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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-29
(54)【発明の名称】抗がん剤効能評価またはスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240822BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240822BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240822BHJP
C12N 5/0786 20100101ALN20240822BHJP
C12N 5/0784 20100101ALN20240822BHJP
C12N 5/09 20100101ALN20240822BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12M1/34 A
C12N5/0783
C12N5/0786
C12N5/0784
C12N5/09
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572883
(86)(22)【出願日】2022-09-16
(85)【翻訳文提出日】2023-11-24
(86)【国際出願番号】 KR2022013919
(87)【国際公開番号】W WO2023043278
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】10-2021-0124736
(32)【優先日】2021-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0092787
(32)【優先日】2022-07-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0095105
(32)【優先日】2022-07-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0096407
(32)【優先日】2022-08-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0099498
(32)【優先日】2022-08-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519427985
【氏名又は名称】オルガノイドサイエンシーズ・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＯＲＧＡＮＯＩＤＳＣＩＥＮＣＥＳ， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】（ＳＡＭＰＹＥＯＮＧ－ＤＯＮＧ， ＫＯＲＥＡ ＰＡＰＥＲＬＥＳＳ ＴＲＡＤＥ ＣＥＮＴＥＲ）， ６Ｆ， ３３８ ＰＡＮＧＹＯ－ＲＯ， ＢＵＮＤＡＮＧ－ＧＵ， ＳＥＯＮＧＮＡＭ－ＳＩ， ＧＹＥＯＮＧＧＩ－ＤＯ， １３４９３， ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】イ，ボ・ユン
(72)【発明者】
【氏名】キム，サラン
(72)【発明者】
【氏名】シン，ユリ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ユン・ジョン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ヒーラ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ドン・ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジヒョ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB11
4B029FA11
4B063QA05
4B063QQ08
4B063QR77
4B063QS24
4B065AA90X
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、抗癌剤または抗癌剤候補物質の効能を評価する方法であって、がんオルガノイドと免疫細胞の混合物を抗がん剤または抗がん剤候補物質で処理するステップを含む方法に関する。さらに、本発明は、抗がん剤の効能を評価するため、または抗がん剤をスクリーニングするための、がんオルガノイドと免疫細胞を含むシステムに関する。本発明による癌オルガノイドと免疫細胞の混合物は、特定の混合比率により、がん細胞が生体内に存在する腫瘍微小環境を模倣することができる。したがって、この混合物を利用すれば、生体内に投与した薬剤の効能を正確に予測することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記ステップを含む、抗がん剤候補物質の効能評価方法：（ａ）がんオルガノイドおよび免疫細胞を１：０．５～５の割合で混合して共培養するステップ；
（ｂ）前記（ａ）ステップの混合物に抗がん剤候補物質を処理するステップ；および
（ｃ）前記（ｂ）ステップの抗がん剤候補物質が処理された群で陽性対照群または抗がん剤候補物質未処理群に比べてがんオルガノイドの成長阻害または死滅が増加した場合、前記候補物質の効能に優れると決定するステップ。
【請求項2】
前記免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、ＴＩＬ、制御性Ｔ細胞および樹状細胞からなる群より選択される一つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージである場合、前記（ａ）ステップの共培養は、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージを１：０．５：０．５～３の細胞数割合で混合して遂行することである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記免疫細胞がＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージである場合、前記（ａ）ステップの共培養は、がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを１：１～３：０．５～５の細胞数割合で混合して遂行することである、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記免疫細胞がＴＩＬである場合、前記（ａ）ステップの共培養は、がんオルガノイドおよびＴＩＬを１：１～２の細胞数割合で混合して遂行することである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞である場合、前記（ａ）ステップの共培養は、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞を１：３：０．５～３の細胞数割合で混合して遂行することである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞である場合、前記（ａ）ステップの共培養は、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞を１：３：０．５～５の細胞数割合で混合して遂行することである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記抗がん剤は、化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス、融合タンパク質、抗体、アプタマー、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）、ＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびリボザイムからなる群より選択される一つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記がんは、胆道がん、胃がん、肺がん、肝臓がん、大腸がん、結腸がん、小腸がん、膵臓がん、脳腫瘍、骨がん、黒色腫、乳がん、硬化性腺腫、子宮がん、子宮頸がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、腎臓がん、肉腫、前立腺がん、尿道がん、膀胱がん、血液がん、リンパ腫および線維腺腫からなる群より選択される一つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記がんオルガノイドの成長阻害または死滅は、がんオルガノイドの面積増減を通じて確認することである、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
請求項１に記載の抗がん剤効能評価方法を使用した抗がん剤効能評価システムであって、がんオルガノイドおよび免疫細胞を含む抗がん剤効能評価システム。
【請求項12】
請求項１に記載の抗がん剤効能評価方法を使用した抗がん剤スクリーニングシステムであって、がんオルガノイドおよび免疫細胞を含む抗がん剤スクリーニングシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、がんオルガノイドおよび免疫細胞の混合物に抗がん剤または抗がん剤候補物質を処理するステップを含む抗がん剤または抗がん剤候補物質の効能評価方法に関する。また、がんオルガノイドおよび免疫細胞を含む抗がん剤効能評価システムまたは抗がん剤スクリーニングシステムに関する。
【背景技術】
【0002】
オルガノイドは、組織または器官に由来した細胞を３次元培養して製造した臓器類似体である。オルガノイドは、長期培養、凍結保存が可能であり、操作と観察が容易であるという長所を持つ。同時に不死化が必要なく、それによる細胞の本来特性が保持されることはもちろん、生体内でのみ見られた細胞階層的、組織学的構造を再現することで、細胞より一層高い次元の生理現象を研究することができる実験モデルである。このような特性によって、オルガノイドは、細胞の内在的特性が変化した不死化した細胞株、人体と構造が異なる動物モデルに比べて高い正確度で薬物評価をすることができ、特に、患者由来組織を利用するので、人を対象にした臨床に先立って、薬物の安全性はもちろん、効能まで予め確認することができる長所がある。ただし、既存の薬物評価モデルとして開発されたがんオルガノイドは、腫瘍微小環境を反映することができない限界点を有していたところ、多様な腫瘍微小環境を揃えたオルガノイドを開発し、これを薬物評価モデルとして使用するための努力が遂行される必要がある。
【0003】
腫瘍微小環境は、がん細胞周囲に血管、免疫細胞、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、リンパ球、シグナル伝達分子、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）などが取り囲まれている細胞環境である。腫瘍微小環境でがん細胞は、細胞外シグナル放出、がん細胞新生血管促進、末梢免疫寛容などを誘導して、微小環境に影響を与える。したがって、がん細胞は、微小環境を変化させたり、微小環境ががん細胞の成長または転移に影響を及ぼしたりするが、特に、リンパ球などと関連する腫瘍微小環境は、がんの発生および転移だけでなく、がんの免疫システム回避とも関連が高いため、抗がん剤による治療反応に影響を及ぼし、抗がん免疫療法の主要標的になる。
【0004】
例えば、腫瘍微小環境に存在する細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ、ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌ）、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ、Ｔｒｅｇ）、骨髄由来抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌ、ＭＤＳＣ）、樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＴＡＭ）、腫瘍－浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＴＩＬ）、がん－関連線維芽細胞（ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＣＡＦ）などの細胞が免疫抗がん剤の効能に影響を及ぼすと知られており、これらは、がん組織内へのＴ細胞浸透を制限するだけでなく、腫瘍浸潤リンパ球の増殖と生存を減少させることで免疫抗がん剤の治療効果を阻害する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らは、腫瘍微小環境を揃えたがんオルガノイドを開発し、これを薬物評価のプラットホームとして使用するための多様な研究を進めた。その結果、腫瘍微小環境を構成する多様な細胞のうち一つである免疫細胞とがんオルガノイドを特定割合で共培養するシステムを確立した。また、前記システムでは、がんオルガノイドが適切に成長することによって薬物の効能を正確に確認することができることを実験的に立証して、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明において開示されているそれぞれの説明および実施形態は、それぞれの他の説明および実施形態にも適用されることができる。すなわち、本発明において開示されている多様な要素のすべての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、後述された具体的な叙述によって本発明の範疇が制限されるものと認められない。
【0007】
また、本明細書において特に定義されない用語に対しては、本発明の属する技術分野において通常的に使用される意味を有するものと理解されなければならない。また、文脈上、特に定義しない場合であれば、単数は複数を含み、複数は単数を含む。
【0008】
本発明の一様態は、下記ステップを含む、抗がん剤候補物質の効能評価方法を提供する：
（ａ）がんオルガノイドおよび免疫細胞を１：０．５～５の割合で混合して共培養するステップ；
（ｂ）前記（ａ）ステップの混合物に抗がん剤候補物質を処理するステップ；および
（ｃ）前記（ｂ）ステップの抗がん剤候補物質が処理された群で陽性対照群または抗がん剤候補物質未処理群に比べてがんオルガノイドの成長阻害または死滅が増加した場合、前記候補物質の効能に優れると決定するステップ。
（ａ）がんオルガノイドおよび免疫細胞を１：０．５～５の割合で混合して共培養するステップ；
（ｂ）前記（ａ）ステップの混合物に抗がん剤候補物質を処理するステップ；および
（ｃ）前記（ｂ）ステップの抗がん剤候補物質が処理された群で陽性対照群または抗がん剤候補物質未処理群に比べてがんオルガノイドの成長阻害または死滅が増加した場合、前記候補物質の効能に優れると決定するステップ。
【0009】
抗がん剤、特に免疫抗がん剤の場合、患者が有している免疫細胞を利用してがんを死滅させるので、その効能を評価する評価プラットホームは、体内の免疫環境を模倣しなければならない。本発明においては、このような体内免疫環境をｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣するために、がんオルガノイドと多様な免疫細胞を共培養することができる評価プラットホームを構築した。患者の免疫環境を完璧に模倣するためには、すべての種類の免疫細胞を共培養しなければならないが、各患者別に免疫細胞の割合が異なるため、これをｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣することに限界があり、特に、薬物評価プラットホームに含まれる免疫細胞の割合が変わると、薬物の効能も変わるようになり、効能の予測が却って難しくなる短所があった。したがって、薬物に対する効能を正確に確認するための目的で、免疫細胞の種類を分類してそれぞれのプラットホームを構築した。また、薬物がターゲットする免疫細胞を考慮して、適切な効能評価プラットホームを選択することができるように多様な免疫細胞を利用してプラットホームを構築した。
【0010】
具体的に、前記ステップ（ａ）は、がんオルガノイドおよび免疫細胞を混合して共培養するステップであって、生体内腫瘍微小環境をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で再現するステップである。
