特表 2024-530856 コイルドコイル融合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-27

(54)【発明の名称】コイルドコイル融合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240820BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240820BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240820BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240820BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240820BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240820BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240820BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K16/00

C07K14/47

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K38/16

A61K48/00

A61K35/76

A61P35/00

C12N15/62 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577954

(86)(22)【出願日】2022-09-28

(85)【翻訳文提出日】2024-01-31

(86)【国際出願番号】 KR2022014508

(87)【国際公開番号】W WO2023055045

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】10-2021-0128551

(32)【優先日】2021-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0043553

(32)【優先日】2022-04-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0121834

(32)【優先日】2022-09-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523473316

【氏名又は名称】エヌビオス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】イ，デ－ヒ

(72)【発明者】

【氏名】イ，ジョン ウン

(72)【発明者】

【氏名】イム，ソン イン

(72)【発明者】

【氏名】シン，ゴウン

(72)【発明者】

【氏名】クォン，ヒョク テク

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，イ ジ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA06

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084CA53

4C084NA14

4C084ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA18

4H045BA19

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA22

(57)【要約】

本発明は、自己結合ドメインを含むポリペプチド、前記ポリペプチドを含む融合タンパク質又はこれをコードする核酸分子、若しくは前記ポリペプチド、融合タンパク質又は核酸分子を含む組成物に関する。本発明の融合タンパク質又は組成物は、所望の目的に応じて様々な薬物モイエティ（タンパク質、抗体切片など）を結合又は搭載させてこれをモジュール形式で具現し、自己結合によって結合させることによってターゲットに対する向上した結合力及び／又は薬物の活性増加を達成できる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の構成を含む融合タンパク質：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、又は前記配列番号１において６番目、２７番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含むポリペプチド１；
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、又は前記配列番号６において８番目、２９番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含むポリペプチド２；及び
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド１及び２のＮ末端及びＣ末端からなる群から選ばれる１以上の部位に結合している薬物モイエティ；であって、
前記ポリペプチド１及び２は自己結合で結合することを特徴とする、融合タンパク質。

【請求項2】

前記薬物モイエティは、抗体又はその抗原結合断片、又はタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記タンパク質は、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ；Ａｌｂｕｍｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）又はトレール（ＴＲＡＩＬ；Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）であることを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記タンパク質は、トレール三量体（ｔｒｉｍｅｒ）であることを特徴とする、請求項４に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記薬物モイエティは、前記ポリペプチド１又は２のＮ末端又はＣ末端にリンカーで結合したことを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

請求項１の融合タンパク質をコードする核酸分子。

【請求項8】

請求項７の核酸分子を含むベクター。

【請求項9】

下記の構成を含む発現構築物：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、又は前記配列番号１において６番目、２７番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含むポリペプチド１をコードする核酸分子１；及び
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、又は前記配列番号６において８番目、２９番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含むポリペプチド２をコードする核酸分子２；を含む発現構築物であって、
前記核酸分子１及び２は、同じベクター又は互いに異なるベクターで発現してポリペプチド１及び２が自己結合で結合可能であることを特徴とする、発現構築物。

【請求項10】

請求項８のベクター又は請求項９の発現構築物を含む宿主細胞。

【請求項11】

下記の構成を含む組成物：
ｉ）自己結合ドメイン１として、配列番号２又は３のアミノ酸配列を含むポリペプチド１又は前記ポリペプチド１をコードする核酸分子１；及び
ｉｉ）自己結合ドメイン２として、配列番号７又は８のアミノ酸配列を含むポリペプチド２又は前記ポリペプチド２をコードする核酸分子２。

【請求項12】

請求項１の融合タンパク質、請求項７の核酸分子、請求項８のベクター、請求項９の発現構築物、請求項１０の宿主細胞、又は請求項１１の組成物を含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物。

【請求項13】

請求項１の融合タンパク質、請求項７の核酸分子、請求項８のベクター、請求項９の発現構築物、請求項１０の宿主細胞、又は請求項１１の組成物を、それを必要とする対象に投与する段階を含む癌の治療方法。

【請求項14】

下記の構成を含むキット：
（ｉ）配列番号１において６番目、２７番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含むポリペプチド１又はこれをコードする核酸分子１；
（ｉｉ）配列番号６において８番目、２９番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含むポリペプチド２又はこれをコードする核酸分子２；及び
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド１及び２のＮ末端及びＣ末端からなる群から選ばれる１以上の部位に結合している薬物モイエティ又は前記核酸分子１及び２の５’末端又は３’末端からなる群から選ばれる位置に結合している薬物モイエティコーディングヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｄｒｕｇ ｍｏｉｅｔｙ）。

【請求項15】

前記薬物モイエティは、トレール（ＴＲＡＩＬ）であることを特徴とする、請求項１４に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔技術分野〕
本発明は、共同発現による結合安定性が向上したコイルドコイルスキャフォールドに関し、本発明で提示するコイルドコイルスキャフォールドは、ＭＢＤ２－ｐ６６α（Ｍｅｔｈｙｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ２－Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｐ６６α）複合体に薬物モイエティ（タンパク質、抗体切片など）が結合し、様々な機能性分子の多重複合体をモジュール形式で具現できる融合タンパク質又は薬物伝達体に関する。

【0002】

〔背景技術〕
現在、使用中であるか開発中である薬物伝達体は、通常、２重薬物搭載が最大であり、搭載される薬物の形態が１つに限定されている。また、新しい薬物を搭載して伝達体を作るためには、既存の薬物伝達体を生産する工程を同一に行わなければならないという非効率性があり、搭載される薬物の組合せを簡便に変え難いという欠点がある。

【0003】

〔先行技術文献〕
〔特許文献〕
〔特許文献１〕ＵＳ２０１４－００７３５６６ Ａ１
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明者らは、種々の薬物モイエティ（治療用タンパク質、抗体切片など）を簡便に搭載できながらも、改善された薬効を示すことができる融合タンパク質又は薬物伝達体のプラットホームを開発するために鋭意努力してきた。その結果、ＭＢＤ２アミノ酸配列の３６０－３９３位置を含むポリペプチド及びｐ６６αアミノ酸配列の１３８－１７８アミノ酸位置を含むポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に薬物モイエティを結合させる場合に、前記両方のポリペプチドが自己結合によって結合することによって、ターゲットに対する向上した結合力及び／又は薬物の活性を示すということを確認し、本発明を完成するに至った。

【0004】

したがって、本発明の目的は、自己結合ドメイン１を含むポリペプチド１及び自己結合ドメイン２を含むポリペプチド２を含む融合タンパク質を提供することにある。

【0005】

本発明の他の目的は、前記融合タンパク質をコードする核酸分子を提供することにある。

【0006】

本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することにある。

【0007】

本発明のさらに他の目的は、自己結合ドメイン１を含むポリペプチド１をコードする核酸分子１、及び自己結合ドメイン２を含むポリペプチド２をコードする核酸分子２を含む発現構築物を提供することにある。

【0008】

本発明のさらに他の目的は、前記ベクター又は発現構築物を含むか、前記ベクター又は発現構築物で形質転換された宿主細胞を提供することにある。

【0009】

本発明のさらに他の目的は、前記融合タンパク質、核酸分子、ベクター、発現構築物又は宿主細胞を含む、癌の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することにある。

【0010】

本発明のさらに他の目的は、前記ポリペプチド１又は核酸分子１、及びポリペプチド２又は核酸分子２を含むキットを提供することにある。

【0011】

本発明の別の目的及び利点は、後述する発明の詳細な説明、特許請求の範囲、及び図面によってより明確になる。

【0012】

〔課題を解決するための手段〕
本発明の一態様によれば、本発明は、自己結合ドメイン１を含むポリペプチド１及び自己結合ドメイン２を含むポリペプチド２を含む融合タンパク質を提供する。

【0013】

本明細書において、用語「融合タンパク質」は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現したハイブリッドタンパク質を意味する。

