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▶ トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-23
(54)【発明の名称】ナノ秒スケールの光熱変換動態イメージング
(51)【国際特許分類】
G01N 21/17 20060101AFI20240816BHJP
【ＦＩ】
G01N21/17 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506905
(86)(22)【出願日】2022-08-05
(85)【翻訳文提出日】2024-04-04
(86)【国際出願番号】 US2022074606
(87)【国際公開番号】W WO2023015294
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】63/229,841
(32)【優先日】2021-08-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】301069856
【氏名又は名称】トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100189131
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 拓郎
(74)【代理人】
【識別番号】100182486
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 正展
(74)【代理人】
【識別番号】100147289
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 裕子
(72)【発明者】
【氏名】チェン， ジ－シン
(72)【発明者】
【氏名】ラン， ルー
(72)【発明者】
【氏名】イン， ジアズ
【テーマコード（参考）】
2G059
【Ｆターム（参考）】
2G059AA03
2G059AA05
2G059BB14
2G059EE02
2G059FF01
2G059FF03
2G059FF05
2G059GG01
2G059GG08
2G059HH02
2G059MM01
(57)【要約】
光熱変換動態イメージングを行うためのシステムおよび方法が提供される。例示的な方法は、試料を走査して複数の生の光熱変換動態信号を生成すること、試料の生の光熱変換動態信号を受信すること、生の光熱変換動態信号を整合フィルタリングして非変調ノイズを除去することによって複数の第２の信号を生成すること、および第２の信号に逆演算を実行して時間領域における少なくとも１つの熱動態信号を取り出すこと、を含む、方法。
【選択図】図２Ｂ
【選択図】図２Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
光熱変換動態イメージングを実行するための方法であり：試料を走査して複数の生の光熱変換動態信号を生成すること；
前記試料の前記生の光熱変換動態信号を受信すること；
前記生の光熱変換動態信号を整合フィルタリングして非変調ノイズを除去することによって複数の第２の信号を生成すること、ここで、前記整合フィルタリングは、周波数領域における櫛状通過帯域によって実行され、前記櫛状通過帯域は、非変調ノイズを除去するために高調波周波数で共局在する中心位置を有する少なくとも１つの窓を含み；および、
前記第２の信号に対して逆演算を実行して、時間領域における少なくとも１つの熱動態信号を取り出すこと、を含む、光熱変換動態イメージングを実行するための方法。
【請求項2】
前記少なくとも１つの熱動態信号を使用して、前記試料の減衰定数を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記少なくとも１つの熱動態信号に対して微分を実行して、前記試料の時間分解されたエネルギー流束を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも１つの熱動態信号が、周波数領域における複数の高調波を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
整合フィルタリングによって前記複数の第２の信号を生成することが、基本周波数および赤外線（ＩＲ）変調周波数の高調波において整合フィルタリングを実行することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも１つの熱動態信号が、ナノ秒スケールの熱動態情報を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記試料を走査することが、前記試料を、１ｎｓ～１０００ｎｓのパルス幅および１μｓ～１００μｓの期間を有する単一の赤外線（ＩＲ）パルス励起に供することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
整合フィルタリングによって前記複数の第２の信号を生成することは、前記生の光熱変換動態信号に対してフーリエ変換を実行することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
光熱変換動態イメージングを実行するための方法であり：試料を走査して複数の生の光熱変換動態信号を生成すること；
前記試料の前記生の光熱変換動態信号を受信すること；
前記生の光熱変換動態信号を整合フィルタリングして非変調ノイズを除去することによって複数の第２の信号を生成すること、ここで、前記整合フィルタリングは、周波数領域における櫛状通過帯域によって実行され、前記櫛状通過帯域は、非変調ノイズを除去するために高調波周波数で共局在する中心位置を有する少なくとも１つの窓を含む；
前記第２の信号に対して逆演算を実行して、時間領域における少なくとも１つの熱動態信号を取り出すこと；
前記少なくとも１つの熱動態信号を用いて、前記試料の水バックグラウンドを決定すること；
前記水バックグラウンドおよび前記試料間の熱減衰の差分を決定すること；および
前記熱減衰の差分を使用して、前記試料の光熱変換イメージングにおける前記水バックグラウンドを抑制すること、を含む、光熱変換動態イメージングを実行するための方法。
【請求項10】
前記熱減衰の差分を決定することが、前記少なくとも１つの熱動態信号に対して指数関数的フィッティングを実行して、前記水バックグラウンドおよび前記試料の前記減衰定数を決定することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記少なくとも１つの熱動態信号に対して微分を実行して、前記試料の時間分解されたエネルギー流束を決定することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
整合フィルタリングによって前記複数の第２の信号を生成することが、基本周波数および赤外線（ＩＲ）変調周波数の高調波において整合フィルタリングを実行することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
前記少なくとも１つの熱動態信号が、ナノ秒スケールの熱動態情報を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項14】
前記試料を走査することが、前記試料を、１ｎｓ～１０００ｎｓのパルス幅および１μｓ～１００μｓの期間を有する単一の赤外線（ＩＲ）パルス励起に供することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項15】
整合フィルタリングによって前記複数の第２の信号を生成することは、前記生の光熱変換動態信号に対してフーリエ変換を実行することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項16】
