本発明のISVDまたは活性抗体断片のN末端および/またはC末端に融合され得、これらはすべて、当業者にそれ自体知られているタンパク質操作の技術を使用する。別の、通常あまり好ましくない改変は、タンパク質結合剤を発現させるために使用される宿主細胞に応じて、通常は共翻訳および/または翻訳後改変の一部として、N連結またはO連結グリコシル化を含む。結合ドメインの半減期を増加させるための別の技術は、二重機能性もしくは二重特異性ドメイン(例えば、少なくとも1つの標的特異的結合体、CI-M6PRに対する1つのISVDまたは活性抗体断片、および半減期の延長を助けるアルブミンのような血清タンパク質に対するもの)への操作、または抗体断片、特に免疫グロブリン単一可変ドメインとペプチドとの融合物(例えば、アルブミンなどの血清タンパク質に対するペプチド)への操作を含み得る。したがって、半減期延長は、CI-M6PR特異的ISVDと標的特異的結合体との間のリンカーとして適用されることができるか、またはそれらのいずれか1つにカップリングされることができる。

【0055】

細胞の細胞外表面におけるCI-M6PRタンパク質への結合は、エンドソームにおける受容体の内在化の際にその結合を維持するために、特定の親和性を必要とする。マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲であり得る閾値結合親和性が達され、標的特異的結合体がその標的に結合すると、細胞内の標的との複合体における該二重特異性薬剤の内在化および取り込みは、タンパク質結合剤/標的複合体が、初期エンドソームから後期エンドソームまで細胞区画内に存在し、最終的に細胞のリソソームに移動することをもたらす。本発明のCI-M6PR結合体については、細胞内のCI-M6PRタンパク質による効率的な取り込みおよび/またはリサイクルを可能にするために、中性pH、より具体的にはpH7.4で決定される場合、ナノモルからピコモルの範囲の結合親和性が想定される。

【0056】

本発明のタンパク質結合剤のCI-M6PR特異的ISVD、具体的にはN末端ドメイン1～3においてCI-M6PRに結合することは、本明細書において、N末端ドメイン1については配列番号23に存在するアミノ酸残基1～161、N末端ドメイン2については配列番号23に存在するアミノ酸残基162～313、およびN末端ドメイン3については配列番号23に存在するアミノ酸残基314～467を構成する該3つのN末端ドメインの少なくとも1以上に存在するエピトープへの結合として定義される(たとえば図11を参照のこと)。一態様では、該CI-M6PR特異的ISVDは、エンドソームへの内在化および/または細胞上もしくは細胞内でのリソソーム輸送時にCI-M6P受容体N末端部分への結合を保持するために、異なるpH値で必要な生物物理学的および結合特性を提供する。さらに特定の態様では、その内在化の効率は、生命細胞画像化実験方法(例を参照)におけるボクセル数/分による該CI-M6PR特異的結合剤の最小内在化速度として定義され、本明細書において、少なくとも15ボクセル数/分、または少なくとも35、または少なくとも50、または少なくとも65、または少なくとも80、または少なくとも100、または少なくとも120ボクセル数/分の内在化速度で「内在化された」と考えられる。

【0057】

特定の態様では、該結合剤は、内在化時に該CI-M6P受容体への保持された結合を提供し、そのpH依存性結合プロファイル(BLIによってISVDについて実証される)によって示されるように、エンドソーム区画のpH未満、したがってpH6未満のpHでのみ受容体から解離する。したがって、該ISVDに基づく結合剤は、中性pHおよびエンドソーム(pH6～5.5)において強い結合体を提供するが、より低いpHにおいて受容体からの明確な解離を可能にし、これにより、該ISVD結合剤は、少なくとも部分的にリサイクルされて外膜に戻される可能性が高い。これは、細胞の外側からエンドソーム区画への表面または細胞外分子の機能的なISVDに基づく除去をもたらし得る。そのようなpH依存性解離プロファイルは、たとえば、以前に開示されたVHH8(配列番号8)、VHH5(配列番号5)およびVHH1H52(配列番号25)ISVDについて観察されている(Callewaert et al.,PCT/EP2022/054278)。これらのVHHは異なるVHHファミリーに属するが、CI-M6PR上の同じ結合部位について競合し、CI-M6PRドメイン1～3とのVHH8の共結晶分析に基づいて、エピトープはN末端ドメイン2および3に位置すると決定された。

【0058】

したがって、特定の態様において、該ISVDは、CI-M6PRに特異的に結合し、N末端ドメイン2および3上に位置する結合部位を特異的に認識し、該結合部位は、エピトープ(VHH8-ペチオープとも呼ばれる)または配列番号23に示されるCI-M6PR Lys191、Gly194、Ala195、Tyr196、Leu197、Phe208、Arg219、Gln224、Leu225、Ile297、Lys357、Gly408、Asp409、Asn431、Glu433、およびPhe457のアミノ酸残基と接触しているISVDとしてより具体的に描写され得る。

【0059】

本明細書において使用される「エピトープ」または「結合部位」は、CI-M6P受容体タンパク質の細胞外部分などの標的分子上の結合部位または結合ポケット、より具体的には、ISVDまたはVHHにアクセス可能なN末端ドメイン(1～3)上の結合ポケットを構成するポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、エピトープに固有の空間的立体配座で3アミノ酸を含むことができる。一般に、エピトープは、少なくとも4、5、6、7個のそのようなアミノ酸からなり、より通常には、少なくとも8、9、10個またはそれよりも多くのそのようなアミノ酸からなる。これらの残基は、結合剤と「接触している」。エピトープは、本明細書において、Callewaert et al.(PCT/EP2022/054278)に記載されているように、VHH残基から4オングストローム以下の距離の統合分析、PISAおよびFastContact分析に基づいて互いに接触しているアミノ酸として定義される。

【0060】

さらなる態様では、該CI-M6PR特異的結合剤は、本明細書において記載されるような該VHH8エピトープへの結合について競合する薬剤として定義され得る。

【0061】

標的に特異的に結合するか、または標的のエピトープに結合するための必須残基を構成する結合剤残基は、当技術分野で知られているように、本明細書においてパラトープと定義される。したがって、CI-M6PRに対する結合剤のそのようなパラトープは、CI-M6PRのN末端ドメイン1～3上のエピトープ残基と接触している、本明細書において開示される該ISVDの残基として記載され得る。

【0062】

さらに特定の態様では、該CI-M6PR特異的ISVDは、該ISVDの特異的パラトープを接触させることによって特異的に結合し、これは、たとえば、配列番号8に示される残基Tyr32、Arg52、Trp53、Ser54、Ser56、Lys57、Ile100、Phe103およびSer108から構成され(番号順、ここではKabatナンバリングを使用しない)、上記の該エピトープに結合するための該ISVDのパラトープを提供する。あるいは、該CI-M6PR特異的ISVDは、配列アラインメント時に、VHH8の該残基32、52～57、100～103、108に対応するVHH5またはVHH1H52の特異的パラトープと接触させることによって特異的に結合する。

【0063】

さらなる代替的な態様では、該タンパク質結合剤は、内在化のためのCI-M6PR特異的ISVDを提供し、これは、そのpH依存的結合プロファイル(Callewaert et al.,PCT/EP2022/054278)によって示されるように、エンドソーム区画に存在するようなpHで受容体から徐々に解離し、そのため、解離は、6～5.5付近のpHで受容体の天然リガンドと同様に起こる。したがって、該ISVDに基づく結合剤は、中性pHにおいて結合体を提供するが、エンドソーム内で解離し(pH6～5.5)、受容体がサイクルバックし、ISVD結合剤がリソソームに進むことを可能にする(外膜にリサイクルされない)。そのようなpH依存性解離プロファイルは、たとえば、VHH7(配列番号7)、VHH1(配列番号1)およびVHH1H11(配列番号24)ISVDについて観察されている。これらのVHHは各々異なるVHHファミリーに属するが、M6PRドメイン1～3上の同じ結合部位について競合し、CI-M6PRドメイン1～3とのVHH7およびVHH1H11の共結晶分析に基づいて、エピトープはN末端ドメイン1に位置すると決定された。より具体的には、該CI-M6PR特異的ISVD結合部位(本明細書において、VHH7エピトープまたはVHH7/VHH1H11エピトープまたはVHH1H11エピトープとも呼ばれる)は、ISVDが、配列番号23に示されるLys59、Asn60、Met85、Asp87、Lys89、Ala146、Thr147、およびGlu148、ならびにAsp118またはGln119の位置のCI-M6PRのアミノ酸残基と接触しているとして、より具体的に描写され得る。エピトープは、本明細書において、Callewaert et al.(PCT/EP2022/054278)に記載されているように、VHH残基から4オングストローム以下の距離の統合分析、PISAおよびFastContact分析に基づいて互いに接触しているアミノ酸として定義される。

【0064】

さらなる特定の態様では、該結合剤は、配列番号7に示される(番号順、ここではKabatナンバリングを使用しない)その残基Asp31、Arg33、Asp35、Trp53、Ser54、Ser56、Lys57、Lys96、Asp104に接触させることによってCI-M6PRの主にドメイン1に特異的に結合するISVDを含み、上記の該エピトープへの結合のための該ISVDのパラトープを提供する。あるいは、該CI-M6PR特異的ISVDは、配列アラインメント時に、VHH7の該残基31、33、35、53、54、56、57、96、104に対応するVHH1またはVHH1H11の特異的パラトープ、たとえば配列番号24に示される残基31～35、50、52～57、96～98を含むパラトープなどと接触させることによって特異的に結合する。

【0065】

さらなる態様では、本明細書において記載されるタンパク質結合剤は、VHH1、VHH5、VHH7、VHH8、VHH1H11、またはVHH1H52 ISVDから選択される配列のいずれかのCDR1、CDR2、およびCDR3からそれぞれ選択されるISVDの結合残基に関するCDR1、CDR2、およびCDR3領域を含むCI-M6PR特異的ISVDを含み、該CDR領域は、当技術分野で公知のアノテーションのいずれか1つに従って、具体的には、Kabat、MacCallum、IMGT、AbM、またはChothiaのアノテーションに従って定義される。CDR領域の決定は、MacCallum et al.(J.Mol.Biol.(1996)262,732-745)に記載されている接触分析および結合部位トポグラフィに基づく指定などの様々な方法に従って、または、AbM(AbMは、http://www.bioinf.org.uk/abs/index.htmlに記載されているOxford Molecular Ltd.の抗体モデリングパッケージである)、Chothia(Chothia and Lesk,1987;Mol Biol.196:901-17)、Kabat(Kabat et al.,1991;5th edition,NIH publication 91-3242)、もしくはIMGT(LeFranc,2014;Frontiers in Immunology.5(22):1-22)として知られているアノテーションのいずれかに従って行われ得る。該アノテーションは、免疫グロブリンドメイン含有タンパク質中のCDRおよびフレームワーク領域(FR)の描写をさらに包含し、したがって、過度の負担なしにこれらのアノテーションをあらゆる免疫グロブリンタンパク質配列に適用することができる当業者に公知の方法およびシステムである。これらのアノテーションはわずかに異なるが、各々が標的の結合を伴うループの領域を含むことを意図している。AbMによる本明細書において記載される各VHH配列に対するCDR領域アノテーションを表12に提供する。あるいは、本明細書において開示される、たとえば図21においてVHH7およびVHH8について示される、ISVDのCDR/FR領域を同定するために、当技術分野で公知のわずかに異なるCDRアノテーションがここで適用され得る。

【0066】

VHドメインおよびVHHドメインについて当技術分野でよく知られているように、CDRの各々におけるアミノ酸残基の総数は変動し得、Kabatナンバリングによって示されるアミノ酸残基の総数に対応し得ない(すなわち、Kabatナンバリングに従う1以上の位置が実際の配列に占有され得ず、または実際の配列がKabatナンバリングによって許容される数よりも多くのアミノ酸残基を含有し得る)ことに留意すべきである。これは、一般に、Kabatによるナンバリングは、実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応し得ることまたは対応し得ないことを意味する。VHドメインおよびVHHドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常、110～120の範囲、しばしば112～115の間である。しかしながら、本明細書において記載される目的には、より小さい配列およびより長い配列も適切であり得ることに留意されたい。

【0067】

別の態様では、本明細書において提供されるタンパク質結合剤は、CI-M6PR細胞外N末端ドメイン1～3に特異的に結合するISVDを含み、該ISVDは、本明細書において例示されるVHH1、5、7、8、1H11または1H52を表す配列(それぞれ、配列番号1、5、7、8、24および25において示される)の群から選択される配列、またはその少なくとも85％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも99％の同一性を有する配列を含有し、CDR領域はそれぞれのISVD配列と同一であり、残基のバリエーションはFR領域の非結合残基についてのみ存在する。

【0068】

さらなる態様は、本明細書において表12に定義されるように、AbMに従ってアノテーションされた配列番号1、5、7、8、24または25の該CDRを含むCI-M6PR特異的ISVDを含む該タンパク質結合剤に関し、以下を含む:
-コンセンサス配列「xVQLxESGGGLVQxGGSLxLSCxAx」(配列番号78)に包含される配列のいずれかに対応するFR1配列であって、1位のx(x1)がQ、E、またはDであり、x5がQまたはVであり、x14がPまたはAであり、x19がRまたはKであり、x23がA、E、T、またはVであり、かつx25がSまたはAであるもの;
-コンセンサス配列「WxRQxPGKxxExVx」(配列番号79)に包含される配列のいずれかに対応するFR2配列であって、2位のx(x2)がL、FまたはYであり、x5がAまたはIであり、x9がG、EまたはQであり、x10がRまたはIであり、x12がG、FまたはWであり、x14がSまたはAであるもの;
-コンセンサス配列「YxDSxKxRFxxSRDxxKNTxxLxMNSLxxEDTAxxYCxx」(配列番号80)に包含される配列のいずれかに対応するFR3配列であって、2位のx(x2)がA、S、H、またはDであり、x5がVまたはAであり、x7がGまたはDであり、x10がS、T、またはAであり、x11がIまたはVであり、x15がDまたはNであり、x16がA、T、またはSであり、x20がL、IまたはVであり、x21がYまたはNであり、x23がR、QまたはYであり、x28がK、QまたはRであり、x29がPまたはTであり、x34がVまたはIであり、x35がYまたはVであり、x38がK、AまたはYであり、x39がA、RまたはCであるもの;
-コンセンサス配列「xGQGTxVTVSS」(配列番号81)に包含される配列のいずれかに対応するFR4配列であって、1位のx(x1)がWまたはRであり、x6がQまたはLであるもの。

【0069】

コンセンサスFR配列に示される該「x」残基は、ISVDの機能性を低下させることなく、可能なバリエーションを有するアミノ酸位置を提供し、その同一性の可能な差異は、VHH1、5、7、8、1H11および1H52、ならびに配列番号26～35に開示されるVHH7およびVHH8のヒト化フォーマットについて記載される配列に基づく該コンセンサス配列によって提供される。さらに、たとえばヒト化を考慮すると、類似の性質/タイプのアミノ酸が代替として使用され得るので、それぞれの位置でのそれらのアミノ酸のさらなる置換も効果を失うことなく可能である。たとえば、脂肪族小アミノ酸(I,V,L)の間、または芳香族アミノ酸(F,W,Y,H)の間、または正に帯電したアミノ酸(K,R)の間、または負に帯電したアミノ酸(DまたはE)の間、または小極性アミノ酸(S,T)の間、または非常に小さい中性アミノ酸(G,A)の間で置換が許容され得る。

