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特表2024-530465細胞療法に使用するための識別可能な細胞表面タンパク質変異体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-21
(54)【発明の名称】細胞療法に使用するための識別可能な細胞表面タンパク質変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240814BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240814BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240814BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240814BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20240814BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20240814BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240814BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240814BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240814BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240814BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240814BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240814BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N15/09 100
C12N15/12
A61K35/12
A61K35/28
A61P7/00
A61P35/02
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K35/17
A61K39/395 N
A61K39/395 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506654
(86)(22)【出願日】2022-08-05
(85)【翻訳文提出日】2024-03-28
(86)【国際出願番号】 EP2022072168
(87)【国際公開番号】W WO2023012367
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】22158991.4
(32)【優先日】2022-02-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21306100.5
(32)【優先日】2021-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520104880
【氏名又は名称】ウニバズィテート バーゼル
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＢＡＳＥＬ
(71)【出願人】
【識別番号】524042805
【氏名又は名称】シメイオ セラピューティクス アーゲー
【氏名又は名称原語表記】ＣＩＭＥＩＯ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(74)【代理人】
【識別番号】100133503
【弁理士】
【氏名又は名称】関口 一哉
(72)【発明者】
【氏名】レポレ， ロザルバ
(72)【発明者】
【氏名】イエカー， ルカス
(72)【発明者】
【氏名】ウルリンガー， シュテファニー
(72)【発明者】
【氏名】ランドマン， エマニュエル
(72)【発明者】
【氏名】シノーポリ， アレサンドロ
(72)【発明者】
【氏名】ヴィーダーケア， アメリー
(72)【発明者】
【氏名】ドゥボー， アナ
(72)【発明者】
【氏名】カミュ， アナ
(72)【発明者】
【氏名】ハイデン， アナ
(72)【発明者】
【氏名】マター－マローネ， ロミーナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084ZA511
4C084ZA512
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZC75
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB11
4C085CC01
4C085DD62
4C085EE03
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB44
4C087BB65
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA51
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZC75
(57)【要約】
本発明は、治療に使用するための、操作されたまたは天然に存在する突然変異を有するが機能的な表面タンパク質を有する識別可能な表面タンパク質を有する細胞の使用に関する。本発明はまた、識別可能なＣＤ１２３表面タンパク質変異体を有するが、治療、特に養子細胞療法に使用するための機能性表面タンパク質を有する細胞の使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのＣＤ１２３の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する前記患者の前記ゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが機能的である、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
【請求項2】
ＣＤ１２３の前記第１および前記第２のアイソフォームが、ＩＬ－３結合、ＩＬ－３依存的増殖、前記細胞表面での発現または細胞内シグナル伝達能に関して機能的である、請求項１に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
【請求項3】
前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、配列番号１のＥ５１位またはＳ５９位のアミノ酸の少なくとも１つの置換を特徴とする、請求項１または２に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
【請求項4】
前記残基Ｅ５１が、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＫ、ＡまたはＴで置換されており、ならびに／あるいは前記残基Ｓ５９が、Ｉ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｒ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくは、Ｐ、Ｅ、ＲまたはＦで置換されている、請求項３に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
【請求項5】
前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、前記第１のアイソフォームをコードする核酸において少なくとも１つの天然多型対立遺伝子を有する天然ゲノムＤＮＡを含む対象から選択されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
【請求項6】
前記第１のアイソフォームが、遺伝子編集によって、好ましくは少なくとも第１の抗原結合領域を含む薬剤の結合に関与する表面タンパク質領域をコードする標的配列内部に部位特異的変異を誘導することができる遺伝子編集酵素を細胞に導入することによって、前記表面タンパク質をコードする前記核酸配列をエクスビボで改変することによって得られる、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
【請求項7】
前記医学的治療が、それを必要とする前記患者に前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記細胞または細胞の集団を、前記第２のアイソフォームに特異的に結合する少なくとも第１の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して投与して、第２のアイソフォームを発現する患者の細胞を特異的に枯渇させ、好ましくは造血疾患の前記治療における、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、芽球性形質細胞樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などの悪性造血疾患の前記治療における免疫療法後に正常な造血を回復させること、を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の、哺乳動物細胞または細胞の集団、好ましくは造血幹細胞。
【請求項8】
前記枯渇剤が、抗体、抗体－薬物コンジュゲートまたは免疫細胞、好ましくは、前記第２のアイソフォームに特異的に結合し、前記第１のアイソフォームに結合しない第１の抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞である、請求項７に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
【請求項9】
前記表面タンパク質がＣＤ１２３であり、前記枯渇剤の前記第１の抗原結合領域が、配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むエピトープに特異的に結合し、好ましくは、前記第１の抗原結合領域が、ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８であり、より好ましくは前記第１の抗原結合領域は、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２、および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはからなる軽鎖可変ドメインを含む、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む抗原結合領域と同じエピトープ特異性を有する抗原結合領域を含む、請求項８に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
【請求項10】
前記医学的治療が、第１のアイソフォームを発現する移入された細胞を特異的に枯渇させるために、好ましくは養子細胞移入療法における使用のために、より好ましくは悪性造血疾患、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、芽球性形質細胞樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）の治療のために、前記第１のアイソフォームと特異的に結合する少なくとも第２の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して、それを必要とする前記患者に前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団の治療有効量を投与することであって、再度、より好ましくは、前記枯渇剤は、移植による移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用を回避するために、表面タンパク質の前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団に続いて投与される、投与されること、を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の、哺乳動物細胞または細胞の集団。
【請求項11】
前記第１のアイソフォームを発現する細胞または細胞の集団が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する免疫細胞、好ましくはＴ細胞である、請求項１０に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
【請求項12】
前記ＣＡＲが、第３の細胞外ループ内部、または配列番号１の前記アミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むポリペプチド内に位置するＣＤ１２３のエピトープに特異的に結合する抗原結合領域を含み、好ましくは、前記第１の抗原結合領域が、ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８であり、より好ましくは前記抗原結合領域は、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２、および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはからなる軽鎖可変ドメインを含み、再度より好ましくは、前記ＣＡＲが、配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはからなる、抗体軽鎖可変ドメイン
を含む、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む抗原結合領域と同じエピトープ特異性を有する抗原結合領域を含む、請求項１１に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
【請求項13】
哺乳動物細胞、好ましくは造血幹細胞または免疫細胞、例えば請求項１から１２のいずれか一項に定義されているＴ細胞、好ましくは請求項８または９に定義されている枯渇剤、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項14】
表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与されたことがある患者において重篤な副作用のリスクを防止することまたは低下させることにおいて使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞が、表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤は、前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記第２のアイソフォームに結合しない少なくとも第２の抗原結合領域を含み、好ましくは前記表面タンパク質がＣＤ１２３である、枯渇剤。
【請求項15】
それを必要とする患者において宿主細胞を選択的に枯渇させるのに使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然細胞は表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤は、前記第２のアイソフォームに特異的に結合する少なくとも第１の抗原結合領域を含み、好ましくは、前記表面タンパク質はＣＤ１２３であり、前記枯渇剤の前記第１の抗原結合領域は、配列番号１の前記アミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むエピトープに特異的に結合し、より好ましくは、前記第１の抗原結合領域は、ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８であり、再度、より好ましくは前記第１の抗原結合領域は、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２、および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはからなる軽鎖可変ドメイン
を含む、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合領域と同じエピトープ特異性を有する抗原結合領域を含む、枯渇剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、治療に使用するための、操作されたまたは天然に存在する突然変異を有するが機能的な表面タンパク質を有する識別可能な表面タンパク質を有する細胞の使用に関する。本発明はまた、識別可能なＣＤ１２３表面タンパク質変異体を有するが、治療、特に養子細胞療法に使用するための機能性表面タンパク質を有する細胞の使用に関する。
【0002】
資金の記載
本願につながるプロジェクトは、欧州連合のＨｏｒｉｚｏｎ２０２０研究およびイノベーションプログラム（認可合意第８１８８０６番）の下で、欧州研究会議（ＥＲＣ）から資金提供を受けている。
本願につながるプロジェクトは、欧州連合のＨｏｒｉｚｏｎ２０２０研究およびイノベーションプログラム（認可合意第８１８８０６番）の下で、欧州研究会議（ＥＲＣ）から資金提供を受けている。
【背景技術】
【0003】
細胞療法は、抗体を含む組換えタンパク質などの生物製剤に基づく小分子療法および治療後の医学の第３の柱として浮上している。細胞療法は、造血性悪性疾患を治療するための腫瘍学で使用することができるが、遺伝性疾患、固形臓器腫瘍および自己免疫疾患の治療などの他の用途も開発中である。しかしながら、細胞療法は、重度の望ましくない副作用に関連し得る。実際、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を用いたがん免疫療法は、特定の抗原を発現する悪性細胞を標的化し、根絶することに成功しているが、それは正常細胞と悪性細胞とを区別しないことが多く、したがって、正常な造血系の破壊を誘導する。標的療法は、抗体に基づく療法、例えば従来のモノクローナル抗体、多重特異性抗体、例えばＴ細胞エンゲージャー（例えば、ＢｉＴＥ）および細胞療法、例えばＣＡＲ細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ ＮＫ細胞またはＣＡＲマクロファージ）を含み、標的分子を発現するすべての細胞を排除する。しかしながら、ほとんどのがん細胞表面抗原は、正常な造血細胞または他の細胞と共有される。したがって、健常細胞への損傷を回避しながら腫瘍を含む病んだ細胞を殺傷させる標的を同定することは、標的療法の主要な課題である。特に、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または芽球性形質細胞樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）などの骨髄性悪性腫瘍を含む骨髄性疾患では、ＣＤ３３またはＣＤ１２３などの細胞表面抗原が正常な骨髄前駆細胞と共有される。したがって、ＭＤＳ、ＡＭＬまたはＰＢＤＣＮに対するＣＤ３３またはＣＤ１２３抗原を標的とする免疫療法は、患者の悪性細胞に加えて正常な造血細胞の枯渇に関連し得る（Ｇｉｌｌ Ｓ．Ｉ．Ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１９）。結果として、ｍＡｂ、Ｔ細胞エンゲージャーまたはＣＡＲ Ｔを含む標的化免疫療法は、一部には真に疾患特異的な表面抗原が存在しないために、ほとんどが困難であった（Ｇｉｌｌ Ｓ．Ｉ．Ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１９）。
【0004】
ＣＤ３３－ＣＡＲ Ｔ細胞移入によって枯渇した正常な造血を再生するために、ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞耐性造血細胞が、ＣＤ３３遺伝子全体がノックアウトされるように操作されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｃｅｌｌ．１７３：１４３９－５３）。しかしながら、ＣＤ３３は、その免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）シグナル伝達ドメインを介して骨髄細胞に対して構成的阻害効果を有する。したがって、ＣＤ３３の喪失がどの程度良好に許容され得るかは不明のままである。患者に移植されたＣＤ３３ノックアウト（ＣＤ３３ ＫＯ）操作細胞は、長期の機能的欠陥および非常に不均一な結果を示す可能性がある（国際公開第２０１８／１６０７６８号パンフレット、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｃｅｌｌ．１７３：１４３９－５３，Ｂｏｒｏｔ ｅｔ ａｌ．２０１９．ＰＮＡＳ．１１６：１１９７８－８７，Ｈｕｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．３３：７６２－８０８）。実際、ＣＤ３３ ＫＯ細胞の頻度は、長期観察が報告された２匹のサルで減少した。これは、例えばＣＤ３３ ＫＯ長期再増殖ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）の生着の減少による、または競合的不利益による、ＣＤ３３ ＫＯ細胞の機能障害を示し得る（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｃｅｌｌ．１７３：１４３９－５３）。さらに、必須の機能を有する細胞表面抗原の数は非常に限られており、前記冗長な細胞表面抗原の喪失は抗原陰性再発を誘発し得る。ＣＤ１９陰性再発が、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ療法を受けている患者のおよそ３０％において認められる（Ｏｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４：１５０４－６）。ＣＤ１９およびＣＤ１２３の二重標的化は、抗原喪失の再発を予防することができる（Ｒｕｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１ ２６：３８１４－２６）。
【0005】
国際公開第２０１８／１６０７６８号パンフレットは、表面抗原ＣＤ３３上のエピトープ全体が欠失するように造血細胞を操作するアプローチを記載している。このような大きな欠失を有する抗原は、それぞれの野生型表面抗原と同等の機能を有さないと予想され得る。国際公開第２０１４／１３８８０５号パンフレットは、特定の抗体への結合の減少を示すＣＤ１２３の特定の変異体を開示している。Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１４）８：４１０－９には、ＣＤ１２３へのＣＳＬ３６２の結合に関与する特定のアミノ酸が開示されている。米国特許出願公開第２０１９０１８５５７３号明細書は、ＣＤ１２３の特定の変異体の抗体結合特性を開示している。これらの文献のいずれも、本開示において企図されるような変異体の使用を開示していない。欧州特許第３７６９８１６号明細書は、本開示に開示される特定の分子のＣＤＲと相同性を有する抗体鎖を開示している。Ｂｌｏｏｄ（２０１７）１３０ Ｓｕｐｐｌ １：２６２５は、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を利用してがんを治療する方法を開示している。そのような治療は、ＣＤ１２３のいかなる変異体も使用しない。
【0006】
以前の特許出願において本発明者らは、表面タンパク質変異体における単一アミノ酸の相違を操作して造血細胞に入れて抗原性を変化させ、特異的および選択的抗体によって識別することができることを示した（国際公開第２０１７／１８６７１８号パンフレット、国際公開第２０１８／０８３０７１号パンフレット）。ＣＤ３３ ＫＯ細胞とは対照的に、これらの細胞における表面タンパク質変異体は、それらの正常な発現および機能を保持し、重要な非冗長機能を有する表面タンパク質を標的化することを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】国際公開第２０１８／１６０７６８号パンフレット
【特許文献2】国際公開第２０１４／１３８８０５号パンフレット
【特許文献3】米国特許出願公開第２０１９０１８５５７３号明細書
【特許文献4】欧州特許第３７６９８１６号明細書
【特許文献5】国際公開第２０１７／１８６７１８号パンフレット
【特許文献6】国際公開第２０１８／０８３０７１号パンフレット
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｇｉｌｌ Ｓ．Ｉ．Ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１９
【非特許文献2】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｃｅｌｌ．１７３：１４３９－５３
【非特許文献3】Ｂｏｒｏｔ ｅｔ ａｌ．２０１９．ＰＮＡＳ．１１６：１１９７８－８７
【非特許文献4】Ｈｕｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．３３：７６２－８０８
【非特許文献5】Ｏｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４：１５０４－６
【非特許文献6】Ｒｕｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６：３８１４－２６
【非特許文献7】Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１４）８：４１０－９
【非特許文献8】Ｂｌｏｏｄ（２０１７）１３０ Ｓｕｐｐｌ １：２６２５
【発明の概要】
【0009】
本開示の目的の１つは、悪性腫瘍、特にがん、血液学的悪性腫瘍、骨髄性疾患を治療するためのより安全な方法を開発することである。したがって、本発明者らは、正常な機能を保持しながら免疫学的に区別可能であり、アミノ酸の変化が単一または複数のヌクレオチド変異に起因して生じる表面タンパク質の変異を求めた。特に、本発明者らは、ＣＤ１２３の合理的に設計された天然に存在する変異体を同定し、これらの変異が、その正常な発現および機能、特にインターロイキン－３（ＩＬ－３）の結合を保持しながら、ＣＤ１２３の特異的抗体に対する抗原性を変化させることを示した。
【0010】
本発明は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、好ましくはＣＤ１２３の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、好ましくは前記第１および第２のアイソフォームが機能的である、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。
【0011】
特定の実施形態において、本発明は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための哺乳動物細胞または細胞の集団、好ましくは造血幹細胞に関し、前記医学的治療は、それを必要とする前記患者に前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記細胞または細胞の集団を、前記第２のアイソフォームに特異的に結合する少なくとも第１の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して投与して、第２のアイソフォームを発現する患者の細胞を特異的に枯渇させ、好ましくは造血疾患、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、芽球性形質細胞樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などの悪性造血疾患の治療における免疫療法後に正常な造血を回復させることを含む。
【0012】
別の特定の実施形態において、本発明は、それを必要とする患者における医学的治療においての使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関し、前記医学的治療が、第１のアイソフォームを発現する移入された細胞を特異的に枯渇させるために、好ましくは養子細胞移入療法における使用のために、より好ましくは悪性造血疾患、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、芽球性形質細胞樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）の治療のために、前記第１のアイソフォームと特異的に結合する少なくとも第２の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して、それを必要とする前記患者に前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団の治療有効量を投与することであって、再度、より好ましくは、前記枯渇剤は、移植による移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用を回避するために、表面タンパク質の前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団に続いて投与される、投与されることを含む。
【0013】
別の態様では、本発明は、哺乳動物細胞、好ましくは造血幹細胞または免疫細胞、例えば上記のＴ細胞、および好ましくは枯渇剤、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【0014】
本発明はまた、表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与されたことがある患者において重篤な副作用のリスクを防止することまたは低下させることにおいて使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞が、表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤は、前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記第２のアイソフォームに結合しない少なくとも第２の抗原結合領域を含み、好ましくは前記表面タンパク質がＣＤ１２３である、枯渇剤に関する。
【0015】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者において宿主細胞を選択的に枯渇させるのに使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然細胞は表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤は、前記第２のアイソフォームに特異的に結合する少なくとも第１の抗原結合領域を含み、好ましくは、前記表面タンパク質はＣＤ１２３であり、前記枯渇剤の前記第１の抗原結合領域は、配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むエピトープに特異的に結合し、より好ましくは、前記第１の抗原結合領域は、
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８であり、再度、より好ましくは前記第１の抗原結合領域は、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２、および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはからなる軽鎖可変ドメイン
を含む、枯渇剤に関する。
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８であり、再度、より好ましくは前記第１の抗原結合領域は、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２、および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはからなる軽鎖可変ドメイン
を含む、枯渇剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】Ａ）ＣＤ１２３の残基あたりの相対的な溶媒へのアクセス可能性（ＲＳＡ）。ＣＤ１２３－ＣＳＬ３６２複合体のＸ線構造に基づいて、ＣＳＬ３６２に結合した状態およびＣＳＬ３６２を含まない状態についてＲＳＡを計算した（ＰＤＢ ＩＤ：４ＪＺＪ）。Ｎ末端ドメインについてデータを示す。矢印は、残基Ｅ５１、Ｓ５９およびＲ８４のＲＳＡを示す。Ｂ）ＣＤ１２３－ＣＳＬ３６２複合体および選択されたアミノ酸変異体の３Ｄ構造。ＣＤ１２３残基Ｅ５１、Ｓ５９およびＲ８４をスティックとして示す。ＣＳＬ３６２抗体の構造を分子の表面として示す。
【図2】２つのモノクローナル抗体クローンＭＩＲＧ１２３および６Ｈ６で染色したＣＤ１２３変異体および対照（ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３）のフローサイトメトリー。変異体は、ＭＩＲＧ１２３に対するそれらの消失された結合（下線）、弱い結合（丸）または強い結合（アスタリスク）に従って符号化されている。灰色のＨＥＫおよびＨＥＫ－ＣＤ１２３を対照とする。
【図3】図２のＦＡＣＳプロットの定量。ＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋二重陽性（右上象限）細胞の百分率を、対照およびすべての変異体についてプロットする。６Ｈ６結合は変化しなかった（図２を参照されたい）。３つの独立した実験の概要。突然変異変異体は、非結合剤（下線、＜１％のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋）、弱結合剤（丸、１から２０％のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６）および強結合剤（アスタリスク、＞２０％のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６）として適格である。
【図4】ＣＤ１２３アイソフォーム変異体はＦｃｇＲＩＩＩＡ活性化を防止する。ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３（野生型）およびＨＥＫ ＣＤ１２３変異体アイソフォームとＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポーター細胞およびＭＩＲＧ１２３との共培養後に測定された相対発光シグナル。ＲＬＵは、ＨＥＫ－ＣＤ１２３（野生型）で測定されたシグナルに対して正規化される。突然変異変異体は、非結合剤（下線、＜１％のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋）、弱結合剤（丸、１から２０％のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６）および強結合剤（アスタリスク、＞２０％のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６）として適格である。
【図5】ＣＤ１２３アイソフォーム変異体は、ＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥ媒介Ｔ細胞の活性化を防止する。安定的な標的細胞株ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびＣＤ１２３変異体を、３００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥの存在下、１０：１のＥ：Ｔ比で、ヒト初代ｐａｎ Ｔ細胞と共培養した。ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３またはすべてのＣＤ１２３変異体との共培養後に測定されたＣＤ６９＋Ｔ細胞の百分率の概要が示されている。データを、ＨＥＫ標的細胞の存在下におけるＣＤ６９＋細胞の百分率に対して正規化する。エラーバーは平均±ＳＤを示す。データは、５人の独立した血液ドナーおよび群あたり２回の技術的反復実験を表す。
【図6】ＣＤ１２３アイソフォーム変異体は、ＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥ媒介ヒトＴ細胞殺傷から保護されている。安定的な標的細胞株ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびＣＤ１２３変異体を、３００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥの存在下、１０：１のＥ：Ｔ比で、ヒト初代ｐａｎ Ｔ細胞と共培養した。７２時間の共培養後のＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびすべてのＣＤ１２３変異体の特異的ＢｉＴＥ媒介殺傷が百分率で示されている。エラーバーは平均±ＳＤを示す。データは、５人の独立した血液ドナーおよび群あたり２回の技術的反復実験を表す。ＣＤ１２３変異体の発現を、モノクローナル抗体６Ｈ６を用いたＦＡＣＳによって確認した。
【図7】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１へのＣＤ１２３特異的第２世代ＣＡＲの非ウイルスＨＤＲ媒介性インテグレーションおよびＣＳＬ３６２に基づくＣＡＲ構築物の設計。
【図8】エフェクターＣＡＲ Ｔ細胞を異なる標的細胞と１日共培養した後のエフェクターＣＡＲ Ｔ細胞活性化（ＣＤ６９）を表すＦＡＣＳ分析の結果。単独のＣＤ６９＋ＣＡＲ Ｔ細胞（エフェクターＴ細胞）、または２４時間の共培養後のＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３もしくはすべてのＣＤ１２３変異体の存在下のＣＤ６９＋ＣＡＲ Ｔ細胞の百分率の概要である。データを、ＨＥＫ標的細胞の存在下におけるＣＤ６９＋細胞の百分率に対して正規化する。ＣＡＲを発現しない対照Ｔ細胞は活性化されなかった。
【図9】図８の定量化基礎データ。共培養の１日目にＣＤ１２３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞によるＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびその変異体のフローサイトメトリーによって測定された特異的殺傷の定量化。エラーバーは平均±ＳＤを示す。３人の独立した血液ドナーおよび群あたり２回の技術的反復実験からのデータである。
【図10A】ＣＳＬ３６２に対するＣＤ１２３ ＷＴおよびＥ５１ＴのＢＬＩセンソグラム。
【図10B】２８０秒における、捕捉されたＣＳＬ３６２抗体（同じレベルで捕捉された）との、５０ｎＭの最高濃度でのＣＤ１２３＿ＷＴおよび変異体の結合のレベル。
【図10C】対照抗体６Ｈ６に対するＣＤ１２３＿ＷＴおよびＥ５１ＴのＢＬＩセンソグラム。
【図10D】２５０秒での、捕捉された６Ｈ６抗体（捕捉／負荷レベルに対して正規化）とのＣＤ１２３＿ＷＴおよび変異体の結合のレベル。
【図10E】ＣＳＬ３６２に対するＥ５１ＱおよびＥ５１ＴのＢＬＩセンソグラム。
【図10F】２８０秒における、捕捉されたＣＳＬ３６２抗体（最高濃度で捕捉）との、Ｂよりも高い濃度（最高濃度として３００ｎＭ）でのＣＤ１２３＿変異体の結合のレベル。
【図10G】２５０秒における、捕捉されたフロテツズマブ（同じレベルで捕捉）との、５０ｎＭの最高濃度でのＣＤ１２３＿ＷＴおよび３００ｎＭの最高濃度でのＣＤ１２３＿変異体との結合レベル。
【図11A】ＩＬ３に結合するＣＤ１２３＿ＷＴおよびＥ５１ＴのＢＬＩセンソグラム。
【図11B】２５０秒での捕捉されたビオチン化ＣＤ１２３変異体とのＩＬ３の結合のレベル（捕捉／負荷レベルに対して正規化）。
【図12A】ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを使用して熱的アンフォールディングを監視する。挿入図は一次導関数データである。蛍光を、ＰＢＳ緩衝液５×Ｓｙｐｒｏオレンジ色素でモニターした。タンパク質濃度は０．２５ｍｇ／ｍＬである。使用した加熱速度は１．５℃／分ランプであり、２５から９５℃まで記録した。ＣＤ１２３＿ＷＴおよびＣＤ１２３変異体の熱的アンフォールディング（Ｅ５１Ｔ、Ｅ５１Ｋ、Ｅ５１Ｑ、Ｓ５９Ｐ、Ｓ５９ＥおよびＲ８４Ｅ）。
【図12B】ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを使用して熱的アンフォールディングを監視する。挿入図は一次導関数データである。蛍光を、ＰＢＳ緩衝液５×Ｓｙｐｒｏオレンジ色素でモニターした。タンパク質濃度は０．２５ｍｇ／ｍＬである。使用した加熱速度は１．５℃／分ランプであり、２５から９５℃まで記録した。ＣＤ１２３変異体の熱的アンフォールディング（Ｅ５１Ａ、Ｓ５９Ｒ、Ｓ５９Ｆ、Ｓ５９Ｙ、Ｒ８４ＱおよびＲ８４Ｔ）。
【図13】バルクＴＦ－１細胞を、対照（ｃｒＲＮＡなし）、ＫＯ（ｃｒＲＮＡはあるがＨＤＲＴなし）、またはＫＩ（ｃｒＲＮＡ＋ＫＩ ＨＤＲＴ、Ｅ５１ＫまたはＥ５１Ｔ）として培養した。ＩＬ－３またはＧＭ－ＣＳＦと共に培養した対照細胞は、ＭＩＲＧ１２３＋、６Ｈ６＋のままであった。ＧＭ－ＣＳＦと共に培養したＫＯ細胞は、ほとんどがＭＩＲＧ１２３－、６Ｈ６＋のままであった。対照的に、ＩＬ－３と共に徐々に培養したＫＯ細胞を含む培養物では、ＭＩＲＧ１２３＋、６Ｈ６＋細胞の集団が検出可能になった。６日目に、ＭＩＲＧ１２３＋、６Ｈ６＋集団が支配的であり、ＣＤ１２３受容体を発現する細胞がＩＬ３の存在下で競合的利点を有したことが実証された。ＫＩ細胞（Ｅ５１ＫまたはＥ５１Ｔ）では、ＭＩＲＧ１２３－６Ｈ６＋の集団だけでなく、ＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋細胞の集団も、ＩＬ３と共に徐々に増加した。これは、ＧＭ－ＣＳＦと共に培養した細胞ではあまり顕著ではなかった。したがって、ＫＩ細胞（ＭＩＲＧ１２３－６Ｈ６＋）は機能的受容体を有する。
【図14】ＴＦ－１細胞（野生型、ノックアウト、ならびにＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックイン細胞を、ＩＬ３で刺激されるそれらの能力について試験した。ＣＤ１２３のＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体を発現するＴＦ－１ノックイン細胞は、ｈＩＬ３の添加により、野生型ＣＤ１２３を発現するＴＦ－１細胞と同程度に増殖することができる。ノックアウト細胞は、ｈＩＬ３に対して最小限の応答しか示さない。
【図15】抗体ＭＩＲＧ１２３を、ＴＦ－１細胞（野生型、ノックアウト、ならびにＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックイン細胞）に結合するその能力について試験した。ＭＩＲＧ１２３は、ＩＬ３刺激野生型ＴＦ－１細胞の用量依存的な増殖遮断およびアポトーシスをもたらす。対照的に、ＣＤ１２３のＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体を発現するＴＦ－１ノックイン細胞は、ＭＩＲＧ１２３の遮断効果から効率的に保護される。
【図16】Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックインを有するＨＳＰＣ細胞を首尾よく生成することができた。エレクトロポレーション（ＥＰ）の２日後および５日後のノックイン細胞の百分率をプロットしている。
【図17】Ｅ５１ＫおよびＥ５１ＴノックインのＨＳＣは、対照抗体６Ｈ６によって評価した場合、抗体ＭＩＲＧ１２３への結合の喪失を示したが、ＣＤ１２３の発現を保存した。
【図18】ＬＴ－ＨＳＣ（長期再増殖造血幹細胞）、ならびにＭＰＰ１細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０－ＣＤ４５ＲＡ－）およびＭＰＰ２細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０－ＣＤ４５ＲＡ＋）も首尾よく編集されている。
【図19】ヒトエフェクターＴ細胞と対照または編集されたＨＳＰＣ細胞（Ｅ：Ｔ＝３：１）とを、ＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥの存在下で共培養すると、フローサイトメトリープロットの定量化によって測定した場合、ＢｉＴＥで処理すると野生型ＨＳＰＣの減少に至った。対照的に、ＣＤ１２３ Ｅ５１ＫまたはＥ５１Ｔ変異体を発現するＨＳＣは、保護され、富化される。エラーバーは平均±ＳＤを示す。２人の独立したドナーでデータを作成した。
