特表 2024-530951 二重特異性融合ポリペプチド及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-27

(54)【発明の名称】二重特異性融合ポリペプチド及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240820BHJP

   C07K 16/22 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240820BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240820BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240820BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20240820BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240820BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240820BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/22

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P35/00

A61P27/02

A61P27/06

A61P9/10

A61K39/395 N

A61K39/395 D

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024508305

(86)(22)【出願日】2022-08-09

(85)【翻訳文提出日】2024-04-04

(86)【国際出願番号】 CN2022111142

(87)【国際公開番号】W WO2023016449

(87)【国際公開日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】202110910605.4

(32)【優先日】2021-08-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524051874

【氏名又は名称】ユアンプ バイオテクノロジー（ウーハン）カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＹＵＡＮＰＵ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（ＷＵＨＡＮ） ＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ドン，シコン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，フイ

(72)【発明者】

【氏名】スン，ウェンジエ

(72)【発明者】

【氏名】リウ，イー

(72)【発明者】

【氏名】フェン，ヤン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA33

4C085BB11

4C085BB31

4C085CC22

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA24

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

ＶＥＧＦＡを特異的に認識する第１ドメインと、ＶＥＧＦＣを特異的に認識する第２ドメインとを含む、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ＡとＶＥＧＦＣに結合する二重特異性融合ポリペプチドを提供する。また、前記二重特異性融合ポリペプチドのＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＣに関連する疾患を治療又は予防する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ＡとＶＥＧＦＣに結合する二重特異性融合ポリペプチドであって、ＶＥＧＦＡを特異的に認識する第１ドメインと、ＶＥＧＦＣを特異的に認識する第２ドメインとを含む二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項2】

前記第１ドメインは、ＶＥＧＦＡを特異的に認識する血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）又はその機能性断片、又はＶＥＧＦＡに対する抗体又はその機能性断片であり、
前記第２ドメインは、ＶＥＧＦＣを特異的に認識するＶＥＧＦＲ又はその機能性断片、又はＶＥＧＦＣに対する抗体又はその機能性断片であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項3】

前記第１ドメインは、ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン２及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３を含み、又は
前記第１ドメインは、ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ナノ抗体、重鎖可変領域（ＶＨ）断片又は軽鎖可変領域（ＶＬ）断片を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項4】

前記第２ドメインは、ＶＥＧＦＲ３のＩｇ様ドメイン１、Ｉｇ様ドメイン２及びＩｇ様ドメイン３を含み、又は
前記第２ドメインは、ＶＥＧＦＣに特異的に結合する抗体Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ナノ抗体断片、ＶＨ断片又はＶＬ断片を含むことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項5】

前記二重特異性融合ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第３ドメインをさらに含み、
好ましくは、前記免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥから選ばれ、好ましくはＩｇＧであり、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、
より好ましくは、前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１５のいずれか一項に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１５のいずれか一項と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項6】

前記第１ドメイン、前記第２ドメイン及び／又は第３ドメインは、直接接続され又はリンカーを介して接続され、
好ましくは、前記リンカーは少なくとも６つのアミノ酸を含み、
より好ましくは、前記リンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又は８に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又は８に示されるアミノ酸配列と比較して１、２又は３個のアミノ酸の挿入、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項５に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項7】

前記第１ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記第１ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又は、前記第１ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項8】

前記第２ドメインは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対応する７５番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項9】

前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対応する７５番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列において、７５番目のアミノ酸はグルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン又はリジンに置換され、
好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対応する７５番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項８に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項10】

前記第２ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対応する８０番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対応する８０番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列において、８０番目のアミノ酸はグルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン又はリジンに置換され、より好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対応する８０番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項11】

前記二重特異性融合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７～２４のいずれか一項に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７～２４のいずれか一項に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。

【請求項13】

核酸送達キャリアであって、請求項１２に記載の単離された核酸分子を含む核酸送達キャリア、
好ましくは、前記核酸送達キャリアは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス又は他の許容可能な核酸送達キャリアに由来するものを含む。

【請求項14】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性融合ポリペプチドの二量体を含むことを特徴とする血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ＡとＶＥＧＦＣとの二重特異性結合分子、
好ましくは、前記二量体はホモ二量体又はヘテロ二量体である。

【請求項15】

請求項１２に記載の単離された核酸分子を含む宿主細胞。

【請求項16】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性融合ポリペプチド、請求項１２に記載の単離された核酸分子、請求項１３に記載の核酸送達キャリア、又は請求項１４に記載の二重特異性結合分子、及び薬学的に許容される担体を含む薬物組成物。

【請求項17】

前記薬物組成物は、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、注射剤、懸濁液、粉剤、乳剤、エアロゾル剤、ゲル剤、点眼剤、徐放剤又は徐放性インプラントの形態であることを特徴とする請求項１６に記載の薬物組成物。

【請求項18】

容器に封入される請求項１６又は１７に記載の薬物組成物を含むキット、
前記容器は、好ましくはガラスアンプル、ガラス瓶、プラスチックアンプル、プラスチックボトル、プラスチック袋、又はプレフィルドシリンジである。

【請求項19】

治療有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性融合ポリペプチド、請求項１２に記載の単離された核酸分子、請求項１３に記載の核酸送達キャリア、又は請求項１４に記載の二重特異性結合分子又は請求項１６又は１７に記載の薬物組成物を被験者に投与することを含む、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＣに関連する疾患を治療又は予防する方法。

【請求項20】

前記疾患は、血管新生性眼疾患及び癌関連適応症から選ばれ、好ましくは、前記疾患は、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症、新生血管性緑内障、網膜静脈閉塞、角膜新生血管、角膜移植後新生血管、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、膵臓癌、肝臓癌、子宮頸癌及び膠芽腫から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、融合ポリペプチドの分野に関し、より具体的には、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＣとを結合する二重特異性融合ポリペプチド及びその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

脈管形成とは、内皮細胞の前駆細胞又は脈管母細胞から新たな脈管を形成することをいう。血管新生とは、組織中に既に存在する血管の内皮細胞が増殖と遊走を起こして小血管を形成する過程である。脈管形成及び血管新生は、発育及びその後の生理学的動態バランス過程において重要であるが、癌及び複数の眼科疾患において病原性である可能性がある。

【0003】

既に、脈管形成及び血管新生に非常に重要な血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーが同定された。ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ、ＶＥＧＦＥ及び胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）を含む。ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）は、主にＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３の３種類のサブタイプを含む。異なるＶＥＧＦは、それぞれの受容体（ＶＥＧＦＲ）のサブタイプと結合し、ＶＥＧＦＲをリン酸化し、さらに対応する生物学的作用を発揮する。したがって、ＶＥＧＦとその受容体ＶＥＧＦＲとの結合を遮断し、内皮細胞の増殖、血管増生及び漏れを効果的に抑制し、内皮細胞の増殖及び血管新生に関連する疾患を治療する目的を達成することができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

従来技術に存在する技術的課題の１つを解決するために、本発明は、様々な血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）とその受容体ＶＥＧＦＲとの結合を効果的に遮断し、内皮細胞の増殖、脈管増生及び漏れを抑制することができる新規な融合ポリペプチドを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の一態様は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ＡとＶＥＧＦＣに結合する二重特異性融合ポリペプチドであって、ＶＥＧＦＡを特異的に認識する第１ドメインと、ＶＥＧＦＣを特異的に認識する第２ドメインとを含む二重特異性融合ポリペプチドを提供する。

【0006】

本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメインは、ＶＥＧＦＡを特異的に認識する血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）又はその機能性断片であってもよい。本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメインは、ＶＥＧＦＡを特異的に認識する抗体又はその機能性断片であってもよい。

【0007】

本発明のいくつかの実施形態において、前記第２ドメインは、ＶＥＧＦＣを特異的に認識するＶＥＧＦＲ又はその機能性断片であってもよい。本発明のいくつかの実施形態において、前記第２ドメインは、ＶＥＧＦＣを特異的に認識する抗体又はその機能性断片であってもよい。

【0008】

本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメインは、ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン２及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３を含んでもよい。本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメインは、ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ナノ抗体、重鎖可変領域（ＶＨ）断片又は軽鎖可変領域（ＶＬ）断片を含んでもよい。本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメインは、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン４を含んでもよい。

【0009】

本発明のいくつかの実施形態において、前記第２ドメインは、ＶＥＧＦＲ３のＩｇ様ドメイン１、Ｉｇ様ドメイン２及びＩｇ様ドメイン３を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記第２ドメインは、ＶＥＧＦＣに特異的に結合する抗体Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ナノ抗体断片、ＶＨ断片又はＶＬ断片を含む。

【0010】

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第３ドメインをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥから選ばれる。本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫グロブリンはＩｇＧである。本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である。

【0011】

本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメイン、前記第２ドメイン及び／又は第３ドメインは、直接接続され又はリンカーを介して接続される。

【0012】

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、前記第１ドメイン、前記第２ドメイン及び前記第３ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、任意の方式で連結された第１ドメイン、第２ドメイン及び第３ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの第１ドメイン－第２ドメイン－第３ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの第１ドメイン－第３ドメイン－第２ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの第２ドメイン－第１ドメイン－第３ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの第２ドメイン－第３ドメイン－第１ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの第３ドメイン－第１ドメイン－第２ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端までの第３ドメイン－第２ドメイン－第１ドメインを含む。

【0013】

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、前記第１ドメイン及び前記第３ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメインは、前記第３ドメインのＮ末端に直接接続されるか、又はリンカーを介して前記第３ドメインのＮ末端に接続され、その逆も同様である。

【0014】

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、前記第１ドメイン及び前記第２ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメインは、前記第２ドメインのＮ末端に直接接続されるか、又はリンカーを介して前記第２ドメインのＮ末端に接続され、その逆も同様である。

【0015】

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、前記第２ドメイン及び前記第３ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記第２ドメインは、前記第３ドメインのＮ末端に直接接続されるか、又はリンカーを介して前記第３ドメインのＮ末端に接続され、その逆も同様である。

【0016】

本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１５のいずれか一項に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１５のいずれか一項と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0017】

本発明のいくつかの実施形態において、前記リンカーは少なくとも６つのアミノ酸を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記リンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又は８に示されるアミノ酸配列と比較して１、２又は３個のアミノ酸の挿入、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有する。

【0018】

本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0019】

本発明のいくつかの実施形態において、前記第２ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対応する７５番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0020】

本発明のいくつかの実施形態において、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対応する７５番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列において、７５番目のアミノ酸はグルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン又はリジンに置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対応する７５番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列である。

【0021】

本発明のいくつかの実施形態において、前記第２ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対応する８０番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対応する８０番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列において、８０番目のアミノ酸はグルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン又はリジンに置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対応する８０番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列である。

【0022】

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性融合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0023】

本発明の別の態様は、本発明の二重特異性融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。

【0024】

本発明のさらに別の態様は、本発明の単離された核酸分子を含む核酸送達キャリアを提供する。本発明のいくつかの実施形態によれば、前記核酸送達キャリアは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス又は他の許容可能な核酸送達キャリアに由来することができる。

【0025】

本発明のさらに別の態様は、本発明の二重特異性融合ポリペプチドが形成する二量体を含む、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ＡとＶＥＧＦＣとの二重特異性結合分子を提供する。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドはホモ二量体を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドはヘテロ二量体を形成する。

