特表 2024-530643 バイオ医薬組成物および安定同位体標識ペプチドマッピング法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-23

(54)【発明の名称】バイオ医薬組成物および安定同位体標識ペプチドマッピング法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/13 20060101AFI20240816BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240816BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240816BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240816BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240816BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20240816BHJP

   A61K 38/06 20060101ALN20240816BHJP

【ＦＩ】

C07K1/13 ZNA

A61K47/68

A61K39/395 L

A61K39/395 T

A61P35/00

C07K16/28

G01N33/68

A61K38/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506801

(86)(22)【出願日】2022-08-02

(85)【翻訳文提出日】2024-04-02

(86)【国際出願番号】 IB2022057173

(87)【国際公開番号】W WO2023012669

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】63/228,951

(32)【優先日】2021-08-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513032275

【氏名又は名称】グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＩＮＴＥＬＬＥＣＴＵＡＬ ＰＲＯＰＥＲＴＹ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100172557

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 啓靖

(72)【発明者】

【氏名】タイラー、キース、デイビス

(72)【発明者】

【氏名】ヒラリー、アンバー、シュスラー

【テーマコード（参考）】

2G045

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045DA38

2G045FB06

2G045FB07

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA15

4C084BA23

4C084CA59

4C084DA27

4C084NA05

4C084ZB26

4C085AA21

4C085CC23

4C085DD53

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA72

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA10

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書では、正確で高感度なコンジュゲーション部位定量化のための、安定同位体標識（ＳＩＬ）ペプチドマッピング法が開示される。本明細書ではまた、ＢＣＭＡを標的とする抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む組成物も開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）カルボニル基を含有する同位体標識された細胞毒素と還元剤とを使用して、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の未占有システイン部位のコンジュゲーションを行うことにより、同位体標識されたＡＤＣサンプルを作製すること、および、
（ｉｉ）前記サンプルのペプチドマッピングを行うこと
を含む分析方法。

【請求項2】

前記細胞毒素が、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＡＤＣが、はじめに前記還元剤によって還元され、次いで前記同位体標識された細胞毒素とコンジュゲートされる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記還元剤が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

余剰の還元剤が、前記ペプチドマッピングの前に、サイズ排除クロマトグラフィーカラムから前記サンプルを溶出させることにより除去される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

コンジュゲーションが、前記ＡＤＣを前記同位体標識された細胞毒素と反応させることにより起こる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

余剰の同位体標識された細胞毒素が、前記ペプチドマッピングの前に、サイズ排除クロマトグラフィーカラムから前記サンプルを溶出させることにより除去される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ペプチドマッピングが、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）の使用を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ペプチドマッピングが、前記サンプルの変性、残留する総てのジスルフィド結合の還元、および生じた遊離スルフヒドリルのアルキル化を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ペプチドマッピングが、前記サンプルの酵素消化による同位体標識されたコンジュゲートペプチドの生成、および任意選択で、強酸の添加による酵素消化のクエンチを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記同位体標識されたコンジュゲートペプチドがイオン化され、質量電荷比が検出される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記同位体標識されたコンジュゲートペプチドに関して検出された質量電荷比が、同位体標識されていないコンジュゲートペプチドと比較される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

細胞毒素を同位体標識された水と反応させて、前記同位体標識された細胞毒素を生成することを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記細胞毒素をアセトニトリル中で同位体標識された水と反応させる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ＡＤＣがベランタマブマホドチンである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体を含む組成物であって、
前記抗体が、
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および、
配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３
を含み、かつ、
前記細胞毒性剤が、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が、約５６％～約８０％である、組成物。

【請求項17】

抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体を含む組成物であって、
前記抗体が、
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および、
配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３
を含み、かつ、
前記細胞毒性剤が、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が、約５８％～約８１％である、組成物。

【請求項18】

抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体を含む組成物であって、
前記抗体が、
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および、
配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３
を含み、かつ、
前記細胞毒性剤が、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が、約１５％～約４６％である、組成物。

【請求項19】

抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体を含む組成物であって、
前記抗体が、
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および、
配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３
を含み、かつ、
前記細胞毒性剤が、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が、約１１％～約１５％である、組成物。

【請求項20】

抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体を含む組成物であって、
前記抗体が、
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および、
配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３
を含み、かつ、
前記細胞毒性剤が、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が、約５６％～約８０％であり、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が、約５８％～約８１％であり、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が、約１５％～約４６％であり、かつ、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が、約１１％～約１５％である、組成物。

【請求項21】

抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体を含む組成物であって、
前記抗体が、
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および、
配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３
を含み、かつ、
前記細胞毒性剤が、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が、約６３％～約７６％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が、約６５％～約７８％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が、約２２％～約４０％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が、約１１％～約１６％である、組成物。

【請求項22】

抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体を含む組成物であって、
前記抗体が、
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および、
配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３
を含み、かつ、
前記細胞毒性剤が、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が、約６５％～約７１％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が、約６８％～約７４％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が、約２４％～約３０％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が、約１２％～約１８％である、組成物。

【請求項23】

前記抗ＢＣＭＡ抗体がベランタマブである、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

前記ＡＤＣがベランタマブマホドチンである、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項25】

ＤＬ２の割合が少なくとも約３０％、約１５％～約２７％、または約１５％～約３２％であり、かつ／あるいは、
ＤＬ４ａの割合が少なくとも約３０％、約３５％～約３８％、または約３０％～約４０％であり、かつ／あるいは、
ＤＬ４ｂの割合が少なくとも約５％、約７％～約９％、または約５％～約１０％であり、かつ／あるいは
ＤＬ６の割合が少なくとも約１０％、約１４％～約２０％、または約１０％～約２０％であり、かつ／あるいは、
ＤＬ８の割合が少なくとも約１％、約６．０％～約１２．０％、または約４％～約１５％である、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項26】

ＤＬ０の割合が約１０％以下または約５％以下である、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項27】

請求項１６～２６のいずれか一項に記載の組成物と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項28】

癌を治療する方法であって、それ必要とする対象に治療有効量の請求項１６～２６のいずれか一項に記載の組成物または請求項２７に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

【請求項29】

癌の治療に使用するための、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の組成物または請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項30】

癌の治療に使用するための医薬の製造における、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項31】

システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体のコンジュゲーションレベルを決定する方法であって、
ａ）前記抗体薬物複合体を還元して還元抗体薬物複合体を形成すること、
ｂ）前記還元抗体薬物複合体を同位体標識された細胞毒素とコンジュゲートして同位体標識された抗体薬物複合体を形成すること、
ｃ）前記同位体標識された抗体薬物複合体から同位体標識されたコンジュゲートペプチドを生成し、前記同位体標識されたコンジュゲートペプチドに対してペプチドマッピングを行うこと、
ｄ）前記同位体標識されたコンジュゲートペプチドの質量電荷比を検出すること、および、
ｅ）前記同位体標識されたコンジュゲートペプチドの質量電荷比を同位体標識されていないコンジュゲートペプチドの質量電荷比と比較して、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体のコンジュゲーションレベルを決定すること
を含む、方法。

【請求項32】

前記細胞毒素が、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体が、はじめに還元剤によって還元され、次いで前記同位体標識された細胞毒素とコンジュゲートされる、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項34】

前記還元剤が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

余剰の還元剤が、前記ペプチドマッピングの前に、サイズ排除クロマトグラフィーカラムからサンプルを溶出させることにより除去される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

コンジュゲーションが、前記システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体を前記同位体標識された細胞毒素と反応させることにより起こる、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

余剰の同位体標識された細胞毒素が、前記ペプチドマッピングの前に、サイズ排除クロマトグラフィーカラムからサンプルを溶出させることにより除去される、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記ペプチドマッピングが、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）の使用を含む、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記ペプチドマッピングが、サンプルの変性、残留ジスルフィド結合の還元、および生じた遊離スルフヒドリルのアルキル化を含む、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記ペプチドマッピングが、サンプルの酵素消化よる同位体標識されたコンジュゲートペプチドの生成、および任意選択で、強酸の添加による酵素消化のクエンチを含む、請求項３１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

細胞毒素を同位体標識された水と反応させて、前記同位体標識された細胞毒素を生成することを含む、請求項３１～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記細胞毒素をアセトニトリル中で同位体標識された水と反応させる、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体が、ベランタマブマホドチンである、請求項３１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年８月３日に出願された米国特許出願第６３／２２８，９５１号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書の一部とされる。

【0002】

配列表
本願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書の一部とされる。前記ＸＭＬファイルは054624_09_5031_Sequence_Listing.xmlの名称で、２０２２年７月２５日に作成され、１５，８５５バイトのサイズである。

【0003】

分野
本明細書では、低分子細胞毒性ペイロード（例えば、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥ）を有する、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体（cysteine-conjugated antibody drug conjugate）の部位特異的コンジュゲーションレベルを、安定同位体標識（stable isotope labeling）（ＳＩＬ）ペプチドマッピングを使用して決定する方法が開示される。

【背景技術】

【0004】

背景
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性と細胞毒性低分子薬物の効力とを組み合わせた、標的腫瘍療法のための、成長中のクラスのバイオ医薬品である（Ｈａｆｅｅｚら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．、２０２０年、２５巻、４７６４頁およびＢｏｎｉら、Ｔｈｅ Ｒｅｓｕｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｎｏｖｅｌ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｐａｙｌｏａｄｓ．、Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ Ｅｄｕｃ Ｂｏｏｋ．、２０２０年、４０巻、１～１７頁）。低分子ペイロードは通常、システインまたはリジンタンパク質残基を介してコンジュゲートされ、その結果、異なる薬物負荷（ＤＬ）種の不均一な混合物となる（Ｐｏｎｚｉａｎｉら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｏｆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．、２０２０年、２１巻、５５１０頁）。ＡＤＣの薬物抗体比（ＤＡＲ）は、薬物の効力および有効性に影響を及ぼすため、重要な品質特性（ＣＱＡ）として特定されている（Ｌｉら、Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｂａｓｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ／Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．、２０２０年、６０巻、１０５～１１９頁）。その結果、ＡＤＣは、ｍＡｂバイオ医薬品で一般に特性評価されるタンパク質配列および翻訳後修飾（ＰＴＭ）に加えて、これらの薬物負荷種の特性評価という分析上の課題を要する。

【0005】

ＡＤＣの広範囲のＤＡＲは、以下のいくつかの分析法で決定することができる：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（Ｂｏｂａｌｙら、Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｉｎ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ．、２０１７年、１４８１巻、８２～９１頁）、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）（Ｄ’Ａｔｒｉら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｂｙ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ．、２０１８年、１０８０巻、３７～４１頁）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）（Ｌｅｃｈｎｅｒら、Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｏｄ ２０１６－２０１８．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ．、２０１９年、１１２２～１１２３巻、１～１７頁）、ならびにネイティブおよびサブユニット液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）（Ｚｈｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ ＬＣ－ＭＳ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ．、２０２０年、１０巻、２０９～２２０頁）。これらの方法は、コンジュゲーション部位の位置に関する定性的な情報も提供できるが、部位特異的なコンジュゲーションレベルを評価することは困難であった。

【0006】

酵素消化物の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（ペプチドマッピング）は、天然型ペプチドと修飾型ペプチドの相対的定量を行うことによって、タンパク質配列の特徴付けおよびバイオ医薬品の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の定量を行うための、広く使用されている分析方法である。ＭＭＡＦコンジュゲートペプチドは、疎水性の薬物ペイロードの付加により天然型ペプチドとコンジュゲートペプチド間の質量および保持時間に比較的大きい差があるため、このアプローチを複雑にしている。これらの差により、イオン化効率が大きく異なるペプチドペアが生じ、ペプチド間の相対定量には適さなくなる。

【0007】

その結果、ほとんどのＡＤＣペプチドマッピングの適用は、実際は、コンジュゲーション部位の位置を確認するだけの定性的なものとなり、これらの部位におけるコンジュゲーションのレベルを定量する試みはほとんど記載されていない。Ｑ．Ｌｕｏら（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．、２０１６年、８８巻、６９５～７０２頁）が記載している１つの方法は、ＡＤＣサンプルとともにコンジュゲートされていないｍＡｂ中間体サンプルの分析を含むものであった。ｍＡｂサンプルで検出されたコンジュゲートされていないピーク面積を、ＡＤＣサンプルで検出された面積と比較し、面積の損失はそのペプチド部位でのコンジュゲーションに起因するものとされた。しかし、この方法では、ｍＡｂとＡＤＣのサンプル間におけるサンプル調製のばらつきが正規化されず、システインコンジュゲートされたＡＤＣの重鎖ヒンジペプチドのように、１個のペプチドに複数のコンジュゲーション部位がある場合は考慮できなかった。

【0008】

Ｌ．Ｃｈｅｎら（Ｉｎ－ｄｅｐｔｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）（ａｄｏ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅ．、ｍＡｂｓ．、２０１６年、８巻、１２１０～１２２３頁）が記載している別の方法では、既知量のロイシンエンケファリンペプチドを添加した場合のピーク面積に対して、コンジュゲートペプチドのピーク面積を正規化することにより、サンプル調製のばらつきの補正が試みられた。しかしながら、この方法はサンプル間の相対的なコンジュゲーション定量を提供するだけであり、特定のコンジュゲーション部位の真の部位占有率を提供するものではなかった。

【0009】

Ｈ．Ｓａｎｇら（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＡＤＣｓ）ｂｙ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｏｎ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ａｒｅａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｕｓｉｎｇ ｎａｎｏ－ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．、２０１７年、９５５巻、６７～７８頁）が記載している第３の方法は、コンジュゲートペプチドのピーク面積を、それぞれの非コンジュゲートペプチドのピーク面積で正規化することにより、イオン化の違いを考慮することを試みた。次いで、この比に、非コンジュゲートペプチドとコンジュゲートペプチドの検量線の傾きを割って算出した相対イオン化強度係数を掛けて、正規化比を求めた。次いで、この正規化された比率の関数として、部位のコンジュゲーションレベルを計算した。しかし、この方法では、総てのコンジュゲーション部位のペプチドペアの検量線を作製するために、標準物質を分析する必要があった。さらに、このコンジュゲーションレベルの式は、１個のペプチドに複数のコンジュゲーション部位があることを考慮していなかった。

【0010】

安定同位体標識（ＳＩＬ）は、目的の分析物に重い同位体原子を組み込むプロセスであり、その結果、質量分析によって検出することができる質量変化が生じる。ＳＩＬペプチドマッピングは、プロテオミクスの分野において、差異のある標識サンプル中のタンパク質の相対定量を提供するための一般的な方法である（Ｌｉｕら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０２０年、１２４巻、１１５８１５）が、タンパク質のＰＴＭ特性評価にも応用されている。Ｌｉｕら（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ＬＣ－ＭＳ Ａｎａｌｙｓｉｓ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０１３年、８５巻、１１７０５～１１７０９頁）は、ｍＡｂサンプルを酸素－１８過酸化水素と反応させて目的のメチオニンを完全に酸化することで、メチオニンの酸化レベルを調べた。次いで、同位体ピーク面積を使用して、酸化ペプチドの天然型（＋１６ Ｄａ）とＳＩＬ型（＋１８ Ｄａ）の相対定量を行った。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

したがって、当技術分野には、ＡＤＣのための改良された分析方法を提供する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

概要
本開示の第１の態様によれば、
（ｉ）カルボニル基を含有する同位体標識された細胞毒素と還元剤とを使用して、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の未占有システイン部位のコンジュゲーションを行うことにより、同位体標識されたＡＤＣサンプルを作製すること、および、
（ｉｉ）前記サンプルのペプチドマッピングを行うこと
を含む方法（例えば、分析方法）が提供される。

【0013】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体を含む組成物であって、
前記抗体が、
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および、
配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３
を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約５６％～約８０％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約５８％～約８１％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約１５％～約４６％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％～約１５％である、組成物が提供される。

【0014】

本開示のさらなる態様によれば、本明細書に記載される組成物と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。

【0015】

本開示のさらなる態様によれば、約２０ｍｇ／ｍＬ～約６０ｍｇ／ｍＬのＡＤＣと、約１０ｍＭ～約３０ｍＭのクエン酸緩衝液と、約１２０ｍＭ～約２４０ｍＭのトレハロースと、約０．０１ｍＭ～約０．１ｍＭのＥＤＴＡと、約０．０１％～約０．０５％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０とを含む本明細書に記載される医薬組成物を含む製剤であって、製剤のｐＨが約５．９～約６．５である製剤が提供される。

【0016】

本開示のさらなる態様によれば、それを必要とする対象に治療有効量の本明細書に開示される組成物または製剤を投与することを含む、癌を治療する方法が提供される。

【0017】

本開示のさらなる態様によれば、癌の治療に使用するための本明細書に開示される組成物または製剤が提供される。

【0018】

本開示のさらなる態様によれば、癌の治療に使用するための医薬の製造における、本明細書に開示される組成物の使用が提供される。

【0019】

本開示のさらなる態様によれば、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体のコンジュゲーションレベルを決定する方法であって、
前記抗体薬物複合体を還元して還元抗体薬物複合体を形成すること、
前記還元抗体薬物複合体を同位体標識された細胞毒素とコンジュゲートして同位体標識された抗体薬物複合体を形成すること、
前記同位体標識された抗体薬物複合体から同位体標識されたコンジュゲートペプチドを生成し、前記同位体標識されたコンジュゲートペプチドに対してペプチドマッピングを行うこと、
前記同位体標識されたコンジュゲートペプチドの質量電荷比を検出すること、および、
前記同位体標識されたコンジュゲートペプチドの質量電荷比を同位体標識されていないコンジュゲートペプチドの質量電荷比と比較して、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体のコンジュゲーションレベルを決定すること
を含む方法が提供される。一実施形態において、細胞毒素はＭＭＡＦまたはＭＭＡＥである。別の実施形態において、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体は、はじめに還元剤により還元され、次いで同位体標識された細胞毒素とコンジュゲートされる。一実施形態において、還元剤はジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。別の実施形態において、余剰の還元剤は、ペプチドマッピングの前に、サイズ排除クロマトグラフィーカラムからサンプルを溶出させることによって除去される。さらに別の実施形態において、コンジュゲーションは、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体を同位体標識された細胞毒素と反応させることにより起こる。別の実施形態において、余剰の同位体標識された細胞毒素は、ペプチドマッピングの前に、サイズ排除クロマトグラフィーカラムからサンプルを溶出させることによって除去される。さらに別の実施形態において、ペプチドマッピングは、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析の使用を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドマッピングは、サンプルの変性、残留ジスルフィド結合の還元、および生じた遊離スルフヒドリルのアルキル化を含む。別の実施形態において、ペプチドマッピングは、サンプルの酵素消化による同位体標識されたコンジュゲートペプチドの生成、および任意選択で、強酸の添加による酵素消化のクエンチを含む。いくつかの実施形態において、方法は、細胞毒素を同位体標識された水と反応させて同位体標識された細胞毒素を生成することを含む。別の実施形態において、細胞毒素をアセトニトリル中で同位体標識された水と反応させる。さらに別の実施形態において、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体はベランタマブマホドチンである。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、安定同位体標識されたＭＭＡＦのＵＶクロマトグラムおよびＭＳスペクトルを示す。

【図2】図２は、安定同位体標識の前と後のベランタマブマホドチン軽鎖および重鎖の還元ＬＣ－ＭＳスペクトルを示す。

【図3】図３は、ベランタマブマホドチンにおける薬物負荷種不均一混合物の概略図を示す。

【図4】図４は、標準ペプチドマッピングおよび安定同位体標識ペプチドマッピングから検出された軽鎖、重鎖ｆａｂおよび重鎖ヒンジピークのＸＩＣを比較する図である。

【図5】図５は、標識されたコンジュゲート軽鎖ペプチドおよび標識されていないコンジュゲート軽鎖ペプチドの代表的ＭＳスペクトルを示す。アイソトポマー寄与の計算のために使用した天然同位体比を示している。

【図6】図６は、標識されたコンジュゲート重鎖Ｆａｂペプチドおよび標識されていないコンジュゲート重鎖Ｆａｂペプチドの代表的ＭＳスペクトルを示す。アイソトポマー寄与の計算のために使用した天然同位体比を表示している。