【0011】
本発明において、前記免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、ＴＩＬ、制御性Ｔ細胞および樹状細胞からなる群より選択される一つ以上であってよい。
【0012】
本明細書において使用される用語「オルガノイド」は、３次元立体構造を有する細胞の塊を意味し、器官または組織から分離した細胞を３次元培養を通じて製造した臓器類似体を意味する。オルガノイドは、器官または組織を構成する特異的細胞集団を含んでおり、実際組織または器官と類似した形態で構造的組織化がなされているので、各組織または器官が有する特殊な形態および機能を再現することができる。
【0013】
本明細書において使用される用語「がんオルガノイド」は、腫瘍から分離した細胞から由来したオルガノイドを意味する。
【0014】
本明細書において使用される用語「細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）」は、抗原特異的後天性免疫（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ、ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を遂行するリンパ球を意味する。細胞傷害性Ｔ細胞は、がん細胞、ウイルス、バクテリアなど病原体に感染した細胞を死滅させ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γのようなサイトカインを生成する。本発明による細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍組織内に浸潤したものであるか、腫瘍組織から分離したものであってよい。本明細書において、前記細胞傷害性Ｔ細胞は、「分化されたＴ細胞」、「分化後Ｔ細胞」、「活性化されたＴ細胞」、「活性化Ｔ細胞」または「ＣＤ８＋Ｔ細胞」と相互交換的に命名されることができる。
【0015】
本明細書において使用される用語「Ｍ１マクロファージ（古典的活性化マクロファージ：ｃｌａｓｓｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、Ｍ１）」は、腫瘍－関連マクロファージ（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＴＡＭ）の一種であって、ＬＰＳ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＴＬＲ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔなどのサイトカインによって活性化されたマクロファージを意味する。Ｍ１は、ＩＬ－６、ＩＬ－１２およびＴＮＦ－αのような前炎症性サイトカインまたはケモカインを分泌し、抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＡＰＣ）として機能してＴ細胞を活性化するか、腫瘍－浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＴＩＬ）またはＮＫ細胞を活性化することで病原体死滅またはがん細胞死滅を誘導するか、食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を通じてがん細胞を直接死滅させることができる。本明細書において、前記Ｍ１マクロファージは、「Ｍ１」と相互交換的に命名されてよい。
【0016】
本明細書において使用される用語「Ｍ２マクロファージ（選択的活性化マクロファージ：ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、Ｍ２）」は、腫瘍－関連マクロファージ（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＴＡＭ）の一種であって、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０などのサイトカインによって活性化されたマクロファージを意味する。Ｍ２は、ＭＭＰまたはＣＯＸ－２のような酵素、またはＩＬ－１０、ＴＧＦ－βのような抗炎症性サイトカインを分泌し、これにより、炎症減少、傷治癒、組織回復と関連した免疫反応を遂行する。しかし、Ｍ２が分泌する酵素は、腫瘍周辺組織を破壊して腫瘍細胞の増殖と転移を促進させるか、血管新生の開始および保持に関与して腫瘍の成長を誘導することもある。本明細書において、前記Ｍ２マクロファージは、「Ｍ２」と相互交換的に命名することができる。
【0017】
本明細書において使用される用語「ＴＩＬ（Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）」は、「腫瘍－浸潤リンパ球」とも呼ばれる、腫瘍組織の近くに存在するか、腫瘍組織内へ浸潤したリンパ球を意味する。また、ＴＩＬは、多様な種類の免疫細胞で構成されているリンパ球の集団であってよい。本発明によるＴＩＬは、細胞表面にＣＤ８タンパク質を発現するＴＩＬであってよく、具体的に、細胞表面にＣＤ８タンパク質を発現し、腫瘍組織の近くに存在するか、腫瘍組織内へ浸潤したリンパ球の集団であってよく、好ましくＣＤ８＋Ｔ細胞であってよいが、これに制限されない。
【0018】
本明細書において使用される用語「制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ、Ｔｒｅｇ）」は、免疫反応を抑制して恒常性と免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を保持する役割をし、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン生成を抑制して自己免疫を予防するのに重要な役割を遂行するリンパ球を意味する。本発明による制御性Ｔ細胞は、腫瘍組織内に浸潤したものであるか、腫瘍組織から分離したものであってよい。本明細書において、前記制御性Ｔ細胞は、「Ｔｒｅｇ細胞」または「Ｔｒｅｇ」と相互交換的に命名することができる。
【0019】
本明細書において使用される用語「樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）」は、抗原提示細胞であって、抗原物質を処理して、これをＴ細胞に提示する役割を遂行するリンパ球を意味する。具体的に、樹状細胞は、腫瘍成長を抑制することができる免疫細胞であるヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）と細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）を活性化して、これらの機能を促進して、これにより腫瘍の進行を制御性する役割を遂行することができる。本発明による樹状細胞は、血液から分離したものであってよい。本明細書において、前記樹状細胞は、「ＤＣ細胞」または「ＤＣ」と相互交換的に命名することができる。
【0020】
本発明において、前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージである場合、（ａ）ステップの共培養は、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージを１：０．５：０．５～３の細胞数割合で混合して遂行することができる。前記がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージが前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物処理前であるにもかかわらず、がんオルガノイドが成長しないため、薬物の抗がん効果を確認することができず、またはＭ１マクロファージが自然的に死滅して腫瘍微小環境を再現し得ない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージを前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0021】
本発明において、前記免疫細胞がＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージである場合、（ａ）ステップの共培養は、がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを１：１～３：０．５～５の細胞数割合で混合して遂行することができる。前記がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージが前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。Ｍ１マクロファージは、腫瘍細胞死滅促進特性、Ｍ２マクロファージは、腫瘍細胞成長促進特性を示すことにより、前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物処理前であるにもかかわらず、がんオルガノイドが成長しないか、過度に成長する問題が発生し、また薬物の抗がん効果を正確に確認することができない問題が発生するので、がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0022】
本発明において、前記免疫細胞がＴＩＬである場合、（ａ）ステップの共培養は、がんオルガノイドおよびＴＩＬを１：１～２の細胞数割合で混合して遂行することができ、具体的に、１：１．５の細胞数割合で混合して遂行することができる。前記がんオルガノイドおよびＴＩＬが前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物処理前であるにもかかわらず、がんオルガノイドの成長が顕著に増加して薬物に反応しないか、がんオルガノイドが成長しないため、薬物の抗がん効果を確認することができない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイドおよびＴＩＬを前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0023】
本発明において、前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞である場合、（ａ）ステップの共培養は、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞を１：３：０．５～３の細胞数割合で混合して遂行することができ、具体的に、１：３：１～３の細胞数割合、より具体的に１：３：３の細胞数割合で混合して遂行することができる。前記がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞が前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物によるがんオルガノイドの死滅率が顕著に低くいため、薬物の抗がん効果を確認することができない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞を前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0024】
本発明において、前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞である場合、（ａ）ステップの共培養は、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞を１：３：０．５～５の細胞数割合で混合して遂行することができ、具体的に、１：３：０．５～１の細胞数割合で混合して遂行することができる。前記がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞が前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、がんオルガノイドが適切に成長しないか、薬物によるがんオルガノイドの死滅率が顕著に低くいため、薬物の抗がん効果を確認することができない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞を前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0025】
本発明による抗がん剤候補物質の効能評価方法は、がんオルガノイドおよび免疫細胞を前記割合で混合した混合物に抗がん剤候補物質を処理する。すなわち、がん細胞が生体内で存在している形態である腫瘍微小環境を類似に再現したシステムを通じて抗がん剤候補物質の効能を評価する。したがって、抗がん剤候補物質が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができる。
【0026】
本発明による抗がん剤候補物質の効能評価方法において、前記ステップ（ｂ）は、前記（ａ）ステップによってがんオルガノイドおよび免疫細胞が共培養された混合物に抗がん剤候補物質を処理するステップである。
【0027】
本明細書において使用される用語「抗がん剤」は、がんの予防または治療効果を示す物質であって、具体的に、がん細胞、がんオルガノイドまたは腫瘍などを死滅させるか、またはその成長を抑制することができる物質を意味する。
【0028】
本明細書において使用される用語「抗がん剤候補物質」は、がんの予防または治療効果を示すものと予想される物質を意味し、具体的に、がん細胞、がんオルガノイドまたは腫瘍などを死滅させるか、またはその成長を抑制するものと予想される物質を意味する。
【0029】
本明細書において、前記「抗がん剤」は、「薬物」と相互交換的に使用されてよく、また前記「処理」は、「添加」または「投与」と相互交換的に使用されてよい。
【0030】
具体的に、前記抗がん剤または抗がん剤候補物質は、がんオルガノイドおよび／または免疫細胞をターゲットするものであってよい。例えば、前記抗がん剤または抗がん剤候補物質は、がんオルガノイドのみをターゲットするものであるか、免疫細胞のみをターゲットするものであるか、がんオルガノイドおよび免疫細胞を同時にターゲットするものであってよい。例えば、免疫細胞をターゲットする抗がん剤は、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、抗－ＴＩＧＩＴ抗体または抗－ＣＤ４７抗体であってよい。前記「抗－ＣＤ４７抗体」は、がん細胞で発現するＣＤ４７とマクロファージが発現するＳＩＲＰαの結合を直接的に遮断することで、マクロファージによるがん細胞の食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を向上させることができる。
【0031】
本発明において、前記抗がん剤または抗がん剤候補物質は、化合物、タンパク質、融合タンパク質、化合物－タンパク質複合体、薬物－タンパク質複合体、抗体、化合物－抗体複合体、薬物－抗体複合体、アミノ酸、ペプチド、ウイルス、炭水化物、脂質、核酸、抽出物、分画物などを制限なく含む。
【0032】
例として、前記抗がん剤または抗がん剤候補物質は、化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス、融合タンパク質、抗体、アプタマー、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）などを含むことができるが、これに制限されるものではない。好ましく、前記抗がん剤または抗がん剤候補物質は、抗体であるか、または免疫抗がん剤であってよい。
【0033】
本明細書において使用される用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を含み、新規抗体の他に既に当該技術の分野において公知になっているか、または市販の抗体も含まれる。前記抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む全長の形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。前記抗体分子の機能的な断片は、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、ここには、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖなどが含まれ得るが、これに制限されるものではない。用語「ペプチドミメティクス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」は、ホルモン、サイトカイン、酵素基質、ウイルスまたは他の生物学的分子の活性リガンドを生物学的に模倣するペプチド、または改変されたペプチドを意味する。用語「アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）」は、それ自体で安定した三次構造を有しながら、標的分子に高い親和性と特異性で結合できる特徴を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは改変核酸）を意味する。