前記試料の前記水バックグラウンドを決定することが、前記試料を１６５０ｃｍ－１の単一の赤外線（ＩＲ）パルス励起に供することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
光熱変換動態イメージングを実行するためのシステムであり、前記システムが：
１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサと；
前記１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサに結合された１つまたは複数のコンピューティングデバイスメモリと、を備え、
前記１つまたは複数のコンピューティングデバイスメモリが、前記１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサによって実行される命令を記憶し、
前記命令が、
試料を走査して複数の生の光熱変換動態信号を生成し；
前記試料の前記生の光熱変換動態信号を受信し；
前記生の光熱変換動態信号を整合フィルタリングして非変調ノイズを除去することによって複数の第２の信号を生成し、
ここで、前記整合フィルタリングは、周波数領域における櫛状通過帯域によって実行され、前記櫛状通過帯域は、非変調ノイズを除去するために高調波周波数で共局在する中心位置を有する少なくとも１つの窓を含む；および
前記第２の信号に対して逆演算を実行して、時間領域における少なくとも１つの熱動態信号を取り出す、ように構成される、
光熱変換動態イメージングを実行するためのシステム。
【請求項18】
前記命令は、前記少なくとも１つの熱動態信号を使用して、前記試料の減衰定数を決定するようにさらに構成される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項19】
前記命令は、前記少なくとも１つの熱動態信号に対して微分を実行して、前記試料の時間分解されたエネルギー流束を決定するようにさらに構成される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項20】
前記命令は、整合フィルタリングによって前記複数の第２の信号を生成する間に、基本周波数および赤外線（ＩＲ）変調周波数の高調波で整合フィルタリングを実行するように構成される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項21】
前記少なくとも１つの熱動態信号は、ナノ秒スケールの熱動態情報を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項22】
前記命令は、前記試料を走査している間に、前記試料に単一の赤外線（ＩＲ）パルス励起を受けさせるように構成される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項23】
前記命令は、整合フィルタリングによって前記複数の第２の信号を生成する間に、前記生の光熱変換動態信号に対してフーリエ変換を実行するように構成される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項24】
光熱変換動態イメージングを実行するためのシステムであり、前記システムが：
複数の生の光熱変換動態信号を増幅するための１つまたは複数の信号増幅デバイス；
前記１つまたは複数の信号増幅デバイスに結合された１つまたは複数の信号取得デバイス；
前記１つまたは複数の信号取得デバイスに結合された１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサ；および
前記１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサに結合された１つまたは複数のコンピューティングデバイスメモリを備え、
前記１つまたは複数のコンピューティングデバイスメモリが、前記１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサによって実行される命令を記憶し、
前記命令は、
試料を走査して前記複数の生の光熱変換動態信号を生成し；
前記試料の前記生の光熱変換動態信号を受信し；
前記生の光熱変換動態信号を整合フィルタリングして非変調ノイズを除去することによって複数の第２の信号を生成し、ここで、前記整合フィルタリングは、周波数領域における櫛状通過帯域によって実行され、前記櫛状通過帯域は、非変調ノイズを除去するために高調波周波数で共局在する中心位置を有する少なくとも１つの窓を含み；および
前記第２の信号に対して逆演算を実行して、時間領域における少なくとも１つの熱動態信号を取り出す、ように構成される、
光熱変換動態イメージングを実行するためのシステム。
【請求項25】
前記命令は、前記少なくとも１つの熱動態信号を使用して、前記試料の減衰定数を決定するようにさらに構成される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項26】
前記命令は、前記少なくとも１つの熱動態信号に対して微分を実行して、前記試料の時間分解されたエネルギー流束を決定するようにさらに構成される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項27】
前記命令は、整合フィルタリングによって前記複数の第２の信号を生成する間に、基本周波数および赤外線（ＩＲ）変調周波数の高調波で整合フィルタリングを実行するように構成される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項28】
前記少なくとも１つの熱動態信号は、ナノ秒スケールの熱動態情報を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項29】
前記命令は、前記試料を走査している間に、前記試料に、１ｎｓ～１０００ｎｓのパルス幅および１μｓ～１００μｓの期間を有する単一の赤外線（ＩＲ）パルス励起に供するように構成される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項30】
前記命令は、整合フィルタリングによって前記複数の第２の信号を生成する間に、前記生の光熱変換動態信号に対してフーリエ変換を実行するように構成される、請求項２４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月５日に出願された米国仮出願第６３／２２９，８４１号の優先権を主張し、その内容は、その全体が本明細書に含まれる。
本出願は、２０２１年８月５日に出願された米国仮出願第６３／２２９，８４１号の優先権を主張し、その内容は、その全体が本明細書に含まれる。
【0002】
政府支援
本発明は、認可番号ＧＭ１３６２２３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、認可番号ＧＭ１３６２２３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
光熱変換顕微鏡法は、極めて高い感度で光吸収を測定するための多用途の分析ツールである。光減衰を測定する従来の分光法とは異なり、光熱変換検出は、吸収帯域外の別の光ビームによる熱作用を精査することによって吸収情報を取得する。その高い感度は、主に、変調された熱ビームと、ロックイン増幅器を用いた周波数シフトされたプローブビームのヘテロダイン検出とを用いることによって、バックグラウンドが低減されることから高い恩恵を受ける。そのような検出スキームを使用して、直径１．４ｎｍの単一金ナノ粒子のイメージングのショットノイズが制限されることが、実証されている。単一分子の検出限界もまた報告されている。
【0004】
最近、新たに出現した無標識の振動分光イメージングモダリティは、ポンプ源として中赤外（ｍｉｄ－ＩＲ）レーザを、プローブとして可視光を使用する。このイメージングモダリティでは、ｍｉｄ－ＩＲ吸収コントラストは、吸収体の近傍に閉じ込められた過渡温度場から生じる。３００ｎｍ程度のサブミクロン空間分解能は、そのような場を、しっかりと焦点を合わせた可視光で探ることによって達成される。この新しいイメージングモダリティは、膨大な分子指紋情報により光熱変換技術を強化させ、従来のｍｉｄ－ＩＲ吸収顕微鏡法および近接場ＩＲアプローチにおける制限を克服する。
