特表2024-530970抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体およびこれの用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-27
(54)【発明の名称】抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体およびこれの用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20240820BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240820BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240820BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240820BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024510417
(86)(22)【出願日】2021-08-18
(85)【翻訳文提出日】2024-02-19
(86)【国際出願番号】 KR2021010945
(87)【国際公開番号】W WO2022039490
(87)【国際公開日】2022-02-24
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519238473
【氏名又は名称】エービーエル バイオ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パク，キュンジン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ヤンスン
(72)【発明者】
【氏名】イム，セイ
(72)【発明者】
【氏名】パク，キョンス
(72)【発明者】
【氏名】ソン，ミンキュ
(72)【発明者】
【氏名】ソン，ウォンジュン
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ヒェジン
(72)【発明者】
【氏名】ヨン，イェリョン
(72)【発明者】
【氏名】ソン，ヨンキュ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ヨンジュ
(72)【発明者】
【氏名】パク，ヨンドン
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、腫瘍細胞表面上のＢ７－Ｈ４のＴ－細胞抑制効果を効果的に遮断するとともに、Ｔ－細胞上の４－１ＢＢを活性化することができる抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体を提供する。二重特異的抗体は、Ｂ７－Ｈ４タンパク質（例えば、ヒト、サルおよびマウスのＢ７－Ｈ４タンパク質）および４－１ＢＢタンパク質（例えば、ヒト、サルおよびマウスの４－１ＢＢタンパク質）の両方に対して高い結合親和度を有することができる。本開示は、さらにＢ７－Ｈ４タンパク質に特異的に結合する抗－Ｂ７－Ｈ４抗体を提供する。
【選択図】 図１７
【選択図】 図１７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原－結合断片および抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原－結合断片を含む抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体。前記抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原－結合断片は、以下を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
配列番号：２、２５および３３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖相補性－決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）；
配列番号：３、２６および３４からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖相補性－決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）；
配列番号：４、２７および３５からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖相補性－決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）；
配列番号：７、８、２９および３７からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖相補性－決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）；
配列番号：９および３０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖相補性－決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）；および
配列番号：１０、３１および３８からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖相補性－決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）；
前記抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原－結合断片は、以下を含む抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体であって、
配列番号：３９ないし４３からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号：５２および５３からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【請求項2】
前記抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片は、配列番号：１、２２、２４および３２からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号：５、６、２３、２８、および３６からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものである、請求項１に記載の抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体。
【請求項3】
前記抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク１（Ｈ－ＦＲ１）；
配列番号：１３のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク２（Ｈ－ＦＲ２）；
配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク３（Ｈ－ＦＲ３）；
配列番号：１５のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク４（Ｈ－ＦＲ４）；
配列番号：１７のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク１（Ｌ－ＦＲ１）；
配列番号：１８のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク２（Ｌ－ＦＲ２）；
配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク３（Ｌ－ＦＲ３）；および
配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク４（Ｌ－ＦＲ４）；を含むものである、請求項１または請求項２に記載の抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体。
【請求項4】
前記抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原－結合断片および前記抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原－結合断片のそれぞれは、独立して、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体。
【請求項5】
請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の抗体または抗原－結合断片を暗号化する分離されたポリヌクレオチド。
【請求項6】
請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の前記抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体またはこれの抗原結合断片を含む、Ｂ７－Ｈ４、４－１ＢＢ、または両方に関連する疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項7】
Ｂ７－Ｈ４、４－１ＢＢ、または両方に関連する疾患は癌である、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項8】
前記癌は、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、白血病、リンパ腫、膵臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、尿道癌、頭頸部癌、消化管癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌および甲状腺癌からなる群より選択されるものである、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項9】
個体でＢ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する疾病の予防または治療する方法であって、前記方法は、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体またはこれの抗原結合断片、または請求項６ないし請求項８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を個体に投与することを含む、方法。
【請求項10】
Ｂ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する疾病の予防または治療に用いるための、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体またはこれの抗原結合断片。
【請求項11】
Ｂ７－Ｈ４タンパク質に特異性を有する抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片であって、前記抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片は、以下を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片。配列番号：２、２５および３３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖相補性－決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）；
配列番号：３、２６および３４からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖相補性－決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）；
配列番号：４、２７および３５からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖相補性－決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）；
配列番号：７、８、２９および３７からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖相補性－決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）；
配列番号：９および３０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖相補性－決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）；および
配列番号：１０、３１および３８からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖相補性－決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）。
【請求項12】
請求項１１に記載の前記抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片は、以下を含む。配列番号：１、２２、２４および３２からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号：５、６、２３、２８および３６からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項13】
前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１１または請求項１２に記載の抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片。
【請求項14】
請求項１１ないし請求項１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を暗号化する分離されたポリヌクレオチド。
【請求項15】
請求項１１ないし請求項１４のいずれか一項に記載の抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片を含む、Ｂ７－Ｈ４関連疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項16】
Ｂ７－Ｈ４に関連する疾患は癌である、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項17】
前記癌は、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、白血病、リンパ腫、膵臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、尿道癌、頭頸部癌、消化管癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌および甲状腺癌からなる群より選択されるものである、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項18】
個体でＢ７－Ｈ４に関連する疾病の予防または治療する方法であって、前記方法は、請求項１１ないし請求項１４のいずれか一項に記載の抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片を個体に投与することを含む、方法。
【請求項19】
Ｂ７－Ｈ４に関連する疾病の予防または治療に用いるための、請求項１１ないし請求項１４のいずれか一項に記載の抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体、抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体およびこれらの用途に関するものである。
【背景技術】
【0002】
Ｂ７－Ｈ４は、単一通過Ｉ型膜貫通タンパク質であり、Ｔ－細胞受容体抗原信号とともに共同－信号を提供するタンパク質のＢ７スーパーファミリの構成員である。Ｂ７－Ｈ４は、Ｔ－細胞の陰性調節子であり、Ｔ－細胞への結紮はこれらの成長、サイトカイン分泌および細胞毒性を抑制する。
【0003】
ヒトのＢ７－Ｈ４は、２８２個のアミノ酸タンパク質（アミノ－末端信号配列を含む）であり、このうち２３５個のアミノ酸は、アミノ末端信号配列の切断後、細胞外の空間にあるものと予測される。Ｂ７－Ｈ４は、Ｉｇ－類似Ｖ－ドメイン、Ｉｇ－類似Ｃドメイン、膜横断ドメインおよび短い細胞質テールを含む。
【0004】
Ｂ７－Ｈ４は、Ｔ細胞受容体の抗原依存的信号伝達とともに、これの共同抑制信号を通じて免疫体系を下向きになるように調節する潜在力を有している。Ｂ７－Ｈ４は名目上、正常なヒト組職で一般的に発現されるが、女性生殖係－乳房、卵巣、子宮内膜の癌を含む無数に多いヒトの癌において高度に過発現される。Ｂ７－Ｈ４の有病率は、原発性（－９５％）および転移性乳癌（－９７％）をいずれも含む浸湿性乳管癌および小葉癌において高いものと報告された。増加したＢ７－Ｈ４染色は、陰性ＰＲおよびＨｅｒ２の状態に関連があったが、発現は腫瘍等級または段階と無関係であった。このような類型の乳癌で、Ｂ７－Ｈ４染色細胞の高い割合に加えて、浸潤性リンパ球数の減少も伴った。
【0005】
４－１ＢＢは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリ（ＴＮＦ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、ＴＮＦＲＳＦ）の構成員であり、先天的（ｉｎｎａｔｅ）および後天的（ａｄａｐｔｉｖｅ）免疫細胞の両方の免疫細胞の活性化後に発現される共刺激分子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）である。４－１ＢＢは、多様な免疫細胞の活性を調節するのに重要な役目を果たす。４－１ＢＢ作用制は、免疫細胞の増殖、生存、サイトカインの分泌およびＣＤ８ Ｔ細胞の細胞溶解活性を増進させる。色々他の研究は、４－１ＢＢの活性化がマウスで腫瘍を除去する免疫反応を増進させることを示した。したがって、４－１ＢＢが癌免疫学の前途有望な標的分子であることを示唆する。これらの抗－腫瘍効能にもかかわらず、抗－４－１ＢＢ抗体は、臨床適用から深刻な肝毒性を誘導した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体またはこれの抗原結合断片を提供するものである。
【0007】
本発明の他の目的は、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片を提供するものである。
【0008】
本発明のまた他の目的は、Ｂ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供するものである。
【0009】
本発明のまた他の目的は、Ｂ７－Ｈ４関連疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供す
るものである。
るものである。
【0010】
本発明のまた他の目的は、個体でＢ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する疾病の予防または治療方法を提供するものである。
【0011】
本発明のまた他の目的は、個体でこれのＢ７－Ｈ４に関連する疾病の予防または治療方法を提供するものである。
【0012】
本発明のまた他の目的は、Ｂ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する疾病の予防または治療に用いるための抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体またはこれの抗原結合断片を提供するものである。