【図7】図７は、標識された重鎖ヒンジペプチドおよび標識されていないコンジュゲート重鎖ヒンジペプチドの代表的ＭＳスペクトルを示す。アイソトポマー寄与の計算のために使用した天然同位体比を表示している。

【図8】図８は、全コンジュゲーション部位に関して、標準ペプチドマッピングと安定同位体標識ペプチドマッピングの間での線形応答曲線を比較する図である。

【図9】図９は、ベランタマブマホドチン線形サンプルについて、標準ペプチドマッピングとＳＩＬペプチドマッピングでの計算ＤＡＲと理論ＤＡＲを比較する図である。

【図10】図１０は、ＤＡＲが異なるベランタマブマホドチンサンプルのコンジュゲーション値を示す。

【図11】図１１は、ＤＡＲが異なるベランタマブマホドチンサンプルについて、ＳＩＬペプチドマッピングでの計算ＤＡＲと理論ＨＩＣ ＤＡＲを比較する図である。

【図12】図１２は、薬物負荷画分を回収するために使用した、分析的疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび分取スケール疎水性相互作用クロマトグラフィーのトレースを示す。

【図13】図１３は、精製されたＤＬ０、ＤＬ２、ＤＬ４ａ、ＤＬ４ｂ、ＤＬ６およびＤＬ８の代表的ＮＲ－ＣＧＥエレクトロフェログラムを示す。

【図14】図１４は、精された製ＤＬ０、ＤＬ２、ＤＬ４ａ、ＤＬ４ｂ、ＤＬ６およびＤＬ８薬物負荷バリアントのインタクトマススペクトルを示す。

【図15】図１５は、精製されたＤＬ０、ＤＬ２、ＤＬ４ａ、ＤＬ４ｂ、ＤＬ６およびＤＬ８薬物負荷バリアントの重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）の還元マススペクトルを示す。

【図16】図１６は、精製されたＤＬ０、ＤＬ２、ＤＬ４ａ、ＤＬ４ｂ、ＤＬ６およびＤＬ８薬物負荷バリアントのキャピラリー示差走査熱量測定（ＤＳＣ）のトレースを示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

安定同位体標識（ＳＩＬ）ペプチドマッピング法
「約（about）」または「およそ（approximately）」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対して許容可能な誤差範囲内であることを意味し得る。この誤差範囲は、値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に部分的に依存する。

【0022】

例えば、「約」は、当業者の慣例に従って、プラスまたはマイナス１０％を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値のプラスもしくはマイナス２０％、プラスもしくはマイナス１０％、プラスもしくはマイナス５％、またはプラスもしくはマイナス１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１０倍以内、５倍以内または２倍以内を意味し得る。本願および特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に断りのない限り、特定の値について許容される誤差範囲内を意味する「約」という用語が想定されるべきである。また、値の範囲および／または下位範囲が示される場合、その範囲および／または下位範囲は、その範囲および／または下位範囲の端点を含み得る。

【0023】

本開示は、安定同位体標識ペプチドマッピングＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を使用して、低分子ペイロード（例えば、細胞毒素）を有する、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体の部位特異的コンジュゲーションレベルを決定するための方法を提供する。

【0024】

本開示の第１の態様によれば、
（ｉ）カルボニル基を含有する同位体標識された細胞毒素と還元剤とを使用して、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の未占有システイン部位のコンジュゲーションを行うことにより、同位体標識されたＡＤＣサンプルを作製すること、および、
（ｉｉ）前記サンプルのペプチドマッピングを行うこと
を含む分析方法が提供される。

【0025】

一実施形態において、細胞毒素はカルボニル基（例えば、二重結合を有するカルボニル酸素）を含む。

【0026】

一実施形態において、細胞毒素はモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。

【0027】

酵素消化物の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（ペプチドマッピング）は、天然型ペプチドと修飾型ペプチドとの間の相対定量を行うことにより、バイオ医薬のタンパク質配列を同定しＰＴＭを定量するための、当業者に広く知られている分析方法である。本明細書に記載の分析方法は、未占有システイン部位と安定同位体標識された細胞毒素とをコンジュゲートして、保持時間が同一で、質量および疎水性の違いが最小限のペプチドペアを作製し、１つの多属性分析法（multi-attribute analytical method）（ＭＡＭ）において、モニタリングされるその他の翻訳後修飾（post-translational modifications）（ＰＴＭ）と並行した相対定量を可能とすることにより、従来技術の方法に伴うイオン化効率が異なるという問題を軽減する（排除することも含む）。

【0028】

安定同位体標識（ＳＩＬ）は、重い同位体原子（例えば、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１８）を目的の分析物に組み込むプロセスであり、これにより、質量分析によって検出可能な質量変化が生じる。本明細書に記載のペプチドマッピング法は、利用可能なコンジュゲーション部位を同位体標識された細胞毒素で標識して、保持時間が同一で、質量の違いが最小限のコンジュゲーション部位ペプチドペアを作製することにより、ペプチドのイオン化効率が異なるという問題を軽減する（排除することも含む）。この方法は、部位特異的なコンジュゲーションレベルの正確な定量を可能とし、１つの多属性分析法（ＭＡＭ）において、タンパク質配列およびＰＴＭの特性評価と並行して「ボトムアップ」のＤＡＲ特性評価を行う最初の既知例を提供する。

【0029】

一実施形態において、本明細書に記載の分析方法は、細胞毒素を同位体標識された水（例えば、Ｈ_２ ^１８Ｏ）と反応させて同位体標識された細胞毒素を作製することを含む。一実施形態において、同位体標識された水は、カルボニル基（二重結合を有する酸素、例えば、ケトン）を含む細胞毒素との溶媒交換を受け、同位体標識された細胞毒素を生成する。この反応は室温または３７℃で起こり得る。反応時間は、２日～数週間であり得る。一実施形態において、反応時間は、７日～１４日である。

【0030】

一実施形態において、細胞毒素は、同位体標識された水と反応させる前に有機溶媒、例えば、アセトニトリル（ＡＣＮ）に溶解させる。一実施形態において、ＡＣＮ中の細胞毒素をＨ_２ ^１８Ｏと反応させて同位体標識された細胞毒素を生成する。別の実施形態において、ＡＣＮ中のＭＭＡＦまたはＭＭＡＥをＨ_２ ^１８Ｏと反応させて同位体標識されたＭＭＡＦまたはＭＭＡＥを生成する。特定の実施形態において、細胞毒素は、強酸性条件下で同位体標識された水と反応させる。酸としては、ＴＦＡまたはギ酸が挙げられる。特定の実施形態において、標識された分子の同位体純度は、同位体標識された細胞毒素をイオン化して、その同位体標識された細胞毒素に関連する質量電荷比を検出することによって評価することができる。

【0031】

一実施形態において、システインコンジュゲートされた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の未占有システイン部位を、同位体標識された細胞毒素とコンジュゲートする。

【0032】

特定の実施形態において、還元剤は、同位体標識された細胞毒素とのコンジュゲーションの前に、ＡＤＣ鎖間ジスルフィド結合を還元して遊離スルフヒドリル基（例えば、未占有システイン部位）を生成するために使用される。遊離スルフヒドリル基は、その後、同位体標識された細胞毒素とのコンジュゲーションに利用可能である。したがって、一実施形態において、ＡＤＣは、はじめに還元剤により還元され、次いで同位体標識された細胞毒素とコンジュゲートされる。

【0033】

一実施形態において、還元剤は、鎖間ジスルフィド結合を還元することができる任意の化合物または試薬である。特定の実施形態において、還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール、および／または、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。さらなる実施形態において、還元剤はＤＴＴである。別の実施形態において、還元剤はＴＣＥＰである。その他の還元剤も本明細書で開示される方法で使用可能であり、当業者に周知である。

【0034】

還元剤は、鎖間ジスルフィド結合を還元するために適用される。一実施形態において、還元剤は、鎖間ジスルフィド結合の完全な還元を確保するために過剰量で適用され、これにより、その後の標識化が総てのジスルフィド結合部位でなくても大部分のジスルフィド結合部位で確実となる。還元剤の量を最適化するための方法は、当業者に公知である。還元剤の濃縮物を、鎖内ジスルフィド結合が還元されるまで、漸増量で加えることができ、鎖内ジスルフィド結合の還元は、還元反応の後に分離された重鎖および軽鎖を測定することにより検出可能である。鎖間ジスルフィド結合の完全な還元が起こらなければ、一部のジスルフィド結合は細胞毒素（天然の細胞毒素または同位体標識された細胞毒素）で標識されず、天然の細胞毒素の定量値が人為的により高くなる可能性がある。

【0035】

一実施形態において、余剰の還元剤は、コンジュゲーションの前に除去される。特定の実施形態において、還元剤は、その後のコンジュゲーション工程を妨害する可能性があるため、コンジュゲーションの前に余剰の還元剤を除去する必要がある。例えば、一実施形態において、余剰の還元剤は、サイズ排除クロマトグラフィーカラムからサンプルを溶出させることにより除去される。別の実施形態において、余剰の還元剤は、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルターにより除去される。さらなる実施形態において、余剰の還元剤は、同位体標識された細胞毒素とのコンジュゲーションの前に除去される。

【0036】

一実施形態において、コンジュゲーションは、ＡＤＣを同位体標識された細胞毒素と反応させることにより起こる。反応は、例えば、室温または約３７℃でＡＤＣと同位体標識された細胞毒素を混合することによって起こり得る。反応時間は最適化することができる。一実施形態において、反応時間は５分～約６０分である。一実施形態において、同位体標識された細胞毒素は、同位体標識されたＭＭＡＦまたはＭＭＡＥである。一実施形態において、ＡＤＣの標識細胞毒素に対する比率は、細胞毒素（天然の細胞毒素または同位体標識された細胞毒素）のないジスルフィド結合が存在しないことに確実にするために最適化され、例えば、生じる総てのＡＤＣは、薬物負荷が８（ＤＬ８）であるべきである。ＡＤＣの薬物負荷を試験するための様々な方法が当業者に公知である。

【0037】

一実施形態において、余剰の同位体標識された細胞毒素（抗体にコンジュゲートされていないもの）は、ペプチドマッピングの前に除去される。一実施形態において、余剰の同位体標識された細胞毒素（抗体にコンジュゲートされていないもの）は、ペプチドマッピングの前に、サイズ排除クロマトグラフィーカラムからサンプルを溶出させることによって除去される。

【0038】

一実施形態において、コンジュゲーションの後、同位体標識された細胞毒素および同位体標識されていない細胞毒素（例えば、「天然の細胞毒素」）の混合物を有するＡＤＣサンプルが得られる。

【0039】

別の実施形態において、同位体標識された細胞毒素とのコンジュゲーションの後、ＡＤＣサンプルのペプチドマッピング（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によるペプチドマッピング）が行われる。この工程は、同位体標識された抗体薬物複合体の変性、残留する総てのジスルフィド結合の還元、生じた遊離スルフヒドリルのアルキル化、サンプルの酵素消化、および、サンプルの質量分析による分析を含む。様々なペプチドマッピング法が当業者に周知であり、例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６６巻、３１～４７頁（１９９９年）に記載されている。一実施形態において、変性剤は、例えば、グアニジンＨＣｌ、尿素またはその後の還元のために総ての鎖間および鎖内ジスルフィド結合を開裂（open up）する任意の変性剤を含み得る。還元剤の例としては、ＴＣＥＰおよびＤＴＴが挙げられる。還元の後、ジスルフィド結合が再形成されないことを確実にするために、サンプルにアルキル化剤を適用することができる。例示的なアルキル化剤としては、ヨード酢酸ナトリウムが挙げられる。特定の実施形態において、酵素消化の前に残存している変性剤を、酵素の添加の前に、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去することができる。特定の実施形態において、サンプルのペプチドは、酵素的に消化される。例示的な酵素としては、トリプシンまたはＬｙｓ－Ｃが挙げられる。サンプルの酵素消化は、ＨＣｌまたはＴＦＡ等の強酸の添加によってクエンチすることができる。いくつかの実施形態において、得られたペプチドは次いでイオン化され、天然の（同位体標識されていない）および同位体標識されたコンジュゲートペプチドに関連する質量電荷比が検出され、比較される。

【0040】

抗体薬物複合体
本明細書に記載の分析方法は、カルボニル基を含む細胞毒素（例えば、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥ）を含むＡＤＣを分析するために特によく適している。一実施形態において、ＡＤＣは抗ＢＣＭＡ ＡＤＣである。さらなる実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣはベランタマブマホドチンである。ベランタマブマホドチンは、マレイミドカプロイル（ＭＣ）リンカーによってＭＭＡＦ細胞毒性剤に結合された抗ＢＣＭＡ抗体を含む。

【0041】

本開示はまた、抗ＢＣＭＡ抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む組成物およびＢＣＭＡが媒介する疾患または障害を治療するための関連の方法を提供する。本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ ＡＤＣを含む組成物はまた、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ ＡＤＣの集団と呼ぶこともでき、これらの語句は互換性があると理解される。

【0042】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および／または、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む。

【0043】

別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0044】

さらに別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）；および／または、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）を含む。

【0045】

本開示の一態様において、本明細書に記載の分析方法は、抗体（例えば、ベランタマブ）上の細胞毒性剤の特定のアミノ酸残基の位置ならびに各アミノ酸残基における細胞毒素の定量的な量を決定することができる。一実施形態において、細胞毒素は、システイン含有アミノ酸、例えば、軽鎖（ＬＣ）Ｃ２１４、重鎖（ＨＣ）Ｃ２２４、重鎖ヒンジ領域（ＨＣヒンジ）Ｃ２３０、および／または、重鎖ヒンジ領域（ＨＣヒンジ）Ｃ２３３にコンジュゲートされている。一実施形態において、重鎖ヒンジ領域は、Ｃ２３０およびＣ２３３の両方に２個の細胞毒素分子を含む。これは本明細書では「ＨＣヒンジＤＬ２」と呼称される場合がある。別の実施形態において、重鎖ヒンジ領域は、Ｃ２３０またはＣ２３３のいずれかに１個の細胞毒素分子を含む。これは本明細書では「ＨＣヒンジＤＬ１」と呼称される場合がある。本明細書に記載の方法は、ＨＣヒンジＤＬ２アイソフォームとＨＣヒンジＤＬ１アイソフォームを識別することができる。ＨＣヒンジＤＬ１アイソフォームが検出される場合、本明細書に記載の方法は、ＨＣヒンジＤＬ１アイソフォームの有無を決定することができる。

【0046】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号９（ＣＤＲを下線で示し；ＨＣ Ｃ２２４、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３を太字／下線で示す）の重鎖配列を含むベランタマブである。

【0047】

【化1】

【0048】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号１０（ＣＤＲを下線で示し；ＬＣ Ｃ２１４を太字／下線で示す）の軽鎖配列を含むベランタマブである。

【0049】

【化2】

【0050】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約２．１であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約３８％～約４４％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約４０％～約４６％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約５％～約９％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約３％～約７％である、組成物が提供される。

【0051】

したがって、本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とを含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥ（特に、ＭＭＡＦ）であり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約２．１であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約４１％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約４３％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約７％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約５％である、組成物が提供される。

【0052】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３．０であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約５３％～約５９％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約５５％～約６１％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約１３％～約１９％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約８％～約１４％である、組成物が提供される。

【0053】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とを含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥ（特に、ＭＭＡＦ）であり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３．０であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約５６％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約５８％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約１６％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％である、組成物が提供される。

【0054】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３．５であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約６０％～約６６％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約６２％～約６８％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約２０％～約２６％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約８％～約１４％である、組成物が提供される。

【0055】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えばベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とを含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥ（特に、ＭＭＡＦ）であり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３．５であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約６３％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約６５％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約２３％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％である、組成物が提供される。

【0056】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約４．０であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約６５％～約７１％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約６８％～約７４％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約２４％～約３０％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１２％～約１８％である、組成物が提供される。

【0057】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とを含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥ（特に、ＭＭＡＦ）であり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約４．０であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約６８％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約７１％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約２７％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１５％である、組成物が提供される。

【0058】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約４．６であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約７２％～約７８％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約７３％～約７９％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約３７％～約４３％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１３％～約１９％である、組成物が提供される。

【0059】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とを含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥ（特に、ＭＭＡＦ）であり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約４．６であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約７５％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約７６％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約４０％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１６％である、組成物が提供される。

【0060】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体を含む組成物であって、
前記抗体（例えば、ベランタマブ）が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約５．０であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約７５％～約８１％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約７７％～約８３％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約４３％～約４９％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％～約１７％である、組成物が提供される。

【0061】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とを含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥ（特に、ＭＭＡＦ）であり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約５．０であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約７８％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約８０％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約４６％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１４％である、組成物が提供される。

【0062】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約５．７であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約８１％～約８７％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約８２％～約８８％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約５６％～約６１％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１０％～約１６％である、組成物が提供される。

【0063】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とを含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥ（特に、ＭＭＡＦ）であり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約５．７であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約８４％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約８５％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約５８％であり、かつ／あるいは、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１３％である、組成物が提供される。

【0064】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞傷毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約５６％～約８０％である、組成物が提供される。

【0065】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約５８％～約８１％である、組成物が提供される。

【0066】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約１５％～約４６％である、組成物が提供される。

【0067】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％～約１５％である、組成物が提供される。

【0068】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約５６％～約８０％であり、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約５８％～約８１％であり、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約１５％～約４６％であり、かつ、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％～約１５％である、組成物が提供される。

【0069】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３～約５であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約５６％～約８０％である、組成物が提供される。

【0070】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３～約５であり、かつ、
ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約５８％～約８１％である、組成物が提供される。

【0071】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３～約５であり、かつ、
ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約１５％～約４６％である、組成物が提供される。

【0072】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３～約５であり、かつ、
ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％～約１５％である、組成物が提供される。

【0073】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３～約５であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約５６％～約８０％であり、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約５８％～約８１％であり、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約１５％～約４６％であり、かつ、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％～約１５％である、組成物が提供される。

【0074】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約６３％～約７６％である、組成物が提供される。

【0075】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約６５％～約７８％である、組成物が提供される。

【0076】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約２２％～約４０％である、組成物が提供される。

【0077】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％～約１６％である、組成物が提供される。

【0078】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約６３％～約７６％であり、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約６５％～約７８％であり、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約２２％～約４０％であり、かつ、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％～約１６％である、組成物が提供される。

【0079】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３．５～約４．６であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約６３％～約７６％である、組成物が提供される。

【0080】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３．５～約４．６であり、かつ、
ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約６５％～約７８％である、組成物が提供される。

【0081】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３．５～約４．６であり、かつ、
ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約２２％～約４０％である、組成物が提供される。

【0082】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３．５～約４．６であり、かつ、
ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％～約１６％である、組成物が提供される。

【0083】

本開示のさらなる態様によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する、細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）を含む組成物であって、
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、かつ、
前記細胞毒性剤がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、かつ、
平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が約３．５～約４．６であり、かつ、
ＬＣ Ｃ２１４での薬物負荷の割合が約６３％～約７６％であり、ＨＣ Ｃ２２４での薬物負荷の割合が約６５％～約７８％であり、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ２の薬物負荷の割合が約２２％～約４０％であり、かつ、ＨＣ Ｃ２３０またはＨＣ Ｃ２３３でのＨＣヒンジＤＬ１の薬物負荷の割合が約１１％～約１６％である、組成物が提供される。

【0084】

本明細書に記載の組成物における抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、ＢＣＭＡが媒介する様々な疾患（例えば、リンパ腫および多発性骨髄腫等のＢ細胞が媒介する癌を含む）の治療および／または予防に有用であり得る。本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、ヒトＢＣＭＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ０２２２３．２のアミノ酸配列を含むヒトＢＣＭＡ）またはそれに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性もしくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＢＣＭＡタンパク質と結合し得る。