【0014】

本明細書において、用語「自己結合ドメイン」は、他の自己結合ドメインと自己結合してコイルドコイルを形成できるタンパク質を意味する。例えば、自己結合ドメイン１は自己結合ドメイン２と自己結合してコイルドコイルを形成できる。前記自己結合ドメインは、相互間に疎水性及び／又はイオン性相互作用である非共有結合を可能にし、個別ドメインが互いに結合（自己結合）してコイルドコイルを形成できるようにする。

【0015】

前記自己結合ドメイン１は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列、又は前記配列番号１において６番目、２７番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含み、より好ましくは、前記配列番号１において６番目、２７番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含む。

【0016】

前記自己結合ドメイン２は、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列、又は前記配列番号６において８番目、２９番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含み、より好ましくは、前記配列番号６において８番目、２９番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含む。

【0017】

前記アミノ酸位置でのシステインへの変異は、２の自己結合ドメイン間共有結合（二硫化結合）をさらに誘導し、より安定した融合タンパク質を形成可能にする。

【0018】

本発明の一実施例によれば、前記自己結合ドメイン１のシステイン変異位置（配列番号１において６番目、２７番目の位置）及び自己結合ドメイン２のシステイン変異位置（配列番号６において８番目、２９番目の位置）ではなく他の位置（例えば、配列番号１において１６番目、２０番目の位置及び／又は配列番号６において１８番目、１１番目の位置など）にシステイン変異が導入される場合に、安定した融合タンパク質を形成できないか、発現量が顕著に低下することが確認できる（図３Ａ及び図３Ｂ）。

【0019】

本発明の好ましい具現例によれば、前記自己結合ドメイン１は、配列番号２又は３のアミノ酸配列を含むものである。

【0020】

本発明の好ましい具現例によれば、前記自己結合ドメイン２は、配列番号７又は８のアミノ酸配列を含むものである。

【0021】

本発明の好ましい具現例によれば、前記融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む自己結合ドメイン１、及び配列番号７のアミノ酸配列を含む自己結合ドメイン２を含むものである。

【0022】

本発明の好ましい具現例によれば、前記融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む自己結合ドメイン１、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む自己結合ドメイン２を含むものである。

【0023】

本発明の融合タンパク質は、１以上の薬物モイエティ（ｄｒｕｇ ｍｏｉｅｔｙ）をさらに含んでよい。

【0024】

本発明の好ましい具現例によれば、前記融合タンパク質は、前記自己結合ドメイン１、又は自己結合ドメイン１を含むポリペプチド１のＮ末端及びＣ末端からなる群から選ばれる１以上の部位に薬物モイエティを含む。

【0025】

本発明の好ましい具現例によれば、前記融合タンパク質は、前記自己結合ドメイン２、又は自己結合ドメイン２を含むポリペプチド２のＮ末端及びＣ末端からなる群から選ばれる１以上の部位に薬物モイエティを含む。

【0026】

本明細書で使われる用語「ポリペプチド１」は、前記自己結合ドメイン１、又は前記自己結合ドメイン１を含むペプチドであり、自己結合ドメイン２、又は前記自己結合ドメイン２を含むペプチド２と自己結合する性質を有するペプチドを意味する。

【0027】

本明細書で使われる用語「ポリペプチド２」は、前記自己結合ドメイン２、又は前記自己結合ドメイン２を含むペプチドであり、自己結合ドメイン１、又は前記自己結合ドメイン１を含むペプチド１と自己結合する性質を有するペプチドを意味する。

【0028】

本明細書で使われる用語「薬物モイエティ」は、抗体又はその抗原結合断片、又はタンパク質（例えば、治療用タンパク質、リガンド、レセプター、Ｆｃ部位）など、他の種類のタンパク質又は物質と相互作用するか、発現時に特定機能を有し得る物質のことを指す。前記タンパク質は、全長タンパク質の他に、特定機能を担当するドメイン又はポリペプチドの一部であってもよく、天然型又は人為的な配列であってよい。

【0029】

本明細書において、用語「抗体」は、免疫学的に特定抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体役割を担うタンパク質分子を意味し、多クローン抗体及び単クローン抗体のいずれをも含む。

【0030】

抗体は、完全な全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）抗体の形態の他、抗体分子の抗原結合断片（抗体断片）も含む。完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖と二硫化結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、及びエプシロン（ε）のタイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）、及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（ｋａｐｐａ，κ）及びラムダ（ｌａｍｂｄａ，λ）のタイプを有する。

【0031】

本明細書において、用語「抗体の抗原結合断片」は、全抗体分子内で抗原を特異的に認識し、抗原－抗体結合機能を保有する断片を意味し、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖなどを含む。断片の例には、ＶＬ、ＶＨ、Ｃκ（又は、ＣＬ）、及びＣＨ１ドメインで構成された１価断片（Ｆａｂ断片）；ヒンジ領域で二硫化物ブリッジによって連結された２個のＦａｂ断片を含む２価断片（Ｆ（ａｂ’）２断片）；ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されたＦｄ断片；抗体の１つのアーム（ａｒｍ）のＶＬ及びＶＨドメイン、及び二硫化物－連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）で構成されたＦｖ断片；ＶＨドメインで構成されたｄＡｂ断片；及び、分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）又はリンカーによって選択的につながり得る２つ以上の分離されたＣＤＲの組合せを含む。また、ｓｃＦｖは、ＶＬとＶＨ領域が対をなして１価分子を形成した単一タンパク質鎖をなすようにリンカーによってつながってよい。このような一本鎖抗体も抗体の断片に含まれる。また、前記抗体又は抗体の断片は、２個の重鎖分子と２個の軽鎖分子を含むテトラマー抗体；抗体軽鎖モノマー；抗体重鎖モノマー；抗体軽鎖ダイマー、抗体重鎖ダイマー；イントラボディー；１価抗体；ラクダ抗体；及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。

【0032】

本発明の好ましい具現例によれば、前記薬物モイエティとして抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。

【0033】

本発明の好ましい具現例によれば、前記薬物モイエティとしてタンパク質は、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ；Ａｌｂｕｍｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）又はトレール（ＴＲＡＩＬ；Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）である。

【0034】

本明細書で使われる用語「アルブミン結合ペプチド」は、血液浸透圧の維持、様々な基質の輸送などにおいて重要な役割を担う多機能性血漿タンパク質であるアルブミンに結合するペプチド又はタンパク質を意味する。アルブミンは、ＦｃＲｎに対する結合力を有しているので、３週の長い血漿半減期を有し、アルブミンに結合活性を保有するアルブミン結合ペプチドの配列を融合タンパク質に含めることによって半減期増加の特性を付与することができる。当業界には種々のアルブミン結合ペプチドが開示（Ｚｏｒｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｃｈｅｍｃｏｍｍ．２０１９ Ｊｕｌ １；１０（７）：１０６８－１０８１など）されており、本明細書に参照によって組み込まれる。

【0035】

本明細書で使われる用語「トレール」は、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）の一種で、腫瘍細胞の自己細胞死滅を誘導するリガンドを意味する。ＴＲＡＩＬは４個の受容体を有しており、前記受容体のうち死滅受容体（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＤＲ４、ＤＲ５）は癌細胞株において、デコイ受容体（Ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＤｃＲ１、ＤｃＲ２）は正常細胞株において過発現する。前記ＴＲＡＩＬは、腫瘍細胞の表面にあるＤＲ４及びＤＲ５のような死滅受容体に結合して腫瘍細胞の死滅を誘導することができる。前記デコイ受容体は、ｃ末端に死滅ドメインを有しておらず、細胞死滅信号伝達が細胞内に伝達されない。したがって、ＴＲＡＩＬに基づく治療は、正常細胞に対しては無害であり、様々な癌細胞株に対してのみ毒性を誘導するという特徴を有することから、非常に効果的な次世代抗癌治療剤である。しかし、ＴＲＡＩＬは、このような長所にもかかわらず、トレール単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の活性型である三量体（ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒ）は非共有結合で連結されているため、構造安定性及び体内持続性が弱く、臨床的応用に制限がある。