【0070】

より特に、本発明のタンパク質結合剤の該CI-M6PR特異的ISVDのFR1～4領域は、表13に提供されるFR配列によって提供されることができる。

【0071】

さらなる態様では、本明細書において記載されるタンパク質結合剤は、配列番号1、5、7、8、24もしくは25の群から選択されるCI-M6PR特異的ISVD、またはそれらのいずれか1つのヒト化バリアントを含む。ドメイン抗体およびナノボディ(登録商標)(VHHドメインを包含する)などの免疫グロブリン単一可変ドメインの「ヒト化バリアント」という用語は、ヒト化に供された成果を表す、すなわち最も近いヒト生殖細胞系配列との配列同一性の程度を増加させるための該ISVDのアミノ酸配列を指す。特に、ナノボディ(登録商標)(VHHドメインを包含する)などのヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化置換(本明細書においてさらに定義される)である、および/またはそれに相当する、少なくとも1つのアミノ酸残基(特に、少なくとも1つのフレームワーク残基)が存在する、免疫グロブリン単一可変ドメインであり得る。潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するVHH配列のフレームワーク領域の配列を1以上の密接に関連するヒトVH配列の対応するフレームワーク配列と比較することによって確認することができ、その後、このように決定された潜在的に有用なヒト化置換(またはそれらの組み合わせ)の1以上を該VHH配列に(本明細書においてさらに説明されるようにそれ自体で知られているいずれかの方法で)導入することができ、得られたヒト化VHH配列は、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さおよびレベル、ならびに/または他の所望の特性について試験されることができる。このようにして、限られた程度の試行錯誤によって、他のまたはさらに適切なヒト化置換(またはそれらの適切な組み合わせ)が、当業者によって決定されることができる。また、前述のものに基づいて、ナノボディ(登録商標)(VHHドメインを包含する)などの免疫グロブリン単一可変ドメイン(のフレームワーク領域)が、部分的にヒト化され得るか、または完全にヒト化され得る。ヒト化免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にナノボディは、対応する天然に存在するVHHドメインと比較して、免疫原性の低下などのいくつかの利点を有し得る。要約すると、ヒト化置換は、ISVDおよび/またはVHHの得られたヒト化アミノ酸配列が、抗原結合能およびアロステリック調節能などの好ましい特性を依然として保持するように選択されるべきである。当業者は、一方ではヒト化置換によって提供される好ましい特性と他方では天然に存在するVHHドメインの好ましい特性との間の所望のまたは適切なバランスを最適化または達成するヒト化置換またはヒト化置換の適切な組み合わせを選択することが可能である。そのような方法は、当業者に知られている。ヒトコンセンサス配列は、ヒト化のための標的配列として使用されることができるが、他の手段も当該分野で知られている。1つの代替案は、当業者が、いくつかのヒト生殖細胞系対立遺伝子をアラインメントして(たとえば、限定されないが、IGHV3対立遺伝子のアラインメントなど)、標的配列におけるヒト化に適した残基の同定のために該アラインメントを使用する方法を包含する。また、標的配列に最も相同なヒト生殖系列対立遺伝子のサブセットを出発点として整列させて、適切なヒト化残基が同定され得る。あるいは、VHHが分析されて、ヒト対立遺伝子における最も近いホモログを同定し、ヒト化構築物の設計のために使用される。ラクダ科VHHに適用されるヒト化技術はまた、単独でまたは組み合わせて、特定のアミノ酸の置き換えを含む方法によって実施され得る。該置き換えは、文献から公知のもの、公知のヒト化努力からのもの、ならびに天然VHH配列と比較したヒトコンセンサス配列、または目的のVHH配列に最も類似するヒト対立遺伝子からのものに基づいて選択され得る。国際公開第08/020079号の表A-5～A-8に示されるVHHエントロピーおよびVHH変動性に関するデータから見られることができるように、フレームワーク領域内のいくつかのアミノ酸残基(すなわち、ホールマーク残基)は、他のものよりもヒトとラクダ科との間でより保存されている。一般に、本発明はその最も広い意味において限定されないが、何らかの置換、欠失または挿入は、好ましくは、あまり保存されていない位置で行われる。また、一般に、アミノ酸の置換は、アミノ酸の欠失または挿入よりも好ましい。たとえば、ラクダ科単一ドメイン抗体のヒト様クラスは、ヒト起源または他の種由来の従来の抗体に典型的に見られる疎水性FR2残基を含有するが、この親水性の喪失を、二本鎖抗体由来のVH中に存在する保存されたトリプトファン残基を置換する位置103における他の置換によって補償する。したがって、これらの2つのクラスに属するペプチドは、ヒトVHフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、該ペプチドは、そこから望ましくない免疫応答を予想することなく、さらなるヒト化の負担なしにヒトに直接投与され得る。実際、いくつかのラクダ科VHH配列は、ヒトVHフレームワーク領域に対して高い配列相同性を示し、したがって、該VHHは、そこからの免疫応答を予想することなく、ヒト化の追加の負荷なしにペイシェントに直接投与され得る。適切な突然変異、特に置換をヒト化中に導入して、例えば11、13、14、15、40、41、42、82、82a、82b、83、84、85、87、88、89、103、または108の位置の少なくとも1つにおいて、既存の抗体への結合が減少したポリペプチドを生成することができる(例えば、国際公開第2012/175741号および国際公開第2015/173325号に対して参照がなされる)。本発明のアミノ酸配列および/またはVHHは、1以上のホールマーク残基(本明細書において定義される)または好ましくは1以上の他のフレームワーク残基(すなわち、非ホールマーク残基)またはそれらのあらゆる適切な組み合わせなどのあらゆるフレームワーク残基(複数可)で適切にヒト化され得る。本発明のアミノ酸配列、ISVD、VHHまたはポリペプチドを発現するために使用される宿主生物に応じて、そのような欠失および/または置換はまた、当業者の能力の範囲内であるように、翻訳後改変のための1以上の部位(G、AまたはSで置き換えられるアスパラギンにおける1以上のグリコシル化部位;および/またはメチオニン酸化部位など)が除去されるように設計され得る。あるいは、置換または挿入は、例えば部位特異的ペグ化を可能にするために、官能基の付着のための1以上の部位を導入するように設計され得る。場合によっては、位置37、44、45および/または47に親水性特性を有する典型的なラクダ科のホールマーク残基の少なくとも1つが置き換えられる(カバット番号;国際公開第2008/020079号の表A-03を参照)。ヒト化の別の例は、1、5、11、14、16、および/または23、および/または28位などのFR1の残基;40位および/または43位などのFR2の残基;60～64、73、74、75、76、78、79、81、82b、83、84、85、93および/または94位などのFR3の残基;および103、104、105、108および/または111位などのFR4の残基の置換を包含する(国際公開第2008/020079号の表A-05～A08を参照;すべてのナンバリングはKabatに従う)。

【0072】

特定の態様では、本明細書において記載されるタンパク質結合剤は、保持された機能性がCallewaert et al.(PCT/EP2022/054278)において示された配列番号26～35のいずれか1つに対応する、VHH7またはVHH8のヒト化バリアントを含むCI-M6PR特異的ISVDを含む。

【0073】

別の態様は、本明細書において記載されるCI-M6PRドメイン1～3に特異的に結合するISVDと、細胞外からアクセス可能な標的に特異的に結合する結合剤とを含むタンパク質結合剤であって、該CI-M6PR特異的ISVDまたは標的特異的結合剤のいずれかに、異なるエピトープおよび/または異なる標的に対して特異的に直接または間接的に連結またはカップリングされる結合剤または部分をさらに含む多重特異性薬剤であるタンパク質結合剤に関する。したがって、該さらなる結合剤または部分は、CI-M6PRに特異的な結合剤を含み得るが、第1の結合剤とは異なる化学構造を有し、これにより、多重パラトープ性または多重特異性結合剤がもたらされ得るか、または該さらなる結合剤は、融合タンパク質の結合剤と同じ細胞外からアクセス可能な標的に結合するが該標的上の別のエピトープに結合するのに特異的な結合剤を含み得るか、または別の細胞外からアクセス可能な標的に結合し得る。さらに、該さらなる結合剤は、たとえば血清アルブミンタンパク質などの対象における融合物のタンパク質の半減期を延長することが可能な別の標的に特異的に結合し得る。したがって、該さらなる結合剤は、抗原結合ドメインを含み得、および/または機能性部分であり得る。該さらなる結合剤が、融合タンパク質の他のビルディングブロックと比較して同じまたは同一の構造または配列を有する結合剤、すなわち、CI-M6PR特異的および細胞外からアクセス可能な標的特異的結合体を含む場合、これは、該それぞれの結合体のいずれかのための多価結合体を提供し、たとえば、結合のアビディティを増加させ得る。さらに、該さらなる結合剤はまた、異なる標的特異性を有する結合剤を包含するか、または異なるリソソーム標的化タンパク質に結合する、別の形態のCI-M6PR結合剤を含み得る。特定の態様ではすべてがISVDを含み得るいくつかの結合体をカップリングさせ、異なる標的、好ましくは細胞表面上または細胞外環境に存在する標的と相互作用させることにより、これらは多重特異性結合剤として定義される。特定の態様では、融合タンパク質は、CI-M6PRおよび細胞外からアクセス可能な標的に対する結合剤と特異的に相互作用するための本明細書において開示される1よりも多くのVHHを含む。別の特定の態様は、CI-M6PRに特異的な1つの結合剤と、目的の細胞外からアクセス可能な標的タンパク質のための多価または多重特異性結合剤とを含む融合タンパク質に関する。いくつかのISVDが結合剤として使用される特定の態様では、たとえば、「多重特異性」形態が、少なくとも1つが異なる特異性を有する2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを互いに結合することによって形成される。

【0074】

したがって、本発明は、本明細書において記載されるCI-M6PRを標的とし、かつ、第2の結合として、細胞表面分子または細胞外分子、すなわち、細胞外からアクセス可能なタンパク質(CI-M6PRタンパク質とは異なる)を特異的に標的とする二重機能性の二重特異性薬剤に関し、ここで、そのような二重特異性薬剤は、CI-M6PR結合剤単独の存在下(したがって、標的に特異的に結合する該さらなる結合剤にはカップリングされない)での細胞表面分子または細胞外分子の分解と比較して標的の分解を増大させ得る。本発明のタンパク質結合剤は、少なくともCI-M6PRおよび別の細胞外からアクセス可能なタンパク質に結合するので、それ自体で既に二重特異性である。したがって、多重特異性結合剤または融合タンパク質はまた、同じまたはさらなる標的の1つに結合し得るさらなる結合剤の添加にも関連し得る。多重特異性構築物の非限定的な例は、「二重特異性」構築物、「三重特異性」構築物、「四重特異性」構築物等々を包含する。これをさらに説明するために、本発明のいずれかの多価または多重特異性(本明細書において定義される)タンパク質結合剤は、同じ抗原上の2以上の異なるエピトープに対して、例えば、CI-M6PRの1つのドメイン上のエピトープ1および別のドメイン上のエピトープ2に対して適切に向けられ得るか;または、2以上の異なる抗原、例えば、CI-M6PRに対する抗原および血清アルブミンに対する半減期延長として抗原に対して向けられ得る。医薬タンパク質の半減期を増加させるおよび/または免疫原性を低下させるための最も広く使用されている技術の1つは、ポリ(エチレングリコール)(PEG)またはその誘導体(メトキシポリ(エチレングリコール)またはmPEGなど)などの適切な薬理学的に許容され得るポリマーの付着を含む。結合ドメインの半減期を増加させるための別の技術は、二重機能性もしくは二重特異性ドメイン(例えば、半減期の延長を助ける1以上のISVDまたは1つのISVDにカップリングされたCI-M6PRに対する活性抗体断片または血清アルブミンに対する活性抗体断片)への操作、または抗体断片、特に免疫グロブリン単一可変ドメインとペプチドとの融合物(例えば、アルブミンなどの血清タンパク質に対するペプチド)への操作を含み得る。追加の部分へのカップリングは、本明細書においてさらに開示されるように、多重特異性結合剤をもたらす。

【0075】

本発明の多価または多重特異性結合剤はまた、所望のCI-M6PR相互作用およびリソソーム標的化機能について、ならびに/またはそのような多価または多重特異性結合剤の使用によって得られ得るいずれかの他の所望の特性または所望の特性の組み合わせについて、増大したアビディティおよび/または改善された選択性を有し得る(またはそのために操作および/または選択され得る)。たとえば、本明細書において記載されるような、CI-M6PRエピトープのいずれかに結合する1以上ISVDと、細胞外からアクセス可能な標的エピトープのいずれかに結合する1以上のISVDとの組み合わせは、CI-M6PR内在化を介した、タンパク質結合剤とそれに結合したその標的との完全な複合体の細胞取り込みまたは内在化の可能性を有する本発明の多重特異性結合剤をもたらし、最終的にリソソームにおける該標的(複数可)の分解をもたらし得る。細胞外からアクセス可能な標的タンパク質の「内在化」とは、本明細書において、標的が、本発明のタンパク質結合剤(したがって、CI-M6PR-ISVDを包含する)に結合した場合に、該CI-M6PR-ISVDを含まないか、またはCI-M6PRもしくはリソソーム取り込みのための他の標的に特異的に結合しない代替ISVDを含む同じタンパク質結合剤であり得る対照と比較して、より高い程度まで細胞表面から除去されることを意味し;かつ、内在化は、ボクセル数/分(本明細書において、少なくとも15ボクセル数/分、または少なくとも35、または少なくとも50、または少なくとも65、または少なくとも80、または少なくとも100、または少なくとも120ボクセル数/分の内在化速度で「内在化された」と考えられる、生命細胞画像化方法で決定される)として表すこともできる。対照と比較して「分解」または「増強された分解」とは、本明細書において、総タンパク質(細胞表面に保持されたタンパク質画分を包含する)について決定された場合、または該標的タンパク質の内在化後の細胞の細胞内画分もしくは溶解物が、いくつかの断片(たとえば、本明細書において例示されるようにウエスタンブロット分析によって決定される)に分解されたタンパク質を定性的に示す場合、該標的のタンパク質量が減少することを意味する。「対照に対する分解」(例、未処置または本発明のタンパク質結合剤のCI-M6PR特異的ISVDを欠く同等のタンパク質結合剤での処置)とは、対照と比較して、タンパク質レベルが少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、またはそれよりも多く減少することを意味する(かつ好ましくは、正規化のために対照タンパク質を用いて正規化されたタンパク質レベルに基づく)。

【0076】

さらなる態様では、本発明のタンパク質結合剤は、少なくとも本明細書において記載される該CI-M6PR特異的ISVDと、リンカー、スペーサーを介してカップリングされ得る細胞外からアクセス可能な標的タンパク質特異的結合剤とを含む多重特異性結合剤である。CI-M6PRに結合すると、該多重特異性結合剤または多価ISVDは、CI-M6PR内在化活性に対して相加的または相乗的な影響を有し得るか、または細胞表面分子もしくは細胞外分子を標的化し、細胞外環境もしくは膜環境からエンドソームおよびリソソームに抽出もしくはシャッフルするために使用され得るか、または代替的に、エンドソームサイクリング経路を介してそれらの標的をリサイクルすることによってそれらの半減期を延長するために使用され得る。本発明の多重特異性結合剤は、機能性部分、治療(さらなる標的化)部分、半減期延長部分、または細胞浸透性担体にカップリングされ得る。

【0077】

さらなる特定の態様では、該細胞外からアクセス可能な標的タンパク質特異的結合剤は、ISVD、VHH、Nb、VHH-Fc融合物、VHH-Fc-VHH融合物、ノブ・イントゥ・ホールVHH-Fc融合物などの抗原結合ドメイン、またはIgGなどの抗体を含み得るか、あるいは小分子(共有結合化学カップリングを介して連結され得る)を含み得るか、またはペプチドもしくはペプチド模倣物であり得る。さらなる特定の態様は、本明細書において記載される該ISVDに基づくCI-M6PR結合体を含み、かつ、直接的に、またはスペーサーもしくはリンカーを介して間接的に、または化学的に、細胞外からアクセス可能な標的タンパク質特異的かつ任意にさらなる結合剤にカップリングされた二重特異性フォーマットまたは多重特異性フォーマットに関する。CI-M6PR特異的ISVDと、たとえば、本明細書において定義されるような別のISVD、抗体断片または抗体タイプのVH構造またはVL構造との該カップリングまたは融合はまた、上記で議論されるように二重特異性ISVD-Fc抗体を生産するためのFcテールを介した連結を介して起こり得る。

【0078】

したがって、本明細書において想定される特定の態様は、CI-M6PRのN末端部分と特異的に相互作用するISVDに基づく結合体が、そのエンドソームサイクルの間、CI-M6PRへのその結合を保持し、pH約5.5までの解離に対して安定かつ耐性である結合親和性を有する、それらの二重特異性キメラを包含する。本明細書において記載される抗CI-M6PR VHHは、pH(in vitro)をpH6、5、4.5または4に低下させるときに異なるpH解離プロフィールを有するが、中性pHで高い特異的かつ高親和性の結合体のパネルを提供する。したがって、このパネルは、特異的な標的および用途の必要性に応じて異なる性質のリソソーム分解およびリサイクルの可能性を有する二重特異性を探索するための汎用ツールボックスを提供する。さらに、中性pHでの該CI-M6PR結合剤の高親和性(ナノモル～ピコモルのKD値)は、細胞表面上の受容体への特異的な強固な結合を確実にするために必要とされるが、その後、エンドソーム/リソソーム内に内在化されたときに迅速に解離する必要性は、CI-M6PRの天然カーゴと同じ後期エンドソーム/リソソーム送達経路が続くチャンスを高めるために望ましくあり得る。特定のpH条件での結合親和性を最適化することを考慮して、中性pHと比較して酸性pHで抗体の結合親和性を低下させることを具体的には目的とする、たとえばヒスチジンスキャン法突然変異誘発［22］を使用してVHHなどの結合剤を操作する方法が当業者に知られている。ヒスチジン残基のイミダゾール側鎖が約6.0のpKaを有するので、そのプロトン化状態の切り替えは、それが生じる界面での結合相互作用を変化させる。簡潔には、VHH CDRに組み込まれたヒスチジンを用いてコンビナトリアルファージライブラリーが得られる。次いで、このライブラリーは、pH7.4での結合およびpH5.5での溶出を用いたバイオパニングによってスクリーニングされ、続いてBLIによってこれらのpHで得られたVHHの正確な結合特性が決定される。