【0034】
また他の例として、前記抗がん剤は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムなどを含むことができるが、これに制限されるものではない。
【0035】
本明細書において使用される用語「アンチセンス核酸」は、特定ｍＲＮＡの配列に対して相補的な核酸配列を含有しているＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの断片または誘導体を意味し、ｍＲＮＡの配列に相補的に結合またはハイブリダイズしてｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する作用をする。用語「ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」は、特定ｍＲＮＡの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）を通してＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導することができる短い二重鎖ＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、これと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制できるので、遺伝子ノックダウン方法または遺伝子治療方法などに使用される。用語「ｓｈＲＮＡ（小ヘアピンＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）」は、一本鎖ＲＮＡであって、水素結合により二重鎖部分を形成するステム（ｓｔｅｍ）部分と、環状を帯びるループ（ｌｏｏｐ）部分とに区分されるＲＮＡを意味する。ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）などのタンパク質によりプロセッシングされてｓｉＲＮＡに変換され、ｓｉＲＮＡと同一の機能を遂行することができる。用語「ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）」は、標的ＲＮＡの分解を促進するか、またはこれらの翻訳を抑制させることで遺伝子発現を転写後に調節する２１～２３ｎｔのノンコーディングＲＮＡを意味する。用語「リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）」は、特定塩基配列を認識して自己的にそれを切断する酵素のような機能を有したＲＮＡ分子を意味する。リボザイムは、ターゲットメッセンジャーＲＮＡ鎖の相補的な塩基配列で特異性を有して結合する領域と、ターゲットＲＮＡを切断する領域とで構成される。
【0036】
本発明の方法によって効能が評価されるかスクリーニングされる抗がん剤または抗がん剤候補物質は、例えば、胆道がん、胃がん、肺がん、肝臓がん、大腸がん、結腸がん、小腸がん、膵臓がん、脳腫瘍、骨がん、黒色腫、乳がん、硬化性腺腫、子宮がん、子宮頸がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、腎臓がん、肉腫、前立腺がん、尿道がん、膀胱がん、血液がん、白血病、リンパ腫、線維腺腫などを予防または治療するものであってよいが、これに制限されるものではない。
【0037】
本発明による抗がん剤候補物質の効能評価方法において、前記ステップ（ｃ）は、前記（ｂ）ステップの抗がん剤候補物質が処理された群で陽性対照群または抗がん剤候補物質未処理群に比べてがんオルガノイドの成長阻害または死滅が増加した場合、前記候補物質の効能に優れると決定するステップである。
【0038】
本明細書において使用される用語「陽性対照群」は、当業界において抗がん剤として使用されている薬物を処理した群を意味する。
【0039】
具体的に、前記がんオルガノイドの成長阻害または死滅は、がんオルガノイドの面積増減を通じて確認するものであってよい。また、前記がんオルガノイドの面積が減少する場合、がんオルガノイドの成長阻害または死滅が増加されたものと判断するものであってよい。また、前記がんオルガノイドの面積増減は、当業界に公知になっている方法で確認することができ、例として、ＨＣＳ（ハイコンテントスクリーニング：Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、フローサイトメトリ（Ｆｌｏｗ－ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）などの分析方法を通じて確認することができるが、これに制限されるものではない。
【0040】
本発明の他の一様態は、前記抗がん剤候補物質の効能評価方法を使用するための抗がん剤効能評価システムであって、がんオルガノイドおよび免疫細胞を含む抗がん剤効能評価システムを提供する。
【0041】
本発明による抗がん剤効能評価システムにおいて、各用語は、特に言及しない限り、前述したとおりである。
【0042】
本発明の抗がん剤効能評価システムは、腫瘍微小環境を模倣したものであって、生体内腫瘍微小環境を構成する腫瘍としてがんオルガノイド、および免疫細胞として細胞傷害性Ｔ細胞、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、ＴＩＬ、制御性Ｔ細胞および樹状細胞からなる群より選択される一つ以上を含む。
【0043】
具体的に、前記抗がん剤効能評価システムは、前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージである場合、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージを１：０．５：０．５～３の細胞数割合で含むものであってよい。前記がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージが前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物処理前であるにもかかわらず、がんオルガノイドが成長しないため、薬物の抗がん効果を確認することができず、またはＭ１マクロファージが自然的に死滅して腫瘍微小環境を再現し得ない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージを前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0044】
また、前記抗がん剤効能評価システムは、前記免疫細胞がＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージである場合、がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを１：１～３：０．５～５の細胞数割合で含むものであってよい。前記がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージが前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。Ｍ１マクロファージは、腫瘍細胞死滅促進特性、Ｍ２マクロファージは、腫瘍細胞成長促進特性を示すことにより、前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物処理前であるにもかかわらず、がんオルガノイドが成長しないか、過度に成長する問題が発生し、また薬物の抗がん効果を正確に確認することができない問題が発生するので、がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0045】
また、前記抗がん剤効能評価システムは、前記免疫細胞がＴＩＬである場合、がんオルガノイドおよびＴＩＬを１：１～２の細胞数割合で含むものであってよく、具体的に、１：１．５の細胞数割合で含むものであってよい。前記がんオルガノイドおよびＴＩＬが前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物処理前であるにもかかわらず、がんオルガノイドの成長が顕著に増加して薬物に反応しないか、がんオルガノイドが成長しないため、薬物の抗がん効果を確認することができない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイドおよびＴＩＬを前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0046】
また、前記抗がん剤効能評価システムは、前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞である場合、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞を１：３：０．５～３の細胞数割合で含むものであってよく、具体的に、１：３：１～３の細胞数割合、より具体的に１：３：３の細胞数割合で含むものであってよい。前記がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞が前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物によるがんオルガノイドの死滅率が顕著に低くいため、薬物の抗がん効果を確認することができない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞を前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0047】
また、前記抗がん剤効能評価システムは、前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞である場合、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞を１：３：０．５～５の細胞数割合で含むものであってよく、具体的に、１：３：０．５～１の細胞数割合で混合して含むものであってよい。前記がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞が前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、がんオルガノイドが適切に成長しないか、薬物によるがんオルガノイドの死滅率が顕著に低くいため、薬物の抗がん効果を確認することができない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞を前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0048】
本発明による抗がん剤効能評価システムは、がんオルガノイドおよび免疫細胞を前記割合で混合した混合物を含むので、がん細胞が生体内で存在している形態である腫瘍微小環境を類似に再現することができる。したがって、抗がん剤が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができるので、抗がん剤効能評価に有用に活用されることができる。
【0049】
本発明のまた他の一様態は、前記抗がん剤候補物質の効能評価方法を使用するための抗がん剤スクリーニングシステムであって、がんオルガノイドおよび免疫細胞を含む抗がん剤スクリーニングシステムを提供する。
【0050】
本発明による抗がん剤スクリーニングシステムにおいて、各用語は、特に言及しない限り、前述したとおりである。
【0051】
具体的に、前記抗がん剤スクリーニングシステムは、前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージである場合、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージを１：０．５：０．５～３の細胞数割合で含むものであってよい。前記がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージが前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物処理前であるにもかかわらず、がんオルガノイドが成長しないため、薬物の抗がん効果を確認することができず、またはＭ１マクロファージが自然的に死滅して腫瘍微小環境を再現し出すことができない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージを前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0052】
また、前記抗がん剤スクリーニングシステムは、前記免疫細胞がＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージである場合、がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを１：１～３：０．５～５の細胞数割合で含むものであってよい。前記がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージが前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。Ｍ１マクロファージは、腫瘍細胞死滅促進特性、Ｍ２マクロファージは、腫瘍細胞成長促進特性を示すことにより、前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物処理前であるにもかかわらず、がんオルガノイドが成長しないか、過度に成長する問題が発生し、また薬物の抗がん効果を正確に確認することができない問題が発生するので、がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0053】
また、前記抗がん剤スクリーニングシステムは、前記免疫細胞がＴＩＬである場合、がんオルガノイドおよびＴＩＬを１：１～２の細胞数割合で含むものであってよく、具体的に、１：１．５の細胞数割合で含むものであってよい。前記がんオルガノイドおよびＴＩＬが前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物処理前であるにもかかわらず、がんオルガノイドの成長が顕著に増加して薬物に反応しないか、がんオルガノイドが成長しないため、薬物の抗がん効果を確認することができない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイドおよびＴＩＬを前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0054】
また、前記抗がん剤スクリーニングシステムは、前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞である場合、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞を１：３：０．５～３の細胞数割合で含むものであってよく、具体的に、１：３：１～３の細胞数割合、より具体的に１：３：３の細胞数割合で含むものであってよい。前記がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞が前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、薬物によるがんオルガノイドの死滅率が顕著に低くいため、薬物の抗がん効果を確認することができない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞を前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0055】
