特表 2024-531234 同種異系細胞療法のための遺伝子改変された初代細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】同種異系細胞療法のための遺伝子改変された初代細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240822BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 35/39 20150101ALI20240822BHJP

   A61K 35/407 20150101ALI20240822BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240822BHJP

   A61K 35/55 20150101ALI20240822BHJP

   A61K 35/36 20150101ALI20240822BHJP

   A61K 35/44 20150101ALI20240822BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20240822BHJP

   A61K 35/22 20150101ALI20240822BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 38/13 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/675 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/706 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240822BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240822BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 38/47 20060101ALN20240822BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALN20240822BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALN20240822BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALN20240822BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

A61P43/00 105

A61P3/10

A61P35/00

A61P9/00

A61P27/02

A61P5/14

A61P17/00

A61P1/16

A61P13/12

A61P35/02

A61K35/39

A61K35/407

A61K35/17

A61K35/55

A61K35/36

A61K35/44

A61K35/30

A61K35/22

A61P43/00 121

A61K48/00

A61K45/00

A61K38/13

A61K38/17 100

A61K31/5377

A61K31/573

A61K31/675

A61K31/436

A61K31/706

A61K47/34

A61K39/395 U

C12N15/867 Z

C12N15/12

C12N15/09 110

A61K38/47

C12N5/0775

C12N5/0789

C12N5/0735

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024508656

(86)(22)【出願日】2022-08-11

(85)【翻訳文提出日】2024-04-11

(86)【国際出願番号】 US2022074878

(87)【国際公開番号】W WO2023019229

(87)【国際公開日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】63/232,161

(32)【優先日】2021-08-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/297,694

(32)【優先日】2022-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/344,502

(32)【優先日】2022-05-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/348,990

(32)【優先日】2022-06-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/353,531

(32)【優先日】2022-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522043688

【氏名又は名称】サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】フー シャオモン

(72)【発明者】

【氏名】シュレプファー ソニア

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA01

4B065CA44

4C076AA95

4C076BB12

4C076BB13

4C076BB15

4C076CC10

4C076CC11

4C076CC16

4C076CC17

4C076CC21

4C076CC26

4C076CC27

4C076CC30

4C076EE17

4C084AA02

4C084AA13

4C084AA19

4C084BA44

4C084DA11

4C084DA38

4C084DC22

4C084MA66

4C084MA67

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA331

4C084ZA361

4C084ZA751

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4C084ZA891

4C084ZB211

4C084ZB261

4C084ZB271

4C084ZC061

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4C084ZC751

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB17

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4C086AA01

4C086BC73

4C086CB22

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4C086GA02

4C086GA12

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZA33

4C086ZA36

4C086ZA75

4C086ZA81

4C086ZA89

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4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZC35

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4C087AA02

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4C087BB37

4C087BB41

4C087BB48

4C087BB51

4C087BB52

4C087BB56

4C087BB62

4C087BB63

4C087CA04

4C087MA66

4C087MA67

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA33

4C087ZA36

4C087ZA75

4C087ZA81

4C087ZA89

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC06

4C087ZC35

4C087ZC75

(57)【要約】

同種異系細胞療法に使用するための、遺伝子改変などの１つ以上の改変を含む、操作された初代細胞などの操作された細胞が提供される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、低免疫原性細胞である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞集団の改変を促進するための動きの使用であって、前記細胞集団は、前記動きに供する前に、前記集団の細胞における遺伝子発現を改変するために１つ以上の試薬と接触されている、前記使用。

【請求項2】

細胞集団の改変を強化する方法であって、
ｉ）前記集団の細胞における遺伝子発現を改変するために、細胞集団を１つ以上の試薬と接触させることと、
ｉｉ）前記１つ以上の試薬との接触後に前記細胞集団を動きに供することと
を含む、前記方法。

【請求項3】

細胞集団の改変方法であって、
ｉ）前記集団の細胞における遺伝子発現を改変するために、細胞集団を１つ以上の試薬と接触させることと、
ｉｉ）前記１つ以上の試薬との接触後に前記細胞集団を動きに供することと
を含む、前記方法。

【請求項4】

前記細胞集団は、初代細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項5】

前記細胞集団は、幹細胞に由来する細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項6】

前記幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞、生殖細胞系幹細胞、肺幹細胞、臍帯血幹細胞、及び複能性幹細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の使用または方法。

【請求項7】

前記幹細胞は、多能性幹細胞である、請求項５または請求項６に記載の使用または方法。

【請求項8】

前記幹細胞は、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、請求項５～７のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項9】

前記細胞集団は、膵島細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、内皮細胞、筋肉細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、肝細胞、グリア前駆細胞、ドーパミン作動性ニューロン、網膜色素上皮細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、及び血液細胞からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項10】

前記細胞集団は、３Ｄネットワーク内に自然に存在する、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項11】

前記細胞集団は、懸濁状態にある、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項12】

前記細胞集団は、低付着表面を有する容器内にある、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項13】

前記細胞集団は、前記細胞を覆うのに十分な最小体積の培地中で容器内で維持される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項14】

懸濁状態の前記細胞集団は、前記接触前に付着培養物または細胞クラスターから細胞を解離させることによって作製される、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項15】

前記細胞集団は、膵島細胞である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項16】

前記細胞集団は、β膵島細胞を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項17】

β膵島細胞を含む細胞集団は、初代膵島クラスターを、初代β膵島細胞を含む細胞の懸濁液へと解離させることによって作製される、請求項１６に記載の使用または方法。

【請求項18】

前記接触は、前記細胞を動きに供する前に２日よりも短い期間実施される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項19】

前記接触は、前記細胞を動きに供する前に３０秒～２４時間実施される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項20】

前記接触は、前記細胞を動きに供する前に１分～６０分、２分～３０分、５分～１５分実施される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項21】

前記細胞集団を動きに供することにより、細胞凝集体の形成が促進される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項22】

前記細胞集団を動きに供することにより、細胞クラスターが形成される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項23】

前記細胞を動きに供した後、静的条件下で前記細胞をインキュベートすることを更に含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項24】

前記接触後かつ前記細胞を動きに供する前に、静的条件下で前記細胞をインキュベートすることを更に含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項25】

前記１つ以上の試薬は少なくとも２つの異なる試薬を含み、任意選択で、前記少なくとも２つの異なる試薬のそれぞれは異なる遺伝子の発現を調節するためのものである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項26】

前記方法の工程は、繰り返される、請求項１～２５のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項27】

前記方法の第１の反復における前記１つ以上の試薬は、前記方法の前記繰り返される反復における前記１つ以上の試薬とは異なり、任意選択で、前記方法の第１の反復における前記１つ以上の試薬は、前記方法の前記繰り返される反復における前記１つ以上の試薬と異なる、請求項２６に記載の使用または方法。

【請求項28】

前記１つ以上の試薬との前記接触後に前記細胞を動きに供する前に、任意選択で前記接触前の前記細胞と比較して、遺伝子発現が改変された細胞を選択することを更に含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項29】

初代膵島細胞を改変するための方法であって、
ｉ）初代膵島クラスターを初代膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、
ｉｉ）遺伝子発現を改変するために、前記初代膵島細胞の懸濁液を１つ以上の試薬と接触させることと、
ｉｉｉ）前記接触後、前記改変された膵島細胞を、前記細胞を膵島に再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、前記インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される、前記インキュベートすることと
を含む、前記方法。

【請求項30】

前記初代膵島クラスターは、ヒト初代死体膵島クラスターである、請求項１７または請求項２９に記載の使用または方法。

【請求項31】

前記インキュベートすることは、静的条件下でインキュベートすることの少なくとも一部を更に含む、請求項２９または請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記インキュベートすることは、静的条件下での第１のインキュベートと、それに続く動きを伴うインキュベートすることとを含む、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記インキュベートすることは、動きを伴うインキュベートすることと、それに続く静的条件下での第２のインキュベートとを含む、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

工程ｉ）～ｉｉｉ）は、繰り返される、請求項２９～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記方法の前記第１の反復における前記１つ以上の試薬は、前記方法の前記繰り返される反復における前記１つ以上の試薬とは異なる、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記１つ以上の試薬は１つ以上の第１の試薬であり、かつ前記再クラスター化膵島細胞は第１の改変された初代膵島クラスターであり、かつ前記方法は更に、
ｉｖ）前記第１の改変された初代膵島クラスターを改変された初代膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、
ｖ）遺伝子発現を改変するために、前記懸濁液の前記改変された初代膵島細胞を１つ以上の更なる試薬と更に接触させることと、
ｖｉ）前記更なる接触後に、前記更に改変された初代膵島細胞を、第２の改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、前記インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される、前記インキュベートすることと
を含む、請求項２９～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

ｉｉｉ）における前記インキュベートすることの前に、任意選択で前記接触前の前記初代膵島細胞と比較して、改変された遺伝子発現を有する膵島細胞を選択することを含む、請求項２９～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

ｖ）の前に、ｉｖ）で前記解離させた膵島細胞から、遺伝子発現が改変された膵島細胞を、任意選択で前記接触前の初代膵島細胞と比べて改変された膵島細胞を選択することと、任意選択で、前記選択された膵島細胞に対して工程ｉｉｉ）及びｉｖ）を繰り返すこととを含む、請求項３６または請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

ｖｉ）のインキュベートすることの後に、改変された初代膵島細胞を含む懸濁液へと前記第２の改変された初代膵島クラスターを解離させることと、改変された遺伝子発現、任意選択で前記接触前または前記更なる接触前の初代膵島と比べて改変された遺伝子発現を有する膵島細胞を選択することとを含む、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記選択された改変膵島細胞を、改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、前記インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される、前記インキュベートすることを含む、請求項２８、３８及び３９のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項41】

初代膵島細胞の懸濁液は、低付着表面を有する容器中に存在する、請求項２９～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記容器は、前記細胞を覆うのに十分な最小体積の培地を有する、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記動きは、それぞれ両端を含んで、約２０ｒｐｍ～約１８０ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ～約１２５ｒｐｍ、または約６０ｒｐｍ～約１００ｒｐｍの速度である、請求項１～４２のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項44】

前記動きは、両端を含んで、約８５ｒｐｍ～約９５ｒｐｍの速度である、請求項１～４３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項45】

前記動きは、振盪である、請求項１～４４のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項46】

前記振盪は、軌道運動を含む、請求項４５に記載の使用または方法。

【請求項47】

前記動きは、波状の動きである、請求項１～４６のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項48】

前記波状の動きは、軌道運動と揺動運動を組み合わせたシェーカー装置によるものである、請求項４７に記載の使用または方法。

【請求項49】

前記動きは、双方向の直線運動を含む、請求項１～４８のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項50】

前記動きは、オービタルシェーカーによるものである、請求項１～４９のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項51】

前記動きは、傾斜角を伴うものであり、任意選択で、前記傾斜角は１°～８°である、請求項１～５０のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項52】

前記選択することは、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む、請求項２８及び３８～５１のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項53】

前記１つ以上の試薬は、前記細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるか、または前記細胞における１つ以上の異種タンパク質の発現を増加させる、請求項１～５２のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項54】

前記第１の１つ以上の試薬の少なくとも１つは、前記細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるためのものであり、かつ前記更なる１つ以上の試薬の少なくとも１つは、前記細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させるためのものである、請求項３６～５３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項55】

前記第１の１つ以上の試薬の少なくとも１つは、前記細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させるためのものであり、かつ前記更なる１つ以上の試薬の少なくとも１つは、前記細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるためのものである、請求項３６～５３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項56】

前記第１の１つ以上の試薬は、前記細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるためのものであり、かつ前記更なる１つ以上の試薬は、前記細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させるためのものである、請求項３６～５３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項57】

前記１つ以上の試薬は、内因性タンパク質をコードする標的遺伝子を遺伝子編集するためのゲノム改変タンパク質、及び／または外因性タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む薬剤を含む、請求項１～５６のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項58】

前記細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるための前記１つ以上の試薬は、ゲノム改変タンパク質を含む、請求項５３～５７のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項59】

前記ゲノム改変タンパク質は、配列特異的ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ（ＣＡＳＴ）、プライム編集、または部位特異的ターゲティングエレメントを介したプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）による遺伝子編集に関連している、請求項５７または請求項５８に記載の使用または方法。

【請求項60】

前記ゲノム改変タンパク質は、配列特異的ヌクレアーゼである、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項61】

前記配列特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）からなる群から選択される、請求項５９または請求項６０に記載の使用または方法。

【請求項62】

前記配列特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼである、請求項５９～６１のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項63】

前記ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせ）を含む、請求項６１または請求項６２に記載の使用または方法。

【請求項64】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項６３に記載の使用または方法。

【請求項65】

前記Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型またはＶ型Ｃａｓタンパク質である、請求項６３または請求項６４に記載の使用または方法。

【請求項66】

前記ゲノム改変タンパク質は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、または前述のいずれかのホモログからなる群から選択される、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項67】

前記Ｃａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２である、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項68】

前記１つ以上の試薬は、１つ以上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の発現を低減させるため、及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるためのものである、請求項１～６７のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項69】

前記１つ以上の第１の試薬は、１つ以上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の発現を低減させるため、及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるためのものである、請求項３６～６７のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項70】

前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質、またはＨＬＡ－Ｃタンパク質である、請求項６８及び請求項６９に記載の使用または方法。

【請求項71】

前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質、またはＨＬＡ－ＤＱタンパク質である、請求項６８または請求項６９に記載の使用または方法。

【請求項72】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるための前記１つ以上の試薬、または前記更なる１つ以上の試薬のうちの前記少なくとも１つは、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、及び／またはＮＦＹ－Ｃのうちの１つ以上の発現を低減させる、請求項６９～７１のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項73】

ａ．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させるための前記１つ以上の試薬、または前記更なる１つ以上の試薬のうちの前記少なくとも１つは、Ｂ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減させ、及び／または、
ｂ．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるための前記１つ以上の試薬、または前記更なる１つ以上の試薬のうちの前記少なくとも１つは、ＣＩＩＴＡの発現を低減させることによるものである、
請求項６９～７１のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項74】

前記細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させるための前記１つ以上の試薬は、外因性ポリヌクレオチドを含む薬剤を含む、請求項５３～７３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項75】

前記外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項７４に記載の使用または方法。

【請求項76】

前記プロモーターは、構成的プロモーターである、請求項７５に記載の使用または方法。

【請求項77】

前記プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項７５または請求項７６に記載の使用または方法。

【請求項78】

前記１つ以上の外因性タンパク質は、１つ以上の免疫寛容原性因子である、請求項７４～７７のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項79】

前記１つ以上の試薬は、１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるための薬剤を含む、請求項５３～７８のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項80】

前記１つ以上の更なる試薬は、前記細胞における１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるための薬剤を含む、請求項５４～７８のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項81】

前記薬剤は脂質粒子またはウイルスベクターであり、任意選択で、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである、請求項７４～８０のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項82】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１－阻害剤、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＳｅｒｐｉｎｂ９、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項７８～８１のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項83】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、
ａ）ＣＤ４７；ｂ）ＨＬＡ－Ｅ；ｃ）ＣＤ２４；ｄ）ＰＤ－Ｌ１；ｅ）ＣＤ４６；ｆ）ＣＤ５５；ｆ）ＣＤ５９；ｈ）ＣＲ１；ｉ）ＭＡＮＦ；ｊ）Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３；ｋ）ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７；ｌ）ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１及びこれらの任意の組み合わせ；ｍ）ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｎ）ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｏ）ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｐ）ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｑ）ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１；ｒ）ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰならびにこれらの任意の組み合わせ；ｓ）ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１及びＭＡＮＦならびにこれらの任意の組み合わせ；ｔ）ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ及びＭＡＮＦならびにこれらの任意の組み合わせ；ならびにｕ）ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８及びこれらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される、請求項７８～８２のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項84】

前記１つ以上の試薬は、
（ｉ）（ａ）ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩの発現を低減させ、（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低減させ、（ｃ）ＣＤ４７ならびに任意選択でＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現を増加させ、かつ（ｄ）ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１の発現を増加させる、
（ｉｉ）（ａ）ＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させ、（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低減させ、（ｃ）ＴＸＮＩＰの発現を低減させ、（ｄ）ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅの発現を増加させ、かつ（ｅ）任意選択で、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦの発現を増加させる、
（ｉｉｉ）（ａ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させ、かつ（ｂ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低減させる、
（ｉｖ）（ａ）ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩの発現を低減させ、かつ（ｂ）ＣＤ４７の発現を増加させる
ためのものであり、または、
（ｖ）上記の（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかは、１つ以上の追加の遺伝子の発現を増加または減少させるための、任意選択で、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＩＲＦ１、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、酸化ストレスもしくはＥＲストレスに関与するタンパク質、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＣＤ１４２、ＡＢＯ、ＣＤ３８、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＮＬＧＮ４Ｙ及び／またはＲＨＤの発現を低減させるためのものであることを更に含み、更に任意選択で、酸化ストレスまたはＥＲストレスに関与する前記タンパク質は、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）、イノシトール要求性酵素１α（ＩＲＥ１α）及びＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）を含む、
請求項１～８３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項85】

前記外因性ポリヌクレオチドは、前記細胞のゲノム内に組み込まれる、請求項７４～８４のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項86】

前記外因性ポリヌクレオチドは、マルチシストロン性ベクターである、請求項８５に記載の使用または方法。

【請求項87】

前記組込みは、前記細胞のゲノム内への非標的挿入により、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した前記細胞内への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によるものである、請求項８５または請求項８６に記載の使用または方法。

【請求項88】

前記組込みは、前記細胞の標的ゲノム遺伝子座への標的挿入によるものである、請求項８５または請求項８６に記載の使用または方法。

【請求項89】

前記膵島細胞は、β膵島細胞である、請求項９～８８のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項90】

前記方法によって作製される前記細胞の生存率は、約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％またはそれ以上を超える、請求項１～８９のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項91】

前記方法によって改変された前記集団の細胞の割合は、約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％またはそれ以上を超える、請求項１～８９のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項92】

（ｉ）１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させる、ならびに（ｉｉ）１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる、改変を含む、操作された初代細胞であって、（ｉ）の発現の増加及び（ｉｉ）の発現の低減は、前記改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較したものである、前記操作された初代細胞。

【請求項93】

（ｉｉ）における１つ以上の前記改変は、
ａ．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、
ｂ．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または、
ｃ．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子
の発現を低減させる、請求項９２に記載の操作された初代細胞。

【請求項94】

前記１つ以上の改変は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ及び／またはＮＦＹ－Ｃ、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の分子の発現を低減させる、請求項９２または請求項９３に記載の操作された初代細胞。

【請求項95】

前記操作された細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の分子を発現しない、請求項９２～９４のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項96】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１－阻害剤、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＳｅｒｐｉｎｂ９、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項９２～９５のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項97】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、
ａ）ＣＤ４７；ｂ）ＨＬＡ－Ｅ；ｃ）ＣＤ２４；ｄ）ＰＤ－Ｌ１；ｅ）ＣＤ４６；ｆ）ＣＤ５５；ｆ）ＣＤ５９；ｈ）ＣＲ１；ｉ）ＭＡＮＦ；ｊ）Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３；ｋ）ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７；ｌ）ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１及びこれらの任意の組み合わせ；ｍ）ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｎ）ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｏ）ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｐ）ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｑ）ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１；ｒ）ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰならびにこれらの任意の組み合わせ；ｓ）ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１及びＭＡＮＦならびにこれらの任意の組み合わせ；ｔ）ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ及びＭＡＮＦならびにこれらの任意の組み合わせ；ならびにｕ）ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８及びこれらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される、請求項９２～９６のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項98】

前記操作された細胞は、以下：
（ｉ）（ａ）ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩの発現を低減させ、（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低減させ、（ｃ）ＣＤ４７ならびに任意選択でＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現を増加させ、かつ（ｄ）ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１の発現を増加させる、
（ｉｉ）（ａ）ＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させ、（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低減させ、（ｃ）ＴＸＮＩＰの発現を低減させ、（ｄ）ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅの発現を増加させ、かつ（ｅ）任意選択で、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦの発現を増加させる、
（ｉｉｉ）（ａ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させ、かつ（ｂ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低減させる、
（ｉｖ）（ａ）ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩの発現を低減させ、かつ（ｂ）ＣＤ４７の発現を増加させる、
改変を含み、または、
（ｖ）上記の（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかは、１つ以上の追加の遺伝子の発現を増加または減少させるための、任意選択で、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＩＲＦ１、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、酸化ストレスもしくはＥＲストレスに関与するタンパク質、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＣＤ１４２、ＡＢＯ、ＣＤ３８、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＮＬＧＮ４Ｙ及び／またはＲＨＤの発現を低減させるための改変を更に含み、更に任意選択で、酸化ストレスまたはＥＲストレスに関与する前記タンパク質は、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）、イノシトール要求性酵素１α（ＩＲＥ１α）及びＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）を含む、
請求項９２～９７のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項99】

（ｉ）ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させる、ならびに（ｉｉ）１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる、改変を含む、操作された初代細胞であって、（ｉ）の発現の増加及び（ｉｉ）の発現の低減は、前記改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較したものである、前記操作された初代細胞。

【請求項100】

発現を増加させる前記改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる前記改変は、表面発現の低減を含み、任意選択で、検出可能な表面発現はない、請求項９２～９９のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項101】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させる前記改変は、前記１つ以上の免疫寛容原性因子をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項９２～１００のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項102】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７を含む、請求項９２～１０１のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項103】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子はＣＤ４７であり、かつＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつ前記操作された初代細胞の自然免疫による殺傷を低減させる、請求項１０１または請求項１０２に記載の操作された初代細胞。

【請求項104】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の配列をコードする、請求項１０３に記載の操作された初代細胞。

【請求項105】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１０１～１０４のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項106】

前記プロモーターは、構成的プロモーターである、請求項１０５に記載の操作された初代細胞。

【請求項107】

前記プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項１０５または請求項１０６に記載の操作された初代細胞。

【請求項108】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、前記操作された初代細胞のゲノム内に組み込まれる、請求項１０１～１０７のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項109】

前記外因性ポリヌクレオチドは、前記１つ以上の免疫寛容原性因子をコードするマルチシストロン性ベクター、及び第２の導入遺伝子をコードする追加の導入遺伝子である、請求項１０８に記載の操作された初代細胞。

【請求項110】

前記組込みは、前記操作された初代細胞のゲノム内への非標的挿入により、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した前記細胞内への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によるものである、請求項１０８または請求項１０９に記載の操作された初代細胞。

【請求項111】

前記組込みは、前記細胞の標的ゲノム遺伝子座への標的挿入によるものである、請求項１０８または請求項１０９に記載の操作された初代細胞。

【請求項112】

前記標的ゲノム遺伝子座は、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＭＩＣＡ座、ＭＩＣＢ座、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座である、請求項１１１に記載の操作された初代細胞。

【請求項113】

前記標的ゲノム遺伝子座は、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、Ｆ３遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＫＤＭ５Ｄ遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、及びＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される、請求項１１１に記載の操作された初代細胞。

【請求項114】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる、請求項９２～１１３のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項115】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、Ｂ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減させる改変である、請求項９２～１１４のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項116】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現の低減を含む、請求項１１５に記載の操作された初代細胞。

【請求項117】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の低減を含む、請求項１１５に記載の操作された初代細胞。

【請求項118】

前記改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する、請求項１１５～１１７のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項119】

前記改変は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む、請求項１１５～１１８のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項120】

前記改変は、前記細胞におけるすべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む、請求項１１５～１１９のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項121】

前記不活性化または前記破壊は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子中のインデルを含む、請求項１１９または請求項１２０に記載の操作された初代細胞。

【請求項122】

前記改変は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である、請求項１１５～１２１のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項123】

前記Ｂ２Ｍ遺伝子はノックアウトされている、請求項１１５～１２２のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項124】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質またはＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を低減させる改変であり、任意選択で、前記ＨＬＡ－Ａタンパク質、前記ＨＬＡ－Ｂタンパク質または前記ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコードする遺伝子は、ノックアウトされている、請求項１１４～１２３のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項125】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる、請求項９２～１２４のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項126】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＣＩＩＴＡの発現を低減させる改変である、請求項９２～１２５のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項127】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現の低減を含む、請求項１２６に記載の操作された初代細胞。

【請求項128】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の低減を含む、請求項１２６に記載の操作された初代細胞。

【請求項129】

前記改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性を排除する、請求項１２６～１２８のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項130】

前記改変は、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む、請求項１２６～１２９のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項131】

前記改変は、前記細胞におけるすべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む、請求項１２６～１３０のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項132】

前記不活性化または前記破壊は、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子中のインデルを含む、請求項１３０または請求項１３１に記載の操作された初代細胞。

【請求項133】

前記インデルは、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である、請求項１２６～１３２のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項134】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質またはＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現を低減させる改変であり、任意選択で、前記ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、前記ＨＬＡ－ＤＲタンパク質または前記ＨＬＡ－ＤＱタンパク質をコードする遺伝子は、ノックアウトされている、請求項１２５～１３３のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項135】

前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ゲノム改変タンパク質によるものである、請求項９２～１３４のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項136】

前記ゲノム改変タンパク質は、配列特異的ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ（ＣＡＳＴ）、プライム編集、または部位特異的ターゲティングエレメントを介したプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）による遺伝子編集に関連している、請求項１３５に記載の操作された初代細胞。

【請求項137】

前記ゲノム改変タンパク質による前記改変は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集である、請求項１３５または請求項１３６に記載の操作された初代細胞。

【請求項138】

前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、前記ＣａｓはＣａｓ９である、請求項１３７に記載の操作された初代細胞。

【請求項139】

前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、かつ前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるための内因性遺伝子の少なくとも１つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１３７または請求項１３８に記載の操作された初代細胞。

【請求項140】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項１３９に記載の操作された初代細胞。

【請求項141】

ヒト細胞または動物細胞である、請求項９２～１４０のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項142】

ヒト細胞である、請求項１４１に記載の操作された初代細胞。

【請求項143】

前記初代細胞は、血液に曝露される細胞種である、請求項９２～１４２のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項144】

ドナー対象から単離された初代細胞である、請求項９２～１４３のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項145】

前記ドナー試料が前記ドナー対象から得られる時点で、前記ドナー対象は健康であるか、または疾患または状態を有する疑いがない、請求項１４４に記載の操作された初代細胞。

【請求項146】

膵島細胞、β膵島細胞、膵臓膵島細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ細胞、内皮細胞、筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ドーパミン作動性ニューロン、網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、及び血液細胞から選択される、請求項９２～１４５のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項147】

内皮細胞である、請求項９２～１４６のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項148】

上皮細胞である、請求項９２～１４６のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項149】

網膜色素上皮細胞である、請求項９２～１４６のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項150】

Ｔ細胞である、請求項９２～１４６のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項151】

ＮＫ細胞である、請求項９２～１４６のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項152】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１５０または請求項１５１に記載の操作された初代細胞。

【請求項153】

膵島細胞、任意選択で、β膵島細胞である、請求項９２～１４６のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項154】

肝細胞である、請求項９２～１４６のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項155】

ＡＢＯ式血液型Ｏ型である、請求項９２～１５４のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項156】

Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である、請求項９２～１５５のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項157】

請求項１～９１のいずれか１項に記載の方法によって作製される、請求項９２～１５６のいずれか１項に記載の操作された初代細胞。

【請求項158】

操作された初代細胞を生成する方法であって、
ａ）初代細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させることと、
ｂ）前記初代細胞における１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させることと
を含む、前記方法。

【請求項159】

ａ）の発現の増加、及びｂ）の発現の低減は、前記方法を受けていない同じ細胞種の細胞と比較したものである、請求項１５８に記載の方法。

【請求項160】

前記１つ以上のＭＨＣ分子の発現を低減させることは、
ａ．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、
ｂ．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または、
ｃ．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子
から選択される、請求項１５８または請求項１５９に記載の方法。

【請求項161】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させることは、前記細胞に１つ以上の改変を導入することによるものであり、任意選択で、前記１つ以上の改変は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ及び／またはＮＦＹ－Ｃ、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の分子の発現を低減させる、請求項１５８～１６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項162】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１－阻害剤、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＳｅｒｐｉｎｂ９、及び任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１５８～１６２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項163】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、
ａ）ＣＤ４７；ｂ）ＨＬＡ－Ｅ；ｃ）ＣＤ２４；ｄ）ＰＤ－Ｌ１；ｅ）ＣＤ４６；ｆ）ＣＤ５５；ｆ）ＣＤ５９；ｈ）ＣＲ１；ｉ）ＭＡＮＦ；ｊ）Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３；ｋ）ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７；ｌ）ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１及びこれらの任意の組み合わせ；ｍ）ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｎ）ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｏ）ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｐ）ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ｑ）ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１；ｒ）ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰならびにこれらの任意の組み合わせ；ｓ）ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１及びＭＡＮＦならびにこれらの任意の組み合わせ；ｔ）ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ及びＭＡＮＦならびにこれらの任意の組み合わせ；ならびにｕ）ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８及びこれらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される、請求項１５８～１６２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項164】

１つ以上の改変は前記細胞に導入され、かつ前記１つ以上の改変は、以下：
（ｉ）（ａ）ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩの発現を低減させ、（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低減させ、（ｃ）ＣＤ４７ならびに任意選択でＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現を増加させ、かつ（ｄ）ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１の発現を増加させること、
（ｉｉ）（ａ）ＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させ、（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低減させ、（ｃ）ＴＸＮＩＰの発現を低減させ、（ｄ）ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅの発現を増加させ、かつ（ｅ）任意選択で、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦの発現を増加させること、
（ｉｉｉ）（ａ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させ、かつ（ｂ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低減させること、
（ｉｖ）（ａ）ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩの発現を低減させ、かつ（ｂ）ＣＤ４７の発現を増加させること
に従い、または、
（ｖ）上記の（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかは、１つ以上の追加の遺伝子の発現を増加または減少させるための、任意選択で、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＩＲＦ１、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、酸化ストレスもしくはＥＲストレスに関与するタンパク質、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＣＤ１４２、ＡＢＯ、ＣＤ３８、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＮＬＧＮ４Ｙ及び／またはＲＨＤの発現を低減させるためのものであることを更に含み、、更に任意選択で、酸化ストレスまたはＥＲストレスに関与する前記タンパク質は、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）、イノシトール要求性酵素１α（ＩＲＥ１α）及びＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）を含む、
請求項１５８～１６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項165】

操作された初代細胞を生成する方法であって、
ａ．前記細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することと、
ｂ．前記細胞におけるＣＤ４７の発現を増加させることと
を含む、前記方法。

【請求項166】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させることを含む、請求項１５７～１６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項167】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させることを含む、請求項１５７～１６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項168】

発現を増加させることは、前記１つ以上の免疫寛容原性因子の表面発現を増加させることを含み、及び／または発現を低減させることは、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低減を含む、請求項１５７～１６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項169】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させることは、前記１つ以上の免疫寛容原性因子をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む、請求項１５７～１６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項170】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である、請求項１５７～１６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項171】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつ前記操作された初代細胞の自然免疫による殺傷を低減させる、請求項１６９または請求項１７０に記載の方法。

【請求項172】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の配列をコードする、請求項１７１に記載の方法。

【請求項173】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１６９～１７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項174】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、前記操作された初代細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１６９～１７３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項175】

前記組込みは、前記操作された初代細胞のゲノム内への非標的挿入により、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した前記操作された初代細胞内への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によるものである、請求項１７４に記載の方法。

【請求項176】

前記組込みは、前記細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によるものであり、任意選択で、前記標的挿入は、相同指向性修復を伴うヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである、請求項１７５に記載の方法。

【請求項177】

前記標的ゲノム遺伝子座は、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＭＩＣＡ座、ＭＩＣＢ座、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座である、請求項１７６に記載の方法。

【請求項178】

前記標的ゲノム遺伝子座は、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、Ｆ３遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＫＤＭ５Ｄ遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、及びＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される、請求項１７６に記載の方法。

【請求項179】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させることは、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変を導入することを含む、請求項１５７～１７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項180】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、Ｂ２Ｍの発現の低減を含む、請求項１５７～１７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項181】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の低減を含む、請求項１５７～１８０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項182】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する、請求項１８０または請求項１８１に記載の方法。

【請求項183】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む、請求項１６０～１８２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項184】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、前記細胞におけるすべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む、請求項１６０～１８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項185】

前記不活性化または前記破壊は、前記内因性Ｂ２Ｍ遺伝子中のインデル、または前記内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失を含む、請求項１８３または請求項１８４に記載の方法。

【請求項186】

前記インデルは、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である、請求項１８５に記載の方法。

【請求項187】

前記内因性Ｂ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされている、請求項１８０～１８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項188】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＨＬＡ－Ａタンパク質発現、ＨＬＡ－Ｂタンパク質発現、またはＨＬＡ－Ｃタンパク質発現を低減させ、任意選択で、前記タンパク質発現は、前記ＨＬＡ－Ａタンパク質、前記ＨＬＡ－Ｂタンパク質または前記ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって低減される、請求項１６０～１８７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項189】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させることは、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる改変を導入することを含む、請求項１６０～１８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項190】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＣＩＩＴＡの発現の低減を含む、請求項１８９に記載の方法。

【請求項191】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の低減を含む、請求項１６０～１９０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項192】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＣＩＩＴＡを排除する、請求項１６０～１９１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項193】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む、請求項１６０～１９２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項194】

前記改変は、前記細胞におけるすべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む、請求項１６０～１９３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項195】

前記不活性化または前記破壊は、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子中のインデル、または前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失を含む、請求項１９３または請求項１９４に記載の方法。

【請求項196】

前記インデルは、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である、請求項１９５に記載の方法。

【請求項197】

前記ＣＩＩＴＡ遺伝子は、ノックアウトされている、請求項１５７～１９６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項198】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質またはＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現を低減させ、任意選択で、前記ＨＬＡ－ＤＰタンパク質発現、前記ＨＬＡ－ＤＲタンパク質発現または前記ＨＬＡ－ＤＱタンパク質発現は、前記ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、前記ＨＬＡ－ＤＲタンパク質または前記ＨＬＡ－ＤＱタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって低減される、請求項１６０～１９７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項199】

前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、前記細胞へのゲノム改変タンパク質によるものであり、任意選択で、前記ゲノム改変タンパク質または前記ゲノム改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記細胞に導入される、請求項１６０～１９８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項200】

前記ゲノム改変タンパク質は、配列特異的ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ（ＣＡＳＴ）、プライム編集、または部位特異的ターゲティングエレメントを介したプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）による遺伝子編集に関連している、請求項１９９に記載の方法。

【請求項201】

前記ゲノム改変タンパク質による前記改変は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集である、請求項１９９または請求項２００に記載の方法。

【請求項202】

前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、前記ＣａｓはＣａｓ９である、請求項２０１に記載の方法。

【請求項203】

前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、かつ前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるための内因性遺伝子の少なくとも１つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項２０１または請求項２０２に記載の方法。

【請求項204】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項２０３に記載の方法。

【請求項205】

前記Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型またはＶ型Ｃａｓタンパク質である、請求項２０２～２０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項206】

前記ゲノム改変タンパク質は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、または前述のいずれかのホモログからなる群から選択される、請求項２０２～２０５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項207】

前記Ｃａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２である、請求項２０２～２０６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項208】

前記操作された初代細胞はヒト細胞または動物細胞であり、任意選択で、前記動物細胞はブタ細胞、ウシ細胞、またはヒツジ細胞である、請求項１５７～２０７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項209】

前記操作された初代細胞は、ヒト細胞である、請求項１５７～２０８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項210】

前記操作された初代細胞は、血液に曝露される細胞種である、請求項１５７～２０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項211】

前記操作された初代細胞は、ドナー対象から単離されている、請求項１５７～２１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項212】

前記操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、膵臓膵島細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ細胞、内皮細胞、筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ドーパミン作動性ニューロン、網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、及び血液細胞から選択される、請求項１５７～２１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項213】

前記操作された初代細胞は、膵島細胞である、請求項１５７～２１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項214】

前記操作された初代細胞は、β膵島細胞である、請求項１５７～２１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項215】

前記操作された初代細胞は、肝細胞である、請求項１５７～２１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項216】

前記操作された初代細胞は、Ｔ細胞である、請求項１５７～２１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項217】

前記操作された初代細胞は、内皮細胞である、請求項１５７～２１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項218】

前記操作された初代細胞は、甲状腺細胞である、請求項１５７～２１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項219】

前記操作された初代細胞は、皮膚細胞である、請求項１５７～２１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項220】

前記操作された初代細胞は、網膜色素上皮細胞である、請求項１５７～２１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項221】

請求項１～９１のいずれか１項に記載の方法に従って作製される、操作された細胞。

【請求項222】

前記細胞は、初代細胞である、請求項２２１に記載の操作された細胞。

【請求項223】

請求項１５８～２２０のいずれか１項に記載の方法に従って作製される、操作された細胞。

【請求項224】

前記細胞は、初代膵島細胞である、請求項２２２または請求項２２３に記載の操作された細胞。

【請求項225】

前記膵島細胞は、β膵島細胞である、請求項２２４に記載の操作された細胞。

【請求項226】

前記操作された細胞は、レシピエント患者への投与時にＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を回避することができ、及び／または、
前記操作された細胞は、レシピエント患者への投与時に成熟ＮＫ細胞による細胞溶解から保護される、
請求項９２～１５６及び２２１～２２３のいずれか１項に記載の操作された細胞。

【請求項227】

レシピエント患者への投与時に前記細胞に対する免疫応答を誘導しない、請求項９２～１５６及び２２１～２２５のいずれか１項に記載の操作された細胞。

【請求項228】

前記操作された細胞は、レシピエント患者への投与時に前記細胞に対する全身性炎症反応を誘導せず、及び／または前記操作された細胞は、レシピエント患者への投与時に前記細胞に対する局所炎症反応を誘導しない、請求項９２～１５６及び２２１～２２６のいずれか１項に記載の操作された細胞。

【請求項229】

請求項１～９１のいずれか１項に記載の方法によって作製される、操作された細胞の集団。

【請求項230】

請求項９２～１５７及び２２１～２２８のいずれか１項に記載の操作された細胞を複数含む、操作された細胞の集団。

【請求項231】

前記複数の操作された細胞は、複数のドナー対象からプールされた細胞に由来する初代細胞であり、任意選択で、前記複数のドナー対象のそれぞれは、前記ドナー試料が前記ドナー対象から得られる時点で、健康な対象であるか、または疾患もしくは状態を有する疑いがない、請求項２２９または請求項２３０に記載の操作された細胞の集団。

【請求項232】

前記集団中の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、前記改変を含む、請求項２２９～２３１のいずれか１項に記載の集団。

【請求項233】

前記集団中の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２２９～２３２のいずれか１項に記載の集団。

【請求項234】

前記集団中の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、前記改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減を含む、請求項２２９～２３３のいずれか１項に記載の集団。

【請求項235】

前記集団中の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、前記改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、Ｂ２Ｍ及び／またはＣＩＩＴＡの発現の低減を含む、請求項２２９～２３４のいずれか１項に記載の集団。

【請求項236】

前記集団中の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、前記改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、Ｂ２Ｍの発現の低減を含む、請求項２２９～２３５のいずれか１項に記載の集団。

【請求項237】

前記集団中の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、前記改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減を含む、請求項２２９～２３６のいずれか１項に記載の集団。

【請求項238】

前記集団中の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する、１つ以上の変化を含む、請求項２２９～２３７のいずれか１項に記載の集団。

【請求項239】

前記集団中の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、内因性ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する、１つ以上の変化を含む、請求項２２９～２３８のいずれか１項に記載の集団。

【請求項240】

請求項２２９～２３９のいずれか１項に記載の集団を含む、組成物。

【請求項241】

請求項１５～９１のいずれか１項に記載の方法によって作製される、操作された初代膵島クラスターを含む、組成物。

【請求項242】

操作された初代膵島細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代膵島細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊とを含む、前記組成物。

【請求項243】

前記操作された初代膵島細胞の集団は、初代膵島細胞のクラスターである、請求項２４２に記載の組成物。

【請求項244】

前記操作された初代膵島細胞の集団は、操作された初代β膵島細胞の集団である、請求項２４２に記載の組成物。

【請求項245】

前記集団中の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、及び前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活化または破壊を含む、請求項２４２～２４４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項246】

操作された初代Ｔ細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代Ｔ細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊とを含む、前記組成物。

【請求項247】

操作された初代甲状腺細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代甲状腺細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊とを含む、前記組成物。

【請求項248】

操作された初代皮膚細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代皮膚細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊とを含む、前記組成物。

【請求項249】

操作された初代内皮細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代内皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊とを含む、前記組成物。

【請求項250】

操作された初代網膜色素上皮細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代網膜色素上皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊とを含む、前記組成物。

【請求項251】

前記操作された初代細胞の集団の操作された初代細胞は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子にインデルを含む、請求項２４０～２５０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項252】

前記操作された初代細胞の集団の前記操作された初代細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を更に含み、任意選択で、前記操作された初代細胞の集団の操作された初代細胞は、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子にインデルを含む、請求項２４０～２５１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項253】

前記操作された初代細胞の集団の前記操作された初代細胞は、表現型Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}；ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}；ＣＤ４７ｔｇを有する、請求項２４０～２５２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項254】

医薬組成物である、請求項２４０～２５３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項255】

医薬的に許容される賦形剤を含む、請求項２４０～２５４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項256】

凍結保護物質を含む、無血清凍結保存培地中で調製される、請求項２４０～２５５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項257】

前記凍結保護物質はＤＭＳＯであり、かつ前記凍結保存培地は５％～１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である、請求項２５６に記載の組成物。

【請求項258】

前記凍結保護物質は、１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）であるか、または約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である、請求項２５６及び請求項２５７に記載の組成物。

【請求項259】

滅菌である、請求項２４０～２５８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項260】

請求項２４０～２５９のいずれか１項に記載の組成物を含む、容器。

【請求項261】

滅菌バッグである、請求項２６０に記載の容器。

【請求項262】

前記バッグは、凍結保存適合バッグである、請求項２６１に記載の滅菌バッグ。

【請求項263】

有効量の請求項２２９～２３９のいずれか１項に記載の集団、請求項２４０～２５３のいずれか１項に記載の組成物、または請求項２５４に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、その必要がある前記患者において疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法。

【請求項264】

前記集団は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として調製される、請求項２６３に記載の方法。

【請求項265】

前記細胞集団は、β膵島細胞を含む、膵島細胞を含む、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項266】

前記膵島細胞の集団は、膵島細胞のクラスターとして投与される、請求項２６３～２６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項267】

前記膵島細胞の集団は、β膵島細胞のクラスターとして投与される、請求項２６３～２６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項268】

前記細胞集団は、肝細胞である、請求項２６３～２６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項269】

前記細胞集団は、Ｔ細胞を含む、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項270】

前記細胞集団は、甲状腺細胞を含む、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項271】

前記細胞集団は、皮膚細胞を含む、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項272】

前記細胞集団は、内皮細胞を含む、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項273】

前記細胞集団は、網膜色素上皮細胞を含む、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項274】

前記状態または前記疾患は、糖尿病、がん、血管新生障害、眼疾患、甲状腺疾患、皮膚疾患、及び肝臓疾患からなる群から選択される、請求項２６３～２７３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項275】

前記細胞欠損症は糖尿病に関連するか、または前記細胞療法は糖尿病の治療のためのものであり、任意選択で、前記糖尿病はＩ型糖尿病である、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項276】

前記細胞集団は、β膵島細胞を含む、膵島細胞の集団である、請求項２７５に記載の方法。

【請求項277】

前記細胞集団は、膵島細胞のクラスターとして投与される、請求項２７６に記載の方法。

【請求項278】

その必要がある患者において糖尿病を治療する方法であって、前記方法は、有効量の請求項２２９～２３９のいずれか１項に記載の膵島細胞の集団、請求項２４０～２５３のいずれか１項に記載の組成物、または請求項２５４に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含み、任意選択で、前記細胞集団は、膵島細胞のクラスターとして投与される、前記方法。

【請求項279】

前記膵島細胞のクラスターは、β膵島細胞のクラスターである、請求項２７６～２７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項280】

前記細胞欠損症は、血管状態もしくは疾患に関連するか、または前記細胞療法は、血管状態もしくは疾患の治療のためのものである、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項281】

前記細胞集団は、内皮細胞の集団である、請求項２８０に記載の方法。

【請求項282】

前記細胞欠損症は、自己免疫性甲状腺炎に関連するか、または前記細胞療法は、自己免疫性甲状腺炎の治療のためのものである、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項283】

前記細胞欠損症は、肝臓疾患に関連するか、または前記細胞療法は、肝臓疾患の治療のためのものである、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項284】

前記肝臓疾患は、肝硬変を含む、請求項２８３に記載の方法。

【請求項285】

前記細胞集団は、肝細胞の集団である、請求項２８３または請求項２８４に記載の方法。

【請求項286】

前記細胞欠損症は、角膜疾患に関連するか、または前記細胞療法は、角膜疾患の治療のためのものである、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項287】

前記角膜疾患は、フックスジストロフィー、または先天性遺伝性内皮ジストロフィーである、請求項２８６に記載の方法。

【請求項288】

前記細胞集団は、角膜内皮細胞の集団である、請求項２８６または請求項２８７に記載の方法。

【請求項289】

前記細胞欠損症は、腎臓疾患に関連するか、または前記細胞療法は、腎臓疾患の治療のためのものである、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項290】

前記細胞集団は、腎細胞の集団である、請求項２８９に記載の方法。

【請求項291】

前記細胞療法は、がんの治療のためのものである、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項292】

前記がんは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌からなる群から選択される、請求項２９１に記載の方法。

【請求項293】

前記細胞集団は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団である、請求項２６３または請求項２６４に記載の方法。

【請求項294】

前記細胞は、投与前に増殖されかつ凍結保存される、請求項２６３～２９３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項295】

前記集団を投与することは、前記集団の静脈内注射、筋肉内注射、血管内注射、及び移植を含む、請求項２６３～２９４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項296】

前記集団は、腎被膜移植または筋肉内注射を介して移植される、請求項２９５に記載の方法。

【請求項297】

前記集団はドナー対象に由来し、前記ドナーのＨＬＡ型は前記患者のＨＬＡ型と一致しない、請求項２６３～２９６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項298】

前記集団はヒト細胞集団であり、かつ前記患者はヒト患者である、請求項２６３～２９７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項299】

前記β膵島細胞は、前記対象における耐糖能を改善する、請求項２７６～２７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項300】

前記対象は、糖尿病患者である、請求項２９９に記載の方法。

【請求項301】

前記糖尿病患者は、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病を有する、請求項３００に記載の方法。

【請求項302】

耐糖能は、前記膵島細胞の投与前の前記対象の耐糖能と比較して、改善される、請求項２７６～２７８及び２９９～３０１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項303】

前記β膵島細胞は、前記対象における外因性インスリン使用量を低減させる、請求項２７６～２７８及び２９９～３０２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項304】

ＨｂＡ１ｃレベルによって測定される耐糖能が改善される、請求項３０１～３０３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項305】

前記対象は絶食している、請求項３０１～３０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項306】

前記膵島細胞は、前記対象におけるインスリン分泌を改善する、請求項２７６～２７８及び２９７～３０５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項307】

インスリン分泌は、前記膵島細胞の投与前の前記対象のインスリン分泌と比較して、改善される、請求項３０６に記載の方法。

【請求項308】

１つ以上の免疫抑制剤を前記患者に投与することを更に含む、請求項２６３～３０７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項309】

前記患者は、１つ以上の免疫抑制剤を投与されている、請求項２６３～３０７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項310】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、小分子または抗体である、請求項３０８または３０９に記載の方法。

【請求項311】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、コルチコステロイド、プレドニゾン、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、ブレキナール、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスペルグアリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン（チモシン－α）、及び免疫抑制抗体からなる群から選択される、請求項３０８～３１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項312】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、シクロスポリンを含む、請求項３０８～３１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項313】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、ミコフェノール酸モフェチルを含む、請求項３０８～３１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項314】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、コルチコステロイドを含む、請求項３０８～３１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項315】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、シクロホスファミドを含む、請求項３０８～３１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項316】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、ラパマイシンを含む、請求項３０８～３１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項317】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む、請求項３０８～３１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項318】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、抗胸腺細胞グロブリンを含む、請求項３０８～３１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項319】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、１つ以上の免疫調節剤である、請求項３０８～３１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項320】

前記１つ以上の免疫調節剤は、小分子または抗体である、請求項３１９に記載の方法。

【請求項321】

前記抗体は、ＩＬ－２受容体のｐ７５、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５８、及びこれらのリガンドのいずれかに結合する抗体からなる群から選択される、受容体またはリガンドのうちの１つ以上に結合する、請求項３１０または請求項３２０に記載の方法。

【請求項322】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項323】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項324】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項325】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項326】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与の少なくとも１週間後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項327】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与の少なくとも２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項328】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与と同じ日に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項329】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項330】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項331】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項332】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項333】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項334】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項335】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３０８～３２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項336】

前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の前記改変を含まない免疫原性細胞の免疫拒絶を低減させるために投与される１つ以上の免疫抑制剤の用量と比較して、より低い用量で投与される、請求項３０８～３３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項337】

前記操作された細胞は、前記操作された細胞の制御された殺傷を可能にする、請求項３０８～３３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項338】

前記操作された細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチを含む、請求項３０８～３３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項339】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、薬物またはプロドラッグの存在下、または選択的な外因性化合物による活性化の際に、制御された細胞死を誘導する、請求項３３８に記載の方法。

【請求項340】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、前記操作された細胞のアポトーシスを誘導できる誘導性タンパク質である、請求項３３８または請求項３３９に記載の方法。

【請求項341】

前記操作された細胞のアポトーシスを誘導できる前記誘導性タンパク質は、カスパーゼタンパク質である、請求項３４０に記載の方法。

【請求項342】

前記カスパーゼタンパク質は、カスパーゼ９である、請求項３４１に記載の方法。

【請求項343】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項３３８～３４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項344】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、前記患者への前記１つ以上の免疫抑制剤の投与後に活性化され、制御された細胞死を誘導する、請求項３３８～３４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項345】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、前記患者への前記１つ以上の免疫抑制剤の投与前に活性化され、制御された細胞死を誘導する、請求項３３８～３４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項346】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、前記患者への前記操作された細胞の投与後に活性化され、制御された細胞死を誘導する、請求項３３８～３４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項347】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、活性化され、前記患者に対する細胞傷害性または他の悪影響が生じた場合に制御された細胞死を誘導する、請求項３３８～３４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項348】

前記操作された細胞の集団の操作された細胞の枯渇を可能にする、薬剤を投与することを含む、請求項３０８～３４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項349】

前記操作された細胞の枯渇を可能にする前記薬剤は、前記操作された細胞の表面に発現したタンパク質を認識する抗体である、請求項３４８に記載の方法。

【請求項350】

前記抗体は、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、及びＲＱＲ８を認識する抗体からなる群から選択される、請求項３４９に記載の方法。

【請求項351】

前記抗体は、モガムリズマブ、ＡＦＭ１３、ＭＯＲ２０８、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－Ｒｌｌｂ、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジニツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－Ｒｌｌｃ、及びこれらのバイオシミラーからなる群から選択される、請求項３４９または請求項３５０に記載の方法。

【請求項352】

前記操作された細胞の表面上の前記１つ以上の免疫寛容原性因子を認識する薬剤を投与することを含む、請求項２６３～３０７及び３４８～３５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項353】

前記操作された細胞は、前記１つ以上の免疫寛容原性因子を発現するように操作されている、請求項３５２に記載の方法。

【請求項354】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である、請求項３５２または請求項３５３に記載の方法。

【請求項355】

１つ以上の追加の治療薬を前記患者に投与することを更に含む、請求項２６３～３５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項356】

前記患者は、１つ以上の追加の治療薬を投与されている、請求項２６３～３５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項357】

前記方法の治療効果を監視することを更に含む、請求項２６３～３５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項358】

前記方法の予防効果を監視することを更に含む、請求項２６３～３５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項359】

１つ以上の疾患症状の所望の抑制が起こるまで繰り返される、請求項２６３～３５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項360】

自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項９２～１５６及び２２１～２２８のいずれか１項に記載の操作された細胞。

【請求項361】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項３６０に記載の操作された細胞。

【請求項362】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子または安全スイッチに関連する遺伝子は、前記操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、請求項３６０または請求項３６１に記載の操作された細胞。

【請求項363】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチ、及び前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、前記操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、請求項３６０または請求項３６１に記載の操作された細胞。

【請求項364】

前記バイシストロン性カセットは、前記操作された細胞のゲノム内への非標的挿入によって、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した前記細胞内への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によって組み込まれる、請求項３６２または請求項３６３に記載の操作された細胞。

【請求項365】

前記バイシストロン性カセットは、前記細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によって組み込まれ、任意選択で、前記標的挿入は、相同指向性修復を伴うヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである、請求項３６４に記載の操作された細胞。

【請求項366】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である、請求項３５９～３６５のいずれか１項に記載の操作された細胞。

【請求項367】

前記操作された細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１５７～２２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項368】

前記自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項３６７に記載の方法。

【請求項369】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子または前記安全スイッチに関連する遺伝子は、前記操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、請求項３６７または請求項３６８に記載の方法。

【請求項370】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチ、及び前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、前記操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、請求項３６７または請求項３６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項371】

前記バイシストロン性カセットは、前記操作された細胞のゲノム内への非標的挿入によって組み込まれる、請求項３６９または請求項３７０に記載の方法。

【請求項372】

前記バイシストロン性カセットは、前記操作された細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によって組み込まれる、請求項３７１に記載の方法。

【請求項373】

前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である、請求項３６７～３７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項374】

前記操作された細胞の集団の操作された細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２４０～２５９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項375】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項３７４に記載の組成物。

【請求項376】

前記自殺遺伝子、及び前記自殺遺伝子または前記安全スイッチに関連する遺伝子は、前記操作された細胞の集団の操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、請求項３７４または請求項３７５に記載の組成物。

【請求項377】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチ、及び前記外因性ＣＤ４７は、前記操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、請求項３７４または請求項３７５に記載の組成物。

【請求項378】

前記バイシストロン性カセットは、前記ゲノム内への非標的挿入によって、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した前記操作された細胞の集団の操作された細胞内への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によって組み込まれる、請求項３７６または請求項３７７に記載の組成物。

【請求項379】

前記バイシストロン性カセットは、前記操作された細胞の集団の操作された細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によって組み込まれ、任意選択で、前記標的挿入は、相同指向性修復を伴うヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである、請求項３７６または請求項３７７に記載の組成物。

【請求項380】

前記細胞は、自家細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または細胞。

【請求項381】

前記細胞は、同種異系細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月１１日出願の米国仮特許出願第６３／２３２，１６１号、２０２２年１月７日出願の米国仮特許出願第６３／２９７，６９４号、２０２２年５月２０日出願の米国仮特許出願第６３／３４４，５０２号、２０２２年６月３日出願の米国仮特許出願第６３／３４８，９９０号、及び２０２２年６月１７日出願の米国仮特許出願第６３／３５３，５３１号に対する優先権を主張し、これらの特許のそれぞれの内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子形式の配列表の参照
電子形式の配列表（１８６１５２００５４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌ、サイズ：３２，４１３バイト、作成日：２０２２年８月１１日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

分野
特定の態様では、本開示は、同種異系細胞療法に使用するための、遺伝子改変などの１つ以上の改変を含む、操作された初代細胞などの操作された細胞に関する。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、低免疫原性細胞である。

【発明の概要】

【0004】

概要
いくつかの態様では、本明細書では、（ｉ）１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させる、ならびに（ｉｉ）１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる、改変を含む、操作された初代細胞などの操作された細胞が提供され、（ｉ）の発現の増加及び（ｉｉ）の発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較したものである。

【0005】

いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）の改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる。提供される実施形態のいずれかのいくつかでは、１つ以上の免疫寛容原性因子は、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１阻害剤、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及び／またはＳｅｒｐｉｎｂ９である。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子のうちの少なくとも１つは、ＣＤ４７である。

【0006】

任意の実施形態のいくつかでは、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７；ＨＬＡ－Ｅ；ＣＤ２４；ＰＤ－Ｌ１；ＣＤ４６；ＣＤ５５；ＣＤ５９；ＣＲ１；ＭＡＮＦ；Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３；ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７；ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１及びこれらの任意の組み合わせ；ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１ならびにこれらの任意の組み合わせ；ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１；ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰならびにこれらの任意の組み合わせ；ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１及びＭＡＮＦならびにこれらの任意の組み合わせ；ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ及びＭＡＮＦならびにこれらの任意の組み合わせ；ならびにＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８及びこれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。

【0007】

任意の実施形態のいくつかでは、改変は、ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩの発現を低減させる；ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低減させる；ＣＤ４７ならびに任意選択でＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現を増加させる；ならびにＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１の発現を増加させる、改変から選択される。

【0008】

任意の実施形態のいくつかでは、改変は、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる；ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低減させる；ＴＸＮＩＰの発現を低減させる；ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅの発現を増加させる；ならびに任意選択でＡ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦの発現を増加させる、改変から選択される。

【0009】

任意の実施形態のいくつかでは、改変は、ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる；ならびにＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低減させる、改変から選択される。

【0010】

いくつかの実施形態では、改変は、ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩの発現を低減させる；ならびにＣＤ４７の発現を増加させる、改変から選択される。

【0011】

いくつかの実施形態では、上記の改変のいずれかは、細胞における遺伝子の発現を増加または低下させる１つ以上の追加の編集と共に、提供される操作された細胞において存在する。いくつかの実施形態では、更なる改変のいずれか１つ以上は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＩＲＦ１、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ－の発現の妨害、不活性化またはノックアウトなど、発現を低減させる改変であり得る。いくつかの実施形態では、更なる改変のいずれか１つ以上は、酸化ストレスまたはＥＲストレスに関与するタンパク質、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＣＤ１４２、ＡＢＯ、ＣＤ３８、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＮＬＧＮ４Ｙ及び／またはＲＨＤの発現を低減させる、改変であり得る。いくつかの実施形態では、酸化ストレスまたはＥＲストレスに関与するタンパク質には、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）、イノシトール要求性酵素１α（ＩＲＥ１α）、及びＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）が含まれる。

【0012】

いくつかの実施形態では、上記の標的遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＩＲＦ１、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ）の発現が低減している提供された実施形態のいずれかについて、標的遺伝子は、操作された細胞によって発現されない。いくつかの実施形態では、標的遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞の表面上には発現されない。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ複合体及び／またはＭＨＣクラスＩＩ複合体は、細胞の表面上には発現されない。

【0013】

いくつかの態様では、本明細書では、（ｉ）ＣＤ４７の発現を増加させる、ならびに（ｉｉ）１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる、改変を含む、操作された初代細胞が提供され、（ｉ）の発現の増加及び（ｉｉ）の発現の低減は、改変を含まない、同じ細胞種の細胞と比較したものである。

【0014】

いくつかの実施形態では、発現を増加させる改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる改変は、表面発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現を増加させる改変は、ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、操作された初代細胞の自然免疫による殺傷を低減させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、操作された初代細胞のゲノム内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ＣＤ４７をコードするマルチシストロン性ベクター、及び第２の導入遺伝子をコードする追加の導入遺伝子である。いくつかの実施形態では、組込みは、操作された初代細胞のゲノム内への非標的挿入により、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した細胞内への外因性ポリヌクレオチドの導入によるものである。いくつかの実施形態では、組込みは、細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によるものである。いくつかの実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座である。いくつかの実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（別名、ＡＡＶＳ１）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及びＲＯＳＡ２６遺伝子座からなる群から選択される。

【0015】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる改変は、Ｂ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減させる改変である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる改変は、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞におけるすべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、Ｂ２Ｍ遺伝子中のインデルを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされる。いくつかの実施形態では、改変は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、ＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる改変は、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質またはＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を低減させる改変であり、任意選択で、当該ＨＬＡ－Ａタンパク質、当該ＨＬＡ－Ｂタンパク質または当該ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコードする遺伝子は、ノックアウトされる。

【0016】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡの発現を低減させる改変である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性を排除する。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞におけるすべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、ＣＩＩＴＡ遺伝子中のインデルを含む。いくつかの実施形態では、インデルは、ＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子は、ノックアウトされる。いくつかの実施形態では、改変は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、ＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ＣＩＩＴＡ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる改変は、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質またはＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現を低減させる改変であり、任意選択で、当該ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、当該ＨＬＡ－ＤＲタンパク質または当該ＨＬＡ－ＤＱタンパク質をコードする遺伝子は、ノックアウトされる。

【0017】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ヒト細胞または動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、ブタ（ｐｉｇ）（ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ））、ウシ（ｃｏｗ）（ウシ（ｂｏｖｉｎｅ））またはヒツジ（ｓｈｅｅｐ）（ヒツジ（ｏｖｉｎｅ））細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、血液に曝露される細胞型である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ドナー対象から単離された初代細胞である。いくつかの実施形態では、ドナー試料がドナー対象から得られる時点で、ドナー対象は健康であるか、または疾患または状態を有する疑いがない。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞から選択される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、内皮細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、上皮細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞である。いくつかの実施形態では、膵島細胞は、β膵島細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ型である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0018】

いくつかの態様では、本明細書では、操作された初代細胞を生成する方法が提供され、方法は、ａ）初代細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することと、ｂ）初代細胞における１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させることと、を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子のうちの少なくとも１つは、ＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減または排除することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することを含む。

【0019】

いくつかの態様では、本明細書では、操作された初代細胞を生成する方法が提供され、方法は、ａ．細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することと、ｂ．細胞におけるＣＤ４７の発現を増加させることと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減または排除することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することを含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、発現を増加させる改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる改変は、表面発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現を増加させる改変は、ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、操作された初代細胞の自然免疫による殺傷を低減させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、操作された初代細胞のゲノム内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組込みは、操作された初代細胞のゲノム内への非標的挿入により、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した操作された初代細胞内への外因性ポリヌクレオチドの導入によるものである。いくつかの実施形態では、組込みは、細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によるものであり、任意選択で、標的挿入は、相同指向性修復を伴うヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座である。いくつかの実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（別名、ＡＡＶＳ１）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及びＲＯＳＡ２６遺伝子座からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、標的ゲノム遺伝子座を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、ＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、標的ゲノム遺伝子座の標的配列に相補的なターゲティングドメインと、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む相同指向修復鋳型と、を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、低免疫原性初代細胞である。

【0021】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減または排除することは、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍの発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変は、細胞におけるすべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子中のインデル、または内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失を含む。いくつかの実施形態では、インデルは、Ｂ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である。いくつかの実施形態では、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、ＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる改変は、ＨＬＡ－Ａタンパク質発現、ＨＬＡ－Ｂタンパク質発現、またはＨＬＡ－Ｃタンパク質発現を低減させ、任意選択で、タンパク質発現は、当該ＨＬＡ－Ａタンパク質、当該ＨＬＡ－Ｂタンパク質または当該ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって低減される。

【0022】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することは、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる遺伝子改変は、ＣＩＩＴＡの発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる遺伝子改変は、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡを排除する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞におけるすべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、ＣＩＩＴＡ遺伝子中のインデル、またはＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失を含む。いくつかの実施形態では、インデルは、ＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子は、ノックアウトされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩの発現を低減させる遺伝子改変は、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質またはＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現を低減させ、任意選択で、当該ＨＬＡ－ＤＰタンパク質発現、当該ＨＬＡ－ＤＲタンパク質発現または当該ＨＬＡ－ＤＱタンパク質発現は、当該ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、当該ＨＬＡ－ＤＲタンパク質または当該ＨＬＡ－ＤＱタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって低減される。

【0023】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ヒト細胞または動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、ブタ（ｐｉｇ）（ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ））細胞、ウシ（ｃｏｗ）（ウシ（ｂｏｖｉｎｅ））細胞またはヒツジ（ｓｈｅｅｐ）（ヒツジ（ｏｖｉｎｅ））細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、血液に曝露される細胞型である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ドナー対象から単離されている。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞から選択される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞である。

【0024】

いくつかの実施形態では、初代膵島細胞は、初代膵島クラスターから解離されている。いくつかの実施形態では、初代膵島クラスターは、ヒト初代死体膵島クラスターである。いくつかの実施形態では、工程ａ）の後及び／または工程ｂ）の後、初代膵島細胞は、改変された初代膵島クラスターへの再クラスター化のための条件下でインキュベートされ、インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される。いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、静的条件下でインキュベートすることの少なくとも一部を更に含む。いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、静的条件下での第１のインキュベートと、それに続く動きを伴うインキュベートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、動きを伴うインキュベートすることと、それに続く静的条件下での第２のインキュベートと、を含む。いくつかの実施形態では、再クラスター化のための条件下でインキュベートする前に、方法は、改変された膵島細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、選択することは、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によるものである。

【0025】

いくつかの実施形態では、方法は、ｉ）初代膵島クラスターを初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、ｉｉ）懸濁液の初代β膵島細胞を改変し、初代β膵島細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡの発現を低減または排除することと、ｉｉｉ）改変された初代β膵島細胞を、第１の改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、インキュベートすることの少なくとも一部は動きを伴って実行される、インキュベートすることと、ｉｖ）改変された初代膵島クラスターを改変された初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、ｖ）懸濁液の改変された初代膵島細胞を更に改変し、初代細胞における１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させることと、ｖｉ）更に改変された初代β膵島細胞を、第２の改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、インキュベートすることの少なくとも一部は動きを伴って実行される、インキュベートすることと、を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ ＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質またはＨＬＡ－Ｃタンパク質である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡは、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質またはＨＬＡ－ＤＱタンパク質である。いくつかの実施形態では、改変することは、遺伝子操作によるものである。いくつかの実施形態では、動きは、振盪である。いくつかの実施形態では、振盪は、軌道運動を含む。いくつかの実施形態では、振盪は、双方向の直線運動を含む。いくつかの実施形態では、振盪は、オービタルシェーカーによるものである。いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）のインキュベートすること及び／またはｖｉ）のインキュベートすることは、静的条件下でインキュベートすることの少なくとも一部を更に含む。いくつかの実施形態では、ｉｉｉ）のインキュベートすること及び／またはｖｉ）のインキュベートすることは、静的条件下での第１のインキュベートと、それに続く動きを伴うインキュベートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、動きを伴うインキュベートすることと、それに続く静的条件下での第２のインキュベートと、を含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、ｖ）の前に、方法は、ｉｖ）で解離させた膵島細胞から、改変されたβ膵島細胞を選択することと、任意選択で、選択された膵島細胞に対して工程ｉｉｉ）及び工程ｉｖ）を繰り返すことと、を含む。いくつかの実施形態では、ｖｉ）のインキュベートすることの後に、方法は、第２の改変された初代膵島クラスターを改変された初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、改変された膵島細胞を選択することと、を含む。いくつかの実施形態では、選択された改変初代β膵島細胞を、改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される。

【0028】

いくつかの実施形態では、本明細書では、細胞集団の改変を促進するための動きの使用が提供され、細胞集団は、動きに供する前に、集団の細胞における遺伝子発現を改変するために１つ以上の試薬と接触されている。

【0029】

いくつかの実施形態では、本明細書では、細胞集団の改変を促進する方法が提供され、そこで、方法は、ｉ）その集団の細胞における遺伝子発現を改変するために、細胞集団を１つ以上の試薬と接触させることと、ｉｉ）１つ以上の試薬と接触させた後、細胞集団を動きに供することと、を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、本明細書では、細胞集団の生存率を促進する方法が提供され、そこで、方法は、ｉ）その集団の細胞における遺伝子発現を改変するために、細胞集団を１つ以上の試薬と接触させることと、ｉｉ）１つ以上の試薬と接触させた後、細胞集団を動きに供することと、を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、本明細書では、細胞集団の改変の方法が提供され、そこで、方法は、ｉ）その集団の細胞における遺伝子発現を改変するために、細胞集団を１つ以上の試薬と接触させることと、ｉｉ）１つ以上の試薬と接触させた後、細胞集団を動きに供することと、を含む。

【0032】

提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、細胞集団は、初代細胞である。提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、細胞集団は、幹細胞に由来する細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞、生殖細胞系幹細胞、肺幹細胞、臍帯血幹細胞、及び複能性幹細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、膵島細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、内皮細胞、筋肉細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、肝細胞、グリア前駆細胞、ドーパミン作動性ニューロン、網膜色素上皮細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、及び血液細胞からなる群から選択される。

【0033】

提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、細胞集団は、３Ｄネットワーク中に自然に存在する。

【0034】

提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、細胞集団は、懸濁状態にある。いくつかの実施形態では、細胞集団は、低付着表面を有する容器中にある。いくつかの実施形態では、細胞集団は、細胞を覆うのに十分な最小体積の培地中で容器内に維持される。いくつかの実施形態では、懸濁状態の細胞集団は、接触前に付着培養物または細胞クラスターから細胞を解離させることによって作製される。

【0035】

提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、細胞集団は、膵島細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、β膵島細胞を含む。いくつかの実施形態では、β膵島細胞を含む細胞集団は、初代膵島クラスターを、初代β膵島細胞を含む細胞の懸濁液へと解離させることによって作製される。

【0036】

提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、接触は、細胞を動きに供する前に２日よりも短い期間実施される。いくつかの実施形態では、接触は、細胞を動きに供する前に３０秒～２４時間実施される。いくつかの実施形態では、接触は、細胞を動きに供する前に１分～６０分、２分～３０分、５分～１５分間実施される。

【0037】

提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、細胞集団を動きに供することにより、細胞凝集体の形成が促進される。いくつかの実施形態では、細胞集団を動きに供することにより、細胞クラスターが形成される。

【0038】

提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、方法または使用は、細胞を動きに供した後、静的条件下で細胞をインキュベートすることを更に含む。提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、方法または使用は、接触後かつ細胞を動きに供する前、静的条件下で細胞をインキュベートすることを更に含む。

【0039】

提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、１つ以上の試薬は、少なくとも２つの異なる試薬を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる試薬のそれぞれは、異なる遺伝子の発現を調節するためのものである。

【0040】

提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、方法の工程は、繰り返される。いくつかの実施形態では、方法の第１の反復における１つ以上の試薬は、方法の繰り返される反復における１つ以上の試薬とは異なる。いくつかの実施形態では、方法の第１の反復における１つ以上の試薬は、方法の第２の反復における１つ以上の試薬とは異なる。

【0041】

提供される使用または方法の任意の実施形態のいくつかでは、これは、１つ以上の試薬との接触後に細胞を動きに供する前に、遺伝子発現が改変された細胞を選択することを更に含み得る。任意の実施形態のいくつかでは、改変された遺伝子発現を有する細胞を選択することは、接触前の細胞と比較したうえで行うことであり得る。いくつかの実施形態では、改変された遺伝子発現は、例えば、接触前の細胞中の遺伝子の発現と比較して、増加する。いくつかの実施形態では、改変された遺伝子発現は、例えば、接触前の細胞における遺伝子の発現と比較して、減少する。

【0042】

本明細書では、初代膵島細胞を改変するための方法が提供され、この方法は、ｉ）初代膵島クラスターを初代膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、ｉｉ）遺伝子発現を改変するために、初代膵島細胞の懸濁液を１つ以上の試薬と接触させることと、ｉｉｉ）接触後、細胞を膵島に再クラスター化するための条件下で、改変された膵島細胞をインキュベートすることであって、インキュベートすることの少なくとも一部は動きを伴って実行される、インキュベートすることと、を含む。

【0043】

いくつかの態様では、本明細書では、初代膵島細胞を遺伝子編集するための方法が提供され、この方法は、ｉ）初代膵島クラスターを初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、ｉｉ）懸濁液の初代β膵島細胞を改変することと、ｉｉｉ）改変された初代β膵島細胞を膵島に再クラスター化するための条件下で、改変された初代β膵島細胞をインキュベートすることであって、インキュベートすることの少なくとも一部は振盪しながら実行される、インキュベートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、初代膵島クラスターは、ヒト初代死体膵島クラスターである。いくつかの実施形態では、改変することは、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるため、または細胞における１つ以上の異種タンパク質の発現を増加させるために、細胞内に１つ以上の改変を導入することを含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）のインキュベートすること及び／またはｖｉ）のインキュベートすることは、静的条件下でインキュベートすることの少なくとも一部を更に含む。いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、静的条件下での第１のインキュベートと、それに続く動きを伴うインキュベートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、動きを伴うインキュベートすることと、それに続く静的条件下での第２のインキュベートと、を含む。いくつかの実施形態では、工程ｉ）～ｉｉｉ）が繰り返される。いくつかの実施形態では、方法の第１の反復における改変は、方法の繰り返される反復における改変とは異なる。いくつかの実施形態では、方法の第１の反復における１つ以上の試薬は、方法の繰り返される反復における１つ以上の試薬とは異なる。

【0045】

いくつかの実施形態では、再クラスター化膵島細胞は、第１の改変された初代膵島クラスターであり、方法は、ｉｖ）第１の改変された初代膵島クラスターを改変された初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、ｖ）懸濁液の改変された初代膵島細胞を更に改変することと、ｖｉ）第２の改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下で、更に改変された初代β膵島細胞をインキュベートすることであって、インキュベートすることの少なくとも一部は動きを伴って実施される、インキュベートすることと、を更に含む。

【0046】

いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬は１つ以上の第１の試薬であり、再クラスター化膵島細胞は第１の改変された初代膵島クラスターであり、方法は、ｉｖ）第１の改変された初代膵島クラスターを改変された初代膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、ｖ）遺伝子発現を改変するために、懸濁液の改変された初代膵島細胞を１つ以上の更なる試薬と更に接触させることと、ｖｉ）更なる接触後に、更に改変された初代膵島細胞を、第２の改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、インキュベートすることの少なくとも一部は動きを伴って実施される、インキュベートすることと、を更に含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、ｉｉｉ）のインキュベートすることの前に、方法は、改変された膵島細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、ｖ）の前に、方法は、ｉｖ）で解離させた膵島細胞から、改変されたβ膵島細胞を選択することと、任意選択で、選択された膵島細胞に対して工程ｉｉｉ）及び工程ｉｖ）を繰り返すことと、を含む。いくつかの実施形態では、ｖｉ）のインキュベートすることの後に、方法は、第２の改変された初代膵島クラスターを改変された初代膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、改変された膵島細胞を選択することと、を含む。いくつかの実施形態では、改変された細胞は、改変された遺伝子発現を有し、例えば、接触前の初代膵島細胞と比較して改変されている。

【0048】

いくつかの実施形態では、選択された改変初代β膵島細胞を、改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される。いくつかの実施形態では、選択することは、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、懸濁液は、単一細胞懸濁液である。

【0050】

いくつかの実施形態では、初代膵島細胞の懸濁液は、低付着表面を有する容器中に存在する。いくつかの実施形態では、容器は、細胞を覆うのに十分な最小体積の培地を有する。

【0051】

任意の実施形態のいくつかでは、動きは、それぞれ両端を含んで、約２０ｒｐｍ～約１８０ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ～約１２５ｒｐｍ、または約６０ｒｐｍ～約１００ｒｐｍの速度である。いくつかの実施形態では、動きは、両端を含んで、約８５ｒｐｍ～約９５ｒｐｍの速度である。

【0052】

いくつかの実施形態では、動きは、振盪である。いくつかの実施形態では、振盪は、軌道運動を含む。いくつかの実施形態では、動きは、波状の動きである。いくつかの実施形態では、波状の動きは、軌道運動と揺動運動を組み合わせたシェーカー装置によるものである。いくつかの実施形態では、振盪は、双方向の直線運動を含む。いくつかの実施形態では、振盪は、オービタルシェーカーによるものである。いくつかの実施形態では、動きは、傾斜角を伴うものである。いくつかの実施形態では、傾斜角は、１°～８°である。

【0053】

いくつかの実施形態では、第１の改変することまたは更なる改変することの一方は、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させることを含み、第１の改変することまたは更なる改変することのうちの他方は、細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、第１の改変することは、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させることを含み、更なる改変することは、細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させることを含む。