【図20】ヒトエフェクターＴ細胞と対照または編集されたＨＳＰＣ細胞（Ｅ：Ｔ＝３：１）とを、ＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥの存在下で共培養すると、フローサイトメトリープロットの定量化によって測定した場合、ＢｉＴＥで処理すると野生型ＨＳＰＣの減少に至った。対照的に、ＣＤ１２３ Ｅ５１ＫまたはＥ５１Ｔ変異体を発現するＨＳＣは、保護され、富化される。エラーバーは平均±ＳＤを示す。２人の独立したドナーでデータを作成した。
【発明を実施するための形態】
【0017】
免疫療法は、がん、遺伝性および自己免疫疾患を治療するための有望な治療法である。腫瘍抗原を対象として操作された免疫細胞などの免疫枯渇剤は、腫瘍細胞を標的化して殺傷させるために患者に投与される。しかしながら、腫瘍表面タンパク質はまた造血細胞を含む正常細胞の表面で発現されるので、この戦略は、例えば造血を変化させることによって患者に重篤な副作用を誘発することができる。患者における造血を回復させるために、造血細胞をその後に患者に移植することができる。しかしながら、病んだ細胞だけでなく、新たに移植された健常な細胞への枯渇剤の結合は、最大耐量を制限し得るか、または健常な細胞の移植前の治療への使用を制限し得る。あるいは、移植された細胞が、前記免疫枯渇剤によって標的化され、排除されないように、前記免疫枯渇剤に対して耐性である必要がある。したがって、本発明者は、患者における正常な造血を回復させるためのそれらの機能を保持しながら、免疫療法において使用される前記免疫枯渇剤に対して耐性の細胞を選択した。
【0018】
本発明者らは、特定の枯渇剤の結合に関与する表面タンパク質領域をコードする遺伝子配列の機能的対立遺伝子変異体を同定する方法を開発する。そのような変異体は、天然に存在する多型および／または設計および操作された変異体であり得る。表面タンパク質の異なるアイソフォームを選択または生成することができる。前記多型の核酸によってコードされる表面タンパク質の前記第１のアイソフォームは、特定の枯渇剤によって認識されない。この変異対立遺伝子は、特に表面タンパク質の機能を変化させない。したがって、前記枯渇剤を使用して、一方のアイソフォームに特異的に結合し、他方のアイソフォームには結合せず、それによって、１つのアイソフォームを発現する細胞を特異的に枯渇させることができる。例えば、枯渇剤が第１のアイソフォームではなく第２のアイソフォームに特異的に結合する場合、前記枯渇剤は、前記第２のアイソフォームを発現する細胞を特異的に枯渇させる。別の実施形態では、前記第１のアイソフォームは、第２の薬剤によって認識され得、したがって、この第２の薬剤は、第２のアイソフォームではなく、第１のアイソフォームを発現する細胞を特異的に枯渇させるために使用され得る。少なくとも１つの変異対立遺伝子によってコードされる表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞は、第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者における医学的治療において、特に、それぞれ第２または第１の薬剤を使用することによって、特異的に移植された細胞または患者の細胞を枯渇させるために有利に使用される。
【0019】
枯渇剤
本開示は、細胞上の表面タンパク質の１つのアイソフォームに特異的に結合し、前記表面タンパク質の別のアイソフォームには結合しない抗原結合領域を含む薬剤に関する。そのような薬剤は、本明細書では「枯渇剤」と呼ばれる。前記表面タンパク質の両方のアイソフォームは機能性であり、すなわち、前記表面タンパク質の少なくとも１つの関連する特性に関して機能性である場合、表面タンパク質である。好ましくは、前記表面タンパク質の両方のアイソフォームは、同じ機能を有する、すなわち、機能的に区別できない。
本開示は、細胞上の表面タンパク質の１つのアイソフォームに特異的に結合し、前記表面タンパク質の別のアイソフォームには結合しない抗原結合領域を含む薬剤に関する。そのような薬剤は、本明細書では「枯渇剤」と呼ばれる。前記表面タンパク質の両方のアイソフォームは機能性であり、すなわち、前記表面タンパク質の少なくとも１つの関連する特性に関して機能性である場合、表面タンパク質である。好ましくは、前記表面タンパク質の両方のアイソフォームは、同じ機能を有する、すなわち、機能的に区別できない。
【0020】
しかしながら、表面タンパク質の２つのアイソフォームは、枯渇剤への結合に関して異なる。枯渇剤は、前記表面タンパク質のアイソフォームの１つにのみ特異的に結合する。したがって、アイソフォームは、機能的に同一であるが免疫学的に区別可能であると記載することができる。
【0021】
前記表面タンパク質の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームは、前記表面タンパク質の多型対立遺伝子であり得る。好ましくは、前記表面タンパク質の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームは、前記表面タンパク質の天然に存在する多型対立遺伝子である。また好ましくは、前記表面タンパク質の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームは、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子である。
【0022】
前記表面タンパク質の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームはまた、遺伝子操作された対立遺伝子であり得る。好ましくは、前記表面タンパク質の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームは、１、２、３、４または５アミノ酸異なる。最も好ましくは、前記表面タンパク質の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームは、１つのアミノ酸が異なる。
【0023】
第２のアイソフォームを生成するために表面タンパク質に導入される突然変異を判定するために、様々な方法を使用することができる。例えば、突然変異を表面タンパク質にランダムに挿入し、続いて生成された変異体の機能的および免疫学的スクリーニングを行うことができる。あるいは、突然変異は、例えば表面タンパク質の二次または三次タンパク質の構造の分析によって合理的に設計することができる。
【0024】
枯渇剤は、細胞上の表面タンパク質の１つのアイソフォームに特異的に結合し、前記表面タンパク質の別のアイソフォームには結合しない抗原結合領域を含む。本開示の枯渇剤は、２つの主要なカテゴリーに分けることができる。
【0025】
第１に、枯渇剤は、抗原結合領域を含むポリペプチドであり得る。前記ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチド鎖からなり得る。好ましくは、抗原結合領域を含む前記ポリペプチドは抗体である。抗原結合領域を含む前記ポリペプチドはまた、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、または抗体もしくは足場の別の変異体であり得る。例示的な抗体断片および足場には、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、ビス－ｓｃＦｖ、ラクダ抗体、アンキリン、センチリン、ドメイン抗体、リポカリン、小型モジュール免疫医薬品、マキシボディ、プロテインＡおよびアフィリンが含まれる。
【0026】
抗原結合領域を含む前記ポリペプチドは、二重特異性、バイスペシフィックまたは多重特異性抗体であってもよい。そのような分子はまた、さらなる機能的ドメインを含有し得る。例えば、抗原結合領域を含む前記ポリペプチドは、Ｔ細胞エンゲージャー、例えばＢｉＴＥであり得る。抗原結合領域を含む前記ポリペプチドはまた、サイトカインもしくはケモカイン、または細胞表面受容体の細胞外ドメインに融合され得る。
【0027】
あるいは、枯渇剤は、抗原結合領域を含む細胞であり得る。例えば、枯渇剤はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。本開示の特定の実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ ＮＫ細胞またはＣＡＲマクロファージである。本開示の好ましい実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞はＣＡＲ Ｔ細胞である。本開示の別の好ましい実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞は、ＣＡＲを含む初代Ｔ細胞である。
【0028】
枯渇剤は、表面タンパク質の１つのアイソフォームに特異的に結合するが、第２のアイソフォームには結合せず、したがって、１つのアイソフォームを発現する細胞を特異的に枯渇させる。
【0029】
特定の実施形態では、本開示は、表面タンパク質の第２のアイソフォームに特異的に結合し、第１のアイソフォームに結合しない第１の抗原結合領域を含む薬剤に関する。他の実施形態では、本開示はまた、第１のアイソフォームに特異的に結合し、第２のアイソフォームに結合しない第２の抗原結合領域を含む薬剤に関する。
【0030】
表面タンパク質の第１および第２のアイソフォームは、１つのアミノ酸置換のみが互いに異なり得る。第１のアイソフォームと第２のアイソフォームとの間の前記１つのアミノ酸の相違はまた、天然に存在する一塩基多型などの一塩基多型が存在することの結果であり得る。表面タンパク質の第１および第２のアイソフォームはまた、１個より多いアミノ酸、例えば２個、３個、または３個より多いアミノ酸が互いに異なっていてもよい。表面タンパク質の第１および第２のアイソフォームはまた、アイソフォームの一方が他方のアイソフォームと比較して１個、２個、３個または３個を超えるアミノ酸の挿入を有するという点で互いに異なり得る。表面タンパク質の第１および第２のアイソフォームはまた、アイソフォームの一方が他方のアイソフォームと比較して１個、２個、３個または３個を超えるアミノ酸の欠失を有するという点で互いに異なり得る。好ましい実施形態では、前記枯渇剤は抗体または抗原結合断片である。
【0031】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。したがって、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく、抗体断片ならびに抗体の変異体（誘導体を含む）も包含する。
【0032】
げっ歯類および霊長類の天然の抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結されており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。ラムダ（λ）とカッパ（κ）という２種類の軽鎖が存在する。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥという、抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）がある。各鎖は、異なる配列ドメインを含む。典型的なＩｇＧ抗体では、軽鎖は２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、総合的にＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）の両方が、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常領域ドメイン（ＣＨ）は、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を付与する。
【0033】
Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主に超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基で構成される。時折、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基は、抗体結合部位に関与し得るか、またはドメイン構造全体、したがって結合部位に影響を及ぼし得る。相補性決定領域、つまりＣＤＲは、天然の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定めるアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、３つのＣＤＲを有し、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、およびＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３とそれぞれ呼ばれる。したがって、抗原結合部位は、典型的には、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列を指す。したがって、軽鎖および重鎖の可変領域は、典型的には、以下の配列、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の４つのフレームワーク領域および３つのＣＤＲを含む。
【0034】
抗体可変ドメインの残基は、従来、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従ってナンバリングされる。このシステムは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２、以降「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．」）に記載されている。このナンバリングのシステムが、本明細書で使用されている。Ｋａｂａｔの残基表記は、配列番号の配列におけるアミノ酸残基の線形の番号付けと必ずしも直接対応しない。実際の線形のアミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）にかかわらず、構造成分の短縮または挿入に対応する厳密なＫａｂａｔナンバリングよりも少ないまたは付加的なアミノ酸を含み得る。残基の正確なＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列における相同性の残基と「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリングのなされた配列とのアラインメントによって、所与の抗体について決定され得る。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基３１から３５（Ｈ－ＣＤＲ１）、残基５０から６５（Ｈ－ＣＤＲ２）および残基９５から１０２（Ｈ－ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基２４から３４（Ｌ－ＣＤＲ１）、残基５０から５６（Ｌ－ＣＤＲ２）、および残基８９から９７（Ｌ－ＣＤＲ３）に位置する。
【0035】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、抗体断片、より具体的には本明細書に開示される抗体の抗原結合ドメインを含む任意のタンパク質である。抗原結合ドメインはまた、別のタンパク質足場に組み込まれ得る。抗体断片および足場には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、ビス－ｓｃＦｖ、ラクダ科抗体、アンキリン、センチリン、ドメイン抗体、リポカリン、小型モジュール免疫医薬品、マキシボディ、プロテインＡおよびアフィリンが含まれるが、これらに限定されない。
【0036】
本明細書で使用される場合、「抗原結合領域」または「抗体の抗原結合断片」は、場合によってはそのネイティブ形態で、特定の抗原に対する抗原結合能力を示す抗体の一部、すなわち抗体の構造の一部に対応する分子を意味する。そのような断片は、特に、対応する４鎖抗体の抗原結合特異性と比較して、前記抗原に対して同じまたは実質的に同じ抗原結合特異性を示す。抗原結合能は、抗体と標的断片との間の親和性を測定することによって、決定することができる。この抗原結合領域は、抗体の「機能的断片」と呼ばれることもある。
【0037】
本開示の薬剤は、抗体およびその断片を含むが、本明細書では抗原結合抗体模倣物とも呼ばれる、抗体の抗原を模倣する、抗原に結合する能力を有する人工タンパク質も含む。抗原結合抗体模倣物は、抗原に特異的に結合するが、抗体に構造的に関連しない有機化合物である。それらは、通常、約３ｋＤａから２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチドまたは小タンパク質である。
【0038】
「抗原を認識する抗原結合領域」および「抗原に対する特異性を有する抗原結合領域」という語句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗原結合領域」という用語と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、抗体などの抗原結合領域を含む薬剤が抗原において提示されたエピトープに検出可能に結合できることを指す。
【0039】
「明らかな親和性」または「特異的結合」または「特異的に結合する」には、約１０－８Ｍ（ＫＤ）またはそれより強い親和性での結合が含まれる。好ましくは、結合親和性が１０－８Ｍ（ＫＤ）から１０－１２Ｍ（ＫＤ）、任意選択で１０－８Ｍ（ＫＤ）から１０－１０Ｍ（ＫＤ）、特に少なくとも１０－８Ｍ（ＫＤ）である場合、結合は特異的であると考えられる。親和性は、当業者に周知の様々な方法によって決定することができる。これらの方法には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）およびスキャッチャードプロットが含まれるが、これらに限定されない。結合ドメインが標的と特異的に反応するかまたは標的に結合するかどうかは、とりわけ、前記結合ドメインと標的タンパク質または抗原との反応を、前記結合ドメインと標的タンパク質以外のタンパク質または抗原との反応と比較することによって、容易に試験することができる。
【0040】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはその抗原結合領域が結合する抗原の一部を意味する。タンパク質抗原のエピトープは、立体構造エピトープおよび線状エピトープの２つのカテゴリーに分けることができる。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続の部分に対応する。線状エピトープは、抗原からのアミノ酸の連続した配列に対応する。
【0041】
別の態様では、二重特異性または多重特異性の分子、例えば二重特異性抗体または多重特異性抗体が、本明細書にさらに開示される。例えば、抗体は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、別の機能性分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に誘導体化または連結され得る。抗体は、実際には、２つを超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を生成するために、１つを超える他の機能性分子に誘導体化または連結され得る。そのような多重特異性分子はまた、本明細書で使用される「二重特異性分子」、「二重特異性抗体」、「二重特異性分子」、「二重特異性抗体」、「多重特異性分子」、および「多重特異性抗体」という用語に包含されることが意図される。二重特異性分子を作出するために、本発明の抗体は、二重特異性分子が生じるように、１つまたはそれを超える他の結合分子、例えば、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物、サイトカイン、ケモカイン、または受容体細胞外ドメインに機能的に連結され得る（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合または他の方法によって）。本開示によって企図される特定の二重特異性分子および多重特異性分子は、Ｔ細胞エンゲージャー、例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、例えばＢｉＴＥである。
【0042】
本明細書で使用される場合、特定のアイソフォームに結合しない薬剤には、前記特定のアイソフォームを発現する細胞に結合することができない薬剤が含まれる。特に、前記薬剤は、蛍光マーカーで標識されるか、または前記薬剤を対象とする二次抗体で検出され、ＦＡＣＳ分析によって検出された表面での前記蛍光マーカーまたは前記二次抗体染色を提示する細胞の割合は、実験のパートにおいて記載されているように判定される。変異体アイソフォームの発現をモニタリングするために、細胞を２つの薬剤で同時に染色し、一方は変異体が導入されたエピトープに結合し（例えば、抗ＣＤ１２３ ＣＳＬ３６２）、第２のものは第１の薬剤によって結合されたものとは異なるエピトープに結合する（例えば抗ＣＤ１２３クローン６Ｈ６）。第２のエピトープは変化しないままであり、したがって、この染色は発現の制御として働く。非結合制御として、目的のタンパク質を発現しない細胞（例えばＨＥＫ細胞）を使用した。最大限の結合制御として、目的のタンパク質を通常発現しない細胞を、野生型アイソフォーム（例えばＨＥＫ－ＣＤ１２３）でトランスフェクトした。したがって、特定の実施形態では、ＦＡＣＳ分析により検出する蛍光マーカーにカップリングされる薬剤（例えば抗ＣＤ１２３抗体）にその表面で結合する細胞のパーセンテージが１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、または検出可能な限界に満たないものである場合、前記薬剤は、前記特定のアイソフォームを発現する細胞に結合することができない。これにより、結合を、右上象限（すなわち、制御薬剤および目的の薬剤の両方への結合）のＦＡＣＳにおける蛍光によって測定する。結合の減少はまた、前記第１の薬剤の蛍光の減少をもたらすが、前記第２の薬剤の蛍光の減少をもたらさない。
【0043】
別のアッセイでは、２つの薬剤の結合、すなわち、変異体が導入されたエピトープに結合するもの（例えば抗ＣＤ１２３抗体ＣＳＬ３６２）と、第１の薬剤によって結合されたものとは異なるエピトープに結合する第２のもの（例えば抗ＣＤ１２３クローン６Ｈ６）との結合を、標識なしで、リアルタイムで、野生型の精製された組換えＣＤ１２３細胞外ドメインならびに変異体アイソフォームについて、バイオレイヤー干渉法によって、測定する。したがって、特定の実施形態において、前記第１の薬剤は、バックグラウンドを上回る関連シグナルが５０ｎＭから３００ｎＭという抗体の濃度において検出可能でない場合、組換えＣＤ１２３変異体アイソフォーム細胞外ドメインに結合することができない。５０ｎＭから３００ｎＭの濃度での不変異体エピトープに対する第２の薬剤の検出可能な結合は、結合および完全性の制御として作用する。
【0044】
前記薬剤の結合は、第１のアイソフォームを発現する細胞の枯渇をもたらし得る。様々な機構が細胞の枯渇をもたらし得る。抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、標的タンパク質への薬剤の結合およびＮＫ細胞によって発現されるＦｃＲによって結合される薬剤へのＦｃ部分を介したＮＫ細胞の活性化から生じる。免疫グロブリンのＦｃ部分は、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端領域を指す。Ｆｃ部分は、野生型または操作されたものであり得る。強化され操作されたＦｃ部分の突然変異は、当技術分野で公知である。特定の治療の状況では、エフェクター機能を誘導する抗体の能力を低減または無効にするために、Ｆｃ受容体の１つ以上または全部への野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域などの抗体の野生型Ｆｃ領域の正常な結合、および／またはＣ１ｑなどの補体成分への結合を、低減または無効にすることが所望される。例えば、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩｌａ、ＦｃｙＲＩＩｂ、ＦｃｙＲＩＩＩａなどのＦｃｙ受容体の１つ以上またはすべてに対する抗体のＦｃ領域の結合を低減または無効にすることが所望され得る。エフェクター機能には、以下の、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカインの分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込み、ＮＫ細胞への結合、マクロファージへの結合、単球への結合、多形核細胞への結合、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達、標的結合抗体の架橋、樹状細胞の成熟、またはＴ細胞プライミングのうちの１つまたは複数が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0045】
Ｆｃ受容体および／またはＣ１ｑへのＦｃ領域の結合の低減または無効は、典型的には、野生型Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１ Ｆｃ領域、より具体的にはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を変異させて、前記野生型Ｆｃ領域の変異または操作されたＦｃ領域、例えば変異体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をもたらすことによって達成される。結合の低減をもたらす置換が有用であり得る。Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合特性を低減または無効にするために、非保存的アミノ酸置換、すなわちあるアミノ酸を異なる構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換することが好ましい。
【0046】
代用のＡＤＣＣアッセイは、実験のパートに記載されているように、ＡＤＣＣを媒介する薬剤の効力を定量するための業界の標準を構成する。操作されたＪｕｒｋａｔレポーター細胞は、ＮＦＡＴ応答性ルシフェラーゼ遺伝子およびＦｃ受容体を有する。結合する抗体とのＦｃ受容体の結合は、ＮＦＡＴ誘導、したがってルシフェラーゼシグナルを生じる。結合がないと、ルシフェラーゼシグナルを生じない。標的タンパク質を発現しない細胞（例えばＨＥＫ）、野生型タンパク質を発現する細胞（例えばＨＥＫ－ＣＤ１２３）または個々の変異体を発現する細胞（例えば、ＣＤ１２３変異体）を試験薬剤（例えば、ＣＳＬ３６２またはＭＩＲＧ１２３）と共にインキュベートし、ＡＤＣＣレポーター細胞と混合した。次いで、ルシフェラーゼを測定してＡＤＣＣシグナルを定量した。ルシフェラーゼ発光シグナルを、ＨＥＫ－ＣＤ１２３において観察された最大のシグナルに対して正規化した。ＡＤＣＣは、ＡＤＣＣレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７０１５）を用いて測定した。
【0047】
標的細胞を枯渇させる別の方法は、Ｔ細胞エンゲージャー分子の使用によるものである。本発明者らは、Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ，Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ，２０１９に記載されているように、ＣＳＬ３６２由来のＣＤ１２３結合部位およびＣＤ３（ＯＫＴ３）結合部位を使用して二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを構築した。ＡＤＣＣアッセイに使用したのと同じ標的細胞を使用した。初代ヒトＴ細胞および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを添加した。ヒトＴ細胞の活性化を、ＣＤ６９アップレギュレーションの頻度を決定することによってＦＡＣＳによって定量した。さらに、方法に記載されているように、特異的殺傷を計算した。
【0048】
本開示による枯渇剤は、表面タンパク質の１つのアイソフォームに特異的に結合し、前記アイソフォームを発現する細胞の枯渇を可能にする。
【0049】
より好ましくは、特定の実施形態において、本開示による前記枯渇剤は、細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームに結合せず、前記細胞表面タンパク質の第２のアイソフォームに特異的に結合し、特に本明細書において開示されるような使用方法において、前記第２のアイソフォームを発現する前記細胞の枯渇を可能にする。特に、細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームに結合しないが、患者の細胞において発現される第２のアイソフォームに特異的に結合する前記枯渇剤は、患者の細胞を枯渇させるために使用されるが、前記患者において造血を回復させるために移植された前記第１のアイソフォームを発現する造血幹細胞またはその継代を枯渇させない。
【0050】
別の実施形態において、本開示による前記枯渇剤は、細胞表面タンパク質の第２のアイソフォームに結合せず、前記細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームに特異的に結合し、特に本明細書において開示されるような使用方法において、前記第１のアイソフォームを発現する細胞の枯渇を可能にする。特に、細胞表面タンパク質の第２のアイソフォームに結合しないが、移植された細胞において発現される第１のアイソフォームに特異的に結合する前記枯渇剤は、移植された細胞を特異的に枯渇させて、移植による移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用を回避するために使用される。
【0051】
表面タンパク質の特異的アイソフォームを発現する細胞の選択的枯渇は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）によって制限なく達成することができる。
【0052】
特定の実施形態では、抗原結合領域を、薬物または毒素などのエフェクター化合物にカップリングさせる。そのようなコンジュゲートは、本明細書では「イムノコンジュゲート」または「抗体－薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）と呼ばれる。細胞毒または細胞傷害剤は、細胞に有害な（例えば、殺傷する）任意の薬剤を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ．コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、メイタンシノイド、カリケアマイシン、インドリノベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン、アルファ－アマニチン、ミクロシスチン、アウリスタチン、およびピューロマイシンならびにそれらの類似体またはホモログが挙げられる。
【0053】
別の特定の実施形態において、前記枯渇剤は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体を有する免疫細胞である。前記免疫細胞は、その細胞表面に、抗原受容体とも呼ばれる組換え抗原結合領域を発現し得る。「組換え体」とは、その天然の状態で細胞によってコードされない、すなわち異種の非内因性である抗原結合領域を意味する。したがって、組換え抗原結合領域の発現は、免疫細胞に新しい抗原特異性を導入し、細胞に以前に認識されていない抗原を認識させて結合させるということが分かる。抗原受容体は、任意の有用な供給源から単離され得る。本開示の特定の実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ ＮＫ細胞、またはＣＡＲマクロファージである。本開示の好ましい実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞はＣＡＲ Ｔ細胞である。本開示の別の好ましい実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞は、ＣＡＲを含む初代Ｔ細胞である。
【0054】
特定の実施形態では、前記組換え抗原受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達ドメインに連結された、典型的には抗体に由来する抗原結合領域を含む融合タンパク質である。ＣＡＲは、適切な抗原結合領域が選択される場合、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞を標的抗原に対して指向させるために使用することができる。
【0055】
ＣＡＲの抗原結合領域は、典型的には、抗体に由来するｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）に基づく。Ｎ末端の細胞外抗体結合領域に加えて、ＣＡＲは、典型的には、それが発現される免疫エフェクター細胞の原形質膜から離れるように抗原結合領域を延ばすためのスペーサーとして機能するヒンジドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＴＣＲ複合体のＣＤ３分子のゼータ鎖（ＣＤ３ζ）由来のシグナル伝達ドメイン、または同等物）、および任意選択でＣＡＲを発現する細胞のシグナル伝達または機能性を支援し得る１つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る。ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む共刺激分子からのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ改変免疫細胞の生存を増強し、増殖を増加させるために、単独で（第２世代）または併用して（第３世代）添加することができる。
【0056】
当業者は、本発明に従って使用される免疫細胞をリダイレクトするための上記の適切な抗原結合領域を選択することができる。特定の実施形態では、本発明の方法で使用するための免疫細胞は、リダイレクトされたＴ細胞、例えば、リダイレクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはリダイレクトされたＣＤ４＋Ｔ細胞、またはリダイレクトされたＮＫ細胞である。
【0057】
本発明者らは、クローンＣＳＬ３６２の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＣＤ８アルファヒンジおよび膜貫通ドメイン（Ｇｅｎ ＣＤ８Ａ ＥＮＳＧ０００００１５３５６３）、細胞内シグナル伝達部分４－１ＢＢ（Ｇｅｎ ＴＮＦＲＳＦ９ ＥＮＳＧ００００００４９２４９）、およびＣＤ３ゼータ（Ｇｅｎ ＣＤ２４７ ＥＮＳＧ０００００１９８８２１）を有するＣＤ１２３特異的ＣＡＲを生成した。特異的殺傷は、実施例に記載されているように、フローサイトメトリーによって生存細胞の数を判定することによって測定することができる。特異的殺傷を、示された式、（１－ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養した生存標的細胞数／対照細胞と共培養した生存標的細胞数）＊１００に従って計算した。
【0058】
組換え抗原結合領域を発現するように免疫細胞を遺伝子改変することができる方法は、当技術分野で周知である。抗原受容体をコードする核酸分子は、例えばベクター、または任意の他の適切な核酸構築物の形態で、細胞に導入され得る。ベクターおよびそれらの必要な成分は、当技術分野で周知である。抗原結合領域をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の任意の方法、例えばＰＣＲを用いた分子クローニングを用いて生成することができる。抗原結合領域配列は、部位特異的突然変異誘発などの一般的に使用される方法を使用して改変することができる。
【0059】
抗ＣＤ１２３剤
抗ＣＤ１２３剤は当技術分野で公知である。例えば、タラコツズマブ（ＣＳＬ３６２）は、ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄのヒト化抗ＣＤ１２３抗体であり、フロテツズマブは、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ（Ｕｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １３７：７５１－６２）によって開発された二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。抗ＣＤ１２３／抗ＣＡＲ－Ｔは、Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈによって開発されている。ＭＢ－１０２、抗ＣＤ１２３／抗ＣＤ２８共刺激細胞剤は、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｂｉｏによって開発されている。ＩＭＧ－５３２は、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎによって開発された抗ＣＤ１２３－ＡＤＣである。ＵＣＡＲＴ－１２３は、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓによって開発された抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔである。Ｖｉｂｅｃｏｔａｍａｂは、Ｘｅｎｃｏｒによって開発された抗ＣＤ１２３／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。ＧｅＭｏａＢ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（ＪＥＺ－５６７）、Ｈｒａｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＨＲＡＩＮ－００４）、およびＨｅｂｅｉ Ｓｅｎｌａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのものを含む他の抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔも開発中である。開発中の二重特異性分子には、Ａｐｔｅｖｏ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＡＰＶＯ－４３６およびＪｏｈｎｓｏｎ＆ＪｏｈｎｓｏｎのＪＮＪ－６３７０９１７８が含まれる。これらの分子はすべて、本開示による細胞表面タンパク質の２つのアイソフォームを区別することができる限り、主に本開示の方法および組成物に使用することができる。
抗ＣＤ１２３剤は当技術分野で公知である。例えば、タラコツズマブ（ＣＳＬ３６２）は、ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄのヒト化抗ＣＤ１２３抗体であり、フロテツズマブは、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ（Ｕｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １３７：７５１－６２）によって開発された二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。抗ＣＤ１２３／抗ＣＡＲ－Ｔは、Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈによって開発されている。ＭＢ－１０２、抗ＣＤ１２３／抗ＣＤ２８共刺激細胞剤は、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｂｉｏによって開発されている。ＩＭＧ－５３２は、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎによって開発された抗ＣＤ１２３－ＡＤＣである。ＵＣＡＲＴ－１２３は、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓによって開発された抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔである。Ｖｉｂｅｃｏｔａｍａｂは、Ｘｅｎｃｏｒによって開発された抗ＣＤ１２３／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。ＧｅＭｏａＢ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（ＪＥＺ－５６７）、Ｈｒａｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＨＲＡＩＮ－００４）、およびＨｅｂｅｉ Ｓｅｎｌａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのものを含む他の抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔも開発中である。開発中の二重特異性分子には、Ａｐｔｅｖｏ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＡＰＶＯ－４３６およびＪｏｈｎｓｏｎ＆ＪｏｈｎｓｏｎのＪＮＪ－６３７０９１７８が含まれる。これらの分子はすべて、本開示による細胞表面タンパク質の２つのアイソフォームを区別することができる限り、主に本開示の方法および組成物に使用することができる。
【0060】
タラコツズマブ（ＣＳＬ３６２）、フロテツズマブおよびビベコタマブは、同じ親抗体の誘導体であり、それらのＣＤＲは９８から１００％の配列同一性を有する。したがって、ＣＳＬ３６２のエピトープを知ることにより、フロテツズマブおよびビベコタマブが同一のエピトープに結合すると仮定することができる。
【0061】
特定の実施形態では、前記表面タンパク質がＣＤ１２３である場合、上記のように前記第２のアイソフォームに結合し、前記第１のアイソフォームに結合しない前記枯渇剤は、配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むエピトープに特異的に結合する。
【0062】
好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、以下を含む抗原結合領域を含む。
ａ）３つのＣＤＲ ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ＶＨＣＤＲ１は配列番号２（ＤＹＹＭＫ）であり、ＶＨＣＤＲ２は配列番号３（ＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧ）であり、ＶＨＣＤＲ３は配列番号４（ＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹ）である、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５（ＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）または配列番号６（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬ）であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７（ＷＡＳＴＲＥＳ）であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８（ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ）である。
ａ）３つのＣＤＲ ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ＶＨＣＤＲ１は配列番号２（ＤＹＹＭＫ）であり、ＶＨＣＤＲ２は配列番号３（ＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧ）であり、ＶＨＣＤＲ３は配列番号４（ＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹ）である、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５（ＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）または配列番号６（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬ）であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７（ＷＡＳＴＲＥＳ）であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８（ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ）である。