【0013】
本発明のまた他の目的は、Ｂ７－Ｈ４に関連する疾病の予防または治療に用いるための抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
定義
【0015】
本発明で、使用された用語「一つ（「ａ」または「ａｎ」）」の実体（ｅｎｔｉｔｙ）は、その実体の一つ以上を指すという点に留意しなければならず、例えば「抗体」は、一つ以上の抗体を示すものと理解される。このように、用語「一つ（「ａ」または「ａｎ」）」、「一つ以上」、および「少なくとも一つ」は、本発明で相互交換的に使用することができる。
【0016】
本発明で、使用された用語「配列で構成される」、「必須な配列で構成される」または「配列を含む」は、配列を含む任意の場合を指すことができるが、前記配列以外の追加配列を含む場合を除外しようとする意図ではない。
【0017】
本発明で、使用された用語「配列番号によって確認されたアミノ酸配列を含むか、これで構成されたタンパク質またはポリペプチド」および「配列番号によって確認された核酸配列を含むか、これで構成された遺伝子またはポリペプチド」は、必須なアミノ酸配列または核酸配列で構成されるか、固有の活性／または機能を維持しながら少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性のアミノ酸配列または核酸配列を有するタンパク質（または、ポリペプチド）、または遺伝子（または、ポリヌクレオチド）を指す。
【0018】
本発明で、使用された用語「抗体」は、生化学的に区別できる多様で広範囲な種類のポリペプチドを包括することができる。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファー、デルタまたはエプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それらの一部は、下位分類（例：γ１－γ４）を有し、軽鎖がカッパまたはラムダ（Κ、λ）に分類されることを理解されるべきである。抗体の「分類」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥに決定することはこの鎖の特性である。免疫グロブリンの下位分類（イソ型）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などはよく特性化しており、機能的特殊性を与えるものと知られている。
【0019】
用語「重鎖」は、抗原に特異性を提供するのに十分なアミノ酸配列を含む可変領域ＶＨ、および３個の不変領域であるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、およびヒンジ領域を含む全長重鎖またはこれの断片を意味することもある。用語「軽鎖」は、抗原に特異性を提供するのに十分なアミノ酸配列を含む可変領域ＶＬ－および不変領域ＣＬを含む全長軽鎖または
これの断片を指すこともある。
これの断片を指すこともある。
【0020】
用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の超可変領域で発見されるアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ３個のＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３；およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）を含むことができる。ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するのに重要な役目を果たす残基を提供することができる。「特異的に結合する」または「特異的に認識される」という用語は、当業者によく知られており、抗体と抗原が特異的に相互作用して免疫学的活性を誘導することを示す。
【0021】
本発明で、抗体は、ポリクローンまたは単一クローン；および／またはヒト、ヒト化、動物（例えば、マウス、ウサギなど）来由の抗体、またはキメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ抗体）を含有するが、これに制限されない。また、本発明の抗体は、単一特異的抗体および例えば二重特異的抗体および三重特異的抗体のような多重特異的抗体を含有してもよいが、これに制限されるものではない。
【0022】
本発明で、用語「抗原結合断片」は、ＣＤＲのような抗原に結合できる部分を含む完全な免疫グロブリン構造に来由した断片を指す。例えば、抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはこれらの任意の組合であってもよいか、またはこれを含んでもよいが、これに制限されるものではない。本発明において、抗原結合断片は、例えばｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択される少なくとも一つの相補性決定領域を含む抗体来由の断片であってもよい。例えば、抗体または抗原結合断片は、化学的または組み換え的に合成することができる（自然発生ではない）。
【0023】
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体
【0024】
抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体は、Ｂ７－Ｈ４標的化モイアティとして抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原－結合断片を含むことができる。
【0025】
一具現例で、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの断片は、Ｂ７－Ｈ４（例えば、ヒトのＢ７－Ｈ４）タンパク質に特異的に結合することができる。
【0026】
Ｂ７ファミリの構成員であるＢ７－Ｈ４（Ｖ－ｓｅｔ Ｄｏｍａｉｎ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １（ＶＴＣＮ１）とも知られている）は、Ｔ細胞活性化の制御に関与する。Ｂ７－Ｈ４は、Ｔ細胞の増殖サイトカイン分泌と細胞周期を抑制することによってＴ細胞免疫反応を陰性的に調節する。構造的の観点からみると、Ｂ７－Ｈ４は、以下の二つのＩｇ－類似ドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリの構成員である。可変（ＩｇＶ）ドメインと不変（ＩｇＣ）ドメイン。他の陰性共刺激剤であるＰＤ－Ｌ１と同様に、Ｂ７－Ｈ４は、ＡＰＣ（抗原提示細胞）だけでなく、多様な普通の非－リンパ性組職および癌組職でも発現される。非－ＡＰＣによる発現は、Ｂ７－Ｈ４がさらに古典的共刺激分子の一つに追加機能を有することができることを暗示する。
【0027】
Ｂ７－Ｈ４のヒトタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列ＩＤ：ＮＰ＿００１２４０７７８．１、ＮＰ＿００１２４０７７９．１または、ＮＰ＿０７８９０２．２のアミノ酸配列で構成され、核酸配列は、ＮＭ＿００１２５３８４９．２、ＮＭ＿００１２５３８５０．２、または、ＮＭ＿０２４６２６．４である。本発明で使用された文脈上、明白ではない限り、Ｂ７－Ｈ４はヒトのＢ７－Ｈ４を指すが、抗体はさらにサルのＢ７－Ｈ４に対する結合能力を有する。マウスのＢ７－Ｈ４アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＸＰ＿００１１０３
７１５で表される。
７１５で表される。
【0028】
Ｂ７－Ｈ４の組職特異性の過発現は、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌および腎臓癌で陰性臨床結果と相関関係があった。最近、本発明者らは損傷されたＢ７－Ｈ４の提示が、マウスモデルおよびヒト患者の両方でＩ型糖尿病発明を表示し、この過程をＡＰＣおよび膵島で細胞表面Ｂ７－Ｈ４のタンパク質分解排出と連結することを示した。Ｉｇ治療は、Ｔ１Ｄ、実験的自己免疫脳脊髓炎およびリュウマチ関節炎の発病率を減少させ、自己免疫と癌の両方に対する潜在的な治療標的としての重要性を強調した。
【0029】
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原－結合断片は、Ｂ７－Ｈ４に対する強力な結合活性を示すことができ、治療および／または診断の用途に流用することができる。
【0030】
一具現例で、抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体は、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片および抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片を含み、ここで抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片は、以下を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
配列番号：２、２５および３３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）；
配列番号：３、２６および３４からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；
配列番号：４、２７および３５からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；
配列番号：２、２５および３３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）；
配列番号：３、２６および３４からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；
配列番号：４、２７および３５からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；
【0031】
配列番号：７、８、２９および３７からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）；
配列番号：９および３０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および
配列番号：１０、３１および３８からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；
前記抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片は、配列３９ないし４３からなる群より選択された少なくとも一つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号：５２および５３からなる群より選択された少なくとも一つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、表１に並べられている。
配列番号：９および３０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および
配列番号：１０、３１および３８からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；
前記抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片は、配列３９ないし４３からなる群より選択された少なくとも一つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号：５２および５３からなる群より選択された少なくとも一つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、表１に並べられている。
【0032】
【表1】
【0033】
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、表２に並べられている。
【0034】
【表2】
【0035】
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、表３に並べられている。
【0036】
【表3】
【0037】
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、表４に並べられている。
【0038】
【表4】
【0039】
一具現例で、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片は、Ｂ７－Ｈ４に対するその親和性を維持するために、表１および３に挙げられたＣＤＲを適切に混合およびマッチングすることによって設計することができる。例えば、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片は、以下を含むことができる。
（１）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号７のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９のＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１０のＣＤＲ－Ｌ３；
（２）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号８のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９のＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１０のＣＤＲ－Ｌ３；
（３）配列番号２５のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２および配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３；または
（４）配列番号３３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３５のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号３７のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９のＣＤＲ－Ｌ２および配列番号３８のＣＤＲ－Ｌ３。
（１）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号７のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９のＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１０のＣＤＲ－Ｌ３；
（２）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号８のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９のＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１０のＣＤＲ－Ｌ３；
（３）配列番号２５のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２および配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３；または
（４）配列番号３３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３５のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号３７のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９のＣＤＲ－Ｌ２および配列番号３８のＣＤＲ－Ｌ３。
【0040】
一具現例で、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片は、以下を含む。
配列番号：１、２２、２４および３２からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
配列番号：５、６、２３、２８および３６からなる群より選択されたアミノ酸を含む軽鎖
可変領域。
配列番号：１、２２、２４および３２からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
配列番号：５、６、２３、２８および３６からなる群より選択されたアミノ酸を含む軽鎖
可変領域。
【0041】
抗体または抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の例は、表２および４に並べられている。
【0042】
他の具現例で、表２および４に開示の重鎖および軽鎖の可変領域は、多様な形態の抗体の製造のために、適切に組合（混合およびマッチング）することができ、例えば、これらはＳｃＦＶのような単一鎖－抗体、またはドメイン抗体、または全長抗体（例えば、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むＩｇＧ形態抗体）を形成することができる。
【0043】
例えば、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体または抗原結合断片は、以下を含むことができる。
（１）配列番号：１の重鎖可変領域および配列番号：５の軽鎖可変領域；
（２）配列番号：１の重鎖可変領域および配列番号：６の軽鎖可変領域；
（３）配列番号：２２の重鎖可変領域および配列番号：２３の軽鎖可変領域；
（４）配列番号：２４の重鎖可変領域および配列番号：２８の軽鎖可変領域；または
（５）配列番号：３２の重鎖可変領域および配列番号：３６の軽鎖可変領域。
（１）配列番号：１の重鎖可変領域および配列番号：５の軽鎖可変領域；
（２）配列番号：１の重鎖可変領域および配列番号：６の軽鎖可変領域；
（３）配列番号：２２の重鎖可変領域および配列番号：２３の軽鎖可変領域；
（４）配列番号：２４の重鎖可変領域および配列番号：２８の軽鎖可変領域；または
（５）配列番号：３２の重鎖可変領域および配列番号：３６の軽鎖可変領域。
【0044】
本発明でそれぞれの重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、完全な抗体の重鎖および軽鎖を形成するために、各重鎖および軽鎖の多様な不変領域と組合されてもよい。
【0045】
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片の非制限的な例は、以下を含むことができる。
配列番号：１、２２、２４および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または前述したアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
配列番号：５、６、２３、２８、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または前述したアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
配列番号：１、２２、２４および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または前述したアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
配列番号：５、６、２３、２８、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または前述したアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【0046】