【0026】

本発明のいくつかの実施形態において、本発明の二重特異性融合ポリペプチドは、第１ドメイン、第２ドメイン及び第３ドメインを含み、前記第３ドメインは免疫グロブリンのＦｃ領域を含む。本発明のいくつかの実施形態において、Ｎ－末端からＣ－末端までの第１ドメイン－第２ドメイン－第３ドメインを含む二重特異性融合ポリペプチドは二量体を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、Ｎ－末端からＣ－末端までの第１ドメイン－第３ドメイン－第２ドメインを含む二重特異性融合ポリペプチドは二量体を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、Ｎ－末端からＣ－末端までの第２ドメイン－第１ドメイン－第３ドメインを含む二重特異性融合ポリペプチドは二量体を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、Ｎ－末端からＣ－末端までの第２ドメイン－第３ドメイン－第１ドメインを含む二重特異性融合ポリペプチドは二量体を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、Ｎ－末端からＣ－末端までの第３ドメイン－第１ドメイン－第２ドメインを含む二重特異性融合ポリペプチドは二量体を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、Ｎ－末端からＣ－末端までの第３ドメイン－第２ドメイン－第１ドメインを含む二重特異性融合ポリペプチドは二量体を形成する。

【0027】

本発明のさらに別の態様は、本発明に記載の単離された核酸分子を含む宿主細胞を提供する。

【0028】

本発明のさらに別の態様は、薬物組成物を提供する。本発明のいくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、本発明に記載の二重特異性融合ポリペプチド、及び薬学的に許容される担体を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、本発明に記載の単離された核酸分子、及び薬学的に許容される担体を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、本発明に記載の核酸送達キャリア、及び薬学的に許容される担体を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、本発明に記載の二重特異性結合分子、及び薬学的に許容される担体を含む。

【0029】

本発明のいくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、注射剤、懸濁液、粉剤、乳剤、エアロゾル剤、ゲル剤、点眼剤、徐放剤又は徐放性インプラントの形態である。いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、注射可能な調製物として調製されてもよい。いくつかの実施形態において、前記調製物は、硝子体内注射、皮下、皮内、筋肉内、静脈、髄腔内又は脊髄内投与に適している。

【0030】

本発明のさらに他の態様は、容器に封入される本発明に記載の薬物組成物を含むキットを提供する。本発明のいくつかの実施形態において、前記容器は、ガラスアンプル、ガラス瓶、プラスチックアンプル、プラスチックボトル、プラスチック袋、又はプレフィルドシリンジである。いくつかの実施形態において、本発明は、適切な容器内の本明細書に記載の薬物組成物を含む、ヒトの非経口投与に適した薬物単位剤形に関する。いくつかの実施形態において、前記適切な容器は、プレフィルドシリンジである。いくつかの実施形態において、該プレフィルドシリンジは注射針を含む。

【0031】

本発明のさらに別の態様は、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＣに関連する疾患を治療又は予防する方法を提供する。前記方法は、治療有効量の本発明に記載の二重特異性融合ポリペプチド、本発明に記載の単離された核酸分子、本発明に記載の単離された核酸分子を含む核酸送達キャリア、本発明の二重特異性結合分子又は本発明に記載の薬物組成物を被験者に投与することを含む。

【0032】

本発明のいくつかの実施形態において、前記疾患は、血管新生性眼疾患及び癌関連適応症から選ばれる。本発明のいくつかの実施形態において、前記疾患は、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症、新生血管性緑内障、網膜静脈閉塞、角膜新生血管、角膜移植後新生血管、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、膵臓癌、肝臓癌、子宮頸癌及び膠芽腫から選択される。

【0033】

発明の詳細な説明
定義
特に定義されない限り、本発明で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する分野で通常使用されるものと同じ意味を有する。本明細書を説明する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合、単数形で使用される用語も複数形を含み、その逆もまた同様である。

【0034】

文脈で明確に説明しない限り、本明細書で用いられる「一」、「一種」及び「一つ」という表現は、複数の指示を含む。例えば、「１つの細胞」が言及されると、複数のこのような細胞及び当業者に知られる同等物などを含む。

【0035】

本明細書で使用される用語「約」とは、その後の数値の±２０％の範囲を意味する。いくつかの実施形態において、用語「約」は、その後の数値の±１０％の範囲を示す。いくつかの実施形態において、用語「約」は、その後の数値の±５％の範囲を示す。

【0036】

本明細書で使用される用語「血管内皮成長因子」又は「ＶＥＧＦ」は、１６５－アミノ酸の血管内皮成長因子、及び関連する１２１－、１８９－及び２０６－アミノ酸の血管内皮成長因子等（例えば、Leung et al., Science 246:1306(1989)及びHouckら、Mol. Endocrin.5:1806(1991)に記載される通り）、並びにこれらの成長因子の天然に存在するアレル形態及び加工された形態を意味する。ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ、ＶＥＧＦＥ及び胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）を含む。ＶＥＧＦは、脈管内皮細胞の成長を高度に特異的に促進する因子であり、脈管透過性の増加、細胞外基質の変性、脈管内皮細胞の遊走、増殖及び脈管形成を促進するなどの作用を有する。

【0037】

本明細書で使用される用語「血管内皮成長因子受容体」、「ＶＥＧＦ受容体」又は「ＶＥＧＦＲ」は、ＶＥＧＦの細胞受容体を意味し、通常、脈管内皮細胞に発見された細胞表面受容体及びそのＶＥＧＦ結合能を保留する変異体である。ＶＥＧＦＲファミリーは、主にＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３を含む。ＶＥＧＦＲファミリーのこの３つのメンバーは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内のチロシンキナーゼドメインを含み、細胞外ドメインのいずれにも７つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有する（図１に示す）。タンパク質Ｎ末端からのこの７つの免疫グロブリンドメインは、それぞれＩｇ様ドメイン１、Ｉｇ様ドメイン２、Ｉｇ様ドメイン３、Ｉｇ様ドメイン４、Ｉｇ様ドメイン５、Ｉｇ様ドメイン６及びＩｇ様ドメイン７と呼ばれる。ＶＥＧＦＲは、その細胞外ドメインを介してＶＥＧＦと結合し、またＶＥＧＦＲのＩｇ様ドメインはＶＥＧＦと高い親和力を有する。ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２はほとんどの血管内皮細胞で発現し、ＶＥＧＦＲ３は主にリンパ管内皮細胞で発現する。ＶＥＧＦＡは、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２と結合することにより、細胞内の関連シグナル伝達経路を起動し、細胞増殖、血管形成などの生理学的病理的過程に関与することができ、新生血管形成を促進し血管透過性を増加させるだけでなく、細胞アポトーシスを防止して血管の維持を実現することもできる。ＶＥＧＦＲ１の２番目のＩｇ様ドメイン（すなわち、Ｉｇ様ドメイン２）は、該受容体とＶＥＧＦとの結合を決定することが報告されている（Terri Davis-Smyth et al., The EMBO Journal, vol.15 no.18, pp4919-4927, 1996）。ＶＥＧＦＣは、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３と結合することができ、主にリンパ管の生成を調節するために用いられる。ＶＥＧＦＢは非新生血管が形成した腫瘍において作用する可能性があり、ＶＥＧＦＣとＶＥＧＦＤは癌組織の新生血管と新生リンパ管の形成過程において作用することができ、ＶＥＧＦＥも潜在的な新生血管形成因子である。報道によれば、ＶＥＧＦＲ３はＶＥＧＦＤと結合することもできる。ＰＬＧＦは、その受容体ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ－１に特異的に結合することによってシグナル伝達経路を活性化し、内皮細胞と間質細胞の作用を媒介し、内皮細胞の分化成熟にも影響する。

【0038】

本明細書で使用される「融合ポリペプチド」という用語は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの遺伝的発現又はタンパク質合成方法を使用して、２つ又は複数のタンパク質又はその断片をそれぞれのペプチド骨格を介して共線状に連結することを意味する。好ましくは、前記ポリペプチド又はその断片は異なる由来である。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、異なる由来のペプチド断片、例えばＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、免疫グロブリン又は抗体断片に由来するものを含む。

【0039】

本明細書で使用される用語「親和力」又は「結合親和力」とは、分子（例えば、二重特異性融合ポリペプチド又は二重特異性結合分子）の単一の結合部位とその結合リガンド（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を意味する。結合親和力は、通常、解離定数（Ｋ_D）で表すことができ、解離定数（Ｋ_D）は、解離速度（ｋ_d）と結合速度（ｋ_a）との比率、すなわち、Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aである。親和力は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）など、当分野で公知の従来の方法により測定することができる。

【0040】

本明細書で使用される用語「特異的に認識する」又は「特異的に結合する」とは、融合ポリペプチド又は特異性結合分子がリガンドに対して認識及び結合選択性を有し、不要な又は非特異的な結合と区別できることを意味する。１つの実施形態において、例えばＳＰＲにより測定された、本発明の二重特異性融合ポリペプチド又は二重特異性結合分子は、無相関タンパク質との結合度がＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣとの結合度の約１０％未満である。いくつかの実施形態において、本発明によって提供される二重特異性融合ポリペプチド又は二重特異性結合分子は、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣに結合するＫ_Dがいずれも１０^-7Ｍ以下であり、例えば、１０^-10Ｍ～１０^-11Ｍである。

【0041】

本明細書においてアミノ酸に対して使用される用語「置換」とは、あるアミノ酸配列における少なくとも１つのアミノ酸残基が別の異なる「置換」アミノ酸残基に置換されることを意味する。本明細書においてアミノ酸に対して使用される用語「挿入」とは、少なくとも１つの追加のアミノ酸をあるアミノ酸配列に組み込むことを意味する。挿入物は、通常、挿入される１又は２個のアミノ酸残基からなるが、例えば、約３～５個、又は最大で約１０、１５又は２０個のアミノ酸残基が挿入された大きな「ペプチド挿入物」を調製してもよい。以上に開示したように、挿入される残基は、天然に存在していても、天然に存在していなくてもよい。本明細書においてアミノ酸に対して使用される用語「欠失」とは、あるアミノ酸配列から少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することを意味する。

【0042】

本開示の融合ポリペプチド又はその断片は、１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば必須又は非必須のアミノ酸残基に保存的アミノ酸置換を含んでもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることである。本分野では、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが定義されている。したがって、本明細書において、融合ポリペプチド又はリンカーにおける必須又は非必須のアミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置換される。いくつかの実施形態において、アミノ酸セグメントは、構造が類似し、側鎖ファミリーのメンバーの順序及び／又は組成が異なるセグメントで置換されてもよい。あるいは、いくつかの実施形態において、飽和突然変異誘発によって導入されるなど、コード配列の全部又は一部にランダムに突然変異を導入してもよく、それによって得られた突然変異体は、本発明の融合ポリペプチドに取り込まれ、これらのポリペプチドが所望の標的に結合する能力をスクリーニングしてもよい。

【0043】

本明細書で使用される用語「抗体」は、完全な抗体及び任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」、「抗原結合ポリペプチド」又は「免疫結合剤」）、又はそれらの一本鎖を含む。「抗体」は、少なくとも２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）がジスルフィド結合により互いに連結された糖タンパク質、又はその抗原結合部分を含む糖タンパク質の一種である。各重鎖はいずれも重鎖可変（ＶＨ）領域及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。各軽鎖はいずれも軽鎖可変（ＶＬ）領域及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、それぞれ３つのアミノ酸組成及び配列順序が高度に可変である領域を含み、高可変領域又は相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれる。ＶＨ領域及びＶＬ領域のうちＣＤＲ領域以外の領域のアミノ酸組成及び配列順序は相対的に保存され、骨格領域（framework region、ＦＲ）と呼ばれる。ＶＨ又はＶＬは、それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４で表される４つの骨格領域を有する。