【0079】

別の特定の態様は、本明細書において記載されるCI-M6PR特異的ISVDと、遺伝子融合によって融合またはカップリングされ、宿主における組換え発現によって生産される、別の細胞外からアクセス可能なタンパク質のための結合剤とを含むタンパク質結合剤に関する。

【0080】

本発明の別の側面は、試料中のCI-M6PRおよび/または細胞外からアクセス可能な標的タンパク質の存在、非存在またはレベルを検出するための方法を提供し、この方法は、試料を本明細書において記載されるタンパク質結合剤と接触させること、および結合したCI-M6PR ISVDまたは標的タンパク質結合剤(任意に、標識、コンジュゲート、または多重特異性結合剤である)の存在または非存在またはレベルを検出すること、すなわち定量することを含む。本明細書において使用される試料は、とりわけ血液、血清、脳脊髄液を包含する体液などの身体から単離された試料であり得るか、またはタンパク質抽出物、細胞溶解物などの抽出物等であり得る。

【0081】

in vitroまたはin vivoでの検出および/または画像化の目的のために、本明細書において記載されるような、CI-M6PR特異的ISVDと、細胞外からアクセス可能なタンパク質に特異的に結合する結合剤とを含む本発明のタンパク質結合剤または融合タンパク質は、いくつかの態様において、検出剤(タグまたは標識など)をさらに含み得る。たとえば、本明細書において例示されるようなISVD、VHHまたはNbsもタグ付けされた。そのようなタグは、本発明の抗体または活性抗体断片の親和性精製および検出を可能にする。

【0082】

いくつかの態様は、標識もしくはタグをさらに含むタンパク質結合剤、またはより具体的には、検出可能なマーカーで標識された融合タンパク質を含む。本明細書において使用される検出可能な標識またはタグという用語は、本明細書において記載される融合タンパク質の検出および/または定量を可能にする検出可能な標識またはタグを指し、これらの目的のために当技術分野で公知のあらゆる標識/タグを包含することが意味される。特に好まれるものは、限定されないが、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、ポリ(His)(例、6×HisまたはHis6)、ビオチンまたはストレプトアビジン(Strepタグ(登録商標)、StrepタグII(登録商標)およびTwin-Strepタグ(登録商標)など)などの親和性タグ;チオレドキシン(TRX)、ポリ(NANP)およびSUMOなどの可溶化タグ;FLAGタグなどのクロマトグラフィータグ;V5タグ、mycタグおよびHAタグなどのエピトープタグ;蛍光タンパク質(例、GFP、YFP、RFP等)および蛍光色素(例、FITC、TRITC、クマリンおよびシアニン)などの蛍光標識またはタグ(すなわち、蛍光色素/蛍光体);ルシフェラーゼ、生物発光または化学発光化合物などの発光標識またはタグ(ルミナール、イスラミノール、セロマティックエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンまたはGFPおよびその類似物など);りん光標識;金属キレート剤;および(他の)酵素標識(例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼまたはグルコースオキシダーゼ);放射性同位元素である。前述の標識またはタグのいずれかの組み合わせも包含される。標識されたポリペプチドおよびタンパク質を生成するための技術は、当技術分野でよく知られている。本発明のCI-M6PR特異的ISVDと、標識もしくはタグにカップリングされた(または標識もしくはタグをさらに含む)細胞外からアクセス可能な標的に対する結合剤とを含む、本明細書において記載されるタンパク質結合剤または融合タンパク質は、たとえば該結合した融合タンパク質の免疫に基づく検出を可能にする。免疫に基づく検出は当技術分野でよく知られており、多数のアプローチの適用によって達成することができる。これらの方法は、一般に、上記などの標識またはマーカーの検出に基づく。例えば、米国特許第3,817,837号;第3,850,752号;第3,939,350号;第3,996,345号;第4,277,437号;第4,275,149号および第4,366,241号を参照されたい。複数の抗体を単一のアレイで反応させる場合、各抗体は、同時検出のために別個の標識またはタグで標識されることができる。さらに別の態様は、本発明の標識またはタグ化された融合タンパク質の意図される使用に応じて、1以上の検出可能な標識または他のシグナル生成基もしくは部分、またはタグの導入を含み得る。他の適切な標識は当業者には明らかであり、例えば、NMRまたはESR分光法を使用して検出されることができる部分を包含する。本明細書において記載されるものなど、そのような標識融合タンパク質は、特定の標識の選択に応じて、例えば、in vitro、in vivoまたはin situアッセイ(ELISA、RIA、EIAおよび他の「サンドイッチアッセイ」等などのそれ自体で知られている免疫アッセイを包含する)ならびにin vivo画像化目的に使用され得る。

【0083】

本発明の別の側面は、本明細書において記載される本発明のタンパク質結合剤または融合タンパク質を含むか、または本明細書において記載される核酸分子またはベクターと、任意に薬学的に許容され得る担体または希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。これらの医薬組成物は、それを必要とするペイシェントへの投与によって所望の薬理学的効果を達成するために利用されることができる。

【0084】

さらなる側面は、本発明の該タンパク質結合剤であって、内在化および分解のための細胞外からアクセス可能な標的タンパク質をさらに認識するISVDに基づくCI-M6PR特異的融合タンパク質を含むタンパク質結合剤、該タンパク質結合剤もしくは融合タンパク質をコードする核酸分子もしくはベクター、または診断として使用するための本明細書において記載されるこれらを含む医薬組成物に関する。

【0085】

特定の態様では、細胞外からアクセス可能な標的タンパク質を分解する手段を含有するキットが提供され、該キットは、本明細書において記載されるタンパク質結合剤を包含し、in vitroまたはin vivo系であり得る系における標的タンパク質の輸送を検出または調節することを可能にする。これらのキットは、エンドソーム/リソソーム標識などの特定の目的のために、またはin vitroで標的タンパク質分解を誘発するために、またはin vivo画像化のために、または対象における変化したCI-M6PRもしくは標的量、応答もしくは効果の診断のために提供されることが想定される。別の態様では、本明細書において記載される核酸分子、ベクター、または医薬組成物を包含する手段を含有する該キットが提供される。キットによってさらに提供される手段は、本出願で使用される方法論およびキットの目的に依存する。たとえば、本明細書において記載されるような標識された融合タンパク質、または本明細書において記載されるような核酸分子の検出は、核酸またはタンパク質レベルでのCI-M6PRまたは標的定量のために所望され得る。タンパク質に基づく検出のために、キットは、典型的には、ISVDなどの標識またはカップリングされた結合剤を含有する。同様に、核酸レベルでの検出のために、キットは、プライマーまたはプローブなどの核酸のための標識を含有し得る。さらなる制御剤、抗体または核酸もキットに提供され得る。参照もしくは比較のための標準、CI-M6PRもしくは標的タンパク質基質もしくはシグナル伝達コンポーネント、レポーター遺伝子もしくはタンパク質、またはキットを使用するための他の手段も包含され得る。当然のことながら、キットは、薬学的に許容され得る賦形剤、緩衝剤、ビヒクルまたは送達手段、取扱説明書等々をさらに含み得る。

【0086】

本発明の特定の側面は、本明細書において記載されるISVDに基づくCI-M6PR結合剤と、膜貫通受容体タンパク質として細胞表面に位置する上皮成長因子受容体(EGFR)細胞外アクセス可能標的タンパク質に特異的に結合する結合剤とを含むタンパク質結合剤に関する。GFPなどの細胞外から添加されたタンパク質がエンドソーム/リソソーム機構において効果的に内在化および分解されることができることを示す本明細書において例示される概念実証実験に加えて、膜貫通タンパク質の内在化および分解のための概念実証は、カップリングされたVHH7またはVHH8 CI-M6PR特異的ISVDと組み合わせて、EGFR結合剤がNbまたは抗体によって提供されるタンパク質結合剤を使用することによって提供された。CI-M6PR媒介性内在化および好ましくはリソソーム分解のためのEGFR標的化は、それによって、いくつかの癌の治療的処置における代替アプローチを提供する。EGFRを標的化し、またはEGFRに特異的に結合する該結合剤は、該CI-M6PR特異的ISVDに融合されることができるあらゆるタイプの結合剤として本明細書において想定され得、そのため、EGFR特異的結合剤は、抗体、小分子、ペプチド、またはISVDもしくはVHHもしくはNbを包含する別の抗原結合タンパク質であり得る。特定の態様では、該EGFR特異的結合剤は、Nbまたはその機能的(変異体)バリアントを含み、たとえば限定されないが、配列番号12に示される一価9G8 VHH、または一価ISVDの全長にわたってその少なくとも80％、85％、90％、95％、もしくは97％もしくは99％の同一性を有する機能的ホモログを包含する。機能的ホモログは、該ISVDホモログの結合特性が、本明細書において定義されるように、非常に類似または同じままであることを意味する。好ましくは、CDR中のアミノ酸残基は、突然変異が結合特性に有意に影響しない場合、および/または、例えば配列番号17に提供される配列番号12の変異体バリアントの場合のように、そのような突然変異をCDRに導入することによってグリコシル化などの別の障害物を回避することができる場合を除き、該機能的ホモログにおいて同一であり、ここで、セリン上のN-グリコシル化は、S54A置換(Kabatナンバリングによる)によって回避され、または一価ISVDの全長にわたってその少なくとも80％、85％、90％、95％、もしくは97％もしくは99％の同一性を有するいずれかの機能的ホモログである。該CI-M6PR特異的VHHに融合されると、これは、本明細書において配列番号13、18、82もしくは84において例示されるような二重特異性融合タンパク質、または各一価ISVDの全長にわたって、および/または融合タンパク質の全長にわたって、その少なくとも80％、85％、90％、95％もしくは97％もしくは99％の同一性を有する機能的ホモログをもたらす。具体的には、該CI-M6PR特異的ISVDに融合された該EGFR結合剤は、多価または多重特異性EGFR特異的結合剤であり得、より具体的には、配列番号14、配列番号19、配列番号85、または各一価ISVDの全長にわたって、および/または融合タンパク質の全長にわたって、その少なくとも80％、85％、90％、95％もしくは97％もしくは99％の同一性を有する機能的ホモログを含み得る。さらなる特定の態様では、該EGFR特異的結合剤は、本明細書においてセツキシマブとして提供される従来の抗体であり、配列番号87のようなその重鎖と配列番号86に示される軽鎖との組み合わせによって提供されるか、または本明細書において例示されるように、該タンパク質結合剤は、配列番号87の重鎖が本明細書において記載される該CI-M6PR特異的ISVDに融合されるように提供され得(配列番号88または89に提供されるものなど)、多重特異性EGFR特異的結合剤をもたらし、これは、配列番号86によって提供される軽鎖と組み合わせて、強力な様式でEGFRを内在化および分解することが可能である。したがって、EGFRを特異的に標的とする該タンパク質結合剤は、医薬として、より具体的には癌の処置に使用するために使用され得る。

【0087】

本開示による製品、組成物、方法、使用、試料およびバイオマーカー製品について、特定の態様、特異的な構成ならびに材料および/または分子が本明細書において論じられたが、本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更または改変が行われ得ることを理解されたい。以下の例は、特定の態様をよりよく説明するために提供されており、これらは本出願を限定するものと見なされるべきではない。本出願は特許請求の範囲によってのみ限定される。

【0088】

例
以下に記載される例は、ナノボディに基づくLYTACの開発を初めて示し、目的の細胞外からアクセス可能なタンパク質に対して、抗CI-M6PR VHHをVHHまたは抗体などの抗原結合タンパク質にカップリングして、内在化および/またはリソソーム分解のためにこのタンパク質を標的化するための、新規な二重特異性/多重特異性プラットフォームの概念実証を提供する。そのような多重特異性融合タンパク質の内在化の有効性は、本明細書において、細胞外標的タンパク質としてGFPおよびGFP特異的VHHを使用する概念実証実験において示され、ヒト上皮成長因子受容体(EGFR)を標的として使用して本明細書において実証された関連疾患を引き起こすタンパク質などの膜貫通タンパク質との関連でさらに調査され、該受容体を特異的に標的とする結合剤は、本発明者らが以前にラマ免疫化およびスクリーニングキャンペーンの後に単離した抗CI-MPR VHHに融合された。HeLa細胞は一般に、一般的な細胞に基づく癌モデルとして適用されるので、本発明者らは、本発明者らのNbに基づくLYTACシステムがそれらの細胞上でEGFRの内在化および/または分解を誘導できるかどうかを調査した。

【0089】

例1.VHHに基づく抗EGFR LYTAC構築物の生産および精製。
抗CI-M6PR VHHは、リソソーム蓄積症のための酵素補充治療に関連して以前に生成され、特徴づけられている(Callewaert et al.,PCT/EP2022/054278)。手短に言えば、アルパカが、ヒトCI-M6PRのドメイン1～3で免疫化され、［19］の方法に従って一連のファージパニングを行って、いくつかのヒト/マウス交差反応性VHHを得た。ヒトとマウスとの間で最も類似する親和性を有するVHHを試験し、CI-M6PR媒介性リソソーム取り込みを引き起こすことが示された。PCT/EP2022/054278で論じられているように、さらなる特徴づけが、本明細書において開示および使用されるような選択されたVHHのパネルが細胞発現M6PRの結合および内在化に適していることを明らかにした(例4)。該パネルは、N末端M6PR細胞外領域上に存在する2つのエピトープへの結合に特異的なVHHにさらにグループ化されることができた(例6)。これらの中から、本発明者らは、初期nanoLYTAC構築物への組み込みについて、バイオレイヤー干渉法(BLI)によって評価した場合に、血漿のpH(7.4)(K_D約3.35E10-9)で高い親和性で結合するVHH 8をこの例で選択した。CI-M6PRによって介在されない内在化/分解に対する陰性対照として、GFP結合性VHH(GBP)が使用された。

【0090】

CI-M6PRの二価結合が受容体二量体化を介した内在化の速度を増加させることが示されているので［7］、各構築物のCI-M6PRの一価および二価フォーマットの両方が、分解効力および有効性の評価のために分析され得る。二価を作成するために、2つのCI-M6PR VHHが、たとえば標準的なGly4 Serリンカーと連結され得る。

【0091】

第1の例では、一価のVHH8が、細胞外からアクセス可能な標的タンパク質特異的VHHとともに抗EGFR LYTAC構築物のセットに組み込まれており、より具体的には、本明細書において選択される標的はEGFRである。記載されているように、低ナノモル範囲の一価親和性でEGFR［5-6］に結合し、EGFR媒介性シグナル伝達を阻害するVHH(PMP9G8と呼ばれ、以後9G8と呼ばれる;配列番号12)は、本発明者らの抗EGFR nanoLYTACへの組み込みに使用される。受容体チロシンキナーゼは活性化時にホモ二量体を形成することができるので、EGFRの二価結合は見かけの親和性を改善し、より強力かつ効果的なCI-M6PR媒介性内在化をもたらし得る。さらに、EGFRの二量体化自体が受容体内在化およびその後のリソソームにおける分解による下方制御を駆動することができることも示されている［8］。これを説明するために、タンデムで2つの抗EGFR VHHに接続されたGBP-VHHの融合構築物(二価フォーマット)が本明細書において想定される。

【0092】

本明細書において使用される構築物は、野生型Komagataella phaffii(以下、Pichia pastorisと呼ぶ)で生産されたモジュール式クローニングプラットフォームを使用してクローニングされ、続いて精製され、その後、それらのEGFR内在化および分解能がHeLa細胞で調べられた。

【0093】

表1は、最初にクローニングされ、P.pastorisで発現されたLYTAC構築物のセットを要約している。発現試験のSDS-PAGE分析は、2つの異なるバンドを示し、1つは予想される分子量であり、1つはより大きなMWに対応する(図1)。

【表1】

【0094】

上清のエンドグリコシダーゼH(EndoH)消化の分析は、P.pastorisにおける9G8抗EGFR VHHのN-グリコシル化を示した(図2)。実際、9G8のアミノ酸配列において、N-W-SシークオンがCDR2領域において同定された。EGFR外部ドメインとの複合体における9G8の既存の結晶構造の分析は、CDR2領域からの残基のいずれも抗原結合を伴わないことを明らかにした。N-グリコシル化を除去する試みにおいて、9G8がS54A突然変異を含有する新しいセットのLYTAC構築物が生産された(表1)。発現試験は、SDS-PAGE上の追加のバンドの非存在によって実証されるグリコシル化の除去を確認した(図3)。各構築物について、適切なクローンが選択され、ベンチトップ重力流IMACおよび脱塩によって大規模な発現および精製が行われた(図4)。