【0063】
抗原結合領域は、上で定義されたそれらの結合特性についてさらにスクリーニングまたは最適化され得ることがさらに企図される。特に、その前記抗原結合領域は、本明細書において提供されるモノクローナル抗体の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲ、特に配列番号３から８のアミノ酸配列において１、２、３、４、５、６またはそれを超える変化を有し得ることが企図される。抗原結合領域の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のＶＪ領域またはＶＤＪ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５、またはＣＤＲ６の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位または１０位のアミノ酸は、保存アミノ酸または非保存アミノ酸による挿入、欠失または置換を有し得ることが企図される。置換され得るかまたは置換を構成し得るそのようなアミノ酸は、上に開示されている。
【0064】
いくつかの実施形態では、アミノ酸の相違は、保存的置換、すなわち、類似の化学的または物理的特性（サイズ、電荷、または極性）を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換であり、この置換は、一般に、抗体の生化学的、生物物理学的、および／または生物学的特性に悪影響を及ぼさない。特に、置換は、抗体とＣＤ１２３抗原との相互作用を破壊しない。前記保存的置換は、有利には、以下の５つの群、第１群－小脂肪性、非極性またはわずかに極性の残基（Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ）、第２群－極性、負に荷電した残基、およびそれらのアミド（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、第３群－極性、正に荷電した残基（Ｈ、Ｒ、Ｋ）、第４群－大脂肪、非極性残基（Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ）、および第５群－大きな、芳香族残基（Ｆ、Ｙ、Ｗ）の中で選択される。
【0065】
別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、抗原結合領域と同じエピトープに結合する抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、以下を含む。
ａ）３つのＣＤＲ ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ＶＨＣＤＲ１は配列番号２（ＤＹＹＭＫ）であり、ＶＨＣＤＲ２は配列番号３（ＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧ）であり、ＶＨＣＤＲ３は配列番号４（ＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹ）である、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５（ＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）または配列番号６（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬ）であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７（ＷＡＳＴＲＥＳ）であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８（ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ）である。
ａ）３つのＣＤＲ ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ＶＨＣＤＲ１は配列番号２（ＤＹＹＭＫ）であり、ＶＨＣＤＲ２は配列番号３（ＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧ）であり、ＶＨＣＤＲ３は配列番号４（ＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹ）である、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５（ＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）または配列番号６（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬ）であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７（ＷＡＳＴＲＥＳ）であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８（ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ）である。
【0066】
別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、抗原結合領域と同じエピトープ特異性を有する抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、以下を含む。
ａ）３つのＣＤＲ ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ＶＨＣＤＲ１は配列番号２（ＤＹＹＭＫ）であり、ＶＨＣＤＲ２は配列番号３（ＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧ）であり、ＶＨＣＤＲ３は配列番号４（ＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹ）である、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５（ＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）または配列番号６（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬ）であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７（ＷＡＳＴＲＥＳ）であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８（ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ）である。
ａ）３つのＣＤＲ ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ＶＨＣＤＲ１は配列番号２（ＤＹＹＭＫ）であり、ＶＨＣＤＲ２は配列番号３（ＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧ）であり、ＶＨＣＤＲ３は配列番号４（ＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹ）である、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５（ＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）または配列番号６（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬ）であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７（ＷＡＳＴＲＥＳ）であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８（ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ）である。
【0067】
別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、抗原結合領域と免疫学的に区別できない抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、以下を含む。
ａ）３つのＣＤＲ ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ＶＨＣＤＲ１は配列番号２（ＤＹＹＭＫ）であり、ＶＨＣＤＲ２は配列番号３（ＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧ）であり、ＶＨＣＤＲ３は配列番号４（ＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹ）である、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５（ＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）または配列番号６（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬ）であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７（ＷＡＳＴＲＥＳ）であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８（ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ）である。
ａ）３つのＣＤＲ ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ＶＨＣＤＲ１は配列番号２（ＤＹＹＭＫ）であり、ＶＨＣＤＲ２は配列番号３（ＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧ）であり、ＶＨＣＤＲ３は配列番号４（ＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹ）である、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５（ＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）または配列番号６（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬ）であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７（ＷＡＳＴＲＥＳ）であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８（ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ）である。
【0068】
より特定の実施形態では、前記第１の抗原結合領域が、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む。
【0069】
別の特定の実施形態では、前記第１の抗原結合領域が、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる抗原結合領域と同じエピトープに結合する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む。
【0070】
別の特定の実施形態では、前記第１の抗原結合領域が、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる抗原結合領域および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインと同じエピトープ特異性を有する。
【0071】
別の特定の実施形態では、前記第１の抗原結合領域が、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる抗原結合領域および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインと免疫学的に区別できない。
【0072】
上で定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するその前記第１の抗原結合領域はまた、本開示の一部であり、典型的には、第１の抗原結合領域は、配列番号９、１１、および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つからなる重鎖と、配列番号１０、１２、および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つからなる軽鎖とからなる前記第１の抗原結合領域と少なくとも同等またはそれより高次の結合活性を有する。
【0073】
特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、ＣＤ１２３に対する少なくとも１つの第１の結合特異性、例えば本明細書に記載の抗ＣＤ１２３の１つの抗原結合領域、および第２の標的エピトープまたは標的抗原に対する第２の結合特異性を含む二重特異性ＣＤ１２３抗体であり得る。特に、前記二重特異性抗体は、Ｋｕｏ Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２０１２；２５：５６１－５６９，１３７；Ｈｕｓｓａｉｎｉ Ｍ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２：３６０．；Ｃｈｉｃｉｌｉ Ｇ．Ｒ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１５；７：２８９ｒａ８２ ａｎｄ Ａｌ－Ｈｕｓｓａｉｎｉ Ｍ．Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２７：１２２－１３１）に記載されているように、二官能性融合抗ＣＤ１２３および抗ＣＤ３である。
【0074】
本開示によれば、前記抗ＣＤ１２３剤は、ＣＤ１２３標的抗原受容体、例えばＣＤ１２３標的ＣＡＲを有する免疫細胞であり得、前記抗原受容体は上記の抗原結合領域を含む。
【0075】
特定の実施形態では、ＣＤ１２３標的ＣＡＲを有する前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、それを必要とする患者において発現されるＣＤ１２３の第２のアイソフォームを認識し、ＣＤ１２３の第１のアイソフォームを認識しない。特に、前記免疫細胞は、配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むエピトープに特異的に結合し得る。
【0076】
特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、ＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、前記ＣＡＲは、抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含み、抗原結合領域は以下を含む。
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である。
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である。
【0077】
別の特定の実施形態において、前記抗ＣＤ１２３剤は、ＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、前記ＣＡＲは、抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含み、それは、抗原結合領域と同じエピトープに結合する抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、以下を含む。
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である。
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である。
【0078】
別の特定の実施形態において、前記抗ＣＤ１２３剤は、ＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、前記ＣＡＲは、抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含み、それは、抗原結合領域と同じエピトープ特異性を有し、抗原結合領域は、以下を含む。
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である。
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である。
【0079】
別の特定の実施形態において、前記抗ＣＤ１２３剤は、ＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、前記ＣＡＲは、抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含み、それは、以下を含む抗原結合領域と免疫学的に区別できない抗原結合領域であり、
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である。
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である。
【0080】
より特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、前記第１の抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、それは、配列番号９、１１、および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および、１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む。
【0081】
別の特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、前記第１の抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、それは、配列番号９、１１、および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および、１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域と同じエピトープに結合する。
【0082】
別の特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、前記第１の抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、それは、配列番号９、１１、および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および、１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域と同じエピトープ特異性を有する。
【0083】
別の特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、前記第１の抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、それは、配列番号９、１１、および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および、１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域として含む抗原結合領域と免疫学的に区別できない。
【0084】
好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、実施例に記載のＣＤ１２３の特異的アイソフォームを標的とするＣＡＲを有する免疫細胞であり得、典型的には、前記抗ＣＤ１２３ ＣＡＲは、ヒンジドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、およびＣＤ３分子のゼータ鎖からの細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに共刺激ドメイン４－１ＢＢを含み、好ましくは、前記抗ＣＤ１２３ ＣＡＲは、配列番号１５を含むかまたはこれからなる。
【0085】
本開示によれば、前記抗ＣＤ１２３剤は、ＣＤ１２３を標的とする抗原受容体、例えばＣＤ１２３の特異的アイソフォームを標的とするＣＡＲを有する免疫細胞であり得、前記抗原受容体は上記の抗原結合領域を含み、前記免疫細胞はＣＤ１２３を発現しないか、または前記ＣＡＲによって認識されないＣＤ１２３のアイソフォームを発現する。
【0086】
特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、ＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、ＣＤ１２３の特異的アイソフォームを標的とするＣＡＲは、ｓｃＦｖなどの抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、以下を含む。
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は、配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は、配列番号８である、
また、前記免疫細胞は、ＣＤ１２３を発現しないか、または前記ＣＡＲによって認識されないＣＤ１２３のアイソフォームを発現するかのいずれかである。
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は、配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は、配列番号８である、
また、前記免疫細胞は、ＣＤ１２３を発現しないか、または前記ＣＡＲによって認識されないＣＤ１２３のアイソフォームを発現するかのいずれかである。
【0087】
より特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、前記第１の抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、それは、配列番号９、１１、および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および、１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含み、前記免疫細胞は、前記ＣＡＲによって認識されないＣＤ１２３のアイソフォームを発現する。
【0088】
より好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、実施例に記載のようにＣＳＬ３６２抗体である。
【0089】
別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、実施例に記載のようにＭＩＲＧ１２３抗体である。
【0090】
別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、実施例に記載のＣＤ１２３の特異的アイソフォームを標的とするＣＡＲを有する免疫細胞であり得、典型的には、前記抗ＣＤ１２３ ＣＡＲは、ヒンジドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、およびＣＤ３分子のゼータ鎖からの細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに共刺激ドメイン４－１ＢＢを含み、好ましくは、前記抗ＣＤ１２３ ＣＡＲは、配列番号１５を含むかまたはこれからなる。
【0091】
特に、本開示はまた、それを必要とする対象において、宿主細胞または移入細胞をそれぞれ選択的に枯渇させるのに使用するための第１または第２の抗原結合領域を含む上記の抗ＣＤ１２３剤（例えば、ＣＡＲ細胞組成物または抗体）を枯渇させることに関する。
【0092】
表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞または細胞の集団
本開示は、哺乳動物細胞、好ましくは造血細胞、または表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞の集団に関し、前記細胞または細胞の集団は、前記第１のアイソフォームをコードする核酸において少なくとも１つの多型対立遺伝子を含む細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現し、前記第１のアイソフォームは、本明細書に記載の第１の抗原結合領域を含む枯渇剤によって認識されない。
本開示は、哺乳動物細胞、好ましくは造血細胞、または表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞の集団に関し、前記細胞または細胞の集団は、前記第１のアイソフォームをコードする核酸において少なくとも１つの多型対立遺伝子を含む細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現し、前記第１のアイソフォームは、本明細書に記載の第１の抗原結合領域を含む枯渇剤によって認識されない。
【0093】
前記細胞または細胞の集団は、前記細胞表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する患者における医学的治療に特に有用である。
【0094】
特定の実施形態において、枯渇剤（例えば造血細胞）によって認識されない前記第１のアイソフォームをコードするかまたは発現する前記細胞（例えば造血幹細胞）は、免疫療法後に正常な造血を回復させるための医学的治療、例えば、前記第２のアイソフォームを発現する患者における養子細胞移入において特に有用であり、具体的には、前記治療は、前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記造血細胞を、前記第２のアイソフォームを標的化する治療有効量の枯渇剤と組み合わせて投与することを含む。特に、前記造血細胞、好ましくは造血幹細胞は、前記枯渇剤に続いて投与される。別の特定の実施形態において、前記造血細胞、好ましくは造血幹細胞は、前記枯渇剤の前に、または前記枯渇剤と同時に投与され得る。
【0095】
別の特定の実施形態において、第２のアイソフォームに結合しない枯渇剤によって特異的に認識される前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞は、前記第２のアイソフォームを発現する患者における医学的治療において、特に、移植される細胞に関連する重篤な副作用を回避するために（安全スイッチ）特に有用であり、前記治療は、前記第１のアイソフォームを標的とする治療有効量の枯渇剤を投与することを含む。特に、前記造血細胞、好ましくはＣＡＲを有する免疫細胞は、前記枯渇剤の前に投与される。
【0096】
本明細書で使用される場合、細胞という用語は、哺乳動物の細胞、好ましくはヒトの細胞に関する。
【0097】
特定の実施形態では、前記細胞は造血細胞である。造血細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球などの骨髄細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、顆粒球、樹状細胞（ＤＣ）および板状樹状細胞（ｐＤＣ）を含む免疫細胞を含む。
【0098】
好ましい実施形態では、前記免疫細胞はＴ細胞である。別の好ましい実施形態では、前記免疫細胞は初代Ｔ細胞である。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する細胞、またはＴＣＲを有するＴ細胞に由来する細胞を含む。本開示によるＴ細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球、または１型および２型ヘルパーＴ細胞とＴｈ１７ヘルパー細胞の両方を含むヘルパーＴリンパ球からなる群から選択することができる。別の実施形態では、前記細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球または非古典的Ｔ細胞、例えばＭＲ１拘束性Ｔ細胞、ＭＡＩＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、または自然免疫様Ｔ細胞からなる群に由来し得る。
【0099】
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む複数の非限定的な供給源から得ることができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液の単位から得ることができる。あるいは、Ｔ細胞をｉＰＳ細胞から分化させることができる。
【0100】
別の好ましい実施形態では、前記造血細胞は造血幹細胞である。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト幹細胞はＣＤ３４＋細胞である。造血幹細胞は、ｉＰＳ細胞から分化され得るか、または動員されたもしくは動員されていない末梢血から採取され得る。
【0101】
特定の実施形態では、細胞は、同種異系細胞であり、これは、あるＨＬＡについて細胞を投与されている人と少なくとも類似する、類似するＨＬＡを提示するドナーに由来する細胞を指す。ドナーは、血縁者であっても非血縁者であってもよい。特定の実施形態では、細胞は、細胞を投与されている同じ人に由来する細胞を指す自己細胞である。
【0102】
前記細胞は、健常なドナーまたは患者、特にがんまたは自己免疫疾患と診断された患者または感染症と診断された患者に由来し得る。造血細胞は、血液から抽出され得るか、または幹細胞に由来し得る。
【0103】
当業者は、移植される患者または対象に応じてより適切な細胞を選択されよう。
【0104】
本開示はさらに、本明細書に開示される治療に使用するための細胞または細胞の集団の組成物に関する。
【0105】
表面タンパク質
本開示によれば、前記細胞は表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する。本開示による表面タンパク質は、細胞膜に付着したタンパク質である。前記表面タンパク質は、本明細書では細胞表面抗原とも呼ばれる。特に、造血細胞では、前記表面タンパク質は、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ７、ＣＤ１１７、ＣＤ４５、ＣＤ１３５、ＣＬＥＣ１２ａ、ＣＤ４４、およびＣＤ７０からなる群から選択される細胞表面マーカーであり得る。
本開示によれば、前記細胞は表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する。本開示による表面タンパク質は、細胞膜に付着したタンパク質である。前記表面タンパク質は、本明細書では細胞表面抗原とも呼ばれる。特に、造血細胞では、前記表面タンパク質は、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ７、ＣＤ１１７、ＣＤ４５、ＣＤ１３５、ＣＬＥＣ１２ａ、ＣＤ４４、およびＣＤ７０からなる群から選択される細胞表面マーカーであり得る。
【0106】
特定の実施形態では、前記表面タンパク質は、インターロイキン－３受容体アルファサブユニット（ＩＬ３ＲＡ）遺伝子（遺伝子ＩＤ：３５６３）によってコードされるＣＤ１２３である。ＩＬ３ＲＡは、インターロイキン３（ＩＬ３）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２／ＧＭ－ＣＳＦ）およびインターロイキン５（ＩＬ５）の受容体によって共有されるリガンド特異的アルファサブユニットおよびシグナル伝達ベータサブユニットから構成されるヘテロ二量体サイトカイン受容体の特異的サブユニットである。ＩＬ－３は、赤血球、骨髄およびリンパ系統の細胞への造血前駆細胞の発生を促進する多能性サイトカインである。ＩＬ３ＲＡ １型（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００２１７４．１，１０－Ｊａｎ－２０２１）（配列番号１）および２型（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ－００１２５４６４２．１，１０－Ｊａｎ－２０２１）の異なるタンパク質をコードするスプライシングされた転写変異体が見出されている。
【0107】
本開示に沿って、本開示の方法および組成物の中でＣＤ１２３のさらなる変異体またはアイソフォームを組み合わせることも可能である。そのようなアイソフォームは、例えば二重変異体を含み得る。そのようなアイソフォームは、例えば、単一変異体および二重変異体も含み得る。本開示の方法および組成物はまた、ＣＤ１２３ノックアウト、例えば永続的ノックアウトまたは一時的ノックアウト（例えばＣＲＩＳＰＲｏｆｆを介して）を有する細胞と組み合わせることができる。本開示の方法および組成物はまた、腫瘍の応答を増強するために、固形腫瘍における骨髄細胞の枯渇において使用され得る。
【0108】
本開示の方法および組成物はまた、特に前記表面タンパク質が、ＣＤ１２３と他の標的のＫＯ、すなわちＣＤ３３ ＫＯ、ＣＤ７ ＫＯ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ４４ ＫＯおよびそれらの組み合わせである場合、細胞の組み合わせと組み合わせることができる。
【0109】
本開示の方法および組成物はまた、ＣＤ１２３の第１のアイソフォーム（ＣＤ１２３変異体）、および他の表面タンパク質変異体、例えばＣＤ３３変異体、ＣＤ７変異体、およびそれらの任意の組み合わせを発現する細胞を含み得る。
【0110】
表面タンパク質アイソフォームの多型
本開示による表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞は、前記表面タンパク質をコードする核酸に、少なくとも１つの多型対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含む。特に、前記多型は、前記第２のアイソフォームと比較して、特定の薬剤の結合に関与する表面タンパク質領域における少なくとも１つの変異を誘導する。
本開示による表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞は、前記表面タンパク質をコードする核酸に、少なくとも１つの多型対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含む。特に、前記多型は、前記第２のアイソフォームと比較して、特定の薬剤の結合に関与する表面タンパク質領域における少なくとも１つの変異を誘導する。
【0111】
好ましい実施形態では、表面タンパク質の前記第１のアイソフォームは機能性のままであり、顕著な障害なしに、細胞内で対応する野生型アイソフォームと同じ機能を実行する能力を保持する。特に、ＣＤ１２３の前記第１のアイソフォームは、ＣＤ１２３の第２のアイソフォームの特性と同様の以下の特性の１つまたは複数を有する
－細胞表面での発現、
－保持される構造、
－ＩＬ－３結合、
－実験のパートに記載の機能アッセイで測定しているような、細胞内シグナル伝達能力（例えば、ＳＴＡＴ５リン酸化／シグナル伝達）、ＩＬ－３に応答した細胞株の細胞の増殖の誘導、ヒト化マウスにおける複数の系統／細胞型への分化、ヒト化マウスから単離したｐＤＣのｐＤＣ機能。
－細胞表面での発現、
－保持される構造、
－ＩＬ－３結合、
－実験のパートに記載の機能アッセイで測定しているような、細胞内シグナル伝達能力（例えば、ＳＴＡＴ５リン酸化／シグナル伝達）、ＩＬ－３に応答した細胞株の細胞の増殖の誘導、ヒト化マウスにおける複数の系統／細胞型への分化、ヒト化マウスから単離したｐＤＣのｐＤＣ機能。
【0112】
ＣＤ１２３の前記第１のアイソフォームは、ＣＤ１２３の第２のアイソフォームのものと同様の造血幹細胞生着能力または編集された造血幹細胞コロニー形成能力を有することができる。より詳細には、ＴＦ－１細胞の増殖はＩＬ－３によって誘導することができ、このＩＬ－３依存的な増殖の誘導は、ＣＳＬ３６２またはＭＩＲＧ１２３によって阻止される。ＨＤＲなどの適切な遺伝子編集方法によってＣＤ１２３変異体アイソフォームをＴＦ－１細胞に導入することにより、各ＣＤ１２３変異体アイソフォームを用いてＴＦ－１細胞の増殖速度を決定し、それを野生型ＴＦ－１細胞のＩＬ－３依存的増殖と直接比較することが可能になる。野生型ＣＤ１２３と等しい増殖速度をもたらすＣＤ１２３変異体アイソフォームは、機能的に等価であると見なされる。
【0113】
特に、表面タンパク質がＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）である場合、ＣＤ１２３の第１のアイソフォームは機能的なままであり、抗原活性化Ｔ細胞によって産生されるサイトカインであるＩＬ－３によって活性化され、ＩＬ－３シグナル伝達を誘導することができる。
【0114】
前記多型は、好ましくは、第１の薬剤の結合に関与する表面タンパク質領域をコードする核酸配列内部にあり、好ましくは前記表面タンパク質の細胞外部分、特に溶媒露出二次構造要素に位置する。より詳細には、前記多型は、第１の薬剤の結合に関与する少なくとも１つの特定のアミノ酸残基をコードする核酸配列内部にある。前記多型は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５または２０ヌクレオチドの欠失、置換、および／または挿入などの突然変異であり得る。特定の実施形態では、前記多型は一塩基多型である。
【0115】
２つのアイソフォームの配列の相違はまた、遺伝的に導入され得る。また、ここで、配列の相違は、好ましくは、第１の薬剤の結合に関与する表面タンパク質領域をコードする核酸配列内部にあり、好ましくは前記表面タンパク質の細胞外部分、特に溶媒露出二次構造要素に位置する。より詳細には、前記配列の相違は、第１の薬剤の結合に関与する少なくとも１つの特定のアミノ酸残基をコードする核酸配列内部にある。前記相違は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５または２０ヌクレオチドの欠失、置換、および／または挿入などの突然変異であり得る。特定の実施形態では、前記配列の相違は単一点の変異である。
【0116】
本発明者らは、上記のように抗ＣＤ１２３剤の結合に関与するアミノ酸残基をコードする核酸配列における天然の多型、特にＣＤ１２３の配列（配列番号１）に対する残基Ｅ５１、Ｓ５９またはＲ８４、好ましくはＥ５１またはＳ５９の置換を誘導する多型を同定した。したがって、本開示は、ＣＤ１２３のアイソフォームを発現する細胞に関し、前記アイソフォームは、ＣＤ１２３（配列番号１）のＥ５１、Ｓ５９およびＲ８４、好ましくはＥ５１またはＳ５９から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に置換を有する。
【0117】
天然の多型
特定の実施形態では、本開示による前記細胞は、前記アイソフォームをコードする核酸において、少なくとも１つの天然多型対立遺伝子、好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）を有する天然ゲノムＤＮＡを含む対象から選択される。
特定の実施形態では、本開示による前記細胞は、前記アイソフォームをコードする核酸において、少なくとも１つの天然多型対立遺伝子、好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）を有する天然ゲノムＤＮＡを含む対象から選択される。
【0118】
特定の実施形態では、表面タンパク質がＣＤ１２３である場合、細胞は、好ましくは前記表面タンパク質の細胞外部分、より好ましくは溶媒露出二次構造要素に位置する、抗ＣＤ１２３剤結合に関与するＣＤ１２３領域をコードする核酸配列において、少なくとも１つの天然多型対立遺伝子、特にＳＮＰを有する天然ゲノムＤＮＡを含む対象から選択される。より具体的には、前記多型対立遺伝子は、配列番号１の残基Ｅ５１、Ｓ５９および／またはＲ８４、好ましくは配列番号１のＥ５１またはＳ５９をコードする核酸配列の内部にある。特に、前記多型対立遺伝子は、配列番号１のＥ５１、Ｓ５９および／またはＲ８４位、好ましくは配列番号１のＥ５１またはＳ５９から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を引き起こす。好ましくは、アミノ酸残基Ｅ５１は、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｒ、Ｍ、ＧおよびＡからなる群、好ましくはＫまたはＴから選択されるアミノ酸で置換される。また好ましくは、アミノ酸残基Ｓ５９は、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｔ、Ｋ、Ｆ、ＲおよびＹからなる群、好ましくはＰまたはＥから選択されるアミノ酸によって置換されている。また好ましくは、アミノ酸残基Ｒ８４は、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、ＬおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸によって置換される。
【0119】
遺伝子編集方法
別の特定の実施形態では、本開示による第１のアイソフォームを発現する前記細胞は、遺伝子編集によって、好ましくは患者の天然ゲノムＤＮＡの前記表面タンパク質をコードする配列を変更することによって、得られる。
別の特定の実施形態では、本開示による第１のアイソフォームを発現する前記細胞は、遺伝子編集によって、好ましくは患者の天然ゲノムＤＮＡの前記表面タンパク質をコードする配列を変更することによって、得られる。
【0120】
細胞は、表面タンパク質のアミノ酸の挿入、欠失および／または置換をもたらす前記多型を誘導する遺伝子編集酵素を細胞に導入することによって、遺伝子操作することができる。前記遺伝子編集酵素は、本明細書では上記の第１の薬剤結合に関与する表面タンパク質領域をコードする標的配列と呼ばれる核酸配列を標的とする。特に、前記表面タンパク質がＣＤ１２３である場合、前記遺伝子編集酵素は、好ましくは配列番号１の位置Ｅ５１、Ｓ５９および／またはＲ８４の少なくとも１つの残基が置換されるように、配列番号１のＥ５１、Ｓ５９および／またはＲ８４位の少なくとも１つの残基をコードする核酸を標的とする。好ましくは、アミノ残基Ｅ５１は、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｒ、Ｍ、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＫまたはＴによって置換されている。また、好ましくは、アミノ酸残基Ｓ５９は、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｔ、Ｋ、Ｆ、ＲおよびＹからなる群、好ましくはＰまたはＥから選択されるアミノ酸によって置換されている。また好ましくは、アミノ酸残基Ｒ８４は、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、ＬおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸によって置換される。
【0121】
遺伝子編集酵素は、配列特異的ヌクレアーゼ、塩基またはプライムエディタであり得る。
【0122】
「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子、好ましくはＤＮＡ分子のヌクレオチド間のホスホジエステル結合の加水分解（切断）を触媒することができる野生型または変異型酵素を指す。「切断」とは、二本鎖切断または一本鎖切断事象を意味する。
【0123】