一具現例で、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク１（Ｈ－ＦＲ１）；配列番号：１３のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク２（Ｈ－ＦＲ２）；配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク３（Ｈ－ＦＲ３）；配列番号：１５のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク４（Ｈ－ＦＲ４）；配列番号：１７のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク１（Ｌ－ＦＲ１）；配列番号：１８のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク２（Ｌ－ＦＲ２）；配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク３（Ｌ－ＦＲ３）；および配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク４（Ｌ－ＦＲ４）を含む。
【0047】
一具現例で、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体または抗原結合断片がｓｃＦｖの形態の場合、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は適したペプチドリンカーを通じて連結することができる。例えば、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、または（ＧＳ）９であってもよい。
【0048】
例えば、ヒトのＢ７－Ｈ４に対する本発明の抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片の結合親和度は、解離定数またはＫＤが１×１０－６Ｍ以下、１×１０－７Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、または１×１０－１０Ｍ以下である。
【0049】
抗－４－１ＢＢ抗体
【0050】
抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体は、４－１ＢＢ標的化モイアティとして抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片を含むことができる。抗－４－１ＢＢ抗体を開示するＷＯ２０２０／１１１９１３は、その全体が参考として本明細書に含まれる。
【0051】
一具現例で、抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの断片は、４－１ＢＢ（例えば、ヒトの４－１ＢＢ）タンパク質に特異的に結合することができる。例えば、ヒトの４－１ＢＢタンパク質は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００１５５２．２などで表されるタンパク質からなる群より選択されてもよいが、ここに限定されない。
【0052】
このような抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片は、哺乳動物で免疫反応を増進して／するか、腫瘍（癌）を治療することができる。抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片は、腫瘍微細環境（ＴＭＥ）でのみ局所化および／または活性化させて／させるか、免疫反応増進および／または腫瘍治療の効能を維持しながら既存の抗－４－１ＢＢ抗体と比べて、肝毒性を非常に減少させることを特徴とする。
【0053】
本発明で、用語「４－１ＢＢ」は、ＣＤ１３７またはＴＮＦＲＳＦ９（ＴＮＦ受容体２５スーパーファミリ構成員９）を指し、ＴＮＦ受容体スーパーファミリ（ＴＮＦＲＳＦ）の構成員であって、先天的および後天的免疫細胞の両方の免疫細胞の活性化後に発現される共刺激分子である。本発明で使用されたように、４－１ＢＢは哺乳動物、例えばホモサピエンス（ヒト）（ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００１５５２．２）に来由してもよい。
【0054】
本発明で記述されたように、用語「４－１ＢＢ」は、変異体、イソ型、相同体、オルソログ、およびパラログを含む。例えば、ヒトの４－１ＢＢタンパク質に特異的な抗体は、特定の場合にヒト以外の種からの４－１ＢＢタンパク質と交差反応することができる。他の具現例で、ヒトの４－１ＢＢタンパク質に特異的な抗体は、ヒトの４－１ＢＢタンパク質に完全に特異的であってもよいか、種または他の類型の交差反応性を示すことができるか、他の全ての種ではないが特定の他の種からの４－１ＢＢと交差反応することができる（例えば、サルの４－１ＢＢとは交差反応するが、マウスの４－１ＢＢとはそうではない）。用語「ヒトの４－１ＢＢ」は、ヒト配列４－１ＢＢ、例えば、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００１５５２．２を有するヒトの４－１ＢＢの完全なアミノ酸配列を指す。用語「マウスの４－１ＢＢ」は、マウス配列４－１ＢＢ、例えば、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ０３３４３０．１を有するマウスの４－１ＢＢの完全なアミノ酸配列を指す。
【0055】
４－１ＢＢは、さらに当該分野において、例えばＣＤ１３７と知られている。
【0056】
本発明のヒトの４－１ＢＢ配列は、例えば、保存した突然変異または非－保存領域の突然変異を有することによって、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００１５５２．２のヒトの４－１ＢＢと異なることもあり、本発明の４－１ＢＢは、ＮＣＢＩ登録番号Ｎｏ．ＮＰ＿００１５５２．２のヒトの４－１ＢＢと実質的に同一の生物学的機能を有する。
【0057】
一具現例で、抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片は、以下を含むことができる。
配列番号：４４および４５より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；
配列番号：４６および４７より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；
配列番号：４８ないし５１より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；
配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；
配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および
配列番号：５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３。
配列番号：４４および４５より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；
配列番号：４６および４７より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；
配列番号：４８ないし５１より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；
配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；
配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および
配列番号：５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３。
【0058】
抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、表５に並べられている。
【0059】
【表5】
【0060】
抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、表６に並べられている。
【0061】
【表6】
【0062】
抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、表７に並べられている。
【0063】
【表7】
【0064】
抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、表８に並べられている。
【0065】
【表8】
【0066】
一具現例で、抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片は、４－１ＢＢに対するその親和度を維持するために、表５および７に挙げられたＣＤＲを適切に混合およびマッチングすることによって設計することができる。例えば、抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片は、以下を含むことができる。
（１）配列番号：４４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号：４８のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号：５４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のＣＤＲ－Ｌ３；
（２）配列番号：４４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号：４９のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号：５４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のＣＤＲ－Ｌ３；
（３）配列番号：４４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号：５０のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号：５４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のＣＤＲ－Ｌ３；
（４）配列番号：４４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号：４９のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号：５４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のＣＤＲ－Ｌ３；または
（５）配列番号：４５のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４７のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号：５１のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号：５４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のＣＤＲ－Ｌ３。
（１）配列番号：４４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号：４８のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号：５４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のＣＤＲ－Ｌ３；
（２）配列番号：４４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号：４９のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号：５４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のＣＤＲ－Ｌ３；
（３）配列番号：４４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号：５０のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号：５４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のＣＤＲ－Ｌ３；
（４）配列番号：４４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４６のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号：４９のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号：５４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のＣＤＲ－Ｌ３；または
（５）配列番号：４５のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４７のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号：５１のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号：５４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のＣＤＲ－Ｌ３。
【0067】
抗体または抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の例は、表６および８に並べられている。
【0068】
抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片の非制限的な例は、以下を含むことができる。
配列番号：３９ないし４３からなる群より選択されたアミノ酸配列または前記に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
配列番号：５２および５３より選択されたアミノ酸配列または前記に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
配列番号：３９ないし４３からなる群より選択されたアミノ酸配列または前記に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
配列番号：５２および５３より選択されたアミノ酸配列または前記に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【0069】
他の具現例で、表６および８に開示の重鎖および軽鎖の可変領域は、多様な形態の抗体の製造のために適宜組合（混合およびマッチング）することができ、例えば、これらはｓｃＦｖのような単一鎖抗体、またはドメイン抗体、または全長抗体（例えば、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むＩｇＧ形態抗体）を形成することができる。
【0070】
例えば、抗－４－１ＢＢ抗体または抗原結合断片は、以下を含むことができる。
（１）配列番号：３９の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（２）配列番号：４０の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（３）配列番号：４１の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（４）配列番号：４０の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域；
（５）配列番号：４１の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域；
（６）配列番号：４２の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（７）配列番号：４３の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域。
（１）配列番号：３９の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（２）配列番号：４０の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（３）配列番号：４１の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（４）配列番号：４０の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域；
（５）配列番号：４１の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域；
（６）配列番号：４２の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（７）配列番号：４３の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域。
【0071】
また他の具現例で、抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原－結合断片は、下記を含むｓｃＦｖ（単鎖可変断片）であってもよい。
配列番号：４４および４５より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４６および４７より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号：４８ないし５１より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３で構成された重鎖可変領域；配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３で構成された軽鎖可変領域；および重鎖可変領域と軽鎖可変領域間のペプチドリンカー。
配列番号：４４および４５より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号：４６および４７より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号：４８ないし５１より選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３で構成された重鎖可変領域；配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号：５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３で構成された軽鎖可変領域；および重鎖可変領域と軽鎖可変領域間のペプチドリンカー。
【0072】
より具体的に、抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片は、下記を含むｓｃＦｖであってもよい。
配列番号：３９ないし４３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；配列番号：５２および５３で選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および重鎖可変領域と軽鎖可変領域間のペプチドリンカー。