【0054】

いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬は、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるか、または細胞における１つ以上の異種タンパク質の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、第１の１つ以上の試薬の少なくとも１つは、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるためのものであり、更なる１つ以上の試薬の少なくとも１つは、細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させるためのものである。いくつかの実施形態では、第１の１つ以上の試薬の少なくとも１つは、細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させるためのものであり、更なる１つ以上の試薬の少なくとも１つは、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるためのものである。いくつかの実施形態では、第１の１つ以上の試薬は、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるためのものであり、更なる１つ以上の試薬は、細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させるためのものである。いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬は、内因性タンパク質をコードする標的遺伝子を遺伝子編集するためのゲノム改変タンパク質、及び／または外因性タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む薬剤を含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させることは、遺伝子編集システムを細胞内に導入することによるものである。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、配列特異的ヌクレアーゼを含む。任意の実施形態のいくつかでは、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるための１つ以上の試薬は、ゲノム改変タンパク質を含む。ゲノム改変タンパク質は、配列特異的ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ（ＣＡＳＴ）、プライム編集、または部位特異的ターゲティングエレメントを介したプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）による遺伝子編集に関連している。いくつかの実施形態では、ゲノム改変タンパク質は、配列特異的ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼである。

【0056】

いくつかの実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、ＩＩ型またはＶ型Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ホモログまたはＣｐｆ１ホモログである。いくつかの実施形態では、ゲノム改変タンパク質は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、及びＭａｄ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓは、Ｃａｓ１２である。

【0057】

いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬は、１つ以上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の発現を低減させるため、及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるためのものである。いくつかの実施形態では、第１の改変することは、１つ以上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、改変することは、遺伝子操作することである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ ＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質またはＨＬＡ－Ｃタンパク質である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡは、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質またはＨＬＡ－ＤＱタンパク質である。

【0058】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるための１つ以上の試薬は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ及び／またはＮＦＹ－Ｃのうちの１つ以上の発現を低減させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩの発現を低減させることは、Ｂ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減させることによるものである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩの発現を低減させることは、ＣＩＩＴＡの発現を低減させることによるものである。

【0059】

いくつかの実施形態では、更なる改変することは、細胞における１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性タンパク質は、１つ以上の免疫寛容原性因子である。いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬は、１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるための薬剤を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、脂質粒子またはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

【0060】

いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１－阻害剤、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＳｅｒｐｉｎｂ９である。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子のうちの少なくとも１つは、ＣＤ４７である。

【0061】

いくつかの実施形態では、細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させることは、外因性ポリヌクレオチドを導入することによるものである。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞のゲノム内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、マルチシストロン性ベクターである。いくつかの実施形態では、組込みは、細胞のゲノム内への非標的挿入により、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した細胞内への外因性ポリヌクレオチドの導入によるものである。いくつかの実施形態では、組込みは、細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によるものである。いくつかの実施形態では、膵島細胞は、β膵島細胞である。

【0062】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、内皮細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、甲状腺細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、皮膚細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、網膜色素上皮細胞である。

【0063】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って産生された操作された細胞が提供される。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、本明細書に記載のいずれかの細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、初代細胞である。任意の実施形態のいくつかでは、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞から選択される。いくつかの実施形態では、初代細胞は、膵島細胞である。いくつかの実施形態では、膵島細胞は、β膵島細胞である。

【0064】

いくつかの実施形態では、方法によって作製される細胞の生存率は、約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％またはそれ以上を超える。いくつかの実施形態では、方法によって改変された集団の細胞の割合は、約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％またはそれ以上を超える。

【0065】

任意の実施形態のいくつかでは、提供される改変細胞のいずれかにおいて記載される改変は、操作された細胞の自然免疫殺傷を低減させる。

【0066】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、レシピエント患者への投与時にＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を回避することができる。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、レシピエント患者への投与時に成熟ＮＫ細胞による細胞溶解から保護される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、レシピエント患者への投与時に細胞に対する免疫応答を誘導しない。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、レシピエント患者への投与時に細胞に対する全身性炎症反応を誘導しない。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、レシピエント患者への投与時に細胞に対する局所的炎症反応を誘導しない。

【0067】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載の操作された初代細胞のいずれかを複数含む、操作された初代細胞の集団が提供される。いくつかの実施形態では、複数の操作された初代細胞は、複数のドナー対象からプールされた細胞に由来する。いくつかの実施形態では、複数のドナー対象のそれぞれは、健康な対象であるか、またはドナー試料がドナー対象から得られる時点で疾患もしくは状態を有する疑いがない。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、改変を含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、Ｂ２Ｍ及び／またはＣＩＩＴＡの発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、Ｂ２Ｍの発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する、１つ以上の変化を含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、内因性ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する、１つ以上の変化を含む。

【0068】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載の集団のいずれか１つを含む、組成物が提供される。

【0069】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載の方法のいずれか１つによって作製される操作された初代膵島クラスターを含む、組成物が提供される。

【0070】

いくつかの態様では、本明細書では、操作された初代膵島細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代膵島細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代膵島細胞の集団は、初代膵島細胞のクラスターである。いくつかの実施形態では、操作された初代膵島細胞の集団は、操作された初代β膵島細胞の集団である。

【0071】

いくつかの態様では、本明細書では、操作された初代Ｔ細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代Ｔ細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。

【0072】

いくつかの態様では、本明細書では、操作された初代甲状腺細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代甲状腺細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。

【0073】

いくつかの態様では、本明細書では、操作された初代皮膚細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代皮膚細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。

【0074】

いくつかの態様では、本明細書では、操作された初代内皮細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代内皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。

【0075】

いくつかの態様では、本明細書では、操作された初代網膜色素上皮細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代網膜色素上皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の集団の操作された初代細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子にインデルを含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の集団の操作された初代細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を更に含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の集団の操作された初代細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子にインデルを含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の集団の操作された初代細胞は、表現型Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇを有する。

【0077】

いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、生理食塩水などの緩衝液である。いくつかの実施形態では、組成物は、凍結保護物質を含む、無血清凍結保存培地中で調製される。いくつかの実施形態では、凍結保護物質はＤＭＳＯであり、凍結保存培地は５％～１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保護物質は、１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）であるか、または約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、組成物は、滅菌である。いくつかの実施形態では、本明細書では、本明細書に記載の組成物のいずれかを含む、容器が提供される。いくつかの実施形態では、容器は、滅菌バッグである。いくつかの実施形態では、バッグは、冷凍保存に適合するバッグである。

【0078】

いくつかの態様では、本明細書では、有効量の本明細書に記載の集団、組成物、または医薬組成物のいずれかを患者に投与することを含む、その必要がある患者において疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、集団は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として調製される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、β膵島細胞を含む膵島細胞を含む。いくつかの実施形態では、膵島細胞の集団は、膵島細胞のクラスターとして投与される。いくつかの実施形態では、膵島細胞の集団は、β膵島細胞のクラスターとして投与される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、甲状腺細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、皮膚細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、内皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、網膜色素上皮細胞を含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、状態または疾患は、糖尿病、がん、血管新生障害、眼疾患、甲状腺疾患、皮膚疾患、及び肝臓疾患からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞欠損症は糖尿病に関連するか、または細胞療法は糖尿病の治療のためのものであり、任意選択で、糖尿病はＩ型糖尿病である。

【0080】

いくつかの実施形態では、細胞集団は、β膵島細胞を含む膵島細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、膵島細胞のクラスターとして投与される。

【0081】

いくつかの態様では、本明細書では、有効量の本明細書に記載の膵島細胞の集団、組成物もしくは医薬組成物のいずれかを患者に投与することを含む、その必要がある患者の糖尿病を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、膵島細胞のクラスターは、β膵島細胞のクラスターである。いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、血管状態もしくは疾患に関連するか、または細胞療法は、血管状態もしくは疾患の治療のためのものである。いくつかの実施形態では、細胞集団は、内皮細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、自己免疫性甲状腺炎に関連するか、または細胞療法は、自己免疫性甲状腺炎の治療のためのものである。いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、肝臓疾患に関連するか、または細胞療法は、肝臓疾患の治療のためのものである。いくつかの実施形態では、肝臓疾患は、肝硬変を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、肝細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、角膜疾患に関連するか、または細胞療法は、角膜疾患の治療のためのものである。いくつかの実施形態では、角膜疾患は、フックスジストロフィー、または先天性遺伝性内皮ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、細胞集団は、角膜内皮細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、腎疾患に関連するか、または細胞療法は、腎疾患の治療のためのものである。いくつかの実施形態では、細胞集団は、腎細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞療法は、がんの治療のためのものである。いくつかの実施形態では、がんは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞は、投与前に増殖され、凍結保存される。

【0082】

いくつかの実施形態では、集団を投与することは、集団の静脈内注射、筋肉内注射、血管内注射、及び移植を含む。いくつかの実施形態では、集団は、腎被膜移植または筋肉内注射を介して移植される。いくつかの実施形態では、集団はドナー対象に由来し、ドナーのＨＬＡ型は患者のＨＬＡ型と一致しない。いくつかの実施形態では、集団はヒト細胞集団であり、患者はヒト患者である。いくつかの実施形態では、β膵島細胞は、対象における耐糖能を改善する。いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病患者である。いくつかの実施形態では、糖尿病患者は、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である。いくつかの実施形態では、耐糖能は、膵島細胞の投与前の対象の耐糖能と比較して改善される。いくつかの実施形態では、β膵島細胞は、対象における外因性インスリン使用量を低減させる。いくつかの実施形態では、ＨｂＡ１ｃレベルによって測定される耐糖能が改善される。いくつかの実施形態では、対象は絶食している。いくつかの実施形態では、膵島細胞は、対象におけるインスリン分泌を改善する。いくつかの実施形態では、インスリン分泌は、膵島細胞の投与前の対象のインスリン分泌と比較して改善される。

【0083】

疾患を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の免疫抑制剤を患者に投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、患者は、１つ以上の免疫抑制剤を投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、小分子または抗体である。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、コルチコステロイド、プレドニゾン、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、ブレキナール、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスペルグアリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン（チモシン－α）、及び免疫抑制抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、シクロスポリンを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、ミコフェノール酸モフェチルを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、コルチコステロイドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、シクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、ラパマイシンを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、抗胸腺細胞グロブリンを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、１つ以上の免疫調節剤である。

【0084】

疾患を治療する方法のいくつかの実施形態では、１つ以上の免疫調節剤は、小分子または抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＬ－２受容体のｐ７５、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５８、及びこれらのリガンドのいずれかに結合する抗体からなる群から選択される、受容体またはリガンドのうちの１つ以上に結合する。

【0085】

疾患を治療する方法のいくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の投与前に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日前に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の投与の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上前に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の投与の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の第１の投与と同じ日に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の投与後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の第１及び／または第２の投与の投与後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の第１及び／または第２の投与の投与前に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日前に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上前に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作された細胞の改変を含まない免疫原性細胞の免疫拒絶を低減させるために投与される１つ以上の免疫抑制剤の用量と比較して、より低い用量で投与される。

【0086】

疾患を治療する方法のいくつかの実施形態では、操作された細胞は、操作された細胞の制御された殺傷を可能にする。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチを含む。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、薬物またはプロドラッグの存在下、または選択的な外因性化合物による活性化の際に、制御された細胞死を誘導する。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、操作された細胞のアポトーシスを誘導できる、誘導性タンパク質である。いくつかの実施形態では、操作された細胞のアポトーシスを誘導できる誘導性タンパク質は、カスパーゼタンパク質である。いくつかの実施形態では、カスパーゼタンパク質はカスパーゼ９である。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、患者への１つ以上の免疫抑制剤の投与後に活性化され、制御された細胞死を誘導する。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、患者への１つ以上の免疫抑制剤の投与前に活性化され、制御された細胞死を誘導する。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、患者への操作された細胞の投与後に活性化され、制御された細胞死を誘導する。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、活性化され、患者に対する細胞傷害性または他の悪影響が生じた場合に制御された細胞死を誘導する。

【0087】

疾患を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、操作された細胞の集団の操作された細胞の枯渇を可能にする、薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞の枯渇を可能にする薬剤は、操作された細胞の表面上に発現されるタンパク質を認識する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、及びＲＱＲ８を認識する抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、モガムリズマブ、ＡＦＭ１３、ＭＯＲ２０８、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－Ｒｌｌｂ、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジニツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－Ｒｌｌｃ、及びこれらのバイオシミラーからなる群から選択される。

【0088】

疾患を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、操作された細胞の表面上の１つ以上の免疫寛容原性因子を認識する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上の免疫寛容原性因子を発現するように操作されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である。

【0089】

疾患を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の追加の治療薬を患者に投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、患者は、１つ以上の追加の治療薬が投与されている。

【0090】

疾患を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、方法の治療効果を監視することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、方法の予防効果を監視することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の疾患症状の所望の抑制が起こるまで繰り返される。

【0091】

操作された細胞のいくつかの実施形態では、操作された細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び自殺遺伝子または安全スイッチに関連する遺伝子は、操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び１つ以上の免疫寛容原性因子は、操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、操作された細胞のゲノム内への非標的挿入によって、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した細胞内への外因性ポリヌクレオチドの導入によって組み込まれる。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、操作された細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によって組み込まれ、任意選択で、標的挿入は、相同指向性修復を伴うヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である。

【0092】

操作された細胞を作製する方法のいくつかの実施形態では、操作された細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び自殺遺伝子または安全スイッチに関連する遺伝子は、操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び１つ以上の免疫寛容原性因子は、操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、操作された細胞のゲノム内への非標的挿入によって組み込まれる。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、操作された細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によって組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である。

【0093】

操作された細胞の組成物のいくつかの実施形態では、操作された細胞の集団の操作された細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子、及び自殺遺伝子または安全スイッチに関連する遺伝子は、操作された細胞の集団の操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び外因性ＣＤ４７は、操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、ゲノム内への非標的挿入によって、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した操作された細胞の集団の操作された細胞内への外因性ポリヌクレオチドの導入によって組み込まれる。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、操作された細胞の集団の操作された細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によって組み込まれ、任意選択で、標的挿入は、相同指向性修復を伴うヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである。

【0094】

提供される方法または細胞のいずれかのいくつかでは、細胞は、自家細胞である。

【0095】

提供される方法または細胞のいずれかのいくつかでは、細胞は、同種異系細胞である。

【図面の簡単な説明】

【0096】

【図1】Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスから単離されたＢ２Ｍ^－／－初代β膵島細胞が、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）またはクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）分子を発現しないことを示す。移植前、及び移植後に単離された細胞における発現を分析した。

【図2】図２Ａ～２Ｂは、マウスＢ２Ｍ^－／－初代β膵島細胞（Ａ）、またはＣＤ４７の過剰発現のためにレンチウイルスベクターが形質導入されたＢ２Ｍ^－／－初代β膵島細胞（Ｂ）におけるＣＤ４７発現を示す。

【図3-1】図３Ａ～３Ｆは、操作された及び野生型（ＷＴ）の初代β膵島細胞の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射移植試験の結果を提供する。ルシフェラーゼ発現の生物発光イメージング（ＢＬＩ）の定量化は、移植されたマウスＷＴ初代β膵島細胞（Ａ定量化、Ｂ対応するＢＬＩ画像）について、及び移植されたマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇ初代β膵島細胞（Ｃ定量化、Ｄ対応するＢＬＩ画像）について、提供される。血糖測定値は、マウスＷＴ初代β膵島細胞を移植された糖尿病マウス（Ｅ）及びマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇ初代β膵島細胞を移植された糖尿病マウス（Ｆ）について提供される。

【図3-2】図３－１の説明を参照されたい。

【図4-1】図４Ａ～４Ｆは、腎被膜内に注入された、操作されたマウス初代β膵島細胞及びマウスＷＴ初代β膵島細胞の試験の結果を提供する。ルシフェラーゼ発現のＢＬＩの定量化は、移植されたマウスＷＴ初代β膵島細胞（Ａ定量化、Ｂ対応するＢＬＩ画像）について、及び移植されたマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇ初代β膵島細胞（Ｃ定量化、Ｄ対応するＢＬＩ画像）について、提供される。血糖測定値は、マウスＷＴ初代β膵島細胞を移植された糖尿病マウス（Ｅ）について、及びマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇ初代β膵島細胞を移植された糖尿病マウス（Ｆ）について、提供される。

【図4-2】図４－１の説明を参照されたい。

【図5】図５Ａ～５Ｃは、免疫応答を評価する筋肉内注射同種異系移植試験の結果を提供する。血糖測定値は、同種異系マウスＷＴ初代β膵島細胞を移植された糖尿病マウス、及び同種異系マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞を移植された糖尿病マウスについて提供される（Ａ）。インターフェロンγ（ＩＦＮｇ）レベルは、同種異系マウスＷＴ初代β膵島細胞を移植された糖尿病マウス、及び同種異系マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞を移植された糖尿病マウスについて提供される（Ｂ）。ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）ＩｇＧレベルは、同種異系マウスＷＴ初代β膵島細胞を移植された糖尿病マウス、及び同種異系マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞を移植された糖尿病マウスについて提供される（Ｃ）。

【図6】図６Ａ～６Ｆは、操作された及びマウスＷＴ初代β膵島細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性細胞殺傷の結果を提供する。ＮＫ細胞媒介性細胞殺傷は、マウスＷＴ初代β膵島細胞（Ａ）、マウスＢ２Ｍ^－／－初代β膵島細胞（Ｂ）、及びマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞（Ｃ）について提供される。抗ＣＤ４７抗体の存在下でのＮＫ細胞媒介性細胞殺傷はまた、マウスＷＴ初代β膵島細胞（Ｄ）、マウスＢ２Ｍ^－／－初代β膵島細胞（Ｅ）、及びマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞（Ｆ）について提供される。

【図7】図７Ａ～７Ｆは、操作されたマウス及びマウスＷＴ初代β膵島細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでのマクロファージ細胞媒介性細胞殺傷の結果を提供する。マクロファージ細胞媒介性細胞殺傷は、マウスＷＴ初代β膵島細胞（Ａ）、マウスＢ２Ｍ^－／－初代β膵島細胞（Ｂ）、及びマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞（Ｃ）について提供される。抗ＣＤ４７抗体の存在下でのマクロファージ細胞媒介性細胞殺傷はまた、マウスＷＴ初代β膵島細胞（Ｄ）、マウスＢ２Ｍ^－／－初代β膵島細胞（Ｅ）、及びマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞（Ｆ）について提供される。

【図8-1】図８Ａ～８Ｎは、ＣＤ４７の過剰発現のためにレンチウイルスベクターが形質導入されたマウスＢ２Ｍ^－／－（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）初代β膵島細胞におけるＣＤ４７発現を示し（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｍ））、様々な感染多重度（ＭＯＩ）について、操作されたマウス初代β膵島細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＫ細胞媒介性細胞殺傷の対応する結果（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、Ｎ）を提供する。

【図8-2】図８－１の説明を参照されたい。

【図8-3】図８－１の説明を参照されたい。

【図8-4】図８－１の説明を参照されたい。

【図9-1】図９Ａは、ＷＴ初代ヒトβ膵島細胞及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ヒトβ膵島細胞を移植した代表的なマウスの細胞組成を示す。

【図9-2】図９Ｂ～９Ｇは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ（Ｂ～Ｃ）、ＨＬＡクラスＩＩ（Ｄ～Ｅ）、及びＣＤ４７発現（Ｆ～Ｇ）の表面発現について、代表的なドナーからのＷＴ初代ヒトβ膵島細胞から生成されたＷＴ初代ヒトβ膵島細胞、ならびにＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ操作されたヒトβ膵島細胞のフローサイトメトリー染色を示す。

【図9-3】図９Ｈは、ＷＴ初代ヒトβ膵島細胞、及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ操作されたヒトβ膵島細胞からのインスリン分泌を示す。

【図9-4】図９Ｉ～９Ｋは、代表的なドナーからの、ＷＴ初代ヒトβ膵島細胞（Ｉ）、Ｂ２Ｍ^－／－初代ヒトβ膵島細胞（Ｊ）、及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ヒトβ膵島細胞（Ｋ）についてのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＫ細胞媒介性細胞殺傷を示す。図９Ｌ～９Ｎは、代表的なドナーからの、ＷＴ初代ヒトβ膵島細胞（Ｌ）、Ｂ２Ｍ^－／－初代ヒトβ膵島細胞（Ｍ）、及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ヒトβ膵島細胞（Ｎ）についてのｉｎ ｖｉｔｒｏでのマクロファージ媒介性細胞殺傷を示す。

【図10A】同種異系ヒト初代膵島細胞に対するレシピエントの免疫応答を評価する同種異系移植試験の結果を提供する。代表的なドナーからの移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇヒト初代膵島細胞（Ａ定量；Ｂ対応するＢＬＩ画像）についてのルシフェラーゼ発現のＢＬＩの定量化が提供される。

【図10B】同種異系ヒト初代膵島細胞に対するレシピエントの免疫応答を評価する同種異系移植試験の結果を提供する。代表的なドナーからの移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇヒト初代膵島細胞（Ａ定量；Ｂ対応するＢＬＩ画像）についてのルシフェラーゼ発現のＢＬＩの定量化が提供される。

【図10C】同種異系ヒト初代膵島細胞に対するレシピエントの免疫応答を評価する同種異系移植試験の結果を提供する。代表的なドナーからの移植されたＷＴヒト初代膵島細胞（Ｃ定量；Ｄ対応するＢＬＩ画像）についてのルシフェラーゼ発現のＢＬＩの定量化が提供される。

【図10D】同種異系ヒト初代膵島細胞に対するレシピエントの免疫応答を評価する同種異系移植試験の結果を提供する。代表的なドナーからの移植されたＷＴヒト初代膵島細胞（Ｃ定量；Ｄ対応するＢＬＩ画像）についてのルシフェラーゼ発現のＢＬＩの定量化が提供される。

【図10E】代表的なドナーから採取した同種異系Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病マウスの血糖測定値を示す。

【図10F】代表的なドナーから採取した同種異系ＷＴヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病マウスの血糖測定値を示す。

【図10G】代表的なドナーからの同種異系Ｂ２Ｍ^－／－；ヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病マウスのルシフェラーゼ発現のＢＬＩを提供する。

【図10H】代表的なドナーから採取した同種異系Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病マウスの血糖測定値を示す。

【図10I】免疫応答を評価する筋肉内注射同種異系移植試験の結果を提供する。インターフェロンγ（ＩＦＮｇ）レベルは、ＷＴヒト初代膵島細胞、Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞、及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病マウスについて提供される。

【図10J】免疫応答を評価する筋肉内注射同種異系移植試験の結果を提供する。ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）ＩｇＧレベルは、ＷＴヒト初代膵島細胞、Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞、及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病マウスについて提供される。

【図11】図１１Ａ～１１Ｃは、代表的なドナーから採取された、同種異系Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（Ａ）、ＷＴヒト初代膵島細胞（Ｂ）、及びＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞（Ｃ）を移植された糖尿病マウスのｃタンパク質測定値を示す。

【図12A】移植されたＷＴ初代ヒト膵島細胞、移植されたＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞、及び移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ヒト膵島細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの脾細胞媒介性細胞殺傷の結果を提供する。

【図12B】移植されたＷＴ初代ヒト膵島細胞、移植されたＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞、及び移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ヒト膵島細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイの結果を提供する。

【図13-1】図１３Ａ～１３Ｄは、糖尿病患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用したＰＢＭＣ殺傷アッセイの結果を提供する。糖尿病性ＰＢＭＣを用いた殺傷アッセイの結果を、ＷＴヒト初代膵島細胞（Ａ）及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（Ｃ）について示す。対照として、殺傷はまた、ＰＢＭＣの非存在下で、ＷＴヒト初代膵島細胞標的細胞（Ｂ）及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞標的細胞（Ｄ）についてのみ、示される。

【図13-2】図１３Ｅ～１３Ｈは、健常ドナーのＰＢＭＣを使用したＰＢＭＣ殺傷アッセイの結果を提供する。健康なＰＢＭＣを用いた殺傷アッセイの結果を、代表的なもの由来のＷＴヒト初代膵島細胞（Ｅ）及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（Ｇ）について示す。対照として、殺傷はまた、ＰＢＭＣの非存在下で、ＷＴヒト初代膵島細胞標的細胞（Ｆ）及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞標的細胞（Ｈ）についてのみ、示される。

【図13-3】図１３Ｉ～１３Ｊは、死細胞のフローサイトメトリー分析による細胞殺傷の評価を示す。代表的なドナーからのＷＴヒト初代膵島細胞と糖尿病患者ＰＢＭＣまたは健常ドナーＰＢＭＣとのｉｎ ｖｉｔｒｏでのインキュベーション後の死細胞の割合を、図１３Ｉに示す。代表的なドナーからのＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞と糖尿病患者ＰＢＭＣまたは健常ドナーＰＢＭＣとのｉｎ ｖｉｔｒｏでのインキュベーション後の死細胞の割合を、図１３Ｊに示す。

【図14】図１４Ａ～１４Ｆは、操作された初代ヒトβ膵島細胞及び操作された初代ヒトβ膵島細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ならびにマクロファージ細胞媒介性細胞殺傷の結果を提供する。ＮＫ細胞媒介性細胞殺傷は、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（Ａ）、抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１Ｆｃの存在下におけるＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（Ｂ）、及び抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４Ｆｃの存在下におけるＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（Ｃ）について、提供される。マクロファージ細胞媒介性細胞殺傷はまた、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（Ｄ）、抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１Ｆｃの存在下におけるＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（Ｅ）、及び抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４Ｆｃの存在下におけるＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（Ｆ）について、提供される。

【図15】図１５Ａ～１５Ｃは、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞、抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１Ｆｃを発現するＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞、及び抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４Ｆｃの存在下でのＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞について、グランザイムＢ（Ａ）、パーフォリン（Ｂ）ならびに活性酸素種（ＲＯＳ）（Ｃ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定値を示す。

【図16】ＷＴヒト初代膵島細胞、Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞、及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞におけるＣＤ４７発現を示す。

【図17】ＷＴヒト初代膵島細胞（全、アポトーシス及び壊死）、Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞（全、アポトーシス及び壊死）、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（全、アポトーシス及び壊死）、及び抗ＣＤ４７ Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（全、アポトーシス及び壊死）について、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマクロファージの貪食の結果を提供する。

【図18】Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞、抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１Ｆｃの存在下でのＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ヒトβ膵島細胞、及び抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４Ｆｃの存在下でのＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ヒトβ膵島細胞について、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマクロファージの貪食の結果を示す。

【図19-1】図１９Ａ～１９Ｆは、同種異系ヒト初代膵島細胞に対する糖尿病ＮＳＧマウスの免疫応答を評価する、同種異系移植試験の結果を提供する。ルシフェラーゼ発現画像のＢＬＩは、代表的なドナーからの移植されたＢ２Ｍ^－／－ＣＤ４７^ｔｇヒト初代膵島細胞（Ａ）及び代表的なドナーからの移植されたＷＴ初代ヒト膵島細胞（Ｄ）について提供される。血糖測定値は、代表的なドナーから採取した同種異系Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病ＮＳＧマウス（Ｂ）及び代表的なドナーから採取した同種異系ＷＴヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病マウス（Ｅ）について示す。Ｃタンパク質測定値も、代表的なドナーから採取した同種異系Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病ＮＳＧマウス（Ｃ）及び代表的なドナーから採取した同種異系ＷＴヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病マウス（Ｆ）について提供される。

【図19-2】図１９－１の説明を参照されたい。

【図20-1】図２０Ａ～２０Ｄは、局所投与された抗ＣＤ４７及びアイソタイプ対照の存在下での同種異系ヒト初代膵島細胞に対する、糖尿病ヒト化マウス免疫応答またはその欠如を評価する、同種異系移植試験の結果を提供する。ルシフェラーゼ発現画像のＢＬＩは、移植後８日目に、アイソタイプ対照抗体を局所的に（Ａ）または抗ＣＤ４７を局所的に（Ｃ）更に投与した、代表的なドナー由来のＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病ヒト化マウスについて提供される。血糖測定値は、移植後８日目に、アイソタイプ対照抗体を局所的に（Ｂ）または抗ＣＤ４７を局所的に（Ｄ）更に投与した、代表的なドナー由来のＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病ヒト化マウスについて示す。

【図20-2】図２０－１の説明を参照されたい。

【図21-1】図２１Ａ～２１Ｄは、全身投与された抗ＣＤ４７及びアイソタイプ対照の存在下での同種異系ヒト初代膵島細胞に対する、糖尿病ヒト化マウス免疫応答またはその欠如を評価する、同種異系移植試験の結果を提供する。ルシフェラーゼ発現画像のＢＬＩは、移植後８日目に、アイソタイプ対照抗体を全身に（Ａ）または抗ＣＤ４７を全身に（Ｃ）更に投与した、代表的なドナー由来のＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病ヒト化マウスについて提供される。血糖測定値は、移植後８日目に、アイソタイプ対照抗体を全身に（Ｂ）または抗ＣＤ４７を全身に（Ｄ）更に投与した、代表的なドナー由来のＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇヒト初代膵島細胞を移植された糖尿病ヒト化マウスについて示す。

【図21-2】図２１－１の説明を参照されたい。

【図22】図２２Ａ～２２Ｂは、同種異系非ヒト霊長類（ＮＨＰ）初代膵島細胞に対するＮＰＨレシピエントの免疫応答を評価する同種異系移植試験の結果を提供する。ルシフェラーゼ発現のＢＬＩの定量化は、移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇ ＮＨＰ初代膵島細胞（Ａ定量化；Ｂ対応するＢＬＩ画像）について提供される。

【図23】図２３Ａ～２３Ｄは、免疫応答を評価するＮＨＰにおける筋肉内注射同種異系移植試験の結果を提供する。インターフェロンγ（ＩＦＮｇ）レベルは、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７^ｔｇ ＮＨＰ初代膵島細胞を移植されたＮＨＰについて、提供される（Ａ）。ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）のＩｇＭレベル（Ｂ）及びＩｇＧレベル（Ｃ）は、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ ＮＨＰ初代膵島細胞を移植されたＮＨＰについて、提供される。ＤＳＡ ＩｇＧレベルはまた、移植前にＩｇＧレベルが上昇した、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ ＮＨＰ初代膵島細胞（Ｄ）を移植された感作ＮＨＰについて、提供される。

【図24】Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ ＮＨＰ初代膵島細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性細胞殺傷の結果を提供する。

【図25】ＷＴヒト初代ＲＰＥ細胞（上パネル）、ダブルノックアウト（Ｂ２Ｍ^－／－ＣＩＩＴＡ^－／－）初代ＲＰＥ細胞（中パネル）及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ＲＰＥ細胞（下パネル）における、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ分子及びＣＤ４７の発現を示す。

【図26】図２６Ａ～２６Ｉは、ＷＴヒト初代ＲＰＥ細胞（上パネル）、ヒトダブルノックアウト（Ｂ２Ｍ^－／－ＣＩＩＴＡ^－／－）初代ＲＰＥ細胞（中パネル）及びヒトＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ＲＰＥ細胞（下パネル）のｉｎ ｖｉｔｒｏでのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性細胞殺傷（Ａ～Ｃ）及びマクロファージ細胞媒介性細胞殺傷（Ｄ～Ｆ）の結果を提供する。標的細胞のみを媒介した細胞殺傷を、対照として各細胞株について提供する（Ｇ～Ｉ）。

【発明を実施するための形態】

【0097】

詳細な説明
本明細書では、いくつかの態様では、同種異系細胞療法などの同種異系移植に応答する免疫系反応の影響を軽減及び／または回避するための方法、ならびに組成物が提供される。細胞療法の免疫拒絶の問題を克服するために、本明細書では、免疫系を回避する能力を有する操作された細胞（本明細書では、操作された免疫回避細胞または操作された低免疫原性細胞とも呼ばれる）もしくはその集団、または任意の移植可能な細胞型の生存可能な供給源を表すその医薬組成物が開示される。本明細書で提供される操作された細胞の態様では、レシピエント対象の免疫系による細胞の拒絶反応は減少し、操作された細胞は、遺伝子操作された細胞は、対象の遺伝子構成、または１つ以上の以前の同種異系移植、以前の自家キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ拒絶、及び／または導入遺伝子が発現される他の自己もしくは同種異系治療に対する対象内の既存の反応に関係なく、投与後に宿主に生着して機能することができる。したがって、いくつかの態様では、操作された細胞は、操作された免疫回避細胞を指す。本明細書に記載される操作された細胞は、これらに限定されないが、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、形質細胞または血小板）を含む、任意の細胞に由来する。いくつかの実施形態では、提供される操作された初代細胞は、操作された細胞（例えば、生検などの生体組織から直接採取された細胞）である。

【0098】

いくつかの実施形態では、初代細胞などの細胞は、未変化または未改変の野生型細胞と比較して、１つ以上の標的の低減または発現の増加を有するように操作される。いくつかの実施形態では、細胞は、未変化または未改変の野生型細胞と比較して、１つ以上の標的の構成的な、発現の低減または増加を有するように操作される。いくつかの実施形態では、細胞は、未変化または未改変の野生型細胞と比較して、１つ以上の標的の制御可能な、発現の低減または増加を有するように操作される。いくつかの実施形態では、細胞は、同じ細胞種の野生型細胞または対照細胞と比較して、ＣＤ４７の増加した発現を含む。細胞の文脈における「野生型」または「ｗｔ」または「対照」は、天然に見られる任意の細胞を意味する。野生型または対照細胞の例には、天然に見られる初代膵臓膵島細胞などの初代細胞が含まれる。しかしながら、例として、操作された細胞の文脈で、本明細書で使用する場合、「野生型」または「対照」はまた、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減をもたらす核酸変化を含有し得るが、ＣＤ４７タンパク質の過剰発現をもたらすための遺伝子編集手順を受けなかった操作された細胞を意味し得る。いくつかの実施形態では、野生型細胞または対照細胞は、出発材料である。いくつかの実施形態では、初代細胞株出発材料は、本明細書で想到されるように野生型細胞または対照細胞とみなされる出発材料である。いくつかの実施形態では、出発材料は、他に、操作された細胞を生成するために１つ以上の遺伝子の変化した発現を有するように改変または操作される。いくつかの実施形態では、野生型細胞または対照細胞は、ドナーからの細胞の形態の出発材料である。特定の実施形態では、野生型細胞または対照細胞は、生きている対象もしくは死亡した対象からの臓器または細胞の提供によって得られる細胞、例えば、死体膵臓細胞または腎臓細胞であり得る出発材料である。

【0099】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術は膵島細胞に適用される。

【0100】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術は、初代膵島から単離されたものであっても、初代膵島内の初代膵臓β膵島細胞に由来するものであっても、または初代膵島の成分としても、初代膵臓β膵島細胞に適用される。例えば、初代膵臓β膵島細胞は、単一のβ膵島細胞、β膵島細胞の集団として、または初代膵島の成分（例えば、他の細胞種と共に初代膵島内に存在する初代膵臓β膵島細胞）として、編集され得る。別の例として、初代膵臓β膵島細胞は、単一のβ膵島細胞、β膵島細胞の集団として、または初代膵島の成分（例えば、他の細胞種と共に初代膵島内に存在する初代膵臓β膵島細胞）として、患者に対して投与され得る。膵臓β膵島細胞が他の細胞種と共に膵島内に存在する実施形態では、他の細胞種も本明細書に記載の方法によって編集され得る。

【0101】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術はまた、遺伝子工学などの操作前または操作後に初代膵島から解離された初代膵島細胞にも適用される。このような解離した膵島細胞は、患者に投与する前にクラスター化することができ、クラスターには、β膵島細胞を含む膵島細胞、ならびに限定されないが初代膵島由来のものを含む他の細胞種が含まれ得る。クラスターの膵島細胞の数は、約５０、約１００、約２５０、約５００、約７５０、約１０００、約１２５０、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００、約２７５０、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、または約５０００の細胞など、様々であり得る。患者は、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、または約１０００のクラスターを投与され得る。

【0102】

本明細書で提供される操作された初代細胞は、１つ以上の免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）の発現の変化（例えば、過剰発現または発現の増加）、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の変化（例えば、発現の低減または排除）をもたらす改変（例えば、遺伝子改変）を含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞に存在する改変は、１つ以上の免疫寛容原性因子の細胞表面発現の変化（例えば、増加または過剰発現）、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上数のＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現の変化（例えば、低減または排除）、例えば、細胞表面上の１つ以上の免疫寛容原性因子の増加または過剰発現、ならびに細胞表面上の１つ以上数のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減または場合によっては排除を提供する。提供される態様では、変化した発現は、同じ細胞種の野生型または未改変などの改変を含まない類似の細胞、またはそれ以外は同じであるが、１つ以上の免疫寛容原性因子と１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を変化させる本明細書の改変を欠く細胞と比較したものである。細胞に改変を導入して発現を変化させる例示的な方法を、本明細書に記載する。例えば、遺伝子またはタンパク質の発現を過剰発現または増加させるための様々な方法のいずれかは、例えば、タンパク質（すなわち、導入遺伝子）をコードする外因性ポリヌクレオチドの導入もしくは送達によって、またはＤＮＡターゲティングドメインと遺伝子を標的とする転写活性化因子の融合タンパク質の送達の導入によって、使用することができる。また、阻害性核酸（例えば、ＲＮＡｉ）の導入もしくは送達による非遺伝子編集方法、または標的ヌクレアーゼ系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなど）の導入もしくは送達を伴う遺伝子編集方法を含む、遺伝子またはタンパク質の発現を低減または排除するための様々な方法のいずれかを、使用することもできる。いくつかの実施形態では、発現を低減または排除する方法は、ヌクレアーゼベースの遺伝子編集技術によるものである。

【0103】

いくつかの実施形態では、レアカット（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びホーミングエンドヌクレアーゼシステム）を利用したゲノム編集技術を使用し、ヒト細胞において免疫遺伝子の発現を（例えば、必要不可欠な免疫遺伝子のゲノムＤＮＡを欠失させることによって）低減または排除する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集技術は、ニッカーゼ、塩基編集、プライム編集、及び遺伝子書き込みの使用を含む。特定の実施形態では、ゲノム編集技術または他の遺伝子調節技術を使用し、ヒト細胞において耐性誘導（免疫寛容原性）因子が挿入されて（例えば、ＣＤ４７）、そうして、レシピエント対象への移植時に免疫認識を回避することができる操作された細胞を生成する。したがって、本明細書で提供される操作された初代細胞などの操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ならびにＣＤ４７などの免疫寛容原性因子の発現の調節（例えば、発現の増加または過剰発現）に影響を及ぼす、１つ以上の遺伝子ならびに因子の調節された発現（例えば、発現の低減または排除）を示す。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、レシピエント対象の免疫系を回避する。

【0104】

いくつかの態様では、本明細書で提供される操作された細胞は、自然免疫細胞拒絶反応または適応免疫細胞拒絶反応（例えば、低免疫原性細胞）を受けない。例えば、いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＮＫ細胞媒介性溶解及びマクロファージ貪食の影響を受けない。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、免疫抑制剤をほとんどもしくはまったく必要とすることなくレシピエント対象に移植される、普遍的に適合性の細胞または組織（例えば、普遍的ドナー細胞または組織）の供給源として有用である。このような低免疫原性細胞は、移植時に細胞特異的性質及び特徴を保持する。

【0105】

本開示は、少なくとも部分的に、操作された細胞上の１つ以上の細胞表面抗原に対して、既存の抗体（及び／または操作された細胞を投与された個体における操作された細胞の循環寿命中に発生する抗体）を有する個体への投与に有用な細胞の遺伝子操作に関する、発明者らの発見及び独自の観点に基づいている。このような操作は、操作された細胞に対する個体の免疫応答の誘発を回避するのに役立つ。更に、これらの発見は、患者及び／または治療の選択など、本明細書で提供される追加の開示を裏付ける。

【0106】

本明細書で提供される操作された細胞は更に、免疫寛容原性因子の過剰発現を利用し、１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子（ＭＨＣクラスＩ分子）もしくはその成分、及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（ＭＨＣクラスＩＩ分子）の発現（例えば、表面発現）を調節（例えば、低減または排除）し得る。いくつかの実施形態では、レアカット（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びホーミングエンドヌクレアーゼシステム）を利用したゲノム編集技術を使用し、ヒト細胞において免疫遺伝子の発現を（例えば、必要不可欠な免疫遺伝子のゲノムＤＮＡを欠失させることによって）低減または排除する。特定の実施形態では、ゲノム編集技術または他の遺伝子調節技術を使用し、ヒト細胞において耐性誘導（免疫寛容原性）因子が挿入されて（例えば、ＣＤ４７）、そうして、レシピエント対象への移植時に免疫認識を回避することができる操作された細胞を生成する。したがって、本明細書で提供される操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に影響を及ぼして、レシピエント対象の免疫系を回避する、１つ以上の遺伝子及び因子の調節された発現を示す。場合によっては、細胞はＴ細胞であり、細胞はまた、内因性ＴＣＲ発現を調節（例えば、低減または排除）するように操作される。

【0107】

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、免疫認識を回避することを可能にする特徴を示す。いくつかの実施形態では、提供される操作された細胞は、低免疫原性である。いくつかの態様では、本明細書で提供される操作された細胞は、自然免疫細胞拒絶反応を受けない。例えば、いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＮＫ細胞媒介性溶解及びマクロファージ貪食の影響を受けない。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、免疫抑制剤をほとんどもしくはまったく必要とすることなくレシピエント対象に移植される、普遍的に適合性の細胞または組織（例えば、普遍的ドナー細胞または組織）の供給源として有用である。このような低免疫原性細胞は、移植時に細胞特異的性質及び特徴を保持する。

【0108】

いくつかの態様では、本明細書では、（ｉ）１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させる、ならびに（ｉｉ）１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる、改変を含む、操作された初代細胞が提供され、（ｉ）の発現の増加及び（ｉｉ）の発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子のうちの少なくとも１つは、ＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる改変は、ｂ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減させる改変である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩの発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡの発現を低減させる改変である。いくつかの実施形態では、発現を増加させる改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる改変は、表面発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、血漿細胞または血小板）から選択される。

【0109】

いくつかの態様では、本明細書では、操作された初代細胞などの操作された細胞を生成する方法が提供され、方法は、ａ．細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することと、ｂ．細胞における１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させることと、を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子のうちの少なくとも１つは、ＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる改変は、ｂ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減させる改変である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡの発現を低減させる改変である。いくつかの実施形態では、発現を増加させる改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる改変は、表面発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、血漿細胞または血小板）から選択される。

【0110】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載の操作された初代細胞などの操作された細胞のいずれかを複数含む、操作された初代細胞などの操作された細胞の集団が提供される。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、未変化もしくは未改変の野生型細胞と比較して、Ｂ２Ｍ及び／またはＣＩＩＴＡの発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、本明細書では、組成物（例えば、本明細書に記載の操作された細胞の集団のいずれかの医薬組成物）が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書では、組成物（例えば、本明細書に記載の操作された初代細胞の集団のいずれかの医薬組成物）が提供される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の集団は、操作された初代膵島細胞、操作された初代β膵島細胞、操作された初代Ｔ細胞、操作された初代甲状腺細胞、操作された初代皮膚細胞、操作された初代内皮細胞、及び操作された初代網膜色素上皮細胞からなる群から選択される、操作された初代細胞の集団を含む。

【0111】

本明細書ではまた、ＭＨＣ不適合の同種異系レシピエントにおける免疫拒絶反応を回避する操作された細胞（例えば、操作された初代細胞）を投与することを含む、障害を治療するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれか１つから生成される操作された細胞は、ＭＨＣ不適合の同種異系レシピエントに反復投与された（例えば、移植された（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）または移植された（ｇｒａｆｔｅｄ））ときに免疫拒絶反応を回避する。

【0112】

いくつかの態様では、本明細書では、有効量の本明細書に記載の操作された初代細胞などの操作された細胞の集団のいずれかの集団を患者に投与することを含む、その必要がある患者において疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法が提供される。いくつかの態様では、本明細書では、有効量の本明細書に記載の操作された初代細胞などの操作された細胞の組成物のいずれかを患者に投与することを含む、その必要がある患者において疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法が提供される。いくつかの態様では、本明細書では、有効量の本明細書に記載の操作された初代細胞などの操作された細胞の医薬組成物のいずれかを患者に投与することを含む、その必要がある患者において疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法が提供される。

【0113】

特定の実施形態の実施は、特にそれとは反対の指示がない限り、当業者の技能の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来の方法を用いることになり、これらのうちの多くが例示説明の目的で下記に記載される。このような技法は、文献において完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；ａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；及びＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの刊行物におけるモノグラフを参照されたい。

【0114】

本出願で言及される特許文献、科学記事及びデータベースを含むすべての刊行物は、それぞれの個々の刊行物が参照により個々に開示されているのと同じ程度に、すべての目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願及び他の刊行物に記載の定義に反する、または矛盾する場合、本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれる定義より優先する。

【0115】

本明細書で使用される節の見出しは、単に構成目的のものであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。当業者であれば、いくつかの実施形態が本開示の範囲及び趣旨内で可能であることを認識するだろう。以下の説明は本開示を例示するものであり、当然のことながら、本明細書に記載される本発明の範囲をいかなる形でも限定するものとして解釈されるべきではない。

【0116】

Ｉ．定義
別段定義されない限り、本明細書で使用される当技術分野のすべての用語、表記ならびに他の技術的及び科学的用語または専門用語は、請求される主題が関連する当技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有することが意図されている。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語を、明確にするため及び／または容易に参照できるように本明細書で定義されており、そのような定義を本明細書に含めることは、必ずしも当技術分野で一般に理解されている意味との実質的な違いを表すと解釈されるべきではない。

【0117】

量または濃度などの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される「約」という用語は、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％または０．１％の変動を包含することを意味する。

【0118】

添付の特許請求の範囲を含む、本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。本明細書に記載の態様及び変形は、このような態様及び変形「からなる」及び／または「から本質的になる」実施形態を含むことが理解される。

【0119】

本明細書で使用する場合、「及び／または」という用語には、関連する列挙された項目の１つ以上の任意かつすべての組み合わせが含まれる。

【0120】

本明細書で使用する場合、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関連する「外因性」という用語は、指示対象の分子が目的の細胞に導入されることを意味することが意図される。外因性ポリヌクレオチドなどの外因性分子は、例えば、外因性コーディング核酸を、染色体内への組込みによって、またはプラスミドもしくは発現ベクターなどの非染色体遺伝物質としてなどで、細胞の遺伝物質内に導入することによって導入され得る。したがって、この用語は、コーディング核酸の発現に関して使用する場合、発現可能な形態でのコーディング核酸の細胞への導入を指す。場合によっては、「外因性」分子とは、細胞内に通常は存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞内に導入され得る分子、コンストラクト、因子などである。

【0121】

「内因性」という用語は、天然型または未改変の細胞に存在する、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）もしくはポリペプチドなどの指示対象の分子を指す。例えば、内因性遺伝子の発現に関して使用する場合のこの用語は、細胞内に含まれ、外因的に導入されたのではない内因性核酸によってコードされる遺伝子の発現を指す。

【0122】

「遺伝子」とは、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域（このような制御配列がコード配列及び／または転写された配列に隣接するか否かにかかわらず）を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。遺伝子の配列は通常、細胞中の染色体上の固定された染色体位置または遺伝子座に存在する。

【0123】

「遺伝子座」という用語は、特定の遺伝子または遺伝マーカーが位置する染色体上の固定位置を指す。「標的遺伝子座」への言及は、遺伝子編集または外因性ポリヌクレオチドの組込みなどの遺伝子改変を標的とすることが望ましい、所望の遺伝子の特定の遺伝子座を指す。

【0124】

遺伝子に関連する「発現」または「遺伝子発現」という用語は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）であり得るか、またはｍＲＮＡの翻訳によって作製されるタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって改変されるＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化、及びグリコシル化によって改変されるタンパク質も含まれる。したがって、発現または遺伝子発現への言及には、タンパク質（またはポリペプチド）の発現、またはｍＲＮＡなどの遺伝子の転写可能な産物の発現が含まれる。タンパク質発現には、タンパク質の細胞内発現または表面発現が含まれ得る。通常、ｍＲＮＡまたはタンパク質などの遺伝子産物の発現は、細胞において検出可能なレベルである。

【0125】

本明細書で使用する場合、「検出可能な」発現レベルは、当業者に公知の標準的な技術によって検出可能なレベルを意味し、例えば、ディファレンシャルディスプレイ、ＲＴ（逆転写酵素）共役ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ノーザンブロット、及び／またはＲＮａｓｅ保護分析、ならびにフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットなどのタンパク質検出のための免疫親和性に基づく方法を含む。発現レベルの程度は、標準的な特性評価技術によって視覚化または測定できる程度の大きさであれば十分である。

【0126】

本明細書で使用する場合、「発現の増加」、「発現の促進」または「過剰発現」という用語は、特定の遺伝子発現を調節するための改変を含まない、例えば、野生型の発現レベル（発現がないこと、または測定不能な発現であり得る）の元の細胞またはソース細胞における発現に追加される、任意の発現形態を意味する。本明細書における「発現の増加」、「発現の促進」または「過剰発現」への言及は、遺伝子発現の増加、及び／またはポリペプチドに言及する限り、改変を含まない細胞、例えば、改変を導入するための遺伝子操作を行う前の元のソース細胞、例えば、未改変細胞または野生型細胞におけるレベルと比較して、ポリペプチドレベルの増加及び／またはポリペプチド活性の増加を意味すると解釈される。発現、ポリペプチドレベルまたはポリペプチド活性の増加は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは１００％、またはそれ以上であり得る。場合によっては、発現、ポリペプチドレベルまたはポリペプチド活性の増加は、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍またはそれ以上であり得る。

【0127】

「低免疫原性」という用語は、このような細胞を移植される対象による免疫拒絶反応を受けにくい細胞を指す。例えば、同じ細胞型であるが未変化または未改変の野生型細胞などの改変を含まない同様の細胞と比べて、このような低免疫原性細胞は、このような細胞を移植される対象による免疫拒絶反応を約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれ以上受けにくい可能性がある。通常は、低免疫原性細胞は、対象に対して同種異系であり、低免疫原性細胞は、ＭＨＣ不適合同種異系レシピエントにおける免疫拒絶を回避する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、Ｔ細胞媒介性適応免疫による拒絶反応及び／または自然免疫細胞による拒絶反応から保護される。

【0128】

細胞の低免疫原性は、細胞が適応免疫応答及び自然免疫応答を誘発する能力などの細胞の免疫原性を評価することによって決定することができる。このような免疫応答は、当業者に認識されているアッセイを使用して測定することができる。

【0129】

本明細書で使用する場合、「免疫寛容原性因子」とは、投与、移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）時に、宿主もしくはレシピエント対象の免疫系によって認識される細胞の能力を調節するかもしくはそれに影響を及ぼす、免疫抑制因子または免疫調節因子を含む。通常、免疫寛容原性因子は、操作された初代細胞などの操作された細胞がレシピエントの宿主免疫系によって標的にされないように、例えば、拒絶されないように、操作された初代細胞などの操作された細胞に対する免疫寛容を誘導する因子である。したがって、免疫寛容原性因子は、低免疫因子であり得る。免疫寛容原性因子の例には、免疫細胞抑制受容体（例えば、ＣＤ４７）、免疫細胞抑制受容体に関与するタンパク質、チェックポイント阻害剤、及び自然免疫または適応免疫の認識を低減させる他の分子が含まれる。

【0130】

「減少する」、「低減される」、「低減」及び「減少」という用語はすべて、統計学的に有意な量の減少を一般に意味するように本明細書で使用される。しかしながら、疑義を回避するために、「減少する」、「低減される」、「低減」、「減少」とは、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の減少、または最大１００％かつこれを含む減少（すなわち、参照試料と比較して不在のレベル）、または１０～１００％の任意の減少を意味する。

【0131】

「増加した」、「増加」、または「促進する」もしくは「活性化する」という用語はすべて、本明細書で統計学的に有意な量の増加を一般に意味するように使用される。疑義を避けるために、「増加した」、「増加」、または「促進する」もしくは「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増加、または最大１００％かつこれを含む増加、または１０～１００％の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍～１０倍超の任意の増加を意味する。

【0132】

本明細書で使用する場合、「改変」という用語は、細胞における遺伝子発現に影響を及ぼす、細胞における任意の変更または変化を指す。いくつかの実施形態では、改変は、遺伝子編集、突然変異誘発または外因性ポリヌクレオチドもしくは導入遺伝子の遺伝子操作などによって、細胞のタンパク質産物をコードする遺伝子またはその調節エレメントを直接変更する、遺伝子改変である。

【0133】

本明細書で使用する場合、「インデル」とは、ゲノム中のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、またはこれらの組み合わせからもたらされる変異を指す。したがって、インデルは通常、配列からヌクレオチドを挿入または削除する。当業者であれば理解するように、ゲノム配列のコード領域におけるインデルは、インデルの長さが３の倍数でない限り、フレームシフト変異をもたらすことになる。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用し、標的ポリヌクレオチド配列における任意の長さのインデルを誘導することができる。

【0134】

いくつかの実施形態では、変化は、点変異である。本明細書で使用する場合、「点変異」とは、ヌクレオチドのうちの１つを置き換える置換を指す。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用し、標的ポリヌクレオチド配列における任意の長さのインデルまたは点変異を誘導できる。

【0135】

本明細書で使用する場合、「ノックアウト」とは、標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨げるように、標的ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部分を欠失させることを含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能的ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）において標的ポリヌクレオチド配列におけるインデルを誘導することにより標的ポリヌクレオチド配列を変化させることによって、達成され得る。当業者であれば、本明細書に記載の詳細に基づいて、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをどのように使用して、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部分をノックアウトするかについて容易に理解するであろう。

【0136】

いくつかの実施形態では、変化は、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部分のノックアウトをもたらす。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用した標的ポリヌクレオチド配列またはその一部分のノックアウトは、様々な用途に有用であり得る。例えば、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトを研究目的のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。ｅｘ ｖｉｖｏ目的では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、（例えば、細胞における変異対立遺伝子をｅｘ ｖｉｖｏでノックアウトし、ノックアウトされた変異対立遺伝子を含むそれらの細胞を対象に導入することによって）標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を治療または予防するのに有用であり得る。

【0137】

本明細書における「ノックイン」とは、遺伝子機能を宿主細胞に付加するプロセスを意味する。これは、ノックインされた遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはコードされたタンパク質のレベルの増加を引き起こす。当業者であれば理解するように、これは、遺伝子の１つ以上の追加のコピーを宿主細胞に付加すること、または内因性遺伝子の制御要素を変化させることにより、作製されるタンパク質の発現を増加させることを含めた、いくつかの方式で遂行することができる。これは、プロモーターを改変すること、異なるプロモーターを付加すること、エンハンサーを付加すること、または他の遺伝子発現配列を改変することによって遂行されてもよい。

【0138】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変化または改変は、標的または選択したポリヌクレオチド配列の発現の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変化または改変は、標的または選択したポリペプチド配列の発現の低減をもたらす。

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変化または改変は、標的または選択したポリヌクレオチド配列の発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変化または改変は、標的または選択したポリペプチド配列の発現の増加をもたらす。

【0140】

遺伝子発現の「調節」とは、遺伝子の発現レベルの変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。調節はまた、完全であってもよく（すなわち、遺伝子発現が完全に不活性化されるか、または野生型のレベル以上まで活性化される）、またはそれは部分的であってもよい（遺伝子発現が部分的に低減されるか、または野生型のレベルのある割合まで部分的に活性化される）。

【0141】

「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の構成要素（配列エレメントなど）の並置に関して互換的に使用され、これらの構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、その他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぼす機能を媒介し得るという可能性を許容するように配置される。例示説明として、プロモーターなどの転写制御配列は、その転写制御配列が１つ以上の転写制御因子の存否に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、コード配列に作動的に連結されている。転写制御配列は通常、コード配列とシスで作動的に連結されるが、それに直接的に隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、コード配列に、それらが連続していない場合であっても、作動的に連結されている転写制御配列である。

【0142】

本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって結合された一連のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基のポリマー）を指すために互換的に使用され得、最小の長さに限定されない。このようなポリマーは、天然もしくは非天然のアミノ酸残基、またはこれらの組み合わせを含むことができ、アミノ酸残基のペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、及び多量体を含むがこれらに限定されない。したがって、タンパク質またはポリペプチドには、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）及びアミノ酸類似体を有するものが含まれる。完全長ポリペプチドまたはタンパク質、及びそれらの断片は、この定義に包含される。この用語にはまた、その改変種、例えば、１つ以上の残基の翻訳後修飾、例えば、メチル化、リン酸化、グリコシル化、シアリル化またはアセチル化も含まれる。

【0143】

本開示を通じて、特許請求される主題の様々な態様が、範囲形式で提示される。範囲形式での説明は単に便宜的及び簡潔にするためのものであり、請求される主題の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、すべての可能なサブ範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、値の範囲が提供される場合、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、記載範囲内の任意の具体的に除外される限界値を条件として、本開示内に包含されることが理解される。表示範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値の片方または両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれる。いくつかの実施形態では、特徴に対して２つの対向するオープンエンド範囲が提供され、そのような説明では、それらの２つの範囲の組み合わせが本明細書で提供されることが想定される。例えば、いくつかの実施形態では、特徴は約１０単位より大きいと説明され、（別の文などで）その特徴は約２０単位未満であると説明され、したがって、約１０単位から約２０単位の範囲が本明細書に記載される。

【0144】

本明細書で使用する場合、互換的に使用される用語である「対象」または「個体」は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、「哺乳動物」には、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物及び家畜動物、ならびに動物園動物、スポーツ動物またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、スナネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコ、サルなどが含まれる。いくつかの実施形態では、対象または個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態を有することが知られているか、またはその疑いがある患者である。

【0145】

本明細書で使用する場合、「治療すること」及び「治療」という用語は、対象が疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患の改善、例えば、有益なまたは所望の臨床結果を有するように、有効量の本明細書に記載の細胞を対象に投与することを含む。本技術の目的において、有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減弱、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または一時的緩和、及び寛解（部分的か完全かにかかわらず）が含まれるが、これらに限定されない。治療することは、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することを指し得る。したがって、当業者であれば、治療が病態を改善し得るが、疾患に対する完全な治癒ではない場合があることを認識している。いくつかの実施形態では、疾患または障害の１つ以上の症状は、疾患の治療により少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％緩和される。

【0146】

本技術の目的において、疾患の治療の有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減弱、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または一時的緩和、及び寛解（部分的か完全かにかかわらず）が含まれるが、これらに限定されない。

【0147】

「ベクター」または「コンストラクト」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」及び「遺伝子導入ベクター」とは、目的の遺伝子の発現を導くことができ、遺伝子配列を標的細胞に導入し得る、任意の核酸コンストラクトを意味する。したがって、この用語は、クローニング、及び発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む。ベクターまたはコンストラクトを細胞に導入するための方法は、当業者に公知であり、これには、脂質媒介性導入（すなわち、中性及びカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性導入、及びウイルスベクター媒介性導入が含まれるが、これらに限定されない。

【0148】

ＩＩ．操作された細胞及び細胞を遺伝子操作する方法
本明細書では、１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の発現を調節する改変、例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を調節する改変を含む、操作された初代細胞などの操作された細胞が提供される。

【0149】

いくつかの実施形態では、提供される操作された細胞（例えば、操作された初代細胞）は、１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を調節する（例えば、増加させる）ための改変も含む。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子の発現の調節（例えば、発現の増加）、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の調節（例えば、発現の低減または排除）は、改変（複数可）を含まない細胞における当該分子（複数可）の発現量に対する相対的なものである。いくつかの実施形態では、発現の調節は、野生型細胞における当該分子（複数可）の発現量に対する相対的なものである。いくつかの実施形態では、未改変細胞または野生型細胞は、提供される操作された初代細胞と同じ細胞種の細胞である。いくつかの実施形態では、未改変細胞または野生型細胞は、免疫寛容原性因子、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する。いくつかの実施形態では、未改変細胞または野生型細胞は、１つ以上の免疫寛容原性因子、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない。未改変細胞または免疫寛容原性因子を発現しない野生型細胞が操作された初代細胞を生成するために使用される、いくつかの実施形態では、提供される操作された初代細胞は、１つ以上の免疫寛容原性因子を過剰発現するか、または１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を０％から増加させるための改変を含む。操作前の細胞が検出可能な量の免疫寛容原性因子を発現しない場合、したがって、任意の検出可能な量の免疫寛容原性因子の発現をもたらす改変は、改変を含まない同様の細胞と比較して、発現の増加であることが理解される。

【0150】

いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子の発現の調節（例えば、発現の増加）、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の調節（例えば、発現の低減または排除）は、改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞における当該分子（複数可）の発現量に対する相対的なものである。１つ以上の免疫寛容原性因子を発現しない同じ細胞種の細胞を使用し、操作された初代細胞を生成する、いくつかの実施形態では、提供される操作された初代細胞は、１つ以上の免疫寛容原性因子を過剰発現するか、または１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を０％から増加させるための改変を含む。操作前の細胞が検出可能な量の免疫寛容原性因子を発現しない場合、したがって、任意の検出可能な量の免疫寛容原性因子の発現をもたらす改変は、改変を含まない同様の細胞と比較して、発現の増加であることが理解される。

【0151】

いくつかの実施形態では、提供される操作された細胞（例えば、操作された初代細胞）は、１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるための改変を含む。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ、及びＨ２－Ｍ３（これらの任意の組み合わせを含む）のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００、及びＭｆｇｅ８（これらの任意の組み合わせを含む）のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＣＤ４７の発現の増加であるか、またはＣＤ４７の発現の増加を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＰＤ－Ｌ１の発現の増加であるか、またはＰＤ－Ｌ１の発現の増加を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＨＬＡ－Ｅの発現の増加であるか、またはＨＬＡ－Ｅの発現の増加を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＨＬＡ－Ｇの発現の増加であるか、またはＨＬＡ－Ｇの発現の増加を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、Ｈ２－Ｍ３（ＨＬＡ－Ｇ）、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭｆｇｅ８の発現の増加であるか、またはそれらの発現の増加を含む。

【0152】

いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減する、ゲノム改変などの１つ以上の改変、及びＣＤ４７の発現を増加させる改変を含む。換言すれば、操作された初代細胞などの操作された細胞は、外因性ＣＤ４７タンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現の低減またはサイレンシングを示す。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減する１つ以上のゲノム改変、及びＣＤ４７の発現を増加させる改変を含む。いくつかの事例では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、外因性ＣＤ４７核酸及びタンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現の低減またはサイレンシングを示す。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除する１つ以上のゲノム改変、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除する１つ以上のゲノム改変、及びＣＤ４７の発現を増加させる改変を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、外因性ＣＤ４７タンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現の低減またはサイレンシングを示し、及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低減または欠如を示す。多くの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ細胞である。

【0153】

いくつかの実施形態では、記載される操作された初代細胞などの操作された細胞の集団は、レシピエント対象への投与時にレベルが低減した免疫活性化を誘発するか、または免疫活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象においてレベルが低減した全身性のＴＨ１活性化を誘発するか、または全身性のＴＨ１活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象においてレベルが低減した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の免疫活性化を誘発するか、またはＰＢＭＣの免疫活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象への投与時に細胞に対するレベルが低減したドナー特異的ＩｇＧ抗体を誘発するか、またはドナー特異的ＩｇＧ抗体を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象において細胞に対するレベルが低減したＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生を誘発するか、またはＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象への投与時に、細胞の、レベルが低減した細胞傷害性Ｔ細胞による殺傷を誘発する。

【0154】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作された初代細胞などの操作された細胞は、「自殺遺伝子」または「自殺スイッチ」を含む。自殺遺伝子または自殺スイッチは、操作された初代細胞などの操作された細胞が細胞に投与された後ならびに細胞が望ましくない方法で成長及び分裂する場合など、操作された細胞（例えば、操作された初代細胞）の死を引き起こすことができる「安全スイッチ」として機能するように組み込まれ得る。「自殺遺伝子」による消失アプローチは、特定の化合物によって活性化されたときにのみ細胞殺傷をもたらすタンパク質をコードする、遺伝子導入ベクター内の自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、無毒の化合物を毒性の高い代謝産物へと選択的に変換する、酵素をコードし得る。その結果、その酵素を発現している細胞が特異的に排除される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であり、トリガーは、ガンシクロビルである。他の実施形態では、自殺遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）遺伝子であり、トリガーは、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である（Ｂａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２－１９４３（２０１２）、Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．８：７３－８（１９９８）（いずれも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。

【0155】

他の実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパーゼタンパク質は、アポトーシスを誘導できるカスパーゼタンパク質の少なくとも一部分を含む。好ましい実施形態では、誘導性カスパーゼタンパク質は、ｉＣａｓｐ９である。それは、一続きのアミノ酸を介してヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子につなげられた、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質の配列ＦＫＢＰ１２とＦ３６Ｖ変異を含む。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、低分子二量体化剤であるＡＰＩ ９０３に高い親和性で結合する。したがって、本発明のｉＣａｓｐ９の自殺機能は、二量体誘導化合物（ＣＩＤ）の投与によって発動される。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、低分子薬ＡＰＩ ９０３である。二量体化は、アポトーシスの迅速な誘導を引き起こす（例えば、ＷＯ２０１１１４６８６２、Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６５；１８（２０１１）、Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３－９２４（２００７）を参照されたく、文献のそれぞれは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。

【0156】

安全スイッチまたは自殺遺伝子を組み込むことにより、レシピエントに対する細胞傷害性または他の悪影響が発生した場合に制御された細胞の殺傷が可能となり、免疫寛容原性因子を使用するものを含む、細胞ベースの治療の安全性が向上する。

【0157】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、本明細書に提供される操作された初代細胞などの操作された細胞に導入するなど組み込まれ、例えば、細胞が望ましくない方法で増殖及び分裂するか、または宿主に過剰な毒性を引き起こした場合に、安全スイッチを含む操作された初代細胞などの操作された細胞の死またはアポトーシスを誘導する能力を提供する。したがって、安全スイッチの使用により、ｉｎ ｖｉｖｏで異常細胞を条件によって排除することが可能となり、クリニックにおける細胞療法の適用にとって重要な工程となり得る。安全スイッチ及びその使用は、例えば、Ｄｕｚｇｕｎｅ§，Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１９）；Ｄｕｚｇｕｎｅ§（ｅｄｓ），Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８９５（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）（ＨＳＶ－ｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼについて）、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ４４（１１）：１０１３－１０１９ （２０１６） （ｉＣａｓｐａｓｅ９について）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１８（５）：１２５５－１２６３（２００１）（ｈｕＥＧＦＲについて）、米国特許出願公開第２０１８０００２３９７号（ＨＥＲ１について）、及びＰｈｉｌｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１２４（８）：１２７７－１２８７（２０１４）（ＲＱＲ８について）に記載される。

【0158】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、例えば、薬物もしくはプロドラッグの存在下で、または選択的な外因性化合物による活性化により、制御された方法で細胞死を引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、ラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、及びＲＱＲ８からなる群から選択される。

【0159】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、薬物またはプロドラッグによって活性化されると、例えば、細胞内で非毒性のプロドラッグを有毒な代謝産物に変えることによって、細胞を殺傷する能力を有する生成物をコードする導入遺伝子であり得る。これらの実施形態では、細胞殺傷は、操作された初代細胞などの操作された細胞を薬物またはプロドラッグと接触させることによって活性化される。場合によっては、安全スイッチはＨＳＶ－ｔｋであり、これは、ガンシクロビル（ＧＣＶ）をＧＣＶ三リン酸に変換し、それによってＤＮＡ合成を妨害し、分裂細胞を殺傷する。場合によっては、安全スイッチはＣｙＤまたはその変異体であり、これは、シトシンのウラシルへの加水分解脱アミノ化を触媒することにより、抗真菌薬５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を細胞毒性５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換する。５－ＦＵは更に、細胞酵素によって強力な代謝拮抗物質（５－ＦｄＵＭＰ、５－ＦｄＵＴＰ、５－ＦＵＴＰ）に変換される。これらの化合物は、チミジル酸合成酵素ならびにＲＮＡ及びＤＮＡの産生を阻害し、細胞死をもたらす。場合によっては、安全スイッチはＮＴＲまたはその変異体であり、これは、ニトロ基を増殖細胞及び非増殖細胞中で毒性である反応性Ｎ－ヒドロキシルアミン中間体に還元することを介して、プロドラッグＣＢ１９５４に作用できる。場合によっては、安全スイッチはＰＮＰまたはその変異体であり、これは、プロドラッグ６－メチルプリンデオキシリボシドまたはフルダラビンを増殖細胞及び非増殖細胞の両方に対する毒性代謝産物に変えることができる。場合によっては、安全スイッチは西洋ワサビペルオキシダーゼまたはその変異体であり、これは、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）を触媒して強力な細胞毒に変えることで、細胞を殺傷することができる。

【0160】

いくつかの実施形態では、安全スイッチはｉＣａｓｐ９であってもよい。カスパーゼ９は、生理的条件下で損傷ミトコンドリアからのシトクロムＣの放出によって活性化される、内因性ミトコンドリアアポトーシス経路の構成要素である。次いで、活性化されたカスパーゼ９はカスパーゼ３を活性化し、これは、ターミナルエフェクター分子を誘発してアポトーシスを引き起こす。ｉＣａｓｐ９は、切断型カスパーゼ９（その生理学的二量体化ドメインまたはカスパーゼ活性化ドメインを持たない）を、ペプチドリンカーを介してＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）であるＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖに融合することによって生成することができる。ｉＣａｓｐ９は、低い二量体非依存性基礎活性を有し、宿主細胞（例えば、ヒトＴ細胞）においてその表現型、機能または抗原特異性を損なうことなく安定して発現できる。しかしながら、リミデュシド（ＡＰ１９０３）、ＡＰ２０１８７及びラパマイシンなどの二量体誘導化合物（ＣＩＤ）の存在下では、ｉＣａｓｐ９は二量体誘導化を起こし、下流のカスパーゼ分子を活性化して、ｉＣａｓｐ９を発現する細胞のアポトーシスを引き起こし得る。例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１１／１４６８６２号、Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５；１８（２０１１）、Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １３：９１３－９２４（２００７）を参照のこと。特に、ラパマイシン誘導型カスパーゼ９変異体は、ｒａｐａＣａｓｐ９と称される。Ｓｔａｖｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｔｈｅｒ．２６（５）：１２６６－１２７６（２０１８）を参照のこと。したがって、ｉＣａｓｐ９は、宿主細胞の制御された殺傷を達成するための安全スイッチとして使用できる。

【0161】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは膜発現タンパク質であってもよく、これは、そのタンパク質に対する特異的抗体の投与後の細胞枯渇を可能にする。このカテゴリーの安全スイッチには、例えば、その表面発現のためにＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡまたはＲＱＲ８をコードする１つ以上の導入遺伝子が含まれ得る。これらのタンパク質は、特異的抗体によって標的化され得る、表面エピトープを有し得る。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＣＲ４抗体によって認識され得る、ＣＣＲ４を含む。適切な抗ＣＣＲ４抗体の非限定的な例としては、モガムリズマブ及びそのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＤ１６抗体または抗ＣＤ３０抗体によって認識され得る、ＣＤ１６またはＣＤ３０を含む。このような抗ＣＤ１６抗体または抗ＣＤ３０抗体の非限定的な例としては、ＡＦＭ１３及びそのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＤ１９抗体によって認識され得る、ＣＤ１９を含む。このような抗ＣＤ１９抗体の非限定的な例としては、ＭＯＲ２０８及びそのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＤ２０抗体によって認識され得る、ＣＤ２０を含む。このような抗ＣＤ２０抗体の非限定的な例としては、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＩＩｂ、及びこれらのバイオシミラーが挙げられる。したがって、安全スイッチを発現する細胞はＣＤ２０陽性であり、記載されているように抗ＣＤ２０抗体の投与によって殺傷の標的となり得る。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＥＧＦＲ抗体によって認識され得る、ＥＧＦＲを含む。このような抗ＥＧＦＲ抗体の非限定的な例としては、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びこれらのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＧＤ２抗体によって認識され得る、ＧＤ２を含む。このような抗ＧＤ２抗体の非限定的な例としては、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＩＩｃ、及びこれらのバイオシミラーが挙げられる。

【0162】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、操作された初代細胞などの操作された細胞の表面上の１つ以上の免疫寛容原性因子を認識する、外因的に投与される薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、外因的に投与される薬剤は、免疫寛容原性剤に対する抗体または免疫寛容原性剤に特異的な抗体、例えば、抗ＣＤ４７抗体である。操作された初代細胞などの操作された細胞上の免疫寛容原性因子を認識してブロックすることによって、外因的に投与される抗体は、免疫寛容原性因子の免疫阻害機能をブロックし、それによって、操作された初代細胞などの操作された細胞に対する免疫系を再感作することができる。例えば、ＣＤ４７を過剰発現する操作された初代細胞などの操作された細胞の場合、外因的に投与される抗ＣＤ４７抗体は対象に投与され、その結果、操作された初代細胞などの操作された細胞上のＣＤ４７がマスキングされ、操作された初代細胞に対する免疫応答が誘発され得る。

【0163】

いくつかの実施形態では、方法は、誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターを細胞に導入することを更に含む。

【0164】

いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子はＣＤ４７であり、細胞は、ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを発現する。

【0165】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、その必要がある対象にＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤を投与することを含み、対象は、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを発現するように操作された細胞集団が予め投与されていた。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＣＤ４７結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ヒト抗体の断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＴＴＩ－６２１、ＴＴＩ－６２２、及びＡＬＸ１４８からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＴＴＩ－６２１、ＴＴＩ－６２２、及びＡＬＸ１４８である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＴＴＩ－６２２である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＡＬＸ１４８である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＭＩＡＰ４１０、Ｂ６Ｈ１２、及びマグロリマブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＭＩＡＰ４１０である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｂ６Ｈ１２である。いくつかの実施形態では、抗体は、マグロリマブである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＡＯ－１７６、ＩＢＩ１８８（レタプリマブ）、ＳＴＩ－６６４３、及びＺＬ－１２０１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＢＩ１８８（レタプリマブ）（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＳＴＩ－６６４３（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＺＬ－１２０１（Ｚａｉ）である。