また、前記抗がん剤スクリーニングシステムは、前記免疫細胞が細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞である場合、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞を１：３：０．５～５の細胞数割合で含むものであってよく、具体的に、１：３：０．５～１の細胞数割合で混合して含むものであってよい。前記がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞が前記割合で混合されて共培養される場合にのみ生体内腫瘍微小環境を模倣することができる。前記割合以外の割合で共培養される場合には、がんオルガノイドが適切に成長しないか、薬物によるがんオルガノイドの死滅率が顕著に低くいため、薬物の抗がん効果を確認することができない問題が発生する。また、前記割合以外の割合で共培養される場合には、互いに異なるメカニズムで作用する薬物の効能が均一に示されない問題が発生するので、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞を前述のような細胞数割合で混合することが重要である。
【0056】
本発明の抗がん剤スクリーニングシステムは、腫瘍微小環境を模倣したものであって、生体内腫瘍微小環境を構成する腫瘍としてがんオルガノイド、および免疫細胞として細胞傷害性Ｔ細胞、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、ＴＩＬ、制御性Ｔ細胞および樹状細胞を含む。
【発明の効果】
【0057】
本発明によるがんオルガノイドおよび免疫細胞の混合物は、特定割合で混合して、がん細胞が生体内で存在している形態である腫瘍微小環境を類似に再現することができる。したがって、これを活用する場合、薬物が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1a】細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ、以下、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」）およびＭ１マクロファージ（ｃｌａｓｓｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、以下、「Ｍ１」）割合によるがんオルガノイドの死滅程度を示すグラフである。
【図1b】細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージ割合によるＭ１の死滅程度を示すグラフである。
【図2】ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１割合によるがんオルガノイドの成長阻害程度を示すグラフであって、０時間、２４時間、４８時間および７２時間にわたって共培養した結果に関する。
【図3】抗－ＣＤ４７抗体処理による食作用（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）活性化程度を示すグラフである。
【図4】ＣＤ８＋Ｔ細胞割合増加によるがんオルガノイド死滅に対する薬物の全般的な効能（ｏｖｅｒａｌｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ）を示すグラフである。
【図5】Ｍ１割合増加によるがんオルガノイド死滅に対する薬物の全般的な効能（ｏｖｅｒａｌｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ）を示すグラフである。
【図6】がんオルガノイド死滅に対する薬物の全般的な効能（ｏｖｅｒａｌｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ）を示すグラフである。
【図7a】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２マクロファージ（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、以下「Ｍ２」）の共培養割合によるがんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、Ｍ１が含まれない条件（「１：３：０」）またはＭ２が含まれない条件（「１：０：５」）で共培養した結果に関する。
【図7b】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合によるがんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、がんオルガノイドおよびＭ１が１：０．５の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。
【図7c】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合によるがんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、がんオルガノイドおよびＭ１が１：１の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。
【図7d】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合によるがんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、がんオルガノイドおよびＭ１が１：３の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。
【図8a】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合によるがんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、Ｍ１が含まれない条件（「１：３：０」）またはＭ２が含まれない条件（「１：０：５」）で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「ＣＤ４７」は、例示薬物として抗－ＣＤ４７抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図8b】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合によるがんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、Ｍ１が含まれない条件（「１：３：０」）またはＭ２が含まれない条件（「１：０：５」）で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「ＣＤ４７」は、例示薬物として抗－ＣＤ４７抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図9a】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合によるがんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、がんオルガノイドおよびＭ１が１：０．５の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「ＣＤ４７」は、例示薬物として抗－ＣＤ４７抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図9b】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合によるがんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、がんオルガノイドおよびＭ１が１：０．５の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「ＣＤ４７」は、例示薬物として抗－ＣＤ４７抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図10a】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合によるがんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、がんオルガノイドおよびＭ１が１：１の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「ＣＤ４７」は、例示薬物として抗－ＣＤ４７抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図10b】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合によるがんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、がんオルガノイドおよびＭ１が１：１の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「ＣＤ４７」は、例示薬物として抗－ＣＤ４７抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図11a】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合によるがんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、がんオルガノイドおよびＭ１が１：３の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「ＣＤ４７」は、例示薬物として抗－ＣＤ４７抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図11b】がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合によるがんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、がんオルガノイドおよびＭ１が１：３の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「ＣＤ４７」は、例示薬物として抗－ＣＤ４７抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図12】腫瘍－浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下、「ＴＩＬ」）単独培養；またはＴＩＬおよびがんオルガノイドの共培養を通じて製造されたＴＩＬに対してＦＡＣＳ分析を遂行した結果に関するものであって、全体ＴＩＬに対して細胞表面にＣＤ８タンパク質を発現するＴＩＬの割合を示す。
【図13a】肺がんオルガノイドとＴＩＬの共培養割合による肺がんオルガノイドの成長率を示すグラフである。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、薬物処理群を意味し、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した。成長率は、薬物処理直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ測定した。
【図13b】肺がんオルガノイドとＴＩＬの共培養割合による肺がんオルガノイドの死滅率を示すグラフである。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、薬物処理群を意味し、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した。薬物処理直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ成長率を測定した結果に基づいて死滅率を分析した。
【図14a】大腸がんオルガノイドとＴＩＬの共培養割合による大腸がんオルガノイドの成長率を示すグラフである。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、薬物処理群を意味し、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した。成長率は、薬物処理直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ測定した。
【図14b】大腸がんオルガノイドとＴＩＬの共培養割合による大腸がんオルガノイドの死滅率を示すグラフである。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、薬物処理群を意味し、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した。薬物処理直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ成長率を測定した結果に基づいて死滅率を分析した。
【図15】大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ、以下、「Ｔｒｅｇ」）の各共培養割合による大腸がんオルガノイドの成長率を示すグラフである。代表的な例として、図面に記載された「１：３：０」は、大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇが１：３：０の細胞数割合で混合されたことを意味する。前記成長率は、共培養開始直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ分析した。
【図16】肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの各共培養割合による肺がんオルガノイドの成長率を示すグラフである。代表的な例として、図面に記載された「１：３：０」は、肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇが１：３：０の細胞数割合で混合されたことを意味する。前記成長率は、共培養開始直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ分析した。
【図17】大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの共培養割合による大腸がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、Ｔｒｅｇが含まれない条件（「１：３：０」）またはＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれない条件（「１：０：３」）で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味し、「ＴＩＧＩＴ」は、例示薬物として抗－ＴＩＧＩＴ抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図18】大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの共培養割合による大腸がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：１の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味し、「ＴＩＧＩＴ」は、例示薬物として抗－ＴＩＧＩＴ抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図19】大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの共培養割合による大腸がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：３の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味し、「ＴＩＧＩＴ」は、例示薬物として抗－ＴＩＧＩＴ抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図20】肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの共培養割合による肺がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、Ｔｒｅｇが含まれない条件（「１：３：０」）またはＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれない条件（「１：０：３」）で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味し、「ＴＩＧＩＴ」は、例示薬物として抗－ＴＩＧＩＴ抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図21】肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの共培養割合による肺がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：１の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味し、「ＴＩＧＩＴ」は、例示薬物として抗－ＴＩＧＩＴ抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図22】肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの共培養割合による肺がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：３の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味し、「ＴＩＧＩＴ」は、例示薬物として抗－ＴＩＧＩＴ抗体を処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図23】大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞および樹状細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ、以下、「ＤＣ」）の共培養割合による大腸がんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：０．５の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。代表的な例として、図面に記載された「１：０．５：０．５」は、大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣが１：０．５：０．５の細胞数割合で混合されたことを意味する。前記成長率は、共培養開始直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ分析した。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。
