特表 2024-531265 ウイルス膜融合阻害剤を最適化する方法、および広域スペクトルの抗コロナウイルスリポペプチドとその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-29

(54)【発明の名称】ウイルス膜融合阻害剤を最適化する方法、および広域スペクトルの抗コロナウイルスリポペプチドとその応用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/00 20060101AFI20240822BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20240822BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240822BHJP

【ＦＩ】

C07K14/00 ZNA

A61P31/14

A61K47/62

A61K38/16

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024508915

(86)(22)【出願日】2022-05-19

(85)【翻訳文提出日】2024-02-09

(86)【国際出願番号】 CN2022094001

(87)【国際公開番号】W WO2023155318

(87)【国際公開日】2023-08-24

(31)【優先権主張番号】202210156260.2

(32)【優先日】2022-02-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524056363

【氏名又は名称】悦康薬業集団股分有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】何玉先

(72)【発明者】

【氏名】朱園美

(72)【発明者】

【氏名】種輝輝

(72)【発明者】

【氏名】劉念

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076CC35

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF63

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084NA14

4C084ZB33

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA55

4H045BA56

4H045EA20

4H045FA10

(57)【要約】

本開示は、ウイルス膜融合阻害剤を最適化する方法、および広域スペクトルの抗コロナウイルスリポペプチドとその応用に関する。本開示は、化合物またはその薬学的に許容可能な塩またはその誘導体を提供し、前記化合物は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表され、Ｘ_１はアミノ末端保護基であり、Ｘ_２はポリペプチドであり、アミノ酸配列は（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであり、Ｘ_３は、リジンまたはシステインまたは２，３－ジアミノプロピオン酸またはオルニチンまたは２，４－ジアミノブタン酸または２，７－ジアミノヘプタン酸であり、Ｘ_４はＸ_３に修飾された親油性の化合物官能基であり、またはＸ_２のＫに修飾された親油性の化合物官能基であり、Ｘ_５はカルボキシ末端保護基である。本開示の化合物は、性質が安定であり、コロナウイルスに起因する疾患を予防および治療するための薬物組成物の調製に用いられ、非常に効果的で広域スペクトルの新型コロナウイルス膜融合阻害剤であり、前記薬物組成物は、コロナウイルスに起因する疾患の予防および治療のために使用される。

【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩またはその誘導体であって、

【化1】

式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、Ｘ_１はアミノ末端保護基であり、
式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、Ｘ_２はポリペプチドであり、アミノ酸配列は（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであり、ｎはＥＡＡＡＫ配列の繰り返し回数を表す５以下の自然数であり、
式（Ｉ）において、Ｘ_３は、リジンまたはシステインまたは２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）またはオルニチン（Ｏｒｎ）または２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）または２，７－ジアミノヘプタン酸（Ｄａｈ）であり、
式（Ｉ）において、Ｘ_４はＸ_３に修飾された親油性の化合物官能基であり、
式（ＩＩ）において、Ｘ_４はＸ_２のＫに修飾された親油性の化合物官能基であり、
式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、Ｘ_５はカルボキシ末端保護基である、化合物またはその薬学的に許容可能な塩またはその誘導体。

【請求項2】

前記化合物は、式（Ｉ）で表される化合物であり、
そのうちＸ_１はアセチル基（Ａｃ）であり、Ｘ_２はＥＡＡＡＫであり、Ｘ_３はリジンであり、親油性の化合物はコレステロールコハク酸モノエステルであり、Ｘ_５はＮＨ_２である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩またはその誘導体。

【請求項3】

前記化合物は、式（Ｉ）で表される化合物であり、
そのうちＸ_１はアセチル基（Ａｃ）であり、Ｘ_２はＥＡＡＡＫであり、Ｘ_３はリジンであり、親油性の化合物は塩化ステアリルであり、Ｘ_５はＮＨ_２である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩またはその誘導体。

【請求項4】

下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかの多量体であって、
（ａ１）請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物で形成される多量体であり、
（ａ２）請求項１～３のいずれか１項に記載の薬学的に許容可能な塩で形成される多量体であり、
（ａ３）請求項１～３のいずれか１項に記載の誘導体で形成される多量体である、多量体。

【請求項5】

下記（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの応用であって、
（ｂ１）コロナウイルス膜融合阻害剤の調製における応用であり、
（ｂ２）コロナウイルスに起因する疾患を予防および／または治療するための薬物の調製における応用であり、
（ｂ３）コロナウイルス膜融合阻害剤としての応用であり、
（ｂ４）コロナウイルスに起因する疾患を予防および／または治療するための応用である、請求項１～３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩またはその誘導体の応用。

【請求項6】

請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩またはその誘導体を含む製品であって、
前記製品は、下記（ｃ１）または（ｃ２）の機能を果たし、
（ｃ１）コロナウイルス膜融合阻害剤としての機能であり、
（ｃ２）コロナウイルスに起因する疾患を予防および／または治療する機能である、製品。

【請求項7】

ウイルス膜融合阻害剤の抗ウイルス活性および／または安定性を増強する製品の調製におけるリンカーポリペプチドの応用であって、
前記リンカーポリペプチドのアミノ酸配列は（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであり、ｎは５以下の自然数である、応用。

【請求項8】

ウイルス膜融合阻害剤の抗ウイルス活性および／または安定性を増強する方法であって、
前記方法は、リンカーポリペプチドをウイルス膜融合阻害剤に連結するステップを含み、そのうち前記リンカーポリペプチドのアミノ酸配列は、（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであり、ｎは５以下の自然数である、方法。

【請求項9】

下記ステップ（ｄ１）またはステップ（ｄ２）を含む、改変されたウイルス膜融合阻害剤の調製方法であって、
（ｄ１）アミノ酸配列が（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであるリンカーポリペプチドを連結アームとして用い、改変前のウイルス膜融合阻害剤とＸ_３（Ｘ_４）基を連結することによりリポペプチドを取得し、Ｘ_３（Ｘ_４）基において、Ｘ_４はＸ_３に修飾され、Ｘ_３はリジンまたはシステインまたは２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）またはオルニチン（Ｏｒｎ）または２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）または２，７－ジアミノヘプタン酸（Ｄａｈ）であり、Ｘ_４は親油性の化合物官能基であり、ｎは５以下の自然数であり、
（ｄ２）アミノ酸配列が（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであるリンカーポリペプチドを連結アームとして用い、改変前のウイルス膜融合阻害剤とＸ_４基を連結することによりリポペプチドを取得し、そのうちＸ_４は、親油性の化合物官能基であり、リンカーポリペプチドのＫに修飾され、ｎは５以下の自然数であり、
前記リポペプチドは、改変後のウイルス膜融合阻害剤である、調製方法。

【請求項10】

下記（ｅ１）または（ｅ２）の改変されたウイルス膜融合阻害剤であって、
（ｅ１）アミノ酸配列が（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであるリンカーポリペプチドを連結アームとして用い、改変前のウイルス膜融合阻害剤とＸ_３（Ｘ_４）基を連結することによりリポペプチドを取得し、Ｘ_３（Ｘ_４）基において、Ｘ_４はＸ_３に修飾され、Ｘ_３はリジンまたはシステインまたは２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）またはオルニチン（Ｏｒｎ）または２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）または２，７－ジアミノヘプタン酸（Ｄａｈ）であり、Ｘ_４は親油性の化合物官能基であり、ｎは５以下の自然数であり、
（ｅ２）アミノ酸配列が（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであるリンカーポリペプチドを連結アームとして用い、改変前のウイルス膜融合阻害剤とＸ_４基を連結することによりリポペプチドを取得し、そのうちＸ_４は、親油性の化合物官能基であり、リンカーポリペプチドのＫに修飾され、ｎは５以下の自然数であり、
前記リポペプチドは、改変後のウイルス膜融合阻害剤である、改変されたウイルス膜融合阻害剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ウイルス膜融合阻害剤を最適化する方法、および広域スペクトルの抗コロナウイルスリポペプチドとその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

膜融合は、極めて重要な生物学的現象であり、例えば受精卵の形成や細胞内小胞輸送などの生理的プロセスは膜融合によって達成される。エイズウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、サーズ（ＳＡＲＳ）コロナウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス、そして現在人類の集団に猛威を振るっている新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）など、ヒトの健康に深刻な脅威をもたらす数多くのウイルスも膜融合によって宿主細胞に感染する。ウイルス膜融合は、ＨＩＶのエンベロープタンパク質のｇｐ４１サブユニットやコロナウイルスのスパイクＳタンパク質のＳ２サブユニットなどのウイルス粒子表面に存在する融合タンパク質によって媒介される。融合タンパク質は、通常、配列構造において融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタペプチドリピートドメイン１（ＨＲ１）、ヘプタペプチドリピートドメイン２（ＨＲ２）および膜貫通領域（ＴＭ）などの重要な機能領域を含む。ウイルス膜融合の際、融合タンパク質は劇的なコンフォメーション変化を起こし、まずＦＰが露出して標的細胞膜に挿入され、続いてＨＲ１が三量体らせんを形成し、ＨＲ２がＨＲ１三量体によって形成された溝の中に逆方向に折り畳まれて典型的な六重らせん束構造（６－ＨＢ）となり、それによってウイルス膜と細胞膜を引き寄せて融合反応を引き起し、ウイルスの遺伝子物質が融合孔を通過して標的細胞内に入ることを可能にする。研究により、多くのウィルスＨＲ１およびＨＲ２領域に由来するポリペプチドが、融合前の状態にある融合タンパク質に競合的に結合して６－ＨＢ構造の形成を阻害する作用機序によって、ウイルス膜融合阻害剤として作用することが見出された。現在、ＨＩＶ治療薬であるＴ２０（エンフビルペプチド）は、米国で唯一ＦＤＡによって臨床使用が承認されているウィルス膜融合阻害薬であり、かかる標的をターゲットとした抗ウィルス薬の開発が日増しに重視されつつある。ポリペプチドの半減期と抗ウィルス活性を向上させるため、脂質化合物（例えば、脂肪酸とコレステロールなど）の修飾を利用したリポペプチド（ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ）が近年のウィルス膜融合阻害薬の開発で注目を浴びている（非特許文献１）。

【0003】

コロナウイルス（ＣｏＶ）は、エンベロープを持つ一本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、α、β、γとδの４つの属に分類される。現在ヒトに感染することが知られているＣｏＶには、α属のＨＣｏＶ－２２９ＥおよびＨＣｏＶ－ＮＬ６３、β属のＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が含まれる。ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３およびＣｏＶ－ＨＫＵ１は、一般的に流行している病原菌であり、通常は普通の風邪症状のみを引き起こし、成人の上気道感染症の約１０％～３０％を占めるが、それでも小児、高齢者、免疫不全患者において重篤な、あるいは致命的な病気を引き起こす可能性がある。一方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は高病原性病原体に属し、高い致死率を伴う重篤な肺疾患を引き起こす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびコウモリコロナウイルスＳＬ－ＣｏＶ－ＲａＴＧ１３とそれぞれ７９．５％と９６％の配列相同性を持ち、かつ同じ細胞受容体（ＡＣＥ２）を使用し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＳＡＲＳ－ＣｏＶよりも高い伝播能力を持っている。２０２２年１月末までに、全世界で約３億６，０００万件の累積新型コロナ確認症例（ＣＯＶＩＤ－１９）が報告され、そのうち５６０万例を超える患者が命を落とした（ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、流行に伴いアルファ株（Ａｌｐｈａ）、ベータ株（Ｂｅｔａ）、ガンマ株（Ｇａｍｍａ）、デルタ株（Ｄｅｌｔａ）、オミクロン株（Ｏｍｉｃｒｏｎ）など、特に懸念される変異株（ＶＯＣ）を生み出し続けており、その結果、ワクチンや薬物の効力が低下したり、効かなくなったりすることが多い。そのため、効率的で且つ広域スペクトルのコロナウイルス阻害剤の開発が必要とされている。

【0004】

つまり、当分野では、異なる突然変異を含む多くの異なるタイプのコロナウイルスを阻害することができ、効率的で且つ広域スペクトルのコロナウイルス阻害剤の開発が期待されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Xue J, Chong H, Zhu Y, Zhang J, Tong L, Lu J, Chen T, Cong Z, Wei Q, He Y.2022. Efficient treatment and pre-exposure prophylaxis in rhesus macaques by an HIV fusion-inhibitory lipopeptide. Cell 185:131-144 e18.