【0085】

抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、抗ＢＣＭＡ抗原結合タンパク質を含む。「抗原結合タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原に結合し得る抗体、抗体フラグメントおよびその他のタンパク質構築物、例えば、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に結合し得る抗ＢＣＭＡ抗原結合タンパク質を指す。抗原結合タンパク質は、天然の抗体またはその機能的フラグメントもしくは等価物の構造にフォーマットされ得る本開示の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み得る。したがって、抗原結合タンパク質は、適当な軽鎖と組合せた場合に、全長抗体、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメントまたはその等価物（例えば、ｓｃＦＶ、バイボディ、トリボディまたはテトラボディ、Ｔａｎｄａｂ等）にフォーマットされる本開示のＶ_Ｈ領域を含み得る。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはＩｇＤまたはそれらの修飾バリアントであり得る。抗体重鎖の定常ドメインを、それに応じて選択することができる。軽鎖定常ドメインは、κまたはλ定常ドメインであり得る。さらに、抗原結合タンパク質は、総てのクラスの修飾、例えばＩｇＧ二量体、Ｆｃ受容体と結合しなくなったＦｃ変異体またはＣ１ｑ結合を媒介しなくなったＦｃ変異体を含み得る。抗原結合タンパク質はまた、抗原結合領域および非免疫グロブリン領域を含む、国際公開第８６／０１５３３号に記載されているタイプのキメラ抗体であり得る。

【0086】

抗原結合タンパク質は、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体またはミニボディのいずれかであり得る。抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体のいずれかであり得る。抗原結合タンパク質は、ヒト化された抗体であり得る。抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体であり得る。

【0087】

例示的な抗ＢＣＭＡ抗原結合タンパク質およびその作製方法は、国際公開第２０１２／１６３８０５号に開示され、その全体が参照により本明細書の一部とされる。さらなる例示的な抗ＢＣＭＡ抗原結合タンパク質には、国際公開第２０１６／０１４７８９号、同第２０１６／０９０３２０号、同第２０１６／０９０３２７号、同第２０１６／０２０３３２号、同第２０１６／０７９１７７号、同第２０１４／１２２１４３号、同第２０１４／１２２１４４号、同第２０１７／０２１４５０号、同第２０１６／０１４５６５号、同第２０１４／０６８０７９号、同第２０１５／１６６６４９号、同第２０１５／１５８６７１号、同第２０１５／０５２５３６号、同第２０１４／１４０２４８号、同第２０１３／０７２４１５号、同第２０１３／０７２４０６号、同第２０１４／０８９３３５号、米国特許公開第２０１７／１６５３７３号、国際公開第２０１３／１５４７６０号および同第２０１７／０５１０６８号に記載されているものが含まれ、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書の一部とされる。

【0088】

別の実施形態において、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ抗原結合タンパク質は、ＢＣＭＡ受容体に対するＢＡＦＦおよび／またはＡＰＲＩＬの結合を阻害し得る。別の実施形態において、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ抗原結合タンパク質は、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合することができるか、またはＦｃγＲＩＩＩＡにより媒介されるエフェクター機能を示すことができる。

【0089】

抗ＢＣＭＡ抗原結合タンパク質は、抗体（「抗ＢＣＭＡ抗体」）を含んでいてもよい。「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリン様ドメインを有する分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）を指し、このタイプのモノクローナル分子、組換え分子、ポリクローナル分子、キメラ分子、ヒト分子およびヒト化分子を含み得る。モノクローナル抗体は、抗体を発現する真核細胞クローンまたは原核生物クローン細胞（prokaryotic close cell）によって産生され得る。モノクローナル抗体はまた、真核細胞株によっても産生され得、真核細胞株は、細胞に導入された抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を有することによって、抗体の重鎖および軽鎖を組換え的に発現し得る。種々の真核細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ハイブリドーマまたは動物（例えばヒト）に由来する不死化抗体細胞から抗体を産生するための例示的な方法は、当業者に周知である。

【0090】

抗体は、例えば、ラット、マウス、霊長類（例えば、カニクイザル、旧世界ザルまたは大型類人猿）、ヒト、またはその他の供給源（例えば、当業者に周知の分子生物学的技術を使用して作製された、抗体分子をコードする核酸）のいずれかに由来し得る。

【0091】

抗体は、定常領域を含み得、任意のアイソタイプまたはサブクラスであり得る。定常領域は、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４またはそれらのバリアントであり得る。

【0092】

抗原結合タンパク質は、１または２以上の修飾を含み得、修飾としては、例えば、抗原結合タンパク質が抗体である場合には、抗体のエフェクター機能／ＡＤＣＣおよび／または補体活性化を増強するように変異した定常ドメインが挙げられる。

【0093】

抗ＢＣＭＡ抗体は、抗体依存性の細胞媒介細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）エフェクター機能が増強されている。「エフェクター機能」という用語は、本明細書で使用する場合、抗体依存性の細胞媒介細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）媒介応答、Ｆｃ媒介貪食作用および／またはＦｃＲｎ受容体を介した抗体のリサイクルのうち、１または２以上を指すことを意味する。ＩｇＧ抗体の場合、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを含み得るエフェクター機能、重鎖定常領域と免疫細胞の表面に存在するＦｃγ受容体ファミリーとの相互作用によって媒介され得る。ヒトにおいて、これらはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含み得る。抗原に結合した抗原結合タンパク質とＦｃ／Ｆｃγ複合体形成との間の相互作用は、様々な作用、例えば、細胞傷害性、免疫細胞活性化、貪食作用および／または炎症性サイトカインの放出を誘導し得る。

【0094】

抗ＢＣＭＡ抗体は、ＢＣＭＡ受容体へのＢＡＦＦおよび／またはＡＰＲＩＬの結合を阻害し得る。抗ＢＣＭＡ抗体は、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合することができるか、またはＦｃγＲＩＩＩＡ媒介エフェクター機能を示し得る。

【0095】

抗ＢＣＭＡ抗体は、２個の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖（「ＨＣ」）と２個のＩｇ軽鎖（「ＬＣ」）を含み得る。基本の抗体構造単位は、例えば、サブユニットの四量体を含み得る。各四量体は２対のポリペプチド鎖を含み得、各対は１本の「軽鎖」（約２５ｋＤａ）と１本の「重鎖」（約５０～７０ｋＤａ）を含み得る。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う約１００～１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含み得る。この可変領域は、最初に、切断可能なシグナルペプチドに結合されて発現し得る。シグナルペプチドを含まない可変領域は、成熟可変領域と呼ばれる。したがって、一例において、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域を含み得る。各鎖のカルボキシ末端部分は、定常領域を規定し得る。重鎖定常領域は、主としてエフェクター機能を担うものであり得る。

【0096】

各軽鎖／重鎖対の成熟可変領域は、抗体結合部位（抗原結合部位とも呼ばれる）を形成し得る。「抗原結合部位」は、抗原と特異的に結合し得る抗体上の部位を指し、これは単一の可変ドメインであり得るか、または標準的な抗体に見られるような対をなしたＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌドメインであり得る。したがって、インタクトな抗体は、例えば２個の結合部位を有し得る。二機能性または二重特異性抗体の場合を除き、これらの２個の結合部位は同一であり得る。これらの鎖は総て、相補性決定領域または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３個の超可変領域により結合された、比較的保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を示し得る。各対の２個の鎖に由来するＣＤＲは、フレームワーク領域により整列され、特定のエピトープへの結合を可能とする。したがって、一例において、軽鎖および重鎖とも、Ｎ末端からＣ末端へ、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。

【0097】

「ＣＤＲ」は、抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列として定義される。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には、３個の重鎖ＣＤＲおよび３個の軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。したがって、「（複数の）ＣＤＲ」は、本明細書で使用する場合、３個総ての重鎖ＣＤＲ、３個総ての軽鎖ＣＤＲ、総ての重鎖および軽鎖ＣＤＲ、または少なくとも２個のＣＤＲを指す。一実施形態において、組成物は、本明細書に記載される１個または２個以上のＣＤＲ、または本明細書に記載される重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインの一方もしくは両方を含む抗ＢＣＭＡ抗体を含む。

【0098】

「バリアント」、「抗体バリアント」、「ＣＤＲバリアント」および「翻訳後修飾バリアント」という用語は、抗体配列の少なくとも１つのアミノ酸変化を指す。バリアントは、翻訳後修飾、化学変化または少なくとも１つの欠失、置換もしくは付加による配列変化の結果であり得る。配列を変化させない化学変化（例えば、Ｍｅｔと酸化Ｍｅｔ、またはＡｓｐと異性体化／ｉｓｏ－Ａｓｐ、または凝集）をもたらす翻訳後修飾もあれば、配列変化、例えば、あるアミノ酸残基の別のアミノ酸残基への変換（例えば、脱アミド化によるＡｓｎのＡｓｐへの変換、またはリジン欠失）をもたらす翻訳後修飾もある。さらなる翻訳後修飾バリアントを以下に記載する。配列変化を含むバリアント抗体配列は、設計された配列変化または翻訳後修飾の結果であり得る。アミノ酸の配列変化は、欠失、置換または付加であり得る。

【0099】

このような一実施形態において、置換は保存的置換である。別の実施形態において、抗体バリアントは、少なくとも１つの置換を含み得、抗原結合タンパク質のカノニカル構造を保持する。一実施形態において、抗体バリアントは、親抗体のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一である（すなわち、親抗体のアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性を有する）。別の実施形態において、抗体バリアントは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％同一の重鎖アミノ酸配列、および／または、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％同一の重鎖アミノ酸配列を含む。

【0100】

抗原結合タンパク質は、ＦｃＲｎに対する定常ドメインまたはそのフラグメントの親和性を高めるアミノ酸修飾（例えば、アミノ酸置換）を有し得る。治療用および診断用のＩｇＧ抗体およびその他の生物活性分子の半減期（例えば、血清半減期）の延長は、これらの分子の投与量および／または投与頻度の低減を含む多くの利益を有する。一実施形態において、本開示の抗原結合タンパク質は、以下のアミノ酸修飾のうち１または２以上を有するＩｇＧ定常ドメインの全部または一部（ＦｃＲｎ結合部分）を含む。

【0101】

例えば、ＩｇＧ１に関して、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（一般に「ＹＴＥ」と呼ばれる）および／またはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（一般に「ＬＳ」と呼ばれる）の修飾は、ｐＨ６．０でＦｃＲｎ結合を増加させる（Ｗａｎｇら、２０１８年）。

【0102】

半減期はまた、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４ＡおよびＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ修飾（ＩｇＧ１およびＫａｂａｔナンバリングを参照）によっても延長され得る（Ｍｏｎｎｅｔら）。

【0103】

半減期およびＦｃＲｎ結合はまた、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ修飾（一般に「ＨＮ」または「ＮＨａｎｃｅ」と呼ばれる）（ＩｇＧ１を参照）を導入することによっても延長され得る（国際公開第２００６／１３０８３４号）。

【0104】

国際公開第００／４２０７２号には、ＦｃＲｎ結合親和性が変更されたバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドが開示され、このポリペプチドは、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８６、３８８、４００、４１３、４１５、４２４、４３３、４３４、４３５、４３６、４３９および４４７（ＥＵインデックスナンバリング）のうちの任意の１または２以上のアミノ酸修飾を含む。

【0105】

国際公開第０２／０６０９１９号には、野生型ＩｇＧ定常ドメインに比べて１または２以上のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ定常ドメインを含む修飾ＩｇＧが開示されており、この修飾ＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期に比べて半減期の延長を示し、これら１または２以上のアミノ酸修飾は、２５１、２５３、２５５、２８５～２９０、３０８～３１４、３８５～３８９および４２８～４３５のうち１または２以上に存在する。

【0106】

Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００１年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７６巻、６５９１～６０４頁）は、アラニンスキャニング変異誘発を使用してヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の残基を変更し、次いで、ヒトＦｃＲｎへの結合を評価した。アラニンに変更された場合にＦｃＲｎへの結合を効果的に抑制する位置としては、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５およびＹ４３６挙げられる。以下のその他の位置：Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｒ２５５、Ｋ２８８、Ｌ３０９、Ｓ４１５およびＨ４３３は、結合に顕著な低下を示さなかった。いくつかのアミノ酸位置は、アラニンに変更された場合にＦｃＲｎ結合の改善を示し、これらの中で顕著なものは、Ｐ２３８、Ｔ２５６、Ｅ２７２、Ｖ３０５、Ｔ３０７、Ｑ３１１、Ｄ３１２、Ｋ３１７、Ｄ３７６、Ｅ３８０、Ｅ３８２、Ｓ４２４およびＮ４３４である。その他の多くのアミノ酸位置は、ＦｃＲｎ結合にわずかな改善を示した（Ｄ２６５、Ｎ２８６、Ｖ３０３、Ｋ３６０、Ｑ３６２およびＡ３７８）か、または変化がなかった（Ｓ２３９、Ｋ２４６、Ｋ２４８、Ｄ２４９、Ｍ２５２、Ｅ２５８、Ｔ２６０、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｓ２６９、Ｄ２７０、Ｋ２７４、Ｎ２７６、Ｙ２７８、Ｄ２８０、Ｖ２８２、Ｅ２８３、Ｈ２８５、Ｔ２８９、Ｋ２９０、Ｒ２９２、Ｅ２９３、Ｅ２９４、Ｑ２９５、Ｙ２９６、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｒ３０１、Ｎ３１５、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｓ３２４、Ｋ３２６、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｐ３３１、Ｅ３３３、Ｋ３３４、Ｔ３３５、Ｓ３３７、Ｋ３３８、Ｋ３４０、Ｑ３４２、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｑ３４５、Ｑ３４７、Ｒ３５６、Ｍ３５８、Ｔ３５９、Ｋ３６０、Ｎ３６１、Ｙ３７３、Ｓ３７５、Ｓ３８３、Ｎ３８４、Ｑ３８６、Ｅ３８８、Ｎ３８９、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｌ３９８、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｋ４１４、Ｒ４１６、Ｑ４１８、Ｑ４１９、Ｎ４２１、Ｖ４２２、Ｅ４３０、Ｔ４３７、Ｋ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４２、Ｓ４４４およびＫ４４７）。

【0107】

ＦｃＲｎ結合の改善に関して最も顕著な効果は、組合せバリアントに見られた。ｐＨ６．０で、Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａバリアントは、ＦｃＲｎへの結合は、天然（native）のＩｇＧ１に対して８倍以上優れていたが、Ｅ３８０Ａでは２倍、Ｎ４３４Ａでは３．５倍であった。これにＴ３０７Ａを追加すると、天然のＩｇＧ１と比較して結合が１２倍改善した。一実施形態において、本開示の抗原結合タンパク質は、Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ置換を含み、ＦｃＲｎへの結合の増大を示す。

【0108】

Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（２００２年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６９巻、５１７１～８０頁）は、マウスＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１ヒンジＦｃフラグメントのファージディスプレーライブラリーのランダム変異誘発およびスクリーニングについて記載している。著者らは、位置２５１、２５２、２５４～２５６、３０８、３０９、３１１、３１２、３１４、３８５～３８７、３８９、４２８、４３３、４３４および４３６のランダム変異誘発を開示している。ＩｇＧ１－ヒトＦｃＲｎ複合体安定性の主な改善は、Ｆｃ－ＦｃＲｎ界面に沿った帯域に位置する残基（Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｈ４３３、Ｎ４３４およびＹ４３６）を置換する場合に生じ、周辺（periphery）の残基、例えば、Ｖ３０８、Ｌ３０９、Ｑ３１１、Ｇ３８５、Ｑ３８６、Ｐ３８７およびＮ３８９の置換の場合には、改善の程度は低い。ヒトＦｃＲｎに対する親和性が最も高いバリアントは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）とＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ変異を組み合わせることで得られ、野生型ＩｇＧ１と比較して５７倍の親和性を示した。このように変異したヒトＩｇＧ１のｉｎ ｖｉｖｏでの挙動は、野生型ＩｇＧ１と比較して、カニクイザルの血清半減期にほぼ４倍の延長を示した。

【0109】

抗原結合タンパク質は、ＦｃＲｎに対して最適な結合を示し得る。したがって、抗原結合タンパク質は、前記抗原結合タンパク質のＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、前記修飾は、Ｆｃ領域の２２６、２２７、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４１、２４３、２４６、２５０、２５２、２５６、２５９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２７６、２８４、２８５、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９４、２９７、２９８、２９９、３０１、３０２、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１５、３１７、３２０、３２２、３２５、３２７、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、３４２、３４３、３４５、３４７、３５０、３５２、３５４、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３６２、３６９、３７０、３７１、３７５、３７８、３８０、３８２、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、３９０、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０３、４０４、４０８、４１１、４１２、４１４、４１５、４１６、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２４、４２６、４２８、４３３、４３４、４３８、４３９、４４０、４４３、４４４、４４５、４４６および４４７からなる群から選択されるアミノ酸位置に存在する（Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１年））のようにＥＵインデックスに従うナンバリング）。

【0110】

さらに、様々な刊行物には、半減期が変更された生理活性分子を得るための方法が記載されており、その方法は、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドを分子に導入することによって得る方法（国際公開第９７／４３３１６号、米国特許公開第５８６９０４６号、同第５７４７０３５号、国際公開第９６／３２４７８号および同第９１／１４４３８）、またはそれらの分子を、ＦｃＲｎ結合親和性は保存されているが、その他Ｆｃ受容体に対する親和性は大幅に低減されている抗体に融合することによって得る方法（国際公開第９９／４３７１３号）、または抗体のＦｃＲｎ結合ドメインと融合させることによって得る方法（国際公開第００／０９５６０号、米国特許公開第４７０３０３９号）のいずれかである。

【0111】

抗体細胞傷害性と半減期の両方を改善するためのＦｃＲｎ親和性が増強されたＦｃバリアントは、ｐＨ６．０でのスクリーニングで同定された。選択されたＩｇＧバリアントは、低フコシル化分子として作製され得る。得られたバリアントは、ｈＦｃＲｎマウスにおいて血清持続性の増強を示すとともに、保存され増強されたＡＤＣＣを示す（Ｍｏｎｎｅｔら）。例示的なバリアントとしては以下のものが挙げられる（ＩｇＧ１およびＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うナンバリングを参照）：
Ｐ２３０Ｔ／Ｖ３０３Ａ／Ｋ３２２Ｒ／Ｎ３８９Ｔ／Ｆ４０４Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；
Ｐ２２８Ｒ／Ｎ４３４Ｓ；
Ｑ３１１Ｒ／Ｋ３３４Ｒ／Ｑ３４２Ｅ／Ｎ４３４Ｙ；
Ｃ２２６Ｇ／Ｑ３８６Ｒ／Ｎ４３４Ｙ；
Ｔ３０７Ｐ／Ｎ３８９Ｔ／Ｎ４３４Ｙ；
Ｐ２３０Ｓ／Ｎ４３４Ｓ；
Ｐ２３０Ｔ／Ｖ３０５Ａ／Ｔ３０７Ａ／Ａ３７８Ｖ／Ｌ３９８Ｐ／Ｎ４３４Ｓ；
Ｐ２３０Ｔ／Ｐ３８７Ｓ／Ｎ４３４Ｓ；
Ｐ２３０Ｑ／Ｅ２６９Ｄ／Ｎ４３４Ｓ；
Ｎ２７６Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｎ４３４Ｓ；
Ｔ３０７Ａ／Ｎ３１５Ｄ／Ａ３３０Ｖ／３８２Ｖ／Ｎ３８９Ｔ／Ｎ４３４Ｙ；
Ｔ２５６Ｎ／Ａ３７８Ｖ／Ｓ３８３Ｎ／Ｎ４３４Ｙ；
Ｎ３１５Ｄ／Ａ３３０Ｖ／Ｎ３６１Ｄ／Ａ３８７Ｖ／Ｎ４３４Ｙ；
Ｖ２５９Ｉ／Ｎ３１５Ｄ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｙ；
Ｐ２３０Ｓ／Ｎ３１５Ｄ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｙ；
Ｆ２４１Ｌ／Ｖ２６４Ｅ／Ｔ３０７Ｐ／Ａ３７８Ｖ／Ｈ４３３Ｒ；
Ｔ２５０Ａ／Ｎ３８９Ｋ／Ｎ４３４Ｙ；
Ｖ３０５Ａ／Ｎ３１５Ｄ／Ａ３３０Ｖ／Ｐ３９５Ａ／Ｎ４３４Ｙ；
Ｖ２６４Ｅ／Ｑ３８６Ｒ／Ｐ３９６Ｌ／Ｎ４３４Ｓ／Ｋ４３９Ｒ；
Ｅ２９４ｄｅｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙ（「ｄｅｌ」は欠失を示す）。