【0005】
水性環境における化学結合のサブミクロンの化学マッピングが可能になったことにより、中赤外光熱変換イメージング分野は様々な革新技術や用途を拡大してきた。それらは、広視野検出、光位相検出、光音響検出、ラマンとの相乗的な統合、非接触材料の特性評価、生体分子マッピング、ならびに生細胞および他の生命体の代謝の画像化等が挙げられる。
【0006】
光熱変換顕微鏡法の開発および応用におけるその成功にもかかわらず、物体の熱動態（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ）および過渡的な光熱変換プロセスに関する貴重な情報はめったに利用されない。ロックインアプローチを活用する光熱変換ヘテロダインイメージング（ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ ｈｅｔｅｒｏｄｙｎｅ ｉｍａｇｉｎｇ）（ＰＨＩ）は、媒体の熱拡散率を明らかにし得る。このアプローチは、超伝導転移の観察、組織分化、および膜界面の解明を含む、様々な用途を可能にしてきた。しかしながら、ロックインの復調が一般に光熱変換信号の高次高調波を全て失い時間分解能の悪化をもたらす。
【0007】
したがって、ＰＨＩを用いて包埋剤および物体から生じる中赤外光熱変換信号を解釈することは困難である。時間領域では、短パルスプローブを使用する時間ゲートアプローチは、プローブパルスとポンプパルスとの間の遅延を調整することによってそのダイナミクスを分解し得る。しかし、ナノ秒の分解能での温度上昇および減衰を示す完全な熱動態スペクトルを取得するには、数千回の反復測定が必要であり、日常的な使用には適さない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本開示に記載される主題の一態様によれば、光熱変換動態イメージング（ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ ｄｙｎａｍｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ）を実行するための方法が提供される。本方法は、以下のステップを含む：試料を走査して複数の生の光熱変換動態信号を生成すること；試料の生の光熱変換動態信号を受信すること；生の光熱変換動態信号を整合フィルタリングして非変調ノイズを除去することによって複数の第２の信号を生成すること、ここで、整合フィルタリングは、その周波数領域における櫛状通過帯域によって実行され、櫛状通過帯域は非変調ノイズを除去するために高調波周波数で共局在する中心位置を有する少なくとも１つの窓を含む；および、前記第２の信号に対して逆演算を実行して時間領域において少なくとも１つの熱動態信号を取り出すこと。
【0009】
本開示に記載される主題の一実施態様によれば、光熱変換動態イメージングを実行するための方法が提供される。この方法は、以下のステップを含む：試料を走査して複数の生の光熱変換動態信号を生成すること；試料の生の光熱変換動態信号を受信すること；生の光熱変換動態信号を整合フィルタリングすることによって複数の第２の信号を生成すること、ここで、整合フィルタリングは、周波数領域の櫛状通過帯域によって実行され、この櫛状通過帯域は、非変調ノイズを除去するために高調波周波数で共局在する中心位置を有する少なくとも１つの窓を含む；第２の信号に逆演算を実行して、時間領域の少なくとも１つの熱動態信号を取り出すこと；その少なくとも１つの熱動態信号を使用して、試料の水バックグラウンド（ｗａｔｅｒ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を決定すること；水バックグラウンドと試料との間の熱減衰差を決定すること；および、その熱減衰差を使用して、試料の光熱変換イメージングにおいて水バックグラウンドを抑制すること。
【0010】
本開示に記載される主題の別の態様によれば、光熱変換動態イメージングを実行するためのシステムが提供される。システムは、１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサと、１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサに結合された１つまたは複数のコンピューティングデバイスメモリとを含む。１つまたは複数のコンピューティングデバイスメモリは、１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサによって実行される命令を記憶し、命令は：試料を走査して複数の生の光熱変換動態信号を生成し；試料の生の光熱変換動態信号を受信し；生の光熱変換動態信号を整合フィルタリングして非変調ノイズを除去することによって複数の第２の信号を生成し、ここで、整合フィルタリングは周波数領域における櫛状通過帯域によって実行され、櫛状通過帯域は、非変調ノイズを除去するために高調波周波数で共局在する中心位置を有する少なくとも１つの窓を含み；および、第２の信号に対して逆演算を実行して、時間領域における少なくとも１つの熱動態信号を取り出す、ように構成される。
【0011】
本開示に記載される主題の別の実施態様によれば、光熱変換動態イメージングを実行するためのシステムが提供される。システムは、複数の生の光熱変換動態信号を増幅するための１つまたは複数の信号増幅デバイスを含む。１つまたは複数の信号取得装置が、１つまたは複数の信号増幅装置に結合される。１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサは、１つまたは複数の信号取得デバイスに結合される。１つまたは複数のコンピューティングデバイスメモリが、１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサに結合される。１つまたは複数のコンピューティングデバイスメモリは、１つまたは複数のコンピューティングデバイスプロセッサによって実行される命令を記憶し、命令は：試料を走査して複数の生の光熱変換動態信号を生成し；試料の生の光熱変換動態信号を受信し；生の光熱変換動態信号を整合フィルタリングして非変調ノイズを除去することによって複数の第２の信号を生成し、ここで整合フィルタリングは周波数領域における櫛状通過帯域によって行われ、櫛状通過帯域は、非変調ノイズを除去するために高調波周波数で共局在する中心位置を有する少なくとも１つの窓を含み；および、第２の信号に逆演算を行って時間領域における少なくとも１つの熱動態信号（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｉｇｎａｌ）を取り出す、ように構成される。
【0012】
本開示に記載された主題の別の実施態様によれば、コンピュータによって実行された場合に、光熱変換動態イメージングを実行するための方法をコンピュータに実行させる命令を記憶する非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。この方法は、以下のステップを含む：試料を走査して複数の生の光熱変換動態信号を生成すること；試料の生の光熱変換動態信号を受信すること；生の光熱変換動態信号を整合フィルタリングして非変調ノイズを除去することによって複数の第２の信号を生成すること、ここで、整合フィルタリングは、周波数領域において櫛状通過帯域によって実行され、櫛状通過帯域は、非変調ノイズを除去するために高調波周波数で共局在する中心位置を有する少なくとも１つの窓を含み；および、第２の信号に対して逆演算を実行して時間領域において少なくとも１つの熱動態信号を取り出すこと、を含む方法。
【0013】
本開示のさらなる特徴および利点は、本開示の詳細な説明に記載されており、本開示の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0014】