【非特許文献2】Zhu Y, Yu D, Hu Y, Wu T, Chong H, He Y.2021. SARS-CoV-2-derived fusion inhibitor lipopeptides exhibit highly potent and broad-spectrum activity against divergent human coronaviruses. Signal Transduct Target Ther 6:294.

【非特許文献3】Yu D, Zhu Y, Yan H, Wu T, Chong H, He Y.2021. Pan-coronavirus fusion inhibitors possess potent inhibitory activity against HIV-1, HIV-2, and simian immunodeficiency virus. Emerg Microbes Infect 10:810-821.

【非特許文献4】Yu D, Zhu Y, Jiao T, Wu T, Xiao X, Qin B, Chong H, Lei X, Ren L, Cui S, Wang J, He Y.2021. Structure-based design and characterization of novel fusion-inhibitory lipopeptides against SARS-CoV-2 and emerging variants. Emerg Microbes Infect 10:1227-1240.

【非特許文献5】Zhu Y, Yu D, Yan H, Chong H, He Y.2020. Design of Potent Membrane Fusion Inhibitors against SARS-CoV-2, an Emerging Coronavirus with High Fusogenic Activity. J Virol 94:e00635-20.

【非特許文献6】Zhou J, Xu W, Liu Z, Wang C, Xia S, Lan Q, Cai Y, Su S, Pu J, Xing L, Xie Y, Lu L, Jiang S, Wang Q.2021. A highly potent and stable pan-coronavirus fusion inhibitor as a candidate prophylactic and therapeutic for COVID-19 and other coronavirus diseases. Acta Pharm Sin B doi:10.1016/j.apsb.2021.07.026.

【非特許文献7】Xia S, Liu M, Wang C, Xu W, Lan Q, Feng S, Qi F, Bao L, Du L, Liu S, Qin C, Sun F, Shi Z, Zhu Y, Jiang S, Lu L.2020. Inhibition of SARS-CoV-2 (previously 2019-nCoV) infection by a highly potent pan-coronavirus fusion inhibitor targeting its spike protein that harbors a high capacity to mediate membrane fusion. Cell Res 30:343-355.

【非特許文献8】de Vries RD, Schmitz KS, Bovier FT, Predella C, Khao J, Noack D, Haagmans BL, Herfst S, Stearns KN, Drew-Bear J, Biswas S, Rockx B, McGill G, Dorrello NV, Gellman SH, Alabi CA, de Swart RL, Moscona A, Porotto M.2021. Intranasal fusion inhibitory lipopeptide prevents direct-contact SARS-CoV-2 transmission in ferrets. Science 371:1379-1382.

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本開示の科学研究チームは、ウイルス膜融合阻害薬の研究開発に取り組んでおり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびその突然変異株に対して比較的強い阻害活性を有し、リポペプチドベースの広域スペクトルを持つコロナウイルス膜融合阻害剤を設計することに至った（非特許文献２～５）。

【0007】

リポペプチドをベースとしたウイルス膜融合阻害剤の設計においては、通常、ポリペプチド配列と脂質部分（例えば、脂肪酸やコレステロールなど）の間に連結アームとして働くリンカーを組み込む必要がある。脂質部分の結合部位としてはウイルスまたは細胞膜が想定されるが、ポリペプチドが標的領域に集積されるため、脂質部分とポリペプチドの結合部位は異なる。ポリペプチドは構造上の剛性が強く、安定した二次構造を形成する傾向があり、ポリペプチドと脂質部分がそれぞれ適切なコンフォメーションを形成してそれぞれの結合部位に結合でき、同時にそれぞれの役割を十分に発揮しながらも立体障害などによる相互干渉を避ける観点から、ポリペプチドと脂質部分の間にはフレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅｌｉｎｋｅｒ）を用いて連結することが多い。一般的なフレキシブルリンカーとしては、グリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）の組み合わせが挙げられ、例えば（ＧＧＧＧＳ）ｎや（ＧＳＧＳＧ）ｎなどが用いられ、ｎの大きさを変えることで構造ドメイン間の距離を拡大したり縮小したりすることができる。もう一つの一般的なフレキシブルリンカーとしては、低分子のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ｎが挙げられ、そのうちｎは２～２４の範囲であることが多い。これまでに文献で報告されているコロナウイルス膜融合阻害剤として用いられるリポペプチドもフレキシブルリンカーを採用し、例えばＩＰＢ０２Ｖ１～ＩＰＢ０２Ｖ５はすべてＰＥＧ８であり（非特許文献２）、ＩＰＢ２４～ＩＰＢ２７はそれぞれＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ８であり（非特許文献４）、ＥＫＬ１ＣはＧＳＧであり（非特許文献６）、ＥＫ１Ｃ４は直列に連結したＧＳＧＳＧとＰＥＧ４であり（非特許文献７）、［ＳＡＲＳＨＲＣ－ＰＥＧ４］２－ｃｈｏｌはＰＥＧ４である（非特許文献８）。融合タンパク質の調製に使用される一般的な剛性リンカー（ｒｉｇｉｄ ｌｉｎｋｅｒ）としては、α－ヘリックスを形成しうる（ＥＡＡＡＫ）ｎ配列が挙げられ、これは内部水素結合および密接に連結したペプチド鎖骨格を持ち、剛性で安定な配列である。もう一つのタイプの剛性リンカーとしては、Ｐｒｏ－ｒｉｃｈ配列（ＸＰ）ｎを持ち、そのうちＸは任意のアミノ酸、好ましくはアラニン、リジンまたはグルタミン酸を割り当てることができ、（ＸＰ）ｎ配列はらせん構造を持たないが、そのうちのプロリンが骨格の剛性を高め、構造ドメインを分離するのに有効である。

【0008】

現在調製されているリポペプチドベースのウイルス膜融合阻害剤において剛性リンカーを用いる前例がなく、本開示では、剛性リンカーとしてＥＡＡＡＫ配列を創意的に使用することにより広域スペクトルのコロナウイルス膜融合阻害剤であるリポペプチドを調製し、ポリペプチドに顕著ならせん構造を与えるとともに、阻害剤の抗ウイルス活性および安定性を著しく向上させた。

【0009】

本開示は、ウイルス膜融合阻害剤を最適化する方法、および広域スペクトルの抗コロナウイルスリポペプチドとその応答を独創的に提供する。

【0010】

本開示において、剛性リンカーＥＡＡＡＫを持ち、式Ｉを有する化合物ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０、特にＩＰＢ２９が、当該リンカーを有しない化合物に比べて新型コロナウイルスを阻害する活性が少なくとも７０倍増加し、ＰＥＧまたはＧＳＧＳＧのようなフレキシブルリンカーを有する化合物に比べて阻害活性が約８倍増加することを初めて見出した。

【0011】

同時に、本発明者は、リポペプチドＩＰＢ２９の活性の増加は、剛性リンカーＥＡＡＡＫが当該リポペプチドのらせん含有量を著しく増加させ、同時に安定性を増加させることに起因することを見出した。また、このリポペプチドＩＰＢ２９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびそのさまざまな突然変異株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３およびＨＣｏＶ－ＮＬ６３などのコロナウイルスを含むがこれらに限定されない、多くの異なるタイプの新型コロナウイルスを阻害することができる。

【0012】

具体的には、本開示では、ポリペプチド配列と脂質化合物との間の連結アームとしてα－ヘリックス構造を持つ剛性リンカーＥＡＡＡＫ配列を用いることにより、α－ヘリックス構造、安定性、および抗ウイルス活性が著しく向上したことを特徴とする新規化合物を調製した。

【課題を解決するための手段】

【0013】

上記目的を達成すべく、本開示は、下記式（Ｉ）または下記式（ＩＩ）で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩またはその誘導体を提供する。

【化1】

【0014】

式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、Ｘ_１はアミノ末端保護基であり、
式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、Ｘ_２はポリペプチドであり、アミノ酸配列は（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであり、ｎはＥＡＡＡＫ配列の繰り返し回数を表す５以下の自然数であり、
式（Ｉ）において、Ｘ_３は、リジンまたはシステインまたは２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）またはオルニチン（Ｏｒｎ）または２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）または２，７－ジアミノヘプタン酸（Ｄａｈ）であり、
式（Ｉ）において、Ｘ_４はＸ_３に修飾された親油性の化合物官能基であり、
式（ＩＩ）において、Ｘ_４はＸ_２のＫに修飾された親油性の化合物官能基であり、
式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、Ｘ_５はカルボキシ末端保護基である。

【0015】

例示的に、Ｘ_１は、アセチル基（Ａｃ）、アミノ基（ＮＨ_２）、マレオイル基、スクシニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基またはベンジルオキシ基、或いは他の疎水性基または高分子担体基のうちいずれかである。

【0016】

例示的に、Ｘ_５は、アミノ基（ＮＨ_２）、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミド基またはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、或いは他の疎水性基または高分子担体基のうちいずれかである。