【0112】

また、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を生産するための方法であって、以下の工程：ａ）本明細書に記載の単離された核酸を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養する工程であって、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を組換え宿主細胞中で不活化する工程；およびｂ）抗原結合タンパク質を回収する工程を含む方法も記載される。このような抗原結合タンパク質を生産するための方法は、例えば、ＢｉｏＷａ，Ｉｎｃ．（プリンストン、ＮＪ）から入手可能なＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ技術システムを使用して行うことができ、このシステムにおいて、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くＣＨＯＫ１ＳＶ細胞は、増強された抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有するモノクローナル抗体を産生し、この活性は、機能的ＦＵＴ８遺伝子を有する細胞内で生産された同一のモノクローナル抗体よりも増強されている。ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ技術システムの態様は、米国特許公開第７２１４７７５号、同第６９４６２９２号、国際公開第００６１７３９号および同第０２３１２４０号に記載され、これらは総て、引用することにより本明細書の一部とされる。当業者はまた、抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するためのその他の適切なシステムおよび方法を認識する。

【0113】

抗体は、従来のタンパク質精製手順によって回収および精製され得る。例えば、抗体は培養培地から直接採取され得る。細胞培養培地の採取は、清澄化、例えば、遠心分離および／または深層濾過による清澄化であり得る。抗体を回収した後、十分な純度を確保するための精製が行われる。したがって、本明細書に記載の抗体を含む細胞培養培地もまた記載される。一実施形態において、細胞培養培地は、ＣＨＯ細胞を含む。

【0114】

次いで、抗体は、細胞培養培地から精製され得る。これは、細胞培養上清を採取し、細胞培養上清を精製媒体（例えば、抗体分子を結合させるためのプロテインＡ樹脂またはプロテインＧ樹脂）と接触させ、精製媒体から抗体分子を溶出させて溶出液を生成することを含み得る。したがって、一態様において、本明細書に記載の抗体を含む溶出液が提供される。

【0115】

精製には、１または２以上のクロマトグラフィー工程を精製に使用してもよく、例えば、１または２以上のクロマトグラフィー樹脂および／または１または２以上の濾過工程を精製に使用することができる。例えば、樹脂、例えば、プロテインＡ、ＧまたはＬを使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して、組成物を精製することができる。あるいは、またはそれに加えて、陽イオン交換樹脂、例えば、陽イオン交換体を使用して、組成物を精製することができる。

【0116】

あるいは、精製工程は、アフィニティークロマトグラフィー樹脂による工程と、その後の陽イオン交換樹脂による工程とを含む。

【0117】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）を含む。一実施形態において、重鎖可変領域ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸変異（「バリアント」）を有するアミノ酸配列を含む。

【0118】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）を含む。一実施形態において、重鎖可変領域ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸変異（「バリアント」）を有するアミノ酸配列を含む。

【0119】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）を含む。一実施形態において、重鎖可変領域ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸変異（「バリアント」）を有するアミノ酸配列を含む。

【0120】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）を含む。一実施形態において、軽鎖可変領域ＣＤＬ１（「ＣＤＲ１」）は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸変異（「バリアント」）を有するアミノ酸配列を含む。

【0121】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）を含む。一実施形態において、軽鎖可変領域ＣＤＬ２（「ＣＤＲ２」）は、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸変異（「バリアント」）を有するアミノ酸配列を含む。

【0122】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を含む。一実施形態において、軽鎖可変領域ＣＤＬ３（「ＣＤＲ３」）は、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸変異（「バリアント」）を有するアミノ酸配列を含む。

【0123】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および／または、配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む。

【0124】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（「Ｖ_Ｈ」）を含む。

【0125】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（「Ｖ_Ｌ」）を含む。

【0126】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ；および配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含み、抗ＢＣＭＡ抗体は、ＢＣＭＡに対する結合を保持する。

【0127】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖領域（「ＨＣ」）を含む。

【0128】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖領域（「ＬＣ」）を含む。

【0129】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ；および配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣを含む。

【0130】

クエリーアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列の間の「配列同一性」は、ペアワイズＢＬＡＳＴＰアラインメントが実行された後に、サブジェクトアミノ酸配列がクエリーアミノ酸配列と１００％のクエリーカバー率を有する場合に、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムにより計算されるパーセンテージとして表される「同一性」の値である。クエリーアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列の間のこのようなペアワイズＢＬＡＳＴＰアラインメントは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのデフォルト設定を、低複雑性領域のフィルターをオフにして使用することによって実行される。重要なこととして、クエリー配列は本明細書の１または２以上の請求項で特定されるアミノ酸配列により記載され得る。

【0131】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１；配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２；配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３；配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１；配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２；および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む。

【0132】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ；および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを含む。

【0133】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＨＣ、および配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＬＣを含むベランタマブである。

【0134】

抗体の配列は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ ＮＩＨ、１９８７年）によって決定され得る。あるいは、Ｃｈｏｈｔｉａナンバリングシステム（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７年、ＪＭＢ、２７３巻、９２７～９４８頁）、接触定義法（contact definition method）（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ．Ｍ．、Ｍａｒｔｉｎ Ａ．Ｃ．Ｒ．およびＴｈｏｒｎｔｏｎ Ｊ．Ｍ、１９９６年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２６２巻５号、７３２～７４５頁）または抗体の残基をナンバリングして、当業者に公知のＣＤＲを決定するための任意のその他の確立された任意の方法を使用して決定することができる。当業者が利用可能な抗体配列のためのその他のナンバリング規則としては、「ＡｂＭ」法（バース大学）および「接触」法（ロンドン大学）がある。最後に、抗体配列は、連続的にナンバリングすることができる。

【0135】

本明細書に記載のアミノ酸を数値的に言及する場合は、Ｋａｂａｔ法または連続ナンバリング法に従ってナンバリングされ得る。別段の明記がない限り、特定のアミノ酸番号に対する数値の言及は、本明細書では、連続ナンバリングシステムで記載される。本明細書を通じて、「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」という用語は、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。可変領域配列および全長抗体配列のアミノ酸残基は、任意の抗体配列バリアントの位置または翻訳後修飾バリアント位置、例えば、異性体化バリアント（例えば、Ｄ１０３）、脱アミド化バリアント（例えば、Ｎ３８８）または酸化バリアント（例えば、Ｍ３４）を表すために連続的にナンバリングされる。

【0136】

ＣＤＲ（例えば、Ｍ３４またはＤ１０３）の位置への言及は、全抗体配列に関する位置番号（連続的ナンバリング）を提供する。したがって、ＣＤＲＨ１のＭ３４は、配列番号１の４番目の残基、すなわち、ＮＹＷＭＨ（配列番号１）の下線を指すと理解される。同様に、ＣＤＲＨ３のＤ１０３は、配列番号３の５番目の残基、すなわち、ＧＡＩＹＤＧＹＤＶＬＤＮ（配列番号３）の下線を指す。

【0137】

一実施形態において、組成物は、一次配列における１または２以上のアミノ酸の変化を含む抗体バリアントを含む。一実施形態において、組成物は、配列番号９の重鎖アミノ酸配列および／または配列番号１０の軽鎖配列と少なくとも約９０％同一である抗体であって、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）へのアミノ酸変化、例えば、ＣＤＲＨ３におけるＤ１０３Ｎ（例えば、ＫａｂａｔナンバリングにおけるＤ９９Ｎ）を有する抗体を含む。

【0138】

別の実施形態において、組成物は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む抗体であって、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）へのアミノ酸変化、例えば、ＣＤＲＨ３におけるＤ１０３Ｎを含む抗体を含む。

【0139】

別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、ベランタマブを含み、かつ、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）へのアミノ酸変化、例えば、ＣＤＲＨ３におけるＤ１０３Ｎを含む。

【0140】

一実施形態において、組成物は、配列番号９の重鎖アミノ酸配列および／または配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列と少なくとも約９０％同一の抗体の混合物であって、混合物中の抗体の約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約５０％以上、約７５％以上または約９０％以上がＣＤＲＨ３にＤ１０３Ｎを含む混合物を含む。

【0141】

一実施形態において、組成物は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む抗体の混合物であって、混合物中の抗体の約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約５０％以上、約７５％以上または約９０％以上がＣＤＲＨ３にＤ１０３Ｎを含む混合物を含む。

【0142】

一実施形態において、組成物はベランタマブを含み、ベランタマブの約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約５０％以上、約７５％以上または約９０％以上はＣＤＲＨ３にＤ１０３Ｎを含む。

【0143】

一実施形態において、組成物はベランタマブを含み、ベランタマブは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用して、Ｇ２７Ｙ、Ｓ３０Ｔ、Ａ９３Ｔ、Ａ２４Ｇ、Ｋ７３Ｔ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｆ７１Ｙ、Ｄ９９Ｎ、Ｍ４ＬおよびＫ４５Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの抗体バリアントを含む。

【0144】

抗体薬物複合体
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、新たなクラスの強力な抗癌剤であり、近年、顕著な臨床的有用性が示されている。ＡＤＣは、リンカーを介して抗体に化学的に結合した細胞毒性剤で構成されている。おそらく、細胞表面での抗原結合、エンドサイトーシス、リソソームへの輸送、ＡＤＣの分解、ペイロードの放出、細胞処理（例えば、有糸分裂）の阻害およびアポトーシスを含む一連のイベントによって、ＡＤＣは細胞表面タンパク質の過剰発現を有する癌細胞を破壊し得る。ＡＤＣは、モノクローナル抗体の抗原により駆動される標的化特性と、細胞毒性剤の強力な抗腫瘍効果を併せ持つ。例えば、２０１１年に、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（抗ＣＤ３０抗体－ＭＭＡＥ ＡＤＣ）は、難治性ホジキンリンパ腫および全身性未分化リンパ腫の治療薬として規制当局の承認を得た。

【0145】

ＡＤＣは、癌の治療において、細胞毒性剤、例えば、細胞を死滅させるまたは細胞の成長もしくは増殖を阻害する薬物の局所送達のために使用されてきた（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．、２００５年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５、５４３～５４９頁；Ｗｕら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３巻９号、１１３７～１１４６頁；Ｐａｙｎｅ，Ｇ．、２００３年、ｉ３、２０７～２１２頁；ＳｙｒｉｇｏｓとＥｐｅｎｅｔｏｓ、１９９９年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９、６０５～６１４頁；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ－ＤｕｖａｚとＳｐｒｉｎｇｅｒ、１９９７年、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２６巻、１５１～１７２頁；米国特許公開第４，９７５，２７８号）。ＡＤＣは、腫瘍への薬物部分の標的化送達およびそこでの細胞内蓄積を可能にし、コンジュゲートされていない薬物の全身投与は、排除しようとする腫瘍細胞だけでなく正常細胞にも許容できないレベルの毒性をもたらす可能性がある（Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｌａｎｃｅｔ、１９８６年３月１５日、６０３～０５頁；Ｔｈｏｒｐｅ、１９８５年、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８４、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａら編）４７５～５０６頁）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方がこれらの戦略に有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら、１９８６年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２１巻、１８３～８７頁）。抗体－毒素複合体に使用される毒素には、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物毒素、例えばリシン、低分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒら、２０００年、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、９２巻１９号、１５７３～１５８１頁；Ｍａｎｄｌｅｒら、２０００年、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １０、１０２５～１０２８頁；Ｍａｎｄｌｅｒら、２００２年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１３巻、７８６～７９１頁）、メイタンシノイド（欧州特許公開第１３９１２１３号；Ｌｉｕら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻８６１８～８６２３頁）およびカリケアミシン（Ｌｏｄｅら、１９９８年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５８巻、２９２８頁；Ｈｉｎｍａｎら、１９９３年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５３巻、３３３６～３３４２頁）等が含まれる。

【0146】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、１または２以上の細胞毒性剤、例えば、化学療法薬、薬物増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素またはそれらのフラグメント）、あるいは放射性同位体（例えば、放射性複合体（radioconjugate））にコンジュゲートされた抗体または抗体フラグメントを含む。

【0147】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、以下の一般構造：
ＡＢＰ－（（リンカー）_ｎ－Ｃｔｘ）_ｍ
［式中、
ＡＢＰは、抗原結合タンパク質、抗体または抗体フラグメントであり、
リンカーは、存在しないか、または任意の切断可能もしくは切断不可能なリンカーであり、
Ｃｔｘは、本明細書に記載の任意の細胞毒性剤であり、
ｎは、０、１、２または３であり、かつ、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。］
を有する。

【0148】

例示的な実施形態において、使用可能な酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α－サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンまたはトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照されたい。様々な放射性核種、例えば、^２１１Ａｔ、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ、または^１８６Ｒｅが放射性複合体抗体の生産に利用可能である。

【0149】

本開示の抗ＢＣＭＡ抗体またはそのフラグメントは、１または２以上の細胞毒性剤、例えば、限定するものではないが、カリケアミシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、トリコテセンおよびＣＣ１０６５、または毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体にコンジュゲートされ得る。好適な細胞毒性剤としては、例えば、アウスタリチン（モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）およびモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）ならびにＭＭＡＥのエステル形態を含む）、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセルを含む）、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイドおよびビンカアルカロイドが挙げられる。特定の細胞毒性剤としては、トポテカン、モルホリノ－ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン－１０、エチノマイシン、コンブレタスタチン（combretastatin）、カリケアミシン、メイタンシン、ＤＭ－１、ＤＭ－４、ネトロプシンが挙げられる。その他の好適な細胞毒性剤としては、抗チューブリン剤、例えば、アウリスタチン、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチンまたはドラスタチンが挙げられる。抗チューブリン剤としては、ジメチルバリン－バリンドライソロイン－ドラプロイン－フェニルアラニン－ｐ－フェニレン－ジアミン（ＡＦＰ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ－１６、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンＡ、エポチロンＢ、ノコダゾール、コルヒチン、コルシミド(colcimid)、エストラムスチン、セマドチン(cemadotin)、ディスコデルモリド、メイタンシン、ＤＭ－１、ＤＭ－４またはエリュテロビンが挙げられる。

【0150】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦに結合された抗ＢＣＭＡ抗体を含む。

【0151】

【化3】

【0152】

例示的なリンカーとしては、切断可能リンカーおよび切断不能リンカーが挙げられる。切断可能リンカーは、細胞内条件下で切断に感受性があり得る。好適な切断可能リンカーとしては、細胞内プロテアーゼ、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーが挙げられる。例示的な実施形態において、リンカーは、ジペプチドリンカー、例えば、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔ）リンカーまたはフェニルアラニン－リジン（ｐｈｅ－ｌｙｓ）リンカーであり得る。その他の好適なリンカーとしては、５．５より低いｐＨで加水分解可能なリンカー、例えばヒドラゾンリンカーが挙げられる。その他の好適な切断可能リンカーとしては、例えば、ジスルフィドリンカーが挙げられる。例示的なリンカーとしては、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボンキシレート（ＳＭＣＣ）およびＮ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）が挙げられる。

【0153】

一実施形態において、リンカーは、チオール反応性マレイミド、カプロイルスペーサー、ジペプチドバリン－５シトルリン、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル、自己犠牲フラグメント化基（self-immolative fragmenting group）、またはプロテアーゼ耐性マレイミドカプロイルを含み得る。

【0154】

別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、下記の構造で示されるようなＭＣリンカーによりＭＭＡＥまたはＭＭＡＦに結合された抗ＢＣＭＡ抗体を含む。

【0155】

【化4】

【0156】

本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、本明細書に記載の任意の抗ＢＣＭＡ抗体を本明細書に記載の任意の細胞毒性剤とともに含み得る。

【0157】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および／または、配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む抗ＢＣＭＡ抗体を含み、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦにコンジュゲートされている。

【0158】

さらに別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１；配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２；配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３；配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１；配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２；および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む抗ＢＣＭＡ抗体を含み、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥにコンジュゲートされている。

【0159】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ；および／または、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む抗ＢＣＭＡ抗体を含み、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦにコンジュゲートされている。

【0160】

さらに別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ；および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを含む抗ＢＣＭＡ抗体を含み、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥにコンジュゲートされている。

【0161】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣ；および／または、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣを含む抗ＢＣＭＡ抗体を含み、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥにコンジュゲートされている。

【0162】

さらに別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＨＣ、および配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗ＢＣＭＡ抗体を含むベランタマブマホドチンであり、ＭＭＡＦにコンジュゲートされている。

【0163】

ＡＤＣの調製および特性評価
特定の天然ＩｇＧ１分子は、１６個のジスルフィド結合（３２個のシステインまたはスルフヒドリル基）を含む。特定の態様において、抗体は、４個の鎖間ジスルフィド結合のみが還元される方法で還元され、細胞毒性剤とコンジュゲートすることができ、細胞毒性剤に対する結合部位を最大８個とすることができる。言い換えれば、薬物負荷（「ＤＬ」）数、すなわち、抗体分子当たりの細胞毒性剤の数は０～８の範囲であり得、本明細書においてＤＬ０、ＤＬ２（ＤＬ２ａおよびＤＬ２ｂを含む）、ＤＬ４（ＤＬ４ａ、ＤＬ４ｂおよびＤＬ４ｃを含む）、ＤＬ６（ＤＬ６ａおよびＤＬ６ｂを含む）およびＤＬ８として記載される。

【0164】

コンジュゲーションプロセスは、１）各抗体分子に結合する薬物の数、および２）細胞毒性剤の位置の両方が異なる、所与のＡＤＣ組成物に対する薬物－抗体結合の不均一性をもたらし得る。これにより、様々なＤＬ種を有するＡＤＣ組成物が得られる。本明細書において、不均一なＡＤＣ組成物全体の平均薬物抗体比を「平均ＤＡＲ」または「ＤＡＲ」と呼ぶ。例えば、ＡＤＣ組成物は、それぞれが独自のＤＬを有する抗体種の混合物（混合物中のいくつかの種はＤＬ２であり、混合物中のいくつかの種はＤＬ４であり、混合物中のいくつかの種はＤＬ６であり、混合物中のいくつかの種はＤＬ８である）を含む場合があり、組成物全体の平均ＤＡＲは約４であり得る。

【0165】

別の実施形態において、不均一なＡＤＣ組成物内の特定のＤＬ種の割合を記載するために「ＤＬの割合」という用語を使用する場合がある（例えば、ＤＬ２の割合は不均一なＡＤＣ組成物全体の約１０％～約３０％である）。

【0166】

薬物は、抗体上のスルフヒドリル基を介して抗体にコンジュゲートされ得る。スルフヒドリル基は、システイン側鎖上のスルフヒドリル基であり得る。システイン残基は、抗体内に天然に存在する（例えば、鎖間ジスルフィド）か、またはその他の手段、例えば突然変異誘発によって導入され得る。薬物と抗体上のスルフヒドリル基をコンジュゲートする方法は当技術分野で周知である（例えば、米国特許第７，６５９，２４１号、同第７，４９８，２９８号、および国際公開第２０１１／１３０６１３号、同第２０１４／１５２１９９号、同第２０１５／０７７６０５号およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００５年、１６巻、１２８２～１２９０頁を参照）。抗体は一般に、スルフヒドリル基をコンジュゲーションに利用可能とするために、コンジュゲーション前に還元される。抗体は、当技術分野で既知の条件を使用して還元され得る。還元条件は、一般にその後の抗体の変性を生じず、一般に抗体の抗原結合親和性に影響を及ぼさない条件である。

【0167】

還元工程で使用される還元剤はＴＣＥＰであり得、ＴＣＥＰは、例えば、室温で３０分間、過剰量で添加することができる。例えば、ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＴＣＥＰ溶液２５０μＬは、室温３０分で、１～１００μｇの抗体の鎖間ジスルフィドを容易に還元する。しかしながら、その他の還元剤および条件も使用可能である。反応条件の例としては、ｐＨ５～８で、５℃～３７℃の温度の条件が挙げられる。

【0168】

ＡＤＣ組成物のＤＬ種の割合および／または平均ＤＡＲを計算するための様々な方法が存在し、当業者に公知である。例えば、システインに結合されたＡＤＣの不均一性は、一般に、負荷される薬物の数に基づいてＤＬ種を分離する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により測定される。ＬＣ－ＭＳアッセイもまた、ＤＬ分布を評価するために開発されている。ＡＤＣ組成物における薬物負荷分布を計算するための例示的な方法は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ １０６０、２０１７年、１８２～１８９頁に見出すことができる。