【0036】

本発明の好ましい具現例によれば、前記薬物モイエティとしてタンパク質はトレール三量体（ｔｒｉｍｅｒ）である。

【0037】

前記トレール三量体は、前記自己結合ドメイン１、又は自己結合ドメイン１を含むポリペプチド１のＮ末端及び／又はＣ末端に結合するか、前記自己結合ドメイン２、又は自己結合ドメイン２を含むポリレペプチド２のＮ末端及び／又はＣ末端に結合することによって、三量体、六量体、九量体、十二量体などを融合タンパク質内に構築できる。

【0038】

本発明の一実施例によれば、トレール三量体－自己結合ドメイン１及びトレール三量体－自己結合ドメイン２が自己結合して形成されたトレール六量体は、１）トレール三量体－自己結合ドメイン１、又は２）トレール三量体－自己結合ドメイン２が単独で発現した場合と比較して、死滅受容体との親和度が２～５倍増加したことが確認できる（図４）。

【0039】

本発明のさらに他の実施例によれば、トレール三量体－自己結合ドメイン１及びトレール三量体－自己結合ドメイン２が自己結合して形成されたトレール六量体は、１）トレール三量体－自己結合ドメイン１、又は２）トレール三量体－自己結合ドメイン２が単独で発現した場合と比較して癌細胞死滅率が４倍以上増加したことが確認できる（図５Ａ及び図５Ｂ）。

【0040】

本明細書で使われる用語「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」は、ポリペプチドにおいてアミノ末端及びカルボキシ末端を意味する。前記薬物モイエティは、同種（例えば、トレール三量体＋トレール三量体など）のタンパク質が、前記自己結合ドメイン１、又は自己結合ドメイン１を含むポリペプチド１のＮ末端及び／又はＣ末端に結合するか、前記自己結合ドメイン２、又は自己結合ドメイン２を含むポリレペプチド２のＮ末端及び／又はＣ末端に結合してよく、異種（例えば、トレール三量体＋ＡＢＰ、又はトレール三量体＋ＡＢＰ＋ｓｃＦｖなど）のタンパク質がそれぞれのＮ末端及び／又はＣ末端に結合してもよく、様々な機能性分子の多重複合体をモジュール形式で具現することができる。

【0041】

本発明の好ましい具現例によれば、前記薬物モイエティは、前記ポリペプチド１又は２のＮ末端又はＣ末端にリンカーで結合したものであってよい。

【0042】

本明細書に使われた用語「リンカー」は、前記ポリペプチド１又は２のＮ末端又はＣ末端と薬物モイエティのＮ末端又はＣ末端との間に存在するアミノ酸配列を意味する。前記リンカーは任意のアミノ酸組合せであってよいが、これに限定されず、前記ポリペプチド１又は２と薬物モイエティの結合及び解離を促進する配列であるが、コイルドコイル形成ドメインに柔軟性を付与したり、コイルドコイル形成ドメインが結合する時に発生する立体障害などを減少させる目的で導入することができる。前記リンカーは、任意の長さのグリシン及びセリン豊富配列が好ましく、例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ又はこれらの組合せが反復されるものであってよいが、これに限定されるものではない。

【0043】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明は、下記の構成を含むコイルドコイル（Ｃｏｉｌｅｄ－Ｃｏｉｌ）複合体に関する：
（ｉ）配列番号１において６番目、２７番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したポリペプチド１；及び
（ｉｉ）配列番号６において８番目、２９番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したポリペプチド２。

【0044】

本発明の他の態様によれば、本発明は、前記融合タンパク質又はコイルドコイル複合体をコードする核酸分子を提供する。

【0045】

本明細書において、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が修飾された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，（１９９０）９０：５４３－５８４）。本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子の配列は修飾されてよい。前記修飾は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

【0046】

本発明の核酸分子は、上述したヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。上記の実質的な同一性は、上述した本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列を極力対応するようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムによってアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも８０％の相同性、一特定例では少なくとも９０％の相同性、他の特定例では少なくとも９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。

【0047】

本発明の好ましい具現例によれば、前記ポリペプチド１をコードする核酸分子（核酸分子１）及び／又は前記ポリペプチド２をコードする核酸分子（核酸分子２）の５’末端又は３’末端からなる群から選ばれる位置に、薬物モイエティをコードするヌクレオチド配列が含まれてよい。

【0048】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記核酸分子を含むベクターを提供する。

【0049】

本明細書において、用語「ベクター」は、前記核酸分子配列を複製できる細胞への導入のためにポリヌクレオチド配列を挿入できる伝達体を意味する。ポリヌクレオチド配列は、外生（Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってよい。ベクターとしては、プラスミド、コスミドベクター、及びウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ－付属ウイルスベクターなど）を挙げることができるが、これに限定されない。当業者は標準的な組換え技術によってベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及び、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。

【0050】

本明細書において、用語「発現構築物」は、転写される遺伝子産物のうち少なくとも一部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。一部の場合には、以降、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドとして翻訳される。発現ベクターには様々な調節配列を含んでよい。転写及び翻訳を調節する調節配列に加え、ベクター及び発現ベクターにはさらに他の機能も提供する核酸配列も含まれてよい。前記発現構築物は、同一のベクター内に前記ポリペプチド１をコードする核酸分子１及び前記ポリペプチド２をコードする核酸分子２を同時に含むか、互いに異なるベクター内に含んでよい。前記核酸分子１及び２はインビトロ又はインビボで同一のベクター又は互いに異なるベクターから発現したポリペプチド１及び２が自己結合で結合して融合タンパク質を形成することができる。

【0051】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述したベクター又は発現構築物を含むか、前記ベクター又は発現構築物で形質転換された宿主細胞を提供する。

【0052】

本明細書において、用語「細胞」は、真核細胞及び原核細胞を含み、前記ベクターを複製可能であるか、ベクターによってコードされる遺伝子を発現させることができる任意の形質転換可能な細胞を意味する。細胞は、前記ベクターによって形質感染（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）、形質導入（Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）又は形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）されてよく、これは、外生のポリヌクレオチド（核酸分子）が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。本明細書において、用語「形質転換」は、前記形質感染（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）及び形質導入（Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）を含む意味で使われる。

【0053】

本発明の（宿主）細胞は限定されないが、好ましくは、昆虫細胞又は哺乳動物細胞、より好ましくは昆虫細胞の場合に、Ｓｆ９、哺乳動物細胞の場合に、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、ＲＰＥ－１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ－７細胞、Ｃ８Ｄ１ａ細胞、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＥＳ１３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＭＣＦ－７細胞、ＨＣ７０細胞、ＨＣＣ１４２８細胞、ＢＴ－５４９細胞、ＰＣ３細胞、ＬＮＣａＰ細胞、Ｃａｐａｎ－１細胞、Ｐａｎｃ－１細胞、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞、ＳＷ４８０細胞、ＨＣＴ１６６細胞、ＬｏＶｏ細胞、Ａ１７２細胞、ＭＫＮ－４５細胞、ＭＫＮ－７４細胞、Ｋａｔｏ－ＩＩＩ細胞、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞、ＨＴ－１４４細胞、ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｃ６細胞、ＨＴ－２２細胞、ＰＣ－１２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などを用いることができる。

【0054】

本発明の宿主細胞は、好ましくは単離した宿主細胞である。

【0055】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した融合タンパク質、前記核酸分子、前記ベクター、前記発現構築物、又は前記細胞を含む組成物を提供する。

【0056】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、ｉ）自己結合ドメイン１として、配列番号２又は３のアミノ酸配列を含むポリペプチド１又は前記ポリペプチド１をコードする核酸分子１、及びｉｉ）自己結合ドメイン２として、配列番号７又は８のアミノ酸配列を含むポリペプチド２又は前記ポリペプチド２をコードする核酸分子２、を含む組成物を提供する。