【0095】

さらに、最も高い分解有効性を達成するために、標的が後期エンドソームにおいて放出されることを確実にするために、カテプシン切断部位を有するプロテアーゼ感受性リンカーを含有する抗EGFR VHHに対するCI-M6PR VHHの融合物を生成することが想定される。したがって、2つの同一のVHHの間で、標準的なフレキシブル15アミノ酸Gly4Serリンカーが使用され得る。

【0096】

最後に、VHHは治療用途に多くの利点を有するが、マイナス面は、静脈内投与時の急速な腎クリアランスであり［9］、これは、VHHコンカテマーではいくらか減少するが依然として急速である。したがって、in vivo研究での静脈内注射のために、抗EGFR nanoLYTACの薬物動態特性を改善することは予想通り有益である。したがって、結合体が抗アルブミンVHHに融合されているこれらのnanoLYTAC構築物のさらなるバリアントも本明細書において想定される。アルブミンは血管内皮細胞上の新生仔Fc受容体(FcRn)によって絶えずリサイクルされるので、これは糸球体濾過から救済され、ヒトでは19～21日の半減期をもたらす［12］。加えて、この融合は、nanoLYTAC構築物の流体力学的半径をさらに増加させる。

【0097】

例2.フローサイトメトリーによるLYTAC媒介性EGFR内在化有効性の評価のためのin vitroアッセイ。
細胞表面からの標的タンパク質の消失は、フローサイトメトリーによって定量されることができる。抗体カップリング蛍光染色強度のシグナルの減少は、標的タンパク質の内在化の際に検出される。

【0098】

フローサイトメトリーを使用して細胞表面EGFRを検出することによって、HeLa細胞処置後のEGFR-LYTAC構築物の第1のセットのEGFR内在化有効性が評価された。HeLa細胞は、未処置のままにされたか、または5もしくは50nMの構築物26(9G8 S54A-VHH8)もしくは27(2x9G8 S54A-VHH8)または対応する対照構築物28(9G8 S54A-GBP)もしくは29(2x9G8 S54A-GBP)と二連で24時間インキュベートされた。インキュベーション期間後、細胞は回収され、EGFRについて特異的に染色された。

【0099】

図5A-Bにおいて、細胞表面EGFRに対応する蛍光シグナルの代表的なヒストグラムが、未処置HeLa細胞およびLYTAC構築物(26および27)または対応する対照構築物(それぞれ28および29)で処置したHeLa細胞について示された。図5Cにおいて、実験の各条件について測定された蛍光強度中央値を示す棒グラフが示されている。結果は、LYTAC構築物26および27で処置した細胞について、未処置細胞または対応する対照構築物28および29で処置した細胞と比較して、細胞表面EGFRのシグナルが減少したことを実証している。さらに、二価EGFR結合LYTAC(構築物27)は、5nMおよび50nMの濃度の両方で一価EGFR結合LYTAC(構築物26)による処置と比較してより低いシグナルをもたらし、両方の構築物について最も高い効果は50nMで観察された(図5B)。構築物29で処置した細胞のEGFRシグナルのピークは、未処置細胞のピークと比較してわずかに左にシフトされ、EGFRの二価結合による可能性が最も高い中程度のVHH8非依存性内在化効果を示している。

【0100】

例3.ウエスタンブロットによるLYTAC媒介性EGFR分解の評価のためのin vitroアッセイ。
標的タンパク質のどの画分がnanoLYTACによる処置に応答して分解されるかを定量するために、化学発光ウエスタンブロット分析が行われた。HeLa細胞は、50nMの構築物26(9G8 S54A-VHH8)もしくは27(2x9G8 S54A-VHH8)または対応する対照構築物28(9G8 S54A-GBP)もしくは29(2x9G8 S54A-GBP)とOptiMEMにおいて24時間インキュベートされた(二連)。溶解物が得られ、抗EGFR抗体による免疫ブロットに供された(図6)。陽性対照として、細胞が、EGFR分解を誘導することが知られているEGFと共にインキュベートされた。記載されたウエスタンブロット実験において、本発明者らは、未処置細胞または対照構築物で処置された細胞と比較して、該nanoLYTAC構築物で処置された細胞についてより低いレベルの総EGFRを効果的に検出することができなかった。しかしながら、本発明者らは、これが現在の実験設定の原因であり得、したがって条件および方法の最適化が必要とされると推測しており、例10および例12でさらに詳述されている。

【0101】

例4.抗CI-M6PR VHH1、VHH5、VHH7およびVHH8は、エンドサイトーシスされ、後期エンドソームおよびリソソームと共局在化する。
M6PR結合VHHの選択されたパネルが効果的に内在化し、エンドソーム区画を通ってリソソームに輸送することを実証するために、Callewaert et al.(PCT/EP2022/054278)に記載され、本明細書において要約されるように、いくつかの実験が以前に行われた。

【0102】

エンドリソソーム区画への標的化は、生細胞内のAAF488-VHHシグナルを経時的に(3時間)モニタリングすることによって評価された。LTRインキュベーションならびにAF488標識抗CI-M6PR VHH、GFP結合タンパク質(GBP)および組換えヒト酸グルコシダーゼα(rhGAA;陽性対照)の投与後、6分ごとに3視野が画像化された。画像化後、本発明者らは、各蛍光VHHのボクセル数の合計を、特定の時点における画像化細胞あたりのボクセル数の合計で割ることによって、細胞体積あたりの取り込みを計算した。

【0103】

細胞体積に対するタンパク質の取り込みは、VHH1、-5、-7および-8について最良の結果を提供した。細胞体積に対するタンパク質の最大取り込みは、3時間にわたって観察されたシグモイド傾向および125.5×10⁴の合計AF-ボクセル/分の内在化速度の後に、VHH7について観察された。同様に、AF488陽性ボクセル数の合計を時間で割ることによって計算すると、VHH1の内在化速度は138.2×10⁴の合計AF-ボクセル/分であった。VHH7および-1と比較して、VHH5の観察された細胞内蛍光はより低く、より可変であったが、VHH8およびrhGAAについては、内在化速度は68.7、67.3および17.8×10⁴の合計AF-ボクセル/分であった。残りのVHH(VHH1～11が本明細書において分析された)のプロファイルは陰性対照(GBP)と同等であり、これらが実際に細胞表面hCI-M6PRに結合しないことが確認された。

【0104】

LTRと共局在化した細胞内AF488シグナルおよび全細胞内VHHシグナルのボクセル数比をとることによって、リソソームとのVHH共局在化の平均パーセンテージが計算された。これの次に、特定のVHHまたはrhGAAを含有するエンドライソームプール全体の平均パーセンテージも、LTRと共局在化するVHHシグナルおよび総LTRシグナルのボクセル数比によって決定された。時折、低い細胞内AF488シグナルおよび変動するパーセンテージのために、細胞内VHHシグナルおよびVHH-LTR共局在化シグナルの絶対ボクセル数も考慮された。120分間のインキュベーション後の一次画像が図7に示される。

【0105】

60分後、リソソーム内VHH1、5および7のパーセンテージは平衡に達するが、VHH8は90分でプラトーに達しつつある。VHH1、-8およびrhGAAで処置した細胞のLTR陽性ボクセルは最大60％の内在化タンパク質を含有していたが、総VHH7陽性LTR陽性プールは3時間後に20％付近であった。三角曲線は、AF488-VHHまたは-rhGAAと共局在するLTR染色オルガネラのモニターされた画分を概説している。AF488シグナルについて陽性である総LTRプールは、VHH7について最も高く、3時間後に30～40％の間であり、VHH1については15％付近であった。VHHを含有するLTRプールの画分は、VHH5、VHH8およびrhGAAについては10％未満であり、他のVHHについてはさらに低かった。全体として、これらの結果は、特異的エンドサイトーシスおよび抗CI-M6PR VHH1、5、7および8によるリソソーム標的化の最大パーセンテージを明確に示している(陰性対照(すなわち、GBP)と比較した場合;表2)。陽性対照は、限定されたリソソーム共局在化のみを示す。

【表2】

【0106】

差次的な効率で標識されているが、エンドサイトーシス時のこれらの4つの抗CI-M6PR VHHのエンドリソソーム含有量のバリエーションは、これらの分子の差次的なリソソーム送達または可変サイクル経路を示し得る。これは、VHH7について最も顕著であり、本発明者らは、他と比較して、より低いVHH7エンドライソームプールであるが、VHH7を含有するエンドライソソームの画分の増加を観察した。エンドリソソーム含有量のこれらのバリエーションが真のリソソーム送達の結果であるかどうかを調べるために、本発明者らは、固定細胞上で成熟リソソーム中に徐々に存在するリソソーム膜タンパク質であるLAMP1と共局在するAF488-VHHの画分を調べた。本発明者らは、ますますエンドサイトーシスを受けているVHH7、および細胞内画分は低いがより大きなLTR陽性画分が観察されることができるVHH8についてもこれを行った。HeLa細胞上で4時間インキュベートした後、抗LAMP1抗体は染色に使用された。

【0107】

図8に示されるように、240分後の細胞内VHH7のリソソーム内画分は、LTRとの200分後の生細胞画像化実験の間に本発明者らが観察したもの(すなわち20％)と同じ範囲(すなわち19％)であった。しかしながら、本発明者らは、LTRとの60％と比較して、LAMP1陽性リソソームとの2.5～12％のみの細胞内VHH8共局在化を検出したので、これはVHH8について完全に反対である。リソソーム内画分の次に、VHHを含有するLAMP1染色ボクセルのパーセンテージも計算した(図8A)。

【0108】

AF488-VHH7のLAMP1共局在化画分およびLTR共局在化画分はそれぞれ19％および20％であり似ているが、VHH8はLAMP1共局在化画分(すなわち、最大12％)と比較してはるかに高いLTR共局在化画分(すなわち60％)を有することは注目に値する。生細胞画像化と固定後の顕微鏡検査とを比較することは困難であるが、もちろん使用される細胞株が異なるために、これらの実験は、VHH7およびVHH8が異なるエンドリソソーム経路に従い得ることを示唆している可能性がある。VHH7は、LTRおよびLAMP1とほぼ等しい共局在化を示し、VHH7のリソソーム標的化の増加を示唆している。pH7.4に対してpH6.0でのVHH7の解離速度が5倍高いことを考えると、エンドサイトーシス時の即時エンドソーム酸性化がVHH7の迅速な解離を可能にし、その後、成熟中にエンドソームカーゴと共にリソソームに送達されることができることはもっともらしい。その場合、未結合受容体はリサイクルされ、新しい結合ラウンドに参与し得る。LTR染色オルガネラと比較してLAMP1染色された低量のVHH8は、以前のエンドライソームネットワークとの共局在化の増加を示すことができる。しかしながら、VHH8を有するより多量のLAMP1-リソソームが検出された(図8B)。VHH8はpH6.0とpH5.0との間で解離が移行するので、リソソームに送達される代わりに初期エンドソーム段階(pH5.9～6.5)でhCI-M6PRに結合したままであり得ることはもっともらしい。一方ではVHH7の高いLAMP1共局在化、他方ではVHH8の周辺局在化は、これを示すことができる(図8C)。

【0109】

VHHが成熟リソソームに到達すると、それらはおそらくリソソームプロテアーゼによって変性されることにも留意すべきである。その後、局在化に関してフルオロフォアに何が起こるかは不明である。しかしながら、この挙動は、研究されたVHHにわたって同様であると仮定することができる。

【0110】

これらの顕微鏡検査における絶対数の解釈を通して重要なことは、すべてのVHHの得られた標識化の程度および組換えhCI-M6PR_D1-D3に対するその低下した親和性を認識することである。これは不可避であり、これらのNHS-エステル標識について一般に予想されるものと同等であるが、VHH7の絶対数は、その高い標識効率のためにおそらく過大評価される。組換えhCI-M6PR_D1-D3について組み合わされた多様な親和性が天然のhCI-M6PRへの結合に直接対応しないことを想起することも重要である。さらに、本発明者らが共局在化AF488およびLTRの画分またはLAMP1シグナルを計算したところ、他のすべての記載とともに、レプリケートVHH間の変動性とともに低レベルのエンドサイトーシスが異常に高い共局在化パーセンテージを迅速にもたらすことができることが観察された。他のVHHは、以前の実験において細胞表面におけるCI-M6PR受容体係合の証拠を有していなかった。しかし、ほとんどがGBPと同様にこの低レベルの非常に可変的な取り込みを示し、これらの理由のために上記の議論から除外された。

【0111】

例5.VHH7およびVHH8のヒト化バリアント。
抗CI-M6PR VHH7およびVHH8の複数のヒト化バリアントはin silicoで設計された(VHH7ヒト化バリアントについては配列番号26～29、およびVHH8ヒト化バリアントについては配列番号30～35;Callewaert et al.(PCT/EP2022/054278)に開示されている)。VHH7hWNおよびVHH8hWNはHEK293Sにおいて生産し、IMACおよびSECによって精製された。バリアントVHH7h1-3およびVHH8h1-5は大腸菌で生産させ、精製はIMACおよび脱塩によって行われた。

【0112】

VHH7およびVHH8のヒト化バリアントの選択のために、ヒトCI-M6PRドメイン_1-3His₆がビオチン化され、ストレプトアビジンバイオセンサチップにカップリングされるバイオレイヤー干渉法(BLI)実験が行われた。ローディング後、会合相の間、チップはpH7.4のカイネティック緩衝液に連続希釈されたVHHとインキュベートされ、pH7.4、pH6.5、pH6.0、pH5.5およびpH5.0で解離が行われた。次いで、その後のVHHの分析の前に、すべてのバイオセンサチップが再生された。表3は、BLI測定の処理およびカーブフィッティング後に検索された動態パラメータをまとめたものである。会合および解離の両方がpH7.4で行われた場合、得られた親和定数(K_D)、会合(k_on)および解離速度定数(k_off)が示されている1:1結合モデルに従って、全体的な適合が行われた。pH7.4での会合およびpH6.5、6.0、5.5および5.0での解離を用いた測定の場合、示された解離速度定数は、200、100および50nMのVHHの解離の局所曲線フィッティングによって決定されたパラメータの平均である。VHH7およびそのヒト化バリアントの会合-解離曲線は図9に示され、VHH8およびそのヒト化バリアントの会合-解離曲線は図10に示される。

【0113】

BLIは、ヒト化バリアントVHH7h1、VHH7h2、VHH7h3およびVHH7hWNのpH依存性解離を明らかにし、解離プロファイルはそれらの非ヒト化対応物VHH7と同様であり、解離速度は徐々にであるが、pHの低下とともに中程度に増加した(図9、表3)。さらに、pH7.4でのヒトCI-M6PRドメイン_1-3His₆に対するそれらの親和性は、ヒト化時にほとんど変化しないままである。同様に、解離速度がpH7.4と6.0との間で中程度にしか増加しないが、次いでpH5.5と5.0との間で一桁近くの急速なサージを示すVHH8のpH依存性解離プロファイルは、そのヒト化バリアントVHH8h1、VHH8h2、VHH8h3およびVHH8hWNについて変化しない(図10、表3)。ここでも、pH7.4で得られたK_D値は、評価中のすべてのバリアントについて同等である。

【表3】

【0114】

例6.VHH-hDom1-3His複合体の多角度光散乱および結晶学。
本明細書において使用されるVHHの結合部位を同定することを考慮して、Callewaert et al.(PCT/EP2022/054278)に以前に記載されたように、ヒトM6PRドメイン1～3との複合体におけるいくつかのVHHの構造分析が行われた。CI-M6PRの3つのN末端ドメインはCI-M6PRタイプドメインのリピートであるので(Pfam PF00878)、本発明者らは、hCIMPR_D1-D3:VHHタンパク質複合体の分子量およびオリゴマー状態を最初に決定し、本発明者らは、hCIMPR_D1-D3:VHH8を1:1および1:3のモル様式でインキュベートした後、SEC-MALLS溶出および画分試料を分析した。計算されたタンパク質質量は、VHHおよび抗原について予想されたもの、それぞれ17kDa(±1kDa)および51.3kDa(±0.9kDa)、複合体について62kDa(±2kDa)に対応し、両タンパク質の等モル結合に応じた。画分試料が非還元SDS-PAGEで分析された場合も、凝集したまたは他のオリゴマー構造が検出されることができたが、限定されたままであった。VHHと抗原タンパク質の複合体化は、エンドグリコシダーゼH消化後に調べたところ、hCI-M6PR_D1-D3 N-グリカンからも独立していた。本発明者らは、VHH8およびhCI-M6PR_D1-D3との等モル結合を見出したので、次のSEC-MALLS実行中に等しい濃度のVHH7およびhCIM6PR_D1-D3も使用された。hCIM6PR_D1-D3については50kDa(±2kDa)、抗CI-M6PR VHH7については15(±1kDa)および複合体については63.7(±0.5kDa)の分子量が測定された。したがって、共結晶化スクリーニングの前に、VHH7、VHH8およびVHH1H11(後者は再パニング実験後に得られたものである(例7を参照))の両方について、(グリコシル化)hCI-M6PR_D1-D3を用いて最終的な分取SEC実行がしかるべく行われた。結晶化後、抗原およびVHHの両方の存在がSDS-PAGEで確認された。