【0166】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する有用な抗体またはその断片は、マグロリマブ（（Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４））（Ｆｏｒｔｙ Ｓｅｖｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２（Ｃｅｌｇｅｎｅ；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＩＢＩ－１８８（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＩＢＩ－３２２（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＴＧ－１８０１（ＴＧ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；ＮＩ－１７０１としても公知、Ｎｏｖｉｍｍｕｎｅ ＳＡ）、ＡＬＸ１４８（ＡＬＸ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＪ０１１１３３（ＴＪＣ４としても公知、Ｉ－Ｍａｂ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ－１２０１（Ｚａｉ Ｌａｂ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、ＡＫ１１７（Ａｋｅｓｂｉｏ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ， Ｌｔｄ．）、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＳＲＦ２３１（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＧｅｎＳｃｉ－０５９ （ＧｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）、Ｃ４７Ｂ１５７ （Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ１６１（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ１６７（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ２２２（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ２２７（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｖｘ－１００４（Ｃｏｒｖｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＨＭＢＤ００４（Ｈｕｍｍｉｎｇｂｉｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｔｅ Ｌｔｄ）、ＳＨＲ－１６０３（Ｈｅｎｇｒｕｉ）、ＡＭＭＳ４－Ｇ４（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＲＴＸ－ＣＤ４７（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）、及びＩＭＣ－００２ （Ｓａｍｓｕｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ；ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｉａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を含む群から選択することができる。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＤ４７結合に関して、マグロリマブ、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２、ＩＢＩ－１８８、ＩＢＩ－３２２、ＴＧ－１８０１（ＮＩ－１７０１）、ＡＬＸ１４８、ＴＪ０１１１３３、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ１２０１、ＡＫ１１７、ＡＯ－１７６、ＳＲＦ２３１、ＧｅｎＳｃｉ－０５９、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２７、Ｖｘ－１００４、ＨＭＢＤ００４、ＳＨＲ－１６０３、ＡＭＭＳ４－Ｇ４、ＲＴＸ－ＣＤ４７、及びＩＭＣ－００２を含む群から選択される抗体と競合しない。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＤ４７結合に関して、マグロリマブ、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２、ＩＢＩ－１８８、ＩＢＩ－３２２、ＴＧ－１８０１（ＮＩ－１７０１）、ＡＬＸ１４８、ＴＪ０１１１３３、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ１２０１、ＡＫ１１７、ＡＯ－１７６、ＳＲＦ２３１、ＧｅｎＳｃｉ－０５９、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２７、Ｖｘ－１００４、ＨＭＢＤ００４、ＳＨＲ－１６０３、ＡＭＭＳ４－Ｇ４、ＲＴＸ－ＣＤ４７、及びＩＭＣ－００２から選択される抗体と競合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する抗体またはその断片は、ＣＤ４７に対する単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ＣＤ４７に対するＦａｂ、ＣＤ４７に対するＶＨＨナノボディ、ＣＤ４７に対するＤＡＲＰｉｎ、及びこれらの変異体を含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に対するｓｃＦｖ、ＣＤ４７に対するＦａｂ、及びこれらの変異体は、マグロリマブ、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２、ＩＢＩ－１８８、ＩＢＩ－３２２、ＴＧ－１８０１（ＮＩ－１７０１）、ＡＬＸ１４８、ＴＪ０１１１３３、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ１２０１、ＡＫ１１７、ＡＯ－１７６、ＳＲＦ２３１、ＧｅｎＳｃｉ－０５９、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２７、Ｖｘ－１００４、ＨＭＢＤ００４、ＳＨＲ－１６０３、ＡＭＭＳ４－Ｇ４、ＲＴＸ－ＣＤ４７、及びＩＭＣ－００２を含む群から選択される抗体のいずれかの抗原結合ドメインに基づく。

【0167】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７アンタゴニストは、ＣＤ４７遮断を提供する。ＣＤ４７遮断のための方法及び薬剤は、ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０５４３２６に記載されており、これは、その全体が参照により組み込まれる。

【0168】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、１つ以上の所望の改変をすでに含む、ソース細胞に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される教示を考慮すると、当業者であれば、操作された初代細胞などの操作された細胞の所望の最終形態に到達するためにどのような改変が必要かをいかに評価するか、及び標的要素のレベルの低減または増加がすべてアクティブな遺伝子操作によって達成されるわけではないことを容易に認識するであろう。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の改変は任意の順序であってもよく、必ずしも本明細書に提供される説明文に列挙された順序である必要はない。

【0169】

ひとたび変化されると、本明細書に記載の分子のうちのいずれかの発現の存在について、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、フローサイトメトリーなどの既知の技法を使用してアッセイすることができる。

【0170】

Ａ．遺伝子発現が低減している標的
いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、ＴＸＩＰ、ＣＴＬＡ－４及び／またはＰＤ－１のうちの１つ以上の発現を調節する（例えば、低減または排除する）、１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列（互換的に標的遺伝子とも称される）の改変（例えば、遺伝子改変）を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を調節する（例えば、低減または排除する）１つ以上の遺伝子の改変を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及び／またはＨＬＡ－ＤＲのうちのいずれか１つ以上である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子に対する改変は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、またはＮＦＹ－Ｃのうちのいずれか１つ以上を低減または排除する改変である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、ＴＸＩＰ、ＣＴＬＡ－４及び／またはＰＤ－１のうちの１つ以上の発現を低減または排除する改変を有する。様々な公知の遺伝子編集技術のいずれかを含む、当業者に公知の様々な方法のいずれかを使用し、任意のそのような標的遺伝子の発現を低減または排除することができる。

【0171】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの提供される操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかの発現を調節する（例えば、低減または排除する）、１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列（互換的に標的遺伝子とも称される）の改変（例えば、遺伝子改変）を含む。いくつかの実施形態では、改変または操作された初代細胞は、１つ以上の改変が以前に導入されていない未改変細胞、または未操作の初代細胞などの未操作の細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムを使用し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかの発現を調節する（例えば、低減または排除する）、１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列を改変する。特定の実施形態では、細胞のゲノムは、細胞の表面上の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現などのＨＬＡ発現を容易にする際に必要とされるもしくはそれに関与する、構成要素を低減または欠失するように変化されている。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の構成要素であるβ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現が細胞内で低減または排除され、それによって、操作された細胞による１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現（例えば、細胞表面発現）が低減または排除される。したがって、いくつかの実施形態では、発現は、遺伝子及び／またはその機能、ＲＮＡの発現及び機能、タンパク質の発現及び機能、局在（細胞表面発現など）、ならびに寿命を介して低減させることができる。

【0172】

いくつかの実施形態では、ヒトにおけるＭＨＣは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。例えば、ヒトＭＨＣクラスＩはＨＬＡクラスＩとしても公知であり、ヒトＭＨＣクラスＩＩはＨＬＡクラスＩＩとしても公知である。したがって、特に明記しない限り、ＭＨＣへの言及には、対応するヒトＨＬＡ分子を含むことが意図される。

【0173】

いくつかの実施形態では、標的の発現の低減は、操作された細胞での発現が、標的の発現を低減させるように操作する前のソース細胞の標的の対応する発現（例えば、タンパク質の発現と比較したタンパク質の発現）のレベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下のいずれかなど）のレベルまで低減されるようなものである。いくつかの実施形態では、標的の発現の低減は、操作された細胞での発現が、参照細胞または参照細胞集団（同じ細胞種の細胞もしくは集団、または免疫原性応答が低減もしくは排除されている細胞など）での標的の対応する発現（例えば、タンパク質の発現と比較したタンパク質の発現）のレベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下のいずれかなど）のレベルまで低減されるようなものである。いくつかの実施形態では、標的の発現の低減は、操作された細胞での発現が、測定した発現レベル（標的の存在により、免疫原性応答が低減または排除されているとわかっているレベルなど）以下のレベルまで低減するような低減である。いくつかの実施形態では、標的のレベルは、刺激状態または未刺激状態の操作された細胞、参照細胞、または参照細胞集団において評価される。いくつかの実施形態では、標的のレベルは、標的が発現されるように（または、それが刺激に応答する細胞の能力の場合、発現していくように）、刺激状態の操作された細胞、参照細胞または参照細胞集団で評価する。いくつかの実施形態では、刺激は、ｉｎ ｖｉｖｏでの刺激を表す。

【0174】

いくつかの実施形態では、提供される操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかの発現を調節する（例えば、低減または排除する）、１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列（互換的に標的遺伝子とも称される）の遺伝子改変などの改変を含む。いくつかの実施形態では、ヒトにおけるＭＨＣは、ヒト白血球抗原とも称される。例えば、ヒトＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡクラスＩ分子としても公知であり、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子はＨＬＡクラスＩＩ分子としても公知である。いくつかの実施形態では、改変または操作された細胞は、１つ以上の改変が以前に導入されていない未改変細胞または未操作の細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムを使用し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかの発現を調節する、１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列を改変する。特定の実施形態では、細胞のゲノムは、細胞の表面上の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現などのＨＬＡ発現を容易にする際に必要とされるもしくはそれに関与する、構成要素を低減または欠失するように変化されている。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の構成要素であるβ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現が細胞内で低減または排除され、それによって、操作された細胞による１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現（例えば、細胞表面発現）が低減または排除される。

【0175】

いくつかの実施形態では、操作された細胞における１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現を調節する（例えば、低減または排除する）、操作された細胞における記載された改変のいずれかは、第Ｉ．Ｂ節に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＣＤ４７などの免疫寛容原性因子）を過剰発現する１つ以上の改変と組み合わせることができる。

【0176】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減は、例えば、以下：（１）多型のＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子遺伝子を直接標的化すること、（２）Ｂ２Ｍの除去（これにより、すべてのＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送を低減する）、及び／または（３）ＭＨＣエンハンセオソームの構成要素、例えば、ＨＬＡ発現に不可欠であるＬＲＣ５、ＲＦＸ－５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＩＲＦｌ、ＮＦ－Ｙ（ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃを含む）及びＣＩＩＴＡのうちの１つ以上の欠失のうちの１つ以上によって実現できる。

【0177】

特定の実施形態では、ＨＬＡ発現は妨害されている。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現は、個々のＨＬＡを標的化すること（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／またはＨＬＡ－Ｃの発現をノックアウトすること）、ＨＬＡ発現の転写レギュレーターを標的化すること（例えば、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ及び／またはＩＲＦ－１の発現をノックアウトすること）、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送を遮断すること（例えば、Ｂ２Ｍ及び／またはＴＡＰ１の発現をノックアウトすること）、及び／またはＨＬＡ－Ｒａｚｏｒで標的化すること（例えば、ＷＯ２０１６１８３０４１を参照されたい）によって妨害される。

【0178】

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体は、ヒトＭＨＣと同義である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作された細胞は、ヒト細胞である。特定の態様では、本明細書に開示される操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に対応する１つ以上のヒト白血球抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／またはＨＬＡ－Ｃ）を発現せず、したがって、低免疫原性であることを特徴とする。例えば、特定の態様では、本明細書に開示される操作された細胞は、細胞が以下のＭＨＣクラスＩ分子：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上を発現しないか、またはその発現の低減を示すように改変されている。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上は、細胞から「ノックアウト」され得る。ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子及び／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子がノックアウトされた細胞は、ノックアウトされた各遺伝子の発現の低減または排除を示し得る。

【0179】

特定の実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、連続した一続きのゲノムＤＮＡを標的化して欠失させ、それによって、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５からなる群から選択される標的遺伝子の発現が低減または排除されることによって調節される。

【0180】

いくつかの実施形態では、提供される操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩを調節する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の遺伝子改変などの改変を含む。１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減するための例示的な方法は、以下の節に記載されている。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍ及びＮＬＲＣ５のうちの一方または両方である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。

【0181】

いくつかの実施形態では、提供される操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を調節する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の遺伝子改変などの改変を含む。１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減するための例示的な方法は、以下の節に記載されている。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。

【0182】

いくつかの実施形態では、提供される操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を調節する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の遺伝子改変などの改変を含む。１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減するための例示的な方法は、以下の節に記載されている。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子及びＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。特定の実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子及びＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５の発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現を低減させる。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、約５％を超えて低減し、例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上のいずれかを超えて低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現は、最大約１００％低減し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％、最大約５％またはそれ未満のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現は、排除される（例えば、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡの発現は０％）。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５遺伝子活性を排除する。

【0184】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５の発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のタンパク質発現を低減させる。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のタンパク質発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のタンパク質発現は、約５％を超えて低減し、例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上のいずれかを超えて低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のタンパク質発現は、最大約１００％低減し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％、最大約５％またはそれ未満のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のタンパク質発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のタンパク質発現は、排除される（例えば、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のタンパク質の発現は０％）。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のタンパク質発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５遺伝子活性を排除する。

【0185】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５遺伝子の一方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0186】

いくつかの実施形態では、改変は、細胞における１つ以上のＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５コード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞におけるすべてのＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５コード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５遺伝子中のインデルを含む不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５遺伝子は、ノックアウトされる。

【0187】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子またはその成分の発現の低減を含み、低減は、本明細書に記載されているように、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子またはその成分の発現を低減させるように操作する前、参照細胞もしくは参照細胞集団（免疫原性応答が所望どおりに欠失している細胞など）、または測定値に対するようなものである。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチド、またはその成分（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現を低減させるように操作される。いくつかの実施形態では、操作された細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面提示を低減させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現は、参照細胞または参照細胞集団上での１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現レベル（１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現の平均量など）の約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面提示は見られない（公知の技法、例えば、フローサイトメトリーを用いて測定した場合を含む、検出可能な細胞表面発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現を低減させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現を低減させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）のレベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現を示さない（公知の技法、例えば、ウェスタンブロットまたは質量分析法を用いて測定した場合を含む、検出可能なタンパク質発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）を含まない（公知の技法、例えば、ウェスタンブロットまたは質量分析法を用いて測定した場合を含む、検出可能なタンパク質が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）をコードするｍＲＮＡ発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）をコードするｍＲＮＡ発現は、１つ以上のＭＨＣポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）のｍＲＮＡ発現を低減させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）をコードするｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分（Ｂ２Ｍなど）をコードするｍＲＮＡ発現は、参照細胞または参照細胞集団のｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分をコードするｍＲＮＡを発現しない（公知の技法、例えば、配列決定法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含む、検出可能なｍＲＮＡ発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはその成分をコードするｍＲＮＡを含まない（公知の技法、例えば、配列決定法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含む、検出可能なｍＲＮＡが見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子遺伝子の遺伝子不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、両方の対立遺伝子の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子遺伝子の遺伝子不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、すべての対立遺伝子の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子遺伝子の遺伝子不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子ノックアウト、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子成分（例えば、Ｂ２Ｍ）ノックアウトである。

【0188】

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減を含み、低減は、本明細書に記載されているように、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるように操作する前、参照細胞もしくは参照細胞集団（免疫原性応答が所望どおりに欠失している細胞など）、または測定値に対するようなものである。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの細胞表面発現を低減させるように操作される。いくつかの実施形態では、操作された細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの細胞表面発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの細胞表面提示を低減させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの細胞表面発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの細胞表面発現は、参照細胞または参照細胞集団上での１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの細胞表面発現レベル（１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの細胞表面発現の平均量など）の約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの細胞表面提示は見られない（公知の技法、例えば、フローサイトメトリーを用いて測定した場合を含む、検出可能な細胞表面発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドのタンパク質発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドのタンパク質発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドのタンパク質発現を低減させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドのタンパク質発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞上でのＭＨＣクラスＩＩポリペプチドのタンパク質発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドのタンパク質発現を低減させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドのレベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドのタンパク質発現を示さない（公知の技法、例えば、ウェスタンブロットまたは質量分析法を用いて測定した場合を含む、検出可能なタンパク質発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドを含まない（公知の技法、例えば、ウェスタンブロットまたは質量分析法を用いて測定した場合を含む、検出可能なタンパク質が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドをコードするｍＲＮＡ発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドをコードするｍＲＮＡ発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドのｍＲＮＡ発現を低減させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドをコードするｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドをコードするｍＲＮＡ発現は、参照細胞または参照細胞集団のｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低減される。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現しない（公知の技法、例えば、配列決定法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含む、検出可能なｍＲＮＡ発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含まない（公知の技法、例えば、配列決定法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含む、検出可能なｍＲＮＡが見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子遺伝子の遺伝子不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、両方の対立遺伝子の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子遺伝子の遺伝子不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、すべての対立遺伝子の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の遺伝子不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子ノックアウトである。

【0189】

１．発現を低減させる方法
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、記載されるような１つ以上の標的ポリヌクレオチドの発現を低減させるように、遺伝子改変など改変されている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現を低減させる（例えば、排除する）ために１つ以上の改変により操作される細胞は、本明細書に記載される任意のソース細胞である。いくつかの実施形態では、ソース細胞は、本明細書に記載される任意の細胞である。特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞（例えば、初代細胞）は、１つ以上の標的ポリヌクレオチドの発現を低減させるような、遺伝子改変などの１つ以上の改変を含む。１つ以上の標的ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、上記のいずれか、例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子またはその成分、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＬＲＣ５、ＲＦＸ－ＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸ－ＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ１及びＴＡＰ１が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的ポリヌクレオチドの発現を低減させるための遺伝子改変などの１つ以上の改変は、本明細書に記載されるいずれかなどの所望の導入遺伝子の発現を増加させるための１つ以上の改変と組み合わされる。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾などの１つ以上の改変は、免疫特権細胞または低免疫原性細胞である操作された細胞を作製する。１つ以上の標的ポリヌクレオチドの発現を調節すること（例えば、低減するまたは欠失させること）によって、このような細胞は、レシピエント対象に移植されたときに減少した免疫活性化を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、投与時にレシピエント対象または患者において低免疫原性とみなされる。

【0190】

標的ポリヌクレオチドの発現を低減させるための任意の方法を、使用できる。いくつかの実施形態では、改変（例えば、遺伝子改変）は、標的ポリヌクレオチドの発現の永久的な排除または低減をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、標的化エンドヌクレアーゼを使用することなどにより、標的ポリヌクレオチドにＤＮＡ切断を導入することによって破壊される。他の実施形態では、改変（例えば、遺伝子改変）は、標的ポリヌクレオチドの発現の一過性の低減をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子抑制は、例えば、アンチセンス技法を使用して、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）及び／またはリボザイムによって、標的ポリヌクレオチドに相補的である阻害性核酸を使用して遺伝子の発現を選択的に抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）または抑制（ｒｅｐｒｅｓｓ）することで達成される。

【0191】

いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物ゲノム配列である。

【0192】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術のうちのいずれかを使用し、記載したような１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたは標的タンパク質の発現を低減することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術には、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、リコンビナーゼを含む系が含まれ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、遺伝子のノックアウトまたはノックダウンに使用することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、ゲノム領域へのＤＮＡのノックインまたは組込みに使用することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、一本鎖切断（ＳＳＢ）を媒介する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同配向型修復（ＨＤＲ）と関連するものを含む、二本鎖切断（ＤＳＢ）を媒介する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、ＤＮＡベースの編集またはプライム編集を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、部位特異的ターゲティングエレメントを介したプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）を含むことができる。

【0193】

いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、通常は標的化された様態での、遺伝子における１つ以上の二本鎖切断及び／または１つ以上の一本鎖切断の誘導によって実施される。いくつかの実施形態では、二本鎖または一本鎖切断は、遺伝子標的化ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼによって作製される。いくつかの実施形態では、標的化ヌクレアーゼは、遺伝子の配列またはその一部分に標的化されるように特異的に設計された、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択される。いくつかの実施形態では、標的化ヌクレアーゼは、二本鎖または一本鎖切断を生じさせ、その後、エラープローンな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または場合によっては、鋳型が使用される正確な相同性指向修復（ＨＤＲ）を介して修復を受ける。いくつかの実施形態では、標的化ヌクレアーゼは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。いくつかの実施形態では、切断を生成及び修復するプロセスは典型的には、エラープローンであり、ＮＨＥＪによる修復から、ＤＮＡ塩基の挿入及び欠失（インデル）をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、標的遺伝子のヌクレオチド配列の欠失、挿入または変異を誘導し得る。場合によっては、遺伝子改変により、フレームシフト変異が発生し得、その結果、未成熟終止コドンが生じ得る。ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集の例では、標的化編集は、遺伝子の両方の対立遺伝子で生じ、その結果、遺伝子の両対立遺伝子の破壊または編集が行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子のすべての対立遺伝子は、遺伝子編集の標的となる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用するなどした、標的化ヌクレアーゼによる遺伝子改変は、遺伝子の完全なノックアウトをもたらす。

【0194】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ、例えば、レアカットエンドヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入される。ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼをコードする核酸の形態で細胞に導入され得る。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技法によって達成され得る。好適な技法には、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞に導入される核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で細胞に導入される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの場合、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）が細胞に導入され得る。

【0195】

いくつかの実施形態では、改変（例えば、遺伝子改変）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変化させることができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが使用され得る。このようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、様々なＣａｓタンパク質を用いることができる（Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００５；１（６）ｅ６０）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変化させることを可能にする、このようなＣａｓタンパク質の分子機構には、ＲＮＡ結合タンパク質、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ならびにポリメラーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ Ｉ型システムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型システムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ Ｖ型システムである。

【0196】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、細胞における任意の標的ポリヌクレオチド配列を変化させるために使用され得る標的化システムが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くと共にそれにハイブリダイズすることができる、１つ以上の、例えば、少なくとも１～２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））を含む。

【0197】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの事例では、置換及び／または改変は、タンパク質分解を防止または低減し、及び／または細胞内のポリペプチドの半減期を延長し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合の置き換え（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、代替のアミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、部位（例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、エンドキャッピングなど）を含めるような改変を含み得る。

【0198】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例となるＣａｓコアタンパク質には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、及びＣａｓ１３が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、大腸菌サブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ２）を含む。大腸菌サブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、及びＣａｓ５ｅが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＹｐｅｓｔサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ３）を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、及びＣｓｙ４が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮｍｅｎｉサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ４）を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｎ１及びＣｓｎ２が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＤｖｕｌｇサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ１）を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例となるＣａｓタンパク質は、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、及びＣａｓ５ｄが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＴｎｅａｐサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ７）を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃａｓ５ｔが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、及びＣａｓ５ｈが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡｐｅｒｎサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ５）を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、及びＣａｓ５ａが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＭｔｕｂｅサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ６）を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、及びＣｓｍ５が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例となるＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質には、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、及びＣｍｒ６が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｋｌｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５７１，２１９－２２５（２０１９）、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６５，４８－５３（２０１９）を参照されたい。

【0199】

いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子をノックアウト、ノックダウン、または別様に改変するように細胞を遺伝子改変するための方法は、当技術分野で既知の、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムを含めた部位特異的ヌクレアーゼを使用することを含む。

【0200】

ＺＦＮは、細菌ＦｏｋＩ制限酵素のエンドヌクレアーゼドメインに結合したジンクフィンガー含有転写因子から適応された数々の部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む、融合タンパク質である。ＺＦＮは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多く）のＤＮＡ結合ドメインまたはジンクフィンガードメインを有してもよい。例えば、Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（２０１１）１８８：７７３－７８２、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１１５６－１１６０を参照されたい。各ジンクフィンガードメインは、１つ以上の亜鉛イオンによって安定化された小さなタンパク質の構造モチーフであり、通常、３～４ｂｐのＤＮＡ配列を認識する。したがって、タンデムドメインは、細胞のゲノム内で固有である長いヌクレオチド配列に結合する可能性があり得る。

【0201】

特異性が知られている種々のジンクフィンガーを組み合わせて、約６、９、１２、１５、または１８ｂｐの配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを生み出すことができる。ファジーディスプレイ、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッド及びツーハイブリッドシステム、ならびに哺乳動物細胞を含む、特定の配列を認識するジンクフィンガー（及びこれらの組み合わせ）を生成するための種々の選択及びモジュール式組立て技法が利用可能である。ジンクフィンガーは、既定の核酸配列に結合するように操作され得る。既定の核酸配列に結合するようにジンクフィンガーを操作するための基準は、当技術分野で既知である。例えば、Ｓｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：７０７４－７０８１、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２００８）２４：１８５０－１８５７を参照されたい。

【0202】

ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたは他の二量体ヌクレアーゼドメインを含有するＺＦＮは、二量体として機能する。したがって、非回文型ＤＮＡ部位を標的とするためにＺＦＮの対が必要とされる。２つの個々のＺＦＮは、それらのヌクレアーゼが適切に離間した状態でＤＮＡのそれぞれ反対の鎖に結合しなければならない。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５：１０５７０－１０５７５を参照されたい。ゲノム内の特定の部位を切断するために、ＺＦＮの対は、一方が順方向鎖上、他方が逆方向鎖上で、当該部位の両側に位置する２つの配列を認識するように設計される。ＺＦＮが当該部位のそれぞれの側で結合すると、ヌクレアーゼドメインは二量体化し、当該部位にてＤＮＡを切断して、５’オーバーハングを伴うＤＳＢを生じさせる。次いでＨＤＲを使用して、相同性アームが両側に位置する所望の変異を含有する修復鋳型の一助により、特定の変異を誘導できる。修復鋳型は通常、細胞に導入される外因性二本鎖ＤＮＡベクターである。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３－１４８、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：７３１－７３４を参照されたい。

【0203】

ＴＡＬＥＮは、標的遺伝子を編集するために使用され得る人工ヌクレアーゼの別の例である。ＴＡＬＥＮは、長いＤＮＡ配列に結合し、それを認識する１０～３０のリピートを有するタンデムアレイを通常含む、ＴＡＬＥリピートと呼ばれるＤＮＡ結合ドメインに由来する。各リピートは、３３～３５アミノ酸長であり、このうち２つの隣接するアミノ酸（反復可変性二残基（ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ）またはＲＶＤと呼ばれる）が４つのＤＮＡ塩基対のうちの１つに対する特異性を付与する。故に、標的ＤＮＡ配列においてリピートと塩基対との間に１対１の対応関係が存在する。

【0204】

ＴＡＬＥＮは、１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多く）をヌクレアーゼドメイン、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインに融合することによって人工的に生産される。Ｚｈａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４９－１５３を参照されたい。ＴＡＬＥＮにおける使用に向けてＦｏｋＩに対するいくつかの変異が作製されており、これらは、例えば、切断特異性または活性を改善する。Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１１）３９：ｅ８２；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４３－１４８；Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：７３１－７３４、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１）３３３：３０７；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）８：７４－７９、Ｓｚｃｚｅｐｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００７）２５：７８６－７９３、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１０）２００：９６を参照されたい。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能するため、適切な向き及び間隔での、標的ゲノム内の部位に対する固有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つのコンストラクトを必要とする。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとの間のアミノ酸残基の数、及び２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基の数の両方が、高レベルの活性を達成するために重要なパラメータであるようである。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４３－１４８。

【0205】

操作されたＴＡＬＥリピートをヌクレアーゼドメインと組み合わせることによって、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な部位特異的ヌクレアーゼを生産することができる。ＺＦＮに類似して、ＴＡＬＥＮを細胞に導入して、ゲノム内の所望の標的部位にてＤＳＢを生じさせることができるため、これを使用して、類似のＨＤＲ媒介性経路で遺伝子をノックアウトまたは変異をノックインすることができる。Ｂｏｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１３５－１３６、Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６：１５０９－１５１２、Ｍｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６：３５０１を参照されたい。

【0206】

メガヌクレアーゼは、大きなＤＮＡ配列（１４～４０塩基対）を認識し切断する能力が特徴的な、エンドヌクレアーゼファミリーにおける酵素である。メガヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性及び／またはＤＮＡ認識に影響を及ぼすそれらの構造的モチーフに基づいてファミリーにグループ化される。最も広くかつ最もよく知られているメガヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーにおけるタンパク質であり、それらの名称は保存されたアミノ酸配列に由来する。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照されたい。一方、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリーメンバーは、７０～１００残基長であるＧＩＹ－ＹＩＧモジュールを有し、４つの不変残基を有する４または５つの保存配列モチーフを含み、そのうち２つは、活性に必要とされる。Ｖａｎ Ｒｏｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．（２００２）９：８０６－８１１を参照されたい。Ｈｉｓ－Ｃｙｓファミリーメガヌクレアーゼは、数百のアミノ酸残基を包含する領域にわたる高度に保存された一連のヒスチジン及びシステインによって特性化される。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照されたい。ＮＨＮファミリーのメンバーは、アスパラギン残基によって囲まれた２対の保存されたヒスチジンを含有するモチーフによって定義される。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照されたい。

【0207】

特定の標的ＤＮＡ配列のための天然メガヌクレアーゼを同定するための可能性は、高い特異性が必要であるため低いので、変異誘発及びハイスループットスクリーニング法を含む様々な方法が、独自の配列を認識するメガヌクレアーゼ変異体を生成するために使用されてきた。例えば、既定の核酸配列に結合するように変化したＤＮＡ結合特異性を有するメガヌクレアーゼを操作するためのストラテジーが当技術分野で知られている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．（２００２）１０：８９５－９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００３）３１：２９５２－２９６２、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００６）３６１：７４４－７５４、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００２）３０：３８７０－３８７９、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００４）３４２：３１－４１、Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（２００６）１２８：２４７７－２４８４、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ（２００９）２２：２４９－２５６、Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００６）３５５：４４３－４５８、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００６）３６３（２）：２８３－２９４を参照されたい。

【0208】

ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮのように、メガヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡにおけるＤＳＢを生成し得、これは、例えば、ＮＨＥＪを介して、不適切に修復された場合にフレームシフト変異を生成し、細胞における標的遺伝子の発現の減少をもたらし得る。代替的には、外来ＤＮＡは、メガヌクレアーゼと共に細胞に導入され得る。外来ＤＮＡの配列及び染色体配列に応じて、このプロセスは、標的遺伝子を改変するために使用され得る。Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１１）１１：１１－２７を参照されたい。

【0209】

トランスポザーゼは、トランスポゾンの末端に結合し、切り貼りメカニズムまたは複製的転座メカニズムによってゲノムの別の部分へのその移動を触媒する酵素である。トランスポサーゼを他のシステム、例えば、ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓシステムと連結させることによって、ゲノムＤＮＡの部位特異的挿入または操作を可能とするために新たな遺伝子編集ツールが開発され得る。非活性Ｃａｓエフェクタータンパク質及びＴｎ７様トランスポゾンを触媒的に使用するトランスポゾンを使用する２つの既知のＤＮＡ組込み方法が存在する。トランスポザーゼ依存性ＤＮＡ組込みは、ゲノムにおいてＤＳＢを誘発せず、これはより安全かつより特異的なＤＮＡ組込みを保証し得る。

【0210】

ＣＲＩＳＰＲシステムは、獲得免疫の形態を提供する、侵入ファージ及びプラスミドに対する防御に関与するシステムとして原核生物（例えば、細菌及び古細菌）において元々発見された。現在では、研究及び臨床的用途において人気のある遺伝子編集ツールとして適応され、使用されている。

【0211】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは通常、少なくとも２つの構成要素：１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓタンパク質を含む。Ｃａｓタンパク質は、標的部位にＤＳＢを導入するヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、２つの主要なクラスに分類される：クラス１システムは、核酸を分解するために複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用する；クラス２システムは、同じ目的のために単一の大きなＣａｓタンパク質を使用する。クラス１はタイプＩ、ＩＩＩ、及びＩＶに分けられ、クラス２はタイプＩＩ、Ｖ、及びＶＩに分けられる。遺伝子編集用途のために適応された様々なＣａｓタンパク質には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、及びＭａｄ７が含まれるが、これらに限定されない。最も広く使用されるＣａｓ９は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質であり、例示説明として本明細書に記載される。これらのＣａｓタンパク質は、異なる源種を起源とし得る。例えば、Ｃａｓ９は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に由来し得る。

【0212】

元の微生物ゲノムにおいて、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、宿主ゲノム内のアレイとしてコードされるＣＲＩＳＰＲリピート配列間に侵入ＤＮＡからの配列を組み込んでいる。ＣＲＩＳＰＲリピートアレイからの転写産物は、「プロトスペーサー」配列として知られている、侵入ＤＮＡから転写された可変要素配列、及びＣＲＩＳＰＲリピートの一部をそれぞれ保有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へとプロセシングされる。各ｃｒＲＮＡは、第２のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズし、これらの２つのＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成する。ｃｒＲＮＡのプロトスペーサーコード部分は、相補的標的ＤＮＡ配列を切断するようにＣａｓ９複合体を誘導するが、ただし、それらは、「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）として知られている短い配列に隣接する。

【0213】

その発見から、ＣＲＩＳＰＲシステムは、細菌からヒト細胞を含む真核細胞にわたる広範囲の細胞及び生物において配列特異的ＤＳＢ及び標的化ゲノム編集を誘導するために適応されてきた。遺伝子編集用途におけるその使用では、人工的に設計された合成ｇＲＮＡが、元来のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体に置き換わっている。例えば、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ、テトラループ、及びｔｒａｃｒＲＮＡから構成される単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。ｃｒＲＮＡは通常、目的の標的ＤＮＡを認識するようにユーザーが設計した相補的領域（スペーサーとも呼ばれ、通常は長さが約２０ヌクレオチド）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、Ｃａｓヌクレアーゼ結合のための骨格領域を含む。ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、テトラループによって連結され、それぞれは、互いのハイブリダイゼーションのための短いリピート配列を有し、よって、キメラｓｇＲＮＡを生成する。ｇＲＮＡに存在するスペーサーまたは相補的領域配列を単純に変更することによってＣａｓヌクレアーゼのゲノム標的を変更し得る。相補的領域は、標準的なＲＮＡ－ＤＮＡ相補的塩基対合規則を介して標的ＤＮＡ部位にＣａｓヌクレアーゼを導く。

【0214】

Ｃａｓヌクレアーゼが機能するために、ゲノムＤＮＡにおいて標的配列のすぐ下流にＰＡＭが存在しなければならない。Ｃａｓタンパク質によるＰＡＭの認識は、隣接するゲノム配列を不安定化し、ｇＲＮＡによる配列の調査を可能にし、一致する配列が存在する場合にｇＲＮＡ－ＤＮＡ対合をもたらすと考えられている。ＰＡＭの具体的な配列は、Ｃａｓ遺伝子の種に応じて様々である。例えば、Ｓ．ピオゲネスに由来する最も一般的に使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、５’－ＮＧＧ－３’のＰＡＭ配列または、あまり効率的ではない速度では、５’－ＮＡＧ－３’（「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得る）を認識する。代替的ＰＡＭを有する他のＣａｓヌクレアーゼ変異体もまた特性化されており、ゲノム編集のために成功裏に使用されており、それは以下の表１ａにまとめられている。

【0215】

【表1a】

【0216】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、それらの活性、特異性、認識、及び／または他の特徴を変化させるための１つ以上の変異を含み得る。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは、オフターゲット効果を軽減するためにその忠実度を変化させる１つ以上の変異を有してもよい（例えば、ｅＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＨｙｐａＳｐＣａｓ９、ＨｅＦＳｐＣａｓ９、及びｅｖｏＳｐＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９の高忠実度変異体である）。別の例として、Ｃａｓヌクレアーゼは、そのＰＡＭ特異性を変化させる１つ以上の変異を有してもよい。

【0217】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載のＣａｓタンパク質のうちのいずれか１つまたはその機能的部分を含む。本明細書で使用する場合、「機能的部分」とは、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体を形成し、標的ポリヌクレオチド配列を切断するその能力を保持するペプチドの部分を指す。いくつかの実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたＣａｓ９タンパク質の機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたＣａｓ１２ａ（別名、Ｃｐｆ１）タンパク質の機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能的ドメインは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。

【0218】

いくつかの実施形態では、適切なＣａｓタンパク質としては、Ｃａｓ０、Ｃａｓ１２ａ（すなわち、Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｉ、ＣａｓＸ、及びＭａｄ７が挙げられるが、これらに限定されない。

【0219】

いくつかの実施形態では、外因性Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞に導入され得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過ポリペプチドまたは細胞透過ペプチドにコンジュゲートまたは融合され得る。本明細書で使用する場合、「細胞透過ポリペプチド」及び「細胞透過ペプチド」は、細胞への分子の取り込みを容易にするポリペプチドまたはペプチドをそれぞれ指す。細胞透過ポリペプチドは、検出可能な標識を含有し得る。

【0220】

特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、荷電タンパク質（例えば、正電荷、負電荷、または全体的に中性の電荷を保有する）にコンジュゲートまたは融合され得る。このような連結は、共有結合性であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質が細胞を透過する能力を顕著に増加させるために、超陽性荷電したＧＦＰに融合され得る（Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１０；５（８）：７４７－５２）。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞内へのその進入を容易にするためにタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合され得る。例となるＰＴＤには、Ｔａｔ、オリゴアルギニン、及びペネトラチンが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞透過ペプチドに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、超陽性荷電したＧＦＰに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、細胞透過ペプチドに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、超陽性荷電したＧＦＰに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。

【0221】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で、標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入され得る。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技法によって達成され得る。好適な技法には、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が含まれる。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるような改変ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるような改変ｍＲＮＡ（例えば、合成の改変ｍＲＮＡ）を含む。

【0222】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるような改変核酸（例えば、合成の改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。

【0223】

提供される実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは一般に、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓタンパク質という２つの構成要素を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上、例えば、１～２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるような改変核酸（例えば、合成の改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。

【0224】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ結合のための足場配列、及びｃｒＲＮＡと呼称されるユーザー設計されるスペーサーまたは相補的部分から構成される、短鎖合成ＲＮＡである。ｃＲＮＡは、改変されるゲノム標的を定めるｃｒＲＮＡターゲティング配列（以下、ｇＲＮＡターゲティング配列とも呼ばれる；通常、約２０ヌクレオチド長）、及びｃｒＲＮＡリピート領域（例えば、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ；配列番号２３）から構成される。ｇＲＮＡに存在する相補的部分の配列（例えば、ｇＲＮＡターゲティング配列）を単に変更することによって、Ｃａｓタンパク質のゲノム標的を変更することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合のための足場配列は、そのアンチリピート配列を介してｃｒＲＮＡにハイブリダイズするｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ；配列番号２４）から構成される。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ間の複合体はＣａｓヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）を動員し、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流を切断する。Ｃａｓタンパク質が機能するためには、ＰＡＭがゲノムＤＮＡ内の標的配列のすぐ下流に存在しなければならない。Ｃａｓタンパク質によるＰＡＭの認識は、隣接するゲノム配列を不安定化し、ｇＲＮＡによる配列の調査を可能にし、一致する配列が存在する場合にｇＲＮＡ－ＤＮＡ対合をもたらすと考えられている。ＰＡＭの具体的な配列は、Ｃａｓ遺伝子の種に応じて様々である。例えば、Ｓ．ピオゲネスに由来する最も一般的に使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＮＧＧのＰＡＭ配列を認識する。代替のＰＡＭを用いる他のＣａｓ９変異体及び他のヌクレアーゼもまた特性評価され、ゲノム編集に成功裏に使用されている。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用し、標的遺伝子座に対して設計されたｇＲＮＡに相補的である指定のゲノム遺伝子座にて標的化ＤＳＢを作製することができる。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、キメラシングルガイドＲＮＡであるｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．２０１３）を生成するために、ループ配列（例えば、テトラループ；ＧＡＡＡ、配列番号２５）で連結され得る。ｓｇＲＮＡは、ＤＮＡベースの発現用に、または化学合成によって生成できる。

【0225】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの相補的部分の配列（例えば、ｇＲＮＡターゲティング配列）は、目的の標的部位に応じて変化するであろう。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、表１ｂに示される遺伝子の配列に特異的な相補的部分を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化されるゲノム遺伝子座は、記載した遺伝子座のいずれかの４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内に位置する。

【0226】

本明細書に開示される方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くと共にそれにハイブリダイズすることができる、任意のリボ核酸の使用を企図する。いくつかの実施形態では、リボ核酸のうちの少なくとも１つは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸のうちの少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、単一のリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くと共にそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くと共にそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸の両方は、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くと共にそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。当業者には理解されようが、本明細書で提供されるリボ核酸は、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに応じて様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチドの配列にハイブリダイズするように選択され得る。１～２つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるようにも選択され得る。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸のそれぞれは、標的モチーフ間に位置する変異対立遺伝子を挟む、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸のそれぞれは、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くと共にそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。

【0227】

いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列に相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列に相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列には相補的でなく、及び／またはそれにはハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフに相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列のオフセット標的モチーフに相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。

【0228】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸及び少なくとも１～２つのリボ核酸をコードする核酸は、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるような改変核酸（例えば、合成の改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。

【0229】

本明細書に記載の遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的化に有用な例となるｇＲＮＡターゲティング配列は、表１ｂで提供される。これらの配列は、２０１６年５月９日に出願されたＷＯ２０１６１８３０４１に見出すことができ、表、付録、及び配列表を含めたこの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0230】

【表1b】

【0231】

いくつかの実施形態では、記載されている遺伝子の発現を低減または排除するための遺伝子破壊の方法に使用するための新たな遺伝子座及び／またはｇＲＮＡターゲティング配列を同定することは、当業者の技能水準内にある。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに関して、特定の遺伝子座（例えば、表１ｂに示す、例えば、標的遺伝子内の）に対する既存のｇＲＮＡターゲティング配列が公知の場合、「インチワーミング」アプローチを使用し、通常はゲノムにわたって約１００塩基対（ｂｐ）毎に存在するＰＡＭ配列について遺伝子座のそれぞれの側の隣接領域をスキャンすることによって、導入遺伝子の標的挿入のための追加の遺伝子座を同定することができる。異なるヌクレアーゼは通常、異なる対応するＰＡＭ配列を有することから、ＰＡＭ配列は、使用される特定のＣａｓヌクレアーゼに依存することになる。遺伝子座の両側の隣接領域は、約５００～４０００ｂｐ長、例えば、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約３０００ｂｐ、約３５００ｂｐ、または約４０００ｂｐ長であり得る。ＰＡＭ配列が検索範囲内で同定される場合、その遺伝子座の配列に従って、遺伝子破壊方法において使用するための新たなガイドが設計され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを例示的なものとして記載しているが、この新たな座位を特定する方法では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ及びトランスポザーゼを使用するものを含む、記載されるいずれの遺伝子編集アプローチも使用することができる。

【0232】

本明細書に記載の遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのターゲティングに有用な追加の例示的Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ配列が、表２で提供される。

【0233】

【表2】

【0234】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）手法を使用して作製される。「ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）とは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に典型的に由来する核酸結合ドメイン及び核酸標的配列を切断するための１つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を意図する。触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメイン、より好ましくは、例えば、Ｉ－ＴｅｖＩ、ＣｏｌＥ７、ＮｕｃＡ、及びＦｏｋ－Ｉのような、エンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、例えば、Ｉ－ＣｒｅＩ及びＩ－Ｏｎｕｌまたはそれらの機能的変異体のような、メガヌクレアーゼに融合され得る。より好ましい実施形態では、当該ヌクレアーゼは、モノマーＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。モノマーＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、ＷＯ２０１２１３８９２７に記載される操作されたＴＡＬリピートとＩ－ＴｅｖＩの触媒ドメインとの融合体などの、特異的認識及び切断のために二量体化を必要としないＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、細菌種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のタンパク質であり、複数のリピート配列を含み、各リピートが、１２位及び１３位において核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に特異的である二残基（ＲＶＤ）を含む。同様のモジュール式塩基対塩基核酸結合特性を有する結合ドメイン（ＭＢＢＢＤ）もまた、異なる細菌種において出願人によって最近発見された新たなモジュール式タンパク質に由来し得る。この新たなモジュール式タンパク質は、ＴＡＬリピートよりも大きな配列可変性を示すという利点を有する。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴを認識するためのＮＳ、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ及びＴを認識するためのＹＧ、Ａを認識するためのＴＬ、ＡまたはＧを認識するためのＶＴ、ならびにＡを認識するためのＳＷである。別の実施形態では、必要不可欠なアミノ酸１２及び１３は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧに対するそれらの特異性を調節するため、ならびに特にこの特異性を強化するために、他のアミノ酸残基に向けて変異させることができる。ＴＡＬＥＮキットは、市販されている。

【0235】

いくつかの実施形態では、該細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して操作される。「ジンクフィンガー結合タンパク質」は、亜鉛イオンの配位によるタンパク質構造の安定化の結果として、好ましくは配列特異的様態で、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質に結合するタンパク質またはポリペプチドである。ジンクフィンガー結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略称される場合が多い。個々のＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、「フィンガー」と称される。ＺＦＰは、少なくとも１つのフィンガー、典型的には２つのフィンガー、３つのフィンガー、または６つのフィンガーを有する。各フィンガーは、２～４塩基対のＤＮＡ、典型的には３または４塩基対のＤＮＡに結合する。ＺＦＰは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各フィンガーは、典型的には、およそ３０アミノ酸の亜鉛キレート化ＤＮＡ結合サブドメインを含む。このクラスの単一のジンクフィンガーは、単一のベータターンの２つのシステイン残基と共に亜鉛と配位結合した２つの不変のヒスチジン残基を含むアルファヘリックスからなることが、研究により実証されている（例えば、Ｂｅｒｇ＆Ｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１０８１－１０８５（１９９６）を参照されたい）。

【0236】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して作製される。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当技術分野で周知である（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖切断を生じさせる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、長さ１２～４５塩基対（ｂｐ）の範囲、通常は長さ１４～４０ｂｐの範囲のＤＮＡ標的部位を認識する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、またはＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼに対応し得る。いくつかの実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩ変異体であり得る。

【0237】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、メガヌクレアーゼを使用して作製される。メガヌクレアーゼは、定義上、大きな配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄ Ｂ．Ｌ．Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１，２９，３７５７－３７７４）。それらは、生細胞において固有の部位を切断し、それによって切断部位の近傍で遺伝子の標的化を１０００倍以上強化することができる（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，５０３４－５０４０、Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４，８０９６－８１０６；Ｃｈｏｕｌｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，１９９５，１５，１９６８－１９７３；Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，５０５５－５０６０；Ｓａｒｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，１７，２６７－７７；Ｄｏｎｏｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１９９８，１８，４０７０－４０７８；Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，９３－１０１；Ｃｏｈｅｎ－Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，１４４４－１４４８）．

【0238】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は塩基編集に関連する。塩基エディター（ＢＥ）は通常、Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ関連」）ドメイン及び核酸塩基改変ドメイン（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１（「アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド１」）、ＣＤＡ（「シチジンデアミナーゼ」）、及びＡＩＤ（「活性化誘導シチジンデアミナーゼ」）を含むシチジンデアミナーゼなどの天然のまたは進化したデアミナーゼ）ドメインの融合体である。場合によっては、塩基エディターには、細胞のＤＮＡ修復プロセスを変更して、結果として生じる単一ヌクレオチドの変化の効率及び／または安定性を高めるタンパク質またはドメインも含まれる場合がある。

【0239】

いくつかの態様では、現在利用可能な塩基エディターには、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換するシチジン塩基エディター（例えば、ＢＥ４）、及び標的Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換するアデニン塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）が含まれる。いくつかの態様では、Ｃａｓ９を標的とした脱アミノ化は、二本鎖ＤＮＡ切断を導入することなく塩基変化を誘導するように設計された塩基エディター（ＢＥ）系と関連して最初に示された。更に、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）に融合されたラットデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）を使用し、ｓｇＲＮＡのＰＡＭの上流でシチジンをチミジンに変換することに成功した。いくつかの態様では、この最初のＢＥシステムは、ｄＣａｓ９を、脱アミノ化されたシチジンの反対側の鎖に切れ目を入れる「ニッカーゼ」Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａに変更することによって最適化された。理論に束縛されるものではないが、これにより、ロングパッチ塩基除去修復（ＢＥＲ）が開始されると予想される。この場合、脱アミノ化された鎖が修復の鋳型として優先的に使用されてＵ：Ａ塩基対が生成され、その後、この塩基対がＤＮＡ複製中にＴ：Ａに変換される。

【0240】

いくつかの実施形態では、塩基エディターは、触媒的に不活性である第１のＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、塩基編集活性を有するドメイン、及びニッカーゼ活性を有する第２のＤＮＡ結合タンパク質ドメインを含む核酸塩基編集体であり、ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、単一の融合タンパク質上に、または別々に（例えば、別々の発現ベクター上で）発現させる。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、塩基編集活性を有するドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ）と、２つの核酸プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質ドメイン（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とを含む融合タンパク質であり、第１のドメインはニッカーゼ活性を含み、第２のｎａｐＤＮＡｂｐは触媒的に不活性であり、少なくとも２つのｎａｐＤＮＡｂｐがリンカーによって結合されている。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、ニッカーゼ活性（ｎＣａｓ；ｎＣａｓ９）を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）のＤＮＡドメイン、核酸プログラム可能ＤＮＡ結合活性を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）の触媒的に不活性なドメイン（ｄＣａｓ；例えば、ｄＣａｓ９）、及びデアミナーゼドメインを含み、ｄＣａｓはリンカーによってｎＣａｓに接合されており、ｄＣａｓはデアミナーゼドメインに直接隣接する、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、アデニンからチミンへの、すなわち「ＡＴＢＥ」（または、チミンからアデニンへの、すなわち「ＴＡＢＥ」）塩基転換塩基エディターである。例示的な塩基エディター及び塩基エディターシステムには、特許公報第ＵＳ２０２２０１２７６２２号、同第ＵＳ２０２１００７９３６６号、同第ＵＳ２０２００２４８１６９号、同第ＵＳ２０２１００９３６６７号、同第ＵＳ２０２１００７１１６３号、ＷＯ２０２０１８１２０２、ＷＯ２０２１１５８９２１、ＷＯ２０１９１２６７０９号、ＷＯ２０２０１８１１７８、ＷＯ２０２０１８１１９５、ＷＯ２０２０２１４８４２、ＷＯ２０２０１８１１９３に記載されるいずれかが含まれ、これらは、これらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0241】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、標的プライム逆転写（ＴＰＲＴ）、すなわち「プライム編集」である。いくつかの実施形態では、プライム編集は、ＤＳＢまたはドナーＤＮＡ鋳型を必要とせずに、ヒト細胞において標的挿入、欠失、１２の考え得るすべての塩基間変換、及びこれらの組み合わせを媒介する。

【0242】

プライム編集は、ポリメラーゼ（すなわち、融合タンパク質の形態のポリメラーゼ、またはｎａｐＤＮＡｂｐとトランスで提供されたポリメラーゼ）と連携して機能する、核酸プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質（「ｎａｐＤＮＡｂｐ」）を用いて、新たな遺伝子情報を所定のＤＮＡ部位に直接書き込むゲノム編集法であり、プライム編集システムは、標的部位を指定すると共に、ガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡの５’末端もしくは３’末端、または内部部分）上に操作された伸長部（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）により、置換ＤＮＡ鎖の形態で、所望の編集合成の鋳型となるプライム編集（ＰＥ）ガイドＲＮＡ（「ＰＥｇＲＮＡ」）でプログラムする。所望の編集（例えば、単一核酸塩基置換）を含有する置換鎖は、編集される標的部位の内因性鎖と同じ配列を共有する（所望の編集を含むことを除く）。ＤＮＡ修復及び／または複製機構を介して、標的部位の内因性鎖は、所望の編集を含有する新たに合成された置換鎖により置き換えられる。場合によっては、プライム編集は、「検索及び置換」ゲノム編集技術と考えられ得る。プライム編集は、編集対象である所望の標的部位を検索して、それを特定すると共に、対応する標的部位の内因性ＤＮＡ鎖の代わりに同時に導入される所望の編集を含む置換鎖をコードするからである。例えば、プライム編集は、二本鎖切断をバイパスするために、精密なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ゲノム編集を実行するために適合させることができる。いくつかの実施形態では、相同タンパク質は、ガイドＲＮＡで特定のＤＮＡ配列を標的とし、標的部位に一本鎖切れ目を生成し、切れ目の入ったＤＮＡを、ガイドＲＮＡと一体化された操作された逆転写酵素鋳型を逆転写するためのプライマーとして使用するための、Ｃａｓタンパク質－逆転写酵素融合体または関連するシステムであるか、またはそれをコードする。いくつかの実施形態では、プライム編集タンパク質は、ゲノムＤＮＡの対向する鎖上の相補的ＤＮＡフラップの合成の鋳型となる２つのプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）と対合され、ＰＥにより誘導される切れ目の部位間の内因性ＤＮＡ配列とｐｅｇＲＮＡにコードされる配列との置換をもたらす。

【0243】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、逆転写酵素、または当技術分野で公知の任意のＤＮＡポリメラーゼであるプライム編集に関連する。したがって、一態様では、プライム編集は、標的ＤＮＡ中の相補的プロトスペーサーにアニーリングするスペーサー配列を含有する特殊なガイドＲＮＡ（すなわち、ＰＥｇＲＮＡ）と関連付けることによってＤＮＡ配列を標的とするようにプログラムされる、Ｃａｓ９（または同等のｎａｐＤＮＡｂｐ）を含んでもよい。このような方法には、Ａｎｚａｌｏｎｅら（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１７１１－４）、またはＰＣＴ公開第ＷＯ２０２０１９１２４８号、同第ＷＯ２０２１２２６５５８号もしくは同第ＷＯ２０２２０６７１３０号に開示されているものが含まれ、これらはその全体が本明細書に組み込まれる。

【0244】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、部位特異的ターゲティングエレメントを介したプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）である。いくつかの態様では、ＰＡＳＴＥは、逆転写酵素とセリンインテグラーゼの両方に融合されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ニッカーゼを介してゲノム挿入を指示するプラットフォームである。Ｉｏａｎｎｉｄｉら（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．１１．０１．４６６７８６）に記載されるように、ＰＡＳＴＥは二本鎖切断を生成しないが、最大約３６ｋｂの配列の組込みを可能にする。いくつかの実施形態では、セリンインテグラーゼは、当技術分野で公知の任意のものであり得る。いくつかの実施形態では、セリンインテグラーゼは、ＰＡＳＴＥを多重遺伝子組込みに使用して、少なくとも２つのゲノム遺伝子座で少なくとも２つの異なる遺伝子を同時に組み込むことができるように、十分な直交性を有する。いくつかの実施形態では、ＰＡＳＴＥは、相同組換え修復または非相同末端結合ベースの組込みと同等またはそれより優れた編集効率を有し、非分裂細胞において活性を有し、検出可能なオフターゲット事象が少ない。

【0245】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される細胞は、ポリペプチドの発現をノックダウンする（例えば、減少させる、排除する、または阻害する）ためのＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して作製される。有用なＲＮＡｉ法は、合成ＲＮＡｉ分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ相互作用ＮＲＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び当業者に認識される他の一過性ノックダウン法を利用するものを含む。配列特異的ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを含めたＲＮＡｉのための試薬は、市販されている。例えば、上記のいずれか、例えば、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２ＭまたはＮＬＲＣ５のような標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの標的モチーフと相補的な阻害性核酸、例えば、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入することによって、その細胞内でＲＮＡ干渉によってノックダウンされ得る。いくつかの実施形態では、上記のいずれか、例えば、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２ＭまたはＮＬＲＣ５のような標的ポリヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡを発現するウイルスを細胞内に形質導入することによって、その細胞内でノックダウンされ得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉を用いて、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及びＮＬＲＣ５からなる群から選択される少なくとも１つの発現が低減または阻害される。

【0246】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変などの改変は、アクセサリー鎖Ｂ２Ｍを標的とすることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子遺伝子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子遺伝子の発現を低減させるか、または排除、例えば、ノックアウトする。Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ及び／またはＮＦＹ－Ｃ、ならびにこれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の減少または排除は、以下のＢ２Ｍのうちの１つ以上の発現を低減させる、例えば、ノックアウトする改変である。Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ及び／またはＮＦＹ－Ｃ。

【0247】

２．例示的な標的ポリヌクレオチド、及び発現を低減させる方法
ａ．ＭＨＣクラスＩ分子
特定の実施形態では、遺伝子改変などの改変は、アクセサリー鎖Ｂ２Ｍを標的とすることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子遺伝子の発現を低減させるか、または排除、例えば、ノックアウトする。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。Ｂ２Ｍの発現を低減または排除、例えば、ノックアウトすることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送が遮断され、このような細胞は、レシピエント対象に移植されたときに免疫寛容を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、投与時にレシピエント対象または患者において低免疫原性とみなされる。

【0248】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍの変異体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのホモログである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのオルソログである。

【0249】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の減少または排除は、以下のＭＨＣクラスＩ分子－ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上の発現を低減させる、改変である。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の減少または排除は、以下のＭＨＣクラスＩ分子－ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の減少または排除は、ＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の減少または排除は、ＨＬＡ－Ｂタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の減少または排除は、ＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の減少または排除は、以下のＭＨＣクラスＩ分子－ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上の発現を当該分子をコードする遺伝子をノックアウトすることによって、低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトし、当該ＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトし、当該ＨＬＡ－Ｂタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトし、当該ＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を低減または排除する。

【0250】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする改変（例えば、遺伝子改変）を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする改変（例えば、遺伝子改変）は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、標的ヌクレアーゼシステムを使用することによるものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えば、ｇＲＮＡターゲティング配列）は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録２または表１５の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択され、この開示は参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするためのｇＲＮＡターゲティング配列は、ＣＧＵＧＡＧＵＡＡＡＣＣＵＧＡＡＵＣＵＵ（配列番号３３）である。

【0251】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示される別の免疫寛容原性因子）をコードする外因性核酸または導入遺伝子は、Ｂ２Ｍ遺伝子にて挿入される。Ｂ２Ｍ遺伝子座での標的挿入のための例示的な導入遺伝子には、本明細書に記載される任意のものが含まれる。

【0252】

Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは公知であると共に、本明細書に記載される。一実施形態では、結果として生じるＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子改変は、ＰＣＲによって評価される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ、例えば、ＨＬＡ－Ｉの発現の低減は、ＦＡＣＳ分析などのフローサイトメトリーによるアッセイであり得る。別の実施形態では、Ｂ２Ｍタンパク質発現は、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用し、遺伝子改変などの不活性化遺伝子改変の存在が確認される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子発現の低減は、免疫組織化学または免疫細胞化学などの免疫親和性法を使用して評価される。

【0253】

いくつかの実施形態では、操作された細胞における１つ以上のＭＨクラスＩ分子の発現または機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ Ｉ）の低減は、当技術分野で公知の技術、例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識抗体を使用する、例えば、ヒト主要組織適合性ＨＬＡクラスＩ抗原のα鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体を使用するＦＡＣＳ技法を使用して、測定することができる。また、細胞は、ＨＬＡ Ｉ複合体が細胞表面上に発現していないことを確認するために試験され得る。これは、上で論述される１つ以上のＨＬＡ細胞表面構成要素に対する抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析によってアッセイされ得る。ＨＬＡ Ｉ（または、ＭＨＣクラスＩ）の低減に加えて、本明細書で提供される操作された細胞は、マクロファージの貪食及びＮＫ細胞による殺傷に対して感受性が低減する。操作された細胞の低免疫原性表現型をアッセイする方法は、以下に更に記載される。

【0254】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現を低減させる。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、約５％を超えて低減し、例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上のいずれかを超えて低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、最大約１００％低減し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％、最大約５％またはそれ未満のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、排除される（例えば、Ｂ２ＭのｍＲＮＡの発現は０％）。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する。

【0255】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現を低減させる。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は、約５％を超えて低減し、例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上のいずれかを超えて低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は、最大約１００％低減し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％、最大約５％またはそれ未満のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は、排除される（例えば、Ｂ２Ｍのタンパク質の発現は０％）。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する。

【0256】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、Ｂ２Ｍ遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の一方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0257】

いくつかの実施形態では、改変（例えば、遺伝子改変）は、細胞における１つ以上のＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞におけるすべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子中のインデルを含む不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされる。

【0258】

ｂ．ＭＨＣクラスＩＩ分子
特定の態様では、遺伝子改変などの改変は、クラスＩＩ分子トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）発現を標的とすることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子遺伝子の発現を低減させるか、または排除、例えば、ノックアウトする。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。ＣＩＩＴＡは、ＬＲ、またはヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチ反復配列（ＬＲＲ）ファミリーのタンパク質のメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと会合することによって１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の転写を制御する。ＣＩＩＴＡの発現を低減させるか、または排除、例えば、ノックアウトすることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させ、それによって、表面発現も低減する。場合によっては、そのような細胞は、レシピエント対象に移植されたときに免疫寛容を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、投与時にレシピエント対象または患者において低免疫原性とみなされる。

【0259】

いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡの変異体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのホモログである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのオルソログである。

【0260】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の減少または排除は、以下のＭＨＣクラスＩＩ分子－ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上の発現を低減させる、改変である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低減または排除は、以下のＭＨＣクラスＩＩ分子－ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の減少または排除は、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の減少または排除は、ＨＬＡ－ＤＭタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の減少または排除は、ＨＬＡ－ＤＯＡタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の減少または排除は、ＨＬＡ－ＤＯＢタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の減少または排除は、ＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の減少または排除は、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の減少または排除は、以下のＭＨＣクラスＩＩ分子－ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上の発現を当該分子をコードする遺伝子をノックアウトすることによって、低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトし、当該ＨＬＡ－ＤＰタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＭタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトし、当該ＨＬＡ－ＤＭタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＯＡタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトし、当該ＨＬＡ－ＤＯＡタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＯＢタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトし、当該ＨＬＡ－ＤＯＢタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＱタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトし、当該ＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトし、当該ＨＬＡ－ＤＲタンパク質の発現を低減または排除する。

【0261】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする改変（例えば、遺伝子改変）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＣＩＩＴＡを特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、標的ヌクレアーゼシステムによるものである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えば、ｇＲＮＡターゲティング配列）は、ＷＯ２０１６１８３０４１の付録１または表１２の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択され、この開示は参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするためのｇＲＮＡターゲティング配列は、ＧＡＵＡＵＵＧＧＣＡＵＡＡＧＣＣＵＣＣＣ（配列番号３４）である。

【0262】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示される別の免疫寛容原性因子）をコードする外因性核酸または導入遺伝子は、ＣＩＩＴＡ遺伝子にて挿入される。Ｂ２Ｍ遺伝子座での標的挿入のための例示的な導入遺伝子には、本明細書に記載される任意のものが含まれる。

【0263】

ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは、公知であると共に、本明細書に記載される。一実施形態では、結果として生じるＣＩＩＴＡ遺伝子の遺伝子改変は、ＰＣＲによって評価される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、例えば、ＨＬＡ－ＩＩの発現の低減は、ＦＡＣＳ分析などのフローサイトメトリーによるアッセイであり得る。別の実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現は、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用し、遺伝子改変などの不活性化遺伝子改変の存在が確認される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子発現の低減は、免疫組織化学または免疫細胞化学などの免疫親和性法を使用して評価される。

【0264】

いくつかの実施形態では、操作された細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現または機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ ＩＩ）の低減は、タンパク質に対する抗体を使用したウェスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技法、ＲＴ－ＰＣＲ技法などといった当技術分野で公知の技法を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ ＩＩ複合体が細胞表面上に発現していないことを確認するために、操作された細胞を試験することができる。表面発現を評定するための方法には、当技術分野で公知の方法が含まれ（例えば、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２１を参照されたい）、一般には、ヒトＨＬＡクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ及びほとんどのＤＱ抗原に結合する市販の抗体に基づくウェスタンブロットまたはＦＡＣＳ分析のいずれかを使用して行われる。ＨＬＡクラスＩＩ分子（または、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子）の低減に加えて、本明細書で提供される操作された細胞は、マクロファージの貪食及びＮＫ細胞による殺傷に対して感受性が低減する。操作された細胞の低免疫原性表現型をアッセイする方法は、以下に更に記載される。

【0265】

いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現を低減させる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は、約５％を超えて低減し、例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上のいずれかを超えて低減する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は、最大約１００％低減し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％、最大約５％またはそれ未満のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は、排除される（例えば、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡの発現は０％）。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性を排除する。

【0266】

いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現を低減させる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は、約５％を超えて低減し、例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上のいずれかを超えて低減する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は、最大約１００％低減し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％、最大約５％またはそれ未満のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は、排除される（例えば、ＣＩＩＴＡのタンパク質の発現は０％）。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性を排除する。

【0267】

いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の一方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0268】

いくつかの実施形態では、改変（例えば、遺伝子改変）は、細胞における１つ以上のＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞におけるすべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子中のインデルを含む不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子は、ノックアウトされる。

【0269】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、Ｔ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子を標的とする改変（例えば、遺伝子改変）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＴＲＡＣを特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、標的ヌクレアーゼシステムによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＵＳ２０１６０３４８０７３の配列番号５３２～６０９及び９１０２～９７９７からなる群から選択され、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とするためのｇＲＮＡターゲティング配列は、ＡＧＡＧＵＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡ（配列番号３５）である。

【0270】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示される別の免疫寛容原性因子）をコードする外因性核酸または導入遺伝子は、ＴＲＡＣ遺伝子にて挿入される。ＴＲＡＣ遺伝子座での標的挿入のための例示的な導入遺伝子には、第ＩＩ．Ｂ節に記載される任意のものが含まれる。

【0271】

ＴＲＡＣ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは公知であると共に、本明細書に記載される。一実施形態では、ＰＣＲによる結果として生じるＴＲＡＣ遺伝子の遺伝子改変、及びＨＬＡ－ＩＩ発現の低減は、フローサイトメトリーによって、例えば、ＦＡＣＳ解析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、ＴＲＡＣタンパク質の発現は、ＴＲＡＣタンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化改変の存在が確認される。

【0272】

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現を低減させる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現は、約５％を超えて低減し、例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上のいずれかを超えて低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現は、最大約１００％低減し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％、最大約５％またはそれ未満のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現は、排除される（例えば、ＴＲＡＣのｍＲＮＡの発現は０％）。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現を低減させる改変は、ＴＲＡＣ遺伝子活性を排除する。

【0273】

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、ＴＲＡＣのタンパク質発現を低減させる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現は、約５％を超えて低減し、例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上のいずれかを超えて低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現は、最大約１００％低減し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％、最大約５％またはそれ未満のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現は、排除される（例えば、ＴＲＡＣのタンパク質の発現は０％）。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現を低減させる改変は、ＴＲＡＣ遺伝子活性を排除する。

【0274】

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、ＴＲＡＣ遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ発現を低減させる改変は、ＴＲＡＣ遺伝子の一方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ発現を低減させる改変は、ＴＲＡＣ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0275】

いくつかの実施形態では、改変（例えば、遺伝子改変）は、細胞における１つ以上のＴＲＡＣコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞におけるすべてのＴＲＡＣコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＲＡＣ遺伝子中のインデルを含む不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＲＡＣ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＲＡＣ遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＲＡＣ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、ノックアウトされる。

【0276】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、Ｔ細胞受容体β定常（ＴＲＢＣ）遺伝子を標的とする改変（例えば、遺伝子改変）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とする改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＴＲＢＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、標的ヌクレアーゼシステムによるものである。

【0277】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示される別の免疫寛容原性因子）をコードする外因性核酸または導入遺伝子は、ＴＲＢＣ遺伝子にて挿入される。ＴＲＢＣ遺伝子座での標的挿入のために例示的な導入遺伝子には、第ＩＩ．Ｂ節に記載される任意のものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＵＳ２０１６０３４８０７３の配列番号６１０～７６５及び９７９８～１０５３２からなる群から選択され、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0278】

ＴＲＢＣ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは公知であると共に、本明細書に記載される。一実施形態では、ＰＣＲによる結果として生じるＴＲＢＣ遺伝子の遺伝子改変、及びＨＬＡ－ＩＩ発現の低減は、フローサイトメトリーによって、例えば、ＦＡＣＳ解析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、ＴＲＢＣタンパク質の発現は、ＴＲＢＣタンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化改変の存在が確認される。

【0279】

いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現を低減させる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現は、約５％を超えて低減し、例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上のいずれかを超えて低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現は、最大約１００％低減し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％、最大約５％またはそれ未満のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現は、排除される（例えば、ＴＲＢＣのｍＲＮＡの発現は０％）。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現を低減させる改変は、ＴＲＢＣ遺伝子活性を排除する。

【0280】

いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、ＴＲＢＣのタンパク質発現を低減させる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのタンパク質発現は、約５％を超えて低減し、例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上のいずれかを超えて低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのタンパク質発現は、最大約１００％低減し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％、最大約５％またはそれ未満のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのタンパク質発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれかだけ低減する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのタンパク質発現は、排除される（例えば、ＴＲＢＣのタンパク質の発現は０％）。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのタンパク質発現を低減させる改変は、ＴＲＢＣ遺伝子活性を排除する。

【0281】

いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ発現を低減させる改変（例えば、遺伝子改変）は、ＴＲＢＣ遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ発現を低減させる改変は、ＴＲＢＣ遺伝子の一方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ発現を低減させる改変は、ＴＲＢＣ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0282】

いくつかの実施形態では、改変（例えば、遺伝子改変）は、細胞における１つ以上のＴＲＢＣコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞におけるすべてのＴＲＢＣコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＲＢＣ遺伝子中のインデルを含む不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＲＢＣ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＲＢＣ遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＲＢＣ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子は、ノックアウトされる。

【0283】

Ｂ．ポリヌクレオチドの過剰発現
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作された初代細胞などの操作された細胞は、例えば、細胞において所望のポリヌクレオチドを過剰発現させるような１つ以上の改変の細胞内への導入によって、遺伝子改変または操作される。いくつかの実施形態では、改変または操作された初代細胞などの細胞は、１つ以上の改変が以前に導入されていない未改変細胞または未操作細胞（例えば、未改変の初代細胞または未操作の初代細胞）である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作された初代細胞などの操作された細胞は、外因性タンパク質をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド（「導入遺伝子」という用語と互換的に使用される）を含むように遺伝子改変される。記載したように、いくつかの実施形態では、初代細胞などの細胞は、レシピエントにおける免疫認識及び寛容に影響を及ぼす免疫寛容原性（例えば、免疫）因子である特定の遺伝子の発現を増加させるように改変される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの提供される操作された初代細胞はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、外因性ポリヌクレオチドは、操作された細胞において、上記の第Ｉ．Ａ節に記載される標的ポリヌクレオチド、例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減するような１つ以上の遺伝子改変と一緒に発現（例えば、過剰発現）してもよい。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの提供される操作された細胞は、レシピエント対象への投与時に免疫応答を誘発または活性化しない。

【0284】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる過剰発現したポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる過剰発現したポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、過剰発現したポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、過剰発現したポリヌクレオチドは、初代細胞においてエピソームとして発現する外因性ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、過剰発現したポリヌクレオチドは、操作された初代細胞の１つ以上のゲノム遺伝子座に挿入されているか、または組み込まれている外因性ポリヌクレオチドである。

【0285】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡターゲティングドメイン及び転写活性化因子を含有する融合タンパク質を使用して、ポリヌクレオチドの発現は増加する、すなわち、ポリヌクレオチドは過剰発現される。トランス活性化因子ドメインを使用して発現を増加させる標的化方法は、当業者に公知である。

【0286】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含有し、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、非標的挿入方法によって、例えば、レンチウイルスベクターによる形質導入によって細胞のゲノム遺伝子座内に挿入または組み込まれる。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃランスポゾンを含む。転位中、ｐｉｇｇｙＢａｃkトランスポゾンはレンチウイルスベクター内のトランスポゾン特異的な逆方向末端反復（ＩＴＲ）を認識し、ベクター内容物のＴＴＡＡ染色体部位への効率的な移動と組込みを可能にする。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、標的挿入法によって、例えば、相同性指向修復（ＨＤＲ）を使用することによって、初代細胞などの細胞のゲノム内に挿入されているか、または組み込まれる。任意の適切な方法を使用し、本明細書に記載の遺伝子編集法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含むＨＤＲによって、外因性ポリヌクレオチドを初代細胞などの操作された細胞のゲノム遺伝子座内に挿入することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のゲノム遺伝子座位などの１つ以上のゲノム遺伝子座位に挿入される（例えば、表４）。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、同じゲノム遺伝子座内に挿入される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、異なるゲノム遺伝子座内に挿入される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドのうちの２つ以上は、本明細書に記載の任意のゲノム遺伝子座位などの同じゲノム遺伝子座位に挿入される（例えば、表４）。いくつかの実施形態では、２つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の２つ以上のゲノム遺伝子座位などの異なるゲノム遺伝子座位に挿入される（例えば、表４）。

【0287】

例示的なポリヌクレオチドまたは過剰発現、及びそれを過剰発現させる方法は、以下の項に記載される。

【0288】

１．免疫寛容原性因子
いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子の発現は、細胞、例えば、初代細胞において過剰発現または増加する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、少なくとも１つの免疫寛容原性因子の発現の増加、すなわち、過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、免疫系（例えば、自然免疫系または適応免疫系）による操作された細胞に対する寛容を促進するか、またはその促進もしくは誘導に寄与する、任意の因子である。

【0289】

いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１－阻害剤、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ、及びＨ２－Ｍ３である。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００もしくはＭｆｇｅ８、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、初代細胞などの細胞は、免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドである。本明細書では、レシピエント対象への投与時に免疫応答を発動または活性化しない細胞が提供される。上述したように、いくつかの実施形態では、初代細胞などの細胞は、レシピエントにおける免疫認識及び寛容に影響を及ぼす遺伝子及び免疫寛容原性（例えば、免疫）因子の発現を増加させるように改変される。

【0290】

いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子の発現（例えば、表面発現）は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約１０％以上増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれ以上のいずれかだけ増加する。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子の発現は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約９９％以下増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％またはそれ以下のいずれかだけ増加する。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子の発現は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約１０％～約１００％増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約１０％～約４０％、約２０％～約６０％、約５０％～約８０％、及び約７０％～約１００％のいずれかだけ増加する。

【0291】

いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子の発現（例えば、表面発現）は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約２倍以上増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約４倍以上、約６倍以上、約８倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約６０倍以上、約７０倍以上、約８０倍以上、約９０倍以上、約１００倍以上、約１５０倍以上、及び約２００倍以上のいずれかだけ増加する。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子の発現は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約２００倍以下増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約１５０倍以下、約１００倍以下、約９０倍以下、約８０倍以下、約７０倍以下、約６０倍以下、約５０倍以下、約４０倍以下、約３０倍以下、約１５倍以下、約１０倍以下、約８倍以下、約６倍以下、約４倍以下、及び約２倍以下のいずれかだけ増加する。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子の発現は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約２倍～約２００倍増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約２倍～約２０倍、約１０倍～約５０倍、約３０倍～約７０倍、約５０倍～約１００倍、約８０倍～約１５０倍、及び約１２０倍～約２００倍のいずれかだけ増加する。

【0292】

いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ４７などの免疫寛容原性因子（例えば、免疫調節ポリペプチド）を発現するように改変された、初代細胞などの細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ４７などの免疫寛容原性因子（例えば、免疫調節ポリペプチド）を発現するように細胞のゲノムを変化させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、外因性ＣＤ４７などの外因性免疫寛容原性因子（例えば、免疫調節ポリペプチド）を発現する。いくつかの事例では、外因性ポリヌクレオチドの過剰発現または発現の増加は、ヒトＣＤ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを初代細胞内に導入する（例えば、細胞に形質導入する）ことによって達成される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得るか、または非ウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態では、初代細胞などの細胞は１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むように操作され、外因性ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ、及びＨ２－Ｍ３（これらの任意の組み合わせを含む）。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００、及びＭｆｇｅ８（これらの任意の組み合わせを含む）のうちの１つ以上である。例えば、いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドである。

【0293】

いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、初代細胞などの操作された細胞は、ヒトＣＤ４７などのＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７は、細胞、例えば、初代細胞において過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現は、改変によって操作されていない同じ細胞種の類似の細胞、例えば、参照細胞または未改変細胞、例えば、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドで操作されていない初代細胞と比較して、操作された初代細胞などの操作された細胞において過剰発現するか、または増加する。ＣＤ４７は、白血球表面抗原であり、インテグリンの細胞接着及び調節において役割を有する。それは通常、細胞の表面上に発現し、循環マクロファージが細胞を食べないようにシグナル伝達する。ヒトＣＤ４７についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドの情報は、例えば、ＮＰ＿００１７６８．１、ＮＰ＿９４２０８８．１、ＮＭ＿００１７７７．３、及びＮＭ＿１９８７９３．２で提供される。

【0294】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現（例えば、表面発現）は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約１０％以上増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれ以上のいずれかだけ増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約９９％以下増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％またはそれ以下のいずれかだけ増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約１０％～約１００％増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約１０％～約４０％、約２０％～約６０％、約５０％～約８０％、及び約７０％～約１００％のいずれかだけ増加する。

【0295】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現（例えば、表面発現）は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約２倍以上増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約４倍以上、約６倍以上、約８倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約６０倍以上、約７０倍以上、約８０倍以上、約９０倍以上、約１００倍以上、約１５０倍以上、及び約２００倍以上のいずれかだけ増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約２００倍以下増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約１５０倍以下、約１００倍以下、約９０倍以下、約８０倍以下、約７０倍以下、約６０倍以下、約５０倍以下、約４０倍以下、約３０倍以下、約１５倍以下、約１０倍以下、約８倍以下、約６倍以下、約４倍以下、及び約２倍以下のいずれかだけ増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約２倍～約２００倍増加し、例えば、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、約２倍～約２０倍、約１０倍～約５０倍、約３０倍～約７０倍、約５０倍～約１００倍、約８０倍～約１５０倍、及び約１２０倍～約２００倍のいずれかだけ増加する。

【0296】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に定められるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に定められるアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２に定められる配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４７のためのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２に定められるＣＤ４７のためのヌクレオチド配列を含む。