【0044】

免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという５つの主要タイプが存在し、これらの主要タイプは、さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２というサブタイプ（アイソタイプ）に分類することもできる。異なるタイプの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるタイプ（κ又はλ）の免疫グロブリンのＣＬの長さはほぼ一致するが、異なるタイプの免疫グロブリンのＣＨの長さは異なり、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤはＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含み、ＩｇＭ及びＩｇＥはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４を含む。ヒンジ領域（hinge region）は、ＣＨ１とＣＨ２との間に位置し、プロリンを豊富に含み、伸展湾曲しやすく、抗原結合部位間の距離を変化させ、抗体が異なる位置にある抗原エピトープに結合するのに有利である。ヒンジ領域はパパイン、ペプシンなどによって加水分解されやすく、異なる加水分解断片を生成する。パパインがＩｇを加水分解する部位は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合で連結された２本の重鎖のＮ末端に近く、Ｉｇを２つの完全に同じＦａｂ断片と１つのＦｃ断片に分解することができる。Ｆａｂ断片は、抗原結合断片（fragment antigenbinding、Ｆａｂ）であり、１本の完全な軽鎖と重鎖のＶＨ及びＣＨｌドメインからなる。

【0045】

本明細書で使用される用語「抗体」、「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」のＦｃ領域は、免疫グロブリン重鎖又はその断片のＣ末端の定常ドメイン又は定常領域（ＣＨ）を意味し、結晶性断片（fragment crystallizable、Ｆｃ）であり、ＩｇのＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる。本明細書において、用語「Ｆｃ領域」は、野生型Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。野生型Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９は、野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を示す。用語「変異体（ヒト）Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸が変異することにより、そのアミノ酸配列が野生型（ヒト）Ｆｃ領域のアミノ酸配列と異なることを意味する。いくつかの実施形態において、野生型Ｆｃ領域と比較して、変異体Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸変異、例えば１～１０個のアミノ酸変異を有する。いくつかの実施形態において、変異体Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して、１～３個のアミノ酸変異を有する。

【0046】

本明細書で使用される用語「ホモ二量体」は、本発明の融合ポリペプチドから形成され、２本の同じ本発明の融合ポリペプチドを含むことを意味する。本明細書で使用される用語「ヘテロ二量体」は、本発明の融合ポリペプチドから形成され、２本の異なる本発明の融合ポリペプチドを含むことを意味する。

【0047】

本明細書で使用される用語「個体」又は「被験者」とは、哺乳動物を意味し、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含むがこれらに限定されず、例えば、哺乳動物は、馴養動物（例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ネコ及びイヌ）、霊長類動物（例えば、ヒト及びサル）及びげっ歯動物（例えば、ウサギ、マウス及びラット）を含むがこれらに限定されない。

【0048】

本明細書で使用される数値範囲は、この範囲内の全ての数字を列挙したものとして理解されるべきである。例えば、１から２０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のグループからの任意の数字、数字の組み合わせ、又はサブ範囲を含むと理解されるべきである。

【0049】

本明細書で使用される用語「リンカー」は、鎖状のアミノ酸からなる天然及び／又は合成由来の（ペプチド）リンカーを意味する。本発明の二重特異性融合ポリペプチドにおける各ドメインは、リンカーを介して連結されてもよく、各リンカーは、少なくとも２つのポリペプチド又はドメインと融合及び／又は他の方式で（例えば、ペプチド結合を介して）連結される。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性融合ポリペプチドに存在する全てのリンカーのアミノ酸配列は同じである。他の実施形態において、本発明の二重特異性融合ポリペプチドに存在する少なくとも２つのリンカーのアミノ酸配列は異なる。リンカーは、このように２つ又はより多くのモノマードメインを連結するのに適した長さを有するべきであり、リンカーは、その連結された異なるドメインが正確に折り畳まれて適切に発現され、生物学的活性を発揮する機能を保証することができる。異なる実施形態において、リンカーはフレキシブルな配座を有する。適切なフレキシブルリンカーは、例えば、グリシン、グルタミン及び／又はセリン残基を有するものを含む。いくつかの実施形態において、リンカー中のアミノ酸残基は、５個のアミノ酸までの小さな繰り返し単位配列であってもよく、例えば、ＧＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）又はＧＧＧＳＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）に示されるアミノ酸配列を有する。

【0050】

参照アミノ酸配列に対して「百分率（％）配列同一性を有する」とは、最大百分率配列同一性を得るために配列比較及び（必要に応じて）ノッチを導入した後、候補配列において参照アミノ酸配列のアミノ酸残基と同じであるアミノ酸残基の百分率を意味するが、配列同一性に保存的に置換される一部はいずれ考慮しない。アミノ酸配列の同一性百分率を特定するために、例えばＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当分野の範囲内の様々な方式で比較することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の比較を実現するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列比較のための適切なパラメータを決定することができる。

【0051】

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、薬物製剤における活性成分以外の被験者に対して毒性のない成分を意味する。薬学的に許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は防腐剤を含むが、これらに限定されない。

【0052】

本明細書で使用される用語「治療」は、障害及び／又はそれに関連する疾患又は症状を軽減及び／又は改善し、障害症状の悪化を予防することを意味する。所望の治療効果は、疾患の発生又は再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の緩和、症状の改善又は緩和、予後の緩和又は改善を含むが、これらに限定されない。しかし、疾患又は症状の治療は、当該疾患又はそれに関連する症状を完全に解消することを要求するものではない。

【0053】

本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の治療又は予防効果を達成するために、必要な用量及び期間における有効な量を意味する。

【0054】

以下、本発明の理解を助けるために、実施例及び図面を提供する。ただし、これらの実施例及び図面は、本発明を説明するためのものに過ぎず、何ら制限を構成するものではない。本発明の実際の保護範囲は特許請求の範囲によって示される。本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で任意に修正、変更可能であると理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0055】

【図1】図１はＶＥＧＦＲファミリーの３種類のサブタイプのＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３の構造模式図を示す。

【図2】図２は構築された融合ポリペプチド鎖の構造模式図である。ただし、図１と同じドメインには同じパターンが充填されており、「＊」はＶＥＧＦＲ３のＩｇ様ドメイン１に変異があることを示す。

【図3】図３は発現した融合ポリペプチド二量体の模式図を示す。

【図4】図４は本発明の二重特異性タンパク質とＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣとの結合を示す。（Ａ）本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ３、ＢｉＦｐＣ４及びＢｉＦｐＣ５がＶＥＧＦＡに結合したＥＬＩＳＡ結果を示し、（Ｂ）本発明の二重特異性タンパク質がＶＥＧＦＣに結合したＥＬＩＳＡ結果を示し、（Ｃ）本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６がＶＥＧＦＡ（ＶＡ）又はＶＥＧＦＣ（ＶＣ）に結合したＥＬＩＳＡ結果を示す。

【図5】図５は本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ６がＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣと同時に結合することを示す。（Ａ）ＢｉＦｐＣ２がＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣと同時に結合することを示す。（Ｂ）ＢｉＦｐＣ６がＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣと同時に結合することを示す。

【図6】図６は本発明の二重特異性タンパク質がＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＣによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対する抑制を示す。（Ａ）ＢｉＦｐＣ２がＶＥＧＦＡによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制することを示す。（Ｂ）ＢｉＦｐＣ６がＶＥＧＦＡによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制することを示す。（Ｃ）ＢｉＦｐＣ２がＶＥＧＦＣによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制することを示す。（Ｄ）ＢｉＦｐＣ６がＶＥＧＦＣによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制することを示す。

【図7】図７は本発明の二重特異性タンパク質のＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＣに対する競合的結合を示す。（Ａ）ＢｉＦｐＣ２がＥｙｌｅａと競合的にＶＥＧＦＡに結合することを示す。（Ｂ）ＢｉＦｐＣ６がＶＥＧＦＲ２と競合的にＶＥＧＦＡに結合することを示す。（Ｃ）ＢｉＦｐＣ２がＶＥＧＦＲ３－Ｆｃと競合的にＶＥＧＦＣに結合することを示す。（Ｄ）ＢｉＦｐＣ６がＶＥＧＦＲ３と競合的にＶＥＧＦＣに結合することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0056】

本発明の目的、技術案及び利点をより明確にするために、以下、実施例を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。ここで説明される具体的な実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。なお、以下の説明では、本開示の概念を不必要に混同しないように、周知の構成や技術の説明を省略する。このような構造及び技術は、例えばSambrook，J.，Fritsch，E．F．及びManiais，T．（1989） Molecular Cloning： A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Pressのような多くの出版物においても記載されている。

【0057】

実施例１ 発現プラスミドの構築
本実施例において、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３、ＶＥＧＦＲ３のＩｇ様ドメイン１～３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＶＥＧＦＡに対する一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）とヒトＩｇＧ１－Ｆｃを選択し、下記表１に示される組み合わせを行った。

【0058】

【表1】

備考：「Ｒ１Ｄ２」は、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２を示す。「Ｒ２Ｄ３」は、ＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３を示す。「Ｒ３Ｄ１Ｄ２Ｄ３」は、ＶＥＧＦＲ３のＩｇ様ドメイン１、Ｉｇ様ドメイン２及びＩｇ様ドメイン３を示す。「Ｆｃ」はヒト由来免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ領域を示す。「Ｆｃ（ＦＬ）」は、Ｆｃ（full-length、全長）を示し、ヒト由来ＩｇＧ１のＦｃ領域であり、「Ｆｃ」よりも５個のアミノ酸「ＥＰＫＳＣ」が多いとともに、「Ｆｃ」よりもヒンジ領域に１個のジスルフィド結合が多い。示された突然変異部位は、突然変異が存在する融合ポリペプチド鎖のＮ末端から始まり、アミノ酸の番号付けを行う。

【0059】

上記表に示す構造に従って、８本の融合ポリペプチド鎖を得た。それらのアミノ酸配列はそれぞれ以下のとおりである。
ＢｉＦｐＣ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、
ＢｉＦｐＣ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、
ＢｉＦｐＣ３鎖１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、
ＢｉＦｐＣ３鎖２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、
ＢｉＦｐＣ４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、
ＢｉＦｐＣ５鎖１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、
ＢｉＦｐＣ５鎖２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、
ＢｉＦｐＣ６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４。

【0060】

図２は、上記融合ポリペプチド鎖の構造模式図を示し、図中の「＊」は、アミノ酸配列に突然変異があることを示す。

【0061】

上記８種の融合ポリペプチド鎖をコードする核酸配列を、標準分子生物学技術（例えば、Sambrook，J.，Fritsch，E．F．及びManiais，T．（1989） Molecular Cloning： A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Pressを参照）を用いて、それぞれ一過性発現ベクターｐｔｔ５又は安定化発現ベクターＦＴＰ００２に挿入する。具体的には、ベクターＦＴＰ００２のＥＦ－１αプロモーターの下流のマルチクローニングサイトにＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ４及びＢｉＦｐＣ６を挿入し、ベクターｐｔｔ５のマルチクローニングサイトにＢｉＦｐＣ３鎖１、ＢｉＦｐＣ３鎖２、ＢｉＦｐＣ５鎖１及びＢｉＦｐＣ５鎖２を挿入した。８種類のプラスミド構築物ＦＴＰ００２－ＢｉＦｐＣ１、ＦＴＰ００２－ＢｉＦｐＣ２、ｐｔｔ５－ＢｉＦｐＣ３鎖１、ｐｔｔ５－ＢｉＦｐＣ３鎖２、ＦＴＰ００２－ＢｉＦｐＣ４、ｐｔｔ５－ＢｉＦｐＣ５鎖１、ｐｔｔ５－ＢｉＦｐＣ５鎖２、ＦＴＰ００２－ＢｉＦｐＣ６を得た。シーケンシングにより、挿入配列の正確性を検証した。