【0115】

CI-M6PRのN末端の最初の3つのドメイン(CI-M6PR_D1-D3)は、以前に公開された立体配座に似ている。VHH7およびVHH8との共結晶において、hCI-M6PR_D1-D3は、ウシCI-MPR_D1-D3(pdb 1q25)について観察された立体配座と同様のトレフォイル形状の構造を採用する。

【0116】

VHH1H11との共結晶構造において、第3のドメインは、pdb 6p8iに存在する立体配座に似るようにD1に向かってシフトしている(図14)。VHH7および-8含有複合体の結晶化混合物中に存在するが、マンノース6リン酸は、いずれの構造にも観察されなかった。3つのN-グリコシル化配列におけるN-グリカン(すなわち、Asn112、Asn400およびAsn435)は、電子密度から様々な程度まで同定されることができた。VHH7およびVHH8を有する共結晶構造では、Asn112にグリカンを含有するMan3GlcNAc2またはMan4GlcNAc2について明確な電子密度が解釈されることができた。部分的なコアGlcNAcまたはGlcNAc2のみが、他の位置における電子密度から解釈されることができた。しかしながら、興味深いのは、結晶学的対称性関連のCI-M6PRコピーのAsn112上のN連結グリカンとD3中のM6P結合ポケットとの間のこれらの結晶構造において観察される結晶接触である。より具体的には、Asn112上のオリゴマンノシル化グリカンのα1,3-Manは、主に水素結合を介して残基Tyr359、Gln383、Arg426、Glu451およびTyr456と相互作用するCI-M6PR_D3上のクレフトに結合する(図16)。VHH 1H11共結晶構造のAsn112およびAsn435上のN連結グリカンは、コア1-6フコシル化として同定されることができた。

【0117】

各ドメインのコア構造は、5本鎖逆平行βシート(β3～β6)を含む平坦化βバレル(PfamドメインCIMR PF00878)からなり、その鎖は第2の5本鎖βシート(β8～β11)上に直交配向されて延伸し、その第4の鎖がβ9とβ11との間に挿入されている。各ドメインは、CI-M6PR(PDB:1sy0,1sz0,1q25,6p8i)¹⁷のN末端の3つのドメインのウシ結晶構造と同等であるように、4つのジスルフィド結合を含有すべきである。ヒトドメイン2(残基161～313)およびドメイン3(残基314～467)のN末端は各々、ランダムコイルと、それに続くコア平坦化βバレル構造を接続する2つの補助的β鎖(β0、β1およびβ2)とから構成されるリンカー領域を含有する。

【0118】

抗CI-M6PR VHH7、VHH8およびVHH 1H11は、それぞれ、中性および伸張捻転CDR3ループを有する一般的な免疫グロブリン様フォールドを採用する。抗CI-M6PR VHH7およびhCI-M6PR_D1-D3タンパク質複合体の最高解像度結晶構造は、2.2Aの分解能まで解明され(図12A)、pH 6.5で成長された(図12A)。第1のタンパク質複合体は、hCI-M6PR_D1の平坦化βバレルの2つのβシートの間に充填された片側に位置するVHH7を明らかにする(図12B)。VHH7は、その抗原に1つの側面を提示しながら、そのCDR1、2を介して相互作用するが、CDR3の残基とも相互作用する(図12C)。これらは、D1のドメイン内ループA～Dのアミノ酸側鎖と接触する(図12)。この複合体は、他の結晶形態では同一に近い。

【0119】

2.75Aの分解能で解明されたVHH8共結晶構造は、VHH8がCI-M6PRのhCI-M6PR_D2とhCI-M6PR_D3との間に位置することを明らかにする(図13A)。これらは、アミノ酸がVHH8の可変突出ループと接触するV字形表面を形成する(図13B)。一般に、CDR2由来の残基の大部分はD3の残基と相互作用するが、CDR3由来の残基はD2に面している。CDR1の寄与は、他のCDRと比較して、全体的な相互作用についてのみ限定される(図13C)。

【0120】

VHH7競合抗CI-M6PR VHH 1H11およびhCI-M6PR_D1-D3の結晶構造が2.7Aの分解能で解明され、それによって突然変異スクリーニングおよび競合BLIから得られた結果が確認された。VHH7と同等に、VHH 1H11は、hCI-M6PR_D1の平坦化βバレルの片側に面し(図14A～B)、主にCDR1およびCDR2を有するβシートの両方からの残基と相互作用する(図14C)。一般的な概要として、リード抗CI-M6PR VHHの結合の概略図が図15に示される。

【0121】

PISA［18］およびFastContact［16］ソフトウェアが調べられて、hCI-M6PR_D1-D3との抗CI-M6PR VHH7、-8および-1H11の結合表面における相互作用残基が大まかに計算および同定された。FastContact分析は静電相互作用に偏っているので、本発明者らは、PyMol［14］で計算された脱溶媒和自由エネルギーおよび静電エネルギーの計算を距離尺度と組み合わせて、抗CI-M6PR VHHおよびその抗原の界面残基を近似した。この情報から、VHH7、VHH 1H11およびVHH8のいずれかについて、2つの非常に異なるパラトープおよびエピトープが描写されることができた。抗CI-M6PR VHH7のエピトープ(図12)は、主に、CI-M6PRD1におけるβシートのドメイン内ループA、B、CおよびDの一部であるアミノ酸からなる(図12)。加えて、平坦化βバレルの疎水性コアを構成する疎水性残基(例、Phe143)は、VHH結合に寄与する。現在の推定によれば、重要なパラトープ残基はArg33、Lys57およびAsp104を含み、hCI-M6PR_D1残基Asp87、Glu148およびLys89とそれぞれ相互作用する(表4、図12D)。これらの計算により、VHH 1H11およびVHH7のエピトープの類似性を確認することができた。一般に、相互作用に寄与すると推定される残基は、VHH7のエピトープおよびパラトープと同等であった(表4)。例えば、残基Arg33およびLys57は、CI-M6PR_D1-D3へのVHH 1H11の結合を高度に伴うと推定されたが(図14D)、VHH 1H11のCDR3の残基は、おそらくあまり寄与していない。その上、ここでの推定は、Asp87、Lys89およびGlu148が高度に寄与する残基として、両エピトープ間で高い類似性を示した(表5)。抗CI-M6PR VHH8のエピトープは大きく異なる(図13)。VHH7とは対照的に、CI-M6PRD1-D3とVHH8との相互作用は、hCI-M6PRD2およびhCI-M6PRD3のドメイン間およびドメイン内ループで起こるが、これらのドメインのβ鎖内の残基も影響を及ぼす(表6)。記載されるように、CDR2を構成するアミノ酸はD3と接触する。このうち、VHH8のLys57は、D3のGlu409およびGlu433と静電相互作用を形成すると推定される(表6、図13D)。D2とCDR3との間の強い接触は、それぞれAsp102およびLys191であると推定された(表6、図13D)。

【0122】

エピトープ情報により、VHH7、-8および1H11の(非)交差反応性結合をさらに考察することが可能になる。ヒトドメイン1～3とBos taurusまたはMus musculusドメイン1～3配列のいずれかとの間の75％の配列同一性にもかかわらず、VHH7およびVHH8界面はかなり保存されている。図11において、本発明者らは、hCI-M6PR_D1-D3についてのオーソロガス配列における特異的エピトープ残基の各々を示した。総結合自由エネルギーに有意に寄与する残基を考慮すると(すなわち、ΔGが-1.5kcal/mol未満)、VHH8よりもVHH7の方が高い程度のバリエーションが観察されることができる。

【0123】

それぞれVHH7、VHH 1H11およびVHH8に関する情報に対応する表4～6について、FastContactおよびPISAによる抗CI-M6PR VHHおよびhCI-M6PR_D1-D3の残基間の相互作用についての計算された静電自由エネルギー、脱溶媒和自由エネルギーおよび構成エントロピーの和によって決定された推定結合自由エネルギー(ΔG)としての相互作用残基およびそれらの推定された相互作用タイプが示される。

【表4】

【表5】

【表6】

【0124】

LinXis BV(WO2020/185069A1として公開されたHouthoff et al.に記載されている)によってCI-M6PRの細胞外部分に対して開発された抗CI-M6PR VHHのパネルをスクリーニングするために必要とされるVHH7、VHH1H11およびVHH8についての本明細書において定義されるヒトM6PR結合部位の新規性および特異性の検証。精製された代替の抗CI-M6PR VHHのタンデム競合バイオレイヤー干渉法は、LinXis VHH 13E8、ならびに本明細書において記載されるVHH7およびVHH8が、各々、CI-M6PR hDom_1-3His₆上の重複しないエピトープに特異的に結合し、CI-M6PR hDom_1-3His₆への結合が、いずれのさらなる代表的なVHHについて観察されず、したがって、競合する結合体が同定されなかったことを明らかにした。

【0125】

例7.VHH7またはVHH8ヒトM6PRエピトープへの結合について競合するさらなるVHH CDR3ファミリー。
組換えヒトCI-M6PR Dom_1-3His₆による免疫化に対して抗原特異的応答をもたらしたラマの元のVHHライブラリーを、Callewaert et al.(PCT/EP2022/054278)に以前に記載されたように、コーティングされたCI-M6PR hDom_1-3His₆上に再パニングした。12個の新規CDR3群に属する15個の新規VHHが、これらのパニング努力において同定された。

【0126】

本明細書において定義される異なる「CDR3」ファミリーまたはVHHファミリーからのVHH7またはVHH8と重複または同一のCI-M6PR上のエピトープに結合する抗CI-M6PR VHHを同定するために、CI-M6PR結合部位についてのVHH7またはVHH8の競合物質を同定するためのバイオレイヤー干渉法(BLI)実験が実施され、以前に特徴づけられたVHH1およびVHH5も評価された。大腸菌から精製した抗CI-M6PR VHHのタンデム競合BLIは、VHH 1H11およびVHH1は、CI-M6PR hDom_1-3His₆結合についてVHH7と競合するが、VHH8とは競合しないこと;ならびに、1H52およびVHH5は、CI-M6PR hDom_1-3His₆結合についてはVHH8と競合するが、VHH7とは競合せず、一方、1H21、1H37、2H74および2H79は、CI-M6PR hDom_1-3His₆への結合についてVHH7またはVHH8と競合しないことを明らかにした。1H74、1H44および2H60について、CI-M6PR hDom_1-3His₆の飽和結合は得られなかった(図17、18)。

【0127】

VHH 1H11(配列番号24)およびVHH 1H52(配列番号25)について、ヒトCI-M6PRドメイン1-3His6がビオチン化され、ストレプトアビジンバイオセンサチップにカップリングされるBLI実験が行われた。ローディング後、会合相の間、チップはpH7.4のカイネティック緩衝液に連続希釈されたVHHとインキュベートされ、pH7.4、pH6.5、pH6.0、pH5.5およびpH5.0で解離が行われた。次いで、その後のVHHの分析の前に、すべてのバイオセンサチップが再生された。表7は、BLI測定の処理およびカーブフィッティング後に検索された動態パラメータをまとめたものである。会合および解離の両方がpH7.4で行われた場合、得られた親和定数(KD)、会合(k_on)および解離速度定数(k_off)が示されている1:1結合モデルに従って、全体的な適合が行われた。pH7.4での会合およびpH6.5、6.0、5.5および5.0での解離を用いた測定の場合、示された解離速度定数は、200、100および50nMのVHHの解離の局所曲線フィッティングによって決定されたパラメータの平均である。VHH1H11およびVHH1H52の会合-解離曲線は、それぞれ図19および図20に示される。

【0128】

BLIデータの分析は、CI-M6PR hDom_1-3His₆の結合についてのVHH7との競合がBLIを介して(VHH1に加えて)実証された抗CI-M6PR VHH 1H11が、VHH7自体と同様のpH依存性解離プロファイルを実証することを明らかにした(図19)。VHH7の場合のように、解離速度定数の値は、pH7.4からpH5.0に低下するにつれて徐々にではあるが中程度に増加する(表7)。BLIを通して示されるように、CI-M6PR hDom_1-3His₆の結合についてVHH8と競合した抗CI-M6PR VHHの1つであるVHH 1H52もまた(VHH5の次)、VHH8と同様のpH依存性解離プロファイルを示した(図20)。実際、pH5.5とpH5.0との間で解離速度の急速な増加がある(表7)。

【表7】

【0129】

例8.VHHに基づく抗EGFR nanoLYTAC構築物の生産および精製。
抗EGFR VHH 9G8 S54Aを含有し、抗CI-M6PR VHH VHH7またはVHH8のいずれかに(G4S)₃リンカー(またはさらに(G4S)₉リンカー)でC末端においてカップリングされた、EGFRに対するLYTAC構築物がクローニングされた。さらに、VHH7またはVHH8に連結された(G4S)₃リンカーともカップリングされた、2コピーの9G8 S54Aを含有するLYTAC構築物がクローニングされた。CI-M6PRによって特異的に媒介されない内在化および/または分解の対照として、本発明者らは、9G8 S54Aの1つまたは2つのコピーを「GBP」と命名した抗GFP VHHに連結する構築物を設計した。これらの構築物はすべて、C末端FLAG3His6タグを用いてPichia pastorisにおいて生産され、IMACおよび脱塩によって精製され、その発現収量は、タンパク質構築物の組成と同様に、表8に要約されている。タンパク質構築物の品質はSDS-PAGEによってチェックされ(図22)、それらのHeLa細胞結合をフローサイトメトリーによって検証した(データは示さず)。

【表8】

【0130】

VHH8および対照構築物を含有するLYTACのうち、タンパク質の初期セットは小規模で早期に生産された(例1～3に記載の構築物26～29)が、N末端には、本明細書において提供される配列の前にアミノ酸Arg-Ser-Met(RSM)を含むクローニング方法に関連する3つのさらなるアミノ酸を潜在的に含有していた。この例に記載されるように、それらの構築物は、それらの追加のアミノ酸の非存在下で再クローニングされ、再生産され、その後、それらの保持されたin vitro EGFR内在化有効性がフローサイトメトリーによって検証された(例9)。したがって、N末端を付加していないタンパク質が実験を通して使用され、例がさらに示され、結果は最初に観察されたものと一致した。

【0131】

例9.フローサイトメトリーによるVHHに基づく抗EGFR nanoLYTAC構築物のin vitro EGFR内在化有効性の評価。
細胞表面におけるEGFRのレベルを低下させるためのVHHに基づく抗EGFR nanoLYTAC構築物の有効性がin vitroで評価された。この目的のために、HeLa細胞は、50nMのLYTAC構築物(番号34～37、表8参照)または対照構築物と共に完全培地中で24時間インキュベートされ、その後、細胞が剥離され、細胞表面EGFRが染色され、フローサイトメトリーによる測定が行われた。

【0132】

図23Aでは、細胞表面EGFRに対応する蛍光シグナルの代表的なヒストグラムが、未処置HeLa細胞および50ng/mlの組換えヒトEGF(rhEGF)、LYTAC構築物34(9G8 S54A-VHH7)、35(9G8 S54A-VHH8)または対応する対照構築物38(9G8 S54A-GBP)で処置したHeLa細胞について示された。図23Bは、未処置HeLa細胞および50ng/mlのrhEGF、LYTAC構築物36(2x 9G8 S54A-VHH7)、37(2x9G8 S54A-VHH8)または対応する対照構築物39(2x9G8 S54A-GBP)で処置したHeLa細胞の代表的なヒストグラムを示す。図23Cでは、未処置HeLa細胞について測定されてパーセンテージで表されたMFIに対して正規化された、実験におけるすべての条件について測定された中央蛍光強度(MFI)値を示す棒グラフが示されている。

【0133】

この実験の結果は、EGFRに対する一価であるLYTAC構築物(構築物34および35)のいずれかで処置した細胞では、未処置細胞(34:P＝0.001、35:P＝0.0007)および中程度のEGFR内在化効果も(未処置細胞の83％まで)誘導する対応する対照構築物(38)(34:P＝0.00009)、35:P＝0.00005)で処置した細胞と比較して、細胞表面EGFRに対するシグナルが有意に減少したことを実証している。より長い(G4S)₉リンカーを有する一価EGFR結合構築物(構築物40および41)もまた、それらの(G4S)₃対応物と同等である(そしてこの実験ではさらにわずかに効率的である)EGFR内在化の効率的な誘導を実証した。