【0169】

例えば、ＤＬ０は、抗体に薬物負荷がない。例えば、ＤＬ２は、薬物負荷が２である。一実施形態において、ＤＬ２のコンジュゲーション部位は、ＬＣ Ｃ２１４およびＨＣ Ｃ２２４である。例えば、ＤＬ４は、薬物負荷が４である。一実施形態において、ＤＬ４ａのコンジュゲーション部位は、ＬＣ Ｃ２１４、ＨＣ Ｃ２２４、ＬＣ Ｃ２１４およびＨＣ Ｃ２２４である。一実施形態において、ＤＬ４ｂのコンジュゲーション部位は、ＨＣ Ｃ２３０、ＨＣ Ｃ２３３、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３である。例えば、ＤＬ６は、薬物負荷が６である。一実施形態において、ＤＬ６のコンジュゲーション部位は、ＬＣ Ｃ２１４、ＨＣ Ｃ２２４、ＨＣ Ｃ２３０、ＨＣ Ｃ２３３、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３である。例えば、ＤＬ８は、薬物負荷が８である。一実施形態において、ＤＬ８のコンジュゲーション部位は、ＬＣ Ｃ２１４、ＨＣ Ｃ２２４、ＬＣ Ｃ２１４、ＨＣ Ｃ２２４、ＨＣ Ｃ２３０、ＨＣ Ｃ２３３、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３である。

【0170】

一実施形態において、特定のＤＬ種の割合（例えば、ＤＬ０の割合、ＤＬ２の割合、ＤＬ４ａの割合、ＤＬ４ｂの割合、ＤＬ６の割合、ＤＬ８の割合）は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して個々のＤＬ種を分離し、各ＤＬピークの曲線下面積を計算し、各ＤＬピークを、総てのＤＬ種の合計の総曲線下面積で割ることによって決定することができる。一実施形態において、平均ＤＡＲは、下式を使用して各ＤＬ種の曲線下面積から計算することができる。

【数1】

【0171】

一実施形態において、特定の下位種のＤＡＲの割合（例えば、ＤＬ２の合計に占めるＤＬ２ａの割合）は、ＨＩＣ、非還元分離法および質量分析技術を含み得る分析技術の組合せを使用して、特定のＤＬ種を収集することによって決定される。

【0172】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ組成物の平均ＤＡＲは、約２～約７、約２～約６、約２．１～約５．７、約２．１～約５．０、約２．１～約４．６、約２．１～約４．１、約２．１～約３．５、約２．１～約３．０、約３．０～約５．７、約３．０～約５．０、約３．０～約４．６、約３．０～約４．１、約３．０～約３．５、約３．５～約５．７、約３．５～約５．０、約３．５～約４．６、約３．５～約４．１、約３．８～約４．５、約４．１～約５．７、約４．１～約５．０、約４．１～約４．６、約４．６～約５．７、約４．６～約５．０、約５．０～約５．７、約２．１、約３．０、約３．５、約４．１、約４．６、約５．０または約５．７である。

【0173】

別の実施形態において、組成物は、平均ＤＡＲが約２．１～約５．７、約３．４～約４．６、約３．８～約４．５または約４である抗ＢＣＭＡ ＡＤＣを含む。

【0174】

一実施形態において、組成物は抗ＢＣＭＡ ＡＤＣを含み、抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み、細胞毒性剤はＭＭＡＥまたはＭＭＡＦであり、平均ＤＡＲは、約２～約６、約２．１～約５．７、約３．４～約４．６または約３．８～約４．５である。

【0175】

一実施形態において、組成物は抗ＢＣＭＡ ＡＤＣを含み、抗体は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶ_Ｈおよび配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを含み、細胞毒性剤はＭＭＡＥまたはＭＭＡＦであり、平均ＤＡＲは、約２～約６、約２．１～約５．７、約３．４～約４．６または約３．８～約４．５である。

【0176】

一実施形態において、組成物はベランタマブマホドチンを含み、平均ＤＡＲは、約２～約６、約２．１～約５．７、約３．４～約４．６または約３．８～約４．５である。

【0177】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ組成物中のＤＬ０種の割合は、約１０％以下、約５％以下、約１％～約１０％、約１％～約５％または約２．８％～約４．７％である。

【0178】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ組成物中のＤＬ２種の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、約１５．８％～約２６．３％、約１５％～約２７％、約１５％～約３２％または約１０％～約４０％である。

【0179】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ組成物中のＤＬ４ａ種の割合は、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、約３５．５％～約３７．９％、約３５％～約３８％、約３０％～約４０％または約２０％～約５０％である。別の実施形態において、ＤＬ４ａ種の割合は抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ組成物中の主要な種であり、組合された総ての種の約３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上を占める。

【0180】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ組成物中のＤＬ４ｂ種の割合は、少なくとも約５％、少なくとも約７％、約７．１％～約８．５％、約７％～約９％、約５％～約１０％または約１％～約１５％である。

【0181】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ組成物中のＤＬ６種の割合は、少なくとも約１０％、少なくとも約１４％、約１４．０％～約１９．１％、約１４％～約２０％、約１０％～約２０％または約５％～約３０％である。

【0182】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ組成物中のＤＬ８種の割合は、少なくとも約１％、少なくとも約６％、約６．０％～約１２．０％、約４％～約１５％または約１％～約２０％である。

【0183】

一実施形態において、組成物は抗ＢＣＭＡ ＡＤＣを含み、ＤＬ２の割合は約１５％～約２７％または約１５％～約３２％であり、ＤＬ４ａの割合は約３５％～約３８％または約３０％～約４０％であり、ＤＬ４ｂの割合は約７％～約９％または約５％～約１０％であり、ＤＬ６の割合は約１４％～約２０％または約１０％～約２０％であり、かつ／あるいは、ＤＬ８の割合は約６．０％～約１２．０％または約４％～約１５％である。

【0184】

一実施形態において、組成物はベランタマブマホドチンを含み、ＤＬ２の割合は約１５％～約２７％または約１５％～約３２％であり、ＤＬ４ａの割合は約３５％～約３８％または約３０％～約４０％であり、ＤＬ４ｂの割合は約７％～約９％または約５％～約１０％であり、ＤＬ６の割合は約１４％～約２０％または約１０％～約２０％であり、かつ／あるいは、ＤＬ８の割合は約６．０％～約１２．０％または約４％～約１５％である。

【0185】

「望ましくないＤＡＲ種」という用語は、本明細書で使用する場合、最終組成物中において望ましくなく、最終治療用生成物の特定の特性（例えば、標的結合、有効性、安全性等）に悪影響を及ぼし得る任意のＤＡＲ種を指す。一実施形態において、望ましくないＤＡＲ種はＤＬ０、すなわち、コンジュゲーションプロセス後に細胞毒性剤と結合していない抗体である。一実施形態において、ＡＤＣ組成物中のＤＬ０の割合は、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下または約０．５％以下である。別の実施形態において、ＡＤＣ組成物中のＤＬ０の割合は、約１％～約１０％、約２％～約５％または約２．０％～約４．８％である。

【0186】

翻訳後修飾
本明細書に記載の抗体の「翻訳後修飾産物」は、組成物の全部または一部が「翻訳後修飾」を含む抗体組成物である。翻訳後修飾は、宿主細胞中で抗体の生産、上流および下流製造、および／または貯蔵（例えば、光、温度、ｐＨ、水への曝露の影響、あるいは賦形剤および／または直後の容器閉鎖システムとの反応）の結果であり得る抗体への変化である。したがって、本開示の組成物は、抗体の製造または貯蔵から形成され得る。例示的な翻訳後修飾は、抗体配列の変化（上記のような「抗体バリアント」）、特定のリーダー配列切断、様々なグリコシル化パターンにおける様々な糖部分の付加、非酵素糖化、脱アミド化、酸化、ジスルフィド結合のスクランブル化（disulfide bond scrambling）およびその他のシステインバリアント（例えば、遊離スルフヒドリル、ラセミ化ジスルフィド、チオエーテルおよびトリスルフィド結合）、異性化、Ｃ末端リジン切断、および／またはＮ末端グルタミン環化を含む。

【0187】

一例において、翻訳後修飾産物は、機能および／または活性の低下をもたらす化学変化を含む「産物関連不純物（product-related impurity）」を含む。別の例において、翻訳後修飾産物は、機能および／または活性の低下をもたらさない化学変化を含む「産物関連物質（product-related substance）」を含む。本明細書に記載の抗体の産物関連不純物としては、異性化バリアントおよび酸化バリアントが挙げられる。本明細書に記載の抗体の産物関連物質としては、脱アミド化バリアント、グリコシル化バリアント、Ｃ末端切断バリアントおよびＮ末端ピログルタミン酸バリアントが挙げられる。

【0188】

一実施形態において、組成物は、配列番号９の重鎖配列および配列番号１０の軽鎖配列を含み、１または２以上のその機能的翻訳後修飾を含む。別の実施形態において、組成物は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４の重鎖配列、および配列番号１０の軽鎖を含み、１または２以上のその機能的翻訳後修飾を含む。

【0189】

本明細書で提供されるバリアントの割合は、組成物中の抗体の総量（例えば、抗体の「集団」）に対するパーセンテージとして表される。例えば、４０％以下の酸化バリアントは、組成物中の総量１００％抗体のうち４０％以下が酸化されていることを指す。例えば、２５％以下の異性化バリアントは、組成物中の総量１００％抗体のうち２５％以下が異性化されていることを指す。

【0190】

糖化は、グルコース等の還元糖とタンパク質中の遊離アミン基との間の非酵素的化学反応を含む翻訳後修飾であり、一般にリジン側鎖のイプシロンアミンまたはタンパク質のＮ末端に見られる。糖化は、還元糖の存在下での製造および／または貯蔵中に起こり得る。

【0191】

製造および／または貯蔵中に起こり得る脱アミド化は、酵素反応または化学反応であり得る。脱アミド化は、分子内環化を介した単純な化学反応によって起こり得、鎖内の隣のアミノ酸のアミド窒素がアミドに求核的に攻撃（Ｎ＋１がＮに攻撃）してスクシンイミド中間体を形成する。脱アミド化は、主にアスパラギン（Ｎ）をイソアスパラギン酸（イソアスパルテート）とアスパラギン酸（アスパルテート）（Ｄ）に約３：１比で変換する。したがって、この脱アミド化反応は、アスパルテート（Ｄ）のイソアスパルテートへの異性化に関連すると考えられる。アスパラギンの脱アミド化もアスパルテートの異性化も、中間体であるスクシンイミドが関与している可能性がある。程度ははるかに低いが、脱アミド化はグルタミン残基でも同様に起こり得る。脱アミド化はＣＤＲ、Ｆａｂ（非ＣＤＲ領域）またはＦｃ領域で起こり得る。異性化はアスパルテート（Ｄ）からイソアスパルテートへの変換であり、中間体スクシンイミドが関与する。

【0192】

酸化は、製造および／または貯蔵中に（例えば、酸化条件の存在下で）に起こり得、直接的には反応性酸素種によって、または間接的には酸化ストレスの二次副産物との反応によって誘導されるタンパク質の共有結合的修飾をもたらす。酸化は主にメチオニン残基で起こり得るが、トリプトファン残基および遊離システイン残基でも起こり得る。酸化はＣＤＲ、Ｆａｂ（非ＣＤＲ）領域またはＦｃ領域で起こり得る。

【0193】

ジスルフィド結合のスクランブル化は、製造および／または貯蔵条件中に起こり得る。特定の状況下において、ジスルフィド結合は破断するかまたは不適切に形成され、不対のシステイン残基（－ＳＨ）を生じることがある。これらの遊離（不対）スルフヒドリル（－ＳＨ）は、シャッフリングを促進し得る。

【0194】

チオエーテルの形成およびジスルフィド結合のラセミ化は、製造または貯蔵中の塩基性条件下で起こり得、ジスルフィド架橋のβ脱離によって、デヒドロアラニンおよび過硫化物中間体を介してシステイン残基に戻る。その後のデヒドロアラニンとシステインの架橋によってチオエーテル結合が形成され得、または遊離システイン残基がＤ－システインとＬ－システインの混合物とジスルフィド結合を再形成する。

【0195】

トリスルフィドは、硫黄原子のジスルフィド結合（Ｃｙｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｃｙｓ）への挿入から生じ得、生産細胞培養において硫化水素の存在によって形成され得る。

【0196】

重鎖および／または軽鎖におけるＮ末端グルタミン（Ｑ）およびグルタメート（グルタミン酸）（Ｅ）は、環化によりピログルタメート（ｐＧｌｕ）を形成し得る。ｐＧｌｕ形成は、生産バイオリアクター内で形成される可能性があるが、処理および貯蔵条件のｐＨおよび温度に応じて、例えば非酵素的に形成されることもある。Ｎ末端ＱまたはＥの環化は、天然のヒト抗体で一般的に観察される。

【0197】

Ｃ末端リジンの切断はカルボキシペプチダーゼによって触媒される酵素反応であり、組換え抗体および天然のヒト抗体で一般的に観察される。このプロセスの変形には、組換え宿主細胞からの細胞酵素による一方または両方の重鎖からのリジンの除去が含まれる。ヒト対象／患者に投与すると、残留するＣ末端リジンの除去が起こる可能性がある。

【0198】

本開示は、本明細書に記載の翻訳後修飾のうち１または２以上を施された可能性のある、または受けた可能性のある抗体を包含する。例示的な組成物は、１）本明細書に記載の（１または２以上の）翻訳後修飾を有するおよび有さない、または２）２以上の翻訳後修飾を有する抗体の混合物またはブレンドを含む。

【0199】

組成物は、抗体バリアントと翻訳後修飾バリアントの混合物を含み得る。例えば、抗体組成物は、酸化バリアント、脱アミド化バリアント、異性化バリアント、Ｎ末端ピログルタメートバリアントおよびＣ末端リジン切断バリアントのうち１または２以上、例えば２または３以上を含む。

【0200】

例えば、一実施形態において、組成物は、抗体の混合物であって、混合物中の抗体の１０％が配列番号９および１０のアミノ酸配列を含み、混合物中の抗体の９０％がＣ末端リジン切断を有する配列番号９および１０のアミノ酸配列を含む混合物を含み得る。

【0201】

別の例示的実施形態において、組成物は、抗体の混合物であって、混合物中の抗体の１０％が配列番号９および１０のアミノ酸配列を含み、混合物中９０％の抗体がＣ末端リジン切断を有する配列番号９および１０のアミノ酸配列を含み、その１００％の全抗体混合物のうち、最大１００％のＮ末端グルタミンがピログルタメートへと環化されている混合物を含み得る。

【0202】

別の例示的実施形態において、組成物は、抗体の混合物であって、混合物中の抗体の１０％が配列番号９および１０のアミノ酸配列を含み、混合物中９０％の抗体がＣ末端リジン切断を有する配列番号９および１０のアミノ酸配列を含み、その１００％の全抗体混合物のうち、最大１００％がＮ末端ピログルタメートであり、最大２３％がＣＤＲＨ３のＤ１０３で異性化されている抗体を含み得る。

【0203】

さらに別の例示的実施形態において、組成物は、抗体の混合物であって、混合物中の抗体の２０％が配列番号９および１０のアミノ酸配列を含み、混合物中の抗体の８０％がＣＤＲＨ３にＮ１０３のバリアントを有する配列番号９および１０のアミノ酸配列を含み、その１００％の全抗体混合物のうち、抗体の最大３７％がＣＤＲＨ１のアミノ酸Ｍ３４で酸化されている混合物を含み得る。

【0204】

一実施形態において、本明細書に記載の翻訳後修飾は、抗原結合親和性、生物活性、薬物動態学（ＰＫ）／薬力学（ＰＤ）、凝集、免疫原性、および／または、Ｆｃ受容体との結合に有意な変化をもたらさない。ただし、産物関連不純物として特定および記載される場合を除く。

【0205】

本明細書に記載されるような「機能」または「活性」は、１）ＢＣＭＡとの結合、２）ＦｃγＲＩＩＩａとの結合、および／または３）ＦｃＲｎとの結合のうち１または２以上として定義される。一実施形態において、「機能の低下」または「活性の低下」は、ＢＣＭＡとの結合、ＦｃγＲＩＩＩａとの結合またはＦｃＲｎとの結合が、参照標準と比較したパーセンテージとして低下し、アッセイのばらつきに対して有意であることを意味する。例えば、機能または活性の低下は、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上または５０％以上の低下として記載することができる。

【0206】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号９および配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一の抗体を含み、存在する場合には、抗体のあらゆる翻訳後修飾を含む。

【0207】

別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、ベランタマブを含み、存在する場合にはあらゆる翻訳後修飾を含む。

【0208】

抗体バリアントは、抗体の組成物が等電点（ＩＥＦ）ゲル電気泳動、キャピラリー等電点（ｃＩＥＦ）ゲル電気泳動、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）等の電荷に基づく分離技術により分析される際に一般に観察される。

【0209】

医薬組成物
本明細書に記載の組成物は、医薬組成物の形態であり得る。「医薬組成物」は、本明細書に記載の組成物（例えば、有効成分）と、１または２以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含み得る。賦形剤は、製剤のその他の成分と適合し、医薬製剤化が可能であり、そのレシピエントに有害でなく、および／または有効成分の有効性を妨げないという意味で許容可能でなければならない。

【0210】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、担体、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および／または吸収遅延剤を含み得る。薬学的に許容可能な賦形剤の例としては、緩衝剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうち１または２以上、ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物には等張剤、例えば、ポリオール、糖類、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）または塩化ナトリウム；保存剤；共溶媒；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；キレート剤（ＥＤＴＡ等）；金属錯体（例えば、Ｚｎ^２＋－タンパク質複合体）；生分解性ポリマー；および／または塩形成対イオン（ナトリウムまたはカリウム等）を含むことが好ましい。

【0211】

賦形剤またはその他の材料の厳密な性質は投与経路に依存し、投与経路は、例えば、経口、直腸、鼻腔、局所（頬および舌下を含む）、膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）および腫瘍内であり得る。好ましい賦形剤は、例えば、レシピエントの状態および治療される疾患によって異なり得ることが認識される。

【0212】

賦形剤およびそれぞれの集合物の混合物は、一緒に「医薬製剤」（または「製剤」）を形成する。製剤は、液体形態であってもまたは凍結乾燥形態であってもよい。液体製剤中の組成物は容器に充填し、凍結させることができる。特定の実施形態において、組成物を含む凍結製剤のアリコートは、凍結乾燥させることができる。凍結乾燥物は、水またはその他の水溶液の添加によって再構成されて、組成物を含む再構成製剤を生成し得る。

【0213】

いくつかの実施形態において、抗ＢＭＣＡ抗原結合タンパク質は、製剤中に少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、抗ＢＭＣＡ抗原結合タンパク質は、製剤中に約２０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬ、または約２０ｍｇ／ｍＬ～約６０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。特定の実施形態において、製剤中の抗ＢＣＭＡ抗原結合タンパク質の濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬまたは約１００ｍｇ／ｍＬである。一実施形態において、抗ＢＭＣＡ抗原結合タンパク質は、液体製剤中に約２０ｍｇ／ｍＬまたは約２５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。別の実施形態において、抗ＢＭＣＡ抗原結合タンパク質は、凍結乾燥製剤中に約５０ｍｇ／ｍＬまたは約６０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。さらに別の実施形態において、抗ＢＭＣＡ抗原結合タンパク質は、再構成製剤中に約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。

【0214】

特定の実施形態において、緩衝剤は、クエン酸緩衝液である。クエン酸緩衝液は、例えば、共役酸／共役塩基系（クエン酸ナトリウム／クエン酸）の使用によって、またはクエン酸ナトリウム溶液のＨＣｌ滴定によって達成され得る。特定の実施形態において、クエン酸緩衝液の濃度は約１０ｍＭ～約３０ｍＭである。好ましい実施形態において、クエン酸緩衝液の濃度は２５ｍＭである。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、約５ｍＭ～約３５ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液である。

【0215】

緩衝剤は、好ましいｐＨ範囲を維持するのを補助するために使用することができる。特定の実施形態において、製剤のｐＨは、約５．５～約７または約５．９～約６．５、好ましくはｐＨ６．２である。

【0216】

いくつかの実施形態において、製剤はポリオールを含む。いくつかの実施形態において、ポリオールは糖であり、好ましくは、非還元糖である。いくつかの実施形態において、非還元糖はトレハロースである。いくつかの実施形態において、製剤は、トレハロースを約１２０ｍＭ～約２４０ｍＭ含む。さらに別の実施形態において、製剤は、トレハロースを約２００ｍＭ含む。

