特表 2024-530778 オルガノイドの生産のためのバイオリアクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-23

(54)【発明の名称】オルガノイドの生産のためのバイオリアクター

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20240816BHJP

   C12M 1/02 20060101ALI20240816BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240816BHJP

   C12M 1/36 20060101ALI20240816BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20240816BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00

C12M1/02 A

C12M1/34 Z

C12M1/36

C12N5/07

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024513803

(86)(22)【出願日】2022-09-01

(85)【翻訳文提出日】2024-04-24

(86)【国際出願番号】 EP2022074315

(87)【国際公開番号】W WO2023031329

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】2029095

(32)【優先日】2021-09-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】506308769

【氏名又は名称】ウニフェルジテイト・ユトレヒト・ホールディング・ベスローテン・フェンノートシャップ

【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｕｔｒｅｃｈｔ Ｈｏｌｄｉｎｇ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ケルスティン・スネーベルハー

(72)【発明者】

【氏名】バルト・スペー

(72)【発明者】

【氏名】ヒレス・セバスティアーン・ファン・ティーンデレン

(72)【発明者】

【氏名】シチェン・イェ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029BB11

4B029CC01

4B029DB01

4B029FA02

4B029FA15

4B029GB03

4B029GB04

4B065AA90X

4B065BC02

4B065BC03

4B065BC08

4B065BC18

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、たとえばオルガノイドの並行培養を可能にする、オルガノイドを培養するための少なくとも２つのリアクターモジュールから構成されるオルガノイドの生産のためのバイオリアクターに関する。本発明は、さらに、バイオリアクターを使用する細胞培養のための方法に関し、より具体的には、バイオリアクターを使用するオルガノイドの拡張および分化のための方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オルガノイドを生産するためのバイオリアクターであって、前記バイオリアクターは、前記オルガノイドの培養のための少なくとも２つのリアクターモジュールから構成され、前記少なくとも２つのリアクターモジュールは、５ｍＬ～４５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬ～３０ｍＬ、より好ましくは１５ｍＬ～２５ｍＬの容積を有する培養容器から構成され、各リアクターモジュールは、
前記リアクターモジュールへおよび前記リアクターモジュールからガス交換を継続するための少なくとも１つのガス交換ポータルと、
連続的混合を行うための、前記リアクターモジュールの内側にある攪拌要素と、
前記攪拌要素と動作可能に接続するモーターと、
培養容器としての前記バイオリアクターを閉じる蓋またはキャップと、
をさらに備え、
前記バイオリアクターは、リアクターモジュール毎の前記攪拌要素の速度を制御するために各リアクターモジュールの前記モーターと通信するマイクロコントローラを備えるバイオリアクター。

【請求項2】

前記バイオリアクターは、前記少なくとも２つのリアクターモジュールを保持するように配置構成された１つまたは複数のホルダーからさらに構成される請求項１に記載のバイオリアクター。

【請求項3】

前記ホルダーは、最大４個のリアクターモジュールを保持するように配置構成される請求項２に記載のバイオリアクター。

【請求項4】

前記少なくとも２つのリアクターモジュールは、少なくとも４個のリアクターモジュール、好ましくは少なくとも６個のリアクターモジュール、より好ましくは少なくとも８個のリアクターモジュール、さらに好ましくは少なくとも２４個のリアクターモジュール、最も好ましくは少なくとも６４個のリアクターモジュールである請求項１から３のいずれか一項に記載のバイオリアクター。

【請求項5】

前記攪拌要素は、前記リアクターモジュールの前記培養容器の全長の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％に対応する長さを有する攪拌棒である請求項１から４のいずれか一項に記載のバイオリアクター。

【請求項6】

前記攪拌要素は、前記攪拌要素の前記長さに沿った複数のフィンまたはフィン構造を備え、前記攪拌要素の前記長さに沿って、前記フィンまたはフィン構造は、１ｍｍ～３０ｍｍ、好ましくは５ｍｍ～２０ｍｍ、より好ましくは１０ｍｍ～１５ｍｍのスペースによって分離される請求項１から５のいずれか一項に記載のバイオリアクター。

【請求項7】

前記複数のフィンまたはフィン構造は、前記攪拌要素の前記長さに沿って少なくとも３個のフィンまたはフィン構造、好ましくは少なくとも５個のフィンまたはフィン構造、より好ましくは少なくとも７個のフィンまたはフィン構造である請求項６に記載のバイオリアクター。

【請求項8】

前記少なくとも２つのリアクターモジュールは、温度、ガス、およびｐＨセンサーからなる群から選択される１つまたは複数のセンサーからさらに構成される請求項１から７のいずれか一項に記載のバイオリアクター。

【請求項9】

前記バイオリアクターは、制御パネル、ＬＣＤディスプレイ、および電源からなる群から選択される１つまたは複数をさらに備える請求項１から８のいずれか一項に記載のバイオリアクター。

【請求項10】

前記細胞培養は、５ｍＬ～４５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬ～３０ｍＬ、より好ましくは１５ｍＬ～２５ｍＬの細胞培養量で行われる請求項１から９のいずれか一項に記載のバイオリアクターを使用する細胞培養のための方法。

【請求項11】

前記細胞培養は、オルガノイド、免疫細胞、抗体、幹細胞、ＥＢ、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、およびスフェロイドまたは細胞凝集塊の培養からなる群から選択される１つまたは複数である請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記オルガノイドは、ヒトオルガノイドである請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記オルガノイドは、肝臓、腸、腎臓、膵臓、肺、脳、脾臓、および心臓オルガノイドからなる群から選択される１つまたは複数のオルガノイド、好ましくは肝臓オルガノイドである請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

オルガノイドの拡張および／または分化のための方法であって、前記方法は、
ａ）請求項１から９のいずれか一項に記載のバイオリアクターを提供するステップと、
ｂ）前記２つ以上のリアクターモジュールにおける前記オルガノイドの前記生産のための培地および細胞を供給するステップと、
ｃ）前記細胞をオルガノイド培養に適した培養条件下で培養し、前記２つ以上のリアクターモジュールの前記モーターを作動させ、リアクターモジュール１つあたりの回転速度を４０ｒｐｍ～１２０ｒｐｍの間に設定することによって、前記細胞培養物を混合するステップと、
ｄ）前記１つまたは複数のリアクターモジュールから前記オルガノイドを回収するステップと、
を含む方法。