「配列特異的ヌクレアーゼ」という用語は、配列特異的に核酸を切断するヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼ、ＴＡＬヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または集まって規則的に間を空けて配置された短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ系およびアルゴノートのようなＲＮＡ／ＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼなど、異なるタイプの部位特異的ヌクレアーゼを使用することができる（Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，５，２０２０；Ｇｕｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１７，１５，１４６－１６０）。
【0124】
本開示によれば、ヌクレアーゼは、標的配列内にＤＮＡ切断を生じさせ、前記標的配列は、上記のように第１の薬剤結合に関与する表面タンパク質領域をコードする。特定の実施形態では、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲのシステムを使用して、上記のように第１の薬剤によって認識される表面タンパク質領域をコードする標的配列内で切断を誘導する。
【0125】
「標的配列」とは、上記のように記載した第１の薬剤結合に関与する表面タンパク質領域をコードする配列の一部および／または第１の薬剤結合に関与する前記表面タンパク質領域に隣接する配列、特に第１の薬剤結合に関与する前記表面タンパク質領域に隣接する最大５０ヌクレオチド、好ましくは前記リプレッサー結合部位に隣接する２０、１５、１０、９、８、７、６または５ヌクレオチドの少なくとも１つ（１つまたは２つ）の配列を標的とすることを意図する。
【0126】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、２つ以上の成分、Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）および単一ガイドＲＮＡを含む。Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡ配列をガイドとして使用して、単一ガイドＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡの二本鎖の切断を認識および生成するＤＮＡエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓタンパク質は、２つの活性切断部位、すなわちＨＮＨヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。
【0127】
Ｃａｓタンパク質はまた、標的核酸配列を切断することができるＣａｓ９の操作されたエンドヌクレアーゼまたはホモログを意味する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、二本鎖切断または一本鎖切断のいずれかに対応し得る核酸標的配列の切断を誘導し得る。Ｃａｓタンパク質変異体は、天然には存在せず、タンパク質のエンジニアリングまたはランダムな突然変異誘発によって得られるＣａｓエンドヌクレアーゼであり得る。Ｃａｓタンパク質は、当技術分野で公知のＣａｓタンパク質の１つのタイプであり得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘｌ２としても知られる）、ＣａｓｌＯ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｎｒｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、ＣｓｘＭ、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、そのホモログ、オルソログ、またはそれらの改変型が挙げられる。好ましくは、Ｃａｓタンパク質は化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質である。
【0128】
Ｃａｓを、標的配列の相補的な配列を含むように設計されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させて、前記標的配列内、特に本開示によれば、上記の薬剤によって認識される表面タンパク質領域をコードする標的配列の一部の相補配列のＤＮＡ切断を特異的に誘導する。
【0129】
本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」または「単一ガイドＲＮＡ」は、標的核酸へのｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体の特異的標的化またはホーミングを促進する核酸を指す。
【0130】
特に、ｇＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡを含むＲＮＡを指す。好ましくは、前記ガイドＲＮＡは、別々に使用され得るかまたは一緒に融合され得るｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに対応する。標的配列との相補的な配列対合は、Ｃａｓを動員して、標的配列においてＤＮＡに結合して切断する。
【0131】
本開示によれば、ｃｒＲＮＡは、薬剤によって認識される表面タンパク質領域を標的化することができるように、薬剤によって認識される表面タンパク質領域をコードする上記の標的配列の一部に相補的な配列を含むように操作される。
【0132】
特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、標的配列に相補的な５～５０ヌクレオチド、好ましくは１５～３０ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの配列を含む。本明細書で使用される場合、「相補配列」という用語は、標準的で低ストリンジェントな条件下でポリヌクレオチドの別の部分にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド（例えばｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃＲＮＡの一部）の配列部分を指す。好ましくは、配列は、鎖間のワトソン－クリック塩基対合、すなわちアデニン・チミン（Ａ－Ｔ）ヌクレオチドとグアニン・シトシン（Ｇ－Ｃ）ヌクレオチドとの間の固有の塩基対合に依存する２つの核酸鎖間の相補性に従って、互いに相補的である。前記ｇＲＮＡは、本開示を考慮して当業者に公知の任意の方法によって設計することができる。
【0133】
本開示によれば、前記標的配列は、第１の薬剤結合に関与する表面タンパク質領域をコードし、好ましくは前記表面タンパク質の細胞外部分に位置し、より好ましくは前記第２のアイソフォームと比較して細胞外ループに位置し、やはりより好ましくは、薬剤の結合に関与するアミノ酸残基を含む。
【0134】
好ましい実施形態では、表面タンパク質がＣＤ１２３である場合、前記標的配列は、上に開示されるような抗ＣＤ１２３剤結合などの第１の薬剤の結合に関与するＣＤ１２３領域をコードする。好ましくは、前記標的配列は、配列番号１のＥ５１、Ｓ５９および／またはＲ８４、好ましくは配列番号１のＥ５１またはＳ５９位の少なくとも１つの残基をコードする。
【0135】
特定の実施形態では、前記ｇＲＮＡは、第１の薬剤の結合に関与するＣＤ１２３領域をコードする配列を標的とし、特に表１に記載の配列の１つ（ｇＲＮＡ配列）を含み得る。
【表1】
【0136】
換言すれば、表面タンパク質がＣＤ１２３である場合、前記核酸構築物は、好ましくは、以下を含み得る。
配列番号１に対して置換Ｅ５１Ｋをコードする配列を標的とする、配列番号１６または１７のｇＲＮＡ配列、
－配列番号１に対して置換Ｓ５９Ｐをコードする配列を標的とする、配列番号１８から２０からなる群から選択されるｇＲＮＡ配列、または
－配列番号１に対して置換Ｒ８４Ｅをコードする配列を標的とする、配列番号２１から２３からなる群から選択されるｇＲＮＡ配列。
配列番号１に対して置換Ｅ５１Ｋをコードする配列を標的とする、配列番号１６または１７のｇＲＮＡ配列、
－配列番号１に対して置換Ｓ５９Ｐをコードする配列を標的とする、配列番号１８から２０からなる群から選択されるｇＲＮＡ配列、または
－配列番号１に対して置換Ｒ８４Ｅをコードする配列を標的とする、配列番号２１から２３からなる群から選択されるｇＲＮＡ配列。
【0137】
本開示によるヌクレアーゼによって導入されるＤＮＡ鎖の切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介した切断部位でのＤＮＡの突然変異をもたらし得、これは頻繁に、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介した切断部位周囲のＤＮＡの小さな挿入および／または欠失または置換をもたらす。
【0138】
好ましい実施形態では、表面タンパク質アイソフォームをコードする核酸内部の前記多型は、ＤＮＡ切断後のＨＤＲ修復、および本明細書でＨＤＲ鋳型と呼ばれる外因性ヌクレオチド配列の導入を介して誘導される。
【0139】
ＨＤＲ鋳型は、標的配列の領域５’および３’にそれぞれ相同な配列の第１および第２の部分と、多型を含む外因性配列とを含む。標的配列の切断に続いて、標的配列を含有するゲノムとＨＤＲ鋳型との間で相同組換え事象が達成され、標的配列を含有するゲノム配列が外因性配列によって置き換えられる。
【0140】
好ましくは、少なくとも２０ｂｐ、好ましくは５０ｂｐ超、より好ましくは２００ｂｐ未満の相同配列が使用される。実際、共有するＤＮＡ相同性は、切断部位の上流および下流に隣接する領域に位置し、導入される外因性配列は、２つのアームの間に位置するはずである。
【0141】
好ましい実施形態では、本開示による細胞は、上記のような前記第１の薬剤によって認識される表面タンパク質領域をコードする配列およびＨＤＲ鋳型を標的とする前記部位特異的ヌクレアーゼを前記細胞に導入することによって遺伝子操作される。
【0142】
別の特定の実施形態では、前記遺伝子編集酵素は、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５３３，４２０－４２４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１７９４６、およびＲｅｅｓ ＨＡ，Ｌｉｕ ＤＲ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１８ Ｄｅｃ；１９（１２）：７７０－７８８に記載されているＤＮＡ塩基エディタであるか、またはＡｎｚａｌｏｎｅ ＡＶ．Ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１９，５７６：１４９－１５７，Ｍａｔｓｏｕｋａｓ ＩＧ．Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ．２０２０；１１：５２８ ａｎｄ Ｋａｎｔｏｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０２０，２１（６２４０）で説明されているプライムエディタである。塩基エディタまたはプライムエディタを使用して、標的配列の特定の部位に突然変異を導入することができる。
【0143】
本開示によれば、塩基エディタまたはプライムエディタは、第１の薬剤結合に関与する表面タンパク質領域をコードする配列の配列特異的標的化によって標的配列の内部に突然変異を生成する。
【0144】
特に、前記塩基エディタまたはプライムエディタは、ＣＲＩＳＰＲベースまたはプライムエディタである。前記ＣＲＩＳＰＲ塩基またはプライムエディタは、触媒的に不活性な配列特異的ヌクレアーゼとして、死んだＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）を含む。ｄＣａｓは、エンドヌクレアーゼ活性を欠く改変Ｃａｓヌクレアーゼを指す。ヌクレアーゼ活性は、Ｃａｓタンパク質のＨＮＨおよび／またはＲｕｖＣ様触媒ドメインにおける１つ以上の突然変異および／または１つ以上の欠失によって、ｄＣａｓタンパク質において阻害または防止され得る。得られたｄＣａｓタンパク質はヌクレアーゼ活性を欠くが、特異的標的配列に対して高い特異性および効率でガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）－ＤＮＡ複合体に結合する。特定の実施形態では、前記死んだＣａｓは、Ｃａｓの１つの触媒ドメインが阻害または防止されるＣａｓニッカーゼであり得る。
【0145】
前記塩基エディタを、標的核酸配列の相補的配列を含むように設計されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させて、上記のように前記標的配列に特異的に結合させる。
【0146】
前記ｇＲＮＡは、本開示を考慮して当業者に公知の任意の方法によって設計することができる。特定の実施形態では、前記ｇＲＮＡは、上記のように前記第１の薬剤によって認識される表面タンパク質領域をコードする配列を標的とすることができ、特に表面タンパク質がＣＤ１２３である場合、表１に記載の配列の１つ（ｇＲＮＡ配列）を含む。
【0147】
非限定的な例として、前記塩基エディタは、死んだＣａｓタンパク質、特にＣａｓニッカーゼに融合したヌクレオチドデアミナーゼドメインである。前記ヌクレオチドデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼであり得る。前記ヌクレオチドデアミナーゼは、天然または操作されたデアミナーゼであり得る。
【0148】
特定の実施形態では、前記塩基エディタは、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＢＥ４、ＨＦ－ＢＥ３、Ｓａ－ＢＥ３、Ｓａ－ＢＥ４、ＢＥ４－Ｇａｍ、ｓａＢＥ４－Ｇａｍ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＢＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＳａＫＫＨ－ＢＥ３、ｃａｓ１２ａ－ＢＥ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ－ＮＧ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、Ａ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＰＳ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＡＢＥｍａｘ、ＡＢＥ８ｅ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥおよびＳａＫＫＨ－ＡＢＥからなる群から選択される非限定的な例であってもよい。
【0149】
前記プライムエディタは、上記の触媒的に不活性な配列特異的ヌクレアーゼ、特にＣａｓニッカーゼと触媒的に活性な操作された逆転写酵素（ＲＴ）酵素との融合からなる。前記融合タンパク質は、特に表面タンパク質がＣＤ１２３である場合、上記の標的配列と相補的な配列を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）と併用して使用され、表１に記載の配列の１つと、ＤＮＡのプライマー結合部位領域に結合する配列も含む追加の配列を含む。特定の実施形態では、前記逆転写酵素は、マロニーマウス白血病ウイルスＲＴ酵素およびその変異体である。前記プライムエディタは、ＰＥ１、ＰＥ２、ＰＥ３およびＰＥ３ｂからなる群から選択される非限定的な例であり得る。
【0150】
ＣＡＲ
養子細胞移入療法に使用するために、本開示による第１のアイソフォームを発現する前記細胞を、所望の特異性および増強された機能性を示すように改変することができる。特に、細胞は、特定の標的に向けられるように改変され得る。特定の実施形態では、前記細胞は、上記のようにその細胞表面に抗原受容体とも呼ばれる組換え抗原結合領域を発現し得る。特定の実施形態では、前記組換え抗原受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。本開示によれば、細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームおよびＣＡＲを発現する前記免疫細胞は、前記表面タンパク質の前記第１のアイソフォームに特異的に結合するが第２のアイソフォームには結合しない第２の抗原結合領域を含む治療有効量の薬剤の投与によって特異的に枯渇させることができ、それにより、前記免疫細胞の移植に起因する最終的な重篤な副作用を回避する。
養子細胞移入療法に使用するために、本開示による第１のアイソフォームを発現する前記細胞を、所望の特異性および増強された機能性を示すように改変することができる。特に、細胞は、特定の標的に向けられるように改変され得る。特定の実施形態では、前記細胞は、上記のようにその細胞表面に抗原受容体とも呼ばれる組換え抗原結合領域を発現し得る。特定の実施形態では、前記組換え抗原受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。本開示によれば、細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームおよびＣＡＲを発現する前記免疫細胞は、前記表面タンパク質の前記第１のアイソフォームに特異的に結合するが第２のアイソフォームには結合しない第２の抗原結合領域を含む治療有効量の薬剤の投与によって特異的に枯渇させることができ、それにより、前記免疫細胞の移植に起因する最終的な重篤な副作用を回避する。
【0151】
特定の実施形態では、免疫細胞はがん抗原に対して再配向される。「がん抗原」とは、がんに関連する任意の抗原（すなわち、免疫応答を誘導することができる分子）を意味する。本明細書で定義される抗原は、免疫応答を誘導する任意の種類の分子であり得、例えば、多糖または脂質であり得るが、最も好ましくはペプチド（またはタンパク質）である。ヒトがん抗原は、ヒトまたはヒト由来であり得る。がん抗原は腫瘍特異的抗原であり得、これは健常な細胞には見られない抗原を意味する。腫瘍特異的抗原は、一般に、健康なヒトのプロテオームには見られない全く新しいアミノ酸配列を生成する突然変異、特にフレームシフト突然変異から生じる。
【0152】
がん抗原には、腫瘍関連抗原も含まれ、腫瘍関連抗原は、その発現または産生が腫瘍細胞に関連する（しかし、これに限定されない）抗原である。腫瘍関連抗原の例としては、例えばＨｅｒ２、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、がん抗原－１２５（ＣＡ－１２５）、ＣＡ１９－９、カルレチニン、ＭＵＣ－１、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９９、ＣＤｌ１７、ＣＤ１２３、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、総嚢胞性疾患液タンパク質（ＧＣＤＦＰ－１５）、ＨＭＢ－４５抗原、タンパク質メラン－Ａ（Ｔリンパ球によって認識されるメラノーマ抗原；ＭＡＲＴ－１）、ｍｙｏ－Ｄ１、筋特異的アクチン、神経線維、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシン、サイログロブリン、甲状腺転写因子－１、ピルビン酸キナーゼアイソエンザイムＭ２型（腫瘍Ｍ２－ＰＫ）の二量体形態、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＧＤ２（ガングリオシドＧ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮成長因子変異体ＩＩＩ）、精子タンパク質１７（Ｓｐｌ７）、メソテリン、ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、プロステイン、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体ガンマ鎖代替リーディングフレームタンパク質）、Ｔｒｐ－ｐ８、ＳＴＥＡＰ１（前立腺６膜貫通上皮抗原１）、異常なｒａｓタンパク質または異常なｐ５３タンパク質が挙げられる。別の特定の実施形態では、前記腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原は、インテグリンανβ３（ＣＤ６１）、ガラクチン、Ｋ－Ｒａｓ（Ｖ－Ｋｉ－ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスがん遺伝子）、またはＲａｌ－Ｂである。
【0153】
特定の実施形態では、養子細胞移入療法に使用するために、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などの悪性造血疾患の治療のために、本開示による免疫細胞は、ＣＤ１２３標的ＣＡＲなどの組換え抗原結合領域を発現する。第１のアイソフォームを発現し、ＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ－ＣＤ１２３）を発現する前記細胞は、ＣＤ１２３の第１のアイソフォームに特異的に結合するが、ＣＤ１２３の第２のアイソフォームには結合しない第２の抗原結合領域を含む枯渇剤を投与することによって、さらに特異的に枯渇され得、それにより、移植に起因する移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用が回避される。
【0154】
特定の実施形態では、第１のアイソフォームを発現する前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＤ１２３標的ＣＡＲを有し、前記ＣＡＲは、Ｎ末端ドメイン内、または配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むポリペプチド内に位置するＣＤ１２３のエピトープに特異的に結合する抗原結合領域を含む抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含む。
【0155】
特に、第１のアイソフォームを発現する前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＤ１２３標的ＣＡＲを有し、抗原結合領域は、以下を含み
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である、
より好ましくは、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域を含む。
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である、
より好ましくは、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域を含む。
【0156】
好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１２３剤は、実施例に記載のＣＤ１２３の特異的アイソフォームを標的とするＣＡＲを有する免疫細胞であり得、典型的には、前記抗ＣＤ１２３ ＣＡＲは、ヒンジドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、およびＣＤ３分子のゼータ鎖からの細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに共刺激ドメイン４－１ＢＢを含み、好ましくは、前記抗ＣＤ１２３ ＣＡＲは、配列番号１５を含むかまたはこれからなる。
【0157】
第１のアイソフォームを発現する細胞を調製するインビトロの方法
本開示による第１のアイソフォームを発現する細胞は、上記の遺伝子編集酵素および／またはＨＤＲ鋳型を含む少なくとも１つの遺伝子編集酵素またはリボ核タンパク質複合体をコードする核酸構築物（例えばｍＲＮＡ）を前記細胞に導入することによって、遺伝子操作することができる。前記細胞はまた、上記のＣＡＲをコードする核酸構築物を前記細胞にさらに導入することによって、遺伝子操作され得る。特に、前記方法は、細胞の培養物に対して行われるエクスビボな方法である。
本開示による第１のアイソフォームを発現する細胞は、上記の遺伝子編集酵素および／またはＨＤＲ鋳型を含む少なくとも１つの遺伝子編集酵素またはリボ核タンパク質複合体をコードする核酸構築物（例えばｍＲＮＡ）を前記細胞に導入することによって、遺伝子操作することができる。前記細胞はまた、上記のＣＡＲをコードする核酸構築物を前記細胞にさらに導入することによって、遺伝子操作され得る。特に、前記方法は、細胞の培養物に対して行われるエクスビボな方法である。
【0158】
本明細書で使用される「核酸構築物」という用語は、組換えＤＮＡ技術の使用から生じる人工の核酸分子を指す。核酸構築物は、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子であり、核酸配列のセグメントを含むように修飾されており、普通なら自然界に存在しない様式で組み合わされ、並置される。核酸構築物は、通常、「ベクター」、すなわち外因的に作製されたＤＮＡを宿主細胞に送達するために使用される核酸分子である。
【0159】
好ましくは、核酸構築物は、１つ以上の制御配列に作動可能に連結された前記遺伝子編集酵素、ＨＤＲ鋳型および／またはＣＡＲを含む。前記制御配列は、標的器官（すなわち、造血細胞）の細胞において機能的である遍在性、組織特異的または誘導性プロモーターであり得る。当技術分野で周知のそのような配列には、特にプロモーター、および導入遺伝子の発現をさらに制御することができるさらなる調節配列、例えば限定されないが、エンハンサー、ターミネーター、イントロン、サイレンサーが含まれる。
【0160】
上記のような核酸構築物は、発現ベクターに含まれていてもよい。ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであり得る。
【0161】
適切なベクターの例としては、組換え組込み型または非組込み型ウイルスベクター、および組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ベクターは組換え組込み型または非組込み型ウイルスベクターである。組換えウイルスベクターの例としては、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはウシパピローマウイルスに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0162】
本開示は、上記の遺伝子編集酵素および／またはＨＤＲ鋳型を含む遺伝子編集酵素またはリボ核タンパク質複合体をコードする核酸構築物（例えばｍＲＮＡ）を細胞に導入することによって、細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームを細胞において発現させる方法に関する。前記方法は、ＣＡＲをコードする核酸構築物を前記細胞に導入する工程をさらに含み得る。前記方法は、Ｃａｓタンパク質、塩基エディタまたはプライムエディタおよびガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮａ、または融合ガイドＲＮＡまたはｐｅｇＲＮＡ）などの遺伝子編集酵素を細胞に導入することを含む。特に、前記遺伝子編集酵素は、上記のＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ遺伝子編集酵素である。より特定の実施形態では、前記遺伝子編集酵素は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含む部位特異的ヌクレアーゼ、より好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、Ｃａｓタンパク質と併用した前記ガイドＲＮＡは、上記のように薬剤結合に関与する表面タンパク質領域をコードする核酸を含む前記標的配列内部で切断する、および切断を誘導する。
【0163】
好ましい実施形態では、前記核酸構築物は、枯渇剤への結合に関与する表面タンパク質領域をコードする核酸配列を標的化することができるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。表面タンパク質がＣＤ１２３である場合、前記核酸構築物は、好ましくは、以下を含む。
配列番号１に対して置換Ｅ５１Ｋをコードする配列を標的とする、配列番号１６または１７のｇＲＮＡ配列、
－配列番号１に対して置換Ｓ５９Ｐをコードする配列を標的とする、配列番号１８から２０からなる群から選択されるｇＲＮＡ配列、または
－配列番号１に対して置換Ｒ８４Ｅをコードする配列を標的とする、配列番号２１から２３からなる群から選択されるｇＲＮＡ配列。
配列番号１に対して置換Ｅ５１Ｋをコードする配列を標的とする、配列番号１６または１７のｇＲＮＡ配列、
－配列番号１に対して置換Ｓ５９Ｐをコードする配列を標的とする、配列番号１８から２０からなる群から選択されるｇＲＮＡ配列、または
－配列番号１に対して置換Ｒ８４Ｅをコードする配列を標的とする、配列番号２１から２３からなる群から選択されるｇＲＮＡ配列。
【0164】
上記のような前記遺伝子編集酵素、好ましくはガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質、塩基エディタまたはプライムエディタは、核酸構築物、好ましくは上記のようなガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質、塩基エディタまたはプライムエディタなどの前記遺伝子編集酵素をコードする発現ベクターの細胞への導入の結果として、細胞でインサイチュで合成され得る。あるいは、ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質、塩基エディタまたはプライムエディタなどの前記遺伝子編集酵素は、細胞外で産生され、次いでそれに導入され得る。
【0165】
前記核酸構築物または発現ベクターは、当技術分野で公知の任意の方法によって細胞に導入することができ、非限定的な例として、核酸構築物または発現ベクターが細胞のゲノムに組み込まれる安定的な形質導入方法、核酸構築物または発現ベクターが細胞のゲノムに組み込まれない一過性のトランスフェクション方法、およびウイルス媒介方法が挙げられる。例えば、一過性の形質転換方法は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞スクイージングまたは粒子衝撃を含む。
【0166】
医薬組成物
さらなる態様では、本開示はまた、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に、上記の細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞または細胞の集団を含む医薬組成物を提供する。
さらなる態様では、本開示はまた、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に、上記の細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞または細胞の集団を含む医薬組成物を提供する。
【0167】
特定の実施形態では、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、好ましくは上記のように前記患者の細胞によって発現されるＣＤ１２３の第２のアイソフォームを標的とするＣＡＲを有する免疫細胞、好ましくはＴ細胞、より好ましくは初代Ｔ細胞である。
【0168】
別の特定の実施形態では、細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する前記細胞は造血幹細胞である。
【0169】
医薬組成物は、上記のような第１または第２の抗原結合領域を含む枯渇剤をさらに含み得る。
【0170】
医薬組成物は、投与経路に従って薬学的に許容される担体中に製剤化される。好ましくは、組成物は、静脈内注射によって投与されるように製剤化される。そのような投与に適した医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容され得る滅菌等張水溶液もしくは非水溶液（例えば、平衡塩類溶液（ＢＳＳ））、分散液、懸濁液もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射液もしくは分散液に再構成され得る滅菌粉末と併用して、上記の第１のアイソフォームを発現する細胞を含み得、これは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質もしくは懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。
【0171】
任意選択で、第１のアイソフォームを発現する細胞を含む組成物は、細胞の保存に適切な任意の温度で保存のために凍結され得る。例えば、細胞は、約－２０℃、－８０℃または任意の他の適切な温度で凍結され得る。極低温凍結細胞は、細胞への損傷のリスクを低減し、細胞が融解後に生存する可能性を最大化するために、適切な容器に保存され、保存用に調製され得る。あるいは、細胞を冷蔵の室温、例えば約４℃に維持してもよい。
【0172】
治療での使用
本開示は、医薬として使用するための、特に患者における養子細胞移入療法などの免疫療法に使用するための、上記の第１のアイソフォームを発現する細胞または細胞の集団に関する。
本開示は、医薬として使用するための、特に患者における養子細胞移入療法などの免疫療法に使用するための、上記の第１のアイソフォームを発現する細胞または細胞の集団に関する。
【0173】
本開示によれば、上記のような細胞表面タンパク質の第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の第１のアイソフォーム）を発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、それを必要とする患者の医学的治療に使用され、前記医学的治療は、前記細胞表面タンパク質の前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の細胞または細胞の集団を、前記細胞表面タンパク質の（例えばＣＤ１２３の）前記第２のアイソフォームまたは第１のアイソフォームに特異的に結合する治療有効量の枯渇剤（例えば、ＣＡＲ細胞または抗体）と併用して投与して、それぞれ患者または移植細胞を特異的に枯渇させることを含む。
【0174】
本明細書で使用される場合、「併用して」または「併用療法で」という用語は、２つ（またはそれ以上）の異なる治療が、障害により対象が苛まれる過程のさなかに対象に送達されること、例えば、２つ以上の治療が、対象が障害と診断された後、障害が治癒もしくは排除される前、または他の理由で治療が中止される前に送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、一方の治療の送達が、第２の治療の送達が開始されたときに依然として行われているので、投与に関する重複がある。これは、本明細書では「同時」または「同時送達」と呼ばれることがある。他の実施形態では、一方の治療の送達は、他方の治療の送達が始まる前に終了している。送達は、送達される第１の治療の効果が、第２の治療が送達されるときに依然として検出可能であるようなものであり得る。１つの実施形態において、細胞表面タンパク質の第２のアイソフォームまたは第１のアイソフォームに結合する枯渇剤が、本明細書に記載されている用量および／または投薬スケジュールで投与され、第１のアイソフォームを発現する細胞が、本明細書に記載されている用量および／または投薬スケジュールで投与される。いくつかの態様では、「と併用して」は、細胞表面タンパク質の第２のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の第２のアイソフォームを認識するＣＡＲ細胞または抗体）または第１のアイソフォームを標的とする枯渇剤、および前記細胞表面タンパク質の前記第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の第１のアイソフォーム）を発現する細胞の組成物が、同時に投与されなければならない、および／または一緒に送達するべく製剤化されなければならないということを意味するよう意図されてはいない、ただしこれらの送達方法は本開示の範囲内である。枯渇剤（例えば、ＣＤ１２３の第２のアイソフォームを標的とするＣＡＲ細胞または抗体）は、細胞表面タンパク質の第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の第１のアイソフォーム）を発現する造血幹細胞の用量と同時、（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間、または１６週間）前、または後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間、または１６週間後）に投与され得る。特定の実施形態では、各薬剤は、その特定の薬剤について決められている用量および／または時間スケジュールで投与される。
【0175】
本開示による養子細胞移入療法は、がん、自己免疫疾患、感染性疾患、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を必要とする疾患、臓器拒絶の予防、腫瘍移植前処置、腫瘍維持療法、最小残存疾患、再発の予防と診断された患者を治療するために使用することができる。
【0176】
本開示はまた、患者における養子移入細胞療法のための医薬の製造における、上記の細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞の使用に関する。
【0177】
本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」という用語は、ヒト、ブタ、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、マウス、ウサギまたはラットを含む動物、好ましくは免疫応答が誘発され得る哺乳動物を指す。より好ましくは、対象は、成人、小児および出生前段階のヒトを含むヒトである。
【0178】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」または「治療すること」という用語は、疾患の治療、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、および遅延などの患者の健康状態を改善することを意図した任意の行為を指す。特定の実施形態では、そのような用語は、疾患または疾患に関連する症状の改善または根絶を指す。他の実施形態では、この用語は、そのような疾患を有する対象への１つまたは複数の治療薬の投与から生じる疾患の進展または悪化を最小限に抑えることを指す。
【0179】
治療され得るがんには、血管新生していない、またはまだ実質的に血管新生していない腫瘍、ならびに血管新生した腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（例えば、血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫、例えば再発および治療関連腫瘍、例えば、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の二次性悪性腫瘍）を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。
【0180】
本明細書で使用される「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答に起因する障害として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な応答の結果である。
【0181】
感染症は、細菌、ウイルス、寄生虫または真菌などの病原性微生物によって引き起こされる疾患である。特定の実施形態では、本開示による感染症は、ＨＳＣＴ後の患者または固形臓器移植を受けた患者などの免疫抑制患者で起こる。
【0182】
好ましい実施形態では、本開示は、血液がん、好ましくは白血病またはリンパ増殖性障害に使用するための上記のＣＤ１２３の第１のアイソフォームを発現する細胞に関する。前記白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、芽球性形質細胞樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性二表現型白血病、有毛細胞白血病、インターロイキン－３受容体サブユニットアルファ陽性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、全身性肥満細胞症、好ましくはＭＤＳ、好ましくはＡＭＬまたはＢＰＤＣＮからなる群から選択することができる。
【0183】
特定の実施形態では、上記の細胞表面タンパク質の第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の第１のアイソフォーム）を発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、固形腫瘍の治療、特に患者の固形腫瘍の骨髄細胞の選択的枯渇のために使用して、腫瘍の骨髄細胞は免疫抑制性であり得るので、免疫チェックポイント阻害剤、ＣＡＲ Ｔ細胞またはＴＩＬなどの免疫療法剤が腫瘍にアクセスすることを可能にすることができる。この状況では、上記の細胞表面タンパク質の第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の第１のアイソフォーム）を発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、固形腫瘍の骨髄細胞を枯渇させることを意図した治療によって影響を受け得る造血系を補充するのに役立ち得る。
【0184】
別の特定の実施形態では、上記の細胞表面タンパク質の第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の第１のアイソフォーム）を発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、狼瘡、多発性硬化症、強皮症などの自己免疫疾患の治療に使用することができる。
【0185】
本開示はまた、それを必要とする対象において、宿主細胞または移入細胞をそれぞれ選択的に枯渇させるのに使用するための第１または第２の抗原結合領域を含む枯渇剤（例えば、ＣＡＲ細胞組成物または抗体）に関する。
【0186】
特異的に患者の細胞を枯渇させ、移植された細胞は枯渇させない方法。
【0187】
本開示によれば、上記のような細胞表面タンパク質の第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の第１のアイソフォーム）を発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、それを必要とする患者の医学的治療に使用され、前記医学的治療は、前記細胞表面タンパク質の前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の細胞または細胞の集団を、前記細胞表面タンパク質の（例えばＣＤ１２３の）前記第２のアイソフォームに特異的に結合する治療有効量の枯渇剤（例えば、ＣＡＲ細胞または抗体）と併用して投与することを含む。
【0188】
実際、免疫療法中に、腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１２３）を対象とするＣＡＲ発現免疫細胞などの免疫枯渇剤を患者に投与して、腫瘍細胞を標的とし、殺傷させることができる。しかしながら、腫瘍表面タンパク質はまた、正常な造血細胞の表面で発現されるので、この戦略は、造血を変化させることによって患者に重篤な副作用を誘発することができる。患者における造血を回復させるために、造血細胞をその後に患者に移植することができる。しかしながら、これらの細胞は、前記薬剤によって標的化されないように、前記薬剤（例えば、ＣＤ１２３発現細胞用の枯渇剤）に対して耐性がある必要がある。
【0189】
したがって、あるいは、本開示によれば、細胞表面タンパク質の（例えば、ＣＤ１２３の）第２のアイソフォームに特異的に結合する第１の抗原結合領域を含む枯渇剤を投与して、細胞表面タンパク質の（例えば、ＣＤ１２３の）前記第２のアイソフォームを発現する患者の細胞であって、前記第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の）を発現する移植細胞ではない患者の細胞を特異的にアブレーションすることができる。患者の細胞は枯渇するが移植された細胞は枯渇させない選択的枯渇は、免疫枯渇剤によってもはや枯渇されない健常な造血系で患者を再構成することを可能にする。したがって、本治療的使用によれば、患者は、免疫抑制を長期間経るより、むしろ機能的な免疫系を有する。本開示による細胞の使用は、現在のＨＳＣ移植の主要な合併症としての感染症を排除する。
【0190】
