特表 2024-530541 粘膜の癒着を予防、緩和或いは治療する薬物及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-22

(54)【発明の名称】粘膜の癒着を予防、緩和或いは治療する薬物及びその応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20240815BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240815BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20240815BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240815BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240815BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20240815BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20240815BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20240815BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240815BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240815BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240815BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240815BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240815BHJP

   A61P 13/00 20060101ALI20240815BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240815BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20240815BHJP

【ＦＩ】

A61K38/17

C12N15/12 ZNA

C07K14/47

C07K16/18

C12Q1/02

C12Q1/6851 Z

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

A61K31/7088

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K45/00

A61P1/00

A61P11/00

A61P13/00

A61P17/00

A61P19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024503774

(86)(22)【出願日】2022-07-22

(85)【翻訳文提出日】2024-03-18

(86)【国際出願番号】 CN2022107526

(87)【国際公開番号】W WO2023001304

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】202110833123.3

(32)【優先日】2021-07-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522293490

【氏名又は名称】シャンハイ シンヴィダ バイオテクノロジー カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ジュンリン

(72)【発明者】

【氏名】ファン，シュエメイ

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ヤンジュン

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045DA14

2G045DA36

2G045FB01

2G045FB02

2G045FB03

4B063QA01

4B063QQ20

4B063QQ53

4B063QR08

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS36

4B063QX02

4C084AA13

4C084AA17

4C084CA53

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA59

4C084ZA66

4C084ZA67

4C084ZA81

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB11

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC23

4C085GG02

4C085GG05

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA55

4C086MA56

4C086MA63

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA59

4C086ZA66

4C086ZA67

4C086ZA81

4C086ZA89

4C086ZA96

4C086ZB11

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA09

4H045DA76

4H045EA20

(57)【要約】

本発明は、癒着を予防、緩和又は治療する薬物及びその応用を提供する。本発明は、体腔内の外界からの刺激を受けた線維芽細胞内に、活性化負制御受容体Ｐｅａｒ１が存在し、線維芽細胞内のＰｅａｒ１の欠失により、体内の粘膜癒着の形成が顕著に促進され、Ｐｅａｒ１アゴニストは、線維芽細胞の活性化を特異的に阻害し、細胞外マトリックスを合成し、癒着性病変を改善することを開示する。Ｐｅａｒ１アゴニストを投与することにより、癒着の形成を効果的に防止できる。同時に、本発明は、Ｐｅａｒ１アゴニスト抗体を提供し、それが、正常な組織の修復や治癒に影響を与えず、組織に低酸素状態を引き起こさず、抗体薬物としての半減期が長く、拡散しやすく、副作用が少なく、投与に便利である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

癒着疾患を予防、緩和または治療するための薬物組成物の製造におけるＰｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質またはそのアゴニストの応用。

【請求項2】

前記癒着疾患は、粘膜癒着疾患、形質膜癒着疾患；好ましくは、前記癒着疾患は、損傷、出血、感染、異物刺激、腫瘍浸潤又は炎症性細胞浸潤後に形成される癒着疾患を含む；好ましくは、前記損傷により形成される癒着は術後癒着、放射線治療または化学療法後癒着を含み、前記感染により形成される癒着は炎症癒着を含む；好ましくは、前記癒着疾患は、消化器系、泌尿器系、呼吸系、生殖系、口腔、関節、皮膚内層の癒着疾患を含む；より好ましくは、腹腔、骨盤腔、胸腔、子宮、関節腔、心嚢、硬膜外または歯周部の癒着疾患を含む；より好ましくは、前記癒着疾患は、腹腔癒着、骨盤癒着、胸腔癒着または関節腔癒着であることを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項3】

前記Ｐｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質のアゴニストは、Ｐｅａｒ１の発現、活性、安定性、および／または有効作用時間を増強する薬剤を含む；好ましくは、Ｐｅａｒ１活性を特異的に活性化する抗体、その抗原結合断片またはバリアント、Ｐｅａｒ１を組換えて発現する発現構築物、Ｐｅａｒ１の化学アゴニスト、Ｐｅａｒ１遺伝子プロモーターの駆動能力を促進する発現アップレギュレーターを含む；より好ましくは、前記Ｐｅａｒ１の化学アゴニストは、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項4】

前記Ｐｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質、またはそのアゴニストは、以下のことにさらに使用されることを特徴とする請求項１に記載の応用：
粘膜線維芽細胞の活性化を阻害すること；
組織ヒドロキシプロリン含有量を低下させること；
病巣部の粘膜厚を下げること；
病巣における線維芽細胞の増殖または活性化を低下させること；
病巣におけるコラーゲンの合成を低下させること；または
癒着関連指標を下げること；好ましくは、前記指標は、フィブリノーゲン、α－平滑筋アクチン、ｔ－ＰＡ／ＰＡＩ、ＭＭＰ／ＴＩＭＰ、トランスフォーミング成長因子、血管内皮成長因子、腫瘍壊死因子および／またはインターロイキンを含む。

【請求項5】

予防、緩和または治療を必要とする対象に、Ｐｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質またはそのアゴニストを投与することを含む、癒着疾患を予防、緩和または治療する方法。

【請求項6】

有効量のＰｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質またはそのアゴニスト、および薬学的に許容される担体を含む、癒着疾患を予防、緩和または治療する薬物組成物またはキット。

【請求項7】

前記アゴニストは、Ｐｅａｒｌ活性を特異的に活性化する抗体、その抗原結合断片またはバリアントである；好ましくは、前記抗体は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、２７と２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、２７と２９に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、３０と２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１、２７と３２に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３、３４と３５に示される；及び／又は前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、ＧＡＴとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４７、ＳＡＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９、ＤＴＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＧＡＴとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２に示される；
より好ましくは、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４或いは１５に示され、或いは前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４或いは２５に示される；
ことを特徴とする請求項１に記載の応用、請求項５に記載の方法、または請求項６に記載の薬物組成物。

【請求項8】

癒着疾患を予防、緩和または治療する薬物または化合物をスクリーニングするためのＰｅａｒ１遺伝子またはそれがコードするタンパク質の応用。

【請求項9】

（１）候補物質でＰｅａｒ１を発現する、またはＰｅａｒ１を含む発現システムを処理すること；及び
（２）前記システム内のＰｅａｒ１の発現または活性を検出すること；
を含む；
前記候補物質が、統計的にＰｅａｒ１の発現または活性を増加させる場合、これは、当該候補物質が所望の薬物または化合物であることを示す、癒着疾患を予防、緩和または治療する薬物または化合物をスクリーニングする方法。

【請求項10】

ステップ（１）は、試験群では、前記発現システムに候補物質を添加することを含む；および／または、
ステップ（２）は、前記システムにおけるＰｅａｒ１の発現または活性を検出し、かつ対照群と比較することを含み、ここで、前記対照群は、候補物質を添加しない発現システムである；前記候補物質が統計的にＰｅａｒ１の発現または活性を増加させる場合、これは、当該候補物質が所望の薬物または化合物であることを示す；
を特徴とする請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年７月２２日に提出された中国出願番号２０２１１０８３３１２３．３の特許出願に基づく優先権を主張する。

【0002】

本発明は、生物医薬物分野に属し、癒着を緩和或いは治療することに関連する標的及びその調節分子に関わり、具体的に、癒着を緩和或いは治療することにおける標的としてのＰｅａｒ１の応用に関わり、さらに、Ｐｅａｒ１に標的する調節分子（例えば抗体）及びその応用に関わる。

【背景技術】

【0003】

人体と動物体の粘膜は、機体の重要な部分に属し、それは、主に機体の消化システム、泌尿器システム、呼吸システム、口腔、関節、皮膚内層などに被覆され、分布は比較的に広い。粘膜は、生体免疫システムの障壁を構成し、有害物質や病原微生物の侵入に抵抗でき、相応の損傷も現れ、粘膜病変を形成する。粘膜内には血管と神経があり、粘液を分泌することができる。

【0004】

複数の要因ＵＩ、例えば機械的損傷、感染などは、粘膜癒着を引き起こす。例えば、外科手術は、手術治療の効果を達成することができるが、外科介入は患者の組織、例えば腹膜などに異なる程度の損傷を与え、粘着性嚢膜炎、腹腔癒着、骨盤癒着、心嚢癒着、硬膜外癒着、歯周癒着、関節腔癒着を含む線維性接着を形成し、これは患者の身体機能の回復と予後効果を深刻に脅かし、例えば腹腔癒着による腸癒着、腸閉塞などの合併症は腹痛を引き起こし、そして生命に危害を及ぼす腸壊死と女性不妊を引き起こすことができる；また、癒着は、二次手術組織の分離が困難であり、手術出血量の増加を招く主な原因でもある。癒着は、手術後の人体自然治癒過程であるが、過剰な治癒は、過剰な癒着の形成を招き、臓器や組織の正常な活動機能に影響を与え、かつ二次手術に大出血の危険性をもたらす。