【請求項15】

細胞培養開始時のステップｂにおける前記培地および細胞は、５ｍＬ～１５ｍＬ、好ましくは６ｍＬ～１２ｍＬ、より好ましくは７ｍＬ～９ｍＬの細胞培養量を有する請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

オルガノイド培養用の前記細胞の培養は、５ｍＬ～４５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬ～３０ｍＬ、より好ましくは１５ｍＬ～２５ｍＬの細胞培養量で行われる請求項１４または１５に記載の方法。

【請求項17】

オルガノイド培養のための前記細胞の培養は、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１４日間行われ、少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも２５倍、最も好ましくは少なくとも３０倍の平均細胞拡張をもたらす請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記２つ以上のリアクターモジュールにおける前記回転速度は、４０ｒｐｍ～１２０ｒｐｍ、好ましくは５０ｒｐｍ～８０ｒｐｍ、より好ましくは５５ｒｐｍ～７０ｒｐｍ、最も好ましくは６０ｒｐｍ～６５ｒｐｍである請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記回転速度は、前記２つ以上のリアクターモジュールの間で異なる請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記オルガノイドは、肝臓、腸、腎臓、膵臓、肺、脳、脾臓、および心臓オルガノイドからなる群から選択される１つまたは複数のオルガノイド、好ましくは肝臓オルガノイドである請求項１４から１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記オルガノイドは、肝臓オルガノイドであり、前記回転速度は、約５０ｒｐｍ～８０ｒｐｍ、好ましくは約５５ｒｐｍ～６５ｒｐｍ、より好ましくは約６０ｒｐｍである請求項１４から２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記オルガノイドは、腸オルガノイドであり、前記回転速度は、約８０ｒｐｍ～から１２０ｒｐｍ、好ましくは約９５ｒｐｍ～１０５ｒｐｍ、より好ましくは約１００ｒｐｍである請求項１４から２０のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、たとえばオルガノイドの並行培養を可能にする、オルガノイドを培養するための少なくとも２つのリアクターモジュールから構成されるオルガノイドの生産のためのバイオリアクターに関する。本発明は、さらに、バイオリアクターを使用する細胞培養のための方法に関し、より具体的には、バイオリアクターを使用するオルガノイドの拡張および分化のための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

組織工学および再生医療の研究が進むにつれて、細胞を迅速に大量に生産することが求められており、バイオリアクターはこの要求に応えるための重要要件である。ごく最近の、そしてこれからの技術は、オルガノイドの拡張である。オルガノイドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて３Ｄで生産される、「ミニチュア臓器(miniature organ)」であり、これは細胞の種類や機能に関してその元の臓器に類似しており、様々な臓器および生物種から確立され得る。オルガノイドは、３次元培養において自己組織化することができる、組織幹細胞、胚幹細胞、または人工多能性幹細胞に由来する。細胞培養技術を使用するオルガノイドの生産は、幹細胞を２Ｄで培養し分化させることから臓器の複雑な３Ｄ構造の発達を可能にする３Ｄ培養条件へのシフトから始まった。したがって、オルガノイドは、臓器の発生および病気を研究するためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして有望視されている。オルガノイドは、また、実験室において、すなわち、患者のｉｎ ｖｉｖｏ臓器／細胞によく似たｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして、（個別化）治療を研究する、たとえば将来の治療法の有効性または毒性を試験するためにも使用される。

【0003】

オルガノイド形成は、ラミニンを豊富に含む細胞外マトリックスヒドロゲル（主にＭａｔｒｉｇｅｌまたはＣｕｌｔｒｅｘ ＢＭＥ）を使用して、幹細胞または前駆細胞を３Ｄ環境で培養し包埋することによって開始される。成長因子を豊富に含む培地とともに、これは、細胞の増殖および３Ｄオルガノイドへの自己組織化を促進する。ほとんどのオルガノイド培養は、細胞培養プレート内のヒドロゲル液滴中にオルガノイドを播種することによって、３Ｄ静置細胞培養（3D static cell culture）を使用して実行される。しかしながら、この標準的な静置オルガノイド培養は、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌの液滴中に包埋することおよび健全な培養を維持するために細胞培養を毎週継代することなど、大量の材料、労力、および時間を必要とする煩わしいプロセスである。さらに、この静置培養法は、結果として、有毒な廃棄代謝物の局部的蓄積、さらには栄養物および酸素の不均一分布を引き起こし、その結果、個別のオルガノイド間の不均一性が増大し、次善の結果に至る。

【0004】

静置細胞培養に次いで、スピニングバイオリアクター（spinning bioreactor）またはスピナーフラスコが、オルガノイド細胞培養および３Ｄオルガノイドの形成で望まれているように、大量の細胞を迅速に生産する上で有望である。これらのバイオリアクターは、勾配形成（たとえば、ｐＨ、栄養物、代謝物、溶存酸素）の最小化、酸素および栄養物の輸送の増大、細胞沈殿の防止を含む、したがって静置培養システムの本質的な制限を克服する、静置細胞培養に勝るいくつかの利点を提供する。しかしながら、現在のバイオリアクターは、大量の接種（少なくとも５０ｍＬ～２００ｍＬ）を必要とし、したがって、多数の細胞も必要とし、小規模な実験への適用には不適当であり高価であり、複数の条件を並行して実施するのに理想的でない。さらに、市販のスピナーフラスコは、そのサイズの面で、また攪拌子を回転させるための磁気攪拌プレートが必要であることから、インキュベーターの広いスペースを必要とする。細胞培養に使用されている標準サイズのインキュベーターでは、これらのバイオリアクターのうち６個～７個しか同時に細胞培養に使用できない。これは、複数の条件の試験、異種間変異の試験、および並行試験を困難にする。

【0005】

上記を考慮すると、当技術分野では、少量の接種量を使用して、オルガノイドの迅速な、効率的な、費用効果の高い生産のためのバイオリアクターが必要とされており、このリアクターは、細胞培養中の勾配形成の改善された最小化、酸素および栄養物の改善された輸送を提供し、その結果、公知の細胞培養システムに比べて細胞およびオルガノイドの生産のより迅速な拡張を行う。それに加えて、当技術分野では、小規模な、費用効果の高い、オルガノイドの生産のための方法が必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、とりわけ、当技術分野における上記の必要性に対処することである。本発明の目的は、とりわけ、付属の請求項において概要が述べられている本発明によって達成される。