別の実施形態において、本開示は、表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞（例えば、ＣＤ１２３）を有する患者において正常な造血を回復させるための養子細胞移入療法のための、好ましくは造血幹細胞移植のための方法に関し、それは以下を含む。
（ｉ）前記表面タンパク質（例えば、ＣＤ１２３）の第１のアイソフォームを発現する有効量の細胞（例えば造血幹細胞）であって、前記第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３）を発現する前記細胞が、前記第１のアイソフォームをコードする核酸に少なくとも１つの多型対立遺伝子、好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子、または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型が、前記表面タンパク質の（例えば、ＣＤ１２３の）前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在しない、細胞、またはその医薬組成物を投与すること、および
（ｉｉ）前記表面タンパク質の（例えば、ＣＤ１２３の）前記第２のアイソフォームに特異的に結合し、前記表面タンパク質の（例えばＣＤ１２３の）前記第１のアイソフォームに結合しない少なくとも第１の抗原結合領域を含む薬剤の治療有効量を投与して、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞（患者の細胞）を特異的に枯渇させること。
（ｉ）前記表面タンパク質（例えば、ＣＤ１２３）の第１のアイソフォームを発現する有効量の細胞（例えば造血幹細胞）であって、前記第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３）を発現する前記細胞が、前記第１のアイソフォームをコードする核酸に少なくとも１つの多型対立遺伝子、好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子、または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型が、前記表面タンパク質の（例えば、ＣＤ１２３の）前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在しない、細胞、またはその医薬組成物を投与すること、および
（ｉｉ）前記表面タンパク質の（例えば、ＣＤ１２３の）前記第２のアイソフォームに特異的に結合し、前記表面タンパク質の（例えばＣＤ１２３の）前記第１のアイソフォームに結合しない少なくとも第１の抗原結合領域を含む薬剤の治療有効量を投与して、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞（患者の細胞）を特異的に枯渇させること。
【0191】
第１のアイソフォームを発現する前記細胞またはその医薬組成物は、上記のような第１の抗原結合領域を含む薬剤と併用して（例えば、前に、同時に、または後に）対象に投与される。
【0192】
好ましい実施形態では、枯渇剤（例えば、ＣＤ１２３の第２のアイソフォームを標的とするＣＡＲ細胞または抗体）は、前記表面タンパク質の第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の第１のアイソフォーム）を発現する造血幹細胞の用量の、（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間、または１６週間）前、または後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間、または１６週間後）に投与される。
【0193】
「治療有効量」または「有効量」とは、上で定義した治療、特に患者における正常な造血の回復を構成するのに十分な、対象に投与される、上で説明したような第１のアイソフォームを発現するいくつかの細胞、特に造血幹細胞を意図する。
【0194】
本開示による細胞または医薬組成物の投与は、注射、輸血、または移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を含む任意の好都合な様式で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内またはリンパ内注射によって、または腹腔内に患者に投与することができる。別の実施形態では、本発明の細胞または医薬組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。本発明の細胞または医薬組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射され得る。
【0195】
細胞または細胞の集団の投与は、それらの範囲内の細胞数のすべての整数の値を含む、１０４から１０９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５から１０７細胞／ｋｇ体重の投与からなることができる。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、もしあれば併用治療の種類、治療の頻度および所望の効果の性質に依存する。細胞または細胞の集団は、１つまたは複数の用量で投与することができる。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、対象の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々の必要性は様々であるが、当技術分野の範囲内の特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定がなされた。
【0196】
特に、本開示はまた、それを必要とする対象において、宿主細胞を選択的に枯渇させるのに使用するための第１の抗原結合領域を含む上記の抗ＣＤ１２３剤（例えば、ＣＡＲ細胞組成物または抗体）を枯渇させることに関する。
【0197】
特異的に移植された細胞を枯渇させ、患者の細胞は枯渇させない方法（安全スイッチ）。
【0198】
本開示によれば、上記のような前記表面タンパク質の第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の第１のアイソフォーム）を発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、それを必要とする患者の医学的治療に使用され、前記医学的治療は、前記表面タンパク質の前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の細胞または細胞の集団を、前記表面タンパク質の（例えばＣＤ１２３の）前記第１のアイソフォームに特異的に結合する治療有効量の枯渇剤（例えば、ＣＡＲ細胞または抗体）と併用して投与することを含む。
【0199】
本開示の第１のアイソフォームを発現する細胞または細胞の集団、好ましくは免疫細胞は、患者への養子移入細胞移入療法において特に使用される。前記表面タンパク質の前記第１のアイソフォームを発現する前記移植細胞は、移植による移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用を回避するために、特に第１のアイソフォームに特異的に結合し、患者の細胞によって発現される前記表面タンパク質の第２のアイソフォームには結合しない第２の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤を投与することによって、患者においてさらに枯渇させることができる。この場合、（移植された細胞によって発現される）前記表面タンパク質の前記第１のアイソフォームに特異的に結合する第２の抗原結合領域を含む前記薬剤は、患者の細胞ではなく特異的に移植された細胞を枯渇させるために投与される。移植細胞の選択的枯渇は、「安全スイッチ」を設けることによって重要な安全機能を構成する。
【0200】
移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は、遺伝的に異なる人からの移植組織の受け入れ後の医学的合併症に関する。提供された組織（移植片）の免疫細胞は、レシピエント（宿主）を外来細胞として認識する。特定の実施形態では、医学的状態は、免疫細胞が患者に移入される造血幹細胞移植または養子細胞移入療法によって引き起こされる移植片対宿主病である。
【0201】
前記副作用は、移植細胞、特にＣＡＲを有する免疫細胞がサイトカイン放出症候群および／または神経毒性などの重篤な副作用を有する場合にも起こり得る。この場合、第１のアイソフォームを発現する移植細胞は、前記細胞が悪性になるか、または安全スイッチとして任意のタイプの望ましくないオンターゲットまたはオフターゲットの損傷を引き起こすと排除することができる。
【0202】
本開示は、表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞（例えば、ＣＤ１２３）を有する患者における養子細胞移入療法のための方法に関し、方法は以下を含む。
（ｉ）前記表面タンパク質（例えば、ＣＤ１２３）の第１のアイソフォームを発現する有効量の細胞であって、前記第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３）を発現する前記細胞が、前記表面タンパク質の前記第１のアイソフォームをコードする核酸に少なくとも１つの多型対立遺伝子、好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子、または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型が、前記表面タンパク質の（例えば、ＣＤ１２３の）前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在しない、細胞、またはその医薬組成物を投与すること、および
（ｉｉ）前記表面タンパク質の（例えば、ＣＤ１２３の）前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記表面タンパク質の（例えばＣＤ１２３の）前記第２のアイソフォームに結合しない少なくとも第２の抗原結合領域を含む薬剤の治療有効量を投与して、前記第１のアイソフォームを発現する細胞を特異的に枯渇させること。
（ｉ）前記表面タンパク質（例えば、ＣＤ１２３）の第１のアイソフォームを発現する有効量の細胞であって、前記第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３）を発現する前記細胞が、前記表面タンパク質の前記第１のアイソフォームをコードする核酸に少なくとも１つの多型対立遺伝子、好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子、または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型が、前記表面タンパク質の（例えば、ＣＤ１２３の）前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在しない、細胞、またはその医薬組成物を投与すること、および
（ｉｉ）前記表面タンパク質の（例えば、ＣＤ１２３の）前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記表面タンパク質の（例えばＣＤ１２３の）前記第２のアイソフォームに結合しない少なくとも第２の抗原結合領域を含む薬剤の治療有効量を投与して、前記第１のアイソフォームを発現する細胞を特異的に枯渇させること。
【0203】
第１のアイソフォームを発現する前記細胞またはその医薬組成物は、上記のような第２の抗原結合領域を含む薬剤と併用して（例えば、前に、同時に、または後に）対象に投与される。
【0204】
好ましい実施形態では、枯渇剤（例えば、ＣＤ１２３の第２のアイソフォームを標的とするＣＡＲ細胞または抗体）は、第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１２３の第１のアイソフォーム）を発現する造血幹細胞の用量の、（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間、または１６週間）前、または後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間、または１６週間後）に投与される。
【0205】
本開示による細胞または医薬組成物の投与は、注射、輸血、または移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を含む、任意の好都合な様式で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内またはリンパ内注射によって、または腹腔内に患者に投与することができる。別の実施形態では、本発明の細胞または医薬組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。本発明の細胞または医薬組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射され得る。
【0206】
細胞または細胞の集団の投与は、それらの範囲内の細胞数のすべての整数の値を含む、１０４から１０９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５から１０７細胞／ｋｇ体重の投与からなることができる。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、もしあれば併用治療の種類、治療の頻度および所望の効果の性質に依存する。細胞または細胞の集団は、１つまたは複数の用量で投与することができる。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、対象の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々の必要性は様々であるが、当技術分野の範囲内の特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定がなされた。
【0207】
したがって、特定の実施形態において、本開示は、上で記載されるような細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与されたことがある患者において重篤な副作用のリスクを防止することまたは低下させることにおいて使用するための枯渇剤（例えば、ＣＡＲ細胞または抗体）に関し、前記患者は、前記細胞表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する天然の細胞を有し、前記枯渇剤は、前記細胞表面タンパク質の前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記細胞表面タンパク質の前記第２のアイソフォームに結合しない少なくとも第２の抗原結合領域を含む。
【0208】
キット
別の態様では、本開示は、上記の表面タンパク質の第１のアイソフォームを細胞に発現させるためのキットであって、Ｃａｓタンパク質、塩基エディタもしくはプライムエディタ、核酸構築物、上記の発現ベクターと併用させたガイドＲＮＡなどの遺伝子編集酵素、または本開示による単離細胞を含むキットに関する。
別の態様では、本開示は、上記の表面タンパク質の第１のアイソフォームを細胞に発現させるためのキットであって、Ｃａｓタンパク質、塩基エディタもしくはプライムエディタ、核酸構築物、上記の発現ベクターと併用させたガイドＲＮＡなどの遺伝子編集酵素、または本開示による単離細胞を含むキットに関する。
【0209】
本発明は、以下のクレームに開示される。
１．それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者は前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、
前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞は、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、好ましくは、前記多型は、前記第１のアイソフォームをコードする核酸における、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子であり、前記多型対立遺伝子は、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムには存在しない、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２．表面タンパク質の前記第１および第２のアイソフォームが機能的である、クレーム１に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
３．前記表面タンパク質がＣＤ１２３である、クレーム１または２に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
４．前記多型対立遺伝子または遺伝子操作された対立遺伝子が、配列番号１と比較してＥ５１位、Ｓ５９位および／またはＲ８４位のアミノ酸の少なくとも１つの置換によって特徴付けられる、クレーム３に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
５．前記残基Ｅ５１が、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＫまたはＴで置換されている、クレーム４に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
６．前記残基Ｓ５９が、Ｉ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｒ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＰ、Ｅによって置換されている、クレーム４または５に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
７．前記残基Ｒ８４が、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、ＨおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸によって置換されている、クレーム４から６のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
８．前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、前記第１のアイソフォームをコードする核酸において少なくとも１つの天然多型対立遺伝子を有する天然ゲノムＤＮＡを含む対象から選択されている、クレーム１から７のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
９．前記第１のアイソフォームが、遺伝子編集によって前記表面タンパク質をコードする核酸配列をエクスビボ修飾することによって得られる、クレーム１から７のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１０．表面タンパク質をコードする前記核酸配列が、少なくとも第１の抗原結合領域を含む薬剤の結合に関与する表面タンパク質領域をコードする標的配列内部に部位特異的変異を誘導することができる遺伝子編集酵素を細胞に導入することによって改変される、クレーム９に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１１．前記遺伝子編集酵素が、部位特異的ヌクレアーゼ、塩基エディタまたはプライムエディタ、好ましくは前記標的配列に対する相補配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集酵素である、クレーム１０に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１２．前記表面タンパク質がＣＤ１２３であり、
－ガイドＲＮＡ配列は配列番号１６または１７であり、配列番号１と比較して置換Ｅ５１Ｋをコードする配列を標的とし、
－ガイドＲＮＡ配列が、配列番号１８から２０からなる群から選択され、配列番号１と比較して置換Ｓ５９Ｐをコードする配列を標的とし、および／または
－ガイドＲＮＡ配列は、配列番号２１から２３からなる群から選択され、配列番号１と比較して置換Ｒ８４Ｅをコードする配列を標的とする、クレーム１１に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１３．前記表面タンパク質をコードする前記核酸配列が、ＨＤＲ鋳型をさらに導入することによって改変されている、クレーム９から１２のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞。
１４．前記医学的治療が、
第２のアイソフォームを発現する患者の細胞を特異的に枯渇させるために、前記第２のアイソフォームに特異的に結合する少なくとも第１の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して、それを必要とする前記患者に前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記細胞または細胞の集団を投与すること
を含む、クレーム１から１３のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または集団。
１５．前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が造血細胞、好ましくは造血幹細胞である、クレーム１４に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１６．造血疾患、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、芽球性形質細胞樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などの悪性造血疾患の治療における免疫療法後に正常な造血を回復するための、クレーム１４または１５に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１７．前記枯渇剤が、前記第２のアイソフォームに特異的に結合し、前記第１のアイソフォームに結合しない第１の抗原結合領域を含む抗体または抗体－薬物コンジュゲートである、クレーム１４から１６のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１８．前記枯渇剤が、免疫細胞、好ましくは、前記第２のアイソフォームに特異的に結合し、前記第１のアイソフォームに結合しない第１の抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞である、クレーム１４から１６に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１９．前記表面タンパク質がＣＤ１２３であり、前記枯渇剤の前記第１の抗原結合領域が、配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むエピトープに特異的に結合する、クレーム１７または１８に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２０．前記第１の抗原結合領域が、
ｃ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｄ）３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、クレーム１９に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。
２１．前記第１の抗原結合領域が、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む、クレーム２０に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。
２２．前記医学的治療が、
第１のアイソフォームを発現する移入された細胞を特異的に枯渇させるために、前記第１のアイソフォームに特異的に結合する少なくとも第２の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して、それを必要とする前記患者に前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記細胞または細胞の集団を投与すること
を含む、クレーム１から１３のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。
２３．養子細胞移入療法において、好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、芽球性形質細胞樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などの悪性造血疾患の治療のための、クレーム２２に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２４．移植による移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用を回避するために、前記枯渇剤が、表面タンパク質の前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団に続いて投与される、クレーム２２または２３に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。
２５．前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、造血細胞、好ましくは免疫細胞、より好ましくはＴ細胞である、クレーム２２から２４のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２６．前記第１のアイソフォームを発現する前記免疫細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する免疫細胞、好ましくはＴ細胞である、クレーム２５に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２７．前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、前記患者の細胞によって発現される第２のアイソフォームを標的とする、クレーム２６に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２８．前記ＣＡＲが、第３の細胞外ループ内、または配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むポリペプチド内に位置するＣＤ１２３のエピトープに特異的に結合する抗原結合領域を含む、クレーム２７に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２９．前記ＣＡＲが、
－ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
－３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、抗原結合領域を含む、クレーム２８に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
３０．前記ＣＡＲが、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域を含み、好ましくは前記ＣＡＲがアミノ酸配列の配列番号１５を含むかまたはそれからなる、クレーム２９に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
３１．前記枯渇剤が、前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記第２のアイソフォームに結合しない第２の抗原結合領域を含む抗体または抗体－薬物コンジュゲートである、クレーム２２から３０のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
３２．前記枯渇剤が、免疫細胞、好ましくは、前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記第２のアイソフォームに結合しない第２の抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞である、クレーム２２から３０に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
３３．哺乳動物細胞、好ましくは造血幹細胞または免疫細胞、例えばクレーム１から１３のいずれか一項に定義されているＴ細胞、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
３４．前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、好ましくは前記患者の細胞によって発現されるＣＤ１２３の第２のアイソフォームを標的とするＣＡＲを有する免疫細胞、好ましくはＴ細胞である、クレーム３３に記載の医薬組成物。
３５．前記ＣＡＲが、第３の細胞外ループ内、または配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むポリペプチド内に位置するＣＤ１２３のエピトープに特異的に結合する抗原結合領域を含む、クレーム３４に記載の医薬組成物。
３６．前記ＣＡＲが、
－ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
－３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、抗原結合領域を含む、クレーム３５に記載の医薬組成物。
３７．前記ＣＡＲが、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域を含み、好ましくは前記ＣＡＲが配列番号１５を含むかまたはそれからなる、クレーム３６に記載の医薬組成物。
３８．クレーム２７から２７、３１および３２に定義されている枯渇剤をさらに含む、クレーム３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
３９．表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与されたことがある患者において重篤な副作用のリスクを防止することまたは低下させることにおいて使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞が、表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤は、前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記第２のアイソフォームに結合しない少なくとも第２の抗原結合領域を含む、枯渇剤。
４０．前記枯渇剤が、表面タンパク質の第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記表面タンパク質の第２のアイソフォームに結合しない第２の抗原結合領域を含む抗体または抗体－薬物コンジュゲートである、クレーム３９に記載の使用のための枯渇剤。
４１．前記枯渇剤が、免疫細胞、好ましくは、前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記第２のアイソフォームに結合しない第２の抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞である、クレーム４０に記載の使用のための枯渇剤。
４２．前記表面タンパク質がＣＤ１２３である、クレーム３９から４１のいずれか一項に記載の使用のための枯渇剤。
４３．それを必要とする患者において宿主細胞を選択的に枯渇させることにおいて使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞が表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤が、前記第２のアイソフォームに特異的に結合する少なくとも第１の抗原結合領域を含む、使用のための枯渇剤。
４４．前記枯渇剤が、前記表面タンパク質の第２のアイソフォームに特異的に結合する第１の抗原結合領域を含む抗体または抗体－薬物コンジュゲートである、クレーム４４に記載の使用のための枯渇剤。
４５．前記枯渇剤が、免疫細胞、好ましくは、前記第２のアイソフォームに特異的に結合する第１の抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞である、クレーム４４に記載の使用のための枯渇剤。
４６．前記表面タンパク質がＣＤ１２３である、クレーム４４から４６のいずれか一項に記載の枯渇剤。
４７．前記枯渇剤の前記第１の抗原結合領域が、第３の細胞外ループ内、または配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むポリペプチド内に位置するエピトープに特異的に結合する、クレーム４７に記載の使用のための枯渇剤。
４８．前記第１の抗原結合領域が、
ｅ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｆ）３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、クレーム４８に記載の使用のための枯渇剤。
４９．前記第１の抗原結合領域が、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含み、好ましくは前記枯渇剤が配列番号１５を含むかまたはそれからなるＣＡＲである、クレーム４９に記載の枯渇剤。
１．それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者は前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、
前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞は、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、好ましくは、前記多型は、前記第１のアイソフォームをコードする核酸における、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子であり、前記多型対立遺伝子は、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムには存在しない、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２．表面タンパク質の前記第１および第２のアイソフォームが機能的である、クレーム１に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
３．前記表面タンパク質がＣＤ１２３である、クレーム１または２に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
４．前記多型対立遺伝子または遺伝子操作された対立遺伝子が、配列番号１と比較してＥ５１位、Ｓ５９位および／またはＲ８４位のアミノ酸の少なくとも１つの置換によって特徴付けられる、クレーム３に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
５．前記残基Ｅ５１が、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＫまたはＴで置換されている、クレーム４に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
６．前記残基Ｓ５９が、Ｉ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｒ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＰ、Ｅによって置換されている、クレーム４または５に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
７．前記残基Ｒ８４が、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、ＨおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸によって置換されている、クレーム４から６のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
８．前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、前記第１のアイソフォームをコードする核酸において少なくとも１つの天然多型対立遺伝子を有する天然ゲノムＤＮＡを含む対象から選択されている、クレーム１から７のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
９．前記第１のアイソフォームが、遺伝子編集によって前記表面タンパク質をコードする核酸配列をエクスビボ修飾することによって得られる、クレーム１から７のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１０．表面タンパク質をコードする前記核酸配列が、少なくとも第１の抗原結合領域を含む薬剤の結合に関与する表面タンパク質領域をコードする標的配列内部に部位特異的変異を誘導することができる遺伝子編集酵素を細胞に導入することによって改変される、クレーム９に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１１．前記遺伝子編集酵素が、部位特異的ヌクレアーゼ、塩基エディタまたはプライムエディタ、好ましくは前記標的配列に対する相補配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集酵素である、クレーム１０に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１２．前記表面タンパク質がＣＤ１２３であり、
－ガイドＲＮＡ配列は配列番号１６または１７であり、配列番号１と比較して置換Ｅ５１Ｋをコードする配列を標的とし、
－ガイドＲＮＡ配列が、配列番号１８から２０からなる群から選択され、配列番号１と比較して置換Ｓ５９Ｐをコードする配列を標的とし、および／または
－ガイドＲＮＡ配列は、配列番号２１から２３からなる群から選択され、配列番号１と比較して置換Ｒ８４Ｅをコードする配列を標的とする、クレーム１１に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１３．前記表面タンパク質をコードする前記核酸配列が、ＨＤＲ鋳型をさらに導入することによって改変されている、クレーム９から１２のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞。
１４．前記医学的治療が、
第２のアイソフォームを発現する患者の細胞を特異的に枯渇させるために、前記第２のアイソフォームに特異的に結合する少なくとも第１の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して、それを必要とする前記患者に前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記細胞または細胞の集団を投与すること
を含む、クレーム１から１３のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または集団。
１５．前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が造血細胞、好ましくは造血幹細胞である、クレーム１４に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１６．造血疾患、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、芽球性形質細胞樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などの悪性造血疾患の治療における免疫療法後に正常な造血を回復するための、クレーム１４または１５に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１７．前記枯渇剤が、前記第２のアイソフォームに特異的に結合し、前記第１のアイソフォームに結合しない第１の抗原結合領域を含む抗体または抗体－薬物コンジュゲートである、クレーム１４から１６のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１８．前記枯渇剤が、免疫細胞、好ましくは、前記第２のアイソフォームに特異的に結合し、前記第１のアイソフォームに結合しない第１の抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞である、クレーム１４から１６に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
１９．前記表面タンパク質がＣＤ１２３であり、前記枯渇剤の前記第１の抗原結合領域が、配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むエピトープに特異的に結合する、クレーム１７または１８に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２０．前記第１の抗原結合領域が、
ｃ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｄ）３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、クレーム１９に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。
２１．前記第１の抗原結合領域が、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む、クレーム２０に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。
２２．前記医学的治療が、
第１のアイソフォームを発現する移入された細胞を特異的に枯渇させるために、前記第１のアイソフォームに特異的に結合する少なくとも第２の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して、それを必要とする前記患者に前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記細胞または細胞の集団を投与すること
を含む、クレーム１から１３のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。
２３．養子細胞移入療法において、好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、芽球性形質細胞樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などの悪性造血疾患の治療のための、クレーム２２に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２４．移植による移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用を回避するために、前記枯渇剤が、表面タンパク質の前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団に続いて投与される、クレーム２２または２３に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。
２５．前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、造血細胞、好ましくは免疫細胞、より好ましくはＴ細胞である、クレーム２２から２４のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２６．前記第１のアイソフォームを発現する前記免疫細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する免疫細胞、好ましくはＴ細胞である、クレーム２５に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２７．前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、前記患者の細胞によって発現される第２のアイソフォームを標的とする、クレーム２６に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２８．前記ＣＡＲが、第３の細胞外ループ内、または配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むポリペプチド内に位置するＣＤ１２３のエピトープに特異的に結合する抗原結合領域を含む、クレーム２７に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