【0057】

本発明において、前記「ポリペプチド」、「核酸分子」、「薬物モイエティ」など、上述した項目と同じ内容については、明細書の複雑性及び反復を避けるために省略する。

【0058】

前記組成物に含まれる、配列番号２又は３のアミノ酸配列を含むポリペプチド１及び配列番号７又は８のアミノ酸配列を含むポリペプチド２のＮ末端及びＣ末端からなる群から選ばれる１以上の部位には薬物モイエティが結合してよい。

【0059】

したがって、前記組成物は、ｉ）ポリペプチド１－薬物モイエティ、薬物モイエティ－ポリペプチド１、又は薬物モイエティ－ポリペプチド１－薬物モイエティ、及びｉｉ）ポリペプチド２－薬物モイエティ、薬物モイエティ－ポリペプチド２、又は薬物モイエティ－ポリペプチド２－薬物モイエティを含んでよい。

【0060】

また、前記組成物に含まれる、配列番号２又は３のアミノ酸配列を含むポリペプチド１をコードする核酸分子１及び配列番号７又は８のアミノ酸配列を含むポリペプチド２をコードする核酸分子２の５’末端又は３’末端からなる群から選ばれる位置に、薬物モイエティをコードするヌクレオチド配列が結合してよい。

【0061】

また、前記組成物に含まれる、核酸分子１、核酸分子２、及びこれに結合した薬物モイエティをコードするヌクレオチド配列は、１つ又は複数のベクターに挿入された形態で組成物内に存在してよい。

【0062】

本発明の好ましい具現例によれば、前記組成物は、癌の予防又は治療用薬剤学的組成物である。

【0063】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した融合タンパク質、前記核酸分子、前記ベクター、前記発現構築物、前記細胞又は前記組成物の薬剤学的有効量を対象体に投与する段階を含む癌の予防又は治療方法を提供する。

【0064】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した融合タンパク質、前記核酸分子、前記ベクター、前記発現構築物、前記細胞又は前記組成物の治療用途（ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ）を提供する。

【0065】

本発明の好ましい具現例によれば、前記治療用途は、癌の治療用途である。

【0066】

本明細書において、用語「予防」は、疾患又は疾病を保有していると診断されたことはないが、このような疾患又は疾病にかかる可能性のある対象体において疾患又は疾病の発生を抑制することを意味する。

【0067】

本明細書において、用語「治療」は、（ａ）疾患、疾病又は症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病又は症状の軽減；又は、（ｃ）疾患、疾病又は症状を除去すること、を意味する。

【0068】

したがって、本発明の組成物は、それ自体で癌治療用組成物であってもよく、或いは、他の薬理成分と併せて投与されてその治療反応性を向上させる治療補助剤として適用されてもよい。そこで、本明細書において、用語「治療」又は「治療剤」は、「治療補助」又は「治療補助剤」の意味を含む。

【0069】

本明細書において、用語「投与」又は「投与する」は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接に投与することによって、対象体の体内で同一の量が形成されるようにすることを指す。

【0070】

本発明におい、用語「治療的有効量」は、本発明の薬剤学的組成物を投与しようとする個体に組成物中の薬理成分が治療的又は予防的効果を提供するのに十分な程度で含まれた組成物の含有量を意味し、よって、「予防的有効量」を含む意味である。

【0071】

本明細書において、用語「対象体」は、これに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ギニアピッグ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒ又はアカゲザルを含む。具体的には、本発明の対象体はヒトである。

【0072】

薬剤学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０） Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）中で所望の程度の純度を有する、本明細書に開示の組成物が本明細書に開示される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、使用された投薬量及び濃度で受恵者に非毒性であり、バッファー、例えばホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及び、ｍ－クレゾール）；低分子量（約１０個残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート化剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成反対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又は、非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

【0073】

一部の具体例において、薬剤学的組成物は、本明細書に開示の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、発現構築物又は細胞を、薬剤学的に許容される担体中に含む。特定具体例において、薬剤学的組成物は、本明細書に開示の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、発現構築物又は細胞の有効量、及び選択的に１つ以上の追加の予防又は治療剤を、薬剤学的に許容される担体中に含む。一部の具体例において、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、発現構築物又は細胞は、薬剤学的組成物に含まれた唯一の活性成分である。

【0074】

非経口製造物において使われる薬剤学的に許容される担体は、水性ビークル、非水性ビークル、抗菌剤、等張剤、バッファー、抗酸化剤、局所痲酔剤、懸濁及び分散剤、乳化剤、金属イオンの封鎖又はキレート化剤、及び他の製薬的に許容される物質を含む。水性ビークルの例は、塩化ナトリウム注射液、点滴注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロース及びラクテート点滴注射液を含む。非水性ビークルは、植物起源の固定油、綿実油、とうもろこし油、胡麻油及びピーナッツ油を含む。静菌又は精真菌濃度の抗菌剤が多回用量容器にパッケージされた非経口製造物に添加されてよく、これらは、フェノール又はクレゾール、水銀含有物質、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ－ヒドロキシベンゾ酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムを含む。等張剤は、塩化ナトリウム及びデキストロースを含む。バッファーは、ホスフェート及びシトレートを含む。抗酸化剤は、重硫酸ナトリウムを含む。局所痲酔剤は、プロカイン塩酸塩を含む。懸濁及び分散剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンを含む。乳化剤は、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）を含む。金属イオンの封鎖又はキレート化剤は、ＥＤＴＡを含む。製薬学的担体は、また、水混和性ビークル用エチルアルコール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコールを含み、ｐＨ調整用水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸又は乳酸を含む。

【0075】

薬剤学的組成物は、対象に対する任意の投与経路に合わせて製剤化してよい。投与経路の具体的な例は、鼻内、経口、非経口、脊髄腔内、脳室内、肺、皮下、又は心室内経路を含む。皮下、筋肉内又は静脈内注射を特徴とする非経口投与も考慮される。注射可能物質が従来の形態で、液体溶液又は懸濁液、注射前に液体中で溶液又は懸濁液になるのに適した固体形態、又はエマルジョンとして製造されてよい。注射可能物質、溶液及びエマルジョンは、また、１つ以上の賦形剤を含有する。適宜な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール又はエタノールである。これに加え、所望であれば、投与される製薬学的組成物は、また、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解性増進剤、及び他の製剤、例えばナトリウムアセテート、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレート及びシクロデキストリンを含有できる。

【0076】

薬剤学的組成物の非経口投与用製造物は、直に注射可能な滅菌溶液、皮下注射用錠剤を含む、使用直前に溶媒と直に組み合わせ可能な滅菌乾燥可溶性製品、例えば凍結乾燥した粉末、直に注射可能な滅菌懸濁液、使用直前にビークルと直に組み合わせ可能な滅菌乾燥不溶性製品、及び滅菌エマルジョンを含む。溶液は、水性又は非水性であってよい。

【0077】

本明細書に開示の薬剤学的組成物は、また、治療される対象の特定組織、受容体、又は他の身体領域に標的化されるように製剤化してよい。様々な標的化方法が当業者に公知されている。このような標的化方法を本組成物に使用することが考慮される。標的化方法の非制限的な例は、米国特許第６，３１６，６５２号、第６，２７４，５５２号、第６，２７１，３５９号、第６，２５３，８７２号、第６，１３９，８６５号、第６，１３１，５７０号、第６，１２０，７５１号、第６，０７１，４９５号、第６，０６０，０８２号、第６，０４８，７３６号、第６，０３９，９７５号、第６，００４，５３４号、第５，９８５，３０７号、第５，９７２，３６６号、第５，９００，２５２号、第５，８４０，６７４号、第５，７５９，５４２号、及び第５，７０９，８７４号を参照する。特定の具体例において、本明細書に開示の薬剤学的組成物は、癌を治療するために使われてよい。