【0005】

手術による癒着は、１つの組織内から別の組織に延び、通常は、２つの傷ついた表面において、細胞外マトリックスタンパク質が損傷した組織上に堆積して組織癒着が発生する。手術による癒着の形成のメカニズムは複雑で、組織損傷後の修復の結果であり、手術による鋭性、機械性或いは熱損傷、感染、熱放射、局所虚血、脱水及び異物反応などの多種の要素と関係があり、組織創傷に基づいて一連の反応を続発し、大量のヒスタミン、キニンなどの血管活性物質の放出を招き、局所血管透過性が増加し、局所組織は、酸素不足に基づいて酸化ストレス損傷を発生し、局所的に大量に遊離した酸素、窒素ラジカルは、局所炎症反応をさらに誘発し、組織損傷を加重する。その後、細胞外マトリックスタンパク質は、局所的に堆積し、大量に滲出した白血球、マクロファージを含有し、その後、マトリックスタンパク質堆積と線維芽細胞増殖活性化により組織の治癒過程を完成し、細胞外フィブリン堆積が優勢であり、早期の癒着を形成する。その後、線維芽母細胞と血管が侵入し、局所的に血管化し、永久的な癒着を形成する。

【0006】

当分野にも、癒着を防止する薬物がいくつかあり、例えば癒着防止膜、癒着防止ゲルは手術終了前に傷口を植え込み、術後の癒着を防止するために使用できるが、現在の癒着防止膜などの薬物は、すべて生理的隔離であり、局所組織の酸欠を招き、傷口の治癒に影響を与えることがある。そのため、当分野では、組織の治癒に影響を与えずに組織器官の癒着を防止するための新しい癒着を防止する薬物の開発が切実に求められている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、粘膜の癒着を緩和又は治療する薬物及びその応用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の第１の態様では、癒着疾患を予防、緩和または治療するための薬物組成物の製造におけるＰｅａｒ１（血小板内皮凝集受容体１、Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）遺伝子、それがコードするタンパク質またはそのアゴニストの応用を提供する。

【0009】

１つの実施形態では、前記癒着疾患は、粘膜癒着疾患、形質膜癒着疾患；好ましくは、前記癒着疾患は、損傷、出血、感染、異物刺激、腫瘍浸潤又は炎症性細胞浸潤後に形成される癒着疾患を含むが、これらに限定されない；好ましくは、前記損傷により形成される癒着は術後癒着、放射線治療または化学療法後癒着を含み、前記感染により形成される癒着は炎症癒着を含む；好ましくは、前記癒着疾患は、消化器系、泌尿器系、呼吸系、生殖系、口腔、関節、皮膚内層の癒着疾患を含むが、これらに限定されない；より好ましくは、腹腔、骨盤腔、胸腔、子宮、関節腔、心嚢、硬膜外または歯周部の癒着疾患を含む。

【0010】

別の実施形態では、前記癒着疾患は、腹腔癒着、骨盤癒着、胸腔癒着または関節腔癒着である。

【0011】

別の実施形態では、前記Ｐｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質のアゴニストは、Ｐｅａｒ１の発現、活性、安定性、および／または有効作用時間を増強する薬剤を含む；好ましくは、Ｐｅａｒ１活性を特異的に活性化する抗体、その抗原結合断片またはバリアント、Ｐｅａｒ１を組換えて発現する発現構築物（発現ベクターを含む）、Ｐｅａｒ１の化学アゴニスト、Ｐｅａｒ１遺伝子プロモーターの駆動能力を促進する発現アップレギュレーターを含むが、これらに限定されない；より好ましくは、前記Ｐｅａｒ１の化学アゴニストは、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0012】

別の実施形態では、前記Ｐｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質、またはそのアゴニストは、以下のことにさらに使用される：粘膜線維芽細胞の活性化を阻害すること、組織ヒドロキシプロリン含有量を低下させること、病巣部の粘膜厚を下げること、病巣における線維芽細胞（例えば筋線維芽細胞）の増殖または活性化を低下させること、病巣におけるコラーゲンの合成を低下させること、または癒着関連指標を下げること；好ましくは、前記指標は、フィブリノーゲン（ＦＩＢ）、α－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）、ｔ－ＰＡ／ＰＡＩ、ＭＭＰ／ＴＩＭＰ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ－β１）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）および／またはインターロイキン（ＩＬ－６、ＩＬ－１７）を含む。

【0013】

本発明の別の態様では、予防、緩和または治療を必要とする対象に、Ｐｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質またはそのアゴニストを投与することを含む、癒着疾患を予防、緩和または治療する方法を提供する。

【0014】

本発明の別の態様では、有効量のＰｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質またはそのアゴニスト、および薬学的に許容される担体を含む、癒着疾患を予防、緩和または治療する薬物組成物またはキットを提供する。

【0015】

別の実施形態では、前記薬物組成物の剤形は、物理的形態に応じて、煎じ薬、注射剤、懸濁液などの液剤、凍結乾燥剤、散剤、顆粒剤、丸剤などの固形剤、軟膏、ペースト剤などの半固形剤、エアゾール剤、ドライパウダー吸入器、エアロゾル吸入剤などのガス剤から選ばれる。

【0016】

別の実施形態では、前記薬物組成物の剤形は、投与経路に応じて、以下から選ばれるものを含む：注射剤（例えば腔内（非静脈）、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および経穴注射など）、皮膚薬物送達製剤（例えばローション、コーティング剤、軟膏、経皮パッチなど）、粘膜薬物送達製剤（例えば経口フィルム、舌下錠、うがい薬など）、消化器剤（例えば煎じ薬、混合剤、顆粒剤、丸剤、錠剤など）、吸入剤（例えばエアゾール剤、ドライパウダー吸入剤、エアロゾル吸入剤など）、直腸用製剤（例えば坐剤、浣腸剤など）、またはそれらの組み合わせ。

【0017】

別の実施形態では、前記薬物組成物あるいはキットにおいて、成分または組成物の投与は、局所適用、局所注射、経皮吸収、皮下注射、吸入投与、および肺噴霧を含む。

【0018】

別の実施形態では、前記薬物組成物は、Ｐｅａｒ１アゴニストとして、ＦｃγＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、アプタマー、および小分子化合物の１つまたは複数をさらに含む；より好ましくは、ＦｃγＲ１α、デキストラン硫酸、およびフコイダンを含む。

【0019】

別の実施形態では、前記アゴニストは、Ｐｅａｒｌ活性を特異的に活性化する抗体、その抗原結合断片またはバリアントである；好ましくは、前記抗体は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、２７と２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、２７と２９に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、３０と２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１、２７と３２に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３、３４と３５に示される；及び／又は前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、ＧＡＴとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４７、ＳＡＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９、ＤＴＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＧＡＴとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２に示される。

【0020】

別の実施形態では、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４或いは１５に示され、或いは前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４或いは２５に示される。

【0021】

別の実施形態では、前記抗体は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む；前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示される；前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６に示され、或いは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４７、ＧＴＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８に示され、或いは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９、ＤＴＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０に示され、或いは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２に示され、或いは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３、ＬＶＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４に示される。

【0022】

別の実施形態では、前記バリアントは、抗体のＣＤＲ配列、ＦＲ配列、または全長配列において、１～数個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以内のアミノ酸残基が付加、欠失、または置換された配列である。

【0023】

別の実施形態では、前記バリアントは、Ｐｅａｒ１を標的にして活性化する活性を有するか、または実質的に有する。

【0024】

別の実施形態では、前記バリアントのＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるアミノ酸配列の第三位のＳからＡ或いはＴへ突然変異し、第六位のＧからＤへ突然変異し、及び／又は、第八位のＰからＴ或いはＹへ突然変異するものである；及び／又は、前記バリアントのＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるアミノ酸配列の第三位のＰからＳ或いはＧへ突然変異し、第四位のＹからＮへ突然変異し、及び／又は、第八位のＴからＡへ突然変異するものである；及び／又は、前記バリアントのＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示されるアミノ酸配列の第九位のＡからＤへ突然変異し、及び／又は、第十位のＹからＦへ突然変異するものである。

【0025】

別の実施形態では、前記抗体或いはそのバリアントのＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、３１、３３、３６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７、３０、３４、３７、とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０－４４に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；及び、ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、２９、３２、３５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；及び／又は、前記抗体或いはそのバリアントのＬＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、４７、４９、５１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；ＬＣＤＲ２は、ＧＡＴ、ＳＡＳ、ＤＴＳ、とＬＶＳに示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；及び、ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、４８、５０、５２或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む。

【0026】

別の実施形態では、前記抗体或いはそのバリアントのＨＦＲ（重鎖可変領域フレームワーク領域）１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５、５６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；ＨＦＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；及び、ＨＦＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；及び、ＨＦＲ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；及び／又は、
別の実施形態では、前記抗体或いはそのバリアントのＬＦＲ（軽鎖可変領域フレームワーク領域）１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７９、８０、８１、８２、８３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８４に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；ＬＦＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８５、８６、８７、８８、８９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９０に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；及び、ＬＦＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９８に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む；及びＬＦＲ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９９、１００、１０１、１０２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０３に示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つを含む。

【0027】

別の実施形態では、前記の抗体或いはそのバリアントは、それぞれに、以下のアミノ酸配列を含む：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＧＴＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＤＴＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＡＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＬＶＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＬＶＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＡＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＤＴＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＬＶＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＤＴＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＬＶＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＡＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＤＴＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＡＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＤＴＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３；或いは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３。

【0028】

別の実施形態では、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示される；或いは、前記軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示される。

【0029】

別の実施形態では、前記バリアントは、前記抗体のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。

【0030】

別の実施形態では、前記抗体は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖであり、例えば、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、もしくは単一ドメイン抗体であるか、または上記の抗体から調製されたモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体である。