【課題を解決するための手段】

【0007】

特に、上記の目的は、目的はとりわけ、第１の態様により、本発明によって、オルガノイドの生産のためのバイオリアクターによって達成され、少なくとも２つのリアクターモジュールは、５ｍＬ～４５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬ～３０ｍＬ、より好ましくは１５ｍＬ～２５ｍＬの容積を有する培養容器から構成され、バイオリアクターは、前記オルガノイドの培養のための少なくとも２つのリアクターモジュールから構成され、各リアクターモジュールは、
リアクターモジュールへおよびリアクターモジュールからガス交換を継続するための少なくとも１つのガス交換ポータル(gas exchange portal)と、
連続的混合を行うための、リアクターモジュールの内側にある攪拌要素と、
攪拌要素と動作可能に接続するモーターと、
培養容器としてのバイオリアクターを閉じる蓋またはキャップと、
を備え、
バイオリアクターは、リアクターモジュール毎の攪拌要素の速度を制御するために各リアクターモジュールの前記モーターと通信するマイクロコントローラを備える。各リアクターモジュールは、電気エンジンとつながっている攪拌棒と、培養容器としてのバイオリアクターを閉じる蓋またはキャップと、を備える。少なくとも１つのガス交換ポータルは、リアクターモジュール内の細胞培養物の微生物感染を防止するためのフィルター（たとえば０．２２μｍのフィルター）を備え得る。

【0008】

本発明のバイオリアクターは、最適なオルガノイド生産のために、モジュールの各々において回転を継続的に行う。リアクターモジュールは、培地、培養用の細胞／オルガノイド、および攪拌要素を保持する容器である。各リアクターモジュールは、攪拌要素と、スピニングバイオリアクターのマイクロコントローラによって制御されるモーターと、を備えているので、リアクターモジュール毎に、回転または混合の速度が調整され得る。培地とバイオマスは常に移動し、細胞培養ではガス交換がなされる。スピニングバイオリアクターのリアクターモジュールの各々は、異なる培地を備え、異なる試験条件下、すなわちオルガノイドまたは細胞を培養する単一の実験もしくは生産サイクル内で運転され得る。これは、複数の条件を試験すること、および異種間変異を試験することを可能にする。オルガノイドに適合させたサイズを考慮すると、異なる条件を並行して試験する方が安価であり容易である。したがって、本発明のスピニングバイオリアクターは、細胞の最後に影響を及ぼす物理化学的因子（酸素、ｐＨなど）、培地条件、最適回転速度など、より大きなサイズのバイオリアクターに対するプロトコルを最適化するためのモデルまたは試験バイオリアクターとして使用され得る。栄養物濃度、ｐＨ、溶存ガス（Ｏ_２、ＣＯ_２）などの、バイオリアクターのリアクターモジュール内の条件は、オルガノイドの増殖および機能性に影響を及ぼす。リアクターモジュールの各々内の攪拌機によって実行される回転または混合は、酸素および栄養物へのすべてのオルガノイドの均一な曝露を円滑にする、リアクター内の循環流をもたらす。ガスは、リアクターモジュールの各々におけるガス交換ポータルを介して受動的に交換される。

【0009】

さらに、本発明のバイオリアクターは、オルガノイドの拡張および分化に適合されている。このバイオリアクターは、５ｍＬの比較的少ない開始容積（たとえば１×１０^４個～１×１０^７個の細胞を含む）を必要とする。これは、結局、少なくとも３０ｍＬの開始容積を必要とするスピナーフラスコと比較して培地および細胞接種量を少なくとも８０％削減することになり、したがって、より少ない細胞およびより多くの条件を必要とする実験に対してオルガノイドの拡張および分化を容易にする。大容量のバイオリアクターと比較して、プロトコルを最適化するのは安価であり、サイズが小さいので、１つのインキュベーターで複数の条件（約６４個のバイオリアクター）を実施することが可能である。さらに、このシステムは、マイクロ制御されており、非常に人間工学的なものとなっている。このサイズの小さい、モジュール式スピニングバイオリアクターは複数のリアクターモジュールからなり、オルガノイドを培養するコストを大幅に削減する。

【0010】

スピニングバイオリアクターは、大量の細胞を迅速に生産することに関して有望である。バイオリアクターは、勾配形成（たとえば、ｐＨ、栄養物、代謝物、溶存酸素）の最小化、酸素および栄養物の輸送の増大、細胞沈殿の防止を含む、したがって静置培養システムの本質的な制限を克服するいくつかの利点を提供する。一例として、出願人は、出願人のグループにおいて、市販のスピナーフラスコでヒト肝臓オルガノイドを大量生産するためのプロトコルを確立した。スピナーフラスコでは、オルガノイドは急速に増殖し、静置培養（ＳＣ）での６倍の拡張と比較して、２週間後には平均４０倍の細胞拡張に達した。本発明のバイオリアクターは、ヒトオルガノイドの迅速な生産に対して効率的である。結果は、スピニングバイオリアクターは上皮表現型を損なうことなく２週間以内に肝臓オルガノイドの３０倍～４２倍の拡張を達成することができることを示している。一方、静置培養では同じ条件下で１０倍～１３倍の拡張のみが観察された。さらに、スピニングバイオリアクターでの急速拡張後、オルガノイドは、機能的な肝細胞様細胞に分化され得、分化の効率は静置培養条件よりも高い。

【0011】

好ましい一実施形態によれば、本発明は、バイオリアクターが、少なくとも２つのリアクターモジュールを保持するように配置構成された１つまたは複数のホルダーからなるバイオリアクターに関する。ホルダーは、好ましくは、複数のリアクターモジュールを保持するように配置構成され、より多くのモジュールを追加することによって拡張され得る。複数のリアクターモジュールを保持するためのホルダーを使用することによって、オルガノイド細胞培養物は、ホルダー内に並べて、またはクラスター状に置かれたときに、より容易に視覚的に観察され得る。

【0012】

別の好ましい実施形態によれば、本発明は、バイオリアクターに関するものであり、少なくとも２つのリアクターモジュールは、少なくとも４個のリアクターモジュール、好ましくは少なくとも６個のリアクターモジュール、より好ましくは少なくとも８個のリアクターモジュール、さらに好ましくは少なくとも２４個のリアクターモジュール、最も好ましくは少なくとも６４個のリアクターモジュールである。