配列番号：３９ないし４３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；配列番号：５２および５３で選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および重鎖可変領域と軽鎖可変領域間のペプチドリンカー。
【0073】
例えば、抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの断片は、以下を含むｓｃＦｖであってもよい。配列番号：３９ないし４３からなる群より選択されるアミノ酸配列、または前述したアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくと
も９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
配列番号：５２および５３からなる群より選択されるアミノ酸配列、または前述したアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および重鎖可変領域と軽鎖可変領域間のペプチドリンカー。
も９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
配列番号：５２および５３からなる群より選択されるアミノ酸配列、または前述したアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および重鎖可変領域と軽鎖可変領域間のペプチドリンカー。
【0074】
例えば、抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片は、以下を含むｓｃＦｖであってもよい。
（１）配列番号：３９の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（２）配列番号：４０の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（３）配列番号：４１の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（４）配列番号：４０の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域；
（５）配列番号：４１の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域；
（６）配列番号：４２の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（７）配列番号：４３の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域；
重鎖可変領域と軽鎖可変領域間のペプチドリンカー。
（１）配列番号：３９の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（２）配列番号：４０の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（３）配列番号：４１の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（４）配列番号：４０の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域；
（５）配列番号：４１の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域；
（６）配列番号：４２の重鎖可変領域および配列番号：５２の軽鎖可変領域；
（７）配列番号：４３の重鎖可変領域および配列番号：５３の軽鎖可変領域；
重鎖可変領域と軽鎖可変領域間のペプチドリンカー。
【0075】
本発明で、抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、任意の順序で重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができる。例えば、抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ－末端からＣ－末端の順に軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むことができる。代案的に、抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ－末端からＣ－末端まで順に重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができる。
【0076】
一具現例で、ｓｃＦｖの重鎖可変領域および軽鎖可変領域は適したペプチドリンカーを通じて連結することができる。例えば、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、または（ＧＳ）９であってもよい。
【0077】
本発明で、開示されたそれぞれの重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ完全な抗体の重鎖および軽鎖を形成するために、重鎖および軽鎖の多様な不変領域と組合されてもよい。
【0078】
このような抗－４－１ＢＢ抗体は、多様な類型の癌治療などのような治療目的に流用することができ、診断および予後の目的でも用いることができる。
【0079】
本発明の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性を特徴とする。例えば、抗体は、ヒトの４－１ＢＢに特異的に結合し、特定の他の種からの４－１ＢＢ、例えばサル、例えばシノモルグスサル、アカゲザルの４－１ＢＢに結合することができるが、特定の他の種からの４－１ＢＢ、例えばマウスの４－１ＢＢには実質的に結合しないこともある。好ましくは、本発明で開示された抗体は、ヒトの４－１ＢＢに高い親和度で結合する。
【0080】
本発明抗体の４－１ＢＢに対する結合は、当該分野においてよく確立された一つ以上の技術を用いて評価することができる。例えば、好ましい具現例で、抗体は、ヒトの４－１ＢＢを発現する細胞株、例えば４－１ＢＢ、例えば、ヒトの４－１ＢＢまたはサルの４－１ＢＢ、例えばアカゲサルまたはシノモルグスサル、またはマウスの４－１ＢＢを細胞表面に発現するように形質感染させたＣＨＯ細胞と反応させる流細胞分析法で試験することができる。流細胞分析に用いるのに適した他の細胞は、固有の４－１ＢＢを発現する抗－ＣＤ３刺激性ＣＤ４＋活性化Ｔ細胞を含む。
【0081】
また他の適した結合分析は、例えば、組み換え４－１ＢＢタンパク質を用いるＥＬＩＳＡ分析を含む。追加的または代案的に、結合動力学（例えば、ＫＤ値）を含む抗体の結合は、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）分析で試験することができる。例えば、ヒトの４－１ＢＢに対する本発明の抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片の結合親和度は、１×１０－６Ｍ以下、１×１０－７Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下または１．８０×１０－１０Ｍ以下の解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
ｃｏｎｓｔａｎｔ）またはＫＤを有するものなどを含む。
ｃｏｎｓｔａｎｔ）またはＫＤを有するものなどを含む。
【0082】
抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの断片、前記抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの断片、および／または二重特異的抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってもよく、これに制限されるものではない。
【0083】
一具現例で、抗体またはこれの断片は、自然的に発生しないか、化学的または組み換え的に合成されたものである。それぞれのこれら抗体が４－１ＢＢ（例えば、ヒトの４－１ＢＢ）および／またはＢ７－Ｈ４（例えば、ヒトのＢ７－Ｈ４）に結合できることを考慮すると、ＣＤＲ配列またはＶＨおよびＶＬ配列は、その他の抗－４－１ＢＢ結合分子および／またはその他の抗－Ｂ７－Ｈ４結合分子を生成するように「混合およびマッチ」されてもよい。具体的に、ＣＤＲ配列またはＶＨおよびＶＬ鎖が混合およびマッチされるとき、例えば、特定のＶＨ／ＶＬの対からのＶＨ配列は構造的に類似のＶＨ配列に取り替えられてもよい。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬの対からのＶＬ配列は構造的に類似のＶＬ配列に取り替えられてもよい。
【0084】
抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異性抗体
【0085】
本発明の二重特異的抗体は、以下を含むことができる。
（１）Ｂ７－Ｈ４タンパク質を特異的に認識および／または結合することができる抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片；および
（２）４－１ＢＢタンパク質を特異的に認識および／または結合することができる抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片。
（１）Ｂ７－Ｈ４タンパク質を特異的に認識および／または結合することができる抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原結合断片；および
（２）４－１ＢＢタンパク質を特異的に認識および／または結合することができる抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片。
【0086】
本発明の二重特異的抗体は、Ｂ７－Ｈ４および４－１ＢＢの両方に結合することができる。二重特異的抗体で、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原－結合断片および抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原－結合断片は、前記に記載の通りである。
【0087】
二重特異的抗体は、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの断片および／または抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの断片の機能によってメリットを有することができる。
【0088】
一具現例で、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体またはこれの抗原－結合断片によって、二重特異的抗体はサイトカインの分泌を向上させる能力を有することができる。また、抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原－結合断片によって、本発明の二重特異的抗体は、ヒトの４－１ＢＢに結合することができ、Ｔ細胞を活性化する能力を示すことができる。抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体は、Ｂ７－Ｈ４発現腫瘍細胞の条件下で、４－１ＢＢ信号伝逹を活性化することができる。また、二重特異的抗体に含まれた抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片は、腫瘍微細環境（ＴＭＥ）でのみ局所化および／または活性化して／するか、以前に比べて肝毒性を非常に減少させることを特徴とする。
【0089】
また、抗－４－１ＢＢ抗体は、免疫反応の向上および／または腫瘍治療の効能を維持する。
【0090】
抗体が免疫反応を刺激する能力を評価する方法は、生体内腫瘍移植モデルのように、抗体
が腫瘍成長を抑制する能力を評価することを含む。
が腫瘍成長を抑制する能力を評価することを含む。
【0091】
Ｂ７－Ｈ４標的化モイアティおよび４－１ＢＢ標的化モイアティを含む二重特異的抗体で、Ｂ７－Ｈ４標的化モイアティおよび４－１ＢＢ標的化モイアティの一つは、全長抗体であってもよく、残りは、重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、またはこれらの組合を含む抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）であってもよいが、これに制限されない。
【0092】
Ｂ７－Ｈ４および４－１ＢＢタンパク質の一つを標的にする全長抗体および残りのタンパク質を標的にする抗原－結合断片は、直接にまたはペプチドリンカーを通じて化学的に連結（例えば、共有的に連結）されてもよい。抗原－結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、全長抗体のＮ－末端（例えば、全長抗体の軽鎖または、重鎖のＮ－末端）、全長抗体のＣ－末端（例えば、全長抗体の重鎖（または、ＦｃまたはＣＨ３ドメイン）のＣ－末端）またはこれらの両方に直接にまたはペプチドリンカーを通じて連結することができる。
【0093】
一具現例で、二重特異的抗体は、全長抗－Ｂ７－Ｈ４抗体、抗－４－１ＢＢ抗体の抗原－結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）およびこれらの間にペプチドリンカーを含むことができる。他の具現例で、二重特異的抗体は、全長抗－４－１ＢＢ抗体、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の抗原－結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）およびこれらの間にペプチドリンカーを含むことができる。
【0094】
一具現例で、二重特異的抗体に含有されたｓｃＦｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を任意の順序で含むことができる。例えば、二重特異的抗体に含有されたｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端方向に重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、そして選択的にこれらの間にペプチドリンカーを含むことができるか、代案的に二重特異的抗体に含有されたｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端方向に軽鎖可変領域および重鎖可変領域を、そして選択的にこれらの間にペプチドリンカーを含むことができる。
【0095】
一具現例で、抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体は、４－１ＢＢ信号伝逹を活性化し、その結果、細胞表面に発現されたＢ７－Ｈ４によって免疫反応を活性化する。
【0096】
二重特異的抗体が全長抗－Ｂ７－Ｈ４抗体および抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖを含む場合、二重特異的抗体は、以下を含むことができる。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端方向への第１ポリペプチド：
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖、
選択的に、ペプチドリンカー（第１ペプチドリンカー）、および
抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ；および
（ｉｉ）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖を含む第２ポリペプチド、
前記抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ－末端からＣ－末端への方向であり、
抗－４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域、
選択的に、ペプチドリンカー（第２ペプチドリンカー）、および
抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端方向への第１ポリペプチド：
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖、
選択的に、ペプチドリンカー（第１ペプチドリンカー）、および
抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ；および
（ｉｉ）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖を含む第２ポリペプチド、
前記抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ－末端からＣ－末端への方向であり、
抗－４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域、
選択的に、ペプチドリンカー（第２ペプチドリンカー）、および
抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域。
【0097】
また選択的に、二重特異的抗体は、以下を含むことができる。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端方向への第１ポリペプチド：
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖、
選択的に、ペプチドリンカー（第１ペプチドリンカー）、および
抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ；および
（ｉｉ）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖を含む第２ポリペプチド、
前記抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ－末端からＣ－末端への方向であり、
前記抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域、
選択的に、ペプチドリンカー（第２ペプチドリンカー）、および
抗－４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端方向への第１ポリペプチド：
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖、
選択的に、ペプチドリンカー（第１ペプチドリンカー）、および
抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ；および
（ｉｉ）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖を含む第２ポリペプチド、
前記抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ－末端からＣ－末端への方向であり、
前記抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域、
選択的に、ペプチドリンカー（第２ペプチドリンカー）、および
抗－４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域。
【0098】
また選択的に、前記二重特異的抗体は、以下を含むことができる。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端方向への第１ポリペプチド：
抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ、
選択的に、ペプチドリンカー（第１ペプチドリンカー）、および