本開示は、添付図面の図において、例示的様式で示されるが、限定的様式ではなく、図において、同様の参照番号は、同様の要素を指すために使用される。様々な特徴は、一定の縮尺で描かれていない場合があり、様々な特徴の寸法は、議論を明確にするために任意に拡大または縮小されている場合があることを強調する。
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【発明を実施するための形態】
【0046】
本明細書に提供される図および説明は、本明細書に説明されるデバイス、システム、および方法の明確な理解のために関連する態様を図示するように簡略化されている一方、明確にする目的で、典型的な類似のデバイス、システム、および方法に見出され得る他の態様を排除している場合がある。当業者は、他の要素および／または動作が、本明細書に説明されるデバイス、システム、および方法を実装するために望ましくあり得る、および／または必要であり得ることを認識し得る。しかし、そのような要素および動作は当技術分野でよく知られており、それらは本開示のより良い理解を容易にしないので、そのような要素および動作の説明は本明細書では提供されないことがある。しかしながら、本開示は、当業者に知られているであろう、説明された態様に対するすべてのそのような要素、変形形態、および修正形態を本質的に含むと考えられる。
【0047】
本明細書で使用される用語は、特定の例示的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定することを意図したものではない。例えば、本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことを意図し得る。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有している（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であり、したがって、述べられた特徴、整数、ステップ、動作、要素、および／または構成要素の存在を指定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、動作、要素、構成要素、および／またはそれらのグループの存在または追加を排除しない。本明細書に記載された方法のステップ、プロセス、および動作は、実行の順序として具体的に特定されない限り、必ずしも説明または図示された特定の順序での実行を必要とすると解釈されるべきではない。追加のまたは代替のステップが使用されてもよいことも理解されたい。
【0048】
第１、第２、第３などの用語は、本明細書では、様々な要素、構成要素、領域、層、および／またはセクションを説明するために使用され得るが、これらの要素、構成要素、領域、層、および／またはセクションは、これらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、１つの要素、構成要素、領域、層、またはセクションを別の要素、構成要素、領域、層、またはセクションと区別するためにのみ使用され得る。すなわち、「第１の」、「第２の」などの用語、および他の数値用語は、本明細書で使用される場合、文脈によって明確に示されない限り、順序（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または順序（ｏｒｄｅｒ）を暗示しない。
【0049】
本明細書には、ナノ秒スケールの時間分解能を有し、２５ＭＨｚよりも大きい帯域幅をカバーするｍｉｄ－ＩＲの光熱変換動態イメージング（ＰＤＩ）システムの例示的な実装形態が記載される。帯域幅は、１ｋＨｚ～１ＧＨｚであってもよい。単一のＩＲパルス励起に応答する熱動態スペクトルが、広帯域電圧増幅器およびメガヘルツデジタイザを使用して取得され、デジタル信号処理と組み合わせて、基本ＩＲ変調周波数および高調波の外側のノイズをフィルタリングして除去する。ＰＤＩシステムは、ロックインに基づく光熱ヘテロダインイメージング（ＰＨＩ）よりも信号対ノイズ比（ＳＮＲ）において５倍を超える改善を達成することができる。さらに、ＰＤＩシステムは、過渡温度場特性を検索し、ターゲットの物理的特性および微小環境に関する情報を提供する。
【0050】
がん細胞内の様々な細胞小器官の光熱変換動態を、このアプローチを使用して取得し得る。組織または細胞の均一な熱応答の巨視的観察とは異なり、細胞内では熱環境は化学的依存性が極めて不均一であることが描写され得る。水と生体分子との間の熱減衰差を利用することによって、従来の光熱変換顕微鏡法では水バックグラウンドから分離することが困難な細胞成分が、それらの時間分解された特性に基づいてここで区別し得る。
【0051】
まとめると、ＰＤＩシステムは、ナノ秒の時間分解能で過渡的な光熱変換プロセスの直接検出を可能にする。ｍｉｄ－ＩＲの励起と共に、このアプローチは、試料の固有の化学的及び物理的特性の非破壊的調査を可能にし、化学物質特有の過渡熱イメージング用途を可能にする。
【0052】
光熱変換現象は、吸収された光子エネルギーを、非放射緩和を介して熱に変換することから生じる。パルスレーザ励起下では、熱緩和時間よりも短い吸収エネルギーがその吸収体に蓄積し、局所的な温度場を形成する。これが、局所的な密度変化を介して局所的な光屈折率を変更する熱弾性変形を並行して誘発し、光散乱を通して時間分解された光熱変換信号として検出され得る。ナノ粒子のＰＨＩ検出と比較して、中赤外光熱（ＭＩＰ）の熱動態を解釈する際に２つの違いがある。
【0053】
第１に、ＭＩＰ吸収体は、媒体、特に生体システムにおける点熱源によってモデル化することができない。例えば、脂肪滴、タンパク質凝集、および細胞質のような結合選択的標的は、嵩高い。熱動態は、吸収体と局所媒体の両方によって集合的に影響を受ける。第２に、ｍｉｄ－ＩＲ範囲における水吸収を考えると、吸収体および媒体の両方が、信号コントラストに影響を及ぼす水性環境における温度上昇となり得る。したがって、不均一な熱拡散率内の温度場の発生を考慮すべきである。
【0054】
ｍｉｄ－ＩＲポンプの下での吸収体の局所的な温度の急激な変化は、図１Ａに示すように、ｍｉｄ－ＩＲパルスの存在に伴う温度の急激な変化と、それに続く、図１Ｂに示すような、熱放散（ｈｅａｔ ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ）に関連する指数関数的な減衰とからなる。この過渡的プロセスは、以下の熱伝達方程式を解くことによって得られる。
ここで、ｍおよびＣｓは、吸収体の重量および特定の熱容量を表し、ｄＴ／ｄｔは、時間に対する温度変化であり、（Ｑａｂｓ－Ｑｄｉｓｓ）は、吸収されたエネルギーと散逸されたエネルギーとのレート差を表すエネルギー流束を示す。ＩＲパルス持続時間（パルス幅）は、１ｎｓ～１０００ｎｓであり、１μｓ～１００μｓの期間（ｐｅｒｉｏｄ）を有し得る。
【数1】
【0055】
Ｑａｂｓの量は、ＩＩＲ（ｔ）σａｂｓによって近似され得、ここで、ＩＩＲ（ｔ）は、ＩＲパルスにわたる入射ＩＲ強度を表し、σａｂｓは、ＩＲ吸収断面積を表す。熱放散は、ニュートンの法則（Ｎｅｗｔｏｗｎ’ｓ Ｌａｗ）に従い、Ｑｄｉｓｓは、温度勾配によって導出され、（ｈＳ［Ｔ（ｔ）－Ｔ０］）で与えられ、ここで、ｈおよびＳは、それぞれ、被検査物から環境への熱伝達係数および有効伝達表面積を表す。関係（ｈＳ［Ｔ（ｔ）－Ｔ０］）は、吸収体と周囲環境Ｔ０との間の時間依存性の温度の差である。
【0056】
加熱プロセス中、Ｔ（ｔ）は、初期条件Ｔ（０）＝Ｔ０を用いて式（１）を解くことにより導出され得、ＩＲパルス波形を無視し得る。
【数2】
【0057】
ＩＲパルス加熱が終了すると、Ｑａｂｓはゼロになる。その温度変化はＱｄｉｓｓによってのみ導出され、Ｔ（ｔ）は次のように解かれる。
ここで、Ｔｍａｘは加熱終了後の吸収体の最大温度である。
【数3】
【0058】