【0062】

実施例２ 二重特異性タンパク質の発現
実施例１で構築された安定発現ベクターＦＴＰ００２－ＢｉＦｐＣ１、ＦＴＰ００２－ＢｉＦｐＣ２、ＦＴＰ００２－ＢｉＦｐＣ４、ＦＴＰ００２－ＢｉＦｐＣ６を、カチオン性ポリマートランスフェクション試薬（ＡＴＧ ｆｅｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、品番ＡＴＯ０００１７、武漢普健生物）を用いて、製造元の取扱説明書に従って、チャイニーズハムスター細胞系ＣＨＯ ＨＤ－ＢＩＯＰ３（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｔｄ．、米国）にトランスフェクションした。４ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）（品番：Ａ３７０４、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ）を含むＦｅｃｔｏＣＨＯ^TMＣＤ培地（品番：７１６－０６Ｌ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）で培養した。発現ベクターは、ＥＦ－１αプロモーター及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）の遺伝子をコードする。ＧＳの発現はグルタミンの生物化学合成を可能にし、グルタミンはＣＨＯ ＨＤ－ＢＩＯＰ３細胞成長に必要なアミノ酸である。トランスフェクション後、細胞を２５μＭ Ｌ－メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ、品番：Ｍ１１１０９６、Ａｌａｄｄｉｎ、中国）で混合して選択した。ＭＳＸによりＧＳを抑制し、選択の厳しさを増すためである。発現ベクターｃＤＮＡが宿主細胞ゲノムの転写活性領域内に組み込まれた細胞を有し、ＣＨＯ ＨＤ－ＢＩＯＰ３野生型細胞を選択し、ここでＣＨＯ ＨＤ－ＢＩＯＰ３野生型細胞は内因性レベルのＧＳを発現しない。トランスフェクションされた細胞を９６ウェルプレートに低密度（約０．８ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で接種することにより、細胞を安定的に発現して指数関数的に成長することを可能にする。マスターウェル（ｍａｓｔｅｒｗｅｌｌｓ）は、二重特異性タンパク質の発現をスクリーニングし、その後、無血清のＤｙｎａｍｉｓ培地（品番：Ａ２６１７５－０２、Ｇｉｂｃｏ、米国）において浮遊培養で拡大し、二重特異性タンパク質を発現させた。

【0063】

一過性発現ベクターｐｔｔ５－ＢｉＦｐＣ３鎖１及びｐｔｔ５－ＢｉＦｐＣ３鎖２は、コトランスフェクションの方式を採用し、カチオン性ポリマートランスフェクション試薬（ＡＴＧ ｆｅｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、品番ＡＴＯ０００１７、武漢普健生物）を用いて、製造元の取扱説明書に従ってＨＥＫ－２９３細胞系にトランスフェクションした。二重特異性タンパク質を一過性的に発現するＨＥＫ－２９３細胞は、３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ₂のインキュベーター内で培養し、細胞の生存率がある程度に低下するまで収穫した（モノクローナルのスクリーニング及び培養を行わなかった）。一過性発現ベクターｐｔｔ５－ＢｉＦｐＣ５鎖１及びｐｔｔ５－ＢｉＦｐＣ５鎖２は、類似の方法で二重特異性タンパク質を発現した。

【0064】

図３は発現した二重特異性タンパク質の模式図を示す。

【0065】

実施例３ アフィニティークロマトグラフィーにより二重特異性タンパク質を精製し、その発現量及び凝集特性を検出した。
実施例２で発現した二重特異性タンパク質は培地に分泌された。二重特異性タンパク質を含む培地をプロテインＡアフィニティーカラムＵｎｉｍａｂ ５０（品番１７０１０－０５０１００、ナノマイクロテクノロジー、蘇州、中国）に加え、プロテインＡアフィニティーカラムはリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）で平衡化された。その後、結合した二重特異性タンパク質を０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ３．４）により溶出した。溶出した二重特異性タンパク質は、酸（例えば、０．１Ｍクエン酸）又は塩基（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ）で溶液のｐＨを調整し、二重特異性タンパク質を安定な状態にし、４℃で検出に供し又は分注した後－８０℃で保存する。

【0066】

二重特異性タンパク質１ｍＬを取り、紫外分光光度法を用いて『中国薬典２０２０版』に従って紫外定量を行い、２８０ｎｍでの吸収光を記録し、二重特異性タンパク質の吸収係数で割って、二重特異性タンパク質の濃度を得た。二重特異性タンパク質の発現量は、計算式：濃度（ｍｇ／ｍＬ）×アフィニティー溶出体積（ｍＬ）／ＣＨＯ細胞上清体積（Ｌ）＝二重特異性タンパク質発現量（ｍｇ／Ｌ）を採用することができる。細胞上清Ｔｉｔｅｒを測定することにより発現量を表すこともでき、実験方法は非同（成都）生物科技有限公司により提供される。

【0067】

また、発現した二重特異性タンパク質の凝集特性を検出した。発現した候補二重特異性タンパク質をモレキュラーシーブ（ＳＥＣ）ＨＰＬＣにより検出した。被検試料を１．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、モレキュラーシーブカラム（Ｓｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ－３００）に１０μＬ（１０μｇ）を注射して分析した。流速０．６５ｍＬ／分、カラム温度３５℃、２１４ｎｍで検出し、移動相は２００ｍＭリン酸塩緩衝液＋３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０であった。二重特異性タンパク質多量体、メインピーク、フラグメントは適切なピークを統合することにより測定される。

【0068】

【表2】

【0069】

表２のデータから分かるように、異なる構造の二重特異性タンパク質の間の発現量の差が大きく、そのうち、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ５及びＢｉＦｐＣ６の発現量が２５ｍｇ／Ｌを超えて高く、他の二重特異性タンパク質の発現量が低く、前記３種類の二重特異性タンパク質の発現量の約１／５だけであった。また、異なる構造は、一段階のアフィニティ精製後に得られたタンパク質サンプルにおいて、純度の差も非常に顕著であり、例えばＢｉＦｐＣ５は、発現量が大きいが、明らかにメインピークの純度が低く（目的産物はＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出結果におけるメインピークの純度によって表すことができる）、主な不純物は断片化分子であり、また、例えばＢｉＦｐＣ３は、発現量が非常に低く、同時に多量体不純物を多く（２０％を超える）含有する。以上で説明したように、異なる分子構造設計は、発現量と純度において非常に大きな差がある。

【0070】

実施例４ 本発明の二重特異性タンパク質とＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣとの結合を検出
本実施例はＥＬＩＳＡにより本発明の二重特異性タンパク質とＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣとの結合をそれぞれ検出した。

【0071】

４．１ 二重特異性タンパク質とＶＥＧＦＡとの結合を検出
５０μＬ／ウェルでリン酸塩緩衝液（１×ＰＢＳ）中の０．２μｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦＡ（品番：Ｚ０３０７３－１０μｇ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、中国）で９６ウェルプレートをコーティングし、プレートを密封して４℃で一晩コーティングした。各ウェルを洗浄バッファー１×ＰＢＳＴ（８．０１ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、１．４２ｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．２７ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、２００μＬ／ウェルの１％ウシ血清アルブミンＢＳＡ（ＢＩＯＦＲＯＸＸ）を含むＰＢＳＴを加えてブロッキングした。９６ウェルプレートを密封し、３７℃で２時間インキュベートした後、各ウェルを１×ＰＢＳＴで２回洗浄し、ブロッキング試薬を除去した。本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ３、ＢｉＦｐＣ４及びＢｉＦｐＣ５、及び陽性対照Ｅｙｌｅａを、４倍シリーズの希釈物（１×ＰＢＳで希釈）で、各ウェル（５０μＬ／ウェル）に加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、各ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、未結合の二重特異性タンパク質を除去した。その後、１００μＬ／ウェルの１：８０００希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（品番Ａｂ６８５８、Ａｂｃａｍ、米国）を添加し、３７℃で０．５時間インキュベートした。プレートを１×ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＭＢ基質（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、１００μＬ／ウェル）を加えた。暗中、３７℃で１０分間インキュベートした。最後に１００μＬの２Ｍ硫酸を各ウェルに加えて反応を停止した。マイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ Ｌｘ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を用いて、４５０ｎｍにおける光学濃度を測定した。ＥＣ₅₀は、二重特異性タンパク質、陽性対照又は陰性対照タンパク質が５０％のＶＥＧＦＡに結合する際に必要なタンパク質サンプル濃度を示す。試験はいずれも二連で行った。

【0072】

結果を図４Ａに示す。図４Ａに示すように、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ３、ＢｉＦｐＣ４及びＢｉＦｐＣ５は濃度依存的にＶＥＧＦＡに結合することができ、結合効果は陽性対照Ｅｙｌｅａに相当する。

【0073】

４．２ 二重特異性タンパク質とＶＥＧＦＣとの結合を検出
５０μＬ／ウェルでリン酸塩緩衝液（１×ＰＢＳ）中の２．０μｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ（品番：Ｚ０３２８６－１０μｇ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、中国）で９６ウェルプレートをコーティングし、プレートを密封して４℃で一晩コーティングした。各ウェルを洗浄バッファー１×ＰＢＳＴ（８．０１ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、１．４２ｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．２７ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、２００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ（ＢＩＯＦＲＯＸＸ）を含むＰＢＳＴを加えてブロッキングした。プレートを密封し、３７℃で２時間インキュベートした後、各ウェルを１×ＰＢＳＴで２回洗浄してブロッキング試薬を除去した。二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ３、ＢｉＦｐＣ４及びＢｉＦｐＣ５の４倍シリーズの希釈物（リン酸塩緩衝液１×ＰＢＳで希釈）、及び陽性対照ＯＰＴ－３０２（０．０４～４０ｎＭ、リン酸塩緩衝液１×ＰＢＳで希釈）を各ウェル（１００μＬ／ウェル）に加え、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、未結合の二重特異性タンパク質を除去した後、１００μＬ／ウェルの１：８０００希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（品番Ａｂ６８５８、Ａｂｃａｍ、米国）を添加し、３７℃で０．５時間インキュベートした。プレートを１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、１００μＬ／ウェル）を加えた。暗中、３７℃で１０分間インキュベートした。最後に１００μＬの２Ｍ硫酸を各ウェルに加えて反応を停止した。４５０ｎｍに設定した比色マイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ Ｌｘ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を用いて直ちに光学濃度を測定した。ＥＣ₅₀は、二重特異性タンパク質、陽性対照又は陰性対照タンパク質が５０％のＶＥＧＦＣに結合する際に必要なタンパク質サンプル濃度を示す。試験はいずれも二連で行った。

【0074】

結果を図４Ｂに示す。図４Ｂから分かるように、本発明のＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ３及びＢｉＦｐＣ４は、濃度依存的にＶＥＧＦＣと結合し、結合力が陽性対照ＯＰＴ－３０２に相当する。二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ５は基本的にＶＥＧＦＣとは結合しない。

【0075】

また、図４Ａ－Ｂから分かるように、異なる構造形式は、２つの標的に対する結合力が大きく区別され、ＶＥＧＦＡ標的にとって、ＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ３は、同じ結合ドメインを使用し、且つＥｙｌｅａと一致するが、明らかに各構造のＶＥＧＦＡに対する結合力が異なり、同時に、ＢｉＦｐＣ４及びＢｉＦｐＣ５は、別の同じ結合ドメインを使用するが、ＶＥＧＦＡに対する結合力も異なる。また、既存の文献から分かるように、ＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ３に使用される結合ドメインは、ＶＥＧＦＡに対する結合力がＢｉＦｐＣ４及びＢｉＦｐＣ５に使用される結合ドメインよりもはるかに高いが、本実施例の実験で得られたデータから分かるように、ＢｉＦｐＣ４及びＢｉＦｐＣ５は、逆により高い親和力を有し、ＶＥＧＦＣ標的にとって、ＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ３、ＢｉＦｐＣ４、ＢｉＦｐＣ５及び対照分子ＯＰＴ３０２と同様に、同様のＶＥＧＦＣ結合ドメインを使用したが、標的結合力に対して依然として大きな差があり、特にＢｉＦｐＣ５は、ＶＥＧＦＣに対する結合能力を完全に喪失した。以上から分かるように、同じ標的結合ドメインを採用しても、全体構造の違いにより、異なる分子は完全に異なる標的結合能を示し、増加、低下、さらには喪失する可能性がある。