【0013】

別の好ましい実施形態によれば、本発明は、バイオリアクターに関するものであり、攪拌要素は、リアクターモジュールの培養容器の全長の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％に対応する長さを有する攪拌棒である、攪拌棒は、培養容器の底に接触するべきではない。攪拌要素は、リアクターモジュールの各々の中のモーターに動作可能に接続され、各反応モジュールの攪拌の速度を調節する。攪拌機は、リアクターモジュールの培養容器の全長よりも小さい全長を有し、それによって攪拌要素が培養容器の底に触れないことを確実にする。これは、培地全体が攪拌されるが、攪拌棒がリアクターモジュールの培養容器の底に触れた場合に起こるであろう「細胞の破砕」が起こらないことを確実にする。本発明のバイオリアクターは、バイオリアクターの内側の回転、運動、または攪拌を誘発するためにバイオリアクター内に磁気プレートを必要とせず、設計を単純化し、このバイオリアクターは市販のバイオリアクターに比べて安価になる。

【0014】

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、バイオリアクターに関するものであり、攪拌要素は、攪拌要素の長さに沿って複数のフィンまたはフィン構造を備え、攪拌要素の長さに沿って、前記フィンまたはフィン構造が、５ｍｍ～３０ｍｍ、好ましくは８ｍｍ～２０ｍｍ、より好ましくは１０ｍｍ～１５ｍｍ、最も好ましくは５ｍｍ～１５ｍｍのスペースによって分離されている。攪拌要素は、１つまたは複数のフィン（またはウィング）またはフィン構造を備え、リアクターモジュールの内側に流れおよび揚力を発生させ、組織培養物が常に懸濁状態にあるようにする。フィンは、攪拌要素の長さに沿ったフィン構造にも関するものとしてよく、たとえば、１つのフィン構造は、プロペラのような１つのフィン構造を形成する３個～４個のフィンからなる。本実施形態における攪拌要素は、その長さに沿って複数のフィン構造（プロペラのような構造を形成する）を備える。以前のバイオリアクターでは、ときには、バイオリアクター内で細胞の「凝固」が観察されたが、これはオルガノイドの拡張を妨げる。これは、攪拌棒の設計が最適でないことに起因する。出願人は、したがって、本発明のスピニングバイオリアクターにおけるオルガノイドの拡張および分化を最適化するように攪拌棒のレイアウトを設計した。実験は、すべてのウィングが互いに融合され、ウィングの間のスペースで凝固が起こらないような設計が、オルガノイド培養物中で良好な結果をもたらすことを示している。攪拌要素が、攪拌要素の長さに沿って、各ウィングの間の小さな（少なくとも５ｍｍ～１５ｍｍの）スペースによって区切られた棒の長さに沿った複数のウィングまたはフィン構造（櫛形設計のような）を備える、別の実施形態は、リアクターモジュールの内側で移動するための改善されたスペースを有するオルガノイド培養物のための改善された、より最適な環境を提供し、また凝固の減少ももたらした。攪拌要素の長さに沿ってフィンを分離するスペースは、培養物中のオルガノイドの細胞および構造の破壊を防ぐために５ｍｍ未満であるべきである。これらの結果は、攪拌要素の長さに沿って互いから５ｍｍの距離のところにある複数のウィングを有する設計は、結果として、最も均質な懸濁液を形成し、また最良のオルガノイド拡張をもたらすことを示している。

【0015】

好ましい一実施形態によれば、本発明は、バイオリアクターに関するものであり、複数のフィンは、攪拌要素の長さに沿って少なくとも３個のフィンまたはフィン構造、好ましくは少なくとも５個のフィンまたはフィン構造、より好ましくは少なくとも７個のフィンまたはフィン構造である。フィンは、攪拌要素の長さに沿ったフィン構造にも関するものとしてよく、たとえば、１つのフィン構造は、プロペラのような１つのフィン構造を形成する３個～４個のフィンからなる。

【0016】

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、バイオリアクターに関するものであり、少なくとも２つのリアクターモジュールは、温度、ガス、およびｐＨセンサーからなる群から選択される１つまたは複数のセンサーからさらに構成される。モジュールは、ｐＨ、温度、およびガスセンサーをさらに備え、リアクターモジュール毎の細胞培養のための情報を提供し、最適条件を調節する。

【0017】

別の好ましい実施形態によれば、本発明は、バイオリアクターに関するものであり、スピニングバイオリアクターは、制御パネル、ＬＣＤディスプレイ、および電源からなる群から選択される１つまたは複数をさらに備える。

【0018】

本発明は、第２の態様によれば、上で示されているバイオリアクターを使用する細胞培養のための方法に関し、細胞培養は、５ｍＬ～４５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬ～３０ｍＬ、より好ましくは１５ｍＬ～２５ｍＬの細胞培養量で行われる。本発明の方法は、小規模なコスト効果の高いオルガノイドの生産方法を提供する。バイオリアクターは、肝臓、腸、腎臓、膵臓、肺、脳、脾臓、および心臓オルガノイドなどの臓器および組織由来の様々なオルガノイド、好ましくはヒトオルガノイド、より好ましくは肝臓オルガノイドに対して応用され得る。また、バイオリアクターは、免疫細胞、ＭＳＣ、ＥＢ、抗体、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、およびスフェロイドまたは細胞凝集塊などの、攪拌懸濁液下で培養され得、迅速に生産される必要のある、従来の細胞培養にも使用され得る。

【0019】

本発明は、さらなる態様によれば、オルガノイドの拡張および／または分化のための方法に関し、この方法は、
ａ）本発明によるバイオリアクターを提供するステップと、
ｂ）２つ以上のリアクターモジュールでオルガノイドを生産するための培地および細胞を供給するステップと、
ｃ）細胞をオルガノイド培養に適した培養条件下で培養し、２つ以上のリアクターモジュールのモーターを作動させ、リアクターモジュール１つあたりの回転速度を４０ｒｐｍ～１２０ｒｐｍの間に設定することによって、細胞培養物を混合するステップと、
ｄ）１つまたは複数のリアクターモジュールからオルガノイドを回収するステップと、
を含む。