このモデルから、加熱プロセスと冷却プロセスの両方が、ｍＣｓ／ｈＳの時定数τを有する指数関数的プロセスとして記述され得ることが分かる。加熱プロセス中、レーザパルス持続時間がτよりもはるかに短い場合にのみ、放熱が無視できると仮定して、放熱閉じ込め条件が満たされ、式（２）は、（Ｔ０＋（ＩＩＲσａｂｓ／ｈＳ）ｔ）になる。そうでなければ、温度は、吸収体がその熱平衡状態に近づくときに、徐々にプラトーに到達し得る。
【0059】
抵抗－コンデンサ回路と同様に、ｍＣｓは熱コンデンサの量であり、１／ｈＳは熱抵抗である。これらのいずれの増分も、かなりの時定数をもたらす。これらの時定数は、かさ高い水および大きな粒子などの大きな熱容量を有する吸収体にとって重要であると予想される。ｈＳの量は、包埋媒体の伝熱能力および吸収体の形状に最も関連する。したがって、熱応答は、試料及び連関する環境の両方の物理的特性に密接に関連しており、生細胞のような不均一系では大きく異なり得る。
【0060】
周波数領域において、短パルスレーザによって誘起される熱応答は、広帯域にわたって広がり、これは、パルス周波数スペクトルを吸収体の伝達関数と多重化した結果である。時定数τを有する特定の吸収体の伝達関数は、以下の式によって近似し得る。
【数4】
【0061】
この表現は、光熱変換信号に関する重要な事実を伝える。第１に、吸収体は、１／２πτで－３ｄＢのカットオフを有する過渡的な熱摂動のためのローパスフィルタである。この関係は、熱残留を回避し、かなりの変調度を維持するために適切なＩＲ繰り返し率を選択することに対処する。第２に、ｆＩＲの繰り返し率を有するＩＲによって生成される光熱変換信号は、そのような関数のフーリエ合成として扱うことができ、図１Ｃの直径Ｄ＝５００ｎｍのＰＭＭＡビーズを有する空気中のポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズのシミュレーションに示されるように、ｆＩＲの各高調波における成分を含む。
【0062】
特に、図１Ｃは、高調波が周波数領域において広く拡散され、帯域幅がカットオフ周波数によって決定されることを示す。τが大きいと、スパンが狭くなる。光熱変換信号は、変調周波数で正弦波に近くなり、高次高調波をほとんど有さないが、高速減衰信号は、多くの強い高調波成分を有する。さらに、これらの特徴は、従来のロックインベースのＭＩＰシステムに対する微小環境の影響を強調する。ロックイン法は、基本高調波振幅のみを回復し、高調波周波数での他の全ての信号を見逃すものであり、これは感度を犠牲にし、異なる熱応答を有する異種の試料においてコントラスト歪みを引き起こす。加えて、水のバックグラウンドは、変調周波数で最大になり、弱い信号の大きさで小さな細胞小器官の信号を隠すが、周波数領域で様々な高次の高調波成分をロードする。
【0063】
光熱変換信号は、微細であり、大きなバックグラウンド信号にわたって変調される。ロックイン検出アプローチは、変調周波数帯域の外側のノイズを除去することによって信号を復調する。しかしながら、この狭帯域フィルタリング技術は、検出帯域幅および時間分解能を失う。ＰＤＩシステムは、ノイズを抑制するために整合フィルタリングを使用する広帯域取得方式を利用する。このようにして、帯域幅、時間分解能、および感度が良好に維持される。
【0064】
図２Ａは、いくつかの実施形態に従って使用される例示的なｍｉｄ－ＩＲ ＰＤＩシステムの概略図である。量子カスケードレーザは、第１のダイクロイックミラー（ＤＭ１）を通過し、次いで反射対物レンズ（ＲＬ）を用いて試料上に集束されるパルス化されたｍｉｄ－ＩＲポンプビーム２１０を提供する。ダイクロイックミラーＤＭによって反射された残留ｍｉｄ－ＩＲビーム２１２は、ＭＣＴ検出器で監視される。連続波５３２ｎｍレーザからの逆伝播プローブビーム２１４は、第２のダイクロイックミラー（ＤＭ２）を通過し、水浸対物レンズ（ＯＬ）上に集束される。後方散乱プローブ光子２１６は、５０／５０ビームスプリッタ（ＢＳ）で収集され、前方散乱プローブ光子２１８は、反射対物レンズ（ＲＬ）によって収集され、ダイクロイックミラー（ＤＭ３）によって分離される。前方プローブ光子２１８及び後方プローブ光子２１６の両方が収集され、図２Ｂに示すように、広帯域電圧増幅器２０２に接続されたシリコンフォトダイオードＰＤ１及びＰＤ２に送られる。
【0065】
図２Ｂは、２５ＭＨｚのカットオフ周波数を伴うローパスフィルタ２０４でフィルタリングされ、１秒当たり５０００万試料のサンプリングレートで高速デジタイザ（ＤＡＱ）２０６に送られる電圧信号を示す。ＤＡＱ２０６は、１秒当たり１００万試料から３０億試料のサンプリングレートを有する。コンピュータ２０８は、走査台２０９とＱＣＬレーザとを同期して制御するために使用される。一方、ＩＲポンプパルスを監視するためにテルル化水銀カドミウム（ＭＣＴ）検出器が配置され、信号は同じＤＡＱ２０６によって同期してデジタル化される。
【0066】
フレームごとに取得された生のＰＤＩデータは、試料の走査が終了した後にＤＡＱ２０６からコンピュータ２０８のメモリに転送され、カスタムコード化されたソフトウェアで処理される。時間トレース全体は、割り当てられたピクセル滞留時間に従ってセグメント化される。次いで、各セグメントは、高調波ポンプレーザ繰り返し率で各通過窓を伴う櫛状通過帯域を用いて周波数領域内でフィルタリングされる（１００ｋＨｚで作動するレーザの場合、通過窓は、１００ｋＨｚ、２００ｋＨｚ、．．．、２ＭＨｚ、２．１ＭＨｚで選択される）。スペクトル分解能は、ピクセル滞留時間に従ってウィンドウサイズを定義する。通過する高調波の数は、熱動態の帯域幅を決定し、ＳＮＲに影響を及ぼす。この場合、吸収コントラストを描くために第１６次高調波（１．６ＭＨｚ）を使用して、最も高い画像ＳＮＲを与えることができる。一方で、完全な光熱変換動態プロファイルを定義するために、２５ＭＨｚの帯域幅を使用してもよい。
【0067】
図３Ａは、いくつかの実施形態による、ＰＤＩを実行するためのプロセスフロー図である。生のＰＤＩのデータは、ＩＲポンプ下、１７２９ｃｍ－１の吸収ピークで５００ｎｍのＰＭＭＡビーズの中心から取得した（ステップ３０２）。単一パルス光熱変換信号は、広帯域検出スキームを使用して平均化することなく、４３を超える信号対ノイズ比（ＳＮＲ）で明確に分解し得る。この単一パルスの分解能力は、ＰＤＩを、数マイクロ秒の最小取得時間を有する前例のない撮像速度に押し上げる。実際には、ステージ走査速度によって制限され、ピクセルごとに取得される信号は、数百マイクロ秒のセグメントである。フーリエ変換を使用する整合フィルタリングは、ＳＮＲを向上させるために、周波数領域において櫛状通過帯域３１０を有する各セグメントに対して実行される（ステップ３０４）。
図３Ｂは、櫛状の通過帯域３１０を示し、各窓３１２は、非変調ノイズ３１４のほとんどを除去するために、周波数領域における高調波周波数で共局在する中心位置を有する。フィルタリング後、フィルタリングされた光熱変換信号３０８が、逆フーリエ変換を用いて取得される（ステップ３０６）。フィルタリングされた光熱変換信号は、時間領域において拡張された各空間画素で再構成されたＸ－Ｙ－ｔスタックに関連付けられる（ステップ３０６）。
図３Ｂは、櫛状の通過帯域３１０を示し、各窓３１２は、非変調ノイズ３１４のほとんどを除去するために、周波数領域における高調波周波数で共局在する中心位置を有する。フィルタリング後、フィルタリングされた光熱変換信号３０８が、逆フーリエ変換を用いて取得される（ステップ３０６）。フィルタリングされた光熱変換信号は、時間領域において拡張された各空間画素で再構成されたＸ－Ｙ－ｔスタックに関連付けられる（ステップ３０６）。
【0068】
ＰＤＩは、公称直径３００ｎｍのＰＭＭＡビーズに対して実施した。ＱＣＬレーザを、ＰＭＭＡ中のＣ＝Ｏ結合の吸収ピークに対応する１７２９ｃｍ－１に調整した後、図４Ａに示すように、ＰＭＭＡビーズの光熱変換の輝度画像を取得した。図４Ａは、ＰＭＭＡビーズの大部分がｔ＝４４０ｎｓで最高温度に達したことを示す。図４Ｂは、１６００ｃｍ－１のオフレゾナンスｍｉｄ－ＩＲ励起で光熱変換コントラストを示さない。図４Ｃは、ロックインおよび共振増幅器を使用した、図４Ａと同じ視野を有する１７２９ｃｍ－１の励起における従来のＭＩＰ顕微鏡の光熱変換の輝度画像を示す。一方、ロックイン法は、５００μｓのピクセル滞留時間で７１のＳＮＲを生成し、検出感度の５倍に近い改善を示す。ピクセル滞留時間は２００μｓに押し上げられ、ＰＤＩを使用して単一のＰＭＭＡビーズに対して２２０のＳＮＲを達成することができる。