【0031】

別の実施形態では、前記抗体またはそのバリアントは、全長抗体であり、当該全長抗体の重鎖定常領域は、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、またはｈＩｇＧ４の重鎖定常領域、またはその誘導体配列から選ばれる。

【0032】

別の実施形態では、前記抗体の軽鎖定常領域は、κ鎖もしくはλ鎖、またはそれらの誘導体配列から選ばれる。

【0033】

別の実施形態では、前記重鎖定常領域の誘導体配列は、前記ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、またはｈＩｇＧ４の重鎖定常領域の配列において、１～数個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以内のアミノ酸残基が付加、欠失、または置換された配列である。

【0034】

別の実施形態では、前記重鎖定常領域の誘導配列は、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、またはｈＩｇＧ４の重鎖定常領域と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。

【0035】

別の実施形態では、前記全長抗体の重鎖定常領域は、ｈＩｇＧ３もしくはｈＩｇＧ４の重鎖定常領域、あるいはその誘導体配列である。

【0036】

別の実施形態では、前記誘導配列は、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４の重鎖定常領域のアミノ酸配列において、１～２個のアミノ酸が置換された配列である。

【0037】

別の実施形態では、前記誘導配列は、ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ変異である。

【0038】

別の実施形態では、前記軽鎖定常領域は、ヒトκ鎖である。

【0039】

別の実施形態では、前記発現構築物（発現ベクター）は、ウイルスベクター、非ウイルスベクターを含み、例えば、前記発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターを含む。

【0040】

本発明の別の態様では、癒着疾患を予防、緩和または治療する薬物または化合物をスクリーニングするため（すなわち、薬剤スクリーニング標的として）のＰｅａｒ１遺伝子またはそれがコードするタンパク質の応用を提供する。

【0041】

本発明の別の態様では、癒着疾患を予防、緩和または治療する薬物または化合物（または潜在的な薬物または化合物）をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、（１）候補物質でＰｅａｒ１を発現する、またはＰｅａｒ１を含む発現システムを処理すること；及び（２）当該システム内のＰｅａｒ１の発現または活性を検出すること；を含む；前記候補物質が、統計的にＰｅａｒ１の発現または活性を増加させる場合、これは、当該候補物質が所望の（興味深い）薬物または化合物であることを示す。

【0042】

別の実施形態では、ステップ（１）は、試験群では、前記発現システムに候補物質を添加することを含み、および／または、ステップ（２）は、前記システムにおけるＰｅａｒ１の発現または活性を検出し、かつ対照群と比較することを含み、ここで、前記対照群は、候補物質を添加しない発現システムである；前記候補物質が統計的にＰｅａｒ１の発現または活性を増加させる（例えば、２０％を超える増加、好ましくは５０％を超える増加、好ましくは８０％を超える増加）場合、これは、当該候補物質が所望の（興味深い）薬物または化合物であることを示す。

【0043】

別の実施形態では、前記システムは、細胞システム（または細胞培養物システム）、サブ細胞システム（またはサブ細胞培養物システム）、溶液システム、組織システム、器官システムまたは動物システムから選ばれる。

【0044】

別の実施形態では、前記システムは、細胞または細胞培養物システムである。好ましくは、当該細胞は、Ｐｅａｒｌを発現もしくは過剰発現する；あるいは、当該細胞はＰｅａｒｌで処理され、ただし、前記Ｐｅａｒｌの濃度は０．００１ｎＭ～１Ｍである。

【0045】

別の実施形態では、前記細胞は、粘膜線維芽細胞を含む。

【0046】

別の実施形態では、粘膜線維芽細胞によってスクリーニングする場合、線維芽細胞の細胞外マトリックスを合成する能力を検出することによってさらなる判断／補助判断が行われ、対照群に比べて、試験群の細胞の細胞外マトリックスを合成する能力が弱る場合、対応する候補物質は、潜在的に望ましい（興味深い）薬物または化合物である。

【0047】

別の実施形態では、前記システムは、動物システムである。

【0048】

別の実施形態では、前記動物システムは、Ｐｅａｒ１ヒト化トランスジェニック動物である。

【0049】

別の実施形態では、前記動物は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、サル、ラマ、アルパカ、またはそれらの組み合わせを含む。

【0050】

別の実施形態では、動物によってスクリーニングする場合、ＢｈａｔｉａＤＳスコアまたはＺｕｈｌｋｅスコアによって、さらなる判断／補助判断が行われ、対照群に比べて、試験群のＢｈａｔｉａＤＳスコアまたはＺｕｈｌｋｅスコアが大幅に低下している場合、対応する候補物質は、潜在的に望ましい（興味深い）薬物または化合物である。

【0051】

別の実施形態では、動物によってスクリーニングする場合、組織ヒドロキシプロリン含有量の測定によって、さらなる判断／補助判断が行われ、対照群に比べて、試験群の組織ヒドロキシプロリン含有量が大幅に低下している場合、対応する候補物質は、潜在的に望ましい（興味深い）薬物または化合物である。

【0052】

別の実施形態では、動物によってスクリーニングする場合、癒着関連指標（例えば、フィブリノーゲン（ＦＩＢ）、α－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）、ｔ－ＰＡ／ＰＡＩ、ＭＭＰ／ＴＩＭＰ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ－β１）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）、インターロイキン（ＩＬ－６、ＩＬ－１７））の測定によって、さらなる判断／補助判断が行われ、対照群に比べて、試験群の癒着関連指標が大幅に低下している場合、対応する候補物質は、潜在的に望ましい（興味深い）薬物または化合物である。

【0053】

別の実施形態では、動物によってスクリーニングする場合、皮下粘膜と皮膚の厚さ、線維芽細胞の増殖、過剰な活性化とコラーゲンの合成に対する測定によって、さらなる判断／補助判断が行われ、対照群に比べて、試験群の皮下粘膜と皮膚の厚さ、線維芽細胞の増殖、過剰な活性化とコラーゲンの合成が大幅に低下している場合、対応する候補物質は、潜在的に望ましい（興味深い）薬物または化合物である。

【0054】

別の実施形態では、前記活性は、Ｐｅａｒ１を活性化する活性である。

【0055】

別の実施形態では、前記候補物質は、Ｐｅａｒ１、その断片またはバリアント、それがコードする遺伝子またはその上流および下流の分子またはシグナル伝達経路に対して設計された抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）；過剰発現／発現喪失／ダウンレギュレーションさせる分子、例えば構築物；活性を促進または阻害する分子；低分子化学分子；相互作用分子などを含むが、これらに限定されない。

【0056】

別の実施形態では、前記方法は、さらに、候補物質から癒着疾患の予防、緩和または治療に有用な組成物をさらに選択および決定するために、得られた薬物または化合物（潜在的な薬物または化合物）についてさらなる細胞実験および／または動物実験を行うことを含む。

【0057】

本文に開示された内容に基づき、当業者にとって、本発明の他の面は自明なものである。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】図１は、Ｐｅａｒ１欠失マウスは、対照マウスよりも重篤な皮下粘膜癒着を発症することを示す。Ａ、創傷のＨＥ染色では、Ｐｅａｒ１欠失マウスの創傷内で、増殖している多数の線維芽細胞と、体積的により大きな活性化された筋線維芽細胞の増加が示されている。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、表皮と真皮の厚さを計算した。Ｂ、創傷のマッソン染色で、コラーゲン面積を統計した。

【図2】図２は、抗Ｐｅａｒ１モノクローナル抗体は、粘膜線維芽細胞の活性化を阻害することを示す。Ａ、細胞培養上清中のヒドロキシプロリン含有量の検出。Ｂ、ＱＰＣＲで、線維芽細胞における細胞外マトリックスタンパク質コラーゲン１ａ２、平滑筋アクチンα２（ＡＣＴＡ２）の発現レベルを検出した。

【図3】図３は、抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体は、癒着の形成を阻害することを示す。Ａ、創傷のＨＥ染色、Ｂ、創傷のマッソン染色；対照群に比べて、抗Ｐｅａｒ１モノクローナル抗体ＬＦ２およびｈＬＦ１０５で治療したマウスでは、創傷の皮下粘膜におけるコラーゲンの沈着が少ないことが分かる。Ｃ、ＨＥ染色を統計し、対照群に比べて、抗Ｐｅａｒ１モノクローナル抗体ＬＦ２、ｈＬＦ１０５で治療したマウスでは、創傷において線維芽細胞が少なく、真皮の厚さが薄いことを示した。

【発明を実施するための形態】

【0059】

本発明者は、体腔内の外界からの刺激を受けた線維芽細胞内に、活性化負制御受容体Ｐｅａｒ１が存在し、線維芽細胞内のＰｅａｒ１の欠失により、体内の粘膜癒着の形成が顕著に促進され、Ｐｅａｒ１アゴニスト（Ｐｅａｒ１活性を特異的に活性化する抗体、アゴニスト抗体など）は、線維芽細胞の活性化を特異的に阻害し、細胞外マトリックスを合成し、癒着性病変を改善することを思いがけず初めて発見した。Ｐｅａｒ１アゴニストを投与することにより、癒着の形成を効果的に防止できる。さらに、本発明は、Ｐｅａｒ１アゴニスト抗体を提供し、それが、正常な組織の修復や治癒に影響を与えず、組織に低酸素状態を引き起こさず、抗体薬物としての半減期が長く、拡散しやすく、副作用が少なく、投与に便利である。