【0017】

例示的に、前記親油性の化合物は、コレステロールコハク酸モノエステル、２－コレステリル酢酸、２－コレステリルプロピオン酸、３－コレステリルプロピオン酸、２－コレステリル酪酸、２－コレステリルイソ酪酸、３－コレステリル酪酸、３－コレステリルイソ酪酸、４－コレステリル酪酸、２－コレステリル吉草酸、２－コレステリルイソ吉草酸、３－コレステリル吉草酸、５－コレステリル吉草酸、２－コレステリルヘキサン酸、６－コレステリルヘキサン酸、２－コレステリルヘプタン酸、７－コレステリルヘプタン酸、２－コレステリルオクタン酸、８－コレステリルオクタン酸、コレステリルブロモアセテート、炭素数８～２０の脂肪酸（例えば、オクタデカン酸）、ジヒドロ（ニューロ）スフィンゴシン、ビタミンＥなどの脂質化合物である。

【0018】

例示的に、前記親油性の化合物は塩化ステアリルである。

【0019】

例示的に、前記化合物はリポペプチドＩＰＢ２９である。リポペプチドＩＰＢ２９は式（Ｉ）で表される化合物であり、Ｘ_１はＡｃであり、Ｘ_２はＥＡＡＡＫであり、Ｘ_３はリジンであり、親油性の化合物はコレステロールコハク酸モノエステルであり、Ｘ_５はＮＨ_２である。

【0020】

例示的に、前記化合物はリポペプチドＩＰＢ３０である。リポペプチドＩＰＢ３０は式（Ｉ）で表される化合物であり、Ｘ_１はＡｃであり、Ｘ_２はＥＡＡＡＫであり、Ｘ_３はリジンであり、親油性の化合物は塩化ステアリルであり、Ｘ_５はＮＨ_２である。

【0021】

そのうちＥＡＡＡＫとは、（ＥＡＡＡＫ）ｎにおけるｎが１に等しい態様を指す。

【0022】

本開示は、さらに、下記（ａ１）または（ａ２）または（ａ３）の多量体を保護し、そのうち、
（ａ１）上記のいずれかに記載の化合物で形成される多量体であり、
（ａ２）上記のいずれかに記載の薬学的に許容可能な塩で形成される多量体であり、
（ａ３）上記のいずれかに記載の誘導体で形成される多量体である。

【0023】

本開示は、さらに、下記（ｂ１）または（ｂ２）または（ｂ３）または（ｂ４）の、上記のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩またはその誘導体の応用を保護し、そのうち、
（ｂ１）コロナウイルス膜融合阻害剤の調製における応用であり、
（ｂ２）コロナウイルスに起因する疾患を予防および／または治療するための薬物の調製における応用であり、
（ｂ３）コロナウイルス膜融合阻害剤としての応用であり、
（ｂ４）コロナウイルスに起因する疾患を予防および／または治療するための応用である。

【0024】

本開示は、さらに、上記のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩またはその誘導体を含む製品を保護し、前記製品は、下記（ｃ１）または（ｃ２）の機能を果たし、そのうち、
（ｃ１）コロナウイルス膜融合阻害剤としての機能であり、
（ｃ２）コロナウイルスに起因する疾患を予防および／または治療する機能である。

【0025】

本開示は、さらに、ウイルス膜融合阻害剤の抗ウイルス活性および／または安定性を増強する製品の調製におけるリンカーポリペプチドの応用を保護し、前記リンカーポリペプチドのアミノ酸配列は（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであり、ｎは５以下の自然数である。

【0026】

本開示は、さらに、ウイルス膜融合阻害剤の抗ウイルス活性および／または安定性を増強する方法を保護し、前記方法は、リンカーポリペプチドをウイルス膜融合阻害剤に連結するステップを含み、そのうち前記リンカーポリペプチドのアミノ酸配列は、（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであり、ｎは５以下の自然数である。

【0027】

本開示は、さらに、以下のステップ（ｄ１）またはステップ（ｄ２）を含む、改変されたウイルス膜融合阻害剤の調製方法を保護し、そのうち、
（ｄ１）アミノ酸配列が（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであるリンカーポリペプチドを連結アームとして用い、改変前のウイルス膜融合阻害剤とＸ_３（Ｘ_４）基を連結することによりリポペプチドを取得し、Ｘ_３（Ｘ_４）基において、Ｘ_４はＸ_３に修飾され、Ｘ_３はリジンまたはシステインまたは２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）またはオルニチン（Ｏｒｎ）または２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）または２，７－ジアミノヘプタン酸（Ｄａｈ）であり、Ｘ_４は親油性の化合物官能基であり、ｎは５以下の自然数であり、
（ｄ２）アミノ酸配列が（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであるリンカーポリペプチドを連結アームとして用い、改変前のウイルス膜融合阻害剤とＸ_４を連結することによりリポペプチドを取得し、そのうちＸ_４は、親油性の化合物官能基であり、リンカーポリペプチドのＫに修飾され、ｎは５以下の自然数であり、
前記リポペプチドは、いわゆる改変後のウイルス膜融合阻害剤である。

【0028】

本開示は、さらに、下記（ｅ１）または（ｅ２）の改変されたウイルス膜融合阻害剤を保護し、そのうち、
（ｅ１）アミノ酸配列が（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであるリンカーポリペプチドを連結アームとして用い、改変前のウイルス膜融合阻害剤とＸ_３（Ｘ_４）基を連結することによりリポペプチドを取得し、Ｘ_３（Ｘ_４）基において、Ｘ_４はＸ_３に修飾され、Ｘ_３はリジンまたはシステインまたは２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）またはオルニチン（Ｏｒｎ）または２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）または２，７－ジアミノヘプタン酸（Ｄａｈ）であり、Ｘ_４は親油性の化合物官能基であり、ｎは５以下の自然数であり、
（ｅ２）アミノ酸配列が（ＥＡＡＡＫ）ｎまたはＡ［（ＥＡＡＡＫ）ｎ］Ａであるリンカーポリペプチドを連結アームとして用い、改変前のウイルス膜融合阻害剤とＸ_４を連結することによりリポペプチドを取得し、そのうちＸ_４は、親油性の化合物官能基であり、リンカーポリペプチドのＫに修飾され、ｎは５以下の自然数であり、
前記リポペプチドは、いわゆる改変後のウイルス膜融合阻害剤である。

【0029】

本開示は、さらに、上記のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩または誘導体、または上記のいずれかに記載の多量体である医薬化合物を保護する。

【0030】

前記医薬化合物は、以下の（ｆ１）または（ｆ２）または（ｆ３）または（ｆ４）または（ｆ５）または（ｆ６）の用途に使用され、そのうち、
（ｆ１）コロナウイルス膜融合阻害剤としての用途であり、
（ｆ２）コロナウイルスに起因する疾患を予防および／または治療するための用途であり、
（ｆ３）抗コロナウイルス用の用途であり、
（ｆ４）コロナウイルスの細胞融合を阻害するための用途であり、
（ｆ５）コロナウイルスが細胞に侵入するのを阻害するための用途であり、
（ｆ６）コロナウイルスの複製を阻害するための用途である。

【0031】

本開示は、さらに、コロナウイルスが動物に感染するのを治療または／および予防する方法を保護し、前記方法は、前記医薬化合物を対象動物に投与することにより、コロナウイルスが動物に感染するのを阻害することを含む。

【0032】

上記のいずれかに記載のＸ_２は、剛性リンカーである。

【0033】

上記のいずれかに記載のリンカーポリペプチドは、剛性リンカーポリペプチドである。

【0034】

上記のいずれかに記載のＸ_２は、α－ヘリックス構造を有する剛性リンカーである。

【0035】

上記のいずれかに記載のリンカーポリペプチドは、α－ヘリックス構造を有する剛性リンカーポリペプチドである。

【0036】

上記のいずれかに記載のｎは、１、２、３、４または５であってもよい。

【0037】

上記のいずれかに記載のＸ_２は、連結アームとして機能し、α－へリックス構造を著しく増加させ、その結果、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩またはその誘導体の安定性および抗ウイルス活性を向上させることができる。

【0038】

上記のいずれかに記載のリンカーポリペプチドは、連結アームとして機能し、α－へリックス構造を著しく増加させ、その結果、ウイルス膜融合阻害剤の安定性および抗ウイルス活性を向上させることができる。

【0039】

Ｘ_３がリジンである場合、脂質化合物はその側鎖のアミノ基を介して連結される。

【0040】

Ｘ_３がシステインである場合、脂質化合物はその側鎖のスルフヒドリル基を介して連結される。

【0041】

Ｘ_３がリジンである場合、好ましい親油性の化合物は、コレステロールコハク酸モノエステルであり、アミド化反応によってリジンの側鎖に連結される。

【0042】

Ｘ_４がシステインである場合、好ましい親油性の化合物は、コレステリルブロモアセテートである。

【0043】

式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、アミノ酸の略号は、当分野で周知の意味を有し、例えば、Ｓはセリン、Ｖはバリン、Ｎはアスパラギン、Ｉはイソロイシン、Ｑはグルタミン、Ｋはリジン、Ｅはグルタミン酸、Ｄはアスパラギン酸、Ｒはアルギニン、Ｌはロイシン、Ａはアラニン、Ｇはグリシン、Ｙはチロシン、Ｃはシステインなどである。

【0044】

前記アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸であってもよい。

【0045】

ポリペプチドの生物学的利用能、安定性および／または抗ウイルス活性を向上させるために、ポリペプチドにおける１つまたは複数（例えば、２～５個、２～４個または２～３個）のアミノ酸を、Ｄ型コンホメーションを有するアミノ酸、人工的に修飾されたアミノ酸、自然界に存在する希少アミノ酸などで置き換えてもよい。

【0046】

Ｄ型アミノ酸とは、タンパク質を構成するＬ型アミノ酸に対応するアミノ酸を指す。

【0047】

人工的に修飾されたアミノ酸とは、メチル化やリン酸化などによって修飾されたンパク質を構成する一般的なＬ型アミノ酸を指す。

【0048】

自然界に存在する希少アミノ酸には、例えば５－ヒドロキシリジン、メチルヒスチジン、γ－アミノ酪酸、ホモセリンなど、タンパク質を構成する一般的ではないアミノ酸やタンパク質を構成しないアミノ酸が含まれる。

【0049】

本開示は、ウイルス膜融合阻害剤としてのリポペプチドを設計するための新規な方法を提供し、該方法または策略を使用して調製されたリポペプチド阻害剤は、著しく増加したらせん構造特徴および著しく増加した抗ウイルス活性を有する。該化合物によって形成される薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、キレートまたは非共有結合複合体、該化合物をベースとする薬物前駆体、または上記形態の任意の混合物もまた、本開示の一部である。

【0050】

本開示は、本開示の化合物を含む、コロナウイルスに起因する疾患を予防および治療する方法を提供する。

【0051】

本開示は、さらに、本開示に係る化合物を含む、コロナウイルスに起因する疾患を予防および治療するための薬物組成物を提供する。好ましくは、前記薬物組成物は、コロナウイルスに起因する疾患を予防と治療するための用途に使用される。