【0217】

一実施形態において、製剤はキレート剤を含む。別の実施形態において、キレート剤はＥＤＴＡである。特定の実施形態において、製剤は、ＥＤＴＡを０．０１ｍＭ～約０．１ｍＭの濃度で含む。さらに別の実施形態において、製剤は、ＥＤＴＡを０．０５ｍＭの濃度で含む。

【0218】

いくつかの実施形態において、製剤は界面活性剤を含む。「界面活性剤」は、親水基と疎水基の両方を含有する化学組成のために、固－固、固－液、液－液および液－気界面でそれらの効果を発揮し得る界面活性剤である。界面活性剤は、タンパク質が吸着し凝集する可能性のある空気－水および／または水－固界面において、希釈溶液中のタンパク質濃度を低下し得る。界面活性剤は、タンパク質製剤の疎水性界面に結合し得る。いくつかの非経口的に（parentally）許容可能な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート群またはポリエーテル群を含む。ポリソルベート２０および８０は、本開示の製剤において好適な界面活性安定剤である。いくつかの実施形態において、製剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０を約０．０１％～約０．０５％で含む。さらに別の実施形態において、製剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０を約０．０２％で含む。好ましい実施形態において、製剤は、ポリソルベート８０を約０．０２％で含む。

【0219】

本開示の一態様は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬの抗ＢＣＭＡ ＡＤＣと、約１０ｍＭ～約２５ｍＭの緩衝剤と、約１２０ｍＭ～約２４０ｍＭのポリオールとを含む製剤であって、製剤のｐＨが５．５～６．５である製剤に関する。

【0220】

一実施形態において、製剤は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約６０ｍｇ／ｍＬの抗ＢＣＭＡ ＡＤＣと、約１０ｍＭ～約３０ｍＭのクエン酸緩衝液と、約１２０ｍＭ～約２４０ｍＭのトレハロースと、約０．０１ｍＭ～約０．１ｍＭのＥＤＴＡと、約０．０１％～約０．０５％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０とを含み、製剤のｐＨは約５．９～約６．５である。

【0221】

一実施形態において、組成物は、製剤中にＡＤＣを含み、抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み、細胞毒素はＭＭＡＥまたはＭＭＡＦであり、製剤は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約６０ｍｇ／ｍＬのＡＤＣと、約１０ｍＭ～約３０ｍＭのクエン酸緩衝液と、約１２０ｍＭ～約２４０ｍＭのトレハロースと、約０．０１ｍＭ～約０．１ｍＭのＥＤＴＡと、約０．０１％～約０．０５％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０とを含み、製剤のｐＨは約５．９～約６．５である。

【0222】

一実施形態において、組成物は、製剤中にＡＤＣを含み、抗体は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ、および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを含み、細胞毒素はＭＭＡＦまたはＭＭＡＥであり、製剤は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約６０ｍｇ／ｍＬのＡＤＣと、約１０ｍＭ～約３０ｍＭのクエン酸緩衝液と、約１２０ｍＭ～約２４０ｍＭのトレハロースと、約０．０１ｍＭ～約０．１ｍＭのＥＤＴＡと、約０．０１％～約０．０５％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０とを含み、製剤のｐＨは約５．９～約６．５である。

【0223】

一実施形態において、組成物は、製剤中にＡＤＣを含み、ＡＤＣはベランタマブマホドチンであり、製剤は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約６０ｍｇ／ｍＬのベランタマブマホドチンと、約１０ｍＭ～約３０ｍＭのクエン酸緩衝液と、約１２０ｍＭ～約２４０ｍＭのトレハロースと、約０．０１ｍＭ～約０．１ｍＭのＥＤＴＡと、約０．０１％～約０．０５％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０とを含み、製剤のｐＨは約５．９～約６．５である。

【0224】

一実施形態において、組成物は、製剤中にベランタマブマホドチンを含み、製剤は、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬまたは６０ｍｇ／ｍＬのベランタマブマホドチンと、２５ｍＭのクエン酸緩衝液と、２００ｍＭのトレハロースと、０．０５ｍＭの二ナトリウムＥＤＴＡと、０．０２％のポリソルベートまたは８０ポリソルベート８０とを含み、製剤のｐＨは約５．９～約６．５である。

【0225】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物１ｍＬ当たりに、ベランタマブマホドチン（５０ｍｇ）、クエン酸（０．４２ｍｇ）、エデト酸二ナトリウム二水和物（０．０１９ｍｇ）、ポリソルベート８０（０．２ｍｇ）、トレハロース二水和物（７５．６ｍｇ）およびクエン酸三ナトリウム二水和物（６．７ｍｇ）を含み、ｐＨは約６．２である。

【0226】

「安定な」製剤は、その中のタンパク質が、製造、輸送、貯蔵および投与の間、その物理的および／または化学的安定性を本質的に保持する製剤である。安定性は、選択された期間、選択された温度で測定することができる。例えば、２℃～８℃の推奨温度で貯蔵される製品の場合、製剤は室温、約３０℃または４０℃で少なくとも１か月間安定であり、および／または約２～８℃で少なくとも１年間、好ましくは少なくとも２年間安定である。例えば、貯蔵中の凝集の程度をタンパク質の安定性の指標として使用することができる。したがって、「安定な」製剤は、例えば、タンパク質の約１０％未満、好ましくは約５％未満が製剤中に凝集体として存在するものであってもよい。タンパク質の安定性を測定するための種々の分析技術が当技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７～３０１頁、Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．、１９９１年およびＪｏｎｅｓ、Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、１０巻、２９～９０頁、１９９３年に概説されている。

【0227】

本開示の特定の態様において、製剤は、組成物が凍結、解凍、および／または混合に対して安定性を保持することを可能にする。

【0228】

さらに別の態様において、本開示は、本明細書に記載の製剤中に組成物を保持する容器を含む製品、例えばキットを対象とする。一態様において、製剤を含む注射デバイスが提供される。注射デバイスは、ペンインジェクターデバイスまたはオートインジェクターデバイスを含み得る。一実施形態において、製剤は、充填済みシリンジ中に含まれる。

【0229】

治療方法および使用のための組成物
本開示の組成物は、Ｂ細胞関連障害もしくは疾患（例えば、抗体媒介疾患もしくは形質細胞媒介疾患、または形質細胞悪性腫瘍（例えば、多発性骨髄腫等の癌））、または抗ＢＣＭＡ ＡＤＣにより治療可能なその他の疾患の治療のための治療的アプローチを提供し得る。特に、本開示の１つの目的は、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣを含む組成物であって、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）と特異的に結合し、ＢＣＭＡとそのリガンド（例えば、ＢＡＦＦおよび／またはＡＰＲＩＬ）との相互作用を調整（例えば、阻害または遮断）する組成物を、その相互作用の調整に応答する疾患および障害の治療において提供することである。

【0230】

本開示の別の態様において、Ｂ細胞関連障害もしくは疾患（例えば、抗体媒介疾患もしくは形質細胞媒介疾患、または形質細胞悪性腫瘍（例えば、多発性骨髄腫等の癌）に罹患している対象（例えば、ヒト患者）を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ組成物を対象に投与する工程を含む方法が提供される。

【0231】

さらに別の実施形態において、本開示は、癌患者を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ組成物を患者に投与する工程を含む方法が提供される。

【0232】

本明細書で使用される場合、「癌」および「腫瘍」という用語は互換的に使用され、単数形または複数形のいずれでも、宿主生物を病的な状態にする形質転換、例えば悪性の形質転換を受けた細胞を指す。原発性癌細胞は、十分に確立された技術、特に組織学的検査によって、非癌細胞と容易に区別することができる。本明細書で使用する場合、癌細胞の定義には、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞の原細胞に由来するいずれの細胞も含まれる。これには、転移した癌細胞、ならびに癌細胞由来のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物および細胞株が含まれる。「臨床的に検出可能な」腫瘍とは、通常固形腫瘍として発現するタイプの癌を指す場合、腫瘍塊に基づいて検出可能な腫瘍、例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波または身体検査での触診等の手順によって検出可能な腫瘍、および／または、患者から得られるサンプル中の１または２以上の癌特異的抗原の発現によって検出可能な腫瘍である。腫瘍は、造血系（hematopoietic）（または血液性（hematologic）または血液学的（hematological）または血液関連性（blood-related））癌、例えば、血液細胞または免疫細胞に由来する癌であってもよく、これらは「液性腫瘍」と呼ばれることがある。血液性腫瘍に基づく臨床状態の具体例としては、白血病、例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病および急性リンパ性白血病；形質細胞悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫、ＭＧＵＳおよびワルデンストロームマクログロブリン血症；リンパ腫、例えば、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫等が挙げられる。

【0233】

癌は、異常な数の芽球細胞または望ましくない細胞増殖が存在する癌、またはリンパ性および骨髄性の両方の悪性腫瘍を含む血液学的癌と診断される癌のいずれかである。骨髄性悪性腫瘍には、限定するものではないが、急性骨髄性（myeloid）（または骨髄性（myelocytic）または骨髄性（myelogenous）または骨髄芽球性（myeloblastic））白血病（未分化型または分化型）、急性前骨髄性（promyeloid）（または前骨髄性（promyelocytic）または前骨髄性（promyelogenous）または前骨髄芽球性（promyeloblastic））白血病、急性骨髄単球性（または骨髄単芽球性）白血病、急性単球性（または単芽球性）白血病、赤白血病および巨核球性（または巨核芽球性）白血病が含まれる。これらの白血病は、急性骨髄性（myeloid）（または骨髄性（myelocytic）または骨髄性（myelogenous））白血病（ＡＭＬ）と総称されることがある。骨髄性悪性腫瘍にはまた、限定するものではないが、慢性骨髄性（myelogenous）（または骨髄性（myeloid））白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、本態性血小板血症（または血小板増加症）、および真性赤血球増加症（ＰＣＶ）を含む骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）も含まれる。骨髄性悪性腫瘍にはまた、不応性貧血（ＲＡ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）および移行期の芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢＴ）と呼ばれることがある骨髄異形成（または骨髄異形成症候群またはＭＤＳ）；ならびに原因不明の骨髄化生を伴うまたは伴わない骨髄線維症（ＭＦＳ）も含まれる。

【0234】

造血器癌にはまた、リンパ性悪性腫瘍が含まれ、リンパ節、脾臓、骨髄、末梢血および／または節外部位に影響を及ぼし得る。リンパ性癌には、限定するものではないが、Ｂ細胞悪性腫瘍が含まれ、これにはＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）が含まれる。Ｂ－ＮＨＬは、インドレント（もしくは低悪性度）、中悪性度（もしくはアグレッシブ）または高悪性度（高度アグレッシブ）であり得る。インドレントＢ細胞リンパ腫には、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）；小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）；辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、例えば、結節性ＭＺＬ、節外性ＭＺＬ、脾臓ＭＺＬおよび絨毛リンパ球を伴う脾臓ＭＺＬ；リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）；および粘膜関連リンパ組織型（ＭＡＬＴまたは節外性辺縁帯）リンパ腫が含まれる。中悪性度Ｂ－ＮＨＬには、白血球浸潤を伴うまたは伴わないマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性大細胞（またはグレード３またはグレード３Ｂ）リンパ腫、および原発性縦隔リンパ腫（ＰＭＬ）が含まれる。高悪性度Ｂ－ＮＨＬには、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、バーキット様リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫（ＳＮＣＣＬ）およびリンパ芽球性リンパ腫が含まれる。その他のＢ－ＮＨＬには、免疫芽球性リンパ腫（または免疫細胞種）、原発性滲出液リンパ腫、ＨＩＶ関連（またはＡＩＤＳ関連）リンパ腫、および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）または移植後リンパ腫が含まれる。Ｂ細胞悪性腫瘍にはまた、限定するものではないが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ワルデンストロームマクログロブリン血症（ＷＭ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、大顆粒リンパ球性（ＬＧＬ）白血病、急性リンパ性（またはリンパ球性またはリンパ芽球性）白血病、およびキャッスルマン病も含まれる。ＮＨＬにはまた、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）を含むことができ、これには、限定するものではないが、とりわけ、特定不能Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＯＳ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）、鼻腔ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／Ｔ細胞リンパ腫、γ／δリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、およびセザリー症候群が含まれる。

【0235】

造血器癌にはまた、ホジキンリンパ腫（またはホジキン病）、例えば、古典的ホジキンリンパ腫、結節硬化型ホジキンリンパ腫、混合細胞型ホジキンリンパ腫、リンパ球優位型（ＬＰ）ホジキンリンパ腫、結節性ＬＰホジキンリンパ腫、およびリンパ球減少型ホジキンリンパ腫を含むも含まれる。造血器癌にはまた、形質細胞疾患または形質細胞癌、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）（くすぶり型ＭＭを含む）、意義不明（または未知もしくは不明確な）単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、形質細胞腫（骨、髄外）、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、ワルデンストロームマクログロブリン血症、形質細胞白血病および原発性アミロイドーシス（ＡＬ）も含まれる。造血器癌はまた、さらなる造血系細胞、例えば、多形核白血球（または好中球）、好塩基球、好酸球、樹状細胞、血小板、赤血球およびナチュラルキラー細胞その他の癌も含み得る。本明細書で「造血細胞組織」と呼ぶ造血細胞を含む組織には、骨髄；末梢血；胸腺；および末梢リンパ組織、例えば、脾臓、リンパ節、粘膜に関連するリンパ組織（腸関連リンパ組織等）、扁桃腺、パイエル板および虫垂、ならびにその他の粘膜（例えば気管支の内膜）に関連するリンパ組織が含まれる。

【0236】

一実施形態において、癌は、大腸癌（ＣＲＣ）、胃癌、食道癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、黒色腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、ＥＣ扁平上皮細胞、非小細胞肺癌、中皮腫、膵臓癌および前立腺癌からなる群から選択される。

【0237】

用語「治療する」およびその派生語は、本明細書で使用される場合、治療的療法を含むことを意味する。特定の状態に関して治療するとは、（１）その状態もしくはその状態の生物学的発現の１もしくは２以上を改善すること、（２）（ａ）その状態に至る、もしくは状態の原因となる生物学的カスケードにおける１もしくは２以上のポイント、または（ｂ）その状態の生物学的発現の１もしくは２以上を妨げること、（３）その状態に関連する症状、影響もしくは副作用の１もしくは２以上、またはその状態もしくはその治療に関連する症状、影響もしくは副作用の１もしくは２以上を軽減すること；（４）その状態またはその状態の生物学的発現の１もしくは２以上の進行を遅らせること、および／あるいは（５）寛解の期間にわたって追加の治療を行うことなく、その発現の寛解状態とみなされる期間、状態の生物学的発現の１または２以上を排除するまたは検出不能なレベルまで減少させることにより、状態または状態態の生物学的発現の１または２以上を治癒させることを意味する。当業者であれば、特定の疾患または状態について寛解とみなされる期間を理解する。

【0238】

Ｂ細胞障害は、Ｂ細胞の発生／免疫グロブリン産生の欠損（例えば、免疫不全症）および過剰／制御不能な増殖（例えば、リンパ腫、白血病）に分けることができる。本明細書で使用する場合、Ｂ細胞障害は両方のタイプの疾患を指し、本明細書に記載される組成物を使用してＢ細胞障害を治療する方法が提供される。

【0239】

特定の態様において、疾患または障害は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、孤立性形質細胞腫（骨、髄外）、アミロイドーシス（ＡＬ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、孤立性形質細胞腫（骨、髄外）またはワルデンストロームマクログロブリン血症である。

【0240】

予防的療法もまた企図される。当業者は、「予防」が絶対的な用語ではないことを認識する。医学において「予防」とは、状態もしくはその生物学的発現の可能性または重症度を実質的に低減させるか、またはそのような状態もしくはその生物学的発現の発症を遅延させるための薬物の予防的投与を指すと理解される。予防的療法は、例えば、癌を発症するリスクが高いと考えられる場合、例えば、対象が癌の強い家族歴を有する場合または対象が発癌物質に暴露されてきた場合に適切である。

【0241】

「対象」または「患者」は、本明細書において互換的に使用され、治療を必要とするあらゆる人、例えば癌治療を必要とする人を含むように広く定義される。対象は、哺乳動物が含み得る。一実施形態において、対象はヒト患者である。癌治療を必要とする対象は、様々なステージ、例えば、新規診断、再発、難治性、病勢進行、寛解およびその他の患者を含み得る。癌治療を必要とする対象には、幹細胞移植を受けた患者、または移植不適格とみなされる患者も含まれ得る。

【0242】

本明細書に記載される組成物による治療に選択されるために、対象を事前にスクリーニングすることができる。一実施形態において、対象からのサンプルは、本明細書に記載の組成物による治療の前に、ＢＣＭＡの発現に関して検査される。

【0243】

対象には、本開示の組成物による治療を受ける前に、少なくとも１種の癌療法を受けたことがあってもよい。一実施形態において、対象には、本開示の組成物による治療を受ける前に少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種または少なくとも７種の癌療法を受けたことがある。

【0244】

別の実施形態において、対象は新たに癌と診断され、本開示の組成物による治療を受ける前に療法を受けたことがない。

【0245】

本開示の組成物は、任意の適切な経路によって投与され得る。いくつかの組成物において、好適な経路としては、経口、直腸、鼻腔、局所（頬および舌下を含む）、膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）および腫瘍内が挙げられる。好ましい経路は、例えば、レシピエントの状態および治療される癌によって異なり得ることが認識される。

【0246】

特定の実施形態において、本開示の組成物は医薬組成物として投与される。

【0247】

「投与する」という用語は、本明細書で使用する場合、治療目的を達成するための本明細書に記載される組成物の送達を指すことを意味する。組成物は、臨床的有効性を達成するために十分な投与間隔、期間で投与され得る。組成物は、特定の部位に療法を標的化するように対象に投与され得る。

【0248】

いくつかの実施形態において、組成物は、注射によって投与される。したがって、一態様において、本開示の組成物、医薬組成物または製剤を含む注射デバイスが提供される。注射デバイスは、ペンインジェクターデバイスまたはオートインジェクターデバイスを含み得る。

【0249】

組成物の「治療有効量」または「治療有効用量」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｂ細胞媒介障害または障害の症状の予防または治療または緩和に有効な量を指す。治療有効量および治療レジメンは、一般に経験的に決定され、患者の年齢、体重および健康状態、ならびに治療される疾患または障害等の要因に依存し得る。このような要因は主治医の管理範囲内にある。

【0250】

抗ＢＣＭＡ ＡＤＣを含む組成物の適切な治療有効量は、当業者により容易に決定される。本明細書に記載される組成物の好適な用量は、体重によって患者ごとに計算することができ、例えば、好適な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、または例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇであり得る。

【0251】

一実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣを含む組成物の治療有効用量は、約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約４．６ｍｇ／ｋｇである。さらに別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣを含む組成物の治療有効用量は、少なくとも約０．０３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．４８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９６ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．９２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．４ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも約４．６ｍｇ／ｋｇである。さらに別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＡＤＣを含む組成物の治療有効用量は、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇまたは３．４ｍｇ／ｋｇである。

【0252】

特定の実施形態において、組成物は、対象に１または２以上の追加の治療薬とともに併用投与することができる。別の実施形態において、組成物は、対象に１または２以上の追加の癌治療とともに併用投与することができる。追加の癌治療薬としては、限定するものではないが、その他の免疫調節薬、治療抗体（例えば、ダラツムマブ等の抗ＣＤ３８抗体）、ＣＡＲ－Ｔ治療薬、ＢｉＴＥ、ＨＤＡＣ阻害剤、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、抗炎症性化合物および免疫調節性イミド薬（ＩＭｉＤ）（例えば、サリドマイドおよびその類似体）が挙げられる。

【0253】

「併用投与」とは、同一の医薬組成物または別個の医薬組成物に組み合わせて対象に投与する２または３以上の異なる医薬組成物または治療（例えば、放射線治療）の投与を意味する。したがって、併用投与は、２または３以上の医薬剤を含む単一の医薬組成物の同時投与、または２または３以上の異なる組成物の同一対象への同時もしくは異なる時間での投与を含む。

【0254】

本開示の一態様において、本開示は、それを必要とする対象においてＢ細胞疾患または障害を治療する方法であって、治療有効用量の、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ ＡＤＣを含む組成物を投与する方法を提供する。