【0076】

４．３ ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６のＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＣに対する結合を検出
本実施例は、ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６と抗原ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＣとの結合を比較した。

【0077】

１００μＬ／ウェルで炭酸塩緩衝液（１×ＣＢＳ）中の０．５μｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ（品番：Ｚ０３０７３－１０μｇ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、中国）で９６ウェルプレートをコーティングした。プレートを密封し、４℃で一晩コーティングした。各ウェルを洗浄バッファー１×ＰＢＳＴ（８．０１ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、１．４２ｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．２７ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、２００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ（ＢＩＯＦＲＯＸＸ）を含むＰＢＳＴを加えてブロッキングした。プレートを密封し、３７℃で２時間インキュベートした後、各ウェルを１×ＰＢＳＴで２回洗浄してブロッキング試薬を除去した。ＢｉＦｐＣ２又はＢｉＦｐＣ６の４倍シリーズの希釈物（すべてリン酸塩緩衝液１×ＰＢＳで希釈）を各ウェル（１００μＬ／ウェル）に加え、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄して未結合の二重特異性タンパク質を除去した後、１００μＬ／ウェルの１：１００００希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（品番Ａｂ９７２２５、Ａｂｃａｍ、米国）を添加し、３７℃で０．５時間インキュベートした。プレートを１×ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＭＢ基質（Ｔｉａｎｇｅｎ、１００μＬ／ウェル）を加えた。暗中、３７℃、インキュベーション時間は１０分であった。最後に、５０μＬの２Ｍ硫酸を各ウェルに加えた。４５０ｎｍに設定した比色マイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ Ｌｘ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を用いて直ちに光学濃度を測定した。ＥＣ₅₀は、二重特異性タンパク質が５０％のＶＥＧＦＡ量に結合する際に必要なタンパク質サンプル濃度を示す。試験はいずれも二連で行った。

【0078】

１００μＬ／ウェルで炭酸塩緩衝液（１×ＣＢＳ）中に２．０μｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ（品番：Ｚ０３２８６－１０μｇ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、中国）で９６ウェルプレートをコーティングし、プレートを密封して４℃で一晩コーティングした。各ウェルを洗浄バッファー１×ＰＢＳＴ（８．０１ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、１．４２ｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．２７ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、２００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ（ＢＩＯＦＲＯＸＸ）を含むＰＢＳＴを加えてブロッキングした。プレートを密封し、３７℃で２時間インキュベートした後、各ウェルを１×ＰＢＳＴで２回洗浄してブロッキング試薬を除去した。二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６の４倍シリーズの希釈物（リン酸塩緩衝液１×ＰＢＳで希釈）を各ウェル（１００μＬ／ウェル）に加え、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、未結合の二重特異性タンパク質を除去した後、１００μＬ／ウェルの１：１００００希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（品番Ａｂ９７２２５、Ａｂｃａｍ、米国）を添加し、３７℃で０．５時間インキュベートした。プレートを１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｔｉａｎｇｅｎ、１００μＬ／ウェル）を加えた。暗中、３７℃で１０分間インキュベートした。最後に５０μＬの２Ｍ硫酸を各ウェルに加えて反応を停止した。４５０ｎｍに設定した比色マイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ Ｌｘ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を用いて直ちに光学濃度を測定した。ＥＣ₅₀は、二重特異性タンパク質が５０％のＶＥＧＦＣ量に結合する際に必要なタンパク質サンプル濃度を示す。試験はいずれも二連で行った。

【0079】

図４Ｃに示すように、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６は、濃度依存的にＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＣに結合することができ、２種類の二重特異性タンパク質は、相当するＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣに対する親和力を有する。

【0080】

実施例５ 二重特異性タンパク質とＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣとの結合親和力を検出
上述したように、ＶＥＧＦＡはＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２に結合することができ、ＶＥＧＦＣはＶＥＧＦＲ２とＶＥＧＦＲ３に結合することができる。本発明で構築された候補二重特異性タンパク質がＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＣに特異的に結合できることを証明するために、本実施例はさらに表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により候補二重特異性タンパク質の結合親和力を検出した。前記のデータを総合的に考慮した後、さらにデータが好ましいＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ４及びＢｉＦｐＣ６構造を選択し、Ｂｉａｃｏｒｅにより標的親和力を評価した。

【0081】

５．１ 二重特異性タンパク質とＶＥＧＦＡとの結合親和力を検出
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ２００又はＢｉａｃｏｒｅ ８０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、ＨＥＰＥＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋３ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）をランニングバッファーとして、２５℃分析温度で、表面プラズモン共鳴測定を行い、候補二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ４及びＢｉＦｐＣ６とヒトＶＥＧＦＡ（品番：Ｚ０３０７３－１０μｇ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、中国）との結合親和力を測定した。１０μｇ／ｍＬの４種類の候補タンパク質、及びＶＥＧＦＡに特異的に結合する陽性対照品、Ｅｙｌｅａ（Ｂａｙｅｒ、ドイツ）を、それぞれプロテインＡカップリングによりプロテインＡチップ（品番：２９１５７５５５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉した。また、ヒトＶＥＧＦＡをランニングバッファー内に希釈し、１０、５、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０．１６、０．０８及び０（ブランク）ｎＭ濃度のヒトＶＥＧＦＡ溶液を調製した。

【0082】

各分析サイクルは、（１）フローセル２（Ｆｃ２）に上記候補タンパク質を捕捉すること、（２）３０μＬ／分（１２０秒）でＶＥＧＦＡ溶液をフローセル１及びフローセル２（Ｆｃ１及びＦｃ２）に注射すること、（３）１×ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を３０μＬ／分でチップに３６０秒流して解離相をモニタリングすること、（４）１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液、ｐＨ１．５で注射してプロテインＡチップ表面を再生すること、を含む。Ｂｉａｃｏｒｅ^TM Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、１：１結合モデルとの標準二重参照とフィッティングを用いてデータを加工し、結合速度（ｋ_a）と解離速度（ｋ_d）を測定した。Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aから平衡解離定数（Ｋ_D）を算出し、結果を以下の表３に示す。

【0083】

【表3】

【0084】

表３の結果から分かるように、本発明のＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ４及びＢｉＦｐＣ６はいずれもＶＥＧＦＡとの結合親和力が高く、Ｋ_DはＥｙｌｅａに類似し、１０^-11Ｍレベルに達することができる。

【0085】

５．２ 二重特異性タンパク質とＶＥＧＦＣとの結合親和力を検出
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ２００又はＢｉａｃｏｒｅ ８０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、ＨＥＰＥＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋３ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）をランニングバッファーとして、２５℃の分析温度とした表面プラズモン共鳴測定により、本発明の二重特異性タンパク質とヒトＶＥＧＦＣとの結合親和力を特定した。

【0086】

二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ４、ＢｉＦｐＣ６、及びＶＥＧＦＣを特異的に認識する陽性対照ＯＰＴ－３０２を、１０μｇ／ｍＬの固定濃度でＰｒｏｔｅｉｎ ＡとカップリングすることによりＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップ（品番：２９１５７５５５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉した。ランニングバッファー内に希釈することにより、１０、５、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０．１６、０．０８及び０（ブランク）ｎＭ濃度のヒトＶＥＧＦＣ（品番：Ｚ０３２８６－１０μｇ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、中国）を調製した。各分析サイクルは、（１）フローセル２（Ｆｃ２）に二重特異性タンパク質を捕捉すること、（２）３０μＬ／分（１２０秒）でＶＥＧＦＣをフローセル１及びフローセル２（Ｆｃ１及びＦｃ２）に注射すること、（３）１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ緩衝液を３０μＬ／分でチップに３６０秒流して解離相をモニタリングすること、（４）１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液、ｐＨ１．５でチップ表面に注射再生することによって構成される。Ｂｉａｃｏｒｅ^TM Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、１：１結合モデルとの標準二重参照とフィッティングを用いてデータを加工し、結合速度（ｋ_a）と解離速度（ｋ_d）を測定した。Ｋ_D＝ｋ_d／ｋ_aの関係から平衡解離定数（Ｋ_D）を算出した。結果を下記表４に示す。

【0087】

【表4】

【0088】

表４の結果から分かるように、本発明のＢｉＦｐＣ１、ＢｉＦｐＣ２、ＢｉＦｐＣ４、ＢｉＦｐＣ６及びＶＥＧＦＣはいずれも高い結合親和力を有し、Ｋ_Dは１０^-10Ｍレベルに達することができ、中でもＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６はさらに１０^-11Ｍレベルに達し、陽性対照ＯＰＴ－３０２（１０^-10Ｍレベル）をはるかに超え、より高いＶＥＧＦＣに対する親和力を示した。

【0089】

上記の結果から分かるように、試験された４つの構造はいずれも強いＶＥＧＦＡ親和力を示したが、ＶＥＧＦＣ親和力に対して大きく異なり、中でもＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６は極めて強いＶＥＧＦＣ親和力を有し、対照分子ＯＰＴ－３０２の１０倍程度であった。これもまた、同じドメインを使用しても、分子構造の違いにより、標的分子に対する分子の結合能力に大きな影響を与えることを説明している。

【0090】

実施例６ 本発明の二重特異性タンパク質が同時にＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣと結合することを検証
本実施例は、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６が同時にＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＣに結合できるか否かを検出した。

【0091】

Ｂｉａｃｏｒｅ ８０００機器において、ＨＥＰＥＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋３ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）をランニングバッファーとして、分析温度２５℃で、表面プラズモン共鳴測定を行い、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６がヒトＶＥＧＦＡ及び／又はＶＥＧＦＣと結合する能力を特定した。

【0092】

実施例３で発現された二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６を、１０μｇ／ｍＬの固定濃度でＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップを介して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａとカップリングするように、当該Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップ（品番：２９１５７５５５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉した。Ａ－Ｂ－Ａ連続サンプル導入モードを採用し、動作操作は、具体的には、フローセル２（Ｆｃ２）に二重特異性タンパク質を３０～４０秒捕捉し、３０μＬ／分（１２０秒）で２０ｎＭのＶＥＧＦＡ又は５００ｎＭのＶＥＧＦＣをフローセル１及びフローセル２（Ｆｃ１及びＦｃ２）に注射し、さらに３０μＬ／分（１２０秒）で５００ｎＭのＶＥＧＦＣ又は２０ｎＭのＶＥＧＦＡをフローセル１及びフローセル２（Ｆｃ１及びＦｃ２）に注射し、最終的に１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ１．５）で注射し、３０μＬ／分（６０秒）でチップ表面を再生する。Ｂｉａｃｏｒｅ^TM Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、１：１結合モデルとの標準二重参照とフィッティングを用いてデータを解析し、結果を図５に示す。