【0297】

いくつかの実施形態では、該細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に定められるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に定められるアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドを含む。

【0298】

いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）を有するＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）を有するＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドを含む。

【0299】

特定の実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0300】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下で更に説明するように、標的または非標的挿入方法によって細胞のゲノム内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、標的挿入は、ゲノム（遺伝子）座のいずれか１つへの挿入によるなど、標的遺伝子座への相同性依存型の挿入によるものである。いくつかの実施形態では、１つ以上のゲノム遺伝子座のそれぞれは、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座、及びＫＤＭ５Ｄ遺伝子座からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のゲノム遺伝子座のそれぞれは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＡＰ１遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座、ＭＩＣ－Ａ遺伝子座、ＭＩＣ－Ｂ遺伝子座、及びセーフハーバー遺伝子座からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座からなる群から選択される。

【0301】

いくつかの実施形態では、標的挿入は、表１ｂ、表２または表４に示される遺伝子座のいずれか１つ、例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子、ＴＲＢＣ遺伝子への挿入によるなど、標的遺伝子座への相同性依存型の挿入によるものである。いくつかの実施形態では、標的挿入は、セーフハーバー遺伝子座への挿入によるなど、相同性非依存型の挿入によるものである。場合によっては、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、セーフハーバー遺伝子座、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、表４に示す遺伝子座のいずれか１つに挿入される。場合によっては、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、セーフハーバー遺伝子座に挿入される。

【0302】

特定の実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座またはＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞はＴ細胞であり、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドはＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのうちのいずれか）を使用して、細胞のゲノム遺伝子座内への、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドの挿入が容易にされる。いくつかの実施形態では、操作された細胞はＴ細胞であり、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドはＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのうちのいずれか）を使用し、細胞のゲノム遺伝子座内への、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドの挿入が容易にされる。

【0303】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７タンパク質発現は、ＣＤ４７タンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用し、外因性ＣＤ４７ ｍＲＮＡの存在が確認される。

【0304】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、ヒトＣＤ２００などのＣＤ２００をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２００は、細胞において過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２００の発現は、参照または未改変の細胞がＣＤ２００をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて類似した参照または未改変の細胞（任意の他の改変、例えば、遺伝子改変を有するものを含む）と比較して、操作された初代細胞などの操作された細胞において増加する。ヒトＣＤ２００についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別記号ＧＣ０３Ｐ１１２３３２、ＨＧＮＣ番号７２０３、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ４３４５、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４１２１７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１００４１９６．２、ＮＭ＿００１００４１９６．３、ＮＰ＿００１３０５７５７．１、ＮＭ＿００１３１８８２８．１、ＮＰ＿００５９３５．４、ＮＭ＿００５９４４．６、ＸＰ＿００５２４７５３９．１、及びＸＭ＿００５２４７４８２．２で提供される。特定の実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0305】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、表１Ｂ、表２または表４に示す遺伝子座のいずれか１つに挿入される。場合によっては、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座またはＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞はＴ細胞であり、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドはＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのうちのいずれか）を使用し、細胞のゲノム遺伝子座内への、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドの挿入が容易にされる。

【0306】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２００タンパク質発現は、ＣＤ２００タンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用し、外因性ＣＤ２００ ｍＲＮＡの存在が確認される。

【0307】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、ヒトＨＬＡ－ＥなどのＨＬＡ－Ｅをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅは、細胞において過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅの発現は、参照または未改変の細胞がＨＬＡ－Ｅをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて類似した参照または未改変の細胞（任意の他の改変を有するものを含む）と比較して、操作された初代細胞などの操作された細胞において増加する。ヒトＨＬＡ－Ｅについての有用なゲノム、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別記号ＧＣ０６Ｐ０４７２８１、ＨＧＮＣ番号４９６２、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ３１３３、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１３７４７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００５５０７．３及びＮＭ＿００５５１６．５で提供される。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0308】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、表１Ｂ、表２または表４に示す遺伝子座のいずれか１つに挿入される。場合によっては、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞はＴ細胞であり、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドはＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのうちのいずれか）を使用し、細胞のゲノム遺伝子座内への、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドの挿入が容易にされる。

【0309】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅタンパク質発現は、ＨＬＡ－Ｅタンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用し、外因性ＨＬＡ－Ｅ ｍＲＮＡの存在が確認される。

【0310】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、ヒトＨＬＡ－ＧなどのＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、細胞において過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇの発現は、参照または未改変の細胞がＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて類似した参照または未改変の細胞（任意の他の改変、例えば、遺伝子改変を有するものを含む）と比較して、操作された初代細胞などの操作された細胞において増加する。ヒトＨＬＡ－Ｇについての有用なゲノム、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別記号ＧＣ０６Ｐ０４７２５６、ＨＧＮＣ番号４９６４、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ３１３５、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１７６９３、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００２１１８．１及びＮＭ＿００２１２７．５で提供される。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0311】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、表１ｂ、表２または表４に示す遺伝子座のいずれか１つに挿入される。場合によっては、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座またはＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞はＴ細胞であり、ＨＬＡ－ＧをコードするポリヌクレオチドはＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのうちのいずれか）を使用し、細胞のゲノム遺伝子座内への、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドの挿入が容易にされる。

【0312】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇタンパク質発現は、ＨＬＡ－Ｇタンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用し、外因性ＨＬＡ－Ｇ ｍＲＮＡの存在が確認される。

【0313】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ１などのＰＤ－Ｌ１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、細胞において過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１の発現は、参照または未改変の細胞がＰＤ－Ｌ１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて類似した参照または未改変の細胞（任意の他の改変を有するものを含む）と比較して、操作された初代細胞などの操作された細胞において増加する。ヒトＰＤ－Ｌ１またはＣＤ２７４についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別記号ＧＣ０９Ｐ００５４５０、ＨＧＮＣ番号１７６３５、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ２９１２６、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９ＮＺＱ７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１２５４６３５．１、ＮＭ＿００１２６７７０６．１、ＮＰ＿０５４８６２．１、及びＮＭ＿０１４１４３．３で提供される。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0314】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、表１Ｂ、表２または表４に示す遺伝子座のいずれか１つに挿入される。場合によっては、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞はＴ細胞であり、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドはＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのうちのいずれか）を使用し、細胞のゲノム遺伝子座内への、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入が容易にされる。

【0315】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用し、外因性ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡの存在が確認される。

【0316】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、ヒトＦａｓＬなどのＦａｓＬをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＦａｓＬは、細胞において過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＦａｓＬの発現は、参照または未改変の細胞がＦａｓＬをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて類似した参照または未改変の細胞（任意の他の改変、例えば、遺伝子改変を有するものを含む）と比較して、操作された初代細胞において増加する。ヒトＦａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ１７８、ＴＮＦＳＦ６などとして知られる）についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別記号ＧＣ０１Ｐ１７２６２８、ＨＧＮＣ番号１１９３６、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ３５６、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４８０２３、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００６３０．１、ＮＭ＿０００６３９．２、ＮＰ＿００１２８９６７５．１、及びＮＭ＿００１３０２７４６．１で提供される。特定の実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0317】

いくつかの実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、表１Ｂ、表２または表４に示す遺伝子座のいずれか１つに挿入される。場合によっては、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座またはＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞はＴ細胞であり、Ｆａｓ－ＬをコードするポリヌクレオチドはＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのうちのいずれか）を使用し、細胞のゲノム遺伝子座内への、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドの挿入が容易にされる。

【0318】

いくつかの実施形態では、Ｆａｓ－Ｌタンパク質発現は、Ｆａｓ－Ｌタンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用し、外因性Ｆａｓ－Ｌ ｍＲＮＡの存在が確認される。

【0319】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、ヒトＣＣＬ２１などのＣＣＬ２１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１は、細胞において過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１の発現は、参照または未改変の細胞がＣＣＬ２１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて類似した参照または未改変の細胞（任意の他の改変、例えば、遺伝子改変を有するものを含む）と比較して、操作された初代細胞などの操作された細胞において増加する。ヒトＣＣＬ２１についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別記号ＧＣ０９Ｍ０３４７０９、ＨＧＮＣ番号１０６２０、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ６３６６、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｏ００５８５、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００２９８０．１及びＮＭ＿００２９８９．３で提供される。特定の実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0320】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、表１Ｂ、表２または表４に示す遺伝子座のいずれか１つに挿入される。場合によっては、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞はＴ細胞であり、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドはＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのうちのいずれか）を使用し、細胞のゲノム遺伝子座内への、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドの挿入が容易にされる。

【0321】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１タンパク質発現は、ＣＣＬ２１タンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用し、外因性ＣＣＬ２１ ｍＲＮＡの存在が確認される。

【0322】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、ヒトＣＣＬ２２などのＣＣＬ２２をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２は、細胞において過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２の発現は、参照または未改変の細胞がＣＣＬ２２をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて類似した参照または未改変の細胞（任意の他の改変、例えば、遺伝子改変を有するものを含む）と比較して、操作された初代細胞などの操作された細胞において増加する。ヒトＣＣＬ２２についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別記号ＧＣ１６Ｐ０５７３５９、ＨＧＮＣ番号１０６２１、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ６３６７、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｏ００６２６、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００２９８１．２、ＮＭ＿００２９９０．４、ＸＰ＿０１６８７９０２０．１、及びＸＭ＿０１７０２３５３１．１で提供される。特定の実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0323】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、表１Ｂ、表２または表４に示す遺伝子座のいずれか１つに挿入される。場合によっては、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞はＴ細胞であり、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドはＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのうちのいずれか）を使用し、細胞のゲノム遺伝子座内への、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドの挿入が容易にされる。

【0324】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２タンパク質発現は、ＣＣＬ２２タンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、外因性ＣＣＬ２２ ｍＲＮＡの存在が確認される。

【0325】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、ヒトＭｆｇｅ８などのＭｆｇｅ８をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８は、細胞において過剰発現される。いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８の発現は、参照または未改変の細胞がＭｆｇｅ８をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて類似した参照または未改変の細胞（任意の他の改変、例えば、遺伝子改変を有するものを含む）と比較して、操作された初代細胞などの操作された細胞において増加する。ヒトＭｆｇｅ８についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別記号ＧＣ１５Ｍ０８８８９８、ＨＧＮＣ番号７０３６、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ４２４０、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ０８４３１、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１１０８０８６．１、ＮＭ＿００１１１４６１４．２、ＮＰ＿００１２９７２４８．１、ＮＭ＿００１３１０３１９．１、ＮＰ＿００１２９７２４９．１、ＮＭ＿００１３１０３２０．１、ＮＰ＿００１２９７２５０．１、ＮＭ＿００１３１０３２１．１、ＮＰ＿００５９１９．２、及びＮＭ＿００５９２８．３で提供される。特定の実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0326】

いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、表１Ｂ、表２または表４に示す遺伝子座のいずれか１つに挿入される。場合によっては、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞はＴ細胞であり、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドはＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのうちのいずれか）を使用し、細胞のゲノム遺伝子座内への、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドの挿入が容易にされる。

【0327】

いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８タンパク質発現は、Ｍｆｇｅ８タンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、外因性Ｍｆｇｅ８ ｍＲＮＡの存在が確認される。

【0328】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの操作された細胞は、ヒトＳｅｒｐｉｎＢ９などのＳｅｒｐｉｎＢ９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９は、細胞において過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９の発現は、参照または未改変の細胞がＳｅｒｐｉｎＢ９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて類似した参照または未改変の細胞（任意の他の改変、例えば、遺伝子改変を有するものを含む）と比較して、操作された初代細胞などの操作された細胞において増加する。ヒトＳｅｒｐｉｎＢ９についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別記号ＧＣ０６Ｍ００２８８７、ＨＧＮＣ番号８９５５、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ５２７２、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ５０４５３、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００４１４６．１、ＮＭ＿００４１５５．５、ＸＰ＿００５２４９２４１．１、及びＸＭ＿００５２４９１８４．４で提供される。特定の実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0329】

いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、表１Ｂ、表２または表４に示す遺伝子座のいずれか１つに挿入される。場合によっては、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞はＴ細胞であり、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドはＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのうちのいずれか）を使用し、細胞のゲノム遺伝子座内への、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドの挿入が容易にされる。

【0330】

いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９タンパク質発現は、ＳｅｒｐｉｎＢ９タンパク質に対する抗体によりプローブされた細胞溶解液のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、外因性ＳｅｒｐｉｎＢ９ ｍＲＮＡの存在が確認される。

【0331】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの提供される操作された細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように更に改変される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、初代Ｔ細胞などのＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのＮＫ細胞である。

【0332】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、第３世代ＣＡＲ、及び第４世代ＣＡＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン（例えば１、２または３つのシグナル伝達ドメイン）を含む、第１世代ＣＡＲであるか、または第１世代ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも２つのシグナル伝達ドメインを含む、第２世代ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む、第３世代ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、第４世代のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、及びＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖもしくはＦａｂであるか、または抗体、抗体断片、ｓｃＦｖもしくはＦａｂを含む。

【0333】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞のうちのいずれか１つは、ＣＡＲまたは第１世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。

【0334】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞のいずれか１つは、ＣＡＲまたは第２世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第２世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び２つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中のサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及び／またはＣＡＲ Ｔ細胞存続を増強する。

【0335】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞のうちのいずれか１つは、ＣＡＲまたは第３世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第３世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中のサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及びまたはＣＡＲ Ｔ細胞存続を増強する。いくつかの実施形態では、第３世代ＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの共刺激ドメインは、同じではない。

【0336】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞のいずれか１つは、ＣＡＲまたは第４世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第４世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも２、３または４つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中のサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及びまたはＣＡＲ Ｔ細胞存続を増強する。

【0337】

いくつかの実施形態では、第１、第２、第３または第４世代ＣＡＲは、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含むＣＡＲを含む標的細胞にとって内因性または外因性である。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、炎症促進性サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦもしくはＩＦＮ－γ、またはこれらの機能的断片をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子、もしくはその機能的ドメインもしくは断片であるか、または転写因子、もしくはその機能的ドメインもしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子、もしくはその機能的ドメインもしくは断片であるか、または転写因子、もしくはその機能的ドメインもしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、転写因子またはその機能的ドメインもしくは断片は、活性化Ｔ細胞の核内因子（ＮＦＡＴ）、ＮＦ－ｋＢ、もしくはその機能的ドメインもしくは断片であるか、または活性化Ｔ細胞の核内因子（ＮＦＡＴ）、ＮＦ－ｋＢ、もしくはその機能的ドメインもしくは断片を含む。例えばＺｈａｎｇ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５：２２（２０１７）、ＷＯ２０１６１２６６０８、Ｓｈａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｊａｎ ２７，２０１７，３７（１）を参照されたい。

【0338】

当業者であれば、ＣＡＲ及び様々な構成要素、ならびにＣＡＲの構成に精通している。任意の既知のＣＡＲを、提供される実施形態に関連して使用することができる。本明細書に記載のＣＡＲに加えて、種々のＣＡＲ及びそれらをコードするヌクレオチド配列は当技術分野で公知であり、本明細書に記載される操作された細胞に好適であろう。例えば、ＷＯ２０１３０４０５５７、ＷＯ２０１２０７９０００、ＷＯ２０１６０３０４１４、Ｓｍｉｔｈ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７を参照されたい（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＡＲの例示的な機能と構成要素については、以下の項に記載される。

【0339】

２．キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態では、操作された初代細胞などの提供される操作された細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように更に改変される。いくつかの実施形態では、初代細胞などの提供される細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を調節する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の遺伝子改変を含有し、本明細書に記載される免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、初代細胞などの細胞は、Ｂ２Ｍが低減または排除（例えばノックアウト）されており、ＣＩＩＴＡが低減または排除（例えばノックアウト）されており、ＣＤ４７が過剰発現し、ＣＡＲが発現する細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ－／－、ＣＩＩＴＡ－／－、ＣＤ４７ｔｇ、ＣＡＲ＋である。いくつかの実施形態では、初代細胞（例えば、Ｔ細胞）は更に、ＴＲＡＣが低減または排除（例えば、ノックアウト）されている細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２－／－、ＣＩＩＴＡ－／－、ＣＤ４７ｔｇ、ＴＲＡＣ－／－、ＣＡＲ＋である。

【0340】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、初代細胞に導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、初代Ｔ細胞などのＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのＮＫ細胞である。

【0341】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、第３世代ＣＡＲ、及び第４世代ＣＡＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン（例えば１、２または３つのシグナル伝達ドメイン）を含む、第１世代ＣＡＲであるか、または第１世代ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも２つのシグナル伝達ドメインを含む、第２世代ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む、第３世代ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、第４世代のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、及びＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖもしくはＦａｂであるか、または抗体、抗体断片、ｓｃＦｖもしくはＦａｂを含む。

【0342】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の初代細胞のうちのいずれか１つは、ＣＡＲまたは第１世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。

【0343】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の初代細胞のいずれか１つは、ＣＡＲまたは第２世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第２世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び２つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中のサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及び／またはＣＡＲ Ｔ細胞存続を増強する。

【0344】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の初代細胞のいずれか１つは、ＣＡＲまたは第３世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第３世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中のサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及びまたはＣＡＲ Ｔ細胞存続を増強する。いくつかの実施形態では、第３世代ＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの共刺激ドメインは、同じではない。

【0345】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の初代細胞のいずれか１つは、ＣＡＲまたは第４世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第４世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも２、３または４つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中のサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及びまたはＣＡＲ Ｔ細胞存続を増強する。

【0346】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される操作された初代細胞（例えば、初代Ｔ細胞または初代ＮＫ細胞）は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、ゲノム遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、セーフハーバー遺伝子座、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１、Ｆ３（別名ＣＤ１４２）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＬＲＰ１（別名ＣＤ９１）、ＨＭＧＢ１、ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＦＵＴ１、またはＫＤＭ５Ｄ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＰＤ１、またはＣＴＬＡ４遺伝子に挿入される。本明細書に記載の遺伝子編集法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含む、任意の好適な方法を使用し、ＣＡＲを低免疫原性細胞のゲノム遺伝子座内に挿入することができる。

【0347】

いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、または第４世代ＣＡＲは、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含むＣＡＲを含む標的細胞にとって内因性または外因性である。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、炎症促進性サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦもしくはＩＦＮ－γ、またはこれらの機能的断片をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子、もしくはその機能的ドメインもしくは断片であるか、または転写因子、もしくはその機能的ドメインもしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達の成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子、もしくはその機能的ドメインもしくは断片であるか、または転写因子、もしくはその機能的ドメインもしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、転写因子またはその機能的ドメインもしくは断片は、活性化Ｔ細胞の核内因子（ＮＦＡＴ）、ＮＦ－ｋＢ、もしくはその機能的ドメインもしくは断片であるか、または活性化Ｔ細胞の核内因子（ＮＦＡＴ）、ＮＦ－ｋＢ、もしくはその機能的ドメインもしくは断片を含む。例えばＺｈａｎｇ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５：２２（２０１７）、ＷＯ２０１６１２６６０８、Ｓｈａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｊａｎ ２７，２０１７，３７（１）を参照されたい。

【0348】

当業者であれば、ＣＡＲ及び様々な構成要素、ならびにＣＡＲの構成に精通している。任意の既知のＣＡＲを、提供される実施形態に関連して使用することができる。本明細書に記載のＣＡＲに加えて、種々のＣＡＲ及びそれらをコードするヌクレオチド配列は当技術分野で公知であり、本明細書に記載される操作された細胞に好適であろう。例えば、ＷＯ２０１３０４０５５７、ＷＯ２０１２０７９０００、ＷＯ２０１６０３０４１４、Ｓｍｉｔｈ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７を参照されたい（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＡＲの例示的な機能と構成要素については、以下の項に記載される。

【0349】

ａ．抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、抗体もしくはその抗原結合部分であるか、または抗体もしくはその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖもしくはＦａｂであるか、またはｓｃＦｖもしくはＦａｂを含む。

【0350】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、細胞の細胞表面抗原に結合する。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、特定または特異的な細胞型に特徴的である（例えば、当細胞型によって発現される）。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、複数の細胞型に特徴的である。

【0351】

いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍細胞で排他的にまたは優先的に発現される抗原、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患に特徴的な抗原であり得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、新生細胞に特徴的な抗原を標的とする。例えば、抗原結合ドメインは、新生細胞またはがん細胞によって発現される抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、腫瘍関連抗原に結合する。いくつかの実施形態において、新生細胞に特徴的な抗原（例えば、新生細胞またはがん細胞に関連する抗原）または腫瘍関連抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結型受容体、酵素連結型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ関連受容体から選択される。

【0352】

いくつかの実施形態では、標的抗原は、これらに限定されないが、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、及びＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、及びＦＧＦ２１を含む）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、及びＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体及びＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、及びＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ－１、ＣＩＣ－２、ＣＩＣ－４、ＣＩＣ－５、ＣＩＣ－７、ＣＩＣ－Ｋａ、ＣＩＣ－Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン－１－リン酸受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通型タンパク質、マルチスパン膜貫通型タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ；Ｔ細胞アルファ鎖；Ｔ細胞β鎖；Ｔ細胞γ鎖；Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１６３、Ｆ４／８０、ＩＬ－４Ｒａ、Ｓｃａ－１、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ－１、トランスフェリン受容体、ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ４０、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｆｈ、古典的Ｔｒｅｇ、ＦｏｘＰ３＋、Ｔｒ１、Ｔｈ３、Ｔｒｅｇ１７、Ｔ_ＲＥＧ、ＣＤＣＰ、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２）、ルイス－γ^２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ－ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ－１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ－１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、スムーズンド、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、もしくはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体アルファ（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ－１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒα１、Ｌ１－ＣＡＭ、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン－１１受容体ａ（ＩＬ－１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体－ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、前立腺、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、主要組織適合性複合体クラスＩ関連遺伝子タンパク質（ＭＲ１）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰＩＢ Ｉ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、新生抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ（ＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃ）、Ｈ２－Ｍ３、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、もしくはｔｒｋＣ、またはこれらの抗原断片もしくは抗原部分を含む、抗原である。

【0353】

いくつかの実施形態では、例示的な標的抗原としては、ＣＤＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ７０、κ、λ、及びＢ細胞成熟因子（ＢＣＭＡ）（白血病と関連）；ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＴＡＣＩ、及びＢＣＭＡ（骨髄腫と関連）；ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｂ７Ｈ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲα、ＩＬ－１３Ｒα、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、及びＲＯＲ１（固形腫瘍と関連）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0354】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、リンカーペプチドによって接続されたＦＭＣ６３の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＦＭＣ６３モノクローナル抗体（ＦＭＣ６３）に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、「Ｗｈｉｔｌｏｗ」リンカーペプチドである。ＦＭＣ６３及び派生したｓｃＦｖは、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）及びＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１８／２１３３３７Ａ１号（それらのそれぞれの全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）中で記載される。

【0355】

いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的な抗体のうちの１つに由来する抗体を含み、ＣＤ１９に特異的な抗体は、例えば、ＳＪ２５Ｃ１（Ｂｅｊｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：２３４６－２３５１（１９９５））、ＨＤ３７（Ｐｅｚｕｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８（９）：２７９３－２７９９（１９８７））、４Ｇ７（Ｍｅｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３：３０５－３２０（１９８４））、Ｂ４３（Ｂｅｊｃｅｋ（１９９５））、ＢＬＹ３（Ｂｅｊｃｅｋ（１９９５））、Ｂ４（Ｆｒｅｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，７０：４１８－４２７（１９８７））、Ｂ４ ＨＢ１２ｂ（Ｋａｎｓａｓ＆Ｔｅｄｄｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４０９４－４１０２（１９９１）；Ｙａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１５１７８－１５１８３（２００５）；Ｈｅｒｂｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３５：２１３－２２２（２０１０））、ＢＵ１２（Ｇａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４８（１０）：２９８３－２９８７（１９９２））、及びＣＬＢ ＣＤ１９（Ｄｅ Ｒｉｅ Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８：３６８－３８１（１９８９））を含む。

【0356】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２２ ＣＡＲである。ＣＤ２２は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達の阻害性受容体として機能する、主に成熟Ｂ細胞の表面上に見出される膜貫通タンパク質である。ＣＤ２２は、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病（例えば、慢性Ｂリンパ球性白血病、有毛細胞性白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及びバーキットリンパ腫）の６０～７０％で発現され、Ｂ細胞発生の早期ステージの細胞表面でまたは幹細胞で存在しない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２２に特異的に結合する細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／または細胞内共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、リンカーによって接続されたｍ９７１の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ｍ９７１モノクローナル抗体（ｍ９７１）に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、親抗体ｍ９７１と比較して、有意に改善した（約２ｎＭから５０ｐＭ未満に改善した）ＣＤ２２結合親和性を有するｍ９７１の親和性成熟変異体である、ｍ９７１－Ｌ７に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、ｍ９７１－Ｌ７に由来するｓｃＦｖ抗原断片は、３ｘＧ４Ｓリンカーによって接続されたｍ９７１－Ｌ７のＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、免疫毒素ＨＡ２２またはＢＬ２２を含む。免疫毒素ＢＬ２２及びＨＡ２２は、細菌毒素へ融合されるＣＤ２２について特異的なｓｃＦｖを含み、したがって、ＣＤ２２を発現するがん細胞の表面に結合し、がん細胞を殺傷し得る治療剤である。ＢＬ２２は、緑膿菌外毒素Ａの３８ｋＤａの切断形態へ融合された、抗ＣＤ２２抗体（ＲＦＢ４）のｄｓＦｖを含む（Ｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１１：１５４５－５０（２００５））。ＨＡ２２（ＣＡＴ８０１５、ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）は、ＢＬ２２を突然変異させた、より高親和性のバージョンである（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（１）：６０７－１７（２００５））。ＣＤ２２に特異的なＨＡ２２及びＢＬ２２の抗原結合ドメインの好適な配列は、例えば、米国特許第７，５４１，０３４号、同第７，３５５，０１２号及び同第７，９８２，０１１号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）中で開示される。

【0357】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ ＣＡＲである。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞系譜の細胞で発現される腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦＲ）メンバーであり、終末分化させたＢ細胞または成熟Ｂリンパ球で最も高く発現する。ＢＣＭＡは、長期的な液性免疫の維持のための形質細胞の生存の媒介に関与する。ＢＣＭＡの発現は、最近、多数のがん（多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、様々な白血病、ならびに神経膠芽腫など）に結びつけられた。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的に結合する細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／または細胞内共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に特異的に結合する抗体を含む。ＢＣＭＡに向けられたＣＡＲは、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１６／０１４７８９号、同第ＷＯ２０１６／０１４５６５号、同第ＷＯ２０１３／１５４７６０号、及び同第ＷＯ２０１５／１２８６５３号に記載されている。ＢＣＭＡ結合抗体はまた、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１５／１６６０７３号及び同第ＷＯ２０１４／０６８０７９号にも開示されている。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９（８）：２０４８－２０６０（２０１３）中で記載される、マウスモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ抗体断片は、マウスモノクローナル抗体のヒト化バージョンである（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３１：２１９１－２１９９（２０１７））。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｅａｌ．１１（１）：１４１（２０１８）に記載されるような、ＢＣＭＡの２つのエピトープに結合することができる２本の重鎖（ＶＨＨ）の単一可変断片を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１（１）：２８３（２０２０）中で記載されるような、完全にヒトの重鎖可変ドメイン（ＦＨＶＨ）を含む。

【0358】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、自己免疫障害または炎症性障害を特徴とする抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、自己免疫障害または炎症性障害と関連する抗原に結合する。いくつかの事例では、抗原は、自己免疫障害または炎症性障害と関連する細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害は、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ループス、関節炎、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー、ブドウ膜炎、肝炎、全身性硬化症または強皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、寒冷凝集素症、尋常性天疱瘡、グレーブス病、自己免疫溶血性貧血、血友病Ａ、原発性シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、視神経脊髄炎、エバンス症候群、ＩｇＭ媒介性ニューロパチー、クリオグロブリン血症、皮膚筋炎、特発性血小板減少症、強直性脊椎炎、水疱性類天疱瘡、後天性血管性浮腫、慢性蕁麻疹、抗リン脂質脱髄性多発ニューロパチー、及び自己免疫血小板減少症または好中球減少症または赤芽球癆から選択され、一方で、例示的な同種異系免疫疾患の非限定的な例としては、造血または実質臓器移植、輸血による同種異系感作（ａｌｌｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）（例えば、Ｂｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１５（４）：９３１－４１を参照されたい）または異種感作、胎児同種異系感作を伴う妊娠、新生児の同種異系免疫性血小板減少症、新生児溶血性疾患、酵素またはタンパク質補充療法、血液製剤、及び遺伝子療法で処置される遺伝性または後天性欠損障害の補充に伴い起こり得るものなどの外来抗原への感作が挙げられる。同種異系感作とは、いくつかの事例では、レシピエント対象または妊娠している対象の免疫系が非自己抗原とみなす、ＭＨＣ分子（例えば、ヒト白血球抗原）に対する免疫応答（循環抗体など）の発達を指す。いくつかの実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害に特徴的な抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結受容体、酵素連結受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ関連受容体から選択される。

【0359】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ細胞、形質細胞、または形質芽細胞上に発現したリガンドに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２８、ＴＮＦ、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ、ＺＡＰ－７０、ＬＦＡ－１、ＣＤ３γ、ＣＤ５、またはＣＤ２に結合する。米国特許第２００３／００７７２４９号、ＷＯ２０１７／０５８７５３、ＷＯ２０１７／０５８８５０を参照されたい（これらの文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲである。

【0360】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、老化細胞に特徴的な抗原、例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、老化細胞と関連する抗原に結合する。いくつかの事例では、抗原は、老化細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲを、老化細胞の異常な蓄積を特徴とする障害、例えば、肝線維症及び肺線維症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、ならびに骨関節炎の治療または予防に使用してもよい。

【0361】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、感染性疾患に特徴的な抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、感染性疾患と関連する抗原に結合する。いくつかの事例では、抗原は、感染性疾患によって影響を受けた細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、感染性疾患は、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ））、ヒトＴ－リンパ球向性ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプスタイン－バーウイルス、ＣＭＶ、ヒトパピローマウイルスから選択される。いくつかの実施形態では、感染性疾患に特有の抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結型受容体、酵素連結型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体型セリン／スレオニンキナーゼ、受容体型グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ｇｐｌ２０、またはＨＩＶ－１ Ｅｎｖ上のＣＤ４誘導性エピトープから選択される。

【0362】

これらの実施形態のうちのいずれかでは、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得るか、または細胞外結合ドメインの機能を増加させるために変異体配列を有し得る。

【0363】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、２つの標的抗原に二重特異的である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、異なる標的抗原である。任意のそのような実施形態のいくつかでは、２つの異なる標的抗原は、上記の任意の２つの異なる抗原である。いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは異なり、（ｉ）ＣＤ１９及びＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０及びＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭ及びＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲ及びＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９及びＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲ及びＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴ及びＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲ及びＲＯＲ１からの２つの異なる抗原と結合する。いくつかの実施形態では、２つの異なる抗原結合ドメインのそれぞれは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、第１のｓｃＦｖの１つの可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）のＣ末端は、ポリペプチドリンカーを介して第２のｓｃＦｖ（それぞれ、ＶＬまたはＶＨ）のＮ末端に繋留される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを接続するか、またはＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端とを接続する。これらのｓｃＦｖは、天然抗体の重鎖及び軽鎖に存在する定常領域（Ｆｃ）を欠いている。少なくとも２つの異なる抗原に特異的なこれらのｓｃＦｖは、タンデムで配置され、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。一実施形態では、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合領域と膜貫通ドメインとの間に連結されてもよい。

【0364】

更なる実施形態では、ＣＡＲの各抗原特異的ターゲティング領域は、二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）（または、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ））一本鎖可変断片（ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ）を含む。ｄｉ－ｓｃＦｖを含むＣＡＲでは、各抗原に特異的な２つのｓｃＦｖは、２つのＶＨ領域と２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を生成することによって互いに連結され、タンデムｓｃＦｖを得る（Ｘｉｏｎｇ，Ｃｈｅｎｇ－Ｙｉ；Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ａ；Ｓｈｉ，Ｘ Ｂ；Ｄｅｎａｒｄｏ，Ｇ Ｌ；Ｄｅｎａｒｄｏ，Ｓ Ｊ（２００６）．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉ－ＭＵＣ－１ ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉ－ｓｃＦｖ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ”．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １９（８）：３５９－３６７；Ｋｕｆｅｒ，Ｐｅｔｅｒ；Ｌｕｔｔｅｒｂｕｓｅ，Ｒａｌｆ；Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐａｔｒｉｃｋ Ａ．（２００４）．“Ａ ｒｅｖｉｖａｌ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４）。少なくとも２つの抗原特異的ターゲティング領域を含むＣＡＲは、２つの抗原のそれぞれに特異的な２つのｓｃＦｖを発現するであろう。結果として生じる、少なくとも２つの異なる抗原に特異的な抗原特異的ターゲティング領域は、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに接合される。一実施形態では、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結されてもよい。

【0365】

更なる実施形態では、ＣＡＲの各抗原特異的ターゲティング領域は、ダイアボディを含む。ダイアボディでは、ｓｃＦｖは、２つの可変領域を一緒に折り畳むには短すぎるリンカーペプチドを使用して作製され、ｓｃＦｖを二量体化させる。更に短いリンカー（１つまたは２つのアミノ酸）は三量体、いわゆる、トリアボディまたはトリボディを形成する。四重体も使用することができる。

【0366】

いくつかの実施形態では、細胞は、２つ以上のＣＡＲ、例えば、２つの異なるＣＡＲを発現するように操作され、各ＣＡＲは、異なる標的抗原に向けられた抗原結合ドメインを有する。任意のそのような実施形態のいくつかでは、２つの異なる標的抗原は、上記の任意の２つの異なる抗原である。いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは異なり、（ｉ）ＣＤ１９及びＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０及びＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭ及びＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲ及びＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９及びＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲ及びＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴ及びＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲ及びＲＯＲ１からの２つの異なる抗原と結合する。

【0367】

いくつかの実施形態では、提供される改変を含む、２つの異なる操作細胞が調製され、それぞれは異なるＣＡＲで操作される。いくつかの実施形態では、２つの異なるＣＡＲのそれぞれは、異なる標的抗原に向けられた抗原結合ドメインを有する。任意のそのような実施形態のいくつかでは、２つの異なる標的抗原は、上記の任意の２つの異なる抗原である。いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは異なり、（ｉ）ＣＤ１９及びＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０及びＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭ及びＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲ及びＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９及びＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲ及びＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴ及びＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲ及びＲＯＲ１からの２つの異なる抗原と結合する。いくつかの実施形態では、第１の標的抗原に対して向けられた第１のＣＡＲを発現する操作された細胞（例えば、低免疫原性）の集団と、第２の標的抗原に対して向けられた第２のＣＡＲを発現する操作された細胞（例えば、低免疫原性）の集団とは、別々に対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の細胞集団は、任意の順序で連続して投与される。例えば、第２のＣＡＲを発現する細胞集団は、第１のＣＡＲを発現する細胞集団の投与後に投与される。

【0368】

ｂ．スペーサー
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のスペーサーを更に含み、例えば、スペーサーは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の第１のスペーサーである。いくつかの実施形態では、第１のスペーサーは、免疫グロブリン定常領域、またはその変異体もしくは改変バージョンの少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間の第２のスペーサーである。いくつかの実施形態では、第２のスペーサーはオリゴペプチドであり、例えば、オリゴペプチドは、グリシン及びセリン残基（これらに限定されないが、グリシン－セリンダブレットなど）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、２つ以上のスペーサー、例えば、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサー及び膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間のスペーサーを含む。

【0369】

ｃ．膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、βもしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはその機能的変異体の少なくとも膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及びＦＧＦＲ２Ｂ、またはその機能的変異体の少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む。

【0370】

ｄ．シグナル伝達ドメイン（複数可）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、Ｂ７－１／ＣＤ８０；Ｂ７－２／ＣＤ８６；Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１；Ｂ７－Ｈ２；Ｂ７－Ｈ３；Ｂ７－Ｈ４；Ｂ７－Ｈ６；Ｂ７－Ｈ７；ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２；ＣＤ２８；ＣＴＬＡ－４；Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５；ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８；ＰＤ－１；ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ；ＰＤＣＤ６）；４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７；４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９；ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ；ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７；ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７；ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８；ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８；ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５；ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５；ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５；ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５；ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８；ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８；ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４；ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４；リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ；ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４；ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４；ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ；ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ；ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５；ＴＮＦ－アルファ；ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）；２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４；ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８；ＣＤ２；ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９；ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２；ＣＤ５８／ＬＦＡ－３；ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５；ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３；ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７；ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６；ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）；ＣＤ２；ＣＤ７；ＣＤ５３；ＣＤ８２／Ｋａｉ－１；ＣＤ９０／Ｔｈｙ１；ＣＤ９６；ＣＤ１６０；ＣＤ２００；ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１；ＨＬＡクラスＩ；ＨＬＡ－ＤＲ；Ｉｋａｒｏｓ；インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ；インテグリンアルファ４ベータ１；インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ－１；ＬＡＧ－３；ＴＣＬ１Ａ；ＴＣＬ１Ｂ；ＣＲＴＡＭ；ＤＡＰ１２；デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ；ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６；ＥｐｈＢ６；ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ；ＴＩＭ－４；ＴＳＬＰ；ＴＳＬＰ Ｒ；リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）；ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ３ζドメイン、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、もしくはこれらの機能的断片のうちの１つ以上から選択される１つ、または少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。

【0371】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはこれらの機能的変異体を含む。

【0372】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインであるシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、第２の共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも３つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのうちの１つ以上から選択される共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲが２つ以上の共刺激ドメインを含む場合、２つの共刺激ドメインは、異なる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲが２つ以上の共刺激ドメインを含む場合、２つの共刺激ドメインは、同じである。

【0373】

他の実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的変異体、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的変異体を含む。更に他の実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはそれらの機能的変異体、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的変異体、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはそれらの機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはそれらの機能的変異体、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的変異体、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはそれらの機能的変異体、及び（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0374】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはそれらの機能的変異体を含む。他の実施形態では、少なくとも２つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的変異体、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的変異体を含む。更に他の実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはそれらの機能的変異体、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的変異体、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはこれらの機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的変異体、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的変異体、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的変異体、及び（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0375】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはこれらの機能的変異体を含む。他の実施形態では、少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的変異体、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的変異体を含む。更に他の実施形態では、少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはそれらの機能的変異体、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的変異体、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはこれらの機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的変異体、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的変異体、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的変異体、及び（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0376】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインまたは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的変異体、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的変異体を含む。

【0377】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、または免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的変異体、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的変異体、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的変異体を含む。

【0378】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、または免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的変異体、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、または４－１ＢＢドメイン、またはその機能的変異体、及び／または（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的変異体を含む。

【0379】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、または免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的変異体、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的変異体、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、またはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的変異体、及び（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0380】

ｅ．例示的なＣＡＲ
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原（例えば、腫瘍抗原）に結合する細胞外抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ）、スペーサー（例えば、本明細書に記載のいずれかなどのヒンジドメインを含む）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載のいずれか）、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、任意の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載の一次シグナル伝達ドメインまたは共刺激シグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞質シグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは更に、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン）を含む。このような構成要素はいずれも、上で説明したとおりのいずれかのものであり得る。

【0381】

ＣＡＲの例示的な要素の例は、表３に記載されている。提供される態様では、ＣＡＲにおける各要素の配列には、表３に列挙される任意の組み合わせが含まれ得る。

【0382】

【表3】

【0383】

３．ポリヌクレオチドの発現（例えば、過剰発現）を増加させる方法
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの発現の増加は、様々な技術のいずれかによって実行され得る。例えば、遺伝子及び因子（タンパク質）の発現を調節するための方法には、ゲノム編集技術、及びＲＮＡまたはタンパク質発現技術などが含まれる。これらの技術のすべてについて、周知の組換え技法を使用し、本明細書に概説されるような組換え核酸が生成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの過剰発現または発現の増加のために１つ以上の改変により操作される細胞は、本明細書に記載される任意のソース細胞である。いくつかの実施形態では、ソース細胞は、第ＩＩ．Ｃ節に記載される任意の細胞である。

【0384】

いくつかの実施形態では、遺伝子の発現は、内因性遺伝子活性を増加させる（例えば、外因性遺伝子の転写を増加させる）ことによって増加する。場合によっては、内因性遺伝子の活性は、内因性遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターまたはエンハンサーの活性を増加させることによって増加する。いくつかの実施形態では、プロモーターまたはエンハンサーの活性を増加させることは、内因性プロモーターまたはエンハンサーの活性を増加させる１つ以上の改変を、内因性プロモーターまたはエンハンサーに行うことを含む。場合によっては、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることは、遺伝子の内因性プロモーターを改変することを含む。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることは、異種プロモーターを導入することを含む。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

【0385】

ａ．ＤＮＡ結合融合タンパク質
いくつかの実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＣＤ４７、または別の免疫寛容原性因子）の発現は、（１）内因性ＣＤ４７または他の遺伝子に特異的な部位特異的結合ドメイン、及び（２）転写活性化因子を含有する、融合タンパク質またはタンパク質複合体の発現によって増加される。

【0386】

いくつかの実施形態では、制御因子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの部位特異的ＤＮＡ結合核酸分子から構成される。いくつかの実施形態では、方法は、部位特異的ＤＮＡ結合標的化タンパク質、例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはＺＦＰを含有する融合タンパク質（別名ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ））によって達成される。

【0387】

いくつかの実施形態では、制御因子は、標的領域にて遺伝子に特異的に結合またはハイブリダイズする、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸を使用した、部位特異的結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、提供されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、改変ヌクレアーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼに連結されるか、またはそれと複合体化される。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、改変ヌクレアーゼ、例えば、メガヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、例えば、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖回文配列核酸（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムのＤＮＡ標的化タンパク質を含む融合体を使用して成し遂げられる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を欠くように改変される。いくつかの実施形態では、改変ヌクレアーゼは、触媒的に死んだｄＣａｓ９である。

【0388】

いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、及びＩ－ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５－１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３及びｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように操作され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６、米国特許公開第２００７／０１１７１２８号を参照されたい。

【0389】

ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ及びＣＲＩＳＰＲシステムの結合ドメインは、例えば、天然型ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域を操作すること（１つ以上のアミノ酸を変化させること）によって、既定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」され得る。操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ及び／またはＴＡＬＥ設計及び結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムを含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号を参照されたい。また、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６及びＷＯ０３／０１６４９６及び米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

【0390】

いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、配列特異的様態でＤＮＡに結合する１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはそのドメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、亜鉛イオンの配位により構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的様態でＤＮＡに結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。

【0391】

ＺＦＰの中には、個々のフィンガーの集合によって生成される、典型的には９～１８ヌクレオチド長の特異的ＤＮＡ配列を標的とする人工ＺＦＰドメインがある。ＺＦＰには、単一のフィンガードメインの長さがおよそ３０アミノ酸であり、単一のベータターンの２つのシステインと共に亜鉛へと配位結合した２つの不変のヒスチジン残基を含有するアルファヘリックスを含有し、２、３、４、５、または６つのフィンガーを有するものが含まれる。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガーの認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置（－１、２、３、及び６）にてアミノ酸置換を行うことによって変化させてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＺＦＰまたはＺＦＰ含有分子は、非天然型であり、例えば、選択する標的部位に結合するように操作される。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、及び米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたく、すべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0392】

多くの遺伝子特異的な操作されたジンクフィンガーは、市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と提携して、研究者がジンクフィンガーの構築及び検証を完全に省略することを可能にするジンクフィンガー構築のためのプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発し、何千ものタンパク質に対して特異的に標的化されたジンクフィンガーを提供する（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（７），３９７－４０５）。いくつかの実施形態では、市販のジンクフィンガーが使用されるか、またはカスタム設計される。

【0393】

いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、天然に存在するまたは操作された（天然に存在しない）転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質におけるものを含む。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0394】

いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの関連において「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされた部分的ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの関連において「スペーサー」、または「標的化配列」とも称される）、及び／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含めた、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するかまたはその活性を導く転写物及び他のエレメントを総称的に指す。

【0395】

一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有するポリヌクレオチド配列を含む、ターゲティングドメイン（例えば、ターゲティング配列）を含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントされたときに、約５０％以上、約６０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上、またはそれを超える。いくつかの例では、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、標的核酸上の標的配列に相補的、例えば、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相補的、例えば、完全に相補的である。

【0396】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるような任意のものであり得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＤ４７の標的部位に相補的であるターゲティング配列、例えば、配列番号２００７８４～２３１８８５（ＷＯ２０１６１８３０４１の表２９、付録２２）のうちのいずれか１つに記載されるもの；ＨＬＡ－Ｅの標的部位に相補的であるターゲティング配列、例えば、配列番号１８９８５９～１９３１８３（ＷＯ２０１６１８３０４１の表１９、付録１２）のうちのいずれか１つに記載されるもの；ＨＬＡ－Ｆの標的部位に相補的であるターゲティング配列、例えば、配列番号６８８８０８～６９９７５４（ＷＯ２０１６１８３０４１の表４５、付録３８）のうちのいずれか１つに記載されるもの；ＨＬＡ－Ｇの標的部位に相補的であるターゲティング配列、例えば、配列番号１８８３７２～１８９８５８（ＷＯ２０１６１８３０４１の表１８、付録１１）のうちのいずれか１つに記載されるもの；またはＰＤ－Ｌ１の標的部位に相補的であるターゲティング配列、例えば、配列番号１９３１８４～２００７８３（ＷＯ２０１６１８３０４１の表２１、付録１４）のうちのいずれか１つに記載されるものを有する。

【0397】

いくつかの実施形態では、標的部位は、標的遺伝子の転写開始部位の上流にある。いくつかの実施形態では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位に隣接している。いくつかの実施形態では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ休止部位に隣接している。

【0398】

いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、転写開始、１つ以上の転写エンハンサーもしくは活性化因子、及び／またはＲＮＡポリメラーゼの結合を促進するための標的遺伝子のプロモーター領域を標的とするように構成される。１つ以上のｇＲＮＡを使用し、遺伝子のプロモーター領域を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子の１つ以上の領域が標的とされ得る。特定の態様では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）のいずれかの側の６００塩基対以内にある。

【0399】

エクソン配列ならびにプロモーター及び活性化因子を含む制御領域の配列を含めた、遺伝子を標的とする配列であるかまたはその配列を含む、ｇＲＮＡ配列（すなわち、ｇＲＮＡターゲティング配列）を設計または同定することは、当業者の技能水準の範囲内である。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集のためのゲノムワイドのｇＲＮＡデータベースは公共に利用可能であり、ヒトゲノムまたはマウスゲノムにおける遺伝子の構成的エクソンにおける例となる単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）標的配列を含有する（例えば、ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ－ｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔｍｌを参照されたい。Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１：７８３－４；ｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／；ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／も参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、非標的遺伝子へのオフターゲット結合が最小であるターゲティング配列であるか、またはそれを含む。

【0400】

いくつかの実施形態では、制御因子は、機能的ドメイン、例えば、転写活性化因子を更に含む。

【0401】

いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、標的遺伝子の１つ以上の転写制御要素などの１つ以上の制御要素であるか、またはそれを含有し、それによって、上記で提供されるような部位特異的ドメインが認識されて、かかる遺伝子の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、標的遺伝子の発現を駆動する。場合によっては、転写活性化因子は、異種トランス活性化ドメインの全部または一部分であり得るか、またはそれを含有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、単純ヘルペス由来トランス活性化ドメイン、Ｄｎｍｔ３ａメチルトランスフェラーゼドメイン、ｐ６５、ＶＰ１６、及びＶＰ６４から選択される。

【0402】

いくつかの実施形態では、制御因子は、ジンクフィンガー転写因子（ＺＦ－ＴＦ）である。いくつかの実施形態では、制御因子は、ＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲ）である。

【0403】

特定の実施形態では、制御因子は、転写制御ドメインを更に含む。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子）、サイレンサー、発がん遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連因子及び修飾因子；ＤＮＡ再構成酵素ならびにそれらの関連因子及び修飾因子；クロマチン関連タンパク質及びそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、及びデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＭＴファミリーのメンバーなどのメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌなど、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにそれらの関連因子及び修飾因子が含まれる。例えば、米国特許公開第２０１３／０２５３０４０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0404】

活性化を達成するための好適なドメインには、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２－５９６２（１ ９７）を参照されたい）核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３－３８３（１９９８）を参照されたい）、核因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ＆Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０－５６１８（１９９８）及びＤｏｙｌｅ＆Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７－２９４２（１９９７））；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３－２８（１９９８））、または人工キメラ機能的ドメイン、例えば、ＶＰ６４（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６２３－３３）、及びデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８，６４３９－６４４７）が含まれる。追加の例示的な活性化ドメインには、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐｌ、ＡＰ－２、及びＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯＪ．１１，４９６１－４９６８（１９９２）、ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、及びＥＲＦ－２が含まれる。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９－３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２３：２５５－２７５；Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１－１１；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ－Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７－８９；ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３－１２；Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７－２８３；及びＬｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９－５０４を参照されたい。追加の例となる活性化ドメインには、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃｌ、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、－６、－１、及び－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、及びＴＲＡＢ１が含まれるが、これらに限定されず、例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１－２９；Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７－９９；Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８－３０９；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０：４１９－４２９；Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４－５８４９；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ－Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１－８；Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３－４４；及びＨｏｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８－１５，３５３を参照されたい。

【0405】

遺伝子抑制因子を作製するために使用され得る、例となる抑制ドメインには、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌなど）、Ｒｂ、及びＭｅＣＰ２が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１－４５４；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３－４４６；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７－４５０；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８－３４２を参照されたい。追加の例となる抑制ドメインには、ＲＯＭ２及びＡｔＨＤ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５－３２１；及びＷｕ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９－２７を参照されたい。

【0406】

いくつかの事例では、ドメインは、染色体の後成的制御に関与する。いくつかの実施形態では、ドメインは、核局在性のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）（例えば、Ａ型）、例えば、ＭＹＳＴファミリーメンバーＭＯＺ、Ｙｂｆ２／Ｓａｓ３、ＭＯＦ、及びＴｉｐ６０、ＧＮＡＴファミリーメンバーＧｃｎ５またはｐＣＡＦ、ｐ３００ファミリーメンバーＣＢＰ、ｐ３００、またはＲｔｔｌ０９（Ｂｅｍｄｓｅｎ ａｎｄ Ｄｅｎｕ（２００８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １８（６）：６８２－６８９）である。他の事例では、ドメインは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤ ＡＣ）、例えば、クラスＩ（ＨＤＡＣ－ｌ、２、３、及び８）、クラスＩＩ分子（ＨＤＡＣ ＩＩＡ（ＨＤＡＣ－４、５、７及び９）、ＨＤ ＡＣ ＩＩＢ（ＨＤＡＣ ６及び１０））、クラスＩＶ（ＨＤＡＣ－１１）、クラスＩＩＩ（サーチュイン（ＳＩＲＴ）；別名ＳＩＲＴ１－７）である（Ｍｏｔｔａｍａｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０（３）：３８９８－３９４ｌを参照されたい）。いくつかの実施形態で使用される別のドメインは、ヒストンホスホリラーゼまたはキナーゼであり、例としては、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＤＮＡ－ＰＫ、Ｂｕｂｌ、ＶｐｒＢＰ、ＩＫＫ－ａ、ＰＫＣｐｉ、Ｄｉｋ／Ｚｉｐ、ＪＡＫ２、ＰＫＣ５、ＷＳＴＦ、及びＣＫ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、メチル化ドメインが使用され、Ｅｚｈ２、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲＭＴ ２／６、ＣＡＲＭ１、ｓｅｔ７／９、ＭＬＬ、ＡＬＬ－１、Ｓｕｖ３９ｈ、Ｇ９ａ、ＳＥＴＤＢ１、Ｅｚｈ２、Ｓｅｔ２、Ｄｏｔｌ、ＰＲＭＴ １／６、ＰＲＭＴ ５／７、ＰＲ－Ｓｅｔ７及びＳｕｖ４－２０ｈなどの群から選択され得る。スモ化及びビオチン化に関与するドメイン（Ｌｙｓ９、１３、４、１８及び１２）もいくつかの実施形態で使用され得る（概説はＫｏｕｓａｒｉｄｅｓ（２００７）Ｃｅｌｌ １２８：６９３－７０５を参照されたい）。

【0407】

融合分子は、当業者に周知であるクローニング方法及び生化学的コンジュゲーション方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメイン及び機能的ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子はまた、任意選択で、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原からのシグナルなど）及びエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧ及びヘマグルチニンなど）を含む。融合タンパク質（及びそれらをコードする核酸）は、融合体の構成要素の間で翻訳リーディングフレームが保存されるように設計される。

【0408】

一方で機能的ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド構成要素と、他方で非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、副溝結合剤、核酸）との間の融合体は、当業者に既知の生化学的コンジュゲーション方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの間の融合体を作製するための方法及び組成物が記載されている。Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：３９３０－３９３５。同様に、ポリペプチド構成要素である機能ドメインと関連付けてｓｇＲＮＡ核酸である構成要素を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦ及びヌクレアーゼもまた、当業者に既知であると共に、本明細書に詳述される。

【0409】

ｂ．外因性ポリペプチド
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの発現の増加（すなわち、過剰発現）は、過剰発現されるポリヌクレオチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを初代細胞に導入することによって媒介される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、組換え核酸である。周知の組換え技法を使用し、本明細書に概説されるような組換え核酸が生成される。

【0410】

特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチド、例えば、免疫寛容原性因子またはキメラ抗原受容体をコードする組換え核酸は、発現コンストラクトにおける１つ以上の制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。制御ヌクレオチド配列は通常、治療される宿主細胞及びレシピエント対象にとって適切である。多数のタイプの適切な発現ベクター及び好適な制御配列は、多様な宿主細胞についての当技術分野で知られている。典型的には、１つ以上の制御ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、及びエンハンサーまたは活性化因子配列が含まれ得るが、これらに限定されない。当技術分野で既知であるような構成的または誘導性プロモーターもまた企図される。プロモーターは、天然型プロモーター、または２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれでもよい。発現コンストラクトは、細胞においてプラスミドなどのエピソーム上に存在してもよいし、または発現コンストラクトは、染色体に挿入されてもよい。具体的な実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択可能マーカー遺伝子を含む。特定の実施形態は、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結された変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを含む。本明細書で使用するための制御配列には、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメントが含まれる。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換される宿主細胞、発現させることが望まれる特定の変異体ポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び／またはベクターによってコードされる任意の他のタンパク質、例えば、抗生物質マーカーの発現の選定に対して設計される。

【0411】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、操作された細胞における外因性ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている。好適な哺乳動物プロモーターの例としては、例えば、以下の遺伝子からのプロモーター、すなわち、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（ＷＯ９７／１５６６４）、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長鎖末端反復配列領域、マウス乳癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス長鎖末端反復配列領域、及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターが挙げられる。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリンまたはヒートショックプロモーター（複数可）である。追加の実施形態では、哺乳動物宿主細胞において使用するためのプロモーターは、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ２，２１１，５０４）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られ得る。更なる実施形態では、異種哺乳動物プロモーターが使用される。例としては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、及び熱ショックプロモーターが挙げられる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３－１２０（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素断片として好都合に得られる（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２））。前述の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。

【0412】

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、バイシストロン性またはマルチシストロン性発現ベクターである。バイシストロン性またはマルチシストロン性発現ベクターには、（１）オープンリーディングフレームの各々に融合された複数のプロモーター、（２）遺伝子間のスプライシングシグナルの挿入、（３）発現が単一プロモーターによって駆動される遺伝子の融合、及び（４）遺伝子間のタンパク質分解切断部位（自己切断ペプチド）の挿入または遺伝子間の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の挿入が含まれ得る。

【0413】

いくつかの実施形態では、本明細書の発現ベクターまたはコンストラクトは、マルチシストロン性コンストラクトである。「マルチシストロン性コンストラクト」及び「マルチシストロン性ベクター」という用語は、本明細書では互換的に使用され、１つのｍＲＮＡ分子に転写される組換えＤＮＡコンストラクトであって、１つのｍＲＮＡ分子が２つ以上の遺伝子（例えば、２つ以上の導入遺伝子）をコードする、組換えＤＮＡコンストラクトを指す。マルチシストロン性コンストラクトは、２つの遺伝子をコードする場合はバイシストロン性コンストラクト、３つの遺伝子をコードする場合はトリシストロン性コンストラクト、４つの遺伝子をコードする場合はクアドロシストン性コンストラクトなどと称され、以下同様である。

【0414】

いくつかの実施形態では、ベクターまたはコンストラクト（例えば、導入遺伝子）に含まれる２つ以上の外因性ポリヌクレオチドはそれぞれ、マルチシストロン性分離エレメントによって隔てられる。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性分離エレメントは、ＩＲＥＳ、または切断可能なペプチドもしくはリボソームスキップエレメントをコードする配列である。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性分離エレメントは、脳心筋炎（ＥＭＣＶ）ウイルスＩＲＥＳなどのＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性分離エレメントは、２Ａペプチドなどの切断可能なペプチドである。例示的な２Ａペプチドとしては、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、及びＦ２Ａペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、Ｔ２Ａである。いくつかの実施形態では、２つ以上の外因性ポリヌクレオチド（例えば、第１の外因性ポリヌクレオチド及び第２の外因性ポリヌクレオチド）は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリヌクレオチド及び第２の外因性ポリヌクレオチドは、それぞれプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、同じプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１プロモーターである。

【0415】

場合によっては、外因性ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の免疫寛容原性因子または補体抑制因子をコードする外因性ポリヌクレオチド）は、マルチシストロン性ベクターによってコードされる外因性ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で、切断可能なペプチドまたはリボソームスキップエレメント、例えば、Ｔ２Ａをコードする。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドまたはリボソームスキップエレメントを含めることにより、単一の翻訳開始部位からの２つ以上のポリペプチドの発現が可能になる。いくつかの実施形態では、切断可能ペプチドは、Ｔ２Ａである。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号１５で示されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号１６で示されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号２１で示されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。

【0416】

いくつかの実施形態では、ベクターまたはコンストラクトは、外因性ポリヌクレオチドの１つ以上の転写ユニットの発現を駆動する単一のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、そのようなベクターまたはコンストラクトは、マルチシストロン性（バイシストロン性またはトリシストロン性、例えば、米国特許第６，０６０，２７３号を参照）であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、転写ユニットは、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を含むバイシストロン性ユニットとして操作され得、これにより、単一のプロモーターから転写されたＲＮＡから、遺伝子産物（例えば、ＣＤ４７などの１つ以上の免疫寛容原性因子）の共発現が可能になる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するベクターまたはコンストラクトはバイシストロン性であり、ベクターまたはコンストラクトが２つの別個のポリペプチドを発現することを可能にする。場合によっては、ベクターまたはコンストラクトによってコードされる２つの別個のポリペプチドは、免疫寛容原性因子（例えば、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３から選択される２つの因子（これらの任意の組み合わせを含む））である。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００、及びＭｆｇｅ８（これらの任意の組み合わせを含む）のうちの２つ以上である。いくつかの実施形態では、ベクターまたはコンストラクトによってコードされる２つの別個のポリペプチドは、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するベクターまたはコンストラクトはトリシストロン性であり、ベクターまたはコンストラクトが３つの別個のポリペプチドを発現することを可能にする。場合によっては、トリシストロン性ベクターまたはコンストラクトの３つの核酸配列は、ＣＤ４７などの免疫寛容原性因子である。場合によっては、トリシストロン性ベクターまたはコンストラクトの３つの核酸配列は、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３（これらの任意の組み合わせを含む）から選択される、３つの免疫寛容原性因子である。いくつかの実施形態では、３つの免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００、及びＭｆｇｅ８（これらの任意の組み合わせを含む）から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するベクターまたはコンストラクトはクアドシストロン性であり、ベクターまたはコンストラクトが４つの別個のポリペプチドを発現することを可能にする。場合によっては、クアドシストロン性ベクターまたはコンストラクトの４つの別個のポリペプチドは、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３（これらの任意の組み合わせを含む）から選択される、４つの免疫寛容原性因子である。いくつかの実施形態では、４つの免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００、及びＭｆｇｅ８（これらの任意の組み合わせを含む）から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のベクターまたはコンストラクトを含み、各ベクターまたはコンストラクトは、上述のモノシストロン性またはマルチシストロン性コンストラクトであり、モノシストロン性またはマルチシストロン性コンストラクトは、任意の組み合わせまたは順序で１つ以上の免疫寛容原性因子をコードする。

【0417】

いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のベクターまたはコンストラクトを含み、各ベクターまたはコンストラクトは、上述のモノシストロン性またはマルチシストロン性コンストラクトであり、モノシストロン性またはマルチシストロン性コンストラクトは、任意の組み合わせまたは順序で１つ以上の免疫寛容原性因子をコードする。

【0418】

いくつかの実施形態では、単一のプロモーターは、自己切断ペプチド（例えば、２Ａ配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フューリン）をコードする配列によって互いに隔てられた２つ、３つまたは４つの遺伝子を単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に含む（例えば、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）をコードする）ＲＮＡの発現を誘導する。したがって、ＯＲＦは、単一のポリペプチドをコードし、翻訳中（２Ａの場合）または翻訳後のいずれかに、個別のタンパク質にプロセシングされる。場合によっては、Ｔ２Ａなどのペプチドは、リボソームに２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップさせて（リボソームスキッピング）、２Ａ配列の末端と下流にある次のペプチドとの間の分離をもたらすことができる（例えば、ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒ．２：１３（２００４）及びｄｅＦｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｆｆｉｃ ５：６１６－６２６（２００４）を参照のこと）。数多くの２Ａエレメントが当技術分野で公知である。本明細書に開示されている方法及び核酸で使用できる２Ａ配列の例としては、米国特許出願公開第２００７０１１６６９０号に記載されている、口蹄疫ウイルス由来の２Ａ配列（Ｆ２Ａ、例えば、配列番号２０）、ウマ鼻炎Ａウイルス由来の２Ａ配列（Ｅ２Ａ、例えば、配列番号１９）、ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス由来の２Ａ配列（Ｔ２Ａ、例えば、配列番号１５、１６、２１または２２）、及びブタテシオウイルス－１由来の２Ａ配列（Ｐ２Ａ、例えば、配列番号１７または１８）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0419】

ベクターまたはコンストラクト（例えば導入遺伝子）が、タンパク質をコードする２つ以上の核酸配列、例えば、ＣＤ４７をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、及び第２の導入遺伝子をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドを含む場合には、ベクターまたはコンストラクト（例えば導入遺伝子）は、ペプチドをコードする核酸配列を、第１の外因性ポリヌクレオチド配列と第２の外因性ポリヌクレオチド配列の間に更に含んでもよい。場合によっては、第１の外因性ポリヌクレオチドと第２の外因性ポリヌクレオチドとの間に配置される核酸配列は、翻訳中または翻訳後に第１の外因性ポリヌクレオチド及び第２の外因性ポリヌクレオチドの翻訳産物を隔てるペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ペプチドは、自己切断ペプチド、またはＴ２Ａペプチドなどのリボソームスキッピングを引き起こすペプチド（リボソームスキップエレメント）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドまたはリボソームスキップエレメントを含めることにより、１つの翻訳開始部位から、２つ以上のポリペプチドが発現可能になる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである自己切断ペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号１５で示されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号１６で示されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号２１で示されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。

【0420】

本明細書に記載のポリヌクレオチドを初代細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技法によって達成され得る。好適な技法には、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスポザーゼ媒介性送達、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス形質導入を介して細胞に導入されるか（例えば、レンチウイルス形質導入）、またはウイルスベクター上で別様に送達される（例えば、フソゲン媒介性送達）。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドをパッケージングするベクターを使用し、パッケージングされたポリヌクレオチドを細胞または細胞集団に送達することができる。これらのベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、ウイルスベクター及び粒子を含む、任意の種類のものであってもよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子を使用し、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを使用し、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達することができる。ウイルスベクター技術は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。ベクターとして有用なウイルスの例としては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、腫瘍溶解性ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入は、特異的（標的化）または非特異的（例えば、非標的化）であり得る。いくつかの実施形態では、細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入は、細胞へのゲノムへの組込みまたは挿入をもたらし得る。他の実施形態では、導入された外因性ポリヌクレオチドは、細胞への非組込みまたはエピソームであり得る。当業者であれば、本明細書に記載される例示的な方法のいずれかを含む、細胞への核酸導入遺伝子を導入する方法に精通しており、適切な方法を選択することができる。

【0421】

１）非標的送達
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、様々な非標的方法のいずれかによって初代細胞（例えば、ソース細胞）に導入される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、宿主細胞のランダムなゲノム遺伝子座に挿入される。当業者には公知のように、例えば、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを含むウイルスベクターは、遺伝物質を宿主細胞に送達し、遺伝子の安定した発現及び複製を促進するために外来遺伝子または外因性遺伝子を宿主細胞ゲノムにランダムに挿入するために、一般に使用される。いくつかの実施形態では、細胞への外因性ポリヌクレオチドの非標的導入は、細胞での外因性ポリヌクレオチドの安定した発現のための条件下にある。いくつかの実施形態では、細胞での安定な発現のための核酸を導入する方法は、核酸が組み込まれた細胞が分裂した場合に核酸が増殖し得るように、細胞のゲノムへの核酸の安定した組込みをもたらす任意の方法を含む。

【0422】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、送達された核酸転写物に含まれる遺伝子の安定した発現を可能にするため、ウイルス形質導入を成功させるために特に有用な手段である。レンチウイルスベクターは、送達された核酸転写物に含まれる遺伝子の安定した発現に必要な２つの酵素である、逆転写酵素及びインテグラーゼを発現する。逆転写酵素がＲＮＡ転写物をＤＮＡに転換する一方で、インテグラーゼは、ＤＮＡを標的細胞のゲノムに挿入して組み込む。ＤＮＡがゲノムに安定して組み込まれると、それは宿主と共に分裂する。組み込まれたＤＮＡ内に含まれる目的の遺伝子は、構成的に発現してもよいし、誘導性であってもよい。宿主細胞ゲノムの一部として、それは、標的細胞内の多数の因子に応じて、活性化または抑制を含む細胞調節を受ける可能性がある。

【0423】

レンチウイルスはレトロウイルス科のウイルスの亜群であり、宿主ゲノムに組み込まれる前にウイルスＲＮＡゲノムのＤＮＡへの逆転写が必要であることから命名された。したがって、レンチウイルス媒体／粒子の最も重要な特徴は、その遺伝物質が標的／宿主細胞のゲノムに組み込まれることである。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウマ伝染性貧血、ウイルス、ビスナ・マエディウイルス、ならびにヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられる。

【0424】

通常、遺伝子送達媒体を構成するレンチウイルス粒子は、それ自体では複製欠陥性である（「自己不活性化」とも称される）。レンチウイルスは、無傷の宿主核膜を介した侵入機構により、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができる（Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｉｅｃｋｎｏｌ，１９９８，９：４５７－４６３）。組換えレンチウイルス媒体／粒子は、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重に弱毒化することによって生成されており、例えば、遺伝子Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ及びＴａｔを欠失させて、ベクターを生物学的に安全なものにする。同様に、例えば、ＨＩＶ－１／ＨＩＶ－２由来のレンチウイルス媒体は、非分裂細胞への導入遺伝子の効率的な送達、組込み、及び長期発現を媒介することができる。

【0425】

レンチウイルス粒子は、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞などのプロデューサー細胞内でウイルスパッケージングエレメント及びベクターゲノム自体を共発現させることによって生成され得る。これらのエレメントは通常、３つ（第２世代のレンチウイルスシステムの場合）または４つの別個のプラスミド（第３世代のレンチウイルスシステムの場合）で提供される。プロデューサー細胞は、ウイルスのコア（すなわち、構造タンパク質）及び酵素成分、ならびにエンベロープタンパク質（複数可）（パッケージング系と称される）を含むレンチウイルス成分をコードするプラスミドと、標的細胞、媒体自体に導入される外来導入遺伝子を含むゲノム（導入ベクターとも称される）をコードするプラスミドと、共導入される。一般に、プラスミドまたはベクターは、プロデューサー細胞株に含まれる。プラスミド／ベクターは、トランスフェクション、形質導入、または感染を介してプロデューサー細胞株に導入される。トランスフェクション、形質導入、または感染の方法は、当業者には周知である。非限定的な例として、パッケージング及び導入コンストラクトは、一般的にはネオミオシン（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタミン合成酵素またはアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）のような優性選択可能マーカーと共に、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションによってプロデューサー細胞株に導入することができ、続いて適切な薬剤の存在下で選択し、クローンを単離する。

【0426】

プロデューサー細胞は、外来遺伝子、例えば、外因性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む、組換えウイルス粒子を産生する。組換えウイルス粒子は培養培地から回収され、当業者が使用する標準的な方法によって滴定される。組換えレンチウイルス媒体を使用し、第ＩＩ．Ｃ節に記載されるいずれかを含むソース細胞などの標的細胞を感染させる。

【0427】

高力価レンチウイルス粒子を生成するために使用できる細胞には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、２９３Ｇ細胞、ＳＴＡＲ細胞（Ｒｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５，１１：４５２－４５９）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及び他のＨＥＫ２９３Ｔ系プロデューサー細胞株（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．＿２０１１，２，２．（３）：３５７～３６９、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１２，１０９９６）：１５５１－１５６０、Ｔｈｒｏｍ ｅｔ ａｌ．．Ｂｌｏｏｄ．２００９，１１３（２１）：５１０４－５１１０）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0428】

レンチウイルス粒子に提供される追加のエレメントは、５’末端または３’末端のいずれかのレトロウイルスＬＴＲ（長末端反復）、レトロウイルス輸送エレメント、任意選択で、レンチウイルス逆応答エレメント（ＲＲＥ）、プロモーターまたはその活性部分、及び遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）またはその活性部分を含み得る。他のエレメントには、非分裂細胞における形質導入効率を改善させる中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）配列、導入遺伝子の発現を強化し、力価を増加させるウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が含まれる。

【0429】

組換えレンチウイルス粒子を生成する方法は、当業者に公知である。例えば、米国特許第８，８４６，３８５号、同第７，７４５，１７９号、同第７，６２９，１５３号、同第７，５７５，９２４号、同第７，１７９，９０３号及び同第６，８０８，９０５号。使用されるレンチウイルスベクターは、ｐＬＶＸ、ｐＬｅｎｔｉ、ｐＬｅｎｔｉ６、ｐＬＪＭｌ、ＦＵＧＷ、ｐＷＰＸＬ、ｐＷＰＩ、ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ ｐｕｒｏ ＤＥＳＴ、ｐＬＪＭｌ－ＥＧＦＰ、ｐＵＬＴＲＡ、ｐＩｎｄｕｃｅｒ２Ｑ、ｐＨＩＶ－ＥＧＦＰ、ｐＣＷ５７．１、ｐＴＲＰＥ、ｐＥＬＰＳ、ｐＲＲＬ、及びｐＬｉｏｎＩＩから選択され得るが、これらに限定されない。任意の既知のレンチウイルス媒体もまた使用され得る（米国特許第９，２６０，７２５号、同第９，０６８，１９９号、同第９，０２３，６４６号、同第８，９００，８５８号、同第８，７４８，１６９号、同第８，７０９，７９９号、同第８，４２０，１０４号、同第８，３２９，４６２号、同第８，０７６，１０６号、同第６，０１３，５１６号、及び同第５，９９４，１３６号、国際特許公開第ＷＯ２０１２０７９０００号を参照されたい）。

【0430】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞の一過性発現のための条件下で、例えば、外因性ポリヌクレオチドのエピソーム送達をもたらす方法によって、細胞に導入される。

【0431】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターにパッケージングされ得る。このようなベクターまたはウイルス粒子は、既知の血清型キャプシドまたは血清型キャプシドの組み合わせのいずれかを利用するように設計され得る。血清型キャプシドには、任意の同定されたＡＡＶ血清型及びその変異体、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２及びＡＡＶｒｈ１０からのキャプシドが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、米国特許公開第ＵＳ２００３０１３８７７２号、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，１９（６）：１０７０－１０７８、米国特許第６，１５６，３０３号、同第７，１９８，９５１号、米国特許公開第ＵＳ２０１５／０１５９１７３号及び同第ＵＳ２０１４／０３５９７９９号、ならびに国際特許公開第ＷＯ１９９８／０１１２４４号、同第ＷＯ２００５／０３３３２１号及び同第ＷＯ２０１４／１４４２２号に記載される配列であり得るか、またはその配列を有し得る。

【0432】

ＡＡＶベクターには、一本鎖ベクターだけでなく、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）も含まれる。ｓｃＡＡＶベクターには、一緒にアニーリングして二本鎖ベクターゲノムを形成する、ＤＮＡが含まれる。第２の鎖の合成をスキップすることにより、ｓｃＡＡＶは、細胞での迅速な発現を可能にする。ｒＡＡＶベクターは、ｓｆ９昆虫細胞またはＨＥＫ２９３細胞などのヒト細胞の懸濁細胞培養において、トリプル遺伝子導入などの当技術分野の標準的な方法によって製造され得る。

【0433】

いくつかの実施形態では、非ウイルスベースの方法が使用され得る。例えば、いくつかの態様では、ポリヌクレオチドを含むベクターは、ニードル、エレクトロポレーション、ソノポレーション、ハイドロポレーションなどの物理的方法；無機粒子（例えば、リン酸カルシウム、シリカ、金）などの化学担体及び／または化学的方法による、非ウイルス的方法によって細胞に導入され得る。他の態様では、カチオン性脂質、脂質ナノエマルション、ナノ粒子、ペプチドベースのベクターもしくはポリマーベースのベクターなどの合成または天然の生分解性薬剤を送達に使用することができる。

【0434】

２）標的送達
外因性ポリヌクレオチドは、初代細胞の任意の好適な標的ゲノム遺伝子座に挿入され得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、標的遺伝子座への標的組込みによって細胞内に導入される。いくつかの実施形態では、標的組込みは、相同性依存的組換えまたは相同性非依存的組換えを含むプロセスで、１つ以上のヌクレアーゼ及び／またはニッカーゼならびにドナー鋳型を使用する遺伝子編集によって達成することができる。

【0435】

例えば、相同性指向修復（ＨＯＲ）、相同性媒介性末端結合（ＨＭＥＪ）、相同性非依存的標的組込み（ＨＩＴＩ）、偏性ライゲーション依存的組換え（ＯｂｌｉＧａＲｅ）、または標的染色体への高精度組み込み（ＰＩＴＣｈ）を含む、多くの遺伝子編集方法を使用し、外因性ポリヌクレオチドを所定の特異的ゲノム遺伝子座に挿入できる。

【0436】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ゲノム内の所望の位置（例えば、標的部位）に特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製して、細胞の内因性機構を利用し、誘導された切断を修復する。ニッカーゼは、ゲノム内の所望の位置に、特異的な一本鎖切断を作製する。１つの非限定的な例では、２つのニッカーゼを使用し、標的ＤＮＡの対抗する鎖上に２つの一本鎖切断を作製し、それによって、平滑末端または粘着末端を生成することができる。任意の適切なヌクレアーゼを細胞に導入し、標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導でき、そのヌクレアーゼとしては、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、他のエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ、これらの変異体、これらの断片、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、内因性ゲノム標的遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座の配列またはその近くの配列に相同である相同性配列（例えば、相同性アーム）に挟まれた外因性ポリヌクレオチド配列（導入遺伝子とも称される）を含有するドナー鋳型と共に、ヌクレアーゼまたはニッカーゼが導入される場合、ＤＮＡ損傷の修復経路により、導入遺伝子配列を細胞内の標的部位に組み込むことができる。これは、相同性依存的プロセスによって起こり得る。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、環状二本鎖プラスミドＤＮＡ、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、線状二本鎖ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）断片、またはインタクトな姉妹染色分体の相同配列である。ドナー鋳型の形態に応じて、相同性媒介性遺伝子挿入及び置換は、特異的ＤＮＡ修復経路、例えば、相同性指向修復（ＨＤＲ）、合成依存的鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＭＭＥＪ）及び相同性媒介性末端結合（ＨＭＥＪ）の経路を介して、行うことができる。