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖；および
（ｉｉ）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖を含む第２ポリペプチド、
前記抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ－末端からＣ－末端への方向であり、
抗－４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域、
選択的に、ペプチドリンカー（第２ペプチドリンカー）、および
前記抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端方向への第１ポリペプチド：
抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ、
選択的に、ペプチドリンカー（第１ペプチドリンカー）、および
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖；および
（ｉｉ）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖を含む第２ポリペプチド、
前記抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ－末端からＣ－末端への方向であり、
抗－４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域、
選択的に、ペプチドリンカー（第２ペプチドリンカー）、および
前記抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域。
【0099】
また選択的に、二重特異的抗体は、以下を含むことができる。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端方向への第１ポリペプチド：
項４－１ＢＢ ｓｃＦｖ、
選択的に、ペプチドリンカー（第１ペプチドリンカー）、および
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖；および
（ｉｉ）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖を含む第２ポリペプチド、
前記抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ－末端からＣ－末端への方向であり、
抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域、
選択的に、ペプチドリンカー（第２ペプチドリンカー）、および
抗－４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域。
（ｉ）Ｎ－末端からＣ－末端方向への第１ポリペプチド：
項４－１ＢＢ ｓｃＦｖ、
選択的に、ペプチドリンカー（第１ペプチドリンカー）、および
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖；および
（ｉｉ）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖を含む第２ポリペプチド、
前記抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ－末端からＣ－末端への方向であり、
抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域、
選択的に、ペプチドリンカー（第２ペプチドリンカー）、および
抗－４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域。
【0100】
また他の具現例で、二重特異的抗体に含有されたＢ７－Ｈ４標的化モイアティおよび４－１ＢＢ標的化モイアティの両方は、全長抗体または重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、またはこれらの組合を含む抗原－結合断片であってもよく、これらは互いに直接またはペプチドリンカーを通じて連結することができる。
【0101】
各抗体が４－１ＢＢ（例：ヒトの４－１ＢＢ）およびＢ７－Ｈ４（例：ヒトのＢ７－Ｈ４）、ＣＤＲ配列、またはＶＨ（重鎖可変領域）およびＶＬの両方に結合できるという点を考慮すると、本発明で、開示された（軽鎖可変領域）配列はその他の抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ結合二重特異的分子を生成するため「混合およびマッチ」されてもよい。
【0102】
また他の具現例で、Ｂ７－Ｈ４標的化モイアティおよび４－１ＢＢ標的化モイアティはいずれも、全長抗体または重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、またはこれらの組合を含む抗原－結合断片であってもよい。
【0103】
また他の具現例で、二重特異的抗体は、Ｂ７－Ｈ４および４－１ＢＢの一つを標的化する第１重鎖および第１軽鎖の対を含む第１アーム（ａｒｍ）、および残り一つを標的化する第２重鎖および第２軽鎖の対を含む第２アームを含む異種二量体形態であってもよい。
【0104】
一具現例で、全長抗体は、全長免疫グロブリン形態（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤ、例えば、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＥ、またはヒトＩｇＤ）であってもよく、抗原結合断片は、前述のように、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一鎖抗体、ｓｄＦｖなどからなる群より選択されてもよい。例えば、全長抗体は、全長ヒトＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３またはヒトＩｇＧ４）形態であってもよく、抗原結合断片は、ｓｃＦｖであってもよい。
【0105】
ペプチドリンカー
【0106】
二重特異的抗体に対するペプチドリンカーの使用は、抗体の高い純度を作ることができる。すなわち、抗体の高い純度のために、二重特異的抗体は、第１ポリペプチドで重鎖とｓｃＦｖとの間（第１ペプチドリンカー）および／またはｓｃＦｖで重鎖および軽鎖可変領域の間（第２ペプチドリンカー）にペプチドリンカーを含むことができる。
【0107】
本発明で、用語「ペプチドリンカー」は、１ないし１００個、特に２ないし５０個の任意のアミノ酸を含むものであってもよく、任意の種類のアミノ酸がいかなる制限なく含まれてもよい。ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎおよび／またはＳｅｒ残基を含んでもよく、また中性アミノ酸、例えば、Ｔｈｒおよび／またはＡｌａを含んでもよい。ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は、関連技術分野に公知のものなどであってもよい。
【0108】
また、ペプチドリンカーの長さは、ポリペプチドおよび／またはｓｃＦｖの機能が影響を受けない限度内で多様に決めることができる。例えば、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＡｌａからなる群より選択される一つ以上を総約１ないし約１００個、約２ないし約５０個、または約５ないし約２５個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個）を含んで形成されてもよい。
【0109】
一具現例で、ペプチドリンカーは、（ＧｍＳ１）ｎ（ｍ、１、およびｎは、独立して、約１ないし約１０の定数、特に、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）で表されてもよい。一具現例で、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、または（ＧＳ）９のアミノ酸であってもよいが、これに制限されない。
【0110】
可変抗体
【0111】
例えば、本発明の抗体は、柔軟な（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）リンカー配列を含んでもよいか、機能的モイアティ（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、または標識）を追加するように変形されてもよい。
【0112】
本発明の抗体または変異体は、例えば、抗体に対する任意の類型の分子の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）によって変形された誘導体を含んでもよく、ここで共有結合は、抗体が抗原（例えば、エピトープ）に結合することを妨げないこともある。例えば、抗体は、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質加水分解切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質に対する連結などからなる群より選択される少なくとも一つによって変形されてもよく、前記に制限されるものではない。
【0113】
多くの化学的変形のうち、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むが、これに限定されない公知の技術によって行われてもよい。追加的に、抗体は一つ以上の非古典的（ｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌ）アミノ酸を含有してもよい。
【0114】
ヒトでの抗体の生体内の使用および試験管内の検出分析を含む一部の用途の場合、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を用いることが好ましい。キメラ抗体またはヒト化抗体を生産する方法は、当該分野に公知されている。
【0115】
また他の具現例で、所望の抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の手続きを用いて容易に分離してシーケンシングされてもよい。分離してサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として作用する。一旦分離すると、ＤＮＡは発現ベクターに位置してもよく、次いで、大膓菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他に免疫グロブリンを生産しない骨髄腫細胞のような原核または真核宿主細胞によって形質感染される。
【0116】
本発明では、抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体、抗－４－１ＢＢ抗体またはこれの抗原結合断片を暗号化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0117】
一具現例で、分離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することができる。
【0118】
また、一具現例で、本発明の抗体または抗原結合断片またはこれを含む発現ベクターを暗号化する分離されたポリヌクレオチドを含むハイブリドーマ細胞を提供することができる。
【0119】
また、通常の組み換えＤＮＡ技術を用いて、抗体のＣＤＲの一つ以上をフレームワーク領域、例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入して非ヒト抗体をヒト化することができる。フレームワーク領域は、自然発生またはコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）フレームワーク領域であってもよく、好ましくは、ヒトフレームワーク領域であってもよい（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストは、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７～４７９（１９９８）参照）。例えば、フレームワーク領域とＣＤＲとの組合によって生成されたポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドの少なくとも一つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体、例えば、ＬＩＧＨＴを暗号化する。好ましくは、一つ以上のアミノ酸置き換えフレームワーク領域内からなってもよく、好ましくは、アミノ酸置き換えは、抗体の抗原（または、エピトープ）に対する結合を改善する。追加的に、このような方法は、一つ以上の鎖内の二硫化結合がない抗体分子を生成するために、鎖内の二硫化結合に参加する一つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置き換えまたは欠失を作るのに用いることができる。ポリヌクレオチドに対する他の変更は、本開示および当該分野の技術範囲内に含まれる。
【0120】
追加的に、当業者に公知の標準技術を用いて、本発明の抗体を暗号化するヌクレオシド配列に突然変異を導入することができる。
【0121】
本発明の抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体の「重い構成要素（Ｈｅａｖｙ
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」は、二重特異的抗体が抗－Ｂ７－Ｈ４全長抗体および抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖを含む場合、（１）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖および（２）抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域；または二重特異的抗体が抗－４－１ＢＢ全長抗体および抗－Ｂ７－Ｈ４ｓｃＦｖを含む場合、（１）抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖および（２）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができる。
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」は、二重特異的抗体が抗－Ｂ７－Ｈ４全長抗体および抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖを含む場合、（１）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖および（２）抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域；または二重特異的抗体が抗－４－１ＢＢ全長抗体および抗－Ｂ７－Ｈ４ｓｃＦｖを含む場合、（１）抗－４－１ＢＢ抗体の重鎖および（２）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができる。
【0122】
本発明の抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体の「軽い構成要素（Ｌｉｇｈｔ
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」は、以下を含むことができる。二重特異的抗体が抗－Ｂ７－Ｈ４全長抗体および抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖを含む場合、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖；または二重特異的抗体が抗－４－１ＢＢ全長抗体および抗－Ｂ７－Ｈ４ｓｃＦｖを含む場合、抗－４－１ＢＢ抗体の軽鎖を含むことができる。
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」は、以下を含むことができる。二重特異的抗体が抗－Ｂ７－Ｈ４全長抗体および抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖを含む場合、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖；または二重特異的抗体が抗－４－１ＢＢ全長抗体および抗－Ｂ７－Ｈ４ｓｃＦｖを含む場合、抗－４－１ＢＢ抗体の軽鎖を含むことができる。
【0123】
二重特異的抗体の治療的用途
【0124】
本発明の二重特異的抗体は、細胞表面上のＢ７－Ｈ４タンパク質と４－１ＢＢタンパク質に同時に結合することができるので、例えば、腫瘍微細環境で免疫反応を活性化することによって、免疫療法／およびまたは癌療法で改善した効果を示すことができる。
【0125】
本発明の二重特異的抗体のＢ７－Ｈ４タンパク質に結合する、および抗原特異的Ｔ細胞反応を刺激する能力を考慮すると、本発明の抗体を用いて、抗原特異的Ｔ細胞反応を刺激、増進または上向きになるように調節する組成物、または試験管内および生体内の方法を提供することができる。
【0126】
一具現例は、前記二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４または抗－４－１ＢＢ抗体を含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。薬学的組成物は、免疫反応刺激（例えば、抗原特異的Ｔ細胞反応）および／またはＢ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する疾患の治療および／または予防に用いることができる。
【0127】
また他の具現例は、Ｂ７－Ｈ４に関連する疾病の予防または治療において、二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の用途を提供する。
【0128】
また他の一具現例は、対象体に薬剤学的有効量の二重特異的抗体または薬学的組成物を投与することを含む、これを必要とする対象体で免疫反応を（例えば、抗原－特異的Ｔ細胞反応）刺激して／するか、Ｂ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する、例えば、癌のような疾患の治療および／または予防する方法を提供する。対象体は、免疫反応（例えば、抗原－特異的Ｔ細胞反応）刺激して／するか、Ｂ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する、例えば、癌のような疾病を治療および／または予防する必要がある対象であってもよい。方法は、投与ステップ前に免疫反応を刺激するか、Ｂ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する疾患の治療および／または予防を必要とする対象体を確認するステップをさらに含むことができる。
【0129】
また他の一具現例は、免疫反応刺激（例えば、抗原－特異的Ｔ細胞反応）および／またはＢ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する、例えば、癌のような疾病治療および／または予防するにおいて前記二重特異的抗体または前記治療学的組成物の用途を提供する。また他の具現例は、免疫反応刺激（例えば、抗原－特異的Ｔ細胞反応）および／またはＢ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する、例えば、癌のような疾病治療および／または予防のための薬剤を製造するにおいて前記二重特異的抗体の用途を提供する。
【0130】