【0069】
図５Ａは、図４Ａに示されるＰＭＭＡビーズの光熱変換動態プロファイルを示す。現在のＰＤＩシステムにおける最も高い時間分解能は、最終的には、数ナノ秒であるフォトダイオード応答時間によって制限される。しかし、デジタイザ２０６のために、５０Ｍ試料／秒のサンプリングレート、すなわち２０ナノ秒が使用される。取得された時間プロファイルを用いて、ＩＲパルスが終了するｔ３の後の散逸プロセスの熱減衰定数を定量的に測定し得る。破線５０２によって示されるように、指数関数的フィッティング関数を使用することによって、フィッティングされた減衰定数は３００ｎｓである。
【0070】
式３から、この時定数は、ｍＣｓ／ｈＳによって与えられる。吸収体とその微小環境との間の伝熱パラメータｈＳは、材料の濃度ρおよびＣｓに関する情報を使用して決定されてもよい。フッ化カルシウム（ＣａＦ２）基板上の３００ｎｍのＰＭＭＡ粒子の場合、熱伝達パラメータは７．７８Ｅ－８Ｗ／Ｋと決定される。有限要素法（ＦＥＭ）を用いて、このパラメータは７．６５Ｅ－８Ｗ／Ｋであると決定され、これは実験測定値と密接に一致する。
【0071】
式１の時間分解されたエネルギー流束の関数［Ｑａｂｓ（ｔ）－Ｑｄｉｓｓ（ｔ）］は、図５Ｂに示すように、過渡光熱変換信号の時間に対する導関数を取ることによって直接評価することができる。モデルから、この関数は次のように書かれる。
ここで、
は、特定の試料に対するケルビン当たりの散乱強度変化を表す係数である。
【数5】
【数6】
【0072】
この関数は、実験結果におけるＩＲパルス形状とよく一致した。熱動態は３つの段階からなる。加熱の開始時（ｔ１からｔ２）には、熱放散は無視できる。エネルギー吸収に関連する第１項が支配的であり、図５Ｃに示すように、ＩＲパルス波状ＩＩＲ（ｔ）に類似したパルス状波形が得られる。温度は、熱放散項が熱流入に等しくなるまで上昇し続け、この時点で、エネルギー流束の関数はゼロになり、吸収体は熱平衡状態に入る。
【0073】
非理想的なＩＲパルス波形に起因して、冷却プロセスは、ＩＲパルスが完全に終了する前に起こった。ｔ２からｔ３まで、ＩＲ強度は徐々に減少し、散逸エネルギーが支配的になり、エネルギー流束の関数は負になり始め、吸収体が冷却段階に入ったことを示す。ＩＲパルスが終了した後（＞ｔ３）、熱流束の関数は、指数関数的減衰として熱放散項のみを示す。これは、３００ｎｍのＰＭＭＡビーズの実験的に得られた熱動態が、冷却の開始時に凹関数様の減衰を有する理由を説明した。
【0074】
スペクトル忠実度を検証するために、異なるＩＲ波長下で光熱変換の強度を測定した。図６に示すように、３００ｎｍのＰＭＭＡビーズのＭＩＰスペクトルを、ＦＴＩＲで取得したＰＭＭＡフィルムのスペクトルと比較した。ＩＲレーザーパルスエネルギーは、生の光熱変換スペクトルを正規化した。良好な一貫性が全領域で観察された。
【0075】
上述の熱動態モデルは、温度上昇と温度減衰の両方が、時定数ｍＣｓ／ｈＳに強く関連していることを示している。均一な媒体に埋め込まれた球状微粒子に対して、パラメータｈＳは、２πκＤによって近似され得、ここで、κは、媒体の熱伝導性であり、Ｄは、粒径である。その結果、減衰定数は、γ２ρＣｓ／κに比例する。同じ材料及び均一な微小環境を有する微粒子に対して、時定数はγ２に依存する。図７Ａに示すように、この関係を検証するために、異なるサイズ（３００ｎｍおよび５００ｎｍ）のＰＭＭＡ粒子の熱動態イメージングを行った。光熱強度の差を除いて、それらの熱動態に有意な差が観察される。図７Ａに示された粒子の熱動態および熱流束の関数は、それぞれ図７Ｂおよび図７Ｃに示されている。３００ｎｍおよび５００ｎｍの粒子についての検索された減衰定数は、それぞれ２９０ｎｓおよび５４０ｎｓである。
【0076】
各ピクセルにおける減衰信号が適合され、図７Ｄに示されるように、統計分析を実行するために熱寿命を示す減衰定数マップが生成される。減衰定数マップにおける選択された領域のヒストグラムが図７Ｅに示されており、ここでは、それぞれ２８０ｎｓおよび４９５ｎｓの中心値を有する３００ｎｍのＰＭＭＡ粒子および５００ｎｍのＰＭＭＡ粒子を表す２つのピークが観察される。この結果から、減衰定数は、３００ｎｍと５００ｎｍのＰＭＭＡ粒子の間で１．８倍にスケーリングされる。また、減衰定数は、γ２依存性で推定される場合、２．８倍にスケーリングされ得る。
【0077】
ＣａＦ２基板は、空気（０．０２６Ｗ／（ｍＫ））よりもはるかに大きい熱伝導率（９．７１Ｗ／（ｍＫ））を有する。この違いは、異なる粒子の基板接触面積のばらつきの影響によるものである。その結果、そのような微小環境中の粒子は、様々なサイズの表面積付着を有する不均一な熱放散能力を有する。サイズが大きくなるにつれて、基板の表面接触面積が大きくなり、大きな粒子の伝熱能力が増大する。実際に、減衰定数マップから、図７Ｄの５００ｎｍのＰＭＡＡ粒子の不均一な熱特性を観察することができる。中央領域は、表面接触面積が小さい縁部よりも速い減衰を有する。
【0078】
細胞内の様々な細胞小器官の一過性熱応答を調べるために、酸化重水素（Ｄ２Ｏ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でのＵ８７がん細胞の結合選択的ＰＤＩを実施した。ＩＲをアミドＩバンドに対応する１６５０ｃｍ－１に調整することによって、細胞内のタンパク質に富む内容物は、図８Ａに示される光熱強度マップに明確なコントラストをなす。Ｄ２Ｏ ＰＢＳは、細胞形態を維持し、１６５０ｃｍ－１でのｍｉｄ－ＩＲの著しい水吸収を減少させるために使用される。
【0079】
図８Ａでは、細胞質中に均一に分布したタンパク質内容物および核小体からの強い信号を観察することができる。バックグラウンドは光熱変換信号を有するが、細胞の信号と比較して相対的に弱い。これは、この波数における残留水吸収によるものである。ＩＲを脂質からのＣ＝Ｏバンドに対応する１７５０ｃｍ－１に調整することによって、個々の脂肪滴は、図８Ｂにおいて強い信号を示した。
【0080】
光熱変換分光法を、脂肪滴、核、細胞質、およびバックグラウンド培地について実施した。各内容物のスペクトルを図８Ｃに示す。核および細胞質でのスペクトルは、１６５５ｃｍ－１でアミドＩバンドの強いピークを示し、Ｎ－Ｈ結合の重水素置換により１４５０ｃｍ－１でアミドＩＩバンドをシフトした。脂肪滴のスペクトルにおいて、強いピークが１７５０ｃｍ－１で生じ、高いＣ＝Ｏ含有量を示した。図８Ｄは、脂肪滴、核、細胞質、およびバックグラウンド媒体の光熱変換動態をそれぞれ示す。
【0081】
興味深いことに、脂肪滴のスペクトルは、１６５０ｃｍ－１を中心とする広いピークを示した。これは、１６５０ｃｍ－１での図８Ａの輝度マップの結果と一致し、ここでは脂肪滴も明るくなる。このタンパク質バンドにおける脂質の異常な強いコントラストは、他の報告された散乱に基づく光熱変換システムにおいて広く観察される。この信号の起源は、本明細書に記載されるＰＤＩアプローチによって可能となる、その過渡的な光熱変換信号を研究することにより、調査し得る。
【0082】
このＩＲの化学的特異性と共に、図８Ｄに示すように、様々な細胞内成分の光熱変換動態を評価する。結果は、異なる細胞小器官の間の明確な熱応答を示した。細胞内の脂肪滴は、水性環境に埋め込まれた単離粒子と類似している。したがって、それらは、３００ｎｓの時定数を有する比較的速い減衰信号を有する。豊富なタンパク質含有量を有する核小体および細胞質は、脂肪滴と比較して、２．５μｓである、より遅い減衰シグナルを有する。
【0083】