【0060】

本発明者は、線維性疾患の標的としてＰｅａｒ１を用いて先行特許を出願し、それが、Ｐｅａｒ１の活性を増強する抗体を構築し、線維芽細胞の過剰な活性化経路を阻害することで、線維性疾患の治療という目的を達成した。これらの出願は、出願日２０２０／１／２３の中国特許出願２０２０１００７６７２９．２および出願日２０２０／１１／３の中国特許出願２０２０１１２１２６３９．８を含む。上述の中国特許出願の全文が、本出願に引用される。本発明は、さらに、調節標的としてＰｅａｒ１を使用し、粘膜癒着の緩和または治療に関連する新しい治療計画を提案する。

【0061】

用語
本明細書で使用される場合、用語「粘膜」および「ねんまく」は、互換的に使用され、生物体（口、器官、胃、腸、尿道などの内部）における上皮組織および結合組織から構成される膜状の構造である。本発明においては、管腔臓器や関節腔の腔に面する上皮や結合組織を指しても良い。

【0062】

本明細書で使用される場合、「癒着」および「粘着」という用語は互換的に使用される。

【0063】

本明細書で使用される場合、「増強する」、「促進する」、および「向上する」、「増加する」などの用語は互換的に使用される；好ましくは、それらは統計的に有意な「増強」、「促進」、「向上」、または「増加」であり、例えば、２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、５０％以上、８０％以上、１００％以上、２００％以上、５００％以上の増加である。

【0064】

本明細書で使用される場合、「低下する」、「減少する」、「弱化する」などの用語は互換的に使用される；好ましくは、それらは統計的に有意な「抑制」、「低下」、「減少」、または「弱化」であり、例えば、２％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、３０％以下、５０％以下、８０％以下、１００％以下、２００％以下、５００％以下の低下である。

【0065】

本明細書で使用される場合、「治療」、「処理」および「処置」という用語は、１つまたは複数の活性成分を投与することで、症状または合併症の発症を予防または遅延し、及び病気、状態、または障害の発症を予防または遅延し、および／または、当該病気、状態、または障害を排除または制御し、及び当該病気、状態、または障害に関連する症状または合併症を軽減することを含む。「治療」という用語は、治療（すなわち、治癒的治療および／または緩和的治療）と予防（すなわち、予防的治療）の両方を含む。治療的治療とは、１つ又は複数の急性または慢性形態の前記病気を発症した患者に対する治療を指す。治療的治療は、特定の適応症の症状を緩和するための対症療法であってもよく、またはその適応症の症状を逆転または部分的に逆転させるための、または疾患の進行を予防または遅らせるための原因治療であっても良い。予防的治療（「予防」）とは、疾患が臨床的に発症する前に、リスクを軽減するために、前記状態の１つ以上を発症する前記リスクがある患者の治療を指す。

【0066】

本明細書で使用する場合、「標的活性化」という用語は、試験された分子が、標的の遺伝子、タンパク質またはその活性を活性化し、それによって、その発現または活性をアップレギュレートする能力を有すること指す。一般に、「標的活性化」には、その遺伝子又はタンパク質の発現量、活性レベル、影響される下流の経路又は分泌される物質などの１つまたは複数を測定することで計測することができる。

【0067】

本明細書で使用される場合、「受験者」および「対象」という用語は、生きている動物（例えば、哺乳類）を指し、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類などを含むが、これらに限定されなく、それらは、特定の治療を受けることになる。通常、「対象」と「患者」という用語は、互換的に使用される。

【0068】

本明細書で使用される場合、「含有」という用語は、各成分はともに本発明の混合物または組成物に応用しても良いことを示す。そして、用語「主に・・・からなる」と「・・・からなる」は、用語「含有する」に含まれる。「主に・・・からなる」と「・・・からなる」という用語は、用語「含有する」に含まれる。

【0069】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」成分は、ヒト及び／又は哺乳動物に適用され、過度の不良な副作用（例えば毒性、刺激とアレルギー反応）がないもので、すなわち合理な利益／リスク比がある物質である。「薬学的に許容される担体」という用語とは、治療剤の投薬に用いられる担体を指し、各種な賦形剤と希釈剤を含む。

【0070】

本明細書で使用する場合、「有効量」とは、本発明の薬学的に活性な成分の以下の量を意味し、前記量の本発明の薬学的に活性な成分は、（ｉ）当該特定の疾患または病気を治療または予防するか、（ｉｉ）当該特定の疾患または病気の１つまたは複数の症状を軽減、改善または解消するか、または（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患もしくは病気の１つ以上の症状の発症を予防もしくは遅延する。「有効量」、「安全有効量」、または「治療有効量」という用語は、本明細書では互換的に使用される。当業者（経験豊富な臨床医など）は、対象に応じて、「安全有効量」を調整することができる。

【0071】

本明細書で使用される場合、「抗体またはそのバリアント」という用語は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質、抗体断片またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、多重鎖または単鎖、または完全な免疫グロブリンであり、天然または組換えから由来することができる。特定の実施形態では、本発明の「抗体またはバリアント」は単離され、組換えから由来するものである。

【0072】

本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布を介して）抗原と特異的に相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも一部を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体、抗体断片（例えば、ヒンジ領域のジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）から形成される多重特異性抗体、および抗体から単離されたＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合断片を含むが、これらに限定されい。抗原結合断片は、単一ドメイン抗体、最大抗体、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、およびキメラ抗体に組み込むこともできる。

【0073】

範囲：本開示全体を通して、本発明のさまざまな態様は範囲形式で存在しても良い。理解すべきことは、範囲形式に対する説明は、単に便宜および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲を不可逆的に限定するものとして解釈されるべきではない。したがって、範囲に対する説明は、すべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の値を開示しているとみなされるべきである。たとえば、１～６などの範囲に対する説明は、サブ範囲（たとえば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など）とその範囲内の個々の値（例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、６など）を具体的に開示するものとみなされる必要がある。別の例として、９５～９９％の同一性の範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の範囲を含み、かつ、９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％、および９８～９９％の同一性のサブ範囲も含む。これは範囲の幅に関係なく適用される。

【0074】

癒着疾患
本発明において、「癒着」、「癒着疾患」および「癒着病変」は互換的に使用され、身体の粘膜または形質膜病変を指し、その誘発因子は数多くあり、損傷、出血、感染、異物刺激または腫瘍浸潤後に形成される癒着（術後癒着、放射線療法または化学療法後の癒着、炎症性癒着など）を含む。本発明に記載の癒着疾患は、生物体（口、器官、胃、腸、尿道などの内部）における上皮組織および結合組織から構成される膜状の構造である。本発明においては、線維芽細胞の過剰な活性化やコラーゲンの異常蓄積により、管腔臓器、臓器間、体腔、臓器または関節腔に面する上皮および結合組織に生じる異常過形成組織を指す場合もある。

【0075】

癒着病変は、消化器系、泌尿器系、呼吸器系、口腔、関節、皮膚内層などを含むがこれらに限定されない広範囲の身体部分で発生する可能性がある。癒着の形成には多くの理由があり、そのメカニズムは複雑ですが、その形成プロセスはほとんど類似しており、手術による癒着の形成を例として、癒着は、組織損傷後の修復の結果であり、手術による鋭性、機械性或いは熱損傷、感染、熱放射、局所虚血、脱水及び異物反応などの多種の要素と関係があり、組織創傷に基づいて一連の反応を続発し、大量のヒスタミン、キニンなどの血管活性物質の放出を招き、局所血管透過性が増加し、局所組織は、酸素不足に基づいて酸化ストレス損傷を発生し、局所的に大量に遊離した酸素、窒素ラジカルは、局所炎症反応をさらに誘発し、組織損傷を加重する。その後、細胞外マトリックスタンパク質は、局所的に堆積し、大量に滲出した白血球、マクロファージを含有し、その後、マトリックスタンパク質堆積と線維芽細胞増殖活性化により組織の治癒過程を完成し、細胞外フィブリン堆積が優勢であり、早期の癒着を形成する。その後、線維芽母細胞と血管が侵入し、局所的に血管化し、永久的な癒着を形成する。

【0076】

癒着のある患者の症状は、癒着の程度と場所によって異なる。たとえば、腹腔癒着や腸管癒着のある患者では、癒着により腸の蠕動運動が遅くなったり停滞したりすることがあり、軽症の場合は、明らかな不快症状がないか、食後に軽度の腹痛や膨満感を感じることもあるが、重症の場合は、腹痛や膨満感、排気不良、げっぷ、しゃっくり、乾いた便などを伴うことがよくある；正常な腸の蠕動は、食べ物のカスやガスを体外に排出することができるが、腸管癒着のある患者は、癒着により腸管が狭くなり、腸内容物の通過が妨げられ、腸内のガスや便がスムーズに排出されなくなり、腸内にガスや便がたまり続けると腸腔内の圧力も高まり、腸閉塞を引き起こす。さらに、癒着の存在により、局所組織の虚血、低酸素症、および壊死が発生しやすくなり、酸化ストレス損傷は、低酸素に基づいて局所組織で発生し、局所領域に多量の遊離酸素と窒素フリーラジカルが存在し、さらに局所炎症反応が誘発され、組織損傷が悪化し、その結果、２回目の手術での分離が困難になり、組織の脆弱性が増大し、周囲の接続組織の出血が増加し、手術がより困難になる。