【0052】

本開示で言うコロナウイルスには、実施例において具体化される種々のコロナウイルスが含まれるが、本開示ではこれらについて特に制限がない。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株およびその種々の突然変異株、前記野生株の全ゲノム配列についてはＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７．３を参照でき、前記突然変異株としては、アルファ株、ベータ株、ガンマ株、デルタ株、およびオミクロン株などであり得る）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、および他のコロナウイルス（例えば、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、およびＨＣｏＶ－ＮＬ６３など）が挙げられ、例えば、コウモリ由来のコロナウイルスやセンザンコウ由来のコロナウイルスなどである。

【0053】

前記化合物は、異なる光学異性体、ラセミ体および／またはそれらの混合物を含む。上記の場合において、光学活性を有する異性体のような単一のエナンチオマーまたはジアステレオマー異性体は、不斉合成法またはラセミ体分割法によって得ることができる。ラセミ体の分割は、分割用の試薬を用いた従来の再結晶化や、クロマトグラフィー法などのさまざまな方法で達成することができる。

【0054】

前記化合物は、二重結合を有する異なるシスおよび／またはトランス異性体を含む。

【0055】

化合物の誘導体は、化合物の溶媒和物、化合物の錯体、化合物のキレートまたは化合物の非共有結合複合体であってもよい。化合物の誘導体は、さらに、該化合物に基づく薬物前駆体（例えば、化合物のエステルまたはアミド誘導体）であってもよい。

【0056】

薬物の調製において、上記化合物の任意の形態の混合物を使用することができる。

【0057】

調製された薬物には、上記化合物の任意の形態の混合物を含むことができる。

【0058】

本開示の方法を用いて調製された改変後のウイルス膜融合阻害剤は、著しく増加したらせん構造の特徴を有し、その結果、抗ウイルス活性および／または安定性が著しく増加する。

【0059】

本開示のさらなる態様は、以下に詳細に記載され、或いはその一部が本開示の実施例において具体化される。以下において、別段の説明がない限り、本明細書で使用される異なる成分の量および反応条件は、いかなる場合においても「およそ」、「約」と解釈され得る。したがって、特に明記しない限り、下記および特許請求の範囲に引用される数値パラメータは、おおよそのパラメータであり、標準誤差の違いにより、それぞれの実験条件下で異なる数値パラメータが得られる場合がある。

【0060】

本明細書において、化合物の化学構造式と化学名の間に不一致や疑義がある場合、該化合物は化学構造式に則って正確に定義される。本明細書に記載の化合物は、１つまたは複数のキラル中心、および／または二重結合などの構造を含むことができ、二重結合の異性体（例えば、幾何異性体）、光学エナンチオマーまたはジアステレオマーを含む立体異性体も存在することができる。したがって、本明細書の記載範囲内の任意の化学構造は、一部または全体構造において上記のような構造を含むかどうかにかかわらず、該化合物のすべての可能なエナンチオマーおよびジアステレオマーを含み、また、単純ないずれか１種の立体異性体（例えば、単純な幾何異性体、単純なエナンチオマーまたは単純なジアステレオマー）およびこれらの異性体のいずれか１種の混合物を含む。これらのラセミ体および立体異性体の混合物は、当業者からすればキラル分離技術またはキラル分子合成法を用い、その構成成分のエナンチオマーまたは立体異性体にさらに分割することもできる。

【0061】

実際応用に際して、本開示の薬物は、コロナウイルス感染を治療および／または予防する目的で患者に直接投与するか、或いは適切な担体または賦形剤と混合して投与することができる。ここで、担体材料としては、水溶性担体材料（例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、有機酸など）、難溶性担体材料（例えば、エチルセルロース、ステアリン酸コレステリル等）、腸溶性担体材料（例えば、セルロースフタレートアセテート、カルボキシメチルエチルセルロース等）が挙げられるが、本開示ではこれらについて特に制限がない。好ましくは、水溶性担体材料である。これらの材料を用いてさまざまな剤型を調製することができ、例えば、錠剤、カプセル、ドロップ錠剤、エアゾール剤、丸剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、エマルション、顆粒剤、リポソーム、経皮吸収剤、経口錠剤、坐剤、凍結乾燥粉末剤などが挙げられるが、これらに限定されない。また、一般的な製剤、徐放剤、放出制御製剤、各種の微粒子送達システムであってもよい。単位剤形を錠剤にするために、当分野で周知のさまざまな担体を適宜使用することができる。担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、硫酸カルシウム、乳糖、マンニトール、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、炭酸カルシウム、白土、微結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムなどの希釈剤および吸収剤、水、グリセリン、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、澱粉スラリー、デキストリン、シロップ、蜂蜜、グルコース溶液、アカシア粘液、ゼラチン糊、カルボキシメチルセルロースナトリウム、シェラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの湿潤剤および接着剤、乾燥澱粉、アルギン酸塩、寒天粉末、褐藻澱粉、炭酸水素ナトリウムおよびクエン酸、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレン、ソルビトール脂肪酸エステル、ドデシルスルホン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロースなどの崩壊剤、スクロース、トリステアリン酸グリセリド、ココアバター、水素添加油などの崩壊抑止剤、第四級アンモニウム塩、ドデシル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、タルク、シリカ、コーンスターチ、ステアリン酸塩、ホウ酸、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどの潤滑剤などが挙げられる。錠剤は、さらに、糖衣錠剤、フィルムコーティング錠剤、腸溶錠剤、または二層および多層錠剤などのコーティング錠剤に製造することもできる。単位剤形を丸剤にするために、当分野で周知のさまざまな担体を適宜使用することができる。担体としては、例えば、ブドウ糖、乳糖、澱粉、カカオバター、水素化植物油、ポリビニルピロリドン、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ、カオリン、タルクなどの希釈剤および吸収剤、アラビアゴム、トラガカント、ゼラチン、エタノール、蜂蜜、液糖、ライスペーストおよび小麦粉ペーストなどの接着剤、寒天粉末、乾燥澱粉、アルギン酸塩、ドデシルスルホン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロースなどの崩壊剤などが挙げられる。単位剤形を坐剤にするために、当分野で周知のさまざまな担体を適宜使用することができる。担体としては、例えば、ポリエチレングリコール、レシチン、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル、ゼラチン、半合成グリセリドなどが挙げられる。単位剤形を溶液剤、エマルション、凍結乾燥粉末剤および懸濁剤などの注射用製剤にするために、例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、１，３－プロパンジオール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなど、当分野で慣用のすべての希釈剤を使用することができる。また、等張注射液を調製するために、注射剤に適切な量の塩化ナトリウム、グルコースまたはグリセリンを添加することができ、加えて従来の共溶媒、緩衝剤、ｐＨ調整剤などを添加することができる。また、実際需要に応じて、薬物製剤に着色剤、保存剤、香料、矯味剤、甘味剤または他の材料を適宜添加することもできる。上記の剤形を利用して皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射および腹腔内注射などを含む注射、経直腸および経膣などの管腔内投与、経鼻などの呼吸器投与、および粘膜投与による投与を可能である。上記の投与経路において、注射、霧化吸入、鼻腔スプレーまたは点鼻投与が好ましい。

【0062】

本開示の薬物の投与量は、例えば予防または治療される疾患の特性および重篤度、患者または動物の性別、年齢、体重および個体応答、使用される特定の活性成分、投与経路および投与頻度など、多くの要因に依存する。上記の用量は、単回投与形態で投与してもよいし、数回に分けて、例えば２回、３回または４回に分けて投与してもよい。

【0063】

本開示の薬物は、コロナウイルス感染者の治療および予防のために直接単独で、または全体的な治療効果を向上させる目的で１種または２種以上の他の抗ウイルス薬物と組み合わせて使用することができる。これらの抗ウイルス剤としては、中和抗体、プロテアーゼ阻害剤、ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）阻害剤、ウイルス侵入阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。上記の中和抗体は、アムバルビマブ（ＢＲＩＩ－１９６）、ロムルセビマブ（ＢＲＩＩ－１９８）、カシリビマブ（Ｃａｓｉｒｉｖｉｍａｂ）、イデビマブ（Ｉｍｄｅｖｉｍａｂ）、ソロビマブ（Ｓｏｔｒｏｖｉｍａｂ）、バムラニビマブ（Ｂａｍｌａｎｉｖｉｍａｂ）などから選ばれる１種または２種以上であってもよく、前記プロテアーゼ阻害剤は、パキシロビル（Ｐａｘｌｏｖｉｄ）、ダルナビル（ｄａｒｕｎａｖｉｒ）、ロピナビル／リトナビル（Ｌｏｐｉｎａｖｉｒ／Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）などから選ばれる１種または２種以上であってもよく、前記ＲｄＲｐ阻害剤は、モルヌピラビル（Ｍｏｌｎｕｐｉｒａｖｉｒ）、ファビピラビル（Ｆａｖｉｐｉｒａｖｉｒ）、レムデシビル（Ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ）、ソフォスブビル（Ｓｏｆｏｓｂｕｖｉｒ）などから選ばれる１種または２種以上であってもよく、前記ウイルス侵入阻害剤は、アビドル（Ａｒｂｉｄｏｌ）、ヒドロキシクロロキン（ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）などから選ばれる１種または２種以上であってもよい。

【0064】

特定の患者について、特定の治療上有効な用量レベルは、治療対象の障害および該障害の重篤度、使用される特定の有効成分の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事、使用される特定の有効成分の投与時期、投与経路および排泄速度、治療期間、使用される特定の有効成分と併用または同時に使用される薬物、および医療分野で周知の類似要因を含む種々の要因に基づいて決定される。有効成分の用量は、例えば、所望の治療効果を得るために必要なレベル以下の有効成分の投与量から開始し、所望の効果が得られるまで徐々に投与量を増加させるのが当技術分野における慣行である。

【発明の効果】

【0065】

本開示の発明者は、剛性リンカーＥＡＡＡＫを有する式（Ｉ）の化合物ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０、特にＩＰＢ２９が、該リンカーを有しない化合物に比べて新型コロナウイルスを阻害する活性を少なくとも７０倍向上させ、フレキシブルリンカー（例えば、ＰＥＧまたはＧＳＧＳＧ）を有する化合物に比べて阻害活性を約８倍向上させることを初めて見出した。

【0066】

同時に、本開示の発明者は、リポペプチドＩＰＢ２９の活性の増加は、剛性リンカーＥＡＡＡＫが該リポペプチドのらせん含有量を著しく増加させ、同時に安定性を向上させることに起因することを見出した。さらに、このようなリポペプチドＩＰＢ２９は、多くの異なるタイプの新型コロナウイルスを阻害することができる。

【0067】

本開示の化合物は、性質が安定であり、コロナウイルスに起因する疾患を予防および治療するための薬物組成物の調製に用いられ、非常に効果的で広域スペクトルの新型コロナウイルス膜融合阻害剤であり、前記薬物組成物は、コロナウイルスに起因する疾患の予防および治療のために使用される。