【0093】

図５Ａに示すように、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２は、二重特異性タンパク質に結合する２種類のリガンドに由来する共鳴単位の増加（ＶＥＧＦＡに由来する初期２２．３ＲＵ、次にヒトＶＥＧＦＣに由来する別の８．８ＲＵ）、及び別のサンプル導入方式による共鳴単位の増加（ＶＥＧＦＣに由来する初期１７．３ＲＵ、次にヒトＶＥＧＦＡに由来する別の１２．８ＲＵ）により、ヒトＶＥＧＦＡ及びヒトＶＥＧＦＣに同時に結合できることが実証された。また、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２が異なるサンプル導入順序で２種類のリガンドに結合した後、共鳴単位の累積加算値はそれぞれ３１．１ＲＵと３０．１ＲＵであり、両者に顕著な差異がない。

【0094】

図５Ｂに示すように、本発明の別の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６は、二重特異性タンパク質に結合する２種類のリガンドに由来する共鳴単位の増加（ＶＥＧＦＡに由来する初期３０．６ＲＵ、次にヒトＶＥＧＦＣに由来する別の９．８ＲＵ）、及び別のサンプル導入方式による共鳴単位の増加（ＶＥＧＦＣに由来する初期１７．６ＲＵ、次にヒトＶＥＧＦＡに由来する別の２２．０ＲＵ）により、ヒトＶＥＧＦＡ及びヒトＶＥＧＦＣに同時に結合できることが実証された。また、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６が異なるサンプル導入順序で２種類のリガンドに結合した後、共鳴単位の累積加算値はそれぞれ４０．３ＲＵと３９．９ＲＵであり、両者にも顕著な差異がない。

【0095】

実施例７ 本発明の二重特異性タンパク質の異なる温度での安定性の測定
実施例３で得られた二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６をアフィニティークロマトグラフィーした後、２０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．８の緩衝液系に置いた。サンプルを下記安定性スキームの条件で放置し、サンプルを回収した。

【0096】

サンプルを、低温４℃でそれぞれ１、３、６、１５、３０、６０、９０日間放置し、室温２５℃でそれぞれ３、６、１５、３０日間放置し、高温４０℃でそれぞれ１、３、６日間放置した。時間ゼロ、及び各サンプリング時点でサンプリングした後、二重特異性タンパク質サンプルは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣにより、標的タンパク質分子量百分率（メインピーク％）に基づいてサンプルを分析した。具体的には、被検サンプルを１．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、モレキュラーシーブカラム（Ｓｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ－３００）に１０μＬ（１０μｇ）を注入して分析した。流速０．６５ｍＬ／分、カラム温度３５℃、２１４ｎｍで検出し、移動相は２００ｍＭリン酸塩緩衝液＋３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０であった。二重特異性タンパク質ピーク（メインピーク）、ポリピーク及びフラグメントピークは、適切なピークを統合することにより測定した。その結果、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを用いてクロマトグラムを解析し、ポリピークとフラグメントピークの間に介在する溶出ピークのＡＵＣと全ＡＵＣの比を用いてメインピーク（％）を算出した。結果を下記表５に示す。

【0097】

【表5】

【0098】

上表の結果から分かるように、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６は室温及び低温条件下で安定であった。他の副材料を添加しない場合、室温２５℃で３０日間放置した後、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２のメインピークは８４．２％から８１．１％に変化し、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６のメインピークは８７．０％から８４．６％に変化した。低温４℃で９０日間放置した後、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２のメインピークは８４．２％から８４．９％に変化し、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６のメインピークは８７．０％から８５．８％に変化した。これに対して、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２及びＢｉＦｐＣ６は、高温環境下で不安定であった。４０℃で６日間放置した後、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２のメインピークは８４．２％から３５．３％に変化し、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６のメインピークは８７．０％から４９．７％に変化した。そのため、プロセス中に二重特異性タンパク質が高温環境に接触することを避ける必要がある。ＢｉＦｐＣ６の安定性は、ＢｉＦｐＣ２の安定性よりも良い。

【0099】

実施例８ 本発明の二重特異性タンパク質のＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＣによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞増殖に対する抑制
ＨＵＶＥＣ細胞はヒト臍帯静脈血管内皮細胞であり、インビトロでＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路に関連する薬物を測定するのに最も一般的な細胞系である。本実施例で使用されるＨＵＶＥＣ細胞は、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ社（品番＃８０００）から購入した。

【0100】

８．１ ＶＥＧＦＡによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞増殖について
ＶＥＧＦＡは内皮成長因子であり、細胞膜表面の受容体ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２と結合して細胞内の関連シグナル伝達経路を起動し、細胞増殖、血管形成などの生理的病理的過程に関与する。

【0101】

０.１ｎｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬまでの二重特異性タンパク質の用量範囲を評価した。二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２の各測定濃度を５０μＬで、１０ｎｇ／ｍＬ（最終濃度）ＶＥＧＦＡを５０μＬ含むウェルに加えた。測定は、二連で行った。市販のＶＥＧＦＡの中和性タンパク質Ｅｙｌｅａを陽性対照とし、測定培地のみを添加したウェルを溶媒ブランク対照とした。対照品Ｅｙｌｅａは、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２と同じ質量濃度範囲で測定した。ＶＥＧＦＡ／タンパク質混合物を含む９６ウェルプレートを、３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ₂で６０分間インキュベートした。

【0102】

ＨＵＶＥＣ細胞は、ＥＣＭ完全培地（５％ＦＢＳ、ペニシリンＧ（１×）、ストレプトマイシン（１×）及び内皮細胞成長添加剤ＥＣＧＳ（１×）を含む）において、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターで培養した。２４時間後、細胞を１×ＤＰＢＳ（Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺を含まない）で洗浄し、細胞を１ｍＬの０．６％トリプシン／ＥＤＴＡで消化し、細胞を培養フラスコ底部から脱離させた後、ＥＣＭ完全培地９ｍＬを加えて消化反応を終了した。その後、細胞を１０００×ｇ、室温で５分間遠心した。細胞塊を測定培地（０．５％ＦＢＳを含むＥＣＭ測定培地）で再懸濁した。細胞密度は、自動化セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ、品番：ＩＣ１０００、Ｍｏｔｉｃ）を用いて測定した。密度を調整した後、５０００個の細胞（１００μＬ中）／ウェルで９６ウェルプレートの中間ウェルに添加し、周囲のウェルにＤＰＢＳを添加して培養中の培地の蒸発を防止した。９６ウェルプレートを組織インキュベータ（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ₂）に一晩置いた。２４時間後、タンパク質／ＶＥＧＦＡ混合物（１００μＬ）を９６ウェルプレートで培養したＨＵＶＥＣ細胞に加え、さらに７２時間インキュベートした。

【0103】

反応終了後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^TM細胞活性測定キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を使用し、製品の取扱説明書に従ってＨＵＶＥＣ細胞活性を測定した。簡単に言えば、測定キットを室温まで平衡させ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^TM緩衝液を注射器でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^TMＳｕｂｓｔｒａｔｅに注射し、均一に混合し、１００μＬ／ウェルの量で１００μＬ／ウェル培地を捨てた９６ウェルプレートの細胞に加え、室温で１０分間反応させた後、マイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ Ｌｘ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）で化学発光を測定した。結果を図６Ａに示す。図６Ａにおける相対発光値は、データの４パラメータ抑制曲線フィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン番号５．０）を用いて計算され、ここで、５０％ＶＥＧＦＡ誘導の応答が抑制された場合、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２又はＥｙｌｅａの濃度をＩＣ₅₀とする。図６Ａに示すように、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２は、濃度依存的に、ＶＥＧＦＡによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制した。したがって、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２がＶＥＧＦＡを効果的に中和できることが証明された。

【0104】

ＢｉＦｐＣ２と類似の方法により、同様にＢｉＦｐＣ６のＶＥＧＦＡ誘導によるＨＵＶＥＣ細胞増殖に対する抑制作用を検証した。測定方法を以下に説明する。

【0105】

０．４６ｎｇ／ｍＬから３μｇ／ｍＬ（最終濃度）までの二重特異性タンパク質の用量範囲を評価した。各測定濃度の４５μＬの二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６を、４５μＬの４５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡを含むウェルに加えた。測定は、二連で行った。測定培地のみを添加したウェルを溶媒ブランク対照とした。ＶＥＧＦＡ／タンパク質混合物を含む９６ウェルプレートを、３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ₂で６０分間インキュベートした。

【0106】

ＨＵＶＥＣ細胞は、ＥＣＭ完全培地（５％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン（１×）及び内皮細胞成長添加剤ＥＣＧＳ（１×）を含む）を有するＴ７５細胞培養フラスコで培養し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターで培養した。増殖実験において、被検サンプルを添加する２４時間前に、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、３ｍＬの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を消化し、細胞を培養フラスコの底部から脱離させ、その後、７ｍＬのＥＣＭ完全培地を添加して消化反応を停止させた。その後、細胞を１５０×ｇ、室温で５分間遠心した。細胞塊を測定培地（０．５％ＦＢＳを含むＥＣＭ培地）で再懸濁した。細胞密度は、自動化セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ、品番：ＩＣ１０００、Ｍｏｔｉｃ）を用いて測定した。密度を調整した後、５０００個の細胞（１００μＬ中）／ウェルで９６ウェルプレートの中間ウェルに加え、周囲のウェルに無菌水を添加して培養中の培地の蒸発を防止した。９６ウェルプレートを組織インキュベータ（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ₂）に一晩置いた。２４時間後、タンパク質／ＶＥＧＦＡ混合物（８０μＬ）を９６ウェルプレートで培養したＨＵＶＥＣ細胞に加え、さらに７２時間インキュベートし続け、そのうち、ＶＥＧＦＡの最終濃度は１０ｎｇ／ｍＬであった。

【0107】

反応終了後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ細胞活性測定試薬を用いてＨＵＶＥＣ細胞活性を測定した。簡単に言えば、測定キットを室温まで平衡させ、各ウェルに９０μＬの測定試薬を加え、プレート振とう器で２分間均一に振とうし、室温で１０分間反応させた後、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ^TMマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で化学発光を測定した。結果を図６Ｂに示す。図６Ｂにおいて、４パラメータ曲線フィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン番号８．０）を用いて抑制曲線を生成し、ここで、５０％ＶＥＧＦＡ誘導の応答が抑制される場合、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６濃度をＩＣ₅₀とする。図６Ｂに示すように、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６は、濃度依存的に、ＶＥＧＦＡによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制した。したがって、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６がＶＥＧＦＡを効果的に中和できることが証明された。

【0108】

８．２ ＶＥＧＦＣによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞増殖について
ＶＥＧＦＣは内皮成長因子であり、細胞膜表面の受容体ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３と結合して細胞内の関連シグナル伝達経路を起動し、細胞増殖、血管形成などの生理的病理的過程に関与する。

【0109】

０．０１μｇ／ｍＬから２００μｇ／ｍＬまでの二重特異性タンパク質の用量範囲を評価した。二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２の各測定濃度を５０μＬの１００ｎｇ／ｍＬ（最終濃度）ＶＥＧＦＣを含むウェルに５０μＬ加えた。測定は、二連で行った。モノクローナル抗体ＦＴＬ００１（Ｓｏｕｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、中国）を測定における陰性対照とし、測定培地のみを添加したウェルを溶媒ブランク対照とした。対照モノクローナル抗体は、二重特異性タンパク質と同じ質量濃度範囲で測定した。ＶＥＧＦＣ／タンパク質混合物を含む９６ウェルプレートを、３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ₂で６０分間インキュベートした。