【0078】

生体内投与に使用される組成物は、滅菌されてよい。例えば、滅菌濾過膜を用いた濾過によって滅菌されてよい。

【0079】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の構成を含むキットを提供する：
（ｉ）配列番号１において６番目、２７番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含むポリペプチド１又はこれをコードする核酸分子１；
（ｉｉ）配列番号６において８番目、２９番目及びこれらの組合せからなる群から選ばれるアミノ酸がシステインに変異したアミノ酸配列を含むポリペプチド２又はこれをコードする核酸分子２；及び
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド１及び２のＮ末端及びＣ末端からなる群から選ばれる１以上の部位に結合している薬物モイエティ又は前記核酸分子１及び２の５’末端又は３’末端からなる群から選ばれる部位に結合している薬物モイエティコーディングヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｄｒｕｇ ｍｏｉｅｔｙ）。

【0080】

本発明において前記「ポリペプチド」、「核酸分子」、「薬物モイエティ」など、前述した項目と同じ内容については、明細書の複雑性及び反復を避けるために省略する。

【0081】

一部の具体例において、本明細書に開示の１つ以上の（ｉ）ポリペプチド１又はこれをコードする核酸分子１、（ｉｉ）ポリペプチド２又はこれをコードする核酸分子２、及び（ｉｉｉ）前記ポリペプチド１及び２のＮ末端及びＣ末端からなる群から選ばれる１以上の部位に結合している薬物モイエティ又は前記核酸分子１及び２の５’末端又は３’末端からなる群から選ばれる位置に結合している薬物モイエティコーディングヌクレオチド配列で満たされた１つ以上の容器；選択的な使用説明書；を含む薬剤学的パック又はキットが本明細書に開示される。一部の具体例において、キットは、本明細書に開示の薬剤学的組成物及び本明細書に開示の任意の予防又は治療剤を含有する。一部の具体例において、キットは、本明細書に開示の組成物に関する説明書を含む癌の予防又は治療用組成物が開示される。

【0082】

〔発明の効果〕
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、自己結合ドメインを含むポリペプチド、前記ポリペプチドを含む融合タンパク質又はこれをコードする核酸分子、若しくは前記ポリペプチド、融合タンパク質又は核酸分子を含む組成物を提供する。

【0083】

（ｉｉ）本発明の融合タンパク質は、所望の目的に応じて様々な薬物モイエティ（タンパク質、抗体切片など）を結合又は搭載させてそれをモジュール形式で具現し、自己結合によって結合させることによって、ターゲットに対する向上した結合力及び／又は薬物の活性増加を達成することができる。

【0084】

〔図面の簡単な説明〕
〔図１Ａ〕Ａｌｐｈａｆｏｌｄ２を用いてコイルＣ’－ＧＦＰ－６ｘＨｉｓ及びコイルＣ－ｍＣｈｅｒｒｙ－６ｘＨｉｓの構造を予測した結果である。

【0085】

〔図１Ｂ〕精製されたＣ’－ＧＦＰ及びＣ－ｍＣｈｅｒｒｙの分子量をＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した結果である。

【0086】

〔図２Ａ〕コイル融合蛍光タンパク質が正しく折り畳まれたかを確認するためにＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥを行った結果である。

【0087】

〔図２Ｂ〕等温適正熱量計（ＩＴＣ）を用いてＣ’－ＧＦＰ及びＣ－ｍＣｈｅｒｒｙ間の熱力学を調べて結合媒介変数を決定した結果である。

【0088】

〔図３Ａ〕Ａｌａ２７－Ｉｌｅ８、Ｔｈｒ６－Ａｒｇ２９、Ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ１、及びＣｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ２が安定した複合体を形成するか否かを確認した結果である。

【0089】

〔図３Ｂ〕Ａｌａ２７－Ｉｌｅ８、Ｔｈｒ６－Ａｒｇ２９、Ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ１、及びＣｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ２の相対的発現量を比較した結果である。

【0090】

〔図３Ｃ〕Ａｌａ２７－Ｉｌｅ８のＦＲＥＴ効率を１００％とした時に、Ｔｈｒ６－Ａｒｇ２９、Ｃ’－ＧＦＰ／Ｃ－ｍＣｈｅｒｒｙのＦＲＥＴ効率を相対的に比較した結果である。

【0091】

〔図４〕トレール六量体と死滅受容体との親和度（ＤＲ ａｎｄ ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ＋ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ’）を、トレール三量体－Ｃ又はトレール三量体－Ｃ’と死滅受容体との親和度（ＤＲ ａｎｄ ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ ｏｒ ＤＲ ａｎｄ ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ’）と比較した結果である。

【0092】

〔図５Ａ〕陽性対照群（Ｒ＆Ｄ ＴＲＡＩＬ）、トレール三量体－Ｃ（Ｉ）試験群、トレール三量体－Ｃ’（ＩＩ）試験群及びトレール六量体試験群（Ｉ＋ＩＩ）を処理した膠芽細胞腫細胞株を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）を用いて観察した結果である。

【0093】

〔図５Ｂ〕陽性対照群（ＰＣ）、トレール三量体－Ｃ試験群（Ｔ１）、トレール三量体－Ｃ’（Ｔ２）試験群及びトレール六量体試験群（Ｔ３）の癌細胞死滅率を比較した結果である。

【0094】

〔発明を実施するための形態〕
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

【0095】

＜実施例＞
＜材料及び方法＞
＜１．材料＞
ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、イミダゾール、ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリセロール（９９．８％）、メチルアルコール（９９．８％）、酢酸（９９．７％）、Ｈ２ＰＯ４（リン酸二水素）は、サムチョン（ＳＡＭＣＨＵＮ）から購入した。酵母抽出物、寒天、６Ｎ－ＨＣｌ（６Ｎ－Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）及びブロモフェノールブルー（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）はデジョン（ＤＡＥＪＵＮＧ）から購入した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉは、エンザイオミックス（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）から購入した。１０％ ＳＤＳ溶液、ＤＴＴ（ＤＬ－Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）及びＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｇｈｔ ｂｌｕｅ Ｇ－２５０染色溶液は、バイオセサン（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）から購入した。Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅは、ＢＤ ＤＩＦＣＯから購入した。アンピシリンナトリウム塩及びリソザイムはＳＩＧＭＡから購入した。イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）は、バイオニア（ＢＩＯＮＥＥＲ）から購入した。ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）は、ウェルジン（ＷＥＬＧＥＮＥ）から購入した。グリシンはドクサン（ＤＵＫＳＡＮ）から購入した。Ｔｒｉｓ／Ｇｙｃｉｎｅ ＳＤＳ Ｐｒｅ－ｃａｓｔ ｇｅｌ ８～１６％及びＴｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ ｎｏｎ－ＳＤＳ Ｐｒｅ－ｃａｓｔ ｇｅｌ １２％は、ＫＯＭＡＢＩＯＴＥＣＨから購入した。ポリプロピレンカラムとＰＤ１０カラムはそれぞれ、ＱＩＡＧＥＮ及びＧＥヘルスケアから購入した。Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．の染色されていないタンパク質ＭＷマーカーをＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に使用した。

【0096】

＜２．プラスミド構築及びバクテリア菌株＞
ヒトＭＢＤ２又はその変異体（アミノ酸３６０－３９３、配列番号１～５）又はｐ６６又はその変異体（アミノ酸１３８－１７８、配列番号６～１０）のコイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）領域をエンコードする挿入物を、アンピシリン耐性を持つｐＥＴ２１ａに挿入した。ｐＥＴ－ＧＦＰ－ｐ６６αは、ｐＥＴ２１ａのＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にＧＦＰ－ｐ６６αをクローニングして生成されたし、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＤ２もｐＥＴ２１ａのＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にクローニングされた。前記実験はＢＩＯＮＩＣＳで行われた。