２９．前記ＣＡＲが、
－ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
－３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、抗原結合領域を含む、クレーム２８に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
３０．前記ＣＡＲが、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域を含み、好ましくは前記ＣＡＲがアミノ酸配列の配列番号１５を含むかまたはそれからなる、クレーム２９に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
３１．前記枯渇剤が、前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記第２のアイソフォームに結合しない第２の抗原結合領域を含む抗体または抗体－薬物コンジュゲートである、クレーム２２から３０のいずれか一項に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
３２．前記枯渇剤が、免疫細胞、好ましくは、前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記第２のアイソフォームに結合しない第２の抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞である、クレーム２２から３０に記載の使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。
３３．哺乳動物細胞、好ましくは造血幹細胞または免疫細胞、例えばクレーム１から１３のいずれか一項に定義されているＴ細胞、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
３４．前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、好ましくは前記患者の細胞によって発現されるＣＤ１２３の第２のアイソフォームを標的とするＣＡＲを有する免疫細胞、好ましくはＴ細胞である、クレーム３３に記載の医薬組成物。
３５．前記ＣＡＲが、第３の細胞外ループ内、または配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むポリペプチド内に位置するＣＤ１２３のエピトープに特異的に結合する抗原結合領域を含む、クレーム３４に記載の医薬組成物。
３６．前記ＣＡＲが、
－ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
－３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、抗原結合領域を含む、クレーム３５に記載の医薬組成物。
３７．前記ＣＡＲが、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域を含み、好ましくは前記ＣＡＲが配列番号１５を含むかまたはそれからなる、クレーム３６に記載の医薬組成物。
３８．クレーム２７から２７、３１および３２に定義されている枯渇剤をさらに含む、クレーム３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
３９．表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与されたことがある患者において重篤な副作用のリスクを防止することまたは低下させることにおいて使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞が、表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤は、前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記第２のアイソフォームに結合しない少なくとも第２の抗原結合領域を含む、枯渇剤。
４０．前記枯渇剤が、表面タンパク質の第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記表面タンパク質の第２のアイソフォームに結合しない第２の抗原結合領域を含む抗体または抗体－薬物コンジュゲートである、クレーム３９に記載の使用のための枯渇剤。
４１．前記枯渇剤が、免疫細胞、好ましくは、前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記第２のアイソフォームに結合しない第２の抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞である、クレーム４０に記載の使用のための枯渇剤。
４２．前記表面タンパク質がＣＤ１２３である、クレーム３９から４１のいずれか一項に記載の使用のための枯渇剤。
４３．それを必要とする患者において宿主細胞を選択的に枯渇させることにおいて使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞が表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤が、前記第２のアイソフォームに特異的に結合する少なくとも第１の抗原結合領域を含む、使用のための枯渇剤。
４４．前記枯渇剤が、前記表面タンパク質の第２のアイソフォームに特異的に結合する第１の抗原結合領域を含む抗体または抗体－薬物コンジュゲートである、クレーム４４に記載の使用のための枯渇剤。
４５．前記枯渇剤が、免疫細胞、好ましくは、前記第２のアイソフォームに特異的に結合する第１の抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞である、クレーム４４に記載の使用のための枯渇剤。
４６．前記表面タンパク質がＣＤ１２３である、クレーム４４から４６のいずれか一項に記載の枯渇剤。
４７．前記枯渇剤の前記第１の抗原結合領域が、第３の細胞外ループ内、または配列番号１のアミノ酸Ｔ４８、Ｄ４９、Ｅ５１、Ａ５６、Ｄ５７、Ｙ５８、Ｓ５９、Ｍ６０、Ｐ６１、Ａ６２、Ｖ６３、Ｎ６４、Ｔ８２、Ｒ８４、Ｖ８５、Ａ８６、Ｎ８７、Ｐ８９、Ｆ９０、Ｓ９１を含むポリペプチド内に位置するエピトープに特異的に結合する、クレーム４７に記載の使用のための枯渇剤。
４８．前記第１の抗原結合領域が、
ｅ）ＶＨＣＤ１が配列番号２であり、ＶＨＣＤ２が配列番号３であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｆ）３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５または６であり、ＶＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＶＬＣＤＲ３は配列番号８である、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、クレーム４８に記載の使用のための枯渇剤。
４９．前記第１の抗原結合領域が、配列番号９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含み、好ましくは前記枯渇剤が配列番号１５を含むかまたはそれからなるＣＡＲである、クレーム４９に記載の枯渇剤。
【0210】
ここで、本発明を以下の実施例によって例示するが、これらは限定的ではない。
【実施例】
【0211】
１．ＣＤ１２３の計算分析
細胞表面タンパク質のエピトープの同一性および局在化は、複合体の３Ｄ構造から抽出するか、配列および／または構造ベースのエピトープ予測ツールに基づいて予測することができる。線状または立体配座Ｂ細胞エピトープを予測するための方法としては、限定されないが、ＢｅｐｉＰｒｅｄ ＰＭＩＤ：２８４７２３５６、ＤｉｓｃｏＴｏｐｅ ＰＭＩＤ：２６４２４２６０、ＥｌｌｉＰｒｏ ＰＭＩＤ：１９０５５７３０、およびＳＶＭＴｒｉＰ ＰＭＩＤ：３２１６２２６３が挙げられる。
細胞表面タンパク質のエピトープの同一性および局在化は、複合体の３Ｄ構造から抽出するか、配列および／または構造ベースのエピトープ予測ツールに基づいて予測することができる。線状または立体配座Ｂ細胞エピトープを予測するための方法としては、限定されないが、ＢｅｐｉＰｒｅｄ ＰＭＩＤ：２８４７２３５６、ＤｉｓｃｏＴｏｐｅ ＰＭＩＤ：２６４２４２６０、ＥｌｌｉＰｒｏ ＰＭＩＤ：１９０５５７３０、およびＳＶＭＴｒｉＰ ＰＭＩＤ：３２１６２２６３が挙げられる。
【0212】
タンパク質の構造的および機能的状態ならびに可能性のある病原性作用に対する変異体の作用を推定するために、生物物理学的特徴、進化的保存パターン、生物学的に関連する部位、すなわち相互作用部位、機能的および構造的に関連する部位への近接性を含む情報、タンパク質の安定性が考慮される。
【0213】
タンパク質での変異体の位置は、ｉ）タンパク質の利用可能なまたは予測される３Ｄ構造、ｉｉ）既知の構造の相同タンパク質との配列比較に基づいてマッピングされる。変異体を含有するアミノ酸部位および全体的なタンパク質領域の溶媒アクセス可能性またはアクセス可能表面積（ＡＳＡ）は、入手可能な場合、３Ｄ構造情報に基づいて計算されるか、または配列ベースの特徴から予測される。
【0214】
アミノ酸配列からＡＳＡを予測する方法としては、配列プロファイル、構造の類似性および機械学習アプローチ、例えば、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）およびベイズ統計ＰＭＩＤ：２２１７１３９、ＰＭＩＤ：７８９２１７１、ＰＭＩＤ：１５２８１１２８、ＰＭＩＤ：１５８１４５５５、ＰＭＩＤ：８７２７３１８が挙げられる。変異体の作用を予測するための方法には、ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ、ＭｕｔａｔｉｏｎＴａｓｔｅｒ、Ｃｏｎｄｅｌ、ＦＡＴＨＭＭが含まれるが、これらに限定されない。
【0215】
タンパク質の安定性に対するアミノ酸変異の影響を予測するための構造に基づく方法は、統計的ポテンシャル、物理的または経験的エネルギー関数に基づいており、ＦｏｌｄＸ、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＣＣ／ＰＢＳＡ（ＰＭＩＤ：１２０７９３９３、ＰＭＩＤ：１８４１０２４８、ＰＭＩＤ：１９１１６６０９、ＰＭＩＤ：１５０６３６４７）を含むがこれらに限定されない。
【0216】
複数の配列アラインメントから計算された大域的および局所的確率モデルを使用して、配列情報のみからの単一または高次の置換の作用を定量化することができ、相互情報、直接カップリング分析および共分散推定ＰＭＩＤ：２８０９２６５８、ＰＭＩＤ：２２１０１１５３、ＰＭＩＤ：２３４５８８５６、ＰＭＩＤ：２４５７３４７４を含む。
【0217】
２．ＣＤ１２３－ＣＳＬ３６２複合体の分析
ＣＳＬ３６２エピトープ：開状態対閉状態
ＣＤ１２３－ＣＳＬ３６２相互作用複合体の三次元構造を使用して、タンパク質変異体を生成するための優先部位として重要な相互作用部位を同定した。タンパク質部位および変異体を、ｉ）ＣＳＬ３６２に結合した状態およびＣＳＬ３６２を含まない状態で観察された、残基ごとの相対的溶媒接近可能性、ｉｉ）複数の配列アラインメントからの、部位ごとの進化的保存およびアミノ酸使用、ｉｉｉ）配列（ＥＶ突然変異）および構造ベースのシミュレーション（ＦｏｌｄＸ）に基づくインシリコの突然変異誘発後の予測された安定性変化および、構造ベースのシミュレーション（ＦｏｌｄＸ）に基づいて選択した（図１）。
ＣＳＬ３６２エピトープ：開状態対閉状態
ＣＤ１２３－ＣＳＬ３６２相互作用複合体の三次元構造を使用して、タンパク質変異体を生成するための優先部位として重要な相互作用部位を同定した。タンパク質部位および変異体を、ｉ）ＣＳＬ３６２に結合した状態およびＣＳＬ３６２を含まない状態で観察された、残基ごとの相対的溶媒接近可能性、ｉｉ）複数の配列アラインメントからの、部位ごとの進化的保存およびアミノ酸使用、ｉｉｉ）配列（ＥＶ突然変異）および構造ベースのシミュレーション（ＦｏｌｄＸ）に基づくインシリコの突然変異誘発後の予測された安定性変化および、構造ベースのシミュレーション（ＦｏｌｄＸ）に基づいて選択した（図１）。
【0218】
３．ＣＤ１２３のＳＮＰ分析
アミノ酸の変化の性質と共に、所与の集団における対立遺伝子の分布または頻度、ホモ接合体の状態、疾患関連データ、表現型関連データ、ならびにタンパク質、細胞および生物レベルでの変異の影響に基づいて、各変異体を分析し、優先順位付けする。
アミノ酸の変化の性質と共に、所与の集団における対立遺伝子の分布または頻度、ホモ接合体の状態、疾患関連データ、表現型関連データ、ならびにタンパク質、細胞および生物レベルでの変異の影響に基づいて、各変異体を分析し、優先順位付けする。
【0219】
対立遺伝子頻度データは、１０００ゲノムプロジェクトを含む一連のプロジェクトおよびリポジトリから検索することができる。ゲノム集約データベース（ｇｎｏｍＡＤ）、ｄｂＳＮＰ、Ｅｎｓｅｍｂｌ、Ｕｎｉｐｒｏｔ（表１）。
【0220】
表現型データおよび疾患関連変異体は、ＣｌｉｎＶａｒ、ＣＯＳＭＩＣ表現型変異体、ＨＧＭＤ－ＰＵＢＬＩＣ変異体、表現型変異体のＮＨＧＲＩ－ＥＢＩカタログ、ＯＭＩＭ表現型変異体、ＰｈｅｎＣｏｄｅ、ＧＷＡＳ、遺伝子型－組織発現（ＧＴＥｘ）を含む様々なプロジェクトおよびリポジトリから検索することができる。
【表1】
【0221】
４．生細胞に対するＦＡＣＳスキャン
ＣＳＬ３６２／Ｏｋｔ３の発現および精製
ＣＳＬ３６２／Ｏｋｔ３ ＢｉＴＥをコードするプラスミドは、Ｄａｒｉｏ Ｎｅｒｉからの親切な贈呈品である（Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ．２０１９ Ｓｅｐ；８４：１０６１７８）。
ＣＳＬ３６２／Ｏｋｔ３の発現および精製
ＣＳＬ３６２／Ｏｋｔ３ ＢｉＴＥをコードするプラスミドは、Ｄａｒｉｏ Ｎｅｒｉからの親切な贈呈品である（Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ．２０１９ Ｓｅｐ；８４：１０６１７８）。
【0222】
ＣＨＯ－Ｓは、Ｐｏｗｅｒ ＣＨＯ２培地（Ｌｏｎｚａ：ＢＥＬＮ１２－７７１Ｑ、１ＸＨＴ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、抗生物質－抗真菌剤を補充した）において、２０００万個／ｍｌの密度まで成長させた。
【0223】
次いで、２．１０９個の細胞を遠心分離し、５００ｍｌのＰｒｏＣＨＯ４培地（Ｌｏｎｚａ：ＢＥＢＰ１２－０２９Ｑ、１ＸＨＴ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、抗生物質－抗真菌剤を補充した）において再懸濁する。１．７ｍｇのＣＳＬ３６２／Ｏｋｔ３ ＢｉＴＥ ＤＮＡを５ｍｌのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌ）と共に細胞に添加する。次いで、細胞を４×５００ｍｌのローラーボトルに分配し、ＣＯ２インキュベーターで３１℃、１４０ｒｐｍで６日間増殖させる。
【0224】
次いで、ＣＨＯ－Ｓ細胞を３０００ｒｐｍで２０分遠心分離する。上清を０．２２ｍｍフィルターで濾過し、１００ｍｌの洗浄液（１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）で予備洗浄した５ｍｌのＮｉ ＮＴＡカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に適用する。
【0225】
カラムを１００ｍｌの洗浄培地で洗浄する。溶出は、ＰＢＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ＝８．０で行う。０．５ｍｌの画分を回収し、ＯＤを２８０ｍＭで測定する。高濃度画分をプールし、ＰＢＳに対して２回Ｏ／Ｎ透析する。バイトを０．２２μｍで滅菌濾過し、１ｍｇ／ｍｌで等分し、－８０℃で保存する。
【0226】
ＣＳＬ３６２およびＭＩＲＧ１２３
ＣＳＬ３６２は、Ｆｃ領域にＳ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ変異を有するキメラ抗体である（Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１４）２８：２２１３－２１）。モノクローナルＩｇＧ１抗ＣＤ１２３抗体ＭＩＲＧ１２３を作製するために、重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＫＬ）をＣＳＬ３６２／ＯＫＴ３ ＢｉＴＥから誘導させた。ＶＨおよびＶＫＬの配列を、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で、それぞれＡｂＶｅｃ２．０－ＩＧＨＧ１（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃８０７９５）およびＡｂＶｅｃ １．１－ＩＧＫＣ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃８０７９６）にクローニングした（Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００８ Ｊａｎ １；３２９（１－２）：１１２－２４．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｏｃｔ ３１）。
ＶＨ配列（配列番号９）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＤＹＹＭＫＷＡＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＴＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＶＫＬ配列（配列番号１０）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＰＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＣＳＬ３６２は、Ｆｃ領域にＳ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ変異を有するキメラ抗体である（Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１４）２８：２２１３－２１）。モノクローナルＩｇＧ１抗ＣＤ１２３抗体ＭＩＲＧ１２３を作製するために、重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＫＬ）をＣＳＬ３６２／ＯＫＴ３ ＢｉＴＥから誘導させた。ＶＨおよびＶＫＬの配列を、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で、それぞれＡｂＶｅｃ２．０－ＩＧＨＧ１（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃８０７９５）およびＡｂＶｅｃ １．１－ＩＧＫＣ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃８０７９６）にクローニングした（Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００８ Ｊａｎ １；３２９（１－２）：１１２－２４．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｏｃｔ ３１）。
ＶＨ配列（配列番号９）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＤＹＹＭＫＷＡＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＴＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＶＫＬ配列（配列番号１０）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＰＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【0227】
次いで、両方のプラスミドを発現のためにＣＨＯ－Ｓ細胞に同時トランスフェクトする。ＣＨＯ－Ｓは、Ｐｏｗｅｒ ＣＨＯ２培地（Ｌｏｎｚａ：ＢＥＬＮ１２－７７１Ｑ、ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＴ補充物、抗生物質－抗真菌剤を補充した）において、２０００万個／ｍｌの密度まで成長させた。
【0228】
次いで、２×１０９個の細胞を遠心分離し、５００ｍｌのＰｒｏＣＨＯ４培地（Ｌｏｎｚａ：ＢＥＢＰ１２－０２９Ｑ、１ＸＨＴ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、抗生物質－抗真菌剤を補充した）において再懸濁する。０．６ｍｇのＶＨおよび０．６ｍｇのＶＫＬ ＤＮＡを、５ｍｌのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌ）と共に細胞に添加する。次いで、細胞を４×５００ｍｌのローラーボトルに分配し、ＣＯ２インキュベーターで３１℃、１４０ｒｐｍで６日間増殖させる。
【0229】
次いで、ＣＨＯ－Ｓ細胞を３０００ｒｐｍで２０分遠心分離する。上清を０．２２μｍフィルターで濾過し、ＰＢＳで前洗浄したプロテインＡカラムに適用する。次いで、カラムを１００ｍｌのＰＢＳで洗浄する。抗体を０．１ＭのグリシンｐＨ＝２．２で溶出する。０．５ｍｌの画分を回収し、ＯＤを２８０ｍＭで測定する。高濃度画分をプールし、ＰＢＳに対して２回Ｏ／Ｎ透析する。
【0230】
５．ＦＡＣＳによる結合アッセイ
５．１材料および方法
真核細胞株
ヒト胎児由来腎臓２９３細胞株（ＨＥＫ－２９３）は、Ｍ．Ｚａｖｏｌａｎ（Ｂｉｏｚｅｎｔｒｕｍ Ｂａｓｅｌ）から寄贈された。全細胞株を新たに解凍し、アッセイに使用する前に３から６回継代した。ＨＥＫ－２９３を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘを補充したダルベッコ改変イーグル培地－高グルコース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）において、３７℃、５％のＣＯ２で培養し、週に３回分割した。ネオマイシン耐性カセットを発現するすべての安定的な細胞株の培養培地に、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｇ４１８（５０ｍｇ／ｍｌ；ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ）を３５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。
５．１材料および方法
真核細胞株
ヒト胎児由来腎臓２９３細胞株（ＨＥＫ－２９３）は、Ｍ．Ｚａｖｏｌａｎ（Ｂｉｏｚｅｎｔｒｕｍ Ｂａｓｅｌ）から寄贈された。全細胞株を新たに解凍し、アッセイに使用する前に３から６回継代した。ＨＥＫ－２９３を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘを補充したダルベッコ改変イーグル培地－高グルコース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）において、３７℃、５％のＣＯ２で培養し、週に３回分割した。ネオマイシン耐性カセットを発現するすべての安定的な細胞株の培養培地に、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｇ４１８（５０ｍｇ／ｍｌ；ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ）を３５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。
【0231】
ＣＤ１２３に対して陰性に染色された野生型ＨＥＫ－２９３をＨＥＫと命名し、野生型ＣＤ１２３を発現するＨＥＫ－２９３をＨＥＫ－ＣＤ１２３と標識し、ＣＤ１２３変異体を残基の位置および変化したアミノ酸によって記載する。
【0232】
ヒトインターロイキン３受容体（ＣＤ１２３）の完全長ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００２１８３．２）を、ｐＣＭＶ３ベクター（カタログ番号：ＨＧ１０５１８－ＮＦ）において、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。安定した細胞株生成のために、ハイグロマイシンをネオマイシンに置き換えた。
【0233】
Ｅ５１は、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｒ、Ｍ、Ｇ、Ａに変異している。
【0234】
Ｓ５９は、Ｉ、Ｇ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｔ、Ｋ、Ｆ、Ｒ、Ｙに変異されている。
【0235】
Ｒ８４は、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｈ Ａ、Ｌに変異している。
【0236】
次いで、すべての点突然変異がＰＣＲによって導入され、単一のアミノ酸の変化をもたらした。
【0237】
Ｎｅｏｎエレクトロポレーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１１００Ｖ－２０ｍｓ－２パルス）を使用して、２．１０６個のＨＥＫ細胞に６μｇのＤＮＡ（ｐＣＭＶプラスミド－ｈｕＣＤ１２３ ｗｔまたは変異体）をエレクトロポレーションする。４８時間後、細胞を一過性のトランスフェクションとしてＦＡＣＳによる結合分析に使用する。次いで、それらをＧ４１８選択下で２週間維持し（３５０μｇ／ｍｌ培地）、次いで、結合について安定的な細胞株として試験する。
【0238】
ＦＡＣＳ：
２×１０５個のＨＥＫ細胞を、抗ＨｕＣＤ１２３－Ｂｕｖ４５０クローン６Ｈ６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－Ｃａｔ：３０６０２０－１／１００）により、ＭＩＲＧ１２３－ビオチン（１／５０）＋ストレプトアビジン－ＦＩＴＣ（１／２００）と一緒に染色し、ＦＡＣＳによって分析する。
２×１０５個のＨＥＫ細胞を、抗ＨｕＣＤ１２３－Ｂｕｖ４５０クローン６Ｈ６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－Ｃａｔ：３０６０２０－１／１００）により、ＭＩＲＧ１２３－ビオチン（１／５０）＋ストレプトアビジン－ＦＩＴＣ（１／２００）と一緒に染色し、ＦＡＣＳによって分析する。
【0239】
フローサイトメトリーに基づく結合アッセイ：
ＣＤ１２３変異体のＭＩＲＧ１２３への結合を試験するために、安定した細胞株を高抗体濃度で染色する：抗ＨｕＣＤ１２３－Ｂｕｖ４５０クローン６Ｈ６（１／１２：４．２ｍｇ／ｍｌ）およびビオチン化ＭＩＲＧ１２３－Ｂｉｏ（１／７．５：５０ｍｇ／ｍｌ）＋ストレプトアビジン－ＰＥ（１／２００）。
ＣＤ１２３変異体のＭＩＲＧ１２３への結合を試験するために、安定した細胞株を高抗体濃度で染色する：抗ＨｕＣＤ１２３－Ｂｕｖ４５０クローン６Ｈ６（１／１２：４．２ｍｇ／ｍｌ）およびビオチン化ＭＩＲＧ１２３－Ｂｉｏ（１／７．５：５０ｍｇ／ｍｌ）＋ストレプトアビジン－ＰＥ（１／２００）。
【0240】
５．２結果
図２は、ＨＥＫ－２９３細胞においてインビトロで安定的に発現された野生型ＣＤ１２３およびその変異体に対する抗ヒトＣＤ１２３抗体クローン６Ｈ６（ｘ軸）およびＭＩＲＧ１２３（ｙ軸）の結合を示すフローサイトメトリーのプロットを示す。６Ｈ６による濃い染色は、ＣＤ１２３タンパク質の安定した発現を示すが、異なるＣＤ１２３変異体アイソフォームは、クローンＭＩＲＧ１２３への結合が消失した（＜１のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋細胞（右上象限））、弱い（１から２０％のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋細胞）または強い（＞２０％のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋細胞）ことを示す。対照の条件（灰色）は、ヒト野生型ＣＤ１２３を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞（ＨＥＫ－ＣＤ１２３）および形質導入されていないＨＥＫ－２９３細胞（ＨＥＫ）である。３つの独立した実験の代表的なフローサイトメトリーデータ。
図２は、ＨＥＫ－２９３細胞においてインビトロで安定的に発現された野生型ＣＤ１２３およびその変異体に対する抗ヒトＣＤ１２３抗体クローン６Ｈ６（ｘ軸）およびＭＩＲＧ１２３（ｙ軸）の結合を示すフローサイトメトリーのプロットを示す。６Ｈ６による濃い染色は、ＣＤ１２３タンパク質の安定した発現を示すが、異なるＣＤ１２３変異体アイソフォームは、クローンＭＩＲＧ１２３への結合が消失した（＜１のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋細胞（右上象限））、弱い（１から２０％のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋細胞）または強い（＞２０％のＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋細胞）ことを示す。対照の条件（灰色）は、ヒト野生型ＣＤ１２３を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞（ＨＥＫ－ＣＤ１２３）および形質導入されていないＨＥＫ－２９３細胞（ＨＥＫ）である。３つの独立した実験の代表的なフローサイトメトリーデータ。
【0241】
標的細胞は、野生型ＣＤ１２３（ＨＥＫ－ＣＤ１２３）を発現する、形質導入されていない（ＨＥＫ）もの、またはその変異体アイソフォーム（変化したアミノ酸を有する残基の位置を示す）いずれかの、安定的なＨＥＫ－２９３細胞株である。ＣＤ１２３変異体は、抗ＣＤ１２３抗体クローンＭＩＲＧ１２３に対するそれらの消失された結合（下線）、弱い結合（丸）または強い結合（アスタリスク）に従って符号化されている。３つの独立したフローサイトメトリー実験のコンパイルデータを図３に示す。
【0242】
６．ＡＤＣＣアッセイ：ＭＩＲＧ１２３によって媒介されるＡＤＣＣ活性を定量するためのインビトロのアッセイ
６．１ＡＤＣＣアッセイ法
ＡＤＣＣ活性を、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ、Ｖ変異体（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照番号Ｇ７０１５）を用いて実施したＦｃγＲＩＩＩａ活性化アッセイから外挿した。ｈＣＤ１２３変異体を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞株を白色９６ウェルプレートの透明な底部（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃｏｓｔａｒ＃３６１０）に播種した。０日目に、４４００個の細胞を１００ｕｌの培養培地に播種して、２４時間後に６２５０個の細胞を得た（Ｅ：Ｔ比１２：１）。１日目に、培地をＨＥＫ２９３細胞培養物から除去し、以下を添加した。（ｉ）２５μｌのＡＤＣＣ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、（ｉｉ）最終濃度の３倍のＡＤＣＣ緩衝液（最終濃度１ｕｇ／ｍｌ）に希釈した２５μｌのＭＩＲＧ１２３抗体、（ｉｉｉ）３Ｍ細胞／ｍｌの濃度のＡＤＣＣ緩衝液に希釈した２５μｌのエフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞）。混合物を３７℃、５％のＣＯ２で５時間インキュベートした。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。７５μｌの試薬を添加し、細胞を撹拌しながら室温で１０分間インキュベートした。不透明なラベル（Ｅｌｍｅｒ ６００５１９９）を使用してプレートの底部を覆い、ＰＨＥＲＡｓｔａｒｔ ＦＳＸ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）プログラムＬｕｃ－Ｇｌｏ（ＬＵＭ）、ＧａｉｎＡ＝３６００、Ｏｐｔｉｃ ｍｏｄｕｌｅ＝ＬＵＭｐｌｕｓで発光を読み取った。
６．１ＡＤＣＣアッセイ法
ＡＤＣＣ活性を、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ、Ｖ変異体（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照番号Ｇ７０１５）を用いて実施したＦｃγＲＩＩＩａ活性化アッセイから外挿した。ｈＣＤ１２３変異体を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞株を白色９６ウェルプレートの透明な底部（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃｏｓｔａｒ＃３６１０）に播種した。０日目に、４４００個の細胞を１００ｕｌの培養培地に播種して、２４時間後に６２５０個の細胞を得た（Ｅ：Ｔ比１２：１）。１日目に、培地をＨＥＫ２９３細胞培養物から除去し、以下を添加した。（ｉ）２５μｌのＡＤＣＣ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、（ｉｉ）最終濃度の３倍のＡＤＣＣ緩衝液（最終濃度１ｕｇ／ｍｌ）に希釈した２５μｌのＭＩＲＧ１２３抗体、（ｉｉｉ）３Ｍ細胞／ｍｌの濃度のＡＤＣＣ緩衝液に希釈した２５μｌのエフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞）。混合物を３７℃、５％のＣＯ２で５時間インキュベートした。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。７５μｌの試薬を添加し、細胞を撹拌しながら室温で１０分間インキュベートした。不透明なラベル（Ｅｌｍｅｒ ６００５１９９）を使用してプレートの底部を覆い、ＰＨＥＲＡｓｔａｒｔ ＦＳＸ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）プログラムＬｕｃ－Ｇｌｏ（ＬＵＭ）、ＧａｉｎＡ＝３６００、Ｏｐｔｉｃ ｍｏｄｕｌｅ＝ＬＵＭｐｌｕｓで発光を読み取った。
【0243】
このアッセイでは、１μｇ／ｍｌのリツキシマブでインキュベートしたＲａｊｉ細胞を陽性対照として使用した。
【0244】
６．２結果
ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３（野生型）およびＨＥＫ ＣＤ１２３変異体アイソフォームとＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポーター細胞との共培養後に測定された相対発光シグナル。ＲＬＵは、ＨＥＫ－ＣＤ１２３（野生型）で測定されたシグナルに対して正規化される（図４）。
ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３（野生型）およびＨＥＫ ＣＤ１２３変異体アイソフォームとＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポーター細胞との共培養後に測定された相対発光シグナル。ＲＬＵは、ＨＥＫ－ＣＤ１２３（野生型）で測定されたシグナルに対して正規化される（図４）。
【0245】
７．Ｔ細胞エンゲージャアッセイ：ＣＳＬ３６２由来のＴ細胞エンゲージャーによるＴ細胞活性化および標的細胞殺傷を定量するためのインビトロのアッセイ。
７．１材料および方法
初代ヒトＴ細胞単離培養
匿名の健常人のドナーからの白血球バフィーコートを、献血センターＢａｓｅｌ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｚｅｎｔｒｕｍ ＳＲＫ ｂｅｉｄｅｒ Ｂａｓｅｌ、ＢＳＺ）から購入した。製造業者のプロトコルに従って、密度勾配培地Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた密度遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。次いで、ヒトＴ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の説明書に従って使用して、磁気陰性選択によって精製した（純度＞９６％）。凍結ＰＢＭＣを使用する場合、Ｔ細胞を解凍後に単離し、刺激なしで補充培地で一晩培養した。Ｔ細胞を、１０％熱不活性化ヒト血清（ＡＢ＋、雄；ＢＳＺ Ｂａｓｅｌから購入）、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭの２－メルカプトエタノールおよび１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（１００×）（すべてＧｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で培養した。
７．１材料および方法
初代ヒトＴ細胞単離培養
匿名の健常人のドナーからの白血球バフィーコートを、献血センターＢａｓｅｌ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｚｅｎｔｒｕｍ ＳＲＫ ｂｅｉｄｅｒ Ｂａｓｅｌ、ＢＳＺ）から購入した。製造業者のプロトコルに従って、密度勾配培地Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた密度遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。次いで、ヒトＴ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の説明書に従って使用して、磁気陰性選択によって精製した（純度＞９６％）。凍結ＰＢＭＣを使用する場合、Ｔ細胞を解凍後に単離し、刺激なしで補充培地で一晩培養した。Ｔ細胞を、１０％熱不活性化ヒト血清（ＡＢ＋、雄；ＢＳＺ Ｂａｓｅｌから購入）、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭの２－メルカプトエタノールおよび１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（１００×）（すべてＧｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で培養した。
【0246】
インビトロでのＢｉＴＥ媒介殺傷アッセイ
ＢｉＴＥ殺傷アッセイのために、ＨＥＫ－２９３標的細胞を、初代ヒトエフェクターＴ細胞および３００ｎｇ／ｍＬ ＣＤ３／ＣＳＬ３６５ ＢｉＴＥと共に、１０：１のエフェクター対標的の比（Ｅ：Ｔ比）で７２時間共培養した。
ＢｉＴＥ殺傷アッセイのために、ＨＥＫ－２９３標的細胞を、初代ヒトエフェクターＴ細胞および３００ｎｇ／ｍＬ ＣＤ３／ＣＳＬ３６５ ＢｉＴＥと共に、１０：１のエフェクター対標的の比（Ｅ：Ｔ比）で７２時間共培養した。
【0247】
共培養を開始する前に、ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３、およびＣＤ１２３変異体を安定的に発現するＨＥＫを、製造業者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色し、完全ヒト培地の９６ウェル培養プレートで３７℃、５％のＣＯ２で一晩培養した。翌日、補充培地に一晩維持した解凍Ｔ細胞または新たに単離したＴ細胞のいずれかにＢｉＴＥを３００ｎｇ／ｍｌの濃度でＨＥＫ－２９３細胞に添加し、３７℃で７２時間維持した。Ｔ細胞活性化を、フローサイトメトリーによってＣＤ６９％陽性Ｔ細胞の割合を定量することによって評価した。Ｔ細胞の細胞傷害活性および活性化をフローサイトメトリーによって分析した。特異的殺傷を以下のように計算した。（１－ＢｉＴＥを含むＮｒ．生存標的細胞／ＢｉＴＥを含まないＮｒ．生存標的細胞）＊１００。光学顕微鏡Ａｘｉｏ Ｖｅｒｔ．Ａ１（Ｚｅｉｓｓ）、倍率２０倍を用いて細胞形態を評価した。
【0248】
７．２結果：
Ｔ細胞エンゲージャー媒介Ｔ細胞活性化
安定的な標的細胞株ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびＣＤ１２３変異体を、３００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥの存在下、１０：１のＥ：Ｔ比で、ヒト初代ｐａｎ Ｔ細胞と共培養した。図５は、ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３またはすべてのＣＤ１２３変異体との共培養後に測定された％ＣＤ６９＋Ｔ細胞の概要を示す。データを、ＨＥＫ標的細胞の存在下におけるＣＤ６９＋細胞の百分率に対して正規化する。エラーバーは平均±ＳＤを示す。データは、５人の独立した血液ドナーおよび群あたり２回の技術的反復実験を表す。
Ｔ細胞エンゲージャー媒介Ｔ細胞活性化
安定的な標的細胞株ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびＣＤ１２３変異体を、３００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥの存在下、１０：１のＥ：Ｔ比で、ヒト初代ｐａｎ Ｔ細胞と共培養した。図５は、ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３またはすべてのＣＤ１２３変異体との共培養後に測定された％ＣＤ６９＋Ｔ細胞の概要を示す。データを、ＨＥＫ標的細胞の存在下におけるＣＤ６９＋細胞の百分率に対して正規化する。エラーバーは平均±ＳＤを示す。データは、５人の独立した血液ドナーおよび群あたり２回の技術的反復実験を表す。
【0249】
Ｔ細胞エンゲージャー媒介性細胞殺傷
安定的な標的細胞株ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびＣＤ１２３変異体を、３００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥの存在下、１０：１のＥ：Ｔ比で、ヒト初代ｐａｎ Ｔ細胞と共培養した。図６は、７２時間の共培養後のＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびすべてのＣＤ１２３変異体の特異的ＢｉＴＥ媒介殺傷を百分率で示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。データは、５人の独立した血液ドナーおよび群あたり２回の技術的反復実験を表す。
安定的な標的細胞株ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびＣＤ１２３変異体を、３００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥの存在下、１０：１のＥ：Ｔ比で、ヒト初代ｐａｎ Ｔ細胞と共培養した。図６は、７２時間の共培養後のＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびすべてのＣＤ１２３変異体の特異的ＢｉＴＥ媒介殺傷を百分率で示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。データは、５人の独立した血液ドナーおよび群あたり２回の技術的反復実験を表す。
【0250】
８．ＣＡＲ Ｔ殺傷
８．１材料および方法
フローサイトメトリーおよび細胞の選別
フローサイトメトリーを、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを用いてＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで行い、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．７．１）で分析した。
８．１材料および方法
フローサイトメトリーおよび細胞の選別