【図面の簡単な説明】

【0068】

【図1】ウイルス膜融合阻害剤としてのリポペプチドのα－ヘリックス含有量（左図）および熱安定性（右図）を示す。

【図2】ウイルス膜融合阻害剤としてのリポペプチド－標的配列ポリペプチド複合体のα－ヘリックス含有量（左図）および熱安定性（右図）を示す。

【図3】２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞（左図）またはＨｕｈ－７細胞（右図）へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染に対するリポペプチドの阻害活性を示す。

【図4】２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞へのさまざまなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株の感染に対するリポペプチドの阻害活性を示す。

【図5】Ｈｕｈ－７細胞へのさまざまなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異株の感染に対するリポペプチドの阻害活性を示す。

【図6】他のコロナウイルスに対するリポペプチドの阻害活性を示す。

【図7】リポペプチドのインビトロ細胞毒性試験を示す図である。

【図8】リポペプチドＩＢＰ２４およびＩＰＢ２９の安定性解析を示す図である。

【図9】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を介した細胞膜融合に対する新規リポペプチドの阻害効果を示し、左図の標的細胞は、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞であり、右図の標的細胞は、Ｈｕｈ－７細胞である。

【発明を実施するための形態】

【0069】

本開示の科学研究チームは、長期に渡ってウイルス膜融合阻害薬の研究開発に取り組んでおり、その成果として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびその突然変異株に対して比較的強い阻害活性を有する、リポペプチドベースの広域スペクトルのコロナウイルス膜融合阻害剤を設計することに至った（非特許文献２～５）。

【0070】

リポペプチドをベースとするウイルス膜融合阻害剤の設計おいては、通常、ポリペプチド配列と脂質部分（例えば、脂肪酸やコレステロールなど）の間に連結アームとしてリンカーを組み込む必要がある。脂質部分の予想される結合部位はウイルスまたは細胞膜であり、一方でポリペプチドが標的領域に凝集されるため、脂質部分とポリペプチドの結合部位は異なる。ポリペプチドは安定な二次構造を形成する傾向があり、強い構造的剛性を持つため、通常、ポリペプチドと脂質部分の間にはフレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）を用いて連結され、ポリペプチドと脂質部分がそれぞれ適切なコンフォメーションを形成し、それぞれの結合部位に結合できるようにする。同時に、それぞれの役割を十分に発揮しながらも、立体障害などによる相互作用を避けている。一般的なフレキシブルリンカーとしては、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ或いは（ＧＳＧＳＧ）ｎなどのグリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）の組み合わせが挙げられ、ｎの大きさを変えることで構造ドメイン間の距離を広げたり縮めたりすることができ、もう一つの一般的なフレキシブルリンカーは、低分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ｎであり、そのうちｎは２～２４の範囲であることが多い。これまでに文献で報告されているコロナウイルス膜融合阻害剤であるリポペプチドもフレキシブルリンカーを使用しており、例えばＩＢＰ０２Ｖ１～ＩＢＰ０２Ｖ５ではいずれもＰＥＧ_８（非特許文献２）を用い、ＩＰＢ２４～ＩＰＢ２７ではそれぞれＰＥＧ_４、ＰＥＧ_５、ＰＥＧ_６およびＰＥＧ_８を用い（非特許文献４）、ＥＫＬ１ＣではＧＳＧを用い（非特許文献６）、ＥＫ１Ｃ４ではＧＳＧＳＧとＰＥＧ_４を直列に連結したものを用い（非特許文献７）、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌではＰＥＧ_４を用いる（非特許文献８）ことが挙げられる。融合タンパク質の調製に使用される一般的な剛性リンカー（ｒｉｇｉｄ ｌｉｎｋｅｒ）は、α－ヘリックスを形成することができる（ＥＡＡＡＫ）ｎ配列を有し、内部水素結合および密接に連結されたペプチド鎖骨格を持つため、剛性で且つ安定な配列であり、別のタイプの剛性リンカーにはＰｒｏ－ｒｉｃｈ配列（ＸＰ）ｎを有し、そのうちＸは任意のアミノ酸であり、好ましくはアラニン、リジンまたはグルタミン酸であり、（ＸＰ）ｎ配列はらせん構造を持たないが、プロリンが骨格の剛性を高め、構造ドメインを効果的に分離することができる。

【0071】

以下では、具体的な実施形態を参照しながら本開示をより詳細に説明するが、これらの実施例は、本開示を説明することのみを目的とし、本開示の範囲を限定するものではない。以下に提供される実施例は、当業者による更なる改良のための指針として機能することができ、いかなる態様においても本開示を制限するものではない。当業者は、本明細書の内容を参照した上で、関連のパラメータを適宜変更して本開示の技術案を達成することができる。当業者にとっては、類似の置き換えや変更がすべて自明なことであり、かかる置き換えや変更がすべて本開示の範囲内に含まれる点にも特に留意されたい。また、本開示の方法は、好適な実施例によって説明されており、当業者であれば、本開示の内容、趣旨および範囲から逸脱しない前提で本明細書に記載の化合物および調製方法を変形し、或いは適切な変更および組み合わせを行うことによって、本開示の技術案を実施および適用することができる。

【0072】

下記の実施例における実験方法は、特段の説明がない限り、いずれも慣用の常法であり、当分野の文献に記載された技術または条件に従い、または製品仕様書に従って行われる。下記の実施例で使用される材料や試薬などは、特段の説明がない限り、いずれも市販ルートで入手することができる。

【0073】

実施例１：リポペプチドの調製
リポペプチドとしてリポペプチドＩＰＢ２９、リポペプチドＩＰＢ３０、リポペプチドＩＰＢ２０、リポペプチドＩＰＢ２４、リポペプチドＩＰＢ２８をそれぞれ調製した。そのうち、リポペプチドＩＰＢ２９およびリポペプチドＩＰＢ３０には、いずれもＥＡＡＡＫ（配列番号４）剛性リンカーを有する。リポペプチドＩＰＢ２９およびリポペプチドＩＰＢ３０のアミノ酸部分を配列番号１に示す。
配列番号１：ＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫＥＡＡＡＫＫ。

【0074】

そのうち、リポペプチドＩＰＢ２０（ただし、連結アームとしてリンカーを持たない）、リポペプチドＩＰＢ２４（連結アームとしてフレキシブルリンカーＰＥＧ_４は、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ_４－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨを合成原料として得られる）、およびＩＰＢ２８（連結アームとしてフレキシブルリンカーＧＳＧＳＧ（配列番号５）を持つ）は、いずれも対照物であった。

【0075】

リポペプチドＩＰＢ２９およびリポペプチドＩＰＢ３０は、ともに以下の一般式を満たす。

【化2】

【0076】

リポペプチドＩＰＢ２９において、Ｘ_１はアミノ末端保護基Ａｃであり、Ｘ_２はＥＡＡＡＫ剛性リンカーであり、Ｘ_３はリジン残基であり、Ｘ_４は、Ｘ_３に修飾されたコレステロールコハク酸モノエステル基であり、Ｘ_５はカルボキシ末端保護基ＮＨ_２ある。リポペプチドＩＰＢ３０において、Ｘ_１はアミノ末端保護基Ａｃであり、Ｘ_２はＥＡＡＡＫ剛性リンカーであり、Ｘ_３はリジン残基であり、Ｘ_４は、Ｘ_３に修飾された塩化ステアリル基であり、Ｘ_５はカルボキシ末端保護基ＮＨ_２ある。

【0077】

５つのリポペプチドの配列構造を表１に示す。５つのリポペプチドにおいて、Ａｃはアセチル基を表し、ＮＨ_２はアミノ基を表し、ＥＡＡＡＫは、アミノ酸配列がＥＡＡＡＫである短いペプチドを表す。５つのリポペプチド間の構造上の違いを表２に示す。

【0078】

【表1】

【0079】

【表2】

【0080】

１）調製に必要な化学試薬
化学試薬としては、例えば、さまざまなＦｍｏｃアミノ酸、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピペリジン（ＰＩＰＥ）、ニンヒドリン、無水酢酸（Ａｃ_２Ｏ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ヒドラジン水和物、コレステロールコハク酸モノエステル、塩化ステアリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、エタンジチオール（ＥＤＴ）、チオアニソール（ＴＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、フェノール、Ｎ－フルオレニルメチルオキシカルボニル－テトラポリエチレングリコール－カルボン酸（Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ_４－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ）などは、いずれもメジャーな化学試薬メーカーから購入し、使用前にさらなる精製を行っていないものである。

【0081】

ポリペプチド合成に使用される保護基付きのアミノ酸（以下、「保護アミノ酸」とも称する）原料としては、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨが含まれる。そのうち略語の定義は、周知の通りであり、Ｆｍｏｃは９－フルオレニルメトキシカルボニルであり、Ｄｄｅは１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキセニル）エチルであり、Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルであり、ｔＢｕはｔｅｒｔ－ブチルであり、ＯｔＢｕはｔｅｒｔ－ブトキシであり、Ｔｒｔはトリチルであり、Ｐｂｆは（２，３－ジヒドロ－２，２，４，６，７－ペンタメチルベンゾフラン－５－イル）スルホニルである。

【0082】

２）ペプチド樹脂の合成
Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂をキャリア樹脂とし、脱Ｆｍｏｃ保護およびカップリング反応により、順次ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する保護アミノ酸とカップリングさせてペプチド樹脂を調製した。

【0083】

２－１）主鎖の第１保護アミノ酸の連結
第１保護アミノ酸であるＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）－ＯＨを０．３ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０．３ｍｍｏｌ取って適量のＤＭＦで溶解し、さらに、ＤＩＣを０．３ｍｍｏｌ取って振とうしながら保護アミノ酸のＤＭＦ溶液にゆっくりと加え、室温環境で５分間振とう反応させることで活性化された保護アミノ酸溶液を取得し、後の使用に備える。

【0084】

Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（０．３５ｍｍｏｌ／ｇ＊０．３ｇ）を０．１ｍｍｏｌ取り、２５％のＰＩＰＥ／ＤＭＦ溶液（体積比）で２０分間（２回）脱保護し、洗浄、ろ過して脱Ｆｍｏｃ樹脂を得た。

【0085】

活性化された第１保護アミノ酸溶液をＦｍｏｃ除去済の樹脂に加え、６０分間カップリング反応を行い、ろ過、洗浄して第１保護アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）を含む樹脂を得た。

【0086】

２－２）主鎖の他の保護アミノ酸の連結
上記主鎖の第１保護アミノ酸を連結する場合と同様にして、ポリペプチドに対応する他の保護アミノ酸を順次連結し、主鎖のアミノ酸を含む樹脂を得た。最後に、０．３ｍｍｏｌのＡｃ_２Ｏおよび６ｍｍｏｌのＤＩＥＡを用いてＮ末端をアセチル化することによりブロックし、主鎖の合成を完成した。上記反応の各ステップが終了すると、Ｋａｉｓｅｒテストにより反応をコントロールし、個別のアミノ酸の縮合反応が不完全である場合、目的のペプチドが得られるまで縮合反応を繰り返した。