【0020】

別の好ましい実施形態によれば、本発明は、オルガノイドの拡張および／または分化のための方法に関し、オルガノイド培養用の細胞の培養は、５ｍＬ～４５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬ～３０ｍＬ、より好ましくは１５ｍＬ～２５ｍＬの細胞培養量で行われる。好ましくは、オルガノイド培養のための細胞の培養は、本発明のバイオリアクターを使用して小規模な費用効果の高い、オルガノイドの生産を行うために小さな総細胞培養量で行われる。

【0021】

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、オルガノイドの拡張および／または分化のための方法に関し、細胞培養開始時のステップｂにおける培地および細胞は、５ｍＬ～１５ｍＬ、好ましくは６ｍＬ～１２ｍＬ、より好ましくは７ｍＬ～９ｍＬの細胞培養量を有する。リアクターおよび攪拌機の設計に起因して、小さな開始容積のみが、本発明の方法によりオルガノイドを成功裏に拡張し分化させるために必要である。

【0022】

好ましい一実施形態によれば、本発明は、オルガノイドの拡張および／または分化のための方法に関し、オルガノイド培養のために細胞を培養することは、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１４日間行われ、少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも２５倍、最も好ましくは少なくとも３０倍の平均細胞拡張をもたらす。本発明のバイオリアクターを使用する、本発明の方法は、ヒトオルガノイドの迅速な生産のために効率的である。結果は、本発明のバイオリアクターは上皮表現型を損なうことなく２週間以内に肝臓オルガノイドの３０倍～４２倍の拡張を達成することができることを示している。一方、静置培養では同じ条件下で１０倍～１３倍の拡張のみが観察された。さらに、結果は、このバイオリアクターでの急速拡張後、オルガノイドは、機能的な肝細胞様細胞に分化され得、分化の効率は静置培養条件よりも高いことを示している。

【0023】

好ましい一実施形態によれば、本発明は、オルガノイドの拡張および／または分化のための方法に関し、２つ以上のリアクターモジュールにおける回転速度は、４０ｒｐｍ～１２０ｒｐｍ、好ましくは５０ｒｐｍ～８０ｒｐｍ、より好ましくは５５ｒｐｍ～７０ｒｐｍ、最も好ましくは６０ｒｐｍ～６５ｒｐｍである。結果は、本発明のバイオリアクターを使用するオルガノイド生産における細胞数の最も高い倍率変化は、ヒト肝臓オルガノイドの場合にＲＰ６０で起こることを示しており、これはバイオリアクター内での肝臓オルガノイド拡張に対して最適な回転数であることを示していた。異なる組織からのオルガノイドは、異なる回転速度最適値を有するが、一般に、本発明のバイオリアクターを使用した場合には４０ｒｐｍ～１２０ｒｐｍの間にある。

【0024】

別の好ましい実施形態によれば、本発明は、オルガノイドの拡張および／または分化のための方法に関し、回転速度は、２つ以上のリアクターモジュール間で異なる。バイオリアクターは、いくつかのリアクターモジュールから構成されるので、これらのモジュールは、各々、攪拌速度などの異なる細胞培養条件の下で運転され得る。

【0025】

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、オルガノイドの拡張および分化のための方法に関し、オルガノイドは、肝臓、腸、腎臓、膵臓、肺、脳、脾臓、および心臓オルガノイドからなる群から選択される１つまたは複数であり、好ましくは肝臓オルガノイドである。

【0026】

別の好ましい実施形態によれば、本発明は、オルガノイドの拡張および／または分化のための方法に関し、オルガノイドは、肝臓オルガノイドであり、回転速度は、約５０ｒｐｍ～８０ｒｐｍ、好ましくは約５５ｒｐｍ～６５ｒｐｍ、より好ましくは約６０ｒｐｍである。実験は、肝臓オルガノイド拡張は６０ｒｐｍで最も大きかったことを示している。

【0027】

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、オルガノイドの拡張のための方法に関し、オルガノイドは、腸オルガノイドであり、回転速度は、約８０ｒｐｍ～１２０ｒｐｍ、好ましくは約９５ｒｐｍ～１０５ｒｐｍ、より好ましくは約１００ｒｐｍである。腸オルガノイドについては、拡張率は、１００ｒｐｍで最も高く、２週間以内に、１００ｒｐｍで培養された腸オルガノイドは、静置培養（ＳＣ）における約４０倍の拡張と比較して、１４０倍の拡張を達成した。これらの結果から、本発明のバイオリアクターにおける腸オルガノイド拡張に最適な速度は約１００ｒｐｍであることが確認される。

【0028】

本発明は、以下の実施例および図でさらに詳細に説明される。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】本発明によるオルガノイド生産のためのリアクターモジュール（１）の概略を示す図であって、リアクターモジュールは、電気エンジン（３）とつながっている攪拌要素（２）と、培養容器としてのリアクターモジュールを閉じる蓋またはキャップ（４）と、を備え、リアクターモジュール（１）は、リアクターモジュール（１）へおよびリアクターモジュール（１）からガス交換を継続するためのポータル（５）をさらに備え、リアクターモジュールは、培地、細胞／有機体培養物を保持し、攪拌要素（２）を保持するために、培養容器（６）として標準的な５０ｍＬコニカルチューブから構成され得、攪拌要素（２）、たとえば攪拌棒は、ステンレス鋼から作ることができ、異なる回転速度で動作するように個別バイオリアクターに電力を供給することができる、マイクロコントローラ、たとえばオープンソース電子プロトタイピングプラットフォーム（Ａｒｄｕｉｎｏ）と組み合わせた高トルク低速電気エンジンによって動力を供給され、攪拌要素（２）は、リアクターモジュールの培養容器（６）の底に接触せず、攪拌機は、培養容器（６）の全長よりも小さい全長を有し、それによって攪拌要素はリアクターモジュールの培養容器の底に触れないことを確実にし、これは、すべての培地が攪拌されるが、細胞が「破砕」されないことを確実にし、攪拌要素（２）は、１つまたは複数のフィン（８）（またはウィング）を備え、フィンはリアクターモジュールの内側に流れおよび揚力を発生させ、組織培養物が常に懸濁状態にあるようにし、攪拌要素（２）は、リアクターモジュール（１）の各々の中のモーター（３）に動作可能に接続され、各反応モジュール内の攪拌の速度を調節する、図である。