フローサイトメトリーを、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを用いてＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで行い、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．７．１）で分析した。
【0251】
初代Ｔ細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、固定可能な生存性色素で暗所において４℃で２０分間染色した。その後、蛍光標識抗体を含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ ＦＣＳ＋０．１％ ＮａＮ３）で、暗所において室温で２０分間、細胞表面染色を行った。ビオチン標識抗体の場合、ストレプトアビジンを含む二次抗体を続いて同じプロトコルで染色した。染色した細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、次いで直ちに取得した。
【0252】
細胞の選別のために、細胞をペレット化し、１ｍＭのＥＤＴＡを補充したＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ ＦＣＳ）に再懸濁し、分析まで氷で保った。ＦＡＣＳは、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａまたはＢＤ ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒのいずれかで行った。対照細胞も選別プロセスに供した。
【0253】
ＣＤ１２３－ＣＡＲ ＨＤＲＴの設計および製造
ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＴＲＡＣ遺伝子座（配列番号２４）に特異的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）と二本鎖ＤＮＡ ＨＤＲ鋳型（ＨＤＲＴ）との同時エレクトロポレーションによって生成した。ＨＤＲＴは、クローンＣＳＬ３６２の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（Ｄ．Ｎｅｒｉからの心づかいの贈呈品であり、先行して公表（ＨＵＴＭＡＣＨＥＲ ｅｔ ａｌ．２０１９）、ＣＤ８アルファヒンジ（配列番号２５）、および膜貫通ドメイン（配列番号２６）（Ｇｅｎ ＣＤ８Ａ ＥＮＳＧ０００００１５３５６３）、細胞内シグナル伝達部分４－１ＢＢ（配列番号２７）（Ｇｅｎ ＴＮＦＲＳＦ９ ＥＮＳＧ００００００４９２４９）、ならびにＣＤ３ゼータ（配列番号２８）（Ｇｅｎ ＣＤ２４７ ＥＮＳＧ０００００１９８８２１）、ならびに蛍光レポータータンパク質ＧＦＰを有する第２世代ＣＤ１２３特異的ＣＡＲ（配列番号１５）をコードする。ＴＲＡＣ遺伝子座エクソン１（図７）に相補的な相同の対称アーム（３００ｂｐ）が隣接している。構築物を合成し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）によってクローニングベクター（ｐＵＣ５７骨格）にクローニングし、Ｋａｐａ高忠実度ポリメラーゼ（Ｋａｐａ Ｈｉｆｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ、Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミドからＨＤＲＴをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲアンプリコンを製造者の説明書に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で精製し、正しいサイズを１％アガロースゲルでのゲル電気泳動によって検証した。次いで、ＨＤＲＴを真空濃度を使用して１ｕｇ／μｌの最終濃度に濃縮し、使用するまで－２０℃で保存した。
ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＴＲＡＣ遺伝子座（配列番号２４）に特異的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）と二本鎖ＤＮＡ ＨＤＲ鋳型（ＨＤＲＴ）との同時エレクトロポレーションによって生成した。ＨＤＲＴは、クローンＣＳＬ３６２の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（Ｄ．Ｎｅｒｉからの心づかいの贈呈品であり、先行して公表（ＨＵＴＭＡＣＨＥＲ ｅｔ ａｌ．２０１９）、ＣＤ８アルファヒンジ（配列番号２５）、および膜貫通ドメイン（配列番号２６）（Ｇｅｎ ＣＤ８Ａ ＥＮＳＧ０００００１５３５６３）、細胞内シグナル伝達部分４－１ＢＢ（配列番号２７）（Ｇｅｎ ＴＮＦＲＳＦ９ ＥＮＳＧ００００００４９２４９）、ならびにＣＤ３ゼータ（配列番号２８）（Ｇｅｎ ＣＤ２４７ ＥＮＳＧ０００００１９８８２１）、ならびに蛍光レポータータンパク質ＧＦＰを有する第２世代ＣＤ１２３特異的ＣＡＲ（配列番号１５）をコードする。ＴＲＡＣ遺伝子座エクソン１（図７）に相補的な相同の対称アーム（３００ｂｐ）が隣接している。構築物を合成し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）によってクローニングベクター（ｐＵＣ５７骨格）にクローニングし、Ｋａｐａ高忠実度ポリメラーゼ（Ｋａｐａ Ｈｉｆｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ、Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミドからＨＤＲＴをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲアンプリコンを製造者の説明書に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で精製し、正しいサイズを１％アガロースゲルでのゲル電気泳動によって検証した。次いで、ＨＤＲＴを真空濃度を使用して１ｕｇ／μｌの最終濃度に濃縮し、使用するまで－２０℃で保存した。
【0254】
ヒトＴ細胞からのゲノムＤＮＡ抽出および配列決定
ゲノムＤＮＡを、プロテイナーゼＫ（０．１μｇ；シグマ・アルドリッチ）を含有する１００μｌの尾部溶解緩衝液（１００ｍＭトリス［ｐＨ８．５］、５ｍＭのＮａ－ＥＤＴＡ、０．２％のＳＤＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘ Ｃｏｍｆｏｒｔシェーカーで１０００ｒｐｍで５６℃でインキュベートすることによって、遺伝子改変ヒトＴ細胞から抽出した。１時間後、酵素を９５℃で１５分間熱不活性化した。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分）後、試料を１：１の体積比でイソプロパノールと混合することによってＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡをペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、風乾し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水に再懸濁した。最後に、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＤＮＡの濃度を測定した。ＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＡＲ導入遺伝子の正しい挿入を検証するために、プライマーを相同性の５’および３’アームの外側に設計した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＰＣＲの後、ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルでのゲル電気泳動によってサイズ分離し、正しいアンプリコン長をＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＰＣＲおよびＧｅｌ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ；製造業者のプロトコルに従う）を用いて精製した。１００ｎｇの溶出ＤＮＡを、ＤＮＡの量を増加させるために同じプライマーを用いた、さらなるＰＣＲ増幅のために利用した。ＰＣＲアンプリコンを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＰＣＲおよびＧｅｌ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して清浄化し、ＣｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２２℃で２時間、ｐＪＥＴ １．２／平滑末端クローニングベクターにライゲートした。コンピテント細菌（ＪＭ１０９）への細菌形質転換および３７℃での一晩のインキュベーションの後、３２個のコロニーを選び取り、ＰＣＲによってスクリーニングした。導入遺伝子が正しく組み込まれたコロニーを、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した５ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造者のプロトコルに従って使用して、培養された細菌から単離した。サンガー配列決定をＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄで行った。ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｐｒｏ（ＤＮＡＳＴＡＲ、バージョン１７．０．１．１８３）を使用して配列を分析した。
ゲノムＤＮＡを、プロテイナーゼＫ（０．１μｇ；シグマ・アルドリッチ）を含有する１００μｌの尾部溶解緩衝液（１００ｍＭトリス［ｐＨ８．５］、５ｍＭのＮａ－ＥＤＴＡ、０．２％のＳＤＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘ Ｃｏｍｆｏｒｔシェーカーで１０００ｒｐｍで５６℃でインキュベートすることによって、遺伝子改変ヒトＴ細胞から抽出した。１時間後、酵素を９５℃で１５分間熱不活性化した。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分）後、試料を１：１の体積比でイソプロパノールと混合することによってＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡをペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、風乾し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水に再懸濁した。最後に、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＤＮＡの濃度を測定した。ＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＡＲ導入遺伝子の正しい挿入を検証するために、プライマーを相同性の５’および３’アームの外側に設計した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＰＣＲの後、ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルでのゲル電気泳動によってサイズ分離し、正しいアンプリコン長をＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＰＣＲおよびＧｅｌ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ；製造業者のプロトコルに従う）を用いて精製した。１００ｎｇの溶出ＤＮＡを、ＤＮＡの量を増加させるために同じプライマーを用いた、さらなるＰＣＲ増幅のために利用した。ＰＣＲアンプリコンを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＰＣＲおよびＧｅｌ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して清浄化し、ＣｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２２℃で２時間、ｐＪＥＴ １．２／平滑末端クローニングベクターにライゲートした。コンピテント細菌（ＪＭ１０９）への細菌形質転換および３７℃での一晩のインキュベーションの後、３２個のコロニーを選び取り、ＰＣＲによってスクリーニングした。導入遺伝子が正しく組み込まれたコロニーを、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した５ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造者のプロトコルに従って使用して、培養された細菌から単離した。サンガー配列決定をＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄで行った。ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｐｒｏ（ＤＮＡＳＴＡＲ、バージョン１７．０．１．１８３）を使用して配列を分析した。
【0255】
非ウイルス性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの編集によるヒトＣＤ１２３－ＣＡＲ Ｔ細胞の生成
各エレクトロポレーションの前にＣａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を新たに生成した。解凍したｃｒＲＮＡ（ＴＲＡＣ遺伝子座に特異的であり、先行して公表のＲＯＴＨ ｅｔ ａｌ．２０１８）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（両方ともＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、２００μＭで再懸濁）を１：１のモル比（それぞれ１２０ｐｍｏｌ）で混合し、９５℃で５分間変性させ、室温で１０から２０分間アニールさせて、８０μＭの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）溶液を複合化させた。ポリグルタミン酸（ＰＧＡ；１００ｍｇ／ｍｌで１５から５０ｋＤａ；シグマ・アルドリッチ）を０．８：１の体積比でｓｇＲＮＡに添加した。最後に、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を複合化するために、６０ｐｍｏｌの組換えＣａｓ９（４０μＭ、カリフォルニア大学バークレー校）を新たに調製したｓｇＲＮＡ（モル比Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ＝１：２）と混合し、暗所において室温で２０分間インキュベートした。
各エレクトロポレーションの前にＣａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を新たに生成した。解凍したｃｒＲＮＡ（ＴＲＡＣ遺伝子座に特異的であり、先行して公表のＲＯＴＨ ｅｔ ａｌ．２０１８）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（両方ともＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、２００μＭで再懸濁）を１：１のモル比（それぞれ１２０ｐｍｏｌ）で混合し、９５℃で５分間変性させ、室温で１０から２０分間アニールさせて、８０μＭの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）溶液を複合化させた。ポリグルタミン酸（ＰＧＡ；１００ｍｇ／ｍｌで１５から５０ｋＤａ；シグマ・アルドリッチ）を０．８：１の体積比でｓｇＲＮＡに添加した。最後に、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を複合化するために、６０ｐｍｏｌの組換えＣａｓ９（４０μＭ、カリフォルニア大学バークレー校）を新たに調製したｓｇＲＮＡ（モル比Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ＝１：２）と混合し、暗所において室温で２０分間インキュベートした。
【0256】
エレクトロポレーションの前に、単離されたヒトＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）により、１：１の細胞対ビーズ比で、組換えヒトサイトカインＩＬ－２（１５０Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂａｓｅｌで購入）、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄシステム）およびＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄシステム）と共に、３７℃、５％のＣＯ２、１．５から２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、４８時間活性化した。
【0257】
エレクトロポレーションは、プログラムＥＨ－１１５を用いて４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ）で行った。活性化後、再懸濁したＴ細胞をＥａｓｙＳｅｐ（商標）磁石に２分間入れることによって、ＣＤ３／ＣＤ２８－Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去した。各エレクトロポレーションについて、１×１０６個の活性化Ｔ細胞を使用し、ＰＢＳで１回洗浄し、次いで２０μｌのＬｏｎｚａ補充Ｐ３エレクトロポレーション緩衝液に再懸濁した。別個の９６ウェル培養プレートにおいて、ＨＤＲＴ（３μｇから４μｇ）およびＲＮＰ（６０ｐｍｏｌ）を完全に混合し、５分間インキュベートした。次いで、細胞を添加し、混合し、全体積を１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）ストリップに移した。エレクトロポレーションの直後に、予熱した補足培地８０μｌを各キュベットに添加し、３７℃でインキュベートした。２０分後、細胞を４８ウェル培養プレートに１×１０６細胞／ｍｌで移し、ＩＬ－２ ５００Ｕ／ｍｌを補充した。培地およびＩＬ－２を２日ごとに補充し、細胞を１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で維持した。エレクトロポレーション後３日目から５日目のフローソーティングの後、補充した培地を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（１０’０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）で補完し、その後の実験に使用するまで細胞を５から６日間増殖させた。対照Ｔ細胞に、不完全なＲＮＰ（特異的ｃｒＲＮＡを欠く）をエレクトロポレーションし、そうでなければＣＡＲ Ｔ細胞と完全に同一にプロセシングした。
【0258】
インビトロのヒトＣＤ１２３－ＣＡＲ殺傷アッセイ
共培養の前日に、ＨＥＫ－２９３標的細胞（ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３、ＣＤ－１２３変異体）を製造者の説明書に従ってＣＴＶで染色し、補充したヒト培地で３７℃および５％のＣＯ２で一晩維持した。フローソーティングされ、増殖されたＧＦＰ＋ＣＡＲ Ｔ細胞および対照細胞を、エフェクターと標的との比１０：１で、標的細胞に添加し、３７℃、５％のＣＯ２で、２４時間共培養した。特異的殺傷およびＴ細胞活性化をフローサイトメトリーによって測定した。特異的殺傷を、示された式、（１－ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養した生存標的細胞数／対照細胞と共培養した生存標的細胞数）＊１００に従い、計算した。Ａｘｉｏ Ｖｅｒｔ．Ａ１（Ｚｅｉｓｓ）の顕微鏡を使用して、細胞の形態を記録した。
共培養の前日に、ＨＥＫ－２９３標的細胞（ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３、ＣＤ－１２３変異体）を製造者の説明書に従ってＣＴＶで染色し、補充したヒト培地で３７℃および５％のＣＯ２で一晩維持した。フローソーティングされ、増殖されたＧＦＰ＋ＣＡＲ Ｔ細胞および対照細胞を、エフェクターと標的との比１０：１で、標的細胞に添加し、３７℃、５％のＣＯ２で、２４時間共培養した。特異的殺傷およびＴ細胞活性化をフローサイトメトリーによって測定した。特異的殺傷を、示された式、（１－ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養した生存標的細胞数／対照細胞と共培養した生存標的細胞数）＊１００に従い、計算した。Ａｘｉｏ Ｖｅｒｔ．Ａ１（Ｚｅｉｓｓ）の顕微鏡を使用して、細胞の形態を記録した。
【0259】
ヒトサイトカインの測定（ＥＬＩＳＡ）
共培養実験（ＢｉＴＥおよびＣＡＲ）の上清を回収し、ヒトサイトカインの測定のために－２０℃で保存した。ＩＦＮγを、比色ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を製造者の説明書に従って使用して測定した。手短に言えば、ヒトＩＦＮγ特異的捕捉抗体を９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、サンプル（希釈率１：１０）および標準物を添加し、ビオチン化抗ヒトＩＦＮγ検出抗体とインキュベートした。その後、アビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液を添加し、比色基質ＴＭＢを使用して発色を誘導し、停止溶液で終了させた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで光学密度を読み取った。標準希釈から計算した標準的な曲線を実験ごとに二連で実行した。データをｐｇ／ｍｌで示す。
共培養実験（ＢｉＴＥおよびＣＡＲ）の上清を回収し、ヒトサイトカインの測定のために－２０℃で保存した。ＩＦＮγを、比色ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を製造者の説明書に従って使用して測定した。手短に言えば、ヒトＩＦＮγ特異的捕捉抗体を９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、サンプル（希釈率１：１０）および標準物を添加し、ビオチン化抗ヒトＩＦＮγ検出抗体とインキュベートした。その後、アビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液を添加し、比色基質ＴＭＢを使用して発色を誘導し、停止溶液で終了させた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで光学密度を読み取った。標準希釈から計算した標準的な曲線を実験ごとに二連で実行した。データをｐｇ／ｍｌで示す。
【0260】
統計分析
Ｐｒｉｓｍ ９．１．２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で統計分析を行った。Ｎ個の値が各図の凡例の中で見出される。
Ｐｒｉｓｍ ９．１．２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で統計分析を行った。Ｎ個の値が各図の凡例の中で見出される。
【0261】
８．２結果
ＣＡＲ Ｔ細胞媒介Ｔ細胞活性化
図８は、標的細胞ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３、Ｅ５１Ｋ、および対照細胞またはＣＤ１２３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかの１日の共培養後のエフェクターＴ細胞活性化（ＣＤ６９）を表すＦＡＣＳプロットを示す。単独のＣＤ６９＋ＣＡＲ Ｔ細胞（エフェクターＴ細胞）、または２４時間の共培養後のＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３もしくはすべてのＣＤ１２３変異体の存在下のＣＤ６９＋ＣＡＲ Ｔ細胞の概要である。データを、ＨＥＫ標的細胞の存在下における％ＣＤ６９＋細胞に対して正規化する。
ＣＡＲ Ｔ細胞媒介Ｔ細胞活性化
図８は、標的細胞ＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３、Ｅ５１Ｋ、および対照細胞またはＣＤ１２３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかの１日の共培養後のエフェクターＴ細胞活性化（ＣＤ６９）を表すＦＡＣＳプロットを示す。単独のＣＤ６９＋ＣＡＲ Ｔ細胞（エフェクターＴ細胞）、または２４時間の共培養後のＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３もしくはすべてのＣＤ１２３変異体の存在下のＣＤ６９＋ＣＡＲ Ｔ細胞の概要である。データを、ＨＥＫ標的細胞の存在下における％ＣＤ６９＋細胞に対して正規化する。
【0262】
ＣＡＲ Ｔ細胞媒介性細胞殺傷
図９は、共培養の１日目にＣＤ１２３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞によるＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびその変異体のフローサイトメトリーによって測定された特異的殺傷の定量化を示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。３人の独立した血液ドナーおよび群あたり２回の技術的反復実験からのデータである。
図９は、共培養の１日目にＣＤ１２３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞によるＨＥＫ、ＨＥＫ－ＣＤ１２３およびその変異体のフローサイトメトリーによって測定された特異的殺傷の定量化を示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。３人の独立した血液ドナーおよび群あたり２回の技術的反復実験からのデータである。
【0263】
９．選択された変異体の親和性の測定：
９．１材料および方法
全ＢＬＩ実験は、１×Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＰＮ：１８－１１０５）を用いて１０００ｒｐｍで振盪しながら、２５℃でＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅまたはＯｃｔｅｔ Ｒ８で行った。
９．１材料および方法
全ＢＬＩ実験は、１×Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＰＮ：１８－１１０５）を用いて１０００ｒｐｍで振盪しながら、２５℃でＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅまたはＯｃｔｅｔ Ｒ８で行った。
【0264】
ＣＳＬ３６２ ｈＩｇＧ１のＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体への結合
ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体（分析物）への抗体ＣＳＬ３６２ ｈＩｇＧ１の結合を、低濃度（５０ｎＭ）と高濃度（３００ｎＭ）の分析物で実施した。
ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体（分析物）への抗体ＣＳＬ３６２ ｈＩｇＧ１の結合を、低濃度（５０ｎＭ）と高濃度（３００ｎＭ）の分析物で実施した。
【0265】
抗体ＣＳＬ３６２ ｈＩｇＧ１を、抗ヒトＦｃキャプチャバイオセンサ（ＡＨＣ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＰＮ：１８－５０６０）によって０．５μｇ／ｍＬで３００秒間捕捉した。分析物ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体（高分析物濃度でのＣＤ１２３ ＥＣＤ変異体のみ）を、５０ｎＭから０．７８ｎＭ（３００ｎＭから４．７ｎＭ）の７つの濃度で滴定した。分析物との会合を３００秒間、解離を６００秒間（９００秒間）監視した。二重の参照の減算を、緩衝液のみのウェルおよび陰性のｈＩｇＧ１対照を負荷したバイオセンサに対して行った。再生を１０ｍＭのＧｌｙ－ＨＣｌ、ｐｈ１．７で行った。Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ ＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアＨＴ １２．０を使用してデータを分析した。データを１：１結合モデルに適合させた（可能な場合）。速度論的速度ｋａおよびｋｄを全体に適合させた。図１０Ａ、Ｂ、Ｅ、およびＦの定性的な説明では、結合レベルは、すべての濃度について２８０秒の会合で得られた。
【0266】
６Ｈ６ ｍＩｇＧ１のＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体への結合
ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体（分析物）への抗体６Ｈ６ｍＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＰＮ：３０６００２）の結合を、ストレプトアビジン捕捉バイオセンサ（ＳＡ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＰＮ：１８－５０１９）を使用して行った。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｂｉｏｔｉｎ Ａｎｔｉ－ＬＣ－κ（マウス）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＰＮ：７１０３１５２１００）をＳＡチップにて１μｇ／ｍＬで６００秒間捕捉した。次いで、それらのバイオセンサを使用して、抗体６Ｈ６ ｍＩｇＧ１を２．５μｇ／ｍＬで３００秒間捕捉した。分析物ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体を５０ｎＭから０．７８ｎＭの７つの濃度で滴定した。分析物との会合を３００秒間、解離を６００秒間監視した。緩衝液のみのウェルを参照として使用した。再生を１０ｍＭのＧｌｙ－ＨＣｌ、ｐＨ１．７で行った。Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ ＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアＨＴ １２．０を使用してデータを分析した。データを１：１結合モデルに適合させた（可能な場合）。速度論的速度ｋａおよびｋｄを全体に適合させた。図１０ＣおよびＤの定性的な説明では、結合レベルは、すべての濃度について２５０秒の会合で得られた。
ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体（分析物）への抗体６Ｈ６ｍＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＰＮ：３０６００２）の結合を、ストレプトアビジン捕捉バイオセンサ（ＳＡ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＰＮ：１８－５０１９）を使用して行った。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｂｉｏｔｉｎ Ａｎｔｉ－ＬＣ－κ（マウス）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＰＮ：７１０３１５２１００）をＳＡチップにて１μｇ／ｍＬで６００秒間捕捉した。次いで、それらのバイオセンサを使用して、抗体６Ｈ６ ｍＩｇＧ１を２．５μｇ／ｍＬで３００秒間捕捉した。分析物ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体を５０ｎＭから０．７８ｎＭの７つの濃度で滴定した。分析物との会合を３００秒間、解離を６００秒間監視した。緩衝液のみのウェルを参照として使用した。再生を１０ｍＭのＧｌｙ－ＨＣｌ、ｐＨ１．７で行った。Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ ＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアＨＴ １２．０を使用してデータを分析した。データを１：１結合モデルに適合させた（可能な場合）。速度論的速度ｋａおよびｋｄを全体に適合させた。図１０ＣおよびＤの定性的な説明では、結合レベルは、すべての濃度について２５０秒の会合で得られた。
【0267】
フロテツズマブｈＩｇＧ１のＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体への結合
抗体フロテツズマブｈＩｇＧ１のＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔへの結合を、低濃度（５０ｎＭ）の分析物および高濃度（３００ｎＭ）の分析物のＣＤ１２３変異体（分析物）に対して行った。
抗体フロテツズマブｈＩｇＧ１のＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔへの結合を、低濃度（５０ｎＭ）の分析物および高濃度（３００ｎＭ）の分析物のＣＤ１２３変異体（分析物）に対して行った。
【0268】
抗体フロテツズマブｈＩｇＧ１を、抗ヒトＦｃキャプチャバイオセンサ（ＡＨＣ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＰＮ：１８－５０６０）によって０．５μｇ／ｍＬで３００秒間捕捉した。分析物ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体（高分析物濃度でのＣＤ１２３ ＥＣＤ変異体のみ）を、それぞれ、５０ｎＭから０．７８ｎＭまたは３００ｎＭから４．７ｎＭの７つの濃度で滴定した。分析物との会合を３００秒間、解離を６００秒間（ＣＤ１２３ｗｔ）および９００秒間（ＣＤ１２３変異体）監視した。二重の参照の減算を、緩衝液のみのウェルおよび陰性のｈＩｇＧ１対照を負荷したバイオセンサに対して行った。再生を１０ｍＭのＧｌｙ－ＨＣｌ、ｐＨ１．７で行った。Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ ＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアＨＴ １２．０を使用してデータを分析した。データを１：１結合モデルに適合させた（可能な場合）。速度論的速度ｋａおよびｋｄを全体に適合させた。図１０Ｇの定性的な説明では、結合レベルは、すべての濃度について２５０秒の会合で得られた。
【0269】
９．２結果
ＣＳＬ３６２抗体を固定化し、続いて組換えＣＤ１２３ ｗｔまたは示された変異体への結合を、時間の関数として、様々な濃度で測定した。野生型ＣＤ１２３は、用量依存的に結合したが（図１０Ａ、Ｂ）、変異体Ｅ５１Ｔ、Ｅ５１Ｋ、Ｅ５１Ｑ、Ｓ５９Ｐ、Ｓ５９ＥおよびＲ８４Ｅは、最大５０ｎＭまではＣＳＬ３６２に結合しなかった（図１０Ｂ）。結合が存在しないため、本発明者らは親和性を決定することができなかった。対照的に、野生型ＣＤ１２３およびすべての試験した変異体は、変異体のいずれとも重複しないエピトープに結合する対照抗体６Ｈ６に結合した。結合が低下した唯一の変異体は、Ｒ８４Ｅであり、これはＲ８４Ｅがタンパク質の安定性の低下をもたらすことを示し得る（図１０Ｄ）。本発明者らは、５０ｎＭの最大分析物濃度でＣＳＬ３６２に対する親和性を決定することができなかったので、最大３００ｎＭの分析物で、実験を繰り返した。これらの濃度では、野生型ＣＤ１２３をもはや測定することができなかった。この非常に高いタンパク質濃度でさえ、「非結合剤」（Ｅ５１Ｔ、Ｅ５１Ｋ、Ｅ５１Ａ、Ｓ５９Ｐ、Ｓ５９Ｅ、Ｓ５９Ｒ；Ｓ５９Ｆ；Ｒ８４Ｅ）として特徴付けられる試験変異体のいずれも、検出可能な結合を生じなかった（例えば、図１０Ｅ、Ｆ）。３００ｎＭで非常に弱い結合をもたらした変異体（Ｅ５１Ｑ、Ｓ５９Ｙ、Ｒ８４Ｔ、およびＲ８４Ｑ）は、「弱い結合剤」として特徴付けられた。したがって、試験したすべての非結合剤について、変異体Ｒ８４Ｅを除いて、６Ｈ６への結合は保存されたが、変異体とＣＳＬ３６２との間で相互作用を検出することはできなかった。
ＣＳＬ３６２抗体を固定化し、続いて組換えＣＤ１２３ ｗｔまたは示された変異体への結合を、時間の関数として、様々な濃度で測定した。野生型ＣＤ１２３は、用量依存的に結合したが（図１０Ａ、Ｂ）、変異体Ｅ５１Ｔ、Ｅ５１Ｋ、Ｅ５１Ｑ、Ｓ５９Ｐ、Ｓ５９ＥおよびＲ８４Ｅは、最大５０ｎＭまではＣＳＬ３６２に結合しなかった（図１０Ｂ）。結合が存在しないため、本発明者らは親和性を決定することができなかった。対照的に、野生型ＣＤ１２３およびすべての試験した変異体は、変異体のいずれとも重複しないエピトープに結合する対照抗体６Ｈ６に結合した。結合が低下した唯一の変異体は、Ｒ８４Ｅであり、これはＲ８４Ｅがタンパク質の安定性の低下をもたらすことを示し得る（図１０Ｄ）。本発明者らは、５０ｎＭの最大分析物濃度でＣＳＬ３６２に対する親和性を決定することができなかったので、最大３００ｎＭの分析物で、実験を繰り返した。これらの濃度では、野生型ＣＤ１２３をもはや測定することができなかった。この非常に高いタンパク質濃度でさえ、「非結合剤」（Ｅ５１Ｔ、Ｅ５１Ｋ、Ｅ５１Ａ、Ｓ５９Ｐ、Ｓ５９Ｅ、Ｓ５９Ｒ；Ｓ５９Ｆ；Ｒ８４Ｅ）として特徴付けられる試験変異体のいずれも、検出可能な結合を生じなかった（例えば、図１０Ｅ、Ｆ）。３００ｎＭで非常に弱い結合をもたらした変異体（Ｅ５１Ｑ、Ｓ５９Ｙ、Ｒ８４Ｔ、およびＲ８４Ｑ）は、「弱い結合剤」として特徴付けられた。したがって、試験したすべての非結合剤について、変異体Ｒ８４Ｅを除いて、６Ｈ６への結合は保存されたが、変異体とＣＳＬ３６２との間で相互作用を検出することはできなかった。
【0270】
１０．ＣＤ１２３アイソフォームはインターロイキン－３の結合を保存する
１０．１材料および方法
ｈＩＬ３のＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体への結合
ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体（リガンド）とのｈＩＬ３（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＰＮ：１１８５８－Ｈ０８Ｈ）（分析物）の結合を、ストレプトアビジン捕捉バイオセンサ（ＳＡ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＰＮ：１８－５０１９）を用いて作製した。ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体を、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｔｙｐｅ Ｂ（Ａｂｃａｍ、ＰＮ：ａｂ２０１７９６）を、製造者の説明書に従って使用してビオチン化した。ビオチン化ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体（リガンド）をＳＡチップにおいて１０００秒間捕捉して、１．５から２ｎｍのｎｍシフトを達成した。分析物ｈＩＬ３を５００ｎＭから７．８ｎＭの７つの濃度で滴定した。分析物との会合を３００秒間、解離を１２０秒間監視した。緩衝液のみのウェルを参照として使用した。再生は行わず、ビオチン化捕捉リガンドごとに新しいチップセットを使用した。Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ ＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアＨＴ １２．０を使用してデータを分析した。相互作用データのオン／オフ特性が速いため、定常状態分析を使用して分析した。図１１の結合レベルの定性的表示は、すべての濃度について２５０秒の会合で得られた。
１０．１材料および方法
ｈＩＬ３のＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体への結合
ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体（リガンド）とのｈＩＬ３（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＰＮ：１１８５８－Ｈ０８Ｈ）（分析物）の結合を、ストレプトアビジン捕捉バイオセンサ（ＳＡ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＰＮ：１８－５０１９）を用いて作製した。ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体を、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｔｙｐｅ Ｂ（Ａｂｃａｍ、ＰＮ：ａｂ２０１７９６）を、製造者の説明書に従って使用してビオチン化した。ビオチン化ＣＤ１２３ ＥＣＤｗｔおよび変異体（リガンド）をＳＡチップにおいて１０００秒間捕捉して、１．５から２ｎｍのｎｍシフトを達成した。分析物ｈＩＬ３を５００ｎＭから７．８ｎＭの７つの濃度で滴定した。分析物との会合を３００秒間、解離を１２０秒間監視した。緩衝液のみのウェルを参照として使用した。再生は行わず、ビオチン化捕捉リガンドごとに新しいチップセットを使用した。Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ ＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアＨＴ １２．０を使用してデータを分析した。相互作用データのオン／オフ特性が速いため、定常状態分析を使用して分析した。図１１の結合レベルの定性的表示は、すべての濃度について２５０秒の会合で得られた。
【0271】
１０．２結果
組換え野生型ＣＤ１２３または示された変異体をビオチン化し、捕捉した。インターロイキン－３（ＩＬ－３）の結合を時間の関数として決定した。
組換え野生型ＣＤ１２３または示された変異体をビオチン化し、捕捉した。インターロイキン－３（ＩＬ－３）の結合を時間の関数として決定した。
【0272】
組換え野生型ＣＤ１２３および示された変異体は、用量依存的にＩＬ－３に結合した。したがって、非結合変異体はＣＳＬ３６２に結合しないが、タンパク質は通常、対照抗体の６Ｈ６およびＩＬ－３によって結合される（図１１）。
【0273】
変異体Ｓ５９ＰおよびＲ８４Ｅは、ＷＴと比較してＩＬ３への結合がわずかに減少していることを示す。
【0274】
１１．熱的アンフォールディング
１１．１材料および方法
Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ ＲＴ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍでＤＳＦ分析を行った。ＤＭＳＯのＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ ５０００Ｘ（Ｓｉｇｍａ、ＰＮ：Ｓ５６９２）を５×の最終濃度で使用した。２０ｕＬの反応体積で１．５℃刻みで２５から９５℃までの温度勾配。「ＦＲＥＴ」走査モードを使用して蛍光を監視した。すべての試料を三連で０．２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度で分析した。タンパク質のアンフォールディング転移温度Ｔｍは、一次微分法を用いて計算した。
１１．１材料および方法
Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ ＲＴ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍでＤＳＦ分析を行った。ＤＭＳＯのＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ ５０００Ｘ（Ｓｉｇｍａ、ＰＮ：Ｓ５６９２）を５×の最終濃度で使用した。２０ｕＬの反応体積で１．５℃刻みで２５から９５℃までの温度勾配。「ＦＲＥＴ」走査モードを使用して蛍光を監視した。すべての試料を三連で０．２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度で分析した。タンパク質のアンフォールディング転移温度Ｔｍは、一次微分法を用いて計算した。