【0087】

２－３）側鎖の連結
（ア）Ｃ末端リジン側鎖のＤｄｅ保護基は、樹脂をできるだけ少量の２％のヒドラジン水和物／ＤＭＦ溶液（体積比）で処理する（１０分間、２回）ことにより除去し、ろ過、洗浄して脱Ｄｄｅの樹脂を得た。

【0088】

（イ）ポリペプチドのコレステロール修飾は、以下の通り行われた。つまり、コレステロールコハク酸モノエステル０．３ｍｍｏｌとＨＯＢｔ０．３ｍｍｏｌを取り、適量のＤＭＦで溶解し、さらに、ＤＩＣを０．３ｍｍｏｌ取ってコレステロールコハク酸モノエステルとＨＯＢｔを含む溶液にゆっくりと加え、室温環境下で５分間振とう反応させた。調製されたコレステリルコハク酸モノエステル、ＨＯＢｔおよびＤＩＣを含む溶液を、ステップ（ア）で得られた脱Ｄｄｅの樹脂に加え、６０分間カップリング反応を行い、ろ過、洗浄、乾燥してペプチド樹脂を得た。

【0089】

（ウ）ポリペプチドのステアリル化は、以下の通り行われた。つまり、０．３ｍｍｏｌの塩化ステアリルと０．６ｍｍｏｌのＤＩＥＡを適量のＤＭＦに溶解し、ステップ（ア）で得られた脱Ｄｄｅの樹脂にゆっくりと加え、室温環境下で６０分間振とう反応させ、ろ過、洗浄、乾燥してペプチド樹脂を得た。

【0090】

３）粗品の調製
上記ペプチド樹脂に切断試薬（切断試薬１５ｍＬ／樹脂ｇ）を加え、均一に混合した後、３０℃で３時間振とう反応させ、樹脂から目的ポリペプチドを切断し、側鎖の保護基を除去した。反応混合物のろ液を集め、樹脂をさらに少量のＴＦＡ／ＤＣＭで３回洗浄し、ろ液を合わせた後、無水エーテルを加えて沈殿させ、遠心分離した。ろ過ケーキを冷たい無水エーテルで２回洗浄し、減圧乾燥して得られた灰白色粉末がリポペプチド粗品であった。

【0091】

切断試薬の組成としては、トリフルオロ酢酸：１，２－エタンジチオール：チオアニソール：フェノール：Ｈ_２Ｏ：トリイソプロピルシランが体積比で６８．５：１０：１０：５：３．５：１であった。

【0092】

４）純品の調製
上記リポペプチド粗品を取り、水／アセトニトリルを加えて撹拌して溶解し、遠心分離して不溶物を除去し、後の使用に備える。精製は逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて行われた。クロマトグラフィーカラムはＡｇｅｌａ Ｃ１８（１０μｍ、１００Å、５０×２５０ｍｍ）を用い、移動相は移動相Ａ（０．０５％のＴＦＡと２％のアセトニトリルの水溶液）と移動相Ｂ（９０％のアセトニトリル／水溶液）で構成され、移動相の流速は２５ｍＬ／分間であり、紫外線検出波長は２２０ｎｍであった。粗品溶液をカラムに注入し、グラジエント溶出を行い、対応する精製成分を収集し、直接凍結乾燥して溶媒を除去し、ふんわり状態のポリペプチドのトリフルオロ酢酸塩純品を得た。

【0093】

ポリペプチドのトリフルオロ酢酸塩純品を水とアセトニトリルで再溶解し、大量の陰イオン交換樹脂（酢酸塩の形態）を添加し、３時間撹拌した。ろ過し、水／アセトニトリルの混合溶媒でイオン交換樹脂を洗い流した後、ろ液を合わせて凍結乾燥し、ふんわり状態のポリペプチドの酢酸塩純品（すなわち、表１に示すリポペプチド）を得た。

【0094】

表１に示すリポペプチドの化学構造は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって特定し、その純度は、分析用高速液体クロマトグラフィー（Ａｇｅｌａ Ｃ１８－４．６×２５０ｍｍ、流速１ｍＬ／分間）を用いて測定した。その結果、合成されたリポペプチドの純度はいずれも９５％を超えた。

【0095】

実施例２：リポペプチドの構造特性およびその標的配列との相互作用解析
試験用リポペプチドの二次構造（α－ヘリックス）および熱安定性、並びに試験用リポペプチドと標的配列ミメティックポリペプチドとの相互作用は、本発明者が発表した論文（非特許文献４および非特許文献５）を参考に、円偏光二色性（ＣＤ）技術を用いて測定した。標的配列ミメティックポリペプチドＮ５２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ２サブユニットのＨＲ１配列に由来し、Ｎ５２の配列構造は、以下の通りである。
Ａｃ－ＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱ－ＮＨ_２（Ｎ５２に含まれるアミノ酸配列は、配列番号６に示す）

【0096】

試験用リポペプチドは、実施例１で調製されたリポペプチドＩＰＢ２９、リポペプチドＩＰＢ３０、リポペプチドＩＰＢ２０、リポペプチドＩＰＢ２４またはリポペプチドＩＰＢ２８であり、試験用複合体は、試験用リポペプチドとＮ５２との混合物であった。

【0097】

１）リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）を用いて、試験用リポペプチド（または試験用複合体）を１０μＭの溶液（試験用複合体の場合、１０μＭとは、試験用リポペプチドとＮ５２両方の濃度が１０μＭであることを意味する）に調製し、３７℃の水浴中に３０分間放置した。

【0098】

２）ステップ１で得られた溶液を対応するキュベットに移し、Ｊａｓｃｏ分光偏光計（型番Ｊ－８１５）を用いて１９５～２７０ｎｍの波長範囲における溶液のモル楕円率［θ］λの変化状況を走査した。典型的なα－ヘリックス構造は、２０８ｎｍと２２２ｎｍに最大の負のピークを持つことがあり、スペクトル値を補正するためにＰＢＳブランクを差し引き、計算ではα－ヘリックス含有量１００％の基準として－３３０００ｄｅｇｒｅｅ．ｃｍ２．ｄｍｏｌ－１のピーク値を用い、波長２２２ｎｍにおける溶液のモル楕円率からα－ヘリックス含有量の百分率を算出した。

【0099】

３）ステップ１で得られた溶液を熱安定性検出キュベットに入れ、ＣＤ温度制御モジュールを調整して、温度による溶液[θ]２２２の変化状況を速度２℃／分間、２０～９８℃で走査した。融解グラフは平滑化され、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを用いて熱解離転移の中点温度値（Ｔｍ）を計算し、らせん熱安定性の具合を反映した。

【0100】

試験用リポペプチドのＣＤ結果を図１に示す。フレキシブルまたは剛性リンカーを含まないＩＰＢ２０のα－ヘリックス含有量は５１％であり、フレキシブルリンカーを導入したＩＰＢ２４およびＩＰＢ２８のα－ヘリックス含有量はそれぞれ１９％および２０％であり、フレキシブルリンカーの導入がリポペプチド全体の回転自由度を高め、リポペプチド全体の分子エントロピーを増加させ、ポリペプチドの二次構造の安定化に不利であることが示された。剛性リンカーを導入したＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０のα－ヘリックス含有量はそれぞれ７４％および６２％であり、ＥＡＡＡＫ配列の導入がリポペプチドのヘリックス構造を著しく増加させることが示され、これは、ＥＡＡＡＫリンカーにおけるＥ－Ｋ塩橋がポリペプチドのα－ヘリックス二次構造中の塩橋と共役してその二次構造を安定させ、同時にＡのほうがＧに比べてα－ヘリックス構造を形成しやすいためと考えられる。自身のα－ヘリックス含有量が比較的に高いリポペプチドは、ポリペプチド部分の標的への結合エントロピーを効果的に減少させ、結合定数を増加させ、活性を向上させることができる。また、比較的安定な二次構造は、ポリペプチド抗体内でのプロテアーゼ加水分解を促進し、生体内での安定性を向上させ、抗ウイルス活性にも寄与する。

【0101】

試験用複合体のＣＤ結果を図２に示す。各リポペプチドは、標的配列ミメティックポリペプチドと相互作用して典型的なαらせん構造を持つ複合体を形成することができ、そのうちＩＰＢ２０－Ｎ５２複合体、ＩＰＢ２４－Ｎ５２複合体およびＩＰＢ２８－Ｎ５２複合体のα－ヘリックス含有量は、それぞれ６６％、４８％および３７％であり、ＩＰＢ２９－Ｎ５２複合体およびＩＰＢ３０－Ｎ５２複合体のα－ヘリックス含有量は、それぞれ６８％および５３％であった（図２の左図）。ＩＰＢ２０－Ｎ５２複合体、ＩＰＢ２４－Ｎ５２複合体およびＩＰＢ２８－Ｎ５２複合体のＴｍ値は、それぞれ９０℃、９０℃および８９℃であり、ＩＰＢ２９－Ｎ５２複合体およびＩＰＢ３０－Ｎ５２複合体のＴｍ値は、それぞれ８６℃および７８℃であった（図２の右図）。このことから、ＥＡＡＡＫリンカーを導入したリポペプチドが細胞膜やウイルス膜への結合能力を高めると同時に、標的への特異的且つ安定的な結合を維持することができることがわかる。

【0102】

実施例３：新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびその変異体に対するリポペプチドの阻害効果
２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞またはＨｕｈ－７細胞を試験用細胞とし、２９３Ｔ細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関の製品（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－３２１６）であり、Ｈｕｈ－７細胞は、国家実験細胞資源共有サービスプラットフォームの製品であり、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞は、非特許文献２に記載されている。

【0103】

１）新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するリポペプチドの阻害効果
試験用リポペプチドは、実施例１で調製したリポペプチドＩＰＢ２９、リポペプチドＩＰＢ３０、リポペプチドＩＰＢ２０、リポペプチドＩＰＢ２４またはリポペプチドＩＰＢ２８であった。

【0104】

１－１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの調製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を発現するプラスミドは、ｐＣｏＶ２－Ｓと名付け、該プラスミドは、非特許文献５の材料と方法部分の「Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ」の「ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」に記載されている。ＨＩＶ骨格プラスミドであるｐＮＬ４－３．ｌｕｃ．ＲＥは、米国国立衛生研究所のエイズ試薬および参照プログラム（カタログ番号３４１８）によって提供される。

【0105】

２９３Ｔ細胞にｐＣｏＶ２－ＳとｐＮＬ４－３．ｌｕｃ．ＲＥを１：１で共導入し、３７℃、５％のＣＯ_２細胞培養インキュベータで４８時間培養した後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを含む上澄み液を回収し、ろ過して－８０℃で保存し、後の使用に備える。