【図2】本発明のこの実施形態において最大４つのリアクターモジュール（１）に適合するホルダー（７）を示す図であって、これらリアクターモジュールはすべて別個のバイオリアクターとして機能するものとしてよく、小規模であり、複数のホルダーを使用するモジュール式構造物であることに起因して、たとえば、単一のインキュベーターで少なくとも６４個のリアクターモジュール（ホルダー１６個を４つ）を運転できるバイオリアクターが提供され得る、図である。

【図3】フィン（８）の数およびサイズに関して攪拌要素（２）上の複数のバリエーション（Ｒ１～Ｒ４、それぞれ図３Ａ～図３Ｄ）を示す図であって、攪拌要素（２）は、１つまたは複数のフィン（８）またはフィン構造（またはウィング）を備え、フィンまたはフィン構造はリアクターモジュールの内側に流れおよび揚力を発生させ、組織培養物が常に懸濁状態にあるようにし、バイオリアクター内でのオルガノイドの培養の問題は、オルガノイドの拡張を妨げる細胞の凝固であり、したがって、本発明のスピニングバイオリアクターにおけるオルガノイドの拡張および分化を最適化するように攪拌棒のレイアウト（２）を設計したが、これは図３Ａ～図３Ｄに示されており、実験は、すべてのウィングが互いに融合され１つのフィン構造（図３Ｂ）を形成し、ウィングの間のスペースで凝固が生じ得ないようなＲ２設計が、オルガノイド培養物中で良好な結果をもたらすことを示しており、攪拌要素が攪拌要素の長さ方向に沿って、各ウィングまたはフィン構造の間の小さな（少なくとも５ｍｍ～１５ｍｍ）スペースで分離された棒の長さに沿った複数のフィンまたはフィン構造（各フィン構造が攪拌要素の長さ方向に沿って一種のプロペラを形成する櫛形設計のような）を備える他の実施形態（Ｒ１およびＲ４、それぞれ図３Ａおよび図３Ｄ）は、オルガノイド培養物に対してなおいっそう改善された、より最適な環境を提供しており、Ｒ４攪拌機は、最も改善された結果をもたらし、リアクター容器の内側で細胞が移動するための改善されたスペースを有し、また凝固が減少した、ことを示す図である。

【図4A】本発明のバイオリアクターと静置培養（ＳＣ）におけるオルガノイド拡張の比較を示し、さらに、異なる攪拌要素Ｒ１～Ｒ４が本発明のバイオリアクターで試験された、図であって、ＳＣおよび異なる攪拌棒（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４）を用いた本発明のバイオリアクターにおいて拡張されたオルガノイドの形態学的軌跡を示し、明視野顕微鏡写真は、単一細胞播種後の４つの異なる時点（Ｄ＝日、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４）で撮影されており、管状構造（Ｄ１０とＤ１４の右側）はＤ１０で観察されており、スケールバー＝１，０００μｍであり、Ｒ４は２週間後に最適なオルガノイド拡張をもたらした、ことを示す図である。

【図4B】本発明のバイオリアクターと静置培養（ＳＣ）におけるオルガノイド拡張の比較を示し、さらに、異なる攪拌要素Ｒ１～Ｒ４は本発明のバイオリアクターで試験された、図であって、静置培養（ＳＣ）に関する本発明のバイオリアクター内の細胞増殖の倍率変化を示す図である。

【図5A】本発明のバイオリアクターにおけるヒト肝臓オルガノイドの拡張および特徴付けを示す図であって、展開培地（ＥＭ）内でＳＣ（静置培養）およびＲＰ（本発明のバイオリアクター）において拡張されたオルガノイドの形態を示し、写真は単一細胞播種後２日目、７日目、および１４日目に撮影された、図である。

【図5B】本発明のバイオリアクターにおけるヒト肝臓オルガノイドの拡張および特性を示す図であって、細胞増殖の成長曲線を示し、静置培養および本発明のバイオリアクター内で拡張されたオルガノイドの比較が、０日目（Ｄ０）に関する倍率変化で示され、数は異なるオルガノイド供与体を表す、図である。

【図5C】本発明のバイオリアクターにおけるヒト肝臓オルガノイドの拡張および特性を示す図であって、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）で特徴付けられたｍＲＮＡ発現を示す図である。

【図5D】本発明のバイオリアクターにおけるヒト肝臓オルガノイドの拡張および特性を示す図であって、免疫蛍光（ＩＦ）染色によって検出された上皮および増殖マーカー、ＥＣＡＤ、Ｋｉ６７、ＤＡＰＩ、Ｋ１９およびＰＣＮＡを示す図である。

【図6A】本発明のバイオリアクターにおいて分化されたヒト肝臓オルガノイドの特徴付けを示す図であって、静的制御（ＳＣ）およびバイオリアクター（ＲＰ）において分化されたオルガノイドの形態を示し、明視野（ＢＦ）写真は分化から８日後に撮影された、図である。

【図6B】本発明のバイオリアクターにおいて分化されたヒト肝臓オルガノイドの特徴付けを示す図であって、ｑＲＴ－ＰＣＲで特徴付けられたｍＲＮＡ発現を示す図である。

【図6C】本発明のバイオリアクターにおいて分化されたヒト肝臓オルガノイドの特徴付けを示す図であって、ＩＦ染色によって検出された上皮性、増殖性、および機能性肝細胞マーカーを示す図である。

【図6D】本発明のバイオリアクターにおいて分化されたヒト肝臓オルガノイドの特徴付けを示す図であって、ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）輸送アッセイの結果を示す図である。

【図7A】本発明のバイオリアクターにおけるヒト肝臓オルガノイド拡張に対する最適な回転速度を示す図であって、４０ｒｐｍ、６０ｒｐｍ、８０ｒｐｍ、１００ｒｐｍの４つの回転速度で静置培養および本発明のバイオリアクターで拡張されたオルガノイドの形態を示し、明視野（ＢＦ）写真は播種後９日目と１４日目に撮影された、図である。

【図7B】本発明のバイオリアクターにおけるヒト肝臓オルガノイド拡張に対する最適な回転速度を示す図であって、細胞増殖の成長曲線を示し、異なる速度で静置培養およびバイオリアクター内で拡張されたオルガノイドの比較が、０日目（Ｄ０）に関する倍率変化で示されている、図である。