【0255】

本開示の一態様において、本開示は、Ｂ細胞疾患または障害の治療に使用するための本明細書に記載される組成物を提供する。本開示の別の態様において、本開示は、癌の治療に使用するための本明細書に記載される組成物を提供する。

【0256】

本開示の一態様において、Ｂ細胞疾患または障害の治療に使用するための薬剤の製造における組成物の使用が提供される。本開示の別の態様において、癌の治療に使用するための薬剤の製造における組成物の使用が提供される。

【0257】

本明細書に開示される総ての特許および参考文献は、参照により明示的かつ完全に本明細書の一部とされる。

【実施例】

【0258】

試薬および器具
ベランタマブは、標準的なｍＡｂ製造手順を使用して作製および精製した。次いで、ベランタマブをＭＭＡＦとコンジュゲートし、ベランタマブマホドチンＡＤＣ原薬を作製した。サンプルは総て、製剤バッファー中、－８０℃で分析まで保存した。

【0259】

マレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンＦ（ｍｃＭＭＡＦ）は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（モンマス ジャンクション、ＮＪ）から購入した。同位体標識された水（Ｈ_２ ^１８Ｏ、９７％）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ヨード酢酸ナトリウム（ＩＡＡ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、塩化カルシウムおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ＭＯ）から購入した。グアニジンＨＣｌは、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（アーバイン、ＣＡ）から購入した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）スピンカラムは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（ハーキュリーズ、ＣＡ）から購入し、トリプシンはＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（レイクウッド、ＮＪ）から購入した。トリス塩基、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム塩、塩酸およびＬＣ－ＭＳ用グレードトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水（Ｈ_２Ｏ）およびアセトニトリル（ＡＣＮ）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ウォルサム、ＭＡ）から購入した。

【0260】

液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計に接続したＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ ３００ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、粒径１．７μｍ）搭載のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで実施した。

【0261】

還元ＬＣ－ＭＳ分析は、Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ質量分析計に接続したＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ（４．６×１５０ｍｍ、粒径１．７μｍ）搭載のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで実施した。

【0262】

実施例１：ＭＭＡＦの安定同位体標識
サンプル調製
ＭＭＡＦ（２０ｍｇ）を１２０μＬのアセトニトリルに溶解して、Ｈ_２ ^１８Ｏ中２．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ ８０μＬと混合して、１％ＴＦＡ ６０：４０／ＡＣＮ：Ｈ_２ ^１８Ｏ中、１００ｍｇ／ｍＬ ＭＭＡＦの最終反応条件とした。この溶液を１４日間、室温で遮光して反応させた。アリコート（１０μＬ）を、分析まで－８０℃で凍結した。

【0263】

標識されたＭＭＡＦの同位体純度は、アリコートを５０：５０／ＡＣＮ：Ｈ_２Ｏで１０００倍希釈（０．１ｍｇ／ｍＬ）して、流量０．２ｍＬ／分にて５分間で０％から１００％Ｂへの直線勾配を使用する逆相液体クロマトグラフィー分離を使用して分析することにより決定した。移動相Ａは水中０．１％ＴＦＡであり、移動相ＢはＡＣＮ中０．０９％ＴＦＡであった。カラムは、各注入の後に１００％Ｂで３分間フラッシュし、０％Ｂで１２分間再平衡化した。カラム温度は３０℃、オートサンプラー温度は５℃、注入量は５μＬとした。

【0264】

ＭＳ分析は、データ依存性取得モード（１ＭＳスキャンの後２ＭＳ／ＭＳスキャン）で作動するポストＵＶ検出（２１５ｎｍ）で実施した。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のスプレー電圧は４．５ｋＶ、シースガス流量は４０Ｌ／分、溶媒脱離補助ガス流量は５Ｌ／分、キャピラリー電圧は６０Ｖ、キャピラリー温度は２５０℃、チューブレンズは１２０Ｖおよびスキャン範囲はｍ／ｚ２５０～２０００であった。データはＴｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアを使用して調べた。

【0265】

結果および考察
ＭＭＡＦの安定同位体標識は、（Ｌｉｕら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０２０年、１２４巻、１１５８１５頁）に記載されている酸媒介溶媒交換メカニズムを使用して実施した。簡単に述べれば、酸性条件下で反応させた際に、２個の１８－酸素原子を、同位体標識された水からオルト酸中間体を介してカルボン酸官能基へ交換することができる。酸濃度［０．１％～１０％（ｖ／ｖ）］、酸の種類（ＴＦＡまたはＦＡ）、反応温度（室温、３７℃、７０℃）および有機相（ＡＣＮまたはＤＭＳＯ）を含むいくつかの標識最適化条件を検討した。反応時間は１時間～６週間とし、予想されたように、酸の濃度および温度が高いほど標識速度は増した。最適化実験は、５０：５０／ＡＣＮ：Ｈ_２ ^１８Ｏ中、０．１ｍｇ／ｍＬ ＭＭＡＦを使用して実施した。５０：５０／ＡＣＮ：Ｈ_２ ^１８Ｏでは薄い有機溶媒層が形成されるため、濃いバッチ（１００ｍｇ／ｍＬ）を６０：４０／ＡＣＮ：Ｈ_２ ^１８Ｏ中で標識した。

【0266】

ＭＭＡＦ加水分解の最小化（図１）は、未占有のＡＤＣコンジュゲーション部位に対して、マレイミド含有フラグメントと標識されたＭＭＡＦとが競合する可能性があるため、標識反応条件を最適化する際の主な要因であった。この制限により標識反応は平衡に進むことができず、最小限の非標識（＋０Ｄａ）ＭＭＡＦが残った時点で停止された。その結果、一重標識（＋２Ｄａ）と二重標識（＋４Ｄａ）のＭＭＡＦの混合物となった。この不一致はＭＳデータ処理中に説明がついた。最終的な標識反応条件（１％ＴＦＡ、室温、１４日間）は、十分な標識（＋０Ｄａ ＭＭＡＦの最小化）と最小限の加水分解（＜５％）に基づいて最終的に選択された。

【0267】

実施例２：ＡＤＣの還元および同位体標識されたＭＭＡＦとのコンジュゲーション
サンプル調製
ベランタマブマホドチン（２５０μｇ、１０ｍｇ／ｍＬ）を１．２５μＬの１Ｍ ＤＴＴで３７℃にて１５分間、製剤バッファー（ｐＨ６．２）中で部分的に還元した。余剰のＤＴＴは、製剤バッファーで平衡化したＳＥＣスピンカラムからサンプルを溶出させることによって除去した。次いで、サンプルを室温で３０分間、１００ｍｇ／ｍＬの同位体標識されたＭＭＡＦ １μＬとコンジュゲートさせた。余剰のＭＭＡＦは、製剤バッファーで平衡化したＳＥＣスピンカラムからサンプルを溶出させることによって除去した。

【0268】

コンジュゲーション効率は、サンプルを水で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、流量０．２ｍＬ／分で、６５：３５／ＡＣＮ：Ｈ_２Ｏ移動相中、０．１％ＴＦＡを使用する無勾配サイズ排除液体クロマトグラフィー分離を使用して分析することによって決定した。カラム温度は２５℃、オートサンプラー温度は５℃、注入量は１μＬとした。

【0269】

ＭＳ分析は高感度モードのポストＵＶ検出（２１５ｎｍ）で実施した。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のスプレー電圧は２．２ｋＶ、サンプリングコーンは１２０、イオン源温度は１５０℃、オフセット電圧は８０Ｖ、脱溶媒温度は５００℃、コーンガス流量は６０Ｌ／時および脱溶媒ガス流量は８００Ｌ／時であった。スキャン範囲はｍ／ｚ７００～５０００、スキャン時間は１秒とした。データは、Ｗａｔｅｒｓ ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアを使用して調べた。

【0270】

結果および考察
還元／コンジュゲーションスキーム：簡単に述べれば、ベランタマブはＴＣＥＰで部分的に還元された後に、ＭＭＡＦとコンジュゲートされた。ＴＣＥＰは、それぞれＭＭＡＦとＤＴＴのマレイミド基とチオール基の間で競合する副反応を避けるために、一般にＤＴＴに優先して使用される。最初の還元／コンジュゲーション実験では、ＴＣＥＰはＤＴＴに比べてより高いコンジュゲーション効率を可能にすることが確認されたが、その後のレガシー法（legacy method）を使用したペプチドマッピング解析では、残りのジスルフィド結合を総て完全に還元するためにはＤＴＴを使用することが求められた。両方の還元工程にＤＴＴを選択し、その後のＭＭＡＦコンジュゲーション前に、余剰のＤＴＴをＳＥＣスピンカラムで除去したところ、加水分解フラグメントのコンジュゲーションが最小限になり、完全にコンジュゲートされた軽鎖と重鎖が得られた（図２）。

【0271】

実施例３：ベランタマブマホドチンの安定同位体標識ペプチドマッピングＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
サンプル調製
ベランタマブマホドチン（２５０μｇ、１０ｍｇ／ｍＬ）を還元し、実施例２に記載されるように同位体標識されたＭＭＡＦとコンジュゲートした。次いで、サンプルを、標準的なペプチドマッピング手順を使用して、乾固付近（約５μＬ）まで蒸発させること、および６０μＬの変性バッファー（６ＭグアニジンＨＣｌ、１．２ＭトリスＨＣｌ、２．５ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を添加して室温にて２分間ボルテックスで撹拌することにより変性させることによって調製した。サンプルは、３μＬの１Ｍ ＤＴＴを加えて室温で２０分間インキュベートすることによって還元し、次いで、７．２μＬの１Ｍ ＩＡＡを加えて室温で３０分間インキュベートすることによってアルキル化した。アルキル化は、４．２μＬの１Ｍ ＤＴＴを加えることによってクエンチした。次いで、サンプルを、ＳＥＣスピンカラムを使用して、消化バッファー（５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５）とのバッファー交換を行い、２．５μＬの５ｍｇ／ｍＬトリプシン（１：２０／酵素：タンパク質）を加えて３７℃で３０分間インキュベートすることによって消化した。消化は、３μＬの１Ｎ ＨＣｌを加えることによってクエンチし、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために１０μＬを注入した。

【0272】

サンプルは、９０分で０％から４０％のＢ、続いて１０分で４０％から６０％のＢの２段階の勾配としたことを除き、実施例２の記載と同一のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ条件を使用して分析した。カラムは１００％Ｂで１２分間フラッシュし、各注入後０％Ｂで１８分間再平衡化した。配列カバー率とＰＴＭデータはＰｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｂｙｏｓソフトウェア（クパチーノ、ＣＡ）を使用して解析した。同位体コンジュゲーションデータはＳｋｙｌｉｎｅソフトウェア（ワシントン大学）を使用して解析した。

【0273】

結果および考察
システインコンジュゲートされたＡＤＣは一般に、鎖間ジスルフィド結合に関与するシステイン残基でコンジュゲートされる。これらのジスルフィド結合の還元は、８個の潜在的コンジュゲーション部位（各軽鎖に１個、各重鎖Ｆａｂ領域に１個、および各重鎖ヒンジ領域に２個）を生じる。各ジスルフィド結合が還元されると、２個の遊離スルフヒドリル基が生じるため、偶数の薬物負荷種が一般に見られる。このプロセスにより、ＤＬ０からＤＬ８までの薬物負荷種が、位置異性体の可能性とともに生じる（図３）。

【0274】

ＳＩＬペプチドマッピングでは、天然型ペプチドと標識されたペプチドの両方のコンジュゲートペプチドを含む液体クロマトグラフィーのピークが得られ、一方、標準ペプチドマッピングでは天然型ペプチドとコンジュゲートペプチドについて別々のピークが得られた（図４）。ＳＩＬサンプルのコンジュゲートペプチドのピークデータは、目的の個々の同位体のピーク面積を得るために、Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェアを使用して、抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を積分することにより処理された。

【0275】

ＳＩＬは、天然型ペプチドとＳＩＬペプチドの同位体エンベロープを完全に分離するほど十分に大きな質量変化を誘発しなかった。この結果、天然型またはＳＩＬコンジュゲートペプチドに対応する同重体同位体の重なりにより、同位体異性体（アイソトポマー）の混合物が生じた。したがって、標識されていないＡＤＣサンプルから計算した理論的同位体比を使用して、軽鎖および重鎖ＦａｂペプチドのＭ＋２～Ｍ＋４アイソトポマーの天然同位体寄与を計算した（図５および図６）。この計算ではまた、単一標識された（＋２Ｄａ）ＭＭＡＦとコンジュゲートした部位も補正した。次いで、合計した天然アイソトポマーピーク面積を全アイソトポマーピーク面積で割って、ペプチドコンジュゲーションレベルを決定した。

【0276】

ヒンジペプチドの二重コンジュゲート型（ＤＬ２、Ｃ２３０およびＣ２３３）ならびに天然型（ＤＬ０）の理論的同位体比を、それぞれ標識されていないＡＤＣサンプルおよびＳＩＬ ｍＡｂ中間体サンプルから計算した（図７）。ｍＡｂサンプルのＤＬ０同位体比は、利用可能な２個のヒンジコンジュゲーション部位のＳＩＬ ＭＭＡＦの総ての組合せで標識されたＤＬ０ペプチドからの同位体寄与を考慮した。これらのＤＬ２およびＤＬ０の理論的同位体比を使用して、各ペプチド形態の同位体寄与を計算した。はじめに、ＭとＭ＋１のアイソトポマーピーク面積は、ＤＬ２ペプチドと完全に関連すると仮定した。次いで、Ｍ＋１ピーク面積に各アイソトポマーのＤＬ２相対理論的同位体比を掛けて、Ｍ＋２～Ｍ＋１４アイソトポマーへのＤＬ２の寄与を求めた。次いで、Ｍ＋１５とＭ＋１６アイソトポマーはＤＬ０ペプチドと完全に関連すると仮定した。次いで、Ｍ＋１５のピーク面積に各アイソトポマーのＤＬ０相対理論的同位体比を掛けて、Ｍ＋２～Ｍ＋１４アイソトポマーへのＤＬ０の寄与を求めた。最後に、ＤＬ２アイソトポマーとＤＬ０アイソトポマーの両方のピーク面積を各アイソトポマーピーク面積の合計から差し引き、単一コンジュゲート（ＤＬ１、Ｃ２３０またはＣ２３３）ヒンジペプチドの寄与を求めた。次いで、各形態のアイソトポマーピーク面積の合計を、総アイソトポマーピーク面積で割って、各ヒンジのコンジュゲーションペプチド形態のレベルを求めた。興味深いことに、このデータ処理方法をＪｅｎｎｉｎｇｓとＭａｔｔｈｅｗｓ（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ Ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、７７巻、６４３５～６４４４頁）が記載しているより厳密なアルゴリズムと比較したところ、両方法は同様の結果であった。

【0277】

ＳＩＬペプチドマッピングと標準ペプチドマッピングの比較
ベランタマブ（ｍＡｂ）とベランタマブマホドチン（ＡＤＣ）の直線的組合せで構成されるサンプルを試験して、ＤＡＲが０．０～５．７の範囲のサンプルを作製することにより、方法の直線性を調べた（表１および表２）。標準ペプチドマッピングでは、軽鎖および重鎖Ｆａｂコンジュゲーションレベルを定量する際に感度と直線性が低下し、天然型ペプチドとコンジュゲートペプチド間の相対定量を使用することが実用的でないことが示された。一方、ＳＩＬペプチドマッピングでは、総てのサンプルにおいて、両方の部位で優れた直線性（Ｒ^２≧０．９９６）を示した（図８）。両方法とも一重および二重コンジュゲートされたヒンジ部位について直線的結果が得られたが、ＳＩＬペプチドマッピングでは、一重コンジュゲートされたヒンジと二重コンジュゲートされたヒンジの量により大きな相違が見られた。一重コンジュゲートされたヒンジは、直交法によりベランタマブマホドチンのどの薬剤負荷種でも、主要なアイソフォームとして検出されなかった。この結果は、実験４で述べた薬剤負荷画分のＳＩＬペプチドマッピング解析とよく相関していた。さらに、ＳＩＬペプチドマッピングから計算されたＤＡＲ値は、標準ペプチドマッピングと比較してより優れた直線性（Ｒ^２＝０．９９８）を示し、ＨＩＣによって決定された理論的ＤＡＲの５％以内で相関した（図９）。

【0278】

ベランタマブマホドチン参照標準（ＤＡＲ＝４．０）のコンジュゲーションレベルを定量し、両方法を使用して比較した（表３）。ＳＩＬペプチドマッピング調製物（ｎ＝４）を標準ペプチドマッピング調製物（ｎ＝４）と並行して分析し、再現性を評価した。ＳＩＬペプチドマッピングでは、標準ペプチドマッピング（約９０％～９５％）と比較して、より低レベルの軽鎖および重鎖Ｆａｂコンジュゲーション（約７０％）が検出された。標準ペプチドマッピング（二重コンジュゲートおよび一重コンジュゲートでそれぞれ約１５％および約１２％）と比較して、より高レベルの二重コンジュゲートされたヒンジ（約２５％）とより低レベルの一重コンジュゲートされたヒンジ（約５％～１０％）が検出された。ＳＩＬペプチドマッピングから計算されたＤＡＲ値（３．９～４．０）も、理論的ＤＡＲ４．０と比較した場合、標準ペプチドマッピングから計算された値（４．６）よりも正確であった。ベランタマブマホドチンの典型的なＰＴＭも定量化されたが、ＳＩＬサンプルと標準サンプルの間に大きな差異は検出されなかった（表４）。総てのサンプルについて、完全な配列カバーも検出された。

【0279】

【表1】

【0280】

【表2】

【0281】

【表3】

【0282】

【表4】

【0283】

実施例４：疎水性相互作用クロマトグラフィー薬物負荷画分の分析
サンプル調製
ＤＡＲが異なるサンプル（ＤＡＲ＝２．１～５．７）および個々の薬物負荷サンプル（ＤＬ２、ＤＬ４ａ、ＤＬ４ｂおよびＤＬ６）を、実験３で記載したようにＳＩＬペプチドマッピングで分析した。

【0284】

結果および考察
２．１～５．７のＤＡＲを有するベランタマブマホドチンサンプルを、薬物有効性に対するＤＡＲの影響を評価するために前臨床試験の一部として製造した。これらのサンプルのＤＡＲは、ＨＩＣクロマトグラムで種々の薬物負荷種のピーク面積を積分することにより計算した。ＳＩＬペプチドマッピング結果（表５および図１０）は、ＤＡＲの増加サンプルで、４１．８％～８５．８％の軽鎖および重鎖Ｆａｂコンジュゲーションを示した。この結果は、軽鎖と重鎖のＦａｂ部位がジスルフィド結合で対になっているため予想されたものである。二重コンジュゲートされたヒンジは７．２％～５７．４％を示したが、単一コンジュゲートされたヒンジは５．１％～１５．８％というはるかに低くなり、より高いＤＡＲでは二重コンジュゲートされたヒンジが優勢であることが強調された。興味深いことに、単一コンジュゲートされたヒンジは４．０および４．６ＤＡＲサンプルで最大となり、より高いＤＡＲサンプルでは単一コンジュゲートされたヒンジが減少する変曲点を示した。ＨＩＣとＳＩＬペプチドマッピングから計算されたＤＡＲ値は１０％以内の相関があり、「ボトムアップ」のＤＡＲ特性評価のためのＳＩＬペプチドマッピングの実用性を示すとともに、部位特異的コンジュゲーションレベルも提供することが示された（図１１参照）。

【0285】

個々の薬物負荷ベランタマブマホドチンサンプル（ＤＬ２、ＤＬ４ａ、ＤＬ４ｂおよびＤＬ６）を、スケールアップした疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法で画分により回収した（図１２）。ＤＬ２、ＤＬ４およびＤＬ６の主要な位置異性体を直交分析法で確認し、理論的コンジュゲーション部位占有値を計算するために使用した。ＤＬ４ｂサンプルの理論値は、このサンプルがＤＬ４ａアイソフォームとＤＬ４ｂアイソフォームの混合物であり、ＨＩＣピークが重なるために計算しなかった。ＳＩＬペプチドマッピングからは、理論値とよく相関した値が得られた（表６）。ＳＩＬペプチドマッピングでは、アイソフォームＤＬ４ｂおよびＤＬ６の主なヒンジのコンジュゲーション形態が二重コンジュゲートであることも確認され、少量の単一コンジュゲートされたヒンジが検出された。