興味深いことに、１６５０ｃｍ－１のバックグラウンドは、その大きな水熱容量のために、５μｓよりも大きな減衰定数を有する最長減衰を有する。より直感的な例示のために、１６５０ｃｍ－１（図８Ｅに示す）および１７５０ｃｍ－１（図８Ｆに示す）の減衰定数マップを生成した。図８Ｅおよび図８Ｆの減衰マップから、バックグラウンド構造と細胞構造とを、それらの異なる熱動態について区別することができる。細胞とバックグラウンド媒体との間の熱境界は、図８Ｅの破線８０２として示される縁で観察され得る。
【0084】
脂肪滴は、図８Ｆに示すように、１７５０ｃｍ－１励起で１５０ｎｓ～５００ｎｓの範囲の減衰定数を有する。しかしながら、脂質のより高い減衰定数は、１６５０ｃｍ－１未満では明らかにされない。その代わりに、それらは、バックグラウンド媒体と同様の減衰定数を有する。細胞質および核は、１６５０ｃｍ－１励起で２．５μｓの減衰定数を有する。
【0085】
検出された信号は、典型的には、散乱場変調から生じる。散乱強度は、（ｎｓ－ｎｍ）に比例し、ここで、ｎｓおよびｎｍは、それぞれ、試料およびバックグラウンド媒体の屈折率である。これは、サイズの影響が無視できると仮定している。吸水によるＭＩＰ調節において、ｎｓ（ｔ）およびｎｍ（ｔ）の両方は、時間依存性である。これらの変化のいずれも、散乱強度変調をもたらし得る。
【0086】
脂肪滴の基礎となる動態は、励起１６５０ｃｍ－１（図８Ｇに示す）および１７５０ｃｍ－１（図８Ｈに示す）でプロットされる。実際、明らかになった動態は、異なる熱特性を示す。１７５０ｃｍ－１では、脂質信号ＬＤ１、ＬＤ２、およびＬＤ３は、迅速に応答し、数百ナノ秒のオーダーの減衰時間を有する。しかしながら、１６５０ｃｍ－１では、脂質シグナル信号ＬＤ１、ＬＤ２、およびＬＤ３は、５μｓより高い減衰定数を有する比較的遅い減衰を示した。この過渡応答は、図８Ｇの破線８０４で示すように、水のバックグラウンドと同様である。
【0087】
時間分解された光熱変換信号の導関数をとって、このクロストークが水バックグラウンド媒体と脂質との間の熱交換から生じるかどうかを決定した。このような異なる熱特性により、脂質信号ＬＤ１、ＬＤ２、およびＬＤ３における１６５０ｃｍ－１ピークは、細胞小器官自体ではなく、水バックグラウンド媒体から生じるはずである。１６５０ｃｍ－１では、２０ナノ秒より長い遅延は観察されず、加熱および信号生成中の熱拡散は無視できることを示している。したがって、バックグラウンド媒体は、水の吸収に起因するｎｍの変化の主な原因である。
【0088】
ＰＤＩシステムは、水バックグラウンド媒体と脂肪滴ＬＤ１、ＬＤ２、およびＬＤ３との間の明確な熱特性を利用することによって、時間領域における信号寄与を区別した。図８Ｉに示すように、脂質ＬＤ１、ＬＤ２、およびＬＤ３の水誘導信号を、それらの光熱強度および減衰定数を評価する単純なプログラムによって首尾よく抽出し得る。強度画像から１６５０ｃｍ－１での水誘導信号を除去した後、図８Ｊに示すように、脂質とタンパク質との間で十分に分離された内容物マップが得られる。
【0089】
光熱変換動態結果は、脂肪滴が数百ナノ秒で急速に減衰することを示す。同時に、水のバックグラウンドは、数マイクロ秒のオーダーで、はるかに遅い。高次の高調波信号を捕捉することによって、ＰＤＩは、図９Ａに示されるように、小脂質９０２～９０８を可視化することをさらに可能にした。これらの小さな脂質９０２～９０８は、図９Ｂに示されるように、ロックイン検出が使用された場合、水バックグラウンド中に完全に埋もれた。この能力をより詳しく理解するため、光熱変換動態信号のフーリエ解析を行った。
【0090】
脂質９０２～９０８に関連するバックグラウンド信号（ＢＤ）および脂質信号（ＬＤ）の過渡的光熱変換信号を図９Ｃに示す。図９Ｃは、フーリエ変換によって取得され、プロットされたバックグラウンド信号（ＢＤ）および脂質信号（ＬＤ）についての、１００ｋＨｚにおける基本成分または第１次高調波を示す。バックグラウンド信号（ＢＤ）および脂質信号は迅速に応答し、高次の高調波成分を提示する。これに対して、水のバックグラウンドは、基本変調周波数に局在する。したがって、基本周波数でのロックイン復調は、脂肪滴とバックグラウンドとの間のコントラストを最小化する。
【0091】
バックグラウンド信号（ＢＤ）および脂質信号（ＬＤ）の周波数応答を図９Ｄに示す。低速バックグラウンド信号は、第１次および第２次高調波の成分を有する。比較として、高速脂質信号（ＬＤ）は、周波数領域において広く拡散され、第１次高調波は、全エネルギーの５分の１未満しか含有しない。その結果、脂質対バックグラウンド比（Ｌ／Ｄ）は、第２１次高調波まで増加する。
【0092】
復調をロックインする第１次高調波では、図９Ｄに示すようにコントラストが最も低く、脂質信号はバックグラウンド信号からほとんど分解されない。図９Ｅは、第２１次高調波（２．１ＭＨｚ）の光熱変換画像を示し、最小のバックグラウンドを有する小さな脂質についての明確なコントラストを実証する。図９Ｅに示されるような線９１０の強度プロファイルは、異なる周波数で図９Ｆにプロットされる。脂質対バックグラウンド比（Ｌ／Ｄ）が適切な脂質信号は、高次の高調波（０．７ＭＨｚ～２．１ＭＨｚ）で示される。
【0093】
図１０は、いくつかの実施形態による、光熱変換動態イメージングを実行するための例示的なプロセス１０００に含まれる動作のプロセスフロー図である。動作は、１つまたは複数の非一時的機械可読記憶媒体に記憶されたコンピュータ実行可能命令を使用して実装され得る。命令は、図２に記載されたプロセッサ２０８などの１つまたは複数の処理デバイスによって実行されて、動作を実施してもよい。
【0094】
プロセス１０００は、試料を走査して複数の生の光熱変換動態信号を生成することを含む（ステップ１００２）。プロセス１０００は、試料の生の光熱変換動態信号を受信することを含む（ステップ１００４）。プロセス１０００は、生の光熱変換動態信号を整合フィルタリングして非変調ノイズを除去することによって、複数の第２の信号（フィルタリングされた光信号など）を生成することを含む。整合フィルタリングは、周波数領域における櫛状の通過帯域（通過帯域３０２）によって実行される。櫛状通過帯域は、非変調ノイズ（ノイズ３０８など）を除去するために高調波周波数で共局在する中心位置を有する少なくとも１つの窓（窓３０４など）を含む。プロセス１０００は、第２の信号に対して逆演算を実行して、時間領域における少なくとも１つの熱動態信号を取り出すことを含む。プロセス１０００は、少なくとも１つの熱動態信号を使用して、試料の水バックグラウンド（図８Ａ～図８Ｉの水バックグラウンドなど）を決定することを含む（ステップ３１０）。水バックグラウンドと試料との間の熱減衰差が決定される（ステップ１０１２）。プロセスは、熱減衰差を使用して、試料の光熱変換イメージング（図８Ｉの十分に分離された内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）マップなど）における水バックグラウンドを抑制することを含む（ステップ１０１４）。
【0095】
図１１は、いくつかの実施形態による、コンピュータシステム２０８に含まれ得る構成要素の概略図である。図１１に示されるように、コンピュータシステム２０８は、コンピュータハードディスクなどの非一時的コンピュータ可読媒体を含み得るメモリ１１２０を含む。メモリ１１２０は、とりわけ、データ１１２１、コンピュータプログラム１１２２、およびオペレーティングシステム１１２３を記憶する。オペレーティングシステム１１２３は、コンピュータシステム２０８の動作を制御するためのドライバ、例えばカーネルドライバ１１４４を含む。メモリ１１２０に記憶されたコンピュータプログラムの中には、方法３００および１０００に関連するコンピュータコード１１２４がある。コンピュータシステム２０８には、ドライブインターフェース１１２６、ディスプレイインターフェース１１２７、キーボードインターフェース１１２８、マウスインターフェース１１２９、１つまたは複数のコンピュータバス１１３０、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）１１３１、プロセッサ（ＣＰＵ）１１３２、およびグラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）１１４１も含まれる。コンピュータシステム２０８は、ディスプレイインターフェース１１２７と連動して動作するディスプレイと、テキストおよびユーザコマンドを入力するためのキーボードインターフェース１１２８と連動して動作するキーボードとを含み得る。また、コンピュータシステム２０８は、ディスプレイスクリーン上にカーソルを位置決めし、ユーザコマンドを入力するためにマウスインターフェース１１２９とともに動作するマウスを含んでもよい。