【0275】
１１．２結果
熱的アンフォールディングの測定は、ほとんどの変異体が除いて野生型ＣＤ１２３に匹敵する熱安定性を有することを実証した（図１２）。Ｒ８４Ｅは熱の安定性が低下していた。この結果は、Ｒ８４Ｅが、Ｒ８４Ｅの変異自体に影響されないエピトープに結合する対照抗体６Ｈ６との結合の減少を示した理由を説明し得る。加えて、変異体Ｒ８４Ｑはより低いＴｍを有する。
熱的アンフォールディングの測定は、ほとんどの変異体が除いて野生型ＣＤ１２３に匹敵する熱安定性を有することを実証した（図１２）。Ｒ８４Ｅは熱の安定性が低下していた。この結果は、Ｒ８４Ｅが、Ｒ８４Ｅの変異自体に影響されないエピトープに結合する対照抗体６Ｈ６との結合の減少を示した理由を説明し得る。加えて、変異体Ｒ８４Ｑはより低いＴｍを有する。
【0276】
１２．ＣＤ１２３変異体を発現する遺伝子操作されたＴＦ－１細胞
１２．１材料および方法
赤血球白血球のヒト細胞株ＴＦ－１（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ ３３４）を造血幹細胞（ＨＳＣ）のモデルとして使用した。Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体をＣＤ１２３の内因性ＤＮＡにノックインするために、ＴＦ－１細胞にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９およびＨＤＲ鋳型をエレクトロポレーションした。
１２．１材料および方法
赤血球白血球のヒト細胞株ＴＦ－１（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ ３３４）を造血幹細胞（ＨＳＣ）のモデルとして使用した。Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体をＣＤ１２３の内因性ＤＮＡにノックインするために、ＴＦ－１細胞にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９およびＨＤＲ鋳型をエレクトロポレーションした。
【0277】
各エレクトロポレーションの前にＣａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を新たに生成した。解凍したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（両方ともＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、２００μＭで再懸濁）を１：１のモル比（それぞれ１２０ｐｍｏｌ）で混合し、９５℃で５分間変性させ、室温で１０から２０分間アニールさせて、８０μＭの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）溶液を複合化させた。ポリグルタミン酸（ＰＧＡ；１００ｍｇ／ｍｌで１５から５０ｋＤａ；シグマ・アルドリッチ）を０．８：１の体積比でｓｇＲＮＡに添加した。最後に、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を複合化するために、６０ｐｍｏｌの組換えＣａｓ９（４０μＭ、カリフォルニア大学バークレー校）を新たに調製したｓｇＲＮＡ（モル比Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ＝１：２）と混合し、暗所において室温で２０分間インキュベートした。エレクトロポレーションの５分前に、５０ｐｍｏｌのＨＤＲ鋳型を複合体化ＲＮＰ（６０ｐｍｏｌ）に添加した。
【0278】
エレクトロポレーションは、Ｎｅｏｎ（商標）トランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して行った。各エレクトロポレーションについて、０．２×１０６個のＴＦ－１細胞を使用し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで１０μｌのＲ緩衝液に再懸濁した。Ｒ緩衝液中の細胞を複合体ＲＮＰ／ＨＤＲ鋳型と混合し、１２００Ｖ、４０ｍｓ、１パルスの条件で、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％のＦＣＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ、２ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ）を含む新鮮培地中０．４×１０６細胞／ｍｌで４８ウェル培養プレートに移し、２日ごとに分割した。
【0279】
エレクトロポレーションの１２日後、操作された細胞を、それらのＣＤ１２３変異体発現に従ってフローサイトメトリーによってバルク選別した。細胞を、ＭＩＲＧ１２３－ビオチン／Ｓｔｒｅｐ－ＰＥおよび６Ｈ６－Ｂｖ６５０で染色した。Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックイン（ＭＩＲＧ１２３－、６Ｈ６＋）、ＣＤ１２３ノックアウト（ＭＩＲＧ１２３－、６Ｈ６－）およびＷＴ細胞（ＭＩＲＧ１２３＋、６Ｈ６＋）を選別し、変異体の機能性を試験する前に１４日間培養した。
ＣＤ１２３ ＫＯに使用されるｓｇＲＮＡ：
ＧＴＣＴＴＴＡＡＣＡＣＡＣＴＣＧＡＴＡＴ（配列番号２９）
Ｅ５１Ｋ ＨＤＲ鋳型：
ＴＴＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣａＧＡｃＡＴｔａａｇＴＧＴＧＴＴＡＡＡＧＡＣＧＣＣＧＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＧＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＴＴＡ（配列番号３０）
Ｅ５１Ｔ ＨＤＲ鋳型：
ＴＴＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣａＧＡｃＡＴｔａｃｃＴＧＴＧＴＴＡＡＡＧＡＣＧＣＣＧＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＧＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＴＴＡ（配列番号３１）
ＣＤ１２３ ＫＯに使用されるｓｇＲＮＡ：
ＧＴＣＴＴＴＡＡＣＡＣＡＣＴＣＧＡＴＡＴ（配列番号２９）
Ｅ５１Ｋ ＨＤＲ鋳型：
ＴＴＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣａＧＡｃＡＴｔａａｇＴＧＴＧＴＴＡＡＡＧＡＣＧＣＣＧＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＧＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＴＴＡ（配列番号３０）
Ｅ５１Ｔ ＨＤＲ鋳型：
ＴＴＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣａＧＡｃＡＴｔａｃｃＴＧＴＧＴＴＡＡＡＧＡＣＧＣＣＧＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＧＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＴＴＡ（配列番号３１）
【0280】
１２．２結果
Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックインを有するＴＦ－１細胞を首尾よく生成することができた。細胞を選別し、Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体が抗体ＭＩＲＧ１２３との結合の喪失を示すことを確認することができた（データは示さず）。細胞を選別し、その後の実験のために分析する。
Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックインを有するＴＦ－１細胞を首尾よく生成することができた。細胞を選別し、Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体が抗体ＭＩＲＧ１２３との結合の喪失を示すことを確認することができた（データは示さず）。細胞を選別し、その後の実験のために分析する。
【0281】
１３．非結合変異体は、ＩＬ３と共に培養することによって富化することができる。
１３．１材料および方法
エレクトロポレーションの１２日後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、それらを２ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ（ＲＰＭＩ １６４０、１０％のＦＣＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ）または１０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ３（ＲＰＭＩ １６４０、１０％のＦＣＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ）を含む１ｍｌの培地に３０万の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞を６日間培養し、０、２、４および６日目に、フローサイトメトリーによって分析した。分析の日に、２００μｌの細胞を培養物から採取し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、それらを９６ウェルプレート中２ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含む２００μｌの培地に再懸濁し、３７℃および５％のＣＯ２で７時間インキュベートした後、ＭＩＲＧ１２３－ｂｉｏｔ／Ｓｔｒｅｐ－ＰＥおよび６Ｈ６－Ｂｖ６５０によるフローサイトメトリー染色を行った。ゲノムＤＮＡを２００μｌの培養物から０、２、４および６日目に抽出した。２、４および６日目に、４００μｌの培地を培養物に添加した。
１３．１材料および方法
エレクトロポレーションの１２日後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、それらを２ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ（ＲＰＭＩ １６４０、１０％のＦＣＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ）または１０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ３（ＲＰＭＩ １６４０、１０％のＦＣＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ）を含む１ｍｌの培地に３０万の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞を６日間培養し、０、２、４および６日目に、フローサイトメトリーによって分析した。分析の日に、２００μｌの細胞を培養物から採取し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、それらを９６ウェルプレート中２ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含む２００μｌの培地に再懸濁し、３７℃および５％のＣＯ２で７時間インキュベートした後、ＭＩＲＧ１２３－ｂｉｏｔ／Ｓｔｒｅｐ－ＰＥおよび６Ｈ６－Ｂｖ６５０によるフローサイトメトリー染色を行った。ゲノムＤＮＡを２００μｌの培養物から０、２、４および６日目に抽出した。２、４および６日目に、４００μｌの培地を培養物に添加した。
【0282】
１３．２結果
バルクＴＦ－１細胞を、対照（ｃｒＲＮＡなし）、ＫＯ（ｃｒＲＮＡはあるがＨＤＲＴなし）、またはＫＩ（ｃｒＲＮＡ＋ＫＩ ＨＤＲＴ、Ｅ５１ＫまたはＥ５１Ｔ）として培養した。ＩＬ－３またはＧＭ－ＣＳＦと共に培養した対照細胞は、ＭＩＲＧ１２３＋、６Ｈ６＋のままであった。ＧＭ－ＣＳＦと共に培養したＫＯ細胞は、ほとんどがＭＩＲＧ１２３－、６Ｈ６＋のままであった。対照的に、ＩＬ－３と共に徐々に培養したＫＯ細胞を含む培養物では、ＭＩＲＧ１２３＋、６Ｈ６＋細胞の集団が検出可能になった。６日目に、ＭＩＲＧ１２３＋、６Ｈ６＋集団が支配的であり、ＣＤ１２３受容体を発現する細胞がＩＬ３の存在下で競合的利点を有したことが実証された。ＫＩ細胞（Ｅ５１ＫまたはＥ５１Ｔ）では、ＭＩＲＧ１２３－６Ｈ６＋の集団だけでなく、ＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋細胞の集団も、ＩＬ３と共に徐々に増加した。これは、ＧＭ－ＣＳＦと共に培養した細胞ではあまり顕著ではなかった。したがって、ＫＩ細胞（ＭＩＲＧ１２３－６Ｈ６＋）は機能的受容体を有する。図１３を参照されたい。
バルクＴＦ－１細胞を、対照（ｃｒＲＮＡなし）、ＫＯ（ｃｒＲＮＡはあるがＨＤＲＴなし）、またはＫＩ（ｃｒＲＮＡ＋ＫＩ ＨＤＲＴ、Ｅ５１ＫまたはＥ５１Ｔ）として培養した。ＩＬ－３またはＧＭ－ＣＳＦと共に培養した対照細胞は、ＭＩＲＧ１２３＋、６Ｈ６＋のままであった。ＧＭ－ＣＳＦと共に培養したＫＯ細胞は、ほとんどがＭＩＲＧ１２３－、６Ｈ６＋のままであった。対照的に、ＩＬ－３と共に徐々に培養したＫＯ細胞を含む培養物では、ＭＩＲＧ１２３＋、６Ｈ６＋細胞の集団が検出可能になった。６日目に、ＭＩＲＧ１２３＋、６Ｈ６＋集団が支配的であり、ＣＤ１２３受容体を発現する細胞がＩＬ３の存在下で競合的利点を有したことが実証された。ＫＩ細胞（Ｅ５１ＫまたはＥ５１Ｔ）では、ＭＩＲＧ１２３－６Ｈ６＋の集団だけでなく、ＭＩＲＧ１２３＋６Ｈ６＋細胞の集団も、ＩＬ３と共に徐々に増加した。これは、ＧＭ－ＣＳＦと共に培養した細胞ではあまり顕著ではなかった。したがって、ＫＩ細胞（ＭＩＲＧ１２３－６Ｈ６＋）は機能的受容体を有する。図１３を参照されたい。
【0283】
１４．遺伝子編集された細胞はＩＬ３による刺激に応答性のままである
１４．１材料および方法
ＴＦ－１細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ３およびＳＣＦによる刺激に応答性であることが知られている。ＴＦ－１細胞（野生型、ノックアウト、ならびにＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックイン細胞を、ＩＬ３で刺激されるそれらの能力について試験した。
１４．１材料および方法
ＴＦ－１細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ３およびＳＣＦによる刺激に応答性であることが知られている。ＴＦ－１細胞（野生型、ノックアウト、ならびにＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックイン細胞を、ＩＬ３で刺激されるそれらの能力について試験した。
【0284】
ＴＦ－１（ＡＣＣ ３３４、ＤＳＭＺ）細胞を、１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）および２ｎｇ／ｍｌのｈＧＭ－ＣＳＦ（２１５－ＧＭ、バイオテクノロジー）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地で維持した。ｔｒａｃＲＮＡ／ｃｒＲＮＡミックス（配列番号２９から３１）およびＰＧＡによるＣａｓ９ハイブリダイゼーションのために、追加がなされた（実施例８．１「非ウイルス性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの編集によるヒトＣＤ１２３－ＣＡＲ Ｔ細胞の生成」に記載されている方法を参照されたい）。エレクトロポレーションの直前に、５０ｐｍｏｌの１８０ｂｐ長のｓｓＤＮＡ ＨＤＲ鋳型（ウルトラマーＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＩＤＴ）をＲＮＰに添加した。各エレクトロポレーションについて、２０万個のＴＦ－１細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０μｌのＲ緩衝液（Ｎｅｏｎ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １０ｕＬ）に再懸濁した。ＲＮＰ／ＨＤＲ鋳型の混合物を穏やかに添加し、設定１２００Ｖ、４０ｍｓ、１パルスでＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を、富化アッセイのために１１日間、および機能アッセイのためにフローサイトメトリーソーティングの前に１２日間、２から３日ごとに増殖させた。
【0285】
選別した細胞をＰＢＳで一回洗浄した後、それらを９６ウェル白色マイクロプレート透明平底（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）に分配した。各ウェルにおいて、１０，８００個の細胞を、ＧＭ－ＣＳＦを含まない（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％のＦＣＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ）１５０μｌの培地で、増加する濃度のｈＩＬ３（０．２ｎｇ／ｍｌ、０．８ｎｇ／ｍｌ、３．１３ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）と共に培養した。細胞の増殖を、１５μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して３７Ｃ、５％のＣＯ２で、７２時間後に測定した。発光を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して１秒の積分時間で読み取った。
【0286】
１４．２結果
結果を図１４に示す。ＣＤ１２３のＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体を発現するＴＦ－１ノックイン細胞は、ｈＩＬ３の添加により、野生型ＣＤ１２３を発現するＴＦ－１細胞と同程度に増殖することができる。ノックアウト細胞は、ｈＩＬ３に対して最小限の応答しか示さない。
結果を図１４に示す。ＣＤ１２３のＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体を発現するＴＦ－１ノックイン細胞は、ｈＩＬ３の添加により、野生型ＣＤ１２３を発現するＴＦ－１細胞と同程度に増殖することができる。ノックアウト細胞は、ｈＩＬ３に対して最小限の応答しか示さない。
【0287】
１５．遺伝子編集された細胞は、ＭＩＲＧ１２３によるブロッキングから保護される
１５．１材料および方法
抗体ＭＩＲＧ１２３を、ＴＦ－１細胞（野生型、ノックアウト、ならびにＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックイン細胞）に結合するその能力について試験した。
１５．１材料および方法
抗体ＭＩＲＧ１２３を、ＴＦ－１細胞（野生型、ノックアウト、ならびにＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックイン細胞）に結合するその能力について試験した。
【0288】
選別した細胞をＰＢＳで一回洗浄した後、それらを９６ウェル白色マイクロプレート透明平底（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）に分配した。各ウェルにおいて、１０，８００個の細胞を、ＧＭ－ＣＳＦを含まない１５０μｌの培地（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％のＦＣＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ）中、固定の濃度のｈＩＬ３（２．５ｎｇ／ｍｌ）であるが異なる濃度のＭＩＲＧ１２３（０．００１３ｎＭ、０．００４ｎＭ、０．０１２ｎＭ、０．０３６ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１ｎＭ）で培養した。細胞の増殖を、１５μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して３７℃、５％のＣＯ２で、７２時間後に測定した。発光を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して１秒の積分時間で読み取った。
【0289】
１５．２結果
結果を図１５に示す。ＭＩＲＧ１２３は、ＩＬ３刺激野生型ＴＦ－１細胞の用量依存的な増殖遮断およびアポトーシスをもたらす。対照的に、ＣＤ１２３のＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体を発現するＴＦ－１ノックイン細胞は、ＭＩＲＧ１２３の遮断効果から効率的に保護される。
結果を図１５に示す。ＭＩＲＧ１２３は、ＩＬ３刺激野生型ＴＦ－１細胞の用量依存的な増殖遮断およびアポトーシスをもたらす。対照的に、ＣＤ１２３のＥ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体を発現するＴＦ－１ノックイン細胞は、ＭＩＲＧ１２３の遮断効果から効率的に保護される。
【0290】
１６．ＨＳＰＣの編集
１６．１材料および方法
ＨＳＰＣを、ＨＳＣ－Ｂｒｅｗ ＧＭＰサプリメント、２％ヒト血清アルブミン、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌおよび６０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補充したＨＳＣ－Ｂｒｅｗ ＧＭＰ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で０．５×１０６細胞／ｍｌの密度で解凍した。２日後に細胞をエレクトロポレーションした。解凍したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（両方ともＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、２００μＭで再懸濁）を１：１のモル比（それぞれ１２０ｐｍｏｌ）で混合し、９５℃で５分間変性させ、室温（ＲＴ）で５分間アニールさせて、８０μＭの単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）溶液を複合化させた。最後に、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を複合化するために、１μＭのＳｐｙｆｉ Ｃａｓ９（６１．８８９μＭのＡｌｄｅｖｒｏｎ）を、新たに調製したｇＲＮＡ（モル比Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ＝１：２）と混合し、ＲＴで２０分間インキュベートした。ＲＮＰ複合体化の間、ＨＳＰＣ細胞を収集し、エレクトロポレーション緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で２回洗浄し、１×１０６細胞／５０μｌでエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁した。次いで、細胞をＲＮＰ（５μｌ）およびＨＤＲＴ（５００ｐｍｏｌに相当する５μｌ）と混合し、全体積をエレクトロポレーション核キュベットに移した。エレクトロポレーションは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙを用いて、設定として６００Ｖ １００μｓバースト／４００Ｖ ７５０μｓスクエアを使用して行った。エレクトロポレーションの直後に、細胞を６ウェルプレートに移し、ＲＴで２０分間静置した。２０分後、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯおよび１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌを補充した２ｍＬの予熱ＨＳＰＣ培地を、各ウェルに添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。異なる時点で、細胞を回収し、抗体６Ｈ６－ＢＶ６５０およびＭＩＲＧ１２３－ｂｉｏｔ／Ｓｔｒｅｐ－ＰＥを用いてフローサイトメトリーのために染色した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、配列決定分析のためにＤＮＡ Ｑｕｉｃｋ抽出物（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して抽出した。ＣＤ１２３ ＫＯに使用したｓｇＲＮＡおよびＥ５１ＫおよびＥ５１ＴのＨＤＲ鋳型を、それぞれ配列番号２９から３１として実施例１２に示す。
１６．１材料および方法
ＨＳＰＣを、ＨＳＣ－Ｂｒｅｗ ＧＭＰサプリメント、２％ヒト血清アルブミン、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌおよび６０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補充したＨＳＣ－Ｂｒｅｗ ＧＭＰ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で０．５×１０６細胞／ｍｌの密度で解凍した。２日後に細胞をエレクトロポレーションした。解凍したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（両方ともＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、２００μＭで再懸濁）を１：１のモル比（それぞれ１２０ｐｍｏｌ）で混合し、９５℃で５分間変性させ、室温（ＲＴ）で５分間アニールさせて、８０μＭの単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）溶液を複合化させた。最後に、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を複合化するために、１μＭのＳｐｙｆｉ Ｃａｓ９（６１．８８９μＭのＡｌｄｅｖｒｏｎ）を、新たに調製したｇＲＮＡ（モル比Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ＝１：２）と混合し、ＲＴで２０分間インキュベートした。ＲＮＰ複合体化の間、ＨＳＰＣ細胞を収集し、エレクトロポレーション緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で２回洗浄し、１×１０６細胞／５０μｌでエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁した。次いで、細胞をＲＮＰ（５μｌ）およびＨＤＲＴ（５００ｐｍｏｌに相当する５μｌ）と混合し、全体積をエレクトロポレーション核キュベットに移した。エレクトロポレーションは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙを用いて、設定として６００Ｖ １００μｓバースト／４００Ｖ ７５０μｓスクエアを使用して行った。エレクトロポレーションの直後に、細胞を６ウェルプレートに移し、ＲＴで２０分間静置した。２０分後、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯおよび１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌを補充した２ｍＬの予熱ＨＳＰＣ培地を、各ウェルに添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。異なる時点で、細胞を回収し、抗体６Ｈ６－ＢＶ６５０およびＭＩＲＧ１２３－ｂｉｏｔ／Ｓｔｒｅｐ－ＰＥを用いてフローサイトメトリーのために染色した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、配列決定分析のためにＤＮＡ Ｑｕｉｃｋ抽出物（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して抽出した。ＣＤ１２３ ＫＯに使用したｓｇＲＮＡおよびＥ５１ＫおよびＥ５１ＴのＨＤＲ鋳型を、それぞれ配列番号２９から３１として実施例１２に示す。
【0291】
１６．２結果
Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックインを有する動員された末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、首尾よく生成することができた（図１６）。細胞をＦＡＣＳによって分析し、成功したノックインをＳａｎｇｅｒシーケンシングにより検証した。ＲＮＰ単独（ＫＯ）をエレクトロポレーションしたＨＳＰＣは、ＣＤ１２３陰性細胞の割合の増加を示した。対照的に、Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体は、対照抗体６Ｈ６によって評価した場合、抗体ＭＩＲＧ１２３への結合の喪失を示したが、ＣＤ１２３の発現を保存した（図１７）。ＣＤ９０およびＣＤ４５ ＲＡを使用して、本発明者らは、ＬＴ－ＨＳＣ（長期再増殖造血幹細胞）、ならびにＭＰＰ１細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０－ＣＤ４５ＲＡ－）およびＭＰＰ２細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０－ＣＤ４５ＲＡ＋）も編集されたことを示した（図１８）。
Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔノックインを有する動員された末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、首尾よく生成することができた（図１６）。細胞をＦＡＣＳによって分析し、成功したノックインをＳａｎｇｅｒシーケンシングにより検証した。ＲＮＰ単独（ＫＯ）をエレクトロポレーションしたＨＳＰＣは、ＣＤ１２３陰性細胞の割合の増加を示した。対照的に、Ｅ５１ＫおよびＥ５１Ｔ変異体は、対照抗体６Ｈ６によって評価した場合、抗体ＭＩＲＧ１２３への結合の喪失を示したが、ＣＤ１２３の発現を保存した（図１７）。ＣＤ９０およびＣＤ４５ ＲＡを使用して、本発明者らは、ＬＴ－ＨＳＣ（長期再増殖造血幹細胞）、ならびにＭＰＰ１細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０－ＣＤ４５ＲＡ－）およびＭＰＰ２細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０－ＣＤ４５ＲＡ＋）も編集されたことを示した（図１８）。
【0292】
１７．ＢｉＴＥを用いたインビトロのＨＳＰＣ殺傷アッセイ
１７．１材料および方法
ＢｉＴＥ殺傷アッセイのために、ＨＳＰＣを上記のように編集した。同じＨＳＰＣドナーのヒトＴ細胞を、製造者の説明書に従ってＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、磁気陰性選択によって、ＰＢＭＣから単離した。単離されたＴ細胞を、刺激なしで補充培地で一晩培養した。エレクトロポレーションの２日後、編集したＨＳＰＣを、３：１のエフェクター対標的の比のヒトエフェクターＴ細胞、および１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥと共に、９６ Ｕ底プレートで、３７℃で７２時間共培養した。細胞傷害活性（ＨＳＰＣの特異的殺傷および排除）をフローサイトメトリーによって分析した。特異的殺傷を以下のように計算した。（ＢｉＴＥを含む生存標的細胞の数／ＢｉＴＥを含まない生存標的細胞の数）＊１００。
１７．１材料および方法
ＢｉＴＥ殺傷アッセイのために、ＨＳＰＣを上記のように編集した。同じＨＳＰＣドナーのヒトＴ細胞を、製造者の説明書に従ってＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、磁気陰性選択によって、ＰＢＭＣから単離した。単離されたＴ細胞を、刺激なしで補充培地で一晩培養した。エレクトロポレーションの２日後、編集したＨＳＰＣを、３：１のエフェクター対標的の比のヒトエフェクターＴ細胞、および１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥと共に、９６ Ｕ底プレートで、３７℃で７２時間共培養した。細胞傷害活性（ＨＳＰＣの特異的殺傷および排除）をフローサイトメトリーによって分析した。特異的殺傷を以下のように計算した。（ＢｉＴＥを含む生存標的細胞の数／ＢｉＴＥを含まない生存標的細胞の数）＊１００。
【0293】
１７．２結果
ヒトエフェクターＴ細胞と対照または編集されたＨＳＰＣ細胞（Ｅ：Ｔ＝３：１）とを、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥの存在下で共培養すると、フローサイトメトリープロットの定量化によって測定した場合、ＢｉＴＥで処理すると野生型ＨＳＰＣが減少した。対照的に、ＣＤ１２３ Ｅ５１ＫまたはＥ５１Ｔ変異体を発現するＨＳＣは、ＭＩＲＧ１２３－６Ｈ６＋細胞の集団の増加によって証明されるように、保護され、富化された。図１９および図２０を参照されたい。さらに、７２時間の共培養後、ＨＳＣ細胞を、フローサイトメトリーを使用してＣＤ１２３抗体クローン６Ｈ６＋および６Ｈ６－細胞に選別した。ノックイン細胞の富化を、それぞれの細胞の集団のサンガーシーケンシングによって確認した。
ヒトエフェクターＴ細胞と対照または編集されたＨＳＰＣ細胞（Ｅ：Ｔ＝３：１）とを、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＣＤ３／ＣＳＬ３６２ ＢｉＴＥの存在下で共培養すると、フローサイトメトリープロットの定量化によって測定した場合、ＢｉＴＥで処理すると野生型ＨＳＰＣが減少した。対照的に、ＣＤ１２３ Ｅ５１ＫまたはＥ５１Ｔ変異体を発現するＨＳＣは、ＭＩＲＧ１２３－６Ｈ６＋細胞の集団の増加によって証明されるように、保護され、富化された。図１９および図２０を参照されたい。さらに、７２時間の共培養後、ＨＳＣ細胞を、フローサイトメトリーを使用してＣＤ１２３抗体クローン６Ｈ６＋および６Ｈ６－細胞に選別した。ノックイン細胞の富化を、それぞれの細胞の集団のサンガーシーケンシングによって確認した。
【0294】
１８．編集されたＨＳＰＣのインビボ生着
１８．１材料および方法
ＨＳＣ細胞を上記のように編集した。エレクトロポレーションの１日後、細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、１０×１０６個の生細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳに再懸濁した。前日に２００ｃＧｙを照射したＮＳＧ－ＳＧＭ３雌性マウス（３週齢）に細胞をｉ．ｖ．注射した。マウスおよびヒトＣＤ４５の６週間および１０週間の染色後に末梢血を分析することによって、生着をＦＡＣＳで監視した。マウスを、血液、脾臓および骨髄の分析のために、ヒト化の１３週間後に安楽死させた。
１８．１材料および方法
ＨＳＣ細胞を上記のように編集した。エレクトロポレーションの１日後、細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、１０×１０６個の生細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳに再懸濁した。前日に２００ｃＧｙを照射したＮＳＧ－ＳＧＭ３雌性マウス（３週齢）に細胞をｉ．ｖ．注射した。マウスおよびヒトＣＤ４５の６週間および１０週間の染色後に末梢血を分析することによって、生着をＦＡＣＳで監視した。マウスを、血液、脾臓および骨髄の分析のために、ヒト化の１３週間後に安楽死させた。
【0295】
１８．２結果
ＨＳＰＣの生着を、ＨＳＰＣ注射の１３週間後のマウスの脾臓におけるヒトＣＤ４５（ヒトキメラ現象）の割合を測定することによって定量化した。Ｅ５１ＫまたはＥ５１ＴノックインＨＳＰＣを投与されたマウスは、首尾よく生着し、ヒトＣＤ４５＋免疫細胞の発達の証拠を示した。さらに、脾臓および骨髄におけるヒトＣＤ４５細胞の中のＢ細胞（ＣＤ１９によって測定）、Ｔ細胞（ＣＤ３によって測定）およびＣＤ３３＋骨髄細胞の存在は、操作されたＥ５１ＫまたはＥ５１ＴノックインＨＳＰＣの多系統分化能の成功を実証する。ヒトＨＳＰＣが骨髄で検出された。
ＨＳＰＣの生着を、ＨＳＰＣ注射の１３週間後のマウスの脾臓におけるヒトＣＤ４５（ヒトキメラ現象）の割合を測定することによって定量化した。Ｅ５１ＫまたはＥ５１ＴノックインＨＳＰＣを投与されたマウスは、首尾よく生着し、ヒトＣＤ４５＋免疫細胞の発達の証拠を示した。さらに、脾臓および骨髄におけるヒトＣＤ４５細胞の中のＢ細胞（ＣＤ１９によって測定）、Ｔ細胞（ＣＤ３によって測定）およびＣＤ３３＋骨髄細胞の存在は、操作されたＥ５１ＫまたはＥ５１ＴノックインＨＳＰＣの多系統分化能の成功を実証する。ヒトＨＳＰＣが骨髄で検出された。
【0296】
本発明の実施において使用するための配列
ヒトＣＤ１２３（配列番号１）
ＭＶＬＬＷＬＴＬＬＬＩＡＬＰＣＬＬＱＴＫＥＤＰＮＰＰＩＴＮＬＲＭＫＡＫＡＱＱＬＴＷＤＬＮＲＮＶＴＤＩＥＣＶＫＤＡＤＹＳＭＰＡＶＮＮＳＹＣＱＦＧＡＩＳＬＣＥＶＴＮＹＴＶＲＶＡＮＰＰＦＳＴＷＩＬＦＰＥＮＳＧＫＰＷＡＧＡＥＮＬＴＣＷＩＨＤＶＤＦＬＳＣＳＷＡＶＧＰＧＡＰＡＤＶＱＹＤＬＹＬＮＶＡＮＲＲＱＱＹＥＣＬＨＹＫＴＤＡＱＧＴＲＩＧＣＲＦＤＤＩＳＲＬＳＳＧＳＱＳＳＨＩＬＶＲＧＲＳＡＡＦＧＩＰＣＴＤＫＦＶＶＦＳＱＩＥＩＬＴＰＰＮＭＴＡＫＣＮＫＴＨＳＦＭＨＷＫＭＲＳＨＦＮＲＫＦＲＹＥＬＱＩＱＫＲＭＱＰＶＩＴＥＱＶＲＤＲＴＳＦＱＬＬＮＰＧＴＹＴＶＱＩＲＡＲＥＲＶＹＥＦＬＳＡＷＳＴＰＱＲＦＥＣＤＱＥＥＧＡＮＴＲＡＷＲＴＳＬＬＩＡＬＧＴＬＬＡＬＶＣＶＦＶＩＣＲＲＹＬＶＭＱＲＬＦＰＲＩＰＨＭＫＤＰＩＧＤＳＦＱＮＤＫＬＶＶＷＥＡＧＫＡＧＬＥＥＣＬＶＴＥＶＱＶＶＱＫＴ
抗ＣＤ１２３抗体（フロテツズマブ）ＶＨ（配列番号１１）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＫＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗ＣＤ１２３抗体（フロテツズマブ）ＶＬ（配列番号１２）
ＤＦＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
抗ＣＤ１２３抗体（Ｖｉｂｅｃｏｔａｂａｍ）ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１３）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＫＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＭＧＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＲＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗ＣＤ１２３抗体（Ｖｉｂｅｃｏｔａｂａｍ）ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号１４）
ＤＦＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＴＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ（配列番号１５）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＰＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＤＹＹＭＫＷＡＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＴＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ｇＲＮＡ ＴＲＡＣ（配列番号２４）
ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
ＣＤ８－ヒンジドメイン（配列番号２５）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ
ＣＤ８膜貫通ドメイン（配列番号２６）
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ
４－１ＢＢ細胞質ドメイン（配列番号２７）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３－ゼータドメイン（配列番号２８）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ヒトＣＤ１２３（配列番号１）
ＭＶＬＬＷＬＴＬＬＬＩＡＬＰＣＬＬＱＴＫＥＤＰＮＰＰＩＴＮＬＲＭＫＡＫＡＱＱＬＴＷＤＬＮＲＮＶＴＤＩＥＣＶＫＤＡＤＹＳＭＰＡＶＮＮＳＹＣＱＦＧＡＩＳＬＣＥＶＴＮＹＴＶＲＶＡＮＰＰＦＳＴＷＩＬＦＰＥＮＳＧＫＰＷＡＧＡＥＮＬＴＣＷＩＨＤＶＤＦＬＳＣＳＷＡＶＧＰＧＡＰＡＤＶＱＹＤＬＹＬＮＶＡＮＲＲＱＱＹＥＣＬＨＹＫＴＤＡＱＧＴＲＩＧＣＲＦＤＤＩＳＲＬＳＳＧＳＱＳＳＨＩＬＶＲＧＲＳＡＡＦＧＩＰＣＴＤＫＦＶＶＦＳＱＩＥＩＬＴＰＰＮＭＴＡＫＣＮＫＴＨＳＦＭＨＷＫＭＲＳＨＦＮＲＫＦＲＹＥＬＱＩＱＫＲＭＱＰＶＩＴＥＱＶＲＤＲＴＳＦＱＬＬＮＰＧＴＹＴＶＱＩＲＡＲＥＲＶＹＥＦＬＳＡＷＳＴＰＱＲＦＥＣＤＱＥＥＧＡＮＴＲＡＷＲＴＳＬＬＩＡＬＧＴＬＬＡＬＶＣＶＦＶＩＣＲＲＹＬＶＭＱＲＬＦＰＲＩＰＨＭＫＤＰＩＧＤＳＦＱＮＤＫＬＶＶＷＥＡＧＫＡＧＬＥＥＣＬＶＴＥＶＱＶＶＱＫＴ
抗ＣＤ１２３抗体（フロテツズマブ）ＶＨ（配列番号１１）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＫＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗ＣＤ１２３抗体（フロテツズマブ）ＶＬ（配列番号１２）
ＤＦＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
抗ＣＤ１２３抗体（Ｖｉｂｅｃｏｔａｂａｍ）ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１３）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＫＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＭＧＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＲＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗ＣＤ１２３抗体（Ｖｉｂｅｃｏｔａｂａｍ）ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号１４）
ＤＦＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＴＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ（配列番号１５）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＥＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＰＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＤＹＹＭＫＷＡＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＴＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ｇＲＮＡ ＴＲＡＣ（配列番号２４）
ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ
ＣＤ８－ヒンジドメイン（配列番号２５）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ
ＣＤ８膜貫通ドメイン（配列番号２６）
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ
４－１ＢＢ細胞質ドメイン（配列番号２７）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３－ゼータドメイン（配列番号２８）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図10G】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】