【0437】

例えば、ＤＮＡ修復機構は、（ｉ）２つのＳＳＢ（ＳＳＢは、それぞれの鎖上に存在する）によって一本鎖オーバーハングを誘導するか、または（ｉｉ）両方の鎖で、同じ切断部位で生じたＤＳＢによって平滑末端切断を誘導するかした後に、ヌクレアーゼによって誘導され得る。これらの作用剤の１つによって切断されると、ＳＳＢまたはＤＳＢを有する標的遺伝子座は、ＤＮＡ損傷修復のための２つの主要な経路、すなわち、（１）エラープローンな非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）経路、または（２）忠実度の高い相同性指向修復（ＨＤＲ）経路のうちの１つを経る。いくつかの実施形態では、ＳＳＢまたはＤＳＢが存在する細胞に導入されたドナー鋳型（例えば、環状プラスミドＤＮＡまたは直鎖状ＤＮＡ断片、例えばｓｓＯＤＮ）により、ＨＤＲ及び標的遺伝子座内へのドナー鋳型の組込みをもたらし得る。一般に、ドナー鋳型の不存在下で、ＮＨＥＪプロセスは切断されたＤＮＡ鎖の末端を再ライゲートし、その結果、切断部位でのヌクレオチドの欠失及び挿入が頻繁に生じる。

【0438】

いくつかの実施形態では、細胞への外因性ポリヌクレオチドの部位特異的挿入は、ＨＤＲベースのアプローチを介して達成され得る。ＨＤＲは、細胞がＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するための機構であり、これを利用し、多くの生物において、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びトランスポザーゼを含めた種々の遺伝子編集システムを使用して、ゲノムを改変することができる。

【0439】

いくつかの実施形態では、標的組込みは、標的遺伝子の少なくとも１つの標的部位（複数可）の配列に標的化されるように特異的に設計された、ＤＮＡ結合標的化ヌクレアーゼ、ならびにジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの遺伝子編集ヌクレアーゼ、ならびにＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）システムなどのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む、１つ以上の配列特異的または標的ヌクレアーゼを導入することによって実施される。例示的なＺＦＮ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮは、例えば、Ｌｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（２２１）：１－７（２０１３）に記載されている。特定の実施形態では、標的部位でまたはその近くでの標的遺伝子破壊は、クラスター化した規則的に離間された短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を使用して実行される。Ｓａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ，（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（４）：３４７－３５５を参照。

【0440】

第ＩＩ．Ａ．１節に記載される遺伝子破壊のためのシステムのいずれかを使用することができ、外因性ポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子配列を有する適切なドナー鋳型も導入した場合、システムのいずれかにより、遺伝子破壊の標的部位またはその近傍で外因性ポリヌクレオチドの標的組込みをもたらすことができる。特定の実施形態では、遺伝子破壊は、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して媒介される。例示的なＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡは上記の第ＩＩ．Ａ節に記載されており、そのいずれかを使用し、ＨＤＲの媒介により、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓシステムが特異的である標的遺伝子座へ外因性ポリヌクレオチドを組み込むことができる。ＨＤＲによる外因性ポリヌクレオチドの切断及び組込みのための特定の標的遺伝子座ならびに標的部位に応じるなど、適切なＣａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを選択することは、当業者のレベルの範囲内である。更に、標的遺伝子座に応じて、当業者であれば、以下に更に記載するように、適切なドナー鋳型を容易に調製することができる。

【0441】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的遺伝子座（例えば、セーフハーバー遺伝子座）に二本鎖切断を生じさせ、標的遺伝子座への導入遺伝子の挿入を誘導できる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、プラスミドベースのＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＲＮＡベースのＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、タンパク質／ＲＮＡ複合体、またはプラスミド／ＲＮＡ複合体、またはタンパク質／プラスミド複合体を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型、ならびにＤＮＡヌクレアーゼシステム（例えば、Ｃａｓ９）及び遺伝子座特異的ｇＲＮＡを含むＤＮＡヌクレアーゼシステムを、ソース細胞（例えば、初代細胞）に導入することを含む、操作された細胞を生成するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとして導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡとのリボ核タンパク質複合体として導入される。

【0442】

一般に、挿入されるドナー鋳型は、目的の外因性ポリヌクレオチド（例えば、免疫寛容原性因子またはＣＡＲ）を含有する導入遺伝子カセットを少なくとも含み、任意選択で、プロモーターも含む。これらの実施形態の特定のものでは、挿入される外因性ポリヌクレオチド及び／またはプロモーターを含有する導入遺伝子カセットは、ドナー鋳型において、標的切断部位のすぐ上流及び下流の配列に相同な配列を有する相同性アーム、すなわち、左側相同性アーム（ＬＨＡ）及び右側相同性アーム（ＲＨＡ）が両側に隣接するであろう。通常、ドナー鋳型の相同性アームは、ＨＤＲの鋳型として機能する標的ゲノム遺伝子座用に特異的に設計されている。各相同性アームの長さは一般に、導入されるインサートのサイズに依存し、インサートが大きなほど長い相同性アームが必要になる。

【0443】

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型（例えば、組換えドナー修復鋳型）は、（ｉ）外因性ポリヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、例えば、異種プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセットと、（ｉｉ）導入遺伝子カセットを挟み込み、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２などのＣａｓヌクレアーゼ）切断部位の両側で、標的遺伝子座（例えば、セーフハーバー遺伝子座）の一部分と相同である２つのホモロジーアームと、を含む。ドナー鋳型は、選択可能なマーカー、検出可能なマーカー及び／または精製マーカーを更に含むことができる。

【0444】

いくつかの実施形態では、相同性アームは同じ長さである。他の実施形態では、相同性アームは異なる長さである。相同性アームは、少なくとも約１０塩基対（ｂｐ）、例えば、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４５ｂｐ、５５ｂｐ、６５ｂｐ、７５ｂｐ、８５ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、９５０ｂｐ、１０００ｂｐ、１．１キロベース（ｋｂ）、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、またはそれ以上であり得る。相同性アームは、約１０ｂｐ～約４ｋｂ、例えば、約１０ｂｐ～約２０ｂｐ、約１０ｂｐ～約５０ｂｐ、約１０ｂｐ～約１００ｂｐ、約１０ｂｐ～約２００ｂｐ、約１０ｂｐ～約５００ｂｐ、約１０ｂｐ～約１ｋｂ、約１０ｂｐ～約２ｋｂ、約１０ｂｐ～約４ｋｂ、約１００ｂｐ～約２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１ｋｂ、約１００ｂｐ～約２ｋｂ、約１００ｂｐ～約４ｋｂ、約５００ｂｐ～約１ｋｂ、約５００ｂｐ～約２ｋｂ、約５００ｂｐ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、または約２ｋｂ～約４ｋｂであり得る。

【0445】

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型を、発現ベクターにクローン化することができる。当業者に公知の従来のウイルス及び非ウイルスベースの発現ベクターを、使用することができる。

【0446】

いくつかの実施形態では、組込みの標的となる標的遺伝子座は、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子の組込みを標的とすることが許容されるか、またはそれが望ましいであろう、任意の遺伝子座であり得る。標的遺伝子座の非限定的な例としては、ＣＸＣＲ４遺伝子、アルブミン遺伝子、ＳＨＳ２３１座、Ｆ３遺伝子（別名、ＣＤ１４２）、ＭＩＣＡ遺伝子、ＭＩＣＢ遺伝子、ＬＲＰ１遺伝子（別名、ＣＤ９１）、ＨＭＧＢ１遺伝子、ＡＢＯ遺伝子、ＲＨＤ遺伝子、ＦＵＴ１遺伝子、ＫＤＭ５Ｄ遺伝子（別名、ＨＹ）、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子、ＴＲＢＣ遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、Ｆ３（すなわち、ＣＤ１４２）遺伝子、ＬＲＰ１遺伝子、ＨＭＧＢ１遺伝子、ＡＢＯ遺伝子、ＲＨＤ遺伝子、ＦＵＴ１遺伝子、ＫＤＭ５Ｄ（すなわち、ＨＹ）遺伝子、ＰＤＧＦＲａ遺伝子、ＯＬＩＧ２遺伝子、及び／またはＧＦＡＰ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、例えば、イントロン、エクソン、及び／または遺伝子コード領域（別名、コード配列または「ＣＤＳ」）を含む、標的遺伝子座（例えば、セーフハーバー遺伝子座）の好適な領域に挿入され得る。いくつかの実施形態では、挿入は、標的ゲノム遺伝子座の一方の対立遺伝子で起こる。いくつかの実施形態では、挿入は、標的ゲノム遺伝子座の両方の対立遺伝子で起こる。これらの実施形態のいずれでも、標的ゲノム遺伝子座に挿入される導入遺伝子の方向は、その遺伝子座の遺伝子の方向と同じであっても、逆であってもよい。

【0447】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、セーフハーバー遺伝子座のイントロン、エクソン、またはコード配列領域に挿入される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子に挿入され、挿入は、内因性遺伝子のサイレンシングまたは発現の低減を引き起こす。外因性ポリヌクレオチドの挿入のための例示的ゲノム遺伝子座は、表４に示されている。

【0448】

【表4】

【0449】

いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座とは、近傍または隣接する内因性遺伝子、調節エレメントなどへの影響を最小限に抑えながら、組み込まれたＤＮＡの安定した発現を可能にするゲノム位置である。場合によっては、セーフハーバー遺伝子は持続的な遺伝子発現を可能にし、初代細胞（その誘導体を含む）及びその分化細胞を含む様々な細胞種における遺伝子改変のために操作されたヌクレアーゼによって標的とされ得る。セーフハーバー遺伝子座の非限定的な例としては、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（別名、ＡＡＶＳ１）遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及び／またはＲｏｓａ遺伝子座（例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、及びＣＬＹＢＬ遺伝子座からなる群から選択される。場合によっては、ＳＨＳ２３１は、多くの細胞種のセーフハーバー遺伝子座として標的とされ得る。場合によっては、特定の遺伝子座は、特定の細胞種のセーフハーバー遺伝子座として機能することができる。例えば、ＰＤＧＦＲａはグリア前駆細胞（ＧＰＣ）のセーフハーバーであり、ＯＬＩＧ２は乏突起膠細胞のセーフハーバー遺伝子座であり、ＧＦＡＰは星状細胞のセーフハーバー遺伝子座である。特定の操作された細胞型に応じて適切なセーフハーバー遺伝子座を選択することは、当業者のレベルの範囲内である。場合によっては、複数のセーフハーバー遺伝子を標的とすることができ、それにより、遺伝子改変細胞に複数の導入遺伝子が導入される。

【0450】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子または外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型と、ＤＮＡヌクレアーゼシステム（例えば、Ｃａｓ９）ならびにＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座及び／またはＲｏｓａ遺伝子座（例えばＲＯＳＡ２６遺伝子座）に特異的な相補的部分（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）を含む遺伝子座特異的ｇＲＮＡを含むＤＮＡヌクレアーゼシステムと、をソース細胞（例えば、初代細胞）に導入することを含む、操作された細胞を生成するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化されるゲノム遺伝子座は、記載した遺伝子座のいずれかの４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内に位置する。

【0451】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子のＨＤＲ媒介性挿入のために本明細書で使用されるｇＲＮＡは、ＡＡＶＳ１内の標的配列を認識する相補的部分（例えば、ｇＲＮＡ標的配列）を含む。これらの実施形態のうちの特定のものでは、標的配列はＡＡＶＳ１のイントロン１に位置する。ＡＡＶＳ１は、１９番染色体：５５，０９０，９１８～５５，１１７，６３７リバース鎖に位置し、ＡＡＶＳ１イントロン１（転写産物ＥＮＳＧ０００００１２５５０３に基づく）は、１９番染色体：５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６リバース鎖に位置する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、１９番染色体：５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、１９番染色体：５５，１１５，６７４の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、１９番染色体：５５，１１５，６７４で、または１９番染色体：５５，１１５，６７４の５、１０、１５、２０、３０、４０もしくは５０ヌクレオチド以内の位置で切断部位を生成するように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：８６６－８６９（２０１９）に記載されているＧＥＴ００００４６（「ｓｇＡＡＶＳ１－１」としても知られる）である。このｇＲＮＡは、配列番号２６（例えば、表５）に記載の核酸配列を有する相補的部分（例えば、ｇＲＮＡターゲティング配列）を含み、ＡＡＶＳ１（別名、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のイントロン１を標的とする。

【0452】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子のＨＤＲ媒介性挿入のために本明細書で使用されるｇＲＮＡは、ＣＬＹＢＬ内の標的配列を認識する相補的部分（例えば、ｇＲＮＡターゲティング配列）を含む。これらの実施形態のうちの特定のものでは、標的配列は、ＣＬ ＹＢＬのイントロン２に位置する。ＣＬＹＢＬは、１３番染色体：９９，６０６，６６９～９９，８９７，１３４フォワード鎖に位置し、ＣＬＹＢＬイントロン２（転写物ＥＮＳＴ０００００３７６３５５．７に基づく）は、１３番染色体：９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０フォワード鎖に位置する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、１３番染色体：９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、１３番染色体：９９，８２２，９８０の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、１３番染色体：９９，８２２，９８０で、または１３番染色体：９９，８２２，９８０の５、０、１５、２０、３０、４０もしくは５０ヌクレオチド以内の位置で切断部位を生成するように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡはＧＥＴ００００４７であり、これは、配列番号２７（例えば、表５）に記載の核酸配列を有する相補的部分（例えば、ｇＲＮＡターゲティング配列）を含み、ＣＬＹＢＬのイントロン２を標的とする。標的部位は、Ｃｅｒｂｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１０（１）：ｅ０１１６０３２（２０１５）に記載されているＴＡＬＥＮの標的部位と類似している。

【0453】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子のＨＤＲ媒介性挿入のために本明細書で使用されるｇＲＮＡは、ＣＣＲ５内の標的配列を認識する相補的部分（例えば、ｇＲＮＡターゲティング配列）を含む。これらの実施形態のうちの特定のものでは、標的配列は、ＣＣＲ５のエクソン３に位置する。ＣＣＲ５は、染色体３：４６，３７０，８５４～４６，３７６，２０６フォワード鎖に位置し、ＣＣＲ５エクソン３（転写物ＥＮＳＴ０００００２９２３０３．４に基づく）は、染色体３：４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６フォワード鎖に位置する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、３番染色体：４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、３番染色体：４６，３７３，１８０の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、３番染色体：４６，３７３，１８０で、または３番染色体：４６，３７３，１８０の５、１０、１５、２０、３０、４０もしくは５０ヌクレオチド以内の位置で切断部位を生成するように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５：６４３－６５２（２０１４）に記載されているＧＥＴ００００４８（「ｃｒＣＣＲ５＿Ｄ」としても知られる）である。このｇＲＮＡは、配列番号２８（例えば、表５）に記載の核酸配列を有する相補的部分を含み、ＣＣＲ５のエクソン３（代替的にＥｎｓｅｍｂｌゲノムデータベースにおいてエクソン２と注釈付けされる）を標的とする。Ｇｏｍｅｚ－Ｏｓｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．１０（１）：４０４５（２０１９）を参照のこと。

【0454】

表５は、例示的なｇＲＮＡターゲティング配列を示す。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡターゲティング配列は、表５に示す相補的部分配列の１つ以上のチミンがウラシルで置換されたものを含んでもよい。ウラシルの「ｕ」及びチミンの「ｔ」の代わりに、ウラシル及びチミンは両方とも「ｔ」によって表され得ることが当業者によって理解され、リボ核酸の関連においては、別途指示されない限り、ウラシルを表すために「ｔ」が使用されることが理解されよう。

【0455】

【表5】

【0456】

いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、細胞内でノックアウトされることが望ましい遺伝子座である。このような実施形態では、このような標的遺伝子座は、細胞の表現型または機能を調節するためなど、細胞内でその破壊または排除が望ましい任意の標的遺伝子座である。例えば、標的遺伝子の発現を低減するための第ＩＩ．Ａ節に記載される遺伝子改変のうちのいずれも、外因性ポリヌクレオチドの標的組込みのために所望される標的遺伝子座であり得、ここで、標的遺伝子の遺伝子破壊またはノックアウト及び外因性ポリヌクレオチドの標的挿入による過剰発現は、細胞における同じ標的部位または遺伝子座にて達成され得る。例えば、ＨＤＲプロセスを使用し、表１ｂに示される任意の標的遺伝子の発現を排除または低減する（例えば、ノックアウトする）ための遺伝子破壊をもたらすと同時に、また遺伝子破壊の標的部位におけるまたはその近くの核酸配列に相同である相同性アームを両側に有するドナー鋳型を使用することによって標的遺伝子内に外因性ポリヌクレオチドを組み込んで（例えば、ノックインして）もよい。

【0457】

いくつかの実施形態では、操作された細胞を生成するための方法が提供され、これは、ソース細胞（例えば、初代細胞）内に、導入遺伝子または外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型、ならびにＤＮＡヌクレアーゼシステム（例えば、Ｃａｓ９）及びＢ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座に特異的な相補的部分を含む遺伝子座特異的ｇＲＮＡを含むＤＮＡヌクレアーゼシステムを導入することを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化されるゲノム遺伝子座は、記載した遺伝子座のいずれかの４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内に位置する。

【0458】

特定の実施形態では、標的遺伝子座はＢ２Ｍである。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、標的ヌクレアーゼシステムを使用することによるものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録２または表１５の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択され、この開示は参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡによって標的化される標的部位に隣接する配列に相同な相同性アームを両側に有する、外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型を導入することによって、ＨＤＲにより、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子座内に組み込まれる。

【0459】

特定の実施形態では、標的遺伝子座はＣＩＩＴＡである。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、標的ヌクレアーゼシステムによるものである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６１８３０４１の付録１または表１２の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択され、この開示は参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡによって標的化される標的部位に隣接する配列に相同な相同性アームを両側に有する、外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型を導入することによって、ＨＤＲにより、破壊されたＣＩＩＴＡ遺伝子座内に組み込まれる。

【0460】

いくつかの実施形態では、初代細胞はＴ細胞であり、内因性ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子座の発現は、遺伝子編集法によって細胞において低減または排除される。例えば、ＨＤＲプロセスを使用し、ＴＲＡＣもしくはＴＲＢＣ遺伝子の発現を排除または低減する（例えば、ノックアウトする）ための遺伝子破壊をもたらすと同時に、また遺伝子破壊の標的部位におけるまたはその近くの核酸配列に相同である相同性アームを両側に有するドナー鋳型を使用することによって同じ遺伝子座内に外因性ポリヌクレオチドを組み込んで（例えば、ノックインして）もよい。本明細書に記載の遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的化に有用な例となるｇＲＮＡ配列は、表６で提供される。これらの配列は、ＵＳ２０１６０３４８０７３に見出すことができ、配列表を含めたこの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0461】

【表6】

【0462】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、標的ヌクレアーゼシステムによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えば、ｇＲＮＡターゲティング配列）は、ＵＳ２０１６０３４８０７３の配列番号５３２～６０９及び９１０２～９７９７からなる群から選択され、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡによって標的化される標的部位に隣接する配列に相同な相同性アームを両側に有する、外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型を導入することによって、ＨＤＲにより、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子座内に組み込まれる。

【0463】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＴＲＢＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、標的ヌクレアーゼシステムによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えば、ｇＲＮＡターゲティング配列）は、ＵＳ２０１６０３４８０７３の配列番号６１０～７６５及び９７９８～１０５３２からなる群から選択され、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡによって標的化される標的部位に隣接する配列に相同な相同性アームを両側に有する、外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型を導入することによって、ＨＤＲにより、破壊されたＴＲＢＣ遺伝子座内に組み込まれる。

【0464】

いくつかの実施形態では、記載されるＨＤＲ媒介性組込みアプローチで使用するための新たな遺伝子座及び／またはｇＲＮＡ配列を同定することは、当業者のレベルの範囲内である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに関して、特定の遺伝子座（例えば、表１ｂに示す、例えば、標的遺伝子内の）に対する既存のｇＲＮＡが公知の場合、「インチワーミング」アプローチを使用し、通常はゲノムにわたって約１００塩基対（ｂｐ）毎に存在するＰＡＭ配列について遺伝子座のそれぞれの側の隣接領域をスキャンすることによって、導入遺伝子の標的挿入のための追加の遺伝子座を同定することができる。異なるヌクレアーゼは通常、異なる対応するＰＡＭ配列を有することから、ＰＡＭ配列は、使用される特定のＣａｓヌクレアーゼに依存することになる。遺伝子座の両側の隣接領域は、約５００～４０００ｂｐ長、例えば、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約３０００ｂｐ、約３５００ｂｐ、または約４０００ｂｐ長であり得る。ＰＡＭ配列が検索範囲内で同定される場合、その遺伝子座の配列に従って、遺伝子破壊方法において使用するための新たなガイドが設計され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを例示的なものとして記載しているが、この新たな座位を特定する方法では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ及びトランスポザーゼを使用するものを含む、記載されるいずれかのＨＤＲ媒介性アプローチも使用することができる。

【0465】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、外因性ＣＤ４７ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ４７ポリペプチド）をコードし、外因性ポリペプチドは、本明細書に開示されるセーフハーバー遺伝子座またはセーフハーバー部位または内因性遺伝子のサイレンシングまたは発現の低減を引き起こすゲノム遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座及び／またはＲｏｓａ遺伝子座（例えばＲＯＳＡ２６遺伝子座）に挿入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＰＤ１またはＣＴＬＡ４遺伝子座に挿入される。

【0466】

ｃ．細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞のゲノムが、本明細書に記載されるような１つ以上の遺伝子の発現が低減または欠失する（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を調節する１つ以上の遺伝子）ように改変されている、もしくは遺伝子もしくはポリヌクレオチドが過剰発現または発現を増加させられる（例えば、ＣＤ４７などの免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチド）、操作（または、改変）された細胞（例えば、初代細胞）、またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0467】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変された細胞は、初代細胞である。

【0468】

細胞は、脊椎動物細胞、例えば、ヒト細胞またはマウス細胞などの哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、細胞は改変しやすい。好ましくは、細胞は、疾患、障害、欠損もしくは傷害の治療を必要とする対象において疾患、障害、欠損もしくは傷害を治療するために使用できるように、治療的価値を有するか、または有すると考えられる。

【0469】

いくつかの実施形態では、細胞は、胚組織または新生児組織から単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、線維芽細胞、単球前駆体、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、前脂肪細胞、前駆細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、Ｋ５６２ヒト赤血球白血病細胞株、骨細胞、滑膜細胞、腱細胞、靱帯細胞、半月板細胞、脂肪細胞、樹状細胞、またはナチュラルキラー細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞、赤血球－巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島クラスター、膵島細胞、膵島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、導管細胞、腺房細胞、α細胞、β膵島細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、または褐色脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞または心筋細胞）、赤血球－巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島クラスター、膵島細胞、β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞（例えば、赤血球細胞、白血球細胞または血小板）、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、導管細胞、腺房細胞、α細胞、膵島β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、または白色脂肪細胞もしくは褐色脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ホルモン分泌細胞（例えば、インスリン、オキシトシン、エンドルフィン、バソプレッシン、セロトニン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、グルカゴン、甲状腺ホルモン、ボンベシン、コレシストキニン、テストステロン、エストロゲンもしくはプロゲステロン、レニン、グレリン、アミリン、または膵臓ポリペプチドを分泌する細胞）、表皮角化細胞、上皮細胞（例えば、外分泌上皮細胞、甲状腺上皮細胞、角化上皮細胞、胆嚢上皮細胞、または角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道もしくは膣の表面上皮細胞）、腎臓細胞、胚細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、骨細胞（例えば、破骨細胞または骨芽細胞）、軟骨膜細胞（例えば、軟骨芽細胞または軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）細胞（例えば軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、線維芽細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆体、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜もしくは胎盤膜から単離した細胞、または漿膜細胞（例えば、体腔の内側を覆う漿膜細胞）である。

【0470】

いくつかの実施形態では、細胞は、体細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、皮膚または他の器官、例えば、心臓、脳もしくは脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸または胃に由来する。細胞は、ヒトまたは他の哺乳動物（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、ウシ、またはブタ細胞）からのものであり得る。

【0471】

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、膵島細胞、膵島β細胞、内皮細胞、上皮細胞（例えば、ＲＰＥ、甲状腺、皮膚細胞）、または肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞から改変された操作された初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、操作された初代細胞（例えば、操作された初代Ｔ細胞、ＮＫ細胞、膵島細胞、膵島β細胞、内皮細胞、上皮細胞（例えば、ＲＰＥ、甲状腺、皮膚細胞）または肝細胞）である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含み、操作された初代Ｔ細胞、ＮＫ細胞、膵島細胞、膵島β細胞、内皮細胞、上皮細胞（例えば、ＲＰＥ、甲状腺、皮膚細胞）または肝細胞。

【0472】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含むように操作された初代Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代Ｔ細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、本明細書に記載されるようないずれかを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて操作され得る。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）Ｔ細胞を使用し、本明細書、例えば、第Ｖ節に記載されるようないずれかを含む、同種異系細胞療法により様々な適応症を治療することができる。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）Ｔ細胞を使用し、がんを治療できる。

【0473】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含むように操作された初代ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代ＮＫ細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、本明細書に記載されるようないずれかを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて操作され得る。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）ＮＫ細胞を使用し、本明細書、例えば、第Ｖ節に記載されるようないずれかを含む、同種異系細胞療法により様々な適応症を治療することができる。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）ＮＫ細胞を使用し、がんを治療できる。

【0474】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含むように操作された初代膵島細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代膵島細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）膵島細胞を使用し、本明細書、例えば、第ＩＶ節に記載されるようないずれかを含む、同種異系細胞療法により様々な適応症を治療することができる。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）膵島細胞を使用し、Ｉ型糖尿病などの糖尿病を治療できる。いくつかの実施形態では、細胞は、初代β膵島細胞を含む、初代膵島細胞のクラスターである。

【0475】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含むように操作された初代膵島β細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代膵島β細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）膵島β細胞を使用し、本明細書、例えば、第Ｖ節に記載されるようないずれかを含む、同種異系細胞療法により様々な適応症を治療することができる。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）膵島β細胞を使用し、Ｉ型糖尿病などの糖尿病を治療できる。

【0476】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含むように操作された初代内皮細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代内皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）内皮細胞を使用し、本明細書、例えば、第Ｖ節に記載されるようないずれかを含む、同種異系細胞療法により様々な適応症を治療することができる。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）内皮細胞を使用し、血管新生疾患または眼疾患を治療できる。

【0477】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含むように操作された初代上皮細胞である。いくつかの実施形態では、上皮細胞は、ＲＰＥである。いくつかの実施形態では、上皮細胞は、甲状腺細胞である。いくつかの実施形態では、上皮細胞は、皮膚細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代上皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）上皮細胞を使用し、本明細書、例えば、第Ｖ節に記載されるようないずれかを含む、同種異系細胞療法により様々な適応症を治療することができる。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）上皮細胞を使用し、甲状腺疾患または皮膚疾患を治療できる。

【0478】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含むように操作された初代肝細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代肝細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）上皮細胞を使用し、本明細書、例えば、第ＩＶ節に記載されるようないずれかを含む、同種異系細胞療法により様々な適応症を治療することができる。いくつかの実施形態では、操作された（例えば、低免疫原性）肝細胞を使用し、肝疾患を治療できる。

【0479】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるように操作または改変された細胞は、治療すべき特定の疾患または状態を有することが知られていないか、またはその疑いがない対象などの、健康な対象に由来する細胞である。例えば、初代膵島β細胞が糖尿病の治療などのためにドナー対象から単離または入手される場合、ドナー対象が糖尿病または別の疾患または状態に罹患していることが知られていないか、またはその疑いがない場合、対象は健康な対象である。

【0480】

治療用途では、開示される方法に従って調製された細胞は、典型的には、等張性賦形剤を含む医薬組成物の形態で供給され得、ヒト投与のために十分に無菌である条件下で調製される。細胞は、分布または臨床的使用のために好適なデバイスまたは容器に包装され得る。

【0481】

１．初代細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるように操作された細胞は、１以上の個々の対象またはドナーから入手または単離された初代細胞に由来する細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１以上の（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上の）異なるドナー対象から得られた単離された初代細胞のプールに由来する。いくつかの実施形態では、複数の異なるドナー対象（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上）から単離または入手された初代細胞は、バッチで一緒にプールされ、提供される方法に従って操作される。

【0482】

いくつかの実施形態では、初代細胞は、レシピエント対象（例えば、細胞を投与される患者）とは異なる１以上のドナー対象からの初代細胞のプールからのものである。初代細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、またはそれよりも多くのドナー対象から入手され得、一緒にプールすることができる。初代細胞は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上のドナー対象から入手され得、一緒にプールすることができる。いくつかの実施形態では、初代細胞は、１以上の個体から採取され、いくつかの事例では、初代細胞または初代Ｔ細胞のプールは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。いくつかの実施形態では、初代細胞または初代Ｔ細胞のプールは、本明細書に提供される方法に従って操作または改変される。

【0483】

いくつかの実施形態では、方法は、個々のドナー対象から所望の種類の初代細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、膵島細胞、膵島β細胞、肝細胞、または本明細書に記載されるような他の初代細胞）を入手または単離することと、細胞をプールして初代細胞種のバッチを得ることと、本明細書で提供される方法によって細胞を操作することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、所望の種類の初代細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、膵島細胞、膵島β細胞、肝細胞、または本明細書に記載されているような他の初代細胞）を入手または単離することと、個々のドナーのそれぞれの細胞を本発明で提供する方法によって操作することと、少なくとも２つの個別試料の操作された（改変された）細胞をプールして、初代細胞種の操作された初代細胞のバッチを得ることと、を含む。

【0484】

いくつかの実施形態では、初代細胞は、個体から単離もしくは取得されるか、または２以上の個々のドナーから単離もしくは取得された初代細胞のプールから単離もしくは取得される。初代細胞は、第ＩＩ．Ｃ．３節に記載されるいずれかを含む、本明細書に記載の任意の種類の初代細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、初代細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、膵島細胞、膵島β細胞、内皮細胞、上皮細胞（例えば、ＲＰＥ、甲状腺、皮膚細胞）または肝細胞から選択される。いくつかの実施形態では、個々のドナーまたは個々のドナーのプールからの初代細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作される。

【0485】

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞または心筋細胞）、赤血球－巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島クラスター、膵島細胞、β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞（例えば、赤血球細胞、白血球細胞または血小板）、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、導管細胞、腺房細胞、α細胞、膵島β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、または白色脂肪細胞もしくは褐色脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ホルモン分泌細胞（例えば、インスリン、オキシトシン、エンドルフィン、バソプレッシン、セロトニン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、グルカゴン、甲状腺ホルモン、ボンベシン、コレシストキニン、テストステロン、エストロゲンもしくはプロゲステロン、レニン、グレリン、アミリン、または膵臓ポリペプチドを分泌する細胞）、表皮角化細胞、上皮細胞（例えば、外分泌上皮細胞、甲状腺上皮細胞、角化上皮細胞、胆嚢上皮細胞、または角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道もしくは膣の表面上皮細胞）、腎臓細胞、胚細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、骨細胞（例えば、破骨細胞または骨芽細胞）、軟骨膜細胞（例えば、軟骨芽細胞または軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）細胞（例えば軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、線維芽細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆体、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜もしくは胎盤膜から単離した細胞、または漿膜細胞（例えば、体腔の内側を覆う漿膜細胞）である。

【0486】

例示的な細胞は、以下の項に記載される。

【0487】

ａ．Ｔ細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変された細胞は、初代細胞Ｔリンパ球（Ｔ細胞とも称される）である。いくつかの実施形態では、初代Ｔリンパ球は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健常ドナー（例えば、疾患または感染が知られていないか、またはその疑いがない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）から単離または入手される。いくつかの事例では、Ｔ細胞は、１以上の個体からの初代Ｔ細胞の集団またはサブ集団である。当業者であれば理解するように、個体からＴリンパ球を単離または入手する方法は、既知の技術を使用して達成することができる。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植または生着のために、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含む操作された初代Ｔリンパ球が提供される。例えば、操作されたＴ細胞は、操作されたＴ細胞の注入によって対象（例えば、患者などのレシピエント）に投与される。

【0488】

いくつかの実施形態では、初代Ｔ細胞は、対象または個体から得られ（例えば、採取され、抽出され、離され、または取得され）る。いくつかの実施形態では、初代Ｔ細胞は、Ｔ細胞が１以上の対象（例えば、１以上の健康なヒトを含む１以上のヒト）に由来するようにＴ細胞のプールから生成される。いくつかの実施形態では、初代Ｔ細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象からのものである。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプールが得られるドナー対象のうちの１つ以上は、患者とは異なる。

【0489】

初代Ｔ細胞の非限定的な例には、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、非制御性Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔ濾胞性ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞、セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞、エフェクターメモリーＴ（Ｔｅｍ）細胞、ＣＤ４５ＲＡを発現するエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ細胞）、組織常在性メモリー（Ｔｒｍ）細胞、バーチャルメモリーＴ細胞、自然メモリーＴ細胞、γδＴ細胞、及び任意の他のサブタイプのＴ細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、初代Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、及びこれらの組み合わせを含む群から選択される。

【0490】

本開示の例示的なＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＲＡ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、組織浸潤リンパ球、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。多くの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、及びＣＤ４５ＲＡを発現する。いくつかの実施形態では、セントラルＴ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、及びＣＤ４５ＲＯを発現する。他の実施形態では、エフェクターメモリーＴ細胞は、ＰＤ－１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、及びＣＤ４５ＲＯを発現する。他の実施形態では、エフェクターメモリーＲＡ Ｔ細胞は、ＰＤ－１、ＣＤ５７、及びＣＤ４５ＲＡを発現する。

【0491】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような操作の前に、単離された初代Ｔ細胞または分化したＴ細胞などのＴ細胞を、１つ以上の増殖または活性化工程に供され得る。いくつかの実施形態では、操作されるＴ細胞の集団は、抗ＣＤ３抗体試薬及び抗ＣＤ２８抗体試薬とのインキュベーションによって刺激または活性化される。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８は、これらの試薬の混合物でコーティングされたビーズの形態で適切に提供され得る。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズは、操作されるＴ細胞の集団に対して１：１の比率で適切に提供され得る。いくつかの実施形態では、インキュベーション中の培地は、１つ以上の組換えサイトカイン、例えば、組換えＩＬ－２または組換えＩＬ－１５も含んでよい。

【0492】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離した初代Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（本明細書に記載のキメラ抗原受容体が挙げられるが、これに限定されない）を発現するように操作（例えば、改変）されたＴ細胞を含む。本明細書に記載のＣＡＲを含む、任意の好適なＣＡＲは、Ｔ細胞に含まれ得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、変異細胞、及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つの表面上に発現する目的の抗原またはエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つのキメラ抗原受容体に発現する。他の場合では、操作されたＴ細胞は、細胞が隣接する細胞、組織、または器官と近接する場合に隣接する細胞、組織、または器官において目的の生物学的効果を調節する少なくとも１つのタンパク質を細胞に発現させる改変を含む。初代Ｔ細胞を含むＴ細胞に対する有用な改変は、ＵＳ２０１６／０３４８０７３及びＷＯ２０２０／０１８６２０に詳細に記載されており、その開示は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0493】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、ゲノム遺伝子座に挿入される。本明細書に記載のレンチウイルスベースの形質導入法または遺伝子編集法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含む、任意の好適な方法を使用し、ＣＡＲをＴ細胞のゲノム遺伝子座内に挿入することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、セーフハーバー遺伝子座、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１、Ｆ３（別名ＣＤ１４２）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＬＲＰ１（別名ＣＤ９１）、ＨＭＧＢ１、ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＦＵＴ１、またはＫＤＭ５Ｄ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＰＤ１、またはＣＴＬＡ４遺伝子に挿入される。

【0494】

いくつかの実施形態では、操作または改変されたＴ細胞などの本明細書に記載のＴ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体の発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子座は、本明細書に記載の遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）などによって細胞内で破壊または排除される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、記載されるようなＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドは、破壊されたＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。

【0495】

いくつかの実施形態では、操作または改変されたＴ細胞などの本明細書に記載のＴ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）の発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４遺伝子座は、本明細書に記載の遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）などによって細胞内で破壊または排除される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、記載されるようなＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたは他の外因性ポリヌクレオチドは、破壊されたＣＴＬＡ－４遺伝子座に挿入される。

【0496】

他の実施形態では、操作または改変されたＴ細胞などの本明細書に記載のＴ細胞は、プログラム細胞死（ＰＤ１）の発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ１遺伝子座は、本明細書に記載の遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）などによって細胞内で破壊または排除される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、記載されるようなＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたは他の外因性ポリヌクレオチドは、破壊されたＰＤ１遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、操作または改変されたＴ細胞などの本明細書に記載のＴ細胞は、ＣＴＬＡ４及びＰＤ１の発現の低減を含む。

【0497】

特定の実施形態では、操作または改変されたＴ細胞などの本明細書に記載のＴ細胞は、ＰＤ－Ｌ１の発現の増強を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１遺伝子座は、本明細書に記載の遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）などによって細胞内で破壊または排除される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、記載されるようなＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたは他の外因性ポリヌクレオチドは、破壊されたＰＤ－Ｌ１遺伝子座に挿入される。

【0498】

いくつかの実施形態では、本技術は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現が低減するか、またはその発現を欠いている、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代Ｔ細胞などの操作されたＴ細胞に関する。特定の実施形態では、操作されたＴ細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞はまた、ＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子もしくはＴＲＢＣ遺伝子におけるゲノム改変（例えば、遺伝子破壊）によって、ＴＣＲ複合体分子の発現が低減するか、またはその発現を欠いている。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）及びＣＡＲを過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ遺伝子のうちの１つ以上を破壊する遺伝子改変を保有する。

【0499】

いくつかの実施形態では、提供される操作されたＴ細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代Ｔ細胞は、患者（例えば、投与時のレシピエント）において免疫応答を活性化しない。その必要がある対象（例えば、レシピエント）または患者に本明細書に記載の操作されたＴ細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が、提供される。

【0500】

本明細書で提供されるＴ細胞は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌を含むが、これらに限定されない、適切ながんの治療に有用である。

【0501】

ｂ．ナチュラルキラー細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変された細胞は、初代ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、初代ＮＫ細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健常ドナー（例えば、疾患または感染が知られていないか、またはその疑いがない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）から単離または入手される。いくつかの事例では、ＮＫ細胞は、１以上の個体からの初代ＮＫ細胞の集団またはサブ集団である。当業者であれば理解するように、個体からＮＫ細胞を単離または入手する方法は、既知の技術を使用して達成することができる。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植または生着のために、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含む操作された初代ＮＫ細胞が提供される。例えば、操作されたＴ細胞は、操作されたＮＫ細胞の対象への注入によって対象（例えば、患者などのレシピエント）に投与される。

【0502】

いくつかの実施形態では、初代ＮＫ細胞は、対象または個体から得られ（例えば、採取され、抽出され、離され、または取得され）る。いくつかの実施形態では、初代ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞が１以上の対象（例えば、１以上の健康なヒトを含む１以上のヒト）に由来するようにＮＫ細胞のプールから生成される。いくつかの実施形態では、初代ＮＫ細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象からのものである。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、操作されたＮＫ細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞のプールが得られるドナー対象のうちの１つ以上は、患者とは異なる。

【0503】

いくつかの実施形態では、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代ＮＫ細胞を含むＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現し（例えば、ＣＤ５６^ｄｉｍまたはＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}）、ＣＤ３を欠く（例えば、ＣＤ３^ｎｅｇ）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているようなＮＫ細胞はまた、ＡＤＣＣを媒介する低親和性Ｆｃγ受容体ＣＤ１６も発現し得る。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞はまた、１つ以上のナチュラルキラー細胞受容体ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｄ、または１つ以上の天然細胞傷害性受容体ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０も発現する。例えば、初代ＮＫ細胞の場合、特定の場合では、初代細胞は、ＣＤ３、ＣＤ１４及び／またはＣＤ１９に対して陽性である細胞の枯渇によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含有する試料などのＮＫ細胞の出発供給源から単離され得る。例えば、細胞は、それぞれＣＤ３、ＣＤ１４及び／またはＣＤ１９に対する抗体を結合させた免疫磁気ビーズを使用して枯渇に供され、それによって、ＮＫ細胞の濃縮された集団が作製され得る。他の場合には、初代ＮＫ細胞は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６及び／またはＮＫＧ２ＤなどのＮＫ細胞上の１つ以上数のマーカーの存在に関して細胞を選択することによって、混合集団（例えば、ＰＢＭＣ）である出発供給源から単離され得る。

【0504】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような操作の前に、単離された初代ＮＫ細胞などのＮＫ細胞を、１つ以上の増殖または活性化工程に供され得る。いくつかの実施形態では、増殖は、放射線照射される場合もされない場合もある抗原提示細胞などのフィーダー細胞とのＮＫ細胞の培養によって達成され得る。増殖工程におけるＮＫ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の比は、例えば１：１、１：１．５、１：２または１：３などの特定の数であってもよい。特定の態様では、ＡＰＣは、膜結合型ＩＬ－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように操作される。特定の態様では、ＡＰＣは、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－２を発現するように代替的または追加的に操作される。特定の実施形態では、増殖工程（複数可）が行われる培地は、増殖を促進するための１つ以上の薬剤、例えば、１つ以上の組換えサイトカインを含む。特定の実施形態では、培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８及び／またはＩＬ－２１からの１つ以上の組換えサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような改変を導入することによってＮＫ細胞を操作するための工程は、増殖の開始から２～１２日後、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２日目、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２日目に実施される。

【0505】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＮＫ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離した初代ＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体（本明細書に記載のキメラ抗原受容体が挙げられるが、これに限定されない）を発現するように操作（例えば、改変）されたＮＫ細胞を含む。本明細書に記載のＣＡＲを含む任意の好適なＣＡＲが、ＮＫ細胞に含まれ得る。いくつかの実施形態では、操作されたＮＫ細胞は、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、変異細胞、及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つの表面上に発現する目的の抗原またはエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現する。他の場合では、操作されたＮＫ細胞は、細胞が隣接する細胞、組織、または器官と近接する場合に隣接する細胞、組織、または器官において目的の生物学的効果を調節する少なくとも１つのタンパク質を細胞に発現させる改変を含む。

【0506】

いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、ゲノム遺伝子座に挿入される。本明細書に記載のレンチウイルスベースの形質導入法または遺伝子編集法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含む、任意の好適な方法を使用し、ＣＡＲをＮＫ細胞のゲノム遺伝子座内に挿入することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、セーフハーバー遺伝子座、例えば、限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１、Ｆ３（別名ＣＤ１４２）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＬＲＰ１（別名ＣＤ９１）、ＨＭＧＢ１、ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＦＵＴ１、またはＫＤＭ５Ｄ遺伝子座に挿入される。

【0507】

いくつかの実施形態では、本技術は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現が低減するか、またはその発現を欠いている、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代ＮＫ細胞などの操作されたＮＫ細胞に関する。特定の実施形態では、操作されたＮＫ細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作されたＮＫ細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作されたＮＫ細胞はまた、ＣＡＲを発現するように操作される。

【0508】

いくつかの実施形態では、提供される操作されたＮＫ細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＮＫ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代ＮＫ細胞は、患者（例えば、投与時のレシピエント）において免疫応答を活性化しない。その必要がある対象（例えば、レシピエント）または患者に本明細書に記載の操作されたＮＫ細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が、提供される。

【0509】

本明細書で提供されるＮＫ細胞は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌を含むが、これらに限定されない、適切ながんの治療に有用である。

【0510】

ｃ．β膵島細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変された細胞は、初代膵島細胞である。いくつかの実施形態では、初代膵島細胞は、初代膵島細胞のクラスターである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変された細胞は、初代β膵島細胞（膵臓膵島細胞または膵臓β膵島細胞とも称される）である。いくつかの実施形態では、初代β膵島細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健常ドナー（例えば、疾患または感染が知られていないか、またはその疑いがない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）から単離または入手される。当業者であれば理解するように、個体からβ膵島細胞を単離または入手する方法は、既知の技術を使用して達成することができる。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植または生着のために、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含む操作された初代β膵島細胞が提供される。

【0511】

いくつかの実施形態では、β膵島細胞は、対象または個体から得られ（例えば、採取され、抽出され、離され、または取得され）る。いくつかの実施形態では、初代β膵島細胞は、β膵島細胞が１以上の対象（例えば、１以上の健康なヒトを含む１以上のヒト）に由来するようにβ膵島細胞のプールから生成される。いくつかの実施形態では、初代β膵島細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象からのものである。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、β膵島細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、β膵島細胞のプールが得られるドナー対象のうちの１つ以上は、患者とは異なる。

【0512】

本技術における使用のためを含む膵臓膵島細胞の追加の説明は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、この開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0513】

いくつかの実施形態では、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代β膵島細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された内皮細胞などの、操作されたβ膵島細胞の集団は、投与前に培養物中で維持され、場合によっては増殖される。特定の実施形態では、操作されたβ膵島細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0514】

例示的な膵臓膵島細胞種には、膵島前駆細胞、未成熟膵臓膵島細胞、成熟膵臓膵島細胞などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の膵臓細胞は、糖尿病を治療するために対象に投与される。

【0515】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように操作された膵臓膵島細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代β膵島細胞は、インスリンを分泌する。いくつかの実施形態では、膵臓膵島細胞は、内因性膵臓膵島細胞の少なくとも２つの性質、例えば、限定されないが、グルコースに応答したインスリンの分泌、及びβ膵島細胞マーカーの発現を示す。

【0516】

例示的なβ膵島細胞マーカーまたはβ膵島細胞前駆細胞マーカーには、ｃペプチド、Ｐｄｘ１、グルコース輸送体２（Ｇｌｕｔ２）、ＨＮＦ６、ＶＥＧＦ、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、プロホルモン変換酵素（ＰＣ１／３）、Ｃｄｃｐｌ、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｇｎ３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ６．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、Ｐｔｆ１ａ、Ｉｓｌ１、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１７、及びＦｏｘＡ２が含まれるが、これらに限定されない。

【0517】

いくつかの実施形態では、初代膵臓β膵島細胞は、初代膵島から単離されたものであっても、初代膵島内の初代膵臓β膵島細胞に由来するものであっても、または初代膵島の成分としてであってもよい。例えば、初代膵臓β膵島細胞は、単一のβ膵島細胞、β膵島細胞の集団として、または初代膵島の成分（例えば、他の細胞種と共に初代膵島内に存在する初代膵臓β膵島細胞）として、編集され得る。別の例として、初代膵臓β膵島細胞は、単一のβ膵島細胞、β膵島細胞の集団として、または初代膵島の成分（例えば、他の細胞種と共に初代膵島内に存在する初代膵臓β膵島細胞）として、患者に対して投与され得る。膵臓β膵島細胞が他の細胞種と共に膵島内に存在する実施形態では、他の細胞種も本明細書に記載の方法によって編集され得る。

【0518】

いくつかの実施形態では、初代膵臓膵島細胞は、遺伝子工学などの操作前または操作後に初代膵島から解離される。このような解離した膵島細胞は、患者に投与する前にクラスター化することができ、クラスターには、β膵島細胞、ならびに限定されないが初代膵島由来のものを含む他の細胞種が含まれ得る。クラスターの膵島細胞の数は、約５０、約１００、約２５０、約５００、約７５０、約１０００、約１２５０、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００、約２７５０、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、または約５０００の細胞など、様々であり得る。患者は、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、または約１０００のクラスターを投与され得る。

【0519】

いくつかの実施形態では、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代膵臓膵島細胞は、グルコースの増加に応答してインスリンを産生する。いくつかの実施形態では、膵臓膵島細胞は、β膵島細胞である。いくつかの実施形態では、β膵島細胞は、グルコース制御能力を評価するために監視される。グルコース制御を監視するためのアッセイには、継続的な血糖値モニタリング、一定期間の絶食後の血糖値の監視、耐糖能（例えば、糖負荷）試験、ブドウ糖の利用及び酸化、Ｕ－ＰＬＥＸ（登録商標）Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイ及び／またはグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイによるなどのインスリン分泌、特定の転写因子及び経路（例えば、ホメオボックス転写因子ＳＩＸ２、ＮＫＸ６－１及びＰＤＸ１）の存在の測定、ミトコンドリア呼吸の測定、ならびにグルコース誘導性Ｃａ^２＋上昇、Ｃａ^２＋活性化エキソサイトーシスなどの細胞内Ｃａ^２＋カルシウム流動の変化の測定などが含まれるが、これらに限定されない。グルコース制御を測定する様々な方法は、Ｖｅｌａｚｃｏ－Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０２０，３１，１０７６８７、Ｐａｇｌｉｕｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４，１５９（２）：４２８－４３９、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０２０，３１（６）：１０７６２３、及びＡｌｃａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２０２０，２９に記載されているものなど当技術分野で公知であり、図、図の凡例、及び方法の説明を含む開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、β膵島細胞（例えば、操作されたβ膵島細胞）は、ＧＳＩＳを示し得る。いくつかの実施形態では、ＧＳＩＳは、灌流ＧＳＩＳアッセイで測定される。いくつかの実施形態では、ＧＳＩＳは、第１相及び第２相の動的インスリン分泌を含む動的ＧＳＩＳである。いくつかの実施形態では、ＧＳＩＳは、静的ＧＳＩＳである。例えば、静的インキュベーション指数は、１もしくは約１よりも大きく、２もしくは約２よりも大きく、５もしくは約５よりも大きく、１０もしくは約１０よりも大きく、または２０もしくは約２０よりも大きくてもよい。様々な実施形態では、膵臓膵島細胞は、グルコースの増加に応答してインスリンを分泌する。いくつかの実施形態では、細胞は、敷石状細胞形態及び／または約１７ｐｍ～約２５ｐｍの直径などの特有の形態を有する。

【0520】

いくつかの実施形態では、本技術は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現が低減するか、またはその発現を欠いている、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代β膵島細胞などの操作されたβ膵島細胞に関する。特定の実施形態では、操作されたβ膵島細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作されたβ膵島細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作されたβ膵島細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のうちの１つ以上を破壊する遺伝子改変を保有する。

【0521】

いくつかの実施形態では、提供される操作されたβ膵島細胞は、免疫認識を回避する。例えば、操作されたβ膵島細胞は、ＮＫ細胞媒介性細胞殺傷、マクロファージ媒介性細胞殺傷、及び／またはＰＢＭＣ媒介性細胞殺傷を回避することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたβ膵島細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代β膵島細胞は、患者（例えば、投与時のレシピエント）において免疫応答を活性化しない。例えば、移植後、操作されたβ膵島細胞を投与された対象は、野生型β膵島細胞を投与された対象と比較して、低いレベルのインターフェロンγ（ＩＦＮｇ）を示してもよい。同様に、移植後、操作されたβ膵島細胞を投与された対象は、野生型β膵島細胞を投与された対象と比較して、低いレベルのドナー特異的抗体（ＤＳＡ）結合（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を示してもよい。その必要がある対象（例えば、レシピエント）または患者に本明細書に記載の操作されたβ膵島細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が、提供される。いくつかの実施形態では、疾患は、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病などの糖尿病である。

【0522】

ｄ．内皮細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変された細胞は、初代内皮細胞である。いくつかの実施形態では、初代内皮細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健常ドナー（例えば、疾患または感染が知られていないか、またはその疑いがない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）から単離または入手される。当業者であれば理解するように、個体から内皮細胞を単離または入手する方法は、既知の技術を使用して達成することができる。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植または生着のために、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含む操作された初代内皮細胞種が提供される。

【0523】

いくつかの実施形態では、初代内皮細胞は、対象または個体から得られ（例えば、採取され、抽出され、離され、または取得され）る。いくつかの実施形態では、初代内皮細胞は、内皮細胞が１以上の対象（例えば、１以上の健康なヒトを含む１以上のヒト）に由来するように内皮細胞のプールから生成される。いくつかの実施形態では、初代内皮細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象からのものである。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、内皮細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、内皮細胞のプールが得られるドナー対象のうちの１つ以上は、患者とは異なる。

【0524】

本明細書で提供される方法における使用に向けた内皮細胞の追加の説明は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、この開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0525】

いくつかの実施形態では、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代内皮細胞などの操作された内皮細胞の集団は、投与前に培養物中で維持され、場合によっては増殖される。特定の実施形態では、操作された内皮細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0526】

いくつかの実施形態では、本技術は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現が低減するか、またはその発現を欠いている、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代内皮細胞などの操作された内皮細胞に関する。特定の実施形態では、操作された内皮細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作された内皮細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作された内皮細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のうちの１つ以上を破壊する遺伝子改変を保有する。

【0527】

いくつかの実施形態では、提供される操作された内皮細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作された内皮細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代内皮細胞は、患者（例えば、投与時のレシピエント）において免疫応答を活性化しない。その必要がある対象（例えば、レシピエント）または患者に本明細書に記載の操作された内皮細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が、提供される。

【0528】

いくつかの実施形態では、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代内皮細胞などの操作された内皮細胞は、患者、例えば、それを必要とするヒト患者に投与される。操作された内皮細胞は、限定されないが、心血管疾患、血管疾患、末梢血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、脳卒中、再灌流損傷、肢虚血、ニューロパチー（例えば、末梢ニューロパチーまたは糖尿病性ニューロパチー）、臓器不全（例えば、肝臓不全、腎臓不全など）、糖尿病、関節リウマチ、骨粗鬆症、血管損傷、組織損傷、高血圧症、冠動脈疾患に起因する狭心症及び心筋梗塞、腎血管性高血圧症、腎動脈狭窄に起因する腎不全、下肢の跛行などのような疾患または状態を患う患者に投与することができる。特定の実施形態では、患者は、一過性の虚血性発作または脳卒中を患ったことがあるか、またはそれを患っており、これは場合によっては、脳血管疾患に起因し得る。いくつかの実施形態では、操作された内皮細胞は、例えば、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、及び肢虚血において起こるような組織虚血を治療するため、ならびに損傷した血管を修復するために投与される。いくつかの事例では、細胞は、移植片の生体工学で使用される。

【0529】

例えば、操作された内皮細胞は、虚血組織の修復、血管及び心臓弁の形成、人工血管の工学、損傷を受けた血管の修復、ならびに操作された組織における血管の形成の誘導（例えば、移植前）のために細胞療法で使用され得る。そのうえ、内皮細胞は、作用物質を標的に送達し、腫瘍を治療するように更に改変され得る。

【0530】

多くの実施形態では、血管細胞または血管新生を必要とする組織の修復または置換方法が本明細書で提供される。方法は、このような治療を必要とするヒト患者に、このような組織における血管新生を促進するために単離された初代内皮細胞または分化された内皮細胞などの操作された内皮細胞を含有する組成物を投与することを伴う。血管細胞または血管新生を必要とする組織は、とりわけ、心臓組織、肝臓組織、膵臓組織、腎組織、筋組織、神経組織、骨組織であり得、これは損傷を受けた、過剰な細胞死を特徴とする組織、損傷の危険性がある組織、または人工的に操作された組織であり得る。

【0531】

いくつかの実施形態では、心疾患または障害に関連し得る血管疾患は、限定されないが、本明細書に記載されるように派生させた最終的な血管内皮細胞及び心内膜内皮細胞などの内皮細胞を投与することによって治療することができる。このような血管疾患には、冠動脈疾患、脳血管疾患、大動脈狭窄、大動脈瘤、末梢動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、静脈瘤、血管障害、冠灌流を欠いた心臓の梗塞領域、非治癒性創傷、糖尿病性もしくは非糖尿病性潰瘍、または血管の形成の誘導が望ましい任意の他の疾患もしくは障害が含まれるが、これらに限定されない。

【0532】

特定の実施形態では、内皮細胞は、血管再建手術で使用される補綴インプラント（例えば、Ｄａｃｒｏｎ及びＧｏｒｔｅｘなどの合成材料で作製された血管）を改善するために使用される。例えば、重要な臓器または肢を灌流する病変動脈を置換するために、補綴動脈移植片が使用される場合が多い。他の実施形態では、操作された内皮細胞は、弁表面での血栓形成性を下げることによって塞栓形成の危険性を低下させるように補綴心臓弁の表面を覆うために使用される。

【0533】

概説される内皮細胞は、組織及び／または単離された細胞を血管に移植するための周知の外科的技法を使用して、患者に移植することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、注射（例えば、心筋内注射、冠動脈内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、経皮注射）、注入、移植、及び埋め込みによって患者の心臓組織に導入される。

【0534】

内皮細胞の投与（送達）には、静脈内、動脈内（例えば、冠動脈内）、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻腔内投与ならびに髄腔内、及び注入技法を含む、皮下または非経口が含まれるが、これらに限定されない。

【0535】

当業者には理解されようが、細胞は、細胞種及びこれらの細胞の最終的用途の両方に依存する当技術分野で既知の技法を使用して移植される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、患者において静脈内にまたは特定の箇所での注射によってのいずれかで移植される。特定の部位に移植する場合、細胞は、それらが定着する間の分散を防止するためにゲルマトリックス中に懸濁させてもよい。

【0536】

例示的な内皮細胞種には、毛細血管内皮細胞、血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、動脈内皮細胞、静脈内皮細胞、腎内皮細胞、脳内皮細胞、肝臓内皮細胞などが含まれるが、これらに限定されない。

【0537】

単離された初代内皮細胞など本明細書に概説される内皮細胞は、１つ以上の内皮細胞マーカーを発現し得る。このようなマーカーの非限定的な例としては、ＶＥ－カドヘリン（ＣＤ１４４）、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）（ＣＤ１４３）、ＢＮＨ９／ＢＮＦ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－ｌ）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ－セレクチン）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１４６、エンドカン（ＥＳＭ－ｌ）、エンドグリクス－ｌ、エンドムチン、エオタキシン－３、ＥＰＡＳ１（内皮ＰＡＳドメインタンパク質１）、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、ＦＬＩ－ｌ、Ｆｌｋ－ｌ（ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ－２）、ＦＬＴ－ｌ（ＶＥＧＦＲ－ｌ）、ＧＡＴＡ２、ＧＢＰ－ｌ（グアニル酸結合タンパク質－ｌ）、ＧＲＯ－アルファ、ＨＥＸ、ＩＣＡＭ－２（細胞間接着分子２）、ＬＭ０２、ＬＹＶＥ－ｌ、ＭＲＢ（マジックラウンドアバウト（ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ））、ヌクレオリン、ＰＡＬ－Ｅ（病理解剖学的ライデン内皮（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｃｈｅ ａｎａｔｏｍｉｅ Ｌｅｉｄｅｎ－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ））、ＲＴＫ、ｓＶＣＡＭ－ｌ、ＴＡＬＩ、ＴＥＭ１（腫瘍内皮マーカー１）、ＴＥＭ５（腫瘍内皮マーカー５）、ＴＥＭ７（腫瘍内皮マーカー７）、トロンボモジュリン（ＴＭ、ＣＤ１４１）、ＶＣＡＭ－ｌ（血管細胞接着分子－１）（ＣＤ１０６）、ＶＥＧＦ、ｖＷＦ（フォン・ヴィレブランド因子）、ＺＯ－ｌ、内皮細胞選択的接着分子（ＥＳＡＭ）、ＣＤ１０２、ＣＤ９３、ＣＤ１８４、ＣＤ３０４、及びＤＬＬ４が挙げられる。

【0538】

いくつかの実施形態では、内皮細胞は、障害／病態を治療するかまたは障害／病態の症状を改善させるのに有用である、限定されないが酵素、ホルモン、受容体、リガンド、または薬物などの目的のタンパク質をコードする外因性遺伝子を発現するように、更に遺伝子改変される。内皮細胞を遺伝子改変するための標準的方法は、例えば、ＵＳ５，６７４，７２２に記載される。

【0539】

このような内皮細胞を使用し、疾患の予防または治療において有用であるポリペプチドまたはタンパク質の構成的合成及び送達を提供することができる。このようにして、ポリペプチドは、個体の血流または身体の他の領域（例えば、中枢神経系）中に直接分泌される。いくつかの実施形態では、内皮細胞は、インスリン、血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子またはフォン・ヴィレブランド因子）、アルファ－１抗トリプシン、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３）などを分泌するように改変され得る。

【0540】

特定の実施形態では、内皮細胞は、埋め込まれた移植片の関連においてそれらの性能を改善するように改変され得る。非限定的で例示的な例としては、管腔内血塊形成を予防するための血栓溶解物質の分泌または発現、平滑筋肥大に起因する管腔狭窄を予防するための平滑筋増殖の阻害物質の分泌、ならびに内皮細胞増殖を刺激し、移植片管腔の内皮細胞による裏打ちの範囲または持続期間を改善するための内皮細胞分裂促進因子または自己分泌因子の発現及び／または分泌が挙げられる。

【0541】

いくつかの実施形態では、操作された内皮細胞は、治療的レベルの分泌産物を特定の臓器または肢に送達するのに利用される。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作された（形質導入された）内皮細胞で裏打ちされた血管インプラントが、特定の臓器または肢に移植され得る。形質導入された内皮細胞の分泌産物は、灌流組織に高濃度で送達され、それによって標的とする解剖学的位置への所望の効果を達成するであろう。

【0542】

他の実施形態では、内皮細胞は、血管新生化している腫瘍において、内皮細胞によって発現されるときに血管新生を妨害または阻害する遺伝子を含有するように、更に遺伝子改変される。場合によっては、内皮細胞はまた、腫瘍治療の完了時に移植された内皮細胞の負の選択を可能にする、本明細書に記載の選択可能自殺遺伝子のうちのいずれか１つを発現するように遺伝子改変され得る。

【0543】

いくつかの実施形態では、単離された初代内皮細胞などの本明細書に記載の内皮細胞は、血管損傷、心血管疾患、血管疾患、末梢血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、高血圧症、虚血性組織損傷、再灌流損傷、肢虚血、脳卒中、ニューロパチー（例えば、末梢ニューロパチーまたは糖尿病性ニューロパチー）、臓器不全（例えば、肝不全、腎不全など）、糖尿病、関節リウマチ、骨粗鬆症、脳血管疾患、高血圧症、冠動脈疾患に起因する狭心症及び心筋梗塞、腎血管高血圧症、腎動脈狭窄に起因する腎不全、下肢の跛行、他の血管病態または疾患からなる群から選択される血管障害を治療するためにレシピエント対象に投与される。

【0544】

ｅ．上皮細胞
１）網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変された細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である。いくつかの実施形態では、初代ＲＰＥ細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健常ドナー（例えば、疾患または感染が知られていないか、またはその疑いがない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）から単離または入手される。当業者であれば理解するように、個体からＲＰＥ細胞を単離または入手する方法は、既知の技術を使用して達成することができる。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植または生着のために、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含む操作された初代ＲＰＥ細胞が提供される。

【0545】

いくつかの実施形態では、初代ＲＰＥ細胞は、対象または個体から得られ（例えば、採取され、抽出され、離され、または取得され）る。いくつかの実施形態では、初代ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞が１以上の対象（例えば、１以上の健康なヒトを含む１以上のヒト）に由来するようにＲＰＥ細胞のプールから生成される。いくつかの実施形態では、初代ＲＰＥ細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象からのものである。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞のプールが得られるドナー対象のうちの１つ以上は、患者とは異なる。

【0546】

本技術における使用のための方法を含むＲＰＥ細胞の追加の説明は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、この開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0547】

いくつかの実施形態では、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代ＲＰＥ細胞などの操作されたＲＰＥ細胞の集団は、投与前に培養物中で維持され、場合によっては増殖される。特定の実施形態では、操作されたＲＰＥ細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0548】

例となるＲＰＥ細胞種には、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ＲＰＥ前駆細胞、未成熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞、機能的ＲＰＥ細胞などが含まれるが、これらに限定されない。

【0549】

いくつかの実施形態では、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代ＲＰＥ細胞などのＲＰＥ細胞は、天然ＲＰＥ細胞の遺伝子発現プロファイルと類似または実質的に類似の遺伝子発現プロファイルを有する。このようなＲＰＥ細胞は、平面基板上でコンフルエントの状態まで増殖させたときに、天然ＲＰＥ細胞の多角形平面状シート形態を有してもよい。

【0550】

いくつかの実施形態では、本技術は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現が低減するか、またはその発現を欠いている、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代ＲＰＥ細胞などの操作されたＲＰＥ細胞に関する。特定の実施形態では、操作されたＲＰＥ細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作されたＲＰＥ細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作されたＲＰＥ細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のうちの１つ以上を破壊する遺伝子改変を保有する。

【0551】

いくつかの実施形態では、提供される操作されたＲＰＥ細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＲＰＥ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代ＲＰＥ細胞は、患者（例えば、投与時のレシピエント）において免疫応答を活性化しない。その必要がある対象（例えば、レシピエント）または患者に本明細書に記載の操作されたＲＰＥ細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が、提供される。

【0552】

ＲＰＥ細胞は、黄斑変性を患う患者または損傷を受けたＲＰＥ細胞を有する患者に移植することができる。いくつかの実施形態では、患者は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、初期ＡＭＤ、中期ＡＭＤ、後期ＡＭＤ、新生血管を伴わない加齢黄斑変性、ドライ型黄斑変性（ドライ型加齢黄斑変性）、ウェット型黄斑変性（ウェット型加齢黄斑変性）、若年性黄斑変性（ＪＭＤ）（例えば、スターガルト病、ベスト病、及び若年性網膜分離症）、レーバー先天性黒内障、または網膜色素変性症を有する。他の実施形態では、患者は、網膜剥離を患う。

【0553】

２）甲状腺細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変された細胞は、初代甲状腺細胞である。いくつかの実施形態では、初代甲状腺細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健常ドナー（例えば、疾患または感染が知られていないか、またはその疑いがない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）から単離または入手される。当業者であれば理解するように、個体から甲状腺細胞を単離または入手する方法は、既知の技術を使用して達成することができる。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植または生着のために、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含む操作された初代甲状腺細胞が提供される。

【0554】

いくつかの実施形態では、初代甲状腺細胞は、対象または個体から得られ（例えば、採取され、抽出され、離され、または取得され）る。いくつかの実施形態では、初代甲状腺細胞は、甲状腺細胞が１以上の対象（例えば、１以上の健康なヒトを含む１以上のヒト）に由来するように甲状腺細胞のプールから生成される。いくつかの実施形態では、初代甲状腺細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象からのものである。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、甲状腺細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、甲状腺細胞のプールが得られるドナー対象のうちの１つ以上は、患者とは異なる。

【0555】

いくつかの実施形態では、本技術は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現が低減するか、またはその発現を欠いている、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代甲状腺細胞などの操作された甲状腺細胞に関する。特定の実施形態では、操作された甲状腺細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作された甲状腺細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作された甲状腺細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のうちの１つ以上を破壊する遺伝子改変を保有する。

【0556】

いくつかの実施形態では、提供される操作された甲状腺細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作された甲状腺細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代甲状腺細胞は、患者（例えば、投与時のレシピエント）において免疫応答を活性化しない。その必要がある対象（例えば、レシピエント）または患者に本明細書に記載の操作された内皮細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が、提供される。

【0557】

ｆ．肝細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変された細胞は、初代肝細胞である。いくつかの実施形態では、初代肝細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健常ドナー（例えば、疾患または感染が知られていないか、またはその疑いがない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）から単離または入手される。当業者であれば理解するように、個体から肝細胞を単離または入手する方法は、既知の技術を使用して達成することができる。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植または生着のために、本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含む操作された初代肝細胞が提供される。いくつかの実施形態では、操作された初代肝細胞は、肝細胞機能の喪失または肝硬変に対処するための細胞療法として投与され得る。

【0558】

いくつかの実施形態では、初代肝細胞は、対象または個体から得られ（例えば、採取され、抽出され、離され、または取得され）る。いくつかの実施形態では、初代肝細胞は、肝細胞が１以上の対象（例えば、１以上の健康なヒトを含む１以上のヒト）に由来するように肝細胞のプールから生成される。いくつかの実施形態では、初代肝細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象からのものである。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、肝細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、肝細胞のプールが得られるドナー対象のうちの１つ以上は、患者とは異なる。

【0559】

いくつかの実施形態では、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代肝細胞などの操作された肝細胞の集団は、投与前に培養物中で維持され、場合によっては増殖される。特定の実施形態では、操作された肝細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0560】

いくつかの実施形態では、本技術は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現が低減するか、またはその発現を欠いている、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代肝細胞などの操作された肝細胞に関する。特定の実施形態では、操作された肝細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作された肝細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作された肝細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のうちの１つ以上を破壊する遺伝子改変を保有する。

【0561】

いくつかの実施形態では、提供される操作された肝細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作された肝細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健常ドナー）から単離された初代肝細胞は、患者（例えば、投与時のレシピエント）において免疫応答を活性化しない。その必要がある対象（例えば、レシピエント）または患者に本明細書に記載の操作された肝細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が、提供される。

【0562】

ｇ．心臓細胞
本明細書では、対象（例えば、レシピエント）へのその後の移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）のための心臓細胞種が提供される。

【0563】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の心臓細胞は、小児期心筋症、加齢性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、特発性心筋症、他の心筋症、心筋虚血再灌流傷害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠動脈疾患、末期心疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧症、再狭窄、狭心症、リウマチ性心臓、動脈炎症、心血管疾患、心筋梗塞、心筋虚血、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心外傷、心筋虚血、血管疾患、後天性心疾患、先天性心疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、機能不全の伝導系、機能不全の冠動脈、肺高血圧症、心不整脈、筋ジストロフィー、筋肉量異常、筋肉変性、心筋炎、感染性心筋炎、薬物または毒素誘発性筋肉異常、過敏性心筋炎、及び自己免疫心内膜炎からなる群から選択される心障害を治療するために、レシピエント対象に投与される。

【0564】

したがって、本明細書では、その必要がある対象における、心外傷または心疾患もしくは障害の治療及び予防のための方法が提供される。本明細書に記載の方法を使用し、いくつかの心疾患またはそれらの症状、例えば、心臓の構造及び／または機能への病理学的損傷をもたらすものを治療するか、改善させるか、予防するか、またはその進行を緩徐化することができる。「心臓疾患」、「心臓障害」、及び「心臓外傷」という用語は、本明細書で互換的に使用され、弁、内皮、梗塞領域、または心臓の他の構成要素もしくは構造を含めた心臓に関係する状態及び／または障害を指す。このような心臓疾患または心臓関連疾患には、とりわけ、心筋梗塞、心不全、心筋症、先天性心臓欠陥、心臓弁疾患または機能不全、心内膜炎、リウマチ熱、僧帽弁逸脱症、感染性心内膜炎、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、心肥大、及び／または僧帽弁閉鎖不全症が含まれるが、これらに限定されない。

【0565】

いくつかの実施形態では、操作された心臓細胞の集団は、投与前に培養中に維持され、場合によっては増殖される。特定の実施形態では、操作された心臓細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0566】

いくつかの実施形態では、本技術は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現が低減するか、またはその発現を欠いている、操作された心臓細胞に関する。特定の実施形態では、操作された心臓細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作された心臓細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作された心臓細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のうちの１つ以上を破壊する遺伝子改変を保有する。

【0567】

いくつかの実施形態では、提供される操作された心臓細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された心臓細胞は、患者（例えば、投与時にレシピエント）において免疫応答を活性化しない。その必要がある対象（例えば、レシピエント）または患者に本明細書に記載の操作された心臓細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が、提供される。

【0568】

いくつかの実施形態では、投与は、対象の心臓組織内への埋め込み、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、または輸注を含む。

【0569】

いくつかの実施形態では、操作された心臓細胞を投与される患者はまた、心臓薬も投与される。併用療法において使用するのに好適である心臓薬の例示的な例としては、成長因子、成長因子をコードするポリヌクレオチド、血管新生剤、カルシウムチャネル遮断薬、血圧降下剤、有糸分裂阻害剤、変力作用剤、アテローム生成抑制剤、抗凝血薬、ベータ遮断薬、抗不整脈剤、抗炎症剤、血管拡張剤、血栓溶解剤、強心配糖体、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、原虫を阻害する薬剤、硝酸塩、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）；抗新生細胞剤、ステロイドなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0570】

本明細書で提供される方法による療法の効果は、様々な方式で監視され得る。例えば、心電図（ＥＣＧ）またはホルターモニター（ｈｏｌｉｅｒ ｍｏｎｉｔｏｒ）を利用して、治療の有効性を決定することができる。ＥＣＧは、心臓のリズム及び電気インパルスの尺度であり、療法が対象の心臓における電気伝導を改善もしくは維持、予防、またはその性能低下を緩徐化したかどうかを決定するために非常に有効で非侵襲的な方法である。心臓異常、不整脈障害などを監視するために長時間にわたって装着され得る携帯型ＥＣＧであるホルターモニターの使用もまた、療法の有効性を評定するための信頼のおける方法である。ＥＣＧまたは核研究を使用して、心室機能の改善を決定することができる。

【0571】

ｈ．神経細胞
本明細書では、レシピエント対象へのその後の移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）に有用である、異なる神経細胞種が提供される。例となる神経細胞種には、脳内皮細胞、ニューロン（例えば、ドーパミン作動性ニューロン）、グリア細胞などが含まれるが、これらに限定されない。

【0572】

いくつかの実施形態では、操作された神経細胞の集団は、投与前に培養中に維持され、場合によっては増殖される。特定の実施形態では、操作された神経細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0573】

いくつかの実施形態では、本技術は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現が低減するか、またはその発現を欠いている、操作された神経細胞に関する。特定の実施形態では、操作された神経細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作された神経細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作された神経細胞は、免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のうちの１つ以上を破壊する遺伝子改変を保有する。

【0574】

いくつかの実施形態では、提供される操作された神経細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された神経細胞は、患者（例えば、投与時にレシピエント）において免疫応答を活性化しない。その必要がある対象（例えば、レシピエント）または患者に本明細書に記載の操作された神経細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が、提供される。

【0575】

いくつかの実施形態では、神経細胞は、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、他の神経変性疾患または病態、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、他の神経精神性障害を治療するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の神経細胞は、脳卒中を治療または改善するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、ニューロン及びグリア細胞は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象に投与される。

【0576】

１）脳内皮細胞
いくつかの実施形態では、脳内皮細胞は、脳出血の症状または影響を緩和するために投与される。いくつかの実施形態では、ドーパミン作動性ニューロンは、パーキンソン病を有する患者に投与される。いくつかの実施形態では、ノルアドレナリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、癲癇発作を経験した患者に投与される。いくつかの実施形態では、運動ニューロン、介在ニューロン、シュワン細胞、乏突起膠細胞、及びミクログリアは、脊髄損傷を経験した患者に投与される。

【0577】

２）ドーパミン作動性ニューロン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＨＩＰ細胞は、ドーパミン作動性ニューロンである。

【0578】

場合によっては、「ドーパミン作動性ニューロン」という用語は、ドーパミン合成のための律速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現するニューロン細胞を含む。いくつかの実施形態では、ドーパミン作動性ニューロンは、神経伝達物質ドーパミンを分泌し、ドーパミンヒドロキシラーゼをほとんどまたはまったく発現しない。ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンは、以下のマーカー：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、１－芳香族アミノ酸脱炭酸酵素、小胞モノアミン輸送体２、ドーパミン輸送体、Ｎｕｒｒ－１、及びドーパミン－２受容体（Ｄ２受容体）のうちの１つ以上を発現することができる。

【0579】

いくつかの実施形態では、ＤＡニューロンは、神経変性疾患または状態を治療するために患者、例えば、ヒト患者に投与される。場合によっては、神経変性疾患または状態は、パーキンソン病、ハンチントン病、及び多発性硬化症からなる群から選択される。他の実施形態では、ＤＡニューロンは、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、及びうつ病などの神経精神性障害の１つ以上の症状を治療または改善するために使用される。更なる他の実施形態では、ＤＡニューロンは、障害のあるＤＡニューロンを有する患者を治療するために使用される。