【図8A】本発明のバイオリアクターにおけるヒト腸オルガノイド拡張に対する最適な回転速度を示す図であって、４０ｒｐｍ、６０ｒｐｍ、８０ｒｐｍ、１００ｒｐｍの４つの回転速度で静置培養および本発明のバイオリアクターで拡張されたオルガノイドの形態を示し、明視野（ＢＦ）写真は播種後４日目、７日目、１１日目、および１４日目に撮影された、図である。

【図8B】本発明のバイオリアクターにおけるヒト腸オルガノイド拡張に対する最適な回転速度示す図であって、細胞増殖曲線を示し、異なる速度で静置培養およびバイオリアクター内で拡張されたオルガノイドの比較が、０日目（Ｄ０）に関する倍率変化で示されている、図である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

（実施例）
（実施例１）
スピニングバイオリアクター内でのヒト肝臓オルガノイドの迅速な生産および拡張
本発明のバイオリアクター（ＲＰ）内でのオルガノイドの拡張を静置培養（ＳＣ）と比較するために、出願人は、ヒト肝臓オルガノイド由来の単一細胞をＳＣおよびＲＰの両方に播種し、オルガノイド拡張培地（ＥＭ）で２週間培養した。バイオリアクターは、１０％ｖ／ｖのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む５ｍＬのＥＭ培地に５０万個の細胞を接種された。単細胞播種に起因して、１０ｍＭのＹ－２７６３２（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤）が、培養の最初の週に培地に添加された。回転速度は、８０ｒｐｍに設定された。すべての培養物は、３７℃で、９５％の空気および５％のＣＯ_２の加湿雰囲気中に保たれた。

【0031】

２－３日毎に新しい培地がバイオリアクターに添加された。ＥＭは、１％（ｖ／ｖ）のペニシリン－ストレプトマイシン（アイルランド、ダブリン所在、Ｇｉｂｃｏ）、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ビタミンＡを含まない２％（ｖ／ｖ）のＢ２７サプリメント（米国カリフォルニア州カールズバッド所在、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭのニコチンアミド（米国ミズーリ州セントルイス所在、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１．２５ｍＭのＮ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％（ｖ／ｖ）のＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１ならし培地（Ｒｓｐｏ１－Ｆｃ発現細胞株はＣａｌｖｉｎ Ｊ． Ｋｕｏからの譲渡であった）、１０μＭのフォルスコリン（ＦＳＫ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５μＭのＡ８３－０１（トランスフォーミング成長因子ｂ阻害剤、英国ブリストル所在、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（米国カリフォルニア州カールズバッド所在、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（米国ニュージャージー州ロッキーヒル所在、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．１μｇ／ｍＬのＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および１０ｎＭの組み換えヒト（Ｌｅｕ１５）－ガストリンＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補ったＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（アイルランド、ダブリン所在、Ｇｉｂｃｏ）からなるものであった。

【0032】

光学顕微鏡法では、ＳＣとＲＰの両方で、培養開始の最初の２日以内に単一細胞が成長し、オルガノイドを形成した。１４日目に、ＲＰにおけるオルガノイドは、ＳＣにおける約１ｍｍと比較して最大４ｍｍの直径に達した（図５Ａ）。細胞増殖解析は、８日目および１５日目に、ＲＰから細胞懸濁液の少量のアリコートを採取し、オルガノイドをトリプシン処理して単一細胞にし、その後単一細胞を計数することによって行った。出願人の結果は、２週間でＲＰにおけるオルガノイドがＳＣにおける約１３倍の拡張に比べて平均４２倍の拡張を達成していることを示した（図５Ｂ）。

【0033】

ＳＣと比較して、ＲＰにおけるオルガノイドは、幹細胞マーカー（ＬＧＲ５およびＳＯＸ９）の低い発現を示していたが、増殖マーカーＫｉ６７の発現レベルは高く、幹細胞表現型は両方の条件で保持されたが、ＲＰでは、幹細胞と増殖性の高い前駆細胞との細胞比率は、前駆細胞表現型に向けてシフトしていることを示している。ＲＰとＳＣの両方の条件は、機能的肝細胞マーカーであるＡＬＢおよびＣＹＰ３Ａ４の発現をほとんど示さなかったが（図５Ｃ）、これは、オルガノイドが拡張培地中では未成熟で増殖的な表現型を保持するので、予想された通りであった。

【0034】

免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果、増殖マーカーＫｉ６７およびＰＣＮＡの高発現によって示されるように、上皮性（ＥＣＡＤ）および高増殖性表現型が確認された（図５Ｄ）。

【0035】

総合すると、ＲＰバイオリアクターは、生物学的肝臓前駆細胞表現型を損なうことなく肝臓オルガノイドを迅速に拡張するのに適している。

【0036】

さらに、上で説明されているのと似た追加の実験が実行され、様々な攪拌要素が、本発明のバイオリアクターと静置培養（ＳＣ）におけるオルガノイド拡張の比較について試験された。４つの異なる攪拌要素Ｒ１～Ｒ４は、本発明のバイオリアクターにおいて試験され、攪拌棒は、ウィングの設計、ウィングの数、および攪拌要素の各ウィングセクションの間の隙間が異なる（Ｒ１～Ｒ４攪拌機の間の設計の違いについては図３を参照）。図４Ａは、ＳＣおよび異なる攪拌棒（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４）を用いた本発明のバイオリアクターにおいて拡張されたオルガノイドの形態学的軌跡を示している。明視野顕微鏡写真は、単一細胞播種後の４つの異なる時点（Ｄ＝日、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４）で撮影された。０日目～８日目までは、本発明のバイオリアクターで使用されたＲ１とＲ４の設計の間に大きな違いは観察されなかった。しかしながら、９日目以降、Ｒ４設計を使用する拡張は、他の設計と比較して有意な改善を示した。管状構造（図４ＡのＤ１０とＤ１４における右の写真）はＤ１０以降で観察された。予想通り、ＳＣでは、管状形成も有意なオルガノイド拡張も観察されなかった。本発明のバイオリアクターと組み合わせたＲ４設計は、２週間後に最適なオルガノイド拡張をもたらした。図４Ｂは、静置培養（ＳＣ）に関する本発明のバイオリアクター内の細胞増殖の倍率変化を示している。