【図24】大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合による大腸がんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：１の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。代表的な例として、図面に記載された「１：１：０．５」は、大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣが１：１：０．５の細胞数割合で混合されたことを意味する。前記成長率は、共培養開始直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ分析した。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。
【図25】大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合による大腸がんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：３の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。代表的な例として、図面に記載された「１：３：０．５」は、大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣが１：３：０．５の細胞数割合で混合されたことを意味する。前記成長率は、共培養開始直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ分析した。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。
【図26】大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合による大腸がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：０．５の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図27】大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合による大腸がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：１の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図28】大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合による大腸がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：３の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図29】肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合による肺がんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：０．５の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。代表的な例として、図面に記載された「１：０．５：０．５」は、肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣが１：０．５：０．５の細胞数割合で混合されたことを意味する。前記成長率は、共培養開始直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ分析した。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。
【図30】肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合による肺がんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：１の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。代表的な例として、図面に記載された「１：１：０．５」は、肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣが１：１：０．５の細胞数割合で混合されたことを意味する。前記成長率は、共培養開始直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ分析した。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。
【図31】肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合による肺がんオルガノイドの成長率を示すグラフであって、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：３の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。代表的な例として、図面に記載された「１：３：０．５」は、肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣが１：３：０．５の細胞数割合で混合されたことを意味する。前記成長率は、共培養開始直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ分析した。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。
【図32】肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合による肺がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：０．５の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図33】肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合による肺がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：１の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【図34】肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合による肺がんオルガノイドの死滅率を示すグラフであって、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞が１：３の細胞数割合で固定されて混合された条件で共培養した結果に関する。「Ｎｏｎ」は、薬物未処理群を意味し、「Ａｔｅｚ」は、例示薬物としてアテゾリズマブを処理した薬物処理群を意味する。前記死滅率は、薬物処理７２時間後（７２ｈ）に成長率を測定した結果に基づいて分析した。
【発明を実施するための形態】
【0059】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明しようとする。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
【0060】
実施例１．がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージを含む抗がん剤効能評価およびスクリーニングシステム
がんが生体内存在している環境を類似に再現することで、薬物が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）スクリーニングシステムを確立しようとした。
がんが生体内存在している環境を類似に再現することで、薬物が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）スクリーニングシステムを確立しようとした。
【0061】
具体的に、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ、以下、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」）およびＭ１マクロファージ（ｃｌａｓｓｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、以下、「Ｍ１」）が共存する共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）システムを利用し、共培養時に下記の３つの条件を満たす各オルガノイドまたは細胞の割合を確認した：
（１）がんオルガノイドおよびＭ１死滅が低い条件（前記オルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１の共培養時、薬物未処理群でがんオルガノイドまたはＭ１の死滅が高く観察される場合には、薬物の効能を正確に分析することができない）
（２）食作用（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）が活性化される条件
（３）互いに異なるＭｏＡ（Ｍｏｄｅ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ）特性を示す薬物の効能を評価することができる条件。
（１）がんオルガノイドおよびＭ１死滅が低い条件（前記オルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１の共培養時、薬物未処理群でがんオルガノイドまたはＭ１の死滅が高く観察される場合には、薬物の効能を正確に分析することができない）
（２）食作用（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）が活性化される条件
（３）互いに異なるＭｏＡ（Ｍｏｄｅ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ）特性を示す薬物の効能を評価することができる条件。
【0062】
また、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１の割合で、オルガノイドまたは細胞の数が５．０×１０３個であることを１と設定し、割合によるオルガノイドまたは細胞の具体的な数は、以下のとおりである：
０．２＝１．０×１０３個のオルガノイドまたは細胞
０．５＝２．５×１０３個のオルガノイドまたは細胞
１＝５．０×１０３個のオルガノイドまたは細胞
３＝１５．０×１０３個のオルガノイドまたは細胞
５＝２５．０×１０３個のオルガノイドまたは細胞
１０＝５０．０×１０３個のオルガノイドまたは細胞
０．２＝１．０×１０３個のオルガノイドまたは細胞
０．５＝２．５×１０３個のオルガノイドまたは細胞
１＝５．０×１０３個のオルガノイドまたは細胞
３＝１５．０×１０３個のオルガノイドまたは細胞
５＝２５．０×１０３個のオルガノイドまたは細胞
１０＝５０．０×１０３個のオルガノイドまたは細胞
【0063】
前述のような条件をすべて満たすがんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１の割合は、以下の実施例１．１～１．３を通じて確認した。
【0064】
実施例１．１．がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭ１マクロファージが共存する条件確立
がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１で構成された細胞を共培養する場合で、１種類の細胞でも死滅されれば、薬物の効能を正確に評価し難い問題点が発生する。したがって、本実施例１．１においては、薬物を処理していない状態でがんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１を共培養したとき、前記細胞がすべて生存する条件を確立しようとした。
がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１で構成された細胞を共培養する場合で、１種類の細胞でも死滅されれば、薬物の効能を正確に評価し難い問題点が発生する。したがって、本実施例１．１においては、薬物を処理していない状態でがんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１を共培養したとき、前記細胞がすべて生存する条件を確立しようとした。
【0065】
具体的に、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１は、大腸がん患者由来のものを使用した。また、下記の表１に示したように、がんオルガノイドを１の割合で固定した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、０．１～１０の割合、およびＭ１は０．１～５の割合に設定して２時間にわたって共培養し、各割合によるがんオルガノイドまたは細胞の死滅程度を分析した。このとき、分析は、フローサイトメトリ（Ｆｌｏｗ－ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で遂行し、がんオルガノイドのマーカーはＣＦＳＥ（＋）、Ｍ１マクロファージのマーカーはＣＤ１１Ｂ（＋）を使用した。
【0066】
【表1】
【0067】
その結果、図１ａに示したように、グループ１１および１２のＣＤ８＋Ｔ細胞割合が高い条件（５以上）とグループ９のＭ１割合が高い条件（５以上）でがんオルガノイドの高い死滅が観察された。また、図１ｂに示したように、グループ１１および１２のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が高い条件（５以上）でも、Ｍ１マクロファージの高い死滅が発生することを確認した。
【0068】
これを総合すれば、薬物を処理していない状態では、グループ３、４、５、６、７、８および１０の条件ががんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１が均衡を成して生存することができることを確認した。