【0096】
いくつかの実施形態では、メモリ１１２０は、データを記憶するための複数のメモリ構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＡＭ１１３１は、コンピュータ命令を処理するための複数のＲＡＭを含んでもよい。
【0097】
プロセッサ１１３２は、ＲＡＭ１１３１から、上述したようなコンピュータプログラムを実行するためのマイクロプロセッサ、プログラマブルロジック等であってもよい。プロセッサ１１３２は、ドライブインターフェース１１２６を介して外部デバイスに記憶されたコンピュータプログラム（または他のデータ）にアクセスする。ＧＰＵ１１４１は、処理デバイスの一種である。例えば、ＧＰＵ１１４１は、表示機能を実装し、制御するように構成されたプログラマブルロジックチップであってもよい。この目的のために、ＧＰＵ１１４１は、コンピュータの画面上に画像、アニメーション、およびビデオをレンダリングするようにプログラムされ得る。ＧＰＵ１１４１は、コンピュータシステムのマザーボード上のプラグインカード上またはチップセット内に配置されてもよく、またはＧＰＵ１１４１は、ＣＰＵ１１３２と同じ物理チップ内にあってもよい。いくつかの実装形態では、ＣＰＵ１１３２は、複数のＣＰＵを含み得る。いくつかの実施形態では、複数のＣＰＵは、並列コンピューティング用に構成されてもよい。
【0098】
コンピュータシステム２０８は、情報を無線等で受信および／または送信するための受信機１１１９、例えば、無線受信機を有してもよい。コンピュータシステム２０８は、受信機１１１９からの入力アナログＲＦ信号をデジタル試料に変換するための１つまたは複数のアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）１１３３を含んでもよい。コンピュータシステム２０８は、デジタル試料に対してデジタル信号処理動作を実行するためのデジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）１１３５も含み得る。ＤＳＰ１１３５はまた、デジタル試料の品質を改善するように動作されてもよい。ＤＳＰは、信号処理に関係しないコンピュータプログラムを実行することもできる。
【0099】
コンピュータシステム２０８は、インターネットなどのネットワークにインターフェースするためのイーサネット（登録商標）ポートなどのネットワークインターフェース１１４０を含む。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム２０８は、複数のコンピュータシステム２０８に接続されたサーバであってもよい。
【0100】
いくつかの実装形態では、ＧＰＵ１１４１、ＣＰＵ１１３２、および／またはＤＳＰ１１３５などの複数の電子構成要素が、１つまたは複数のコンピュータプログラムを同時にまたは同時期に実行してもよい。いくつかの実装形態では、ＧＰＵ１１４１は、図１１に示された各タイプの複数の構成要素、たとえば、複数のＣＰＵ、複数のＧＰＵ、複数のＤＳＰなどを含み得る。各種類の構成要素のうちの１つ以上は、１つ以上のコンピュータプログラムを並行して、同時期に、または同時に実行するように構成されてもよい。
【0101】
本開示は、ナノ秒の時間分解能で過渡光熱変調を感知することができる光熱変換動態イメージング（ＰＤＩ）システムを記載する。この先進技術は、サブミクロンの空間分解能で化学的に特異的なＩＲ吸収と物理的に特異的な熱動態とを同時に検出することを可能にする。初めて、細胞内の様々な細胞小器官の熱応答を検索することができる。ＰＤＩシステムを使用して、検索されたデータは、細胞質、核、および脂肪滴が時間分解された異なる特性を示すことを示す。時間分解された特性に基づき、ＰＤＩシステムにより、水媒体の寄与から微小な信号を区別することが可能となった。
【0102】
ＰＤＩシステムは、全ての高調波を捕捉することによって、１桁を超えるＳＮＲを改善し得る。従来のロックインアプローチと比較して、ＰＤＩシステムは、低デューティサイクルの光熱変換信号に対して４倍を超えて感度を増加させる。この改善は、短パルスＩＲポンプによって誘起される全ての高調波成分を捕捉するための広い検出帯域幅を活用する。特に、このアプローチは、主に、数ナノ秒のパルス持続時間および数十キロヘルツの固定繰り返し率を有する、強力な光学パラメトリック発振器（ＯＰＯ）源を伴うｍｉｄ－ＩＲ光熱変換顕微鏡に利益をもたらす。そのような短パルスおよび高ピークパワー励起源は、熱放散が比較的急速である、熱伝導性基板上または水性環境内の小さい物体の大きい変調深度を生成するために非常に好ましい。そのような場合、光熱変換信号は、１％未満のデューティサイクルを有し、ロックイン増幅器は、変調のごく一部しか捕捉することができない。
【0103】
本明細書における「一実装形態（ｏｎｅ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」または「実装形態（ａｎ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」への言及は、実装形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、本開示の少なくとも１つの実装形態に含まれることを意味する。本明細書の様々な箇所における「一実装形態では（ｉｎ ｏｎｅ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」、「いくつかの実装形態では（ｉｎ ｓｏｍｅ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ）」、「一事例では（ｉｎ ｏｎｅ ｉｎｓｔａｎｃｅ）」、「いくつかの事例では（ｉｎ ｏｎｅ ｉｎｓｔａｎｃｅｓ）」、「一事例では（ｉｎ ｏｎｅ ｃａｓｅ）」、「いくつかの事例では（ｉｎ ｓｏｍｅ ｃａｓｅｓ）」、「一実施形態では（ｉｎ ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、または「いくつかの実施形態では（ｉｎ ｓｏｍｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」という句の出現は、必ずしもすべてが同じ実装形態または実施形態を指すとは限らない。
【0104】
最後に、本開示の実施態様の上記の説明は、例示および説明の目的で提示された。網羅的であること、または本開示を開示された厳密な形態に限定することは意図されていない。上記の教示に照らして、多くの修正および変形が可能である。本開示の範囲は、この詳細な説明によってではなく、むしろ本出願の特許請求の範囲によって限定されることが意図される。当業者には理解されるように、本開示は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化されてもよい。したがって、本開示は、以下の特許請求の範囲に記載される本開示の範囲を限定するのではなく、例示することを意図している。
【図1A-C】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A-C】
【図5A-C】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E-J】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】