【0106】

調製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスは、非特許文献２の「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＰＶ、以下では 「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＷＴ」とも称する）」である。

【0107】

１－２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するリポペプチドの阻害効果
（ア）脱イオン水で試験用リポペプチドを溶解し、濃度を測定した後、試験用リポペプチドをＤＭＥＭ培地で開始濃度に希釈し、９６ウェル細胞培養プレートで３倍希釈し、最終的に１ウェルあたり５０μＬのリポペプチド溶液を含むようにした。９つの希釈度を設け、各希釈度につき３つの平行ウェルを設け、さらに、ＤＭＥＭ培地（１ウェルあたり５０μＬ）を加えた対照ウェルを設けた。

【0108】

（イ）ステップ（ア）が終わると、ステップ（ア）で調製した偽ウイルスを１ウェルあたり５０μＬ（ウイルス量：５００ＴＣＩＤ_５０）ずつ加え、室温で３０分間インキュベートした。

【0109】

（ウ）予め培養した試験用細胞を濃度が１０×１０^４細胞／ｍＬの細胞懸濁液に調整し、ＤＥＡＥ－デキストランを加えて濃度が１５μｇ／ｍＬになるようにした後、ステップ（イ）で得られた９６ウェルプレート（１００μＬ／ウェル）に加え、３７℃、５％のＣＯ_２細胞インキュベータで４８時間培養した。

【0110】

（エ）ステップ（ウ）が終わると、上澄み液を捨て、３０μＬ／ウェルの量で細胞溶解液を加え、室温で１５分間溶解した後、ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、マイクロプレート化学発光検出器により相対蛍光単位（ＲＬＵ）を測定し、阻害率グラフおよび薬物の半数阻害濃度（ＩＣ_５０）を算出して図を作成した。

【0111】

結果を図３に示す。２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するＩＰＢ２０、ＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８、ＩＰＢ２９とＩＰＢ３０のＩＣ_５０値は、それぞれ６３．８５ｎＭ、５．５１ｎＭ、６．９１ｎＭ、０．５７ｎＭおよび４．１９ｎＭであり、Ｈｕｈ－７細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するＩＰＢ２０、ＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８、ＩＢＰ２９およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０値は、それぞれ３９ｎＭ、２．４３ｎＭ、２．８８ｎＭ、０．５３ｎＭおよび２．７７ｎＭであった。ＩＰＢ２９およびＩＰＢ２０は、ＩＰＢ２９に剛性リンカーＥＡＡＡＫを含み、ＩＰＢ２０に剛性またはフレキシブルリンカーがない点に相違があり、ＩＰＢ２９は、ＩＰＢ２０に比べて２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞における抗ウィルス活性が約１１２倍に向上し、Ｈｕｈ－７細胞における抗ウィルス活性が約７４倍に向上した。ＩＰＢ２９およびＩＰＢ２４は、ＩＰＢ２９に剛性リンカーＥＡＡＡＫを含み、ＩＰＢ２４にフレキシブルリンカーＰＥＧ_４含む点に相違があり、ＩＰＢ２９は、ＩＰＢ２４に比べて２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞における抗ウイルス活性が約１０倍向上し、Ｈｕｈ－７細胞における抗ウイルス活性が約５倍向上した。ＩＰＢ２９およびＩＰＢ２８は、ＩＰＢ２９に剛体リンカーＥＡＡＡＫを含み、ＩＰＢ２８にフレキシブルリンカーＧＳＧＳＧを含む点に相違があり、ＩＰＢ２９は、ＩＰＢ２８に比べて２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞における抗ウイルス活性が約１２倍向上し、Ｈｕｈ－７細胞における抗ウイルス活性が約５倍向上した。実験結果により、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する阻害活性から示されたように、ＥＡＡＡＫリンカーがリポペプチドの阻害剤としての阻害活性を著しく向上させることが判明された。

【0112】

２）新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異体に対するリポペプチドの阻害効果
試験用リポペプチドは、実施例１で調製したリポペプチドＩＰＢ２９、リポペプチドＩＰＢ３０、リポペプチドＩＰＢ２４またはリポペプチドＩＰＢ２８であった。

【0113】

２－１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異体の偽ウイルスの作製
新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異体の偽ウイルスをそれぞれ作製し、かかる突然変異体として、具体的には図４に示された通りである。方法はステップ１－１）を参照されたく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を発現するプラスミドを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異体（１点突然変異または代表的な流行株）のＳタンパク質を発現するプラスミドに置き換る点が異なるだけであった。作製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ６１４Ｇ突然変異体の偽ウイルスは、いわゆる非特許文献２の「Ｄ６１４Ｇ ＰＶ」である。

【0114】

２－２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異体に対するリポペプチドの阻害効果
ステップ１－２）と同様にして阻害効果を測定し、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞を試験用細胞とする場合の測定結果を図４に示す。２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞において、Ｄｅｌｔａ株を阻害するＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０値は、それぞれ４．９４ｎＭ、６．３０ｎＭ、０．７９ｎＭおよび３．５７ｎＭであり、ＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０値は、それぞれＩＰＢ２９の約６倍、８倍および４倍であった。２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞において、Ｏｍｉｃｒｏｎ株を阻害するＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０値は、それぞれ４．５１ｎＭ、４．５１ｎＭ、０．４７ｎＭおよび１．７８ｎＭであり、ＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０値は、それぞれＩＰＢ２９の約１０倍、１０倍および４倍であった。

【0115】

Ｈｕｈ－７細胞を試験用細胞とする場合の結果を図５に示す。Ｈｕｈ－７細胞において、Ｄｅｌｔａ株感染を阻害するＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０値は、それぞれ３．４６ｎＭ、４．３４ｎＭ、０．５６ｎＭおよび２．１７ｎＭであり、ＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０値は、それぞれＩＰＢ２９の約６倍、８倍および４倍であった。Ｈｕｈ－７細胞において、Ｏｍｉｃｒｏｎ株感染を阻害するＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０値は、それぞれ２．５６ｎＭ、２．４６ｎＭ、０．４６ｎＭおよび１．４６ｎＭであり、ＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０値は、それぞれＩＰＢ２９の約６倍、５倍および３倍であった。

【0116】

これらの結果から、ウイルス膜融合阻害剤として、新規リポペプチド（例えば、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０）が各種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異体（突然変異株）に対して良好な阻害活性を示すことが判明された。

【0117】

実施例４：他のコロナウイルスに対するリポペプチドの阻害効果
試験用リポペプチドは、実施例１で調製したリポペプチドＩＰＢ２９、リポペプチドＩＰＢ３０、リポペプチドＩＰＢ２４またはリポペプチドＩＰＢ２８であり、試験用細胞は、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞またはＨｕｈ－７細胞であった。

【0118】

４－１）他のコロナウイルス偽ウイルスの調製
コウモリ由来のコロナウイルス（ｂａｔ ＲａＴＧ１３）、センザンコウ由来のコロナウイルス（ＰＣｏＶ－ＧＤまたはＰＣｏＶ－ＧＸ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３およびＨＣｏＶ－２２９Ｅなど、その他の各種コロナウイルス偽ウイルスをそれぞれ調製した。

【0119】

方法としては、実施例３のステップ１－１）を参照されたく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を発現するプラスミドを、他のコロナウイルスのＳタンパク質を発現するプラスミドに置き換える点が異なるだけであった。調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ偽ウイルスは、いわゆる非特許文献２の「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＰＶ」であり、調製したＭＥＲＳ－ＣｏＶ偽ウイルスは、いわゆる非特許文献２の「ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＰＶ」であり、調製したＨＣｏＶ－ＮＬ６３偽ウイルスは、いわゆる非特許文献２の「ＨＣｏＶ－ＮＬ６３ ＰＶ」であり、調製したＨＣｏＶ－２２９Ｅ偽ウイルスは、いわゆる非特許文献２の「ＨＣｏＶ－２２９Ｅ ＰＶ」であった。

【0120】

４－２）他のコロナウイルスに対するリポペプチドの阻害効果
実施例３のステップ１－２）と同様にして阻害活性を測定し、測定結果を図６に示す。測定結果から、新規リポペプチドが上記７種類のウイルスの感染を効果的に阻害できることが判明された。２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞において、ｂａｔ ＲａＴＧ１３株、ＰＣｏＶ－ＧＤ株およびＰＣｏＶ－ＧＸ株の感染を阻害するＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０は、それぞれＩＰＢ２９の約４倍、６倍と５倍に達した。Ｈｕｈ－７細胞において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ株、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ株、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３株およびＨＣｏＶ－２２９Ｅ株の感染を阻害するＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０値は、最高でそれぞれＩＰＢ２９の約１１倍、７倍、９倍および７倍に達した。この結果から、リポペプチドＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０、特にＩＰＢ２９が他のコロナウイルスに対して強い阻害効果を示すことが分かり、ＩＰＢ２９は、他のリポペプチドに比べてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と密接に関連するＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＰＣｏＶ－ＧＤおよびＰＣｏＶ－ＧＸに対して依然として最強の阻害活性を示すことが判明された。

【0121】

実施例５：リポペプチドのインビトロ細胞傷害性および治療指数の分析
試験用リポペプチドは、実施例１で調製したリポペプチドＩＰＢ２９、リポペプチドＩＰＢ３０、リポペプチドＩＰＢ２４またはリポペプチドＩＰＢ２８であり、試験用細胞は、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞またはＨｕｈ－７細胞であった。

【0122】

試験用リポペプチドのインビトロ細胞毒性試験は、ＣＣＫ－８細胞増殖／毒性試験キット（Ａｂｂｋｉｎｅ社製、品番ＫＴＣ０１１００１）を用いて行い、具体的には、以下の手順に従って行った。つまり、１）９６ウェル細胞培養プレートにおいて、試験用リポペプチドを３倍勾配で希釈し、最終的に、各ウェルに１００μＬのリポペプチド溶液を加え、１希釈度あたり３つの平行ウェルで９つの希釈度を設け、さらに、ＤＭＥＭ培地（１ウェルあたり１００μＬ）を加えた対照ウェルを設けた。２）１０×１０^４細胞／ｍＬの試験用細胞懸濁液を、ステップ１）で得られた９６ウェル細胞培養プレートに１００μＬ／ウェルの量で加え、３７℃、５％のＣＯ_２の条件下で４８時間培養した。３）ステップ２）が終わると、各ウェルにＣＣＫ－８溶液を２０μＬ添加し、プレートをインキュベータでさらに２時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて阻害率グラフを作成し、薬物の半数細胞毒性濃度（ＣＣ_５０）を算出した。