一具現例で、対象体は、ヒト、サル、レット、マウス、犬、猫、モルモット、ウサギ、レット、馬、牛、雌牛、その他等々を含む哺乳動物またはこれらから得られた細胞または組職より選択されてもよいが、これに制限されない。例えば、対象体は、免疫反応刺激（例えば、抗原－特異的Ｔ細胞反応）および／またはＢ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する、例えば、癌のような疾病治療および／または予防する必要がある対象であってもよい。例えば、対象体は癌で苦しむ哺乳動物（例えば、ヒト）であってもよい。
【0131】
また他の一具現例で、対象体は、哺乳動物、例えば、癌、感染性疾患、自己免疫反応、神経系障害などより選択される疾患を病む哺乳動物から分離された（ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｏｒ ｉｓｏｌａｔｅｄ）細胞（例えば、癌細胞または哺乳動物の感染部位から分離された細胞、またはＴ細胞、例えば腫瘍浸湿性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはこれらの組合）であってもよい。
【0132】
一具現例で、前記疾患は、Ｂ７－Ｈ４の発現または高－発現（過発現）に関連するものであってもよく、例えば、疾患は、Ｂ７－Ｈ４の発現または高－発現（過発現）に関連する癌であってもよい。例えば、「Ｂ７－Ｈ４の高発現に関連する癌」は、Ｂ７－Ｈ４非発現癌細胞（例えば、癌細胞株ＳＫ－ＢＲ３、ＣＡＭＡ－１など）よりＢ７－Ｈ４発現が高い癌細胞に関連する癌を指すことができる。
【0133】
本発明で提供された薬学的組成物、方法および／または用途で、Ｂ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する疾患は、Ｂ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方の活性化（例えば、非正常的な活性化または過活性化）および／または過生成（過発現）に関連する疾患であってもよい。例えば、疾患は癌または感染であってもよい。
【0134】
前記癌は、固形癌または血液癌であってもよい。具体的に、前記癌は、乳癌、結腸癌、胃癌、肺癌（例えば、肺の扁平上皮癌、小細胞肺癌、非細胞肺癌、肺腺癌）、腹膜癌、皮膚癌、扁平細胞癌、肌と眼球の黒色腫、直腸癌、肛門周辺癌、食道癌、小腸腫瘍、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、晩成または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、肝臓癌、消化管癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腺腫、大膓癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺腫瘍、腎臓癌、子宮頸部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、胆道癌、胆嚢癌などからなる群より選択される１種以上の癌であってもよいが、これに制限されるものではない。癌は、原発性癌または転移性癌であってもよい。
【0135】
本発明で、用語「癌の予防および／または治療」は癌細胞の死滅、癌細胞の増殖の抑制、癌に関連する症状の緩和、癌の転移抑制などを意味することができる。
【0136】
本発明で、用語「免疫反応の増進」は、４－１ＢＢ信号活性化、４－１ＢＢ誘導信号活性化のような４－１ＢＢに関連するいかなる免疫反応の向上（例えば、４－１ＢＢ誘導ＮＦ－ｋＢ信号活性化、サイトカイン放出増加、Ｔ細胞のような免疫細胞による標的細胞死滅など、しかし、これに制限されない）を意味することができる。一具現例で、本開示によって提供される二重特異的抗体による免疫反応増進は、Ｂ７－Ｈ４存在の下で（Ｂ７－Ｈ４発現条件の下で）発生することができる。
【0137】
特定の患者に対する特異的用量および治療用法は、特定の抗体、これの変異体または誘導体を含む多様な要素、患者の年、体重、一般健康、性別および食餌、並びに投与時間、排泄速度、薬物組合および治療する特定の疾病の重度度によって異なる。使用された量は、当業係でよく知られた薬理学的および薬動学的原理によって決めることができる。
【0138】
二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４または抗－４－１ＢＢ抗体の投与は、腹腔内静脈、皮下、皮内、筋肉内、鼻腔内、硬膜外および経口投与からなる群より選択される一つ以上を通じて行われてもよいが、これに制限されない。
【0139】
二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４または抗－４－１ＢＢ抗体または組成物は、任意の楽な経路、例えば、注入または一時注射によって、上皮または粘膜皮膚内壁（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）および他の生物学的活性剤とともに投与することができる。したがって、本発明の抗原－結合ポリペプチドを含有する薬学的組成物は、経口、非経口、組職内、膣内、腹腔内、直腸、局所（粉末、軟膏、点滴剤または経口パッチによる）、狭側または経口または狭側投与されるかまたは経口または鼻腔スプレーによって投与することができる。本発明で、使用された用語「非経口的」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、腫瘍内、皮下および関節内注射および注入を含む投与方式を意味する。
【0140】
炎症性、免疫性または悪性疾患、障害、または状態を、治療、抑制、改善および／または
予防するための二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４または抗－４－１ＢＢ抗体の薬学的有効量は、標準臨床技術によって決めることができる。
予防するための二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４または抗－４－１ＢＢ抗体の薬学的有効量は、標準臨床技術によって決めることができる。
【0141】
本発明の薬学的組成物は、有効量の二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４または抗－４－１ＢＢ抗体および許容可能な担体を含むことができる。一部の具現例で、組成物は、第２抗癌剤（例えば、免疫チェックポイント抑制剤）をさらに含むことができる。
【0142】
抗体の診断的用途
【0143】
Ｂ７－Ｈ４および／または４－１ＢＢの過発現および／または過活性化は、特定の癌および／または感染を病んでいる患者からの生物学的サンプル（例えば、細胞、組職、血液、血清など）（例えば、腫瘍細胞または感染患者からの組職、血液または血清）で観察されて／観察されるか、Ｂ７－Ｈ４および／または４－１ＢＢ過発現細胞を有する患者は、二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４または抗－４－１ＢＢ抗体を用いた治療に反応する可能性がある。したがって、本発明の二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４または抗－４－１ＢＢ抗体は、さらに診断および予後の目的に用いることができる。
【0144】
一具現例は、二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４または抗－４－１ＢＢ抗体を含む組成物であるＢ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する疾患を診断するための薬学的組成物を提供する。
【0145】
また他の具現例で、Ｂ７－Ｈ４、４－１ＢＢまたはこれらの両方に関連する疾患を診断するための二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４または抗－４－１ＢＢ抗体の用途を提供する。診断方法および／または検出方法において、抗原－抗体反応を検出するステップまたは抗原－抗体反応の水準を測定するステップは、関連分野に公知の任意の一般的な方法によって行われてもよい。
【0146】
また他の具現例で、Ｂ７－Ｈ４に関連する疾病に関する診断情報を提供する方法を提供する。
【0147】
抗体を暗号化するポリヌクレオチドおよび抗体の製造方法
【0148】
本発明の一具現例は、二重特異的抗体または抗－Ｂ７－Ｈ４または抗－４－１ＢＢ抗体を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。具体的に、一具現例はＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の二重特異的抗体の重鎖を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。
【0149】
他の一具現例は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の二重特異的抗体の軽鎖を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態は、Ｂ７－Ｈ４および４－１ＢＢタンパク質の一つを標的化する（これに結合する）全長ＩｇＧ抗体および残りを標的化する（これに結合する）ｓｃＦｖ断片を含む二重特異的抗体の一種類を指すことができ、ここで、ｓｃＦｖは、全長ＩｇＧ抗体のＣ末端および／またはＮ末端に直接に（ペプチドリンカー無く）またはペプチドリンカーを通じて連結することができる。
【0150】
一具現例で、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の二重特異的抗体が、Ｂ７－Ｈ４に対する全長ＩｇＧ抗体および４－１ＢＢに対するｓｃＦｖ断片を含む場合、二重特異的抗体の重鎖を暗号化するポリヌクレオチドは、Ｂ７－Ｈ４に対する全長ＩｇＧ抗体、および全長ＩｇＧ抗体のＣ末端および／またはＮ末端に直接にまたはペプチドリンカーを通じて連結された４－１ＢＢに対するｓｃＦｖ断片の重鎖を暗号化することができ、二重特異的抗体の軽鎖を暗号化するポリヌクレオチドは、Ｂ７－Ｈ４に対する全長ＩｇＧ抗体の軽鎖を暗号化することができる。
【0151】
また他の一具現例で、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の二重特異的抗体が４－１ＢＢに対する全長ＩｇＧ抗体およびＢ７－Ｈ４に対するｓｃＦｖ断片を含む場合、二重特異的抗体の重鎖を暗号化するポリヌクレオチドは、４－１ＢＢに対する全長ＩｇＧ抗体および全長ＩｇＧ抗体のＣ末端および／またはＮ末端に直接にまたはペプチドリンカーを通じて連結されたＢ７－Ｈ４に対するｓｃＦｖ断片の重鎖を暗号化することができ、二重特異的抗体の軽鎖を暗号化するポリヌクレオチドは、４－１ＢＢに対する全長ＩｇＧ抗体の軽鎖を暗号化することができる。
【0152】
また他の一具現例は、二重特異的抗体の重鎖を暗号化するポリヌクレオチド、二重特異的抗体の軽鎖を暗号化するポリヌクレオチド、またはこれらの両方を含む組み換えベクターを提供する。また他の一具現例は、組み換えベクターで形質感染された組み換え細胞を提供する。
【0153】
一具現例で、発現ベクターは、本発明の抗体または抗原結合断片を暗号化する分離されたポリヌクレオチドを含む。
【0154】
また他の一具現例は、細胞で二重特異的抗体の重鎖を暗号化するポリヌクレオチド、二重特異的抗体の軽鎖を暗号化するポリヌクレオチドを発現させることを含む二重特異的抗体の製造方法を提供する。
【0155】
ポリヌクレオチドを発現させるステップは、ポリヌクレオチドの発現を許容する条件下で、ポリヌクレオチドを含む細胞（例えば、組み換えベクター）を培養することによって行われてもよい。方法は、発現または培養ステップの後、細胞培養物から二重特異的抗体を分離および／または精製するステップをさらに含むことができる。
【発明の効果】
【0156】
本発明は、それぞれＢ７－Ｈ４特異的抗体および４－１ＢＢ特異的抗体を含む二重特異的抗体およびこれの用途に関するものである。抗－Ｂ７－Ｈ４／４－１ＢＢ二重特異的抗体は、Ｂ７－Ｈ４および／または４－１ＢＢに対して高い親和度を有することができ、肝毒性を減少させながら免疫反応を強化および／または哺乳動物の腫瘍（癌）を治療することができる。
【0157】
また、本発明の抗－Ｂ７－Ｈ４単一特異性抗体は癌細胞で発現されるＢ７－Ｈ４を高い親和度で特異的に結合して検出することによって、Ｂ７－Ｈ４のチェックポイント活性を抑制する機能を示す。
【図面の簡単な説明】
【0158】
【実施例】
【0159】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。ただ、下記の実施例は、本発明を例示するものであるだけで、本発明が下記の実施例によって限定されるものではない。
【0160】
製造例１．抗－Ｂ７－Ｈ４抗体生成
【0161】
１－１．免疫化によるマウス単一クローン抗体生成
【0162】
ヒトのＢ７－Ｈ４に対する単一クローン抗体は、以下の手続きを用いて生成された。ＳＪＬおよびＢａｌｂ／Ｃ マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）は、組み換えヒトのＢ７－Ｈ４を過発現する２９３個の細胞の一つで過免疫化した。
【0163】
具体的に、マウスにＰＢＳでヒトのＢ７－Ｈ４を過発現させた２９３個の細胞を注射（腹腔内を通じる５百万個／用量）して、次いで、組み換えヒトのＢ７－Ｈ４ＥＣＤとともにタンパク質ブストを注射（腹腔内を通じる４Ｄｇ／用量）した。血清力価は、６～９回の注射後、標準酵素免疫法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）およびＦＡＣＳによって評価した。血清Ｂ７－Ｈ４陽性マウスから採取した脾臓Ｂ細胞を電気融合（Ｈｙｂｒｉｍｕｎｅ；ハーバード生命科学、ホリストン、ＭＡ、米国）によってマウス骨髄腫細胞（Ｘ６３．Ａｇ８．６５３；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、モネソス、ＶＡ、米国）と融合した。１０～１４日後、ハイブリドーマ上清液をＥＬＩＳＡによって抗体分泌に対して
スクリーニングした。その後、全ての陽性クローンを拡張し、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってｈｕＢ７－Ｈ４に対する結合に対してさらにスクリーニングした。
スクリーニングした。その後、全ての陽性クローンを拡張し、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってｈｕＢ７－Ｈ４に対する結合に対してさらにスクリーニングした。
【0164】
確認された３個のハイブリドーマクローン：１６Ｅ３Ｈ３、２３Ｂ６Ｃ２および７３Ｂ４Ｆ１０（Ｂ７－Ｈ４免疫化したＳＪＬマウスから確認される）。図１に示したように、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣ）によって全てのクローンは、Ｂ７－Ｈ４発現細胞株（ＣＨＯＫ－１ Ｂ７－Ｈ４、ＳＫ－ＢＲ－３）および組み換えヒトのＢ７－Ｈ４に陽性に結合した。確認されたマウスクローンの可変領域およびＣＤＲは、以下の通りである。
【0165】
【表9】
【0166】
【表10】
【0167】
【表11】
【0168】
１－２．マウス単一クローン抗体のクローニングおよびキメラ化
【0169】
マウス単一クローン抗体１６Ｅ３Ｈ３、２３Ｂ６Ｃ２および７３Ｂ４Ｆ１０を、下記のようにクローニングおよびキメラ化した。
【0170】
標準方法を用いて、ミュリン１６Ｅ３Ｈ３、２３Ｂ６Ｃ２および７３Ｂ４Ｆ１０を生産するハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを抽出した。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）ドメインは、重鎖および軽鎖に対する縮退プライマーとともにＲＴ－ＰＣＲを用いて増幅した。正方向プライマーは、ＶＬおよびＶＨ領域のＮ－末端アミノ酸配列に対して特異的であり、それぞれ、ＬＣおよびＨＣ逆方向プライマーは、種の全般にわたって高度で保存した不変軽部（ＣＬ）および不変重部ドメイン１（ＣＨ１）の領域にアニーリングするように設計した。
【0171】
挿入物のポリヌクレオチド配列は、通常のシーケンシング方法を用いて決められた。マウス重鎖可変領域をヒトＩｇＧ１重鎖不変領域にクローニングし、軽鎖可変領域をヒトカッパ軽鎖不変領域にクローニングして各抗体をキメラ化した。
【0172】
１－３．マウス単クローン抗体のヒト化
【0173】
親抗体の構造は、コンピューターサポート相同性モデリングプログラムによってモデリングした。ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植＋逆突然変異を用いて設計した。簡略に、ヒト化軽鎖を得るために親抗体のＣＤＲをヒト受容体に移植した。３個（３）のキメラ化したクロー
ンのうち、優勢クローンとして１６Ｅ３Ｈ３を選択した。１６Ｅ３Ｈ３クローンのヒト化重鎖および軽鎖の配列を表１２および１３に示した。
ンのうち、優勢クローンとして１６Ｅ３Ｈ３を選択した。１６Ｅ３Ｈ３クローンのヒト化重鎖および軽鎖の配列を表１２および１３に示した。
【0174】
軽鎖は、翻訳後変形（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＰＴＭ）を除去するためにさらに修正された。軽鎖の修正された配列は、表１４（１６Ｅ３Ｈ３ Ｍ１クローン）に示した。抗体に含まれた抗体の不変領域は、ヒトＩｇＧ１に一つ以上の突然変異または変更（例えば、ＡＤＣＣ－減少突然変異（Ｎ２９７Ａ突然変異；癌細胞、ｖｏｌ．１９、ｉｓｓｕｅ １、ｐｐ．１０１－１１３、ｅｔｃ．））を導入することによって変形し続けることができる。
【0175】
【表12】
【0176】
【表13】
【0177】
【表14】
【0178】
製造例２．抗－４－１ＢＢ抗体の生成
【0179】
２－１．完全ヒトの抗－４－１ＢＢ単一クローン抗体の製造
【0180】
完全なヒトの抗－４－１ＢＢ単一クローン抗体は、ＷＯ２０２０／１１１９１３に開示されたように製造された。具体的に、標的分子に対するファージライブラリ（ＫＢｉｏ Ｈｅａｌｔｈで獲得）のパニングのために、４－１ＢＢ（ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００１５５２．２）コーティングされた免疫チューブを用いて総４回のパニングを行った。３回パニングの結果物からのバクテリアコロニーを、９６ディープウェルプレートのＳＢ－カルベニシリンで濁るまで成長させ、この時点で１０１１ｐｆｕのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを各ウェルに添加した。３７℃で１時間しなやかに振りながら感染させた後（８０ｒｐｍ）、７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加して細胞を２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩中培養した。翌日、プレートを遠心分離してファージを含む上清液をＰＢＳＴの中で３％のＢＳＡで遮断された４－１ＢＢ抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加した。室温で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄して抗Ｍ１３抗体を添加した。プレートを１時間培養して、ＰＢＳＴで３回洗浄して、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて結合活性を測定した。
【0181】
４－１ＢＢ特異的結合剤は、プラスミドＤＮＡシーケンシングのために増幅された。Ｉｇ軽鎖Ｖ遺伝子（ＶＬ）およびＶＨ配列は、固有の配列を確認して配列多様性を決定するために分析された。
【0182】
２－２．抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ抗体の製造