【0110】

ＨＵＶＥＣ細胞は、通常とおり、完全培地（５％ＦＢＳ、ペニシリンＧ（１×）、ストレプトマイシン（１×）及び内皮細胞成長添加剤ＥＣＧＳ（１×）を含む内皮細胞培地ＥＣＭ）で培養した。２４時間後、細胞を１×ＤＰＢＳ（Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺を含まない）で洗浄し、１ｍＬの０．６％トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を消化し培養フラスコ底部から脱離させ、完全培地９ｍＬを加えて消化反応を終了させた。その後、細胞を１０００×ｇで室温で５分間低速遠心した。細胞塊を測定培地（０．５％ＦＢＳを含むＥＣＭ測定培地）で再懸濁した。自動化セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ、品番：ＩＣ１０００、Ｍｏｔｉｃ）で細胞密度を測定し、密度を調整した後、５０００個の細胞（１００μＬ中）を９６ウェルプレートの中間ウェルに加え、周囲のウェルにＤＰＢＳを添加して培養中の培地の蒸発を防止した。９６ウェルプレートを組織インキュベータ（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ₂）に一晩置いた。２４時間後、二重特異性タンパク質（又はモノクローナル抗体）／ＶＥＧＦＣ混合物（１００μＬ）をＨＵＶＥＣ細胞に加え、７２時間インキュベートした。

【0111】

反応終了後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^TM（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）の取扱説明書に従って、測定キットを室温まで平衡化して使用した。使用前に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏRＢｕｆｆｅｒを注射器でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^TM Ｓｕｂｓｔｒａｔｅに注射し、均一に混合して使用した。１００μＬの培地を捨て、さらに１００μＬの混合済み測定液を加え、室温で１０分間反応させた後、マイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ Ｌｘ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を用いて化学発光を測定した。結果を図６Ｃに示す。

【0112】

図６Ｃにおける相対発光値は、データの４パラメータ抑制曲線フィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン番号５．０）を用いて計算され、ここで、５０％ＶＥＧＦＣ誘導の応答が抑制される場合、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２又は陰性対照の濃度をＩＣ₅₀とする。図６Ｃから分かるように、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２は、濃度依存的に、ＶＥＧＦＣによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制した。本発明の二重特異性タンパク質がＶＥＧＦＣを効果的に中和できることが証明された。

【0113】

ＢｉＦｐＣ２と類似の方法により、同様にＢｉＦｐＣ６のＶＥＧＦＣ誘導によるＨＵＶＥＣ細胞増殖に対する抑制作用を検証した。測定方法を以下に説明する。

【0114】

１．５ｎｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬ（最終濃度）までの二重特異性タンパク質の用量範囲を評価した。各測定濃度の４５μＬの二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６を、４５μＬの２２５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣを含むウェルに加えた。測定は、二連で行った。測定培地のみを添加したウェルを溶媒ブランク対照とした。ＶＥＧＦＣ／タンパク質混合物を含む９６ウェルプレートを、３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ₂で６０分間インキュベートした。

【0115】

ＨＵＶＥＣ細胞は、ＥＣＭ完全培地（５％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン（１×）及び内皮細胞成長添加剤ＥＣＧＳ（１×）を含む）を有するＴ７５細胞培養フラスコで培養し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターで培養した。増殖実験において、被検サンプルを添加する２４時間前に、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、３ｍＬの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を消化し、細胞を培養フラスコの底部から脱離させ、その後、７ｍＬのＥＣＭ完全培地を添加して消化反応を停止させた。その後、細胞を１５０×ｇ、室温で５分間遠心した。細胞塊を測定培地（０．５％ＦＢＳを含むＥＣＭ培地）で再懸濁した。細胞密度は、自動化セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ、品番：ＩＣ１０００、Ｍｏｔｉｃ）を用いて測定した。密度を調整した後、５０００個の細胞（１００μＬ中）／ウェルで９６ウェルプレートの中間ウェルに加え、周囲のウェルに無菌水を添加して培養中の培地の蒸発を防止した。９６ウェルプレートを組織インキュベータ（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ₂）に一晩置いた。２４時間後、タンパク質／ＶＥＧＦＣ混合物（８０μＬ）を９６ウェルプレートで培養したＨＵＶＥＣ細胞に加え、さらに７２時間インキュベートし続け、そのうち、ＶＥＧＦＣの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬであった。

【0116】

反応終了後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ細胞活性測定試薬を用いてＨＵＶＥＣ細胞活性を測定した。簡単に言えば、測定キットを室温まで平衡させ、各ウェルに９０μＬの測定試薬を加え、プレート振とう器で２分間均一に振とうし、室温で１０分間反応させた後、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ^TMマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で化学発光を測定した。結果を図６Ｄに示す。図６Ｄにおいて、４パラメータ曲線フィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン番号８．０）を用いて抑制曲線を生成し、ここで、５０％ＶＥＧＦＣ誘導の応答が抑制される場合、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６濃度をＩＣ₅₀とする。図６Ｄに示すように、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６は、濃度依存的に、ＶＥＧＦＣによって誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制した。したがって、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６がＶＥＧＦＣを効果的に中和できることが証明された。

【0117】

実施例９ 本発明の二重特異性タンパク質のＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＣに対する競合的結合を測定
９．１ ＶＥＧＦＡに対する競合的結合
１×ＰＢＳ（８．０１ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、１．４２ｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．２７ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）中の１．０μｇ／ｍＬ Ｅｙｌｅａ（Ｂａｙｅｒ、ドイツ）で、１００μＬ／ウェルの量で９６ウェルプレートをコーティングし、プレートを密封し４℃で一晩コーティングした。各ウェルを１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、１％ＢＳＡ（ＢＩＯＦＲＯＸＸ）を含むＰＢＳＴを２００μＬ／ウェル加えてブロッキングした。プレートを密封し、３７℃で２時間インキュベートした後、各ウェルを１×ＰＢＳＴで２回洗浄してブロッキング試薬を除去した。本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２、陽性対照コンベルセプト（Ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ）眼用注射液（康弘、中国）及び陰性対照ヒトＩｇＧ１、ｋａｐｐａ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（品番ＨＧ１Ｋ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）を、それぞれ３倍シリーズの希釈物（１×ＰＢＳ中）で、５ｎＭのＶＥＧＦＡ（品番Ｚ０３０７３、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、中国）二量体と、３７℃で１時間プレインキュベートした。プレインキュベート終了後、共インキュベート物を１００μＬ／ウェルの量で各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１００μＬ／ウェルの１：７５０００希釈されたＶＥＧＦＡウサギモノクローナル抗体（品番１１０６６－Ｒ１０５、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）を添加し、３７℃で０．５時間インキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１００μＬ／ウェルの１：７５０００希釈されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（品番５１１２０３、ＺＥＮ ＢＩＯ、中国）を添加した。プレートを１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢ基質（品番ＰＲ１２００、Ｓｏｌａｒｂｉｏ、１００μＬ／ウェル）を加えた。暗中、３７℃、１０分間インキュベートした。最後に、５０μＬの２Ｍ硫酸を各ウェルに加えて反応を停止した。マイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ Ｌｘ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を用いて、４５０ｎｍにおける光学濃度を測定した。測定は、二連で行った。結果を図７Ａに示し、ここで、ＩＣ₅₀は、５０％のＶＥＧＦＡが二重特異性タンパク質又は陽性対照に競合的に結合された場合の二重特異性タンパク質又は陽性対照の濃度を示す。図７Ａに示すように、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２は濃度依存的にＥｙｌｅａと競合的にＶＥＧＦＡに結合し、且つ競合的結合活性は陽性対照コンベルセプトに相当する。そのうち、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２のＩＣ₅₀は１０．６ｎＭであり、陽性対照のＩＣ₅₀は１６．９ｎＭであった。陰性対照は競合的活性がなかった。

【0118】

ＢｉＦｐＣ２と類似の方法により、同様にＢｉＦｐＣ６のＶＥＧＦＡに対する競合的結合能力を検証した。測定方法を以下に説明する。

【0119】

炭酸塩コーティング緩衝液（炭酸ナトリウム １．５９ｇ、炭酸水素ナトリウム ２．９３ｇ、超純水１０００ｍＬ、ｐＨ９．６）中の０．５μｇ／ｍＬ ＶＥＧＦＡ１６５（品番Ｚ０３０７３－５０、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、中国）を用いて１００μＬ／ウェルの量で９６ウェルプレートをコーティングし、プレートを密封して４℃で一晩コーティングした。各ウェルを１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、２６０μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ（品番Ａ８０２０、Ｓｏｌａｒｂｉｏ、中国）を含むＰＢＳＴを加えてブロッキングした。プレートを密封し、３７℃で１．５時間インキュベートした後、各ウェルを１×ＰＢＳＴで２回洗浄してブロッキング試薬を除去した。本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６を３倍シリーズの希釈物（１×ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡ中）と０．５μｇ／ｍＬのＨｕｍａｎ ＶＥＧＦＲ２（品番ＫＤＲ－Ｈ５２２７、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、中国）を１：１の割合で十分に均一に混合した後、１００μＬ／ウェルの量で対応するＥＬＩＳＡプレートウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１００μＬ／ウェルの１：８０００希釈されたＨＲＰ－Ａｎｔｉ ６＊Ｈｉｓ抗体（品番ＨＲＰ－６６００５、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、中国）を添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。１×ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（品番ＰＡ１０７－０１、天根生化科技（北京）有限公司、中国）を加え、３７℃で１０分間、光を避けてインキュベートした。最後に１００μＬのシュウ酸停止液（無水シュウ酸６３．０ｇ、超純水１０００ｍＬ）を各ウェルに加えて反応を停止した。マイクロプレートリーダー（北京普朗新技術有限公司、中国）を用いて４５０ｎｍにおける光学濃度を測定した。結果は図７Ｂに示すように、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６は濃度依存的にＨｕｍａｎ ＶＥＧＦＲ２と競合的にＶＥＧＦＡ１６５に結合し、ここで二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６のＩＣ₅₀は９９６．３ｎｇ／ｍＬであった。

【0120】

９．２ ＶＥＧＦＣに対する競合的結合
５０μＬ／ウェルで１×ＰＢＳ（８．０１ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、１．４２ｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．２７ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）中の１．２５μｇ／ｍＬのＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ（品番ＦＬ４－Ｈ５２５１、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、中国）で９６ウェルプレートをコーティングし、プレートを密封し、４℃で一晩コーティングした。各ウェルを１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、２００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ（ＢＩＯＦＲＯＸＸ）を含むＰＢＳＴを加えてブロッキングした。プレートを密封し、３７℃で２時間インキュベートした後、各ウェルを１×ＰＢＳＴで２回洗浄した。二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２と陰性対照ヒトＩｇＧ１、ｋａｐｐａ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（品番ＨＧ１Ｋ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）を、それぞれ３倍シリーズの希釈物（１×ＰＢＳ中）と、２．５ｎＭのＶＥＧＦＣ－ｈｉｓ（品番ＶＥＣ－Ｈ４２２５、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、中国）二量体とを、３７℃で１時間プレインキュベートした。プレインキュベート終了後、共インキュベート物を各ウェル（１００μＬ／ウェル）に加え、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１００μＬ／ウェルの１：５０００希釈されたＨＲＰコンジュゲート６＊Ｈｉｓ、Ｈｉｓ－Ｔａｇモノクローナル抗体（品番６６００５、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、米国）を添加し、３７℃で０．５時間インキュベートした。プレートを１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢ基質（品番ＰＲ１２００、Ｓｏｌａｒｂｉｏ、１００μＬ／ウェル）を加えた。暗中、３７℃で１０分間インキュベートした。最後に５０μＬの２Ｍ硫酸を各ウェルに加えて反応を停止した。マイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ Ｌｘ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を用いて、４５０ｎｍにおける光学濃度を測定した。測定は、二連で行った。結果を図７Ｃに示す。図７Ｃに示すように、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２は、濃度依存的に、天然受容体ＶＥＧＦＲ３と競合的にＶＥＧＦＣに結合する。ここで、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２のＩＣ₅₀は４．８ｎＭであり、陰性対照は競合的活性がなかった。