【0286】

【表5】

【0287】

【表6】

【0288】

実施例５：薬物負荷バリアントの非還元型キャピラリーゲル電気泳動（ＮＲ－ＣＧＥ）分析
サンプル調製
ＨＩＣ分取精製法を最適化し、Ｔｏｓｏｈ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｓカラム（３５μｍ、８ｍｍ×１０ｃｍ）（Ｐａｒｔ Ｎｏ．４５１２６）を使用するＡＫＴＡシステムにて、２５℃、流量３．５ｍＬ／分、注入量６０ｍｇおよび２８０ｎｍでのＵＶ吸光度検出の条件を使用して実施した。この方法では、１．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０で構成される初期移動相と２０％２－プロパノールおよび５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０で構成される溶出移動相の勾配流を使用する。ピーク頂点で４．５ｍＬの画分を採取した。各ＤＬバリアント（ＤＬ０、ＤＬ２、ＤＬ４ａ、ＤＬ４ｂ、ＤＬ６およびＤＬ８）の画分を複数回の注入から回収し、プールし、製剤バッファーとバッファー交換した。

【0289】

結果
精製したＤＬバリアントＤＬ０、ＤＬ２、ＤＬ４ａ、ＤＬ４ｂ、ＤＬ６およびＤＬ８を、純度分析ために放出および安定性のＨＩＣ法（release and stability HIC method）を使用して試験した。これらのＤＬバリアントのＨＩＣクロマトグラフィーから得られた結果を表７にまとめる。ＤＬ０、ＤＬ２、ＤＬ４ａおよびＤＬ６の純度は９０％を超えた。ＤＬ４ｂおよびＤＬ８はそれぞれ純度６９．３％および８１．９％であった。

【0290】

【表7】

【0291】

精製されたＤＬバリアントのＮＲ－ＣＧＥ分析は、放出および安定性のキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）法を使用して行った。変性サンプルの調製手順は重鎖と軽鎖の解離をもたらし、これらはもはやジスルフィド結合で結合されておらず、生じた分離によって薬物コンジュゲーションの特徴的なフィンガープリントが提供される。ベランタマブマホドチンの可能性のあるアイソフォームが図３に模式的に示され、各ＤＬバリアントの理論的ＮＲ－ＣＧＥフィンガープリントを表８に示す。

【0292】

【表8】

【0293】

精製されたＤＬバリアントのＮＲ－ＣＧＥ分析の結果を表９にまとめる。精製されたＤＬ０は、ＨＩＣで純度９４．６％（表７）およびＮＲ－ＣＧＥで９２．９％ＩｇＧであり、ＨＩＣのＤＬ０ピークはおそらくコンジュゲートされていないＩｇＧであることを示す。精製されたＤＬ０のＮＲ－ＣＧＥプロファイルの追加のピークには、軽鎖（ＬＣ）種およびＨＣ－ＨＣ－ＬＣ（ＨＨＬＣ）種が含まれ、これらはおそらく画分中に存在する４．５％のＤＬ２に由来する。

【0294】

精製されたＤＬ２は、ＮＲ－ＣＧＥ分析で、主としてＬＣおよびＨＨＬＣ種を含み、これはＤＬ２ａと一致し、主要なＤＬ２バリアントがＤＬ２ａであることを示す。一部のＤＬ２ｂはＤＬ２ピーク下に共溶出し、精製されたＤＬ２に４．４％のＩｇＧが検出されたことにより示唆された。

【0295】

精製されたＤＬ４ａは、ＮＲ－ＣＧＥ分析で、主としてＬＣおよびＨＣ－ＨＣ（ＨＨＣ）種を含み、これはＤＬ４ａがベランタマブマホドチンにおける主要なＤＬ４バリアントであることを示す。ＨＩＣにおけるＤＬ４ａのピークは、ＬＣとＨＣの間に鎖間ジスルフィド結合を含む４個のシステイン残基コンジュゲートされたＤＬバリアントである。ＨＨＬＣフラグメントはおよそ６％に見られ、おそらくＤＬ２ａまたはＤＬ４ｃのいずれかに由来するものである。しかしながら、示されているように、ＨＩＣによればＤＬ４ａの純度は９７．１％であることから、ＤＬ４ａピーク下にはおそらく何らかの種の共溶出があり、これが高いＨＨＬＣ含量の主要因である。

【0296】

精製されたＤＬ４ｂは、ＮＲ－ＣＧＥ分析で、主としてＬＣ、ＨＨＣおよびＨＣ－ＬＣ（ＨＬＣ）種を含む。ＨＩＣの結果は、画分の２８．６％がＤＬ４ａであることを示唆し、これが観測されたＬＣおよびＨＨＣフラグメントである。ＨＬＣフラグメントは、ＤＬ４ｂの結果であり、ベランタマブマホドチンのＨＩＣ分析においてＤＬ４ｂピーク下に溶出する種が、ヒンジ領域内に２個の鎖間ジスルフィド結合を含む４個のシステイン基に大部分がコンジュゲートされていることを示す。精製されたＤＬ４ｂはまた、少量のＨＨＬＣおよびＨＣフラグメントも含み、これはおそらくＤＬ４ｃまたはＤＬ６ａの共精製によるものである。

【0297】

精製されたＤＬ６は、ＮＲ－ＣＧＥ分析で、ＬＣ、ＨＣおよびＨＬＣ種の混合物を含む。これはＤＬ６ａと一致し、ベランタマブマホドチンにおける主要なＤＬ６バリアントは、ヒンジ領域内の２個の鎖間ジスルフィド結合およびＬＣとＨＣ鎖間のジスルフィド結合に由来する２個のシステイン残基を含む４個のシステイン残基でコンジュゲートされていることを示す。ＨＨＣ種は３．２％存在し、おそらくＤＬ４ａの共精製由来である。

【0298】

精製されたＤＬ８は、主としてＬＣおよびＨＣ種を含み、これはベランタマブマホドチンの４個の鎖間ジスルフィド結合を含む８個のシステイン残基におけるコンジュゲーションと一致する。おそらくＤＬ４ｂまたはＤＬ６ａの共精製に由来するＨＬＣフラグメントはおよそ１１％存在し、ＨＩＣ分析で報告されたピークと一致する（表７）。

【0299】

精製されたＤＬ０、ＤＬ２、ＤＬ４ａ、ＤＬ４ｂ、ＤＬ６およびＤＬ８の代表的ＮＲ－ＣＧＥエレクトロフェログラムを図１３に示す。

【0300】

【表9】

【0301】

実施例６：インタクトおよび還元ＬＣ－ＭＳの結果
実施例５に記載されるように調製された、精製されたＤＬバリアントを、インタクトおよび還元ＬＣ－ＭＳを使用して分析した。精製されたＤＬバリアントの総薬物負荷は、インタクトＬＣ－ＭＳ分析を使用して決定した。重鎖および軽鎖の総薬物負荷は、還元ＬＣ－ＭＳを使用して決定した。結果を表１０に示し、スペクトルを図１４および図１５に示す。

【0302】

精製されたＤＬバリアントのインタクトＬＣ－ＭＳ分析の結果は、分析的ＨＩＣ分析の純度の結果（表７）と一致し、両分析で、同様の種がほぼ同一の存在量で確認された。これに対する例外は、精製されたＤＬ４ｂ画分においてＤＬ３バリアントはＨＩＣによって検出されるが、インタクトＬＣ－ＭＳ分析では、この画分において３個の薬物分子の薬物負荷に相当する質量を有する種は検出されなかった。このことは、精製されたＤＬ４ｂ画分におけるＤＬ３のピークは、実際には、３個の薬物分子の薬物負荷を有する種ではなく、別のＤＬ４バリアントであることを示唆している。

【0303】

精製されたＤＬバリアントの還元ＬＣ－ＭＳ分析の結果は、ＮＲ－ＣＧＥ結果によって予測されるコンジュゲーションパターンと一致していた。精製されたＤＬ２は、ＤＬ２ａと一致する還元ＬＣ－ＭＳプロファイルであり、ＬＣおよびＨＣとも、５０％ＤＬ０および５０％ＤＬ１を有し、ＬＣとＨＣの間に鎖間ジスルフィド結合を含む２個のシステイン残基でのコンジュゲーションを示している。

【0304】

精製されたＤＬ４ａの還元ＬＣ－ＭＳ分析は、それぞれＬＣおよびＨＣで９３．６％および９６．９％のＤＬ１を示し、これはいずれもＬＣとＨＣの間に鎖間ジスルフィド結合を含む４個のシステイン残基でのコンジュゲーションと一致している。これは精製されたＤＬ４ａのほとんど全部がＤＬ４ａバリアントであることを示している。ＤＬ２ａおよびＤＬ４ｂもまたＨＩＣ結果で低レベルで観察され、還元ＬＣ－ＭＳ分析で観察された低レベルのＬＣ ＤＬ０およびＨＣ ＤＬ２に寄与している。

【0305】

純粋なＤＬ４ｂバリアントの還元ＬＣ－ＭＳは、１００％ＬＣ ＤＬ０および１００％ＨＣ ＤＬ２からなると予想された。ＬＣ ＤＬ０は５０．８％で存在し、ＨＣ ＤＬ２は５４．７％で存在し、サンプルのおよそ５０％がＤＬ４ｂを含むことが示された。５０％のＬＣがＤＬ１であり、５０％のＨＣがＤＬ１であることから、その集団中にＤＬ４ａが存在する可能性が示され、これはＨＩＣによって３０％のＤＬ４ａが検出されたことと一致した。その他のＤＬ４バリアントも、還元ＬＣ－ＭＳ分析で検出されたＬＣ ＤＬ１ピークおよびＨＣ ＤＬ１ピークに寄与している可能性がある。

【0306】

精製されたＤＬ６の還元ＬＣ－ＭＳ分析は、精製されたＤＬ６画分がＤＬ６ａバリアントであることを示した。純粋なＤＬ６ａバリアントは、ＬＣにおける５０：５０／ＤＬ０：ＤＬ１およびＨＣにおける５０：５０／ＤＬ２：ＤＬ３からなると予想された。純粋なＤＬ６ａ画分から予想されるものよりもＬＣ ＤＬ１およびＨＣ ＤＬ２がやや多かったが、これはいくらかのＤＬ６ｂバリアントが存在する可能性があることを示した。これらの結果は、ベランタマブマホドチンの主要なＤＬ６バリアントが、ヒンジ内に鎖間ジスルフィド結合を含む４個のシステイン残基およびＬＣとＨＣの間に鎖間ジスルフィド結合を含む２個のシステイン残基でコンジュゲートされていることを示した。

【0307】

精製されたＤＬ８の還元ＬＣ－ＭＳ分析は、１００％ＬＣ ＤＬ１および１００％ＨＣ ＤＬ３からなると予想された。これらの結果は、８０％を超えるＬＣがＤＬ１であり、８０％を超えるＨＣがＤＬ３であることを示した。これらの結果は、ＨＩＣ純度に基づく予想存在量がおよそ８０％であることと一致した（表７）。ＬＣ ＤＬ１およびＨＣ ＤＬ２はそれぞれ１７％および１４％で検出され、これらはおそらく、ＨＩＣの結果から、ＤＬ６およびＤＬ４ｂがＤＬ８バリアントとともに共精製された結果である可能性がある。

【0308】

【表10】

【0309】

実施例７：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるペプチドマッピング
実施例５に記載されているように調製した、精製されたＤＬバリアントのコンジュゲーション部位および翻訳後修飾を、ペプチドマッピングＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して評価した。

【0310】

ＳＰＲによる抗原、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃＲＮの結合
精製されたＤＬバリアントの抗原、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃＲｎ特異的結合活性を、ＳＰＲを使用して測定した。抗原、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃＲＮ分析は、放出および安定性の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を使用して行った。測定された特異的結合活性は、精製されたＤＬバリアントでは８０～１１０％の間であった。３つのＳＰＲ活性アッセイは、コンジュゲートされた薬物分子の数が増えると特異的活性が低下することを示した（表１１）。この傾向が観察されたにもかかわらず、薬物負荷の関数としての結合活性の低下は最小であり、規格の許容基準内に留まっていた。ＤＡＲが増加しても、ＳＰＲによる抗原ＦｃγＲＩＩＩａ結合および抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性に有意な変化はないことが確認された。

【0311】

【表11】

【0312】

細胞増殖阻害による効力およびＡＤＣＣリポーターバイオアッセイ
精製されたＤＬバリアントの生物活性を、放出および安定性の細胞増殖阻害バイオアッセイおよびＡＤＣＣリポーターバイオアッセイを使用してモニタリングした。結果を表１２に示す。細胞増殖阻害バイオアッセイにおける精製されたＤＬバリアントの相対効力は、薬物負荷の増加と相関した。細胞増殖阻害バイオアッセイにおける精製されたＤＬ０バリアントの相対効力は、コンジュゲートされていない分子に関して予想されるように０．０であった。

【0313】

ＡＤＣＣリポーターバイオアッセイにおける精製されたＤＬバリアントの相対効力は類似していた。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃＲｎの結合で観察されたものと同様に、相対効力の増加と薬物負荷の低下の間にはおそらく相関があった（表１１）。ヒンジ領域付近での薬物のコンジュゲーションは、Ｆｃにおけるタンパク質－タンパク質相互作用に影響を及ぼす若干のコンフォメーション変化を起こし得るため、これは予想できないことではなかった。

【0314】

【表12】

【0315】

キャピラリー示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）
キャピラリーＤＳＣ法を使用して、薬物コンジュゲーション後のベランタマブマホドチンの三次構造および熱安定性の変化を測定した（図１６）。ベランタマブの典型的なサーモグラムでは、第１ピークはＣＨ２ドメインの展開（unfolding）に相当し、第２ピークはＣＨ３ドメインおよびＦａｂの展開に相当する。ｍＡｂのＣＨ３およびＦａｂの融解転移はしばしば重複し、一般に、ＣＨ２ドメインに比べて同一であるか高い温度で生じる。融解温度は一般にタンパク質の安定性と相関し、安定性の増大は、タンパク質を展開するのに必要なエネルギー量が増えるため、通常、融解温度の上昇に表れる。

【0316】

表１３および図１６は、精製されたＤＬバリアントの転移温度およびＤＳＣサーモグラムをそれぞれ示す。精製されたＤＬ０のＤＳＣサーモグラムと転移温度は、ベランタマブに類似している。ベランタマブに比べてＴｍ_２に若干の増加が見られたが、これはおそらく製剤バッファーの違いによるものである。

【0317】

精製されたＤＬ２のＤＳＣ分析は、８４．２℃から７８．２℃へのＦａｂの見掛けの転移温度の低下を示した。これはおそらく、ＬＣとＨＣの間に鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基であるＬＣ Ｃ２１４およびＨＣ Ｃ２２４における薬物コンジュゲーションの結果である。このデータは、ＮＲ－ＣＧＥおよび還元ＬＣ－ＭＳ結果と一致した。

【0318】

精製されたＤＬ４ａのＤＳＣ分析は、精製されたＤＬ２で観察されたものに類似し、Ｆａｂの見掛けの転移温度の低下を示した。しかしながら、精製されたＤＬ２と比較すると、精製されたＤＬ４ａバリアントは７８．０℃にはるかに大きいピーク面積を持つ。これは、ＬＣとＨＣの間に鎖間ジスルフィド結合を含む両方のシステインがコンジュゲートされていることを示すデータと相関した。ＣＨ２ドメインの見掛けの転移温度に若干の低下が観察されたが、これはＤＬ４ａと共精製された別のＤＬ４バリアントに由来するものである可能性がある。

【0319】

精製されたＤＬ４ｂのＤＳＣ分析は、精製されたＤＬ２の結果と一部類似しており、Ｆａｂドメインの見掛けの転移温度が低下していた。しかしながら、ＤＬ２とは異なり、ＣＨ２ドメインの見掛けの転移温度も低下していた。このことは、精製されたＤＬ４ｂがヒンジとＦａｂ鎖間ジスルフィドの両方でシステインにコンジュゲーションを有する種を含むことを示唆している。

【0320】

精製されたＤＬ６のＤＳＣ分析は、ＣＨ２ドメインおよび一部のＦａｂの見掛けの転移温度に低下を示した。シフトしたＦａｂの割合は、精製されたＤＬ２で観察されたものと類似していた。このデータは、ＬＣとＨＣの間に鎖間ジスルフィド結合を形成する２個のシステイン残基、およびヒンジ鎖間ジスルフィド結合における４個のシステイン残基の薬物コンジュゲーションと一致していた。

【0321】

精製されたＤＬ８のＤＳＣ分析は、精製されたＤＬ６で観察されたものと類似する、ＣＨ２ドメインの融解温度の低下を示した。さらに、精製されたＤＬ４ａで観察されたものと類似する、Ｆａｂの見掛けの転移温度の低下があった。これらの結果は、４個の鎖間ジスルフィド結合における８個のシステイン残基のコンジュゲーションと一致していた。

【0322】

システイン残基の部分的な還元とコンジュゲーションによって鎖間ジスルフィド結合が破壊されると、熱的展開の転移温度が低くなると予想される。精された製ＤＬバリアントについて得られたキャピラリーＤＳＣのデータは、この仮説と一致していた。

【0323】

【表13】

【0324】

実施例５～７からの結論
精製されたＤＬバリアントに、ベランタマブマホドチン上のコンジュゲーション部位を含め、その純度、効力および同一性を決定するための特性評価を行った。その結果、ＤＬ分布は、鎖間ジスルフィド結合の部分的還元後に偶数個の薬物（ｍｃＭＭＡＦ）とコンジュゲートしたＤＬバリアントの不均一な混合物であることが示された。ベランタマブマホドチンの主な薬物負荷バリアントはＤＬ４ａ種であり、ＬＣとＨＣ間の鎖間ジスルフィド結合を含む、各ＬＣ Ｃ２１４と各ＨＣ Ｃ２２４にコンジュゲートした４個のＭＭＡＦ分子を含んだ。ＤＬ０バリアントはコンジュゲートされていないベランタマブであることが確認された。ＤＬバリアントの相対効力は、細胞増殖阻害アッセイで薬剤負荷の増加に関連して増加したが、ベランタマブマホドチンは、全体的な相対効力に寄与するこれらのＤＬバリアントの分布で構成されていた。ＤＬの分布は薬物抗体比（ＤＡＲ）によって制御された。ＨＩＣ法は現在、ベランタマブマホドチンの放出時および安定時の薬物負荷バリアントをモニタリングするために、原薬と製剤の両方で実施されている。

【0325】

配列表
配列番号１：ＣＤＲＨ１
ＮＹＷＭＨ

【0326】

配列番号２：ＣＤＲＨ２
ＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧ

【0327】

配列番号３：ＣＤＲＨ３
ＧＡＩＹＤＧＹＤＶＬＤＮ

【0328】

配列番号４：ＣＤＲＬ１
ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ

【0329】

配列番号５：ＣＤＲＬ２
ＹＴＳＮＬＨＳ

【0330】

配列番号６：ＣＤＲＬ３
ＱＱＹＲＫＬＰＷＴ

【0331】

配列番号７：重鎖可変領域（ＣＤＲに下線）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＩＹＤＧＹＤＶＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0332】

配列番号８：軽鎖可変領域（ＣＤＲに下線）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＲＫＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ

【0333】

配列番号９：重鎖領域（ＣＤＲに下線；ＨＣ Ｃ２２４、ＨＣ Ｃ２３０およびＨＣ Ｃ２３３は太字／下線）

【化5】

【0334】

配列番号１０：軽鎖領域（ＣＤＲに下線；ＬＣ Ｃ２１４は太字／下線）

【化6】

【0335】

配列番号１１：Ｄ１０３Ｎを含む重鎖領域（ＣＤＲに下線）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＩＹＮＧＹＤＶＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0336】

配列番号１２：Ｎ３８８Ｄを含む重鎖領域（ＣＤＲに下線）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＩＹＤＧＹＤＶＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＤＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0337】

配列番号１３：Ｎ３９３Ｄを含む重鎖領域（ＣＤＲに下線）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＩＹＤＧＹＤＶＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＤＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0338】

配列番号１４：Ｎ３８８ＤおよびＮ３９３Ｄを含む重鎖領域（ＣＤＲに下線）
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】