【0183】
（Ｎ’）－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－（Ｃ’）の構造を有する抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ抗体は、前記製造実施例２－１で得た４－１ＢＢに対する完全なヒト単一クローン抗体の可変領域を用いて製造し、ここで重鎖可変領域の４４番目のアミノ酸残基「Ｇ」が「Ｃ」に置き換えられ、軽鎖可変領域の１０３番目のアミノ酸残基「Ｇ」が「Ｃ」に置き換えられた。ｓｃＦｖで「Ｇ」から「Ｃ」へのこのようなアミノ酸置き換えは、ｓｃＦｖを一つの標的－特異的モイアティとして含む二重特異的抗体の安全性増加に寄与することができる。製造された抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖのアミノ酸配列を、下記の表１５ないし２１に示し、当業者であれば、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４または（ＧＳ）９のような多様なタイプのペプチドリンカーを適用することを含み、特定の目的を満たすためにアミノ酸配列の変化または変形を適用することができる。
【0184】
【表15】
【0185】
【表16】
【0186】
【表17】
【0187】
【表18】
【0188】
【表19】
【0189】
【表20】
【0190】
【表21】
【0191】
【表22】
【0192】
２－３．二重特異的抗体の形態に抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ抗体の製造
【0193】
二重特異的抗体の代表的な例として、下記のように重い構成および軽い構成で構成された抗－Ｂ７－Ｈ４ｘ４－１ＢＢ二重特異的抗体を準備した。
【0194】
（１）重い構成要素（Ｎ’→Ｃ’）
１）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖；
２）リンカー：（ＧＳ）９；および
３）抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ製造例２－２で用意した抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ
（２）軽い構成要素（Ｎ’→Ｃ’）
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖
１）抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の重鎖；
２）リンカー：（ＧＳ）９；および
３）抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ製造例２－２で用意した抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖ
（２）軽い構成要素（Ｎ’→Ｃ’）
抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の軽鎖
【0195】
製造例３．抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体の製造
ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合形態の抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体を製造するために、製造例１および製造例２で製造された抗－Ｂ７－Ｈ４ ＩｇＧおよび抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖクローンをそれぞれ例示的に選択し、ここで一の抗原のｓｃＦｖ抗体断片が他の抗原のＩｇＧのＣ－末端に融合される。Ｂ７－Ｈ４が全体ＩｇＧ部分に位置するとき、ＡＤＣＣが減少した突然変異体バックボーンを有するＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ突然変異）を用い、４－１ＢＢが全体ＩｇＧ部分に位置するとき、ＩｇＧ４を用いた。
ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合形態の抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体を製造するために、製造例１および製造例２で製造された抗－Ｂ７－Ｈ４ ＩｇＧおよび抗－４－１ＢＢ ｓｃＦｖクローンをそれぞれ例示的に選択し、ここで一の抗原のｓｃＦｖ抗体断片が他の抗原のＩｇＧのＣ－末端に融合される。Ｂ７－Ｈ４が全体ＩｇＧ部分に位置するとき、ＡＤＣＣが減少した突然変異体バックボーンを有するＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ突然変異）を用い、４－１ＢＢが全体ＩｇＧ部分に位置するとき、ＩｇＧ４を用いた。
【0196】
特に、抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体候補が、全長ＩｇＧ（抗－Ｂ７－Ｈ４抗体）－ｓｃＦｖ（抗－４－１ＢＢ抗体）形式に製造された。二重特異的抗体に含有された抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の不変領域は、ＮＡ突然変異（Ｎ２９７Ａ）を導入することによって変形された。本製造例によって製造された二重特異的抗体（１６Ｅ３Ｈ３ ｘ１Ａ１０ Ｍ１２および１６Ｅ３Ｈ３ Ｍ１ ｘ１Ａ１０ Ｍ１２）のアミノ酸配列をそれぞれ表２３および表２４に示した。
【0197】
以下、１６Ｅ３Ｈ３ Ｍ１単一特異性抗体をＭ４０４１３とも言い、１６Ｅ３Ｈ３ Ｍ１
ｘ１Ａ１０ Ｍ１２二重特異性抗体をＢ１０３１７とも言う。
ｘ１Ａ１０ Ｍ１２二重特異性抗体をＢ１０３１７とも言う。
【0198】
【表23】
【0199】
【表24】
【0200】
二重特異的抗体のクローニングは、以下のように行った。ｐｃＤＮＡ ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４６９７；プラスミド１）に抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体のＩｇＧ抗体の重鎖を暗号化するヌクレオシド配列を有するＤＮＡ分節１を挿入し、ｐｃＤＮＡ ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４６９７；プラスミド２）に抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体のＩｇＧ抗体の軽鎖を暗号化するヌクレオシド配列を有するＤＮＡ分節２を挿入した。以後、二重特異的抗体の発現のためのベクターを製造するために、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号：６８）で構成された１６個のアミノ酸長さを有するリンカーペプチドを暗号化するＤＮＡ分節４を用いるか、（ＧＳ）９（配列番号：６９）で構成された１８個のアミノ酸長さを有するリンカーペプチドを暗号化するＤＮＡ分節５を用いてプラスミド１に挿入されたＩｇＧのＦｃ領域のｃ－末端に該当するＤＮＡ分節１の一部にｓｃＦｖを暗号化するＤＮＡ分節３を融合した。また、ｓｃＦｖを安定化するために製造例２に記載されたように、軽鎖のＣ－末端および重鎖のＣ－末端にそれぞれＶＬ１０３－ＶＨ４４（ＶＬ１０３：１０３番目の位置にＧ→Ｃ突然変異を有するＶＬ；ＶＨ４４：４４番目の位置にＧ→Ｃ突然変異を有するＶＨ）を融合する二硫化架橋を生成するように追加変形を適用した。
【0201】
実験例１．抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の抗原結合能力
【0202】
１－１．ＦＡＣＳ分析を用いることによって、マウス抗－Ｂ７－Ｈ４抗体の結合確認
【0203】
抗原結合特性を評価するために、製造例１－１によって生成されたマウス抗体候補物質のＢ７－Ｈ４発現細胞（ＳＫ－ＢＲ３、ＣＡＭＡ－１およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８）またはＢ７－Ｈ４陰性発現細胞（ＰＡＮＣ－１）に対する結合を分析した。簡略に、各細胞を前記提示された抗体１００ｎＭで４℃で１時間処理した。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、細胞をＦＩＴＣ抗－マウスＩｇＧＦｃ抗体とともに４℃で１時間インキュベーションして、次いで、ＦＡＣＳ分析を行った。図１に示したように、抗－Ｂ７－４Ｈマウス抗体は、Ｂ７－Ｈ４を発現するＳＫ－ＢＲ３、ＣＡＭＡ－１およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株には結合したが、Ｂ７－Ｈ４陰性ＰＡＮＣ－１には結合しなかった。その結果、三つの（３）マウス抗体候補物質のうち、１６Ｅ３Ｈ３クローンがＢ７－Ｈ４発現癌細胞に最も高い親和度を示した。前記結果の順位に基づいて、１６Ｅ３Ｈ３がヒト化のために選択された。
【0204】
１－２．ヒトのＢ７－Ｈ４タンパク質に対する抗－Ｂ７－Ｈ４単一特異的抗体の抗原結合能力
【0205】
ヒト化抗体の抗原結合活性を評価するために、１６Ｅ３Ｈ３ Ｍ１に対してＥＬＩＳＡを行った。簡略に、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳの中で１ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｌ／ウェルのＦｃ融合されたヒトのＢ７－Ｈ４タンパク質で４℃で一晩中コーティングして、次いで、３７℃でＰＢＳの中で１％のＢＳＡ ２００ｕｌ／ウェルで遮断した。１００ｎＭから始める単一クローン抗体の４倍希薄液を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。前記プレートをＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で洗浄した後、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）と接合された抗－ヒトＦａｂとともに３７℃で１時間インキュベーションした。前記プレートをＴＭＢ基質で現像したＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％ ｉｎ ＰＢＳ）で洗浄し、ＯＤ ４５０ｎｍ～６５０ｎｍで分光光度計で分析した。図２に示したように、用量依存的方式で１６Ｅ３Ｈ３ Ｍ１は、Ｂ７－Ｈ４に結合した。ＥＣ５０値は、０．０７９ｎＭであった。
【0206】
実験例２．抗－Ｂ７－Ｈ４単一特異的抗体の細胞結合能力
【0207】
腫瘍抗原結合特性を評価するために、１６Ｅ３Ｈ３ Ｍ１クローンをＦＡＣＳによってＢ７－Ｈ４－発現哺乳動物細胞に対するこれの結合に対して分析した。簡略に、Ｂ７－Ｈ４陽性細胞（ＭＸ－１、ＣＡＭＡ－１、ＳＫ－ＢＲ３およびＯＶＣＡＲ－３）またはＢ７－Ｈ４陰性細胞（ＰＡＮＣ－１）をＭ４０４１３抗体とともにインキュベーションした。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中で、１％のＢＳＡ）で洗浄した後、ＦＩＴＣ－抗－ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに添加し、４℃で４５分間インキュベーションした。ＦＩＴＣのＭＦＩをＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで評価した。図３に示したように、用量－依存的方式で１６Ｅ３Ｈ３ Ｍ１クローンは、Ｂ７－Ｈ４陽性癌細胞株に結合した。
【0208】
実験例３．ＩＦＮ－γ生産で測定した抗－Ｂ７－Ｈ４単一特異性抗体のＴ細胞チェックポイントリガンド活性
【0209】
Ｔ－細胞活性化のＢ７－Ｈ４抑制は、プレート－固定された組み換えＢ７－Ｈ４タンパク質（ｒＢ７－Ｈ４）および健康な供与体のＰＢＭＣを用いて行われた。正常供与体ＰＢＭＣ細胞は、対照群タンパク質（ｈＩｇＧ１）または可溶性ｒＢ７－Ｈ４の存在の下で、Ｉ
ｇＧ、ＢＭＵＲ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ、ＢＭＳの抗－４－１ＢＢ抗体）、Ｍ４０４１３（１６Ｅ３Ｈ３ Ｍ１）または参照Ｂ７－Ｈ４抗体（ＦＰＡ１５０、ｆｉｖｅｐｒｉｍｅの参照抗体）とともに抗－ＣＤ３抗体で刺激された（図４）。
ｇＧ、ＢＭＵＲ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ、ＢＭＳの抗－４－１ＢＢ抗体）、Ｍ４０４１３（１６Ｅ３Ｈ３ Ｍ１）または参照Ｂ７－Ｈ４抗体（ＦＰＡ１５０、ｆｉｖｅｐｒｉｍｅの参照抗体）とともに抗－ＣＤ３抗体で刺激された（図４）。
【0210】
ｒＢ７－Ｈ４は、Ｔ細胞チェックポイントリガンド活性を明確に立証した。これは、ＳｒＢ７－Ｈ４－コーティングされたプレートでＴ細胞のＩＦＮ－γ分泌がＩｇＧ－コーティングされたプレートでのものと比較する時に減少したことを示す図４のグラフから分かる。一方、Ｍ４０４１３（グラフ内のスラッシュパターン）およびＦＰＡ１５０（グラフ内の縦パターン）は、ｒＢ７－Ｈ４のＴ細胞チェックポイントリガンド活性を遮断し、これはＩｇＧ（グラフ内の灰色）またはＢＭＵＲ（グラフ内の白色）処理条件と比較して、ＩＦＮ－γ分泌水準の増加により裏付けられる。
【0211】
すなわち、Ｂ７－Ｈ４媒介免疫抑制条件で、例えば、抗－４－１ＢＢ抗体のような他の免疫調節制は機能しない。対照的に、これらＢ７－Ｈ４媒介免疫抑制は、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体によって克服することができる。これとともに、Ｂ７－Ｈ４媒介Ｔ－細胞抑制は、Ｂ７－Ｈ４に特異的ではない抗体よりも、本発明のＢ７－Ｈ４抗体によってより効率的に救済された（Ｔ－細胞活性回復率：Ｍ４０４１３＞ＦＰＡ１５０＞ＢＭＵＲ）。
【0212】
実験例４．用量依存的方式で抗－Ｈ７－Ｈ４抗体のＴ細胞チェックポイントリガンド活性
【0213】
刺激されたヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）反応に対するＢ７－Ｈ４抗体のＴ細胞チェックポイント遮断活性を特徴化するために、Ｔ細胞から分泌された上清液でＩＦＮ－ガンマの濃度を測定した。Ｔ細胞活性化のＢ７－Ｈ４抑制は、プレート－固定された組み換えＢ７－Ｈ４タンパク質および健康な供与体のＰＭＢＣを用いて行われた。多様な濃度のヒトＩｇＧ、ＢＭＵＲ（ＢＭＳからの抗－４－１ＢＢ抗体）およびＢ７－Ｈ４抗体－Ｍ４０４１３またはＦＰＡ１５０－を抗－ヒトＣＤ３の存在の下でＰＢＭＣとともに恒温処理して試験した。５％Ｃｏ２、３７℃の加湿チャンバで７２時間培養した後、ヒトＩＦＮ－ガンマＱｕａｎｔｉｋｉｌｎｅ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステム、ＳＩＦ５０）で上層液内のＩＦＮ－ガンマ濃度を測定した。
【0214】
図５に示したように、Ｍ４０４１３（グラフ内の円）およびＦＰＡ１５０（グラフ内の逆三角形）はｒＢ７－Ｈ４のＴ細胞チェックポイントリガンド活性を遮断し、これはＩｇＧ（グラフ内の空の四角形）またはＢＭＵＲ（グラフ内の菱形）処理条件に比べて、ＩＦＮ－γ分泌水準の増加により裏付けられる。すなわち、Ｂ７－Ｈ４媒介免疫抑制条件で、例えば、抗－４－１ＢＢ抗体のような他の免疫調節制は機能しない。対照的に、これらＢ７－Ｈ４媒介免疫抑制は、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体によって克服することができる。これとともに、Ｂ７－Ｈ４媒介されたＴ－細胞抑制は、Ｂ７－Ｈ４に特異的ではない抗体よりも、本発明のＢ７－Ｈ４抗体によってより効率的に救済された。
【0215】
実験例５．Ｄａｋｏの抗体用量キットを用いた細胞表面Ｂ７－Ｈ４の相対的発現推定
【0216】
細胞表面Ｂ７－Ｈ４発現水準は、製造業社の勧奨事項によってＱＩＦＩＫＩＴ定量キット（Ｄａｋｏ）を用いて多様な癌細胞株で定量された。簡略に、細胞を飽和濃度で標識されていない抗－Ｂ７－Ｈ４マウス単一クローン抗体（ａｂｃａｍ）または精製されたマウスＩｇＧ１ｋイソ型対照群（ａｂｃａｍ）で染色した。洗浄した後、キットの染色された細胞と補正ビードをキットの同一のＦＩＴＣ－接合ヤギ抗－マウスＩｇＧ２次抗体で同時に標識した。洗浄した後、キットの染色された細胞と補正ビードをキットの同一のＦＩＴＣ－接合ヤギ抗－マウスＩｇＧ２次抗体で同時に標識した。標識された細胞および補正ビードをフローサイトメトリーで分析した。補正ビードのＭＦＩ値を用いて線形回帰を行った。ＡＢＣ（抗体－結合能力）は、この回帰線から外挿され、ｓＡＢＣ（特異的ＡＢＣ）は
、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体のＡＢＣからイソ型対照群抗体のＡＢＣを抜けて決められた。表２５に示したように、１１個の癌細胞株のｓＡＢＣを決めた。ＣＨＯＫ１、ＰＡＮＣ１およびＭＣ３８は、Ｂ７－Ｈ４陰性細胞株として見なされた。
、抗－Ｂ７－Ｈ４抗体のＡＢＣからイソ型対照群抗体のＡＢＣを抜けて決められた。表２５に示したように、１１個の癌細胞株のｓＡＢＣを決めた。ＣＨＯＫ１、ＰＡＮＣ１およびＭＣ３８は、Ｂ７－Ｈ４陰性細胞株として見なされた。
【0217】
【表25】
【0218】
実験例６．抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体のヒトのＢ７－Ｈ４および４－１ＢＢタンパク質に対する抗原結合能力
【0219】
抗原結合活性を評価するために、二重特異的抗体Ｂ１０３１７（１６Ｅ３Ｈ３ Ｍ１ ｘ１Ａ１０ Ｍ１２）を対象にしてＤＡＣＥした。簡略には、微細適正プレートをＰＢＳの中で１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルのヒトの４－１ＢＢ－Ｆｃタンパク質で４℃で一晩中コーティングして、次いで、３７℃でＰＢＳの中で１％のＢＳＡ ２００μｌ／ウェルで遮断した。１００ｎＭから始める二重特異的抗体の３倍希薄液を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。前記プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ヒトのＢ７－Ｈ４ｈｉｓタンパク質１μｇ／ｍｌを含むＰＢＳで１％のＢＳＡとともに３７℃で１時間インキュベーションした。前記プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中で、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、ＨＲＰ接合された抗－ｈｉｓ抗体とともに３７℃で１時間インキュベーションした。洗浄した後、前記プレートをＴＭＢ基質で現像して４５０ｎｍ～６５０ｎｍで分光光度計で分析した。図６に示したように、用量依存的方式でＢ１０３１７は、ヒトのＢ７－Ｈ４およびヒトの４－１ＢＢの両方に同時に結合した。ＥＣ５０（ｎＭ）値は、１．２ｎＭであった。
【0220】
実験例７．抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体のサルのＢ７－Ｈ４および４－１ＢＢタンパク質に対する抗原結合能力
【0221】