【0134】

さらに、未処置細胞(構築物36:P＝0.001、37:P＝0.0006)および対応する対照構築物(39)で処置した細胞(構築物36:P＝0.005、37:P＝0.002)と比較して、EGFRに対する二価のLYTAC構築物(構築物36および37)のいずれかで処置したHeLa細胞では、より低いシグナルが検出された。さらに、二価EGFR結合LYTAC(構築物36および37)は、一価EGFR結合LYTAC(構築物34および35)よりもさらに効果的なHeLa細胞におけるEGFRの内在化を誘導した。二価対照構築物(構築物39)で処置した細胞の細胞表面EGFRに対応するシグナルもまた、未処置HeLa細胞のシグナルの49％に低下し、EGFRの二価結合の結果として期待される効果であることに留意されたい。

【0135】

例10.VHHに基づく抗EGFR nanoLYTAC構築物のin vitro EGFR分解有効性の評価。
標的タンパク質の分解を誘導するためのVHHに基づく抗EGFR nanoLYTAC構築物の有効性を評価するために、ウエスタンブロットアッセイが最適化された。この目的のために、例3において詳述した無血清optiMEMとは対照的に、HeLa細胞は、完全増殖培地中で24時間、50nMの抗EGFR LYTAC(構築物34～37)または対応する対照構築物(38～39)と共に、またはEGFR分解の陽性対照として50ng/mlのrhEGFと共にインキュベートされた。次いで、細胞溶解物がRIPA緩衝液中で得られ、等量のタンパク質(BCAアッセイによって測定)が、EGFRおよびβチューブリンの蛍光検出(例3における化学発光検出とは対照的)のための免疫ブロットに供された(図24)。

【0136】

デンシトメトリーによって決定された総EGFRに対応する定量化された強度値から、未処置細胞と比較して、LYTAC構築物(34～37)のいずれかで処置した細胞について一貫して低いシグナルがあることが実証される。さらに、一価対照構築物38(9G8 S54A-GBP)で処置した溶解物のシグナルに対して正規化した場合、一価LYTAC構築物のいずれか(34および35)で処置した細胞について一貫してより低い値が存在することは明らかであり、CI-M6PR依存性効果を示し、これらの完全なVHHに基づく抗EGFR nanoLYTAC構築物がEGFRの分解を効果的に誘導できることが確認される。本発明者らは、(例3に記載されているように)VHH8含有抗EGFR nanoLYTAC構築物(26および27)によって誘導されるより低いレベルの総EGFRを検出することが以前にできなかったことが、最適化されていない細胞アッセイ関連条件と技術的条件の両方に起因すると強く考えている。

【0137】

例11.VHHに基づく抗EGFR nanoLYTAC構築物によるリガンド誘導性EGFR活性化のin vitro阻害の評価。
完全にVHHに基づく抗EGFR nanoLYTAC構築物による処置が、リガンドによって誘導されるEGFRの活性化の阻害に有効であるかどうかを評価するために、ウエスタンブロットアッセイが実施された。HeLa細胞は、50nMのnanoLYTAC構築物(34～37)もしくは対応する対照(構築物38～39)またはFDA/EMA承認された治療用抗EGFRモノクローナル抗体Erbitux(登録商標)(50nMまたは40μg/ml)で完全増殖培地中で24時間処置された。インキュベーション期間後、細胞は、50ng/mlの組換えヒトEGF(rhEGF)で5分間刺激され、その後、細胞溶解物がRIPA緩衝液中で得られ、等量のタンパク質がリン酸化EGFR(＠Tyr1068)の蛍光検出のために免疫ブロットに供された(図25)。

【0138】

結果は、刺激された未処置細胞と比較して、およびそれらの対応する対照構築物(それぞれ38および39)で処置された細胞と比較して、一価EGFR結合LYTAC(構築物34および35)および二価EGFR結合LYTAC(構築物36および37)のいずれかで処置した場合のリン酸化EGFRのレベルの有意な減少を実証している。興味深いことに、この効果の強さは、Erbituxによる処置と同じ範囲であり、構築物37は、試験した濃度のいずれかでErbituxよりもさらに強い阻害効果を誘導する。

【0139】

例12.抗EGFR nanoLYTAC構築物としてのセツキシマブ-VHH融合物の生産およびin vitroでのEGFR内在化および分解有効性。
(G4S)₂リンカーを用いてFcドメインのC末端において抗CI-M6PR VHH7またはVHH8のいずれかにカップリングされた治療用抗EGFRモノクローナル抗体(mAb)セツキシマブからなる、EGFRに対するLYTAC構築物が設計された。これらのセツキシマブに基づくnanoLYTAC構築物は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において発現され、プロテインAクロマトグラフィーおよびSECを通して上清から精製された。非CI-M6PR媒介性EGFR内在化の対照として、非VHH融合セツキシマブもCHOにおいて生産された。本明細書の発現収量は、タンパク質構築物の組成の要約と共に表9に示される。それらの品質はSDS-PAGEによって評価された(図26)。

【表9】

【0140】

細胞表面におけるEGFRのレベルを低下させるためのセツキシマブ-VHH融合構築物の有効性がin vitroで評価された。この目的のために、HeLa細胞は、5または50nMのLYTAC構築物(Ctx-VHH7またはCtx-VHH8)または対照構築物と共に24時間インキュベートされ、その後、細胞が剥離され、細胞表面EGFRが染色され、フローサイトメトリーによる測定が行われた。

【0141】

図27Aでは、細胞表面EGFRに対応する蛍光シグナルの代表的なヒストグラムが、未処置HeLa細胞および50ng/mlの組換えヒトEGF(rhEGF)、5nMのLYTAC構築物(Ctx-VHH7またはCtx-VHH8)または対応する対照構築物(Ctx)で処置したHeLa細胞について示された。図27Bでは、未処置HeLa細胞について測定されてパーセンテージで表されたMFIに対して正規化された、実験におけるすべての条件について測定された中央蛍光強度(MFI)値を示す棒グラフが示されている。

【0142】

この実験の結果は、5nMのセツキシマブに基づくnanoLYTAC構築物(Ctx-VHH7およびCtx-VHH8)のいずれかで処置した細胞について、未処置細胞(Ctx-VHH7:P＝0.002、Ctx-VHH8:P＝0.002)および予想される中程度のEGFR内在化効果も誘導する対応する対照構築物(Ctx)(Ctx-VHH7:P＝0.002、Ctx-VHH8:P＝0.002)で処置した細胞と比較して、細胞表面EGFRのシグナルが有意に減少したことを実証している。誘導効果の大きさは、より高い(50nM)処置濃度ではさらに増加しない。

【0143】

興味深いことに、該セツキシマブ-VHH融合構築物によって誘導されるHeLa細胞におけるEGFR内在化効果の大きさは、Banik et al.［10］およびAhn et al.［15］、ならびにBertozzi et al.WO2020132100A1に記載されているマンノース6ホスホナート(M6Pn)官能化LYTAC構築物によって誘導されるものよりも大きいようである。実際、未処置HeLa細胞の細胞表面EGFRレベルと比較して表すと、50nMのCtx-VHH7での処置はレベルを10％に低下させ、50nMのCtx-VHH8での処置はレベルを6％に低下させたが、50nMのM6Pn-Ctx構築物はEGFRレベルを25～30％に低下させるだけである(図4Cに示される棒グラフから読み取られるAhn et al.［15］)。本発明者らは、これらのフローサイトメトリー実験で測定された効果の大きさが、以下の理由に起因して確実に比較することができると考えている:(1)両方の実験がHeLa細胞に対して行われる、(2)両方の実験において、同じ一次EGFR検出抗体が使用される(EGFRモノクローナル抗体199.12、＃MA5-13319、Invitrogen)、(3)該LYTAC構築物が、モノクローナル抗体セツキシマブである同じEGFR結合部分を利用する、および(4)同じ濃度の各LYTAC構築物で処置が行われた。並列比較が行われなかったことを考慮すると、この差は、Callewaert et al.(PCT/EP2022/054278)に開示されており本明細書において記載されるLYTAC構築物に組み込むために使用されるCI-M6PR結合VHHが、M6Pn-リガンドよりも二重特異性構築物に関連して標的タンパク質の内在化を誘導するのにより有効であることを示すと結論付けるのに十分に有意である。

【0144】

EGFRの分解を誘導するためのnanoLYTAC構築物としてのセツキシマブ-VHH融合物の有効性を評価するために、ウエスタンブロットアッセイが行われた。HeLa細胞は、5nMのCtx-VHH7もしくはCtx-VHH8、または対応する非VHH融合対照Ctx、またはEGFR分解の陽性対照として50ng/mlのrhEGFと共に、完全増殖培地中で24時間インキュベートされた。処置期間後、細胞溶解物がRIPA緩衝液中で得られ、等量のタンパク質(BCAアッセイによって測定)が、EGFRおよびβチューブリンの蛍光検出のための免疫ブロットに供された(図28)。

【0145】

デンシトメトリーによって決定された総EGFRに対応する定量化された強度値から、未処置細胞と比較して、各LYTAC構築物で処置した細胞について一貫して低いシグナルがあることが実証される。さらに、非VHH融合対照構築物(Ctx)で処置した溶解物についてのシグナルに対して正規化した場合、LYTAC構築物(Ctx-VHH7およびCtx-VHH8)のいずれかで処置した細胞について一貫してより低い値が存在することは明らかであり、CI-M6PR依存性効果を示し、記載されたセツキシマブ-VHH融合構築物がEGFRの分解を効果的に誘導できることが確認される。

【0146】

例13.VHHに基づく抗GFP LYTAC構築物の生産およびin vitroでのGFP内在化および分解有効性。
CI-M6PR VHHに基づくLYTAC構築物も可溶性抗原の内在化および分解を効果的に誘導することができるという概念実証を得るために、抗CI-M6PR VHH「VHH7」または「VHH8」のいずれかに(G4S)₃リンカーでC末端にカップリングされた抗GFP VHH「GBP」を含有する、GFPに対するLYTAC構築物が生産された。さらに、「VHH7」競合VHH「VHH1」および「VHH 1H11」にカップリングされ、「VHH8」競合VHH「VHH 5」および「VHH 1H52」にカップリングされた抗GFP LYTAC構築物が生産された。GFPの非CI-M6PR媒介性内在化および分解の対照として、一価GBPもこのセットに包含された。組成が表10に要約されているこれらの構築物が、C末端FLAG₃His₆タグを用いてPichia pastorisにおいて生産され、IMACおよび脱塩によって精製した。それらの品質はSDS-PAGEによって評価された(図29)。

【表10】

【0147】

最初に、本発明者らは、VHH7およびVHH8含有抗GFP LYTACがin vitroでGFPの細胞内在化および分解を誘導することができるかどうかを評価した。この目的のために、50nMのこれらのLYTAC構築物(43＝GBP-VHH7および44＝GBP-VHH8)または対応する非CI-M6PR-VHH融合対照(42＝GBP)が、無血清OptiMEM(Gibco)中50nMの組換えGFP(rGFP)と共に室温で30分間プレインキュベートされた。次いで、HeLa細胞は、エンドソーム酸性化(したがってリソソーム分解)を阻害する十分に記載されたリソソーム指向性化合物である200μMクロロキンの存在下または非存在下のいずれかで、これらのタンパク質溶液またはGFPのみを含有する溶液と共に24時間インキュベートされた。インキュベーション期間後、細胞溶解物が得られ、等量のタンパク質(BCAアッセイによって測定)が、GFPおよびローディング対照としてのβチューブリンの蛍光検出のための免疫ブロットに供された(図30)。結果は、GFPが実際にLYTAC構築物で処置した細胞に取り込まれたが、一価GBPで処理された細胞およびGFPとのみインキュベートされた細胞にもある程度取り込まれたことを示している。しかし、より重要なことには、全長GFPについて予想されるよりも低い分子量でのさらなるバンドの出現であり、これは、LYTACで処置されクロロキン処置されていない条件においてのみである。これは、GFPがGFP特異的LYTAC構築物の存在下でのみ内在化の際に分解され、これがCI-M6PRおよびリソソーム依存的様式であることを示唆している。これらの結果は、MCF7細胞においても検証された(図31)。同様の実験を通して、VHH1およびVHH 1H11であるVHH7、ならびにVHH5およびVHH 1H52であるVHH8の、以前に記載された競合物質抗CI-M6PR VHHを含有するGFP-LYTAC構築物をin vitroで評価した。しかしながら、このアッセイでは、HeLa細胞は、200nMの各構築物と共に完全増殖培地中でインキュベートされ、細胞条件が悪いためにrGFPおよびクロロキン処置試料は得られることができなかった(図32)。低分子量バンドは、GFPの分解産物であることが以前に確立されたように、ここでは、VHH7、VHH8、VHH1、VHH5およびVHH 1H52を含有する抗GFP LYTACについて効果的に検出され、これらの抗CI-M6PR VHHを有する二重特異性構築物も標的抗原の分解を効果的かつ選択的に誘導することができることを示している。GBP-VHH 1H11融合構築物で処置した細胞については、GFPの分解産物は、この特定のアッセイでは残念ながら検出させることができなかった。

【0148】

追跡実験において、本発明者らは、処置ウォッシュアウト後の内在化GFPの細胞運命を評価したいと考えた。したがって、HeLa細胞は、50nMのLYTAC(構築物43＝GBP-VHH7および44＝GBP-VHH8)または一価GBP(＝42)および50nMのrGFPの、クロロキンを含むまたは含まないプレインキュベーション溶液で24時間再び処置され、その後、細胞はPBSで洗浄され、新鮮な完全増殖培地とともに追加の時間インキュベートされた。処置期間の直後(＋0時間)ならびに追加のインキュベーションの3時間(＋3時間)および7時間(＋7時間)に細胞溶解物が得られた。以前と同じように、溶解物は、GFPおよびβチューブリンの検出のために免疫ブロットされた(図33)。ウエスタンブロット分析は、GFPに対応するシグナルの漸進的な消失によって暗示される、試験したすべての条件について処置ウォッシュアウト後の調査した期間にGFPが非GFP含有培地にエキソサイトーシスされる定常状態プロセスの発生を示した。それに加えて、初期処置期間後に内在化された組換えGFPのプールは、低分子量バンドの継続的な検出によって証明されるように、非クロロキンLYTAC処置条件でのウォッシュアウト後の時間枠においてCI-M6PR依存的にさらに分解されることが示唆される。

【0149】

材料および方法
細胞培養
HEK293懸濁細胞を、EX-CELLで構成されるFREX培地(Gibco 14571C)およびL-グルタミン(Lonza、2mM)を補充したFreestyle 293培地(Gibco)中で培養した。ExpiCHO(商標)発現培地(Gibco)中で、Expi-チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が培養された。HeLa細胞は、DMEM(0.1mM非必須アミノ酸(NEAA)、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、10％ウシ胎児血清(FCS))中で培養され、5％ CO2と共に37℃でインキュベートされた。MCF7細胞は、FCS(10％)およびL-グルタミン(2mM)が補充されたDMEM:F12培地中で培養された。

【0150】

VHHに基づく抗EGFRおよび抗GFP nanoLYTAC構築物のクローニング、生産および精製
Pichia pastorisの発現ベクターの生成のために、モジュール式クローニングプラットフォームが使用された。コドン最適化コード配列がAOX1のプロモーターとターミネーターとの間にクローニングされ、FLAG3His6タグがC末端に付着された。ベクターは、エレクトロポレーションによってコンピテントP.pastoris細胞(NCYC2543)に形質転換され、メタノール誘導によってタンパク質が生産された［11］。清澄化された上清に、MgCl2(25mM)、還元型L-Gluthation(100mg/L、Sigma Aldrich、G4251-1G)が補充された。濾過(0.22μm)後、上清が、HisTrap HP(5mL)カラム(GE Healthcare、17524801)にローディングされ、その後、結合タンパク質が洗浄され(5CVの20mMイミダゾール、0,5M NaCl、20mM NaH2PO4/Na2HPO4、pH7,5)、徐々に溶出された(10CV、400mMイミダゾール、20mM NaCl、20mM NaH2PO4/Na2HPO4、pH7,5)。選択されたピーク画分の分析は、SDS-PAGE(4～20％、Genscript)で行われた。目的のタンパク質を含有する画分がプールされ、HBS緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、pH7.5)で平衡化されたHiLoad16/10脱塩カラムで実行された。