【0077】

本発明の癒着疾患は、管腔臓器の腔、臓器間、臓器内部の上皮組織や結合組織など、特に手術、放射線療法、化学療法後の局所に生じる癒着疾患が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、腹腔、胸部、骨盤腔、関節腔などの腔内の場所を挙げられる。

【0078】

Ｐｅａｒ１遺伝子またはそのタンパク質及びおよび薬物スクリーニング標的としてのその応用
本発明は、線維芽細胞におけるＰｅａｒ１の欠失がインビボでの粘膜癒着の形成を有意に促進でき、Ｐｅａｒ１アゴニストは、線維芽細胞の活性化を特異的に阻害し、細胞外マトリックスを合成し、癒着病変を改善することを初めて開示する。

【0079】

Ｐｅａｒ１、すなわち血小板内皮凝集受容体１（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １，ＧｅｎｅＩＤ：３７５０３３）は、１５０ ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質であり、多上皮増殖因子様ドメイン受容体ファミリー（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＥＧＦ）タンパク質ファミリーのメンバーである。ヒトＰｅａｒ１は、１０３７個のアミノ酸（ａａ）を含み、ただし、２０ａａのシグナル配列、７３５ａａの細胞外ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ，ＥＣＤ）、２１ａａの膜貫通領域、および２６１ａａの細胞質領域を含む。Ｐｅａｒ１は、あらゆる哺乳類に存在し、かつ高い類似性を持ち、例えば、ヒトＰｅａｒ１とマウスＰｅａｒ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ： ７３１８２）の類似性は８４％である。

【0080】

本発明において、線維芽細胞特異的Ｐｅａｒ１ノックアウト動物に対して、腹部癒着モデルを用いた偽手術を行い、結果としては、Ｐｅａｒ１アゴニストで処理したマウスのＢｈａｔｉａＤＳスコアまたはＺｕｈｌｋｅスコアが、対照群に比べて有意に低いことが示された。組織ヒドロキシプロリン測定により、Ｐｅａｒ１アゴニストで処理した動物の組織ヒドロキシプロリン含有量が、対照群よりも有意に低いことが示された。

【0081】

Ｐｅａｒ１アゴニストで処理した動物では、癒着関連指標が対照群よりも有意に低かった。線維芽細胞特異的Ｐｅａｒ１ノックアウト動物を用いて、皮下粘膜癒着の形成を観察した結果は、Ｐｅａｒ１が、粘膜線維芽細胞の過剰な活性化と皮下粘膜癒着の形成を阻害することがわかった。

【0082】

本発明者らは、ＱＰＣＲにより、粘膜線維芽細胞における細胞外マトリックスタンパク質（例えばコラーゲン７ａ１（Ｃｏｌ ７ａ１）、平滑筋アクチンα２（ＡＣＴＡ２））の発現レベルを検出し、それを線維芽細胞の活性化とコラーゲン合成の特徴付けに使用した結果、Ｐｅａｒ１を標的とすることで粘膜線維芽細胞の活性化を阻害できることが示された。

【0083】

インビボでの癒着形成阻害におけるＰｅａｒ１の標的化の役割を検出するために、本発明者らは、ヒト化Ｐｅａｒ１動物の癒着モデルを構築し、同時に創傷部位にＰｅａｒ１アゴニスト処理を行い、結果としては、Ｐｅａｒ１アゴニストが、線維芽細胞の細胞外マトリックス合成能力を阻害することが示された。

【0084】

Ｐｅａｒ１の機能とメカニズムがわかれば、当該特徴に基づいて、Ｐｅａｒ１を標的として、Ｐｅａｒ１の発現や活性を促進する物質をスクリーニングすることができる。

【0085】

本発明は、癒着疾患を予防、緩和または治療するために使用できる物質（潜在的な物質を含む）をスクリーニングするための方法を提供し、当該方法は、以下を含む：Ｐｅａｒ１を発現するシステムまたはＰｅａｒ１が存在するシステムに候補物質を接触させる；及び、Ｐｅａｒ１に対する候補物質の効果を検測する；前記候補物質がＰｅａｒ１の発現または活性を増加させることができる場合、当該候補物質は、癒着疾患の予防、緩和または治療に使用できる物質であることを意味する。

【0086】

本発明の好ましい態様においては、スクリーニングの際に、Ｐｅａｒ１とそれが関与するシグナル伝達経路タンパク質またはその上流および下流タンパク質の発現または活性の変化をより簡単に観察するために、対照群を設定することもでき、前記対照群は、前記候補物質を添加しないＰｅａｒ１を発現するシステムまたはＰｅａｒ１を含むシステムとするであっても良い。

【0087】

前記発現システムは、例えば、細胞（または細胞培養物）システムであってもよく、前記細胞は、内因的にＰｅａｒ１を発現する細胞であってもよく、または、Ｐｅａｒ１を組換え的に発現する細胞であってもよい。前記Ｐｅａｒ１を発現するシステムは、サブ細胞システム、溶液システム、組織システム、器官システム、または動物システム（動物モデルなど）などであってもよいが、これらに限定されない。

【0088】

本発明の好ましい態様として、上記の方法は、さらに、得られた潜在物質に対してさらなる細胞実験および／または動物実験を実施して、癒着疾患の予防、緩和または治療に本当に有用な物質をさらに選択および確定することを含む。

【0089】

本発明は、Ｐｅａｒ１の発現、活性、存在量または分泌状況の検測方法に、特に制限はない。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ法、ＥＬＩＳＡなどの従来のタンパク質定量的または半定量的検出技術を使用できるが、これらに限定されない。

【0090】

一方、本発明は、前記スクリーニング方法で得られる化合物、組成物、薬物、あるいはいくつかの潜在物質も提供する。最初にスクリーニングされた物質は、スクリーニングライブラリーを形成することができ、人々は、最終的に癒着疾患の予防、緩和または治療に本当に有用な物質を、臨床用途に向けてスクリーニングすることができる。

【0091】

Ｐｅａｒ１アゴニストおよび組成物
本発明において、「アゴニスト」は、Ｐｅａｒ１遺伝子の発現を促進することにより作用する発現アップレギュレーターを含み、前記発現によって、より多くのＰｅａｒ１タンパク質が得られる（多重発現）場合、通常、Ｐｅａｒ１活性の増加も意味し、癒着疾患の抑制に役立つ。

【0092】

本発明においては、Ｐｅａｒ１の活性を向上する、Ｐｅａｒ１の安定性を維持する、Ｐｅａｒ１の発現を促進する、Ｐｅａｒ１の分泌を促進する、Ｐｅａｒ１の有効作用時間を延長する、または、Ｐｅａｒ１の転写および翻訳を促進することができる任意の物質を使用することができるが、Ｐｅａｒ１の機能／活性をアップレギュレートする有効な物質は、すべて「アゴニスト」または「アップレギュレーター」と呼ぶことができる。前記アップレギュレーターは、活性アップレギュレーターまたは発現アップレギュレーターであっても良い。

【0093】

本明細書で使用される場合、「アゴニスト」、「Ｐｅａｒ１アゴニスト」、または「Ｐｅａｒ１遺伝子またはそのタンパク質のアゴニスト」という用語は、互換的に使用され、いずれも、Ｐｅａｒ１遺伝子またはそのタンパク質の活性を増強し、および／またはＰｅａｒ１タンパク質に結合し、および／またはＰｅａｒ１を促進して線維芽細胞活性化シグナル伝達経路を阻害し、および／または線維芽細胞によるＥＣＭの放出を減少させることができる物質を指す。本発明の具体的な実施形態では、癒着疾患に対して優れた阻害効果を有する、Ｐｅａｒ１を調節標的とするＰｅａｒ１アゴニスト抗体を提供する。

【0094】

本発明の一実施形態として、前記Ｐｅａｒ１アップレギュレーターは、細胞に導入された後に、Ｐｅａｒ１を発現（好ましくは過剰発現）できる発現ベクターまたは発現構築物を含むが、これらに限定されない。通常、前記発現ベクターは、遺伝子カセットを含み、前記遺伝子カセットは、Ｐｅａｒ１をコードする遺伝子およびそれに作動可能に連結された発現制御配列を含む。「作動可能に連結された」または「作動可能に連結する」とは、直鎖状ＤＮＡ配列のある部分が、同じ直鎖状ＤＮＡ配列の他の部分の活性を調節または制御できる状況を指す。例えば、プロモーターが、配列の転写を制御する場合、当該プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。

【0095】

本発明において、Ｐｅａｒ１ポリヌクレオチド配列は、組換え発現ベクターに挿入されてもよく、そして、それを細胞に導入し、過剰発現させてＰｅａｒ１を産生することができる。宿主内で複製可能で安定している限り、任意のプラスミドとベクターを本発明に使用することができる。発現ベクターの重要な特徴の一つは、通常に、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子、および翻訳制御要素を含むことである。例えば、前記発現ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどを含む。

【0096】

好ましくは、本発明によって提供されるアゴニストは、Ｐｅａｒ１遺伝子またはそのタンパク質に結合して、Ｐｅａｒ１の構造を変化させ、それによって、線維芽細胞の活性化を阻害することができるアゴニストである。好ましくは、前記アゴニストは、Ｐｅａｒ１タンパク質を標的とし、かつそれに結合するアゴニストである。