【0069】
したがって、がんオルガノイドの割合が１であるとき、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を３以内およびＭ１の割合を３以内に設定することが抗がん剤のスクリーニングシステムに最適化された割合であることが分かる。
【0070】
実施例１．２．共培養時間によるがんオルガノイド成長阻害および死滅程度確認
前記実施例１．１から確認したような、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１で構成されたスクリーニングシステムにおいては、がんオルガノイドの成長阻害および死滅が観察されない細胞の構成割合を確認した。よって、共培養時間を異に設定した後（２４時間、４８時間、７２時間）、がんオルガノイドの成長程度を分析した。
前記実施例１．１から確認したような、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１で構成されたスクリーニングシステムにおいては、がんオルガノイドの成長阻害および死滅が観察されない細胞の構成割合を確認した。よって、共培養時間を異に設定した後（２４時間、４８時間、７２時間）、がんオルガノイドの成長程度を分析した。
【0071】
具体的に、下記の表２に示したように、がんオルガノイドを１の割合で固定した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞は０．２～３の割合、およびＭ１は０．１～３の割合に設定して共培養し、各割合による食作用を分析した。このとき、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１の割合は、前記実施例１．１で適用した割合よりさらに狭い範囲でテストし、分析は、ＨＣＳ（ハイコンテントスクリーニング：Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）で遂行し、初期オルガノイドの面積を１００％に設定し、反応時間による面積の変化を割合で示した。
【0072】
【表2】
【0073】
その結果、図２に示したように、細胞割合によって成長程度に差はあるが、前記割合では７２時間以上共培養しても、がんオルガノイドの成長が阻害される影響は示されないことを確認した。前記結果を通じて、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１を１：０．２～３：０．１～３の割合に設定することが抗がん剤のスクリーニングシステムに最適化された割合であることが分かる。
【0074】
実施例１．３．食作用（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）が活性化される条件確立
前記実施例１．１から確認したような、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１で構成されたスクリーニングシステムがＭ１をターゲットにする薬物の効能を評価するのに使用できるのかを確認するために、前記システムに抗－ＣＤ４７抗体を処理した後、食作用によるがんオルガノイドの死滅程度を確認した。
前記実施例１．１から確認したような、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１で構成されたスクリーニングシステムがＭ１をターゲットにする薬物の効能を評価するのに使用できるのかを確認するために、前記システムに抗－ＣＤ４７抗体を処理した後、食作用によるがんオルガノイドの死滅程度を確認した。
【0075】
具体的に、がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞は大腸がん患者由来のものを使用し、Ｍ１はＣＨＡ１５細胞株を使用した。
【0076】
また、前記表２に示したように、がんオルガノイドを１の割合で固定した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞は０．２～３の割合、およびＭ１は０．１～３の割合に設定して共培養し、各割合による食作用を分析した。このとき、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１の割合は、前記実施例１．１で適用した割合よりさらに狭い範囲でテストし、分析はフローサイトメトリ（Ｆｌｏｗ－ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で遂行し、がんオルガノイドのマーカーはＥｐＣＡＭ（＋）、Ｍ１のマーカーはＣＤ１１Ｂ（＋）を使用した。食作用の場合、がんオルガノイドマーカーとＭ１マーカーが重複で示される（ｄｏｕｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）割合で確認した。
【0077】
その結果、図３に示したように、Ｍ１が存在しないグループ２を除いたすべての条件で食作用が観察され、特に、グループ３、４、６および７でＭ１に結合する抗－ＣＤ４７抗体を処理する場合には、未処理群に比べて食作用が活性化されることを確認した。
【0078】
前記結果を通じて、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１を１：０．２～０．５：０．１～３の割合に設定することが抗がん剤のスクリーニングシステムに最適化された割合であることが分かる。
【0079】
実施例１．４．互いに異なるＭｏＡ（Ｍｏｄｅ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ）特性を示す薬物の効能を評価することができる条件確立
前記実施例１．１から確認したような、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１で構成されたスクリーニングシステムが薬物の効能を評価するのに使用できるのかを確認するために、前記システムに既存の免疫抗がん剤として使用されていた抗－ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、抗－ＣＤ４７抗体、およびこれらの併用を処理した後、食作用によるがんオルガノイドの死滅程度を確認した。
前記実施例１．１から確認したような、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１で構成されたスクリーニングシステムが薬物の効能を評価するのに使用できるのかを確認するために、前記システムに既存の免疫抗がん剤として使用されていた抗－ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、抗－ＣＤ４７抗体、およびこれらの併用を処理した後、食作用によるがんオルガノイドの死滅程度を確認した。
【0080】
アテゾリズマブは、がん細胞のＰＤ－Ｌ１と結合してＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１機序を防いでＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させ、抗－ＣＤ４７抗体は、Ｍ１のＣＤ４７と結合してＳＩＲＰ－ａ／ＣＤ４７機序を防いでマクロファージを活性化させる。よって、本発明のスクリーニングシステムが互いに異なるメカニズムで作用する二種類の薬物の両方に対して効能を評価することができるのかを確認しようとした。
【0081】
具体的に、がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞は、大腸がん患者由来のものを使用し、Ｍ１はＣＨＡ１５細胞株を使用した。
【0082】
また、前記表２に示したように、がんオルガノイドを１の割合で固定した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞は０～３の割合、およびＭ１は０～３の割合に設定して共培養し、前記共培養物に抗－ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｓｅｌｌｅｃｋ、＃Ａ２００４）１０ｎＭおよび／または抗－ＣＤ４７抗体１０ｎＭを処理した後、各割合によるがんオルガノイドまたはＭ１の死滅程度を分析した。このとき、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１の割合は、前記実施例１．１で適用した割合よりさらに狭い範囲でテストし、分析は、薬物処理後７２時間にわたってオルガノイド面積の変化をＨＣＳ（ハイコンテントスクリーニング：Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）装備を利用して分析した。以後、全般的な効能（Ｏｖｅｒａｌｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ）を薬物処理７２時間後に非処理群のオルガノイド面積に対比して、薬物処理群の面積変化を算出することで薬物の効能性を評価した。
【0083】
その結果、図４に示したように、がんオルガノイドおよびＭ１の割合が１および１で固定され、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が変わるグループ１、３、６および８の結果においては、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が高くなるほど全般的な効能が増加し、特に、アテゾリズマブ処理群でがんオルガノイドの高い成長阻害および死滅効果が示されることを確認した。
【0084】
また、図５に示したように、がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が１および０．５で固定され、Ｍ１の割合が変わるグループ２、４、５、６および７の結果においては、Ｍ１の割合が高くなるほど全般的な効能が増加し、特に、抗－ＣＤ４７抗体処理群でがんオルガノイドの高い成長阻害および死滅効果が示されることを確認した。
【0085】
ただし、図６に示したように、アテゾリズマブ単独、抗－ＣＤ４７抗体単独およびこれらの併用に対するがんオルガノイドの死滅効果が類似していると同時に、高く示されるグループは、グループ５、６および７であることを確認した。
【0086】
したがって、前記実施例１．１～１．３の結果を総合すれば、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１を共培養したとき、がんオルガノイドの成長を阻害しないとともに、がんオルガノイドおよびＭ１の死滅を引き起こさずに、互いに異なる薬物が単独でまたは併用で処理されたとき、全般的な効能を類似に示し得るがんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭ１の割合は、グループ５の１：０．５：０．５、グループ６の１：０．５：１、およびグループ７の１：０．５：３であることを確認した。
【0087】
実施例２．がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを含む抗がん剤効能評価およびスクリーニングシステム
がんが生体内存在している環境を類似に再現することで、薬物が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効能評価およびスクリーニングシステムを確立しようとした。
がんが生体内存在している環境を類似に再現することで、薬物が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効能評価およびスクリーニングシステムを確立しようとした。
【0088】
具体的に、がんオルガノイド、Ｍ１マクロファージ（ｃｌａｓｓｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、以下、「Ｍ１」）およびＭ２マクロファージ（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、以下、「Ｍ２」）が共存する共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）システムを確立するために、共培養時に（１）がんオルガノイドが適切に成長し、（２）薬物の効能が高く観察される条件を満たすこれらの混合割合を導き出した。下記の表３に示したように、がんオルガノイドを１の割合で固定した後、Ｍ１を０．５～３の割合に設定し、Ｍ２を０．５～５の割合に設定した。このとき、各オルガノイドまたは細胞の数が５．０×１０３個であることを１に設定した。
【0089】
【表3】
【0090】
がんオルガノイドは、患者から得た肺がん組織を単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）に分離して、これをＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）とともに培養することで、３Ｄ構造を有するように製造した。形成されたがんオルガノイドは、病理分析を通じて腫瘍であることを確認し、Ｔｒｙｐ－ＬＥ使用を通じて単一細胞に分離した後に使用した。Ｍ１およびＭ２はｉＰＳＣから分化されたものを使用し、当業界に知られている一般的な方法を使用してＨ９細胞株からＭ１またはＭ２に分化させた。
【0091】
実施例２．１．がんオルガノイドが適切に成長する条件
がんオルガノイドが免疫細胞と共培養される場合にも適切に成長することができるようにする、がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の混合割合を導き出した。
がんオルガノイドが免疫細胞と共培養される場合にも適切に成長することができるようにする、がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の混合割合を導き出した。
【0092】
具体的に、前記表３による混合割合で共培養した後、共培養開始直後（Ｏｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にがんオルガノイドの面積をそれぞれ測定して、次のような数式で成長率を分析した。
【0093】
＊がんオルガノイド成長率（％）＝（共培養２４、４８または７２時間後のがんオルガノイド面積）／（共培養開始直後のがんオルガノイド面積）×１００
【0094】
その結果、図７ａ～７ｃから見られるように、すべての混合割合でがんオルガノイドの成長は阻害されず、Ｍ２の割合が高くなるほどがんオルガノイドの成長率が増加する傾向を示した。
【0095】
実施例２．２．薬物の効能が高く示される条件
抗がん剤の効能が高く示されるようにする、がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の混合割合を導き出した。
抗がん剤の効能が高く示されるようにする、がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の混合割合を導き出した。
【0096】
具体的に、前記表３の混合割合によるがんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養物に対して薬物を処理していないものを対照群（以下、「薬物未処理群」）に設定し、実験群（以下、「薬物処理群」）としては、Ｍ１をターゲットする抗－ＣＤ４７抗体を例示薬物として処理したものを設定した。これらを７２時間にわたって共培養した後、薬物処理７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ成長率を測定し、測定した成長率を通じて下記の方法で死滅率を分析した。
【0097】
がんオルガノイド死滅率（％）＝［１－（薬物処理群のがんオルガノイド成長率＊）／（薬物未処理群のがんオルガノイド成長率＊＊）］×１００
【0098】
＊薬物処理群のがんオルガノイド成長率（％）＝（薬物処理７２時間後のがんオルガノイド面積）／（共培養開始直後（０ｈ）のがんオルガノイド面積）×１００
【0099】
＊＊薬物未処理群のがんオルガノイド成長率（％）＝（薬物未処理７２時間後のがんオルガノイド面積）／（共培養開始直後（０ｈ）のがんオルガノイド面積）×１００
【0100】
その結果、図８ａおよび８ｂから見られるように、がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の中で、Ｍ２を除いて、がんオルガノイドおよびＭ１のみ１：３の混合割合で共培養される場合、抗－ＣＤ４７抗体によるがんオルガノイドの死滅率は約２５％で高く示された。一方、がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の中で、Ｍ１を除いてがんオルガノイドおよびＭ２のみ１：５の混合割合で共培養される場合、抗－ＣＤ４７抗体によるがんオルガノイドの死滅率は約５％程度で顕著に低い水準で示された。