【0151】

セツキシマブに基づく抗EGFR nanoLYTAC構築物のクローニング、生産および精製
IgG CHシグナルペプチドを含有するCtx-VHH7、Ctx-VHH8およびCtxのヒトコドン最適化コード配列が合成的にオーダーされ、クレノウ断片(3'から5'エキソ-)(NEB,M0212L)、NEBuffer 2(NEB)、dATP(0.1mM)と共に37℃で45分間インキュベートされ、提供されたプロトコルに従ってpcDNA(商標)3.3-TOPO(商標)TA Cloning(商標)キット(Thermo Fischer Scientific、K830001)を使用してクローニングされた。クローニングしたプラスミドは、化学的にコンピテントな大腸菌に熱ショック形質転換(42℃、90秒)されて、配列が確認された。組換えタンパク質生産のために、ExpiFectamine(商標)CHO Transfectionキット(Thermo Scientific)を使用して、対応する発現ベクターがExpi-チャイニーズハムスター卵巣(CHO)懸濁細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクション後10日目に精製のために培地が回収され、上清がHiTrap MabSelect SuRe(5mL)カラム(Cytiva)にローディングされ、その後、結合タンパク質がMcIlvaine緩衝液pH7.2(0.2M Na₂HPO₄、0.1Mクエン酸)で洗浄され、McIlvaine緩衝液pH3.0で溶出された。選択されたピーク画分の分析は、SDS-PAGE(4～20％、Genscript)で行われた。目的のタンパク質を含有する画分がプールされ、HiLoad 16/600 Superdex 200 pg(Cytiva)で実行され、再び溶出画分がSDS-PAGEで分析された。陽性画分がプールされ、HBS緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、pH7.2)中で濃縮された。

【0152】

フローサイトメトリー
HeLa細胞は前述のように培養され、12ウェルプレートに100,000細胞/ウェルで播種され、様々な濃度のLYTAC構築物または対照構築物と共に24時間インキュベートされた。インキュベーション期間後、細胞解離緩衝液(Gibco)を使用して細胞が回収され、最終的に96ウェルV底プレートに移すためにエッペンドルフチューブに移された。回収後、細胞はPBSで2回およびPBS＋0.5％ BSAで1回洗浄され、その後、抗EGFRモノクローナル抗体(199.12、ThermoFisher,＃MA5-13319、1:40)と共に4℃で1時間インキュベートされた。細胞は、3回洗浄され、二次抗マウスIgG PE-AF647(ThermoFisher、＃A-20990、1:250)と共に4℃で1時間インキュベートされた。PBS＋0.5％ BSAによる3回の追加の洗浄ステップの後、細胞は、100μlのPBS＋0.5％ BSAに再懸濁され、BD LSR IIフローサイトメーターでの測定のためにチューブに移された。

【0153】

ウエスタンブロットによるタンパク質分解分析
HeLa細胞およびMCF7細胞は、前述のように培養され、6ウェルプレートにそれぞれ300,000または450,000細胞/ウェルで播種された。in vitroでのGFP分解アッセイのために、50または200nMの抗GFP LYTACが、等モル濃度の組換えGFPと共に室温で30分間プレインキュベートされた。次いで、細胞は、200μMクロロキンを添加して、または添加せずに、これらのタンパク質溶液と共に24時間インキュベートされた。in vitroでのEGFR分解アッセイのために、細胞は、50nMの抗EGFR LYTACと共に24時間インキュベートされた。両方のアッセイについて、ピペットチップで掻き取り、4℃で1時間撹拌し、最大速度で遠心分離して細胞残屑を除去することによって、100μlのRIPA緩衝液中で細胞溶解物が得られた。タンパク質濃度はBCAアッセイによって決定され、等量のタンパク質がDTTを含有する5×Laemmli緩衝液と混合され、98℃で10分間インキュベートされた。タンパク質はプレキャスト4～20％勾配SDS-PAGEゲル(GenScript、M00657)上で分離され、ウェットブロット法によってニトロセルロース膜に転写された。膜は、PBST中5％スキムミルク(またはリン酸化EGFRが検出される場合はTBST中5％ BSA)中で1時間ブロックされ、抗EGFR抗体(EGFRウサギmAb(D38B1)、Cell Signaling Technology、＃4267S)、抗GFP抗体(GFPウサギmAb(D5.1)、Cell Signaling Technology、＃2956)または抗ホスホEGFR抗体(ホスホ-EGFR(Tyr1068)(D7A5)ウサギmAb、Cell Signaling Technology、＃3777)と4℃で一晩インキュベートされた。各々15分間のPBST(またはTBST)による3回の洗浄ステップが実施された後、二次抗体とインキュベートされた。

【0154】

化学発光検出のために、膜はHRPコンジュゲート二次抗体(ロバ由来のウサギIgG、Cytiva、NA934)と室温で1時間インキュベーションされた。β-アクチンは、直接標識された一次抗体(抗β-アクチン抗体C4、Santa Cruz、sc-47778 HRP)を用いてローディング対照として検出された。別の洗浄ステップの後、膜はTMB基質溶液(Western Lighting Plus-ECL,Perkin Elmer、NEL103001EA)で現像され、Amersham Imager 680(Cytiva)で画像化された。

【0155】

蛍光検出のために、膜はマウス抗β-チューブリン抗体(Sigma Aldrich、T4026)と室温で1時間インキュベートされ、3回洗浄後、抗ウサギDylight800コンジュゲート二次抗体(Thermo Scientific)および抗マウスDylight680コンジュゲート二次抗体(Thermo Scientific)とインキュベートされた。画像化は、Odyssey Imaging System(LI-COR Biosciences)を用いて行われた。ウエスタンブロットの濃度測定分析は、ImageJを使用して行われた。

【0156】

ヒトドメイン1-3His6抗原の組換え生産
HEK293懸濁細胞は、無血清EX-CELL(Gibco 14571C-1000ML)およびL-グルタミン(2mM)が補充されたFreestyle 293培地(Gibco)(1:1)中で培養され、125rpmで振盪しながら8％ CO₂中、37℃で増殖された。pcDNA(商標)3.3-TOPO-hDom_1-3His₆(675μg)およびSV40ラージT抗原DNA(1％)が、HEK293懸濁細胞(300mL)のポリエチレンイミン(1:2)(PolyScience、直鎖、25kDa)によるトランスフェクションに使用された。上清がトランスフェクションの3日後に回収され(200×g、5')、MgCl₂(2mM)、還元型L-Gluthation(100mg/L、Sigma Aldrich、G4251-1G)および1×cOmplete(商標)プロテアーゼ阻害剤(Roche、11697498001)が補充された。濾過(0.22μm)後、上清がHisTrap HP(5mL)カラム(GE Healthcare、17524801)にローディングされた。洗浄(5CVの20mMイミダゾール、0,5M NaCl、20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、pH7,5)後、結合タンパク質が溶出され(10CV、400mMイミダゾール、20mM NaCl、20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、pH7,5)、SDS-PAGE(4～20％、Genscript)で分析された。その後、hDomain_1-3His₆陽性画分がHiLoad 16/600 Superdex 200 pg(GE Healthcare、28989335)にローディングされ、溶出画分がSDS-PAGEで分析され、続いてクーマシーB-Blue R250で染色され、陽性画分がプールされ、MES緩衝液(50mM MES、150mM NaCl、pH6.5)中で濃縮された。mDom1-3His6は、ヒトバリアントと同様に発現および生産されたが、HisTrap(5mL)カラム(GE Healthcare、17524801)でのみ精製された。溶出画分がプールされ、Amicon(登録商標)Ultra-15 Centrifugal Filter Unit(Merck Millipore、UFC901008)で濃縮され、MES緩衝液に再懸濁された。

【0157】

抗CI-M6PR VHHの生産および精製
プラスミド(1000ng)が、PmeI(1U、NEB)を使用して線状化され、エレクトロポレーションによってエレクトロコンピテント［11］Pichia pastoris NRRL-Y-11430を形質転換するために使用された。続いて、単一クローン形質転換体の接種および225rpmで振盪しながら28℃で48時間の増殖のために、酵母用緩衝グリセロール複合培地(pH6)が使用された。酵母用緩衝複合培地(pH6)への緩衝液の切換えが行われ、培養物は225rpmで振盪しながら28℃でさらに48時間増殖された。12時間ごとに、増殖培養物はメタノール(1％)がスパイクされた。最後に、遠心分離(1250rpm、15')によって上清が回収され、pH7に調整された。

【0158】

VHH1、VHH5、VHH6、VHH 1H11およびVHH 1H52は、VHHオープンリーディングフレーム、Lacオペロン、PelB分泌シグナル、アンピシリン選択マーカーおよび複製起点を含有するpHEN6cベクターでコンピテントWK6大腸菌細胞を形質転換することによって、大腸菌において発現された。形質転換された大腸菌細胞は、アンピシリン(100μg/mL)を含有するLB培地に接種され、200～250rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベートされた。この前培養物のうち1mlが、アンピシリン(100μg/mL)、MgCl2(2mM)およびグルコース(0.1％)を含有する330mLのTBに添加され、OD600が0.6～0.9になるまで振盪しながら37℃でインキュベートされた。所望のOD600に達したら、IPTG(Immunosource Cat°102A)(1mM)の添加によって発現が誘導され、培養物は28℃で16～18時間振盪しながらインキュベートされた。タンパク質を抽出するために、一晩誘導培養物が8000rpmで8分間遠心分離され、上下にピペッティングした後に4℃で1時間振盪することによって細胞ペレットが12mlのTES中の1L培養物から再懸濁された。12mlのTESあたり、18mlのTES(MQで1:4希釈)が添加され、振盪しながらさらに1時間氷上でさらにインキュベートされた。全体が4℃、8000rpmで30分間遠心分離され、上清がさらなる精製のために使用された。

【0159】

すべてのVHHについて、清澄化された上清に、MgCl₂(2mM)、還元型L-Gluthation(100mg/L、Sigma Aldrich、G4251-1G)が補充された。濾過(0.22μm)後、上清が、HisTrap HP(5mL)カラム(GE Healthcare、17524801)にローディングされ、その後、結合タンパク質が洗浄され(5CVの20mMイミダゾール、0,5M NaCl、20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、pH7,5)、徐々に溶出された(10CV、400mMイミダゾール、20mM NaCl、20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、pH7,5)。選択されたピーク画分の分析は、SDS-PAGE(4～20％、Genscript)で行われた。目的のタンパク質を含有する画分がプールされ、HBS緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、pH7)で平衡化されたHiLoad16/10脱塩カラムで実行された。

【0160】

VHH7およびVHH8のヒト化バリアントのクローニング生産および精製
IgG C_HシグナルペプチドおよびHis₆を含有するVHH7hWNおよびVHH8hWNのヒトコドン最適化コード配列が合成的にオーダーされ、クレノウ断片(3'から5'エキソ-)(NEB,M0212L)、NEBuffer 2(NEB)、dATP(0.1mM)と共に37℃で45分間インキュベートされ、提供されたプロトコルに従ってpcDNA(商標)3.3-TOPO(商標)TA Cloning(商標)キット(Thermo Fischer Scientific、K830001)を使用してクローニングされた。ヒト化バリアントVHH7h1-3およびVHH8h1-5のコドン最適化配列が、製造業者の指示に従って、GenBuilder(商標)クローニングキット(GenScript(登録商標);カタログ番号:L00701)を使用してpVDS100ベクターにクローニングされた。クローニングしたプラスミドは、化学的にコンピテントな大腸菌に熱ショック形質転換(42℃、90秒)されて、配列が確認された。VHH7hWNおよびVHH8hWNの組換えタンパク質生産のために、対応する発現ベクターがPEIトランスフェクションによってHEK293懸濁細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクション後4日目に精製のために培地が回収された。VHH7h1-3およびVHH8h1-5が、VHHオープンリーディングフレームを含有するpVDS100ベクターでコンピテント細胞を形質転換することによって大腸菌において発現された。形質転換された大腸菌細胞は、選択LB培地に接種され、250rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベートされた。タンパク質発現の自己誘導のために、グルコースおよびラクトースを補充した選択TB培地で前培養物が1:50希釈された。培養物は250rpmで振盪しながら37℃で2時間インキュベートされ、その後、温度が30℃まで下げられ、培養物はさらに26時間インキュベートされた。タンパク質を抽出するために、一晩誘導培養物が4000rpmで20分間遠心分離され、上下にピペッティングした後に4℃で1時間振盪することによって細胞ペレットがD-PBS(発現容量の1/12.5)に再懸濁された。全体が4℃、8500rpmで20分間遠心分離され、上清がさらなる精製のために使用された。精製前に、すべての上清が濾過された(0.22μm)。VHH7hWNおよびVHH8hWNの上清が、HisTrap HP(5mL)カラム(GE Healthcare、17524801)にローディングされ、その後、結合タンパク質が洗浄され(5CVの20mMイミダゾール、0,5M NaCl、20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、pH 7,5)、徐々に溶出された(10CV、400mMイミダゾール、20mM NaCl、20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、pH7.5)。VHH陽性画分がHiLoad 16/600 Superdex 75 pg(GE Healthcare)にローディングされ、溶出画分がSDS-PAGEで分析された。陽性画分がプールされ、HBS緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、pH7)中で濃縮された。VHH7h1-3、VHH8h1-5については、標準的な手順に従ってJanus BioTxシステム(Perkin Elmer)でIMAC精製が行われた。目的のタンパク質を含有する画分がプールされ、タンパク質の濃縮の前に緩衝液がPBSに交換された。

【0161】

アミン反応性Alexa Fluor 488による抗CI-M6PR VHHの標識化
すべての抗CI-M6PR VHH(1mg)は、HEPES(50mM)、NaCl(150mM)およびNaHCO₃ ^-(100mM)、pH8.3で希釈され、1mg Alexa Fluor 488(AF488)NHSエステル(Jena Biosciences、APC-002-5)と共にインキュベートされ、DMSOに再懸濁された(室温で1時間)。その後、遊離AF488 NHSエステルがサイズ排除クロマトグラフィー(HiLoad 16/600 Superdex 75 pg、GE Healthcare)を用いて除去された。溶出画分がプールされ、標識化(DOL)およびhDom1-3His6への機能的結合の程度が評価された。

【0162】

抗CI-M6PR VHHのリソソーム標的化の顕微鏡分析
生細胞画像化のために、2x10⁴ MCF7細胞/ウェルがOptiMEM培地に播種され、翌日、LysoTracker Deep Red DND-99(50nM、Thermo Fischer、L12492)と共に37℃、5％ CO₂で30分間インキュベートされ、OptiMEMで洗浄され、その後、7,5μMのAF488標識抗CI-M6PR VHH(OptiMEM中)が細胞上でインキュベートされた。全ウェル(すなわち、抗CI-M6PR VHH)について、Zスタックが6分ごとに合計3時間にわたって3つの異なる位置で採取された。Zスライス(12)は、ステップサイズ1.5μmおよびXYピクセルサイズ275nm×275nmの位置ごとに取得された。使用した蛍光化合物の励起波長および発光波長は、LTR(λ_Ex:633nmおよびλ_Em:665-715nm)、AF488(λ_Ex:488nmおよびλ_Em:520±35nm)、Hoechst/DAPI(λ_Ex:405nmおよびλ_Em:420-470nm)であった。

【0163】

HeLa細胞が前述のように培養され、それぞれHam F-12培地(ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充)中2.5×10⁴細胞/ウェルで8ウェルチャンバー(iBidi、80841)に播種された。AF488標識VHH(5μM)が細胞上で4時間インキュベートされ、その後PBSで3回洗浄された。細胞は予熱したPFA中で固定された:最初にPBS中の2％ PFA中、37℃で5分間、次に4％ PFAを用いて室温で10分間。室温で10分間、細胞透過処理(0.2％ Triton X-100)の前後に5分間、PBSによる洗浄が3回行われた。次いで、細胞はPBT緩衝液で希釈(1/100)された正常ヤギ血清で30分間ブロックされた。一次マウス抗LAMP1モノクローナル抗体(Abcam、Ab25630、1/500)がブロッキング緩衝液で希釈され、4℃で一晩インキュベートされた。洗浄後、各々PBS中で5分間、DyLight594(PBT中1/1,000)にカップリングされた二次ヤギ抗マウス抗体が室温で2時間インキュベートされた。細胞は、PBSで3回洗浄された後、16℃で15分間、DAPI(PBS中1/1,000)で対比染色された。最後に、洗浄および染色された細胞が、ポリビニルアルコールに封入した後、4℃で保存された。画像化は、Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27対物レンズを備えたFAST Airyscan SRモードで使用されるLSM880 Airyscan共焦点顕微鏡(Zeiss,Jena)で実施された。VHHごとに、細胞体積全体を捕捉するための最適なZスタックが、3つの蛍光化合物のウェルあたり3つの異なる位置で採取された:LAMP1(λ_Ex:633nmおよびλ_Em:＞650nm),AF488(λ_Ex:488nm λ_Em:495-550nm)およびHoechst/DAPI(λ_Ex:405nmおよびλ_Em:420-480nm)。