【0097】

【表1】

【0098】

ヒトＭＢＤ２又はその変異体、及びｐ６６α又はその変異体配列
＜３．タンパク質発現及び精製＞
－ 培養
ＢＬ２１［ＤＥ３］（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を氷の上で解凍させ、それぞれ５０ｕｌずつ取って微小遠心管（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）に入れ、発現ベクター１ｕｌを加えた。この時、陰性対照用微小遠心管２個を準備した後、一方には発現ベクターを追加し、他方には発現ベクターを追加しないで行った。氷の上に３０分、４２℃で３０秒熱衝撃、氷の上に２分置いた。その後、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地２００ｕｌを添加した後、それぞれ７０ｕｌずつ取ってＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレートに吸収させた。最後に、３７℃に設定したインキュベーターで約１２時間以上コロニーを採取し、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地５ｍｌに入れ、振盪インキュベーターから３７℃、２００ｒｐｍで一晩かけて培養した。Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地４００ｍＬを取って１Ｌ三角フラスコに入れ、３７℃及び２００ｒｐｍに設定された振盪培養器に入れた。温度が調節されると、アンピシリン４００ｕｌを添加し、チューブ培養物を添加し、Ａ６００ ０．６でイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドで誘導した。Ａ６００が測定されて２に到達すると細胞を収集した。全ての吸光度は、Ｂｉｏｄｒｏｐ Ｄｕｏ Ｍｉｃｒｏ Ｖｏｌｕｍｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯＤＲＯＰ）で測定された。

【0099】

－ 細胞収穫／溶解
遠心分離用として、表現された培地の重量を正確に半分ずつ分けてＯａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｔｕｂｅｓに入れ、４０００ｒｃｆ、１０分、４℃で遠心分離した後に上澄液を捨て、沈殿した細胞を－２０℃で保管した。各細胞ペレットに２０ｍＬ溶解緩衝液を追加し、ペレットを溶解させた。その後、溶かした溶液を５０ｍＬ円錐形チューブに取り込み、リゾチーム４００ｕｌを加え、ローテ－ターを用いて４℃で３０分間混合した。よく混合された溶液を氷の上で超音波処理した後、７分間超音波処理し、１００００ｒｃｆ、２０分、４℃で遠心分離して沈殿物を捨て、上澄液を収集した。

【0100】

－ 親和力精製
溶液にＮｉ－ＮＴＡアガロース１．５ｍＬを添加した後、ローテーターで１０分間混合した。溶液でタンパク質のみを得るために溶液をポリプロピレンカラム（５ｍＬ）に追加した。洗浄緩衝液で不純物を除去するためにビーズ上に約１５ｍＬを流した。５００ｕｌずつビーズに溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を５回添加し、カラムから出る溶液を、滅菌されたマイクロチューブ（ｍｉｃｒｏ ｔｕｂｅ）に入れた。精製されたＧＦＰ－ｐ６６ａｌｐｈａとｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＤ２は溶出バッファーに入っているので、バッファーをＰＢＳに入れ替えた。ＰＤ１０カラムをＰＢＳで満たした後、タンパク質含有溶液２．５ｍＬを追加し、ＰＢＳ ３ｍＬを追加することで、タンパク質のバッファーを変更した。

【0101】

－ サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）はＰＢＳで平衡化されたＰｒｏｔｅｏＳＥＣ Ｄｙｎａｍｉｃ １１／３０３－７０ ＨＲ ＳＥＣカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｋ，ＵＫ）で行われた。Ｎｉ－ＮＴＡで溶出された試料を遠心フィルターで濃縮し、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過してカラムにロードした。１ｍｌ／ｍｉｎの流速でＰＢＳを使ってＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓにおいてクロマトグラフィーを行い、溶出されたタンパク質分画を別に収集した。

【0102】

＜４．タンパク質電気泳動＞
タンパク質精製の様々な段階で収集されたサンプルを、ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）を含有する１２％不連続ポリアクリルアミドゲルで分析した。タンパク質サンプルを純粋な蒸留水と混合し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離する前に９８℃で７分間培養した。タンパク質を視覚化するために、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅで染色した。Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥは、最大１２５Ｖの電圧で２時間１２％ポリアクリルアミドゲルで実行された。その後、ＵＶを照射してタンパク質の蛍光を観察した。

【0103】

＜５．等温滴定熱量計＞
ＩＴＣ分析は、韓国基礎科学研究院（オチャン、韓国）でＭｉｃｒｏＣａｌ Ａｕｔｏ－ｉＴＣ２００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を用いて行った。結合親和度は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．５）において４０ｕｌ Ｃ’－ＧＦＰ及び２００μｌ Ｃ－ｍＣｈｅｒｒｙを用いて測定した。滴定実験のために、２ｕｌのＣ’－ＧＦＰを２５℃で１５０秒間隔で４秒間Ｃ－ｍＣｈｅｒｒｙに１９回注入し、ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎ ７．０ソフトウェアを用いてデータを分析した。Ｎは化学量論的数、ＫＤは結合親和度、ΔＨ、ΔＳはそれぞれ、エンタルピー及び結合エントロピーの変化である。

【0104】

＜６．サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）＞
タンパク質－タンパク質相互作用を分析するために、ＹＬ ＨＰＬＣシステム（Ｓｅｍｉ－ｐｒｅｐ）（ＹＬ９１００Ｓ ＨＰＬＣ）においてＰＢＳ（ｐＨ７．５）で平衡化されたＣｙｔｉｖａ ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムを使用した。サンプル（Ｃ’－ＧＦＰ及びＣ－ｍＣｈｅｒｒｙ又はＣ’－ＧＦＰ／Ｃ－ｍＣｈｅｒｒｙ）を単独で又は等モル比で混合してカラムにロードした。溶離液は、２８０ｎｍで吸光度を検出してモニタリングした。

【0105】

＜７．蛍光共鳴エネルギー伝達分析（ＦＲＥＴ分析）＞
野生型ＧＦＰ単独又はＣ’－ＧＦＰ／Ｃ－ｍＣｈｅｒｒｙ、Ａｌａ２７－Ｉｌｅ８及びＴｈｒ６－Ａｒｇ２９を同一モル数で混合したサンプルをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に適正に希釈し、総体積が２００μｌ、濃度は４μＭとなるようにした。前記サンプルを９６ウェルプレートに移し、各ウェルの４８８ｎｍ吸光度と５１０ｎｍ発光度（蛍光）をＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）で測定した。野生型ＧＦＰ単独サンプルの単位吸光度当たりの発光度（Ａ）、各サンプルの単位吸光度当たりの発光度（Ｂ）を算出した後、次式を用いて蛍光共鳴エネルギー伝達効率を計算した。

【0106】

【数1】

【0107】

＜実験結果＞
＜１．蛍光タンパク質融合野生型コイルの生成及び特性分析＞
コイルドコイルをスキャフォールドとして用いて非天然異種二量体タンパク質複合体を作るために、互いに相補的に自己組立てするｐ６６ａｌｐｈａとＭＢＤ２のコイルドコイル領域である１３８－１７８（ｃｏｉｌ Ｃ’）及び３６０－３９３（ｃｏｉｌ Ｃ）アミノ酸を使用しようとした。その後、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と赤色蛍光タンパク質のうち一つであるｍＣｈｅｒｒｙを用いてコイルの発現と複合体形成を視覚的に追跡した。ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙはそれぞれ、コイルＣ’及びコイルＣのＣ末端に融合された。６－ヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ）を各蛍光タンパク質のＣ末端にさらに融合させ、ニッケル－ニトリロトリ酢酸アガロース樹脂を用いてタンパク質を精製した。Ａｌｐｈａｆｏｌｄ２を用いてコイルＣ’－ＧＦＰ－６ｘＨｉｓ融合タンパク質（以下、Ｃ’－ＧＦＰという。）とコイルＣ－ｍＣｈｅｒｒｙ－６ｘＨｉｓ融合タンパク質（以下、Ｃ－ｍＣｈｅｒｒｙという）の複雑な構造を予測した（図１Ａ）。ｐＥＴ－Ｃ’－ＧＦＰ及びｐＥＴ－Ｃ－ｍＣｈｅｒｒｙは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１システムで発現したし、親和性クロマトグラフィーに続いてＦＰＬＣで精製された。精製の結果、培養液１リットル当たりに約４ｍｇ以上の収率で高純度タンパク質を得た。精製後、採取したタンパク質試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離してＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅで染色した後、脱色して可視化した（図１Ｂ）。タンパク質の予想分子量は、Ｃ’－ＧＦＰ及びＣ－ｍＣｈｅｒｒｙに対してそれぞれ３３．６４ｋＤａ及び３２．６５ｋＤａであったし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、結果と類似な３５ｋＤａマーカー付近の分子量推定値を提供した。