【0580】

いくつかの実施形態では、分化したＤＡニューロンは、患者において静脈内にまたは特定の部位での注射によってのいずれかで移植される。いくつかの実施形態では、ＤＡ細胞は、パーキンソン病をもたらした変性を有するＤＡニューロンを置換するために、脳の黒質（特に緻密部内にまたはそれに隣接して）、腹側被蓋野（ＶＴＡ）、尾状核、被殻、側坐核、視床下核、またはこれらの任意の組み合わせに移植される。ＤＡ細胞は、細胞懸濁液として標的領域に注射することができる。あるいは、ＤＡ細胞は、支持マトリックスまたは足場に（かかる送達デバイス内に収容された場合）埋め込むことができる。いくつかの実施形態では、足場は、生分解性である。他の実施形態では、足場は、生分解性ではない。足場は、天然または合成（人工）材料を含み得る。

【0581】

ＤＡニューロンの送達は、限定されないがリポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルなどの好適なビヒクルを使用することによって達成することができる。他の実施形態では、ＤＡニューロンは、等張性賦形剤を含む医薬組成物中で投与される。医薬組成物は、ヒト投与のために十分に滅菌された条件下で調製される。いくつかの実施形態では、ＤＡは、医薬組成物の形態で供給される。

【0582】

３）グリア細胞
いくつかの実施形態では、記載される神経細胞には、限定されないが、ミクログリア、星状細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、及びシュワン細胞、グリア前駆体、ならびにグリア前駆細胞などのグリア細胞が含まれる。

【0583】

脊髄損傷に対する神経細胞移植の有効性は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９９，５：１４１０及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：５０によって記載されるような、急性脊髄損傷のラットモデルにおいて評定することができる。例えば、移植の成功は、２～５週間後の病変における移植由来の細胞の存在、星状細胞、乏突起膠細胞、及び／またはニューロンへの分化、病変端部から脊髄に沿った移動、ならびに歩行、協調、及び体重負荷の改善を示し得る。具体的な動物モデルは、神経細胞種及び治療される神経学的疾患または神経学的病態に基づいて選択される。

【0584】

神経細胞は、それらが意図される組織部位に生着し、機能的に不全の領域を再構成または再生することを可能にする様態で投与することができる。例えば、神経細胞は、治療されている疾患に応じて、中枢神経系の実質部位または髄腔内部位に直接移植することができる。いくつかの実施形態では、脳内皮細胞、ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、上衣細胞、星状細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、及びシュワン細胞を含めた、本明細書に記載の神経細胞のうちのいずれも、静脈内、脊髄内、脳室内、髄腔内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、筋肉内、腹部内、眼内、眼球後、及びこれらの組み合わせを介して患者に注射される。いくつかの実施形態では、細胞は、ボーラス注射または持続注入の形態で注射または移植（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）される。特定の実施形態では、神経細胞は、脳内に、脳に適切（ａｐｐｏｓｉｔｅ）に、及びこれらの組み合わせへの注射によって投与される。注射は、例えば、対象の頭蓋に作製された穿頭孔を通して行うことができる。脳への神経細胞の投与に好適な部位には、脳室、側脳室、大槽、被殻、基底核、海馬皮質、線条体、脳の尾状領域、及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

【0585】

本技術における使用に向けたドーパミン作動性ニューロンを含めた神経細胞の追加の説明は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、この開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0586】

２．幹細胞
いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞または前駆細胞（例えば、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞もしくは前駆細胞、生殖細胞系幹細胞、肺幹細胞もしくは前駆細胞、乳腺幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、複能性幹細胞、羊水幹細胞、臍帯血幹細胞、または神経幹細胞もしくは前駆細胞）である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、成体幹細胞（例えば、体性幹細胞または組織特異的幹細胞）である。いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、分化させることができる（例えば、幹細胞は、全能性、多能性、または複能性である）。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞、赤血球－巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、導管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、または褐色脂肪細胞へとマニピュレートされる（例えば、変換または分化させられる）。

【0587】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作された細胞は、人工多能性幹細胞であるか、または人工多能性幹細胞に由来するか、もしくはそれから分化した操作された細胞である。マウス及びヒト多能性幹細胞（一般にｉＰＳＣ；マウス細胞の場合はｍｉＰＳＣまたはヒト細胞の場合はｈｉＰＳＣと称される）の生成は一般的に、当技術分野で知られている。当業者によって理解されるように、ｉＰＣＳの生成のための多様な異なる方法が存在する。元来の誘導は、４つの転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４のウイルス導入を使用してマウス胚または成体線維芽細胞から行われる；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６（２００６）（それに概説された技術についてその全体が具体的に参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。それ以来、いくつかの方法が開発されてきた。概観についてはＳｅｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ７（１）：１１６－１２５（２０１５）、及びＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ａｎｄ Ｖｅｒｍｕｒｉ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１３を参照されたく、同文献はいずれも、参照によりそれらの全体が、とりわけｈｉＰＳＣを生成するための方法（例えば、後者の参考文献の第３章を参照されたい）に関して本明細書に明示的に組み込まれる。

【0588】

通常、ｉＰＳＣは、エピソームベクターを使用して通常導入される、宿主細胞における１つ以上の再プログラム化因子」の一過性発現によって生成される。これらの条件下で、少量の細胞がｉＰＳＣとなるように誘導される（通常、この工程の効率は、選択マーカーが使用されないので低い）。細胞が「再プログラム化」され、多能性となると、それらは、エピソームベクター（複数可）を喪失し、内因性遺伝子を使用してその因子を生成する。

【0589】

また当業者によって理解されるように、使用され得るまたは使用される再プログラム化因子の数は様々であり得る。一般的に、より少ない再プログラム化因子が使用される場合、「多能性」だけでなく、多能性状態への細胞の形質転換の効率が低下し、例えば、より少ない再プログラム化因子は、十分に多能性ではないが、より少ない細胞種にのみ分化することができる場合がある細胞をもたらし得る。

【0590】

いくつかの実施形態では、単一の再プログラミング因子ＯＣＴ４が使用される。他の実施形態では、２つの再プログラミング因子ＯＣＴ４及びＫＬＦ４が使用される。他の実施形態では、３つの再プログラミング因子ＯＣＴ４、ＫＬＦ４及びＳＯＸ２が使用される。他の実施形態では、４つの再プログラミング因子ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ－Ｍｙｃが使用される。他の実施形態では、ＳＯＫＭＮＬＴ；ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及びＳＶ４０Ｌ Ｔ抗原から選択される５、６または７つの再プログラミング因子が使用され得る。通常、これらの再プログラミング因子遺伝子は、当技術分野で知られており、市販されているものなどのエピソームベクター上で提供される。

【0591】

いくつかの実施形態では、１つ以上の再プログラミング因子をトランスフェクトするために使用される宿主細胞は、非多能性幹細胞である。通常、当技術分野で知られているように、ｉＰＳＣは、本明細書に記載される再プログラミング因子を一時的に発現させることによって、非多能性細胞、例えば、限定されないが、血液細胞、線維芽細胞などから作製される。いくつかの実施形態では、線維芽細胞などの非多能性細胞は、細胞を再プログラミングする前に、１以上の個々の対象またはドナーから取得または単離される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上）の異なるドナー対象から得られた、単離された非多能性幹細胞、例えば、線維芽細胞のプールから作製される。いくつかの実施形態では、非多能性細胞、例えば、線維芽細胞は、複数の異なるドナー対象（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上）の異なるドナー対象から単離または取得され、一緒にバッチでプールされ、ｉＰＳＣとして再プログラミングされ、提供される方法に従って操作される。

【0592】

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、レシピエント対象（例えば、細胞を投与される患者）とは異なる１以上のドナー対象からの非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）のプールからの細胞に、１つ以上の再プログラミング因子を一過性にトランスフェクションすることによるなどに由来する。ｉＰＳＣに誘導される非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、またはそれよりも多くのドナー対象から入手され得、一緒にプールすることができる。非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上のドナー対象から入手され得、一緒にプールすることができる。いくつかの実施形態では、非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）は、１以上の個体から採取され、いくつかの事例では、非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）または非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）のプールはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養され、１つ以上の再プログラミング因子を遺伝子導入してｉＰＳＣの生成を誘導する。いくつかの実施形態では、非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）または非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）のプールは、本明細書に提供される方法に従って操作または改変される。いくつかの実施形態では、次いで、操作されたｉＰＳＣまたは操作されたｉＰＳＣのプールは、生物及び組織の任意の細胞に分化するための分化プロセスに供される。

【0593】

操作されたｉＰＳＣが生成されると、それらは、ＷＯ２０１６１８３０４１及びＷＯ２０１８１３２７８３に記載されているように、それらの低免疫原性及び／または多能性の保持についてアッセイされ得る。いくつかの実施形態では、低免疫原性は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１３及び図１５に例示される多数の技術を使用してアッセイされる。これらの技法は、同種異系宿主への移植、及び宿主免疫系を回避する低免疫原性多能性細胞の増殖（例えば、奇形腫）に対する監視を含む。いくつかの事例では、低免疫原性多能性細胞派生物は、ルシフェラーゼを発現するように形質導入され、次いで生物発光イメージングを使用して追跡され得る。同様に、かかる細胞に対する宿主動物のＴ細胞及び／またはＢ細胞反応は、細胞が宿主動物における免疫応答を引き起こさないことを確認するために試験される。Ｔ細胞反応は、Ｅｌｉｓｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、またはマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によって評価され得る。Ｂ細胞反応または抗体反応は、ＦＡＣＳまたはＬｕｍｉｎｅｘを使用して評価される。追加的にまたは代替的に、細胞は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１４及び１５に全般的に示されるように、自然免疫応答、例えば、ＮＫ細胞殺傷を回避するそれらの能力についてアッセイされ得る。

【0594】

いくつかの実施形態では、細胞の免疫原性は、例えば、当業者によって認識されているＴ細胞増殖アッセイ、Ｔ細胞活性化アッセイ、及びＴ細胞殺傷アッセイなどのＴ細胞イムノアッセイを使用して評価される。場合によっては、Ｔ細胞増殖アッセイには、細胞をインターフェロンγで事前治療すること及び細胞を標識Ｔ細胞と共培養すること及び事前選択された時間後にＴ細胞集団（または、増殖しているＴ細胞集団）の存在をアッセイすることが含まれる。場合によっては、Ｔ細胞活性化アッセイには、Ｔ細胞を本明細書で概説される細胞と共培養すること及びＴ細胞におけるＴ細胞活性化マーカーの発現レベルを決定することが含まれる。

【0595】

ｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、本明細書で概説される細胞の免疫原性を評価するために実施され得る。いくつかの実施形態では、操作されたまたは改変されたｉＰＳＣの生存及び免疫原性は、同種異系ヒト化免疫不全マウスモデルを使用して決定される。いくつかの事例では、操作されたまたは改変されたｉＰＳＣは、同種異系ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに移植され、細胞拒絶反応、細胞生存、及び奇形腫形成に関してアッセイされる。いくつかの事例では、移植された操作されたｉＰＳＣまたはその分化細胞は、マウスモデルにおいて長期生存を示す。

【0596】

細胞の低免疫原性を含む免疫原性を決定するための追加の技術は、例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８及びＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に記載されており、図、図の凡例、及び方法の説明を含むその開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0597】

同様に、多能性の保持は、いくつかの方式で試験される。一実施形態では、多能性は、本明細書に一般に記載されると共に、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２９に示されるように、特定の多能性特異的因子の発現によってアッセイされる。追加的にまたは代替的に、多能性細胞は、多能性の指標として１つ以上の細胞種に分化される。

【0598】

ひとたび操作された多能性幹細胞（操作されたｉＰＳＣ）が生成されると、それらは、ｉＰＳＣの維持に関して既知であるように、未分化状態で維持され得る。例えば、細胞は、分化を防止すると共に多能性を維持する培養基を使用してマトリゲル上で培養され得る。加えて、それらは、多能性を維持するような条件下で培養基中にあることができる。

【0599】

本明細書に記載の多能性幹細胞のうちのいずれも、生物及び組織の任意の細胞に分化させることができる。一態様では、レシピエント対象へのその後の移植用にｉＰＳＣから異なる細胞種に分化させられる操作された細胞が、本明細書で提供される。分化は、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって、当技術分野で既知であるようにアッセイすることができる。当業者には理解されようが、分化した操作された（例えば、低免疫原性）多能性細胞派生物は、細胞種及びこれらの細胞の最終的用途の両方に依存する当技術分野で既知の技法を使用して移植することができる。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、本明細書に記載される任意の種類の細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、β膵島細胞、内皮細胞、上皮（例えば、ＲＰＥ、甲状腺、皮膚）細胞、または肝細胞から選択される細胞種に分化される。いくつかの実施形態では、個々のドナーまたは個々のドナーのプールからの非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）などの宿主細胞は、単離または入手され、ｉＰＳＣへと生成され、ここで、ｉＰＳＣは次いで本明細書に記載の改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作され、次いで所望の細胞型に分化される。

【0600】

３．ＡＢＯ式血液型及びＲｈ抗原の発現
血液産物は、ヒトの体内のすべての赤血球細胞の表面上の抗原の有無に従って、異なる群に分類され得る（ＡＢＯ式血液型）。Ａ、Ｂ、ＡＢ、及びＡｌ抗原は、赤血球の糖タンパク質上のオリゴ糖の配列によって決定される。血液型抗原群における遺伝子は、抗原タンパク質を作製するための指示を提供する。血液型抗原タンパク質は、赤血球細胞の細胞膜内で様々な機能を果たす。これらのタンパク質の機能には、他のタンパク質及び分子を細胞内にならびに細胞から輸送すること、細胞構造を維持すること、他の細胞及び分子に付着すること、ならびに化学反応に関与することが含まれる。

【0601】

アカゲザル因子（Ｒｈ）血液型は、ＡＢＯ式血液型システムに次いで２番目に重要な血液型システムである。Ｒｈ血液型システムは、４９個の定義された血液型抗原からなり、この中でもＤ、Ｃ、ｃ、Ｅ及びｅの５個の抗原が最も重要である。個体のＲｈ（Ｄ）ステータスは通常、ＡＢＯ型の後にプラスまたはマイナスの接尾辞を付けて記載される。「Ｒｈ因子」、「Ｒｈ陽性」及び「Ｒｈ陰性」という用語は、Ｒｈ（Ｄ）抗原のみを指す。Ｒｈ抗原に対する抗体は、溶血性輸血反応に関与し得、Ｒｈ（Ｄ）及びＲｈ（ｃ）抗原に対する抗体は、胎児及び新生児の溶血性疾患の重大なリスクを付与する。ＡＢＯ抗体は、すべてのヒトにおいて早期齢に発達する。しかし、Ｒｈ－のヒトにおけるアカゲザル抗体は、典型的には、そのヒトが感作されるときにのみ発達する。これは、例えば、Ｒｈ＋の乳児を出産することによって、またはＲｈ＋血液の輸血を受けることによって起こり得る。

【0602】

Ａ、Ｂ、Ｈ及びＲｈ抗原は、血液、組織、及び細胞移植に向けたドナーとレシピエントとの間の組織適合性の主要な決定因子である。ＡＢＯ遺伝子によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼ活性は、細胞の表面上に提示されるＡ、Ｂ、ＡＢ、Ｏ組織－血液型抗原の生成を担う。Ａ型の個体は、ａ（１，３）Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性の生成に対して特異性をもつＡＢＯ遺伝子産物をコードし、Ｂ型の個体は、ａ（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の生成に対して特異性をもつＡＢＯ遺伝子産物をコードする。Ｏ型の個体は、機能的なガラクトシルトランスフェラーゼをまったく生成せず、したがって、いずれの改変も生成しない。ＡＢ型の個体は、それぞれのコピーを１つずつ保有し、両方の種類の改変を生成する。ＡＢＯ遺伝子の酵素産物は、基質としてのＨ抗原に作用するため、ＡＢＯ活性を欠いているＯ型の個体は、未改変のＨ抗原を提示し、したがって、Ｏ（Ｈ）型と称される場合が多い。

【0603】

Ｈ抗原自体は、ＦＵＴ１遺伝子によってコードされるａ（１，２）フコシルトランフエェラーゼ酵素の産物である。非常にまれな個体では、ＦＵＴ１遺伝子の破壊の結果としてＨ抗原の完全な喪失が存在し、ＡＢＯがＡまたはＢ組織－血液型を生成するための基質が何ら存在しなくなる。これらの個体は、ボンベイ組織－血液型と言われる。Ｒｈ抗原は、ＲＨＤ遺伝子によってコードされ、Ｒｈ陰性である個体は、ＲＨＤ遺伝子の欠失または破壊を保有する。

【0604】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞または細胞集団は、ＡＢＯ Ｏ型Ｒｈ因子陰性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＢＯ Ｏ型Ｒｈ因子陰性細胞は、ＡＢＯ Ｏ型Ｒｈ因子陰性ドナーに由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＢＯ Ｏ型Ｒｈ因子陰性細胞は、ＡＢＯ Ａ型、ＡＢＯ Ｂ型、またはＲｈ因子抗原の提示を欠くように操作される。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ Ｏ型及び／またはＲｈ陰性細胞は、ＡＢＯ遺伝子の部分的もしくは完全な不活性化を含み（例えば、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異によって、またはＡＢＯ遺伝子のエクソン６の２５８ｄｅｌＧ変異の挿入によって）、及び／またはＲＨＤ遺伝子の発現は、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活化される。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ Ｏ型Ｒｈ陰性細胞は、ＦＵＴ１遺伝子の部分的もしくは完全な不活性化を含み、及び／またはＲＨＤ遺伝子の発現は、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的または完全に不活性化される。いくつかの実施形態では、操作されたＡＢＯ Ｏ型及び／またはＲｈ因子陰性細胞は、例えば、Ａ型細胞からＯ型細胞に、Ｂ型細胞からＯ型細胞に、ＡＢ型細胞からＯ型細胞に、Ａ型＋細胞からＯ型－細胞に、Ａ型－細胞からＯ型－細胞に、ＡＢ型＋細胞からＯ型－細胞に、ＡＢ型－細胞からＯ型－細胞に、Ｂ型＋細胞からＯ型－細胞に、及びＢ型－細胞からＯ型－細胞に改変するための遺伝子編集を使用して生成される。例示的な操作されたＡＢＯ Ｏ型Ｒｈ因子陰性細胞及びその生成方法は、ＷＯ２０２１／１４６２２２に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0605】

４．性染色体
特定の態様では、性染色体を有する細胞は、特定の抗原（例えば、Ｙ抗原）を発現でき、レシピエントは、このような抗原に対する既存の感受性を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、男性胎児を妊娠したことがある女性は、男性ドナーからの細胞を拒絶する可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、ドナーは男性であり、レシピエントは男性である。いくつかの実施形態では、ドナーは女性であり、レシピエントは女性である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、プロトカドヘリンＹ及び／またはニューロリギンＹなどの抗原の発現を低減させる改変を含む。いくつかの実施形態では、プロトカドヘリンＹをコードする遺伝子（ＰＣＤＨ１１Ｙ、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＧ００００００９９７１５）は、操作された細胞において低減または排除、例えば、ノックアウトされる。いくつかの実施形態では、ニューロリギンＹをコードする遺伝子（ＮＬＧＮ４Ｙ、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＧ０００００１６５２４６）は、操作された細胞において低減または排除、例えばノックアウトされる。遺伝子の発現を低減または排除するための任意の方法、例えば、本明細書に記載される任意の方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＤＨ１１Ｙ及び／またはＮＬＧＮ４Ｙは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用するなどのヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集法によって、操作された細胞において低減または排除される。

【0606】

Ｄ．操作された初代細胞の例示的な実施形態
いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、操作された初代細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ヒト細胞または動物細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ドナー対象（例えば、ドナー試料が個々のドナー対象から得られる時点で、疾患または状態を有する疑いがない健常ドナー対象）から単離された初代細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、血漿細胞または血小板）から選択される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択され、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ型である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0607】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現の増加、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ複合体及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ複合体のうちの１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現の増加、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現の増加、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現の増加、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ複合体及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ複合体のうちの１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、過剰発現を付与する改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる改変は、表面発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、血漿細胞または血小板）から選択される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択され、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ型である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0608】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現の増加及びＢ２Ｍの発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現の増加及びＣＩＩＴＡの発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現の増加及びＮＬＲＣ５の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのうちの１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ及びＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低減を示す。本明細書に記載の操作された細胞のうちのいずれも、これらに限定されないが、ＣＤ４７、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１－インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＳｅｒｐｉｎｂ９を含む群から選択される１つ以上の因子の発現の増加もまた示し得る。例えば、本明細書に記載の細胞のうちのいずれも、これらに限定されないが、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＩＬ１５－ＲＦ、Ｈ２－Ｍ３、ＤＵＸ４、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＩＬ－３９、ＦａｓＬ、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎｂ９を含む群から選択される１つ以上の因子の発現の増加もまた示し得る。いくつかの実施形態では、発現を増加させる改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる改変は、表面発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、血漿細胞または血小板）から選択される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択され、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ型である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0609】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７、任意選択で、少なくとも１つの他の免疫寛容原性因子の発現の増加、及びＭＨＣクラスＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７、任意選択で、少なくとも１つの他の免疫寛容原性因子の発現の増加、及びＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７、任意選択で、少なくとも１つの他の免疫寛容原性因子の発現の増加、ならびにＭＨＣクラスＩＩの１つ以上の分子ＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７、任意選択で、少なくとも１つの他の免疫寛容原性因子の発現の増加、及びＢ２Ｍの発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７、任意選択で、少なくとも１つの他の免疫寛容原性因子の発現の増加、及びＣＩＩＴＡの発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７、任意選択で、少なくとも１つの他の免疫寛容原性因子の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の免疫寛容原性因子の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ及びＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の免疫寛容原性因子の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の免疫寛容原性因子の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、これらに限定されないが、ＣＤ４７、ＣＤ３５、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＩＬ１５－ＲＦ、Ｈ２－Ｍ３、ＤＵＸ４、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＩＬ－３９、ＦａｓＬ、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎｂ９を含む群からのいずれかも含む。いくつかの実施形態では、過剰発現を付与する改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる改変は、表面発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、血漿細胞または血小板）から選択される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択され、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ型である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0610】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞及びその集団は、ＣＤ４７の過剰発現、Ｂ２Ｍの発現の低減、及びＣＩＩＴＡの発現の低減を示す。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の低減は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の低減は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の低減は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の排除を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の低減は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の低減は、細胞内のすべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの不活性化または破壊は、Ｂ２Ｍ遺伝子中のインデル、またはＢ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低減は、ＣＩＩＴＡの低減されたタンパク質発現を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低減は、ＣＩＩＴＡの排除されたタンパク質発現を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低減は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低減は、細胞内のすべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの不活性化または破壊は、ＣＩＩＴＡ遺伝子中のインデル、またはＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子は、ノックアウトされる。

【0611】

いくつかの実施形態では、発現を増加させる改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる改変は、表面発現の低減を含む。

【0612】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、血漿細胞または血小板）から選択される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択され、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ型である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0613】

当業者であれば、遺伝子、タンパク質、または分子の発現の増加（例えば、過剰発現）または発現の低減などの発現レベルは、同等の細胞を基準とし得るかまたはそれと比較され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現が増加する操作された初代細胞は、未改変の初代細胞と比較して、より高いレベルのＣＤ４７タンパク質を有する改変された初代細胞を指す。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現が低減する操作された初代細胞は、未改変の初代細胞と比較して、より低いレベルのＢ２Ｍタンパク質を有する改変された初代細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現が低減する操作された初代細胞は、未改変の初代細胞と比較して、より低いレベルのＣＩＩＴＡタンパク質を有する改変された初代細胞を指す。

【0614】

一実施形態では、本明細書では、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを発現すると共に、１つ以上のＭＨＣクラスＩ複合体タンパク質、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ複合体タンパク質のいずれか、またはＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ複合体タンパク質の任意の組み合わせの発現が低減する、操作された初代細胞（例えば、初代細胞）が提供される。別の実施形態では、操作された初代細胞は、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを発現すると共に、レベルが低減したＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを発現すると共に、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子の改変（例えば、遺伝子改変）をもつ。いくつかの事例では、改変（例えば、遺伝子改変）は、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子を不活性化する。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、血漿細胞または血小板）から選択される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択され、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ型である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0615】

いくつかの実施形態では、本明細書では、操作された初代細胞（例えば、初代細胞）を生成する方法が提供され、方法は、細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することと、細胞におけるＣＤ４７の発現を増加させること（例えば、過剰発現させること）と、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減または排除することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することを含む。いくつかの実施形態では、発現を増加させる改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる改変は、表面発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現を増加させる改変は、プロモーターに連結されたＣＤ４７タンパク質をコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、操作された初代細胞のゲノム内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組込みは、細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によるものであり、任意選択で、標的挿入は、相同性指向修復を伴うヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、標的ゲノム遺伝子座を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、ＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、低免疫原性初代細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、血漿細胞または血小板）から選択される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択され、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）から更に選択される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ型である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0616】

いくつかの実施形態では、本明細書では、操作された初代細胞（例えば、初代細胞）を生成する方法が提供され、方法は、Ｂ２Ｍの発現を低減または排除することと、細胞におけるＣＤ４７の発現を増加させること（例えば、過剰発現させること）と、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ｂ２Ｍの発現を低減または排除する改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を低減または排除する改変（例えば、遺伝子改変）は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍを低減または排除する改変は、細胞におけるすべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、Ｂ２Ｍ遺伝子中のインデル、またはＢ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失を含む。いくつかの実施形態では、インデルは、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされる。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を低減または排除する改変は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるＢ２Ｍタンパク質発現を低減または排除することを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、ＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のＣＩＩＴＡの発現を低減または排除することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＩＩＴＡの発現を低減または排除する改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ発現を低減または排除する改変（例えば、遺伝子改変）は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡを低減または排除する改変は、細胞におけるすべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、ＣＩＩＴＡ遺伝子中のインデル、またはＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失を含む。いくつかの実施形態では、インデルは、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子は、ノックアウトされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現を増加させる改変は、プロモーターに連結されたＣＤ４７タンパク質をコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、操作された初代細胞のゲノム内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組込みは、細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によるものであり、任意選択で、標的挿入は、相同性指向修復を伴うヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、標的ゲノム遺伝子座を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、ＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、発現を増加させる改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる改変は、表面発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、低免疫原性初代細胞である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、血漿細胞または血小板）から選択される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択され、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ型である。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0617】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載の操作された初代細胞のいずれかなど、操作された初代細胞の集団を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、操作された初代膵島細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代膵島細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍの両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代β膵島細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代β膵島細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代Ｔ細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代Ｔ細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代甲状腺細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代甲状腺細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書では、操作された初代皮膚細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代皮膚細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代内皮細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代内皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代網膜色素上皮細胞の集団を含む組成物が提供され、操作された初代網膜色素上皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。操作された初代細胞の前述の実施形態のいずれかでは、細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を更に含み得る。

【0618】

Ｅ．低免疫原性表現型のアッセイ
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作された初代細胞は、低免疫原性について評価され得る。いくつかの実施形態では、細胞の低免疫原性は、細胞が適応免疫応答及び自然免疫応答を誘発する能力などの細胞の免疫原性を評価することによって決定することができる。このような免疫応答は、当業者に認識されるアッセイを使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、免疫応答アッセイは、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞殺傷、ＮＫ細胞増殖、ＮＫ細胞活性化、及びマクロファージ活性に対する低免疫原性細胞の効果を測定する。場合によっては、低免疫原性細胞及びその派生物は、対象への投与後にＴ細胞及び／またはＮＫ細胞による減少した殺傷を受ける。場合によっては、低免疫原性細胞及びその派生物は、対象への投与後にマクロファージによる減少した殺傷を受ける。場合によっては、低免疫原性細胞及びその派生物は、対象への投与後に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による減少した殺傷を受ける。いくつかの事例では、細胞及びその派生物は、未改変細胞または野生型細胞と比較して、マクロファージの貪食の減少を示す。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、対応する未改変野生型細胞と比較して、レシピエント対象において低減または減弱した免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、非免疫原性であるか、またはレシピエント対象において免疫応答を誘発することができない。

【0619】

低免疫原性細胞が生成されると、それらは、ＷＯ２０１６１８３０４１及びＷＯ２０１８１３２７８３に記載されているように、それらの低免疫原性、生着、及び機能についてアッセイされ得る。

【0620】

低免疫原性細胞は、それらが意図される組織部位に生着し、機能的に不全の領域を再構成または再生することを可能にする様態で投与される。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、生着（例えば、生着の成功）についてアッセイされる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の生着は、予め選択された一定時間の後に評価される。いくつかの実施形態では、生着した細胞は、細胞生存について監視される。例えば、細胞生存は、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を介して監視されることができ、細胞は、細胞生存を監視するためにルシフェラーゼ発現コンストラクトを形質導入される。いくつかの実施形態では、生着した細胞は、当技術分野で公知の免疫染色及びイメージング法によって可視化される。いくつかの実施形態では、生着した細胞は、生着の成功を決定するために検出され得る既知のバイオマーカーを発現する。例えば、フローサイトメトリーを使用し、特定のバイオマーカーの表面発現を決定することができる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、予想どおりに意図された組織部位に生着される（例えば、低免疫原性細胞の生着が成功する）。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、必要に応じて、細胞欠損部位などの意図された組織部位に生着される。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、非操作初代細胞（例えば、操作（複数可）を含まない初代細胞）が意図された組織部位に生着されるのと同じ方法で、意図された組織部位に生着される。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、機能についてアッセイされる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、意図される組織部位に生着する前に機能についてアッセイされる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、意図される組織部位に生着した後に機能についてアッセイされる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の機能は、予め選択された量の後に評価される。いくつかの実施形態では、生着した細胞の機能は、検出可能な表現型を生成する細胞の能力によって評価される。例えば、生着した膵島細胞及び／またはβ膵島細胞の機能は、糖尿病により失われたグルコース制御の回復に基づいて評価され得る。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の機能は予想どおりである（例えば、抗体媒介性拒絶反応を回避しながら、低免疫原性細胞は成功裏に機能する）。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の機能は必要に応じたものであり、例えば、抗体媒介性拒絶を回避しながら、細胞欠陥部位は十分に機能する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、抗体媒介性拒絶反応を回避しながら、非操作初代細胞（例えば、操作（複数可）を含まない初代細胞）が機能するのと同様に機能する。

【0621】

いくつかの実施形態では、低免疫原性は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１３及び図１５に例示される多数の技術を使用してアッセイされる。これらの技法は、同種異系宿主への移植、及び宿主免疫系を回避する低免疫原性細胞の増殖（例えば、奇形腫）に対する監視を含む。いくつかの事例では、低免疫原性細胞派生物は、ルシフェラーゼを発現するように形質導入され、次いで生物発光イメージングを使用して追跡され得る。同様に、かかる細胞に対する宿主動物のＴ細胞及び／またはＢ細胞反応は、細胞が宿主動物における免疫応答を引き起こさないことを確認するために試験される。Ｔ細胞反応は、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、またはマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によって評価され得る。Ｂ細胞反応または抗体反応は、ＦＡＣＳまたはＬｕｍｉｎｅｘを使用して評価される。追加的にまたは代替的に、細胞は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１４及び１５に全般的に示されるように、自然免疫応答、例えば、ＮＫ細胞殺傷を回避するそれらの能力についてアッセイされ得る。

【0622】

いくつかの実施形態では、細胞の免疫原性は、例えば、当業者によって認識されているＴ細胞増殖アッセイ、Ｔ細胞活性化アッセイ、及びＴ細胞殺傷アッセイなどのＴ細胞イムノアッセイを使用して評価される。場合によっては、Ｔ細胞増殖アッセイには、細胞をインターフェロンγで予め治療すること及び細胞を標識Ｔ細胞と共培養すること及び事前選択された時間後にＴ細胞集団（または、増殖しているＴ細胞集団）の存在をアッセイすることが含まれる。場合によっては、Ｔ細胞活性化アッセイには、Ｔ細胞を本明細書で概説される細胞と共培養すること及びＴ細胞におけるＴ細胞活性化マーカーの発現レベルを決定することが含まれる。

【0623】

ｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、本明細書で概説される細胞の免疫原性を評価するために実施され得る。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の生存及び免疫原性は、同種異系ヒト化免疫不全マウスモデルを使用して決定される。いくつかの事例では、低免疫原性幹細胞は、同種異系ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに移植され、細胞拒絶反応、細胞生存、及び奇形腫形成に関してアッセイされる。いくつかの事例では、移植された低免疫原性細胞は、マウスモデルにおいて長期生存を示す。

【0624】

細胞の低免疫原性を含む免疫原性を決定するための追加の技術は、例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８及びＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に記載されており、図、図の凡例、及び方法の説明を含むその開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0625】

当業者には理解されようが、多能性細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ Ｉ）の低減の成功は、当技術分野で既知であると共に下記に記載されるような技法、例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識抗体を使用した、例えば、ヒト主要組織適合性ＨＬＡクラスＩ抗原のアルファ鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体を使用したＦＡＣＳ技法を使用して、測定することができる。

【0626】

また、細胞は、ＨＬＡ Ｉ複合体が細胞表面上に発現していないことを確認するために試験され得る。これは、上で論述される１つ以上のＨＬＡ細胞表面構成要素に対する抗体を使用してＦＡＣＳ分析によってアッセイされ得る。

【0627】

多能性細胞またはその派生物における１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ ＩＩ）の低減の成功は、当技術分野で知られている技術、例えば、タンパク質に対する抗体を使用するウェスタンブロット、ＦＡＣＳ技術、ＲＴ－ＰＣＲ技術などを使用して測定され得る。

【0628】

また、細胞は、ＨＬＡ ＩＩ複合体が細胞表面上に発現していないことを確認するために試験され得る。この場合もまた、このアッセイは、当技術分野で知られているように行われ（例えば、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２１を参照されたい）、ヒトＨＬＡクラスＩＩ分子ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ及びほとんどのＤＱ抗原に結合する市販の抗体に基づいてウェスタンブロットまたはＦＡＣＳ分析のいずれかを使用して一般的に行われる。

【0629】

ＨＬＡ Ｉ及びＩＩ（または、ＭＨＣクラスＩ分子及びクラスＩＩ分子）の低減に加えて、本明細書で提供される低免疫原性細胞は、マクロファージの貪食及びＮＫ細胞による殺傷に対して感受性が低減する。結果として生じる低免疫原性細胞は、１つ以上のＣＤ２４導入遺伝子の発現に起因して免疫マクロファージ及び自然経路を「回避する」。

【0630】

Ｆ．操作された初代細胞を作製する方法
本明細書では、遺伝子編集により細胞内の遺伝子の発現を改変することによって細胞を改変する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の改変に関連して、動きを伴って細胞をインキュベートする工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞を、細胞の遺伝子発現を改変するための１つ以上の試薬と接触させ、その後に細胞に動き（例えば、振盪または波状の動き）を与えることにより、細胞の改変の効率を増強または促進することができる。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の改変を促進または強化するために使用することができる。いくつかの実施形態では、方法は、内因性遺伝子を不活性化または欠失させる遺伝子破壊などによって遺伝子の発現を低減させることができ、及び／または細胞内で遺伝子を過剰発現させるなど遺伝子の発現を増加させるために使用することができる。いくつかの態様では、方法は、本明細書に記載の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるために使用することができる。いくつかの態様では、方法は、本明細書に記載されるように、ＣＤ４７などの１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるために使用することができる。

【0631】

いくつかの実施形態では、本明細書では、細胞集団の改変の方法が提供され、方法は、細胞を動きに供さない、例えば、細胞を静的条件下でインキュベートする同様の方法と比較して、ｉ）その集団の細胞における遺伝子発現を改変するために、細胞集団を１つ以上の試薬と接触させることと、ｉｉ）１つ以上の試薬と接触させた後、細胞集団を動きに供することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、集団の細胞の改変を強化または促進する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を動きに供さない、例えば、細胞を静的条件下でインキュベートする同様の方法と比較して、集団の細胞の生存率を増加させる。

【0632】

いくつかの実施形態では、操作される細胞は、第ＩＩ．Ｃ節に記載されるような、本明細書に記載されるような細胞であり得る。

【0633】

いくつかの実施形態では、細胞集団は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、膵島細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、内皮細胞、筋肉細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、肝細胞、グリア前駆細胞、ドーパミン作動性ニューロン、網膜色素上皮細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、及び血液細胞からなる群から選択される初代細胞である。

【0634】

いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の集団は、初期Ｔ細胞に由来する細胞を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞、生殖細胞系幹細胞、肺幹細胞、臍帯血幹細胞、及び複能性幹細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、幹細胞またはその前駆細胞から分化した細胞であり、そこで、分化した細胞は、膵島細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、内皮細胞、筋肉細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、肝細胞、グリア前駆細胞、ドーパミン作動性ニューロン、網膜色素上皮細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、または血液細胞である。

【0635】

いくつかの実施形態では、多くの既存の遺伝子編集及び細胞工学的方法は完全に静置培養で行われ、これにより、いくつかの態様では、細胞に対する更なるストレスが低減されると考えられている。ただし、観察によると、そのような方法は、必ずしも理想的ではない可能性がある。いくつかの態様では、細胞がｉｎ ｖｉｖｏでどのように存在するかにより厳密に一致する方法で細胞をインキュベートまたは培養することにより、遺伝子編集法などによる細胞の改変の効率を改善することができる。例えば、細胞生存率及び／または改変もしくは遺伝子編集の効率の改善は、細胞を動きに供しながら、懸濁（例えば、非接着）条件で細胞を培養またはインキュベートすることによって達成できる。いくつかの実施形態では、細胞を動きに接触させることにより、細胞間の接触及び３Ｄクラスターの形成をもたらす細胞凝集体を生成することができ、これにより、細胞の生存率及び適合性が改善され、細胞の遺伝子改変効率が全体的に増加する。

【0636】

いくつかの実施形態では、細胞集団は、ｉｎ ｖｉｖｏで３Ｄネットワークに自然に存在する初代細胞である。いくつかの実施形態では、提供される方法は、細胞集団が懸濁状態になるように実行される。いくつかの実施形態では、細胞が培養物または凝集体中に自然に存在する場合、細胞の懸濁液は、接触前に接着培養物または細胞クラスターから細胞を解離することによって生成することができる。

【0637】

いくつかの実施形態では、細胞集団は、低付着表面を有する容器内にある。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非接着培養容器内にある。いくつかの実施形態では、低付着表面を有する容器（例えば、非接着培養容器）などの容器は、細胞付着が一定期間など低減または制限される、培養容器を含む。非接着培養容器は、低付着または超低付着表面を含んでもよい。例えば、ハイドロゲル（例えば、中性荷電及び／または親水性ハイドロゲル）及び／または界面活性剤（例えば、プルロン酸）などの細胞付着を防止する物質で表面を処理することによって達成され得る。非接着培養容器には、丸いもしくは凹面のウェル及び／またはマイクロウェル（例えば、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌｓ（商標））が含まれ得る。いくつかの実施形態では、非接着培養容器は、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートである。非接着培養容器の場合、培養容器から細胞を除去するために酵素を使用する必要がない場合がある。

【0638】

いくつかの実施形態では、非接着培養容器は、細胞付着を阻害または低減させるような、低付着または超低付着表面を備える培養容器である。いくつかの実施形態では、非接着培養容器内で細胞を培養することは、培養物のすべての細胞が培養容器の表面に付着することを妨げるわけでない。

【0639】

いくつかの実施形態では、非接着培養容器は、超低付着表面を備える培養容器である。いくつかの態様では、超低付着表面は、一定期間、細胞付着を阻害し得る。いくつかの実施形態では、超低付着表面は、接着表面上で同じ細胞種のコンフルエントな増殖を得るのに必要な期間、細胞接着を阻害し得る。いくつかの実施形態では、超低付着表面は、ハイドロゲル層（例えば、中性荷電及び／または親水性ハイドロゲル層）などの細胞付着を阻害する物質でコーティングまたは処理される。いくつかの実施形態では、非接着培養容器は、第１のインキュベートの前に界面活性剤でコーティングまたは処理される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、プルロン酸である。

【0640】

いくつかの実施形態では、容器は、プレート、ディッシュ、フラスコ、バイオリアクター、またはバッグである。いくつかの実施形態では、容器は、マルチウェルプレートなどのプレートである。いくつかの実施形態では、容器は、６ウェル、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、または９６ウェルプレートである。いくつかの実施形態では、培養容器は、６ウェルプレートである。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレートのウェルは更に、マイクロウェルを含む。提供される実施形態のいずれかでは、マルチウェルプレートなどの容器は、円形または凹面のウェル及び／またはマイクロウェルを有する。提供される実施形態のいずれかでは、マルチウェルプレートなどの容器には、角または継ぎ目がない。

【0641】

いくつかの実施形態では、容器は、細胞凝集体の三次元形成を可能にする。いくつかの実施形態では、細胞はマルチウェルプレートなどの容器内で培養され、動きに供され、細胞凝集体またはクラスターを生成される。いくつかの実施形態では、細胞を動きに供することにより、凝集体の形成が促進される。いくつかの実施形態では、細胞を動きに供することにより、細胞クラスターが形成される。

【0642】

いくつかの実施形態では、細胞集団は、その生存能力を維持する条件下で培養される。細胞の培養及び生存率に必要な環境を提供するために、適切な温度、ＣＯ_２及び酸素条件を選択することは、当業者のレベルの範囲内である。いくつかの実施形態では、細胞への酸素送達に対する拡散障壁を軽減するために、培地の体積を最小化または低減させることができる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、細胞を覆うのに十分な最小体積の培地中で容器内に維持される。細胞培養及び生存率を支援するために適切な量の培地を決定することは、当業者のレベルの範囲内である。一例として、６ウェルプレートの標準的な作業容量は３．０ｍＬ～５．０ｍＬであるが、細胞を十分に覆い、細胞の増殖を支援する適切な培養液を提供するには、容量を約１ｍＬ～２ｍＬに低減することができる。場合によっては、より多くの培地を使用することにより、培地の深さ及び環境の静的性質が増し、細胞への酸素の拡散が遅くなり得る－これは、理想的ではない可能性がある。

【0643】

いくつかの実施形態では、方法は、静的条件下で実施される培養の少なくとも期間または一部を更に含むことができる。このような実施形態では、細胞は動きに供されず、動かないか固定されたままである。いくつかの実施形態では、改変または遺伝子編集のための１つ以上の試薬との接触中、及び細胞が動きに供される前に、細胞は静的条件下でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、細胞を動きに供した後、細胞は静的条件下でインキュベートされ得る。

【0644】

いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬は、少なくとも２つの異なる試薬を含むことができる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる試薬のそれぞれは、異なる遺伝子の発現を調節するためのものである。場合によっては、少なくとも第１の１つ以上の試薬は、記載されているように１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるための試薬であってもよく、少なくとも第２の１つ以上の試薬は、１つ以上の免疫寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現を増加させるための試薬であってもよい。いくつかの実施形態では、方法の工程を繰り返すことができる。いくつかの実施形態では、方法の第１の反復における１つ以上の試薬は、方法の繰り返される反復における１つ以上の試薬とは異なる。

【0645】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、遺伝子編集などの所望の改変を有する細胞を選択することも含み得る。いくつかの実施形態では、改変を有する細胞を選択する方法は、所望の細胞のポジティブ選択またはネガティブ選択などのフローサイトメトリーによるものであり得る。

【0646】

いくつかの態様では、本明細書では、初代膵島細胞を遺伝子編集する方法が提供される。初代膵島細胞を遺伝子編集する方法は、初代膵島クラスターを初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることを含み、初代膵島クラスターは初代β膵島細胞を含む。次いで、懸濁液中の初代β膵島細胞を改変する（例えば、細胞内の内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるために細胞に１つ以上の改変を導入すること、及び／または細胞内の異種タンパク質の発現を増加させるために１つ以上の改変を導入することによって）。改変された初代β膵島細胞は、改変された初代β膵島細胞を膵島に再クラスター化するための条件下でインキュベートすることができ、インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される。

【0647】

本明細書で使用する場合、「動き」という用語は、細胞（例えば、改変された初代β膵島細胞）を動かすことを指す。例えば、細胞は、円を描くように移動したり、左右に移動したり、上下に移動したり、反転したりできる。いくつかの実施形態では、動きは、振盪である。いくつかの実施形態では、振盪は、軌道振盪を含む。いくつかの実施形態では、振盪は、双方向の直線運動を含む。いくつかの実施形態では、振盪は、直線運動を含む。この動きは、限定されないが、オービタルシェーカー、往復シェーカー、旋回ロッカー、マイクロプレートシェーカー、ベンチトップシェーカー、及び／またはボルテックスなどの当技術分野で公知の様々な方法によって達成され得る。いくつかの実施形態では、動きは、オービタルシェーカーを使用して達成される。いくつかの実施形態では、オービタルシェーカーは、ベリーダンサーオービタルシェーカー（ＩＢＩ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。いくつかの実施形態では、動きは、操作された初代細胞を生成する方法で動きを利用しない方法と比較して、遺伝子編集効率を改善する。例えば、動きは、より良好な遺伝子標的化、発現の改善及び／または遺伝子発現の減少の改善、及び／またはこの方法によって標的とされる細胞数の増加をもたらし得る。いくつかの実施形態では、動きは、操作された初代細胞を生成する方法と比較して、操作された初代細胞を生成する方法における遺伝子編集効率を約０．１倍よりも大きく、例えば、約０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上のいずれかよりも大きく改善する。いくつかの実施形態では、動きは、操作された初代細胞を生成する方法における遺伝子編集効率を約０．１倍～約１００倍、例えば、約０．１倍～約１０倍、約０．５倍～約５０倍、及び約１０倍～約１００倍改善する。

【0648】

いくつかの実施形態では、細胞を動きに供することにより、遺伝子編集のために細胞をもう１つの試薬と接触させるのに必要な時間量を低減することができる。いくつかの実施形態では、改変または遺伝子編集のための１つ以上の試薬との接触は、細胞を動きに供する前に２日よりも短い期間である。いくつかの実施形態では、接触は、細胞を動きに供する前に３０秒～２４時間実施される。いくつかの実施形態では、接触は、１分、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、もしくは約１分、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、または上記のいずれかの値の間の任意の値で実施される。いくつかの実施形態では、接触は、細胞を動きに供する前に１分～６０分実施される。いくつかの実施形態では、接触は、細胞を動きに供する前に２分～３０分実施される。いくつかの実施形態では、接触は、細胞を動きに供する前に５分～１５分実施される。

【0649】

いくつかの実施形態では、本明細書では、初代膵島細胞を遺伝子編集するための方法が提供され、方法は、ｉ）初代膵島クラスターを初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、ｉｉ）懸濁液の初代β膵島細胞を改変することと、ｉｉｉ）改変された初代β膵島細胞を膵島に再クラスター化するための条件下で、改変された初代β膵島細胞をインキュベートすることであって、インキュベートすることの少なくとも一部は動きを伴って実行される、インキュベートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、初代膵島クラスターは、ヒト初代膵島クラスターである。いくつかの実施形態では、初代膵島クラスターは、ヒト初代死体膵島クラスターである。いくつかの実施形態では、初代細胞は、初代β膵島細胞である。いくつかの実施形態では、懸濁液は、単一細胞懸濁液である。

【0650】

本明細書で提供される初代膵島細胞を遺伝子編集するための方法は、１つ以上の解離する工程（例えば、初代膵島クラスターを初代細胞の懸濁液へと解離すること）と、１つ以上の再クラスター化する工程（例えば、初代細胞を膵島に再クラスター化する条件下で、改変された初代細胞をインキュベートすること）と、を含み得る。いくつかの実施形態では、初代膵島細胞を遺伝子編集する方法は、約１、２、３、４、５、またはそれ以上の解離する工程を含む。いくつかの実施形態では、初代膵島細胞を遺伝子編集する方法は、約１、２、３、４、５、またはそれ以上の再クラスター化する工程を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の再クラスター化する工程のそれぞれは、１つ以上の解離する工程のそれぞれの後に実行される。いくつかの実施形態では、初代膵島細胞を遺伝子編集する方法は、解離する工程と再クラスター化する工程との間に一定の期間を含む。いくつかの実施形態では、解離する工程と再クラスター化する工程との間の時間は、約１分～約１０日、例えば、約１分～約１０時間、約５時間～約２４時間、及び約２４時間～約１０日である。いくつかの実施形態では、解離する工程と再クラスター化する工程との間の時間は、約１分より長く、例えば、約５分、１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、２４時間、４８時間、５日間、１０日間、またはそれ以上のいずれかより長い。いくつかの実施形態では、解離する工程と再クラスター化する工程との間の時間は、約１０日間より短く、例えば、約５日間、４８時間、２４時間、１０時間、５時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分、１０分、５分、またはそれ以下のいずれかより短い。

【0651】

いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞を膵島に再クラスター化するための条件下で、改変された初代β膵島細胞をインキュベートすることは、少なくとも１回行われる。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞を膵島に再クラスター化するための条件下で、改変された初代β膵島細胞をインキュベートすることは、断続的に行われ、各インキュベートする工程は、懸濁液の初代β膵島細胞を改変した後に実行される。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞を膵島に再クラスター化するための条件下で、改変された初代β膵島細胞をインキュベートすることは、２回行われ、第１のインキュベートする工程は、細胞内の内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を低減させるため懸濁液の初代β膵島細胞を改変させた後に実行され、第２のインキュベートする工程は、細胞内の１つ以上の異種タンパク質の発現を増加させるために懸濁液の初代β膵島細胞を改変した後に実行される。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞を膵島に再クラスター化するための条件下で、改変された初代β膵島細胞をインキュベートすることは、２回行われ、第１のインキュベートする工程は、細胞内のヒトＢ２Ｍ遺伝子及びヒトＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を低減させるために懸濁液の初代β膵島細胞を改変した後に実行され、第２のインキュベートする工程は、細胞内のＣＤ４７の発現を増加させるために懸濁液の初代β膵島細胞を改変した後に実行される。

【0652】

いくつかの実施形態では、初代膵島クラスターを初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることは、細胞解離溶液によるものである。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、初代膵島クラスターに適用される。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、約１分間～約２０分間、例えば、約１分間～約５分間、約３分間～約１０分間、約８分間～約１５分間、及び約１２分～約２０分、初代膵島クラスターに適用される。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、約１分より長く、例えば、約２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、またはそれ以上のいずれかより長く、初代膵島クラスターに適用される。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、約２０分未満、例えば、約１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、１分、またはそれ以下のいずれかより短く、初代膵島クラスターに適用される。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、初代膵島クラスターに約１０分間適用される。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、約３０℃～約４０℃、例えば、約３０℃～約３５℃、約３３℃～約３８℃、及び約３５℃～約４０℃の温度で初代膵島クラスターに適用される。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、約３０℃を超える、例えば、約３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、またはそれ以上のいずれかよりも高い温度で初代膵島クラスターに適用される。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、約４０℃未満、例えば、約３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃、またはそれ以下のいずれかよりも低い温度で初代膵島クラスターに適用される。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、約３７℃の温度で初代膵島クラスターに適用される。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、約３７℃の温度で約１０分間、初代膵島クラスターに適用される。細胞解離溶液は、タンパク質分解酵素及びコラーゲン分解酵素の溶液を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、ＡＣＣＵＭＡＸ（商標）細胞解離溶液である。

【0653】

いくつかの実施形態では、初代β膵島細胞の解離懸濁液は、改変される。いくつかの実施形態では、改変することは、遺伝子操作することを含む。いくつかの実施形態では、懸濁初代β膵島細胞は、初代膵島クラスターからの解離後に改変される。いくつかの実施形態では、改変することは、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるために、細胞内に１つ以上の改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、改変することは、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させるために、細胞内に１つ以上の改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、改変することは、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるために、細胞内に１つ以上の改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、改変することは、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるために、細胞内に１つ以上の改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる改変は、Ｂ２Ｍの発現を低減させる改変である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる改変は、ＣＩＩＴＡの発現を低減させる改変である。

【0654】

いくつかの実施形態では、細胞内の内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させることは、遺伝子編集システムを細胞内に導入することによるものである。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、配列特異的ヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、ＩＩ型またはＶ型Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ホモログまたはＣｐｆ１ホモログである。

【0655】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及びヒトＢ２Ｍ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡは、ＣＧＵＧＡＧＵＡＡＡＣＣＵＧＡＡＵＣＵＵ（配列番号３３）の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及びヒトＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡは、ＣＧＡＵＡＵＵＧＧＣＡＵＡＡＧＣＣＵＣＣＣ（配列番号３４）の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡは、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡの前に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡは、ヒトＢ２Ｍ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡの前に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡは、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡと同時に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるために改変することは、エレクトロポレーションによって細胞内に導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓ９酵素及びヒトＢ２Ｍ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体でエレクトロポレーションされる。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓ９酵素及びヒトＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体でエレクトロポレーションされる。

【0656】

いくつかの実施形態では、改変することは、細胞における１つ以上の異種タンパク質の発現を増加させるために、細胞内に１つ以上の改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、改変することは、１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるために、１つ以上の改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子のうちの少なくとも１つは、ＣＤ４７である。

【0657】

いくつかの実施形態では、細胞における１つ以上の異種タンパク質の発現を増加させることは、外因性ポリヌクレオチドによるものである。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞のゲノム内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、マルチシストロン性ベクターである。いくつかの実施形態では、組込みは、細胞のゲノム内への非標的挿入により、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した細胞内への外因性ポリヌクレオチドの導入によるものである。いくつかの実施形態では、組込みは、細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によるものである。

【0658】

いくつかの実施形態では、細胞における１つ以上の異種タンパク質の発現を増加させることは、ＣＡＧプロモーターの制御下でＣＤ４７及びルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターを細胞に形質導入することによるものである。いくつかの実施形態では、細胞は、硫酸プロタミンの存在下でレンチウイルスベクターが形質導入される。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターによる形質導入は、遠心分離（例えば、「スピンフェクション」）を使用して行われる。いくつかの実施形態では、細胞は、硫酸プロタミンの存在下でレンチウイルスベクターの存在下にて、約３００×ｇで約１５分間遠心分離される。

【0659】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される初代細胞を遺伝子編集する方法は、改変された膵島を選択することを更に含む。いくつかの実施形態では、選択された改変膵島は、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子（例えば、ヒトＢ２Ｍ遺伝子及び／またはヒトＣＩＩＴＡ遺伝子）の発現を低減するように改変されている。いくつかの実施形態では、選択された改変膵島は、細胞における１つ以上の異種タンパク質（例えば、ＣＤ４７）の発現を増加させるように改変されている。いくつかの実施形態では、選択された改変膵島は、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるか、または細胞における１つ以上の異種タンパク質の発現を増加させるように改変されている。いくつかの実施形態では、選択することは、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳは、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩセルソーターの使用を含む。

【0660】

いくつかの実施形態では、改変された膵島は、本明細書に記載される細胞解離溶液のいずれかのような細胞解離溶液を使用して、ＦＡＣＳ用の単一の初代膵島細胞に解離される。いくつかの実施形態では、細胞解離溶液は、ＡＣＣＵＭＡＸ（商標）細胞解離溶液である。いくつかの実施形態では、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるように改変された初代β膵島細胞は、抗ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体またはＩｇＧ１アイソタイプ適合対照抗体、及び抗ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ抗体またはＩｇＧ２ａアイソタイプ適合対照抗体による細胞解離液を使用するために選択される。いくつかの実施形態では、ダブルネガティブ初代膵島細胞は、ＦＡＣＳを使用して選別される。いくつかの実施形態では、選別されたダブルネガティブ初代膵島細胞は、インキュベートを使用して再クラスター化するために再播種される。いくつかの実施形態では、細胞における内因性タンパク質（例えば、ヒトＢ２Ｍ遺伝子及びヒトＣＩＩＴＡ遺伝子）をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させ、細胞における１つ以上の異種タンパク質の発現を増加させるように改変された初代β膵島細胞は、抗ＣＤ４７抗体またはＩｇＧ１アイソタイプ適合対照抗体による細胞解離溶液を使用するために選択される。いくつかの実施形態では、改変された膵島細胞は、アイソタイプ対照と比較して、細胞における１つ以上の異種タンパク質（例えば、ＣＤ４７）の発現が少なくとも約２０倍増加する、例えば、少なくとも約２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、またはそれ以上増加する場合に選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７にポジティブである選別されたダブルネガティブ初代膵島細胞は、インキュベートを使用して再クラスター化するために再播種される。

【0661】

いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞を膵島に再クラスター化するための条件下で、改変された初代β膵島細胞はインキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、初代β膵島細胞を改変することに続いて行われる。いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、改変された初代β膵島細胞をヒト膵島細胞培養培地中でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ヒト膵島細胞培養培地は、ＰＩＭ（Ｓ）培地（Ｐｒｏｄｏ）である。いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、静的条件下での第１のインキュベートと、それに続く動きを伴うインキュベートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、動きを伴うインキュベートすることと、それに続く静的条件下での第２のインキュベートと、を含む。いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、動きを伴うインキュベートすることと、静的条件下での第２のインキュベートと、を含む。

【0662】

いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞は、約３０分～約２時間、例えば、約３０分～約１時間、約４５分～約１．５時間、及び約１時間～約２時間、静的にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞は、約３０分より長く、例えば、約３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、１．２５時間、１．５時間、１．７５時間、２時間またはそれ以上のいずれかより長く、静的にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞は、約２時間より短く、例えば、約１．７５時間、１．５時間、１．２５時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分またはそれ以下のいずれかより短く、静的にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞は、約１時間、静的にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞は、約３０℃～約４０℃、例えば、約３０℃～約３５℃、約３３℃～約３８℃、及び約３５℃～約４０℃の温度で静的にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞は、約３０℃を超える温度、例えば、約３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃またはそれ以上のいずれかを超える温度で静的にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞は、約４０℃よりも低い、例えば、約３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃またはそれ以下のいずれかより低い温度で静的にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞は、約３７℃の温度で約１時間、静的にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、静的インキュベートは、約２％～約８％のＣＯ_２中、例えば、約２％～約４％のＣＯ_２、約３％～約６％のＣＯ_２、及び約５％～約８％のＣＯ_２中で行われる。いくつかの実施形態では、静的インキュベートは、約２％を超えるＣＯ_２中、例えば、約３％のＣＯ_２、４％のＣＯ_２、５％のＣＯ_２、６％のＣＯ_２、７％のＣＯ_２、８％のＣＯ_２またはそれ以上のいずれかを超える中で行われる。いくつかの実施形態では、静的インキュベートは、約８％未満のＣＯ_２中、例えば、約７％のＣＯ_２、６％のＣＯ_２、５％のＣＯ_２、４％のＣＯ_２、３％のＣＯ_２、２％のＣＯ_２またはそれ以下のいずれか未満の中で行われる。いくつかの実施形態では、静的インキュベートは、約５％のＣＯ_２中で行われる。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞は、約３７℃で約１時間、約５％のＣＯ_２中で静的にインキュベートされる。

【0663】

いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞は、静的インキュベート（例えば、約５％ＣＯ_２中、約３７℃で約１時間の静的インキュベート）後、動きながらインキュベートされる。いくつかの実施形態では、動的インキュベートにより、改変された初代β膵島細胞を膵島に再クラスター化することが可能になる。いくつかの実施形態では、動的インキュベートは、約２４時間～約９６時間、例えば、約２４時間～約４８時間、約４８時間～約７２時間、及び約２８時間～約９６時間実行される。いくつかの実施形態では、動的インキュベートは、約２４時間より長く、例えば、約３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、またはそれ以上のいずれかより長く実行される。いくつかの実施形態では、動的インキュベートは、約９６時間より短い、例えば、約８４時間、７２時間、６０時間、２８時間、３６時間、２４時間、またはそれ以下のいずれかより短い間実行される。いくつかの実施形態では、動的インキュベートは、約７２時間実行される。いくつかの実施形態では、動的インキュベートは約４８時間行われ、その後、完全培地交換が行われ、更に２４時間の動的インキュベートが続く。いくつかの実施形態では、改変された初代β膵島細胞は、ヒト初代膵島細胞の再クラスター化のために、ベリーダンサーオービタルシェーカー（ＩＢＩ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ）上で動きを伴いながらインキュベートされる。

【0664】

いくつかの実施形態では、動的インキュベートは、約１毎分回転数（ＲＰＭ）～約２００ＲＰＭ、例えば、１ＲＰＭ～約２５ＲＰＭ、約１５ＲＰＭ～約５０ＲＰＭ、約３０ＲＰＭ～約７５ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約２００ＲＰＭ、及び約８５ＲＰＭ～約９５ＲＰＭの速度で実行される。いくつかの実施形態では、動的インキュベートは、約１ＲＰＭを超える速度、例えば、約５ＲＰＭ、１０ＲＰＭ、２０ＲＰＭ、３０ＲＰＭ、４０ＲＰＭ、５０ＲＰＭ、６０ＲＰＭ、７０ＲＰＭ、８０ＲＰＭ、９０ＲＰＭ、１００ＲＰＭ、１２５ＲＰＭ、１５０ＲＰＭ、１７５ＲＰＭ、２００ＲＰＭ、またはそれ以上のいずれかを超える速度で実行される。いくつかの実施形態では、動的インキュベートは、約２００ＲＰＭ未満の速度、例えば、約１７５ＲＰＭ、１５０ＲＰＭ、１２５ＲＰＭ、１００ＲＰＭ、９０ＲＰＭ、８０ＲＰＭ、７０ＲＰＭ、６０ＲＰＭ、５０ＲＰＭ、４０ＲＰＭ、３０ＲＰＭ、２０ＲＰＭ、１０ＲＰＭ、５ＲＰＭ、１ＲＰＭ、またはそれ以下のいずれか未満の速度で実行される。いくつかの実施形態では、動的インキュベートは、約８５ＲＰＭ～約９５ＲＰＭの速度で実行される。いくつかの実施形態では、動的インキュベートは、約０°～約８°、例えば、約０°～約４°、約２°～約５°、及び約４°～約８°のピッチで実行される。いくつかの実施形態では、動的インキュベートは、約０°より大きいピッチ、例えば、約１°、２°、３°、４°、５°、６°、７°、８°、またはそれ以上のいずれかを超えるピッチで実行される。いくつかの実施形態では、動的インキュベートは、約８°未満のピッチ、例えば、約７°、６°、５°、４°、３°、２°、１°、またはそれ以下のいずれかを超えるピッチで実行される。

【0665】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される初代膵島細胞を遺伝子編集する方法の工程ｉ）～ｉｉｉ）は、繰り返される。いくつかの実施形態では、方法の第１の反復における改変することは、方法の繰り返される反復における改変することとは異なる。いくつかの実施形態では、方法の第１の反復における改変することは、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるために、細胞へ１つ以上の改変を導入すること（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるために、細胞へ１つ以上の改変、例えば、ヒトＢ２Ｍ遺伝子及び／またはヒトＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を低減させるために、細胞へ１つ以上の改変を導入すること）を含む。いくつかの実施形態では、方法の繰り返される反復における改変することは、細胞における１つ以上の異種タンパク質（例えば、１つ以上の免疫寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７）の発現を増加させるために、細胞へ１つ以上の改変を導入することを含む。

【0666】

いくつかの実施形態では、改変することは、再クラスター化された膵島細胞が、第１の改変で操作された第１の改変膵島である、第１の改変することであり、方法は、ｉｖ）第１の改変膵島を改変された初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、ｖ）懸濁液の改変された初代膵島細胞を第２の改変で更に改変することと、ｖｉ）更に改変された初代β膵島細胞を、第２の改変を含む第２の改変膵島に再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、インキュベートすることの少なくとも一部は動きを伴って実施される、インキュベートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、第１の改変における改変することは、細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるために、細胞へ１つ以上の改変を導入すること（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させるために、細胞へ１つ以上の改変を導入すること、例えば、ヒトＢ２Ｍ遺伝子及び／またはヒトＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を低減させるために、細胞へ１つ以上の改変を導入すること）を含む。いくつかの実施形態では、更なる改変することは、細胞における１つ以上の異種タンパク質（例えば、１つ以上の免疫寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７）の発現を増加させるために、細胞へ１つ以上の改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される初代細胞を遺伝子編集する方法は、第１の改変された膵島を選択することを更に含む。いくつかの実施形態では、選択することは、ＦＡＣＳを含む。

【0667】

いくつかの実施形態では、第２の改変された膵島は、移植に使用される。いくつかの実施形態では、第２の改変された膵島は、本明細書に記載の疾患または状態のいずれかなど、対象における疾患または状態を治療するために使用される。

【0668】

ＩＩＩ．操作された細胞の集団及び医薬組成物
本明細書では、操作された初代細胞などの複数の提供される操作された細胞を含有する、操作された初代細胞などの操作された細胞の集団が提供される。場合によっては、細胞集団は、細胞の混合物を含む。場合によっては、集団中の細胞の少なくとも約３０％は、本明細書に記載される一連の改変を含む。場合によっては、細胞集団は、１つ以上の異なる細胞種を含む。

【0669】

いくつかの実施形態では、集団は、膵臓膵島細胞の混合物を含む。いくつかの実施形態では、集団は、膵臓β細胞、膵臓α細胞、及び膵臓γ細胞からなる群から選択される２つ以上の異なる細胞種を含む、膵島細胞の混合物を含む。場合によっては、集団は、膵臓α、β、及びγ細胞を含む。場合によっては、集団は、初代細胞を含む。いくつかの実施形態では、集団は、幹細胞または前駆細胞から分化した細胞（例えば、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞、生殖系列幹細胞、肺幹細胞、臍帯血幹細胞、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、及び複能性幹細胞から分化した細胞）を含む。

【0670】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の集団は、複数のドナー対象からプールされた細胞に由来する。いくつかの実施形態では、複数のドナー対象のそれぞれは、健康な対象であるか、またはドナー試料がドナー対象から得られる時点で疾患もしくは状態を有する疑いがない。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、改変を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の集団は、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、血漿細胞または血小板）から選択される。

【0671】

いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変更細胞と比較して、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変更細胞と比較して、Ｂ２Ｍ及び／またはＣＩＩＴＡの発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化細胞と比較して、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減を含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化細胞と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する、１つ以上の変化を含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化細胞と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する、１つ以上の変化を含む。

【0672】

いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する、１つ以上の変化を含む。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、内因性ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する、１つ以上の変化を含む。

【0673】

また、本明細書では、操作された初代細胞などの操作された細胞を含む組成物も提供される。また、本明細書では、操作された初代細胞などの操作された細胞の集団を含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、医薬的に許容される賦形剤または担体を更に含む。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、これには緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート（ＴＷＥＥＮ（商標））、ポロキサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物には、医薬的に許容される緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）が含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、明澄度、色、等張性、臭気、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着性、もしくは浸透性を改変する、維持する、または保存するための、１つ以上の賦形剤を含有し得る。いくつかの態様では、当業者は、細胞を含む医薬組成物がタンパク質を含む医薬組成物とは異なる場合があることを理解する。

【0674】

「医薬製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない、調製物を指す。

【0675】

「医薬的に許容される担体」は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。医薬的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0676】

いくつかの実施形態における医薬組成物は、本明細書に記載されるような初代細胞などの操作された細胞を、疾患または状態を治療または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるような操作された細胞を、疾患または状態を治療または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で含む。いくつかの実施形態における治療効果または予防効果は、治療対象の定期的な評価によって監視される。数日間以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療は繰り返される。しかしながら、他の投与レジメンが有用な場合もあり、他の投与レジメンを定めることもできる。所望の用量は、組成物の単回ボーラス投与によって、組成物の複数回ボーラス投与によって、または組成物の連続注入投与によって送達され得る。

【0677】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された初代細胞は、標準的な投与技術、製剤、及び／またはデバイスを使用して投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された初代細胞は、標準的な投与技術、製剤、及び／またはデバイスを使用して投与される。組成物の保存及び投与のための製剤ならびにデバイス（例えば、シリンジ及びバイアル）が提供される。操作された初代細胞は、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を含む、局所注射を介して投与することができる。治療組成物（例えば、操作された初代細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、それは一般に、単位投与注入形態（溶液、懸濁液、乳濁液）で製剤化される。

【0678】

製剤には、静脈内、腹腔内、または皮下投与用の製剤が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非経口で投与される。本明細書で使用する場合、「非経口」という用語には、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣、及び腹腔内投与が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、静脈内、腹腔内、または皮下注射による末梢全身送達を使用して対象に投与される。

【0679】

いくつかの実施形態における組成物は、滅菌液体製剤、例えば、等張水溶液、等張懸濁液、等張乳濁液、または等張分散液として提供され、いくつかの態様では、選択されたｐＨに緩衝され得る。液体組成物は、特に注射による投与がやや便利である。液体組成物は、担体を含むことができ、担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びこれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。滅菌注射用溶液は、無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの好適な担体、希釈剤、または賦形剤との混合物などの溶媒に細胞を組み込むことによって調製することができる。

【0680】

いくつかの実施形態では、医薬的に許容される担体としては、薬品投与に適合する任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤など等が挙げられる（Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。このような担体または希釈剤の例としては、限定されないが、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソーム及び不揮発性油などの非水性媒体が用いられてもよい。補足的活性成分を組成物に組み込むこともできる。医薬的担体は、生理食塩水、デキストロース溶液、またはヒト血清アルブミンを含む溶液など、操作された初代細胞に適したものでなければならない。いくつかの実施形態では、そのような組成物のための医薬的に許容される担体またはビヒクルは、生細胞の投与を可能にするのに十分な時間、操作された初代細胞が維持され得る、または生存し続けることができる、任意の非毒性水溶液である。例えば、医薬的に許容される担体またはビヒクルは、生理食塩水または緩衝生理食塩水であり得る。

【0681】

いくつかの実施形態では、医薬組成物を含む組成物は、滅菌である。いくつかの実施形態では、細胞の単離、濃縮または培養は、エラー、ユーザーの取り扱い及び／または汚染を最小限に抑えるために、閉鎖環境または滅菌環境、例えば、滅菌培養バッグで行われる。いくつかの実施形態では、滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を介した濾過によって容易に達成され得る。いくつかの実施形態では、培養は、気体透過性の培養容器を使用して行われる。いくつかの実施形態では、培養は、バイオリアクターを使用して行われる。

【0682】

本明細書ではまた、提供される操作された初代細胞を凍結保存するのに適した組成物も提供される。いくつかの実施形態では、提供される操作された初代細胞は、凍結保存培地で凍結保存される。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、無血清凍結保存培地である。いくつかの実施形態では、組成物は、凍結保護剤を含む。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、ＤＭＳＯ及び／またはグリセロールであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、５％～１０％または約５％～約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、５％または約５％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、６％または約６％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、７％または約７％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、７．５％または約７．５％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、８％または約８％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、９％または約９％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、１０％または約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存媒体は、市販の凍結保存溶液（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０）を含有する。ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する凍結保存培地である。いくつかの実施形態では、凍結保存用に配合された組成物は、超低温などの低温で保存することができ、例えば、－４０℃～－１５０℃、例えば、８０℃±６．０℃または約８０℃±６．０℃の範囲の温度で保存できる。

【0683】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の操作された細胞と、３１．２５％（ｖ／ｖ）のＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ、３１．２５％（ｖ／ｖ）の５％デキストロース／０．４５％塩化ナトリウム、１０％デキストラン４０（ＬＭＤ）／５％デキストロース、２０％（ｖ／ｖ）の２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及び７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む医薬的に許容される担体と、を含む。

【0684】

いくつかの実施形態では、凍結保存された操作された初代細胞は、解凍することによって投与のために調製される。場合によっては、操作された初代細胞は、解凍直後に対象に投与され得る。このような実施形態では、組成物は、更なる処理を行わなくてもすぐに使用できる。他の場合では、操作された初代細胞は、解凍後に、例えば、医薬的に許容される担体との再懸濁、活性化剤もしくは刺激剤とのインキュベートによって更に処理されるか、または対象への投与前に活性化され、洗浄され、医薬的に許容される緩衝液中に再懸濁される。

【0685】

ＩＶ．キット、成分及び製品
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法、装置及びシステムのキット、成分ならびに組成物（消耗品など）が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書の開示に従って使用するための説明書を含む。

【0686】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された初代細胞の集団を含むキットまたは組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書では、複数の操作された初代細胞を含む細胞集団を含む。キットまたは組み合わせが提供され、操作された初代細胞は、（ｉ）ＣＤ４７の発現を増加させる、及び（ｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現を低減させる、改変を含む、（ｉ）の発現の増加及び（ｉｉ）の発現の低減は、改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、キットの成分は、同時に投与され得る。いくつかの実施形態では、キットの成分は、経時的に投与され得る。

【0687】

本発明のいくつかの実施形態では、細胞療法を含む、臨床移植療法に有用な物質を含む、製品が提供される。いくつかの実施形態では、製品は、細胞不全の治療に有用な物質を含み、その不全は、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病）、血管の状態または血管疾患、自己免疫性甲状腺炎、肝疾患（例えば、肝硬変）、角膜疾患（例えば、フックスジストロフィーまたは先天性遺伝性内皮ジストロフィー）、腎疾患、ならびにがん（例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌）などであるが、これらに限定されない。製品は、容器及び容器上のもしくは容器に関連する、ラベルまたは添付文書を含み得る。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器など（例えば、ガラスまたはプラスチック容器）が含まれる。一般に容器は、容器は、同種異系細胞療法に有効である組成物が収容され、滅菌アクセスポートがあってもよい（例えば、容器は、皮下用注射針で穿刺可能なストッパーを有する静脈内輸液バッグまたはバイアルであってもよい）。少なくとも医薬組成物中の成分は、本明細書で提供される任意の操作された初代細胞などの操作された初代細胞の集団である。ラベルまたは添付文書は、組成物が特定の状態を治療するために使用されることを指示する。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物を患者に投与するための説明書を更に含む。いくつかの実施形態では、製品は、併用治療を含む。

【0688】

製品及び／またはキットは、添付文書を更に含み得る。添付文書とは、このような治療薬の適応症、使用、投薬量、投与、禁忌、及び／またはその使用に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業用パッケージに通例含まれる指示を指す。

【0689】

Ｖ．治療の方法
本明細書では、対象における疾患または状態の治療に使用するための、本明細書に記載の操作された細胞の集団を含む、提供された細胞組成物に関連する組成物及び方法が提供される。本明細書では、本明細書に記載の低免疫原性細胞の集団を投与することによって患者を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、操作された初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、医薬組成物で、例えば、本明細書に記載のいずれかで投与するように配合されている。このような方法及び使用には、例えば、疾患、状態または障害を有する対象への、操作された初代細胞などの操作された細胞の集団、またはそれを含む組成物の投与を含む、治療方法及び使用が含まれる。特定の疾患の適応症に対して、本明細書に提供される適切な操作された初代細胞を選択することは、当業者のレベルの範囲内である。いくつかの実施形態では、細胞またはその医薬組成物は、疾患または障害の治療を果たすために、有効量で投与される。使用には、そのような方法及び治療における、ならびにそのような治療方法を実施するための薬剤の調製における、操作された初代細胞またはその医薬組成物の使用が含まれる。いくつかの実施形態では、方法は、それによって対象における疾患または状態または障害を治療する。

【0690】

本明細書で提供される操作された初代細胞などの操作された細胞は、例えば、疾患または障害の治療のための細胞療法の候補を含む、任意の好適な患者に投与することができる。細胞療法の候補には、本明細書で提供される対象となる操作された初代細胞の治療効果が有益な可能性があり得る、疾患または状態を有する任意の患者が含まれる。いくつかの実施形態では、患者は、投与された細胞の同種異系レシピエントである。いくつかの実施形態では、提供される改変細胞、例えば、操作された初代細胞は、同種異系細胞療法における使用に有効である。本明細書で提供される操作された初代細胞などの対象となる操作された細胞の治療効果が有益である候補は、疾患または状態の排除、低減または寛解を示す。