【0164】

画像処理および解析
Airyscan検出器で取得した画像は、ZENソフトウェア(Zeiss,Jena)を使用して処理された。処理は、ピクセルの再割り当ておよびデフォルトのWienerフィルタリングを包含していた。次いで、処理された画像は、さらなる分析のためにVolocity(Quorum Technologies、Ontario)にインポートされた。LSM880およびSpinning Disk顕微鏡で取得された両方の画像は、Volocityソフトウェアで分析された。両方の場合において、(エンド)リソソーム染色のチャネルおよび標識VHHのチャネルにおけるセグメント化された物体の強度値およびサイズについて閾値が決定された。このようにして、2つの集団が作製され、1つは(エンド)リソソームを含有し、1つは標識VHHを含有した。「交差」コマンドを適用することにより、本発明者らは、(エンド)リソソーム内に局在するVHHの画分、およびVHHを含有するリソソームの画分を決定することができた。分析された細胞の総体積も測定されて補正された。セグメント化された体積に基づいて画分の計算が行われ、体積は「ボクセル」で表された。ボクセルはピクセルの3Dバージョンであるため、画像スタック内の体積単位である。生細胞画像化結果については、各蛍光VHH時点のボクセル数の合計をその時点の細胞あたりのボクセル数の合計(細胞体積を表す)で割ることによって、細胞体積あたりの取り込みが計算された。リソソームとのVHH共局在化のパーセンテージおよび特定のVHHを含有するエンドライソームプール全体のパーセンテージは、LTRと共局在化するVHHシグナルおよび全細胞内VHHシグナルのボクセル数比をとることによって計算された。VHHを有するリソソームのパーセンテージを、LTRと共局在化するVHHシグナルと総LTRシグナルのボクセル数比によって決定した。最後のグラフは、細胞内VHHシグナルおよびVHH-LTR共局在化シグナルの絶対ボクセル数を示す。

【0165】

多角度光散乱にカップリングしたサイズ排除クロマトグラフィー
hCI-M6PR_D1-D3および抗CI-M6PR VHH8タンパク質複合体の分子量および化学量論を推定するために、本発明者らは、アジ化ナトリウム(0.02％)を含有するHBS緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、pH7,5、0,1μm濾過)中で1:1および1:3のモル様式で両方のタンパク質をインキュベートした。両方の試料の総濃度は、0,81および1,08mg/mlであった。SEC(Superdex 200増加HR 10/30)後、溶出したタンパク質はオンラインUV検出器(Generic UV)、ミニDAWN8(Wyatt)多角度レーザー光散乱(MALLS)検出器およびOptilab屈折率(RI)装置(Wyatt)を用いて298Kで検出された。タンパク質濃度および分子量(dn/dc:0.1850ml/g)を決定するために298Kおよび658nmでのRI増加値(dn/dc値)が計算された。14～40分(0.5mL/分)の溶出画分がSDS-PAGEでの分析のために収集された。データ分析および報告は、ASTRA 7.3.2ソフトウェアを使用して行われた。

【0166】

抗CI-M6PR VHH:受容体複合体のインタクト質量分析
LTQ Orbitrap XL質量分析計(Thermo Fischer Scientific)にオンラインで接続したUltimate 3000 HPLCシステム(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)でインタクトタンパク質を分離した。簡潔には、およそ4μgのタンパク質がZorbax Poroshell 300SB-C8カラム(5μm、300A、1×75mm IDxL;Agilent Technologies)に注入され、100μl/分の流速で5％から80％溶媒Bまでの15分間の勾配を用いて分離された(溶媒A:水中0.1％ギ酸および0.05％トリフルオロ酢酸;溶媒B:アセトニトリル中0.1％ギ酸および0.05％トリフルオロ酢酸)。カラム温度は60℃に維持された。溶出タンパク質は、以下のパラメータ:スプレー電圧4.2kV、表面誘起解離30V、キャピラリー温度325℃、キャピラリー電圧35Vおよびシースガス流量7(任意単位)を使用して、ESI源を備えた質量分析計で直接スプレーされた。質量分析計は、プロファイルモードで、分解能100,000(m/z400)および質量範囲600～4000m/zでorbitrapアナライザを使用してMS1モードで動作させた。得られたMSスペクトルは、Xtract逆畳み込みアルゴリズム(同位体分解スペクトル)を使用してBioPharma Finder 3.0ソフトウェア(Thermo Fisher Scientific)で逆畳み込みされ、その後、BioPharma Finderタンパク質配列マネージャおよびタンパク質同定ツールを使用して、逆畳み込みされたスペクトルは自動的にアノテーションされた。

【0167】

VHH-hCI-M6PRD1-D3複合体の共結晶化
hCI-M6PR_D1-D3とVHH7、-8または1H11のいずれかとの複合体が形成され、HBS緩衝液(20mM HEPES、150mM NaCl、pH7,5)中SECで研磨された。この目的のために、hCI-M6PR_D1-D3および1.25モル過剰のいずれかの抗CI-M6PR VHHを含有する溶液が、Superdex 200に注入された。VHH複合体を含有する画分が回収され、マンノース6リン酸(1mM、M3655-100MG、Sigma)が補充され、Amicon Ultra-15タンパク質濃縮器(UFC903024、Millipore)を使用してそれぞれ3.5mg/mLおよび7mg/mLまで濃縮された。マンノース6リン酸を添加せずに3.7mg/mlに濃縮したVHH 1H11複合体。一般的な複合体の結晶化のために、市販の疎マトリックス結晶スクリーン(Molecular Dimensions、Hampton Research)およびMosquito結晶化ロボット(TTP Labtech)を使用して、ナノリットル規模の座位滴蒸気拡散結晶化実験が287Kで設定された。有望なヒットは、96ウェルにおいて勾配最適化を使用してさらに最適化された。

【0168】

VHH7:hCI-M6PR_D1-D3の2つの結晶形態が同定された:2.2Aに回折し、0.3M KBr、0.1M NaCacodylate pH6.5、8％ w/vγ-PGA(Na＋型、LM)から結晶化された菱面体晶(PGAスクリーン条件C9^;Hu et al.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2008;64:957-63)、および、3.0Aに回折し、0.2M NH₄NO₃、0.1M Bis-TrisプロパンpH8.5、18％ v/v PEG Smear High(BCSスクリーニング条件F6)から結晶化した正方晶。hCI-M6PR_D1-D3:VHH 8の単結晶形態は、2.75Aに回折した酢酸ナトリウム三水和物(0.08M)、塩化ナトリウム(0.15M)、トリス(0.1M)、PEG Smear(0.015％ v/v)、pH8)(BCSスクリーニング条件F3)から成長していることが同定された。VHH 1H11:hCI-M6PR_D1-D3の2つの結晶形態が同定された:0.2M(NH4)2SO4 0.1M酢酸ナトリウム4.6 25 ％ v/v PEG Smear Broad(BCSスクリーニング条件C10)のいくつかの条件から結晶化した難回折菱面体晶形態、および、0.1M硫酸アンモニウム、0.1MトリスpH7.5、20％ w/v PEG 1500(Proplexスクリーニング条件A7)のいくつかの条件から結晶化した2.7Aに回折する正方晶形態。

【0169】

BCS条件から成長させたVHH7およびVHH8の複合体を含有する結晶は、DMSO(40％)、エチレングリコール(20％)およびグリセロール(40％)からなるZW221凍結溶液(17.5％ v/v)(Sanchez,et al.Biochemistry 54,no.21(2015):3360-3369)を補充した母液中で凍結保護された。PGA条件から成長させた結晶は、グリセロール(17.5％ v/v)を補充した母液中で凍結保護され、VHH 1H11複合体を含有する結晶は、17.5％(v/v)エチレングリコールを補充した母液中で凍結保護され、その後、液体窒素中でガラス化された。VHH8-hCI-M6PR_D1-D3結晶の最終X線回折測定は、EMBL P14ビームライン(Petra 3シンクロトロン、Germany)で行われ、VHH7-hCI-M6PR_D1-D3結晶についてはProxima PX1ビームライン(Soleilシンクロトロン、France)で行われ、およびVHH 1H11-hCI-M6PR_D1-D3結晶についてはESRF ID30A3で行われた。すべてのデータセットは、個々の結晶に由来する。回折データの統合およびスケーリングはXDSで行われた。データセット統計は表11に報告される。ウシCIMPR構造(PDB:1sz0)およびVHHに基づいて、CIMPR_D1D2、CI-M6PR_D3を使用してPhaserで実施される最大尤度に基づく分子置き換えによって初期相を回収した。構造は、ChimeraX and Phenix refineで実装されたCoot,Isolde(Croll,Tristan Ian.2018.「ISOLDE:A Physically Realistic Environment for Model Building into Low-Resolution Electron-Density Maps.」Acta Crystallographica Section D:Structural Biology 74(6):519-30)において反復的に構築および精密化された。

【表11-1】

【表11-2】

【表11-3】

【0170】

配列表
配列番号1～11:CI-M6PR特異的VHH1-VHH11のアミノ酸配列。
＞配列番号12:一価EGFR特異的VHH 9G8(構築物14)
＞配列番号13:二重特異性9G8-VHH8融合タンパク質(構築物15)
＞配列番号14:三価二重特異性9G8-9G8-VHH8融合タンパク質(構築物16)
＞配列番号15:二重特異性9G8-GBP融合タンパク質(構築物17)
＞配列番号16:三価二重特異性9G8-9G8-GBP融合タンパク質(構築物18)
＞配列番号17:一価VHH 9G8 S54A(構築物25/33)
＞配列番号18:二重特異性9G8 S54A-VHH8融合タンパク質(構築物26/35)
＞配列番号19:三価二重特異性9G8 S54A-9G8 S54A-VHH8融合タンパク質(構築物27/37)
＞配列番号20:二重特異性9G8 S54A-GBP融合タンパク質(構築物28/38)
＞配列番号21:三価二重特異性9G8 S54A-9G8 S54A-GBP融合タンパク質(構築物29/39)
＞配列番号22:構築物で使用される二重特異性VHHにC末端融合したFLAG3His6タグ
＞配列番号23:ヒトカチオン非依存性マンノース6リン酸受容体前駆体［NP_000867.2;2491aa］のアミノ酸配列
＞配列番号24:VHH1H11のアミノ酸配列
＞配列番号25:VHH1H52のアミノ酸配列
＞配列番号26:ヒト化バリアントVHH7h1のアミノ酸配列
＞配列番号27:ヒト化バリアントVHH7h2のアミノ酸配列
＞配列番号28:ヒト化バリアントVHH7h3のアミノ酸配列
＞配列番号29:ヒト化バリアントVHH7hWNのアミノ酸配列
＞配列番号30:ヒト化バリアントVHH8h1のアミノ酸配列
＞配列番号31:ヒト化バリアントVHH8h2のアミノ酸配列
＞配列番号32:ヒト化バリアントVHH8h3のアミノ酸配列
＞配列番号33:ヒト化バリアントVHH8h4のアミノ酸配列
＞配列番号34:ヒト化バリアントVHH8h5のアミノ酸配列
＞配列番号35:ヒト化バリアントVHH8hWNのアミノ酸配列

【表12】

【表13】

配列番号78:FR1コンセンサス(ヒト化を包含)
配列番号79:FR2コンセンサス配列(ヒト化を包含)
配列番号80:FR3コンセンサス配列(ヒト化を包含)
配列番号81:FR4コンセンサス配列(ヒト化を包含)
配列番号82:二重特異性9G8 S54A-VHH7融合タンパク質(構築物34)
配列番号83:三価二重特異性9G8 S54A-9G8 S54A-VHH7融合タンパク質(構築物36)
配列番号84:二重特異性9G8 S54A-VHH7融合タンパク質(構築物40)
配列番号85:二重特異性9G8 S54A-VHH8融合タンパク質(構築物41)
配列番号86:セツキシマブの軽鎖
配列番号87:セツキシマブの重鎖
配列番号88:セツキシマブ-VHH7の重鎖
配列番号89:セツキシマブ-VHH8の重鎖
配列番号90:一価GBP(構築物42)
配列番号91:二重特異性GBP-VHH7融合タンパク質(構築物43)
配列番号92:二重特異性GBP-VHH8融合タンパク質(構築物44)
配列番号93:二重特異性GBP-VHH1融合タンパク質(構築物45)
配列番号94:二重特異性GBP-VHH5融合タンパク質(構築物46)
配列番号95:二重特異性GBP-1H11融合タンパク質(構築物47)
配列番号96:二重特異性GBP-1H52融合タンパク質(構築物48)
配列番号97:マウスカチオン非依存性マンノース6リン酸受容体前駆体［NP_034645.2;2483aa］のアミノ酸配列
配列番号98:ウシカチオン非依存性マンノース6リン酸受容体前駆体［NP_776777.1;2499aa］のアミノ酸配列

【0171】

参考文献
1.Hamers-Casterman,C.et al.Nature 363,446-448(1993).
2.De Duve C,Pressman BC,Gianetto R,Wattiaux R,Appelmans F:Tissue fractionation studies.6.Intracellular distribution patterns of enzymes in rat-liver tissue.Biochem J 1955,60:604-617.
3.Muyldermans,S.Annu.Rev.Biochem.82,775-797(2013).
4.Schrankel,C.S.,Gokirmak,T.,Lee,C.-W.,Chang,G.&Hamdoun,A.Methods Cell Biol.151,353-376(2019).
5.Laeremans,T.,Haard,H.D.&Hoogenboom,H.R.J.M.(2007)-WO2007042289A2
6.Roovers,R.C.et al.Cancer Immunol.Immunother.56,303-317(2007).
7.York,S.J.et al.J.Biol.Chem.274,1164-1171(1999).
8.Wang,Q.,Villeneuve,G.&Wang,Z.EMBO Rep.6,942-948(2005).
9.Jovcevska,I.&Muyldermans,S.BioDrugs 34,11-26(2020).
10.Banik SM,Pedram K,Wisnovsky S,Ahn G,Riley NM,Bertozzi CR:Lysosome-targeting chimaeras for degradation of extracellular proteins.Nature 2020,584:291-297.
11.Lin-Cereghino J,Wong WW,Xiong S,Giang W,Luong LT,Vu J,Johnson SD,Lin-Cereghino GP:Condensed protocol for competent cell preparation and transformation of the methylotrophic yeast Pichia pastoris.Biotechniques 2005,38:44-48.
12.Sand,K.M.K.et al.Front.Immunol.5,(2015).
13.Yang J,Zhang Y:I-TASSER server:New development for protein structure and function predictions.Nucleic Acids Research 2015,43:W174-W181.
14.Schrodinger,LLC:The {PyMOL} Molecular Graphics System,Version～1.8.2015.
15.Ahn et al.Nature Chemical Biology,Vol.17;2021;p.937-946
16.Camacho,C.J.&Zhang,C.FastContact:rapid estimate of contact and binding free energies.
Bioinforma.Oxf.Engl.21,2534-2536(2005).
17.Olson LJ,Dahms NM,Kim J-JP:The N-terminal Carbohydrate Recognition Site of the Cation-independent Mannose 6-Phosphate Receptor.J Biol Chem 2004,279:34000-34009.
18.E.Krissinel,K.Henrick,J.Mol.Biol.372,774-797(2007).
19.Pardon,et al.A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.Nature Protocols 2014.9:674-693.
20.Borden,L.A.,Einstein,R.,Gabel,C.A.&Maxfield,F.R.J.Biol.Chem.1990.265,8497-8504.
21.Epenetos,A.A.,Snook,D.,Durbin,H.,Johnson,P.M.&Taylor-Papadimitriou,J.Cancer Res.1986.46,3183-3191.
22.Schroter,C.et al.mAbs 7,138-151(2014).
23.Pabla,B.,Bissonnette,M.&Konda,V.J.World J.Clin.Oncol.6,133-141(2015).
24.Bokemeyer,C.et al.Eur.J.Cancer Oxf.Engl.1990 48,1466-1475(2012).
25.Tan,C.et al.World J.Gastroenterol.WJG 18,5171-5180(2012).
26.Di Nicolantonio,F.et al.J.Clin.Oncol.Off.J.Am.Soc.Clin.Oncol.26,5705-12(2008).
27.Cunningham,D.et al.N.Engl.J.Med.351,337-345(2004).
28.Arena,S.et al.Clin.Cancer Res.21,2157-2166(2015).
29.Katreddy,R.R.et al.Oncogenesis 7,5(2018).
30.Weihua,Z.et al.Cancer Cell 13,385-393(2008).

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【配列表】

2024530455000001.xml

【国際調査報告】