【0097】

好ましい実施例では、本発明の抗体に加えて、本発明のアゴニストは、さらに、Ｐｅａｒ１に対する活性化作用を有する他の種類の物質（例えば、ＦｃαＲ１α（すなわち、ＩｇＥ受容体ＩａのＦｃ断片）、デキストラン硫酸、フコイダン、またはそれらの組み合わせ）を含んでも良く、Ｐｅａｒ１天然アプタマーおよび／または小分子化合物を含んでも良い；より好ましくは、ＦｃαＲ１α、デキストラン硫酸、とフコイダンを含む。

【0098】

本発明のＰｅａｒｌ標的を利用して、当業者はＰｅａｒ１に対する様々なアゴニストを設計することができ、小分子アゴニスト、抗体またはその活性断片、ｍｉＲＮＡなどを含むが、これらに限定されない。本発明において、前記小分子化合物は、天然に存在する、または人工的に開発されたＰｅａｒ１受容体の小分子アゴニストを指す場合もある。

【0099】

本発明において、前記アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング技術－指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化技術（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，ＳＥＬＥＸ）を通じて得られる構造化されたオリゴヌクレオチド配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指し、対応する標的分子（タンパク質、ウイルス、細菌、細胞、重金属イオンなど）は、厳密な認識能力と高い親和性を有する。

【0100】

本発明の好ましい実施態様として、Ｐｅａｒ１タンパク質に特異的に結合する／標的とする抗体またはそのバリアントを使用し、該抗体またはそのバリアントは、細胞レベルおよび動物レベルで、明確なＰｅａｒ１活性化効果を有することが確認されている。好ましくは、本発明の抗体またはそのバリアントは、マウス由来のモノクローナル抗体であり、または、組換え抗体、ポリクローナル抗体、多重鎖もしくは単鎖、または完全な免疫グロブリンであってもよい。好ましくは、本発明の抗体またはそのバリアントは、ヒト化されたものである。より好ましくは、本発明の抗体は、キメラ抗体である。好ましくは、本発明の抗体またはそのバリアントは、表１～４に示される通りである。

【0101】

前記Ｐｅａｒ１を標的とする抗体は、全長抗体および抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、ｓｃＦｖなどのＦｖ）を含み、それらを含む二重特異性抗体、多重特異性抗体、単一ドメイン抗体、またはこれらの抗体から調製されるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体も含む。前記抗体のＦａｂ断片（抗原結合断片、Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）は、抗原結合断片とも呼ばれ、抗原に結合できる抗体構造内の領域である。Ｆａｂ断片は、完全な軽鎖と重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインで構成される。パパインの作用下では、抗体は、２つのＦａｂ断片と１つのＦｃ断片に分解される；ペプシンの作用下では、抗体は、１つの（Ｆａｂ）２断片とＦｃ断片に分解される。

【0102】

本発明の抗体またはそのバリアントに使用できるＦａｂのＦＲ断片は、特に限定されない；好ましくは、本発明が、ヒトＩｇＧ４のＦＲおよび複数の変異を有するＦＲ配列を用い、その結果としては、ＦＲ配列を変更しても、抗原と抗体の結合力はあまり変化しない。これにより、本発明の抗体のＣＤＲ断片は、Ｐｅａｒ１タンパク質に対して非常に特異的かつ安定した結合機能を有することが分かる。当業者は、本発明のＰｅａｒ１標的およびそれが線維性疾患と相関する教示に基づき、本発明の抗体またはそのバリアントのＣＤＲを利用し、既知の様々なＦＲを使用して、構成された抗体をスクリーニングし、それによって、得られた本発明の抗体またはバリアントと同じまたは実質的に同じ活性を有する抗体も本発明の保護範囲に含まれる。

【0103】

本発明で使用できる抗体またはそのバリアントの定常領域は、特に限定されない。当業者は、本発明のＰｅａｒ１標的およびそれが線維性疾患と相関する教示に基づき、本発明の抗体またはそのバリアントを含むのに適した定常領域断片をスクリーニングし、それによって、本発明の抗体またはバリアントと同じまたは実質的に同じ活性を有する完全な抗体を得る。

【0104】

本発明は、さらに、有効量（例えば０．０００００１～２０重量％、好ましくは０．００００１～１０重量％）の前記Ｐｅａｒ１またはそのアゴニスト（例えば、そのアゴニスト、またはＰｅａｒ１を過剰発現する発現ベクター）、またはその類似体、および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

【0105】

本発明の組成物は、癒着疾患を予防、緩和または治療するために直接使用することができ、または、他の治療剤または補助剤と組み合わせて使用することもできる。

【0106】

一般に、これらの材料は、非毒性で、不活性で、薬学的に許容される水性担体媒体中で、通常、約５～８のｐＨ、好ましくは約６～８のｐＨで処方することができる。

【0107】

本発明の組成物は、安全有効量のＰｅａｒ１、またはそのアゴニスト（例えば、当該Ｐｅａｒ１を過剰発現する発現ベクター）、またはその類似体、および薬学的に許容される担体を含有する。このような担体としては、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。通常、薬物製剤は、投与形態に応じる必要であり、本発明の薬物組成物は、注射剤に調製して、例えば、生理食塩水やブドウ糖やその他の補助剤を含む水溶液を用いて常法により調製される。前記薬物組成物は、好ましくは、無菌条件下で製造される。活性成分の投与量は、治療有効量である。本発明の薬物製剤は、徐放性製剤とすることもできる。

【0108】

本発明に記載のＰｅａｒ１またはそのアゴニストの有効量は、投薬方式と治療しようとする疾病の重症度に応じて変更してもよい。好ましい有効量の選択は、当業者が様々な要因に基づいて決定することができる（例えば、臨床試験による）。かかる要因としては、前記Ｐｅａｒ１またはそのアゴニストの薬物動態学的パラメータ、例えばバイオアベイラビリティ、代謝、半減期など；患者の治療しようとする疾患の重症度、患者の体重、患者の免疫状況、投与経路などがある。

【0109】

本発明は、さらに、癒着疾患を予防、緩和または治療する方法を提供し、対象に、有効量のＰｅａｒ１またはそのアゴニスト（例えば、そのアゴニスト抗体またはＰｅａｒ１を過剰発現する発現ベクター）を投与することを含む。

【0110】

本発明のＰｅａｒ１またはそのアゴニストの投与方式は、特に限定されなく、全身的または局所的であっても良い。例えば、本発明のＰｅａｒ１またはそのアゴニストは、以下のものであってもよいが、これらに限定される：注射剤（例えば腔内（非静脈）、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および経穴注射など）、皮膚薬物送達製剤（例えばローション、コーティング剤、軟膏、経皮パッチなど）、粘膜薬物送達製剤（例えば経口フィルム、舌下錠、うがい薬など）、消化器剤（例えば煎じ薬、混合剤、顆粒剤、丸剤、錠剤など）、吸入剤（例えばエアゾール剤、ドライパウダー吸入剤、エアロゾル吸入剤など）、直腸用製剤（例えば坐剤、浣腸剤など）、またはそれらの組み合わせ。

【0111】

本発明の一実施形態として、前記Ｐｅａｒ１を、哺乳動物（例えばヒト）に直接投与でき、あるいは、Ｐｅａｒ１をコードする遺伝子を、常法により適当なベクター（例えば、通常の原核生物または真核生物発現ベクター、またはヘルペス ウイルス ベクターまたはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクター）にクローニングし、前記ベクターを、Ｐｅａｒ１を発現可能な細胞に導入することにより、Ｐｅａｒ１を発現することができる。適切な量の前記細胞を、哺乳動物の体の適切な部分に導入することで、Ｐｅａｒ１の発現を達成できる。

【0112】

Ｐｅａｒ１またはそのアゴニストの投与方式は、主に、前記アゴニストの種類と特性によって異なる。

【0113】

以下、具体的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の単なる例示であることが理解されるべく。以下の実施例における特定の条件を特定しない実験方法は、通常に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載された通常条件に従って実施され、或いはメーカーが推奨する条件に従って実施される。

【0114】

実験材料と方法
１．抗体の調製
本発明者らは、ヒトＰｅａｒ１細胞外タンパク質を使用してＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、標準的なマウス脾細胞およびマウス骨髄腫細胞融合技術を通じて高親和性モノクローナルハイブリドーマ細胞を調製し、標準的な抗体シークエンシング、２９３Ｓ細胞発現、および精製を通じて、抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体を得た。

【0115】

抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体ＬＦ２、ＬＦ３、ＬＦ７、ＬＦ１１、ＬＦ１５、ＬＦ１６抗体の軽鎖可変領域配列と重鎖可変領域配列を表１に、これらのＣＤＲ部分配列を表２に示す。

【0116】

【表1】

【0117】

【表2】

本発明はまた、ＣＤＲ移植の方法を採用し、上記抗体をヒト化し、フレームワーク領域内の部位に対して、異なる復帰突然変異を行った。ヒト化抗体ｈＬＦ１０１～１１６、ｈＬＦ－Ｎ５５Ｓ、ｈＬＦ－Ｎ５５Ｄ、ｈＬＦ－Ｎ５５Ｑ、ｈＬＦ－Ｇ５６Ａ、とｈＬＦ－Ｇ５６Ｖの配列も表３に示す。

【0118】

【表3】

本発明の抗体のＣＤＲ配列は、下記の表４のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６～５５に示され、これらの抗体のＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴのナンバリングルールを採用する。