【0691】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法のいずれかによって作製される細胞を含む、本明細書に提供される操作された初代細胞は、細胞療法に使用することができる。本明細書に概説される治療用細胞は、限定されないが、がん、遺伝子障害、慢性感染性疾患、自己免疫障害、神経学的障害などといった障害を治療するのに有用である。

【0692】

いくつかの実施形態では、患者は、細胞欠損症を有する。本明細書で使用する場合、「細胞欠損症」とは、患者において細胞集団の機能不全または喪失を引き起こし、患者が細胞集団を自然に置換または再生することができない、任意の疾患または状態を指す。例となる細胞欠損症には、自己免疫性疾患（例えば、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチ、糖尿病、全身性ループス及びエリテマトーデス）、神経変性疾患（例えば、ハンチントン病及びパーキンソン病）、心血管病態及び疾患、血管病態及び疾患、角膜病態及び疾患、肝臓病態及び疾患、甲状腺病態及び疾患、及び腎臓病態及び疾患が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞を投与される患者は、がんを有する。本明細書で提供される操作された細胞によって治療され得る、例となるがんには、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、がん患者は、本明細書で提供される操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の投与によって治療される。

【0693】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は糖尿病に関連するか、または細胞療法は糖尿病の治療のためのものであり、任意選択で、糖尿病はＩ型糖尿病である。いくつかの実施形態では、操作された細胞の集団は、β膵島細胞を含む膵島細胞の集団である。いくつかの実施形態では、膵島細胞は、膵島前駆細胞、未成熟膵島細胞、及び成熟膵島細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、操作された初代β膵島細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作されたβ膵島細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代β膵島細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0694】

本明細書に記載の操作された初代β膵島細胞は、対象における耐糖能を改善し得る。耐糖能は、本明細書に記載される方法（例えば、インスリン分泌アッセイ）などの任意の適切な方法によって測定され得る。いくつかの実施形態では、操作された初代β膵島細胞は、グルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を示す。したがって、いくつかの実施形態では、改善された耐糖能は、ＧＳＩＳ灌流アッセイで測定される。耐糖能障害はインスリン抵抗性に関連しており、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病）を引き起こす可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、操作された初代β膵島細胞、または操作された初代β膵島細胞の集団を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、糖尿病を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病患者である。いくつかの実施形態では、患者は、Ｉ型糖尿病を有する。いくつかの実施形態では、患者は、ＩＩ型糖尿病を有する。具体的には、いくつかの実施形態では、対象における耐糖能を改善する方法が提供され、方法は、操作された初代β膵島細胞、または操作された初代β膵島細胞の集団を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、耐糖能は、膵島細胞の投与前の対象の耐糖能と比較して改善される。いくつかの実施形態では、β膵島細胞は、対象における外因性インスリン使用量を低減させる。いくつかの実施形態では、ＨｂＡ１ｃレベルによって測定される耐糖能が改善される。いくつかの実施形態では、対象は絶食している。いくつかの実施形態では、膵島細胞は、対象におけるインスリン分泌を改善する。いくつかの実施形態では、インスリン分泌は、膵島細胞の投与前の対象のインスリン分泌と比較して改善される。

【0695】

操作された初代β膵島細胞は、対象において適応免疫応答を誘導しない可能性がある。いくつかの実施形態では、適応免疫応答は、ＥＬＩＳＰＯＴを使用して評価される。例えば、適応免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇサイトカイン分泌のレベルを測定することによって評価され得る。いくつかの実施形態では、操作された初代β膵島細胞は、野生型初代β膵島細胞と比較して、低いレベルのＩＦＮｇを示し、例えば、野生型初代β膵島細胞と比較して、ＩＦＮｇの約４００倍、３００倍、２００倍、１００倍、５０倍、２５倍及び１０倍低いレベルのいずれかを示す。いくつかの実施形態では、適応免疫応答は、フローサイトメトリーを使用して評価される。例えば、いくつかの実施形態では、適応免疫応答は、ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）ＩｇＧまたはＩｇＭのレベルを測定することによって評価される。いくつかの実施形態では、操作された初代β膵島細胞は、野生型初代β膵島細胞と比較して、低いレベルのＤＳＡレベルを示し、例えば、野生型初代β膵島細胞と比較して、ＤＳＡの約２倍、１．５倍及び１倍低いレベルのいずれかを示す。

【0696】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、糖尿病、がん、血管新生障害、眼疾患、甲状腺疾患、皮膚疾患、及び肝臓疾患である。

【0697】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、血管状態もしくは疾患に関連するか、または細胞療法は、血管状態もしくは疾患の治療のためのものである。いくつかの実施形態では、細胞集団は、内皮細胞の集団である。いくつかの実施形態では、方法は、操作された初代内皮細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作された初代内皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0698】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、自己免疫性甲状腺炎に関連するか、または細胞療法は、自己免疫性甲状腺炎の治療のためのものである。いくつかの実施形態では、細胞集団は、甲状腺前駆細胞の集団である。いくつかの実施形態では、方法は、操作された初代甲状腺前駆細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作された初代甲状腺前駆細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0699】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、肝臓疾患に関連するか、または細胞療法は、肝臓疾患の治療のためのものである。いくつかの実施形態では、肝臓疾患は、肝硬変を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、肝細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、肝前駆細胞の集団である。いくつかの実施形態では、方法は、操作された初代肝細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作された初代肝細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、方法は、操作された初代肝前駆細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作された初代肝前駆細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0700】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、角膜疾患に関連するか、または細胞療法は、角膜疾患の治療のためのものである。いくつかの実施形態では、角膜疾患は、フックスジストロフィー、または先天性遺伝性内皮ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、細胞集団は、初代角膜内皮前駆細胞、または初代角膜内皮細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、初代視細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、操作された初代角膜内皮前駆細胞または操作された初代角膜内皮細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作された初代角膜内皮前駆細胞または操作された初代角膜内皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、方法は、操作された初代視細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作された初代視細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0701】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、腎疾患に関連するか、または細胞療法は、腎疾患の治療のためのものである。いくつかの実施形態では、細胞集団は、初代腎前駆細胞もしくは初代腎細胞の集団である。いくつかの実施形態では、方法は、操作された初代腎前駆細胞または操作された初代腎細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作された初代腎前駆細胞または操作された初代腎細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0702】

いくつかの実施形態では、細胞療法は、がんの治療のためのものである。いくつかの実施形態では、がんは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、初代Ｔ細胞または初代ＮＫ細胞の集団である。いくつかの実施形態では、方法は、操作された初代Ｔ細胞または初代ＮＫ細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作された初代Ｔ細胞または初代ＮＫ細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0703】

いくつかの実施形態では、細胞療法は、造血疾患または造血障害の治療のためのものである。いくつかの実施形態では、細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、すべての種類の血球を補充し、自己再生する幹細胞である。枯渇化させた造血系をレシピエントマウスの循環に注射した場合、１６週間にわたって骨髄細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞のレベルをロバストに検出可能なレベル（通常、末梢血細胞の１％超）に維持する細胞として、造血幹細胞を具体的に定義してもよい（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６：２０３－２０７）。いくつかの実施形態では、造血障害は、血液疾患、特に造血細胞が関与する疾患に起因し得る。いくつかの実施形態では、造血障害は、単一遺伝子の変異などによる一遺伝子性造血疾患である。いくつかの実施形態では、造血障害は、骨髄異形成、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、鎌状赤血球症、ダイヤモンドブラックファン貧血、シュワッハマンダイヤモンド障害、コストマン症候群、慢性肉芽腫性疾患、副腎白質ジストロフィー、白血球接着不全症、血友病、サラセミア、βサラセミア、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄）白血病（ＡＭＬ）、成人リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、ウィスコット－アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、慢性肉芽腫症、チェディアック－東症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、またはエイズである。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、急性播種性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病、バロー同心円性硬化症、ベーチェット病、ベルジェ病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性再発性多巣性骨髄炎、チャーグ－ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素疾患、補体成分２欠損症、脳動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴ病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん性皮膚全身性硬化症、ドレスラー症候群、円板状エリテマトーデス、湿疹、付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァン症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性肺胞炎、胃炎、胃腸類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、バセドウ病、ギラン－バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、妊娠性ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、炎症性脱髄性多発神経障害、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート－イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ルー・ゲーリック病、ルポイド肝炎、エリテマトーデス、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡多発血管炎、ミラー－フィッシャー症候群、混合性結合組織病、モルフェア、ミュシャ－ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経腎盂炎、神経筋緊張症、眼瘢痕性天疱瘡、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、甲状腺炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲性脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スチル病、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、スウィート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎、トロサ－ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患、未分化脊椎関節症、血管炎、白斑、またはウェゲナー肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、がんを有する対象に由来する。いくつかの実施形態において、がんは白血病である。いくつかの実施形態では、白血病は、Ｂ－ＣＬＬ、ＣＭＬ、またはＡＬＴなどのＴ細胞ベースの白血病である。いくつかの実施形態では、がんは、骨髄腫である。いくつかの実施形態では、方法は、操作されたＨＳＣの集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作されたＨＳＣは、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む。いくつかの実施形態では、操作された初代肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む。

【0704】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作された初代細胞またはそれを含有する組成物は、例えば、細胞移植、輸血、組織移植、または臓器移植などの、以前の移植に存在する１つ以上の抗原から感作された患者の治療に有用である。特定の実施形態では、以前の移植は、同種異系移植であり、患者は、同種異系移植からの１つ以上の同種異系抗原に対して感作されている。同種異系移植には、同種異系細胞移植、同種異系輸血、同種異系組織移植、または同種異系臓器移植が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、患者は、妊娠しているか、または妊娠したことがある（例えば、妊娠中の同種免疫化を有するか、または有したことがある）感作患者である。特定の実施形態では、患者は、以前の移植に含まれる１つ以上の抗原から感作されており、ここで、以前の移植は、改変されたヒト細胞、組織または臓器である。いくつかの実施形態では、改変されたヒト細胞、組織または臓器は、改変された自家ヒト細胞、組織または臓器である。いくつかの実施形態では、以前の移植は、非ヒト細胞、組織または臓器である。例となる実施形態では、以前の移植は、改変された非ヒト細胞、組織または臓器である。特定の実施形態では、以前の移植は、ヒト成分を含むキメラである。特定の実施形態では、以前の移植は、ＣＡＲ－Ｔ細胞である。特定の実施形態では、以前の移植は、自家移植であり、患者は、自家移植からの１つ以上の自己抗原に対して感作されている。特定の実施形態では、以前の移植は、自家細胞、組織または臓器である。特定の実施形態では、感作患者は、アレルギーを有するか、１つ以上のアレルゲンに感作されている。例となる実施形態では、患者は、花粉症、食物アレルギー、昆虫アレルギー、薬物アレルギー、またはアトピー性皮膚炎を有する。

【0705】

いくつかの実施形態では、提供される操作された初代細胞、またはそれを含有する組成物を使用する治療を受けている患者は、以前に治療を受けている。いくつかの実施形態では、操作される初代細胞、またはそれを含有する組成物は、以前の治療と同じ状態を治療するために使用される。特定の実施形態では、操作される初代細胞、またはそれを含有する組成物は、以前の治療とは異なる状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、患者に投与される操作された初代細胞またはそれを含有する組成物は、以前の治療によって治療された同じ状態または疾患の治療に対して強化された治療効果を示す。特定の実施形態では、投与される操作された初代細胞またはそれを含有する組成物は、以前の治療と比較して、患者における状態または疾患の治療に対してより長期の治療効果を示す。例となる実施形態では、投与される細胞は、以前の治療と比較して、がん細胞に対して強化された効力、有効性、及び／または特異性を示す。特定の実施形態では、操作された初代細胞は、がんの治療のためのＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0706】

本明細書で提供される方法は、第一選択の治療が失敗した後の、特定の状態または疾患に対する第二選択の治療として使用することができる。いくつかの実施形態では、以前の処置は、治療上有効でない治療である。本明細書で使用する場合、「治療上有効でない」治療は、患者において所望に満たない臨床成果をもたらす治療を指す。例えば、細胞欠損症に対する治療に関して、治療上有効でない治療とは、患者において欠損細胞を置換するために所望されるレベルの機能的細胞及び／または細胞活性を達成しない、及び／または治療持続性を欠いた治療を指す場合がある。がん治療に関しては、治療上有効でない治療とは、所望されるレベルの効力、有効性、及び／または特異性を達成しない治療を指す。治療有効性は、当技術分野で既知の任意の好適な技法を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、患者は、以前の治療に対して免疫応答を生じる。いくつかの実施形態では、以前の治療は、患者によって拒絶される細胞、組織、または臓器移植片である。いくつかの実施形態では、以前の治療は、機械補助による治療を含んでいた。いくつかの実施形態では、機械補助による治療は、血液透析または補助人工心臓を含んでいた。いくつかの実施形態では、患者は、機械補助による治療に対して免疫応答を生じた。いくつかの実施形態では、以前の治療は、治療用細胞が望まれない様態で増殖及び分裂するようなことがあれば、治療用細胞の死を引き起こすことができる、安全スイッチを含む治療用細胞の集団を含んでいた。特定の実施形態では、患者は、安全スイッチにより誘導される治療用細胞の死の結果として、免疫応答を生じる。特定の実施形態では、患者は、以前の治療から感作されている。例となる実施形態では、患者は、本明細書に提供されるように、投与される操作された初代細胞によっては感作されない。

【0707】

いくつかの実施形態では、提供される操作された初代細胞、またはそれを含む組成物は、それを必要とする患者に組織、臓器または部分的臓器移植を提供する前に投与される。特定の実施形態では、患者は、操作された初代細胞に対して免疫応答を示さない。特定の実施形態では、操作された初代細胞は、特定の組織または臓器における細胞欠損症の治療のために患者に投与され、患者はその後、同じ特定の組織または臓器に対する組織移植または臓器移植を受ける。このような実施形態では、操作された初代細胞による治療は、やがて行われる組織または臓器置換へのブリッジ療法として機能する。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、肝臓障害を有し、肝臓移植を受ける前に、本明細書で提供される操作された肝細胞による治療を受ける。特定の実施形態では、操作された初代細胞は、特定の組織または臓器における細胞欠損症の治療のために患者に投与され、患者はその後、異なる組織または臓器に対する組織移植または臓器移植を受ける。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、腎臓移植を受ける前に本明細書で提供されるような操作された膵臓β膵島細胞で治療される糖尿病患者である。いくつかの実施形態では、方法は、細胞欠損症の治療のためのものである。例となる実施形態では、組織移植または臓器移植は、心臓移植、肺移植、腎臓移植、肝臓移植、膵臓移植、腸移植、胃移植、角膜移植、骨髄移植、血管移植、心臓弁移植、または骨移植である。

【0708】

患者を治療する方法は一般に、本明細書に提供されるように、操作された初代細胞、またはそれを含有する組成物の投与によるものである。理解されようが、細胞及び／または療法のタイミングに関連する本明細書に記載のすべての複数の実施形態に関して、細胞の投与は、所望の部位での導入細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって遂行される。細胞は、対象内の所望の部位に直接埋め込まれ得るか、または代替として、所望の部位への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得、埋め込まれた細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部分は、生存したままである。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞療法によって緩和され得る任意の疾患、障害、状態またはその症状などの疾患または障害を治療するために投与される。

【0709】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の集団またはそれを含有する組成物は、患者が感作されてから少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、または少なくとも１ヶ月以上後に投与される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の集団またはそれを含有する組成物は、患者が感作されてから、または感作の特性もしくは特徴を示してから少なくとも１週間（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、またはそれよりも長い期間）以上後に投与される。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の集団またはそれを含有する組成物は、患者が移植（例えば、同種異系移植）を受けてから、妊娠してから（例えば、妊娠中の同種免疫化を有するか、または有したことがある）、または感作されてから、または感作の特性または特徴を示してから少なくとも１ヶ月（例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、またはそれよりも長い期間）以上後に投与される。

【0710】

いくつかの実施形態では、移植を受けたことがある、妊娠したことがある（例えば、妊娠中の同種免疫化を有するか、または有したことがある）、及び／または抗原（例えば、同種異系抗原）に対して感作されている患者は、本明細書に記載の操作された初代細胞の集団の１回目の用量の投与、１回目の用量の後の回復期間、及び記載される操作された初代細胞の集団の２回目の用量の投与を含む、投与レジメンを施与される。いくつかの実施形態では、第１の細胞集団及び第２の細胞集団中に存在する細胞種の混成は異なる。特定の実施形態では、第１の操作された初代細胞の集団及び第２の操作された初代細胞の集団中に存在する細胞種の混成は、同じであるか、または実質的に同等である。多くの実施形態では、第１の操作された初代細胞の集団及び第２の操作された初代細胞の集団は、同じ細胞種を含む。いくつかの実施形態では、第１の操作された初代細胞の集団及び第２の操作された初代細胞の集団は、異なる細胞種を含む。いくつかの実施形態では、第１の操作された初代細胞の集団及び第２の操作された初代細胞の集団は、同じパーセンテージの細胞種を含む。他の実施形態では、第１の操作された初代細胞の集団及び第２の操作された初代細胞の集団は、異なるパーセンテージの細胞種を含む。

【0711】

いくつかの実施形態では、回復期間は、操作された初代細胞の集団またはそれを含有する組成物の第１の投与に次いで開始し、このような細胞が、患者においてもはや存在しないかまたは検出可能でないときに終了する。いくつかの実施形態では、回復期間の継続期間は、細胞の初回投与から少なくとも１週間（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、またはそれよりも長い期間）以上後である。いくつかの実施形態では、回復期間の継続期間は、細胞の初回投与から少なくとも１ヶ月（例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、またはそれよりも長い期間）以上後である。

【0712】

いくつかの実施形態では、操作された細胞の投与された集団またはそれを含有する組成物は、対象に投与された場合、低免疫原性である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、低免疫である。いくつかの実施形態では、操作された細胞に対する免疫応答は、免疫原性細胞（例えば、同じまたは類似の細胞種または表現型であるが、操作された細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成された免疫応答のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％低減されるか、または少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％低い。いくつかの実施形態では、操作された細胞の投与された集団またはそれを含有する組成物は、患者において操作された細胞に対する免疫応答を誘発しない。

【0713】

いくつかの実施形態では、操作された細胞の投与された集団またはそれを含有する組成物は、患者において減少したまたはより低いレベルの全身性のＴＨ１活性化を誘発する。いくつかの事例では、細胞によって誘発された全身性ＴＨ１活性化のレベルは、免疫原性細胞（例えば、同じまたは類似の細胞種または表現型であるが、操作された初代細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成された全身性ＴＨ１活性化のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の投与された集団またはそれを含有する組成物は、患者において全身性ＴＨ１活性化を誘発しない。

【0714】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の投与された集団またはそれを含有する組成物は、患者において減少したまたはより低いレベルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の免疫活性化を誘発する。いくつかの事例では、細胞によって誘発されたＰＢＭＣの免疫活性化のレベルは、免疫原性細胞（例えば、同じまたは類似の細胞種または表現型であるが、操作された初代細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成されたＰＢＭＣの免疫活性化のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の投与された集団またはそれを含有する組成物は、患者においてＰＢＭＣの免疫活性化を誘発しない。

【0715】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の投与された集団またはそれを含有する組成物は、患者において減少したまたはより低いレベルのドナー特異的ＩｇＧ抗体を誘発する。いくつかの事例では、細胞によって誘発されたドナー特異的ＩｇＧ抗体のレベルは、免疫原性細胞（例えば、同じまたは類似の細胞種または表現型であるが、操作された初代細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成されたドナー特異的ＩｇＧ抗体のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の投与された集団は、患者においてドナー特異的ＩｇＧ抗体を誘発しない。

【0716】

いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の投与された集団またはそれを含有する組成物は、患者において減少したまたはより低いレベルのＩｇＭ及びＩｇＧ抗体生成を誘発する。いくつかの事例では、細胞によって誘発されたＩｇＭ及びＩｇＧ抗体生成のレベルは、免疫原性細胞（例えば、同じまたは類似の細胞種または表現型であるが、操作された初代細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成されたＩｇＭ及びＩｇＧ抗体生成のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い。いくつかの実施形態では、操作された初代細胞の投与された集団またはそれを含有する組成物は、患者においてＩｇＭ及びＩｇＧ抗体生成を誘発しない。

【0717】

いくつかの実施形態では、操作された細胞の投与された集団またはそれを含有する組成物は、患者において減少したまたはより低いレベルの細胞傷害性Ｔ細胞殺傷を誘発する。いくつかの事例では、細胞によって誘発された細胞傷害性Ｔ細胞殺傷のレベルは、免疫原性細胞（例えば、同じまたは類似の細胞種または表現型であるが、操作された初代細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成された細胞傷害性Ｔ細胞殺傷のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い。いくつかの実施形態では、操作された細胞の投与された集団またはそれを含有する組成物は、患者において細胞傷害性Ｔ細胞殺傷を誘発しない。

【0718】

上記で考察したように、本明細書では、特定の実施形態では、ＭＨＣ分子など（例えば、ヒト白血球抗原）の同種異系抗原に対して感作された患者に投与され得る、細胞が提供される。いくつかの実施形態では、患者は、妊娠しているか、または妊娠したことがあり、例えば、妊娠中の同種免疫化（例えば、胎児及び新生児の溶血性疾患（ＨＤＦＮ）、新生児同種免疫性好中球減少症（ＮＡＮ）、または胎児及び新生児同種免疫性血小板減少症（ＦＮＡＩＴ））を有する。換言すれば、患者は、限定されないが、胎児及び新生児の溶血性疾患（ＨＤＦＮ）、新生児同種免疫性好中球減少症（ＮＡＮ）、ならびに胎児及び新生児同種免疫性血小板減少症（ＦＮＡＩＴ）などの、妊娠中の同種免疫化に関連する障害または状態を有するか、または有したことがある。いくつかの実施形態では、患者は、限定されないが、同種異系細胞移植、同種異系輸血、同種異系組織移植、または同種異系臓器移植などの、同種異系移植を受けたことがある。いくつかの実施形態では、患者は、同種異系抗原に対するメモリーＢ細胞を示す。いくつかの実施形態では、患者は、同種異系抗原に対するメモリーＴ細胞を示す。かかる患者は、同種異系抗原に対するメモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞の両方を示す可能性がある。

【0719】

記載される細胞の投与時に、患者は、低免疫原性ではない細胞に対する応答と比較して、全身性の免疫応答の不在またはレベルが低減した全身性の免疫応答を示す。いくつかの実施形態では、患者は、低免疫原性ではない細胞に対する応答と比較して、適応免疫応答の不在またはレベルが低減した適応免疫応答を示す。いくつかの実施形態では、患者は、低免疫原性ではない細胞に対する応答と比較して、自然免疫応答の不在またはレベルが低減した自然免疫応答を示す。いくつかの実施形態では、患者は、低免疫原性ではない細胞に対する応答と比較して、Ｔ細胞応答の不在またはレベルが低減したＴ細胞応答を示す。いくつかの実施形態では、患者は、低免疫原性ではない細胞に対する応答と比較して、Ｂ細胞応答の不在またはレベルが低減したＢ細胞応答を示す。

【0720】

Ａ．用量及び投与レジメン
本明細書に記載の任意の治療上有効量の細胞は、治療されている適応症に応じて医薬組成物に含まれ得る。細胞の非限定的な例には、記載されている初代細胞（例えば、初代Ｔ細胞）が含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物には、少なくとも約１×１０^２、５×１０^２、１×１０^３、５×１０^３、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、または５×１０^１０個の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物には、最大で約１×１０^２、５×１０^２、１×１０^３、５×１０^３、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、または５×１０^１０個の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物には、最大で約６．０×１０^８個の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物には、最大で約８．０×１０^８個の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物には、少なくとも約１×１０^２～５×１０^２、５×１０^２～１×１０^３、１×１０^３～５×１０^３、５×１０^３～１×１０^４、１×１０^４～５×１０^４、５×１０^４～１×１０^５、１×１０^５～５×１０^５、５×１０^５～１×１０^６、１×１０^６～５×１０^６、５×１０^６～１×１０^７、１×１０^７～５×１０^７、５×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～５×１０^８、５×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～５×１０^９、５×１０^９～１×１０^１０、または１×１０^１０～５×１０^１０個の細胞が含まれる。例となる実施形態では、医薬組成物には、約１．０×１０^６～約２．５×１０^８個の細胞が含まれる。

【0721】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または５００ｍｌの体積を有する。例となる実施形態では、医薬組成物は、最大で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または５００ｍｌの体積を有する。例となる実施形態では、医薬組成物は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または５００ｍｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１～５０ｍｌ、５０～１００ｍｌ、１００～１５０ｍｌ、１５０～２００ｍｌ、２００～２５０ｍｌ、２５０～３００ｍｌ、３００～３５０ｍｌ、３５０～４００ｍｌ、４００～４５０ｍｌ、または４５０～５００ｍｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１～５０ｍｌ、５０～１００ｍｌ、１００～１５０ｍｌ、１５０～２００ｍｌ、２００～２５０ｍｌ、２５０～３００ｍｌ、３００～３５０ｍｌ、３５０～４００ｍｌ、４００～４５０ｍｌ、または４５０～５００ｍｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１～１０ｍｌ、１０～２０ｍｌ、２０～３０ｍｌ、３０～４０ｍｌ、４０～５０ｍｌ、５０～６０ｍｌ、６０～７０ｍｌ、７０～８０ｍｌ、７０～８０ｍｌ、８０～９０ｍｌ、または９０～１００ｍｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５ｍｌ～約８０ｍｌの範囲の体積を有する。例となる実施形態では、医薬組成物は、約１０ｍｌ～約７０ｍｌの範囲の体積を有する。多くの実施形態では、医薬組成物は、約１０ｍｌ～約５０ｍｌの範囲の体積を有する。

【0722】

具体的な量／投与レジメンは、個体の体重、性別、年齢及び健康；配合、生化学的特質、生物活性、バイオアベイラビリティ及び細胞の副作用ならびに完全な治療レジームにおける細胞の数及び同一性に応じて様々である。

【0723】

いくつかの実施形態では、１用量の医薬組成物には、約１０ｍＬ～５０ｍＬの体積の約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個の細胞が含まれ、医薬組成物は、単一用量として投与される。

【0724】

多くの実施形態では、細胞はＴ細胞であり、医薬組成物には、例えば、限定されないが、初代Ｔ細胞などの約２．０×１０^６～約２．０×１０^８個の細胞が含まれる。場合によっては、用量には、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積の約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個の本明細書に記載の初代Ｔ細胞が含まれる。いくつかの場合では、用量には、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積の約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個の上述した初代Ｔ細胞が含まれる。他の場合では、用量は、初代Ｔ細胞を含む、約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個のＴ細胞よりも低い範囲である。更に他の場合では、用量は、初代Ｔ細胞を含む、約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個のＴ細胞よりも高い範囲である。

【0725】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、５０ｋｇ以下の対象の場合は体重１ｋｇ当たり約１．０×１０^５～約１．０×１０^７個の操作された初代細胞（例えば、初代Ｔ細胞）の単一用量として投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、５０ｋｇ以下の対象の場合は体重１ｋｇ当たり約０．５×１０^５～約１．０×１０^７、約１．０×１０^５～約１．０×１０^７、約１．０×１０^５～約１．０×１０^７、約５．０×１０^５～約１×１０^７、約１．０×１０^６～約１×１０^７、約５．０×１０^６～約１．０×１０^７、約１．０×１０^５～約５．０×１０^６、約１．０×１０^５～約１．０×１０^６、約１．０×１０^５～約５．０×１０^５、約１．０×１０^５～約５．０×１０^６、約２．０×１０^５～約５．０×１０^６、約３．０×１０^５～約５．０×１０^６、約４．０×１０^５～約５．０×１０^６、約５．０×１０^５～約５．０×１０^６、約６．０×１０^５～約５．０×１０^６、約７．０×１０^５～約５．０×１０^６、約８．０×１０^５～約５．０×１０^６、または約９．０×１０^５～約５．０×１０^６個の細胞の単一用量として投与される。いくつかの実施形態では、用量は、５０ｋｇ以下の対象の場合は体重１ｋｇ当たり約０．２×１０^６～約５．０×１０^６個の細胞である。多くの実施形態では、用量は、５０ｋｇ以下の対象の場合は体重１ｋｇ当たり約０．２×１０^６～約５．０×１０^６個よりも低い範囲である。多くの実施形態では、用量は、５０ｋｇ以下の対象の場合は体重１ｋｇ当たり約０．２×１０^６～約５．０×１０^６個よりも高い範囲である。例となる実施形態では、単一用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積のものである。いくつかの実施形態では、用量は、静脈内に投与される。

【0726】

例となる実施形態では、細胞は、５０ｋｇを超える対象の場合は約１．０×１０^６～約５．０×１０^８個の細胞（例えば、初代細胞）の単一用量で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、５０ｋｇ以下の対象の場合は体重１ｋｇ当たり約０．５×１０^６～約１．０×１０^９、約１．０×１０^６～約１．０×１０^９、約１．０×１０^６～約１．０×１０^９、約５．０×１０^６～約１．０×１０^９、約１．０×１０^７～約１．０×１０^９、約５．０×１０^７～約１．０×１０^９、約１．０×１０^６～約５．０×１０^７、約１．０×１０^６～約１．０×１０^７、約１．０×１０^６～約５．０×１０^７、約１．０×１０^７～約５．０×１０^８、約２．０×１０^７～約５．０×１０^８、約３．０×１０^７～約５．０×１０^８、約４．０×１０^７～約５．０×１０^８、約５．０×１０^７～約５．０×１０^８、約６．０×１０^７～約５．０×１０^８、約７．０×１０^７～約５．０×１０^８、約８．０×１０^７～約５．０×１０^８、または約９．０×１０^７～約５．０×１０^８個の細胞の単一用量として投与される。多くの実施形態では、細胞は、５０ｋｇを超える対象の場合は約１．０×１０^７～約２．５×１０^８個の細胞の単一用量で投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、５０ｋｇを超える対象の場合は約１．０×１０^７～約２．５×１０^８個の細胞よりも低い範囲の単一用量で投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、５０ｋｇを超える対象の場合は約１．０×１０^７～約２．５×１０^８個の細胞よりも高い範囲の単一用量で投与される。いくつかの実施形態では、用量は、静脈内に投与される。例となる実施形態では、単一用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積のものである。いくつかの実施形態では、用量は、静脈内に投与される。

【0727】

例となる実施形態では、用量は、１分当たり約１～５０ｍｌ、１分当たり１～４０ｍｌ、１分当たり１～３０ｍｌ、１分当たり１～２０ｍｌ、１分当たり１０～２０ｍｌ、１分当たり１０～３０ｍｌ、１分当たり１０～４０ｍｌ、１分当たり１０～５０ｍｌ、１分当たり２０～５０ｍｌ、１分当たり３０～５０ｍｌ、１分当たり４０～５０ｍｌの速度で静脈内に投与される。多数の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与のための１つ以上の注入バッグ内で保管される。いくつかの実施形態では、用量は、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、７０分、８０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２４０分、または３００分以下で完全に投与される。

【0728】

いくつかの実施形態では、医薬組成物の単一用量は、単一の注入バッグに存在する。他の実施形態では、医薬組成物の単一用量は、２、３、４または５個の別個の注入バッグに分割される。

【0729】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、２、３、４、５、６回またはそれ以上の用量などの複数回の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複数の用量の各用量は、１～２４時間の範囲空けて対象に投与される。いくつかの事例では、後続の用量は、最初または先行の用量から約１時間～約２４時間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または約２４時間）後に投与される。いくつかの実施形態では、複数の用量の各用量は、約１日～２８日の範囲空けて対象に投与される。いくつかの事例では、後続の用量は、最初または先行の用量から約１日～約２８日（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または約２８日）後に投与される。多くの実施形態では、複数の用量の各用量は、１週～約６週の範囲空けて対象に投与される。特定の事例では後続の用量は、最初または先行の用量から約１週～約６週（例えば、約１、２、３、４、５、または６週）後に投与される。いくつかの実施形態では、複数の用量の各用量は、約１ヶ月～約１２ヶ月の範囲を空けて対象に投与される。いくつかの事例では後続の用量は、最初または先行の用量から約１ヶ月～約１２ヶ月（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月）後に投与される。

【0730】

いくつかの実施形態では、対象は、第１の時点で第１の投与レジメンが投与され、次いでその後、第２の時点で第２の投与レジメンが投与される。いくつかの実施形態では、第１の投与レジメンは、第２の投与レジメンと同じである。他の実施形態では、第１の投与レジメンは、第２の投与レジメンとは異なる。いくつかの事例では、第１の投与レジメン及び第２の投与レジメンにおける細胞の数は、同じである。いくつかの事例では、第１の投与レジメン及び第２の投与レジメンにおける細胞の数は、異なる。場合によっては、第１の投与レジメン及び第２の投与レジメンにおける用量の数は、同じである。場合によっては、第１の投与レジメン及び第２の投与レジメンにおける用量の数は、異なる。

【0731】

いくつかの実施形態では、細胞は操作されたＴ細胞（例えば、初代Ｔ細胞）であり、第１の投与レジメンには、第１のＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞が含まれ、第２の投与レジメンには、第２のＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞が含まれ、第１のＣＡＲ及び第２のＣＡＲは異なる。例えば、第１のＣＡＲ及び第２のＣＡＲは、異なる標的抗原に結合する。場合によっては、第１のＣＡＲには、抗原に結合するｓｃＦｖが含まれ、第２のＣＡＲには、異なる抗原に結合するｓｃＦｖが含まれる。いくつかの実施形態では、第１の投与レジメンには、第１のＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞が含まれ、第２の投与レジメンには、第２のＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞または初代Ｔ細胞が含まれ、第１のＣＡＲ及び第２のＣＡＲは同じである。第１の投与レジメンは、第２の投与レジメンから少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１～３ヶ月、１～６ヶ月、４～６ヶ月、３～９ヶ月、３～１２ヶ月、またはそれを超える月数空けて対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、疾患（例えば、がん）の過程中に複数の投与レジメンが投与され、投与レジメンの少なくとも２つは、本明細書に記載の同じタイプの操作されたＴ細胞を含む。他の実施形態では、複数の投与レジメンの少なくとも２つは、本明細書に記載の異なるタイプの操作されたＴ細胞を含む。

【0732】

Ｂ．免疫抑制剤
いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作された初代細胞の集団またはそれを含有する組成物の第１の投与前に患者に投与されない。

【0733】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作された初代細胞の投与を受けた患者に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作された初代細胞の投与の前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作された初代細胞の第１及び／または第２の投与の前に投与される。

【0734】

免疫抑制剤及び／または免疫調節剤の非限定的な例としては、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、プレドニゾンなどのコルチコステロイド、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、ブレキナール、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスペルグアリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン、チモシン－α、及び類似の薬剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、ＩＬ－２受容体のｐ７５に結合する抗体、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、またはＣＤ５８に結合する抗体、及びそれらのリガンドのうちのいずれかに結合する抗体からなる免疫抑制抗体の群から選択される。免疫抑制剤及び／または免疫調節剤が細胞の第１の投与前または後に患者に投与されるいくつかの実施形態では、投与は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を有し、ＣＤ４７の外因性発現を有しない細胞に必要とされるであろう投与量よりも低い投与量である。

【0735】

一実施形態では、かかる免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、可溶性ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１０、Ｂ７分子（例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、それらの変異体、及びそれらの断片）、ネガティブＴ細胞制御因子の阻害剤であるＩＣＯＳ及びＯＸ４０（ＣＴＬＡ－４に対する抗体など）、ならびに類似の薬剤から選択され得る。

【0736】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作された初代細胞の集団の第１の投与前に患者に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の第１の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日前、またはそれよりも前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の第１の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間前、またはそれよりも前に投与される。

【0737】

特定の実施形態では、免疫抑制及び／または免疫調節剤は、細胞の第１の投与後に患者に投与されないか、または細胞の第１の投与から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日後、もしくはそれよりも後に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の第１の投与から少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間後、またはそれよりも後に投与される。

【0738】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作された細胞の集団の投与前に患者に投与されない。多くの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作された初代細胞の集団の第１及び／または第２の投与前に患者に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制及び／または免疫調節剤は、細胞の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日またはそれ以上前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の第１及び／または第２の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間前、またはそれよりも前に投与される。特定の実施形態では、免疫抑制及び／または免疫調節剤は、細胞の投与から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日後、またはそれよりも後に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の第１及び／または第２の投与から少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間後、またはそれよりも後に投与される。

【0739】

免疫抑制剤及び／または免疫調節剤が細胞の投与前または後に患者に投与されるいくつかの実施形態では、投与は、免疫原性細胞、例えば、同じもしくは類似の細胞種または表現型を含むが、例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を有し、ＣＤ４７の外因性発現を有さない、操作された初代細胞の改変、例えば、遺伝的改変を含有しない細胞集団に必要とされるであろう用量よりも低い用量である。

【0740】

ＶＩ．例となる実施形態
以下の例となる実施形態が本明細書で提供される。

【0741】

実施形態１．（ｉ）１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させる、ならびに（ｉｉ）１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる、改変を含む、操作された初代細胞であって、（ｉ）の発現の増加及び（ｉｉ）の発現の低減は、前記改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較したものである、前記操作された初代細胞。

【0742】

実施形態２．（ｉｉ）の改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる、実施形態１に記載の操作された初代細胞。

【0743】

実施形態３．（ｉｉ）の改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる、実施形態１に記載の操作された初代細胞。

【0744】

実施形態４．前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１～３のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0745】

実施形態５．前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態４に記載の操作された初代細胞。

【0746】

実施形態６．前記１つ以上の免疫寛容原性因子の少なくとも１つは、ＣＤ４７である、実施形態４に記載の操作された初代細胞。

【0747】

実施形態７．（ｉ）ＣＤ４７の発現を増加させる、ならびに（ｉｉ）１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる、改変を含む、操作された初代細胞であって、（ｉ）の発現の増加及び（ｉｉ）の発現の低減は、前記改変を含まない同じ細胞種の細胞と比較したものである、前記操作された初代細胞。

【0748】

実施形態８．発現を増加させる前記改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる前記改変は、表面発現の低減を含む、実施形態１～７のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0749】

実施形態９．ＣＤ４７の発現を増加させる前記改変は、ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態６～８のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0750】

実施形態１０．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、前記操作された初代細胞の自然免疫による殺傷を低減させる、実施形態９に記載の操作された初代細胞。

【0751】

実施形態１１．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の配列をコードする、実施形態１０に記載の操作された初代細胞。

【0752】

実施形態１２．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態７～１１のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0753】

実施形態１３．前記プロモーターは構成的プロモーターである、実施形態１２に記載の操作された初代細胞。

【0754】

実施形態１４．前記プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからなる群から選択される、実施形態１２または１３に記載の操作された初代細胞。

【0755】

実施形態１５．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、前記操作された初代細胞のゲノム内に組み込まれる、実施形態４～１４のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0756】

実施形態１６．前記外因性ポリヌクレオチドは、ＣＤ４７をコードするマルチシストロン性ベクター、及び第２の導入遺伝子をコードする追加の導入遺伝子である、実施形態１５に記載の方法。

【0757】

実施形態１７．前記組込みは、前記操作された初代細胞のゲノム内への非標的挿入により、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した前記細胞内への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によるものである、実施形態１５に記載の操作された初代細胞。

【0758】

実施形態１８．前記組込みは、前記細胞の標的ゲノム遺伝子座への標的挿入によるものである、実施形態１５に記載の操作された初代細胞。

【0759】

実施形態１９．前記標的ゲノム遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座である、実施形態１８に記載の方法。

【0760】

実施形態２０．前記標的ゲノム遺伝子座は、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（別名、ＡＡＶＳ１）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及びＲＯＳＡ２６遺伝子座からなる群から選択される、実施形態１９に記載の方法。

【0761】

実施形態２１．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる、実施形態１～２０のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0762】

実施形態２２．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、Ｂ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減させる改変である、実施形態１～２１のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0763】

実施形態２３．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現の低減を含む、実施形態２２に記載の操作された初代細胞。

【0764】

実施形態２４．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の低減を含む、実施形態２２に記載の操作された初代細胞。

【0765】

実施形態２５．前記改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する、実施形態２２～２４のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0766】

実施形態２６．前記改変は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む、実施形態２２～２５のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0767】

実施形態２７．前記改変は、前記細胞におけるすべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態２２～２６のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0768】

実施形態２８．前記不活性化または前記破壊は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子中のインデルを含む、実施形態２６または実施形態２７に記載の操作された初代細胞。

【0769】

実施形態２９．前記改変は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である、実施形態２２～２８のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0770】

実施形態３０．前記Ｂ２Ｍ遺伝子はノックアウトされている、実施形態２２～２９のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0771】

実施形態３１．前記改変は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである、実施形態２２～３０のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0772】

実施形態３２．前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、前記ＣａｓはＣａｓ９である、実施形態３１に記載の操作された初代細胞。

【0773】

実施形態３３．前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態３２に記載の操作された初代細胞。

【0774】

実施形態３４．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態３３に記載の操作された初代細胞。

【0775】

実施形態３５．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質またはＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を低減させる改変であり、任意選択で、前記ＨＬＡ－Ａタンパク質、前記ＨＬＡ－Ｂタンパク質または前記ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコードする遺伝子は、ノックアウトされている、実施形態２１に記載の操作された初代細胞。

【0776】

実施形態３６．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる、実施形態１～３５のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0777】

実施形態３７．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＣＩＩＴＡの発現を低減させる改変である、実施形態１～３６のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0778】

実施形態３８．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現の低減を含む、実施形態３７に記載の操作された初代細胞。

【0779】

実施形態３９．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の低減を含む、実施形態３７に記載の操作された初代細胞。

【0780】

実施形態４０．前記改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性を排除する、実施形態３７～３９のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0781】

実施形態４１．前記改変は、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む、実施形態３７～４０のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0782】

実施形態４２．前記改変は、前記細胞におけるすべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態３７～４１のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0783】

実施形態４３．前記不活性化または前記破壊は、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子中のインデルを含む、実施形態４１または実施形態４２に記載の操作された初代細胞。

【0784】

実施形態４４．前記インデルは、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である、実施形態３７～４３のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0785】

実施形態４５．ＣＩＩＴＡ遺伝子はノックアウトされている、実施形態３７～４４のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0786】

実施形態４６．前記改変は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである、実施形態３７～４５のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0787】

実施形態４７．前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、前記ＣａｓはＣａｓ９である、実施形態４６に記載の操作された初代細胞。

【0788】

実施形態４８．前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態４６または実施形態４７に記載の操作された初代細胞。

【0789】

実施形態４９．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態４８に記載の操作された初代細胞。

【0790】

実施形態５０．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記改変は、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質またはＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現を低減させる改変であり、任意選択で、前記ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、前記ＨＬＡ－ＤＲタンパク質または前記ＨＬＡ－ＤＱタンパク質をコードする遺伝子は、ノックアウトされている、実施形態３６に記載の操作された初代細胞。

【0791】

実施形態５１．前記操作された初代細胞は、ヒト細胞または動物細胞である、実施形態１～５０のいずれか１つに記載の操作された初代細胞。

【0792】

実施形態５２．前記操作された初代細胞は、ヒト細胞である、実施形態５１に記載の操作された初代細胞。

【0793】

実施形態５３．前記初代細胞は、血液に曝露される細胞種である、実施形態１～５２のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0794】

実施形態５４．前記操作された初代細胞は、ドナー対象から単離された初代細胞である、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の操作された初代細胞。

【0795】

実施形態５５．前記ドナー試料が前記ドナー対象から得られる時点で、前記ドナー対象は健康であるか、または疾患または状態を有する疑いがない、実施形態５４に記載の操作された初代細胞。

【0796】

実施形態５６．前記操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞から選択される、実施形態１～５５のいずれか１つに記載の操作された初代細胞。

【0797】

実施形態５７．前記操作された初代細胞は、内皮細胞である、実施形態１～５６のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0798】

実施形態５８．前記操作された初代細胞は、上皮細胞である、実施形態１～５６のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0799】

実施形態５９．前記操作された初代細胞は、Ｔ細胞である、実施形態１～５６のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0800】

実施形態６０．前記操作された初代細胞は、ＮＫ細胞である、実施形態１～５６のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0801】

実施形態６１．前記操作された初代細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、実施形態５９または実施形態６０に記載の操作された初代細胞。

【0802】

実施形態６２．前記操作された初代細胞は、膵島細胞である、実施形態１～５２のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0803】

実施形態６３．前記膵島細胞は、β膵島細胞である、実施形態６２に記載の操作された初代細胞。

【0804】

実施形態６４．前記操作された初代細胞は、肝細胞である、実施形態１～５２のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0805】

実施形態６５．前記操作された初代細胞は、ＡＢＯ式血液型Ｏ型である、実施形態１～６４のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0806】

実施形態６６．前記操作された初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である、実施形態１～６５のいずれかに記載の操作された初代細胞。

【0807】

実施形態６７．操作された初代細胞を生成する方法であって、前記方法は、
ａ）初代細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することと、
ｂ）前記初代細胞における１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させることと、を含む、前記方法。

【0808】

実施形態６８．前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態６７のいずれかに記載の方法。

【0809】

実施形態６９．前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態６８に記載の方法。

【0810】

実施形態７０．前記１つ以上の免疫寛容原性因子の少なくとも１つは、ＣＤ４７である、実施形態６９に記載の方法。

【0811】

実施形態７１．前記方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減または排除することを含む、実施形態６７～７０のいずれかに記載の方法。

【0812】

実施形態７２．前記方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することを含む、実施形態６７～７１のいずれかに記載の方法。

【0813】

実施形態７３．操作された初代細胞を生成する方法であって、前記方法は、
ａ．前記細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することと、
ｂ．前記細胞におけるＣＤ４７の発現を増加させることと、を含む、前記方法。

【0814】

実施形態７４．前記方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減または排除することを含む、実施形態７３に記載の方法。

【0815】

実施形態７５．前記方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することを含む、実施形態７３に記載の方法。

【0816】

実施形態７６．発現を増加させる前記改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低減させる前記改変は、表面発現の低減を含む、実施形態６７～７５のいずれかに記載の方法。

【0817】

実施形態７７．ＣＤ４７の発現を増加させる前記改変は、ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態７０～７５のいずれかに記載の方法。

【0818】

実施形態７８．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、前記操作された初代細胞の自然免疫による殺傷を低減させる、実施形態７７のいずれかに記載の方法。

【0819】

実施形態７９．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の配列をコードする、実施形態７８に記載の方法。

【0820】

実施形態８０．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態７７～７９のいずれかに記載の方法。

【0821】

実施形態８１．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、前記操作された初代細胞のゲノム内に組み込まれる、実施形態７７～８０のいずれかに記載の方法。

【0822】

実施形態８２．前記組込みは、前記操作された初代細胞のゲノム内への非標的挿入により、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した前記操作された初代細胞内への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によるものである、実施形態８１に記載の方法。

【0823】

実施形態８３．前記組込みは、前記細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によるものであり、任意選択で、前記標的挿入は、相同指向性修復を伴うヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである、実施形態８１に記載の方法。

【0824】

実施形態８４．前記標的ゲノム遺伝子座は、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座である、実施形態８３に記載の方法。

【0825】

実施形態８５．前記標的ゲノム遺伝子座は、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（別名、ＡＡＶＳ１）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及びＲＯＳＡ２６遺伝子座からなる群から選択される、実施形態８４に記載の方法。

【0826】

実施形態８６．前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、前記標的ゲノム遺伝子座を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、前記ＣａｓはＣａｓ９である、実施形態８３～８５のいずれかに記載の方法。

【0827】

実施形態８７．前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記標的ゲノム遺伝子座の標的配列に相補的なターゲティングドメインと、ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドを含む相同指向修復鋳型と、を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態８６に記載の方法。

【0828】

実施形態８８．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態８７に記載の方法。

【0829】

実施形態８９．前記操作された初代細胞は、低免疫原性初代細胞である、実施形態６７～８８のいずれかに記載の方法。

【0830】

実施形態９０．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減または排除することは、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変を導入することを含む、実施形態６７～８９のいずれかに記載の方法。

【0831】

実施形態９１．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる前記改変は、Ｂ２Ｍの発現の低減を含む、実施形態６７～９０のいずれかに記載の方法。

【0832】

実施形態９２．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる前記改変は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の低減を含む、実施形態６７～９１のいずれかに記載の方法。

【0833】

実施形態９３．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる前記改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する、実施形態９１または実施形態９２に記載の方法。

【0834】

実施形態９４．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させる前記改変は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む、実施形態６７～９３のいずれかに記載の方法。

【0835】

実施形態９５．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる前記改変は、前記細胞におけるすべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態６７～９４のいずれかに記載の方法。

【0836】

実施形態９６．前記不活性化または前記破壊は、前記内因性Ｂ２Ｍ遺伝子中のインデル、または前記内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失を含む、実施形態８７または実施形態８８に記載の方法。

【0837】

実施形態９７．前記インデルは、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である、実施形態８９に記載の方法。

【0838】

実施形態９８．前記内因性Ｂ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされている、実施形態８４～９０のいずれかに記載の方法。

【0839】

実施形態９９．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低減させる前記改変は、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである、実施形態８４～９１のいずれかに記載の方法。

【0840】

実施形態１００．前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意選択で、前記ＣａｓはＣａｓ９である、実施形態９２に記載の方法。

【0841】

実施形態１０１．前記ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態１００に記載の方法。

【0842】

実施形態１０２．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態１０１に記載の方法。

【0843】

実施形態１０３．１つ以上のＭＨＣクラスＩの発現を低減させる前記改変は、ＨＬＡ－Ａタンパク質発現、ＨＬＡ－Ｂタンパク質発現、またはＨＬＡ－Ｃタンパク質発現を低減させ、任意選択で、前記タンパク質発現は、前記ＨＬＡ－Ａタンパク質、前記ＨＬＡ－Ｂタンパク質または前記ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって低減される、実施形態６６～１０２に記載の方法。

【0844】

実施形態１０４．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減または排除することは、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる改変を導入することを含む、実施形態６７～１０３のいずれかに記載の方法。

【0845】

実施形態１０５．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる前記遺伝子改変は、ＣＩＩＴＡの発現の低減を含む、実施形態６７～１０４のいずれかに記載の方法。

【0846】

実施形態１０６．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる前記遺伝子改変は、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の低減を含む、実施形態６７～１０５のいずれかに記載の方法。

【0847】

実施形態１０７．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる前記改変は、ＣＩＩＴＡを排除する、実施形態１０４または実施形態１０５に記載の方法。

【0848】

実施形態１０８．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低減させる前記改変は、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を含む、実施形態６７～１０７のいずれかに記載の方法。

【0849】

実施形態１０９．前記改変は、前記細胞におけるすべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態６７～１０８のいずれかに記載の方法。

【0850】

実施形態１１０．前記不活性化または前記破壊は、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子中のインデル、または前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡの欠失を含む、実施形態１０８または実施形態１０９に記載の方法。

【0851】

実施形態１１１．前記インデルは、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の連続した一続きのゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または欠失である、実施形態１１０に記載の方法。

【0852】

実施形態１１２．前記ＣＩＩＴＡ遺伝子は、ノックアウトされている、実施形態６７～１１１のいずれかに記載の方法。

【0853】

実施形態１１３．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させる前記遺伝子改変は、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質またはＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現を低減させ、任意選択で、前記ＨＬＡ－ＤＰタンパク質発現、前記ＨＬＡ－ＤＲタンパク質発現または前記ＨＬＡ－ＤＱタンパク質発現は、前記ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、前記ＨＬＡ－ＤＲタンパク質または前記ＨＬＡ－ＤＱタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって低減される、実施形態６７に記載の方法。

【0854】

実施形態１１４．前記操作された初代細胞は、ヒト細胞または動物細胞である、実施形態６７～１１３のいずれかに記載の方法。

【0855】

実施形態１１５．前記操作された初代細胞は、ヒト細胞である、実施形態６７～１１４のいずれかに記載の方法。

【0856】

実施形態１１６．前記操作された初代細胞は、血液に曝露される細胞種である、実施形態６７～１１５のいずれかに記載の方法。

【0857】

実施形態１１７．前記操作された初代細胞は、ドナー対象から単離されている、実施形態６７～１１５のいずれかに記載の方法。

【0858】

実施形態１１８．前記操作された初代細胞は、膵島細胞、β膵島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞から選択される、実施形態６７～１１５のいずれかに記載の方法。

【0859】

実施形態１１９．前記操作された初代細胞は、膵島細胞である、実施形態６７～１１５のいずれかに記載の方法。

【0860】

実施形態２００．工程ａ）の前に、前記初代膵島細胞は、初代膵島クラスターから解離されている、実施形態１１９に記載の方法。

【0861】

実施形態２０１．前記初代膵島クラスターは、ヒト初代死体膵島クラスターである、実施形態２００に記載の方法。

【0862】

実施形態２０２．工程ａ）の後及び／または工程ｂ）の後、前記初代膵島細胞は、改変された初代膵島クラスターへの再クラスター化のための条件下でインキュベートされ、前記インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される、実施形態２００または実施形態２０１に記載の方法。

【0863】

実施形態２０３．前記インキュベートすることは、静的条件下でインキュベートすることの少なくとも一部を更に含む、実施形態２０２に記載の方法。

【0864】

実施形態２０４．前記インキュベートすることは、静的条件下での第１のインキュベートと、それに続く動きを伴うインキュベートすることと、を含む、実施形態２０２または実施形態２０３に記載の方法。

【0865】

実施形態２０５．前記インキュベートすることは、動きを伴うインキュベートすることと、それに続く静的条件下での第２のインキュベートと、を含む、実施形態２０２または実施形態２０３に記載の方法。

【0866】

実施形態２０６．再クラスター化のための条件下で前記インキュベートする前に、前記方法は、改変された膵島細胞を選択することを含む、実施形態２０２～２０５のいずれかに記載の方法。

【0867】

実施形態２０７．前記選択することは、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によるものである、実施形態２０６に記載の方法。

【0868】

実施形態２０８．前記方法は、
ｉ）初代膵島クラスターを初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、
ｉｉ）前記懸濁液の初代β膵島細胞を改変し、初代β膵島細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡの発現を低減または排除することと、
ｉｉｉ）前記改変された初代β膵島細胞を、第１の改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、前記インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される、前記インキュベートすることと、
ｉｖ）前記改変された初代膵島クラスターを改変された初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、
ｖ）前記懸濁液中の前記改変された初代膵島細胞を更に改変し、前記初代細胞の１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させることと、
ｖｉ）前記更に改変された初代β膵島細胞を、第２の改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、前記インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される、前記インキュベートすることと、を含む、実施形態１１９～２０７のいずれかに記載の方法。

【0869】

実施形態２０９．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ ＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質、またはＨＬＡ－Ｃタンパク質である、実施形態６６または２０８に記載の方法。

【0870】

実施形態２１０．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡは、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質またはＨＬＡ－ＤＱタンパク質である、実施形態６６、２０８または２０９に記載の方法。

【0871】

実施形態２１１．前記改変することは、遺伝子工学によるものである、実施形態２０８～２１０のいずれかに記載の方法。

【0872】

実施形態２１２．前記動きは、振盪である、実施形態２０８～２１１のいずれかに記載の方法。

【0873】

実施形態２１３．前記振盪は、軌道運動を含む、実施形態２１２に記載の方法。

【0874】

実施形態２１４．前記振盪は、双方向の直線運動を含む、実施形態２１２に記載の方法。

【0875】

実施形態２１５．前記振盪は、オービタルシェーカーによるものである、実施形態２１２または実施形態２１３に記載の方法。

【0876】

実施形態２１６．（ｉｉｉ）のインキュベートすること及び／またはｖｉ）のインキュベートすることは、静的条件下でインキュベートすることの少なくとも一部を更に含む、実施形態２０２～２１５に記載の方法。

【0877】

実施形態２１７．ｉｉｉ）のインキュベートすること及び／またはｖｉ）のインキュベートすることは、静的条件下での第１のインキュベートと、それに続く動きを伴うインキュベートすることと、を含む、実施形態２０２～２１６のいずれかに記載の方法。

【0878】

実施形態２１８．前記インキュベートすることは、動きを伴うインキュベートすることと、それに続く静的条件下での第２のインキュベートと、を含む、実施形態２０２～２１６のいずれかに記載の方法。

【0879】

実施形態２１９．ｖ）の前に、前記方法は、ｉｖ）で前記解離させた膵島細胞から、改変されたβ膵島細胞を選択することと、任意選択で、前記選択された膵島細胞に対して工程ｉｉｉ）及び工程ｉｖ）を繰り返すことと、を含む、実施形態２０８～２１８のいずれかに記載の方法。

【0880】

実施形態２２０．ｖｉ）のインキュベートすることの後に、前記方法は、前記第２の改変された初代膵島クラスターを改変された初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、改変された膵島細胞を選択することと、を含む、実施形態２０８～２１８のいずれかに記載の方法。

【0881】

実施形態２２１．前記選択された改変初代β膵島細胞を、改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、前記インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される、実施形態２２０に記載の方法。

【0882】

実施形態２２２．初代膵島細胞を遺伝子編集するための方法であって、前記方法は、
ｉ）初代膵島クラスターを初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、
ｉｉ）前記懸濁液の初代β膵島細胞を改変することと、
ｉｉｉ）前記改変された初代β膵島細胞を、前記改変された初代β膵島細胞を膵島に再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、前記インキュベートすることの少なくとも一部は、振盪しながら実行される、前記インキュベートすることと、を含む、前記方法。

【0883】

実施形態２２３．前記初代膵島クラスターは、ヒト初代死体膵島クラスターである、実施形態２２２に記載の方法。

【0884】

実施形態２２４．前記改変することは、前記細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させるため、または前記細胞における１つ以上の異種タンパク質の発現を増加させるために、前記細胞内に１つ以上の改変を導入することを含む、実施形態２２２または実施形態２２３に記載の方法。

【0885】

実施形態２２５．（ｉｉｉ）のインキュベートすること及び／またはｖｉ）のインキュベートすることは、静的条件下でインキュベートすることの少なくとも一部を更に含む、実施形態２２２～２２４に記載の方法。

【0886】

実施形態２２６．前記インキュベートすることは、静的条件下での第１のインキュベートと、それに続く動きを伴うインキュベートすることと、を含む、実施形態２２２～２２５のいずれかに記載の方法。

【0887】

実施形態２２７．前記インキュベートすることは、動きを伴うインキュベートすることと、それに続く静的条件下での第２のインキュベートと、を含む、実施形態２２２～２２５のいずれかに記載の方法。

【0888】

実施形態２２８．工程ｉ）～ｉｉｉ）は、繰り返される、実施形態２２２～２２７のいずれかに記載の方法。

【0889】

実施形態２２９．前記方法の第１の反復における改変することは、前記方法の繰り返される反復における改変することとは異なる、実施形態２２８に記載の方法。

【0890】

実施形態２３０．前記再クラスター化膵島細胞は、第１の改変された初代膵島クラスターであり、前記方法は更に、
ｉｖ）前記第１の改変された初代膵島クラスターを改変された初代β膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、
ｖ）前記懸濁液の前記改変された初代膵島細胞を更に改変することと、
ｖｉ）前記更に改変された初代β膵島細胞を、第２の改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、前記インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される、前記インキュベートすることと、を含む、実施形態２２２～２２４のいずれかに記載の方法。

【0891】

実施形態２３１．ｉｉｉ）のインキュベートすることの前に、前記方法は、改変された膵島細胞を選択することを含む、実施形態２２２～２３０のいずれかに記載の方法。

【0892】

実施形態２３２．ｖ）の前に、前記方法は、ｉｖ）で前記解離させた膵島細胞から、改変されたβ膵島細胞を選択することと、任意選択で、前記選択された膵島細胞に対して工程ｉｉｉ）及び工程ｉｖ）を繰り返すことと、を含む、実施形態２３０または実施形態２３１に記載の方法。

【0893】

実施形態２３３．ｖｉ）のインキュベートすることの後に、前記方法は、前記第２の改変された初代膵島クラスターを改変された初代膵島細胞の懸濁液へと解離させることと、改変された膵島細胞を選択することと、を含む、実施形態２２２、２２６または２２７に記載の方法。

【0894】

実施形態２３４．前記懸濁液は、単一細胞懸濁液である、実施形態２０８～２３３のいずれかに記載の方法。

【0895】

実施形態２３５．前記選択された改変初代β膵島細胞を、改変された初代膵島クラスターに再クラスター化するための条件下でインキュベートすることであって、前記インキュベートすることの少なくとも一部は、動きを伴って実行される、実施形態２３２～２３４のいずれかに記載の方法。

【0896】

実施形態２３６．前記動きは、振盪である、実施形態２２２～２３５のいずれかに記載の方法。

【0897】

実施形態２３７．前記振盪は、軌道運動を含む、実施形態２３６に記載の方法。

【0898】

実施形態２３８．前記振盪は、双方向の直線運動を含む、実施形態２３６に記載の方法。

【0899】

実施形態２３９．前記振盪は、オービタルシェーカーによるものである、実施形態２３６または実施形態２３７に記載の方法。

【0900】

実施形態２４０．前記選択することは、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む、実施形態２３１～２３９のいずれかに記載の方法。

【0901】

実施形態２４１．前記第１の改変することまたは前記更なる改変することの一方は、前記細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させることを含み、前記第１の改変することまたは前記更なる改変することのうちの他方は、前記細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させることを含む、実施形態２３０～２４０のいずれかに記載の方法。

【0902】

実施形態２４２．前記第１の改変することは、前記細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させることを含み、前記更なる改変することは、前記細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させることを含む、実施形態２３０～２４０のいずれかに記載の方法。

【0903】

実施形態２４３．前記第１の改変することは、１つ以上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させることを含む、実施形態２３０～２４２のいずれかに記載の方法。

【0904】

実施形態２４４．前記改変することは、遺伝子工学である、実施形態２０８～２４３のいずれかに記載の方法。

【0905】

実施形態２４５．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ ＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質、またはＨＬＡ－Ｃタンパク質である、実施形態２３０～２４４のいずれかに記載の方法。

【0906】

実施形態２４６．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡは、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質またはＨＬＡ－ＤＱタンパク質である、実施形態２３０～２４５のいずれかに記載の方法。

【0907】

実施形態２４７．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減させることは、Ｂ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減させることによるものである、実施形態２４３～２４６のいずれかに記載の方法。

【0908】

実施形態２４８．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減させることは、ＣＩＩＴＡの発現を低減させることによるものである、実施形態２４３～２４７のいずれかに記載の方法。

【0909】

実施形態２４９．前記更なる改変することは、前記細胞における１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させることを含む、実施形態２３０～２４８のいずれかに記載の方法。

【0910】

実施形態２５０．前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌ－阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態２４９に記載の方法。

【0911】

実施形態２５１．前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態２５０に記載の方法。

【0912】

実施形態２５２．前記１つ以上の免疫寛容原性因子の少なくとも１つは、ＣＤ４７である、実施形態２５１に記載の方法。

【0913】

実施形態２５３．前記細胞における内因性タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を低減させることは、遺伝子編集システムを前記細胞内に導入することによるものである、実施形態２２４～２５２のいずれかに記載の方法。

【0914】

実施形態２５４．前記遺伝子編集システムは、配列特異的ヌクレアーゼを含む、実施形態２５３に記載の方法。

【0915】

実施形態２５５．前記配列特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）からなる群から選択される、実施形態２５４に記載の方法。

【0916】

実施形態２５６．前記遺伝子編集システムは、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼを含む、実施形態２５５に記載の方法。

【0917】

実施形態２５７．前記ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む、実施形態２５５に記載の方法。

【0918】

実施形態２５８．前記ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、ＩＩ型またはＶ型Ｃａｓタンパク質である、実施形態２５６または実施形態２５７に記載の方法。

【0919】

実施形態２５９．前記ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ホモログまたはＣｐｆ１ホモログである、実施形態２５６、２５７または２５８に記載の方法。

【0920】

実施形態２６０．前記細胞における１つ以上の外因性タンパク質の発現を増加させることは、外因性ポリヌクレオチドを導入することによるものである、実施形態２２４～２５９のいずれかに記載の方法。

【0921】

実施形態２６１．前記外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態２６０に記載の方法。

【0922】

実施形態２６２．前記プロモーターは、構成的プロモーターである、実施形態２６１に記載の方法。

【0923】

実施形態２６３．前記プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからなる群から選択される、実施形態２６１または実施形態２６２に記載の方法。

【0924】

実施形態２６４．前記外因性ポリヌクレオチドは、前記細胞のゲノム内に組み込まれる、実施形態２２４～２５９のいずれかに記載の方法。

【0925】

実施形態２６５．前記外因性ポリヌクレオチドは、マルチシストロン性ベクターである、実施形態２６４に記載の方法。

【0926】

実施形態２６６．前記組込みは、前記細胞のゲノム内への非標的挿入により、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した前記細胞内への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によるものである、実施形態２６４に記載の方法。

【0927】

実施形態２６７．前記組込みは、前記細胞の標的ゲノム遺伝子座への標的挿入によるものである、実施形態２６４に記載の方法。

【0928】

実施形態２６８．前記膵島細胞は、β膵島細胞である、実施形態１１９～２６７のいずれかに記載の方法。

【0929】

実施形態２６９．前記操作された初代細胞は、肝細胞である、実施形態６７～１１５のいずれかに記載の方法。

【0930】

実施形態２７０．前記操作された初代細胞は、Ｔ細胞である、実施形態６７～１１５のいずれかに記載の方法。

【0931】

実施形態２７１．前記操作された初代細胞は、内皮細胞である、実施形態６７～１１５のいずれかに記載の方法。

【0932】

実施形態２７２．前記操作された初代細胞は、甲状腺細胞である、実施形態６７～１１５のいずれかに記載の方法。

【0933】

実施形態２７３．前記操作された初代細胞は、皮膚細胞である、実施形態６７～１１５のいずれかに記載の方法。

【0934】

実施形態２７４．前記操作された初代細胞は、網膜色素上皮細胞である、実施形態６７～１１５のいずれかに記載の方法。

【0935】

実施形態２７５．実施形態６７～２７４のいずれかに記載の方法に従って作製される、操作された初代細胞。

【0936】

実施形態２７６．前記初代細胞は、膵島細胞である、実施形態２７５に記載の操作された初代細胞。

【0937】

実施形態２７７．前記膵島細胞は、β膵島細胞である、実施形態２７６に記載の操作された初代細胞。

【0938】

実施形態２７８．前記操作された初代細胞は、レシピエント患者への投与時に、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を回避することができる、実施形態１～６６及び２７５～２７７のいずれか１つに記載の操作された初代細胞。

【0939】

実施形態２７９．前記操作された初代細胞は、レシピエント患者への投与時に、成熟ＮＫ細胞による細胞溶解から保護される、実施形態１～６６及び２７５～２７８のいずれか１つに記載の操作された初代細胞。

【0940】

実施形態２８０．前記操作された初代細胞は、レシピエント患者への投与時に、前記細胞に対する免疫応答を誘導しない、実施形態１～６６及び２７５～２７９のいずれか１つに記載の操作された初代細胞。

【0941】

実施形態２８１．前記操作された初代細胞は、レシピエント患者への投与時に、前記細胞に対する全身性炎症反応を誘導しない、実施形態１～６６及び２７５～２８０のいずれか１つに記載の操作された初代細胞。

【0942】

実施形態２８２．前記操作された初代細胞は、レシピエント患者への投与時に、前記細胞に対する局所炎症反応を誘導しない、実施形態１～６６及び２７５～２８１のいずれか１つに記載の操作された初代細胞。

【0943】

実施形態２８３．実施形態１～６６及び２７５～２８２のいずれかに記載の複数の操作された初代細胞を含む、操作された初代細胞の集団。

【0944】

実施形態２８４．前記複数の操作された初代細胞は、複数のドナー対象からプールされた細胞に由来する、実施形態２８３に記載の操作された初代細胞の集団。

【0945】

実施形態２８５．前記複数のドナー対象のそれぞれは、前記ドナー試料が前記ドナー対象から得られる時点で、健康な対象であるか、または疾患もしくは状態を有する疑いがない、実施形態２８４に記載の操作された初代細胞の集団。

【0946】

実施形態２８６．前記集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、前記改変を含む、実施形態２８３～２８５のいずれかに記載の集団。

【0947】

実施形態２８７．前記集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態２８３～２８６のいずれかに記載の集団。

【0948】

実施形態２８８．前記集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、前記改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減を含む、実施形態１３６または実施形態１３７に記載の集団。

【0949】

実施形態２８９．前記集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、前記改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、Ｂ２Ｍ及び／またはＣＩＩＴＡの発現の低減を含む、実施形態２８３～２８８のいずれかに記載の集団。

【0950】

実施形態２９０．前記集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、前記改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、Ｂ２Ｍの発現の低減を含む、実施形態２８３～２８９のいずれかに記載の集団。

【0951】

実施形態２９１．前記集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、前記改変（複数可）を含まない同じ細胞種の細胞と比較して、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減を含む、実施形態２８３～２９０のいずれかに記載の集団。

【0952】

実施形態２９２．前記集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する、１つ以上の変化を含む、実施形態２８３～２９１のいずれかに記載の集団。

【0953】

実施形態２９３．前記集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または９９．９９％は、内因性ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する、１つ以上の変化を含む、実施形態２８３～２９２のいずれかに記載の集団。

【0954】

実施形態２９４．実施形態２８３～２９３のいずれかに記載の集団を含む、組成物。

【0955】

実施形態２９５．実施形態１１９～２６８のいずれかに記載の方法によって作製される、操作された初代膵島クラスターを含む組成物。

【0956】

実施形態２９６．操作された初代膵島細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代膵島細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む、前記組成物。

【0957】

実施形態２９７．前記操作された初代膵島細胞の集団は、初代膵島細胞のクラスターである、実施形態２９６に記載の組成物。

【0958】

実施形態２９８．前記操作された初代膵島細胞の集団は、操作された初代β膵島細胞の集団である、実施形態２９６に記載の組成物。

【0959】

実施形態２９９．操作された初代Ｔ細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代Ｔ細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む、前記組成物。

【0960】

実施形態３００．操作された初代甲状腺細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代甲状腺細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む、前記組成物。

【0961】

実施形態３０１．操作された初代皮膚細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代皮膚細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む、前記組成物。

【0962】

実施形態３０２．操作された初代内皮細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代内皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む、前記組成物。

【0963】

実施形態３０３．操作された初代網膜色素上皮細胞の集団を含む組成物であって、前記操作された初代網膜色素上皮細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子と、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊と、を含む、前記組成物。

【0964】

実施形態３０４．前記操作された初代細胞の集団の操作された初代細胞は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両方の対立遺伝子にインデルを含む、実施形態２９４～３０３のいずれかに記載の組成物。

【0965】

実施形態３０５．前記操作された初代細胞の集団の前記操作された初代細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子の不活性化または破壊を更に含む、実施形態２９４～３０４のいずれかに記載の組成物。

【0966】

実施形態３０６．前記操作された初代細胞の集団の操作された初代細胞は、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両方の対立遺伝子にインデルを含む、実施形態２９４～３０５のいずれかに記載の組成物。

【0967】

実施形態３０７．前記操作された初代細胞の集団の前記操作された初代細胞は、表現型Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}；ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}；ＣＤ４７ｔｇを有する、実施形態２９４～３０６のいずれかに記載の組成物。

【0968】

実施形態３０８．前記組成物は、医薬組成物である、実施形態２９４～３０７のいずれかに記載の組成物。

【0969】

実施形態３０９．医薬的に許容される賦形剤を含む、実施形態２９４～３０８のいずれかに記載の組成物。

【0970】

実施形態３１０．前記組成物は、凍結保護物質を含む、無血清凍結保存培地中で調製される、実施形態２９４～３０９のいずれかに記載の組成物。

【0971】

実施形態３１１．前記凍結保護物質はＤＭＳＯであり、前記凍結保存培地は５％～１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である、実施形態３０９に記載の組成物。

【0972】

実施形態３１２．前記凍結保護物質は、１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）であるか、または約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である、実施形態３０８及び実施形態３０９に記載の組成物。

【0973】

実施形態３１３．滅菌である、実施形態２９４～３１２のいずれかに記載の組成物。

【0974】

実施形態３１４．実施形態２９４～３１３のいずれかに記載の組成物を含む、容器。

【0975】

実施形態３１５．滅菌バッグである、実施形態３１４に記載の容器。

【0976】

実施形態３１６．前記バッグは、凍結保存適合バッグである、実施形態３１５に記載の滅菌バッグ。

【0977】

実施形態３１７．有効量の実施形態２８３～２９３のいずれかに記載の集団、実施形態２９４～３０７のいずれかに記載の組成物、または実施形態３０８に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、その必要がある患者において疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法。

【0978】

実施形態３１８．前記集団は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として調製される、３１７に記載の方法

【0979】

実施形態３１９．前記細胞集団は、β膵島細胞を含む、膵島細胞を含む、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【0980】

実施形態３２０．前記膵島細胞の集団は、膵島細胞のクラスターとして投与される、実施形態３１７～３１９のいずれか１つに記載の方法。

【0981】

実施形態３２１．前記膵島細胞の集団は、β膵島細胞のクラスターとして投与される、実施形態３１７～３２０のいずれか１つに記載の方法。

【0982】

実施形態３２２．前記細胞集団は、肝細胞である、実施形態３１７～３２０のいずれかに記載の方法。

【0983】

実施形態３２３．前記細胞集団は、Ｔ細胞を含む、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【0984】

実施形態３２４．前記細胞集団は、甲状腺細胞を含む、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【0985】

実施形態３２５．前記細胞集団は、皮膚細胞を含む、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【0986】

実施形態３２６．前記細胞集団は、内皮細胞を含む、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【0987】

実施形態３２７．前記細胞集団は、網膜色素上皮細胞を含む、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【0988】

実施形態３２８．前記状態または前記疾患は、糖尿病、がん、血管新生障害、眼疾患、甲状腺疾患、皮膚疾患、及び肝臓疾患からなる群から選択される、実施形態３１７～３２７に記載の方法。

【0989】

実施形態３２９．前記細胞欠損症は糖尿病に関連するか、または前記細胞療法は糖尿病の治療のためのものであり、任意選択で、前記糖尿病はＩ型糖尿病である、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【0990】

実施形態３３０．前記細胞集団は、β膵島細胞を含む膵島細胞の集団である、実施形態３２９に記載の方法。

【0991】

実施形態３３１．前記細胞集団は、膵島細胞のクラスターとして投与される、実施形態３３０に記載の方法。

【0992】

実施形態３３２．その必要がある患者において糖尿病を治療する方法であって、前記方法は、有効量の実施形態２８３～２９３のいずれかに記載の膵島細胞の集団、実施形態２９４～３０７のいずれかに記載の組成物、または実施形態３０８に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、前記方法。

【0993】

実施形態３３３．前記膵島細胞のクラスターは、β膵島細胞のクラスターである、実施形態３３０～３３１のいずれかに記載の方法。

【0994】

実施形態３３４．前記細胞欠損症は、血管状態もしくは疾患に関連するか、または前記細胞療法は、血管状態もしくは疾患の治療のためのものである、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【0995】

実施形態３３５．前記細胞集団は、内皮細胞の集団である、実施形態３３４に記載の方法。

【0996】

実施形態３３６．前記細胞欠損症は、自己免疫性甲状腺炎に関連するか、または前記細胞療法は、自己免疫性甲状腺炎の治療のためのものである、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【0997】

実施形態３３７．前記細胞欠損症は、肝臓疾患に関連するか、または前記細胞療法は、肝臓疾患の治療のためのものである、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【0998】

実施形態３３８．前記肝臓疾患は、肝硬変を含む、実施形態３３７に記載の方法。

【0999】

実施形態３３９．前記細胞集団は、肝細胞の集団である、実施形態３３７または実施形態３３８に記載の方法。

【1000】

実施形態３４０．前記細胞欠損症は、角膜疾患に関連するか、または前記細胞療法は、角膜疾患の治療のためのものである、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【1001】