【0121】

ＢｉＦｐＣ２と類似の方法により、同様にＢｉＦｐＣ６のＶＥＧＦＣに対する競合的結合能力を検証した。測定方法を以下に説明する。

【0122】

１００μＬ／ウェルの炭酸塩コーティング緩衝液（炭酸ナトリウム１．５９ｇ、炭酸水素ナトリウム２．９３ｇ、超純水１０００ｍＬ、ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍＬのＨｕｍａｎ ＶＥＧＦＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（品番１０５４２－Ｈ０８Ｈ、北京義翹神州科技コフン有限公司、中国）で９６ウェルプレートをコーティングし、プレートを密封して４℃で一晩コーティングした。各ウェルを１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、２６０μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ（品番Ａ８０２０、Ｓｏｌａｒｂｉｏ、中国）を含むＰＢＳＴを加えてブロッキングした。ＥＬＩＳＡプレートを密封し、３７℃で１．５時間インキュベートした後、各ウェルを１×ＰＢＳＴで２回洗浄した。二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６を３倍シリーズの希釈物（１×ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡ中）と０．１μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦＲ３／ＦＬＴ４ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ、Ａｖｉｔａｇ^TM（品番ＦＬ４－Ｈ８２Ｅ１、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、中国）とを１：１の割合で十分に均一に混合した後、１００μＬ／ウェルの量で対応するＥＬＩＳＡプレートウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１００μＬ／ウェルの１：８０００希釈されたＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（ＳＡ）（品番ＹＸＸＯ５７０１－ＨＲＰ、普健生物（武漢）科技有限公司、中国）を添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。プレートを１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（品番ＰＡ１０７－０１、天根生化科技（北京）有限公司、中国）を加え、３７℃、光を避けて１０分間インキュベートした。最後に１００μＬのシュウ酸停止液（無水シュウ酸６３．０ｇ、超純水１０００ｍＬ）を各ウェルに加えて反応を停止した。マイクロプレートリーダー（北京普朗新技術有限公司、中国）を用いて４５０ｎｍにおける光学濃度を測定した。結果は図７Ｄに示すように、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６は濃度依存的に天然受容体ＶＥＧＦＲ３と競合的にＶＥＧＦＣに結合する。ここで、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ６のＩＣ₅₀は５４０５ｎｇ／ｍＬであった。

【0123】

実施例１０ カニクイザル（Macaca fascicularis）ｎＣＮＶモデルにおける本発明の二重特異性タンパク質のインビボ試験
８匹の滲出型加齢黄斑変性（ｎｅｏＡＭＤ）モデルカニクイザル（広西雄森霊長類実験動物養殖開発有限公司）を使用した。すべての動物モデリング当日をＤ１とした。眼底レーザ光凝固により、カニクイザルの両眼の脈絡膜新生血管（Choroidal neovascularization、ＣＮＶ）を誘導した。Ｄ１５に、蛍光眼底造影（ＦＦＡ）検査により動物の眼底蛍光漏れの状況を評価し、下記の基準に従ってＣＮＶに対して漏れの段階分けを行った。

【0124】

段階１：スポットに高蛍光が現れなかった。
段階２：スポットが高蛍光であったが蛍光漏れがなかった。
段階３：スポットが高蛍光、蛍光が軽度に漏れ、漏れがスポットのエッジを超えなかった。
段階４：スポットが高蛍光、蛍光が重度に漏れ、漏れがスポットのエッジを超えた。

【0125】

Ｄ１６に、段階４の漏れスポットを有する５匹の動物を選択して２群に分けた（段階４のスポットの平均漏れ面積及び段階４のスポット率に基づいて群分けし、２群間に顕著な差異がないようにした）。１群の３匹の動物に、本発明の二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２を投与し、もう１群の２匹の動物に、陽性対照Ｅｙｌｅａを投与した。群分け当日、動物に硝子体腔を経て、１００μＭの２０μＭの二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２又は４３μＭ陽性対照Ｅｙｌｅａを片眼で単回注射した。試験期間中、毎日動物に対して一般的臨床観察を行い、Ｄ１、Ｄ１５、Ｄ１８、Ｄ２２及びＤ２９に動物に対して秤量及び一般的眼科検査を行った。動物に対して、Ｄ１、Ｄ１５、Ｄ２２及びＤ２９に、眼底写真（ＦＰ）、ＦＦＡ及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）検出を行った。段階４のスポットの蛍光漏れ面積及び網膜下の高反射シグナル物質（ＳＨＲＭ）の厚さの計４つの指標に基づいて有効性評価を行い、結果は以下の通りであった。

【0126】

段階４蛍光スポット率：Ｄ２２（投与後１週間）及びＤ２９（投与後２週間）に、治療前と比較して、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２及び陽性対照Ｅｙｌｅａで治療された動物はいずれも有意に低下した段階４蛍光スポット率を示し、且つ二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２群と陽性対照Ｅｙｌｅａ群との間に統計学的差異は見られなかった（ｐ＞０．０５）。

【0127】

段階４蛍光スポットの平均漏れ面積：Ｄ１５（投与前）に、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２群と陽性対照Ｅｙｌｅａ群との間の段階４スポットの平均漏れ面積に統計学的差異がなく（ｐ＞０．０５）、Ｄ２９に、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２及び陽性対照Ｅｙｌｅａはいずれも蛍光漏れ面積を減少させることができ、且つ２群の間の平均蛍光漏れ面積に統計学的差異がなかった（ｐ＞０．０５）。

【0128】

段階４蛍光スポットの平均漏れ面積減少量及び改善率：Ｄ２２及びＤ２９に、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２の平均蛍光漏れ面積減少量は陽性対照Ｅｙｌｅａ群と比較していずれも統計学的差異がなかった（ｐ＞０．０５）。Ｄ２９に、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２群の平均蛍光漏れ面積改善率は陽性対照群と比較して統計学的差異がなかった（ｐ＞０．０５）。

【0129】

ＳＨＲＭ平均厚さ：Ｄ１５、Ｄ２２及びＤ２９に、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２群及び陽性対照Ｅｙｌｅａ群のＳＨＲＭ平均厚さを比較したところ、統計学的差異がなかった（ｐ＞０．０５）。

【0130】

本実施例では、カニクイザルの脈絡膜新生血管モデルを用いて、１００μＬの各眼２０μＭの二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２又は４３μＭの陽性対照Ｅｙｌｅａを一回の硝子体腔注射で投与した。投与後の１週間（Ｄ２２）、２週間（Ｄ２９）に、二重特異性タンパク質ＢｉＦｐＣ２は、モル濃度が陽性対照品Ｅｙｌｅａの半分のみである場合、蛍光漏れの面積を減少させ、網膜下の高反射シグナル物質の厚さを低減することができ、且つＥｙｌｅａに相当する効果を有することが観察された。

【0131】

実施例１１ ラットｎＣＮＶモデルにおける本発明の二重特異性タンパク質のインビボ試験
ラットのｎＣＮＶモデルにおいて、段階４蛍光スポット百分率、段階４蛍光スポット面積及び網膜厚さの３つの指標により、二重特異性タンパク質投与後７、１４、２１日に測定した。その結果、本実施例の試験条件において、脈絡膜新生血管ラットモデルに対して、ＢｉＦｐＣ２高用量群（１５μｇ／眼、硝子体腔１回注射）は、新生血管の生成及び漏れに対して一定の抑制作用を有することを発見した。

【0132】

本発明の技術案は、上記の具体的な実施例に限定されず、本発明の技術案に基づいて行われる技術的変形は、いずれも本発明の保護範囲内に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-04-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ＡとＶＥＧＦＣに結合する二重特異性融合ポリペプチドであって、ＶＥＧＦＡを特異的に認識する第１ドメインと、ＶＥＧＦＣを特異的に認識する第２ドメインとを含む二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項2】

前記第１ドメインは、ＶＥＧＦＡを特異的に認識する血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）又はその機能性断片、又はＶＥＧＦＡに対する抗体又はその機能性断片であり、
前記第２ドメインは、ＶＥＧＦＣを特異的に認識するＶＥＧＦＲ又はその機能性断片、又はＶＥＧＦＣに対する抗体又はその機能性断片であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項3】

前記第１ドメインは、ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン２及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３を含み、又は
前記第１ドメインは、ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ナノ抗体、重鎖可変領域（ＶＨ）断片又は軽鎖可変領域（ＶＬ）断片を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項4】

前記第２ドメインは、ＶＥＧＦＲ３のＩｇ様ドメイン１、Ｉｇ様ドメイン２及びＩｇ様ドメイン３を含み、又は
前記第２ドメインは、ＶＥＧＦＣに特異的に結合する抗体Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ナノ抗体断片、ＶＨ断片又はＶＬ断片を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項5】

前記二重特異性融合ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第３ドメインをさらに含み、
好ましくは、前記免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥから選ばれ、好ましくはＩｇＧであり、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、
より好ましくは、前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１５のいずれか一項に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１５のいずれか一項と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項6】

前記第１ドメイン、前記第２ドメイン及び／又は第３ドメインは、直接接続され又はリンカーを介して接続され、
好ましくは、前記リンカーは少なくとも６つのアミノ酸を含み、
より好ましくは、前記リンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又は８に示されるアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又は８に示されるアミノ酸配列と比較して１、２又は３個のアミノ酸の挿入、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項５に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項7】

前記第１ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記第１ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又は、前記第１ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項8】

前記第２ドメインは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対応する７５番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項9】

前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対応する７５番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列において、７５番目のアミノ酸はグルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン又はリジンに置換され、
好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対応する７５番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項８に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項10】

前記第２ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対応する８０番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対応する８０番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列において、８０番目のアミノ酸はグルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン又はリジンに置換され、より好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対応する８０番目のアミノ酸がアスパラギンではないアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項11】

前記二重特異性融合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７～２４のいずれか一項に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７～２４のいずれか一項に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチド。

【請求項12】

請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。

【請求項13】

核酸送達キャリアであって、請求項１２に記載の単離された核酸分子を含む核酸送達キャリア、
好ましくは、前記核酸送達キャリアは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス又は他の許容可能な核酸送達キャリアに由来するものを含む。

【請求項14】

請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチドの二量体を含むことを特徴とする血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ＡとＶＥＧＦＣとの二重特異性結合分子、
好ましくは、前記二量体はホモ二量体又はヘテロ二量体である。

【請求項15】

請求項１２に記載の単離された核酸分子を含む宿主細胞。

【請求項16】

請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチド、及び薬学的に許容される担体を含む薬物組成物。

【請求項17】

前記薬物組成物は、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、注射剤、懸濁液、粉剤、乳剤、エアロゾル剤、ゲル剤、点眼剤、徐放剤又は徐放性インプラントの形態であることを特徴とする請求項１６に記載の薬物組成物。

【請求項18】

容器に封入される請求項１６に記載の薬物組成物を含むキット、
前記容器は、好ましくはガラスアンプル、ガラス瓶、プラスチックアンプル、プラスチックボトル、プラスチック袋、又はプレフィルドシリンジである。

【請求項19】

請求項１に記載の二重特異性融合ポリペプチドの、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＣに関連する疾患を治療又は予防用医薬組成物製造のための使用。

【請求項20】

前記疾患は、血管新生性眼疾患及び癌関連適応症から選ばれ、好ましくは、前記疾患は、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症、新生血管性緑内障、網膜静脈閉塞、角膜新生血管、角膜移植後新生血管、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、膵臓癌、肝臓癌、子宮頸癌及び膠芽腫から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の使用。

【国際調査報告】