【0119】

【表4】

２、モデルの構築
２．１粘膜癒着モデルの構築：腹膜癒着動物モデル
ヒト化マウスの腹腔盲端から３ｃｍ以内の虫垂を対象として文献（章志量ら、異なる原因によるラット腹膜癒着の実験研究、中国医学雑誌、２００５）中の方法でモデルを作って、３群に分け、群ごと２０匹である：Ａ、生理食塩水対照群；Ｂ、予防的に腹腔内へ抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体（ＬＦ２またはｈＬＦ１０５抗体を含む）０．５ｍｇ／ｋｇを投与する群、週１回；Ｃ、予防的に腹腔内へ抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体１ｍｇ／ｋｇを投与する群、週１回。２週間、４週間の２つの時点で、それぞれに、マウスを安楽死した後、腹部で逆「Ｕ」型切開し、元の手術切開を避けるように腹部に進入し、腹腔内全体の癒着状況を観察し、癒着組織と灌漑洗浄液検体を取り、さらに観察、検査を行った。腹膜癒着モデルの癒着程度を評価した。

【0120】

２．２皮下粘膜癒着モデルの構築
ペントバルビタールナトリウムで麻酔したマウスに、腹腔注射を行った。脱毛して消毒し、皮膚を切除した。シリカゲルプレートの片側に、接着剤を薄く塗り、クリップを傷の周りに同心に固定した。各クランプを、８針間隔で均一に断続的に縫合固定し、クランプを傷口の周囲の完全な組織に補強して固定し、傷口の縁が縮むのを防止した。無菌パッチを使用し、円形にカットし、シリカゲルプレートに貼り、動物による傷や咀嚼を防ぐために傷を保護した。本発明の抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体を、腹腔癒着モデルと同様に予防的に滴下した。

【0121】

３．モデルのメンテナンスと写真
マウスをイソフルランで麻酔し、イソフルラン流量を２％維持した。シリカゲルプレートにおける無菌パッチをはがし（はがさなくてもよい）、固定位置とスケールのそばで、傷の写真を撮った。必要に応じて、無菌パッチを貼り直すことができる。ＩｍａｇｅＪを使用して写真を処理し、スケールに基づき、傷の大きさを囲み、傷の面積を計算した。

【0122】

４．ヘマトキシリンとエオシン（ＨＥ）とマッソン染色
マウスの肺と肝臓を、４％のパラホルムアルデヒドで４８時間固定し、パラフィンに包埋した後、半自動回転ミクロトーム（ｌｅｉｃａ；ｒｍ２２３５とｃｍ１９５０）を使用して切片にし、室温で脱パラフィンし、勾配エタノールで再水和し、ＨＥとマッソンで染色した。

【0123】

５．ヒドロキシプロリンの検測
培養された粘膜または皮下組織から由来する線維芽細胞を１２時間飢餓状態にし、それぞれに、１μｇ／ｍＬの抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体（ＬＦ２抗体またはｈＬＦ１０５抗体を含む）を添加して細胞を処理し、３０分後、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβを添加して、細胞を４８時間処理し、細胞上清を回収し、南京建成生物技術有限会社のヒドロキシプロリン検出キットを使用し、説明書に従ってヒドロキシプロリン含有量を検出した。

【0124】

６．定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
方法５の粘膜線維芽細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して、標準プロトコールに従って、全ｍＲＮＡを抽出した。相補的ＤＮＡを、逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ）を使用して合成した。ＡＢＩ７０００リアルタイムＰＣＲ装置（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で、遺伝子発現を検出し、ＰＣＲプライマー配列を表５に示す。１８ｓＲＮＡ遺伝子を内部参照とした。

【0125】

【表5】

７．Ｐｅａｒ１ヒト化トランスジェニックマウスの構築
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術により、ヒトＰｅａｒ１遺伝子ノックインマウスを構築し、マウスＰｅａｒ１遺伝子コード領域のエクソン１－ＡＴＧの付近に、標的を設計し、相同組換えテンプレートの存在下では、外来遺伝子ヒトＰｅａｒ１を、部位特異的に標的位置に組み込み、マウスＰｅａｒ１遺伝子配列を置き換えた。

【0126】

８．統計的手法
すべてのデータは、Ｇｒａｐｈｐａｄ８．０ソフトウェアを使用して統計的に分析した。２つ群のデータの比較は、ｔ検定を使用して実行した。生存分析には、カプランマイヤー分析を使用した。すべてのデータ比較において、０．０３３未満のｐ値は、統計的に有意であるとみなされる。

【実施例1】

【0127】

実施例１．皮下粘膜線維芽細胞と真皮層の癒着との相関関係
線維芽細胞特異的Ｐｅａｒ１ノックアウトマウスを使用して、その皮下粘膜癒着の形成を観察し、対照群と比較した。

【0128】

その結果、対照マウスよりもＰｅａｒ１欠失マウスは、重度の皮下粘膜癒着を発症したことが示され、図１Ａ～Ｂに示すように、それは、創傷部位の粘膜厚さの増加、線維芽細胞の大量増殖、活性化された筋線維芽細胞の増加、およびコラーゲン面積の増加として現れた。

【0129】

この実験結果は、Ｐｅａｒ１が、粘膜線維芽細胞の過剰な活性化と皮下粘膜癒着の形成を阻害し、したがって、Ｐｅａｒ１は、粘膜癒着を阻害するための潜在的な標的として使用できることを示す。

【実施例2】

【0130】

実施例２．Ｐｅａｒ１を標的とすることで粘膜線維芽細胞の活性化を阻害できる
粘膜線維芽細胞の活性化を阻害することにおけるＰｅａｒ１の標的化の役割をさらに調べるために、単離されたヒト化Ｐｅａｒ１マウス皮下粘膜線維芽細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、ＴＧＦβ活性化線維芽細胞を、抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体（ＬＦ２またはｈＬＦ１０５を含む）で４８時間処理し、ヒドロキシプロリンの含有量を検出するためにそれぞれに上清を収集し、コラーゲン７ａ１（Ｃｏｌ７ａ１）や平滑筋アクチンα２（ＡＣＴＡ２）などの細胞外マトリックスタンパク質の発現レベルをＱＰＣＲで検出するために細胞を収集し、線維芽細胞の活性化とコラーゲン合成の特徴付けに使用された。

【0131】

実験結果は、対照群と比較して、図２ＡおよびＢに示すように、抗Ｐｅａｒ１モノクローナル抗体（ＬＦ２またはｈＬＦ１０５を含む）が、いずれも、線維芽細胞の活性化および細胞外マトリックスを合成する能力を阻害することを示した。

【0132】

この実験データは、Ｐｅａｒ１を標的とする抗Ｐｅａｒ１抗体を使用すると、粘膜線維芽細胞の活性化を阻害でき、かつ、損傷後の粘膜への当該標的に対する抗体を早期に適用すると、癒着の予防に優れた役割を果たし得ることを示した。

【実施例3】

【0133】

実施例３．抗Ｐｅａｒ１モノクローナル抗体は、ヒト化Ｐｅａｒ１マウス皮下粘膜癒着モデルにおける癒着形成を阻害する
次に、生体内での癒着形成の阻害におけるＰｅａｒ１の標的化の役割を調べるために、本発明者らは、ヒト化Ｐｅａｒ１マウスにおいて癒着モデルを構築し、同時に、創傷部位に、それぞれに、５μｇの抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体（ＬＦ２またはｈＬＦ１０５を含む）を７日ごとに点滴した。１４日目に、創傷部位の皮下粘膜組織を摘出し、ＨＥ染色とマッソン染色を行った後、顕微鏡で写真を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて皮下粘膜および皮膚の厚さおよびコラーゲン面積を計測し、癒着の形成の特徴付けに使用された。

【0134】

結果は、図３Ａ、Ｂ、Ｃに示すように、抗Ｐｅａｒ１モノクローナル抗体が、創傷部位の真皮と粘膜の厚さ、線維芽細胞の増殖と過剰な活性化、コラーゲンの合成を大幅に減少させることを示した。

【0135】

これらのデータは、抗Ｐｅａｒ１モノクローナル抗体が、癒着の形成を予防および阻害できることを示す。

【実施例4】

【0136】

実施例４．抗Ｐｅａｒ１モノクローナル抗体は、ヒト化Ｐｅａｒ１マウス腹腔粘膜癒着モデルにおける癒着形成を阻害する
線維芽細胞特異的Ｐｅａｒ１ノックアウトマウスについては、腹部癒着モデルを使用して、マウスに偽手術を行い、モデルの作成と動物の群分けは、上記のとおりであった。

【0137】

１．ＢｈａｔｉａＤＳスコア
ＢｈａｔｉａＤＳスコア基準によると、グレード０：癒着なし；グレードＩ：虫垂の盲端における処理面の癒着面積が処理面の総面積の５０％未満であり、鈍的に剥離しやすい；グレードＩＩ：上記の面積率が５０％以上で、鈍的に剥離しやすい；グレードＩＩＩ：癒着領域の大きさに関わらず、癒着を剥離することが困難である限り、鈍的な剥離を実現できるが、剥離後に腸壁に重大な損傷が生じる；グレードＩＶ：癒着面積の大小に関わらず、癒着が強ければ、鈍的な剥離はできず、鋭的な剥離が求められる。各マウスを３人でスコアリングし、その平均値を、当該サンプルの癒着スコアとした。

【0138】

その結果は、抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体（ＬＦ２またはｈＬＦ１０５を含む）で処理したマウスのＢｈａｔｉａＤＳスコアは、対照群のスコアよりも有意に低く（表６）（特に高用量群（１．０ｍｇ／ｋｇ）で）、Ｐｅａｒ１抗体の使用が、腹部癒着を効果的に予防できることがわかった。