実施形態３４１．前記角膜疾患は、フックスジストロフィー、または先天性遺伝性内皮ジストロフィーである、実施形態３４０に記載の方法。

【1002】

実施形態３４２．前記細胞集団は、角膜内皮細胞の集団である、実施形態３４０または実施形態３４１に記載の方法。

【1003】

実施形態３４３．前記細胞欠損症は、腎臓疾患に関連するか、または前記細胞療法は、腎臓疾患の治療のためのものである、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【1004】

実施形態３４４．前記細胞集団は、腎細胞の集団である、実施形態３４３に記載の方法。

【1005】

実施形態３４５．前記細胞療法は、がんの治療のためのものである、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【1006】

実施形態３４６．前記がんは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌からなる群から選択される、実施形態３４５に記載の方法。

【1007】

実施形態３４７．前記細胞集団は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団である、実施形態３１７または実施形態３１８に記載の方法。

【1008】

実施形態３４８．前記細胞は、投与前に増殖され、凍結保存される、実施形態３１７～３４７のいずれかに記載の方法。

【1009】

実施形態３４９．前記集団を投与することは、前記集団の静脈内注射、筋肉内注射、血管内注射、及び移植を含む、実施形態３１７～３４８のいずれかに記載の方法。

【1010】

実施形態３５０．前記集団は、腎被膜移植または筋肉内注射を介して移植される、実施形態３４９に記載の方法。

【1011】

実施形態３５１．前記集団はドナー対象に由来し、前記ドナーのＨＬＡ型は前記患者のＨＬＡ型と一致しない、実施形態３１７～３５０のいずれかに記載の方法。

【1012】

実施形態３５２．前記集団はヒト細胞集団であり、前記患者はヒト患者である、実施形態３１７～３５１のいずれかに記載の方法。

【1013】

実施形態３５３．前記β膵島細胞は、前記対象における耐糖能を改善する、実施形態３３０～３３３のいずれかに記載の方法。

【1014】

実施形態３５４．前記対象は、糖尿病患者である、実施形態３５３に記載の方法。

【1015】

実施形態３５５．前記糖尿病患者は、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である、実施形態３５４に記載の方法。

【1016】

実施形態３５６．耐糖能は、前記膵島細胞の投与前の前記対象の耐糖能と比較して、改善される、実施形態３３０～３３２及び３５３～３５５のいずれかに記載の方法。

【1017】

実施形態３５７．前記β膵島細胞は、前記対象における外因性インスリン使用量を低減させる、実施形態３３０～３３２及び３５３～３５６のいずれかに記載の方法。

【1018】

実施形態３５８．ＨｂＡ１ｃレベルによって測定される耐糖能が改善される、実施形態３５３～３５７のいずれかに記載の方法。

【1019】

実施形態３５９．前記対象は絶食している、実施形態３５３～３５８のいずれかに記載の方法。

【1020】

実施形態３６０．前記膵島細胞は、前記対象におけるインスリン分泌を改善する、実施形態３３０～３３２及び３５１～３６０のいずれか１つに記載の方法。

【1021】

実施形態３６１．インスリン分泌は、前記膵島細胞の投与前の前記対象のインスリン分泌と比較して、改善される、実施形態３６０に記載の方法。

【1022】

実施形態３６２．１つ以上の免疫抑制剤を前記患者に投与することを更に含む、実施形態３１７～３６１のいずれかに記載の方法。

【1023】

実施形態３６３．前記患者は、１つ以上の免疫抑制剤を投与されている、実施形態３１７～３６１のいずれかに記載の方法。

【1024】

実施形態３６４．前記１つ以上の免疫抑制剤は、小分子または抗体である、実施形態３６２または３６３に記載の方法。

【1025】

実施形態３６５．前記１つ以上の免疫抑制剤は、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、コルチコステロイド、プレドニゾン、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、ブレキナール、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスペルグアリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン（チモシン－α）、及び免疫抑制抗体からなる群から選択される、実施形態３６２～３６４のいずれかに記載の方法。

【1026】

実施形態３６６．前記１つ以上の免疫抑制剤は、シクロスポリンを含む、実施形態３６２～３６４のいずれかに記載の方法。

【1027】

実施形態３６７．前記１つ以上の免疫抑制剤は、ミコフェノール酸モフェチルを含む、実施形態３６２～３６４のいずれかに記載の方法。

【1028】

実施形態３６８．前記１つ以上の免疫抑制剤は、コルチコステロイドを含む、実施形態３６２～３６４のいずれかに記載の方法。

【1029】

実施形態３６９．前記１つ以上の免疫抑制剤は、シクロホスファミドを含む、実施形態３６２～３６４のいずれかに記載の方法。

【1030】

実施形態３７０．前記１つ以上の免疫抑制剤は、ラパマイシンを含む、実施形態３６２～３６４のいずれかに記載の方法。

【1031】

実施形態３７１．前記１つ以上の免疫抑制剤は、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む、実施形態３６２～３６４のいずれかに記載の方法。

【1032】

実施形態３７２．前記１つ以上の免疫抑制剤は、抗胸腺細胞グロブリンを含む、実施形態３６２～３６４のいずれかに記載の方法。

【1033】

実施形態３７３．前記１つ以上の免疫抑制剤は、１つ以上の免疫調節剤である、実施形態３６２～３６４のいずれかに記載の方法。

【1034】

実施形態３７４．前記１つ以上数の免疫調節剤は、小分子または抗体である、実施形態３７３に記載の方法。

【1035】

実施形態３７５．前記抗体は、ＩＬ－２受容体のｐ７５、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５８、及びこれらのリガンドのいずれかに結合する抗体からなる群から選択される、受容体またはリガンドのうちの１つ以上に結合する、実施形態３６４または実施形態３７４に記載の方法。

【1036】

実施形態３７６．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７５のいずれかに記載の方法。

【1037】

実施形態３７７．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1038】

実施形態３７８．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1039】

実施形態３７９．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1040】

実施形態３８０．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1041】

実施形態３８１．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与と同じ日に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1042】

実施形態３８２．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の投与後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1043】

実施形態３８３．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1044】

実施形態３８４．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1045】

実施形態３８５．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1046】

実施形態３８６．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1047】

実施形態３８７．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1048】

実施形態３８８．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の第１の投与及び／または第２の投与の投与の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週またはそれ以上後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３６２～３７６のいずれかに記載の方法。

【1049】

実施形態３８９．前記１つ以上の免疫抑制剤は、前記操作された細胞の前記改変を含まない免疫原性細胞の免疫拒絶を低減させるために投与される１つ以上の免疫抑制剤の用量と比較して、より低い用量で投与される、実施形態３６２～３８８のいずれかに記載の方法。

【1050】

実施形態３９０．前記操作された細胞は、前記操作された細胞の制御された殺傷を可能にする、実施形態３６１～３８９のいずれかに記載の方法。

【1051】

実施形態３９１．前記操作された細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチを含む、実施形態３６１～３９０のいずれかに記載の方法。

【1052】

実施形態３９２．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、薬物またはプロドラッグの存在下、または選択的な外因性化合物による活性化の際に、制御された細胞死を誘導する、実施形態３９１に記載の方法。

【1053】

実施形態３９３．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、前記操作された細胞のアポトーシスを誘導できる誘導性タンパク質である、実施形態３９１または実施形態３９２に記載の方法。

【1054】

実施形態３９４．前記操作された細胞のアポトーシスを誘導できる前記誘導性タンパク質は、カスパーゼタンパク質である、実施形態３９３に記載の方法。

【1055】

実施形態３９５．前記カスパーゼタンパク質は、カスパーゼ９である、実施形態３９４に記載の方法。

【1056】

実施形態３９６．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、実施形態３９３または実施形態３９４に記載の方法。

【1057】

実施形態３９７．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、前記患者への前記１つ以上の免疫抑制剤の投与後に活性化され、制御された細胞死を誘導する、実施形態３９１～３９６のいずれかに記載の方法。

【1058】

実施形態３９８．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、前記患者への前記１つ以上の免疫抑制剤の投与前に活性化され、制御された細胞死を誘導する、実施形態３９１～３９６のいずれかに記載の方法。

【1059】

実施形態３９９．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、前記患者への前記操作された細胞の投与後に活性化され、制御された細胞死を誘導する、実施形態３９１～３９８のいずれかに記載の方法。

【1060】

実施形態４００．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、活性化され、前記患者に対する細胞傷害性または他の悪影響が生じた場合に制御された細胞死を誘導する、実施形態３９１～３９９のいずれかに記載の方法。

【1061】

実施形態４０１．前記操作された細胞の集団の操作された細胞の枯渇を可能にする、薬剤を投与することを含む、実施形態３６１～３９１のいずれかに記載の方法。

【1062】

実施形態４０２．前記操作された細胞の枯渇を可能にする薬剤は、前記操作された細胞の表面に発現したタンパク質を認識する抗体である、実施形態４０１に記載の方法。

【1063】

実施形態４０３．前記抗体は、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、及びＲＱＲ８を認識する抗体からなる群から選択される、実施形態４０２に記載の方法。

【1064】

実施形態４０４．前記抗体は、モガムリズマブ、ＡＦＭ１３、ＭＯＲ２０８、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－Ｒｌｌｂ、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジニツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－Ｒｌｌｃ、及びこれらのバイオシミラーからなる群から選択される、実施形態４０１または実施形態４０２に記載の方法。

【1065】

実施形態４０５．前記操作された細胞の表面上の前記１つ以上の免疫寛容原性因子を認識する薬剤を投与することを含む、実施形態３１７～３６１及び４０１～４０４のいずれかに記載の方法。

【1066】

実施形態４０６．前記操作された細胞は、前記１つ以上の免疫寛容原性因子を発現するように操作されている、実施形態４０５に記載の方法。

【1067】

実施形態４０７．前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である、実施形態４０５または実施形態４０６に記載の方法。

【1068】

実施形態４０８．１つ以上の追加の治療薬を前記患者に投与することを更に含む、実施形態３１７～４０７のいずれかに記載の方法。

【1069】

実施形態４０９．前記患者は、１つ以上の追加の治療薬を投与されている、実施形態３１７～４０８のいずれかに記載の方法。

【1070】

実施形態４１０．前記方法の治療効果を監視することを更に含む、実施形態３１７～４０９のいずれかに記載の方法。

【1071】

実施形態４１１．前記方法の予防効果を監視することを更に含む、実施形態３１７～４１０のいずれかに記載の方法。

【1072】

実施形態４１２．前記方法は、１つ以上の疾患症状の所望の抑制が起こるまで繰り返される、実施形態４１０または実施形態４１１に記載の方法。

【1073】

実施形態４１３．前記操作された細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１～６６及び２７５～２８２のいずれかに記載の操作された細胞。

【1074】

実施形態４１４．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、実施形態４１３に記載の操作された細胞。

【1075】

実施形態４１５．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子または前記安全スイッチに関連する遺伝子は、前記操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４１３または実施形態４１４に記載の操作された細胞。

【1076】

実施形態４１６．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチ、及び前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、前記操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４１３～４１５のいずれかに記載の操作された細胞。

【1077】

実施形態４１７．前記バイシストロン性カセットは、前記操作された細胞のゲノム内への非標的挿入によって、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した前記細胞内への前記外因性ポリヌクレオチドの導入にによって組み込まれる、実施形態４１５または実施形態４１６に記載の操作された細胞。

【1078】

実施形態４１８．前記バイシストロン性カセットは、前記細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によって組み込まれ、任意選択で、前記標的挿入は、相同指向性修復を伴うヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである、実施形態４１７に記載の操作された細胞。

【1079】

実施形態４１９．前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である、実施形態４１２～４１８のいずれかに記載の操作された細胞。

【1080】

実施形態４２０．前記操作された細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態６７～２７４のいずれかに記載の方法。

【1081】

実施形態４２１．前記自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、実施形態４２０に記載の方法。

【1082】

実施形態４２２．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子または前記安全スイッチに関連する遺伝子は、前記操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４２０または実施形態４２１に記載の方法。

【1083】

実施形態４２３．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチ、及び前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、前記操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４２０～４２２のいずれかに記載の方法。

【1084】

実施形態４２４．前記バイシストロン性カセットは、前記操作された細胞のゲノム内への非標的挿入によって組み込まれる、実施形態４２２または実施形態４２３に記載の方法。

【1085】

実施形態４２５．前記バイシストロン性カセットは、前記操作された細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によって組み込まれる、実施形態４２４に記載の方法。

【1086】

実施形態４２６．前記１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である、実施形態４２０～４２５のいずれかに記載の方法。

【1087】

実施形態４２７．前記操作された細胞の集団の操作された細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態２９４～３１３のいずれかに記載の組成物。

【1088】

実施形態４２８．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、実施形態４２７に記載の組成物。

【1089】

実施形態４２９．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子または前記安全スイッチに関連する遺伝子は、前記操作された細胞の集団の操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４２７または実施形態４２８に記載の組成物。

【1090】

実施形態４３０．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチ、及び前記外因性ＣＤ４７は、前記操作された細胞のゲノム内に組み込まれたバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４２７～４２９のいずれかに記載の組成物。

【1091】

実施形態４３１．前記バイシストロン性カセットは、ゲノム内への非標的挿入によって、任意選択で、レンチウイルスベクターを使用した前記操作された細胞の集団の操作された細胞内への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によって組み込まれる、実施形態４２９または実施形態４３０に記載の組成物。

【1092】

実施形態４３２．前記バイシストロン性カセットは、前記操作された細胞の集団の操作された細胞の標的ゲノム遺伝子座内への標的挿入によって組み込まれ、任意選択で、前記標的挿入は、相同指向性修復を伴うヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集によるものである、実施形態４２９または実施形態４３０に記載の組成物。

【実施例】

【1093】

ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、例示の目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定することは意図されていない。

【1094】

実施例１：移植試験におけるＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞の生存及び機能性
同種異系レシピエントの初代β膵島細胞の移植における、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩの発現を低減させること及びＣＤ４７の発現を増加させることの効果を試験するために、Ｂ２ＭノックアウトＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス（ＭＨＣハプロタイプＨ２^ｂ）からの初代β膵島細胞は、ＣＤ４７をコードするレンチウイルスベクターが形質導入され、マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞を生成した。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスから単離されたＢ２Ｍ^－／－初代β膵島細胞は、自然にはＭＨＣ－ＩＩ分子を発現せず（図１）、刺激後にＭＨＣ－ＩＩ分子は上方制御されない。マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇの操作された初代β膵島細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ糖尿病疾患マウスモデルレシピエント（ＭＨＣハプロタイプＨ２^ｄ）に移植した。移植されたマウスのＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞の生存及び機能性を、移植されたマウスの野生型Ｂ６膵島細胞と比較して、経時的に監視した。

【1095】

Ａ．方法
糖尿病マウスモデル。２５匹のＢＡＬＢ／ｃ（ＭＨＣハプロタイプＨ２^ｄ）マウスに、低用量のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（６０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を５日間毎日（－５日目～０日目）注射した。ＳＴＺをクエン酸緩衝液（１０ｍｇ／ｍｌ原液）に溶解させ、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射用に１５０μＬの注射量に希釈した。腎臓を健康に保つために、翌朝、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１ｍＬ）の腹腔内注射をマウスに投与した。

【1096】

血糖の測定。血糖の測定は、標準プロトコールに従って、食物中止の４時間後に行われた。

【1097】

マウス初代β膵島細胞の生成。Ｂ２Ｍ^－／－初代β膵島細胞を、Ｂ２ＭノックアウトＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス（ＭＨＣハプロタイプＨ２^ｂ）から単離した。単離されたマウスＢ２Ｍ^－／－初代β膵島細胞に、マウスＣＤ４７導入遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。野生型Ｂ６マウスから単離された初代β膵島細胞を、対照（野生型膵島）として使用した。生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって細胞生存を監視するために、マウス野生型細胞とマウスＢ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞の両方にルシフェラーゼ発現コンストラクトを形質導入した。

【1098】

フローサイトメトリー。初代β膵島細胞上のＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、及びＣＤ４７の表面発現を、抗体特異的試薬を使用したフローサイトメトリーによって評価した。アイソタイプ抗体を対照として使用した。

【1099】

移植試験の設計及び投与。２５匹のＢＡＬＢ／ｃ ＭＨＣハプロタイプＨ２^ｄマウス（マウス体重１８～２０ｇ）を、糖尿病を誘発するためのＳＴＺ投与後、５つの試験群（試験群当たりｎ＝５）にランダムに分けた。そこで、投与された細胞（マウス野生型対マウスＢ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞）及び／または投与経路（腎被膜への直接注射対筋肉内ｉ．ｍ．投与）に基づいて、群は異なった。試験群は以下のとおりであった：マウス野生型Ｂ６初代β膵島（ｌｕｃ＋）の腎被膜移植、マウス野生型Ｂ６初代β膵島（ｌｕｃ＋）の筋肉内移植、移植なしの糖尿病対照、マウスＢ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島（ｌｕｃ＋）の腎被膜移植、及びマウスＢ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島（ｌｕｃ＋）の筋肉内移植。

【1100】

１クラスター当たり約１５００個の細胞の膵島クラスターを、腎被膜注射または筋肉内注射によってマウスに移植した。腎被膜注射の場合、マウス１匹当たり３００個のクラスター（約４５０，０００個の細胞）を移植した。筋肉内注射の場合、マウス１匹当たり６００個のクラスター（約９００，０００個の細胞）を注射した。０日目（ｄ０）を移植の日として定義した。

【1101】

細胞生存率は、マウスＢ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島について、ｄ０、ｄ３、ｄ５、ｄ７、ｄ９、ｄ１１、ｄ１３、ｄ１７、ｄ２１、ｄ２５及びｄ２９に生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって測定した（野生型Ｂ６初代β膵島の場合、５日目の後にシグナルが検出されなかったため、ＢＬＩイメージングは５日目の後に中止された）。グルコースは、膵島移植前（ＳＴＺ前、ｄ－３、ｄ－２及びｄ－１）の４時間の絶食後、及びｄ０、ｄ３、ｄ１４、ｄ２１、ｄ２８、ｄ３０、ｄ３１、ｄ３２、ｄ３６に測定した。ｄ２９に、腎被膜を移植したコホートからの組織病理学的分析のために、腎臓を取り出した。初代β膵島細胞の単離は、Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．“Ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｉｓｌｅｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｐａｎｃｒｅａｓ．”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．Ｖｏｌ．４，１１（２００９）：１６４９－５２（その内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように実施された。腎臓の単離は、Ｍａｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．“Ｎｅｗ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ．”Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｖｏｌ．７３，８（２００６）：１３３３－６に記載されるように実施された。

【1102】

Ｂ．結果
マウスＢ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞は、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩを発現せず、ＣＤ４７の発現が増加している。マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞におけるＭＨＣ－Ｉ、ＭＣＨ－ＩＩ及びＣＤ４７の発現を評価するために、フローサイトメトリーを実施した。単離したマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞は、移植の前後でＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩに対して陰性であった（図１）。ＣＤ４７を過剰発現するように操作されていないマウスＢ２Ｍ^－／－初代β膵島細胞は、低レベルのＣＤ４７表面発現を示した（図２Ａに示すように、アイソタイプ対照の３．３倍）。マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞は、ＣＤ４７の発現の増加を示した（図２Ｂに示すように、アイソタイプ対照の４８倍）。

【1103】

マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞は、同種異系移植後も生存する。筋肉内注射後のマウス初代β膵島細胞のＢＬＩイメージング結果の定量化を、図３Ａ（マウス野生型Ｂ６初代β膵島細胞）及び図３Ｃ（マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞）に示し、腎臓被膜注射後を、図４Ａ（マウス野生型Ｂ６初代β膵島細胞）及び図４Ｃ（マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞）に示す。筋肉内注射後のマウス初代β膵島細胞の対応するＢＬＩ画像を、図３Ｂ（マウス野生型Ｂ６初代β膵島細胞）及び図３Ｄ（マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞）に示し、腎臓被膜注射後を、図４Ｂ（マウス野生型Ｂ６初代β膵島細胞）及び図４Ｄ（マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞）に示す。生物発光は、マウス初代β膵島細胞の投与後、すべての群の筋肉内注射部位で最初に観察された。しかし、移植されたマウス野生型Ｂ６初代β膵島細胞について検出された光子の数は、移植後の最初の５日間で急速に減少し（図３Ａ及び図４Ａ）、これは、おそらく免疫反応による、マウス野生型Ｂ６初代β膵島細胞の死を示した。対照的に、移植されたマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞から検出された光子の数は、移植後２９日間にわたって増加し、マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞の生存及び増殖を示した（図３Ｃ及び図４Ｃ）。

【1104】

マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞は、同種異系移植後に機能する。移植されたマウス初代β膵島細胞の機能を分析するために、移植後の指定の時点で血糖値を測定した。血糖値は、ナイーブ（未処置）マウスでは８０～１２０ｍｇ／ｄＬであり、糖尿病（ＳＴＺ処置）マウスでは２００ｍｇ／ｄＬ超であった。野生型Ｂ６膵島の筋肉内注射または腎被膜注射を受けた糖尿病（ＳＴＺ処置）マウスの血糖値は、図３Ｅ及び図４Ｅにそれぞれに示すように、全試験期間にわたって高いままであった（４００ｍｇ／ｄＬ超）。対照的に、マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞の筋肉内注射または腎被膜注射を受けた糖尿病（ＳＴＺ処置）マウスの血糖値は、図３Ｆ及び図４Ｆにそれぞれ示すように、移植後すぐに非糖尿病レベル（８０～１２０ｍｇ／ｄＬ）まで低下した。腎被膜注射モデルでは、ｄ２９に腎臓を除去した後、血糖値は上昇し始めた（図４Ｆ）。

【1105】

まとめると、これらのデータは、マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞が、糖尿病疾患モデルにおける同種異系移植後も生存し、機能できた（例えば、糖尿病により失われたグルコース制御を回復する）ことを示している。

【1106】

実施例２：移植試験におけるＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞の免疫機能
マウス初代β膵島細胞における、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ発現の低減とＣＤ４７発現の増加による免疫回避効果を試験するために、ＢＡＬＢ／ｃ糖尿病疾患マウスモデルレシピエント（ＭＨＣハプロタイプＨ２^ｄ）に移植された、実施例１に記載のように作製されたマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞で、免疫機能アッセイを実施した。マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞の移植によって誘発される生存と免疫応答を、マウス野生型Ｂ６初代β膵島細胞及びマウスＢ２Ｍ^－／－Ｂ６初代β膵島細胞と比較して、評価した。

【1107】

Ａ．方法
移植試験の設計及び投与。１５匹のＢＡＬＢ／ｃ ＭＨＣハプロタイプＨ２^ｄマウス（マウス体重１８～２０ｇ）を、糖尿病を誘発するためのＳＴＺ筋肉内（ｉ．ｍ．）投与後、５つの試験群（試験群当たりｎ＝５）にランダムに分けた。そこで、投与された細胞（野生型対Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞）に基づいて、群は異なった。試験群は以下のとおりであった：マウス野生型Ｂ６初代β膵島細胞（ｌｕｃ＋）の筋肉内移植、マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞（ｌｕｃ＋）の筋肉内移植、及び移植なしの糖尿病対照。

【1108】

１クラスター当たり約６００個の細胞の膵島クラスターを、筋肉内注射によってマウスに移植した。筋肉内注射の場合、マウス１匹当たり６００個のクラスター（約９００，０００個の細胞）を注射した。０日目（ｄ０）を移植の日として定義した。グルコースは、膵島移植前（ＳＴＺ前、ｄ－３、ｄ－２及びｄ－１）の４時間の絶食後、及びｄ６に測定した。６日目に、免疫アッセイ分析のためにマウスを屠殺した。

【1109】

Ｔ細胞酵素結合免疫吸収ＳＰＯＴ（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ。マウス初代β膵島細胞におけるインターフェロンγ（ＩＦＮｇ）分泌ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴによって検出した。

【1110】

フローサイトメトリー。初代β膵島細胞におけるドナー特異的抗体（ＤＳＡ）の発現を、フローサイトメトリーによって評価した。

【1111】

Ｂ．結果
マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞は、同種異系移植後に機能する。移植されたβ膵島細胞の機能を分析するために、移植の６日後に血糖値を測定した。マウス野生型Ｂ６初代β膵島細胞の筋肉内注射を受けた糖尿病（ＳＴＺ処置）マウスの血糖値は、図５Ａに示すように、全試験期間にわたって高いままであった（４００ｍｇ／ｄＬ超）。対照的に、マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞の筋肉内注射を受けた糖尿病（ＳＴＺ処置）マウスの血糖値は、図５Ａに示すように、移植後すぐに低下した。これらのデータは、マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞が、同種異系移植後も機能できた（例えば、糖尿病により失われたグルコース制御を回復する）ことを示している。

【1112】

同種異系移植後のマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞免疫応答。移植されたβ膵島細胞に対する免疫応答を分析するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇサイトカイン分泌のレベルを評価した。図５Ｂに示すように、移植されたマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞は、移植されたマウス野生型初代β膵島細胞と比較して、より低いレベルのＩＦＮｇを示した。フローサイトメトリーで測定したＤＳＡ ＩｇＧのレベルも、移植されたマウス野生型初代β膵島細胞と比較して、移植されたマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞では低かった（図５Ｃ）。

【1113】

これらのデータは、マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞が、移植時に細胞に対する免疫応答を誘導せず、投与時にＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を回避でき、抗体の媒介による拒絶反応から保護されることを示している。

【1114】

実施例３：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞の免疫回避
初代β膵島細胞に対するＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ発現の低減及びＣＤ４７発現の増加の免疫回避効果を試験するために、ナチュラルキラー（ＮＫ）及びマクロファージ殺傷アッセイを、実施例１に記載したように作製したマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞で実施した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＫ及びマクロファージによるマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞の殺傷を、マウス野生型Ｂ６初代β膵島細胞及びマウスＢ２Ｍ^－／－Ｂ６初代β膵島細胞と比較して、経時的に監視した。

【1115】

Ａ．方法
ＮＫ細胞培養。ヒト初代ＮＫ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、アッセイを行う前にＲＰＭＩ－１６４０と１０％血清ペニシリン－ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中で培養した。

【1116】

末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からのマクロファージの分化。ＰＢＭＣは、新鮮な血液からＦｉｃｏｌｌ分離によって単離され、１０％血清ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ－１６４０中に再懸濁された。細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）の存在下で蒔いた。６日目以降、アッセイを行う前に、ヒトＩＬ－２を２４時間培地に添加した。

【1117】

ＮＫ細胞及びマクロファージ殺傷アッセイ。ＮＫ細胞殺傷アッセイ及びマクロファージ殺傷アッセイは、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＳＰプラットフォーム及びＭＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行され、細胞増殖及び細胞の生存率を無標識で監視した。４×１０^５個のマウス野生型Ｂ６初代β膵島細胞、マウスＢ２Ｍ^－／－Ｂ６初代β膵島細胞、またはマウスＢ２Ｍ^－／－、ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞（プールまたは単一クローン）を、９６ウェルコラーゲンコーティングしたＥプレートに蒔いた。ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅソフトウェアを使用し、接着及び細胞殺傷の尺度として細胞指数（ＣＩ）を測定した（細胞指数の減少は、細胞殺傷の増加を示す）。ＣＩ値が０．７に達した後、ヒトＮＫ細胞またはヒトマクロファージを、１ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－２またはヒトＩＬ－１５有りまたはなしで、０．５：１、０．８：１または１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で添加した。場合によっては、標的細胞を添加する前に、ＮＫ細胞を、ヒトＦｃ受容体（ＦｃＲ）ブロック（濃度１：５）で前処理した。いくつかのウェルは、抗ＭＩＡＰ４１０ブロッキング抗体（１０μｇ／ｍＬ、クローンＢ６．Ｈ１２、マウスＩｇＧ１，κ）で前処理した。

【1118】

フローサイトメトリー。初代β膵島細胞上のＣＤ４７の表面発現を、抗体特異的試薬を使用したフローサイトメトリーによって評価した。アイソタイプ抗体を対照として使用した。

【1119】

Ｂ．結果
マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞は、ＮＫ細胞及びマクロファージの殺傷を回避する。野生型Ｂ６マウスから単離された初代β膵島細胞（マウスＷＴ Ｂ６初代β膵島細胞）のＮＫ及びマクロファージ媒介性細胞殺傷は、抗ＭＩＡＰ４１０抗体の存在下または非存在下では観察されなかった（図６Ａ及び図６Ｄ、ＮＫ細胞；図７Ａ及び図７Ｄ、マクロファージ）。対照的に、マウスＢ２Ｍ^－／－Ｂ６初代β膵島細胞はＮＫ細胞（図６Ｂ）及びマクロファージ（図７Ｂ）によって殺傷され、これは、マウスＢ２Ｍ^－／－Ｂ６初代β膵島細胞がＮＫ細胞及びマクロファージによって外来細胞として認識され、したがって細胞殺傷が生じたことを示した。マウスＢ２Ｍ^－／－Ｂ６初代β膵島細胞及びＮＫ細胞またはマクロファージの共培養物への抗ＭＩＡＰ４１０抗体の添加は、細胞殺傷に更なる影響を及ぼさなかった（図６Ｅ及び図７Ｅ）。

【1120】

対照的に、マウスＢ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞は、ＮＫ媒介性細胞殺傷（図６Ｃ）またはマクロファージ媒介性細胞殺傷（図７Ｃ）を示さなかった。しかしながら、抗ＭＩＡＰ４１０抗体の存在下では、ＣＤ４７導入遺伝子で操作されていないマウスＢ２Ｍ^－／－ Ｂ６初代β膵島細胞で観察された結果と同様に、ＣＤ４７保護効果は低減され、細胞殺傷はＮＫ細胞（図６Ｆ）及びマクロファージ（図７Ｆ）の両方で観察された（図６Ｂ及び図６Ｅ、ＮＫ細胞；ならびに図７Ｂ及び図７Ｅ、マクロファージ）。これらのデータは、マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞が、ＮＫ細胞及びマクロファージによる免疫応答を効果的に回避することを示している。

【1121】

マウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞のＣＤ４７発現による、ＮＫ細胞殺傷の回避。野生型Ｂ６マウスから単離された様々なＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞（マウスＷＴ Ｂ６初代β膵島細胞）のＮＫ媒介性細胞殺傷は、様々なＣＤ４７導入遺伝子発現に応じて観察された。ＣＤ４７導入遺伝子の過剰発現が低いマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞は、ＮＫ媒介性細胞殺傷を示した（図８Ａ～図８Ｈ）。対照的に、ＣＤ４７導入遺伝子の過剰発現が高いマウスＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇＢ６初代β膵島細胞は、ＮＫ媒介性細胞殺傷を示さなかった（図８Ｉ～図８Ｎ）。これらの結果は、初代β膵島細胞におけるＣＤ４７の過剰発現がＮＫ細胞による免疫応答を回避するのに有効であることを裏付ける。

【1122】

実施例４：Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価
この実施例では、（１）Ｂ２Ｍをノックアウトして（Ｂ２Ｍ^－／－）ＨＬＡクラスＩ発現を低減させ、（２）外因性ＣＤ４７（ＣＤ４７ｔｇ）を過剰発現するように操作された低免疫初代ヒトβ膵島細胞を特徴付ける試験について説明する。低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）初代β膵島細胞は、野生型（ＷＴ）初代ヒトβ膵島細胞またはＢ２Ｍ^－／－初代ヒトβ膵島細胞と比較して、インスリン分泌ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びマクロファージによる細胞殺傷からの保護について監視した。ＷＴヒト初代膵島細胞はＨＬＡクラスＩＩを発現せず（図９Ｃ）、したがって、ＨＬＡクラスＩＩ分子の発現を変えるように操作されていない。低免疫細胞及びＢ２Ｍ^－／－細胞はＷＴ細胞から操作されたため、同じドナーからのものである。

【1123】

Ａ．方法
ヒト初代膵島細胞の作製と細胞工学。標準的な技術を使用して、２人の死体ドナー（ドナー１及びドナー２）から初代β膵細胞を単離した。このような技術は当技術分野で公知であり、Ｊ．Ｋｅｒｒ－Ｃｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，８９，２０１０に記載のものを含む。低免疫細胞を作製するために、標準的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して、単離された細胞を操作してＢ２Ｍをノックアウトし、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを使用して、外因性ＣＤ４７タンパク質をコードする導入遺伝子（ｔｇ）を形質導入した。低免疫膵島を、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩ及びＣＤ４７過剰発現に対して陰性の細胞についてフローサイトメトリーによって選別した。

【1124】

インスリン分泌。標準的なグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏインスリン分泌を測定した。Ｕ－ＰＬＥＸ（登録商標）Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイを使用し、インスリン分泌を検出した。簡単に説明すると、２ｍＬの培地で１００，０００個の細胞を使用し、２４時間にわたる総インスリン分泌を測定した。

【1125】

フローサイトメトリー。ヒト初代膵島細胞上のＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ、及びＣＤ４７の表面発現を、抗体特異的試薬を使用したフローサイトメトリーによって評価した。アイソタイプ抗体を対照として使用した。

【1126】

ＮＫ細胞及びマクロファージ殺傷アッセイ。ＮＫ細胞殺傷アッセイ及びマクロファージ殺傷アッセイは、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＳＰプラットフォーム及びＭＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行され、細胞増殖及び細胞の生存率を無標識で監視した。４×１０^５個の野生型ヒト初代膵島細胞、Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞、またはＢ２Ｍ^－／－、ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（プールまたは単一クローン）を、９６ウェルコラーゲンコーティングしたＥプレートに蒔いた。ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅソフトウェアを使用し、接着及び細胞殺傷の尺度として細胞指数（ＣＩ）を測定した（細胞指数の減少は、細胞殺傷の増加を示す）。ＣＩ値が０．７に達した後、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）で末梢血単核球から分化したヒト初代ＮＫ細胞またはヒトマクロファージを、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１で添加した。

【1127】

Ｂ．結果
試験結果を以下にまとめる。代表的な結果は１人のドナーについて示されているが、同様の結果が少なくとも２人の追加のドナーでも観察された。

【1128】

Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇ編集は、ヒト初代膵島細胞の細胞形態または組成に影響を及ぼさない。細胞形態を評価するために、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、インスリン、及びグルカゴンの免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を、ＷＴヒト初代膵島細胞及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞に対して実施した。結果は、形態に差異がないことを示し、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇのヒト初代膵島に対する編集は、ヒト初代膵島の形態に影響を及ぼさないように見えることを示している。更に、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ編集は、ＷＴヒト初代膵島細胞組成と比較して、ヒト初代膵島細胞組成に影響を及ぼさない（図９Ａ）。

【1129】

Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩを発現せず、ＣＤ４７発現が増加している。Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞におけるＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ、ならびにＣＤ４７の発現を評価するために、フローサイトメトリーを実施した。Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、ＨＬＡ－Ｉ（図９Ｃ）及びＨＬＡ－ＩＩ（図９Ｅ）に対して陰性であったが、ＷＴヒト初代膵島細胞は、ＨＬＡクラスＩを高レベルで発現し（図９Ｂ）、ＨＬＡクラスＩＩを発現しなかった（図９Ｄ）。Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、ＷＴヒト初代膵島細胞（図９Ｆ）と比較して、ＣＤ４７の発現の増加を示した（図９Ｇに示すように、アイソタイプ対照の４８倍及び５１倍）。

【1130】

Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、インスリン分泌能力を保持する。Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、代表的なドナーについて図９Ｈに示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＷＴヒト初代膵島細胞と同様のインスリン分泌能力を保持した。これらのデータは、β膵島細胞に対する低免疫改変がインスリン分泌に影響を及ぼさないことを示している。

【1131】

Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、ＮＫ細胞及びマクロファージ殺傷を回避する。ＷＴヒト初代膵島細胞は、ＮＫ細胞（図９Ｉ）またはマクロファージ（図９Ｌ）によって殺傷されなかった。対照的に、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの発現が低減したＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞は、ＮＫ細胞（図９Ｊ）及びマクロファージ（図９Ｍ）によって殺傷され、Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞がＮＫ細胞及びマクロファージによって外来細胞として認識され、したがって細胞殺傷が生じたことを示した。

【1132】

対照的に、Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、ＮＫ媒介性細胞殺傷（図９Ｋ）またはマクロファージ媒介性細胞殺傷（図９Ｎ）を示さなかった。これらのデータは、低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）ヒト初代膵島細胞がＣＤ４７過剰発現によって保護され、ＮＫ細胞及びマクロファージによる免疫応答を効果的に回避できることを示している。

【1133】

実施例５：糖尿病ヒト化マウス移植試験におけるＢ２Ｍ^－／－及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の生存及び機能性
低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）及び二重ノックアウト（Ｂ２Ｍ^－／－）ヒト初代膵島細胞を実施例４に記載のように作製し、同種異系糖尿病ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３レシピエントマウスに移植した。マウスにおける糖尿病の発生率、移植されたＢ２Ｍ^－／－及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の生存及び機能性を、移植された野生型ヒト初代膵島細胞と比較して、経時的に監視した。

【1134】

Ａ．方法
移植試験の設計及び投与。２５匹のヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（マウス体重１８～２０ｇ）を、糖尿病を誘発するためのＳＴＺ投与後、試験群にランダムに分けた。そこで、投与された細胞（野生型、Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇ、及びＢ２Ｍ^－／－ヒトβ膵島細胞）に基づいて、群は異なった。試験群は以下のとおりであった：野生型ヒト膵島（ｌｕｃ＋）の筋肉内移植、移植なしの糖尿病対照、Ｂ２Ｍ^－／－ヒト膵島（ｌｕｃ＋）筋肉内移植、及びＢ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト膵島（ｌｕｃ＋）筋肉内移植。

【1135】

１クラスター当たり約１，５００個の細胞の３００のヒト膵島クラスターを、筋肉内注射によってマウスに移植した。０日目（ｄ０）を移植の日として定義した。マウスを、β膵島細胞の生存の指標として生物発光（ＢＬＩ）について監視し、糖尿病を監視するために４時間の絶食後のグルコースレベルを監視した。試験の２９日目に糖負荷を実施した。

【1136】

Ｔ細胞酵素結合免疫吸収ＳＰＯＴ（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ。ヒト初代膵島細胞におけるインターフェロンγ（ＩＦＮｇ）分泌ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴによって検出した。

【1137】

Ｃペプチドアッセイ。ヒト初代膵島細胞におけるＣペプチドレベルを、標準的なアッセイを使用して測定した。

【1138】

脾細胞殺傷アッセイ。脾細胞殺傷アッセイは、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＳＰプラットフォーム及びＭＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行され、細胞増殖及び細胞の生存率を無標識で監視した。４×１０^５個の野生型ヒト初代膵島細胞、Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞、またはＢ２Ｍ^－／－、ＣＤ４７^ｔｇヒト初代膵島細胞（プールまたは単一クローン）を、９６ウェルのコラーゲンコーティングしたＥプレートに蒔いた。ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅソフトウェアを使用し、接着及び細胞殺傷の尺度として細胞指数（ＣＩ）を測定した（細胞指数の減少は、細胞殺傷の増加を示す）。ＣＩ値が０．７に達した後、ヒト脾細胞をエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１で添加した。

【1139】

補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ。Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞を血清とインキュベートし、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＭＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でインキュベーション中の細胞溶解を測定することでＣＤＣを分析し、細胞増殖及び細胞の生存率を無標識で監視した。インピーダンスの変化は、細胞指数（ＣＩ）として報告した（細胞指数の減少は、細胞の溶解または殺傷の増加を示す）。

【1140】

Ｂ．結果
試験結果を以下にまとめる。代表的な結果が示されているが、同様の結果は様々なドナーでも観察された。

【1141】

Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、同種異系移植後も生存する。筋肉内注射後のヒト初代膵島細胞のＢＬＩイメージング結果の定量化を、図１０Ａ（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞）及び図１０Ｃ（ＷＴヒト初代膵島細胞）に示す。筋肉内注射後のヒト初代膵島細胞の対応するＢＬＩ画像を、図１０Ｂ（ＷＴヒト初代膵島細胞）及び図１０Ｄ（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞）に示し、Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞のＢＬＩ画像を図２０Ａに示す。生物発光は、細胞の投与後、すべての群の筋肉内注射部位で最初に観察された。しかし、移植されたＷＴヒト初代膵島細胞について検出された光子の数は、移植後の最初の５日間で急速に減少し（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）、これは、おそらく免疫応答による、ＷＴヒト初代膵島細胞の死を示した。ＷＴヒト初代膵島細胞と同様に、Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞の数は、移植後の最初の５日間で急速に減少した（図１０Ｇ）。対照的に、移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞から検出された光子の数は、移植後２９日間にわたって増加し、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の生存及び増殖を示した（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、局所免疫反応を誘導することなく、１ヶ月間生存することができる（データは示さず）。

【1142】

Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、同種異系移植後に機能する。移植されたヒト初代膵島細胞の特定の機能を分析するために、移植の６日後に血糖値を測定した。ＷＴヒト初代膵島細胞及びＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞の筋肉内注射を受けた糖尿病（ＳＴＺ処置）マウスの絶食後約４時間で血糖値を測定し、図１０Ｆ及び図１０Ｈにそれぞれ示すように、全試験期間にわたって高い値（４００ｍｇ／ｄＬ超）を維持した。対照的に、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の筋肉内注射を受けた糖尿病（ＳＴＺ処置）マウスの空腹時血糖値は、図１０Ｅに示すように、移植後すぐに低下した。更に、Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の筋肉内注射を受けたマウスは、２９日目に糖負荷に耐えることに成功した（図１０Ｅ）。

【1143】

移植されたヒト初代膵島細胞の機能を更に分析するために、移植後にＣペプチドレベルを測定した。ＷＴヒト初代膵島細胞及びＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞の筋肉内注射を受けた糖尿病（ＳＴＺ処置）マウスにおけるＣペプチドレベルは、図１１Ｂ及び図１１Ｃにそれぞれ示すように低かった。対照的に、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の筋肉内注射を受けたマウスは、高レベルのＣタンパク質を有していた（図１１Ａ）。

【1144】

これらのデータは、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞が、同種異系移植後も機能できた（例えば、糖尿病により失われたグルコース制御を回復する）ことを示している。

【1145】

同種異系移植後のＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞免疫応答。移植されたヒト初代膵島細胞に対する免疫応答を分析するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇサイトカイン分泌のレベルを評価した。図１０Ｉに示すように、移植されたＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、移植された野生型ヒト初代膵島細胞と比較して、より低いレベルのＩＦＮｇを示した。これらの結果は、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定されたように、野生型β膵島が移植後にＴＨ１活性化を示すという観察と一致している。フローサイトメトリーによって測定したＤＳＡ ＩｇＭのレベルも、移植された野生型初代β膵島細胞と比較して、移植されたＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞及び移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代β膵島細胞では低く、これは、野生型β膵島がドナー特異的抗体結合（ＩｇＭ）を示すことを示している（図１０Ｊ）。

【1146】

このデータは、移植された野生型ヒト初代膵島細胞が適応免疫応答を示すのに対し、移植されたＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞及び移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、適応免疫応答を示さないことを示す。

【1147】

Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ及びＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞は、同種異系移植後の脾細胞殺傷を回避する。図１２Ａの上パネルに示すように、移植されたＷＴヒト初代膵島細胞は、脾細胞によって殺傷された。これは、移植されたＷＴヒト初代膵島細胞が脾細胞によって外来細胞として認識され、したがって細胞殺傷が生じたことを示した。対照的に、移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞及び移植されたＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞は、脾細胞媒介性細胞殺傷を示さなかった（図１２Ａ、中央及び上のパネル）。これらのデータは、移植された低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）及び移植された二重ノックアウト（Ｂ２Ｍ^－／－）ヒト初代膵島細胞が脾細胞による免疫応答を効果的に回避できることを示している。

【1148】

Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ及びＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞は、同種異系移植後にＣＤＣを受けない。移植されたヒト初代膵島細胞に対する免疫応答を更に分析するために、ＣＤＣアッセイを使用した。図１２Ｂの上パネルに示すように、ＷＴヒト初代膵島細胞はＣＤＣアッセイにおいて殺傷され、これは、ＷＴヒト初代膵島細胞が認識され、細胞殺傷が生じたことを示している。対照的に、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ及びＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞は、ＣＤＣ細胞殺傷を示さなかった（図１２Ｂ、中央及び上のパネル）。これらのデータは、低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）及び二重ノックアウト（Ｂ２Ｍ^－／－）ヒト初代膵島細胞がＣＤＣを効果的に回避できることを示している。

【1149】

実施例６：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の免疫回避
ヒト初代膵島細胞に対するＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩ発現を低減すること及びＣＤ４７発現を増加することの免疫回避効果を試験するために、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）殺傷アッセイを、実施例４に記載したように作製したＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞に対して実施した。Ｉ型糖尿病患者由来のＰＢＭＣまたは健康なドナー由来のＰＢＭＣを、ＷＴヒト初代膵島細胞またはＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし、殺傷を経時的に監視した。

【1150】

Ａ．方法
ＰＢＭＣの単離及び培養。ＰＢＭＣは、新鮮な血液からＦｉｃｏｌｌ分離によって５人のＩ型糖尿病ヒト患者または３人の健常ドナーから単離され、１０％血清ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ－１６４０中に再懸濁された。

【1151】

ＰＢＭＣ殺傷アッセイ。ＰＢＭＣ細胞殺傷アッセイは、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＳＰプラットフォーム及びＭＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行され、細胞増殖及び細胞の生存率を無標識で監視した。４×１０^５個のＷＴヒト初代膵島細胞またはＢ２Ｍ^－／－、ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞を、９６ウェルのコラーゲンコーティングしたＥプレートに蒔いた。ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅソフトウェアを使用し、接着及び細胞殺傷の尺度として細胞指数（ＣＩ）を測定した（細胞指数の減少は、細胞殺傷の増加を示す）。ＣＩ値が０．７に達した後、ヒトＰＢＭＣ細胞をエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１で添加した。

【1152】

フローサイトメトリー。ヒト初代膵島細胞のＰＢＭＣ殺傷をフローサイトメトリーで評価し、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５を使用して死細胞の割合を定量化した。

【1153】

Ｂ．結果
試験結果を以下にまとめる。代表的な結果は１人のドナーについて示されているが、同様の結果が両方のドナーでも観察された。

【1154】

Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、糖尿病ＰＢＭＣ殺傷を回避する。Ｉ型糖尿病患者のそれぞれから単離された糖尿病ＰＢＭＣは、ＷＴヒト初代膵島細胞の細胞殺傷を媒介した。１人のＩ型糖尿病患者から単離されたＰＢＭＣから代表的な結果を、図１３Ａに示す。健常ドナーからのＰＢＭＣは、図１３Ｅで代表的な健常ドナーＰＢＭＣについて示されるように、ＷＴヒト初代膵島細胞を殺傷しなかった。ＷＴヒト初代膵島細胞の殺傷は、ＰＢＭＣとのインキュベートがない場合には、観察されなかった（図１３Ｂ及び図１３Ｆ）。死細胞についてフローサイトメトリーによって殺傷を評価した場合にも、同様の結果が観察された（図１３Ｉ）。これらの結果は、ＷＴヒト初代膵島細胞が糖尿病ＰＢＭＣによって外来細胞として認識され、その結果、細胞殺傷が生じたことを示している。

【1155】

対照的に、Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、糖尿病ＰＢＭＣ（図１３Ｃ、１人の患者からの糖尿病ＰＢＭＣを用いた代表的な結果）または健康なＰＢＭＣ（図１３Ｇ、１人の健常ドナーからのＰＢＭＣを用いた代表的な結果）によって殺傷されなかった。Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の殺傷は、ＰＢＭＣとのインキュベートがない場合には、観察されなかった（図１３Ｄ及び図１３Ｈ）。死細胞についてフローサイトメトリーによって殺傷を評価した場合にも、同様の結果が観察された（図１３Ｊ）。これらのデータは、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞が、糖尿病ＰＢＭＣによる免疫応答を効果的に回避することを示している。

【1156】

実施例７：ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗ＣＤ４７融合タンパク質による、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞におけるＣＤ４７シグナル伝達の評価
この実施例では、（１）Ｂ２Ｍをノックアウトして（Ｂ２Ｍ^－／－）ＨＬＡクラスＩ発現を低減させ、（２）外因性ＣＤ４７（ＣＤ４７ｔｇ）を過剰発現するように操作された低免疫初代ヒトβ膵島細胞によるＣＤ４７遮断を特徴付ける試験について説明する。低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）ヒト初代膵島細胞を実施例４に記載するように作製した。抗ＣＤ４７ Ｆｃ融合タンパク質（すなわち、抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１Ｆｃ及び抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４Ｆｃ）の存在下でのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びマクロファージによる細胞殺傷を、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞と比較して、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞について評価した。ＣＤ４７結合による細胞傷害性産物の作製及びマクロファージの貪食も評価した。

【1157】

Ａ．方法
ＮＫ細胞及びマクロファージ殺傷アッセイ。ＮＫ細胞殺傷アッセイ及びマクロファージ殺傷アッセイは、実質的に上記の実施例に記載したように実施した。

【1158】

細胞傷害性産物の検出。グランザイム、パーフォリン及び活性酸素種（ＲＯＳ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製（ヒトグランザイムＢ ＥＬＩＳＡキット及びヒトパーフォリンＥＬＩＳＡキット）及びＢｉｏｓｏｕｒｃｅ（ヒト活性酸素種ＥＬＩＳＡキット）の市販キットを製造業者の指示に従って使用し、ＥＬＩＳＡによって検出した。

【1159】

貪食アッセイ。抗ＣＤ４７抗体（１００μｇ／ｍｌ）を、Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞及びマクロファージと共にインキュベートした。いくつかの条件では、抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１Ｆｃまたは抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４Ｆｃも添加した。β膵島細胞の貪食は、１時間のインキュベート後にフローサイトメトリーによるｐＨｒｏｄｏ（商標）貪食アッセイを使用して評価した。

【1160】

Ｂ．結果
試験結果を以下にまとめる。代表的な結果は１人のドナーについて示されているが、同様の結果が両方のドナーでも観察された。

【1161】

抗ＣＤ４７Ｆｃ融合タンパク質を発現するＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、ＮＫ細胞及びマクロファージによって殺傷される。Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、ＮＫ媒介性細胞殺傷（図１４Ａ）またはマクロファージ媒介性細胞殺傷（図１４Ｄ）を示さなかった。これは、低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）ヒト初代膵島細胞がＣＤ４７の過剰発現によって保護されており、ＮＫ細胞及びマクロファージによる免疫応答を効果的に回避できることを示している。細胞殺傷からの保護は、ＮＫ媒介性細胞殺傷（それぞれ図１４Ｂ及び図１４Ｃ）またはマクロファージ媒介性細胞殺傷（それぞれ図１４Ｅ及び図１４Ｆ）について示されるように、抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１Ｆｃまたは抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質によって遮断された。これらのデータは、Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞におけるＣＤ４７－ＳＩＲＰシグナル伝達の遮断により、ＮＫ細胞及びマクロファージによって外来細胞として認識され、細胞殺傷が生じることを示し、更にＣＤ４７の過剰発現が改変された細胞による免疫回避に寄与していることを裏付けている。

【1162】

Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、抗ＣＤ４７Ｆｃ融合タンパク質が添加されると細胞傷害性産物を作製する。図１５Ａ～図１５Ｃに示すように、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、グランザイムＢ（図１５Ａ）、パーフォリン（図１５Ｂ）及びＲＯＳ（図１５Ｃ）のより低いレベルを示したが、これらの細胞傷害性産物のレベルは、抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１Ｆｃまたは抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質のいずれかの存在下で実質的に高かった。殺傷はこれらの細胞傷害性産物の放出によって媒介されるため、これらのデータは、融合タンパク質ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の両方によるＣＤ４７－ＳＩＲＰシグナル伝達の遮断が、改変された初代β膵島細胞の殺傷を誘導することを示している。

【1163】

実施例８：１人の例示的なドナーからのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の適応免疫応答
Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞のマクロファージ細胞殺傷機構を調査するため、及びＣＤ４７の過剰発現がどのように殺傷に影響を及ぼすのかを理解するために、貪食アッセイを実施した。具体的には、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ ＫＯ細胞はその「自己喪失」によりマクロファージによる殺傷を誘導するため、観察された細胞殺傷のメカニズムが貪食によるものなのか、細胞傷害性産物の放出によるものなのかを明らかにする試験が行われた。更に、ＣＤ４７の過剰発現がマクロファージによる瀕死／死細胞のクリアランス機構に影響を及ぼしているかを評価するために、完全細胞、アポトーシス細胞、及び壊死細胞を用いた試験も実施された。

【1164】

Ａ．方法
フローサイトメトリー。ヒト初代膵島細胞におけるＣＤ４７の発現を、フローサイトメトリーによって評価した。

【1165】

貪食アッセイ。野生型ヒト初代膵島細胞（全、アポトーシス及び壊死）、Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞（全、アポトーシス及び壊死）、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（全、アポトーシス及び壊死）を、マクロファージとインキュベートした。場合によっては、ＦｃＲに結合して貪食を媒介する抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１抗体を添加した。β膵島細胞の貪食は、１時間のインキュベート後にフローサイトメトリーによるｐＨｒｏｄｏ（商標）貪食アッセイを使用して評価した。

【1166】

Ｂ．結果
試験結果を以下にまとめる。代表的なドナーの結果が示されている。

【1167】

以前の結果と一致して、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４７を過剰発現するように操作されていないＢ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞が低レベルのＣＤ４７表面発現を示し（図１６、左パネルに示すように、アイソタイプ対照の２倍）、一方でＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代β膵島細胞は、ＣＤ４７の発現の増加を示した（図１６、右パネルに示すように、アイソタイプ対照の２８倍）ことが確認された。

【1168】

図１７に示すように、全野生型ヒト初代膵島細胞、全Ｂ２Ｍ^－／－ヒト初代膵島細胞、及び全Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、マクロファージによる貪食を回避する。対照的に、各細胞種の壊死性及びアポトーシス性ヒト初代膵島細胞は、マクロファージによって貪食された。したがって、ＣＤ４７の過剰発現は、アポトーシス性または壊死性Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の貪食を妨げず、これは、膵島拒絶後に重要であり得る。更に、抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１融合タンパク質は、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞（全、アポトーシス及び壊死）の貪食を誘導する。

【1169】

実施例９：Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞のＩｇ媒介性貪食の評価
抗ＣＤ４７抗体（１００μｇ／ｍｌ）（ＩｇＧ１ ＦｃまたはＩｇＧ４ Ｆｃのいずれか）を、Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）マクロファージと共にインキュベートした。β膵島細胞の貪食は、１時間のインキュベート後にフローサイトメトリーによるｐＨｒｏｄｏ（商標）貪食アッセイを使用して評価した。

【1170】

図１８に示すように、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞及びマクロファージ（Ｍａｃ）単独対照は、マクロファージによって貪食されなかった。対照的に、抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１ ＦｃとインキュベートしたＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は貪食されたが、抗ＣＤ４７－ＩｇＧ４ Ｆｃは貪食されなかった。観察された貪食は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を介したＩｇＧ１ Ｆｃ結合によるものだった。ＩｇＧ４結合はＩｇＧ１ほど強いＦｃＲ結合をもたらさず、これは、ＩｇＧ４ Ｆｃによる貪食レベルが低いことと一致している。

【1171】

実施例１０：免疫不全糖尿病マウス移植試験におけるＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の生存及び機能性
低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）ヒト初代膵島細胞を実施例４に記載のように作製し、免疫不全糖尿病ＮＳＧレシピエントマウスに移植した。マウスにおける糖尿病の発生率、移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の生存及び機能性を、移植された野生型ヒト初代膵島細胞と比較して、経時的に監視した。

【1172】

Ａ．方法
移植試験の設計及び投与。２５匹のＮＳＧマウス（マウス体重１８～２０ｇ）を、糖尿病を誘発するためのＳＴＺ投与後、試験群にランダムに分けた。そこで、投与された細胞（野生型、Ｂ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇ、及びＢ２Ｍ^－／－ヒト膵島細胞）に基づいて、群は異なった。試験群は以下のとおりであった：野生型ヒト膵島（ｌｕｃ＋）の筋肉内移植、移植なしの糖尿病対照、及びＢ２Ｍ^－／－ＣＤ４７ｔｇヒト膵島（ｌｕｃ＋）筋肉内移植。

【1173】

１クラスター当たり約１，５００個の細胞の３００のヒト膵島クラスターを、筋肉内注射によってマウスに移植した。０日目（ｄ０）を移植の日として定義した。マウスを、膵島細胞の生存の指標として生物発光（ＢＬＩ）を、及び糖尿病の指標として４時間の絶食後のグルコースレベルを監視した。試験の２９日目に糖負荷を実施した。

【1174】

Ｃペプチドアッセイ。ヒト初代膵島細胞のＣペプチドレベルを、検出した。

【1175】

Ｂ．結果
試験結果を以下にまとめる。代表的な結果が示されているが、同様の結果は様々なドナーでも観察された。

【1176】

Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、移植後も生存する。筋肉内注射後のヒト初代膵島細胞のＢＬＩ画像を、図１９Ａ（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞）及び図１９Ｄ（ＷＴヒト初代膵島細胞）に示す。生物発光は、細胞の投与後、両方の群の筋肉内注射部位で最初に観察された。移植されたＷＴヒト初代膵島細胞について検出された生物発光は、試験期間中持続し、これは、免疫不全糖尿病マウスにおいてＷＴ膵島が生存し、機能することを示した（図１９Ｄ）。同様に、移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞から検出された生物発光も、移植後２９日間維持され、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の生存及び増殖が示された（図１９Ａ）。これらの結果は、ＨＩＰ編集が膵島細胞の生存と機能を損なわないことを更に示している。

【1177】

Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、同種異系移植後に機能する。移植されたヒト初代膵島細胞の特定の機能を分析するために、移植の６日後に血糖値を測定した。この試験では、両方のマウス群について、筋肉内注射を受けた糖尿病（ＳＴＺ処置）マウスの空腹時血糖値は、図１９Ｂ（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞）及び図１９Ｅ（ＷＴヒト初代膵島細胞）に示すように、移植後すぐに低下した。更に、マウスは、糖負荷に耐えることに成功した（図１９Ｂ及び図１９Ｅ）。

【1178】

移植されたヒト初代膵島細胞の機能を更に分析するために、移植後にＣペプチドレベルを測定した。ＷＴヒト初代膵島細胞またはＢ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の筋肉内注射を受けた糖尿病（ＳＴＺ処置）マウスにおけるＣペプチドレベルは、図１９Ｆ（図１９Ｃ）にそれぞれ示すように、高いマウスであった。

【1179】

これらのデータは、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞への編集は、免疫系を持たない糖尿病ＮＳＧマウスの膵島の生存または機能に影響を及ぼさなかったことを示している。

【1180】

実施例１１：移植試験における、抗ＣＤ４７及びアイソタイプ対照と共に、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞におけるＣＤ４７シグナル伝達の評価
低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）ヒト初代膵島細胞を実施例４に記載のとおり作製し、実施例４に記載の技術を使用してＣＩＩＴＡを更にノックアウトし、抗ＣＤ４７及びアイソタイプ対照と共に同種異系糖尿病ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３レシピエントマウスに移植した。マウスにおける糖尿病の発生率、移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の生存及び機能性を、移植された野生型ヒト初代膵島細胞と比較して、経時的に監視した。

【1181】

Ａ．方法
移植試験の設計及び投与。２５匹のヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（マウス体重１８～２０ｇ）を、糖尿病を誘発するためのＳＴＺ投与後、試験群にランダムに分け、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト膵島細胞を投与した。試験群は以下のとおりであった：Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト膵島細胞（ｌｕｃ＋）筋肉内移植＋抗ＣＤ４７筋肉内移植、局所投与。Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト膵島細胞（ｌｕｃ＋）筋肉内移植＋抗ＣＤ４７筋肉内移植、全身投与。Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト膵島細胞（ｌｕｃ＋）筋肉内移植＋アイソタイプ対照筋肉内移植、局所投与。Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト膵島細胞（ｌｕｃ＋）筋肉内移植＋アイソタイプ対照筋肉内移植、全身投与。

【1182】

１クラスター当たり約１，５００個の細胞の３００のヒト膵島クラスターを、筋肉内注射によってマウスに移植した。０日目（ｄ０）を移植の日として定義した。抗ＣＤ４７またはアイソタイプ対照を、局所投与または全身投与のいずれかによって、８日目（ｄ８）にマウスに筋肉内注射によって移植した。

【1183】

マウスを、膵島細胞の生存の指標として生物発光（ＢＬＩ）について監視し、糖尿病を監視するために４時間の絶食後のグルコースレベルを監視した。試験の２９日目に糖負荷を実施した。

【1184】

Ｂ．結果
Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、抗ＣＤ４７を添加すると同種異系移植後に生存しない。アイソタイプ対照による局所及び全身筋肉内注射後の筋肉内移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞のＢＬＩ画像を、それぞれ図２０Ａ及び図２１Ａに示し、抗ＣＤ４７による局所及び全身筋肉内注射後の筋肉内移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞のＢＬＩ画像を、それぞれ図２０Ｃ及び図２１Ｃに示す。移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、抗ＣＤ４７の非存在下（すなわち、アイソタイプ対照の局所または全身添加後）で生存及び増殖し続ける（図２０Ａ及び図２１Ａ）。対照的に、移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、移植後８日目に投与された抗ＣＤ４７の局所投与または全身投与の開始後に急速に減少し（図２０Ｃ及び図２１Ｃ）、これは、ＣＤ４７をブロックすることによって、自然免疫細胞によるＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の死を示す。

【1185】

これらのデータは、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞におけるＣＤ４７－ＳＩＲＰシグナル伝達の遮断により、免疫系によって外来細胞として認識され、細胞殺傷が生じることを示し、更にＣＤ４７の過剰発現が改変された細胞による免疫回避に寄与していることを裏付けている。

【1186】

Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞は、抗ＣＤ４７を添加した場合、同種異系移植後に機能しない。移植されたヒト初代膵島細胞の特定の機能を分析するために、移植の６日後に血糖値を測定した。Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の筋肉内注射を受けた糖尿病（ＳＴＺ処置）マウスの絶食後約４時間で測定された血糖値は、図２０Ｂ、図２０Ｄ、図２１Ｂ及び図２１Ｄに示されるように、移植後すぐに減少し、アイソタイプ対照の局所投与及び全身投与の両方の後では低いままだった（それぞれ、図２０Ｂ及び図２１Ｂ）。しかし、Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代膵島細胞の筋肉内注射、それに続く抗ＣＤ４７の局所投与または全身投与を受けたマウスは、血糖値の上昇を示した（それぞれ、図２０Ｄ及び図２１Ｄ）。

【1187】

実施例１２：移植試験におけるＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ非ヒト霊長類初代β膵島細胞の評価
低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）非ヒト霊長類（ＮＨＰ）初代β膵島細胞を作製し、同種異系レシピエントＮＨＰに移植した。移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ ＮＨＰ初代膵島細胞の生存及び機能性を、移植された野生型ヒト初代β膵島細胞と比較して、経時的に監視した。

【1188】

Ａ．方法
ＮＨＰ初代β膵島細胞の作製及び細胞工学。標準的な技術を使用して、ＮＨＰ膵臓から初代β膵島細胞を単離した。そのような技術は当技術分野で公知であり、標準的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して、単離された細胞を操作してＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡをノックアウトし、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含有するレンチウイルスベクターを使用して、外因性ＣＤ４７タンパク質をコードする導入遺伝子（ｔｇ）を形質導入した。低免疫膵島を、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩ及びＣＤ４７過剰発現に対して陰性の細胞についてフローサイトメトリーによって選別した。

【1189】

移植試験の設計及び投与。１クラスター当たり約１，５００個の細胞の３００のＮＨＰ膵島クラスターを、筋肉内注射によってＮＨＰに移植した。０日目（ｄ０）を移植の日として定義した。

【1190】

Ｔ細胞酵素結合免疫吸収ＳＰＯＴ（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ。ＮＨＰ初代β膵島細胞におけるインターフェロンγ（ＩＦＮｇ）分泌ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴによって検出した。

【1191】

フローサイトメトリー。初代β膵島細胞におけるドナー特異的抗体（ＤＳＡ）の発現を、フローサイトメトリーによって評価した。

【1192】

ＮＫ細胞殺傷アッセイ。ＮＫ細胞殺傷アッセイは、実質的に上記の実施例に記載したように実施した。

【1193】

Ｂ．結果
Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ ＮＨＰ膵島細胞は、移植後も生存する。筋肉内注射後のＮＨＰ Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代膵島細胞のＢＬＩイメージング結果の定量化を、図２２Ａに示す。筋肉内注射後のＮＨＰ Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代膵島細胞の対応するＢＬＩ画像を、図２２Ｂに示す。生物発光は、ＮＨＰ初代膵島細胞の投与後、すべての群の筋肉内注射部位で最初に観察された。移植されたＮＨＰ Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代膵島細胞から検出された光子の数は、移植後に最初はわずかに減少したが、移植後４２日間にわたって一貫したままであり、ＮＨＰ Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代膵島細胞の生存を示している（図２２Ａ）。

【1194】

同種異系移植後のＮＨＰ Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代膵島細胞免疫応答。移植されたＮＨＰ初代β膵島細胞に対する免疫応答を分析するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇサイトカイン分泌のレベルを評価した。図２３Ａに示すように、移植されたＮＨＰ Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代膵島細胞は、低レベルのＩＦＮｇを示した。フローサイトメトリーで測定したＤＳＡ ＩｇＭ及びＩｇＧのレベルも、移植されたＮＨＰ Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代膵島細胞では低かった（それぞれ、図２３Ｂ及び図２３Ｃ）。更に、ＮＨＰ Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代膵島細胞による移植前に、高ＩｇＧ抗体濃度で感作されたＮＨＰレシピエントでは、ＤＳＡ ＩｇＧのレベルは、移植後４２日間にわたって減少した（図２３Ｄ）。

【1195】

これらのデータは、ＮＨＰ Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代膵島細胞は、移植時に細胞に対する免疫応答を誘導せず、抗体の媒介による拒絶反応から保護されることを示している。

【1196】

Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ ＮＨＰ初代膵島細胞は、ＮＫ細胞による殺傷を回避する。Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ ＮＨＰ初代膵島細胞は、ＮＫ媒介性細胞殺傷を示さなかった（図２４）。これは、低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）ＮＨＰ初代膵島細胞が、ＮＫ細胞による免疫応答を効果的に回避できることを示している。これらのデータは、移植されたＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ ＮＨＰ初代膵島細胞が、外来細胞として認識されないことを示している。

【1197】

実施例１３：ヒト初代膵島細胞の遺伝子編集
初代膵島細胞を標準的な技術を使用してヒト死体ドナーから単離し、ＡＣＣＵＭＡＸ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞解離溶液を使用して３７℃で１０分間、細胞を単一細胞を含有する懸濁液に解離させた。解離させた細胞懸濁液を、Ｃａｓ９酵素と、ヒトＢ２Ｍ遺伝子及びヒトＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡと、を含有するリボ核タンパク質複合体でエレクトロポレーションした。

【1198】

ヒトＢ２Ｍ遺伝子は配列番号３３のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を用いて破壊され、ヒトＣＩＩ２Ａ遺伝子は配列番号３４のｇＲＮＡ配列を用いて破壊された。ヒト初代膵島細胞を、ＰＩＭ（Ｓ）培地（Ｐｒｏｄｏ）に５０，０００細胞／ウェルを含むＵ底９６ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間静置した後、プレートをヒト初代膵島細胞の再クラスター化のためのベリーダンサーオービタルシェーカー（ＩＢＩ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ）に移した。４８時間後に完全培地交換を実行し、ヒト初代膵島細胞クラスターをベリーダンサーオービタルシェーカー上で更に２４時間インキュベートした。

【1199】

編集された膵島を濃縮するために、再クラスター化されたヒト初代膵島クラスターを、抗ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体（クローンＧ４６＿２．６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＩｇＧ１アイソタイプ適合対照抗体（クローンＭＯＰＣ－２１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び抗ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ抗体（クローンＴｕ３ａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＩｇＧ２ａアイソタイプ適合対照抗体（クローンＧ１５５‐１７８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＡＣＣＵＭＡＸ（商標）を使用して、単一細胞に細胞選別するために解離させた。ダブルネガティブヒト初代膵島細胞をＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩで選別し、ベリーダンサーオービタルシェーカーで再クラスター化するために上記のようにＵ底９６ウェルのプレートに再播種した。

【1200】

２４時間後、ヒト初代膵島細胞を単一細胞に解離し、ＣＤ４７をコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。形質導入されたヒト初代膵島細胞を、ベリーダンサーオービタルシェーカー上で再クラスター化するために上記のようにＵ底９６ウェルプレートに再播種した。４８時間後、ＡＣＣＵＭＡＸ（商標）を使用してヒト初代膵島細胞を単一細胞に解離させ、抗ＣＤ４７抗体（クローンＢ６Ｈ１２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または ＩｇＧ１アイソタイプ適合対照抗体（クローンＭＯＰＣ－２１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してヒトＣＤ４７の細胞選別を行い、ＣＤ４７を過剰発現する形質導入細胞を選択した。ヒト初代膵島細胞を、ベリーダンサーオービタルシェーカー上で再クラスター化するために上記のようにＵ底９６ウェルプレートに再播種した。

【1201】

動きを伴って細胞をインキュベートする代わりに、膵島細胞を３７℃及び５％ＣＯ_２の静的条件下で（動きなし）インキュベートしたことを除いて、同様のプロセスを実行した。このプロセスでは、静的条件により再クラスター化が損なわれ、生存率がわずか約３５％と低かった。理論に束縛されるものではないが、提供された結果は、遺伝子編集のプロセス中に細胞を動きに供すると、細胞の生存率及び遺伝子編集の効率が向上することを裏付ける。

【1202】

実施例１４：Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇヒト初代網膜色素上皮細胞の評価
この実施例では、（１）Ｂ２Ｍをノックアウトして（Ｂ２Ｍ^－／－）ＨＬＡクラスＩ発現を低減させる、（２）ＣＩＩＴＡをノックアウトして（ＣＩＩＴＡ－／－）ＨＬＡクラスＩＩ発現を低減させる、及び（３）外因性ＣＤ４７（ＣＤ４７ｔｇ）を過剰発現させるように操作された、低免疫ヒト初代網膜色素上皮（^ＲＰＥ）細胞を特徴付ける試験について説明する。低免疫（Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ）ヒト初代ＲＰＥ細胞を、野生型（ＷＴ）ヒト初代ＲＰＥ細胞またはダブルノックアウト（Ｂ２Ｍ^－／－ＣＩＩＴＡ^－／－）ヒト初代ＲＰＥ細胞と比較して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びマクロファージによる細胞殺傷からの保護について監視した。

【1203】

Ａ．方法
ヒト初代ＲＰＥの作製及び細胞工学。初代ＲＰＥ細胞はヒト死体眼球から単離され、凍結保存された。単離したＲＰＥ細胞を解凍し、次にＳｙｎｔｈｅｍａｘ（３５３５ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）でコーティングしたプレート上に播種した。低免疫細胞を作製するために、標準的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して、播種した細胞をＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡをノックアウトするように操作し、約２日後に播種した細胞の培地を交換し、次に細胞はそのまま放置するか、またはＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含有するレンチウイルスベクターを使用して、外因性ＣＤ４７タンパク質をコードする導入遺伝子（ｔｇ）を形質導入することによって更に操作された。２日後、培地を再度交換し、次に敷石状形態が形成された時点（例えば、６日目）で細胞を収集し、ＨＬＡクラスＩ／ＩＩ（Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＩＩＴＡ^－／－ダブルノックアウト、ｄＫＯ）、場合によってはＣＤ４７過剰発現（Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＩＩＴＡ^－／－ＣＤ４７ｔｇ）に対して陰性の細胞をフローサイトメトリーで選別した。

【1204】

ＮＫ細胞及びマクロファージ殺傷アッセイ。ＮＫ細胞殺傷アッセイ及びマクロファージ殺傷アッセイは、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＭＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行され、細胞増殖及び細胞の生存率を無標識で監視した。未改変（野生型）ヒト初代ＲＰＥ、Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＩＩＴＡ^－／－改変ヒト初代ＲＰＥ、またはＢ２Ｍ^－／－、ＣＩＩＴＡ^－／－、ＣＤ４７ｔｇ改変ヒト初代ＲＰＥを、ラミニン、コラーゲン及びフィブロネクチンでコーティングした９６ウェルＥプレートに播種した。ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅソフトウェアを使用し、接着及び細胞殺傷の尺度として細胞指数（ＣＩ）を測定した（細胞指数の減少は、細胞殺傷の増加を示す）。ＣＩ値が０．７に達した後、分化したヒト初代ＮＫ細胞またはヒトマクロファージ（両方ともＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１で添加した。

【1205】

Ｂ．結果
ヒトＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ＲＰＥ細胞は、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩを発現せず、ＣＤ４７発現が増加している。ＭＨＣ－Ｉ及びＭＣＨ－ＩＩ、ならびにＣＤ４７の発現をフローサイトメトリーによって評価した。単離されたヒト初代ＲＰＥ細胞は、ＭＨＣ－Ｉに対して陽性であり、ＭＨＣ－ＩＩを発現せず、ＣＤ４７の発現が低かった（図２５、上のパネル）。ヒトＢ２Ｍ^－／－／ＣＩＩＴＡ^－／－ｄＫＯ初代ＲＰＥ細胞及びＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ＲＰＥ細胞は、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩの両方に対して陰性であった（図２５、中央及び下のパネル）。Ｂ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ＲＰＥ細胞のみは、ＣＤ４７の発現の増加を示した（図２５、下パネルに示すように、アイソタイプ対照の２０倍）。

【1206】

ヒトＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ＲＰＥ細胞は、ＮＫ細胞及びマクロファージ殺傷を回避する。未改変（野生型）初代ＲＰＥ細胞は、ＮＫ細胞（図２６Ａ）またはマクロファージ（図２６Ｄ）によって殺傷されず、これは、自然免疫殺傷に対する野生型細胞の耐性と一致する。ヒトＢ２Ｍ^－／－ＣＩＩＴＡ^－／－初代ＲＰＥ細胞は、ＮＫ細胞（図２６Ｂ）及びマクロファージ（図２６Ｅ）によって殺傷され、これは、ヒトＢ２Ｍ^－／－ＣＩＩＴＡ^－／－初代ＲＰＥ細胞は、細胞表面上にＨＬＡ分子を欠失し、ＮＫ細胞及びマクロファージによる自己喪失殺傷を誘発することを示している。対照的に、表面分子ＣＤ４７を更に過剰発現したヒトＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ＲＰＥ細胞は、ＮＫ媒介性細胞殺傷（図２６Ｃ）またはマクロファージ媒介性細胞殺傷（図２６Ｆ）を示さなかった。自然ＮＫ細胞またはマクロファージ（標的細胞のみ）の非存在下では、ＲＰＥ細胞のいずれの殺傷も観察されなかった（図２６Ｇ～図２６Ｉ）。

【1207】

これらのデータは、ヒトＢ２Ｍ^－／－；ＣＩＩＴＡ^－／－；ＣＤ４７ｔｇ初代ＲＰＥ細胞は低免疫力であり、ＮＫ細胞及びマクロファージによる免疫応答を効果的に回避することを示している。

【1208】

本発明は、例えば、本発明の様々な態様を例示するために提供される特定の開示される実施形態に範囲が限定されることを意図していない。記載された組成物及び方法に対する様々な改変は、本明細書の記載及び教示から明らかになるであろう。そのような変形は、本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく実施することができ、本開示の範囲内に含まれることが意図されている。

【1209】

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図10I】

【図10J】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【図20-1】

【図20-2】

【図21-1】

【図21-2】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【配列表】

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【国際調査報告】