二重特異的抗体の交差反応性を評価するために、二重特異的抗体を対象にしてＤＡＣＥした。簡略には、微細適正プレートをＲｈｅｓｕｓ ４－１ＢＢ－Ｆｃタンパク質（１００ｎｇ／ウェル）で４℃で一晩中コーティングして、次いで、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＢ（ＰＢＳ中で、１％のＢＳＡ）で遮断した。１００ｎＭからのＢ１０３１７の３倍希薄液を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。前記プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中で、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、Ｒｈｅｓｕｓ Ｂ７－Ｈ４－ｈｉｓタンパク質（１００ｎｇ／ウェル）とともに３７℃で１時間インキュベーションした。前記プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中で、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、抗－ｈｉｓ抗体が接合されたＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）とともに３７℃で１時間インキュベーションした。洗浄した後、前記プレー
トをＴＭＢ基質で現像して４５０ｎｍ～６５０ｎｍで分光光度計で分析した。図７に示したように、用量依存的方式でＢ１０３１７は、Ｒｈｅｓｕｓ Ｂ７－Ｈ４および４－１ＢＢに同時に結合した。ＥＣ５０（ｎＭ）値は、２．５８ｎＭであった。
トをＴＭＢ基質で現像して４５０ｎｍ～６５０ｎｍで分光光度計で分析した。図７に示したように、用量依存的方式でＢ１０３１７は、Ｒｈｅｓｕｓ Ｂ７－Ｈ４および４－１ＢＢに同時に結合した。ＥＣ５０（ｎＭ）値は、２．５８ｎＭであった。
【0222】
実験例８．抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体の細胞結合能力
【0223】
腫瘍抗原結合特性を評価するために、ＦＡＣＳでＢ１０３１７二重特異的抗体のＢ７－Ｈ４－発現哺乳動物細胞に対する結合に対して分析した。簡略に、Ｂ７－Ｈ４陽性細胞（ＭＸ－１およびＣＡＭＡ－１）をＢ１０３１７抗体とともにインキュベーションした。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中で、１％のＢＳＡ）で洗浄した後、前記ＦＩＴＣ－抗－ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに添加し、４℃で４５分間インキュベーションした。ＦＩＴＣのＭＦＩは、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで評価された。図８に示したように、Ｂ１０３１７は、Ｂ７－Ｈ４陽性癌細胞株に用量依存的方式で結合した。
【0224】
実験例９．抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体の標的タンパク質Ｂ７－Ｈ４および４－１ＢＢに対する結合親和度（ＳＰＲ）
【0225】
ＳＰＲ実験で、製造例３で得られた抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体は、フローセル２、３および４でキャプチャーされ、フローセル１は参照として維持し、タンパク質Ａチップで抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体がアミンカップリングによって固定された。組み換えＢ７－Ｈ４（ヒト／サル）または４－１ＢＢ（ヒト／サル）タンパク質は、Ｂ７－Ｈ４の場合、１００ｎＭないし６．２５ｎＭまたは４－１ＢＢの場合、２５０ｎＭないし１５．６２５ｎＭ範囲の濃度でチップを横切って３０μｌ／分で６０秒間流れ、１８０秒の解除ステップが続いた。１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を用いて再生を行った。得られた結果を表２６に示した。表２６に示したように、Ｂ１０３１７は、Ｂ７－Ｈ４および４－１ＢＢに高い親和性を示し、それぞれのヒトおよびサル標的（Ｂ７－Ｈ４または４－１ＢＢ）に対する親和度は類似している。
【0226】
【表26】
【0227】
実験例１０．Ｂ７－ファミリタンパク質に対するタンパク質結合テスト
【0228】
抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体のＢ７－Ｈ４に対する特異的結合を確認するために、Ｂ１０３１７を対象にしてＥＬＩＳＡテストを行った。微細適正プレートを各タンパク質（１００ｎｇ／ウェル）で４℃で一晩中コーティングした後、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＢ（ＰＢＳ中で、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）で遮断した。１００ｎＭから始めるＢ１０３１７の３倍希薄液を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。前記プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中で、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、抗－ＦｃＨＲＰ（希薄倍率、１：３００００）または抗－Ｆａｂ ＨＲＰ（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、１：２００００）１００ｕｌとともに３７℃で１
時間インキュベーションした。前記プレートをＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で洗浄した後、前記プレートをＴＭＢ気質で発色させ、４５０～６５０ｎｍで分光光度計で分析した。図９に示したように、Ｂ１０３１７は、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合し、他のＢ７－ファミリタンパク質には結合しないことを確認した。
時間インキュベーションした。前記プレートをＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で洗浄した後、前記プレートをＴＭＢ気質で発色させ、４５０～６５０ｎｍで分光光度計で分析した。図９に示したように、Ｂ１０３１７は、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合し、他のＢ７－ファミリタンパク質には結合しないことを確認した。
【0229】
実験例１１．ＩＦＮ－γ生産で測定した抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体のＴ細胞チェックポイントリガンド活性
【0230】
Ｔ－細胞活性化のＢ７－Ｈ４抑制は、プレート－固定された組み換えＢ７－Ｈ４タンパク質（ｒＢ７－Ｈ４）および健康な供与体のＰＢＭＣを用いて行われた。正常供与体ＰＢＭＣ細胞は、対照群タンパク質（ｈＩｇＧ１）または可溶性ｒＢ７－Ｈ４の存在の下で、ＩｇＧ、Ｂ１０３１７二重特異的抗体、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ＭＳＤからの抗－ＰＤ－１抗体）、Ｍ４０４１３単一特異性抗体または参照Ｂ７－Ｈ４抗体とともに抗－ＣＤ３抗体で刺激された（図１０）。
【0231】
ｒＢ７－Ｈ４は、Ｔ－細胞チェックポイントリガンド活性を明白に示した。図１０に示したように、ｒＢ７－Ｈ４コーティングされたプレートでＴ細胞からＩＦＮ－γの分泌が、ＩｇＧ－コーティングされたプレートでのものと比較する時に減少した。一方、Ｂ１０３１７（グラフ内の灰色）、Ｍ４０４１３（グラフ内のスラッシュパターン）およびＦＰＡ１５０（グラフ内の縦パターン）は、ｒＢ７－Ｈ４のＴ細胞チェックポイントリガンド活性を遮断し、これはＩｇＧ（グラフ内の黒色）またはＫｅｙｔｒｕｄａ（グラフ内の白色）処理条件と比べて、ＩＦＮ－γ分泌水準の増加により裏付けられる。
【0232】
すなわち、Ｂ７－Ｈ４媒介免疫抑制条件で、例えば、抗－ＰＤ－１抗体のような他の免疫調節制は機能しない。対照的に、このようなＢ７－Ｈ４媒介免疫抑制は、本開示に係る抗－Ｂ７－Ｈ４抗体によって克服することができる。これとともに、Ｂ７－Ｈ４媒介Ｔ－細胞抑制は、対照群抗体よりも、本発明の単一特異的または二重特異的Ｂ７－Ｈ４抗体によってより効率的に救済された（Ｔ－細胞活性回復率：Ｂ１０３１７＞Ｍ４０４１３≒ＦＰＡ１５０）。
【0233】
実験例１２．多様なＰＢＭＣロット共同－培養システムで、抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体の用量依存的Ｔ細胞チェックポイントリガンド活性
【0234】
実験例４と同一の方法で、Ｂ１０３１７のＴ細胞チェックポイント遮断活性を確認するために、多様なＰＢＭＣロット共同－培養システムで、上清液中のＩＦＮ－ガンマ濃度を測定した。図１１に示したように、上清液内のＩＦＮ－ガンマの水準は、ＰＢＭＣロットによって異なるが、ＩＦＮ－ガンマ分泌水準は、用量依存的方式で増加した。
【0235】
実験例１３．抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ二重特異的抗体のＰＢＭＣ基盤標的細胞溶解試験
【0236】
ヒトＰＢＭＣを抗－ヒトＣＤ３抗体および試験抗体の存在の下で、ＳＫ－ＢＲ３細胞株（ヒトのＢ７－Ｈ４発現）と共同－培養した。簡略に、ＰＢＭＣ（ロット番号．ＨＨＵ２０１９０７１１）は、ウェル当たり３．０×１０４でプレーティングされ、ＳＫ－ＢＲ３はウェル当たり１．０×１０４で共同プレーティングされた（Ｅ：Ｔ割合＝１：３）。二重特異的抗体Ｂ１０３１７（４０ｎＭから始めて４倍希薄）、参照抗体ＦＰＡ１５０、Ｕｒｅｌｕｍａｂ（ＢＭＳからの抗－４－１ＢＢｍＡｂ）、または抗－Ｂ７－Ｈ４（Ｍ４０４１３）および抗－４－１ＢＢ（１Ａ１０Ｍ１２）単一特異的抗体（４０ｎＭから始めて４倍希薄）の組合処理群をそれぞれプレートウェルに添加した。培養６日後、標的細胞溶解％を細胞計数キット－８（ＣＣＫ－８、Ｄｏｊｉｎｄｏ＿ＣＫ０４－２０）で測定した。
図１２に示したように、抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ抗体（Ｂ１０３１７）は、Ｕｒｅｌｕｍａｂ（作用抗－４－１ＢＢ抗体）、ＦＰＡ１５０または組合処理群（抗－Ｂ７－Ｈ４および抗－４－１ＢＢ単一特異性抗体）よりも、より効率的に用量－依存的標的細胞溶解を誘導した。前記と同一の方法で、多様なＰＢＭＣロットを用いてＢ１０３１７の標的細胞溶解能力を試験し、その結果を図１３ａ（ＳＫ－ＢＲ３）および図１３ｂ（ＣＡＭＡ－１）に示した。図１３ａおよび１３ｂに示したように、Ｂ１０３１７は、多様なＰＢＭＣロットを用いるときにも、用量－依存的に標的細胞溶解を誘導した。
図１２に示したように、抗－Ｂ７－Ｈ４／抗－４－１ＢＢ抗体（Ｂ１０３１７）は、Ｕｒｅｌｕｍａｂ（作用抗－４－１ＢＢ抗体）、ＦＰＡ１５０または組合処理群（抗－Ｂ７－Ｈ４および抗－４－１ＢＢ単一特異性抗体）よりも、より効率的に用量－依存的標的細胞溶解を誘導した。前記と同一の方法で、多様なＰＢＭＣロットを用いてＢ１０３１７の標的細胞溶解能力を試験し、その結果を図１３ａ（ＳＫ－ＢＲ３）および図１３ｂ（ＣＡＭＡ－１）に示した。図１３ａおよび１３ｂに示したように、Ｂ１０３１７は、多様なＰＢＭＣロットを用いるときにも、用量－依存的に標的細胞溶解を誘導した。
【0237】
実験例１４．多様なＢ７－Ｈ４発現条件で二重特異的抗体の試験管内の４－１ＢＢ活性化試験
【0238】
Ｐｒｏｍｅｇａキットシステムを用いて、抗－Ｂ７－Ｈ４／４－１ＢＢ二重特異的抗体Ｂ１０３１７の試験管内の４－１ＢＢ活性を分析した。簡略に、それぞれ１００μＬ培養培地の白色９６－ウェル分析プレートに多様な細胞株（ＭＣ３８－ｈＢ７－Ｈ４：２．５×１０４、ＣＡＭＡ－１：２．５×１０４、ＳＫ－ＢＲ３：２．５×１０４、ＨＣＣ１８０６－ｈＢ７－Ｈ４：２．５×１０４、ＯＶＣＡＲ３：２．５×１０４、ＨＣＣ１９５４：２．５×１０４、ＣＨＯＫ１：２．５×１０４、Ｐａｎｃ－１：２．５×１０４ ａｎｄ
ＭＣ３８：２．５×１０４）をプレーティングした。
ＭＣ３８：２．５×１０４）をプレーティングした。
【0239】
細胞を５％ＣＯ２加湿された３７℃のインキュベーターで一晩中培養した。一晩中培養した後、１００μＬの培養培地を除去して２５μＬの分析培地（ＲＰＭＩ１６４０を含有する１％ＦＢＳ）を事前－プレート標的細胞に添加した。２５μＬのＢ１０３１７（５０ｎＭから始めて３倍希薄）またはＢＭＵＲ（１３３ｎＭから始めて６倍希薄）をプレートに添加した。ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅＴＭ ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株を収穫して分析培地で再懸濁した。２５μＬのＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅＴＭ ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株を各ウェルに添加し、ウェル当たり２．５×１０４細胞のプレートを作った。細胞を５％ＣＯ２加湿された３７℃のインキュベーターで６時間培養した。インキュベーションの間、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭ試薬は、製造業社の指針に従い還元された。６時間インキュベーションした後、ウェル当たり７５μＬのＢｉｏ－ＧｌｏＴＭ試薬を分析プレートに添加した。５分後、マイクロプレートリーダーを用いて発光性を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて４個の媒介変数ロジスティック曲線分析を行った。
【0240】
図１４に示したように、Ｂ１０３１７は、Ｂ７－Ｈ４の存在下でのみ４－１ＢＢ信号伝逹を用量依存的に活性化させ、Ｂ１０３１７のＴ細胞刺激活性は、Ｂ７－Ｈ４発現水準に関連があった。Ｂ１０３１７は、Ｂ７－Ｈ４発現がない場合、４－１ＢＢ信号伝逹を活性化しなかった。一方、ＢＭＵＲ処理群でＢ７－Ｈ４陽性細胞株と陰性細胞株の両方でＴ－細胞刺激活性が増加した。前記結果からＢ１０３１７は、ＢＭＵＲと異なり、Ｂ７－Ｈ４を発現する腫瘍環境で特にＴ－細胞活性を増加させることが分かる。
【0241】
実験例１５．ヒト化４－１ＢＢマウスを含むＢ－ＣＡＧ－ｈＢ７－Ｈ４ ＭＣ３８二重特異的抗体の有効量評価
【0242】
Ｂ１０３１７二重特異的抗体の生体内の効能を評価するために、Ｂ－ｈ４－１ＢＢ ＴＧマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）に腫瘍発達のために、０．１ｍＬのＰＢＳに懸濁されたＢ－ＣＡＧ－ｈＢ７－Ｈ４ ＭＣ３８腫瘍細胞（１×１０６）を右側全面に皮下注射した。腫瘍－保有した動物は、腫瘍大きさが１０３ｍｍ３に到逹した時に、無作為に５個の研究グループに登録された。各グループは８匹のマウスで構成された。５個のグループは、Ｇ１（ｈＩｇＧ１イソ型（ｉｓｏｔｙｐｅ）対照群、１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｇ２（ＢＭＵＲ、７．５ｍｇ／ｋｇ、Ｂ１０３１７の１０ｍｇ／ｋｇと同一のモル比）、Ｇ３（Ｂ１０３
１７、１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｇ４（Ｂ１０３１７、２ｍｇ／ｋｇ）およびＧ５（Ｂ１０３１７、０．４ｍｇ／ｋｇ）である。全ての試験物質は、総８回の間、３日に１回の頻度で、腫瘍－保有マウスに静脈に投与した。腫瘍体積と体重を週当たり２回測定して記録した。研究は最後の投与後の２２日目に終了した。グループ化後の２５日目に、Ｇ１（対照群）の平均腫瘍体積は１７５２±２６９ｍｍ３であった。Ｇ２グループの平均腫瘍体積は、１０３．３％のＴＧＩを有する４８±４０ｍｍ３であった。Ｇ３、Ｇ４およびＧ５グループで平均腫瘍体積はそれぞれ１０５．１％のＴＧＩを有する１８±１４ｍｍ３、９７．９％ＴＧＩを有する１３６±１１０ｍｍ３および７７．７％のＴＧＩを有する４７０±１９２ｍｍ３であった。平均体重および平均腫瘍体積は、表２７および２８に示した。ＢＭＵＲとＢ１０３１７の両方とも動物体重または明白な臨床徴候に否定的な影響を及ぼさなかった（表２７）。腫瘍成長抑制（ＴＧＩＴＶ）を計算して表２８に示した。ＢＭＵＲとＢ１０３１７の両方とも腫瘍体積に対する相当な抗腫瘍活性を示した。Ｂ１０３１７処理群では、低用量群でも優れた腫瘍成長抑制率を示し、ＢＭＵＲに対して優れた効能を示した。
１７、１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｇ４（Ｂ１０３１７、２ｍｇ／ｋｇ）およびＧ５（Ｂ１０３１７、０．４ｍｇ／ｋｇ）である。全ての試験物質は、総８回の間、３日に１回の頻度で、腫瘍－保有マウスに静脈に投与した。腫瘍体積と体重を週当たり２回測定して記録した。研究は最後の投与後の２２日目に終了した。グループ化後の２５日目に、Ｇ１（対照群）の平均腫瘍体積は１７５２±２６９ｍｍ３であった。Ｇ２グループの平均腫瘍体積は、１０３．３％のＴＧＩを有する４８±４０ｍｍ３であった。Ｇ３、Ｇ４およびＧ５グループで平均腫瘍体積はそれぞれ１０５．１％のＴＧＩを有する１８±１４ｍｍ３、９７．９％ＴＧＩを有する１３６±１１０ｍｍ３および７７．７％のＴＧＩを有する４７０±１９２ｍｍ３であった。平均体重および平均腫瘍体積は、表２７および２８に示した。ＢＭＵＲとＢ１０３１７の両方とも動物体重または明白な臨床徴候に否定的な影響を及ぼさなかった（表２７）。腫瘍成長抑制（ＴＧＩＴＶ）を計算して表２８に示した。ＢＭＵＲとＢ１０３１７の両方とも腫瘍体積に対する相当な抗腫瘍活性を示した。Ｂ１０３１７処理群では、低用量群でも優れた腫瘍成長抑制率を示し、ＢＭＵＲに対して優れた効能を示した。
【0243】
治療時の平均腫瘍成長プロファイルおよび体積を図１５に示し、個別の腫瘍体積を図１５に示した。図１５および１６に示したように、Ｂ１０３１７は、用量依存的方式でＭＣ３８－ｈＢ７－Ｈ４保有モデルで生体内腫瘍成長を有意に減少させた。ＢＭＵＲ処理群（Ｇ２）も生体内抗腫瘍活性を示したが、Ｂ１０３１７は２ｍｐｋ用量（Ｇ４）でもより強い生体内の効能（すなわち、約１００％腫瘍成長抑制）を示した。
【0244】
【表27】
【0245】
【表28】
【0246】
実験例１６．二重特異的抗体のＭＣ３８－ｈＢ７－Ｈ４の再－攻撃からの保護効果確認
【0247】
最終処理後の２２日目に、投与群で２１匹の完治したマウス（Ｇ２で７匹、Ｇ３で７匹、Ｇ４で５匹、Ｇ５で２匹）および５匹のナイーブ（ｎａｉｖｅ）マウスに再－攻撃実験のために腫瘍細胞を移植した。マウスは、腫瘍発達のために左側全面にＢ－ＣＡＧ－ｈＢ７－Ｈ４ ＭＣ３８結腸腫瘍細胞（１×１０６）を皮下注射した。
【0248】
図１７に示したように、ＢＭＵＲおよびＢ１０３１７の両方とも試験された用量で有意な抗腫瘍活性を示し、動物体重に否定的な影響を及ぼすか、明白な臨床徴候を誘導していない。
【0249】
Ｂ１０３０１７処理群（Ｇ３、Ｇ４およびＧ５）でＢ－ＣＡＧ－ｈＢ７－Ｈ４ ＭＣ３８再－接種による腫瘍成長がなく、これは、Ｂ－ＣＡＧ－ｈＢ７－Ｈ４ ＭＣ３８腫瘍に対する長期記憶保護を促進した。７個の腫瘍のうち２個は、ＢＭＵＲ治療完治群（Ｇ２）でゆっくり育ち、他の腫瘍は初期に現れたが、後期にほとんど消えた。
【0250】
全般的に、Ｂ１０３１７は、Ｂ－ＣＡＧ－ｈＢ７－Ｈ４ ＭＣ３８腫瘍に対してＢＭＵＲよりも、より強力な長期記憶保護を示した。
【0251】
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有した者は、本発明の技術的思想や必須な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解できるだろう。したがって、以上で記述した実施例は、あらゆる面で例示的なものであって限定的なものではないと理解すべきである。例えば、単一型で説明されている各構成要素は、分散して実施されてもよく、同様に分散したものと説明されている構成要素も結合された形態で実施されてもよい。
【0252】
本発明の範囲は、後述する請求の範囲によって示され、請求の範囲の意味および範囲、並びにその均等概念から導出される全ての変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13a】
【図13b】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】