【0101】
一方、図９ａおよび９ｂから見られるように、がんオルガノイドおよびＭ１が１：０．５の割合で共培養される場合、Ｍ２の割合増加によるがんオルガノイドの死滅率は、混合割合間に有意な差を示さず、抗－ＣＤ４７抗体を処理した薬物処理群のすべてでがんオルガノイドの死滅率は最大約１０％に過ぎないことから、薬物の効能が高く示されていないことを確認した。
【0102】
一方、図１０ａおよび１０ｂから見られるように、がんオルガノイドおよびＭ１が１：１の割合で共培養される場合、Ｍ２が０．５～５の割合で混合されたすべての場合で薬物によるがんオルガノイドの死滅率が増加して、最大約２３％の高い水準を示すことを確認した。
【0103】
併せて、図１１ａおよび１１ｂから見られるように、がんオルガノイドおよびＭ１が１：３の割合で共培養される場合、Ｍ２が０．５～５の割合で混合されたすべての場合で薬物によるがんオルガノイドの死滅率が増加して、最大約２５％の高い水準を示すことを確認した。
【0104】
前記結果は、がんオルガノイド、Ｍ１およびＭ２の共培養割合が１：１～３：０．５～５であることが抗がん剤効能評価またはスクリーニングシステムに最適化された割合であり、本システムは、薬物作用にマクロファージが関与する抗がん剤の効能評価またはスクリーニングに適合していることを示唆する。
【0105】
実施例３．がんオルガノイドおよびＴＩＬを含む抗がん剤効能評価およびスクリーニングシステム
がんが生体内に存在している環境を類似に再現することで、薬物が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効能評価およびスクリーニングシステムを確立しようとした。
がんが生体内に存在している環境を類似に再現することで、薬物が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効能評価およびスクリーニングシステムを確立しようとした。
【0106】
具体的に、がんオルガノイドおよび腫瘍－浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下、「ＴＩＬ」）が共存する共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）システムを利用した。
【0107】
実施例３．１．ＴＩＬの取得
ＴＩＬは、腫瘍組織に浸潤するか、これを取り囲む細胞であって、がん細胞を認識して死滅させる役割を遂行する。ＴＩＬには多様な種類の免疫細胞が含まれているが、その中でも腫瘍を攻撃できるＣＤ８＋Ｔ細胞が大部分を占める。また、ＴＩＬは、腫瘍組織から分離されるため、ここに含まれるＣＤ８＋Ｔ細胞は、既に活性化されており、がん細胞を認識および攻撃することができる状態であることが特徴である。
ＴＩＬは、腫瘍組織に浸潤するか、これを取り囲む細胞であって、がん細胞を認識して死滅させる役割を遂行する。ＴＩＬには多様な種類の免疫細胞が含まれているが、その中でも腫瘍を攻撃できるＣＤ８＋Ｔ細胞が大部分を占める。また、ＴＩＬは、腫瘍組織から分離されるため、ここに含まれるＣＤ８＋Ｔ細胞は、既に活性化されており、がん細胞を認識および攻撃することができる状態であることが特徴である。
【0108】
すなわち、本発明による抗がん剤効能評価およびスクリーニングシステムには、組織から分離したＴＩＬを使用することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化過程を省略した。また、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞がさらに長く保持される条件を導き出し、これを本システムに適用した。
【0109】
具体的に、腫瘍組織を細く切った後、分離し出される免疫細胞および組織を集めてＣＤ８＋Ｔ細胞培養液に培養することで、免疫細胞のみ成長するようにして、ＴＩＬを取得した。以後、ＴＩＬを単独培養するか、またはＴＩＬとがんオルガノイドを２０：１の細胞数割合（ＴＩＬ：がんオルガノイド＝１×１０５個：５．０×１０３個）で混合して共培養し、各過程を経たＴＩＬをＦＡＣＳを通じて分析した。このとき、マーカーとしてはＣＤ５６およびＣＤ８を使用し、ＣＤ５６はＴＩＬに存在する全免疫細胞を分析する用途、ＣＤ８は、ＴＩＬに存在する全免疫細胞のうちＣＤ８＋Ｔ細胞を分析する用途で使用した。このようなＦＡＣＳ分析結果においては、ＣＤ８＋割合が２０％以上である場合、該当免疫細胞を薬物の効能評価に使用が可能であると見なす。下記の表４は、全ＴＩＬに存在するＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に関する。
【0110】
【表4】
【0111】
その結果、図１２および前記表４から見られるように、培養開始１日目から７日目までは単独培養と共培養の結果に有意な差が示されてはいない。しかし、培養開始１４日目からは、相当な差を示したが、単独培養方法の場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が約２３．９％であって、７日目（約９０．３％）に比べて半分以上に急激に減少したのに対し、共培養方法の場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は全細胞割合の中で約９７．１％であって、７日目（約９１．４％）に比べてむしろ増加した。
【0112】
ただし、培養２１日目からは、共培養方法の場合にもＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が約３７．９％であって、１４日目（約９７．１％）に比べて半分以上に急激に減少した。
【0113】
前記結果は、がんオルガノイドとの共培養を通じて取得したＴＩＬは活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を長期間保持しているので、これを使用する場合、正確度が向上し、再現性が高い、さらに優れた品質の抗がん剤効能評価およびスクリーニングシステムを確立することができることを示唆する。
【0114】
実施例３．２．がんオルガノイドおよびＴＩＬの共培養割合
がんオルガノイドおよびＴＩＬの共培養システムを活用した薬物効能評価およびスクリーニングシステムを確立するために、がんオルガノイドおよびＴＩＬの最適混合割合を導き出した。
がんオルガノイドおよびＴＩＬの共培養システムを活用した薬物効能評価およびスクリーニングシステムを確立するために、がんオルガノイドおよびＴＩＬの最適混合割合を導き出した。
【0115】
具体的に、共培養時に、（１）がんオルガノイドが適切に成長し、（２）薬物の効能が高く観察される条件を満たすがんオルガノイドおよびＴＩＬの割合を確認した。がんオルガノイドは、肺がんまたは大腸がん患者の腫瘍組織から分離したがん細胞を利用して製造したものを使用し、ＴＩＬは、前記実施例１．１によってがんオルガノイドと１４日間に共培養して取得したものを使用した。
【0116】
下記の表５に示したように、がんオルガノイドを１の割合で固定した後、ＴＩＬを０．５～３の割合に設定し、オルガノイドまたはＴＩＬの数が５．０×１０３個であることを１に設定した。
【0117】
【表5】
【0118】
また、前記割合によるがんオルガノイドおよびＴＩＬの共培養物に対して薬物を処理していないものを対照群（以下、「薬物未処理群」）に設定し、実験群（以下、「薬物処理群」）としては、現在がん治療剤として市販されて使用されているアテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）を例示薬物として処理したものを設定した。これらを７２時間にわたって共培養した後、薬物処理直後（０ｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ成長率を測定し、測定した成長率を通じて、下記の方法で死滅率を分析した。がんオルガノイド死滅率（％）＝［１－（薬物処理群のがんオルガノイド成長率＊）／（薬物未処理群のがんオルガノイド成長率＊＊）］×１００
【0119】
＊薬物処理群のがんオルガノイド成長率（％）＝（薬物処理２４、４８または７２時間後のがんオルガノイド面積）／（０時間のがんオルガノイド面積）×１００
【0120】
＊＊薬物未処理群のがんオルガノイド成長率（％）＝（薬物未処理２４、４８または７２時間後のがんオルガノイド面積）／（０時間のがんオルガノイド面積）×１００
【0121】
その結果、図１３ａおよび１３ｂから見られるように、肺がんオルガノイドおよびＴＩＬが１：０．５の割合で共培養される場合、肺がんオルガノイドは薬物に対して反応せず、これにより、対照群と実験群で肺がんオルガノイドの成長率および死滅率が類似に示された。特に、薬物処理群で肺がんオルガノイドの死滅率は約５％に過ぎないことから、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0122】
また、肺がんオルガノイドおよびＴＩＬが１：３の割合で共培養される場合、薬物処理群でがんオルガノイドの死滅率は約５％に過ぎないことから、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0123】
一方、肺がんオルガノイドおよびＴＩＬが１：１．５の割合で共培養される場合、薬物処理群では肺がんオルガノイドの成長が阻害され、死滅が増加するなどのアテゾリズマブの抗がん効果が示された。特に、薬物処理群において、肺がんオルガノイドの死滅率は約２０％であって、他の混合割合に比べてアテゾリズマブは高い水準の肺がんオルガノイド死滅率を示すことを確認した。
【0124】
併せて、図１４ａおよび１４ｂから見られるように、大腸がんオルガノイドおよびＴＩＬが１：０．５の割合で共培養される場合、大腸がんオルガノイドは薬物に対して反応せず、これにより、対照群と実験群で大腸がんオルガノイドの成長率および死滅率が類似に示された。特に、薬物処理群で大腸がんオルガノイドの死滅率は約５％に過ぎないことから、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0125】
また、大腸がんオルガノイドおよびＴＩＬが１：３の割合で共培養される場合、薬物処理群でがんオルガノイドの死滅率は約５％に過ぎないことから、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0126】
一方、大腸がんオルガノイドおよびＴＩＬが１：１．５の割合で共培養される場合、薬物処理群においては、大腸がんオルガノイドの成長が阻害され、死滅が増加するなどのアテゾリズマブの抗がん効果が示された。特に、薬物処理群において大腸がんオルガノイドの死滅率は約１０％であって、他の混合割合に比べてアテゾリズマブは高い水準の大腸がんオルガノイド死滅率を示すことを確認した。
【0127】
前記結果は、がんオルガノイドおよびＴＩＬの共培養割合を１：１．５に設定することが抗がん剤効能評価またはスクリーニングシステムに最適化された割合であることを示唆する。
【0128】
実施例４．がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞を含む抗がん剤効能評価およびスクリーニングシステム
がんが生体内存在している環境を類似に再現することで、薬物が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効能評価およびスクリーニングシステムを確立しようとした。
がんが生体内存在している環境を類似に再現することで、薬物が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効能評価およびスクリーニングシステムを確立しようとした。
【0129】
具体的に、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ、以下、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」）および制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ、以下、「Ｔｒｅｇ」）が共存する共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）システムを確立するために、共培養時に（１）がんオルガノイドが適切に成長し、（２）薬物の効能が高く観察される条件を満たすこれらの混合割合を導き出した。下記の表６に示したように、がんオルガノイドを１の割合で固定した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇは０～３の割合に設定した。このとき、各オルガノイドまたは細胞の数が５．０×１０３個であることを１に設定した。
【0130】
【表6】
【0131】
がんオルガノイドは、大腸がんまたは肺がん患者の腫瘍組織から分離した幹細胞を利用して製造した。分離した幹細胞を３Ｄ構造で成長することができるように、ＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）と混ぜてｄｏｍｅを作製した後、培養を通じてオルガノイドを形成させて使用した。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇは、大腸がんまたは肺がん患者から得た血液から取得した。血液に存在する免疫細胞を分化し、分化された免疫細胞からＣＤ８＋およびＴｒｅｇ細胞をＭＡＣＳ（磁気活性化細胞選別：ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）方法を利用して分離した。
【0132】
実施例４．１．がんオルガノイドが適切に成長する条件
がんオルガノイドが免疫細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ）と共培養される場合にも適切に成長することができるようにする、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの混合割合を導き出した。
がんオルガノイドが免疫細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ）と共培養される場合にも適切に成長することができるようにする、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの混合割合を導き出した。
【0133】
具体的に、前記表６による混合割合で共培養した後、共培養開始直後（Ｏｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にがんオルガノイドの面積をそれぞれ測定して、次のような数式で成長率を分析した。
【0134】
＊がんオルガノイド成長率（％）＝（共培養２４、４８または７２時間後のがんオルガノイド面積）／（共培養開始直後のがんオルガノイド面積）×１００
【0135】
その結果、図１５および１６から見られるように、すべての混合割合で大腸がんまたは肺がんオルガノイドの成長は阻害されずに適切に成長し、各混合割合間に有意な差が示されてはいない。
【0136】
実施例４．２．薬物の効能が高く示される条件
ＣＤ８＋Ｔ細胞をターゲットする抗がん剤およびＴｒｅｇをターゲットする抗がん剤の効能が高く示されるようにする、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの混合割合を導き出した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞をターゲットする抗がん剤およびＴｒｅｇをターゲットする抗がん剤の効能が高く示されるようにする、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの混合割合を導き出した。
【0137】
具体的に、前記表６の混合割合によるがんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの共培養物に対して薬物を処理していないものを対照群（以下、「薬物未処理群」）に設定し、実験群（以下、「薬物処理群」）としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞をターゲットするアテゾリズマブ、またはＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇをターゲットする抗－ＴＩＧＩＴ抗体を例示薬物として処理したものを設定した。これらを７２時間にわたって共培養した後、薬物処理７２時間後（７２ｈ）にそれぞれ成長率を測定し、測定した成長率を通じて下記の方法で死滅率を分析した。