【0108】

精製後、コイル融合蛍光タンパク質が正しく折り畳まれたかを確認するためにＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥを行った。Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥの結果、Ｃ’－ＧＦＰとＣ－ｍＣｈｅｒｒｙが単独で存在する場合に、緑色蛍光と赤色蛍光を示すことを確認した（図２Ａ）。しかし、Ｃ’－ＧＦＰとＣ－ｍＣｈｅｒｒｙを１：１の比率で混合したとき、緑色蛍光と赤色蛍光とが合わせられて黄色蛍光が観察された。これは、各蛍光タンパク質が正しく折り畳まれており、融合されたコイルが相補的に自己組立てされたことを示す。等温滴定熱量計（ＩＴＣ）を用いてＣ’－ＧＦＰとＣ－ｍＣｈｅｒｒｙ間の熱力学を調べて結合媒介変数を決定した。Ｃ’－ＧＦＰとＣ－ｍＣｈｅｒｒｙ間の測定された媒介変数は、Ｎ＝０．７、ＫＤ＝１０．７ｎＭ、ΔＨ＝－２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、ΔＳ＝－５２．４ｃａｌ／ｍｏｌ／ｄｅｇだったし、両分子間の反応は自発的に駆動されたし、高い結合親和度を示した（図２Ｂ）。また、Ｃ’－ＧＦＰとＣ－ｍＣｈｅｒｒｙは、０．７：１の比率で反応し、理論的に１：１の比率よりも低かった。これは、コイル間の同種二量体の形成又は実際濃度と等温線とを合わせるために用いられた濃度の差による誤りであり得る。要するに、我らは、正確な折り畳みが可能であり、高い親和性で結合して異種二量体複合体を形成できるＣ’－ＧＦＰ及びＣ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現させた。

【0109】

＜２．コイル型システイン突然変異体の設計及び安定性評価＞
分子内又は分子間システイン（Ｃｙｓ）残基の両チオール基間に形成された二硫化ブリッジは、正しいタンパク質フォルディング及び構造的安定性の重要な構成要素として働き得る。自己結合時に、解離に対する向上した耐性を提供するために、我らは二硫化結合コイルドコイル複合体を生成しようとした。そのために、我らは、既存のコイルドコイル相互作用の抑制を最小化しながら二硫化結合を形成できる一対の残基の位置を見出した。Ｃ’＿Ｉｌｅ８－Ｃ＿Ａｌａ２７（Ｉ８Ｃ－Ａ２７Ｃ）（配列番号７＋配列番号２）及びＣ’＿Ａｒｇ２９－Ｃ＿Ｔｈｒ６（Ｒ２９Ｃ－Ｔ６Ｃ）（配列番号８＋配列番号３）は、良好な静電気相互作用を維持しつつ二硫化結合が形成される最適の架橋部位として判断された。突然変異によるコイルドコイル相互作用の抑制程度を調べるために、良好な静電気相互作用残基対Ｃ’＿Ｇｌｕ１８－Ｃ＿Ａｒｇ１６（Ｅ１８Ｃ－Ｒ１６Ｃ）（配列番号９＋配列番号４）及びＣ’＿Ｌｅｕ１１－Ｃ＿Ｖａｌ２０（Ｌ１１Ｃ－Ｖ２０Ｃ）（配列番号１０＋配列番号５）を選択して比較した。ＤＴＴ及び突然変異の有無による野生型ＧＦＰ－Ｃ’と野生型ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃのコイルドコイル相互作用（配列番号６＋配列番号１）（ＧＦＰ－Ｃ’＋ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ）をＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥで分析した結果、Ｃ’＿Ｉｌｅ８－Ｃ＿Ａｌａ２７（Ｉ８Ｃ－Ａ２７Ｃ）（配列番号７＋配列番号２）（Ａｌａ２７－Ｉｌｅ８）及びＣ’＿Ａｒｇ２９－Ｃ＿Ｔｈｒ６（Ｒ２９Ｃ－Ｔ６Ｃ）（配列番号８＋配列番号３）（Ｔｈｒ６－Ａｒｇ２９）は、Ｃ’＿Ｇｌｕ１８－Ｃ＿Ａｒｇ１６（Ｅ１８Ｃ－Ｒ１６Ｃ）（配列番号９＋配列番号４）（Ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ１）及びＣ’＿Ｌｅｕ１１－Ｃ＿Ｖａｌ２０（Ｌ１１Ｃ－Ｖ２０Ｃ）（配列番号１０＋配列番号５）（Ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ２）と比較して、より安定した複合体を形成することが見られた（図３Ａ）。また、相対的な発現量を比較した結果、Ａｌａ２７－Ｉｌｅ８及びＴｈｒ６－Ａｒｇ２９がＣｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ１及びＣｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ２に比べて２倍以上高いことが確認できた（図３Ｂ）。また、Ａｌａ２７－Ｉｌｅ８及びＴｈｒ６－Ａｒｇ２９の安定的コイルドコイル相互作用に起因するＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ分子間の蛍光共鳴エネルギー伝達効率を定量分析（ＦＲＥＴ分析）した結果、野生型（ＧＦＰ－Ｃ’＋ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ）に比べて２倍以上の高い効率が確認できた（図３Ｃ）。

【0110】

＜３．トレール三量体－コイル及びトレール六量体製造＞
＜３．１．細胞発現及び精製＞
２種のタンパク質（トレール三量体－ＭＢＤ２（ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ）、トレール三量体－ｐ６６α（ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ’））を、形質転換された大腸菌の培養によってそれぞれ発現させ、親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。より具体的には、トレール三量体－ＭＢＤ及びトレール三量体－ｐ６６αは、次の固定によって発現及び精製した：
形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を、アンピシリン濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに調節した固体ＬＢ培地で１２時間培養した。その後、ベクターの挿入が確認された菌株を２ｘＹＴ培地（アンピシリン０．１ｍｇ／ｍＬ、以下同一）に接種して３７℃で１２時間培養させた後、２ｘＹＴ培地に１：１００に希釈させて再び接種し、２００ｒｐｍ条件で撹拌して３０℃で培養した。吸光度が６００ｎｍで０．４～０．５になった時に、タンパク質発現誘導のためにＩＰＴＧを最終濃度１．０ｍＭになるように添加した後、温度を１６～１８℃に下げた。２０～４０時間培養後に４０００ｇ条件で１０分間遠心分離して細胞ペレットとして回収し、－２０℃に冷凍保管した。

【0111】

細胞でタンパク質を精製するために溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ ８．０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）４０ｍＬをペレットに添加し、凍っていた細胞を再浮遊させた。リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を最終濃度１ｍｇ／ｍＬで添加した後、４℃で３０分程度回転させて混合過程を行った。その後、８分間、１０秒間隔で超音波分解を行ったし、再び１０，０００ｇ条件で３０分間遠心分離を行い、タンパク質と細胞残物を分離した。タンパク質が含まれている上澄液を別に移し、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズを１．５ｍＬ添加した後、４℃で３０分間回転させつつ混合した。重力流（Ｇｒａｖｉｔｙ－ｆｌｏｗ）カラムを固定させた後、Ｎｉ－ＮＴＡを混合させた上澄液をカラムに流下させながらビーズとフロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）を分離した。フロースルーは除去した後、ビーズ洗浄のために洗浄バッファー（ｐＨ ８．０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ ＮａＣｌ、そして２０ｍＭイミダゾール）を十分に流してフロースルーに流れ出る溶液の吸光度が２８０ｎｍで０．００になるまでビーズに付いた不純物を除去した。ビーズと結合したタンパク質を別に分離するために、溶出バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．０）、０．３ＭＮａＣｌ、そして２５０ｍＭイミダゾール）を５００ｕＬずつ流しながらフロースルーをマイクロチューブに分注した。Ｂｉｏｄｒｏｐを用いて２８０ｎｍで分注された溶液の濃度をそれぞれ測定し、４℃で冷蔵保管した。