【0139】

【表6】

２．Ｚｕｈｌｋｅスコア
組織切片をさまざまな染色法で染色し、光学顕微鏡で、癒着組織の厚さ、炎症細胞の浸潤の程度、新生毛細血管の増殖、線維芽細胞と間質細胞の増殖、コラーゲン線維の並べなどを観察し、定量的なスコアとしてＺｕｈｌｋｅスコア基準を使用した：グレード１、緩い結合組織、豊富な細胞があり、成熟および未熟なフィブリンおよび網状線維が見える；グレード２、細胞と毛細血管を含む結合組織があり、少量のコラーゲン線維が見える；グレード３、固い結合組織、少数の細胞があり、より多くの血管、少量の弾性線維と平滑筋線維が見える；グレード４、成熟した肉芽組織があり、細胞がほとんどなく、形質膜層の区別が困難である。

【0140】

その結果、抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体（ＬＦ２またはｈＬＦ１０５を含む、１．０ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスの腹部癒着組織は、比較的に緩く、細胞が豊富で、スコアは、グレード１からグレード２の範囲であるが、対照群は、すべてグレード４で、結合組織と肉芽組織が密であることが示され、Ｐｅａｒ１抗体の使用により、腹部癒着を効果的に予防できることがわかった。

【0141】

３．組織ヒドロキシプロリンの測定
組織癒着の形成は、コラーゲンの合成に依存し、ヒドロキシプロリンは、コラーゲン合成の前駆体である；この理論に基づくと、組織のヒドロキシプロリン含有量の測定は、癒着の重症度を間接的に反映するでき、両者の間には、直線的な正の相関関係があるため、採取した癒着組織のヒドロキシプロリンレベルを測定することも癒着評価の重要な方法である。

【0142】

結果は、抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体（ＬＦ２またはｈＬＦ１０５を含む）で処理したマウスの組織のヒドロキシプロリン含有量は、対照群のヒドロキシプロリン含有量よりも有意に低いことを示した。

【0143】

４．マウスにおける癒着関連指標の測定
免疫組織化学またはＲＴ－ＰＣＲ法を使用し、癒着の重症度を反映する癒着形成に関連するいくつかの指標を測定する：フィブリノーゲン（ＦＩＢ）、α－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）、ＭＭＰ／ＴＩＭＰ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ－β１）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）。

【0144】

結果は、抗ヒトＰｅａｒ１モノクローナル抗体（ＬＦ２またはｈＬＦ１０５を含む）で処理したマウスの癒着関連指標は、対照群の癒着関連指標よりも有意に低いことを示した。

【0145】

本出願に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきなのは、本発明の上記の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

2024530541000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-03-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

癒着疾患を予防、緩和または治療するための薬物組成物の製造におけるＰｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質またはそのアゴニストの応用。

【請求項2】

前記癒着疾患は、粘膜癒着疾患又は形質膜癒着疾患を含む；好ましくは、前記癒着疾患は、損傷、出血、感染、異物刺激、腫瘍浸潤又は炎症性細胞浸潤後に形成される癒着疾患を含む；好ましくは、前記損傷により形成される癒着疾患は術後癒着、放射線治療または化学療法後癒着を含み、前記感染により形成される癒着疾患は炎症癒着を含む；好ましくは、前記癒着疾患は、消化器系、泌尿器系、呼吸系、生殖系、口腔、関節、皮膚内層の癒着疾患を含む；より好ましくは、腹腔、骨盤腔、胸腔、子宮、関節腔、心嚢、硬膜外または歯周部の癒着疾患を含む；より好ましくは、前記癒着疾患は、腹腔癒着、骨盤癒着、胸腔癒着または関節腔癒着であることを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項3】

前記Ｐｅａｒ１のアゴニストは、Ｐｅａｒ１の発現、活性、安定性、および／または有効作用時間を増強する薬剤を含む；好ましくは、Ｐｅａｒ１活性を特異的に活性化する抗体、その抗原結合断片またはバリアント、Ｐｅａｒ１を組換えて発現する発現構築物、Ｐｅａｒ１の化学アゴニスト、Ｐｅａｒ１遺伝子プロモーターの駆動能力を促進する発現アップレギュレーターを含む；より好ましくは、前記Ｐｅａｒ１の化学アゴニストは、ＦｃεＲ１α、デキストラン硫酸、フコイダン、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項4】

前記Ｐｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質、またはそのアゴニストは、以下のことにさらに使用されることを特徴とする請求項１に記載の応用：
粘膜線維芽細胞の活性化を阻害すること；
組織におけるヒドロキシプロリン含有量を低下させること；
病巣部の粘膜厚を下げること；
病巣部における線維芽細胞の増殖または活性化を低下させること；
病巣部におけるコラーゲンの合成を低下させること；または
癒着関連指標を下げること；好ましくは、前記指標は、フィブリノーゲン、α－平滑筋アクチン、ｔ－ＰＡ／ＰＡＩ、ＭＭＰ／ＴＩＭＰ、トランスフォーミング成長因子、血管内皮成長因子、腫瘍壊死因子および／またはインターロイキンを含む。

【請求項5】

前記アゴニストは、Ｐｅａｒｌ活性を特異的に活性化する抗体、その抗原結合断片またはバリアントである；好ましくは、前記抗体は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、２７と２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、２７と２９に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、３０と２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１、２７と３２に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３、３４と３５に示される；及び／又は、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、ＧＡＴとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４７、ＳＡＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９、ＤＴＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＧＡＴとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２に示される；
ことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項6】

前記抗体は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む；前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示され；前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、ＧＡＴとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６に示され、或いは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４７、ＧＴＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８に示され、或いは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９、ＤＴＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０に示され、或いは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１、ＧＡＴとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２に示され、或いは、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３、ＬＶＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４に示される；
ことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項7】

前記バリアントのＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるアミノ酸配列において第三位のＳからＡ或いはＴへ突然変異し、第六位のＧからＤへ突然変異し、及び／又は、第八位のＰからＴ或いはＹへ突然変異するものである；及び／又は、前記バリアントのＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるアミノ酸配列において第三位のＰからＳ或いはＧへ突然変異し、第四位のＹからＮへ突然変異し、及び／又は、第八位のＴからＡへ突然変異するものである；及び／又は、前記バリアントのＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示されるアミノ酸配列において第九位のＡからＤへ突然変異し、及び／又は、第十位のＹからＦへ突然変異するものである；ことを特徴とする請求項５又は６に記載の応用。

【請求項8】

ＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、３１、３３、３６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７、３０、３４、３７、とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０－４４から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；及び、ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、２９、３２、３５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；及び／又は、ＬＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、４７、４９、５１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；ＬＣＤＲ２は、ＧＡＴ、ＳＡＳ、ＤＴＳ、とＬＶＳから選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；及び、ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、４８、５０、５２或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；ことを特徴とする請求項５又は６に記載の応用。

【請求項9】

ＨＦＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５、５６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；ＨＦＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；及び、ＨＦＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；及び、ＨＦＲ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；及び／又は、
ＬＦＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７９、８０、８１、８２、８３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８４から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；ＬＦＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８５、８６、８７、８８、８９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９０から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；及び、ＬＦＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９８から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；及びＬＦＲ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９９、１００、１０１、１０２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０３から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む；
ことを特徴とする請求項５又は６に記載の応用。

【請求項10】

前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５に示される、或いは、前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、又は２５に示されることを特徴とする請求項５又は６に記載の応用。

【請求項11】

有効量のＰｅａｒ１遺伝子、それがコードするタンパク質またはそのアゴニスト、および薬学的に許容される担体を含む、癒着疾患を予防、緩和または治療する薬物組成物またはキット。

【請求項12】

前記アゴニストは、Ｐｅａｒｌ活性を特異的に活性化する抗体、その抗原結合断片またはバリアントである；好ましくは、前記抗体は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、２７と２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、２７と２９に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、３０と２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１、２７と３２に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３、３４と３５に示される；及び／又は前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、ＧＡＴとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４７、ＳＡＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９、ＤＴＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０に示され、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＧＡＴとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２に示される；
より好ましくは、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４或いは１５に示され、或いは前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４或いは２５に示される；
ことを特徴とする請求項１１に記載の薬物組成物またはキット。

【請求項13】

癒着疾患を予防、緩和または治療する薬物または化合物をスクリーニングするためのＰｅａｒ１遺伝子またはそれがコードするタンパク質の応用。

【請求項14】

（１）候補物質で、Ｐｅａｒ１を発現する、またはＰｅａｒ１を含む発現システムを処理すること；及び
（２）前記システム内のＰｅａｒ１の発現または活性を検出すること；
を含む；
前記候補物質が、統計的にＰｅａｒ１の発現または活性を増加させる場合、これは、当該候補物質が所望の薬物または化合物であることを示す、癒着疾患を予防、緩和または治療する薬物または化合物をスクリーニングする方法。

【請求項15】

ステップ（１）は、試験群では、前記発現システムに候補物質を添加することを含む；および／または、
ステップ（２）は、前記システムにおけるＰｅａｒ１の発現または活性を検出し、かつ対照群と比較することを含み、ここで、前記対照群は、候補物質を添加しない発現システムである；前記候補物質が統計的にＰｅａｒ１の発現または活性を増加させる場合、これは、当該候補物質が所望の薬物または化合物であることを示す；
ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。

【国際調査報告】