【0037】

（実施例２）
バイオリアクター内でのヒト肝臓オルガノイドの分化
オルガノイド拡張に加えて、肝細胞様細胞（ＨＬＣ）への幹細胞オルガノイドの機能分化も試験した。肝分化を誘導するため、肝臓オルガノイドは、２５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－７（米国ニュージャージー州ロッキーヒル所在、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）をＥＭに添加して２日間プライミングされ、その後、培地は分化培地（ＤＭ）に交換された。ＤＭは、１％（ｖ／ｖ）のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１．２５ｍＭのＮ－アセチルシステイン（米国ミズーリ州セントルイス所在、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ビタミンＡを含まない２％（ｖ／ｖ）のＢ２７サプリメント（米国カリフォルニア州カールズバッド所在、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｎＭの組み換えヒト（Ｌｅｕ１５）－ガストリンＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（米国ニュージャージー州ロッキーヒル所在、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５００ｎＭのＡ８３－０１（英国ブリストル所在、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１０ｕＭのＤＡＰＴ（ドイツ、ミュンヘン所在、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、２５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、３０μＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補ったＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（アイルランド、ダブリン所在、Ｇｉｂｃｏ）からなるものであった。分化培地は２日～３日毎に交換された。分化培地（ＤＭ）で８日間培養した後、オルガノイドは、ＳＣおよびＲＰの両方で厚い折りたたまれた形態を有していた（図６Ａ）。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）による遺伝子発現解析（ｍＲＮＡ解析）は、分化後、幹細胞マーカーＬＧＲ５および増殖マーカーＫｉ６７は発現量が低下し、肝細胞マーカーＡＬＢとＣＹＰ３Ａ４は発現量が上昇した（図６Ｂ）。管マーカーであるＫ１９とＳＯＸ９は維持された。遺伝子（ｍＲＮＡ）発現の結果は、ＩＦ染色によって検証され、特に肝細胞特異的タンパク質ＡＬＢは、分化したオルガノイドにおいて検出された（図６Ｃ）。

【0038】

さらに、生成されたＨＬＣが機能的であることを確認するために、ローダミン－１２３輸送アッセイが実施された。ローダミン－１２３は、多剤耐性遺伝子１（ＭＤＲ１）によって肝細胞から活発に分泌され得る蛍光化合物である。出願人は、ＳＣおよびＲＰの両方に対するオルガノイドの内腔の内側の蛍光蓄積を観察した（図６Ｄ）。対照的に、オルガノイドが競合的ＭＤＲ１阻害剤ベラパミルで前処理されていたときに、ローダミン－１２３は、細胞の細胞質内に保持され、それによりローダミン－１２３のＭＤＲ１特異的輸送を確認した（図６Ｄ）。

【0039】

要約すると、バイオリアクター内でオルガノイドを最初に迅速に拡張した後、これらは機能的ＨＬＣに成功裏に分化させることができた。

【0040】

（実施例３）
バイオリアクター内でのヒト肝臓オルガノイドに対する回転速度の最適化
すべての初期バイオリアクター実験は、８０ｒｐｍの回転速度で実行されていた。その後の実験でも、出願人は、バイオリアクター（ＲＰ）の最適な回転速度を検証し続けた。最初の実験では、１人のドナーの肝臓オルガノイドを用いて、４０ｒｐｍ（ＲＰ４０）、６０ｒｐｍ（ＲＰ６０）、８０ｒｐｍ（ＲＰ８０）、および１００ｒｐｍ（ＲＰ１００）の４つの回転速度が試験された。

【0041】

播種後９日目および１４日目に、それぞれ、代表的な写真が撮影され、細胞数が計数された。明視野写真は、ＲＰ６０およびＲＰ８０が、９日目にはＳＣと比べて同等か、またはそれ以上であることを示していた。１４日目には、ＲＰ６０は、他のすべての条件と比較して最も良好な拡張を示した（図７Ａ）。興味深いことに、ＲＰ条件下では、いくつかのオルガノイドが管状構造として伸長しているように見え、これはＲＰ条件がより優れた分化および組織形成に有望である可能性が示している。拡張は、細胞計数で確認され、細胞数の倍率変化は、形態と一致しており、ＲＰ６０で最も高い倍率変化を示した（図７Ｂ）。

【0042】

（実施例４）
バイオリアクター内でのヒト腸オルガノイドに対する回転速度の最適化
さらなる実験が、バイオリアクター（ＲＰ）でのヒト腸オルガノイドの拡張に最適な回転速度を決定するため実行された。１人のドナーの腸オルガノイドを用いて、４０ｒｐｍ（ＲＰ４０）、６０ｒｐｍ（ＲＰ６０）、８０ｒｐｍ（ＲＰ８０）、および１００ｒｐｍ（ＲＰ１００）の４つの回転速度が試験された。異なる速度のバイオリアクター（ＲＰ）内でのオルガノイドの拡張を静置培養（ＳＣ）と比較するために、ヒト腸オルガノイド由来の単一細胞がＳＣおよびＲＰの両方において播種され、ヒト小腸オルガノイド拡張培地で２週間培養された。

【0043】

播種後４日目、７日目、１１日目、および１４日目に、それぞれ、代表的な写真が撮影され、細胞数が計数された。光学顕微鏡法では、すべての回転速度において、ＳＣとＲＰの両方で、培養開始の最初の７日以内に単一細胞が成長し、オルガノイドを形成した。しかしながら、１４日目に、ＲＰ内のオルガノイドは、ＳＣに比べてより大きな直径に達し（図８Ａ）、最も多くの最も大きなオルガノイドがＲＰ１００に現れていた。さらに、ＲＰ中のオルガノイドは、ＳＣと比較してわずかに異なる形態を有し、すべての速度でより不規則な形状を伴い、ＲＰ条件が、より良好な分化および組織形成に対して有望であり得ること示している。拡張は、細胞計数で確認され、細胞数の倍率変化は、形態と一致しており、ＲＰ１００で最も高い倍率変化を示した（図８Ｂ）。２週間以内に、ＲＰ１００内のオルガノイドは、ＳＣにおける約４０倍の拡張に比べて１４０倍の拡張を達成した。これらの結果から、バイオリアクターにおける腸オルガノイド拡張に最適な速度は１００ｒｐｍであることが確認される。

【符号の説明】

【0044】

１ リアクターモジュール
２ 攪拌要素
３ 電気エンジン
４ 蓋またはキャップ
５ ポータル
６ 培養容器
７ ホルダー
８ フィン

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【国際調査報告】