【0112】

＜３．２．特性評価＞
バインディングアッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）（ＭｉｃｒｏＳｃａｌｅ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＭＳＴ）を用いて、１）トレール三量体－Ｃ（ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ）とトレール三量体－Ｃ’（ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ’）と取り込みの親和度、２）トレール三量体－Ｃ又はトレール三量体－Ｃ’と死滅受容体（ＤＲ）との親和度、及び３）トレール六量体（ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ＋ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ’）と死滅受容体（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＤＲ）との親和度、を測定した。ＤＲは、トレールの同族受容体（Ｃｏｇｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。

【0113】

より具体的には、下記の方法によって測定した：
分析前にサンプル前処理のために、死滅受容体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とＤＭＳＯに溶解されたＦｌａｍｍａ（登録商標）６４８ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳエステルを１：５のモル比で混合した後、室温で１時間反応させた。Ｚｅｂａ（商標） Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（４０Ｋ ＭＷＣＯ、０．５ｍＬ）は、サンプルを注入する前に１５００ｇ条件で１分遠心分離して保存溶液を除去し、炭酸ナトリウム１５０ｍＭ溶液４５０ｕＬをカラムに満たした後、再び１５００ｇ条件で１分遠心分離を行った。その後、反応させたＤＲ混合物を１００～１５０ｕＬ注入した後、１５００ｇ条件で２分遠心分離を行って、サンプルに微量含まれたＤＭＳＯを除去し、炭酸ナトリウム溶液に入れ替えると同時に、ｎｏｎ－ｌａｂｅｌｅｄとｌａｂｅｌｅｄ ＤＲを分離した。

【0114】

Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５（Ｇｅｒｍａｎｙ）ＭＳＴ機器を用いてサンプルを分析する前に、ｌａｂｅｌｅｄ ＤＲを用いて測定強度を調節した。４個のキャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）に同じ濃度のｌａｂｅｌｅｄ ＤＲを満たした後、測定しながら励起出力（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｐｏｗｅｒ）を調節し、蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）値が８００～１０００の間に現れることを確認した。

【0115】

リガンド（Ｌｉｇａｎｄ）として使われる組換えタンパク質は、それぞれ、単一分子トレール（ＭｏｎｏＴＲＡＩＬ）、トレール三量体－Ｃとトレール三量体－Ｃ、又はトレール六量体とした。レセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）－リガンド（ｌｉｇａｎｄ）混合方法は次の通りである：まず、レセプタータンパク質である死滅受容体を１番目のラック（ｒａｃｋ）を除く１５個のラックに１０ｕＬずつ分注する。次に、リガンドとして作用するトレール三量体－Ｃを１番目のラックに２０ｕＬを入れ、順次に、１０ｕＬを１番目のラックから取って２番目のラックに希釈し、さらに１０ｕＬを取って３番目のラックに希釈する方式で同一に１６回行う。結果的に、２１６倍希釈されたサンプルが最終１６番目のサンプルになる。１６個の互いに異なるキャピラリーに互いに異なる濃度のサンプルを注入した後、検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）装置に固定させて測定を始める。このとき、励起出力値は、初期設定値の２倍増加した値で行う。その後、トレール三量体－Ｃ’も、六量体トレールも同じ方式で行う。

【0116】

実験の結果、トレール六量体と死滅受容体との親和度（１６３ｎＭ）は、トレール三量体－Ｃ又はトレール三量体－Ｃ’と死滅受容体との親和度（それぞれ、３３７ｎＭ、７８７ｎＭ）に比べて約２～５倍高く形成されていることが確認できた（図４）。

【0117】

＜３．３．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ＞
陽性対照群（Ｒ＆Ｄ ＴＲＡＩＬ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、トレール三量体－Ｃ（Ｉ）、トレール三量体－Ｃ’（ＩＩ）、トレール六量体（Ｉ＋ＩＩ）でそれぞれ４時間処理した膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７－ｌｕｃ細胞（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ａｋｒｏｎ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）を用いて観察した。

【0118】

前記分析の結果、５％未満の死滅率を示したトレール三量体－Ｃ（Ｉ）又はトレール三量体－Ｃ’（ＩＩ）試験群とは対照的に、トレール六量体試験群（Ｉ＋ＩＩ）は約３０％の死滅率を示したし、これは、陽性対照群（Ｒ＆Ｄ ＴＲＡＩＬ）の死滅率である８％よりも約４倍高い数値であることが確認された（図５Ａ及び図５Ｂ）。

【0119】

以上、本発明の実施例について説明したが、当該技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された本発明の思想から逸脱しない範囲内で、構成要素の付加、変更、削除又は追加などによって本発明を様々に修正及び変更させることが可能であろうし、それらもまた本発明の権利範囲に含まれると言えよう。

【図面の簡単な説明】

【0120】

【図1A】Ａｌｐｈａｆｏｌｄ２を用いてコイルＣ’－ＧＦＰ－６ｘＨｉｓ及びコイルＣ－ｍＣｈｅｒｒｙ－６ｘＨｉｓの構造を予測した結果である。

【図1B】精製されたＣ’－ＧＦＰ及びＣ－ｍＣｈｅｒｒｙの分子量をＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した結果である。

【図2A】コイル融合蛍光タンパク質が正しく折り畳まれたかを確認するためにＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥを行った結果である。

【図2B】等温適正熱量計（ＩＴＣ）を用いてＣ’－ＧＦＰ及びＣ－ｍＣｈｅｒｒｙ間の熱力学を調べて結合媒介変数を決定した結果である。

【図3A】Ａｌａ２７－Ｉｌｅ８、Ｔｈｒ６－Ａｒｇ２９、Ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ１、及びＣｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ２が安定した複合体を形成するか否かを確認した結果である。

【図3B】Ａｌａ２７－Ｉｌｅ８、Ｔｈｒ６－Ａｒｇ２９、Ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ１、及びＣｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ＿Ｆ２の相対的発現量を比較した結果である。

【図3C】Ａｌａ２７－Ｉｌｅ８のＦＲＥＴ効率を１００％とした時に、Ｔｈｒ６－Ａｒｇ２９、Ｃ’－ＧＦＰ／Ｃ－ｍＣｈｅｒｒｙのＦＲＥＴ効率を相対的に比較した結果である。

【図4】トレール六量体と死滅受容体との親和度（ＤＲ ａｎｄ ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ＋ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ’）を、トレール三量体－Ｃ又はトレール三量体－Ｃ’と死滅受容体との親和度（ＤＲ ａｎｄ ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ ｏｒ ＤＲ ａｎｄ ｓｃＴＲＡＩＬ－Ｃ’）と比較した結果である。

【図5A】陽性対照群（Ｒ＆Ｄ ＴＲＡＩＬ）、トレール三量体－Ｃ（Ｉ）試験群、トレール三量体－Ｃ’（ＩＩ）試験群及びトレール六量体試験群（Ｉ＋ＩＩ）を処理した膠芽細胞腫細胞株を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）を用いて観察した結果である。

【図5B】陽性対照群（ＰＣ）、トレール三量体－Ｃ試験群（Ｔ１）、トレール三量体－Ｃ’（Ｔ２）試験群及びトレール六量体試験群（Ｔ３）の癌細胞死滅率を比較した結果である。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【配列表】

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【国際調査報告】