【0123】

図７に示すように、ＩＢＰ２４、ＩＢＰ２８、ＩＢＰ２９、ＩＢＰ３０の４つのリポペプチドの２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に対するＣＣ_５０は、それぞれ１４．３６μＭ、１２．２８μＭ、２３．９４μＭ、４５．４６μＭであり、Ｈｕｈ－７細胞に対するＣＣ_５０値はそれぞれ１５．０２μＭ、１５．９７μＭ、２２．７５μＭおよび４４．４３μＭであった。このことから、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０、特に塩化ステアリル基で修飾されたＩＰＢ３０は、細胞毒性が比較的低いことが判明された。

【0124】

ＣＣ_５０／ＩＣ_５０分析（ＩＣ_５０データは実施例３で得られたもの）から、４つのポリペプチドがいずれも非常に高い選択的治療指数（ＴＩ）を有することが確認できた。例えば、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞へのＯｍｉｃｒｏｎ突然変異株の感染に対する阻害活性は、ＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０でそれぞれ約３１８４、２７２３、５０９３６および２５５３９という高いＴＩ値を示し、ＩＰＢ２９のＴＩ値は、ＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８およびＩＰＢ３０のそれぞれ約１６倍、１９倍および２倍であった。また、Ｈｕｈ－７細胞へのＯｍｉｃｒｏｎ突然変異株の感染に対する阻害活性は、ＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０でそれぞれ約５８６７、６４９２、４９４５７および３０４３２という高いＴＩ値を示し、ＩＰＢ２９のＴＩ値は、ＩＰＢ２４、ＩＰＢ２８およびＩＰＢ３０のそれぞれ約８倍、８倍および１．６倍であった。このことから、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０は、ＩＰＢ２４およびＩＰＢ２８に比べて高い治療指数を持ち、ドラッガビリティがより高いことが判明された。

【0125】

実施例６：リポペプチド阻害剤の安定性研究
本実施例において、本発明者らは、代表的なリポペプチドであるＩＰＢ２４およびＩＰＢ２９の安定性を、プロテアーゼによる消化処理、肝ミクロソームによる消化処理、ヒト血清とのインキュベーション、３７℃での長期間放置を含むさまざまな角度から比較解析した。ここで、実施例１で調製したリポペプチドＩＰＢ２９、リポペプチドＩＰＢ２４を試験用リポペプチドとし、実施例３のステップ１と同様にして（試験用細胞：２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞）リポペプチドの抗ウイルス活性を測定した。

【0126】

１）プロテアーゼの消化
試験用プロテアーゼとしてプロテイナーゼＫ、トリプシンおよびα－キモトリプシンを用い、プロテイナーゼＫ、トリプシン、およびα－キモトリプシンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製であり、製品番号がそれぞれＰ２３０８、Ｔ４７９９、およびＣ４１２９であった。

【0127】

試験用リポペプチドおよび試験用プロテアーゼを、終濃度がそれぞれ２ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬとなるように混合し、３７℃でそれぞれ０、３０、６０、１２０または１８０分間インキュベートした後、リポペプチドの抗ウイルス活性を測定した。

【0128】

２）肝臓ミクロソームの消化
第Ｉ相代謝安定性試験キットのヒト肝臓ミクロソーム（混合）試薬は、北京匯智泰康医薬技術有限会社から購入し、商品番号が０１１１Ａ１．０３であり、実験方法はメーカーから提供された説明書に従って行った。まず、キット添付のＡ液１０μＬ、Ｂ液２μＬ、０．１ＭのＰＢＳ緩衝液２８μＬを均一に混合し、３７℃で５分間プレインキュベートした後、４０μＬ／チューブの量で分注し、３７℃水浴中で加温してプレインキュベーション液を調製し、後の使用に備えた。０．１ＭのＰＢＳ緩衝液１５４μＬ、肝ミクロソーム５μＬおよび濃度４ｍＭの試験用リポペプチド溶液１μＬを混合し、次いでプレインキュベーション液４０μＬを加え、直ちに３７℃水浴に入れてインキュベートし、時間を計測した。異なるインキュベーション時間を設定し、インキュベーション系に予め冷やしたアセトニトリル２００μＬを加えて反応を停止させ、リポペプチドの抗ウイルス活性を測定した。

【0129】

３）ヒト血清安定性実験
２０％のヒト血清と終濃度１５０μＭの試験用リポペプチドを混合し、３７℃で０、５、３０、６０、１２０または１８０分間インキュベートした後、リポペプチドの抗ウイルス活性を測定した。

【0130】

４）温度安定性実験
濃度３００μＭの試験用リポペプチド水溶液を、３７℃で異なる時間放置した後、その抗ウイルス活性の変化を測定した。

【0131】

５）結果の分析
実験結果を図８に示す。プロテイナーゼＫ、トリプシンまたはα－キモトリプシンで処理したＩＰＢ２４およびＩＰＢ２９の抗ウイルス活性は、未処理のリポペプチド（すなわち、インキュベーション時間０の処理群）と比較して有意な変化を示さず、単一酵素消化がリポペプチドの安定性に及ぼす影響は限定的であることが示唆された。一方、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染に対するＩＰＢ２４の阻害活性は、ヒト肝ミクロソームで７２時間および９６時間処理することによって明らかに低下し、そのＩＣ_５０値がそれぞれ約８倍および約１４倍上昇したが、ＩＰＢ２９の抗ウイルス活性への影響は限定的であった。肝臓ミクロソームにはほとんどのＩ相酵素が含まれており、中でもＣＹＰ４５０を主成分とするミクロソーム混合機能オキシダーゼ系が最も重要であり、ＩＰＢ２４の活性に影響を及ぼす成分については、さらに深く研究する必要がある。

【0132】

ＩＰＢ２４およびＩＰＢ２９は、２０％のヒト血清の処理に対してより感受性が高く、特にＩＰＢ２４は５分間のインキュベーションで抗ウイルス活性が約２４倍低下し、ＩＰＢ２４の抗ウイルス活性は、３０、６０、１２０および１８０分間のインキュベーションでそれぞれ約３２、３６、３７および４２倍低下した。その一方で、ＩＰＢ２９は、ヒト血清に対して耐性が明らかに高く、上記の５分間から１８０分間までの各時点で、抗ウイルス活性はそれぞれ約４、１０、１２、１３および１３倍低下した。

【0133】

３７℃でそれぞれ３、７、１４、２１および２８日間放置したＩＰＢ２４の抗ウィルス活性は、時間の推移につれて徐々に低下し、特に２８日後には５倍以上に低下した。対照的に、ＩＰＢ２９の抗ウイルス活性は、同じ放置条件下で変化しないか、或いは遥かに小さかった。より長期間にわたるリポペプチドの温度安定性については、さらなる研究が必要である。

【0134】

結論として、ＩＰＢ２９はＩＰＢ２４に比べて安定性が大きく向上し、安定性において明らかな優位性を示し、ＥＡＡＡＫ配列を持つＩＰＢ２９らせん状リポペプチドのより優れたドラッガビリティをさらに裏付けるものであった。

【0135】

実施例７：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を介した細胞－細胞膜融合に対する新規リポペプチドの阻害効果
実施例１で調製したリポペプチドＩＰＢ２９、リポペプチドＩＰＢ３０、リポペプチドＩＰＢ２０を試験用リポペプチドとし、試験用細胞は、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞、Ｈｕｈ－７細胞であった。

【0136】

新規リポペプチド阻害剤の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性をさらに評価するために、本開示においてＤＳＰシステムに基づく細胞－細胞融合阻害実験を実施し、具体的な方法としては、非特許文献４および５の「Ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ」部分の記載を参照することができ、手順は次の通りであった。

【0137】

１）２９３Ｔエフェクター細胞懸濁液（１．５×１０^４個／１００μＬ／ウェル）を９６ウェルプレートに加え、同時に２９３Ｔ／ＡＣＥ２またはＨｕｈ－７標的細胞懸濁液（１．５×１０^５個細胞／ｍＬ）を１０ｃｍの細胞培養用ディッシュに加え、３７℃、５％のＣＯ_２条件下で培養した。

【0138】

２）１６時間かけて培養した後、ｐＣｏＶ２－ＳプラスミドおよびｐＤＳＰ_１－７プラスミドを２９３Ｔエフェクター細胞に共導入し、同時にｐＤＳＰ_８－１１プラスミドを２９３Ｔ／ＡＣＥ２またはＨｕｈ－７標的細胞に導入し、細胞を培養し続けた。

【0139】

３）２４時間後、ポリペプチドを９６ウェルプレートにおいて３倍勾配で希釈し、各濃度につき３つの平行ウェルで９つの希釈勾配を設けた。希釈したポリペプチドをエフェクター細胞に加え、３７℃、５％のＣＯ_２細胞培養インキュベータで１時間インキュベートした。

【0140】

４）ＤＭＥＭ完全培地を予め加温し、ＥｎｄｕＲｅｎライブセル基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を１：４０００の割合で加えた後、得られた培地を用いて遠心回収した２９３Ｔ／ＡＣＥ２またはＨｕｈ－７標的細胞を再懸濁させ、細胞濃度を３×１０^５／ｍＬに調整して３７℃、５％のＣＯ_２で３０分間インキュベートした。

【0141】

５）２９３Ｔ／ＡＣＥ２またはＨｕｈ７標的細胞を１００μＬ／ウェルの量で２９３Ｔエフェクター細胞に加え、エフェクター細胞と標的細胞が十分に接触するように４００ｇ、１分間遠心した後、混合した細胞を２時間培養した。

【0142】

６）ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）をマイクロプレート光度計で読み取り、阻害率とＩＣ_５０を算出した。

【0143】

図９に示すように、標的細胞が２９３Ｔ／ＡＣＥ２である場合（左図）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を介した細胞－細胞膜融合を阻害するＩＰＢ２０、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０は、それぞれ３．６５ｎＭ、０．２ｎＭおよび０．４４ｎＭであり、標的細胞がＨｕｈ－７である場合（右図）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を介した細胞－細胞膜融合を阻害するＩＰＢ２０、ＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０のＩＣ_５０は、それぞれ４．０１ｎＭ、０．３１ｎＭおよび０．４５ｎＭであった。これらの実験結果により、新型膜融合阻害剤であるＩＰＢ２９およびＩＰＢ３０がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ蛋白を介した細胞－細胞融合に対して比較的に強い阻害活性を示すことが確認できた。

【0144】

以上では、本開示を詳細に説明した。当業者であれば、本開示の趣旨や範囲から逸脱しない前提で且つ不要な実験を行うことなく、等価なパラメータ、濃度および条件下において比較的広い範囲で本開示を実施することができる。本開示において特定の実施例が示されているが、本開示に対してさらなる改良がなされ得ることが理解されるべきである。つまり、本開示の原理に従って、本願は、本願の開示範囲外であり且つ当分野で周知の従来技術でなされた変更を含む、本開示に対する任意の変更、使用または改良を含むことが意図される。いくつかの本質的な特徴の適用は、以下に添付の特許請求の範囲内で実施され得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】