【0138】
がんオルガノイド死滅率（％）＝［１－（薬物処理群のがんオルガノイド成長率＊）／（薬物未処理群のがんオルガノイド成長率＊＊）］×１００
【0139】
＊薬物処理群のがんオルガノイド成長率（％）＝（薬物処理７２時間後のがんオルガノイド面積）／（共培養開始直後（０ｈ）のがんオルガノイド面積）×１００
【0140】
＊＊薬物未処理群のがんオルガノイド成長率（％）＝（薬物未処理７２時間後のがんオルガノイド面積）／（共培養開始直後（０ｈ）のがんオルガノイド面積）×１００
【0141】
その結果、図１７から見られるように、大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの中で、Ｔｒｅｇを除いて、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞のみ１：３の混合割合で共培養される場合、アテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率は約２６％で高く示されるが、抗－ＴＩＧＩＴ抗体によるがんオルガノイドの死滅率は約５％に過ぎないことから、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。また、大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの中で、ＣＤ８＋Ｔ細胞を除いて、大腸がんオルガノイドおよびＴｒｅｇのみ１：３の混合割合で共培養される場合、アテゾリズマブおよび抗－ＴＩＧＩＴ抗体によるがんオルガノイドの死滅率は約２％程度で顕著に低い水準で示されることにより、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0142】
また、図１８から見られるように、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：１の混合割合で共培養する場合、Ｔｒｅｇの混合割合が増加するほど抗－ＴＩＧＩＴ抗体によるがんオルガノイドの死滅率は増加するが、その最大水準は約６％に過ぎず、アテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率もまた最大約１０％水準に過ぎないことから、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0143】
一方、図１９から見られるように、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：３の混合割合で共培養する場合、Ｔｒｅｇの混合割合が増加するほど抗－ＴＩＧＩＴ抗体によるがんオルガノイドの死滅率は増加して、その最大水準は約１０％に到達し、アテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率もまた約２５％で高く示された。すなわち、前記混合割合では、他の混合割合に比べてアテゾリズマブおよび抗－ＴＩＧＩＴ抗体のようなすべての薬物の効能が高い水準で示され、その効能は最大２倍以上増加することを確認した。
【0144】
併せて、図２０から見られるように、肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの中で、Ｔｒｅｇを除いて、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞のみ１：３の混合割合で共培養される場合、アテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率は約２７％で高く示されるが、抗－ＴＩＧＩＴ抗体によるがんオルガノイドの死滅率は約６％に過ぎないことから、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。また、肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの中で、ＣＤ８＋Ｔ細胞を除いて肺がんオルガノイドおよびＴｒｅｇのみ１：３の混合割合で共培養される場合、アテゾリズマブおよび抗－ＴＩＧＩＴ抗体によるがんオルガノイドの死滅率は約１％程度で顕著に低い水準で示されることにより、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0145】
また、図２１から見られるように、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：１の混合割合で共培養する場合、Ｔｒｅｇの混合割合が増加するほど抗－ＴＩＧＩＴ抗体によるがんオルガノイドの死滅率は増加するが、その最大水準は約６％に過ぎず、アテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率も約１０％水準に過ぎないことから、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0146】
一方、図２２から見られるように、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：３の混合割合で共培養する場合、Ｔｒｅｇの混合割合が増加するほど抗－ＴＩＧＩＴ抗体によるがんオルガノイドの死滅率は増加して、その最大水準は約１０％に到達し、アテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率もまた約２５％で高く示された。すなわち、前記混合割合では、他の混合割合に比べてアテゾリズマブおよび抗－ＴＩＧＩＴ抗体のすべての薬物の効能が高い水準で示され、その効能は最大２倍以上増加することを確認した。
【0147】
前記結果は、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇの共培養割合を１：３：０．５～３に設定することが抗がん剤効能評価またはスクリーニングシステムに最適化された割合であることを示唆する。
【0148】
実施例５．がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞および樹状細胞を含む抗がん剤効能評価およびスクリーニングシステム
がんが生体内存在している環境を類似に再現することで、薬物が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効能評価およびスクリーニングシステムを確立しようとした。
がんが生体内存在している環境を類似に再現することで、薬物が生体内に投与されたときの効能を正確に予測することができるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効能評価およびスクリーニングシステムを確立しようとした。
【0149】
具体的に、がんオルガノイド、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ、以下、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」）および樹状細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ、以下、「ＤＣ」）が共存する共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）システムを確立するために、共培養時に（１）がんオルガノイドが適切に成長し、（２）薬物の効能が高く観察される条件を満たすこれらの混合割合を導き出した。下記の表７に示したように、がんオルガノイドを１の割合で固定した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を０～３の割合に設定し、ＤＣを０．５～５の割合に設定した。このとき、各オルガノイドまたは細胞の数が５．０×１０３個であることを１に設定した。
【0150】
【表7】
【0151】
がんオルガノイドは、患者から得た大腸がんまたは肺がん組織を単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）に分離して、これをＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）とともに培養することで３Ｄ構造を有するように製造した。形成されたがんオルガノイドは、病理分析を通じて腫瘍であることを確認し、Ｔｒｙｐ－ＬＥ使用を通じて単一細胞に分離した後に使用した。
【0152】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから分離して使用した。ドナーから得た血液に対してフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）を利用してＰＢＭＣを分離し、Ｔ細胞活性化過程を経てＭＡＣＳを通じてＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。
【0153】
ＤＣは、ｉＰＳＣから分化されたものを使用し、当業界に知られている一般的な方法を使用してＨ９細胞株からＤＣに分化させた。
【0154】
実施例５．１．がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合
具体的に、前記表７の混合割合によるがんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養物に対して薬物を処理していないものを対照群（以下、「薬物未処理群」）に設定し、実験群（以下、「薬物処理群」）としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞をターゲットするアテゾリズマブを例示薬物として処理したものを設定した。薬物は、共培養開始直後に処理し、共培養開始直後（Ｏｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれがんオルガノイドの成長率を測定し、測定した成長率を通じて、下記の方法で死滅率を分析した。
具体的に、前記表７の混合割合によるがんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養物に対して薬物を処理していないものを対照群（以下、「薬物未処理群」）に設定し、実験群（以下、「薬物処理群」）としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞をターゲットするアテゾリズマブを例示薬物として処理したものを設定した。薬物は、共培養開始直後に処理し、共培養開始直後（Ｏｈ）、２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）にそれぞれがんオルガノイドの成長率を測定し、測定した成長率を通じて、下記の方法で死滅率を分析した。
【0155】
がんオルガノイド死滅率（％）＝［１－（薬物処理群のがんオルガノイド成長率＊）／（薬物未処理群のがんオルガノイド成長率＊＊）］×１００
【0156】
＊薬物処理群のがんオルガノイド成長率（％）＝（薬物処理２４、４８または７２時間後のがんオルガノイド面積）／（薬物処理直後（０ｈ）のがんオルガノイド面積）×１００
【0157】
＊＊薬物未処理群のがんオルガノイド成長率（％）＝（薬物未処理２４、４８または７２時間後のがんオルガノイド面積）／（共培養開始直後（０ｈ）のがんオルガノイド面積）×１００
【0158】
【0159】
ただし、大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣを１：０．５：０．５～５の混合割合で共培養する場合には、薬物によるがんオルガノイドの成長阻害効果が有意に示されてはいないが（図２３）、大腸がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣを１：１～３：０．５～５の混合割合で共培養する場合には、薬物によるがんオルガノイドの成長阻害効果が示された（図２４および２５）。
【0160】
特に、図２６から見られるように、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：０．５の混合割合で共培養する場合、ＤＣの混合割合が増加するほどアテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率は増加するが、その最大水準は約５％に過ぎないため、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0161】
また、図２７から見られるように、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：１の混合割合で共培養する場合、アテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率の最大水準は約１０％に過ぎないことから、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0162】
一方、図２８から見られるように、大腸がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：３の混合割合で共培養する場合、ＤＣが如何なる割合で混合しても、アテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率は約２０％～２５％で高く示された。すなわち、前記混合割合では、他の混合割合に比べて薬物の効能が高い水準で示され、その効能は２．５倍～５倍以上増加することを確認した。
【0163】
【0164】
ただし、肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣを１：０．５：０．５～５、または１：１：０．５～１の混合割合で共培養する場合には、薬物によるがんオルガノイドの成長阻害効果が有意に示されてはいないが（図２９および３０）、肺がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣを１：１：５、または１：３：０．５～５の混合割合で共培養する場合には、薬物によるがんオルガノイドの成長阻害効果が示された（図３０および３１）。
【0165】
特に、図３２から見られるように、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：０．５の混合割合で共培養する場合、ＤＣの混合割合が増加するほどアテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率は増加するが、その最大水準は約５％に過ぎないことから、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0166】
また、図３３から見られるように、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：１の混合割合で共培養する場合、アテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率の最大水準は約１０％に過ぎないことから、薬物の効能を正確に判断することができないことを確認した。
【0167】
一方、図３４から見られるように、肺がんオルガノイドおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：３の混合割合で共培養する場合、ＤＣが如何なる割合で混合しても、アテゾリズマブによるがんオルガノイドの死滅率は約２８％～４０％で高く示された。すなわち、前記混合割合では、他の混合割合に比べて薬物の効能が高い水準で示され、その効能は５倍～８倍以上増加することを確認した。
【0168】
前記結果は、がんオルガノイド、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣの共培養割合を１：３：０．５～５に設定することが抗がん剤効能評価またはスクリーニングシステムに最適化された割合であることを示唆する。
【図1a】
【図1b】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
【図10a】
【図10b】
【図11a】
【図11b】
【図12】
【図13a】
【図13b】
【図14a】
【図14b】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【国際調査報告】